CN101340928A - 抑制补体激活的修饰的蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了调节补体系统的方法和化合物。特别地，本发明提供了抑制补体激活的化合物及促进补体激活的化合物。所述化合物通过其对补体系统的作用而是治疗剂。因此，抑制补体激活的化合物可用于治疗缺血－再灌注疾病，包括心肌梗塞和中风、脓毒症、自身免疫疾病、炎症疾病及具有炎症成分的疾病，包括阿尔茨海默病及其它神经变性疾病。

Description

抑制补体激活的修饰的蛋白酶
相关申请
本申请要求Edwin Madison于2005年10月21日提交的、题为“MODIFIED PROTEASES THAT INHIBIT COMPLEMENT ACTIVATION”的美国临时申请Serial No.60/729,817的优先权。当允许时，这一申请的主题全文引入本文。
本申请与也要求了美国临时申请Serial No.60/729,817的优先权的、Edwin Madison，Jack Nguyen，Sandra Waugh Ruggles和Christopher Thanos于2006年10月20日提交的、题为“MODIFIED PROTEASES THAT INHIBITCOMPLEMENT ACTIVATION”的美国专利申请Serial No.(代理案卷号19049-003001/4903)相关。
本申请还与如下申请相关：2003年10月2日提交的、题为Methods ofGenerating and Screening for proteases with Altered Specificity的美国申请Serial No.10/677,977；2005年4月12日提交的、题为Cleavage of VEGF andVEGF Receptor by Wild-Type and Mutant MTSP-1的美国申请Serial No.11/104,110；2005年4月12日提交的、题为Cleavage of VEGF and VEGFReceptor by Wild-Type and Mutant protease的美国申请Serial No.11/104,111。
当允许时，每一上述申请的主题均全文引入本文。
发明领域
本发明提供了调节补体系统的方法及化合物。本发明特别提供了抑制补体激活的化合物及促进补体激活的化合物。所述化合物由于其对于补体系统的作用而是治疗剂。因此，抑制补体激活的化合物可用于治疗缺血性和再灌注疾病，包括心肌梗塞和中风、脓毒症、自身免疫疾病、炎症疾病及具有炎症成分的疾病，包括阿尔茨海默病及其它神经变性疾病。
背景
补体(C)系统是免疫系统的一部分，在消除侵入的病原体和引发炎症应答中起作用。人及其它哺乳动物的补体系统包括30种以上的可溶和膜结合的蛋白质，参与一系列顺序反应，导致补体激活。血液补体系统具有与广谱宿主防御机制相关的众多功能，包括抗微生物和抗病毒作用。衍生自C成分激活的产物包括非自身识别分子C3b、C4b和C5b，以及影响多种细胞免疫应答的过敏毒素C3a、C4a和C5a。这些过敏毒素也发挥促炎剂作用。
补体系统由一系列酶和非酶蛋白质及受体组成。补体激活是通过已知的“经典”途径、“旁路”途径和“凝集素”途径的三种主要模式之一而发生的(见图1)。这些途径可以通过引发补体激活的过程而区分。经典途径是通过抗体-抗原复合物或者聚集形式的免疫球蛋白而引发的；旁路途径是通过微生物和细胞表面上的结构识别而引发的；凝集素途径是抗体非依赖性途径，通过甘露聚糖结合凝集素(MBL，也称作甘露糖结合蛋白)与碳水化合物如细菌或病毒表面上展示的那些碳水化合物的结合而引发的。该级联反应的激活导致产生参与蛋白酶解或细胞裂解的复合物以及参与调理作用、过敏反应和趋化性的肽。
补体级联反应是动物免疫应答的重要成分，是不可逆的级联。许多蛋白质辅因子调节该过程。不适当的调节、典型是不适当的激活该过程是包含不适当的炎症应答(如在急性和慢性炎症疾病中观测到的那些应答)的多种病变的一方面或者可以发生这样的病变。这些疾病和病症包括自身免疫疾病，如类风湿性关节炎和狼疮，心血管疾病及其它炎症疾病，如脓毒症和缺血-再灌注损伤。
由于补体途径参与许多疾病和病症，因此补体途径的成分是治疗干预的靶位，特别是抑制该途径的靶位。这种治疗的例子包括合成的和天然的小分子治疗剂，抗体抑制剂，及重组可溶形式的膜补体调节蛋白。制备这种治疗剂的策略受到许多限制。小分子在体内具有短的半寿期，需要持续注入以保持补体抑制作用，从而限制了其作用、尤其在慢性疾病中的作用。治疗性抗体在对象中产生免疫应答，并因此可以在治疗特别是在调节免疫应答的治疗中引起并发症。因此，还需要用于治疗补体介导的疾病及其中补体激活起作用的疾病的治疗剂。这些疾病包括急性和慢性炎症疾病。因此，本发明的一个目的是提供靶向补体级联激活的这种治疗剂及提供治疗疾病的治疗剂和方法。
概述
本发明提供了靶向补体级联激活的治疗剂和方法及治疗疾病包括急性和慢性炎症疾病的方法。所述治疗剂是靶向补体途径底物的非补体蛋白酶。所述非补体蛋白酶包括未修饰的蛋白酶，其裂解其天然底物以及补体底物，及修饰的蛋白酶，其对于靶底物具有增加的选择性或底物特异性。所述修饰的蛋白酶对于其天然底物可呈现降低或改变的活性。
本发明提供的方法是调节补体激活的方法，所述方法是将非补体蛋白酶与补体途径的任一或多种如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30或更多种靶底物接触，从而靶底物蛋白质被裂解，由此改变包含所述靶底物的途径中的补体激活。本发明还提供了蛋白酶在治疗和/或配制药物中的应用。这些方法及本文提供的任何方法和应用中的靶底物是补体蛋白质，包括：C1q、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子B、因子D、因子P、MASP-1、MASP-2、C1r、C1s、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、Bb和纤维胶凝蛋白(ficolin)。所述接触可以是离体(ex vivo)、在体外和/或在体内进行。示例的靶位包括具有SEQ ID NO：298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340、344、660-662任一所示氨基酸序列的那些靶位，及呈现补体途径活性的任何靶位片段，或者其等位基因或物种变体，或者具有60、70、80、85、90、95、96、97、98、99％或更高序列相同性的多肽。
对于本文提供的所有方法和应用而言，所述靶底物可以存在于体液或者组织样品中，或者可以是靶底物的集合或者含有这种底物的任何其他组合物。根据靶底物，补体激活可以被抑制或激活。所述方法靶向一或多个补体途径。因此，调节的补体途径可以选自补体的经典途径、旁路途径和凝集素途径的一或多个。非补体蛋白酶与未修饰的蛋白酶或支架蛋白酶相比在任一或多个氨基酸残基如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或更多个残基含有修饰。修饰的氨基酸残基增加了对于靶底物的特异性或者对于靶底物的活性之一或者二者。未修饰的蛋白酶或支架蛋白酶的例子包括任一种丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，例如粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶(chymase)、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白质C、u-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤解酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶(cruzain)、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。例如，所述支架蛋白酶包含如下任一氨基酸序列或其催化活性部分、其等位基因和物种变体及具有60、70、80、85、90、95、96、97、98、99％或更高序列相同性的多肽：SEQ ID NO：2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、377、379、381、383、385、387、547、549及551。MT-SP1或其片段，如SEQ ID NO：2和10分别所示的多肽序列，是一种支架蛋白酶实例。补体途径的C2或C3蛋白质是MT-SP1蛋白酶、修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分的示例靶底物。
MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分的修饰包括在第146、224、41和/或151位的修饰(基于糜蛋白酶编号)。这种修饰的MT-SP1蛋白酶包括具有基于糜蛋白酶编号如下任一修饰的那些蛋白酶：I41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、及I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N及I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。特别地，修饰的MT-SP1含有氨基酸修饰I41T/Y146D/G151L/K224F。
所述修饰可以是在有助于扩展的底物特异性或者相互作用的二级位点的任一或多个氨基酸中，例如，基于糜蛋白酶编号在相应于MT-SP1蛋白酶的97、146、192和224任一或多个氨基酸位置的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰。这种修饰的例子是基于糜蛋白酶编号的MT-SP1蛋白酶的一或多个F97、Y146、Q192和K224的修饰，如F97D、F97E、F97A、F97W、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q192R、Q192V、K224A和K224F。这种修饰的MT-SP1蛋白酶的例子包括具有SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、14、38和40及405-418所示任一氨基酸序列的那些多肽。修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分的其它例子包括氨基酸修饰Y146D/K224F或Y146E，如相应于具有SEQID NO：12、404、28或412所示氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽的那些蛋白酶。
MT-SP1蛋白酶及其催化活性部分包括含有基于糜蛋白酶编号如下一或多种修饰的多肽：F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、F97W、F99A、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、Y146D/K224F、D96A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。这种修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分的例子包括具有SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659或663-710所示任一氨基酸序列的那些多肽。特别地，修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分是具有SEQ ID NO：596或650所示氨基酸序列的一种。
对于本文提供的所有方法和应用而言，可以选择修饰以便所述修饰的蛋白酶如MT-SP1裂解靶底物的底物识别位点。靶底物是任一的上述补体途径多肽并且为本领域技术人员所已知，包括例如C2和/或C3。例如，在靶底物是C2的情况中，所述底物识别位点包括氨基酸序列SLGR(SEQ IDNO：392)。
本文提供的方法和应用中靶向的其它识别位点包括因子I底物识别位点，如LPSR(SEQ ID NO：388)、SLLR(SEQ ID NO：389)或HRGR(SEQ IDNO：390)。MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰可以相应于基于糜蛋白酶编号的MT-SP1蛋白酶第174、217、96、192、146或99位的任一或多个氨基酸位置，如基于糜蛋白酶编号MT-SP1蛋白酶的Q174、D217、D96、Q192、Y146和F99的任一或多个氨基酸。这种修饰的例子是选自如下的一或多种修饰：Q174H、D217Q、D217N、D217H、D96A、D96V、D96F、D96S、D96T、Q192L、Q192I、Q192F、Y146F、F99A、F99V、F99S及F99G(见例如具有SEQ ID NO：41-57或419-435所示任一氨基酸序列的多肽)。
另一识别位点包括氨基酸序列LPSR。针对其识别而加以修饰的修饰的蛋白酶的例子是：在相应于基于糜蛋白酶编号的MT-SP1蛋白酶的第174、180、215、192或99位的任一或多个氨基酸例如基于糜蛋白酶编号在MT-SP1蛋白酶的Q174、M180、W215、Q192或F99的任一或多个氨基酸位置的位点具有修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分。这种修饰的例子是任一或多个Q174F、Q174V、Q174L、Q174Y、M180E、W215F、W215Y、Q192K、Q192R、Q192Y及F99Y(见例如具有SEQ ID NO：36、58、59、61、62、69、416、436、437、439、440、447或524-533所示任一氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽)。
用于本发明方法中的另一底物识别位点包括氨基酸序列HRGR。具有识别这种位点的修饰的蛋白酶的例子是具有以下修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分，所述修饰是在相应于基于糜蛋白酶编号的MT-SP1蛋白酶的第215、174、217、192和99位例如基于糜蛋白酶编号在MT-SP1蛋白酶的W215、Q174、D217、Q192和F99的任一或多个氨基酸位置的修饰。所述修饰的例子是选自任一或多个W215F、W215Y、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、D217A、D217V、Q192E、F99W和F99Y(例如相应于含有SEQ ID NO：58-69和436-447所示任一氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分)。
本发明提供了治疗补体介导的疾病和其症状通过调节补体途径而改善的疾病的方法，所述补体途径包括经典、旁路和凝集素途径的一或多个途径。在实施本发明的方法中，将一或多种非补体蛋白酶与一或多种靶底物接触，如通过在体外、体内或离体给予，从而所述非补体蛋白酶裂解补体途径的任一或多种靶底物，由此包含所述靶底物的途径中的补体激活被改变。本发明还提供了非补体蛋白酶在治疗这类疾病和病变和/或配制进行这种治疗的药物中的应用。调节包括抑制或增强(增加)补体激活。补体激活的抑制可以导致与补体介导的病变相关的炎症症状的减少。炎症疾病的例子是神经变性疾病和心血管疾病，例如但非限于脓毒症、类风湿性关节炎(RA)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(IC)-介导的急性炎症性组织损伤、阿尔茨海默病(AD)、缺血-再灌注损伤和Guillan-Barre综合征。补体介导的疾病可以是对对象进行的治疗所导致。缺血-再灌注损伤可以是选自如下的事件或治疗所引起的：心肌梗塞(MI)、中风、血管成形术、冠状动脉旁路搭桥术、心肺转流术(CPB)及血液透析。
本发明提供的治疗方法可以通过在治疗对象明显病变之前给予对象非补体蛋白酶而实现。正如所指出的，可以通过将体液或者组织样品在体外、离体或在体内与非补体蛋白酶接触而实现给予。补体介导的缺血-再灌注损伤是这种病变的一个例子。导致这种病变的治疗是血管成形术或冠状动脉旁路搭桥术。
正如上文所述，在本文提供的任何方法和应用中，靶底物包括一或多种C1q、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子B、因子D、因子P、MASP-1、MASP-2、C1r、C1s、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、Bb和纤维胶凝蛋白，如含有SEQ ID NO：298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340或344所示任一氨基酸序列或其呈现补体活性的片段的底物。
在这些方法和应用及本文提供的所有方法和应用中，所述非补体蛋白酶与未修饰的蛋白酶或支架蛋白酶相比较可包括在任一或多个氨基酸残基的修饰，其中修饰的氨基酸残基增加对于靶底物的特异性或者对于靶底物的活性或者这二者。未修饰的蛋白酶或支架蛋白酶包括任一种丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，如粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白质C、u-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。例子是含有或具有如下任一氨基酸序列的那些蛋白酶：SEQ ID NO：2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、377、379、381、383、385、387、547、549和551及其催化活性部分。MT-SP1是本发明提供的一种支架蛋白酶实例并如上文描述。裂解可靶向于上述识别序列。本文描述的任何修饰的MT-SP1包括如上述任何MT-SP1可用于治疗方法中。用于本文提供的治疗中的修饰的MT-SP1多肽或其催化活性部分的例子包括具有SEQ IDNO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659或663-710所示任一氨基酸序列的任何多肽或其催化活性部分。特别地，用于本文提供的治疗中的MT-SP1多肽或其催化活性部分具有SEQ ID NO：596或650所示氨基酸序列。
在本文提供的任何或所有方法和应用中，非补体蛋白酶或其催化活性部分可以与治疗补体介导的疾病或任何其它疾病的另一种药物或治疗组合给予。所述另一种药物或治疗可以与所述非补体蛋白酶同时、相继、或交替给予。所述另一种药物可以作为单独的组合物或者与所述非补体蛋白酶于同一组合物中给予。另一种药物的例子是抗炎剂和抗凝血剂，例如但非限于任一或多种NSAID、抗代谢物、皮质类固醇、镇痛药、胞毒剂、促炎细胞因子抑制剂、抗炎细胞因子、B细胞靶向剂、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、PPAR-γ配体、补体抑制剂、肝素、华法林、醋硝香豆素(acenocoumarol)、苯茚二酮、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、阿加曲班(argatroban)、来匹卢定(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)和希美加群(ximelagatran)。
本发明还提供了非补体蛋白酶及其它成分的组合物，如试剂、另一些药物，及给予所述蛋白酶和/或药剂及任何其它成分的装置和容器。所述组合物可以实施或实现本文提供的方法和应用。因此本发明提供的组合物成分例如包括：(a)裂解补体途径的任一或多种补体靶底物的非补体蛋白酶，由此包含所述靶底物的途径中的补体激活被改变；及(b)治疗补体介导的疾病的另一种药物，例如但非限于抗炎剂或抗凝剂，例如任一或多种NSAID、抗代谢物、皮质类固醇、镇痛药、胞毒剂、促炎细胞因子抑制剂、抗炎细胞因子、B细胞靶向剂、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、PPAR-γ配体、补体抑制剂、肝素、华法林、醋硝香豆素、苯茚二酮、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定和希美加群。
正如所指出的，所述组合物用于实施或实现本文所述调节补体途径的任何方法，所述补体途径如补体的经典途径、旁路途径或凝集素途径的一或多个。靶底物和支架蛋白酶包括上述那些任何靶底物和支架蛋白酶。例如，支架蛋白酶包括表14所示任何蛋白酶及表14所示蛋白酶的等位基因变体、同工型和催化活性部分。这种蛋白酶的例子包括具有或含有如下所示任一氨基酸序列或其催化活性部分或其等位基因或物种变体的任何蛋白酶：SEQ ID NO：2、4、8、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、269、270、272、274、276、278、280、282、284、286、287、289、291、293、295、297、373、375、377、379、381、383、385、387、544、545、547、549和551。在一些实例中，所述组合物中使用的蛋白酶是MT-SP1或其催化活性部分，如SEQ ID NO：2或10所示MT-SP1，及上述变体。正如上文所述，MT-SP1蛋白酶及其催化活性部分包括含有基于糜蛋白酶编号的如下一或多种修饰的多肽：F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、F97W、F99A、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、Y146D/K224F、D96A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。这种修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分的例子包括具有SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659或663-710所示任一氨基酸序列的那些多肽。特别地，修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分具有SEQ ID NO：596或650所示氨基酸序列。在一些情况中，MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰包括有助于扩展的底物特异性或相互作用二级位点的任一或多个氨基酸的修饰。这种修饰的例子包括但非限于在相应于基于糜蛋白酶编号的MT-SP1蛋白酶第97、146、192和224位的任一或多个氨基酸位置的修饰。这种修饰的例子是基于糜蛋白酶编号在MT-SP1蛋白酶F97、Y146、Q192和K224的任一或多个氨基酸中的修饰，如MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自任一或多个F97D、F97E、F97A、F97W、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q192R、Q192V、K224A、和K224F(例如MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分相应于具有SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、14、38和40及405-418所示任一氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽和/或在Y146D和K224F或Y146E位置具有修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分，如具有SEQ ID NO：12、404、28或412所示氨基酸序列的那些修饰的MT-SP1多肽)。
在本发明提供的组合物和方法及应用中，所述非补体蛋白酶可裂解靶底物的底物识别位点。识别位点的例子如上文所述。
本发明还提供了特殊修饰的非补体蛋白酶。例如本发明提供了在支架蛋白酶的任一或多个氨基酸中含有修饰的非补体蛋白酶，其中所述修饰的氨基酸残基增加对于靶底物的特异性或对于靶底物的活性或者这二者，其中所述靶底物是补体蛋白质，如上述任何靶底物或其混合物及其原料。所述修饰的非补体蛋白酶包括上述任何合适的支架，如支架蛋白酶选自粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白质C、u-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。靶底物包括上述任何靶底物，例如但非限于C2和/或C3。
修饰的非补体蛋白酶的例子包括基于MT-SP1支架(全长或其催化活性部分)的那些蛋白酶。所述MT-SP1支架包括一个或者至少两或多个修饰，其中基于糜蛋白酶编号，一个修饰是在第146位，另一个修饰在第224位，条件是：
(i)在蛋白酶仅包括两个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括Y146D和K224F作为这两个修饰；及(ii)在蛋白酶含有三个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括F99V或I或L或T与Y146D和K224F。例如，这种修饰的非补体蛋白酶可含有至少两或多个修饰，基于糜蛋白酶编号，其中一个修饰在第146位，另一个修饰在第224位，条件是：(i)在蛋白酶仅包括两个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括Y146D和K224F作为这两个修饰；及(ii)在蛋白酶含有三个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括F99V或I或L或T与Y146D和K224F。MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分也包括在第141位和/或第41位含有一个或者至少两或多个修饰的修饰的蛋白质。上述任何修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分的例子包括含有基于糜蛋白酶编号的如下任何修饰的修饰的MT-SP1：I41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、和I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。
这种修饰的蛋白酶的例子包括具有选自如下基于糜蛋白酶编号的任一或多个修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分：D96A、D96V、D96F、D96F、D96S、D96T、F99S、F99G、Q174H、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、Q174L、Q174Y、Q192L、Q192I、Q192E、Q192K、Q192Y、D217Q、D217N、D217H、K224A。例子是含有或具有SEQ ID NO：41-51、56、57、60-64、67、419-429、431、434、435、438-442或445所示任一氨基酸序列的MT-SP1蛋白酶。
修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分的例子还包括具有基于糜蛋白酶编号的如下任一修饰的任何MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分：Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、及I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N及I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。这种蛋白酶的例子是具有如下所示任一氨基酸序列的任何蛋白酶：SEQ ID NO：41-51、56、57、60-64、67、69、419-429、431、434、435、438-442、445、524、525、527-530、532、533、552-659或663-710。特别地，修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分具有SEQ IDNO：596或650所示氨基酸序列。本发明提供的修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分是裂解靶底物、典型在靶底物的底物识别位点裂解靶底物的那些MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分。靶底物的例子包括C2或C3。C2的裂解可以在C2中的底物识别位点SLGR(SEQ ID NO：392)处。
在支架蛋白酶的任一或多个氨基酸中含有修饰的经修饰的非补体蛋白酶中，所述修饰的氨基酸残基增加对于靶底物的特异性或者低于靶底物的活性或者这二者，其中所述靶底物是一种补体蛋白质，与不具有修饰的相对比，这种具有修饰的修饰的非补体蛋白酶不裂解VEGF或VEGFR或者呈现VEGF或VEGFR的裂解活性降低或者呈现对于靶底物如补体蛋白质较对VEGF或VEGFR更高的底物特异性或活性。例如，所述非补体蛋白酶裂解补体蛋白质较其裂解VEGF或VEGFR具有至少或大约1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更高的特异性或活性。所述靶底物包括补体蛋白质，例如但非限于任一或多种C1q、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子B、因子D、因子P、MASP-1、MASP-2、C1r、C1s、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、  Bb和纤维胶凝蛋白。靶底物的例子包括但非限于含有如下所示任一个氨基酸序列或其呈现补体活性的片段的靶底物：SEQ ID NO：298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340和344。
支架蛋白酶包括任何蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或者金属蛋白酶，如表14列出的任何蛋白酶，及其等位基因和物种变体、同工型和催化活性部分，及其与本文表中或别处提供的任何蛋白酶具有60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％或更高序列相同性的修饰的形式，如含有如下所示任一氨基酸序列的支架蛋白酶或其催化活性部分：SEQ ID NO：2、4、8、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、269、270、272、274、276、278、280、282、284、286、287、289、291、293、295、297、373、375、377、379、381、383、385、387、544、545、547、549和551。所述支架可用于制备修饰的蛋白酶及用于本文所述任何方法或应用中。如上文所述，MT-SP1或其催化活性片段是这种蛋白酶的一个实例。MT-SP1蛋白酶或其一部分的一个例子具有SEQ IDNO：2或10所示氨基酸序列。修饰包括改变底物特异性或选择性的任何修饰，特别是增加底物对于补体蛋白质的特异性或选择性的那些修饰。这种修饰的例子是具有基于糜蛋白酶编号的如下任何修饰的MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分：D96A、D96V、D96F、D96F、D96S、D96T、F97D、F97E、F97A、F97W、F99A、F99S、F99G、F99W、F99Y、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q174H、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、Q174L、Q174Y、M180E、Q192R、Q192V、Q192L、Q192I、Q192F、Q192E、Q192K、Q192Y、W215F、W215Y、D217Q、D217N、D217H、D217A、D217V、K224A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F和I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N，及其等位基因和物种变体和同工型及与其具有60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％或更高序列相同性及包括相应修饰的变体。例如，修饰的MT-SP1多肽含有SEQ ID NOS：41-51、56、57、60-64、67、69、419-429、431、434、435、438-442、445、524、525、527-530、532、533、552-659、或663-710所示任一氨基酸序列。
本发明还提供了含有本发明提供的任何修饰的非补体蛋白酶或组合成分的药物组合物。如果需要，则所述药物组合物包括药物可接受的赋形剂及其它成分。根据任何希望的或合适的给予途径配制所述组合物，所述给予途径包括但非限于全身给予、口服、经鼻、肺、局部给予。
本发明提供了试剂盒。所述试剂盒可用于实施本发明方法。本发明提供了含有组合物的试剂盒。本发明还提供了含有药物组合物的试剂盒。所述试剂盒也可以含有给予所述组合物和/或蛋白酶的装置，及任选给药说明书及用于所述方法中的其它试剂和产品。
本发明还提供了编码任何修饰的非补体蛋白酶的核酸分子。这些核酸分子是编码或者在中等或高度严格条件下与编码SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659或663-710所示任何多肽的任何核酸杂交的核酸分子。这些核酸分子还包括选自如下的那些核酸分子：
a)包含SEQ ID NOS：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451-455、457-462、464-479和534-538所示任一核苷酸序列的核酸分子；
b)包含与SEQ ID NO：11、13、1 5、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451-455、457-462、464-479、534-538所示核苷酸序列具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％序列相同性的核酸分子；
c)在中等或高度严格条件下其全长的至少70％与包含SEQ ID NOS：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451-455、457-462、464-479、534-538所示任何核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸；
d)包含a)、b)或c)的简并密码子的核酸分子；或者
e)包含SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451-455、457-462、464-479、534-538或者a)-d)任一的剪接变体或等位基因变体的核酸分子，或者
核酸分子选自如下之中：
a)包含SEQ ID NO：480-493、495-499、501-506、508-523、539-543所示任何核苷酸序列的核酸分子；
b)包含与SEQ ID NO：480-493、495-499、501-506、508-523、539-543所示核苷酸序列具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％序列相同性的核酸分子；
c)在中等或高度严格条件下其全长的至少70％与包含SEQ ID NO：480-493、495-499、501-506、508-523、539-543所示任何核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸；
d)包含a)、b)或c)的简并密码子的核酸分子；或者
e)包含SEQ ID NO：480-493、495-499、501-506、508-523、539-543或者a)-d)任一的剪接变体或等位基因变体的核酸分子。
含有所述核酸分子的载体。载体包括真核表达载体和原核表达载体，包括哺乳动物和酵母载体。本发明还提供了含有所述核酸分子和/或载体的细胞。表达载体的例子包括但非限于：腺病毒载体、腺伴随病毒载体、EBV、SV40、巨细胞病毒载体、痘苗病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和人工染色体。本文还提供了产生或制备编码的非补体蛋白酶的方法。所述载体或核酸分子被导入细胞中并在一定条件下培养，从而表达所述蛋白酶。所述核酸分子可包括编码指导表达的蛋白酶交通(trafficking)的信号序列例如分泌信号序列的序列。可以通过本领域技术人员已知的常规方法纯化表达的蛋白酶。
本发明提供了通过给予对象核酸分子、载体或细胞的治疗方法。所治疗的疾病包括由补体蛋白质或者补体途径介导或参与的任何疾病，如具有潜在炎症成分或病理学的疾病。载体包括整合进宿主细胞染色体的表达载体或者保留附加体的载体。给予可以是体内给予或离体给予。离体治疗包括将所述核酸在体外给予细胞，随后将所述细胞给予对象。所述细胞可以来自合适的(相容的)供体或者来自治疗对象如人。
本发明还提供了融合蛋白，其含有与非蛋白酶多肽融合的任何非补体蛋白酶的催化活性部分。融合可以通过在任一末端插入非蛋白酶多肽或键而实现。
附图简述
图1描述了经典、凝集素和旁路补体途径及终末补体复合物膜攻击复合物(MAC)的激活。图中特别示出参与补体级联的30种以上的蛋白质、它们在该级联中的作用及在合适情况中它们在补体途径中的会聚点(points ofconvergence)。例如，这三个途径集中于C3转变酶的产生，其裂解C3形成C5转变酶，导致MAC复合物形成。图中还描述了许多补体裂解产物的产生。所述途径中描述的所有蛋白质均可作为靶底物。
详细描述
概述
A.定义
B.靶：补体
1.命名法
2.补体开始途径
a.经典途径
b.旁路途径
c.凝集素途径
3.补体介导的效应功能
a.补体介导的裂解：膜攻击复合物
b.炎症
c.趋化性
d.调理作用
e.体液免疫应答的激活
4.补体受体
5.补体调节
a.因子I
6.补体介导的疾病
a.由补体激活介导的疾病
i.类风湿性关节炎
ii.脓毒症
iii.多发性硬化
iv.阿尔茨海默病
v.缺血-再灌注损伤
b.由补体缺陷介导的疾病
C.蛋白酶
1.蛋白酶的分类
a.丝氨酸蛋白酶
i.MT-SP1
ii.粒酶B
b.半胱氨酸蛋白酶
c.天冬氨酸蛋白酶
d.金属蛋白酶
e.苏氨酸蛋白酶
D.支架蛋白酶
1.修饰的支架蛋白酶
a.合理修饰
i.位置扫描库的合成及使用荧光筛选
b.经验修饰
2.评估特异性的方法
3.蛋白酶多肽
a.MT-SP1多肽
E.评估或监测修饰的蛋白酶对补体介导的功能的活性的分析方法
a.蛋白质检测
i.SDS-PAGE
ii.酶免疫测定
iii.放射免疫扩散法(RID)
b.溶血反应
F.产生编码修饰的蛋白酶的核酸的方法及产生修饰的蛋白酶多肽的方法
1.载体和细胞
2.表达
a.原核生物
b.酵母
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化技术
4.融合蛋白
5.核苷酸序列
G.使用方法：配制/包装/给予
1.修饰的蛋白酶多肽的给予
2.编码修饰的蛋白酶多肽的核酸的给予(基因治疗)
H.治疗应用
1.免疫介导的炎症疾病
2.神经变性疾病
3.心血管疾病
I.组合治疗
J.实施例
A.定义
除非特别指出，则本文的所有技术和科学术语均具有本发明所属技术领域技术人员通常理解的相同含义。除非特别指出，则本文提及的所有专利、专利申请、公布的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站及其它公开的材料均以其全部内容并入作参考。在文中的术语有多种含义的情况中，在本文中使用其常用含义。当引用URL或其他标识符或地址时，应理解这种标识符可能改变并且因特网上特定信息可能变来变去，但是相同信息可以通过搜索因特网发现。这种引用证实了这种信息的可获得性和公开传播。
如本文所用，MBL(甘露糖结合凝集素)也称作甘露糖结合蛋白(MBP)。
如本文所用，补体激活是指由多种激活物包括例如抗原-抗体复合物、脂多糖或者微生物多糖引发的血清成分C1至C9的相继激活，通过任何途径而产生炎症应答。
如本文所用，“补体蛋白”或者“补体成分”是补体系统蛋白质，其在对抗感染和炎症过程的宿主防御中发挥作用。补体蛋白构成本文提供的蛋白酶及修饰的蛋白酶的靶底物。
补体蛋白是在所有脊椎动物中发现的一组相互作用血液蛋白质和糖蛋白。除了结合补体反应产物及在炎症细胞和免疫系统细胞上出现的细胞表面受体之外，有至少30种可溶的血浆蛋白质。另外，还具有保护宿主细胞免于意外补体攻击的调节性膜蛋白。补体蛋白包括在经典途径中发挥作用的那些蛋白质，例如C2；在旁路途径中发挥作用的那些蛋白质，例如因子B；及在凝集素途径中发挥作用的那些蛋白质，例如MASP-1。在这些补体蛋白质中是蛋白酶参与补体途径。另外，如本文所用，补体蛋白包括任何“裂解产物”(也称作“片段”)，其是基于补体级联的激活而形成。补体蛋白还包括无活性或改变形式的补体蛋白，如iC3和C3a-desArg。
因此，补体蛋白包括但非限于：C1q、C1r、C1s、C2、C3、C3a、C3b、C3c、C3dg、C3g、C3d、C3f、iC3、C3a-desArg、C4、C4a、C4b、iC4、C4a-desArg、C5、C5a、C5a-des-Arg、C6、C7、C8、C9、MASP-1、MASP-2、MBL、因子B、因子D、因子H、因子I、CR1、CR2、CR3、CR4、备解素、C1Inh、C4bp、MCP、DAF、CD59(MIRL)、簇蛋白和HRF及任何补体蛋白的等位基因变体和物种变体。
如本文所用，“天然”形式的补体蛋白是在不存在补体激活的条件下可分离自生物体如脊椎动物的补体蛋白，其未在实验室中人为有意修饰。天然补体蛋白的例子包括C1q、C1r、C1s、C2、C3、C4、因子B、因子D、备解素、C5、C6、C7、C6和C9。
