CN101298607A - 重组人促卵泡生长激素的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组人促卵泡生长激素的编码序列、生产该重组人促卵泡生长激素的方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。首次采用了pET系统表达FSH，通过转染CHO工程细胞，获得了高水平表达的细胞株；通过控制培养条件，达到了较高蛋白表达率；在此基础上对分泌表达的重组人促卵泡生长激素的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了一套FSH纯化方法。用本法，可得到高得率、高纯度的重组人促卵泡生长激素，并能满足临床需要。本发明可高效、简便、低成本地获得重组人促卵泡生长激素纯品。

Description

重组人促卵泡生长激素的生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人促卵泡生长激素(FSH)的方法，包括有关的CHO细胞株的构建、重组人促卵泡生长激素的表达和纯化工艺。

背景技术

重组人促卵泡生成素(FSH)是由脑垂体嗜碱性细胞分泌进入血液循环的一种多肽激素，该激素与脑垂体分泌的另一激素一一黄体激素(Lnteinzinghormone，LH)，共同作用于女性卵细胞，控制卵细胞的成熟，其中FSH起着关键调节作用，是卵泡细胞发育成熟不可缺少的因子。

FSH是由双链形成的多肽糖蛋白，包括α链和β链，该二条亚链由非共价键联结，分别由不同的基因转录而来。α链含有92个氨基酸，β链含有111个氨基酸。α链和β链在转录后都经过糖基化，研究表明，该蛋白质糖基化对其生物活性十分重要，是其发挥活性作用的关键。因此，必须采用真核细胞系统表达，该蛋白质才有活性。并且，α链和β链必须成比例共同表达于一个细胞株内，方能达到完全活性的FSH。

不能释放卵子是女性不育最常见的原因，占所有不孕妇女的1/3左右，其主要原因是由于患者在月经中期，下丘脑刺激垂体释放的促卵泡生成素(FSH)不足或相对不足，从而导致卵巢不能产生成熟的卵子或不能引起排卵。促卵泡生成素(FSH)是第一种用于治疗这类不孕症的生物药，目前应用中主要有人基因重组FSH(r-FSH)与高纯度人尿PSH(u-FSH-HP)，u-FSH-HP是由绝经期妇女尿液中提取的，纯度达95％，但仍含有残留尿液中的具有蛋白性质的成分，这些成分可抑制FSH的作用。rh-FSH是近年来应用基因工程技术人工合成的纯度达100％的FSH制剂。u-FSH-HP与rh-FSH不仅在来源上不同，而且在结构上也不完全相同，如它们的寡糖分子结构不同，免疫反应生物活性不同，rh-FSH比u-FSH-HP的碱性形式多，酸性形式少，前者对受体的亲和力更强，自身的生物活性也更。碱性形式在诱导卵泡生长中起重要作用，在自然月经周期中，月经中期FSH的碱性形式较多，说明rh-FSH更接近天然FSH，具有更高的生物活性。由于尿促性腺激素生物活性存在20％的内变异，751U的u-FSH可能含有60~90IU的变异，说明u-FSH活性不如rh-FSH稳定。

因此，迫切需要开发高效生产重组人FSH的方法，本发明采用了CHO(dhfr^-)表达系统表达FSH，通过对人FSH基因的优化，构建含有优化的人FSH基因的表达载体，并获得了高水平的表达细胞株；通过控制培养条件，达到了较高蛋白表达率；在此基础上对表达的rh-FSH的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了高纯度、高得率、可供动物实验的rh-FSH蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人促卵泡生长激素的方法。

本发明的另一目的就是提供优化的重组人促卵泡生长激素的氨基酸序列和用于该方法的表达载体及工程细胞。

在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组促卵泡生长激素的氨基酸序列，其特征在于，所述的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是pET30a(+)/FSH。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。

在另一优选例中，所述的工程细胞是CHO(dhfr^-)，是二氢叶酸还原酶的基因缺陷细胞株，非常适合外源基因的高效表达。

在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人促卵泡生长激素的方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表

达出人促卵泡生长激素；较佳地，所述的宿主细胞是CHO(dhfr^-)。

b)分离纯化出表达的人促卵泡生长激素。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤(a)的培养条件包括：

培养分为有血清培养阶段和无血清阶段，有血清培养阶段细胞进行扩增达到一定密度后，更换无血清培养基进行表达，灌注培养收集培养上清。培养温度保持在37℃，pH值控制在7.0±0.2，搅拌速度80rpm，溶氧(DO)50％。

在本发明的另一优选例中，诱导过程还可以添加酵母提取物(YE)、蛋白胨(peptone)等作为保护剂。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤：

i)对培养上清通过离心和/或过滤方式去除残留细胞及碎片，获得上清；

ii)层析纯化，所述的层析选自：凝胶过滤层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析及其组合。

在本发明的另一优选例中，上清经凝胶过滤层析、Q Sepharose F.F.层析、SP-Sepharose F.F.层析、透析复性、浓缩以后得到纯度大于98％、得率在20％以上的纯品。

