文章信息
- NRP-1单克隆抗体对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的影响
- Influence of NRP-1 Monoclonal Antibody on Growth of Breast Cancer Xenografts in Nude Mouse
- 肿瘤防治研究, 2019, 46(4): 311-315
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2019, 46(4): 311-315
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2019.18.1235
- 收稿日期: 2018-08-29
- 修回日期: 2018-12-29
乳腺癌被列为全球第二大最常见的癌症,是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一[1]。全世界每年约新增150万乳腺癌患者,同时有50余万女性死于该病[2]。目前,乳腺癌的治疗提倡手术、放化疗、内分泌及分子靶向治疗相结合的综合治疗措施,治疗水平较以往有了很大的提高,但是整体临床疗效仍不能让人满意,特别是晚期乳腺癌疗效依然较差。治疗失败的原因主要有原发肿瘤转移、治疗后复发和耐药,其中较早发生血行转移是主要因素[3]。因此,探寻治疗乳腺癌的新靶点,提高其疗效是仍然是亟待解决的临床难题。
Soker等发现神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1, NRP-1)与血管生成存在关系,是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的新型受体,在血管内皮细胞增殖和迁徙过程中有促进作用[4]。近来也有大量研究表明,NRP-1在血管生成方面起着重要作用,可能为抗血管生成治疗提供潜在的靶点。NRP-1在乳腺癌中高表达,而且可作为乳腺癌的独立预后因素[5]。已有研究通过沉默或过表达NRP-1观察乳腺癌细胞在细胞增殖、侵袭、转移和凋亡等生物学行为方面的变化,但是关于NRP-1单克隆抗体(NRP-1 monoclonal antibody, NRP-1 MAb)治疗乳腺癌裸鼠移植瘤的研究国内外尚未见报道。
本研究将从细胞水平检测NRP-1 MAb是否能有效识别乳腺癌MCF7细胞上的NRP-1蛋白,并从动物水平观察NRP-1 MAb对乳腺癌MCF7细胞移植瘤生长的影响,从分子水平检测肿瘤组织中VEGF、NRP-1的表达情况,分析潜在机制,从而为NRP-1单克隆抗体靶向药物的研究提供数据基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂、材料RPMI1640培养基、胎牛血清为GIBCO公司产品(美国),Hoechst染色试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品(中国),羊抗鼠IgG-TRITC罗丹明(Tetramethylrhodamine, TRITC)荧光标记二抗为Sigma公司产品(美国),VEGF抗体为Abcam公司产品(美国),蛋白Marker/预染蛋白Marker、PVDF膜为Fermentas公司产品(美国),增强化学发光(Enhanced chemiluminescence, ECL)试剂盒为鹭隆公司产品(中国)。NPR-1单克隆抗体为厦门大学抗癌研究中心颜江华教授课题组馈赠[6]。
1.2 实验动物、细胞株6~8周龄SPF级雌性BALB/C裸鼠,由厦门大学动物实验动物中心提供。乳腺癌MCF7细胞,为本实验室保存的细胞株。
1.3 细胞培养乳腺癌MCF7细胞常规培养(在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养),每2~3 d传代,取对数生长期细胞用于后续实验。
1.4 抗体特异性的鉴定为了鉴定抗体的特异性,实验设有空白对照组(Blank control, BC),阴性对照组(Negative control, NC)。收集各组细胞,提取总蛋白,进行蛋白免疫印记(Western blot)检测。即经SDS-PAGE电泳后将蛋白转到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭膜后加入稀释的NRP-1 MAb(1:1 000),4℃反应过夜后取出用膜洗涤液(TBST)洗涤3次,加入HRP酶标二抗(1:8 000)室温反应1 h,洗涤5次,加入化学发光液反应,在凝胶成像仪成像。