通常地，天然补体蛋白是无活性的，在激活的基础上获得活性。激活可需要活化裂解、成熟裂解和/或与其它蛋白质的复合物形成。一个例外是因子I和因子D，在其天然形式就具有酶活性。在一些实例中，天然补体蛋白的激活在蛋白质裂解后发生。例如，补体酶原如C2和因子B是通过蛋白酶裂解自身激活的蛋白酶，如此C2由蛋白酶C1s裂解产生C2b，C2b与C4b结合形成具有蛋白酶解活性的C4b2b(C3转变酶)，蛋白酶因子D裂解因子B产生Bb，其与C3b结合形成蛋白酶解活性的另一种C3转变酶，C3bBb。在另一个实例中，无活性的天然补体蛋白的裂解导致蛋白质的结构稳定性改变，导致该蛋白质激活。例如，C3和C4含有内部硫酯键，其在天然蛋白质中是稳定的，但是在蛋白质裂解所致构象变化之后可以变为高度反应性和活性的。因此，C3和C4的裂解产物是生物学活性的。C3和C4的激活也可在无裂解的情况中自发发生。这是天然C3中硫酯键的自发转化，这是补体旁路途径的引发事件。在其它实例中，天然补体蛋白的激活在释放出抑制其它活性天然补体蛋白的活性的复合调节分子之后发生。例如，C1inh结合并失活C1s和C1r，除非它们与C1q复合。
如本文所用，成熟裂解是指酶原激活所需的任何裂解的统称。其包括导致构象变化而产生活性的裂解(即活化裂解)。其还包括其中关键的结合位点被暴露或者位阻被暴露或者抑制性节段被除去或移动的裂解。
如本文所用，改变形式的补体蛋白是指以对其分子结构进行修饰获得的非天然形式存在的补体蛋白。例如，硫酯与水的C3反应可以在无转变酶裂解的条件下发生，产生称作iC3和iC4的水解无活性形式的C3和C4。在另一个实例中，过敏毒素(包括C3a、C5a和C4a)可以通过羧肽酶N脱精氨酸化(desarginated)为更稳定、更低活性形式。
如本文所用，补体蛋白的“片段”或“裂解产物”是含有天然补体蛋白多肽序列一部分的补体蛋白亚组(subset)。补体蛋白的片段通常在任一或多个如1、2或3个补体级联激活之后获得。通常，片段得自天然补体蛋白的蛋白酶解裂解。例如，因子B由因子D酶解，产生两个片段：组成B的N末端部分的Ba，组成C末端部分并含有丝氨酸蛋白酶位点的Bb。补体蛋白的片段也得自补体蛋白另一片段的蛋白酶解。例如，C3b是由C3裂解产生的片段，其由因子I裂解产生片段iC3b和C3f。通常补体蛋白的裂解产物是生物学活性产物，发挥裂解补体系统效应分子的作用。因此，补体蛋白的片段或一部分包括补体蛋白的裂解产物，也包括保留或呈现至少一种活性的蛋白质的部分。
如本文所用，“裂解效应分子”或者“裂解效应蛋白”是指由于补体系统的触发的酶级联的结果而产生的活性裂解产物。裂解效应分子、得自补体激活的片段或裂解产物可助于任一或多种补体介导的功能或活性，包括调理作用、过敏反应、细胞裂解和炎症。裂解或效应分子的例子包括但非限于C3a、C3b、C4a、C4b、C5a、C5b-9和Bb。补体系统的裂解效应分子依靠参与级联而呈现活性，包括刺激炎症、促进抗原吞噬和直接裂解一些细胞。补体裂解产物促进或参与补体途径的激活。
如本文所用，过敏毒素(例如C3a、C4a或C5a)是触发参与炎症应答特别是作为防御寄生虫的一部分的肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱粒(从中释放物质)的裂解效应蛋白。如果脱粒太强，则其可导致过敏反应。过敏毒素也间接介导平滑肌细胞痉挛(如支气管痉挛)，增加毛细血管的通透性和趋化性。
如本文所用，趋化性是指受体介导的白细胞向化学引诱物方向运动，典型是其浓度增加的方向，如过敏毒素浓度增加的方向。
如本文所用，调理作用是指病原体或其它颗粒的表面的改变，由此其被吞噬细胞吞噬。结合或改变病原体表面的蛋白质被称作调理素。抗体和补体蛋白使胞外细菌易受调理素的作用，以被吞噬细胞如嗜中性粒细胞和巨噬细胞摄取和破坏。
如本文所用，细胞裂解是指通过破坏细胞壁或细胞膜而分裂细胞。红细胞溶血是细胞裂解的一个测量标准。
如本文所用，“蛋白酶”和“肽酶”可互换用于描述催化共价肽键水解的酶。这些名称包括其酶原形式及激活的单链、双链和多链形式。为清晰而见，提及蛋白酶是指所有形式。蛋白酶包括例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，根据其活性位点的催化活性和裂解靶底物的肽键的机制而定。
如本文所用，酶原是指通过蛋白酶解激活的蛋白酶，所述蛋白酶解包括成熟裂解如活化裂解和/或与其它蛋白质和/或辅因子的复合物形成。酶原是蛋白酶解酶的无活性前体。这种前体通常比活性形式更大，尽管非必需更大。对于丝氨酸蛋白酶，通过特异性裂解包括催化和自身催化裂解或者通过结合激活辅因子而产生活性酶，酶原被转变为活性酶。因此，酶原是一种酶无活性的蛋白质，通过激活物的作用而被转变为蛋白酶解酶。裂解可以是自身催化实现的。许多补体蛋白是酶原，它们是无活性的，但是基于感染后补体系统引发而变为裂解和激活的。酶原通常是无活性的，通过对酶原的前区(proregion)进行催化或者自身催化裂解而可被转变为成熟活性多肽。
如本文所用，“前区”、“前肽(propeptide)”或“前序列(pro sequence)”是指被裂解产生成熟蛋白质的区域或节段。这可以包括通过掩蔽催化机制并因此阻止催化中间物形成(即通过空间位阻底物结合位点)而发挥抑制酶活性功能的节段。前区是位于成熟的生物学活性多肽的氨基末端的氨基酸序列，可以小如几个氨基酸或者可以是多结构域结构。
如本文所用，活化序列是指酶原中为形成活性蛋白酶所需活化裂解或成熟裂解的部位的氨基酸序列。活化序列的裂解可以是自身催化裂解或者通过激活配偶体而裂解。
活化裂解是一种成熟裂解，其中发生为活性所需的构象改变。这是一种经典的活化途径，例如，对于丝氨酸蛋白酶，其中裂解产生新的N末端，其与催化机构的保守区如催化残基相互作用，诱导为活性所需的构象改变。活化可以导致多链形式的蛋白酶产生。在一些情况中，单链形式的蛋白酶可呈现与单链相同的蛋白酶解活性。
如本文所用，结构域是指分子如蛋白质或编码核酸的一部分，其与所述分子的其它部分在结构上和/或功能上不同，是可鉴别的。
如本文所用，蛋白酶结构域是蛋白酶的催化活性部分。提及的蛋白酶的蛋白酶结构域包括任何这些蛋白质的单链、双链和多链形式。蛋白质的蛋白酶结构域含有所有该蛋白质蛋白酶解活性所需的所有必需性质，例如其催化中心。
如本文所用，蛋白酶的催化活性部分是指保留蛋白酶活性的蛋白酶结构域或其任何片段或一部分。显然，至少在体外，所述单链形式的蛋白酶及其催化结构域或蛋白酶解活性部分(典型C末端截短)呈现蛋白酶活性。
如本文所用，“编码蛋白酶结构域或其催化活性部分的核酸”是指仅编码所述单链蛋白酶结构域或其活性部分而不编码该蛋白酶其它邻近部分作为连续序列的核酸。
如本文所用，基本上由蛋白酶结构域组成的多肽是指所述多肽的仅一部分是蛋白酶结构域或其催化活性部分。所述多肽可任选及通常包括例外的非蛋白酶衍生的氨基酸序列。
如本文所用，“S1-S4”是指形成底物的P1-P4残基的结合位点的氨基酸残基(见例如Schecter and Berger(1967)Biochem Biophys Res Commun27：157-162)。S1-S4的每一个均含有1、2或多个残基，其可以是不连续的。这些位点从是识别位点N末端至蛋白酶解位点相继编号，称作易断裂键。
如本文所用，术语“P1-P4”和“P1’-P4”是指底物肽中分别与S1-S4和S1’-S4’残基特异性相互作用及被所述蛋白酶裂解的残基。P1-P4是指位于裂解位点N末端侧的残基位置；P1’-P4’是指位于裂解位点C末端侧的残基位置。氨基酸残基从多肽底物的N末端至C末端标记(Pi，...，P3，P2，P1，P1′，P2′，P3′，...，Pj)。标示出各自的结合亚位点(Si，...，S3，S2，S1，S1′，S2′，S3′，...，Sj)。所述裂解是在P1与P1’之间催化。
如本文所用，“结合口袋”是指与底物上一或多个特定氨基酸相互作用的一或多个残基。“特异性口袋”是较其它口袋提供更多能量的结合口袋(最重要的或者占优势的结合口袋)。典型地，所述结合步骤在为发生催化过程必需的过渡状态形成之前。S1-S4和S1’-S4’氨基酸组成底物序列结合口袋并通过分别与肽、多肽或蛋白质底物的P1-P4和P1’-P4’氨基酸相互作用而促进底物识别。蛋白酶是否与底物相互作用是S1-S4和S1’-S4’位置中的氨基酸的函数。如果任一或多个S1、S2、S3、S4、S1’、S2’、S3’和S4’亚位点中的氨基酸与底物中P1、P2、P3、P4、P1’、P2’、P3’和P4’位点中的任一或多个氨基酸相互作用或识别其，则所述蛋白酶可裂解该底物。结合口袋将靶氨基酸与蛋白酶定位在一起，以便实现肽键的催化和底物的裂解。例如，丝氨酸蛋白酶典型识别底物中P4-P2’位点；其它蛋白酶可具有超过P4-P2’的扩展识别。
如本文所用，“有助于扩展底物特异性”的氨基酸是指除了特异性口袋之外在活性位点裂缝中的那些残基。这些氨基酸包括蛋白酶中的S1-S4、S1’-S4’残基。
如本文所用，相互作用的二级位点在活性位点裂缝之外。这些可有助于底物识别和催化作用。这些氨基酸包括可有助于与底物的第二和第三层相互作用的氨基酸。例如，S1-S4周围的蛋白酶结构中的环。S1’-S4’氨基酸在底物中定位P1-P4、P1’-P4’氨基酸中起作用，从而指示蛋白酶活性位点中的易断裂的键。
如本文所用，蛋白酶的活性位点是指其中发生底物催化作用的底物结合位点。活性位点的结构和化学性质允许识别和结合底物及随后水解和裂解底物中的易断裂键。蛋白酶的活性位点含有有助于肽裂解的催化机制的氨基酸以及有助于底物序列识别的氨基酸，如有助于扩展底物结合特异性的氨基酸。
如本文所用，丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的催化三元体(triad)是指丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的活性位点中的并有助于肽裂解的催化机制的三个氨基酸组合。通常地，催化三元体在丝氨酸蛋白酶中发现，提供了活性亲核试剂和酸/碱催化作用。所述丝氨酸蛋白酶的催化三元体含有三个氨基酸，在糜蛋白酶中是Asp102、His57和Ser195。这些残基对于丝氨酸蛋白酶的催化效力是关键的。
如本文所用，“底物识别位点”或“裂解序列”是指由蛋白酶裂解的蛋白酶的活性位点识别的序列。典型地，例如对于丝氨酸蛋白酶而言，裂解序列由底物中的P1-P4和P1’-P4’氨基酸组成，其中在P1位置后发生裂解。典型地，丝氨酸蛋白酶的裂解序列的长度为6个残基以匹配许多蛋白酶的扩展的底物特异性，但是根据蛋白酶而可以更长或较短。例如，为自身催化所需的MT-SP1的底物识别位点或裂解序列是RQARVV，其中R在P4位置，Q在P3位置，A在P2位置，R在P1位置。MT-SP1中的裂解发生在位置R后，后面是序列VVGG。
如本文所用，靶底物是指由蛋白酶裂解的底物。典型地，靶底物是由蛋白酶在其底物识别位点裂解。靶底物最低限度地包括组成裂解序列的氨基酸。任选地，靶底物包括含有所述裂解序列及任何其它氨基酸的肽。含有蛋白酶识别的裂解序列的全长蛋白质、其等位基因变体、同工型或其任何部分是该蛋白酶的靶底物。例如，对于本发明补体失活之目的而言，靶底物是含有由蛋白酶识别的裂解序列的任一或多种如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或更多种补体蛋白，或者其任何部分或片段。这种靶底物可以是纯化的蛋白质，或者可以存在于混合物中，如在体外的混合物或在体内的混合物。混合物可包括例如血液或血清或者其它组织液。另外，靶底物包括含有不影响蛋白酶对底物的裂解的其它部分的肽或蛋白质。例如，靶底物可包括与荧光部分连接的四个氨基酸的肽或者全长蛋白质。所述蛋白酶可以被修饰为呈现对于靶底物的更高的底物特异性。
如本文所用，裂解是指蛋白酶对肽键的破坏。蛋白酶的裂解位点基序包括易断裂键的N和C末端残基(分别为unprimed和primed侧，蛋白酶的裂解位点称作...P3-P2-P1-P1′-P2′-P3′...，裂解在P1与P1’残基之间发生)。典型地，底物的裂解是活化裂解或抑制性裂解。活化裂解是指多肽从无活性形式至活性形式的裂解。这种裂解包括例如酶原至活性酶的裂解，和/或前生长因子至活性生长因子的裂解。例如，MT-SP1可以通过在RQAR的P1-P4序列裂解靶底物而自身激活。活化裂解也是其中蛋白质被裂解为一或多个自身具有活性的蛋白质的裂解。例如，补体系统是不可逆的蛋白酶解事件级联，其最终导致刺激炎症、促进抗原吞噬作用及直接裂解一些细胞的多种效应物分子的形成。因此，C3由转变酶裂解为C3a和C3b是活化裂解。
如本文所用，抑制性裂解是蛋白质裂解为一或多个无功能的降解产物的裂解。抑制性裂解导致蛋白质活性的降低或减少。典型地，蛋白质活性的降低减少了该蛋白质参与的途径或过程。在一个实例中，是抑制性裂解的任一或多种补体蛋白的裂解导致补体的经典途径、凝集素途径或旁路功能性途径的任一或多种途径的伴随减少或抑制。抑制性是指与天然形式的蛋白质相比，所述裂解使得活性降低至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99.9％或更高。为抑制性裂解所需的蛋白质裂解百分比根据蛋白质而不同，但是可以通过分析蛋白质的活性而确定。
如本文所用，裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶是指经修饰为裂解VEGF或VEGFR或者以其天然形式裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶，从而降低或者失活VEGF或VEGFR复合物的信号化，特别是可以表明如血管发生、特别是不希望的血管发生的生物学作用的细胞增殖信号化。VEGF或VEGFR由蛋白酶的裂解可以通过使用本领域技术人员已知的评价VEGF或VEGFR功能的方法和检验分析VEGF或VEGFR的活性而确定。
如本文所用，不裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶(修饰或未修饰的)是指不降低或失活VEGF或VEGFR复合物的信号化的蛋白酶。特别地，在本文中所述蛋白酶与含有相应裂解序列(即RRVR)的VEGF或VEGFR蛋白或者肽底物相比具有对于靶底物(即补体蛋白)更高的底物特异性或活性，例如大约1倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍或更高倍数。对于本发明，补体蛋白与VEGF或VEGFR蛋白或肽底物的裂解对比是在与蛋白酶裂解补体蛋白的相同反应条件下进行。
如本文所用，“支架”或“蛋白酶支架”是指可以加以修饰以改变其靶特异性的原型蛋白酶。支架包括野生型蛋白酶，其等位基因变体和同工型。它们可以作为修饰的起始物，以产生具有靶向特异性的蛋白酶。
如本文所用，“修饰的蛋白质”或者“突变蛋白酶”是指与支架蛋白酶相比在一级序列中具有一或多个修饰的蛋白酶多肽(蛋白质)。所述一或多个突变可以是一或多个氨基酸置换(取代)、插入、缺失及其任何组合。修饰的蛋白酶多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰位置的那些蛋白酶。修饰的蛋白酶可以是全长支架蛋白酶，或者可以是修饰的全长支架蛋白酶的催化活性部分以及在改变蛋白酶活性或底物特异性区域含有修饰的蛋白酶及所述蛋白酶是蛋白酶解活性的。通常地，这些突变改变了支架蛋白酶裂解任一或多个补体蛋白的特异性和活性。除了含有改变蛋白酶的底物特异性的区域中的修饰之外，修饰的蛋白酶也可容许为蛋白酶的底物特异性非必需的区域中的其它修饰。因此，修饰的蛋白酶与相应的野生型或支架蛋白酶的氨基酸序列典型具有60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。修饰的蛋白酶的修饰的全长蛋白酶或其催化活性部分可包括作为融合蛋白的蛋白酶，只要所述融合自身不改变蛋白酶的底物特异性即可。
如本文所用，糜蛋白酶编号是指SEQ ID NO：8所示成熟糜蛋白酶多肽的氨基酸编号。可以用糜蛋白酶产生另一种蛋白酶的蛋白酶结构域排列，例如MT-SP1蛋白酶结构域。在这种情况中，相应于糜蛋白酶的氨基酸的MT-SP1氨基酸并给予糜蛋白酶氨基酸的编号。本领域技术人员使用人工排列或者使用众多可利用的排列程序(例如BLASTP)通过这种排列可以确定相应位置。相应位置也可以基于结构排列，例如使用蛋白质结构的计算机模拟排列。相应于揭示的序列中的氨基酸的多肽的氨基酸是指基于使用标准排列算法如GAP算法，排列具有所述揭示的序列的多肽以最大化相同性或同源性(其中排列对比保守的氨基酸)时鉴别的氨基酸。例如，基于MT-SP1(SEQ ID NO：10)丝氨酸蛋白酶结构域与成熟糜蛋白酶的排列对比，在MT-SP1中第1位的V在糜蛋白酶中编号为V16。由此对随后的氨基酸进行编号。在一个实例中，在全长MT-SP1(SEQ ID NO：2)第708氨基酸位置或者在MT-SP1(SEQ ID NO：10)的蛋白酶结构域的第94位置的的F基于糜蛋白酶编号相应于F99。在一个残基在蛋白酶中存在而在糜蛋白酶中不存在的情况中，所述氨基酸残基以字母符号表示。例如，糜蛋白酶中是具有第60位(基于糜蛋白酶编号)氨基酸的环的一部分但插入MT-SP1序列中的残基例如称作Asp60b或Arg60c。
如本文所用，“抑制补体激活”或者“补体失活”是指通过蛋白酶减少或降低任一或多个补体途径补体介导的功能或活性，或者补体途径中任何蛋白质的活性减少和降低。补体的功能或活性可以在体外或体内发生。在本文可以检验和描述的补体的功能的例子包括溶血反应及测量任一或多种补体效应物分子的检验，如通过SDS PAGE及随后的Western印迹或者考马斯亮蓝染色或者通过ELISA进行。蛋白酶可以抑制补体激活5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在其它实施方案中，与不存在蛋白酶的条件下补体的活性相比，补体激活被蛋白酶抑制40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99.9％。
如本文所用，对于靶底物的特异性是指蛋白酶对于靶底物较另一底物(非靶底物)优先裂解。特异性以特异性常数表示(kcat/Km)，，是蛋白酶对于其底物的亲和性和该酶的效力的一种测量标准。
如本文所用，裂解的特异性常数为(kcat/Km)，其中Km是Michaelis-Menton常数(一半Vmax时的[S])，kcat是Vmax/[ET]，，其中ET是最终酶浓度。参数kcat、Km和kcat/Km可以根据底物浓度倒数相对于底物裂解速度倒数的曲线图计算，拟合为Lineweaver-Burk等式(1/速率＝(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax；其中Vmax＝[ET]kcat)。可以使用确定在存在不同浓度底物的条件下随着时间出现的裂解增加的速度的任何方法计算特异性常数。例如，将底物与基于蛋白酶裂解而被释放的荧光部分连接。通过确定在不同酶浓度下裂解的速度，可以对于特定的蛋白酶确定kcat。特异性常数可用于确定蛋白酶的任一或多个S1-S4口袋中的氨基酸较底物中伴随的P1-P4氨基酸的位点特异性优选性，这使用本领域标准方法进行，如位置扫描组合库(positional scanning combinatorial library，PS-SCL)。另外，特异性常数也可以用于确定蛋白酶对于一种底物相对于另一底物的优选性。
如本文所用，底物特异性是指蛋白酶对于一种底物相对于另一底物的优选性。底物特异性可以作为特异性常数的比率(ration)进行测量。
如本文所用，底物特异性比率是特异性常数的比率，可用于比较两或多种蛋白酶或者蛋白酶对于两或多种底物的特异性。例如，蛋白酶对于竞争底物的底物特异性或者竞争蛋白酶对于底物的底物特异性可以通过比较kcat/Km而进行对比。例如，对于靶底物具有2×106M-1sec-1特异性常数及对于非靶底物具有2×104M-1sec-1特异性常数的蛋白酶对于所述靶底物更具特异性。使用上述特异性常数，所述蛋白酶对于靶蛋白酶具有100的底物特异性比率。
如本文所用，对于靶底物的优选性或底物特异性可以底物特异性比率表示。反映优选性的特定比值是底物与有争议的蛋白酶的函数。大于1的底物特异性比率表示对于靶底物的优选性，底物特异性小于1表示对于非靶底物的优选性。通常地，至少或大约为1的比率反映被考虑作为候选治疗剂的蛋白酶的显著差异。
如本文所用，改变的特异性是指与起始的支架蛋白酶相比，修饰的蛋白酶的底物特异性的改变。通常地，特异性的改变反映与支架蛋白酶的野生型底物(在本文称作非靶底物)相比，修饰的蛋白酶对于靶底物的优选性的改变。典型地，本发明提供的修饰的蛋白酶与支架蛋白酶的底物特异性相比呈现对于任一或多种补体蛋白的底物特异性增加。例如，对于靶底物和非靶底物的底物特异性比率为100的修饰的蛋白酶与底物特异性比率为10的支架蛋白酶相比呈现特异性增加10倍。在另一个实例中，底物特异性比率为1的修饰的蛋白酶与比率为0.1的相比呈现底物特异性增加10倍。为与支架蛋白酶相比呈现增加的特异性，修饰的蛋白酶对于任一或多种补体蛋白具有1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更高的底物特异性。
如本文所用，当描述蛋白酶从竞争底物的混合物中选择及裂解一种靶底物时，“选择性”可以与特异性互换应用。可以确定蛋白酶对于一种靶底物较任何其它一或多种靶底物的选择性增加，例如通过比较蛋白酶对靶底物裂解的特异性常数而确定。例如，如果蛋白酶对于一种靶底物的裂解特异性常数为2×106M-1sec-1及对于任何其它一种底物的特异性常数为2×104M-1sec-1，则所述蛋白酶对于前者靶底物更具选择性。
如本文所用，活性是指与全长(竞争)蛋白质相关的多肽或其一部分的功能活性或活性。功能活性包括但非限于生物学活性、催化或酶活性、抗原性(结合或与多肽竞争抗多肽抗体结合的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力，及特异性结合多肽的受体或配体的能力。
如本文所用，补体蛋白的功能活性是指补体介导的功能，包括但非限于过敏反应、调理作用、趋化性或者细胞裂解。检测补体活性的非限制性的检验方法包括红细胞溶血反应，及通过ELISA或SDS-PAGE检测补体效应物分子。
如本文所用，催化活性或裂解活性是指检测选择的底物的蛋白酶解的体外蛋白酶解分析中评价的蛋白酶活性。裂解活性可以通过评价蛋白酶的催化效力而测定。
如本文所用，对于靶底物的活性是指蛋白酶对于靶底物的裂解活性和/或功能活性，或者反应蛋白酶活性的其它测量法。蛋白酶对于补体蛋白靶底物的功能活性可以通过在补体分析中评价IC50而测量，所述补体分析例如是红细胞裂解反应或者本领域技术人员已知的或者本发明提供的评价补体活性的其它这种分析。裂解活性可以通过评价蛋白酶的催化效力而测量。对于本发明而言，如果与不存在所述蛋白酶的条件下相比，蛋白酶呈现较高的蛋白酶解或裂解靶底物活性和/或调节(即激活或抑制)补体蛋白的功能活性，则表示活性增加。
如本文所用，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸内肽酶是指一类肽酶，其特征在于在所述酶的活性中心存在丝氨酸残基。丝氨酸蛋白酶参与机体多种功能，包括凝血和炎症，以及在原核生物和真核生物中作为消化酶。丝氨酸蛋白酶的裂解机制基于丝氨酸对靶向的肽键的亲核攻击。半胱氨酸、苏氨酸或与天冬氨酸或金属结合的水分子也可发挥这种作用。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的侧链排列在一起形成大多数丝氨酸蛋白酶共有的催化三元体。丝氨酸蛋白酶的活性位点形成所述多肽底物结合的裂缝。
如本文所用，补体蛋白酶是指参与任何途径途径中补体级联反应的产生和扩大的蛋白酶。这些蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶因子I、因子D、MBL-相关丝氨酸蛋白酶(MASP)-2、MASP-1、C1s、C1r、因子B、C2及转变酶，及在补体途径中出现的影响补体激活的任何其它蛋白酶。特别地，补体蛋白酶是任何未修饰的补体蛋白酶，包括因子I、因子D、MASP-2、MASP-1、C1s、C1r、因子B和C2。
如本文所用，非补体蛋白酶是任一或多个补体途径中非正常一部分的任何蛋白酶。
如本文所用，MT-SP1是指丝氨酸蛋白酶，基于Ser、His和Lys活性位点残基的位置是丝氨酸蛋白酶的S1肽酶家族的一部分(也含有胰蛋白酶和糜蛋白酶)。MT-SP1特征在于一个跨膜结构域、两个CUB结构域、四个LDLR重复及一个丝氨酸蛋白酶结构域(或肽酶S1结构域)，所述丝氨酸蛋白酶结构域在丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族的所有成员中是高度保守的，例如糜蛋白酶。示例的MT-SP1的序列示于SEQ ID NO：2。所述蛋白酶结构域在第615-854位氨基酸之间发生。
MT-SP1蛋白酶包括全长MT-SP1或其任何催化活性部分，包括等位基因变体和物种变体及由剪接变体编码的变体。MT-SP1蛋白酶作为单链酶原及作为激活的双链多肽发生。所述MT-SP1包括其活性的单链和双链形式。特别感兴趣的是哺乳动物包括人源的MT-SP1蛋白酶。MT-SP1蛋白酶也可包括大鼠或小鼠来源的那些。本领域技术人员通常意识到多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代基本上不改变生物学活性(见例如Watson et al.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/CummingsPub.co.，p.224)。人源MT-SP1蛋白酶和/或其催化活性结构域的编码核酸分子的序列及编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1、2、9和10。非人源的M-SP1多肽是具有如小鼠(Mus musculus，SEQ ID NO：449)和大鼠(Rattusnorvegicus，SEQ ID NO：450)中氨基酸序列的那些多肽。在本发明中，MT-SP1蛋白酶可以是支架MT-SP1。
如本文所用，MT-SP1蛋白酶的“催化活性部分”是指保留蛋白酶活性的蛋白酶结构域或者其任何片段或一部分。例如MT-SP1的催化活性部分可以是MT-SP1蛋白酶结构域，包括分离的单链形式蛋白酶结构域或活化的双链形式。
如本文所用，修饰的MT-SP1蛋白酶是指与支架或未修饰的形式相比呈现改变的活性如改变的底物特异性的蛋白酶。这种蛋白酶与支架MT-SP1相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰(即氨基酸变化)，由此MT-SP1蛋白酶裂解补体蛋白的活性如底物特异性或选择性被改变。修饰的MT-SP1可以是全长支架MT-SP1，或者可以是全长支架蛋白酶的一部分，只要所述修饰的蛋白酶在一些区域中含有改变所述蛋白酶的活性或底物特异性的修饰及所述蛋白酶是蛋白酶解活性的即可。修饰的MT-SP1蛋白酶也可以在一些区域中包括不影响所述蛋白酶的底物特异性的其它修饰。因此，修饰的MT-SP1蛋白酶典型地与野生型或支架MT-SP1的相应氨基酸序列具有60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。修饰的全长MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分可包括是融合蛋白的蛋白酶，只要所述融合蛋白具有所述靶特异性即可。
如本文所用，人蛋白质是由人基因组中存在的核酸分子如DNA编码的一种蛋白质，包括其所有等位基因变体和保守变体。如果所述修饰基于人蛋白质的野生型或主流(prominent)序列，则蛋白质的变体或修饰物是一种人蛋白质。
如本文所用，天然发生的α-氨基酸的残基是自然发现的那些20种α-氨基酸的残基，通过具有其人体中同源mRNA密码子的荷电的tRNA分子的特异性识别而被掺入蛋白质中。
如本文所用，非天然发生的氨基酸是指不是遗传编码的氨基酸。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当是指探针或引物时，其任选被标记，如用可检测的标记物如荧光或放射性标记物标记，预期是单链分子。这种分子典型是其靶位在统计学上是唯一的这样的长度或者拷贝数较低(典型为少于5个，通常少于3个)以探查或引发(priming)文库。探针和引物通常含有与感兴趣的基因互补或相同的至少14、16或30个连续核苷酸的序列。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文所用，肽是指长度为2至40个氨基酸的多肽。
如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中出现的氨基酸根据其已知的三个字母或一个字母的缩写标示(表1)。在各个核酸片段中出现的核苷酸根据本领域通用的标准单字母命名法命名。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基基团和羧酸基团的一种有机化合物。多肽含有两或多个氨基酸。对于本发明而言，氨基酸包括20种天然发生的氨基酸、非天然氨基酸及氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文所用，在本文出现的各个氨基酸序列中出现的“氨基酸”是根据其熟知的三字母或单字母缩写标示的(见表1)。在各个DNA片段中出现的核苷酸以本领域通用的标准单字母命名法命名。
如本文所用，“氨基酸残基”是指基于多肽在其肽键处的化学消化(水解)而形成的氨基酸。本文描述的氨基酸残基假定是“L”异构体形式。也如此命名的“D”异构体形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要保留所述多肽希望的功能性质即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。与J.Biol.Chem.，243：3552-3559(1969)及采用的37 C.F.R..§§1.821-1.822中描述的标准多肽命名法一致，氨基酸残基的缩写示于表1。
表1-对应表
应注意本文以结构式描述的所有氨基酸残基序列均从左至右是氨基末端至羧基末端的常规方向。另外，短语“氨基酸残基”泛指包括表1中列出的氨基酸及修饰的和非常规氨基酸，如在此并入作参考的37 C.F.R.§§1.821-1.822中描述的那些氨基酸。另外，应注意在氨基酸残基序列的起始处或末端的破折号表示与另一个一或多个氨基酸残基的序列、氨基末端基团如NH2或者羧基末端基团如COOH的肽键。
如本文所用，“天然发生的氨基酸”是指在多肽中出现的20种L-氨基酸。
如本文所用，“非天然氨基酸”是指具有与天然氨基酸相似的结构但已经在结构上被修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。非天然氨基酸因此包括例如除了所述20种天然氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但非限于氨基酸的D-立体异构体。非天然氨基酸的例子在本文中描述并为本领域技术人员所已知。
如本文所用，等动力混合物是其中氨基酸的摩尔比率已经基于其报道的反应速度而加以调整的混合物(见例如Ostresh et al.，(1994)Biopolymers34：1681)。
如本文所用，DNA构建体是一种单链或双链的线性或环形DNA分子，其含有以自然中未发现的方式组合和并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果而存在，包括人工处理的分子的克隆和其它拷贝。
如本文所用，DNA节段是具有特定性质的较大DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长的DNA分子的一部分，如质粒或质粒片段，当从5’至3’方向读取时，编码所述特定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语直向同源物是指得自一个物种的多肽或蛋白质，其是得自一不同物种的多肽或蛋白质的功能对等物(counterpart)。直向同源物之中的序列差异是物种形成的结果。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体外合成，或者从天然和合成的分子组合中制备。在本文多核苷酸分子的长度根据核苷酸(缩写为nt)或碱基对(缩写为bp)而指定。根据上下文的内容允许，术语核苷酸用于描述单链和双链分子。当该术语用于描述双链分子时，其用于表示全长并且理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两个链的长度可略微不同，其末端可以是错列的；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以不是配对的。这种未配对的末端的长度通常不超过20个核苷酸。
如本文所用，蛋白酶多肽是具有相应于本文描述的任一支架或修饰的蛋白酶的氨基酸序列的多肽。
如本文所用，两个蛋白质或核酸之间的“相似性”是指蛋白质的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之间的关联性。相似性可以基于残基序列及其中包含的残基的相同性和/或同源性程度。评价蛋白质或核酸之间相似性程度的方法为本领域技术人员所已知。例如，在一种评价序列相似性的方法中，将两个氨基酸或核苷酸序列以产生序列之间最大水平相同性的方式排列。“相同性”是指氨基酸或核苷酸序列的不变程度。氨基酸序列及在一些程度上的核苷酸序列的排列也可考虑到氨基酸(或核苷酸)中的保守差异和/或频繁取代。保守差异是保持所包含的残基的物理-化学性质的那些差异。排列可以是整体排列(全长序列包括所有残基的序列对比排列)或者局部排列(仅包括最相似的区域的一部分序列的排列对比)。
“相同性”具有本领域公认的含义，可以使用公开的技术计算(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。有许多方法测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性，术语“相同性”为本领域技术人员所熟知(Carrillo，H.&Lipman，D.，SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
如本文所用，同源性(关于核酸和/或氨基酸序列)是指大约高于或等于25％的序列同源性，典型为高于或等于25％、40％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同源性；如果需要可以指定精确的百分比。对于本发明而言，除非特别指出，术语“同源性”和“相同性”通常互换应用。通常地，为了确定同源性或相同性百分比，排列序列以获得最高级别的匹配(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991；Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math48：1073)。对于序列同源性而言，保守的氨基酸的数目通过标准排列比对算法程序确定，可以使用每个供应商制定的默认缺口罚分(gap penalties)。基本上同源的核酸分子典型在中等严格或者在高度严格条件下均与感兴趣的核酸的长度杂交。本发明也涉及含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子的核酸分子。
任两个分子是否具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或“同源”的核苷酸序列或氨基酸序列，可以使用已知的计算机算法如FASTA程序确定，使用例如Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85：2444所述的默认参数进行(其它程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(I)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul，S.F.，et al.，J Molec Biol 215：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，SanDiego，1994，and Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，可以使用国立生物技术信息中心数据库的BLAST功能确定相同性。其它可商购或公共可获得的程序包括DNAStar″MegAlign″程序(Madison，WI)和Wisconsin大学遗传学计算机小组(UWG)的Gap程序(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序对比序列信息而确定(例如Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48：443所述，由Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482修定)。简而言之，所述GAP程序阐述了相似性为相似的排列符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列的较短序列的符号总数。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(值1为相同性，0为非相同性)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：6745所述加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff，eds.，ATLASOF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE，National BiomedicalResearch Foundation，pp.353-358(1979)描述；(2)每一缺口罚分3.0并且每一缺口中的每一符号另外罚分0.10；(3)末端缺口无罚分。
因此，如本文所用，术语“相同性”或“同源性”表示测试与参考多肽或多核苷酸之间的对比。如本文所用，术语“至少90％相同”是指与参考多肽核酸或氨基酸序列从90％至99.99％的相同性百分比。90％或更高水平的相同性表示这样的事实，即为了举例目的，假定对比长度为100个氨基酸的测试多肽和参考多肽，测试多肽中不超过10％(即10/100)的氨基酸与参考多肽的氨基酸不同。相似性对比可以在测试和参考多核苷酸之间进行。这种差异可以随机分布于多肽全长的点突变表示，或者可以群聚于不同长度直至容许的最大程度的一或多个位置，例如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异以核酸或氨基酸取代、插入或缺失表示。在大约85-90％以上的同源性或相同性水平，结果应独立于程序和缺口参数设置；这种高水平的相同性可易于通过人工排列对比而不依靠软件进行评价。
如本文所用，排列的序列是指利用同源性(相似性和/或相同性)排列核苷酸或氨基酸序列中的相应位置。典型地，排列对比具有50％或更高相同性的两或多个序列。序列的排列组是指在相应位置排列对比的两或多个序列，可包括与基因组DNA序列排列的衍生自RNA的排列序列，如EST及其它cDNA。
如本文所用，“引物”是指在合适条件下(例如在存在四种不同的三磷酸核苷和聚合剂如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的条件下)在合适的缓冲液及在适当温度下可作为模板指导的DNA合成的起始点的核酸分子。应意识到某些核酸分子可作为“探针”及作为“引物”。然而，引物具有3’羟基基团以进行延伸。引物可用于各种方法中，包括例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、panhandle PCR、捕获PCR、表达PCR、3′和5′RACE、原位PCR、连接介导的PCR及其它扩增方案。
如本文所用，“引物对”是指一组引物，包括与被扩增(例如通过PCR)的序列的5’末端杂交的5’(上游)引物及与被扩增的序列的3’末端的互补体杂交的3’(下游)引物。
如本文所用，“特异性杂交”是指核酸分子(例如寡核苷酸)通过互补碱基配对与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和组成。与体外杂交特别相关的参数进一步包括退火和洗涤温度、缓冲液组成和盐浓度。除去高度严格条件下非特异性结合的核酸分子的洗涤条件的例子是0.1xSSPE、0.1％SDS、65℃，中等严格条件下的洗涤条件是0.2xSSPE、0.1％SDS、50℃。本领域已知等同的严格条件。技术人员可易于调整这些参数以实现核酸分子与适于特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。
如本文所用，与产物基本相同是指足够的相似性，以便感兴趣的性质未明显改变，由此基本相同的产物可用于代替所述产物。
如本文所用，本领域技术人员理解术语“基本相同”或“相似”根据上下文的内容可不同含义。
如本文所用，等位基因变体是指占据相同染色体基因座的任两或多种可选形式的基因。等位基因变体通过突变自然产生，可导致群体中表型多态性。基因突变可以是沉默突变(编码的多肽中无变化)或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在本文也用于描述由基因的等位基因变体编码的蛋白质。典型地，所述参考形式的基因编码一个群体或一个物种的一个成员的野生型和/或显性形式的多肽。典型地，等位基因变体，包括物种之间和之中的变体，与相同物种的野生型或显性形式具有至少80％、90％或更高的氨基酸相同性；相同性的程度依赖于基因及对比是否是种间还是种内的。通常地，种内等位基因变体与野生型和/或显性形式具有至少大约80％、85％、90％或95％或更高的相同性，包括与多肽的野生型和/或显性形式具有96％、97％、98％、99％或更高的相同性。
如本文所用，在本文与“等位基因”可互换应用的术语“等位基因”是指基因或其一部分的另外的形式。等位基因占据同源染色体上相同基因座或位置。当对象具有基因的两个相同的等位基因时，称该对象对于所述基因或等位基因是纯合的。当对象具有基因的两个不同等位基因时，称所述对象对于该基因是杂合的。特定基因的等位基因在一个核苷酸或几个核苷酸中彼此可不同，可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因可是是含有突变的基因形式。
如本文所用，剪接变体是指通过基因组DNA的初级转录的差异处理而产生的变体，产生一种以上类型的mRNA。
如本文所用，修饰是指多肽的氨基酸序列或者核酸分子中的核苷酸序列的修饰，包括缺失、插入及分别的氨基酸和核苷酸置换。
对于本发明而言，氨基酸取代、缺失和/或插入可以在任何蛋白酶及其蛋白酶结构域中产生，条件是所得蛋白质呈现蛋白酶活性或其它活性(或者如果需要，则这种改变可以是消除活性)。修饰可以通过产生保守氨基酸取代也可以通过非保守氨基酸取代产生。例如，可以产生希望的或有利地改变蛋白质性质的氨基酸取代。在一个实施方案中，可以产生防止多肽降解的突变。许多蛋白酶在碱性残基如R和K之后裂解，因此为了消除这种裂解，所述碱性残基由非碱性残基置换。通过在抑制剂与蛋白酶的相互作用部位进行非保守改变，可以阻断蛋白酶与抑制剂之间的相互作用而同时保留催化活性。其它活性也可以被改变。例如可以改变受体结合而不改变催化活性。
所述氨基酸取代包括保守取代，如表2所示那些取代，其不消除蛋白酶解活性。如本文所描述，本发明也涉及改变蛋白质性质的取代，如除去裂解位点及其它这种位点；这种取代通常是非保守的，但可易于由本领域技术人员完成。
合适的氨基酸保守取代为本领域技术人员所已知，通常可以不同改变所得分子的生物学活性例如酶活性而产生。本领域技术人员意识到在多肽的非必需区域中的一个氨基酸取代通常基本上不改变生物学活性(见例如Watson et al.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。该定义也包括丝氨酸蛋白酶的催化活性片段、特别是单链蛋白酶部分。例如根据下表2所示进行保守氨基酸取代。