附图说明

图1.FSH天然序列与FSH优化序列的同源性比较。Query：天然FSH基因序列；Sbjct：优化的FSH基因序列。

图2.pET30a(+)/FSH表达质粒的构建路线图。

图3.工程细胞的培养过程细胞生长和目的蛋白表达曲线。

图4.SP-Sepharose FF纯化电泳图。1.Marker，2.透析上清，3.SP-Sepharose FF离子交换层析穿透液，4-9.SP-Sepharose FF收集液。

图5.15％SDS-PAGE电泳检测纯化过程目的蛋白的纯度及含量。

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，通过优化设计人促卵泡生长激素基因编码序列，将优化后的人促卵泡生长激素编码序列构建入合适表达载体，转化宿主细胞，获得高表达细胞株，并通过优化培养、纯化工艺，实现了人促卵泡生长激素高效表达，并且表达出的人促卵泡生长激素保持生物学活性。在此基础上完成了本发明。

本发明根据人促卵泡生长激素天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，优化其核苷酸序列，全基因合成经优化的重组人促卵泡生长激素蛋白的目的基因序列，将该基因克隆到pET3(+)中测序验证后，用分子克隆的常规方法，构建表达载体，转入CHO细胞(dhfr^-)，通过dhfr+/-筛选出表达工程细胞，增加MTX压力筛选获得高表达工程细胞。6孔板中试验表明，rh-FSH比表达可达4ug/10⁶cells/day。

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下进行培养。在本发明中，工程细胞表达重组人促卵泡生长激素的培养条件没有特别限制。可以采用本领域常规的培养条件。例如，合适的培养基包括(但不限于)以下组成：

(i)氮源含有机氮源和无机氮源，有机氮源包括血清等，无机氮源包括氨基酸等。

(ii)碳源为葡萄糖，是单一碳源。较佳的，有血清培养中葡萄糖浓度为4.5g/L，无血清培养阶段葡萄糖浓度为7g/L。

为大规模获得重组人促卵泡生长激素，需要在反应器中进行表达培养。本发明研究了中试培养工艺，优化后的表达水平达到500mg/L。

在培养表达后，对表达的重组人促卵泡生长激素蛋白进行分离。通常，培养样品先离心获得上清液后，经凝胶过滤层析、Q Sepharose F.F.层析、SP-sepharose F.F.层析、透析、浓缩等。

经不同层析过程比较，优化的纯化方法包括：

1.对培养样品进行离心获得上清；

2.经凝胶过滤层析、Q Sepharose F.F.层析、SP-sepharose F.F.层析、透析、浓缩，纯品纯度98％以上，得率约120mg/L培养液。

纯品的活性按大鼠重量增长法进行测定，最后以国际标淮品校正活性单位。生物活性检测目的蛋白比活性达7000IU/mg。

纯化后重组人促卵泡生长激素可用常规技术制成各种剂型。

在本发明的一个实例中，构建了生产重组人促卵泡生长激素的CHO表达工程细胞，高水平分泌表达。

在本发明的另一个实例中，经过培养工艺的优化，进一步提高了重组人促卵泡生长激素的表达量。

在本发明的另一个实例中，培养上清经离心收集上清，再经一系列纯化步骤后可得到纯品120mg/L。

纯化后原液加入适当辅料，制成重组人促卵泡生长激素的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明，该粉针剂稳定。

中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升培养液可获得重组人促卵泡生长激素纯品120mg，适合产业化生产。

本发明的优点在于：

(1)选用的是CHO宿主细胞(dhfr^-)，通过MTX压力筛选出高表达工程细胞。

(2)优化后的重组人促卵泡生长激素蛋白基因非常适合在CHO(dhfr^-)宿主细胞中表达，具有高表达、高稳定的特点。

(3)通过控制关键的培养工艺条件，使表达水平达到500mg/L。

(4)通过纯化工艺的优化，每升培养液可获得120毫克以上、纯度大于98％重组人促卵泡生长激素。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1表达质粒的构建和高表达工程细胞株的获得

根据人促卵泡生长激素天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，全基因合成重组人促卵泡生长激素蛋白的目的基因序列(SEQ ID NO：1)，该优化的FSH基因序列与天然的FSH基因序列同源性为93％(见图1)。将该基因克隆到pET-30a(+)中并测序验证。

表达载体构建方法见图2。通过PCR扩增得到目的人促卵泡生长激素基因，用Nde I和EcoR I双酶切分别处理基因IL-4的PCR回收产物和质粒pET30a(+)，酶切后回收相应的片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。连接产物转染CHO细胞，在含有卡那霉素的LB平板上挑选抗性阳性的克隆，抽提质粒DNA，并进行质粒酶切鉴定。得到在pET30a(+)中插入了IL-4基因的重组质粒pET30a(+)/IL-4。

