蛋白质研究   目录

1. 封闭液

在使用抗体检测已经转移到膜上的蛋白质之前，必须进行封闭，防止抗体的非特异性结合。 否则，抗体或其他检测试剂将与最初用于固定目的蛋白质的任何剩余位点结合。 原则上，在测定中对靶标或探针组分不具有结合亲和力的任何蛋白质均可用于封闭。

2. 抗体孵育

正确的抗体对于得到干净、可靠和可重复的蛋白免疫印迹结果至关重要。我们提供超过 4 万种高特异性和高灵敏度的一抗和二抗，以帮助您收集高质量的蛋白免疫印迹实验数据。我们所有的抗体都经过验证，可应用于说明书中所述的用途和种属。HRP（辣根过氧化物酶）和 AP（碱性磷酸酶）结合的二抗也有不同的纯度供选择，以满足您所有蛋白免疫印迹分析的需要。特点：

· 高度特异的抗体结合到您的靶蛋白或一抗

· 高度灵敏的抗体满足您所需的检测水平

· 可靠的抗体帮助您每次都获得优质的数据

· 经验证的抗体可用于所述的用途和种属

· 价格合理的抗体帮您最大程度地节约研究预算

1）用于蛋白免疫印迹实验的一抗

抗体对于蛋白免疫印迹实验的成功至关重要。它们允许选择性地检测目的蛋白质。通常情况下，一抗用于特异性地结合目的蛋白，而标记的二抗则用来进行信号放大并最终检测信号。

多克隆和单克隆抗体都适用于蛋白免疫印迹实验。多克隆抗体生产成本较低且耗时较少，而且它们通常对抗原具有高亲和力。单克隆抗体的价值在于其特异性、纯度和一致性可导致较低的背景。多克隆和单克隆抗体是使用小鼠、大鼠、兔、山羊和其他动物种属为宿主开发的。粗制抗体试剂如血清或腹水有时用于蛋白免疫印迹实验，但由于杂质的存在可能会导致背景的增加。

一抗通常在使用前需要从储备浓度稀释，并且每种抗体需要一些优化以达到最佳效果（请务必查看产品数据表中的推荐稀释度）。将转印有蛋白的膜与一抗溶液一起孵育后，洗涤，如果一抗没有标记染料或分子等，则加入标记的二抗或其他第二级检测试剂。

一抗也可用于检测蛋白免疫印迹实验中的内参对照。内参对照抗体有助于评估蛋白免疫印迹的效率，并比较凝胶中每个孔中蛋白的加样量。这些对照有助于确定样本间表达水平的差异是由实际蛋白水平还是由加样量差异引起的。

顶级内参对照抗体

2) 用于蛋白免疫印迹实验的二抗

二抗可以与许多不同的分子结合用于检测，例如酶、荧光团和染料。最常见二抗结合物是辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。荧光标记的二抗，如我们选择的Alexa Fluor 抗体，也越来越受欢迎。基于荧光的检测提供了与化学发光检测相似的灵敏度，但它允许同时检测多个荧光基团，以提供两种或更多不同蛋白的比较数据。

与使用标记的一抗相比，使用二抗可以大大提高灵敏度。直接标记的一抗通常每个抗体上只有少量的标记物。二抗的设计使其可与一抗的多个位点结合，从而导致多个二抗分子可同时与一个一抗分子结合。这导致标记分子或酶的数量增加了 3 到 5 倍，信号显著放大。

二抗通常在使用前需要从其储备浓度稀释，并且每种抗体需要一些优化以达到最佳效果（请务必查看产品数据表中的推荐稀释度）。将转印有蛋白的膜并与一抗先孵育过的膜与二抗溶液一起孵育后，洗涤，再孵育底物以显示条带。

用于蛋白免疫印迹实验的顶级二抗

3.  底物孵育

与蛋白质印迹系统中的其他组分一样，有许多化学发光底物可供选择。底物的正确选择取决于所需检测限（灵敏度）、靶蛋白的丰度、样品丰度和抗体可用性。根据您的实验需要，使用下表找到合适的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）底物。

1）. 辣根过氧化物酶（HRP）化学发光底物

化学发光底物是目前常用的检测工具，它相比其他检测方法具有很多优势。这些优势使化学发 光成为大多数蛋白研究实验室的首选检测方法。化学发光技术可实现多次曝光以获得最佳图像。可剥离抗体并重新检测整个印迹膜，以分析另一个蛋白靶点或优化第一个蛋白靶点的检测结果。线性响应范围更宽，使得可检测和定量的蛋白质浓度范围更宽。最为重要的是，相比其他检测方法，化学发光的检测灵敏度最高。

2）. AP 化学发光底物

4. 漂洗缓冲液

在抗体孵育操作中必须进行漂洗，以除去未结合的试剂并减少背景。漂洗不充分可能导致高背景，同时，过度清洗可能会从印迹上洗脱抗体或抗原而导致灵敏度下降。漂洗时可能会用到一系列缓冲液。通常在生理缓冲液中进行漂洗步骤，比如 Tris-缓冲生理盐水（TBS）或磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）。在缓冲液中加入去垢剂，比如 Tween-20，有助于去除非特异性结合的物质。Tween-20（0.05％-0.2％）的量可根据所用抗体的结合强度而变化。弱结合抗体可能会被过多的去垢剂洗掉。 在使用碱性磷酸酶结合物的应用中，应选择 TBS，因为 PBS 会干扰碱性磷酸酶。进行荧光蛋白质印迹时，建议避免在封闭步骤中使用去垢剂。因为去垢剂会自发荧光，导致背景更高。

5. 抗体剥离液

使用我们的 Thermo Scientific Restore 试剂，您可以快速剥离并重新检测，实现印迹膜的多次重复使用。我们可以帮助您节约时间和成本，减缓印迹重新检测后数据质量的下降。

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