表2
原始残基  保守取代
Ala(A)    Gly；Ser；Abu
Arg(R)    Lys；orn
Asn(N)    Gln；His
Cys(C)    Ser
Gln(Q)    Asn
Glu(E)    Asp
Gly(G)    Ala；Pro
His(H)    Asn；Gln
Ile(I)    Leu；Val
Leu(L)    Ile；Val
Lys(K)    Arg；Gln；Glu
Met(M)    Leu；Tyr；Ile
鸟氨酸    Lys；Arg
Phe(F)    Met；Leu；Tyr
Ser(S)    Thr
Thr(T)    Ser
Trp(W)    Tyr
Tyr(Y)    Trp；Phe
Val(V)    Ile；Leu；Met
也可以允许其它取代，可根据经验确定或者根据本领域已知的保守取代确定。
如本文所用，术语启动子是指含有提供结合RNA聚合酶及转录起始的DNA序列的基因的一部分。启动子序列通常但不总是在基因的5’非编码区中发现。
如本文所用，分离的或纯化的多肽或蛋白质或其生物学活性部分是基本上没有来自从中衍生所述蛋白质的组织细胞的细胞材料或其它污染蛋白质，或者当化学合成时基本上没有化合物前体或其它化合物。如果通过本领域技术人员用于评价纯度的标准分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)确定所述制品看起来没有易于可检测的杂质，则可以确定该制品是基本上没有杂质或者充分纯的，由此进一步的纯化不明显改变所述物质的物理和化学性质，如酶和生物学活性。本领域技术人员已知产生基本上化学纯的化合物纯化方法。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加化合物的特异性活性。
术语基本上没有细胞材料包括这样的蛋白质制品，即其中蛋白质从其分离或重组产生自其中的细胞成分中分离出。在一个实施方案中，术语基本没有细胞材料包括蛋白酶制品，其具有少于大约30％(干重)的非蛋白酶蛋白质(在本文也称作污染蛋白)，通常少于大约20％的非蛋白酶蛋白质或者10％的非蛋白酶蛋白质或者少于大约5％的非蛋白酶蛋白质。在所述蛋白酶蛋白或其活性部分是重组产生的情况中，其基本上没有培养基，即存在的培养基少于大约或等于20％、10％或5％体积的蛋白酶蛋白质制品。
如本文所用，术语基本上没有化合物前体或其它化合物包括这样的蛋白酶制品，其中蛋白质从参与所述蛋白质的合成的化合物前体或其它化合物中分离。该术语包括具有少于大约30％(干重)、20％、10％、5％或更少的化合物前体或非蛋白酶化合物或成分的蛋白酶制品。
如本文所用，使用重组DNA方法通过重组方式产生是指使用熟知的分子生物学方法表达克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，载体(或质粒)是指用于将异源核酸导入细胞中以表达或复制的分立的元件。载体典型保留附加体，但是可以被设计为使得基因或其一部分整合进基因组的染色体中。本发明还设计人工染色体载体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这种载体的选择和应用为本领域技术人员所熟知。
如本文所用，表达载体包括能表达DNA的载体，所述DNA与能影响这种DNA片段表达的调节序列如启动子区域可操纵地连接。这种另外的节段可包括启动子和终止子序列，任选可包括一或多个复制起点、一或多个可选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或者可以含有这两种元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，在导入合适的宿主细胞中时导致克隆的DNA的表达。合适的表达载体为本领域技术人员所熟知，包括在原核细胞和/或真核细胞中可复制的那些载体，及保留附加体的那些载体或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
如本文所用，载体也包括“病毒载体”。病毒载体是与外源基因可操纵地连接以将所述外源基因转移(作为运载体或穿梭体)进细胞中的工程化的病毒。
如本文所用，腺病毒是指任一组含有DNA的病毒，其在人体内导致结膜炎和上呼吸道感染。如本文所用，裸DNA是指无组蛋白的DNA，其可用于疫苗和基因治疗。裸DNA是在称作转化的基因转移过程期间在细胞至细胞之间传送的遗传物质。在转化中，纯化的或裸DNA由受体细胞接收，为该受体细胞提供新的特征或表型。
如本文所用，当描述DNA节段时，可操纵地或可操纵地连接是指排列所述节段以便其功能与指定目的一致，例如启动子中转录起始及通过编码节段至终止子的继续。
如本文所用，蛋白质结合序列是指能特异性结合其它蛋白质或肽序列的蛋白质或肽序列，通常特异性结合一组蛋白质或肽序列或者特定的蛋白质或肽序列。
如本文所用，表位标记是指相应于表位的一段较短的氨基酸残基，以促进随后进行的表位标记的蛋白质或肽的生物化学和免疫学分析。标记表位通过将所述表位标记的序列于合适的表达载体中加入蛋白酶编码序列中而实现。表位标记的蛋白质可以通过该标记的高度特异性抗体亲和纯化。
如本文所用，金属结合序列是指能特异性结合金属离子的蛋白质或肽序列，通常特异性结合一组金属离子或特定的金属离子。
如本文所用，术语评价是指包括定量和定性确定获得样品中存在的蛋白酶或其结构域的活性的绝对值，及获得表示活性水平的指数、比率、百分比、图像或其它数值。评价可以直接或间接进行，实际检测的化合物种类当然不需要是蛋白酶解产物自身，可以例如是其衍生物或一些进一步的物质。例如，通过SDS-PAGE及考马斯蓝进行蛋白质染色检测补体蛋白的裂解产物。
如本文所用，生物学活性是指化合物的体内活性或者基于体内给予化合物、组合物或其它混合物产生的生理学应答。因此，生物学活性包含这种化合物、组合物及混合物的治疗效果和药物活性。生物学活性可以在设计为测试或应用这种活性的体外系统中观测到。因此，对于本发明而言，蛋白酶的生物学活性是其催化活性，其中多肽被水解。
如本文所用，当描述核酸的两个序列时，等价物是指所述两个序列编码相同的氨基酸序列或等价的蛋白质。当等价物用于描述两种蛋白质或肽时，意味着这两种蛋白质或肽具有基本相同的氨基酸序列，仅具有基本上不改变所述蛋白质或肽的活性或功能的少量氨基酸取代(例如但非限于保守改变，如上表2所示)。当等价物用于描述性质时，该性质不需要以相同程度存在(例如两种肽可以呈现不同等级的相同类型酶活性)，但是活性通常是基本相同的。当用于描述连个核苷酸序列时，互补是指这两个核苷酸序列能杂交，在相反的核苷酸之间典型具有低于25％、15％或5％的错配。如果需要，则指定互补百分比。典型地，对这两种分子加以选择以使其在高度严格条件下杂交。
如本文所用，调节蛋白质活性或者基因或核酸表达的物质以一些方式正调节或负调节或者另外改变细胞中所述核酸的表达而降低或增加或者另外改变所述蛋白质的活性。
如本文所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”蛋白酶是指与不同多肽可操纵地连接的多肽。本发明提供的嵌合蛋白或融合蛋白可包括一或多种蛋白酶或其一部分，如其单链蛋白酶结构域，及针对任一或多种转录/翻译控制信号的一或多种其它多肽、信号序列、定位标记、纯化标记、免疫球蛋白G的结构域的一部分，和/或靶向剂。这些嵌合或融合蛋白包括通过重组方式以融合蛋白形式产生的那些蛋白质，通过化学方式如通过化学偶联例如通过与巯基基团偶联而产生的那些蛋白质，及通过其它方法产生的那些蛋白质，其中至少一种蛋白酶或其一部分通过接头与另一多肽直接或间接连接。
如本文所用，当用于描述融合蛋白时，可操纵地连接是指蛋白酶多肽与非蛋白酶多肽符合读框地彼此融合。非蛋白酶多肽可以与蛋白酶多肽的N末端或C末端融合。
如本文所用，靶向剂是使得缀合物与细胞表面受体特异性结合的任何成分，例如蛋白质或其有效部分，在一些情况中可使结合的缀合物或其一部分内在化。靶向剂也可以是促进或便于例如所述缀合物的亲和分离或纯化、所述缀合物与表面的附着、或者所述缀合物或含有所述缀合物的复合物的检测的物质。
如本文所用，抗体缀合物是指其中靶向剂是抗体的缀合物。
如本文所用，分子的衍生物或类似物是指衍生自所述分子的一部分或者修饰形式的分子。
如本文所用，“疾病或病变”是指生物体中由如下原因或状况所致的病理学状况，所述原因和状况包括但非限于感染、获得性疾病、遗传疾病，及特征在于可确认的症状。本发明感兴趣的疾病或病变是参与补体激活的那些疾病，包括由补体激活介导的那些疾病及其中补体激活在病因学或病理学中起作用的那些疾病。疾病或病变也包括由于缺少如免疫缺陷蛋白引起的那些疾病，本发明感兴趣的疾病是其中由于补体蛋白的缺陷而不发生补体激活的那些病变。
如本文所用，补体介导的疾病是其中任一或多种补体蛋白在所述疾病中起作用、由于该蛋白质的缺少或存在而引起的任何病变。补体介导的疾病是由于补体蛋白缺乏所致疾病。补体介导的疾病也可以是由于任一或多种补体蛋白的存在及补体途径的持续激活所致疾病。
如本文所用，“治疗”患病对象是指所述对象的症状在治疗后部分或全部减轻或者保持不变。因此，治疗涵盖了预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在疾病发生和/或防止症状恶化或疾病进展。治疗也涵盖了本发明提供的修饰的干扰素和组合物的任何药物学应用。
如本文所用，治疗剂、治疗方案、辐射防护剂或者化疗是指常规的药物和药物治疗，包括疫苗，这些为本领域技术人员所已知。放疗剂为本领域所熟知。
如本文所用，治疗是指症状、病变或疾病的症状的改善或者另外有益地改变的任何方式。治疗也包含本发明提供的组合物的任何药物学应用。
如本文所用，通过治疗如通过给予药物组合物或其它治疗剂得以改善特定疾病或病变的症状是指归因于或与给予所述组合物或治疗剂相关的症状的无论永久或暂时、持久或瞬时的任何减轻。
如本文所用，防止或预防是指降低疾病或病变发生的危险的方法。
如本文所用，治疗特定疾病的化合物或组合物的有效量是足以改善或以一些方式减少与疾病相关症状的量。这种量可以单一剂量给予或者根据治疗方案给予，从而达到有效。所述有效量可以治愈疾病，但典型是为了改善疾病症状而给予。典型地，需要重复给予以达到希望的改善症状。
如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指至少足以产生治疗作用的药物、化合物、材料或含有化合物的组合物的量。有效量是为预防、治愈、改善、阻止或部分阻止疾病或病变的症状必需的治疗剂数量。
如本文所用，非补体蛋白酶如修饰的非补体蛋白酶的给予是指将所述非补体蛋白酶与其底物接触的任何方法。给予可以在体内或离体或者在体外实现。例如，对于离体给予而言，从对象中取体液如血液，将其在机体外与修饰的非补体蛋白酶接触。对于体内给予而言，修饰的非补体蛋白酶可以导入机体中，例如通过局部、全身和/或其它导入途径导入。体外给予包含如细胞培养方法。
如本文所用，抗凝血剂是一种帮助血液凝聚(凝固)的药物。这些药物用于预防新的凝血块形成或者现有凝血块扩大。
如本文所用，单位剂量形式是指适于人和动物对象的分立单位，如本领域所已知地单独包装。
如本文所用，治疗的“患者”或“对象”包括人或非人动物。哺乳动物包括：灵长类动物如人、黑猩猩、大猩猩和猴；驯养动物如狗、马、猫、猪、山羊、牛；啮齿类动物如小鼠、大鼠、仓鼠和沙鼠。
如本文所用，组合是指两或多个项目的任何关联。所述关联可以是空间关联或者是指为了共同的目的两或多个项目的应用。
如本文所用，组合物是指两或多种产物或化合物(包括药物、调节物、调整物等)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊、水或非水配制品或者其任何组合。
如本文所用，“制品”是生产贩卖的产物。如本申请书中所应用，该术语是指包含包装物中含有的修饰的蛋白酶多肽及核酸。
如本文所用，液体是指可以流动的任何组合物。液体因此包含半固体形式、糊状、溶液、水溶液混合物、凝胶、洗液、乳液及其它这种组合物。
如本文所用，“试剂盒”是指经包装的组合，任选包括试剂及其它产品和/或成分以使用该组合成分进行本发明的方法。例如，本发明提供了含有本发明提供的修饰的蛋白酶多肽或核酸分子及另一种成分的试剂盒，以用于包括但非限于给予、诊断和评价生物学活性或性质之目的。试剂盒任选包含使用说明书。
如本文所用，细胞提取物是指从溶解或破坏的细胞中制成的制品或馏分。
如本文所用，当不考虑涉及单独的蛋白质或与其相关底物、结合配偶体和/或其它成分结合的特异序列而随机选择物质时，称该物质是随机选择的。随机选择的物质的一个例子是利用化学库或肽组合库，或者生物体的生长肉汤或条件培养基。
如本文所用，前体药物是一种化合物，体内给予时产生代谢变化或者另外转变为生物学、药物学或者治疗活性形式的化合物。为了产生前体药物，对药物学活性化合物进行修饰，由此通过代谢过程再生活性化合物。所述前体药物可以设计为改变药物代谢稳定性或者转运特性、掩饰副作用或毒性、改善药物的味道或者改变药物的其它特性或性质。根据体内药效和药物代谢方面的知识，本领域技术人员一旦已知一种药物学活性化合物，则可以设计该化合物的前体药物(见例如Nogrady(1985)MedicinalChemistry A Biochemical Approach，Oxford University Press，New York，pages388-392)。
如本文所用，肽模拟物是模拟生物学活性形式特定肽的构象和某些立体化学特点的化合物。通常地，肽模拟物设计为模拟某些希望性质的化合物，而不是不希望的性质如导致生物学活性构象损失和键破坏的柔性。肽模拟物可以从生物学活性化合物中通过用生物电子等排体置换引起不希望的性质的某些基团或键而制备。生物电子等排体为本领域技术人员所已知。例如亚甲基生物电子等排体CH2S已经在脑啡肽类似物中用作酰胺置换物(见例如Spatola(1983)pp.267-357 in Chemistry and Biochemistry of AminoAcids，Peptides，and Proteins，Weinstein，Ed.volume 7，Marcel Dekker，NewYork)。吗啡可以经口腔给予，是内啡肽的肽模拟物。对于本发明而言，其中形成多肽主链的一或多个肽键由生物电子等排体置换的多肽是肽模拟物。
如本文所用，抗体包括抗体片段，如Fab片段，其由轻链及重链的可变区组成。
如本文所用，受体是指对于特定配体具有亲和性的分子。受体可以是天然发生或合成的分子。在本领域受体也可以称作抗配体。
如本文所用，引物是指含有两或多个(典型不超过三个)脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，从中可以起始引物延伸产物的合成。有益于合成的实验条件包括存在三磷酸核苷及聚合和延伸剂，如DNA聚合酶，合适的缓冲液、温度和pH。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但非限于灵长类动物包括人、大猩猩和猴；啮齿类动物如小鼠和大鼠；禽类如鸡；反刍动物如山羊、牛、鹿、绵羊；绵羊如猪，及其它动物。非人动物除外人作为预期动物。本发明提供的蛋白酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数蛋白酶是动物源的，包括哺乳动物源。
如本文所用，遗传治疗或基因治疗包括异源核酸如DNA转移进还有尝试进行这种治疗的疾病或病变的哺乳动物特别是人的某些细胞中、靶细胞中。所述核酸如DNA以一定方式直接或于载体或其它输送载体中导入选择的靶细胞中，由此异源核酸如DNA被表达并因此产生编码的治疗产物。或者，异源核酸如DNA可以一些方式介导编码治疗产物的DNA的表达，或者其可编码一种产物如肽或RNA，以一些方式直接或间接介导治疗产物的表达。遗传治疗也可用于输送编码基因产物的核酸，代替有缺陷的基因或者补充哺乳动物或导入其中的细胞产生的基因产物。导入的核酸可以编码一种治疗化合物，如蛋白酶或修饰的蛋白酶，其在哺乳动物宿主体内非自然产生或者不以治疗有效量或者在治疗有益时间产生。可以对编码治疗产物的异源核酸如DNA加以修饰，之后导入患病宿主的细胞中，以增强或另外改变所述产物或其表达。遗传治疗也可包含基因表达的抑制剂或阻抑物或其它调节物的输送。
如本文所用，异源核酸是不由表达其的细胞在体内自然产生的核酸，或者是由所述细胞产生、但是在不同基因座或者不同表达或者介导或编码通过影响转录、翻译或其它可调节的生物化学过程改变内源核酸如DNA的表达的介导物的核酸。异源核酸对于其被导入的细胞通常不是内源的，但是已经从另外的细胞获得或者合成制备。异源核酸可以是内源的，但是从不同基因座表达的核酸或其表达被改变。通常地，尽管非必需，这种核酸编码不是由细胞正常产生的或者在细胞中表达的RNA和蛋白质。异源核酸如DNA也可以称作外源核酸，如DNA。因此，异源核酸或外源核酸包括在配对核酸分子的精确方向或位置不存在的核酸分子如DNA，在基因组中发现。其也可以是指来自另一生物体或物种的核酸分子(即外源的)。
在本文异源核酸包含本领域技术人员识别或认为对于核酸在其中表达的细胞而言是异源或外源的任何核酸如DNA；异源核酸包括外源加入的也内源表达的核酸。异源核酸的例子包括但非限于编码可追踪的标记蛋白如授予药物抗性的蛋白质的核酸，编码治疗有效物质的核酸如抗癌剂、酶和激素，及编码其它类型蛋白质如抗体的核酸如DNA。由异源核酸编码的抗体可以在已经导入异源核酸的细胞的表面上分泌或表达。
如本文所用，对于基因治疗而言治疗有效的产物是由异源核酸典型为DNA编码的产物，当所述核酸被导入宿主中，表达一种改善或消除遗传或获得性疾病的症状、临床表现或者治愈所述疾病的产物。治疗有效产物也包括生物学活性核酸分子，如RNAi和反义核酸。
如本文所用，对照是指与测试样品基本相同，但是不是用测试参数处理的样品，或者如果其是血浆样品，其可以来自未感染感兴趣的疾病的正常志愿者。对照物也可以是内在对照。
如本文所用，基本上由所述氨基酸序列组成的多肽是指全长多肽的所述部分或片段。所述多肽可任选及通常包括来自另一来源的额外的氨基酸，或者可以插入另一多肽中。例如，对于本发明而言，基本由蛋白酶结构域组成的多肽是指多肽的唯一部分是蛋白酶结构域或其催化活性部分。所述多肽可任选及通常包括另外的非蛋白酶衍生的氨基酸序列。
如本文所用，除非特别指出，则任何保护基团、氨基酸及其它化合物的缩写均根据其常规用法、公认的缩写方式或者IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature(see，(1972)Biochem. 11：1726)。
B.靶：补体
补体系统及其成分是本发明提供的修饰的蛋白酶的靶底物。所述蛋白酶经修饰或选择或鉴别以裂解所述系统的一或多种成分，及因此提供了调节所述系统活性的方式。这种蛋白酶可作为治疗剂或候选治疗剂以调节补体系统的活性。
补体系统是免疫系统的一部分，在消除入侵的外源生物体及引起炎症应答中起作用。有超过30种的可溶及细胞膜蛋白质是补体系统的一部分。这些蛋白质不仅在抗体介导的免疫应答中起作用，在识别和杀死病原体如细菌、病毒感染的细胞和寄生虫的先天免疫应答中也起作用。补体蛋白是由巨噬细胞和肝细胞组成性产生的，以无活性分子形式存在于循环中。一些补体蛋白是酶原蛋白酶(称作酶原)，其通过蛋白酶解而自身激活变成效应蛋白酶，切断其它补体蛋白中的肽键使其激活。由于每个激活的蛋白酶可激活一些底物分子，因此初始的激活迅速扩大产生数百万的效应分子(级联)。补体系统组成蛋白酶解的不可逆级联，其终止导致多种效应分子形成，刺激炎症、促进抗原吞噬作用及直接裂解一些细胞，并因此可作为治疗呈现共同的病理学或者在病因学和病理学包括这个系统的多种疾病的干预治疗点。
有三种独特的途径，补体通过这些途径可以在病原体表面上激活：经典途径、旁路途径和凝集素途径。这些途径特征在于途径起始需要的成分不同，但是所述途径最后均产生相同的效应分子(见例如图1)。另外，每个途径的早期事件均由触发的酶级联这种相似机制控制，其中无活性的补体酶原被裂解产生两个片段，较大的片段是活性的丝氨酸蛋白酶。所述活性的蛋白酶保留在病原体表面上，以便随后的补体酶原被裂解及激活，以持续进行补体激活的蛋白酶解级联。基于酶原裂解产生的另一个片段是较小的肽片段，其可作为补体的可溶介导物发挥调理素或促炎介导物的作用。
1.命名法
补体途径含有超过30种的可溶介导物(见表3)，其中一些是从无活性的蛋白酶原裂解产生两个片段而产生的。表3示出了天然补体蛋白的例子并提供了对其多肽序列的描述，包括编码的补体片段在多肽中的位置描述。例如，SEQ ID NO：315编码C5补体蛋白，也编码补体蛋白的C5a片段，由C5的第678-751位残基编码，在C5转变酶对C5进行裂解之后而产生的基础上呈现补体活性。天然的补体成分以C及后面的数字命名，如C1、C2等。补体成分的编号基于其发现的顺序而不是补体级联中反应序列的顺序。补体级联的反应序列是C1、C4、C2、C3、C5、C6、C7、C8和C9。在活化后，裂解反应的产物通过加上小写字母而命名，较大的片段通常称作b，较小的片段称作a(即C4裂解产生C4b和C4a)。在一些情况中，C2a被称作较大的裂解产物，但更通常是C2b被认为是较大的裂解产物。因此，C3转变酶C3b2b有时被称作C3b2a。无活性的裂解产物用i命名(即iC3b)。特异于补体旁路途径的蛋白酶原成分不以C命名，基于裂解变成Bb或Ba而以不同大写字母命名如因子B。凝集素途径的两种初始蛋白酶原称作MASP-1和MASP-2。
表3：补体蛋白
Entry名称 AC#  基因名称   氨基酸长度 描述 SEQ ID NO
  C1QA_HUMAN   P02745  C1QA   245   补体C1q亚成分，A链前体   298
  C1QB_HUMAN   P02746  C1QB   251   补体C1q亚成分，B链前体   299
C1QC_HUMAN P02747  C1QG，C1QC 245 补体C1q亚成分，C链前体 300
C1R_HUMAN P00736 C1R 705   补体C1r亚成分前体(补体成分1，r亚成分)[含有：补体C1r亚成分重链(aa：18-463)；补体C1r亚成分轻链(aa：464-705)] 301；302
C1S_HUMAN P09871 C1S 688   补体C1s亚成分前体(C1酯酶)[含有：补体C1s亚成分重链(aa：16-437)；补体C1s亚成分轻链(aa：438-688)] 303，304
  C4BB_HUMAN   P20851  C4BPB   252   C4b-结合蛋白β链前体   305
C4BP_HUMAN P04003  C4BPAC4BP 597   C4b-结合蛋白α链前体(C4bp)(脯氨酸富集蛋白质)(PRP) 306
CFAI_HUMAN P05156 IF 583   补体因子I前体(EC3.4.21.45)(C3B/C4B失活物)[含有：补体因子I重链(aa：19-335)；补体因子I轻链(340-583)] 307，308
CLUS_HUMAN P10909 CLU 449   簇蛋白前体(补体相关蛋白质SP-40，40)(补体细胞裂解抑制剂)(CLI)(NA1/NA2)(载脂蛋白J)(Apo-J)(睾酮抑制的前列腺信使2)(TRPM-2)[含有：簇蛋白β链(ApoJalpha)(补体细胞裂解抑制剂a链)(aa：23-227)；簇蛋白α链(ApoJbeta)(补体细胞裂解抑制剂b链)(aa：228-449)] 309
CO2_HUMAN P06681 C2 752   补体C2前体(EC 3.4.21.43)(C3/C5转变酶) 310，311
CO3_HUMAN P01024 C3 1663   补体C3前体[含有：补体C3β链(aa：23-667)；补体C3α链(aa：672-1663)；C3a过敏毒素(aa：672-748)；补体C3bα′链(aa：749-1663)；补体C3c片段(aa：749-954)；补体C3dg片段(aa：955-1303)；补体C3g片段(aa：955-1001)；补体C3d片段(aa：1002-1303)；C3f片段(aa：1304-1320)] 312
CO4_HUMAN P01028 C4A和C4B 1744   补体C4前体[含有：补体C4β链(aa：20-675)；补体C4α链(aa：680-1446)；C4a过敏毒素(680-756)；C4b(aa：757-1446)；补体C4γ链(aa：1454-1744)] 313
CO5_HUMAN P01031 C5 1676   补体C5前体[含有：补体C5β链(aa：19-673)；补体C5α链(aa：678-1676)；C5a过敏毒素(aa：678-751)；补体C5α′链(aa：752-1676)] 314
  CO6_HUMAN   P13671   C6   934   补体成分C6前体   315
  CO7_HUMAN   P10643   C7   843   补体成分C7前体   316
CO8A_HUMAN P07357 C8A 584   补体成分C8α链前体(补体成分8α亚基) 317
CO8B_HUMAN P07358 C8B 591   补体成分C8β链前体(补体成分8β亚基) 318
  CO8G_HUMAN   P07360   C8G   202   补体成分C8γ链前体   319
CO9_HUMAN P02748 C9 559   补体成分C9前体[含有：补体成分C9a(aa：22-265)；补体成分C9b(aa：266-559)] 320
CR1_HUMAN P17927   CR1，C3BR 2039   补体受体类型1前体(C3b/C4b受体)(CD35抗原) 321
CR2_HUMAN P20023 CR2，C3DR 1033   补体受体类型2前体(Cr2)(补体C3d受体)(Epstein-Barr病毒受体)(EBV受体)(CD21抗原) 322
DAF_HUMAN P08174   DAF，CD55，CR 381   补体衰变加速因子前体(CD55抗原) 323
IC1_HUMAN P05155   SERPING1，C1IN，C1NH 500 血浆蛋白酶C1抑制剂前体(C1Inh)(C1Inh) 324
MASP1_HUMAN P48740 MASP1，CRARF，CRARF1，PRSS5 699   Ra反应因子前体的补体激活的成分(EC 3.4.21.-)(Ra反应因子丝氨酸蛋白酶p100)(RaRF)(甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1)(甘露糖结合蛋白相关丝氨酸蛋白酶)(MASP-1)[含有：Ra反应因子重链的补体激活的成分(aa：20-448)；Ra反应因子轻链的补体激活成分(aa：449-699)] 325，326(V1)；327，328(V2)；329，330(V3)
MASP2_HUMAN O00187 MASP2 686   甘露聚糖结合的凝集素丝氨酸蛋白酶2前体(EC3.4.21.-)(甘露糖结合蛋白相关丝氨酸蛋白酶2)(MASP-2)(MBL-相关的丝氨酸蛋白酶2)[含有：甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2A链(aa：16-444)；甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2B链(aa：445-686)] 331，332(V1)；333，334(V2)
MBL2_HUMAN P11226 MBL2，MBL 248   甘露糖结合蛋白C前体(MBP-C)(MBP1)(甘露聚糖结合蛋白)(甘露糖结合凝集素) 335
MCP_HUMAN P15529 MCP 392   膜辅因子蛋白前体(CD46抗原)(滋养层白细胞共同抗原)(TLX) 336
CFAB_HUMAN P00751 BF 764   补体因子B前体(C3/C5转变酶)(备解素因子B)(甘氨酸富集的β糖蛋白)(GBG)(PBF2)[含有：补体因子BBa片段(aa：26-259)；补体因子B Bb片段(aa：260-764)] 337，338
CFAD_HUMAN P00746 DF 253   补体因子D前体(C3转变酶激活物)(备解素因子D)(Adipsin) 339，340
CFAH_HUMAN P08603  CFH，HF，HF1 1231 补体因子H前体(H因子1) 341，342
  PROP_HUMAN   P27918  PFC   469   备解素前体(因子P)   343，344
FCN2_HUMAN Q15485 FCN2 313   纤维胶凝蛋白-2(含有胶原/纤维蛋白原结构域的蛋白质2；纤维胶凝蛋白B；血清凝集素p35；L-纤维胶凝蛋白 660
FCN1_HUMAN O00602 FCN1 326   纤维胶凝蛋白-1(含有胶原/纤维蛋白原结构域的蛋白质1；纤维胶凝蛋白A；M-纤维胶凝蛋白) 661
FCN3_HUMAN O75636 FCN3 299   纤维胶凝蛋白-3(含有胶原/纤维蛋白原结构域的蛋白质3；含有胶原/纤维蛋白原结构域的凝集素3p35；Hakata抗原；因子-H) 662
2.补体起始途径
补体途径特征在于其起始依赖于不同分子和机制，但是所述途径的相似处是趋于产生相同系列的效应分子。C途径的趋向点是C3由C3转变酶(C3激活酶)裂解。转变酶是用于将无活性的补体蛋白转化为活性状态的补体酶的总称。例如，C3转变酶将C3转化为活性的C3a和C3b。不同的酶复合物具有C3转变酶活性。例如，在经典途径中，C4b2b作为C3转变酶；而在旁路途径中，C3bBb是C3转变酶(见表4)。C3裂解产生C3b和C3a，C3b作为调理素及作为补体系统的主要效应分子进行随后的补体反应，C3a是炎症的肽介导物。每个C3转变酶中加入C3b形成C5转变酶以产生C5a和C5b。C5a与C3一样，是炎症的肽介导物。C5b介导补体激活的“晚期”事件，起始最后产生膜攻击复合物(MAC)的系列反应。尽管三种途径产生不同的C3和C5转变酶，但是所有途径均产生C3和C5的剪接产物及形成MAC。
表4
a.经典途径
C1q是补体经典途径的第一种成分。C1q是钙依赖性结合蛋白，由于全面呈现结构同源而与蛋白质的胶原凝集素家族相关(Malhotra R et al.，ClinExp Immunol.1994，97(2)：4-9；Holmskov et al.Immunol Today.1994，15(2)：67-74)。甘露糖结合凝集素(MBL)是凝集素途径的第一种成分，其也是胶原凝集素家族的一个成员。胶原凝集素是由于其含有胶原样及凝集素结构域而命名。胶原凝集素结构的氨基末端胶原样区域与细胞表面受体相互作用，并赋予蛋白质结构稳定性。胶原凝集素结构的羧基末端区域具有钙依赖性凝集素活性。凝集素结构域由于对病原体表面上的碳水化合物的识别而介导胶原凝集素与多种病原体的相互作用。胶原凝集素通常被称作模式识别分子，一般作为靶病原体的调理素，通过免疫细胞发挥吞噬作用。与常规的胶原凝集素如MBL相反，C1q的羧基末端的球状识别结构域不具有凝集素活性，但是由于其球状结构域的静电表面电势的显著不同而可作为“荷电的”模式识别分子(Gaboriaud et al.J.Biol.Chem.，2003，278(47)：46974-46982)。
C1q以两种不同方式起始补体经典途径。首先，经典途径由C1q与免疫复合物(即抗原-抗体复合物或者聚集的IgG或IgM抗体)的相互作用而激活，因此将补体激活与引起抗体介导的体液免疫应答联系起来。当IgM或IgG的Fab部分(可变区)结合抗原时，Fc(恒定)区的构象被改变，使得C1q结合。C1q必须结合至少两个被激活的Fc区域，因此其利用两个IgG分子激活C1q。血清IgM是具有5个Fc区域的5个IgM分子的五聚体，因此IgM最有效地激活补体。IgA、IgE和IgD不结合C1q及不能激活补体。然而，C1q在没有抗体的情况中也能激活补体，从而在针对感染的先天或立即免疫应答中起作用。除了抗体之外，补体激活也可以通过C1q与非免疫分子如聚阴离子(细菌脂多糖、DNA和RNA)、某些小多糖、病毒膜、C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样P成分(SAP)及细菌、真菌和病毒膜成分的相互作用而实现。
C1q是C1复合物的一部分，其含有与每种C1r和C1s酶原的两个分子结合的单一C1q分子。一个以上的C1q球状结构域与靶表面(如聚集的抗体或病原体)的结合导致(C1r:C1s)2复合物中构象变化，这样使得C1r蛋白酶激活以裂解C1s而产生活性的丝氨酸蛋白酶。活性的C1s随后裂解补体成分C4和C2，产生C4b和C2b，其一起形成经典途径的C3转变酶。C3转变酶将C3裂解为C3b和C3a，C3b共价附着于病原体表面并作为调理素而起作用，C3a刺激炎症。一些C3b分子与C4b2b复合物结合产生C4b2b3b，后者是经典途径级联C5转变酶。表5总结了参与补体经典途径的蛋白质。
表5
Figure A20068004790000741
Figure A20068004790000751
b.旁路途径
旁路途径是由外源病原体在不存在抗体的条件下起始的。补体旁路途径的起始是通过C3自然水解为C3b而发生的。由于血清和组织蛋白酶活性导致体液中总是存在少量的C3b。宿主自身细胞通常含有高水平的膜硅酸，如果结合C3b则使其失活，但是细菌含有低水平的外在硅酸，从而结合C3b而不使其失活。病原体表面上的C3b由蛋白酶酶原因子B识别。因子B由因子D裂解。因子D是C系统唯一的活性蛋白酶，其作为活性酶而不是作为酶原循环，但是由于因子B是因子D的唯一底物，因此正常血清中存在低水平的活性蛋白酶对于宿主通常是安全的。因子B由因子D裂解产生活性产物Bb，其可与C3b结合形成C3bBb，这是旁路途径的C3转变酶。与经典途径相似，C3转变酶从C3中产生更多的C3b和C3a。C3b共价附着于病原体表面并作为调理素起作用，而C3a刺激炎症。一些C3b结合所述复合物形成C3bBb3b，这是旁路途径C5转变酶。C3bBb3b由血浆蛋白备解素或因子P稳定，其结合微生物表面并稳定转变酶。表6总结了参与补体旁路途径的蛋白质。
表6
c.凝集素途径
凝集素途径(也称作MBL途径)是在凝集素蛋白识别并结合病原体相关分子模式(PAMPs，即碳水化合物部分)之后起始的。激活补体凝集素途径的凝集素蛋白的例子包括甘露糖结合凝集素(MBL)和纤维胶凝蛋白(即L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白)。如上所述，MBL是蛋白质胶原凝集素家族的一个成员，以由相同多肽链组成的亚基的寡聚体形式存在，每条多肽链均含有半胱氨酸富集的、胶原样、颈状及碳水化合物识别或凝集素结构域。MBL作为模式识别分子通过其球状凝集素结构域以钙依赖性方式识别病原体表面上的碳水化合物部分，特别是中性糖如甘露糖或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。除了在补体系统中的作用之外，MBL还作为调理素促进吞噬细胞对细菌、病毒和真菌病原体的吞噬作用。另外，凝集素途径的其它起始物包括纤维胶凝蛋白，包括L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白(见例如Liu et al.(2005)J Immunol.，175：3150-6)。与MBL相似，纤维胶凝蛋白识别碳水化合物部分，例如N-乙酰葡糖胺和甘露糖结构。
MBL或纤维胶凝蛋白对旁路途径的激活与C1q对经典途径的激活类似，即单一的凝集素分子与两种蛋白酶酶原相互作用。在凝集素蛋白质的情况中，酶原是MBL-相关丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-2，其与经典途径的C1r和C1s酶原密切同源。基于凝集素蛋白对PAMP的识别，例如通过与病原体表面结合，MASP-1和MASP-2被激活，从而裂解C4和C2形成MBL级联C3转变酶。然后C3b与该复合物结合形成MBL级联C5转变酶。MASP活化不仅参与对微生物的应答，而且参与涉及暴露中性糖的任何应答，包括但非限于组织损伤，如在器官移植中观测到的组织损伤。与旁路级联一样，MBL级联不依赖于抗体而激活；与经典途径一样，MBL级联利用C4和C2形成C3转变酶。表7总结了参与补体凝集素途径的蛋白质。
表7
Figure A20068004790000761
3.补体介导的效应物功能
无论应用的起始途径如何，最终的结果均是激活的补体蛋白片段形成(例如C3a、C4a和C5a过敏毒素及C5b-9膜攻击复合物)。这些片段介导一些功能，包括白细胞趋化性、巨噬细胞的激活、血管通透性和细胞裂解(Frank，M.和Fries，L.Complement.In Paul，W.(ed.)Fundamental Immunology，RavenPress，1989)。补体产物的一些效应物功能在表8中概括示出。
表8：补体效应物分子与功能
  产物   活性
  C2b(激肽原)   体液的积聚
  C3a(过敏毒素)   嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱粒；增强的血管通透性；平滑肌收缩；阻抑T细胞的诱导
  C3b及其产物   调理作用；吞噬细胞活化
  C4a(过敏毒素)   嗜碱性粒细胞&肥大细胞活化；平滑肌收缩；增强的血管通透性
  C4b   调理作用
  C5a(过敏毒素；趋化因子)   嗜碱性粒细胞&肥大细胞活化；增强的血管通透性；平滑肌收缩；趋化作用；中性粒细胞聚集；氧化代谢刺激；白三烯释放的刺激；辅助T细胞的诱导
  C5b67   趋化作用；附着于其它细胞膜及周围细胞裂解
  C5b6789(C5b-9)   靶细胞的裂解
a.补体介导的裂解：膜攻击复合物
所有三种补体途径的补体级联的最后步骤均是膜攻击复合物(MAC)形成(图1)。C5可以由任何C5转变酶裂解为C5a和C5b。C5b与C6和C7于溶液中组合，C5b67复合物通过C7上的疏水位点与病原体脂质膜结合。C8与也具有疏水位点的C9的一些分子结合形成膜攻击复合物，也称作C5b6789或C5b-9。C5b-9形成膜上的孔，水和溶解物可以通过其，使得细胞渗透性裂解和细胞死亡。如果补体在没有C5b67可附着的脂质膜的抗原上激活，则C5b67复合物可结合附近的细胞并起始周围细胞溶解。单一的MAC可裂解红细胞，但是除非存在大量MAC，则有核的细胞可以胞吞MAC及修复损伤。革兰氏阴性细菌及其暴露的外膜和包膜的病毒通常对于补体介导的裂解敏感。敏感性较低的是革兰氏阳性细菌，其浆膜由其较厚的肽聚糖层保护，细胞壁周围有荚膜或粘液层的细菌或者无脂质包膜的病毒。另外，MAC在插入膜之前可以被与复合物结合的蛋白质破坏，如补体的链球菌抑制剂(SIC)和簇蛋白。典型地，MAC帮助破坏革兰氏阴性菌以及呈现外源抗原的人细胞(病毒感染的细胞、肿瘤细胞等)，通过导致其裂解及也可破坏包膜病毒的包膜进行破坏。
b.炎症
炎症是血管膨胀及变得更通透、因此使得机体防御细胞和防御化合物离开血液及进入组织的过程。补体激活导致一些促炎介导物如C3a、C4a和C5a形成。血清或血浆中完整的过敏毒素通过羧肽酶N的作用而迅速转变为更稳定的、活性较低的C3a-desArg、C4a-desArg、或C5a-desArg形式。C3a、C4a和C5a及较低程度的其desArg衍生物，是强有效的生物活性多肽，由于其炎症活性而被称作过敏毒素。过敏毒素结合各种类型细胞上的受体，刺激平滑肌收缩、增加血管通透性、及激活肥大细胞释放炎症介导物。在三种过敏毒素中，C5a是最强有效的。C5a主要作用于白细胞，特别是中性粒细胞。C5a刺激白细胞粘附于血管壁的感染部位，通过刺激粘附分子的表达增加使得白细胞可以从血管中挤出及进入组织中，这是称作血细胞渗出的过程。C5a也刺激中性粒细胞产生具有胞外杀伤力的活性氧、蛋白酶解酶和白三烯。C5a也通过诱导趋化因子、细胞因子及其它促炎介导物的产生而间接地进一步增强炎症过程。C5a也与肥大细胞相互作用，释放血管扩张剂如组胺以使得血管更加通透。C3a也与血细胞相互作用，主要作用于嗜酸性粒细胞，提示C3a在变态反应性炎症中的作用。C3a诱导平滑肌收缩、增强血管通透性，及导致嗜碱性粒细胞脱粒和组胺及其它血管活性物的释放。C2a可以转化为C2激肽，其通过使得血管膨胀而调节血压。
尽管在学术上不认为过敏毒素iC3b(C3b的无活性衍生物)诱导白细胞粘附于血管内皮及通过结合其细胞表面诱整联蛋白受体而诱导促炎细胞因子IL-1的产生。C5b-9也间接刺激白细胞粘附、活化和趋化，通过诱导细胞粘附分子如E-选择素的表达及诱导白细胞介素-8分泌而实现(Bhole et al.(2003)Crit Care Med 31(1)：97-104)。C5b-9也刺激引起炎症的二级介导物的释放，例如前列腺素E2、白三烯B4和血栓烷。
人补体成分C3和C5向产生其各自的过敏毒素产物的转化涉及某些天然发生的病理状态，包括：自身免疫疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、恶性肿瘤、心肌梗塞、Purtscher′s视网膜病、脓毒症及成人呼吸窘迫综合征。另外，在与如下医源性补体激活相关的某些病变中检测到C3a和C5a的循环水平增加：心肺旁路术、肾脏透析、及尼龙纤维白细胞去除术(nylon fiber leukaphoresis)。C4a过敏毒素水平的增高与上述自身免疫疾病相关。
c.趋化性
趋化性是细胞应答其环境中的化合物而定向迁移的过程。在免疫应答中，多种趋化因子指导细胞如吞噬细胞的运动至感染部位。例如，C5a是循环中的中性粒细胞的主要趋化因子，但也可以诱导单核细胞的趋化性。吞噬细胞朝向C5a浓度增加的方向运动，随后通过其CR1受体而附着于与抗原附着的C3b分子。用嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及单核吞噬细胞观测到的C5a的趋化作用在低如10-10M的浓度是活性的。
d.调理作用
补体的一个重要作用是促进吞噬细胞对病原体的摄取和破坏。这是通过称作调理作用的过程发生的，其中结合靶细菌的补体成分与吞噬细胞如中性粒细胞或巨噬细胞表面上的补体受体相互作用。在这种情况中，补体效应分子称作调理素。病原体的调理作用是C3b和C4b的主要功能。iC3b也作为调理素起作用。C3a和C5a增加吞噬细胞上C3b受体的表达及增加其代谢活性。
C3b及较低程度的C4b帮助从机体中除去有害的免疫复合物。C3b和C4b使得免疫复合物附着于红细胞上的CR1受体。然后红细胞输送该复合物至脾和肝内的固定巨噬细胞进行破坏。免疫复合物可导致有害的III型超敏性。
e.体液免疫应答的激活
B细胞的激活需要B细胞受体(BCR)与抗原的连接。然而已经示出补体在降低B细胞对抗原的应答阈值中起作用，降低直至1000倍。这通过自C3的破坏片段中产生的补体产物C3d或C3dg与可与BCR共连接的B淋巴细胞上的CR2受体的结合而发生。当用C3d调理的抗原颗粒例如免疫复合物通过C3d结合CR2受体以及通过抗原结合BCR时发生共连接。当C3d结合抗原增强抗原呈递细胞如树突细胞对抗原的摄取时，抗原复合物的共连接也可以发生，其然后可将抗原呈递给B细胞以增强抗体应答。CR2缺陷的小鼠呈现B细胞功能缺陷，导致天然抗体的水平降低及体液免疫应答削弱。
4.补体受体
细胞对补体效应分子的识别以起始效应物功能如趋化性和调理作用是由不同的补体受体介导的。补体受体分布于广泛的细胞类型上，包括红细胞、巨噬细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞。基于补体成分与受体的结合，受体起始胞内信号级联，产生细胞应答如刺激对细菌的吞噬作用及从细胞中分泌炎症分子。例如，补体受体CR1和CR2识别C3b、C4b，其产物对于刺激趋化性是重要的。CR3(CD11b/CD18)和CR4(CD11c/CD18)是整联蛋白，其在吞噬作用应答中的重要性相似，但是在应答iC3b的白细胞粘附和迁移中起作用。C5a和C3a受体是G蛋白偶联受体，在C5a和C3a过敏毒素的许多促炎介导的功能中起作用。例如，C3a受体C3aR存在于肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞及单核细胞上并直接参与C3a的促炎作用。