将MCF7接种于盖玻片贴壁生长,当细胞长至80%左右,用4℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次; 加入Hoechst染色试剂盒的固定液0.5 ml,4℃固定30 min; 弃掉固定液,PBS洗3遍,3 min每次。甩干,加入1:200稀释的NRP-1抗体,37℃孵育1 h,弃掉一抗溶液,PBS洗3遍,3 min每次; 在细胞片上加1:50稀释的羊抗鼠IgG-TRITC荧光标记二抗,37℃避光孵育1 h,弃掉荧光二抗,PBS洗3遍,3 min每次; 加入0.5 ml Hoechst染色液,于摇床上晃动,室温染色5 min,弃掉染色液,用PBS洗涤3遍。甩干,滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的玻片,尽量避免气泡; 共聚焦扫描显微镜下观察,其中Hoechst激发波长在350 nm左右,发射波长在460 nm左右; 而TRITC最大吸引光波长为550 nm,最大发射光波长为620 nm。
1.5 裸鼠移植瘤模型的建立取对数生长期的乳腺癌MCF7细胞,0.25%胰酶消化后加入含血清培养基中和胰酶,吹打成单细胞悬液。用PBS离心洗涤3次,弃上清液,细胞沉淀用PBS制成1×107个/毫升单细胞悬液,以每只0.2 ml注入裸鼠右前腋下。接种后隔天观察1次小鼠,记录皮下接种点的成瘤情况。当皮下成瘤并生长至约800 mm3时开始传代,剥离瘤块剪切成均匀的小块(2 mm×2 mm×2 mm),移植到30~35只裸鼠右前腋部皮下。
1.6 分组及用药当小鼠移植瘤瘤体长至约100 mm3将荷瘤裸鼠按随机数字表法分为4组,每组6只。对照组(PBS组)腹部皮下注射PBS,0.2 ml,2次/周; NRP-1 MAb低剂量组腹部皮下注射NRP-1 MAb,1 mg/kg,2次/周; NRP-1 MAb中剂量组腹部皮下注射NRP-1 MAb,5 mg/kg,2次/周; NRP-1 MAb高剂量组腹部皮下注射NRP-1 MAb,10 mg/kg,2次/周。以上各组均于瘤组织移植接种后第3天开始给药,共给药7次。
1.7 肿瘤重量、体积测量及抑瘤率模型分组给药后,每天观察裸鼠的一般情况并记录:精神状态、食欲、体重等。隔5天测一次肿瘤长径(a)、短径(b)和小鼠体重。于治疗后第33天脱颈处死,剥离完整肿瘤,称重,投入液氮中保存、备用。用Steel公式计算肿瘤体积(V)。V = a×b2/2。抑瘤率(Tumor Growth Inhibition, TGI)(%)=(Cx-Tx)/Cx×100%(Cx为给药结束后PBS组测量的平均肿瘤体积,Tx为给药结束后各治疗组测量的平均肿瘤体积)。根据测量数据绘制治疗后肿瘤质量的变化,以及实验进程中小鼠体重变化等图表。
1.8 Western blot检测相关蛋白的表达肿瘤组织研磨破碎,加蛋白裂解液,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。将等量蛋白样品点于SDS-聚丙烯酰胺凝胶小孔进行电泳。电泳后进行转膜,将转好的PVDF膜用TBST洗涤后、浸没于封闭液封闭,然后根据预染Marker所指示大小,将内参条带(GAPDH)和目的条带(VEGF、NRP-1)剪开,分别加入对应的一抗,4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,加入相应的二抗孵育30 min,洗涤数次,滴加ECL显影剂,通过设备曝光显影观察蛋白条带。
1.9 统计学方法使用SPSS19.0统计分析软件对原始数据进行统计分析,最终结果数据用样本均数t检验分析,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 NRP-1单克隆抗体的特异性Western blot方法检测抗体特异性结果显示NRP-1 MAb能够与线性NRP-1蛋白结合,无明显杂带,见图 1A。说明抗体特异性良好,且能应用于后续实验,即采用Western blot方法检测肿瘤细胞PD-L1蛋白的表达量。
NRP-1 MAb孵育的乳腺癌细胞MCF7后经免疫荧光染色,使用荧光共聚焦显微镜观察结果。当使用550 nm做激发光,检测TRITC的荧光时,对照组的细胞检测不到红色荧光,而经NRP-1 MAb(标记有TRITC荧光)处理的细胞可以看到清晰的红色荧光; 当使用350 nm做激发光,检测Hoechst的荧光时,可见细胞核带有蓝色荧光,且未对细胞核的形态造成损伤; 将2个图像融合,融合图像显示未加抗体的细胞膜未出现红色荧光,而加入NRP-1 MAb的有红色荧光,且主要呈现在细胞膜上,见图 1B。结果表明,NRP-1 MAb能够有效识别乳腺癌细胞MCF7上天然的NRP-1蛋白,且主要定位在细胞膜上。