将构建好的表达质粒pET30a(+)/IL-4转化进入已制备好的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布含30μg/mL卡那霉素的LB平板，然后在转化平板上挑取单克隆，用碱裂解法抽提并检测质粒。将确证含有表达质粒pET30a(+)/IL-4的单克隆在含30μg/mL卡那霉素的LB平板上保存。

实施例2重组人促卵泡生长激素的表达及表达形式的确定

挑选一株确证好的表达工程细胞CHO/pET30a(+)/FSH，用α-MEM培养基(5％dFBS)进行培养，SDS-PAGE电泳检测上清是否有目的条带的出现，并分析其表达量。取一部分培养后的培养液离心，上清SDS-PAGE电泳检测，确定其表达形式。分析其上清和沉淀，目的蛋白绝大部分在上清中，表明目的蛋白是以分泌形式表达(见图3)。

实施例3重组人促卵泡生长激素的规模化培养

复苏1支冻存的细胞，接种于1个T-25方瓶中，2-3天后传代至1个T-75方瓶中，2-3天后传代至3个T-75方瓶，2-3天后传代至9个T-75方瓶中，2-3天后传代至4个转瓶中，2-3天后接种至2.2L反应器(工作体积1.1L)中，含血清培养基中培养，监测反应器中葡萄糖浓度的变化，待反应器中细胞耗糖量达到4g/天后改为无血清培养基灌注培养，根据细胞耗糖量调节灌流速度，待细胞基本不再消耗葡萄糖时停止培养，收集上清。

实施例4重组人促卵泡生长激素纯化

将发酵后的菌体重悬于20mM Tris，pH 8.0，缓冲液，在冰浴下高压匀浆破菌，离心收集沉淀，再用Tris缓冲液洗涤沉淀，得到包涵体，按1∶10的比例，将包涵体在6M盐酸胍溶液内变性溶解，变性后的蛋白溶液离心取上清；对含1mM还原型谷胱甘肽和0.1mM氧化型谷胱甘肽的5％蔗糖缓冲液透析，使目的蛋白复性；复性后的上清过SP-Seharose fast flow离子交换层析柱，用0-1M NaCl缓冲液梯度洗脱，分管收集洗脱蛋白峰；SP洗脱峰透析后，过Q-Sepharose fast flow离子交换层析柱，进行浓缩。15％SDS-PAGE电泳检测纯化过程目的蛋白的纯度及含量(见图5)。

经过以上纯化工艺，最后可得蛋白纯品120mg/L。

实施例5重组人促卵泡生长激素活性测定

以大鼠卵巢增重法检测rFSH的活性，纯化的重组人促卵泡生长激素的活性达7000U/mg。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海新生源医药研究有限公司

<120>重组人促卵泡生长激素的生产方法

<160>2

<210>1

<211>498

<212>DNA

<213>人工序列

<221>CDS

<222>(1)..(498)

<223>优化的重组人重组人促卵泡生长激素基因

<400>1

atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60

ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatac tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc 120

cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat 180

gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat 240

gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agattaacca tctgaagaca 300

gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg 360

cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420

tgtgcctgga ccattgtcag agtggaaatc ctaaggaact tttacttcat taacagactt 480

acaggttacc tcagaaac                                             498

<210>2

<211>203

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

APDVQ DCPEC TLQEN PFFSQ PGAPI LQCMG CCFSR AYPTP LRSKK TMLVQ KNVTS ESTCC VAKSY NRVTV

MGGFK VENHT ACHCS TCYYH KS NSCEL TNITI AIEKE ECRFC ISINT TWCAG CYTRD LVYKD PARPK IQKTC

TFKEL VYETV RVPGC AHHAS LYTYP VATQC HCGKC DSDST DCTVR GLGPS YCSF GEMK E

Claims (4)

1.一种高表达重组人促卵泡生长激素的工程细胞构建的方法，其特征在于，它包括步骤：

a.获得优化的重组人促卵泡生长激素的DNA序列；

b.构建合适表达载体；

c.转化宿主细胞，筛选获得高表达的工程细胞。

2.如权利要求1所述的一种高表达重组人促卵泡生长激素的工程细胞构建的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的优化的重组人促卵泡生长激素的DNA序列编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。较佳地，其为SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

3.如权利要求1所述的一种高表达重组人促卵泡生长激素的工程细胞构建的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的表达载体含有权利要求1所述的DNA序列。较佳地，所述的表达载体是pET30a(+)/FSH。

4.如权利要求1所述的一种高表达重组人促卵泡生长激素的工程细胞构建的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的工程细胞，含有权利要求3所述的表达载体或权利要求2所述的编码重组人促卵泡生长激素的DNA序列。较佳地，所述的工程细胞是CHO(dhfr^-)。

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