5.补体调节
尽管补体系统通过对抗外源病原体的保护作用而有益于宿主，但是炎症介导物的产生可以是毒性及有害的，导致如下文论述的多种炎症疾病。另外，尽管补体系统的大多数活性蛋白酶是仅基于裂解才变为局部活性的酶原，但是几乎所有补体成分在血清中均低速自然活化，因此需要将其活性最小化。因此，已经鉴别了补体系统的调节蛋白。其主要功能是调节补体激活分子的活性以防止过量的补体激活和宿主组织的自溶性破坏。这些补体调节物是可溶的血浆蛋白或者在多种类型细胞上表达的完整膜蛋白。前者包括C4b结合蛋白(C4bp)和因子H。后者包括C3b/C4b受体(补体受体1，CR1，CD35)、膜辅因子蛋白(MCP，CD46)及衰变加速因子(DAF，CD55)。这些蛋白质具有许多结构相似性。每种蛋白质均由多个长度为大约60个氨基酸的具有保守的半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸残基的短共有重复序列(SCR)组成。编码这些蛋白质的基因已经定位于1号染色体，统称为补体激活调节物(RCA)基因簇(Hourcade et al.(1989)Adv.Immunol.45：381)。
C1抑制剂(C1INH)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其使得激活的C1r和C1s与C1q解离，限制该复合物的活性时间。C1INH还阻断血浆蛋白酶对C1的自发激活。C1INH的缺乏与称作血管神经性水肿的严重突发性水肿(肿胀)相关。一些抑制性蛋白质使得C3与C5转变酶解离，及通过因子I(一种血浆蛋白酶)促进C4b和C3b降解。因子I以活性形式循环，但是其仅能裂解与辅因子蛋白结合的C3b和C4b。因子I裂解C3b导致iC3b、C3c、C3d、C3f和C3dg产生，从而永久失活C3b，尽管降解产物可作为效应物分子，例如iC3b作为调理素。C4b当裂解为C4c和C4d时而失活。作为因子I的辅因子的抑制蛋白包括解离经典途径C3转变酶的血浆蛋白C4结合蛋白，及解离旁路途径C3转变酶的因子H，及膜蛋白补体受体1(CR1)，衰变加速因子(DAF)及膜辅因子蛋白(MCP)，其抑制这两种途径的活性。因子I的辅因子调节其活性。例如人细胞产生因子H，其结合C3b并使得因子I失活C3b。另一方面，一些物质如不表达因子辅因子的细菌细胞上的LPS促进因子B与C3b的结合，这样保护C3b免于被因子I失活。
其它膜和血浆蛋白阻断宿主细胞上MAC形成，以防止MAC不适当地插入膜中。一些血浆蛋白如可溶蛋白C8β结合C5b67复合物并抑制其插入细胞膜中。宿主细胞膜也含有称作HRF的膜结合蛋白(CD59，保护素(protectin))，其抑制C9与C5b678的结合，防止自体或同种异体细胞上膜攻击复合物的形成。
因子I
因子I(fI)是在补体级联反应的产生和扩大中起作用的补体系统中几种丝氨酸蛋白酶(也包括因子D，MBL-相关丝氨酸蛋白酶(MASP)-2，C1s，C1r，因子B和C2)之一。所有补体丝氨酸蛋白酶具有与胰蛋白酶家族的结构域同源性，及共有可以确定底物特异性的一些结构特征。因子I的C末端由胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶轻链组成，其基于与其它丝氨酸蛋白酶的同源性，含有形成His-Asp-Ser催化三元体的残基。另外，存在一些残基限定了特异性口袋(D501)和扩展的底物结合位点S527、W528和G529(在无信号肽的情况中基于成熟蛋白质的编号，见例如Tsiftsoglou et al.，(2005)Biochemistry44：6239)。
因子I通过裂解经典、旁路和凝集素途径中C3转变酶的成分C3b和C4b而在调节补体激活中起作用，从而使所述途径失活。fI底物C3b和C4b的裂解需要通过硫酯键的形成而引起的底物构象改变。例如，C3由转变酶经蛋白酶解活化为C3b，导致构象从由潜伏形式转变为导致分子内硫酯与亲核体如水反应的C3b形式，从而使得C3b对于fI裂解敏感(Ogata et al.，(1998)J Immunol 161：4785)。硫酯与水的反应可以在无转变酶裂解的条件下发生，产生称作iC3和iC4的水解失活形式的C3和C4。例如，iC3是C3b的模拟物；iC3对fI裂解敏感，可以取代C3和C5转变酶中的C3b。通常地，因子I对C3b和C4b底物的裂解需要与辅因子蛋白质的三元复合物形成，所述辅因子蛋白如因子H或C4结合蛋白及MCP。然而，合成底物由因子I的裂解不需要存在辅因子(Tsiftsoglou et al.，(2004)J Immunol173：367-375)。由fI的裂解限于底物中精氨酰键的裂解。C3中的fI裂解位点是LPSR(SEQ ID NO：388)和SLLR(SEQ ID NO：389)，C4中的裂解位点是HRGR(SEQ ID NO：390)。
6.补体介导的疾病和病变
根据疾病和病变的病因学中补体系统的关键作用，补体系统在这种疾病和病变中可作为治疗干预点。本发明提供的蛋白酶靶向这个系统并可以对其加以调节。
本领域技术人员已知补体系统在疾病过程中的作用及了解许多这样的疾病。下文描述了一些疾病的例子及补体系统在其病因学和病理学中的作用。本发明提供的蛋白质对补体系统的调节可用来治疗这种疾病。疾病可包含补体的活化或抑制。
a.由补体激活介导的疾病
补体级联是双刃剑，通过促进针对细菌和病毒入侵的吞噬作用和炎症起到保护作用。相反，甚至当补体正常发挥功能时，通过促进局部炎症和对组织的损害而导致疾病的发生。因此，负责补体保护性作用的同一介导物可介导致病作用。例如，过敏性和趋化性肽C5a通过募集和激活嗜中性粒细胞驱动炎症，C3a可导致其它吞噬细胞的病理性激活，及膜攻击复合物可杀死或损伤细胞。在一个实例中，如在自身免疫疾病中，补体由于在不适当的环境中如被宿主组织的抗体激活而产生组织损伤。在其它情况中，补体可以被正常激活，如败血症；但是仍引起疾病进展，如在呼吸窘迫综合征中。在病理学方面，如果对其未进行充分控制，补体可以导致对血管(脉管炎)、肾基底膜及附着的内皮和上皮细胞(肾炎)、关节滑膜(关节炎)和红细胞(溶血)的实质损害。
补体在许多疾病的免疫-发病机制中起作用，所述疾病包括自身免疫疾病如类风湿性关节炎(见例如Wang et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：8955-8959；Moxley et al.(1987)Arthritis & Rheumatism 30：1097-1104)、红斑狼疮(Wang et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：8563-8568；及Buyon et al.(1992)Arthritis Rheum.35：1028-1037)和急性肾小球肾炎(Couseret al.(1995)J Am Soc Nephrol.5：1888-1894)。其中涉及补体系统活化的其它病变包括脓毒症(见例如Stove et al.(1996)Clin Diag Lab Immunol3：175-183；Hack et al.(1989)Am.J.Med.86：20-26)、呼吸窘迫综合征(见例如Zilow et al.(1990)Clin.Exp.Immunol.79：151-157；及Stevens et al.(1986)J.Clin.Invest.77：1812-1816)、多器官衰竭(见例如Hecke et al.(1997)Shock7：74；及Heideman et al.(1984)J.Trauma 24：1038-1043)及缺血-再灌注损伤如在心血管疾病如中风或心肌梗塞中发生(Austen WG et al.(2003)Int JImmunopathol Pharm 16(1)：1-8)。一些补体介导的疾病的例子在下文描述。
i.类风湿性关节炎
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎症疾病，是一种自身免疫疾病，其中免疫系统将正常组织当作入侵的病原体一样进行攻击。与类风湿性关节炎相关的炎症主要攻击关节内层。内衬血管、心和肺的膜也可能发炎。RA特征在于发炎滑膜及确定的疾病淋巴滤泡和生发中心存在激活的B细胞和血浆细胞。这样导致滑膜及关节软骨相关部位的局部产生高水平的免疫球蛋白及免疫复合物包括IgG和IgM类风湿因子的沉积，作为补体级联的起始物。在发炎的类风湿性关节中已经发现增高水平的补体成分，如C3a、C5a和C5b-9。这些补体成分通过诱导许多促炎活性如改变血管通透性、白细胞趋化性及多种类型细胞的活化和裂解，可加剧与RA相关的炎症。
ii.脓毒症
脓毒症是由严重感染如细菌感染引起的疾病，导致全身性炎症反应。尽管其它细菌、病毒和真菌感染也可刺激脓毒症状，但是细菌细胞壁成分脂多糖通常与脓毒症相关。如果机体天然免疫系统不能防御入侵的微生物则通常导致感染性休克，例如免疫应答的促炎结果是对宿主组织的损害。脓毒症的早期症状特征在于过量的补体激活，导致产生的补体过敏毒素如C3a、C4a和C5a增多，其可导致血管通透性增加、刺激嗜中性粒细胞中过氧化物产生及刺激组胺释放。C5a的作用可以有助于对细菌感染的生产性免疫应答，但是如果未做调节，C5a也可以具有严重损害。在大肠杆菌(E.coli)诱导的炎症模型中，对C5a的阻断通过限制了可导致嗜中性粒细胞介导的组织损伤的C5a介导的嗜中性粒细胞活化而改善了脓毒症动物的结果。
对于细菌感染的先天性免疫应答的持续损伤通常导致慢性脓毒症或感染性休克，其可以危及生命。在脓毒症的晚期，嗜中性粒细胞处于“静止”活性，与在早期出现的超活性相反，导致疾病进一步发展。在晚期阶段，嗜中性粒细胞的主要功能包括趋化性、呼吸爆发活性及细菌杀灭能力均降低。补体、特别是C5a在脓毒症的晚期也起作用。在脓毒症期间C5a的过量产生与血液嗜中性粒细胞的“失活”相关，这个失活过程与C5a诱导的嗜中性粒细胞上其自身受体C5aR的负调节相关(Guo et al.(2003)FASEB J13：1889)。嗜中性粒细胞上C5aR水平的降低与血液嗜中性粒细胞结合C5a的能力降低，受损的趋化应答，丧失过氧化物产生及受损的杀菌活性相关。然而，C5aR水平在脓毒症的晚期可开始“恢复”并与有益的疾病结果相关。
iii.多发性硬化
多发性硬化(MS)及其动物模型实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是中枢神经系统(CNS)的炎症性脱髓鞘疾病。在MS中，神经组织的炎症导致髓磷脂丧失，这是作为脑和脊髓中神经纤维的保护性绝缘体的一种脂肪物质。脱髓鞘产生沿着神经细胞覆盖物的多个部位的疤痕组织(硬化)，这破坏了神经向脑部及从脑部传导电刺激的能力，产生MS的各种症状。MS由激活的淋巴细胞、巨噬细胞/小胶质细胞及补体系统介导。补体激活通过其双重作用有助于这些疾病的发病机制，所述双重作用为：激活的终末复合物C5b-9促进脱髓鞘的能力及亚溶解的C5b-9保护少突胶质细胞(OLG)凋亡的能力。
iv.阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)特征在于脑内的神经纤维缠结(tangles)(蛋白质τ的异常配对的螺旋纤丝，其通常结合微管)和斑块(主要由β淀粉样蛋白质组成的胞外沉积物)。尽管不完全明了AD的精确发生原因，但是AD患者脑中受影响区域的慢性神经炎症提示促炎介导物可起作用。AD患者脑内神经纤维缠结和斑块是激活的补体片段的沉积，例如C4d和C3d。另外，AD患者脑中营养不良的神经突可以被MAC免疫染色，表明AD中这些神经突的自身催化性攻击及伴随神经突丧失。AD中补体的活化是由于聚集的β淀粉样蛋白质诱导的抗体非依赖性机制而发生的。另外，补体级联可以通过在AD中均被正调节的正五聚蛋白、C反应蛋白(CRP)和淀粉样P物质(AP)激活(McGeer et al.，(2002)Trends Mol Med 8：519)。AD中补体的活化以补体介导物增多为标示，不足以为补体调节蛋白如CD59的补偿性正调节所控制。因此，补体激活的促炎结果加剧了AD病进展，并很可能导致神经突破坏。
v.缺血-再灌注损伤
缺血-再灌注损伤是在缺血事件及随后的血流恢复之后发生的损伤，得自对于缺氧损伤后的炎症应答。缺血-再灌注损伤在心脏手术期间例如心脏直视手术或血管成形术中可以是急性的，或者在充血性心力衰竭或闭塞性心血管疾病中是慢性的。可导致缺血-再灌注损伤的例子包括心肌梗塞(MI)和中风。炎症应答的起始很可能是由于组织氧水平增加所致，组织氧水平的增加与再灌注及伴随的可产生免疫刺激性的氧自由基的代谢物积聚相关。其与多种事件相关，包括心肌梗塞、脑缺血、肠缺血的严重性及血管手术、心脏手术、外伤和移植的许多方面。损伤通过将新改变的组织作为非自身组织应答的先天免疫系统的炎症事件而证明，特别是补体系统的激活。这种缺血-再灌注损伤特征在于血管通透性增加所致组织水肿及多形核白细胞的流入所致急性炎症性细胞侵润。
补体系统的活化在缺血-再灌注损伤的炎症事件中起作用。缺血损伤导致细胞膜改变，影响脂质、碳水化合物或者外表面的蛋白质，由此这些暴露的表位被改变及可作为新抗原(修饰的自身抗原)而起作用。循环中的IgM识别并结合所述新抗原，在损伤的细胞表面上形成免疫复合物。所形成的抗原-抗体复合物是补体经典途径的经典激活物，尽管所有途径很可能均以一些方式参与损伤的加剧。补体经典途径参与缺血-再灌注损伤通过小鼠C3或C4遗传缺陷模型证明，该模型显示对小鼠后肢局部损伤和损伤动物模型的相同保护作用(Austen et al.(2003)Int J Immunopath Pharm 16：1)。相反，在缺血性损伤的肾脏模型中，C3-、C5-和C6-缺陷的小鼠被保护，而C4-缺陷的小鼠则否，提示旁路补体途径的重要性(Guo et al.(2005)Ann RevImmunol 23：821)。基于补体激活诱导的介导物起始针对细胞膜局部损伤部位的炎症应答。
缺血-再灌注损伤中补体的主要效应物机制是由于补体成分如C5a导致嗜中性粒细胞流入发炎组织及活化。嗜中性粒细胞的活化导致局部损伤的器官中产生的活性氧增多及溶酶体酶释放，最后导致细胞凋亡、坏死或器官功能丧失。缺血-再灌注损伤中最终MAC、C5b-9的产生也引起局部组织损伤。
b.由补体缺陷介导的疾病
疾病的发生也可以是由于缺乏对于控制感染重要的补体成分而引起。补体缺陷与频繁的感染及免疫复合物疾病相关。在除了C9之外的所有补体因子中鉴别了缺陷，包括因子D和备解素。缺陷也在补体调节蛋白C1INH、因子I、因子H、DAF和HRF中鉴别。
通常地，补体成分的缺陷由于调理作用和吞噬作用降低而导致细菌感染增加。典型地，作为调理素而起作用的补体成分如C3b的缺陷导致对于感染的易感性增加。例如，尽管任何晚期补体成分缺陷的个体相对不受影响，但是缺少C3或者催化C3b沉积的任何分子的个体示出对于广泛的胞外细菌感染的易感性增加。另外，MBL(通常作为传统的调理素及识别外源病原体后作为补体凝集素途径的起始物)缺陷的人群通常对于感染的易感性增加，特别是在儿童早期。晚期补体成分包括参与膜攻击复合物的形成的C5-C9的缺陷对于细菌感染的作用更有限。C5-C9的缺陷仅示出与奈瑟氏球菌(Neisseria)感染的易感性相关，该细菌导致淋病和细菌性脑膜炎。
补体缺陷的另一结果是免疫复合物疾病。免疫复合物疾病是由应答循环血液和组织中现存抗原-抗体复合物的补体介导的炎症所致疾病。由于补体经典途径的早期成分起始补体应答抗原-抗体复合物的识别，因此这些早期成分如C1q的缺陷可导致自身免疫疾病如系统性红斑狼疮。
补体调节蛋白如因子H、DAF和HRF的缺陷也可导致补体介导的疾病。例如，未受控制的补体活化可导致补体蛋白的耗尽，导致细菌、特别是遍在的化脓菌的感染增加。这是遗传因子I缺陷的一种情况，其中因子I不存在及不能抑制C3转变酶的激活。其它例子包括补体调节蛋白DAF或HRF，其通常保护人体自身细胞表面免于补体激活的影响，但是当其缺陷时导致宿主红细胞破坏而引起突发性夜间血红蛋白尿。C1抑制剂的缺陷引起遗传性血管神经性水肿，这是丝氨酸蛋白酶包括补体成分C1r和C1s以及其它丝氨酸蛋白酶如因子XIIa和激肽释放酶的未受调节的活性所致。这些丝氨酸蛋白酶的未受调节的活性的结果是产生各种血管活性介导物，如通过C1s和C2a的活性产生的C2激肽，其导致组织和会厌部位液体积聚肿胀，而可导致窒息。
C.蛋白酶
本发明提供了蛋白酶及使用所述蛋白酶裂解(从而失活)参与疾病过程的蛋白质的方法。典型地，本发明提供的蛋白酶是非补体蛋白酶，其通常不参与补体途径。本发明提供的示例蛋白质裂解补体途径的任一或多种蛋白质或成分及其等位基因变体。补体蛋白的裂解可以是激活裂解，从而补体途径的活性被增强，例如酶原被裂解成为活性形式蛋白酶或者补体蛋白被裂解成为其裂解效应物分子。补体蛋白的裂解也可以是抑制性裂解，从而补体蛋白的活性被降低。本发明提供了这样的蛋白酶，其以抑制性方式裂解补体蛋白，从而抑制任一或多个补体途径的补体激活。本发明提供的蛋白酶可用于调节补体激活。本发明提供的蛋白酶可在体外或体内裂解任一或多种补体蛋白，从而在体外或体内影响补体激活。
蛋白酶可以是全长蛋白酶的任何部分，只要蛋白酶的该部分保留蛋白酶解活性即可。例如，蛋白酶可仅包括多肽的蛋白酶结构域或其任何催化活性部分。所述蛋白酶结构域可包括其单链蛋白酶结构域，可以是融合蛋白或缀合物，只要所得融合蛋白或缀合物保留蛋白酶解活性即可。
如果蛋白酶或其一部分识别靶蛋白例如补体蛋白内的底物序列，(i)其通过基于催化肽键水解而失活靶蛋白质，从而改变功能，(ii)靶蛋白质是特定疾病的分子干预点，工程化的蛋白质通过蛋白酶解介导的失活事件而具有治疗作用。可以改变的补体活性包括但非限于红细胞的溶血和/或效应物补体裂解产物例如但非限于C3a、C3b、C4a、C5a、C5b-9和Bb的产生。补体的生物学活性可以在体外或体内改变。通常地，与没有蛋白酶相比，补体活性由蛋白酶改变至少0.1、0.5、1、2、3、4、5或10倍。典型地，生物学活性与不存在蛋白酶的条件下的活性相比改变10、20、50、100或1000倍或更多倍。对于本发明的补体活性而言，蛋白酶调节补体激活或补体介导的活性。
本发明提供的蛋白酶可以来自任一或多个丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金属-或苏氨酸类别或蛋白酶。可以对蛋白酶进行检测以确定其是否裂解任一或多种补体蛋白和/或可用作支架以在任一或多个氨基酸残基中进行修饰以调节对于靶底物的特异性和/或调节靶底物活性。促成底物特异性的蛋白酶和氨基酸决定簇的类别的例子在下文描述。
1.蛋白酶的类别
蛋白酶(也称作蛋白酶或肽酶)是识别靶蛋白内氨基酸或多肽底物序列的蛋白质降解酶。基于对底物氨基酸序列的识别，蛋白酶催化靶蛋白内肽键的水解和裂解。依赖于全长靶序列内肽键的位置，靶蛋白的这种水解可以失活靶蛋白。
蛋白酶基于其攻击蛋白质的方式而分类，外切或内切蛋白酶。蛋白酶或内切肽酶攻击蛋白质内部，产生较大的肽。肽酶或外切肽酶攻击蛋白质的末端或片段，产生小肽和氨基酸。肽酶基于其作用模式而分类：氨基肽酶从氨基末端裂解氨基酸；羧肽酶从羧基末端裂解氨基酸；二肽基肽酶裂解两个氨基酸；二肽酶裂解二肽；三肽酶从三肽中裂解氨基酸。大多数蛋白酶分子量小，为21,000-45,000道尔顿。许多蛋白酶是以称作酶原的无活性形式合成和分泌的，随后通过蛋白酶解激活。这样改变了酶活性位点的结构。
蛋白酶利用一些独特类型的催化机制(Barret et al.(1994)Meth.Enzymol.244：18-61；Barret et al.(1994)Meth.Enzymol 244：461-486；Barretet al.(1994)Meth.Enzymol.248：105-120；Barret et al.(1994)Meth.Enzymol.248：183-228)。基于其催化机制，羧基肽酶再分为丝氨酸-、金属和半胱氨酸-型羧肽酶，内切肽酶再分为丝氨酸-、半胱氨酸-、天冬氨酸-、苏氨酸-和金属内切肽酶。丝氨酸肽酶在活性中心包含丝氨酸残基，天冬氨酸型肽酶在催化中心具有两个天冬氨酸，半胱氨酸型肽酶具有半胱氨酸残基，苏氨酸型肽酶具有苏氨酸残基，金属肽酶在催化机制中使用金属离子。通常地，蛋白酶可以基于其催化活性分类，由此蛋白酶的类别可包括丝氨酸-、半胱氨酸-、天冬氨酸-、苏氨酸-或金属蛋白酶。蛋白酶的催化活性为裂解靶底物所需。因此，修饰蛋白酶以改变蛋白酶的催化活性可影响(即增强特异性/选择性)蛋白酶裂解底物的能力。
每种蛋白酶均具有一系列氨基酸，其排列成活性位点口袋及使得与底物直接接触。肽酶的晶体结构示出活性位点通常位于相邻结构域之间分子表面上的沟中，底物特异性由沿着催化位点一或两侧上所述沟排列的结合位点的性质显示，催化位点负责易断裂键的水解。因此，肽酶的特异性通过每个亚位点容纳单一氨基酸残基的侧链的能力而描述。所述位点从催化位点开始编号，S1、S2...Sn朝向底物的N末端，S1′、S2′...Sn′朝向C末端。它们容纳的残基分别编号为P1、P2...Pn和P1′、P2′...Pn′。靶蛋白的裂解在P1和P1’之间被催化，其中从多肽底物的N末端至C末端的氨基酸残基被标记(Pi、...、P3、P2、P1、P1′、P2′、P3′、...、Pj)及标记了蛋白酶上其相应的结合识别口袋(Si、...、S3、S2、S1、S1′、S2′、S3′、...、sj)(Schecter和Berger(1967)Biochem Biophys Res Commun 27：157-162)。因此，P2与S2相互作用，P1与S1相互作用，P1’与S1’相互作用等。结果，蛋白酶的底物特异性来自活性位点中的S1-S4位置，蛋白酶与肽底物序列的P1-P4残基接触。在一些情况中，活性位点的S1-S4口袋之间有较少(如果有的话)的相互作用，由此每个口袋看起来识别和结合独立于其它口袋的肽底物序列上相应残基。因此，一个口袋中的特异性决定簇可以改变而不影响其它口袋的特异性。
基于家族成员的多种结构和模型，对于许多蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和苏氨酸蛋白酶家族已经确定了有助于扩展的底物特异性及与底物的其它二级相互作用的表面残基(见例如Wang et al.，(2001)Biochemistry 40(34)：10038-46；Hopfner et al.，(1999)Structure Fold Des.7(8)：989-96；Friedrich et al.(2002)J Biol Chem.277(3)：2160-8；Waugh et al.，(2000)Nat Struct Biol.7(9)：762-5；Cameron etal.，(1993)J Biol Chem.268：11711；Cameron et al.，(1994)J Biol Chem.269：11170)。可以对蛋白酶加以检测以确定其是否裂解任一或多种补体蛋白和/或可用作支架以在任一或多个氨基酸中进行修饰以调节对于补体蛋白靶底物的特异性和/或调节补体蛋白靶底物的活性。为了产生具有改变的底物识别谱(profile)的修饰的蛋白酶，可以针对有助于底物选择性(特异性决定簇)的三维结构中的氨基酸进行诱变。蛋白酶的例子包括但非限于任何蛋白酶，如下文描述和本发明提供的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或苏氨酸蛋白酶。
a.丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶(SP)，包括胞质贮存细胞器分泌的酶和隐藏的酶，具有许多生理学作用，包括在血液凝固、伤口愈合、消化、免疫应答和肿瘤侵润和转移中起作用。例如，糜蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶在消化道中起作用；因子10、因子11、凝血酶和纤溶酶参与凝血和伤口愈合；C1r、C1s和C3转变酶如上述在补体激活中起作用。
一类称作II型跨膜丝氨酸蛋白酶的细胞表面蛋白是这样的蛋白酶，其是具有胞外结构域的膜锚定蛋白质。作为细胞表面蛋白，它们在胞内信号转导和介导细胞表面蛋白酶解中起作用。其它丝氨酸蛋白酶是膜结合蛋白酶，并以相似方式起作用。另外的蛋白酶是分泌的蛋白酶。许多丝氨酸蛋白酶基于结合细胞表面受体而发挥其活性，并因此作用于细胞表面。细胞表面蛋白酶解是产生介导多种细胞功能的生物学活性蛋白质的机制。
丝氨酸蛋白酶，包括分泌的和跨膜的丝氨酸蛋白酶，参与包括肿瘤发生和进展的过程。虽然这些蛋白酶的精确作用还未充分阐述，但是丝氨酸蛋白酶及其抑制剂参与控制许多胞内和胞外生理学过程，包括在癌细胞侵润和转移传播中的降解作用及参与肿瘤进展的肿瘤的新血管化。蛋白酶参与胞外基质(ECM)的降解和重塑(remodeling)及有助于组织重塑，为癌症侵润和转移所必需。一些蛋白酶的活性和/或表达已经示出与肿瘤进展或发生相关。
丝氨酸蛋白酶家族中蛋白酶的活性依赖于形成其活性位点的一组氨基酸残基。一种残基总是丝氨酸；因此将其称作丝氨酸蛋白酶。例如，糜蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶呈现相似的结构，其活性丝氨酸残基在所有这三种蛋白酶中位于相同位置(Ser-195)。尽管其具有相似性，但是它们具有不同的底物特异性；它们在蛋白质消化期间裂解不同的肽键。例如，糜蛋白酶优选残基上芳香侧链，其羰基碳是被裂解的肽键的一部分(下文蓝色R组)。胰蛋白酶优选这个位置的荷正电荷的Lys或Arg残基。丝氨酸蛋白酶的底物识别性质显著不同：一些是高度特异性的(即蛋白酶参与血液凝固和免疫补体系统)；一些仅是部分特异性的(即哺乳动物消化性蛋白酶胰蛋白酶和糜蛋白酶)；另一些蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶(一种细菌蛋白酶)是完全非特异性的。尽管特异性中存在这些差异，但是丝氨酸蛋白酶的催化机制是充分保守的。
丝氨酸蛋白酶对靶蛋白的裂解机制基于丝氨酸对靶向肽键的亲核攻击。半胱氨酸、苏氨酸或者与天冬氨酸或金属结合的水分子也可起这种作用。在许多情况中，这组蛋白酶的亲核性质通过组氨酸的存在得以改善，通过天冬氨酸保持“质子受体状态”。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的排列的侧链组成大多数丝氨酸蛋白酶的催化三元体。例如，糜蛋白酶和是与糜蛋白酶相同家族成员的丝氨酸蛋白酶例如MT-SP1的活性位点残基是Asp102、His57和Ser195。在已经鉴别的超过20个丝氨酸蛋白酶家族中(以S1-S27表示)，基于结构相似性和其它功能特点被分为6个集团(clan)(SA、SB、SC、SE、SF和SG)(Rawlings ND et al.(1994)Meth.Enzymol.244：19-61)。一些丝氨酸肽酶的反应机制存在相似性。糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和羧肽酶C集团通常具有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸催化三元体：丝氨酸作为亲核体，天冬氨酸作为亲电体，组氨酸作为碱基。催化残基的几何方向在家族中是相似的，尽管有一些不同的蛋白质折叠。催化残基的线性排列通常反映集团关系。例如糜蛋白酶集团(SA)中的催化三元体是有顺序的HDS，但是枯草杆菌蛋白酶集团(SB)中是有顺序的DHS，羧肽酶集团(SC)中是有顺序的SDH。
在丝氨酸蛋白酶的糜蛋白酶家族中，底物与酶之间的主链相互作用完全保守，但是侧链相互作用变化显著。含有活性位点S1-S4口袋的氨基酸的相同性决定了该特定口袋的底物特异性。将一个丝氨酸蛋白酶的氨基酸与相同折叠的另一蛋白酶的氨基酸嫁接，使特异性从一方修饰为另一方特异性。典型地，含有S1-S4口袋的蛋白酶的氨基酸是底物中具有4-5埃侧链的那些氨基酸。这些氨基酸与蛋白酶底物的相互作用通常称作“第一层(first shell)”相互作用，因为其直接接触底物。然而，可以有“第二层”和“第三层”相互作用，最终位于第一层氨基酸。第一层和第二层底物结合作用主要通过β-桶结构域之间的环决定。因为这些环不是蛋白质的核心元件，折叠的完整性保持，而具有新底物特异性的环变体可以在进化期间加以选择以达到分子水平必需的代谢或调节小环境(niche)。典型地对于丝氨酸蛋白酶而言，如下一级序列中基于糜蛋白酶编号的氨基酸是特异性的决定簇：195、102、57(催化三元体)；189、190、191、192和226(S1)；57，58和64之间的环和99(S2)；192、217、218(S3)；Cys168和Cys180之间的环、215和97至100(S4)；41和151(S2’)，其中S1位置中的氨基酸影响P1特异性，S2位置中的氨基酸影响P2特异性，S3位置中的氨基酸影响P3特异性，及S4位置中的氨基酸影响P4特异性。丝氨酸蛋白酶中第189位残基是掩藏在口袋底部的决定S1特异性的残基。各种丝氨酸蛋白酶的结构决定簇列于表9，基于成熟糜蛋白酶编号，每个命名的蛋白酶的蛋白酶结构域与糜蛋白酶的蛋白酶结构域排列对比。Cys168-Cys182和60’s环列标题下面的数字表示两个氨基酸之间的环中和环中氨基酸的数目。在Cys191-Cys220列标题下的“是/否”名称表示蛋白酶中是否存在二硫键。这些区域在糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族中是可变的，代表其自身结构决定簇。对蛋白酶进行修饰改变S1-S4口袋中的任一或多个氨基酸影响蛋白酶对于靶底物的特异性或选择性。
表9：各种丝氨酸蛋白酶的结构决定簇
Figure A20068004790000901
Figure A20068004790000911
i.MT-SP1
预期用于调节补体激活或者作为支架进行进一步修饰以增加其调节补体途径的活性的支架蛋白酶的例子是膜型丝氨酸蛋白酶MT-SP1(也称作matriptase，TADG-15，致瘤性阻抑物14，ST14)；见SEQ ID NO：1、2及GenBank Accession Nos：AF118224和AAD42765；(1999)J.Biol.Chem.274：18231-18236；美国专利No.5,792,616；也见Takeuchi(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：11054-1161所述。在本文中称作支架的蛋白质例如是855个氨基酸的MT-SP1蛋白酶(见SEQ ID NO：1和2)。其序列如SEQ IDNO：1(也见Genbank AF118224)所示的核酸分子编码855个氨基酸的MT-SP1(SEQ ID NO：2，GenBank AAD42765)。
其是具有C末端丝氨酸蛋白酶结构域的多结构域蛋白酶(Friedrich et al.(2002)J Biol Chem 277(3)：2160)。已经分离了所述蛋白酶的一个由683个氨基酸的变体，但是这个蛋白质看起来是截短形式或胞外结构域形式。
MT-SP1在前列腺癌、乳腺癌和结肠直肠癌中是高度表达或活性的，其在乳腺癌和前列腺癌的转移中也起作用。MT-SP1也在多种上皮组织中高活性水平表达和/或在人胃肠道和前列腺中表达。已知其它物种的MT-SP1。例如，已经鉴别了MT-SP1的小鼠同源物，称作epithin。
MT-SP1在第615-854位氨基酸之间含有一个跨膜结构域、两个CUB结构域、四个LDLR重复及一个丝氨酸蛋白酶结构域(或者肽酶S1结构域)(如SEQ ID NO：9和10所示)，其在丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族的所有成员中是高度保守的，例如糜蛋白酶(SEQ ID NO：7和8)。MT-SP1是以酶原形式合成的，通过裂解形成双链形式而激活。另外，单独的单链蛋白酶解结构域即具有催化活性和功能性。
MT-SP1属于丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族(也称作糜蛋白酶家族)，其还包括糜蛋白酶和胰蛋白酶。通常地，糜蛋白酶家族成员与糜蛋白酶具有序列和结构同源性。MT-SP1在本文根据成熟糜蛋白酶的编号而编号，其蛋白酶结构域与糜蛋白酶的蛋白酶结构域排列并因此编号其残基。基于糜蛋白酶编号，活性位点残基是Asp102、His57和Ser195。根据糜蛋白酶的β折叠，所述线性氨基酸序列可与糜蛋白酶的氨基酸序列排列并编号。在β折叠之间的环中发生插入和缺失，但是在所有结构家族中，核心折叠是保守的。丝氨酸蛋白酶以保守的β折叠方式与底物相互作用。在底物与酶之间可产生至多6个保守氢键。糜蛋白酶家族的所有丝氨酸蛋白酶在其蛋白酶结构域的N末端均具有保守区域，是其催化活性必需的(即IIGG、VVGG或IVGG，该四元体中第一个氨基酸是根据糜蛋白酶编号进行编号的，命名为Ile16。这个编号不反映前体序列的长度)。
已经使用位置扫描合成组合库和底物噬菌体展示方法对蛋白酶结构域中MT-SP1的底物特异性进行绘图(Takeuchi et al.(2000)J Biol Chem 275：26333)。底物中由MT-SP1识别的裂解残基含有在P4的Arg/Lys及在P3的碱性残基或Gln，在P2的小残基，在P1的Arg或Lys及在P1’的Ala。有效的底物在P4至P1位点分别含有Lys-Arg-Ser-Arg。通常地，MT-SP1的底物特异性示出这样的倾向，即如果P3是碱性的，则P4趋于是非碱性的；如果P4是碱性的，则P3趋于是非碱性的。MT-SP1的已知底物，包括例如蛋白酶激活的受体-2(PAR-2)、单链uPA(sc-uPA)，MT-SP1的原形式(proform)及肝细胞生长因子(HGF)，符合MT-SP1特异性底物的裂解序列。
MT-SP1可以与胰蛋白酶同样有效地裂解选择的合成底物，但是呈现较胰蛋白酶更有限的底物特异性。MT-SP1的催化结构域具有(糜)胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的整体结构折叠，但是展示独特的性质如疏水性/酸性S2/S4亚位点和一个暴露的60环。相似地，MT-SP1不是不加选择地在易受影响的Lys或Arg残基裂解肽底物，而是需要识别易断裂肽键周围的其它残基。这个延伸的一级序列的必要条件突出了MT-SP1对其底物的特异性。例如，尽管MT-SP1裂解蛋白酶激活的受体2(PAR-2)(表现为P4至P1靶序列为Ser-Lys-Gly-Arg)，但该酶不激活与这个底物密切关联的蛋白质，如PAR-1、PAR-3和PAR-4，其未显示出在易断裂键附近匹配延伸的MT-SP1特异性的靶序列(见Friedrich et al.(2002)J Biol Chem 277：2160)。
MT-SP1的蛋白酶结构域(见例如SEQ ID NO：9和10所示)由前区和催化结构域组成。多肽的催化活性部分起自于在成熟蛋白质的第611位氨基酸残基的自身活化位点之后(见例如SEQ ID NO：1和2，在RQAR之后是残基VVGG)。MT-SP1与胰蛋白酶的S1口袋对于Lys以及Arg P1残基具有相似的良好互补性，从而在胰蛋白酶对底物的裂解中造成一些相似性。P1-Lys残基的容纳性是由Ser190介导的，其侧链提供了另一氢键受体以稳定掩藏的α-铵基团(见Friedrich et al.(2002)J Biol Chem 277：2160)。S2口袋被定形为容纳小至中等大小的P2氨基酸的疏水侧链，通常在P2位置接受大范围的氨基酸。基于底物结合，S2亚位点不是刚性的，通过Phe99苯甲基基团的旋转而证实。在P3位置(Gln或碱性残基)和P4位置(Arg或Lys残基)的底物氨基酸的结合看起来是通过在S3和S4口袋中与Asp-217和/或Asp-96的酸性侧链的静电相互作用而介导的，其可有利于预先确定特异性碱性肽底物接近酶活性位点裂缝的方向。P3残基的侧链也能与Gln192的羧基酰胺基团形成氢键，或者P3侧链可伸入S4亚位点与Phe97形成氢键，从而削弱与Gly216的主链间氢键。在任一构象中，碱性P3侧链均能与MT-SP1S4口袋的负电势有利地相互作用。来自相同S4位点的相互电荷补偿和排斥解释了在良好的MT-SP1底物中在P3和P4同时具有Arg/Lys的低可能性。通常地，有助于扩展底物结合特异性的MT-SP1的氨基酸位置包括(基于糜蛋白酶编号)：146和151(S1’)；189、190、191、192、216、226(S1)；57、58、59、60、61、62、63、64、99(S2)；192、217、218、146(S3)；96、97、98、99、100、168、169、170、170A、171、172、173、174、175、176、178.179、180、215、217、224(S4)。表10总结了MT-SP1残基中对于与靶底物特异性相互作用重要的一些氨基酸位置。典型地，对MT-SP1蛋白酶进行修饰以改变扩展的特异性结合口袋中或者相互作用的其它二级位点中的任一或多个氨基酸，影响蛋白酶对于靶底物的特异性或选择性。
表10：MT-SP1底物裂解的结构决定簇
Figure A20068004790000931
ii.粒酶B
粒酶B也是预期用于调节补体激活或者进一步修饰以增加其调节补体途径的活性的一个支架蛋白酶例子。粒酶B是一种丝氨酸蛋白酶(S1型)，为细胞介导的免疫应答中靶细胞裂解所必需。粒酶B与胱天蛋白酶(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)激活级联相关联，负责细胞凋亡并裂解胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-10产生活性酶介导细胞凋亡。粒酶B(SEQ ID NO：3，GenBank#：M17016)编码247个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：4，GenBank#：P10144)。前体粒酶B多肽在第1-20位氨基酸具有一个信号序列和前肽激活肽。成熟的粒酶B蛋白特征在于在第21-245位氨基酸的肽酶S1或蛋白酶结构域。
粒酶B是糜蛋白酶折叠丝氨酸蛋白酶家族的一个成员，与粒酶家族其它成员包括粒酶C-G、组织蛋白酶G和大鼠肥大细胞蛋白酶II具有高于50％的相同性。该蛋白质是由两层6个链的反平行β桶状结构域及与一个短α螺旋连接构成的夹心结构。
野生型粒酶B的底物裂解位点具有一个共有识别位点I/V(P4)-E/Q/M(P3)-P/T(P2)-D(P1)。这些氨基酸顺着底物的P1-P4口袋排列以被粒酶B识别和裂解。通常地，粒酶B在其共有识别位点中Asp之后具有裂解优选性。
粒酶B底物裂解的结构决定簇已经通过大鼠粒酶B(SEQ ID NO：5和6)与大肠杆菌素(IEPD，具有底物样结合环的大分子抑制剂)复合的三维结构鉴别(Waugh et al.，(2000)Nature Struct.Biol 7：762)。催化三元体由Asp102、His57和Ser195组成。表面环根据与α-糜蛋白酶相比较的添加和缺失进行编号，代表这个结构家族的大多数可变区。特异性的其它结构决定簇包括Lys41、Ile99、Arg192、Asn218、Tyr215、Tyr174、Leu172、Arg226和Tyr151(基于糜蛋白酶编号)。丝氨酸蛋白酶的粒酶家族的其它成员与粒酶B仅共有这些氨基酸中的两个。它们是Tyr215和Leu172，与全部的结构家族很少交叉的两个残基。这表明虽然粒酶的序列相同性较高，但是其底物特异性非常不同。粒酶B底物特异性的结构决定簇基于糜蛋白酶编号列于表11中。典型地，对粒酶B蛋白酶进行修饰以改变扩展的特异性结合口袋中或者相互作用的其它二级位点中任一或多个氨基酸，影响蛋白酶对于靶底物包括补体蛋白靶底物的特异性或选择性。
表11：粒酶B底物裂解的结构决定簇
粒酶B结构决定簇对于特异性的重要性已经通过使用组合底物库确定突变对于扩展的特异性的作用而证实。Ile99、Arg192、Asn218和Tyr174突变为丙氨酸已经示出Ile99有助于P2特异性，Asn218和Arg192有助于P3特异性，Tyr174有助于P4特异性。由于蛋白酶的P1特异性代表其主要的特异性，因此这种修饰不破坏粒酶B对于P1天冬氨酸的独特特异性，但是调节扩展的P2至P4位点的特异性。对于P3和P4亚位点，在Tyr174、Arg192和Asn218的突变不明显影响特异性。Y174A增加对在P4的Leu活性，但是剩余的氨基酸持续很少被选择。R192A和N218A均扩大在P3的特异性。代替强烈优选的谷氨酸，在修饰的蛋白酶中导入Ala、Ser、Glu和Gln。对于理想的野生型底物N-乙酰-Ile-Glu-Pro-Asp-AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)(Ac-IEPD-AMC)，突变体的整体活性(kcat/Km)较野生型活性低不到10％。在P2亚位点观测到较大的作用。在野生型粒酶B中，对于Pro残基的略微优选扩宽了优选性。I99A缩窄了对于Phe和Tyr残基的P2特异性。Phe较在这个位置的其它氨基酸的平均活性使得特异性缩窄了接近5倍。在丝氨酸蛋白酶的糜蛋白酶家族中，超过一打的蛋白酶在这个结构位点具有小残基，如天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。从这个组中，使用组合底物库已经鉴别了两种蛋白酶(血浆激肽释放酶和纤溶酶)，其均示出对于Phe和Tyr的强优选性。这两个结果提示在第99位被突变为Asn、Ser、Thr、Gly或Ala的任何丝氨酸蛋白酶均示出在血浆激肽释放酶、纤溶酶和I99A粒酶B突变体中发现的相同疏水性特异性。
P2特异性决定簇可以扩展为相反的突变和底物优选性。例如，接近两打的糜蛋白酶折叠丝氨酸蛋白酶在第99位具有芳香族氨基酸。这些蛋白酶中有四种蛋白酶已经使用组合底物库鉴别：人粒酶B、组织型纤溶酶原激活物、尿激酶型纤溶酶原激活物及膜型丝氨酸蛋白酶1。除了粒酶B之外对在底物P2位置的丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸均具有优选性。
b.半胱氨酸蛋白酶
半胱氨酸蛋白酶具有包含半胱氨酸巯基基团的催化机制。相邻组氨酸残基对半胱氨酸巯基的去质子化作用是通过对肽羰基碳上半胱氨酸的亲核攻击引起的。连接新的羧基末端与半胱氨酸硫醇的硫酯是所述反应的中间产物(与丝氨酸蛋白酶的酰基酶中间产物相当)。半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶、组织蛋白酶、胱天蛋白酶和钙蛋白酶。
木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶是与木瓜蛋白酶结构相似性相关的硫醇依赖性内肽酶家族。它们形成具有标示为R和L(右和左)的结构域的两结构域蛋白质，来自这两个结构域的环形成底物识别裂缝。它们具有由氨基酸Cys25、His159和Asn175组成的催化三元体。与基于底物的β折叠构象识别和蛋白酶解靶肽的丝氨酸蛋白酶不同，这个家族的蛋白酶不具有经充分阐述的底物识别口袋。主要的底物识别发生在P2氨基酸(与丝氨酸蛋白酶中P1残基相比)。
使用完全不同位置扫描合成组合库(PS-SCL)已经确定了许多半胱氨酸蛋白酶(人组织蛋白酶L、V、K、S、F、B、木瓜蛋白酶和克鲁蛋白酶)的底物特异性。所述完全库含有P1、P2、P3和P4四肽底物，其中一个位置保持固定，其它三个位置随机为20种可能的氨基酸的等摩尔混合物，产生共～160,000种不同的四肽序列。
总之，组织蛋白酶之间P1特异性几乎相同，Arg和Lys显然优选，而小的脂肪族氨基酸耐受。大量的选择性在P2位置发现，其中人组织蛋白酶严格限于疏水性氨基酸选择。令人感兴趣地，P2对于疏水性残基的特异性在芳香族氨基酸如Phe、Tyr和Trp(组织蛋白酶L，V)与大脂肪族氨基酸如Val或Leu(组织蛋白酶K、S、F)之间有分歧。与P2位置相比较，在P3位置的选择性显然严格性较低。然而，一些蛋白酶对于脯氨酸(组织蛋白酶V、S和木瓜蛋白酶)、亮氨酸(组织蛋白酶B)或精氨酸(组织蛋白酶S、克鲁蛋白酶)具有独特的优选性。所述蛋白酶示出在P4位置的广泛特异性，因为无一氨基酸相对于其他氨基酸被选出。