2.2 各组裸鼠体重及肿瘤体积、重量的变化实验进程中,各组荷瘤小鼠生长状况良好,饮食规律,排泄无异常,无意外伤害及死亡,成瘤率100%。肿瘤体积从给药后第3天开始测量,根据各个时间点的测量结果绘制肿瘤生长曲线。数据显示从第13天开始实验组的肿瘤体积明显要小于对照组(P=0.00018),不同NRP-1 MAb剂量给药组的抑瘤率随着给药剂量的增加而增高。NRP-1 MAb低剂量组(1 mg/kg)抑瘤率为47.01%,NRP-1 MAb中剂量组(5 mg/kg)抑瘤率为65.70%,NRP-1 MAb高剂量组(10 mg/kg)抑瘤率为69.19%,见图 2。肿瘤的生长依赖于新生血管提供养分,而NRP-1在肿瘤血管生成中充当重要角色。NRP-1 MAb理论上可通过阻断NRP-1与其受体结合,抑制肿瘤血管生成,进而影响肿瘤的增长速度。实验结果显示与该推断一致。给药治疗33天后,剥离肿瘤组织称重,实验组的肿瘤明显小于对照组(高中低组相应的P值为:0.029、0.025、0.016),见图 3。随着荷瘤小鼠给药进程,小鼠体重增长差异不大,无体重骤减现象,见图 4。说明NRP-1 MAb用药对荷瘤小鼠毒副作用小。
2.3 肿瘤组织中VEGF和NRP-1蛋白的表达
Western blot法分析各组中NRP-1和VEGF的表达。以GAPDH为内参蛋白进行调平,结果显示对照组肿瘤组织中NRP-1和VEGF均有表达,不同剂量用药组NRP-1和VEGF的表达则呈现递减趋势,见图 5。
3 讨论我国乳腺癌的发病率逐年上升,且具有年轻化的趋势。近年来,NRP-1如何参与肿瘤的发生发展过程已成为研究热点。在乳腺癌的研究中显示,恶性、癌前病变的乳腺样本中肿瘤脉管系统和肿瘤细胞表达有NRP-1蛋白,显示NRP-1可能和乳腺癌生长和进展有关[7]。
NRP-1作为VEGFR-2的共受体可增强VEGF165与VEGFR-2的结合,增加VEGFR2的蛋白磷酸化程度,负责诱导内皮细胞趋化作用,促进肿瘤血管生成[8]。而且,NRP-1还能够以不依赖VEGF的方式,通过与酪氨酸激酶ABL1形成复合物,重塑肌动蛋白,诱导血管新生[9]。Bachelder等[10]发现恶性乳腺癌细胞中激活VEGF诱导的PI3K信号转导通路的作用是非常重要的。在NRP-1阳性、VEGFR2阴性的乳腺癌细胞株中,VEGF165通过激活PI3k激酶通路阻止凋亡,并与NRP-1的水平和细胞生存直接相关[11]。另外,在介导乳腺癌迁移和转移中NRP-1也起了重要作用。这些研究共同提示了抗NRP-1可能为靶向治疗乳腺癌提供新的途径。
传统化疗药物旨在短时间内最大程度杀伤肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞凋亡,但较长的化疗间歇使得受损的肿瘤血管系统得以重建,不能带来持久疗效,且不良反应大,常伴有肿瘤耐药。靶向治疗作为据手术、放疗、化疗三大传统治疗手段之外的一种全新的治疗方法,特异性强、不良反应小,能够改善化疗药的弊端。以NRP-1为靶点的分子靶向治疗研究,在结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等瘤种的体内外实验中体现出较好的抗肿瘤疗效[12]。
本研究在细胞水平上,通过Western blot和共聚焦免疫荧光法检测NRP-1 MAb的特异性,结果显示其可有效结合乳腺癌细胞MCF7上的NRP-1蛋白。NRP-1在肿瘤生长、发展中参与血管新生、肿瘤细胞侵袭等过程,本研究在动物水平上,探讨了NRP-1 MAb以不同剂量治疗乳腺癌细胞裸鼠移植瘤,不同NRP-1 MAb剂量给药组的抑瘤率随着给药剂量的增加而增高。为了进一步阐释疗效的潜在机制,本研究在分子水平上,初步检测了肿瘤组织中的VEGF和NRP-1的表达情况,结果显示高剂量用药后肿瘤组织中VEGF和NRP-1表达量下调,证实NRP-1 MAb可通过下调VEGF和NRP-1表达,而抑制肿瘤的增长。但是荷瘤小鼠肿瘤生长抑制实验结果显示,中、高浓度抗体的抑瘤作用却没有低浓度显著,提示肿瘤发生发展是个综合复杂的过程,涉及多物质多通路的参与,NRP-1 MAb抑制肿瘤生长不是唯一途径,只是机体中的一种途径,后续研究可以考虑联合用药来提高抗体在实际应用中的有效性。综上,NRP-1 MAb可能通过结合NRP-1蛋白而下调VEGF和NRP-1的表达,从而减少肿瘤组织中血管的生成,发挥一定的抑制肿瘤增长的作用。
作者贡献
马超:抗体鉴定,Western blot等实验实施及论文撰写
王卫星:参与细胞相关实验及论文撰写
苏新辉、陈国强:共同参与实验设计、数据分析等工作
苏福:参与动物实验
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