S2口袋是蛋白酶底物识别位点的最具选择性的及最好特征化的。其通过如下空间位置的氨基酸限定(木瓜蛋白酶编号)：66、67、68、133、157、160和205。205位与丝氨酸蛋白酶中第189位起相似作用，这是掩藏在口袋底部决定特异性的残基。其它特异性决定簇包括如下氨基酸(根据木瓜蛋白酶编号)：61和66(S3)；19，20和158(S1)。各种半胱氨酸蛋白酶的结构决定簇在表12中列出。典型地，对半胱氨酸蛋白酶例如木瓜蛋白酶进行修饰改变扩展的特异性结合口袋或相互作用的其它二级位点中的任一或多个氨基酸，影响蛋白酶对于靶底物包括补体蛋白靶底物的特异性或选择性。
表12：各种半胱氨酸蛋白酶的结构决定簇
Figure A20068004790000961
c.天冬氨酸蛋白酶
天冬氨酸蛋白酶包括消化酶胃蛋白酶、一些在溶酶体中发现的蛋白酶、肾脏酶肾素及HIV-蛋白酶。两种天冬氨酸残基参与活性位点的酸/碱催化作用。在最初的反应中，一个天冬氨酸接受来自活性位点H2O的质子，其攻击肽键的羰基碳。同时，另一天冬氨酸为肽羰基基团的氧贡献质子。它们可呈现不同的特异性，但是均典型在两个疏水性氨基酸之间裂解。经充分阐述的底物的氨基酸侧链的S4、S3、S2、S1、S1’、S2’、S3’和S4’亚位点口袋是这些酶的特点(见例如Brinkworth et al.，(2001)J Biol Chem276：38844)。
天冬氨酸蛋白酶的例子包括逆转录病毒蛋白酶，如人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)PR或者禽成髓细胞瘤病毒/Rous肉瘤病毒(AMV/RSV)PR(Cameron et al.，(1993)J Biol Chem.268：11711)。所述PR具有底物结合口袋，含有与底物的7个氨基酸(P4-P3’)相互作用的至少7个亚位点(S4-S3’)(Cameron et al.，(1993)J Biol Chem.268：11711；Cameron et al.，(1994)J Biol Chem.269：11170)。有助于AMV/RSV PR的底物特异性的残基包括：P62、I42、M73、R105’、H7’、Q63、R10’、D41、I64(S4)；H65、V104’、R105’、G106’、Q63、R10’、L35’、D37’、G39、D41、G66、I67、I108’、R111(S3)；I42、I44、H65、M73、A100、A40、D41、I64、G66、I67’、I108(S2)；H65、V104’、R105’、G106’、S107’、R10’、L35’、D37’、D37、G39、G66、I67、I108’(S1)；H65’、V104、R105、G106、S107、R10、L35、D37、D37’、G39’、G66’、I67’、I108(S1’)、I42’、I44’、H65’、M73’、A100’、V104’、A40’、D41’、I64’、G66’、I67、I108’(S2’)；及S38’、H65’、V104、R105、G106、Q63’、R10、L35、G39’、D41’、I64’、G66’、I67’、I108、R111’(S3’)，其中二聚体的第二亚单位中的氨基酸残基以’表示。有助于HIV-1 PR的底物特异性的残基包括：D30、V56、P81’、R8’、D29、I47(S4)；G48、T80’、P81’V82’、R8’、L23’、D25’、G27、D29、G49、I50、I84’、R87(S3)；D30、V32、G48、V56、L76、A28、D29、I47、G49、I50’、I84(S2)；G48、T80’、P81’、V82’、N83’、R8’、L23’、D25’、D25、G27、G49、I50、I84’(S1)；G48’、T80、P81、V82、N83、R8、L23、D25、D25’、G27’、G49’、I50’、I84(S1’)；D30’、V32’、G48’、V56’、L76’、T80’(S2’)；和R8、L23、G27’、D29’、I47’、G49’、I50’、I84、R87’(S3’)，其中二聚体的第二亚单位中的氨基酸残基以’表示。典型地，对天冬氨酸蛋白酶例如逆转录病毒蛋白酶进行修饰以改变扩展的特异性结合口袋中或相互作用的其它二级位点中的任一或多个氨基酸，影响蛋白酶对于靶底物包括补体蛋白靶底物的特异性或选择性。
d.金属蛋白酶
金属蛋白酶(也称作锌蛋白酶)包括消化酶羧肽酶、由细胞分泌的各种基质金属蛋白酶(MMP)、ADAM(去整合素和金属蛋白酶结构域)及溶酶体蛋白酶。这些酶包括ADAM和MMP，在胚胎发育、细胞生长和增殖、炎症应答、伤口修复、多发性硬化症、关节炎和癌症进展及转移中起作用(Manzettiet al.，(2003)J of Computer-Aided Mol.Design，17：551)。一些MMP(例如胶原酶)在组织重塑期间参与胞外基质的降解。例如，许多这些酶可裂解基底膜和胞外基质的成分。一些MMP在细胞信号化中起作用，涉及其通过膜结合的前蛋白的裂解而从细胞表面释放细胞因子或生长因子如TNFα、TGFβ和白细胞介素的能力。
金属蛋白酶的活性位点的锌结合基序包括两个组氨酸残基，其咪唑侧链是Zn++的配体。在催化期间，Zn++在活性位点促进水分子中的氧原子对羰基碳的亲核攻击。活性位点的碱基(羧肽酶中的谷氨酸残基)通过从攻击中的水分子中提取质子而促进这个反应。通常地，这些酶在其活性位点具有一个共同的锌结合基序(HExxHxxGxxH)和在活性位点之后的一个保守的甲硫氨酸转角。任一组氨酸的突变均消除催化活性。金属蛋白酶之间活性位点特异性不同以容纳易断裂键周围的底物的不同的肽主链。MMP底物特异性的一个关键的分子决定簇是在P1’位置的氨基酸的侧链。因此，S1’亚位点在决定裂解的肽键优选性中起重要作用。例如，MMP-1和MMP-7的小S1’口袋促进对于小疏水性残基的优选性，而其它MMP具有大S1’口袋(Overall et al.，(2002)Mol Biotech 22：51)。S2位置也是特异性的分子决定簇。例如，在MMP-2与MMP-9之间，S2亚位点是MMP的催化裂缝之间少许不同之一，其中MMP-2中Glu412对应MMP-9中Asp410的存在在改变底物特异性中起重要作用。事实上，在较大的MMP家族中，Glu412位置是高度可变的，可由酸性残基、大的疏水性残基及甚至由甘氨酸占据。相反，所有MMP中的S2亚位点周围的大多数残基均是严格保守的(Chen et al.，(2003)J Biol Chem 278：17158)。特异性的其它分子决定簇在下表13中描述(见例如Manzetti et al.，(2003)J Computer-Aided Mol Design 17：551)。典型地，对金属蛋白酶例如MMP或ADAM蛋白酶进行修饰以改变扩展的特异性结合口袋中或者相互作用的其它二级位点中的任一或多个氨基酸，影响蛋白酶对于靶底物包括补体蛋白靶底物的特异性或选择性。
表13：各种金属蛋白酶的结构决定簇
  S4   S3   S2   S1   S1’   S2’   S3’   S4’
  MMP-3   F210F83   F210A169   H166H211   L164V198P221   V163   L164   L164   L222
  ADAM9   F317V318H357   V318M315   V318H351N356   M315H357   I344A313N373   N373T312   S374F333   G310
  ADAM10   P391V332W331   V332P391N387   V332H392   L329H392   L327T379A418   V326   N366   T421
e.苏氨酸
苏氨酸蛋白酶包括蛋白酶体水解酶。蛋白酶体是由α和β亚基组成的大桶形蛋白质复合物。β亚基提供在复合物的两个中心环中发现的催化机制。典型地，催化活性的β亚基的催化机制包括在每个活性位点的保守的N-末端苏氨酸。当该N末端被裂解除去时，使得苏氨酸成为N末端残基，由此催化的苏氨酸暴露在腔表面，使得所述β亚基激活。水解是通过催化机制上羟基亲核体对酰胺键的攻击而起始。所述蛋白酶体的β亚基的特异性结构决定簇已经确定，例如通过使用蛋白酶体的基于肽的共价抑制剂库进行(见例如Groll et al.，(2002)Chem Biol 9：655；Zhang et al.，(2003)EMBO J，22：1488)。
D.支架蛋白
本发明提供了支架蛋白。支架蛋白包括任何野生型蛋白酶，只要其是非补体蛋白酶即可，也包括其等位基因或物种变体或者其催化活性部分。支架蛋白酶可用于靶向(即裂解)任一或多个补体途径底物。典型地，这种裂解导致补体途径失活。在一些情况中，这种裂解可导致补体激活。因此，这种支架蛋白酶可用作治疗剂，通过靶向补体途径底物以例如抑制与各种疾病或病变的病因学相关的补体激活。支架蛋白也是可以被修饰以裂解靶底物的任何蛋白质。在这些支架蛋白酶中，其靶底物特异性可以被修饰。支架蛋白，包括蛋白酶，可以被修饰任一或多个氨基酸，由此获得的蛋白酶显示对于补体途径的任一或多种蛋白质成分改变的特异性和选择性，和/或调节补体蛋白质或途径的活性。例如，修饰的蛋白酶可具有改变的底物特异性，由此修饰的蛋白酶相对于非靶底物例如野生型支架蛋白酶的天然底物优先裂解补体途径的靶底物成分。在一个实施方案中，对于靶底物的特异性与野生型或支架蛋白酶的特异性相比增加。在另一个实施例中，修饰的蛋白酶可以呈现对于补体成分的选择性，由此修饰的蛋白酶裂解特定底物的能力高于裂解所述修饰的蛋白酶对其也可表现特异性的任何其它靶底物。另外，修饰的蛋白酶可裂解靶底物，例如补体途径的任一或多种蛋白质，及调节补体途径的活性。
本文描述了可用于裂解任一或多种补体蛋白或者可用作模板对该蛋白酶进行修饰以提高底物特异性或对于任一或多种补体蛋白质的活性的支架蛋白酶的例子。支架蛋白酶包括任何非补体蛋白酶，其是丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金属或苏氨酸类蛋白酶中的任一种。支架蛋白酶的例子在表14中列出及在本文描述。蛋白酶支架包括任一种蛋白质的等位基因变体和同工型，包括如下所示支架蛋白酶多肽：SEQ ID NO：2、4、8、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、269、270、272、274、276、278、280、282、284、286、287、289、291、293、295、297、373、375、377、379、381、383、385、387、544、545、547、549和551。
支架蛋白或支架蛋白酶可以通过本领域已知的任何方法产生或分离，包括从天然来源中分离、在细胞、组织和生物体中重组产生的蛋白质的分离，及通过重组方法和包括在计算机上(in silico)步骤的方法、合成方法及本领域技术人员已知的任何方法进行。表14示出了支架蛋白酶的例子(也见例如www.merops.sanger.ac.uk所述)。每个候选蛋白酶的核苷酸序列及编码的氨基酸前体序列的序列标识符(SEQ ID NO)在表中示出。表中也示出了相应于信号肽或前肽序列以产生成熟蛋白质的编码的氨基酸。另外，表中也示出了蛋白酶结构域(即肽酶单位)的氨基酸，是组成例如各个蛋白酶的催化三元体的活性位点残基。由于相互作用是动态的，因此所述氨基酸位置仅供参考和例证。所述位置表示在该位置可变化2、3、4、5或更多个氨基酸。在等位基因变体和物种变体中也存在变化。本领域技术人员通过目测对比或其它对比方法包括易于利用的算法和软件可以鉴别相应序列。
表14：支架蛋白酶的实例
  Merops代码 名称   基因   Nucl.ACNO：   同物异名   蛋白质ACNO：   SEQ IDNO：   信号/前肽序列   肽酶单位(活性位点残基)
  S01.010 粒酶B，人型   GZMB   M17016   HLP，CCPI，CGL1，CSPB，SECT，CGL-1，CSP-B，CTLA1，CTSGL1   P10144   3，4   1-18/19-20   21-247(64，108，203)
  S01.011 Testisin   PRSS21   NM_006799(v1)NM_144956(v2)NM_144957(v3)   ESP-1，TEST1   NP_006790NP_659205NP_659206   70，71(V1)；72，73(V2)；74，75(V2)   1-19/20-41   42-288(82，137，238)
  S01.015 trypstaseβ1(人类)(III)   TPSB1   NM_003294   TPS1，TPS2，TPSAB1，αII   NP_003285   76，77   1-18/19-30   31-274(74，121，224)
  S01.017 激肽释放酶hk5   KLK5   NM_012427   SCTE，KLKL2，KLK-L2   NP_036559   78，79   1-22/   67-292(108，153，245)
  S01.019 Corin   NM_006587   CRN，ATC2，Lrp4，TMPRSS10   NP_006578   80，81   802-1037(843，892，985)
  S01.020 激肽释放酶12   KLK12   NM_019598(v1)NM_145894(v2)NM_145895(v3)   KLK-L5   NP_062544NP_665901NP_665902   82，83(V1)；84，85(V2)；86，87(V3)   1-17/   22-248(843，892，985)
  S01.021 DESC1oritease   AF064819   AAF04328   88，89   191-422(231，276，372)
  S01.028 类胰蛋白酶γ1   TPSG1   NM_012467   TMT，trpA，PRSS31   NP_036599   90，91   1-19/   38-272(78，125，222)
  S01.029 激肽释放酶hK14   KLK14   NM_022046   KLK-L6   NP_071329   92，93   1-18/19-24   25-249(67，111，204)
  S01.033 Hyaluronan-结合的丝氨酸蛋白酶(HGF激活物样蛋白质)   HABP2   NM_004132   FSAP，HABP，PHBP，HGFAL   NP_004123   94，95   1-23/   314-557(362，411，509)
  S01.034 跨膜蛋白酶，丝氨酸4   TMPRSS4   NM_019894(v1)NM_183247(v2)   MT-SP2，TMPRSS3   NP_063947NP_899070   96，97(V1)；98，99(V2)   205-436(245，290，387)
  S01.054 类胰蛋白酶δ1(人类)   TPSD1   NM_012217   MCP7L1，MMCP-7L，MGC95428   NP_036349   100，101   1-18/19-30   31-235(74，121，224)
  S01.074 Marapsin   NM_031948   PRSS27，CAPH2   NP_114154   102，103   1-22/23-34   35-279(75，124，229)
  S01.075 类胰蛋白酶同源物2(人类)   BC036846   PRSS33，EOS   AAN04055   104，105   37-281(77，126，231)
  S01.076 类胰蛋白酶同源物3(人类)   PutativeOnlyAC005570(粘粒407D8)   106，107   67-304(107，213，259)
  Merops代码 名称   基因   Nucl.ACNO： 同物异名   蛋白质ACNO：  SEQ IDNO：   信号/前肽序列   肽酶单位(活性位点残基)
  S01.077 类胰蛋白酶染色体21(人类)
  S01.079 跨膜蛋白酶，丝氨酸3   TMPRSS3   NM_024022(vA)NM_032401(vB)NM_032404(vC)NM_032405(vD) DFNB8，DFNB10，ECHOS1，TADG12   NP_076927NP_115777NP_115780NP_115781  108，109(VA)；110，111(vB)；112，113(vC)；114，115(vD)   217-451(257，304，401)
  S01.081 激肽释放酶hK15(人类)   NM_023006(v1)NM_138563(v2)NM_138564(v3)NM_017509(v4) ACO，HSRNASPH   NP_075382NP_612630NP_612631NP_059979  116，117(v1)；118，119(v2)；120，121(v3)；122，123(v4)   1-16/17-21   22-256(62，106，209)
  S01.085 Memame-AA031肽酶(通过MEROPS从EST推导)   BC035384 FLJ16649MGC35022，TRYX3，UNQ2540   AAH35384  124，125   1-241(56，101，195)
  S01.087 膜型镶嵌型丝氨酸蛋白酶   AB048796   BAB39741  126，127   321-556(361，409，506)
  S01.088 Memame-AA038肽酶   PutativeOnlyAL136097(RP11-62C3克隆)   CAC12709  128   10-142(50，101)
  S01.098 Memame-AA128肽酶(通过MEROPS从EST推导)   PutativeOnltBC041609   AAH41609  129，130   33-202(50，152)
  S01.127 阳离子胰蛋白酶(人型1)(阳离子)   PRSS1   NM_002769 TRP1，TRY1，TRY4，TRYP1   NP_002760  131，132   1-15/16-23   24-246(63，107，200)
  S01.131 嗜中性粒细胞弹性蛋白酶   ELA2   NM_001972 NE，HLE，HNE，PMN-E   NP_001963  133，134   1-27/28-29   30-249(70，117，202)
  S01.132 甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-3   AF284421   AAK84071  135，136   1-19/   449-710(497，553，664)
  S01.133 组织蛋白酶G   CTSG   NM_001911 CG，MGC23078   NP_001902  137，138   1-18/19-20   21-245(64，108，201)
  S01.134 成髓细胞素(蛋白酶3)   PRTN3   NM_002777 MBT，P29，ACPA，AGP7，PR-3，C-ANCA   NP_002768  139，140   1-25/26-27   28-250(71，118，203)
  S01.135 粒酶A   GZMA   NM_006144 HFSP，CTLA3   NP_006135  141，142   1-26/27-28   29-261(69，114，212)
  S01.139 粒酶M   GZMM   NM_005317 MET1，LMET1   NP_005308  143，144   1-23/24-25   26-256(66，111，207)
  S01.140 糜酶(人型)   CMA1   NM_001836 CYH，MCT1   NP_001827  145，146   1-19/21-21   22-247(66，110，203)
  S01.143 类胰蛋白酶   TPS1   NM_003294 TPS1，TPS2，   NP_003285  147，148   1-18/19-30   31-274(74，121，224)
  Merops代码  名称   基因   Nucl.ACNO：  同物异名   蛋白质ACNO：   SEQ IDNO：   信号/前肽序列  肽酶单位(活性位点残基)
 α(1)  TPSB1，alphaII
  S01.146  粒酶K   GZMK   NM_002104  TRYP2   NP_002095   149，150   1-24/26-26  27-261(67，116，214)
  S01.147  粒酶H   GZMH   NM_033423  OCP-X，CGL-2，CSP-C，CTLA1，CTSGL2   NP_219491   151，152   1-18/19-20  21-246(64，108，202)
  S01.152  糜蛋白酶B   CTRB1   M24400  CTRB，MGC88037   P17538   7，8   1-18  34-263(75，120，213)
  S01.153  胰弹性蛋白酶   ELA1   NM_001971   NP_001962   153，154   1-8/9-18  19-256(63，111，206)
  S01.154  胰内肽酶E(A)   NM_005747  ELA3   NP_005738   155，156   1-15/16-28  29-270(73，123，217)
  S01.155  胰弹性蛋白酶II(IIA)   M16652   AAA52380   157，158   1-16/7-28  29-269(73，121，216)
  S01.156  肠肽酶   PRSS7   NM_002772  ENTK   NP_002763   159，160  785-1019(825，876，971)
  S01.157  糜蛋白酶C   NM_007272  CLCR   NP_009203   161，162   1-16/17-29  30-268(74，121，216)
  S01.159  Prostasin   PRSS8   NM_002773   NP_002764   163，164   1-29/30-32  45-288(85，134，238)
  S01.160  激肽释放酶1   KLK1   NM_002257  hK1，KLKR，Klk6   NP_002248   165，166   1-18/19-24  25-261(65，120，214)
  SO1.161  激肽释放酶hK2(人类)   KLK2   NM_005551(v1)NM_001002231(v2)NM_001002232(v3)  hK2，KLK2A2，MGC12201   NP_005542NP_001002231NP_001002232   167，168(v1)；169，170(v2)；171，172(v3)   1-18/19-24  25-260(65，120，213)
  S01.162  激肽释放酶3   KLK3   NM_001648(v1)NM_001030047(v3)NM_001030048(v4)NM_001030049(v5)NM_001030050(v6)  APS，PSA，hK3，KLK2A1   NP_001639NP_001025218NP_001025219NP_001025220NP_001025221   173，174(v1)；175，176(v3)；177，178(v4)；179，180(v5)；181，182(v6)   1-17/18-24  25-260(65，120，213)
  S01.174  Mesotrypsin   PRSS3   NM_002771  MTG，TRY3，TRY4，PRSS4   NP_002762   183，184   1-24/  24-246(63，107，200)
  S01.205  胰内肽酶EB型(B)   ELA3B   NM_007352   NP_031378   185，186   1-15/16-28  29-270(73，123，217)
  S01.206  胰腺弹性蛋白酶IIB型(人类)(IIB)   NM_015849  MGC97052   NP_056933   187，188   1-16/17-28  29-269(73，121，216)
  S01.211  凝血因子XIIa   F12   NM_000505  HAF   NP_000496   189，190   1-19/  373-615(412，461，563)
  S01.212  血浆激肽释放酶   KLKB1   NM_000892  KLK3   NP_000883   191，192   1-19/  391-628(434，483，578)
  S01.213  凝血因子XIa   F11   NM_000128(v1)NM_019559(v2)  FXI   NP_000119NP_062505   193，194(v1)；195，193(v2)   1-18/  388-625(431，480，575)
  S01.214  凝血因子IXa   F9   NM_000133  FIX，PTC，HEMB，   NP_000124   197，198   1-28/29-46  227-461(267，315，411)
  Merops代码   名称   基因   Nucl.ACNO： 同物异名   蛋白质ACNO：  SEQ IDNO：   信号/前肽序列  肽酶单位(活性位点残基)
GLA结构域
  S01.215   凝血因子VIIa   F7   NM_000131(v1)NM_019616(v2)   NP_000122NP_062562  199，200(v1)；201，202(v2)   1-20/21-60  213-454(253，302，404)
  S01.216   凝血因子Xa   F10   NM_000504 FX，FXA   NP_000495  203，204   1-31/32-40  235-469(276，322，419)
  S01.217   凝血酶   F2   NM_000506 PT   NP_000497  205，206   1-24/25-43  364-620(406，462，568)
  S01.218   蛋白质C(活化的)   PROC   NM_000312 PROC1，蛋白质C   NP_000303  207，208   1-32/33-42  212-452(253，299，402)
  S01.223   顶体蛋白   ACR   NM_001097   NP_001088  209，210   1-19  43-292(88，142，240)
  S01.224   Hepsin   HPN   NM_182983(v1)NM_002151(v2) TMPRSS1   NP_892028NP_002142  211，212(v1)；213，214(v2)  163-407(203，257，353)
  S01.228   肝细胞生长因子激活物   HGFAC   NM_001528 HGFA   NP_001519  215，216   1-35/36-372  408-648(447，497，598)
  S01.231   u-纤溶酶原激活物(uPA)   PLAU   NM_002658 ATF，UPA，URK，u-PA   NP_002649  217，218   1-20/  179-426(224，275，376)
  S01.232   t-纤溶酶原激活物(tPA)   PLAT   NM_000930(v1)NM_000931(v2)NM_033011(v3) TPA，T-PA，DKFZp686I03148   NP_000921NP_000922NP_127509  219，220(v1)；221，222(V2)，223，224(V3)   1-23/24-32和33-35  311-562(357，406，513)
  S01.233   纤溶酶   PLG   NM_000301 DKFZp779M0222   NP_000292  225，226   1-19/20-97  581-810(622，665，760)
  S01.236   Neurosin   KLK6   NM_002774(vA)NM_001012964(vB)NM_001012965(vC)NM_001012966(vD) hK6，Bssp，Klk7，SP59，ZYME，PRSS9，PRSS18，MGC9355，NEUROSIN   NP_002765NP_001012982NP_001012983NP_001012984  227，228(vA)；229，230(vB)；231，232(vC)；233，234(vD)   1-16/17-21  22-244(62，106，197)
  S01.237   Neurotrypsin   PRSS12   NM_003619 BSSP3，BSSP-3，MGC12722，MOtopSIN   NP_003610  235，236   1-20/  631-875(676，726，825)
  S01.242   类胰蛋白酶β2(人类)(I)   TPSB1   NM_024164 TPS2，TPSB1，类胰蛋白酶C   NP_077078  237，238   1-30/  31-268
  S01.244   Neuropsin   KLK8   NM_007196(v1)NM)144505(v2)NM_144506(v3)NM_144507(v4) NP，HNP，NRPN，PRSS19，TADG14   NP_009127NP_653088NP_653089NP_653090  239，240(v1)；241，242(v2)，243，244(v3)；245，246(v4)   1-28/29-32  33-258(73，120，212)
  S01.246   激肽释放酶hK10(人类)   KLK10   NM_002776(v1)NM_145888(v2) NES1，PRSSL1   NP_002767NP_665895  247，248(v1)；249，250(v2)   1-30/  35-276(86，137，229)
  S01.247   Epitheliasin   TMPRSS2   NM_005656 PRSS10   NP_005647  251，252  256-491(296，345，441)
  Merops代码 名称   基因   Nucl.ACNO：   同物异名   蛋白质ACNO：  SEQ IDNO：   信号/前肽序列  肽酶单位(活性位点残基)
  S01.251 Prostase   KLK4   NM_004917   ARM1，EMSP，PSTS，EMSP1，KLK-L1，PRSS17   NP-004908  253，254   1-26/27-30  31-254(71，116，207)
  S01.252 脑丝氨酸蛋白酶2   NM_022119   BSSP-4，MGC9599，SP001LA，hBSSP-4   NP_071402  255，256   1-32  50-292(90，141，242)
  S01.256 Chymopasin   CTRL   NM_001907   CTRL1，MGC70821   NP_001898  257，258   1-18/19-33  34-264(75，121，214)
  S01.257 激肽释放酶11   KLK11   NM_006853(v1)NM_144947(v2)   TLSP，PRSS20，MGC33060   NP_006844NP_659196  259，260(v1)；261，262(v2) 1-50/51-53  22-250(62，110，203)
  S01.258 阴离子胰蛋白酶(人类)(II)   PRSS2   NM_002770   TRY2，TRY8，TRYP2   NP_002761  263，264   1-15/16-23  24-246(63，107，200)
  S01.291 LOC144757肽酶(人类)   PutativeBC048112   MGC57341   AAH48112  265，266  78-319(122，171，268)
  S01.292 Memame-AA169肽酶   BN000133   CAD67985  267，268   1-19  175-406(215，260，356)
  S01.294 Memame-AA171肽酶   PutativeNo DNA  269
  S01.298 Memame-AA174肽酶   Putativeno DNA seq   TRY6   AAC80208  270  24-246(63，107，200)
  S01.299 Memame-AA175肽酶   NM_198464   NP_940866  271，272  68-302(108，156，250)
  S01.300 角质层糜蛋白酶   KLK7   NM_005046(v1)NM_139277(v2)   SCCE，PRSS6   NP_005037NP_644806  273，274(v1)；275，276(v2)   1-22/23-29  30-250(70，112，205)
  S01.301 胰蛋白酶样酶，呼吸(人类)   NM_004262   HAT   NP_004253  277，278  187-471(227，272，368)
  S01.302 Matripase   ST14   AF118224   HAI，MTSP1，SNC19，MT-SP1，MTSP-1，PRSS14，TADG-15   AAD42765  1，2  615-855(656，711，805)
  S01.306 激肽释放酶hK13   KLK13   NM_015596   KLKL4，KLK-L4，DKFZP586J1923   NP_056411  279，280   1-16/  36-263(76，124，218)
  S01.307 激肽释放酶hK9(人编号)   KLK9   NM_012315   KLKL3，KLK-L3   NP_036447  281，282   1-15/  23-250(63，111，204)
  S01.308 Memame-AA035肽酶   NM_153609   NP_705837  283，284  49-283(89，140，234)
  S01.309 脐静脉蛋白酶   NM_007173   SIG13，SPUVE，ZSIG13，MGC5107   NP_009104  285，286   1-23/  95-383(175，246，316)
  S01.311 LCLP蛋白酶(LCLP(N-末端))   肽片段无DNA   P34168  287  1-26(0)
  S01.313 Spinesin   TMPRSS5   NM_030770   NP_110397  288，289  218-455(258，308，405)
  S01.318 Memame-AA178肽酶   MPN2   NM_183062   NP_898885  290，291   1-33/  53-288(93，143，238)
  Merops代码   名称   基因   Nucl.ACNO：  同物异名   蛋白质ACNO：   SEQ IDNO：   信号/前肽序列 肽酶单位(活性位点残基)
  S01.320   Memame-AA180肽酶   OVTN   BN000120   CAD66452   292，293   1-23/ 52-301(92，142，240)
  S01.322   Memame-AA182肽酶   OVCH1   BN000128   CAD67579   294，295   1-17/ 8-298(87，139，237)
  S01.414   Memame-AA122肽酶(由MEROPS从EST推导)   PutativeAK075142   BAC11431   296，297 1-177(12，64，168)
  C01.032   组织蛋白酶L   CTSL Y14734 P07711   372，373   1-17/18-113 113-333(132，138，276，300)
C01.009 组织蛋白酶V CTSL2 U13665 O60911   374，375   1-17/18-113 114-334(132，138，277，301)
C01.036 组织蛋白酶K CTSK S93414 P43235   376，377   1-15/16-114 115-329(133，139，276，296)
C01.034 组织蛋白酶S CTSS AJ007331 P25774   378，379   1-16/17-114 115-331(133，139，278，298)
C01.018 组织蛋白酶F CTSF M14221 Q9UBX1   380，381   1-19/20-270 271-484(289，295，431，451)
C01.060 组织蛋白酶B CTSB M15203 P07858   382，383   1-17/18-79 80-331(102，108，278，298)
C01.001 木瓜蛋白酶 M84342 P00784   384，385   1-18/19-133 135-342(158，292，308)
C01.075 克鲁蛋白酶(Cruzapain) Y14734 P25779   386，387   123-467/ 124-334(147，284，304，
  A02.001   HIV-1蛋白酶  HIV-1retropepsin；HIV-1PR   P03366(aa500-598)   544
  A02.015   RSV蛋白酶  禽成髓细胞瘤病毒逆转录胃蛋白酶；禽肉瘤病毒内肽酶；逆转录胃蛋白酶   P03322(aa578-701)   545
  M10.005   基质金属蛋白酶-3   MMP3   X05232  胶原酶激活蛋白质MMP-3；基质溶酶1；transin   CAA28859.1   546，547
  M12.209   ADAM9内肽酶   ADAM9   NM_003816  MDC9   NP_003807   548，549
  M12.210   ADAM10内肽酶   ADAM10   NM_003816  MADM   NP_001101   550，551
在一些实施方案中，蛋白酶支架是粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白质C、u-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。这种蛋白酶可用于本发明提供的方法中，靶向补体途径的一或多种靶底物。也可以对这种蛋白酶进行修饰以改变其对于补体途径的任一或多种蛋白质成分的特异性或选择性和/或调节补体蛋白或途径的活性。所述蛋白酶或修饰的蛋白酶可用于本发明提供的方法中以调节补体激活，及因此可用作治疗剂以治疗任何补体介导的疾病或病变。在一些实施方案中，所述蛋白酶支架是MT-SP1。可以对MT-SP1中的氨基酸进行修饰以改变其对于补体蛋白靶底物的特异性和/或选择性。
1.修饰的支架蛋白酶
事实上蛋白酶的每个方面均可以被工程化，包括酶底物序列特异性、热稳定性、pH谱、催化效力、氧化稳定性及催化功能。本发明提供了修饰的蛋白酶，其与支架蛋白酶相比表现为对于任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加。可以使用本领域已知的任何修饰蛋白质的方法修饰蛋白酶。这些方法包括位点定向和随机诱变。可以使用本发明提供的及本领域已知的分析补体激活的生物学功能的方法评价修饰的蛋白酶的生物学功能，以确定所述修饰的蛋白酶是否靶向底物进行裂解和失活。本文提供了鉴别蛋白酶和修饰的蛋白酶的方法的实例。
例如，可以利用基于诱变的多种蛋白质定向进化(protein-directedevolution)方法之任一种。在这些方法中，可以单独或组合应用所述方法修饰多肽如蛋白酶，以改变其对于靶底物的特异性和/或选择性。这些方法包括随机诱变方法，其中起始蛋白质序列中的氨基酸在同一分子上不同氨基酸位置同时被所有(或一组)20个氨基酸单一或多重置换。另一种方法是限制随机诱变方法(restricted random mutagenesis)，导入所有或一部分20个氨基酸或DNA偏向(DNA-biased)残基。所述偏向基于预先已知参与“进化的”生物学活性的蛋白质的限制或预定区域内的DNA序列，非基于分别以随机或半随机方式中蛋白质的序列。产生修饰的蛋白酶的方法的实例在美国专利申请No.10/677,977中描述，以其全部内容并入本文作参考。另外，可以使用本领域已知的任何方法修饰或改变蛋白酶多肽序列。
本发明提供的修饰的多肽是与支架蛋白酶相比具有一或多个修饰的蛋白酶。修饰的蛋白酶多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰位置的那些蛋白酶。本发明提供的蛋白酶保留其蛋白酶活性，但是表现出对于任一或多种补体蛋白靶底物与该蛋白酶的天然底物相比改变的(即增强的)特异性，和/或表现出对于补体系统的任一或多种蛋白质的改变的选择性。特异于任一或多种补体蛋白的修饰的蛋白酶可以根据理论或者根据经验产生：(a)根据理论靶向互补由已知蛋白酶如补体因子I识别的靶补体底物的裂解序列的位点，或者(b)在补体级联失活的功能分析中根据经验测试修饰的蛋白酶库。
a.理论修饰
被发明提供了根据理论修饰蛋白酶以增加其对于靶底物如任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性的方法。在这种方法中，已知靶底物的裂解序列。靶蛋白质内的裂解位点通过如下标准鉴别：1)其位于所述蛋白质的暴露的表面上；2)其位于没有二级结构的区域内(即不在P折叠或螺旋内)，通过原子结构或结构预测算法确定(这些区域在蛋白质的表面上趋于是环形的，或者在细胞表面受体上是杆状的)；3)其位于基于其已知功能而可能失活蛋白质的部位。裂解序列是例如长度为四个残基，以匹配许多蛋白酶的扩展的底物特异性，但是可以较长或较短。
因子I是一种丝氨酸蛋白酶，其通过裂解C3b和C4b而发挥补体激活的天然调节物功能。因子I在由C3和C4上的转变酶激活后分别裂解并失活C3b和C4b，并释放C3a和C4a。由因子I识别的肽裂解序列包括C3中的LPSR(SEQ ID NO：388)和SLLR(SEQ ID NO：389)及C4中的HRGR(SEQ ID NO：390)(见例如Davis et al.，(1982)Biochemistry 21：5745)；Harrison et al.，(1980)Mol.Immunology 17：9；Kai et al.，(1980)J Immunol.125：2409所述)。本发明提供了根据理论设计蛋白酶的特异性结合口袋以识别和特异性裂解因子I底物包括C3和C4以及iC3、C3b、iC4和C4b，从而抑制补体激活的方法。本发明提供了裂解因子I底物的产物。
例如，具有对于因子I靶序列改变的特异性的修饰的蛋白酶是通过基于结构的设计方案产生的。每个蛋白酶均具有一系列氨基酸，其沿着活性位点口袋排列并与底物直接接触。沿着蛋白酶的活性位点口袋排列的氨基酸称作S1-S4，其各自的底物接触位点称作P1-P4。含有活性位点的S1-S4口袋的氨基酸的相同性决定了该特定口袋的底物特异性。本文描述了形成例证的蛋白酶的底物结合口袋的氨基酸。通常地，蛋白酶的底物特异性可以通过例如基于蛋白酶和底物复合物的三维结构的分子建模而获知或确定(见例如，Wang et al.，(2001)Biochemistry 40(34)：10038；Hopfner et al.，StructureFold Des.1999 7(8)：989；Friedrich et al.，(2002)J Biol Chem 277(3)：2160；Waugh et al.，(2000)Nat Struct Biol.7(9)：762)所述)。在一个实例中，参与MT-SP1的S1-S4底物结合口袋的氨基酸如下所示(基于糜蛋白酶编号)：189、190、191、192、216和226(S1)；57、58、59、60、61、62、63、64、99(S2)；146、192、217、218(S3)；96、97、98、99、100、168、169、170、170A、171、172、173、174、175、176、178、179、180、215、217、224(S4)。在另一个实例中，木瓜蛋白酶家族蛋白酶中有助于P2(标准木瓜蛋白酶编号)特异性的氨基酸包括：66-68、133、157、160和/或215。对组成蛋白酶的S1-S4活性位点的任一或多个氨基酸进行修饰将改变该蛋白酶的底物特异性。例如，丝氨酸蛋白酶例如MT-SP1蛋白酶的S2口袋中第99位氨基酸突变为较小的氨基酸，赋予P2底物位置对于较大的疏水性残基的优选性。使用这种选择性诱变方法，可以产生对于因子I裂解序列具有底物特异性的蛋白酶。
在一个实施方案中，可以在组成蛋白酶的特异性结合口袋的氨基酸中、特别是在组成P1-P4底物特异性的任一或多个S1-S4氨基酸残基中进行点突变。通常地，组成蛋白酶的P1-P4特异性的氨基酸残基可以根据理论加以置换，以便产生由因子I识别的靶底物裂解位点。在一个实例中，蛋白酶可以被修饰为识别靶裂解序列LPSR/KI，其中S4位置中的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P4位置的亮氨酸，在S3位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P3位置的脯氨酸，在S2位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P2位置的丝氨酸，及在S1位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P1位置的精氨酸。在另一个实施例中，蛋白酶可以被修饰以识别靶裂解序列SLLR/SE，其中在S4位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P4位置的丝氨酸，在S3位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P3位置的亮氨酸，在S2位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P2位置的亮氨酸，及在S1位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P1位置的精氨酸。在另一个实例中，蛋白酶可以被修饰以识别靶裂解序列HRGR/TL，其中在S4位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P4位置的组氨酸，在S3位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P3位置的精氨酸，在S2位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P2位置的甘氨酸，及在S1位置的任一或多个氨基酸可以被修饰为识别在P1位置的精氨酸。在一些情况中，丝氨酸蛋白酶中的突变已经示出形成活性位点(S1-S4)的每个亚位点彼此不相互依赖地发挥功能，由此在一个亚位点的特异性修饰对相邻亚位点的特异性几乎没有影响。因此，遍及扩展的结合位点中的工程化底物特异性和/或选择性可以逐步实现。
例如，对于特定结合位点的残基或者对于特定序列具有低特异性的蛋白酶通过在底物序列结合口袋中产生点突变可以改变其特异性。在一些情况中，所得突变体较野生型在一个位点对于特定序列的特异性增加大于1.5、2、5、8、10倍或更高。在另一个实施方案中，所得突变体较野生型在一个位点对于特定序列的特异性增加大于100倍。在另一个实施方案中，所得突变体较野生型在一个位点对于特定序列的特异性增加1000倍以上。
在一个例证的实施方案中，可以对野生型MT-SP1蛋白酶进行修饰，以便MT-SP1蛋白酶识别因子I裂解序列LPSR、SLLR或HRGR，所述野生型MT-SP1蛋白酶具有P1-P4优选性，在P4位优选靶裂解序列Arg/Lys，在P3位优选碱性残基或Gln，在P2位优选小残基，在P1位优选Arg或Lys(见表15)。在这个实例中，修饰的MT-SP1的S1位置未改变，因为在P1位的精氨酸残基在MT-SP1的靶底物裂解位点与因子I裂解位点之间是保守的。MT-SP1的S2-S4亚位点中的任一或多个亚位点中的氨基酸残基可以被单独或者组合修饰，以增加对于因子I裂解序列的特异性和/或选择性。例如，为了修饰SEQ ID NO：2或10所示MT-SP1以增加其对于C3b中SLLR因子I裂解序列的特异性和/或选择性，识别底物P4位置中丝氨酸的MT-SP1的S4位置中的修饰可包括氨基酸修饰Q174H、D217Q、D217N、D217H、D96A、D96V、D96F、D96S和/或D96T(基于糜蛋白酶编号)；识别底物P3位置中的亮氨酸的MT-SP1的S3位置中的修饰可包括氨基酸修饰Q192L、Q192I、Q192F和/或Y146F(基于糜蛋白酶编号)；和/或识别底物P2位置中亮氨酸的MT-SP1的S2位置中的修饰可包括氨基酸修饰F99A、F99V、F99S和/或F99G(基于糜蛋白酶编号)。在另一个实例中，为了修饰SEQ ID NO：2或10所示MT-SP1以增加其对于C3b中LPSR因子I裂解序列的特异性和/或选择性，识别底物P4位置中亮氨酸的MT-SP1的S4位置中的修饰可包括氨基酸修饰W215F、W215Y、Q174F、Q174V、Q174L、Q174Y和/或M180E(基于糜蛋白酶编号)；识别底物P3位置中的脯氨酸的MT-SP1的S3位置中的修饰可包括氨基酸修饰Q192K、Q192R、Q192R(基于糜蛋白酶编号)；和/或识别底物P2位置中丝氨酸的MT-SP1的S2位置中的修饰可包括氨基酸修饰F99Y(基于糜蛋白酶编号)。在另一个实例中，为了修饰SEQ IDNO：2或10所示MT-SP1以增加其对于C4b中HRGR因子I裂解序列的特异性和/或选择性，识别底物P4位置中组氨酸的MT-SP1的S4位置中的修饰可包括氨基酸修饰W215F、W215Y、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R和/或Q174K(基于糜蛋白酶编号)；识别底物P3位置中的精氨酸的MT-SP1的S3位置中的修饰可包括氨基酸修饰D217A、D217V和/或Q192E(基于糜蛋白酶编号)；和/或识别底物P2位置中甘氨酸的MT-SP1的S2位置中的修饰可包括氨基酸修饰F99W、F99Y和F99D(基于糜蛋白酶编号)。MT-SP1蛋白酶支架的修饰的例子在表15中示出。本发明也包含所述位置的修饰组合。可以应用本领域已知的在靶蛋白质中进行任一或多个氨基酸突变的任何方法。所述方法包括编码核酸分子的标准位点定向诱变方法(使用例如可得自Stratagene的QuikChange试剂盒)，或者通过固相多肽合成方法。
表15：MT-SP1中改变对于因子I裂解序列的靶特异性的修饰实例
Figure A20068004790001111
i.位置扫描库的合成及使用荧光筛选
可以对在S1-S4任一或多个亚位点进行修饰的蛋白酶检验其在任何指定亚位点对于P1-P4底物特异性，使用含有组合荧光底物库(combinatorialfluorogenic substrate library)的位置扫描合成组合库(positional scanningsynthetic combinatorial library，PS-SCL)进行(Harris et al.，(2000)PNAS97：7754；US 2004/0175777；US 2004/0146938)。PS-SCL策略可以快速及容易地确定在任一或多个S1-S4活性位点亚位点的蛋白酶解底物特异性。PS-SCL策略包括使用肽库，其中所述库中一个位置保持恒定，而剩余的位置由用于制备该库的所有氨基酸组合组成。使用组合荧光肽底物库例如7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)荧光肽底物或者7-氨基-4-氨基甲酰甲基香豆素(ACC)荧光肽底物可用于分析修饰的蛋白酶的活性，其中荧光部分基于蛋白酶的作用而从肽底物中释放。本领域技术人员意识到这些方法提供了多种多样的可供选择的库形式。在一个实例中，蛋白酶可以用P1多样性库做谱(profiled)。P1-多样性四肽库含有ACC-或AMC-荧光四肽，其中P1位置系统地保持恒定，而P2、P3和P4位置含有20个氨基酸的任一或多个氨基酸的等摩尔混合物。ACC P1-固定的库可以核实任一种修饰的蛋白酶的P4、P3和P2特异性。在另一个实例中，将P2位固定为大的疏水性氨基酸可以防止被木瓜蛋白酶折叠蛋白酶优选内部裂解，导致底物序列的正确记录(register)。确定和考虑关于任何特定酶的特殊限制或底物序列特异性确定的方法在本领域技术人员的能力范围内。
本领域技术人员已知现有许多制备肽的方法。在一个例证的实施方案中，通过将荧光标记底物附着于固体支持物而筛选底物库。在一个实例中，来自底物肽的荧光离去基团是通过将N-Fmoc香豆素衍生物缩合至酸不稳定的Rink接头以产生ACC树脂而合成(Backes et al.，(2000)Nat Biotechnol.18：187)。除去Fmoc-产生游离胺。天然、非天然和修饰的氨基酸可以与胺偶联，其可以偶联更多的氨基酸。在另一个实施方案中，荧光离去基团可以是7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)(Harris et al.，(2000)PNAS 97：7754)。在完成肽的合成之后，肽-荧光部分缀合物可以从所述固体支持物裂解下来，或者所述缀合物可以保持连接在该固体支持物上。
典型地，一种制备荧光肽或包含荧光肽的材料的方法包括(a)提供与固体支持物共价结合的含有荧光部分的第一种缀合物；(b)将所述第一种缀合物与第一种保护的氨基酸部分和激活剂接触，从而在羧基与第一种缀合物的胺氮之间形成肽键；(c)去保护，从而形成具有活性胺部分的第二种缀合物；(d)将第二种缀合物与第二种保护的氨基酸及激活剂接触，从而在羧基与所述活性胺部分之间形成肽键；及(e)去保护，从而形成具有活性胺部分的第三种缀合物。在一个例证的实施方案中，所述方法进一步包括：(f)将第三种缀合物与第三种保护的氨基酸和激活剂接触，从而在羧基与活性胺部分之间形成肽键；及(e)去保护，从而形成具有活性胺部分的第四种缀合物。
对于难以偶联的氨基酸而言(例如Ile、Val等)，游离的未反应的胺可以保留在支持物上，使得随后的合成和分析操作变得复杂。一种应用DMF中乙酸的3-硝基三唑活性酯的专门加帽步骤有效地酰化剩余的苯胺。可以存在于未纯化的底物序列溶液中的所得乙酸加帽香豆素通常不是蛋白酶底物序列。
固相肽合成方法是制备本发明提供的多肽的肽主链的方法实例，其中将序列的C末端氨基酸附着于不可溶的支持物，随后相继加入序列中剩余的氨基酸。固相合成技术在由Narany和Merrifield，Solid-Phase PeptideSynthesis；pp.3-284 in The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology.Vol.2；Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Gross和Meienhofer，eds.Academic press，N.Y.，(1980)；及Stewart et al.，(1984)Solid Phase PeptideSynthesis，2nd etd.Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill描述。固相合成方法应用可商购的肽合成仪利用Fmoc或t-BOC化学是最易于完成的。
例如，肽合成方法可使用熟知的Fmoc合成化学进行。例如，使用叔丁基保护Asp、Ser、Thr和Tyr的侧链，使用S-三苯甲基和S-叔丁基硫保护Cys残基的侧链，使用t-Boc、Fmoc和4-甲基三苯甲基保护Lys残基。适当保护的氨基酸试剂可商购，或者可以使用本领域已知的方法制备。多个保护基团的应用可以使荧光团与任何特别希望的侧链选择性去封闭和偶联。因此，例如，t-Boc去保护是使用于二氯甲烷中的TFA实现的。Fmoc去保护是使用例如于DMF或N-甲基吡咯烷酮中的哌啶实现的，4-甲基三苯甲基去保护是使用例如于水中1-5％(v/v)TFA或1％TFA和于DCM中5％三异丙基硅烷实现的。A-叔丁基硫去保护是使用例如巯基乙醇水溶液(10％)实现的。叔丁基、t-boc和S-三苯甲基基团的除去是使用例如TFA∶苯酚∶水∶thioaniso∶ethanedithio(85∶5∶5∶2.5∶2.5)或者TFA∶苯酚∶水(95∶5∶5)实现的。
在任何特定位置或位置组合的多样性可以使用至少2、6、12、20或更多个氨基酸的混合物生长肽链而引入。氨基酸的混合物可包括任何有用量的特定氨基酸组合任何有用量的一或多种不同氨基酸。在一个实施方案中，所述混合物是氨基酸的等动力混合物(适当比率的混合物以使得所有成分的摩尔活性相等)。
可以组合修饰的蛋白酶以达到多重修饰的蛋白酶的特异性。在支架的一个残基的突变在一个位点产生特异性，将其在相同的蛋白酶内组合在支架的另一位点的另一突变，以产生组合特异性蛋白酶。在相同支架的分离的位点的任何数目的突变可用于产生组合特异性蛋白酶。
然后可以使用相应于希望的裂解序列的各个荧光肽底物，分析匹配希望的特异性谱的修饰的蛋白酶例如修饰的MT-SP1蛋白酶。一种分析可裂解任一或多种因子I裂解序列的修饰的蛋白酶的方法包括：(a)将肽荧光样品(含有因子I裂解序列)与蛋白酶接触，以这种方式基于蛋白酶的作用，荧光部分从肽底物序列中释放，从而产生荧光部分；及(b)观测所述样品是否经历可检测的荧光变化，所述可检测的变化是样品中存在酶活性蛋白酶的指征。在这个实例中，可以产生ACC-或AMC-四肽如Ac-SLLR-AMC或Ac-HRGR-AMC，将其与修饰的蛋白酶一起保温，通过分析荧光部分的释放可评价蛋白酶的活性。
在溶液中分析蛋白酶仅需要向荧光蛋白酶指示肽中加入一定量的蛋白酶原液，及测量随后的荧光增加或者吸收光谱中激发带的降低。也可以组合所述溶液和荧光指示剂及在使蛋白酶的活性最佳的“消化缓冲液”中进行分析。适于分析蛋白酶活性的缓冲液为本领域技术人员所熟知。通常地，选择缓冲液的pH相应于特定蛋白酶最佳pH。例如，特别适于分析弹性蛋白酶活性的缓冲液含有50mM磷酸钠、1mM EDTA，pH 8.9。利用荧光计非常便于进行所述测量，所述荧光计是提供荧光团“激发”光源及随后测量在特定波长发射的光的一种装置。与没有所述蛋白酶的对照指示溶液对比提供了蛋白酶活性的测量方法。所述活性水平可以通过产生蛋白酶/指示剂组合的标准曲线而精确定量，其中确定由已知活性的蛋白酶溶液产生的荧光变化的速率。
虽然可以使用荧光计检测荧光化合物，但是也可以通过本领域技术人员熟知的各种其它方法进行检测。因此，例如当荧光团以可见波长发射时，可以简便地通过目测应答光源激发的荧光进行检测。检测也可以利用通过界面连接在数字化仪或其它图像获得系统上的摄像机通过图像分析系统进行。检测也可以通过在荧光显微镜下通过滤光器观测而进行。该显微镜可提供由操作者简便观测到的信号。或者，该信号可以记录在照相底片上或者使用视频分析系统记录。信号也可以使用图像分析系统或光度计实时简便定量。
因此，例如，一种样品的蛋白酶活性的基本分析方法包括将样品悬浮或溶解于缓冲液中(在被分析的特定蛋白酶的最佳pH)，向缓冲液中加入荧光蛋白酶肽指示剂，使用如Harris et al.，(1998)J Biol Chem 273：27364所示荧光分光光度计监测荧光变化。所述荧光分光光度计是在荧光团激发波长发射荧光团的装置。所述荧光蛋白酶指示剂是蛋白酶的底物序列，由于蛋白酶裂解所述指示剂而发生荧光改变。
对修饰的蛋白酶进行分析，以确定当其以全长蛋白质形式呈现时将裂解希望的序列。含有因子I裂解位点的靶底物蛋白质于C3和C4序列中，特别是于在经转变酶激活后分别从C3和C4中产生的C3b和C4b中。因子I也裂解iC3和iC4，其是C3和C4的经改变的物种形式。评价靶蛋白裂解的方法在本文描述和/或为本领域技术人员所熟知。在一个实例中，可以将纯化的补体蛋白C3b、C4b、iC3或iC4在有或无修饰的蛋白酶的条件下保温，裂解事件可以通过SDS-PAGE及随后蛋白质的考马斯亮蓝染色进行监测，使用光密度测定法分析裂解产物。使用本文描述的方法或本领域熟知的方法在例如溶血测定中分析靶蛋白质的活性，以核实其功能已经被裂解事件破坏。
b.经验修饰
修饰的蛋白酶库可以通过使用本领域已知的任何方法突变蛋白酶的任一或多个氨基酸残基而产生(见公布的U.S.Appln.No.2004/0146938)。修饰的蛋白酶库可以在补体激活功能分析中进行检测，以确定其是否是抑制补体激活的“目标(Hit)”。可以鉴别修饰的蛋白酶的靶补体底物，及可以确定肽裂解序列。
在一个实例中，使用任何标准的位点定向诱变试剂盒例如QuikChange(Stratagene)突变蛋白酶的任一或多个氨基酸。在另一个实例中，通过活性位点残基的饱和诱变突变蛋白酶的任一或多个氨基酸。在这个实例中，形成蛋白酶的S1-S4口袋的残基(其中蛋白酶与肽底物的P1-P4残基接触)和/或已经示出是特异性的重要决定簇的残基被单独或组合突变为每一种可能的氨基酸。在一些情况中，活性位点的S1-S4口袋之间有少许(如果有的话)相互作用，因此每个口袋似乎均独立于其它口袋而识别及结合肽底物序列上的相应残基。因此，通常可以改变一个口袋中的特异性决定簇不影响其它口袋的特异性。在一个例证的实施方案中，应用饱和诱变技术，其中沿着口袋的残基被突变为20种可能的氨基酸的每一个氨基酸(见例如Kunkle方法，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，MediaPa.)。在这种技术中，合成诱变寡核苷酸引物，其在希望的密码子含有随机化的NNS或NNK。引物与单链DNA模板退火，加入DNA聚合酶以合成该模板的互补链。在连接后，双链DNA模板转化进大肠杆菌中进行扩增。
本文描述了形成例证的蛋白酶的扩展的底物结合口袋的氨基酸。通常地，例如通过基于蛋白酶和底物的复合物的三维结构进行分子建模，已知蛋白酶的底物特异性(见例如Wang et al.，(2001)Biochemistry 40(34)：10038；Hopfner et al.，Structure Fold Des.1999 7(8)：989；Friedrich et al.，(2002)J BiolChem 277(3)：2160；Waugh et al.，(2000)Nat Struct Biol.7(9)：762所述)。在一个实例中，MT-SP1的突变可以在有助于底物特异性的任一或多个残基，包括(基于糜蛋白酶编号)：195、102、57(催化三元体)；189、190、191、192、216和226(S1)；57、58、59、60、61、62、63、64、99(S2)；146、192、217、218(S3)；96、97、98、99、100、168、169、170、170A、171、172、173、174、175、176、178、179、180、215、217、224(S4)。在另一个实例中，木瓜蛋白酶家族蛋白酶中氨基酸残基的突变可以在影响P2特异性(标准木瓜蛋白酶编号)的任一或多个残基，包括第66-68、133、157、160和/或215。另外，不直接接触蛋白酶底物、但影响接触残基(例如上述那些残基)的位置和/或构象的残基也可以被突变，以改变蛋白酶支架的特异性。
为了鉴别靶向任一或多种补体蛋白的那些修饰的蛋白酶，在补体激活的功能分析中检验从蛋白酶支架如MT-SP1支架中产生的修饰的蛋白酶库。本文描述了补体激活测定，其可包括任一或多种溶血测定和/或检测一或多个补体级联的激活产物的测定。例如，可以应用酶免疫测定或ELISA检测补体激活的裂解产物例如C4a、C5a、C3b、C3d和C5-b9的存在。抑制补体激活(例如通过溶血测定确定增加CH50水平或者降低补体激活裂解产物的检测)的修饰的蛋白酶可被鉴别为“目标”。在一个实施方案中，可以产生“目标”组合以进一步增加蛋白酶抑制补体激活的特异性和/或选择性。
可以筛选在功能分析中鉴别为抑制补体激活的“目标”的修饰的蛋白酶如修饰的MT-SP1，以确定补体蛋白靶底物。本文描述了检测补体蛋白裂解的分析方法。在一个实例中，纯化的补体蛋白可以在有或无修饰的蛋白酶的条件下保温，在SDS-PAGE凝胶上进行测定和分辨，蛋白质裂解产物在经例如考马斯亮蓝蛋白质染色后可进行检测。裂解产物可以被切断，肽裂解序列可以通过N末端测序确定。使用根据经验对修饰的蛋白酶库进行测试而确定的被鉴别的肽裂解序列，使用上述针对因子I裂解序列的理论方法可以鉴别和产生进一步修饰的蛋白酶。
2.分析特异性的方法
本发明提供了评价所得支架或修饰的蛋白酶的底物特异性的方法。在一个实施方案中，S1-S4任一或多个亚位点的特异性可以使用如上述ACC或AMC位置扫描库确定。在另一个实施方案中，与非靶底物相比，支架或修饰的蛋白酶对于靶底物的特异性可以使用单一底物动力学分析确定，见例如Harris，et al.(2000)PNAS，97：7754所述。在特定的实施方案中，靶蛋白酶与支架蛋白酶的特异性的对比可用于确定修饰的蛋白酶与支架蛋白酶相比是否呈现改变的例如增加的特异性。
蛋白酶对于靶底物的特异性可以通过观测在指定活性修饰的蛋白酶较支架蛋白酶裂解多少完全不同的序列而测量。如果修饰的蛋白酶较野生型蛋白酶裂解更少的靶底物，则该修饰的蛋白酶较支架蛋白酶对于那些靶底物具有更高的特异性。蛋白酶对于靶底物的特异性可以从裂解靶底物较非靶底物(即蛋白酶的天然野生型底物序列)的特异性常数中确定。可以产生修饰的蛋白酶对于靶底物及非靶底物的特异性常数比率，以确定蛋白酶的裂解效力比率。对比修饰的蛋白酶与支架蛋白酶之间裂解效力的比率可用于评价对于靶底物的特异性变化倍数。倍数变化是修饰的蛋白酶与支架蛋白酶相比对于靶底物的特异性的增加，其足以实现补体激活或补体介导活性的预定改变。当与支架蛋白对于靶底物及非靶底物的特异性对比时，特异性可以是至少2、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍或更多倍。
在一个实例中，可以对通过使用位置扫描底物库确定的匹配希望的特异性谱的修饰的蛋白酶进行分析，使用与非靶底物裂解序列相比相应于希望的靶裂解序列的各个肽底物确定特异性的程度和变化。在一个实施方案中，所述各个肽裂解序列可以附着于荧光标记的底物如在本文描述的ACC或AMC荧光离去基团，荧光部分的释放可以通过测量蛋白酶对于肽裂解序列的特异性而确定。非靶底物裂解序列或靶裂解序列荧光的增加率可以通过例如使用荧光分光光度计测量。荧光的增加率可以随时间测量。通过标准动力学方法确定Michaelis-Menton动力学常数。动力学常数kcat、Km和kcat/Km可以通过对底物浓度的倒数与底物裂解速度的倒数绘图而计算，拟合为Lineweaver-Burk等式(1/速度＝(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax，其中Vmax＝[ET]kcat)。特异性常数(kcat/Km)是底物被特定蛋白酶裂解的情况的测量手段。
在一个实施方案中，非靶底物裂解序列可以是天然的底物裂解序列，如由野生型MT-SP1识别的裂解序列。例如，MT-SP1的有效自身活化引起对Arg-Gln-Ala-Arg P4-P1靶序列的识别和裂解。MT-SP1也可有效地激活蛋白酶激活受体(PAR2)、单链uPA及肝细胞生长因子/分散因子(scatterfactor)。这些位于胞外表面的蛋白质分别显示P4-P1靶序列Ser-Lys-Gly-Arg、Pro-Arg-Phe-Lys和Lys-Gln-Gly-Arg，其与针对小肽底物观测到的MT-SP1裂解特异性要求非常匹配。在一个实施方案中，荧光标记的四肽RQAR(SEQ ID NO：401)或SLGR(SEQ ID NO：392)或PRFK(SEQID NO：402)或KQGR(SEQ ID NO：403)可以用作非靶底物裂解序列。
在另一个实施方案中，可以确定补体蛋白的任一或多个裂解序列并用作希望的靶裂解序列。例如，任一或多个因子I裂解序列例如SLLR(SEQ IDNO：389)、LPSR(SEQ ID NO：388)及HRGR(SEQ ID NO：390)可用作荧光标记的四肽靶裂解序列。在另一个实例中，由任一或多种野生型或修饰的蛋白酶靶向的补体蛋白中希望的裂解序列可以通过基于蛋白酶对任一或多种补体蛋白的裂解由N末端测序裂解产物而经验确定。在这种实例中，可以使用经鉴别为本发明提供的蛋白酶的靶裂解序列的任一或多个裂解序列，包括实施例3中描述的那些。因此，例如如下所示荧光标记的四肽可用作靶底物裂解序列：GATR(SEQ ID NO：391)、SLGR(SEQ ID NO：392)、VFAK(SEQ ID NO：393)、REFK(SEQ ID NO：394)、QHAR(SEQ ID NO：398)、GLAR(SEQ ID NO：395)、RLGR(SEQ ID NO：396)、AEGK(SEQ ID NO：397)或HRGR(SEQ ID NO：390)。
在另一个实施方案中，全长补体蛋白可用作靶底物以分析与蛋白酶的全长天然靶底物相比蛋白酶的特异性。再者，全长补体蛋白可用于评价蛋白酶对于全长靶底物及对靶底物内含有的四氨基酸P1-P4底物裂解序列的底物特异性和裂解之间的关系。在一个实例中，全长C2蛋白可用作任一或多种蛋白酶的希望的裂解靶以评价特异性。在这个实例中，可以将修饰的或支架蛋白酶对C2的裂解与对另一全长底物的裂解进行对比，或者可以将该裂解与C2的荧光四肽裂解序列如实施例11中描述的那些序列(即GATR、SLGR或VFAK)对比。全长蛋白质由蛋白酶裂解的特异性常数可以通过使用凝胶光密度分析法确定，以评价在存在蛋白酶的条件下在光密度测定法中保温的全长靶底物带随着时间的改变。
3.蛋白酶多肽
使用本文描述的方法，提供了裂解任一或多种补体蛋白的蛋白酶，其中补体蛋白的裂解抑制补体激活。正如本发明所提供，裂解任一或多种补体蛋白的蛋白酶多肽是非补体蛋白酶。蛋白酶多肽可包括支架蛋白酶的氨基酸序列，其序列在本文中提供，例如如下任一序列：SEQ ID NO：2、4、8、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、269、270、272、274、276、278、280、282、284、286、287、289、291、293、295、297、373、375、377、379、381、383、385、387、544、545、547、549和551或其催化活性部分。例如，支架蛋白酶可以是野生型或主流形式的蛋白酶。在另一个实施方案中，支架蛋白酶可以是蛋白酶的等位基因变体。所述支架蛋白酶是哺乳动物来源的，特别是人源的，但是所述支架蛋白酶多肽序列也可以是如下任一或多种来源的：仓鼠、小鼠、大鼠、牛、猴、猩猩、狒狒、黑猩猩、短尾猿、长臂猿或大猩猩。在其它实施方案中，所述支架蛋白酶可以来自非哺乳动物来源，如来自植物或寄生虫。
在一个实施方案中，蛋白酶支架被修饰为与支架蛋白酶相比对于任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加，同时仍编码保持其蛋白酶活性的蛋白质。修饰的蛋白酶多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰部位的多肽。通常地，修饰的蛋白酶包括其中在特定位置的残基已经由其它氨基酸取代的、及进一步包括可能在野生型蛋白酶蛋白质的两个残基之间插入额外的残基以及可能缺失一或多个野生型蛋白酶序列的一或多个残基的任何变体。本文提供了野生型蛋白酶序列的任何氨基酸取代、插入或缺失。
本发明提供了修饰的多肽，其含有支架蛋白酶的全长序列，但是还含有有助于底物特异性和/或选择性的任一或多个氨基酸的修饰。在一个实施方案中，本发明提供的修饰的蛋白酶多肽与支架蛋白酶相比对于任一或多种补体蛋白具有增加的底物特异性和/或选择性，其中补体蛋白的裂解抑制补体激活。在另一个实施方案中，修饰的蛋白酶多肽对于补体蛋白较对于VEGF或VEGFR的裂解具有更高的特异性。在另一个实施方案中，本发明提供的修饰的蛋白酶不裂解VEGF或VEGFR。另外，本发明提供的含有有助于底物特异性和/或选择性的任一或多个氨基酸修饰的修饰的蛋白酶多肽也可以含有在蛋白酶的底物特异性非必需的区域中的其它修饰。
本发明提供的修饰的蛋白酶多肽也可以含有全长支架或未修饰的蛋白酶的催化活性部分。当所述多肽包括催化活性部分时，其可以包括除此之外的其它非蛋白酶部分，只要所得多肽呈现所述全长多肽的至少1％、2％、5％、10％、20％、50％、100％或更多的蛋白酶活性即可。另外，所述催化活性部分比全长序列少至少一个氨基酸，并可少于全长蛋白酶结构域，只要保留蛋白酶活性即可。含有有助于底物特异性的任一或多个氨基酸修饰的蛋白酶的催化活性部分可以是活性的单链或双链形式的支架蛋白酶。在一些实施方案中，修饰的蛋白酶可以在N或C末端由另一多肽取代，如在融合蛋白中。在另外的实施方案中，可以插入修饰的多肽蛋白酶例如修饰的蛋白酶的催化活性部分以置换另一蛋白酶中的蛋白酶结构域。
本发明提供了对于任一或多种补体蛋白具有增加的特异性和/或选择性的蛋白酶，所述补体蛋白具有如下所示任一氨基酸序列或其呈现补体活性的片段：SEQ ID NO：298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340、344、660-662。
a.MT-SP1多肽
本发明提供了裂解任一或多种补体蛋白的MT-SP1多肽，其中补体蛋白的裂解抑制补体激活。本发明提供的MT-SP1多肽可以是全长MT-SP1多肽(SEQ ID NO：2)或者可以是呈现催化活性的全长MT-SP1的片段或部分序列。在一个实例中，MT-SP1多肽可以是MT-SP1的单链蛋白酶结构域(SEQ ID NO：10)。在另一个实施方案中，MT-SP1多肽可以是如SEQ IDNO：448所示MT-SP1的任一或多种等位基因变体。
本发明还提供了修饰的MT-SP1多肽，其含有使用本发明描述的任一种方法产生的支架MT-SP1多肽的任一或多个氨基酸修饰。在一个实施方案中，所述修饰可以在SEQ ID NO：2所示支架MT-SP1中产生，或者可以在野生型MT-SP1的等位基因变体如SEQ ID NO：448所示任一等位基因变体中产生。本发明提供的修饰的MT-SP1多肽可以组成MT-SP1支架的全长序列，或者可以组成全长MT-SP1支架蛋白酶的催化活性部分。修饰的MT-SP1与MT-SP1支架相比表现为对任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加，其中所述蛋白质的裂解抑制补体激活。
本发明提供了具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多修饰位置的修饰的MT-SP1多肽。在一个实施方案中，修饰的MT-SP1多肽包括在MT-SP1的扩展的底物结合口袋中的任一或多个氨基酸的突变，包括例如如下任一或多噶氨基酸残基的修饰(基于糜蛋白酶编号)：195，102，57(催化三元体)；189、190、191、192、216和226(S1)；57、58、59、60、61、62、63、64、99(S2)；146、192、217、218(S3)；96、97、98、99、100、168、169、170、170A、171、172、173、174、175、176、178、179、180、215、217、224(S4)。改变底物特异性和/或选择性的MT-SP1的蛋白酶结构域中的修饰也包括任一或多个41、60c、143、147、151或221a位(基于糜蛋白酶编号)氨基酸残基的修饰。
本发明提供了修饰的MT-SP1多肽，其中如下氨基酸残基经鉴别在MT-SP1的蛋白酶结构域中增加裂解任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性，从而抑制补体激活：41、60c、97、143、146、147、151、172、175、192、217、221a和224(基于糜蛋白酶编号)。修饰的MT-SP1多肽与SEQ IDNO：2所示野生型MT-SP1或SEQ ID NO：10所示其催化活性部分相比呈现对于任一或多种补体成分的特异性和/或选择性增加。因此，本发明提供了修饰的MT-SP1多肽，其对于任一或多种补体成分呈现增加的特异性和/或选择性，其在相应于选自如下的任一或多个氨基酸残基的氨基酸位置具有修饰：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10所示的MT-SP1中的I41、R60C、F97、H143、Y146、G147、G151、L172、Q175、Q192、D217、Q221a或K224(基于糜蛋白酶编号)。在一个实施方案中，氨基酸置换相应于在如下任何位置置换：MT-SP1的蛋白酶结构域的I41T、I41A、I41L、I41F、I41D、I41E、R60CD、R60CW、F97D、F97E、F97A、F97W、H143V、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Y146F、G147E、G151L、L172N、Q175D、Q175E、Q175H、Q175L、Q175F、Q175W、Q175Y、Q175R、Q175K、Q192A、Q192R、Q192V、Q192F、D217F、Q221aD、Q221aL、Q221aE、K224A、K224L、K224R、K224N、K224T、K224Y、K224S及K224F(基于糜蛋白酶编号)。表16提供了增加对于任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性的氨基酸置换的非限制性例子，包括例证的多肽序列的SEQ ID NO及编码核酸序列。
表16
  ID#   修饰   全长SEQ ID NO：(氨基酸，核苷酸)   催化活性部分SEQ ID NO：(氨基酸，核苷酸)
  CB200   野生型   1，2   10，9
  CB12   F97D   406，482   16，15
  CB13   F97E   407，483   18，17
  CB16   Y146F   646   592
  CB17   L172N   647   593
  CB20   Q175D   636   582
  CB21   Q175E   635   581
  CB31   F97A   408，484   20，19
  CB32   F97W   409，485   22，21
  CB40   Y146N   410，486   24，23
  CB41   Y146D   411，487   26，25
  CB42   Y146E   412，488   28，27
  CB43   Y146A   413，489   30，29
  CB44   Y146W   414，490   32，31
  CB45   Y146R   415，491   34，33
  CB62   Q192V   405，481   14，13
  CB64   Q192R   416，492   36，35
  CB66   K224A   417，493   38，37
  CB67   K224F   418，494   40，39
  CB80   R60CD   623   569
  CB82   R60CW   621   567
  CB268   Q221aD   614   560
  CB274   G147E   622   568
本发明还提供了修饰的MT-SP1多肽，其中如下氨基酸残基在MT-SP1的底物结合位点S1-S4中经鉴别为增加含有SLLR/SE因子I裂解序列的任一或多种补体蛋白的裂解特异性和/或选择性，从而抑制补体激活：96、174、217、146、192和99(基于糜蛋白酶编号)。修饰的MT-SP1多肽与SEQ ID NO：2所示野生型MT-SP1的天然靶底物或者SEQ ID NO：10所示其催化活性部分相比呈现出对于C3b或iC3补体蛋白底物的特异性和/或选择性增加。在一个实施方案中，氨基酸置换相应于在如下任何位置置换：MT-SP1的蛋白酶结构域的D96A、D96V、D96F、D96S、D96T、Q174H、D217Q、D217N、D217H、Q192L、Q192I、Q192F、F99A、F99V、F99S或F99G(基于糜蛋白酶编号)。表17提供了增加对于任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性的氨基酸置换的非限制性例子，包括例证的多肽序列的SEQ ID NO及编码核酸序列。
表17
  修饰   全长SEQ ID NO：   催化活性部分SEQ ID NO：
  D96A   423，499   45，455
  D96V   424，500   46，456
  D96F   425，501   47，457
  D96S   426，502   48，458
  D96T   427，503   49，459
  Q174H   419，495   41，451
  D217Q   420，496   42，452
  D217N   421，497   43，453
  D217H   422，498   44，454
  Q192L   428，504   50，460
  Q192I   429，505   51，461
  Q192F   430，506   52，462
  Y146F   431，507   53，463
  F99A   432，508   54，464
  F99V   433，509   55，465
  F99S   434，510   56，466
  F99G   435，511   57，467
本发明还提供了修饰的MT-SP1多肽，其中经鉴别在MT-SP1的底物结合位点S1-S4中如下氨基酸残基增加含有LPSR/KI因子I裂解序列的任一或多种补体蛋白的裂解特异性和/或选择性，从而抑制补体激活：174、180、215、192和99(基于糜蛋白酶编号)。修饰的MT-SP1多肽与SEQ ID NO：2所示野生型MT-SP1的天然靶底物或者SEQ ID NO：10所示其催化活性部分相比呈现对于C3b或iC3补体蛋白底物增加的特异性和/或选择性。在一个实施方案中，氨基酸置换相应于在如下任何位置置换：MT-SP1的蛋白酶结构域的Q174F、Q174V、Q174L、Q174Y、M180E、W215F、W215Y、Q192K、Q192R、Q192Y或F99Y(基于糜蛋白酶编号)。表18提供了增加对于任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性的氨基酸置换的非限制性例子，包括例证的多肽序列的SEQ ID NO及编码核酸序列。
表18
  修饰 全长SEQ ID NO：   催化活性部分SEQ ID NO：
  Q174F   440，516   62，472
  Q174V   439，515   61，471
  Q174L   529，539   524，534
  Q174Y   530，540   525，535
  M180E   531，541   526，536
  W215F   436，512   58，468
  W215Y   437，513   59，469
  Q192K   532，542   527，537
  Q192R   416，492   35，36
  Q192Y   533，543   528，538
  F99Y   447，523   69，479
本发明还提供了修饰的MT-SP1多肽，其中经鉴别在MT-SP1的底物结合位点S1-S4中如下氨基酸残基增加含有因子HRGR/TL因子I裂解序列的任一或多种补体蛋白的裂解特异性和/或选择性，从而抑制补体激活：174、215、192、217和99(基于糜蛋白酶编号)。修饰的MT-SP1多肽与SEQ ID NO：2所示野生型MT-SP1的天然靶底物或者SEQ ID NO：10所示其催化活性部分相比呈现对于C4b或iC4补体蛋白底物增加的特异性和/或选择性。在一个实施方案中，氨基酸置换相应于在如下任何位置置换：MT-SP1的蛋白酶结构域的W215F、W215Y、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、D217A、D217V、Q192E、F99W和F99Y(基于糜蛋白酶编号)。表19提供了增加对于任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性的氨基酸置换的非限制性例子，包括例证的多肽序列的SEQ ID NO及编码核酸序列。
表19
  修饰   全长SEQ ID NO：   催化活性部分SEQ ID NO：
  W215F   436，512   58，468
  W215Y   437，513   59，469
  Q174A   438，514   60，470
  Q174V   439，515   61，471
  Q174F   440，516   62，472
  Q174R   441，517   63，473
  Q174K   442，518   64，474
  D217A   443，519   65，475
  D217V   444，520   66，476
  Q192E   445，521   67，477
  F99W   446，522   68，478
  F99Y   447，523   69，479
在一个实施方案中，可以组合修饰的蛋白酶以例如获得多蛋白酶特异性。在蛋白酶支架的一个残基的突变在底物序列的一个位点产生特异性，可以将此突变在相同蛋白酶中与蛋白酶支架序列的另一位点的突变组合，以产生组合特异性蛋白酶。在相同蛋白酶支架上不同位点的任何数目的突变均可用于产生组合特异性蛋白酶。通过组合经鉴别为是有助于蛋白酶的底物特异性和/或选择性的任两或多个突变，修饰的蛋白酶可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个突变。
例如，修饰的MT-SP1蛋白酶可含有任两或多个突变，如上述任两或多个突变，以产生组合蛋白酶。本发明提供了修饰的MT-SP1多肽，其具有相应于如下任何位置的两或多个修饰：41、60c、96、97、99、143、146、147、151、172、174、175、192、215、217、221a和224(基于糜蛋白酶编号)。修饰的MT-SP1多肽与SEQ ID NO：2所示支架或野生型MT-SP1或SEQ ID NO：10所示其催化活性部分相比呈现对于任一或多种补体成分增加的特异性和/或选择性。因此，本发明提供了修饰的MT-SP1多肽，其呈现对于任一或多种补体成分增加的特异性和/或选择性，所述补体成分在相应于选自如下的任两或多个氨基酸残基的氨基酸位置具有两或多个修饰：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10所示MT-SP1中I41、R60C、D96、F97、F99、H143、Y146、G147、G151、L172、Q174、Q175、Q192、W215、D217、Q221a或K224(基于糜蛋白酶编号)。在一些实例中，含有两或多个修饰的修饰的MT-SP1在Y146或K224位或者这两个位置含有修饰。在另一个实例中，含有两或多个修饰的修饰的MT-SP1在G151位含有修饰。修饰的MT-SP1多肽可以使用本文揭示的任何方法产生。表20提供了增加对于任一或多种补体蛋白的特异性和/或选择性的氨基酸置换的非限制性例子，包括例证的多肽序列的SEQ ID NO及编码核酸序列。
表20：
  ID#   修饰 全长SEQ IDNO： 催化活性部分SEQ ID NO ：
  CB155   Y146D/K224F   404，480   11，12
  CB212   Y146N/K224F   655   601
  CB213   Y146E/K224F   642   588
  CB214   Y146A/K224F   643   589
  CB216   Q192V/K224F   659   605
  CB218   Q192F/K224F   657   603
  CB219   Y146D/Q192A/K224F   658   604
  CB232   Y146E/K224L   620   566
  CB235   Y146E/K224A   630   576
  CB238   Y146D/K224L   628   574
  CB244   Y146D/K224R   617   563
  CB245   Y146D/K224N   637   583
  CB251   Y146E/K224R   615   561
  CB252   Y146E/K224N   606   552
  CB255   Y146E/K224T   644   590
  CB257   Y146E/K224Y   633   579
  CB331   I41D/Y146D/K224L   653   599
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本发明提供了修饰的MT-SP1多肽，其中在具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的MT-SP1多肽支架中进行置换，修饰的MT-SP1多肽与未修饰的蛋白质相比呈现对于任一或多种补体成分增加的特异性和/或选择性。本发明还提供了在具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的MT-SP1支架中含有修饰的修饰的MT-SP1多肽，修饰的MT-SP1多肽与未修饰的蛋白质相比呈现对于任一或多种补体成分增加的特异性和/或选择性。这种MT-SP1支架多肽是MT-SP1多肽的催化活性部分。本发明提供的含有全长MT-SP支架的催化活性部分中的修饰的示例性修饰的MT-SP1多肽具有如下所示任一氨基酸序列：SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、524-528、552-605、672-680或者696-710。本发明提供的含有全长MT-SP1支架修饰的修饰的MT-SP1多肽具有如下所示任一氨基酸序列：SEQ ID NO：404-418-447、529-533、606-659、663-671或681-695。
E.评价或监测修饰的蛋白酶对于补体介导的功能的活性的测定
修饰的蛋白酶与相应全长、支架或野生型形式的补体蛋白相比可以呈现出对于任一或多种补体蛋白改变的特异性和/或选择性，从而失活任一或多种补体蛋白。修饰的蛋白酶保留其蛋白酶活性，但可以呈现对于任一或多种补体蛋白增加的特异性和/或选择性。示例蛋白酶特异裂解任一或多种补体蛋白及从而改变补体蛋白的活性。对于任一或多种补体蛋白具有增加的特异性和/或选择性的所有这种支架或修饰的蛋白酶均是候选治疗剂。
在蛋白酶对于任一或多种补体蛋白呈现出增加的特异性和/或选择性的情况中，可以使用体外和体内测定以监测或筛选对补体介导的功能起作用的蛋白酶。这种测定为本领域技术人员所熟知。本领域技术人员可以检测裂解任一或多种补体蛋白的特殊支架或修饰的蛋白酶和/或测试评价与在没有蛋白酶的情况相比蛋白酶对于补体介导的活性的作用的任何变化。本文例证一些这样的测定。
本文提供了体外和体内测定的实例以对比支架或修饰的蛋白酶对于任一或多种靶向的补体蛋白功能的活性。许多测定可用于其它蛋白酶和修饰的蛋白酶。另外，许多测定如测量补体激活的测定为本领域技术人员所已知。补体活性的测定包括但非限于测量补体激活的活化产物例如C5b-9MAC复合物及任一或多种补体裂解产物如C4a、C5a、C3b和C3d的产生的测定。测量补体激活的测定也包括功能测定，其测量补体途径的特殊成分的功能活性，例如溶血测定用于测量经典、凝集素或旁路途径任一的激活。评价蛋白酶和修饰的蛋白酶对于补体蛋白和/或补体介导的功能的作用的测定包括但非限于SDS分析及随后的Western印迹或考马斯亮蓝染色，酶免疫测定和溶血测定。在一个实例中，可以使用纯化的补体蛋白进行体外测定。在另一个实例中，可通过检测包括哺乳动物或人物种的血清进行体内分析补体的功能性活化。下文描述了一些测定实例。
a.蛋白质检测
蛋白质检测是一种测量样品中各个补体成分的方法。可以对补体蛋白进行检测以直接评价支架或修饰的蛋白酶对于蛋白质裂解的作用，或者对补体蛋白进行测量可以作为评价补体激活的手段。可以通过如下任一或多种分析对在有或无支架或修饰的蛋白酶的条件下处理的补体蛋白进行分析：SDS-PAGE及随后的考马斯蓝染色或者Western印迹，酶免疫测定，免疫组织化学，流式细胞计量术，浊度测定法，琼脂凝胶扩散，或放射免疫扩散。下文描述了进行蛋白质检测的测定实例。
i.SDS-PAGE分析
在有或无增加浓度的支架或修饰的蛋白酶的条件下对补体蛋白的分析可以通过在SDS-PAGE上分析蛋白质及随后检测这些蛋白质而进行。在这种实例中，补体蛋白可以通过例如考马斯亮蓝染色、银染色或者通过本领域技术人员已知的任何其它方法进行总蛋白质染色而检测，或者通过使用特异于特定蛋白质的多克隆或单克隆抗体进行Western印迹而检测。典型地，纯化的补体蛋白例如参与补体途径的任一或多种蛋白质可以在有或无支架或修饰的蛋白酶的条件下保温。经处理的补体蛋白可以在SDS-PAGE凝胶上分辨，随后通过例如考马斯亮蓝染色检测凝胶中的蛋白质。可以将经处理的蛋白质与其同源全长蛋白质进行比较，确定蛋白酶对蛋白质裂解形成的降解产物。
在另一个实施方案中，可以将样品例如人血清或血浆在有或无支架或修饰的蛋白酶的条件下处理，或者可以在用或不用蛋白酶处理动物或人后收集样品。可以在SDS-PAGE上分析经蛋白酶处理的样品，及可以使用该蛋白质的单克隆或多克隆抗体通过Western印迹检测特殊的补体蛋白如C1q、MBL、C2、C3、C4、C5或因子B。可以将所述补体蛋白的裂解与未经蛋白酶处理的样品进行对比。另外，可以刺激样品以起始补体激活，例如通过与刺激经典途径的IgG一起保温或者通过刺激旁路途径激活的LPS进行刺激。样品可以通过SDS-PAGE检测任一或多种天然补体蛋白以确定与未经蛋白酶处理的样品相比指定蛋白质的裂解产物的存在与否而分辨。在这种实例中，也可以使用单克隆和多克隆抗体通过Western印迹分析天然补体蛋白的裂解效应分子，以评价一或多个途径的激活。补体效应分子的例子可包括但非限于C3a、C3d、iC3b、C4d、Bb和C5-b9。例如，样品中C4d的表达降低可表明支架或修饰的蛋白酶抑制一或多个补体经典途径或凝集素途径的激活。在另一个实例中，样品中Bb表达降低可表明支架或修饰的蛋白酶抑制补体旁路途径的激活。也可以确定所述效应分子的裂解产物以评价支架或修饰的蛋白酶浓度增加对于补体效应分子自身裂解的作用。
ii.酶免疫测定
酶免疫测定(EIA，也称作酶联免疫吸附测定ELISA)是用于测定样品中蛋白质存在的一种分析方法。典型地，蛋白质的测定是通过蛋白质与抗体的结合进行间接测定，所述抗体自身用可检测的底物如酶或荧光化合物标记。EIA分析可用于测定支架或修饰的蛋白酶对于补体激活的作用，通过测定在补体激活后产生的补体效应分子的存在而测定。在这种实例中，样品如人血清或血浆可以在有或无增加浓度的支架或修饰的蛋白酶的条件下预处理，随后通过与起始分子保温进行激活以诱导补体激活，或者可以在用蛋白酶处理动物或人之后收集。例如，经典途径可以通过与IgG保温而激活，旁路途径可以通过将样品与LPS保温而激活。特异于凝集素途径的补体激活分析需要补体的经典途径被抑制，因为凝集素途径的C4/C2裂解活性与补体的经典途径共享。经典途径的抑制可以使用抑制C1q与免疫复合物的结合及破坏C1复合物的高离子强度缓冲液实现，其中高离子强度缓冲液不影响MBL的碳水化合物结合活性。因此，凝集素途径的激活可以通过将样品如人血清或血浆与甘露聚糖包被的表面在存在1M NaCl的条件下保温而诱导。
在激活后，加入Pefabloc(Roche)和EDTA淬灭样品，以使得途径的持续激活最小化。可以通过EIA或ELISA分析样品中补体效应分子的存在。测定补体蛋白的EIA和ELISA分析为本领域技术人员所熟知。可以评价任何补体激活产物。用于测量补体激活的补体激活产物的例子包括iC3b、Bb、C4d、C5b-9、C3a、C3a-desArg、C4a-desArg和C5a-desArg。激活的补体途径可以根据测量的补体激活产物而确定。例如，Bb裂解产物的测量是旁路途径的独特标志物。
在一些实例中，通过SDS-PAGE及随后的Western印迹分析方法分析蛋白酶处理的补体刺激的样品，EIA可以与裂解的补体蛋白的检测方法配合进行，以鉴别特异的补体成分。使用光密度测定法软件，可以将补体产物的裂解与在分析中裂解的全长补体成分对比，可以确定所有主要降解产物的表观及裂解百分比。
iii.放射免疫扩散(RID)
放射免疫扩散(RID)是一种依赖于在掺入琼脂糖凝胶中的抗体与测试样品中存在的抗原之间形成的免疫复合物的沉淀导致在样品孔周围形成环状沉淀素带(precipitin line)的技术。沉淀素环的直径与测试样品中存在的抗体(或抗原)的浓度成比例。通过测试样品沉淀素环与已知标准进行对比，可以获得对特异性抗体或抗原浓度的相对粗略的估算。RID可用于测量样品中补体蛋白的量。例如，可以在有或无增加浓度的支架或修饰的蛋白酶的条件下处理样品如人血清或血浆。可以将经蛋白酶处理的样品加入已经掺入任一补体蛋白如包括但非限于C1q、C1r、C1s、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C9或因子B的多克隆或单克隆抗体的琼脂糖凝胶孔中。在通过暴露于0.15M NaCl而除去未沉淀的蛋白质之后，可以通过用蛋白质染料例如考马斯亮蓝染色或Crowles双重染色分析沉淀的蛋白质环。
b.溶血测定
功能性溶血测定提供了关于补体功能的总体信息。这种类型的分析使用抗体致敏或未致敏的绵羊红细胞。溶血测定包括总溶血补体分析(totalhemolytic complement assay，CH50)，其测量经典途径及MAC裂解绵羊RBC的能力。其依赖于经典途径成分(C1-C9)的相继激活以裂解绵羊红细胞，所述绵羊红细胞已经用最佳量的兔抗绵羊红细胞抗体致敏以产生细胞抗原-抗体复合物。溶血测定也可包括旁路途径CH50分析(兔CH50或APCH50)，其测量旁路途径和MAC裂解兔RBC的能力。1个CH50和/或APCH50单位定义为在测试中裂解50％的红细胞需要的血清的量或稀释度。典型地，为了评价补体激活，可以将样品例如人血清或人血浆在有或无增加浓度的支架或修饰的蛋白酶的条件下处理，或者在有或无蛋白酶的条件下处理动物或人之后收集样品。所述蛋白酶处理的样品随后可以与已经用IgG激活或致敏的绵羊红细胞混合。仅是水的样品与绵羊红细胞混合可以用作总裂解对照以准确评价被分析的样品的裂解百分比。可以向样品中加入0.15MNaCl以终止裂解反应。由补体途径最终成分激活而诱导的红细胞裂解可以通过测量血红蛋白的释放而评价。可以使用分光光度计在OD415nm读数样品光密度(OD)进行测量。
在一个实施方案中，可以使用限制稀释溶血测定(limiting dilutionhemolytic assay)测量每个途径的特异性成分的功能活性。在这种分析中，使用在样品中具有过量的所有补体成分、但是缺少被测定的一种的血清来源，即培养基或血清来源对于特异的蛋白质是补体耗竭的。溶血程度因此依赖于测试样品中被测量成分的存在。在这种分析中，可以将纯化的补体蛋白如任一种天然补体蛋白包括但非限于C1q、MBL、C2、C3、C4或C5在有或无增加浓度的支架或修饰的蛋白酶的条件下保温。然后将经蛋白酶处理的纯化的补体蛋白与补体耗竭的培养基或血浆及IgG激活的绵羊红细胞混合，如上述评价样品的溶血情况。在另一个实施方案中，通过分析蛋白酶处理的样品的溶血活性，随后在SDS-PAGE凝胶上分析样品及随后用蛋白质染料例如考马斯蓝染色，可以将蛋白酶裂解与补体激活相关联。可以评价用蛋白酶处理的纯化的补体蛋白的裂解，及可以计算在分析中裂解的全长补体成分的百分比及主要降解产物的表观。或者，可以通过Western印迹分析蛋白酶处理的补体蛋白。
除了溶血测定之外，可以使用称作脂质体免疫测定(LIA)的方法评价经典途径的激活。LIA(Waco Chemicals USA，Richmond，Va.)利用二硝基苯基(DNP)-包被的脂质体，其含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。当血清与脂质体及含有抗DNP抗体的底物、葡萄糖-6-磷酸及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸混合时，激活的脂质体裂解，酶生色反应发生，其与总经典途径补体活性成比例。
F.产生编码蛋白酶的核酸的方法及产生蛋白酶多肽的方法
蛋白酶多肽、包括修饰的MT-SP1多肽或其结构域可以通过本领域熟知的蛋白质纯化和重组蛋白质表达方法获得。可以使用本领域技术人员已知的鉴别编码希望的基因的核酸的任何方法。可以使用本领域可利用的任何方法获得全长(即包含全部编码区)cDNA或者编码蛋白酶蛋白质的基因组DNA克隆，如来自细胞或组织。可以如本文所述从支架或野生型蛋白酶中对修饰的蛋白酶工程化，如通过位点定向诱变技术。
可以使用本领域可利用的克隆和分离核酸分子的任何方法克隆或分离蛋白酶。这种方法包括核酸的PCR扩增及文库筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。
可以使用核酸扩增方法分离编码蛋白酶的核酸分子，包括使用例如聚合酶链反应(PCR)方法。含有核酸的材料可用作起始材料，从中可以分离编码蛋白酶的核酸分子。例如，扩增方法中可以使用DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、体液样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病对象的样品。核酸文库也可以用作起始材料的来源。引物可以设计为扩增蛋白酶。例如，引物可以基于从中产生蛋白酶的表达的序列而设计。引物可以基于蛋白酶氨基酸序列的回译(back-translation)而设计。可以对通过扩增产生的核酸分子进行测序，证实其编码蛋白酶。
另外的核苷酸序列可以与编码蛋白酶的核酸分子结合，所述另外的序列包括含有限制性核酸内切酶位点以将合成的基因克隆进载体中的接头序列，所述载体例如是蛋白质表达载体或者设计为扩增编码核心蛋白的DNA序列的载体。另外，可以将代表功能性DNA元件的另外的核苷酸序列与编码蛋白酶的核酸分子可操纵地连接。这种序列的例子包括但非限于设计为促进胞内蛋白质表达的启动子序列及设计为促进蛋白质分泌的分泌序列。另外的核苷酸序列如代表蛋白质结合区的序列也可以与编码蛋白酶的核酸分子连接。这种区域包括但非限于促进蛋白酶由特定靶细胞摄取的序列，或者另外增强合成基因的药动学的序列。
然后可以将经鉴别和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但非限于质粒或修饰的病毒，但是载体系统必须与所用宿主细胞相容。这种载体内包括但非限于噬菌体如λ衍生物，或者质粒如pBR322或pUC质粒衍生物或者Bluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)。插入克隆载体中可以例如通过将DNA片段连接进具有互补粘着端的克隆载体而实现。插入可以使用TOPO克隆载体(INVITROGEN，Carlsbad，CA)实现。如果克隆载体中不存在用于使DNA成为片段的互补限制位点，则可以对DNA分子的末端用酶进行修饰。或者，可以通过将核苷酸序列(接头)与DNA末端连接而产生任何希望的位点；这些连接的接头可含有经特殊化学合成的编码限制性核酸内切酶识别序列的寡核苷酸。在另一种方法中，可以对裂解的载体和蛋白酶蛋白基因通过同聚物加尾进行修饰。重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和超声方法导入宿主细胞中，以产生基因序列的多个拷贝。
在特殊的实施方案中，用掺入分离的蛋白酶蛋白基因、cDNA或合成的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞可以产生这个基因的多个拷贝。因此，该基因可以通过生长转化体、从转化体中分离重组DNA分子及当需要时从分离的重组DNA中重新获得插入的基因而大量获得。
1.载体和细胞
为了重组表达一或多种蛋白酶蛋白质，可以将含有编码所述蛋白酶的全部或部分核苷酸序列的核酸插入合适的表达载体中，即含有转录和翻译插入的蛋白质编码序列必需的元件的载体。必需的转录和翻译信号也可以由蛋白酶基因的天然启动子和/或其侧翼区域提供。
本发明还提供了含有编码所述蛋白酶或修饰的蛋白酶的核酸的载体。本发明也提供了含有所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，所述载体是适于应用其中的任何载体。
本发明提供了含有所述载体的原核细胞和真核细胞，包括内皮细胞。这种细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、Archea、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。所述细胞用于产生蛋白酶或者其修饰的蛋白酶，通过将上述细胞在一定条件下生长，从而编码的蛋白酶蛋白质由该细胞表达，回收所述表达的蛋白酶蛋白质。对于本发明而言，所述蛋白酶可以分泌进培养基中。
在一个实施方案中，提供了含有编码具有蛋白酶活性的多肽及含有全部或部分蛋白酶结构域的核苷酸序列或其多个拷贝的载体。本发明还提供了含有编码蛋白酶结构域及蛋白酶蛋白质的其它部分直至包括全长蛋白酶蛋白质的核苷酸序列以及其多个拷贝的载体。根据支架或修饰的蛋白酶蛋白或者其蛋白酶结构域在细胞中的表达、或者蛋白酶蛋白以分泌的蛋白质表达的情况选择载体。当蛋白酶结构域被表达时，所述核酸与编码分泌信号的核酸连接，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-交配因子信号序列或其一部分，或者天然信号序列。
可以使用各种宿主-载体系统表达蛋白质编码序列。这些系统包括但非限于病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其它病毒)感染的哺乳动物细胞系统；病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母；或者用噬菌体、DNA、质粒DNA或者粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件的强度和特异性不同。根据所用的宿主-载体系统，可以使用任一种合适的转录和翻译元件。
可以使用本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体中的任何方法构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列。这些方法可包括体外重组DNA及合成技术及体内重组技术(遗传重组)。编码支架或修饰的蛋白酶的核酸序列或其结构域、衍生物、片段或同源物的表达可以由第二种核酸序列调节，由此基因或其片段在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子控制。在一个特殊的实施方案中，所述启动子对于蛋白酶蛋白的基因而言不是天然的。可以使用的启动子包括但非限于SV40早期启动子(Bernoist and Chambon，Nature 290：304-310(1981))、包含在Rous肉瘤病毒的3’长末端重复中的启动子(Yamamoto et al.Cell22：787-797(1980))、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wager et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42(1982))；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或者tac启动子(DeBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25(1983))；也见于“Useful Proteins fromRecombinant Bacteria”：in Scientific American 242：79-94(1980))所述；含有胭脂碱合成酶启动子(Herrar-Estrella et al.，Nature 303：209-213(1984))或者花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Garder et al.，Nucleic Acids Res.9：2871(1981))及光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.，Nature 310：115-120(1984))的植物表达载体；来自酵母及其它真菌的启动子元件如Gal4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子，及如下呈现组织特异性并已经用于转基因动物中的动物转录控制区：弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺腺泡细胞中是活性的(Swift et al.，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，Hepatology 7：425-515(1987))；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中是活性的(Hanahan et al.，Nature 315：115-122(1985))；免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴细胞中是活性的(Grosschedl et al.，Cell 38：647-658(1984)；Adams et al.，Nature 318：533-538(1985)；Alexander etal.，Mol.Cell Biol.7：1436-1444(1987))；小鼠乳癌病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中是活性的(Leder et al.，Cell 45：485-495(1986))；白蛋白基因控制区，其在肝中是活性的(Pinckert et al.，Genes and Devel.1：268-276(1987))；甲胎蛋白基因控制区，其在肝中是活性的(Krumlauf et al.，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer et al.，Science 235：53-58 1987))；α-1抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝中是活性的(Kelsey et al.，Genes andDevel.1：161-171(1987))；β球蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中是活性的(Mogram et al.，Nature 315：338-340(1985)；Kollias et al.，Cell 46：89-94(1986))；髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑的少突胶质细胞中是活性的(Readhead et al.，Cell 48：703-712(1987))；肌球蛋白轻链-2基因控制区，其在骨骼肌中是活性的(Sani，Nature 314：283-286(1985))；及促性腺激素释放激素基因控制区，其在下丘脑的促性腺激素细胞中是活性的(Mason et al.，Science 234：1372-1378(1986))。
在一个特殊的实施方案中，使用含有与编码支架或修饰的蛋白酶蛋白质或其结构域、片段、衍生物或同源物的核酸可操纵地连接的启动子，一或多个复制起点及任选一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)的载体。用于表达蛋白酶蛋白的蛋白酶结构域的载体和系统包括熟知的毕赤氏酵母(Pichia)载体(例如可得自Invitrogen，San Diego，CA)，特别是针对编码的蛋白质分泌而设计的那些载体。用于转化大肠杆菌细胞的质粒载体的例子包括例如pQE表达载体(得自Qiagen，Valencia，CA；也见于Qiagen描述该系统的出版文献所述)。pQE载体具有噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)及一个双重lac操纵基因阻抑模块以提供重组蛋白在大肠杆菌中紧密调节的高水平表达，合成的核糖体结合位点(RBS II)以有效翻译，6×His标记编码序列，t0和T1转录终止子，ColE1复制起点，β内酰胺酶基因以赋予氨苄青霉素抗性。pQE载体使得可以在重组蛋白质的N末端或C末端放置一个6xHis标记。这种质粒包括pQE 32(SEQ ID NO：345)、pQE 30和pQE 31，其为所有三个读框提供了多克隆位点及提供了N末端6xHis-标记蛋白的表达。用于转化大肠杆菌细胞的质粒载体的其它例子包括例如pET表达载体(见美国专利4,952,496所述；可得自NOVAGEN，Madison，WI；也见于Novagen描述该系统的出版文献所述)。这种质粒包括pET 11a，其含有T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操纵基因、及lac阻抑基因；pET 12a-c，其含有T7启动子、T7终止子及大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b和pET19b (NOVAGEN，Madison，WI)，其含有用于使用His柱纯化的His-TagTM前导序列以及允许在经所述柱纯化后裂解的凝血酶裂解位点，T7-lac启动子区域和T7终止子。
2.表达
修饰的蛋白酶可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，包括体内和体外方法。修饰的蛋白酶可以在适于产生需要量和形式的施用和治疗所需的修饰的蛋白酶的任何生物体中表达。表达宿主包括原核生物和真核生物，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞包括人细胞系及转基因动物。表达宿主在其蛋白质产生水平以及在表达的蛋白质上呈现的翻译后修饰的类型方面可有所不同。表达宿主的选择可以基于这些及其它因素，如管理和安全考虑、生产成本及需求以及纯化方法等。
本领域技术人员可利用及已知许多表达载体，这些载体可用于表达修饰的蛋白酶。表达载体的选择受宿主表达系统的选择的影响。通常地，表达载体可包括转录启动子及任选增强子、翻译信号，及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体典型具有可选择的标记，可以选择及维持转化的细胞。在一些情况中，可以使用复制起点扩增载体的拷贝数。
修饰的蛋白酶也可以用作或表达为融合蛋白。例如，可以产生蛋白酶融合体以为蛋白酶加入额外的功能。蛋白酶融合蛋白的例子包括但非限于信号序列、标记如定位标记例如his6标记或myc标记或者纯化标记及指导蛋白酶分泌和/或膜结合的序列的融合体，例如GST融合蛋白。
在一个实施方案中，所述蛋白酶可以活性形式表达。在另一个实施方案中，所述蛋白酶以无活性的酶原形式表达。
a.原核生物
原核生物、尤其是大肠杆菌提供了产生大量蛋白质如蛋白酶或修饰的蛋白酶的系统。大肠杆菌转化是本领域技术人员熟知的一种简便和快速的技术。大肠杆菌的表达载体可含有可诱导的启动子，这种启动子用于诱导高水平的蛋白质表达及用于表达对宿主细胞有一些毒性的蛋白质。可诱导的启动子的例子包括lac启动子、trp启动子、杂种tac启动子、T7和SP6 RNA启动子及温度调节的λPL启动子。
修饰的蛋白酶可以在大肠杆菌的胞质环境中表达。胞质是还原环境，而且对于一些分子而言这可导致不可溶包涵体的形成。还原剂如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇及变性剂如盐酸胍和脲可用于再增溶蛋白质。另一种方法是修饰的蛋白酶在细菌的周质空间中表达，这个空间提供了氧化环境、陪伴蛋白样(chaperonin-like)及二硫键异构酶，可以引起可溶蛋白质的产生。典型地，将前导序列与被表达的蛋白质融合可引导蛋白质至周质。然后通过周质内部的信号肽酶除去该前导序列。靶向周质的前导序列的例子包括来自果胶酸裂合酶基因的pelB前导序列及衍生自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况中，周质表达使得表达的蛋白质渗入培养基中。蛋白质的分泌使得可以从培养上清中快速及简便地纯化。非分泌的蛋白质可以通过渗透性裂解从周质中获得。与胞质表达相似，在一些情况中蛋白质可成为不可溶的，可以使用变性剂和还原剂以促进溶解和再折叠。诱导和生长温度可影响表达水平和溶解性，典型使用在25℃-37℃之间的温度。典型地，细菌产生无糖基化的蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化以发挥其功能，可以在从宿主细胞中纯化后在体外进行糖基化。
b.酵母
酵母如酿酒酵母、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Yarrowia lipolytica、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)是熟知的酵母表达宿主，可用于产生修饰的蛋白酶。酵母可以用附加型复制载体转化或者通过同源重组进行稳定染色体整合而转化。典型地，可诱导的启动子用于调节基因表达。这种启动子的例子包括GAL1、GAL7和GAL5及金属硫蛋白启动子，如CUP1、AOX1或其它毕赤氏酵母或其它酵母启动子。表达载体通常包括一个可选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3以选择和维持转化的DNA。在酵母中表达的蛋白质通常是可溶的。与陪伴蛋白如Bip及蛋白质二硫键异构酶的共表达可改善表达水平和溶解性。另外，可以使用分泌信号肽融合体融合体指导在酵母中表达的蛋白质分泌，如来自酿酒酵母的酵母交配型α因子分泌信号，及与酵母细胞表面蛋白如Aga2p交配粘附受体或者Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合体。蛋白酶裂解位点如Kex-2蛋白酶可以被工程化为在表达的多肽退出分泌途径时从其中除去融合序列。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。
c.昆虫细胞
昆虫细胞、特别是使用杆状病毒表达，用于表达多肽如修饰的蛋白酶。昆虫细胞表达高水平的蛋白质，大多数翻译后修饰能为高等真核生物所利用。杆状病毒具有有限的宿主范围，其改善了真核细胞表达的安全性及降低了管理限制。典型的表达载体使用启动子以高水平表达，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)核型多角体病病毒(AcNPV)，家蚕(Bombyx mori)核型多角体病病毒(BmNPV)及昆虫细胞系如衍生自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和君主斑蝶(Danausplexippus)(DpN1)的Sf9。为高水平表达，将被表达的分子的核苷酸序列与病毒的多角体蛋白起始密码子的立即下游融合。在昆虫细胞中精确加工哺乳动物分泌信号，可用于将表达的蛋白质分泌进培养基中。另外，细胞系一星粘虫(A7S)和君主斑蝶(DpN1)产生与哺乳动物细胞系统相似的具有糖基化模式的蛋白质。
昆虫细胞中另一表达系统是使用稳定转化的细胞。细胞系如Schnieder 2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))及C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))可用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子可用于在存在重金属用镉或铜诱导的条件下诱导高水平的表达。表达载体典型通过使用可选择的标记如新霉素和潮霉素加以维持。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可用于表达修饰的蛋白酶。表达构建体可以通过如下方式转移至哺乳动物细胞中：通过病毒感染如腺病毒或者通过直接DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖及通过物理方式如电穿孔和显微注射。哺乳动物细胞的表达载体典型包括一个mRNA帽位点、一个TATA框、一个翻译起始序列(Kozak共有序列)及聚腺苷酸化元件。这种载体通常包括转录启动子-增强子以高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子及Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多类型的细胞中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区域也可用于表达。启动子/增强子区域的例子包括但非限于来自基因如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳癌病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α-1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2及促性腺激素释放激素基因控制区的那些。可选择的标记可用于选择和维持具有表达构建体的细胞。可选择的标记基因的例子包括但非限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶。与细胞表面信号分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可指导蛋白质以活性状态在细胞表面上表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。所述细胞系的例子包括但非限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌的)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤细胞系和异种杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8及HKB细胞。细胞系也可以用于适应无血清培养基，其有利于分泌的蛋白质从细胞培养基中纯化。一种这样的实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham etal.，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42.)。
e.植物
转基因植物细胞和植物可以表达修饰的蛋白酶。使用直接DNA转移如显微注射轰击和PEG介导的转移进原生质体中及通过农杆菌介导的转化将表达构建体典型地转移至植物中。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术在双子叶宿主如拟南芥属(Arabidopsis)和烟草与在单子叶宿主如玉米和水稻之间通常是有分歧的。用于表达的植物启动子的例子包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子及遍在蛋白和UBQ3启动子。可选择的标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进转化的细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以在培养物中维持作为细胞、聚集体(愈伤组织)或者再生为完整植物。转基因植物细胞也可包括工程化为产生蛋白酶或修饰的蛋白酶的藻类(见例如Mayfield et al.(2003)PNAS100：438-442)。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，因此这可以影响在这些宿主中产生的蛋白酶或修饰的蛋白酶的选择。
3.纯化技术
从宿主细胞中纯化蛋白酶多肽的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质通常是在除去细胞之后从培养基中纯化。对于胞内表达，可以将细胞裂解及从其提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可用作起始材料制备裂解细胞提取物。另外，转基因动物生产可包括在可以收集的乳汁和卵中生产多肽，如果需要则可以使用本领域的标准方法提取蛋白质及进一步纯化。
所述蛋白酶可以无活性形式(酶原)表达和纯化，或者表达的蛋白酶可以通过自身催化除去前区而纯化为活性形式。典型地，所述自身活化在纯化过程例如在室温保温24-72小时期间发生。活化的速度和程度依赖于蛋白质浓度和特异修饰的蛋白酶，由此例如更加稀释的样品可需要在室温保温更长一段时间。活化可以通过SDS-PAGE(3千道尔顿迁移)和通过酶活性(荧光底物的裂解)监测。典型地，蛋白酶在纯化之前可达到＞75％活化。
可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化蛋白酶，所述技术包括但非限于SDS-PAGE、大小分级和大小排阻层析、硫酸铵沉淀和离子交换层析如阴离子交换层析。也可以利用亲和性纯化技术改善制品的效力和纯度。例如，结合蛋白酶的抗体、受体及其它分子可用于亲和性纯化中。表达构建体也可以被工程化为给蛋白质加入亲和性标记例如myc表位、GST融合体或His6，亲和性分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂纯化。可以通过本领域已知的任何方法包括凝胶电泳和染色及分光光度分析技术评价纯度。
4.融合蛋白酶
本发明还提供了含有蛋白酶及一或多种其它多肽的融合蛋白。本发明提供了配制为通过合适途径给予的含有这种融合蛋白的药物组合物。融合蛋白是通过以任何顺序连接支架或修饰的蛋白酶与另一种多肽如抗体或其片段、生长因子、受体、配体及其它这种用于促进蛋白酶的纯化、通过将所述蛋白酶指向靶细胞或组织而改变蛋白酶的药物动力学性质、和/或增加蛋白酶的表达或分泌的物质而形成的。在蛋白酶融合蛋白中，所述蛋白酶多肽可相应于野生型或支架蛋白酶蛋白的全部或其催化活性部分。在一些实施方案中，所述蛋白酶或其催化活性部分是修饰的蛋白酶。本发明提供的融合蛋白基本保留其对于任一或多种补体蛋白的所有特异性和/或选择性。通常地，蛋白酶融合多肽与非融合蛋白酶相比保留至少大约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的底物特异性和/或选择性，包括与非融合蛋白酶相比包括96％、97％、98％、99％或更高的底物特异性。
蛋白酶多肽与另一种多肽的连接可以直接或者通过接头间接连接。在一个实例中，连接可以是通过化学连接，例如通过异(基)双功能试剂或者硫醇键或者其它这种键。蛋白酶与另一种多肽的融合可以在蛋白酶多肽的N或C末端。可用于与本发明提供的蛋白酶形成融合蛋白的多肽的非限制性例子包括例如GST(谷胱甘肽S转移酶)多肽、免疫球蛋白G的Fc结构域或者异源信号序列。所述融合蛋白可含有额外的成分，例如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)，其有助于细胞对蛋白质的摄取(见国际PCT申请No.WO01/32711)。
蛋白酶融合蛋白可以通过标准重组技术产生。例如利用常规技术可以将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起，例如通过应用平端或交错末端进行连接，进行限制酶消化以提供合适的末端，充填合适的粘性末端，经碱性磷酸酶处理以避免不希望的结合，利用酶进行连接。在另一个实施方案中，融合体基因可以通过常规技术包括自动DNA合成仪合成。或者，可以使用锚引物对基因片段进行PCR扩增，所述锚引物使得在两个连续的基因片段之间形成互补突出端，其随后经退火和再扩增产生嵌合基因序列(见例如Ausubel et al.(eds.)CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，1992)。另外，可以商购许多编码融合体部分(例如GST多肽)的表达载体。编码蛋白酶的核酸可以克隆进这种表达载体中，由此所述融合部分与所述蛋白酶蛋白符合读框地连接。
5.核苷酸序列
本发明提供了编码支架或修饰的蛋白酶的核酸分子。核酸分子包括任何编码的支架蛋白酶或其催化活性部分的等位基因变体或剪接变体。在一个实施方案中，本发明提供的核酸分子与编码支架蛋白酶或其催化活性部分的任何核酸全长具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95或99％序列相同性或者在中等或高度严格条件下与所述全长核酸的至少70％杂交。在另一个实施方案中，核酸分子可包括具有任何支架蛋白酶或其催化活性部分的简并密码子序列的那些核酸分子，如本文提供的。编码支架或修饰的蛋白酶或其催化活性部分的核酸分子的例子具有如下所示核苷酸序列：SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、451-523及534-543。
本发明还提供了与启动子可操纵地连接的核酸分子，或者含有核酸分子的催化活性部分的融合蛋白，所述启动子例如是为了在哺乳动物细胞中表达的可诱导的启动子。这种启动子包括但非限于CMV和SV40启动子；腺病毒启动子如E2基因启动子，其应答HPV E7癌蛋白质；PV启动子如PBV p89启动子，其应答PV E2蛋白；及由HIV或PV或癌基因激活的其它启动子。
本发明提供的支架或修饰的蛋白酶也可以在基因转移载体中输送至细胞。所述转移载体也可编码治疗疾病或病变的其它治疗剂，如给予所述蛋白酶的类风湿性关节炎或心血管疾病。编码蛋白酶的转移载体可以通过给予对象所述核酸而全身性应用。例如，转移载体可以是病毒载体，如腺病毒载体。编码蛋白酶的载体也可以掺入干细胞中，将这种干细胞通过在治疗部位移植或嫁接而给予对象。例如，间充质干细胞(MSC)可以被工程化为表达蛋白酶，将这种MSC嫁接在用于治疗的肿瘤部位。
G.使用方法：配制/包装/给药
本发明药物组合物含有蛋白酶或修饰的蛋白酶，包括MT-SP1(修饰的)多肽、修饰的蛋白酶融合蛋白或编码核酸分子，其可以通过任何常规方式配制，通过将选择量的多肽与一或多种生理学可接受的载体或赋形剂混合而制备。载体或赋形剂的选择为本领域技术人员所熟知，可以根据许多参数加以选择。这些包括例如给药模式(即全身性给药、口服、经鼻、肺、局部、病位或任何其它模式)及所治疗的疾病。本发明提供的药物组合物可以配制为单剂量(直接)给予或者进行稀释或其它修饰。配方中化合物的浓度是有效给予量，即给予时其对于指定治疗是有效的。典型地，所述组合物以单剂量给予形式配制。为了配制组合物，将化合物或其混合物的重量级分以有效浓度溶解、悬浮、分散或另外混合于选择的运载体中，由此减轻或改善所治疗的疾病。适于给予本发明提供的化合物的药物学载体或运载体包括本领域技术人员已知适于特定给药模式的的任何这种载体。
1.修饰的蛋白酶多肽的给予
所述多肽在所述引物组合物中可以配制为唯一的药物学活性成分，或者可以组合其它活性成分。所述多肽可通过与靶向剂如抗体缀合而靶向输送。包括靶向组织的脂质体的脂质体悬浮液也可适于作为药物学可接受的载体。根据本领域技术人员已知的方法制备这些。例如，脂质体配制品可以如美国专利No.4,522,811所述制备。脂质体输送也可以包括缓释配制品，包括药物学基质如纤连蛋白修饰的胶原凝胶和脂质体(见例如Weiner et al.(1985)J Pharm Sci.74(9)：922-5)。
所述活性化合物以对治疗对象足以发挥有效的治疗作用而无不希望的副作用的量包含在药物学可接受的载体中。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统如本发明提供的分析中检测所述化合物而根据经验加以确定。
本发明提供的多肽(即活性化合物)可以在体外、离体或在体内给予，通过将混合物如体液或其它组织样品与本发明提供的蛋白酶多肽包括任何修饰的MT-SP1蛋白酶接触。例如，当离体给予化合物时，可以将对象的体液或组织样品与包被在试管和滤膜例如旁路分流术装置的管或滤膜上的蛋白酶多肽接触。当在体内给予时，活性化合物可以通过任何合适途径例如经口、鼻、肺、肠道外、静脉内、皮内、皮下或局部途径以液体、半液体或固体形式给予，以适于每种给予途径的方式配制。
所述修饰的蛋白酶及生理学可接受的盐和溶剂合物可以配制为通过吸入(通过口或鼻)、口服、经皮肤、肺、肠道外或直肠途径给药的形式。对于经吸入给药，所述修饰的蛋白酶可以气雾剂形式利用合适的推进器从压缩包装或喷雾器中输送，所述压缩气体例如是二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或者其它合适气体。在加压气雾剂情况中，剂量单位可以通过阀控制以定量给予。用于吸入器或吹药器中的凝胶胶囊和cartridges可以配制为治疗化合物与合适粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
对于肺部给药，所述修饰的蛋白酶可以利用合适的推进剂以气雾剂形式从喷雾器、turbonebulizer或者微处理器控制的计量经口吸入器中输送。通常地，气雾剂的粒子大小较小，如在0.5-5微米范围。在以肺部给药而配制的药物组合物中，不一定使用洗涤剂表面活性剂。肺部给药输送是一种有前景的非侵入性全身性给药方法。肺部表现为是一种对于药物输送有吸引力的途径，主要是由于其具有较大的吸收表面积、薄肺泡上皮、广泛血管化、无首次经肝脏代谢过程及相对缓慢的代谢活性。
对于口服给药，所述药物组合物可以是例如片剂、丸剂、液体悬浮液或者胶囊，通过常规方法与药物学可接受的赋形剂一起配制，所述赋形剂例如是结合剂(例如预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或者羟丙基甲基纤维素)、充填剂(例如乳糖、微晶纤维素或者磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)、分解质(例如马铃薯淀粉或者羟乙酸淀粉钠)、或者增湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法对药片进行包被。经口服给药的液体制品可以采取例如溶液、糖浆或悬浮液形式，或者可以是干品及在使用之前与水或其它合适的运载体建立(constituion)的形式。这种液体制品可以通过常规方式与药物学可接受的添加剂一起制备，所述添加剂例如是悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或者氢化食用油脂)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水溶液运载体(例如杏仁油、油脂、乙醇或分馏的植物油)及防腐剂(例如甲基或丙基-p-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。所述制品也可以适当地含有缓冲盐、调味剂、色素和甜味剂。
口服给药制品可以配制为活性化合物控制释放的形式。对于经口腔给药途径，所述组合物可以采取常规方式的片剂或锭剂形式。
所述修饰的蛋白酶多肽可以配制为贮存库(depot)制品形式。这种长效配制品可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或肌内注射方式给予。因此，例如所述治疗化合物可以与合适的聚合物或疏水性材料(例如形成于可接受的油中的乳状液)或者离子交换树脂一起配制，或者配制为略微溶解的衍生物例如略微溶解的盐形式。
所述修饰的蛋白酶可以配制为通过注射(例如通过推注或持续输注)以肠道外给药形式。供注射的配制品可以具有添加的防腐剂的单位剂量形式存在(例如于安瓿中或者于多剂量容器中)。所述组合物可采取于油相或水相运载体中的悬浮液、溶液或乳状液形式，可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述活性成分可以是冻干的粉末形式，在使用之前与合适的运载体例如无菌无热原水建立。
所述药物组合物可以配制为以凝胶、乳液和洗剂形式用于局部应用如局部应用于皮肤(经皮)和粘膜如眼中，及应用于眼或用于池内(intracisternal)或脊柱内应用。这种溶液、特别是眼部应用的溶液，可以配制成具有适当盐的0.01％-10％的等渗溶液，pH为大约5-7。所述化合物可以配制成气雾剂以局部应用例如通过吸入(见例如美国专利Nos.4,044,126、4,414,209和4,364,923所述，其描述了输送类固醇用于治疗炎症疾病特别是哮喘的气雾剂)。
药物组合物中的活性化合物的浓度依赖于所述活性化合物的吸收、失活和排泄速度、给药时间表及给予量以及本领域技术人员已知的其它因素。如本文进一步阐述，通过对比修饰的蛋白酶与未修饰的和/或天然蛋白酶的性质和活性(例如对一或多种补体蛋白的裂解)可以根据经验确定给药剂量。
如果需要，所述组合物可以存在于可含有活性成分的一或多种单位剂量形式的包装、试剂盒或分散装置中。在一些实例中，所述组合物可以包被在设备上，例如旁路装置的管或滤膜上。所述包装例如含有金属或塑料箔，例如泡状包装(blister pack)。所述包装或分散装置可附有给药说明书。含有所述活性剂的组合物可以包装为这样的物品，其含有包装材料、本发明提供的物质及标示该物质适应症的标签。
本发明还提供了适于基因治疗的编码所述蛋白酶多肽的核酸分子及编码其的表达载体的组合物。与输送蛋白质不同，核酸可以在体内例如全身性给予，或者通过其它途径或者离体给予，例如通过除去细胞包括淋巴细胞、向其中导入核酸及再导入进宿主或相容受体中。
2.编码修饰的蛋白酶多肽的核酸的给予(基因治疗)
蛋白酶多肽可以通过核酸分子的表达而输送至细胞和组织。蛋白酶多肽可以作为编码蛋白酶多肽的核酸分子给予，包括离体技术和直接在体内表达而给予。可以通过本领域技术人员已知的任何方法将核酸输送至细胞和组织。分离的核酸可以掺入载体中以进一步操纵。核酸的例子是编码或者在中等或高度严格条件下与编码支架或修饰的蛋白酶或其具有如下任一氨基酸序列的催化活性部分的核酸杂交的任何核酸：SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659或者663-710。编码支架或修饰的蛋白酶或其催化活性部分的核酸分子的例子具有如下所示任一核苷酸序列：SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、451-523及534-543。
通过编码核酸分子的表达给予蛋白酶多肽的方法包括给予重组载体。所述载体可以设计为例如通过包含复制起点而保留附加体，或者可是设计为整合进细胞染色体中。蛋白酶多肽也可以用于使用载体进行的离体基因表达治疗。例如，细胞可以被工程化为表达蛋白酶多肽，由此通过将编码蛋白酶多肽的核酸整合进基因组位置中，与调节序列可操纵地连接或者置于与基因组位置中的调节序列可操纵地连接。这种细胞可以局部或全身性给予对象，例如给予需要治疗的患者。进行体内和离体基因治疗的载体的例子包括病毒载体，及非病毒载体如脂质体或人工染色体。
可以应用病毒载体，包括例如腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒EBV、SV40、巨细胞病毒载体、痘苗病毒载体，及为基因治疗设计的其它载体。所述载体可保留附加体，或者可以整合进治疗对象的染色体中。蛋白酶多肽可以由给予需要治疗的对象的病毒表达。适于基因治疗的病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、慢病毒及上述其它病毒。例如，腺病毒表达技术为本领域所熟知，腺病毒的产生及给予方法也为本领域所熟知。腺病毒血清型可例如得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。腺病毒可以离体应用，例如从需要治疗的患者体内分离细胞，及用表达蛋白酶多肽的腺病毒载体转导。在经过适当时期的培养之后，将转导的细胞经局部和/或全身性给予对象。或者，分离表达蛋白酶多肽的腺病毒颗粒，于药物可接受的载体中配制以治疗有效量地给予对象以预防、治疗或减轻所述对象所患疾病或病变。在一个实施方案中，被治疗的疾病是由于补体激活引起的。典型地，腺病毒颗粒以1-1014个颗粒/kg体重的剂量输送，通常为106或108至1012个颗粒/kg体重。
所述核酸分子可以导入人工染色体及其它非病毒载体中。人工染色体如ACES(见Lindenbaum et al.Nucleic Acids Res.2004 Dec 7；32(21)：e172)可以被工程化为编码和表达所述蛋白酶或修饰的蛋白酶。简而言之，哺乳动物人工染色体(MAC)提供了一种将大量有效荷载的遗传信息以自主复制、非整合形式导入细胞中的方式。在MAC中独特的基于哺乳动物卫星DNA的人工染色体表达系统(ACES)可以在不同物种的细胞系中可再生地重新产生及易于从宿主细胞的染色体中纯化。然后纯化的哺乳动物ACE可以被再次导入多种受体细胞系中，在此其已经在无选择压力的条件下使用ACE系统被稳定保持一定时间。使用这种方法，在LMTK(-)和CHO细胞中已经实现一或两个基因靶的特异性荷载。
另一种导入编码修饰的蛋白酶多肽的核酸的方法是在酵母中进行的两步基因置换技术，使用克隆进酵母人工染色体(YAC)的完整腺病毒基因组(Ad2；Ketner et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6186-6190)和含有靶向YAC克隆中的特异区域的腺病毒序列、感兴趣基因的表达盒及阳性和阴性可选择标记的质粒开始。YAC是特别感兴趣的，因为它们允许掺入较大的基因。这种方法可用于构建携带编码任何所述修饰的蛋白酶多肽的核酸的基于腺病毒的载体，以将基因转移进哺乳动物细胞或完整的动物中。
所述核酸可以包囊于运载体如脂质体中，或者导入细胞如细菌细胞、特别是弱化的细菌或者导入病毒载体中。例如，当应用脂质体时，结合与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段、在循环中内在化的蛋白质抗体及靶向胞内定位及增强胞内半衰期的蛋白质。
在一些情况中，需要提供具有靶向细胞的物质如特异于细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体或靶细胞上受体的配体的物质的核酸来源。本发明提供的多核苷酸和表达载体可以通过任何合适的方法产生。本发明进一步提供了含有上述核酸分子的核酸载体。本发明进一步提供了含有上述核酸分子的核酸载体及含有这些载体的细胞。
对于离体和体内方法，将编码蛋白酶多肽的核酸分子导入来自合适供体或治疗对象的细胞中。其中可导入核酸以进行治疗的细胞包括例如适于所治疗的疾病或病变的任何希望的、可利用的细胞类型，包括但非限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如得自骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏、及其它来源的干细胞。
对于离体治疗，移除来自与治疗对象相容的供体的细胞或者治疗对象的细胞，将所述核酸导入这些分离的细胞中，将所述修饰的细胞给予所述对象。治疗包括直接给予例如于有孔膜内包囊化，其可植入患者体内(见例如美国专利Nos.4,892,538和5,283,187)。适于将核酸在体外转移进哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体和阳离子脂质(例如DOTMA、DOPE及DC-Chol)电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、及磷酸钙沉淀方法。DNA输送方法可用于在体内表达蛋白酶多肽。这种方法包括核酸的脂质体输送及裸DNA输送，包括局部或全身性输送，例如使用电穿孔、超声及磷酸钙输送方法。其它技术包括显微注射、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移和原生质球融合。
蛋白酶多肽的体内表达可以与其它分子的表达联合。例如，蛋白酶多肽的表达可以与胞毒性产物的表达联合，例如在工程化的病毒或者在胞毒性病毒中表达。这种病毒可靶向于是治疗效应靶位的特定细胞类型。表达的蛋白酶多肽可用于增强所述病毒的胞毒性。
蛋白酶多肽的体内表达可包括编码蛋白酶多肽的核酸分子与特异的调节序列如细胞特异性或组织特异性启动子可操纵地连接。蛋白酶多肽也可以从载体中表达，所述载体特异性感染靶细胞类型和/或组织和/或在其中复制。可诱导的启动子可用于选择性调节蛋白酶多肽表达。
核酸分子，如裸核酸或者于载体、人工染色体、脂质体及其它运载体中的核酸分子可以通过全身性、局部及其它给予途径给予所述对象。当全身性和体内给予时，所述核酸分子或含有所述核酸分子的运载体可以靶向于细胞。
给予也可以是直接给予，例如典型靶向细胞或组织的载体或细胞。例如，肿瘤细胞和增殖的细胞可以是蛋白酶多肽体内表达的靶细胞。用于蛋白酶多肽的体内表达的细胞也可包括患者的自体细胞。这种细胞可以从患者获得，导入表达蛋白酶多肽的核酸，然后通过例如注射或移植给予患者。
H.治疗应用
治疗性蛋白酶较传统的治疗方法具有许多潜在的优势。最主要的优势是其以催化方式失活疾病靶位(即一至多个化学计量)。另外的分化优势包括(1)不可逆的失活，(2)低给药剂量，(3)小分子大小，(4)靶向翻译后修饰的能力，(5)中和高靶浓度的能力及(6)靶向远离活性位点的能力。作为治疗剂，蛋白酶必须表现如下特性：(1)进入分子靶位(胞外)，(2)具有对于疾病关键的靶位足够严格的特异性。本发明提供的蛋白酶多肽可用于疾病治疗。
本发明的蛋白酶多肽和核酸分子可用于治疗补体途径活化参与的任何病变，特别是炎症病变包括急性炎症病变如感染性休克，及慢性炎症病变如类风湿性关节炎(RA)。急性炎症可以被证明是免疫介导的疾病，例如免疫复合物介导的炎症引起的自身免疫疾病或组织损伤。补体介导的炎症病变也可以被证明是具有炎症成分的神经变性疾病或心血管疾病。这个章节提供了蛋白酶的应用方法和给予方法的例子。这些描述的治疗方法是蛋白酶使用方法的例子，非限制其应用范围。这种方法包括但非限于治疗下文描述和列出的生理学状况和临床病变。这种方法包括但非限于治疗脓毒症、类风湿性关节炎(RA)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、红斑狼疮、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、哮喘、炎症性肠病、呼吸窘迫综合症、免疫复合物(IC)-介导的急性炎症性组织损伤、多器官衰竭、阿尔茨海默病(AD)、缺血-再灌注损伤和Guillan-Barre综合征，缺血-再灌注损伤可以是选自如下的事件或治疗所引起的：心肌梗塞(MI)、中风、心肺转流术(CPB)或冠状动脉旁路搭桥术、血管成形术或者血液透析。
使用蛋白酶对疾病或病变的治疗可以通过任何合适的给予途径、使用如本文所述合适的配制品而实现，包括但非限于通过皮下注射、口服或经皮肤给药。如果需要，可以根据经验确定或推断特定的给药剂量和持续时间及治疗方案。例如，重组和天然蛋白酶多肽的示例剂量可用作起始点以确定合适的剂量。较野生型或支架蛋白酶更具特异性和/或选择性的修饰的蛋白酶可以在降低的剂量或频率是有效的。剂量水平可以基于多种因素而决定，例如个体体重、一般健康状况、年龄、应用的特异性化合物的活性、性别、饮食、给予时间、排泄速度、药物组合、疾病的严重性和进程，及患者疾病的倾向和主治医生的判断。可以与载体材料组合产生单剂量形式的活性成分的量根据治疗宿主和给予的特定模式而有所不同。
基于患者病变的改善，如果需要，可以给予维持量的化合物或组合物；对给予剂量、剂量形式或给予频率或其组合可以加以修改。在一些情况中，基于疾病症状的复发，对象可需要长期的间歇治疗。
1.免疫介导的炎症疾病
本发明所述的蛋白酶及修饰的蛋白酶包括但非限于修饰的MT-SP1蛋白酶，可用于治疗炎症疾病。可以用蛋白酶治疗的炎症疾病包括急性和慢性炎症疾病。炎症疾病的例子包括中枢神经系统疾病(CNS)、自身免疫疾病、呼吸道超反应性病变如哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病及免疫复合物(IC)介导的急性炎症性组织损伤。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)可作为多发性硬化(MS)的模型(Piddlesden et al.，(1994)J Immunol 152：5477)。EAE可以在许多遗传易感的物种中通过用髓磷脂和髓磷脂成分如髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白及髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)免疫而诱导。例如，MOG诱导的EAE重演了人MS的基本特点，包括慢性、复发性临床疾病过程，炎症的病理组织学三联征、反应性神经胶质增生，及大的汇合脱髓鞘斑形成。蛋白酶及修饰的蛋白酶可以在EAE动物模型中评价。通过例如每日腹膜内注射给予蛋白酶，监测疾病进程和症状进展，与对照动物对比。也可以测量可使疾病恶化的炎症性补体成分的水平，通过在溶血测定中分析血清补体活性及分析补体成分例如C1、C3和C9的沉积进行测量。
补体激活调节如类风湿性关节炎(RA)等疾病中的炎症((Wang et al.，(1995)PNAS 92：8955)。蛋白酶及修饰的蛋白酶包括修饰的MT-SP1多肽可用于治疗RA。例如，可以局部或全身性注射蛋白酶。蛋白酶可以每日或每周给予。PEG化的蛋白酶可以用于降低免疫原性。在一个实施例中，可以在小鼠中诱导II型胶原诱导的关节炎(CIA)作为自身免疫炎症性关节疾病的模型，该模型与RA在组织学方面相似，特征在于炎症性滑膜炎、血管翳形成及软骨和骨侵蚀。为了诱导CIA，可以在存在完全Freund’s佐剂下在尾根部皮内注射牛II型胶原(B-CII)。21天后，使用相同方案对小鼠再次免疫。为了检验蛋白酶或修饰的蛋白酶包括MT-SP1多肽的作用，在开始用B-CII攻击3周后，每周两次经腹膜内给予蛋白酶或对照物，共3周。在开始免疫接种后7周处死小鼠，进行组织学分析。为了评价蛋白酶对于确定的疾病的治疗作用，可以在一或多个肢体出现临床关节炎症状之后每日给予蛋白酶，共10天。最初受影响的关节的肿胀程度可以通过使用测径器测量脚掌厚度进行监测。在这两个模型中，可以从小鼠抽取血清进行溶血测定，及测量补体激活标记例如C5a和C5b-9。在另一个实例中，可利用灵长类动物模型进行RA治疗。可以监测用蛋白酶多肽和对照物处理的对象中触痛和肿胀关节的应答，以评价蛋白酶治疗效果。
蛋白酶或修饰的蛋白酶包括但非限于MT-SP1多肽可用于治疗免疫复合物(IC)介导的急性炎症性组织损伤。IC介导的损伤是由于针对组织中IC沉积引起的局部炎症应答所致。继发的炎症应答特征在于水肿、neutrophila、出血及最终的组织坏死。IC介导的组织损伤可以在体内Arthus(RPA)反应中进行研究。简而言之，在RPA反应中，将过量的抗体(例如兔抗IgG抗鸡卵白蛋白)注射进预先通过静脉内注入相应抗原(即鸡卵白蛋白)的动物例如大鼠或豚鼠的皮肤中(Szalai et al.，(2000)J Immunol 164：463)。在马上开始RPA反应之前，可以在经右侧股静脉静脉内注射相应抗原的同时给予蛋白酶或推注对照物。或者，可以在RPA反应初始期间给予蛋白酶，在注射抗原之后及就在经皮肤注射抗体之前立即开始。蛋白酶对于产生补体依赖性IC介导的组织损伤的作用可以在开始RPA之后的不同时间评价，通过收集血液以确定血清溶血活性及通过收集感染部位皮肤量化损伤大小而评价。
治疗性蛋白酶如本文描述的那些蛋白酶包括MT-SP1多肽，可用于治疗脓毒症及可导致致命性休克的严重脓毒症。补体介导的致命性休克的模型可用于测试蛋白酶作为治疗剂的效果。在一个这样的实例中，可以用微量的脂多糖(LPS)致敏大鼠，随后给予补体膜抑制剂的单克隆抗体(抗-Crry)(Mizuno M et al.，(2002)Int Arch Allergy Immunol 127：55)。蛋白酶或对照物可以在开始致命性休克期间的任何时间给予，例如在LPS致敏之前、在LPS致敏之后，或者在给予抗Crry后给予，评价大鼠从致命性休克中的拯救情况。
2.神经变性疾病
补体激活使阿尔茨海默病(AD)的进展恶化并且造成AD脑中神经突丧失。本文描述的蛋白酶及修饰的蛋白酶包括但非限于修饰的MT-SP1多肽可用于治疗AD。模拟AD的一些神经病理学和行为特征的小鼠模型可用于评价蛋白酶的治疗作用。转基因小鼠模型的例子包括将具有产生疾病的突变的人淀粉样前体蛋白(APP)或者早老素1(presenilin 1，PS1)蛋白在强启动子的控制下导入小鼠中。这些小鼠发生AD的特征，包括β淀粉样斑块和营养不良的神经突增加。用APP和PS1突变蛋白双重转基因小鼠产生更大量的纤维状β淀粉样斑块，并示出与所述斑块相关的激活的神经胶质和补体因子。蛋白酶可以例如每日经腹膜内或静脉内注射给予，监测疾病进程和症状进展，与对照动物进行对比。
3.心血管疾病
本文描述的蛋白酶及修饰的蛋白酶包括但非限于修饰的MT-SP1蛋白酶可用于治疗心血管疾病。可以使用蛋白酶治疗的心血管疾病包括得自中风、心肌梗塞、心肺旁路分流术、冠状动脉旁路搭桥术、血管成形术或血液透析的缺血-再灌注损伤。蛋白酶也可以用于治疗可造成组织损伤的与心肺旁路分流术相关的炎症反应。通常地，蛋白酶可以在诱导补体介导的缺血再灌注损伤的治疗之前、同时或随后给予。在一个实例中，蛋白酶可以在通过补体介导的缺血-再灌注损伤诱导事件例如血管成形术的冠状动脉旁路搭桥术治疗对象之前给予对象。
蛋白酶对于治疗缺血-再灌注损伤的作用可以在所述损伤的动物模型中评价。在一个这样的模型中，在兔中诱导心肌缺血，在其前心包做一切口，在距离冠状动脉左前降支(LAD)根部5-8mm处放置3-0丝线，系紧结扎，以便该血管完全闭塞(Buerke et al.，(2001)J Immunol 167：5375)。在冠状动脉闭塞后55分钟(即再灌注之前5分钟)经静脉内推注给予增加剂量的蛋白酶例如修饰的MT-SP1多肽或者对照运载体如盐水。5分钟后(即在缺血共60分钟后)，松开LAD结扎线，缺血的心肌可以再灌注3小时。在再灌注结束时，系紧环绕LAD的结扎线。蛋白酶对于缺血损伤的作用可以通过评价对于心肌坏死、血浆肌酸激酶水平和嗜中性粒细胞激活标志物例如髓过氧化物酶活性和过氧化物自由基释放情况而进行分析。
在基于用含有6％人血浆的Krebs-Henseleit缓冲液灌注分离的小鼠心脏维持的补体介导的心肌损伤的另一模型中，蛋白酶或修饰的蛋白酶处理可用于限制心脏的组织损伤。在这种实例中，用于灌注心脏的缓冲液可以补加不同剂量的蛋白酶，例如但非限于修饰的蛋白酶包括MT-SP1多肽。可以分析灌注的心脏的人C3和C5b-9的沉积、冠状动脉灌注压、舒张末期压及心率。
蛋白酶及修饰的蛋白酶例如MT-SP1多肽可以在心肺旁路分流术(CPB)或者冠状动脉旁路搭桥术之前或之后用作治疗剂，以抑制通常在旁路分流术后发生的及可造成组织损伤的炎症性免疫应答。全血在体外的旁路循环中的体外再循环可用于刺激血小板和白细胞改变及由CPB诱导的补体激活(Rinder et al.(1995)J.Clin.Invest.96：1564)。在这个模型中，可以向已经含有来自健康供体的血液和猪肝素的传输包(transfer pack)中加入各种剂量的蛋白酶或修饰的蛋白酶或对照缓冲液，就在将血液加入体外循环之前加入。可以在再循环后5、15、30、45、60、75和90分钟抽取血液样品，进行补体研究测定；例如溶血测定和/或补体激活测定，以测量C5a、C3a和/或sC5b-9。在加入体外循环之前抽取的预处理血液样品可用作对照。对血样可进行流式细胞计量术，以确定血液中循环白细胞(即嗜中性粒细胞)群上粘附分子的水平，例如CD11b和P-选择蛋白水平。
I.组合治疗
野生型和修饰的蛋白酶可与其它现有药物和治疗剂组合治疗疾病和病变。如本发明所述，许多蛋白酶可用于治疗急性和慢性炎症病变和疾病。这种治疗可以与其它抗炎引物和/或治疗剂联合进行。用于组合治疗的抗炎药物和物质的例子包括非类固醇抗炎药物(NSAIDs)，包括水杨酸盐如阿司匹林，传统的NSAIDs如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、ketroprofen、萘丁美酮(nabumetone)、吡罗昔康(piroxicam)、双氯芬酸(diclofenac)或者吲哚美辛(indomethacin)，及Cox-2选择性抑制剂如塞来考昔(celecoxib，)或者Rotecoxin(
Figure A20068004790001492
)。可用于组合治疗的其它化合物包括抗代谢物如氨甲蝶呤和来氟米特(leflunomide)，皮质类固醇或者其它类固醇如可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)或强的松(prednisone)，镇痛剂如对醋氨酚(acetaminophen)，氨基水杨酸盐(aminosalicylates)如美沙拉秦(mesalamine)，及胞毒剂如咪唑硫嘌呤(azathioprine，
Figure A20068004790001493
)，环磷酰胺(
Figure A20068004790001494
)及环孢霉素A。可用于组合治疗其它物质包括生物学应答修饰剂。生物学应答修饰剂可包括促炎细胞因子抑制剂，包括TNF-α抑制剂如依那西普(etanercept，
Figure A20068004790001495
)、英夫利昔单抗(infliximab，
Figure A20068004790001496
)或者adalimumad(
Figure A20068004790001497
)及IL-1抑制剂如阿那白滞素(anakinra，
Figure A20068004790001498
)。生物学应答修饰剂也可包括抗炎细胞因子如IL-10，B细胞靶向剂如抗CD20抗体()，靶向T抗原的化合物，粘附分子阻断剂，趋化因子受体拮抗剂，激酶抑制剂如MAP激酶、JNK或者NFκB抑制剂，及PPAR-γ配体。
野生型和修饰的蛋白酶也可以与治疗心血管疾病的药物组合使用，和/或与在治疗心血管疾病例如本文描述的造成补体介导的缺血-再灌注损伤相关的炎症疾病的那些疾病期间给予的药物组合应用。例如，本发明提供的蛋白酶例如支架蛋白酶或修饰的蛋白酶可以与抗凝剂组合给予。抗凝剂的例子包括但非限于肝素、华法林、醋硝香豆素、苯茚二酮、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐，及直接的凝血酶抑制剂如阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定、希美加群。
其它药剂如其它补体抑制剂可用作抗炎药物与本发明所述蛋白酶及修饰的蛋白酶组合治疗。这种其它补体抑制剂的例子包括眼镜蛇毒因子(CVF)、聚阴离子分子如肝素、硫酸葡聚糖、聚乙烯基硫酸盐、聚赖氨酸、或者苏拉明，天然分子如K-76COOH、迷迭香酸，或者中草药麻黄提取物，合成的分子如afamastat mesilate(FUT-175)，合成的C1s抑制剂(C1s-INH-248)，或者C1s和fD(BCX-1470)的抑制剂，肽抑制剂如compstatin，补体的抗体抑制剂如抗C5(N19-8)，人源化抗C5(h5G1.1)，抗C6或者抗C8抗体，及可溶形式膜补体调节剂如可溶的CR1(sCR1)、可溶的DAF(sDAF)、可溶的MCP(sMCF)或者可溶的CD59(sCD59)(Morgan et al.，(2003)MolImmunol.40：159)。
含有本发明所述蛋白酶或修饰的蛋白酶的药物组合物可用于治疗由补体激活介导的任一或多种炎症性疾病或病变。本发明还提供了蛋白酶或修饰的蛋白酶与另一种治疗或化合物的组合以治疗炎症疾病或病变。所述蛋白酶或修饰的蛋白酶及抗炎剂可以作为单独的组合物进行包装，一起或相继或间歇给予。或者，它们可以作为单一组合物进行给予，或者作为两种组合物以单一组合物形式给予。所述组合可以包装成为试剂盒，任选具有其它试剂、使用说明书，小瓶或其它容器、注射器及使用修饰的蛋白酶的其它物品。
J.实施例
下述实施例仅仅出于举例目的，而不限制本文提供的实施方案的范围。
实施例1
MT-SP1的克隆和诱变
用BamHI和HindIII限制位点将野生型MT-SP1克隆进pQE32细菌表达载体(Qiagen，SEQ ID NO：345)，位于6组氨酸标记的C末端。所述构建体包括前区、激活序列和蛋白酶结构域，并且含有由Takeuchi et al.(1999)PNAS 96：11054公布的序列和SEQ ID NO：2的598至C末端的残基(即相应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的598-855位残基)。通过Quikchange定点诱变(Stratagene)产生突变体。简而言之，建立一个PCR样品反应，其含有作为模板的野生型MT-SP1和设计含有希望的突变的寡核苷酸引物(见表21)。PCR反应在50μl总反应体积中如下进行：5μl 10X反应缓冲液，1μl MT-SP1 DNA模板(100ng/μl)，0.5μl 50μM正向引物，0.5μl 50μM反向引物，1.0μl dNTP，41.0μl H2O和1.0μl Pfu Ultra(2.5单位/μl)。还进行了缺少正向或反向引物的对照反应。PCR反应条件如下：95℃30秒，随后18个循环的95℃30s、55℃60s和72℃8分钟24秒。在72℃延伸10分钟终止反应，随后在4℃保温。每一反应产物用DpnI在37℃消化1-2小时。将1.0ml产物转化进XL-1Blue超感受态细胞中并以2.0μl和20.0μl涂布在含有50μg/ml羧苄青霉素的选择性琼脂板上。
表21：诱变引物
  引物   序列  SEQIDNO
  F97D正向   5′CACCCCTTCTTCAATGACGACACCTTCGACTATGACATCG-3′  346
  F97D反向   5′-CGATGTCATAGTCGAAGGTGTCGTCATTGAAGAAGGGGTG-3′  347
  F97E正向   5′-CCACCCCTTCTTCAATGACGAGACCTTCGACTATGACATCGC-3′  348
  F97E反向   5′-GCGATGTCATAGTCGAAGGTCTCGTCATTGAAGAAGGGGTGG-3′  349
  F97A正向   5′-CACCCCTTCTTCAATGACGCCACCTTCGACTATGACATC-3′  350
  F97A反向   5′-GATGTCATAGTCGAAGGTGGCGTCATTGAAGAAGGGGTG-3′  351
  F97W正向   5′-CACCCCTTCTTCAATGACTGGACCTTCGACTATGACATC-3′  352
  F97W反向   5′-GATGTCATAGTCGAAGGTCCAGTCATTGAAGAAGGGGTG-3′  353
  Y146N正向   5′-GGACACACCCAGAACGGAGGCACTGGC-3′  354
  Y146N反向   5′-GCCAGTGCCTCCGTTCTGGGTGTGTCC-3′  355
  Y146D正向   5′-GGACACACCCAGGACGGAGGCACTGGC-3′  356
  Y146D反向   5′-GCCAGTGCCTCCGTCCTGGGTGTGTCC-3′  357
  Y146E正向   5′-GGGACACACCCAGGAGGGAGGCACTGGCG-3’  358
  Y146E反向   5′-CGCCAGTGCCTCCCTCCTGGGTGTGTCCC-3′  359
  Y146A正向   5′-GGGACACACCCAGGCCGGAGGCACTGGCG-3′  360
  Y146A反向   5′-CGCCAGTGCCTCCGGCCTGGGTGTGTCCC-3′  361
  Y146W正向   5′-GGGACACACCCAGTGGGGAGGCACTGGCG-3′  362
  Y146W反向   5′-CGCCAGTGCCTCCCCACTGGGTGTGTCCC-3′  363
  Y146R正向   5′-GGGGACACACCCAGAGGGGAGGCACTGGCGC-3′  364
  Y146R反向   5′-GCGCCAGTGCCTCCCCTCTGGGTGTGTCCCC-3′  365
  Q192R正向   5′-TGGACTCCTGCCGGGGTGATTCCGG-3′  366
  Q192R反向   5′-CCGGAATCACCCCGGCAGGAGTCCA-3′  367
  K224A正向   5′-CGCTCAGAGGAACGCGCCAGGCGTGTACA-3′  368
  K224A反向   5′-TGTACACGCCTGGCGCGTTCCTCTGAGCG-3′  369
  K224F正向   5′-GCTGCGCTCAGAGGAACTTCCCAGGCGTGTACACAAG-3′  370
  K224F反向   5′-CTTGTGTACACGCCTGGGAAGTTCCTCTGAGCGCAGC-3′  371
CB编号命名的每一个克隆的蛋白酶结构域MT-SP1突变体的序列在SEQ ID NO：10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，552-605，或672-680的任一序列中示出。
实施例2
MT-SP1的表达和纯化
野生型和修饰的MT-SP1被克隆进实施例1中所述的含有N-末端6组氨酸标记、前区和蛋白酶结构域的pQE32细菌表达载体(Qiagen，SEQ IDNO：345)中，所得构建体被转化进BL-21大肠杆菌细胞中。细胞在100ml培养物中生长至OD为0.6，通过加入IPTG至终浓度为1mM诱导在包涵体中蛋白酶的表达。4-6小时后，离心沉淀细菌并将沉淀重悬于50mM Tris pH8，500mM KCl和10％甘油(缓冲液A)中。细胞经超声裂解并在6000xg离心沉淀。沉淀重悬于50mM Tris pH 8，6M脲，100mM NaCl和1％2-巯基己醇(缓冲液B)中。通过在10,000xg离心沉淀膜和细胞器，上清流过镍NTA柱(Qiagen)。柱用50mM Tris pH8，6M脲，100mM NaCl，20mM咪唑，1％2-巯基乙醇和0.01％Tween 20(缓冲液D)洗涤。柱再次用不含Tween 20的缓冲液D洗涤。然后用50mM Tris pH 8，6M脲，100mM NaCl，1％2-巯基乙醇和250mM咪唑(缓冲液E)从柱中洗脱蛋白酶。然后将蛋白酶浓缩至～1mL体积，然后在1升的50mM Tris pH8，3M脲，100mM NaCl，1％2-巯基乙醇和10％甘油中于4℃透析过夜。最后，在4℃将蛋白酶过夜透析进50mM Tris pH8，100mM NaCl和10％甘油中。在最后的透析步骤中，蛋白酶通过在前结构域(prodomain)和蛋白酶结构域交界处的序列RQAR/VVGG处自我裂解而自身活化，导致除去6组氨酸标记和前结构域。
实施例3
在摇瓶中表达和纯化修饰的MT-SP1 CB155
如实施例1和2所述克隆CB155和相关重组人丝氨酸蛋白酶突变体和野生型MT-SP1蛋白酶并在大肠杆菌中作为包涵体表达。使MT-SP1或突变体的生产适应于实验室规模，所述适应是集合多达30个1L摇瓶以用于随后分离包涵体沉淀以增溶并重折叠。简而言之，将MT-SP1突变体CB155质粒构建体转化进XL-1 Blue超感受态细胞中，挑取1个新鲜菌落并在25ml含有50μg/ml羧苄青霉素的luria肉汤(LB；Difco LB Broth Lennox，大概配方每升：10.0g胰胨，10.0g酵母提取物，5.0g氯化钠)于37℃过夜生长。将10ml过夜培养物稀释进在Ultra Yield瓶(2.5L)中的1L LB中并在37℃振荡至OD600约为0.6至约0.7(即在37℃振荡约2小时)。向培养物中加入IPTG(Dioxane Free；Calbiochem)1.0M至终浓度为1mM以诱导蛋白酶在包涵体中表达，并将培养物在37℃继续振荡4小时。在Sorvall转子#SLC4000中于6000rpm离心20分钟收获培养物。
将来自1L培养物的细胞沉淀重悬在50ml洗涤缓冲液II(300mM氯化钠，50mM磷酸钾pH 7.4)中并转移至莲座细胞进行超声处理。如下经超声裂解细胞：20-50ml溶液，2分钟，30％工作期，输出＝5-6，冰上，重复3次；100+ml溶液，2分钟，60％工作期，输出＝8，冰上，重复6次。超声裂解物在4℃以7000rpm离心20分钟。弃去上清并用刮铲将沉淀以每约2.0g包涵体重悬于40ml洗涤缓冲液I(300mM氯化钠，50mM磷酸钾pH7.4，0.5％LDAO)并涡旋。在4℃以9000rpm离心包涵体15分钟，并在洗涤缓冲液I中总共洗涤3次。在洗涤缓冲液II中重复离心和洗涤步骤2次。洗涤的包涵体每约2.0g包涵体悬浮在20ml变性缓冲液(6M盐酸胍，100mM Tris HCL pH8.0，20mM二硫苏糖醇)，悬浮是用刮铲弄碎沉淀并在室温振荡30分钟直至沉淀溶解或大部分溶解。在Sorvall SLA600TC转子中以9000rpm离心除去任何不溶材料，随后重悬于20ml缓冲液中。将样品缓慢滴入含有100X体积的重折叠缓冲液(100mM Tris HCL pH 8.0，150mM NaCl，5mM还原型谷胱甘肽，0.05M氧化型谷胱甘肽，1.5M L-精氨酸单盐酸盐)的烧杯中并在4℃缓慢搅拌72小时。将样品稀释至于50mM Tris pH 8.0/50mM NaCl的1M终浓度的精氨酸-HCL中，然后用交叉流过滤浓缩至约700ml。然后将样品转移至VivaFlow(Sartorius，Edgewood NY)并进一步浓缩至终体积约300ml。样品过夜透析进50mM Tris pH 8.0/50mM NaCl(8L)。出现了一些样品沉淀。在9000rpm离心样品以除去沉淀。
在室温保温样品直至通过裂解前区释放成熟酶而发生蛋白酶的自身活化。自身活化发生在纯化过程中。用SDS-PAGE监测活性(3kDa迁移)。还通过裂解产荧光底物而评价的酶活性来监测活性。为了测量酶活性，在测定缓冲液中将蛋白酶从1∶20倍稀释至1∶100倍，所述测定缓冲液含有50mM Tris pH 8.0，50mM NaCl和0.01％Tween-20。将5μl稀释的蛋白酶与50μl的100μM Ac-RQAR-AMC底物混合，在荧光分光光度计(MolecularDevices Gemini XPS)中以激发波长380nm、发射波长450nm、截断值滤镜435nm测量荧光。随着样品在室温保温约24-72小时而随时间测量活性，直至活性稳定。对于更稀释的样品，可能需要更长的时间。典型地，在经阴离子交换纯化之前使蛋白酶达到＞75％活化。
一旦活性稳定，将样品过夜透析进50mM Hepes pH6.5(8L)。过滤样品并上样于SourceQ柱。在上样于SourceQ柱后，用3柱体积的缓冲液A(50mMHepes pH6.5)洗样品，并用10柱体积的0-20％的缓冲液B(50mM Hepes pH6.5/1M NaCl)梯度洗脱。测量每一级分的活性，合并活性级分并过夜透析进PBS。蛋白质样品被浓缩至约5ml并加入苯甲脒至终浓度为20mM以抑制CB155的自身裂解。CB155的总收率典型地约15-20mg CB155/1L细胞培养物。在摇瓶规模生产CB155实现了22mg/升细胞培养物的收率。从包涵体到天然蛋白质的总收率典型地少于10％。在摇瓶中实现了发酵效价高达3g/L。
测定了纯化的蛋白质的比活性、纯度和内毒素水平。通过活性位点滴定测定了每一制备物中活性蛋白酶的比活性或量，活性位点滴定是与各种浓度的功能蛋白酶的活性位点结合的抑制剂保温、随后加入产荧光底物以测量底物蛋白酶解而进行的。活性酶的量是从残余蛋白酶活性对抑制剂浓度的图而计算的，图中截距相应于活性蛋白酶的浓度。简而言之，用Harriset al.(JBC，1988，273：27354-73)的方法用大肠杆菌素M84R滴定纯化的蛋白质，即用4-甲基伞形基对胍基苯甲酸酯(4-methylumbelliferylp-guandinobenzoate，MUGB)滴定胰蛋白酶原液，然后用所述胰蛋白酶滴定M84R大肠杆菌素原液。最后用所述M84R大肠杆菌素原液滴定纯化的蛋白酶。在每种情况下，蛋白酶均与浓度为预期蛋白酶浓度的0.1-2倍浓度的抑制剂在30℃保温30分钟。使用30％-90％未被抑制的蛋白酶活性的残余活性进行数据作图。在Gemini XPS光谱荧光计(激发：380nm；发射：450nm；截断：435mn)上，在含有50mM Tris pH 8.0，50mM NaCl和0.01％Tween-20(对于胰蛋白酶活性，加入10mM CaCl2)的测定缓冲液中在40μMAc-RQAR-AMC存在下于30℃监测酶活性。蛋白制备物的纯度通过在SDS-PAGE上分辨蛋白质产物并用考马斯蓝染色而评价。成熟蛋白酶电泳为一条25kD的单带。每一制备物中的内毒素水平用Liumlus AmebocyteLysate Chromo-LAL测定(Associated of Cape Cod)根据厂商方案经下列修改而测定。蛋白酶在LAL Reagent Water(LRW)中稀释100倍，分成两管。向一管中加入100内毒素单位(EU)/mL的攻击，向另一管中加入LRW。然后，将样品稀释2倍成原液，从而反应含有终浓度为5mM的甲苯磺酰基-赖氨酰-氯甲基酮(TLCK)和10mM的Tris pH8.0。每一样品在37℃保温2小时以失活蛋白酶活性。样品被进一步稀释50倍并根据厂商指导测定。如果内毒素攻击的恢复在理论值的50-150％之间则认为结果是有效的。最终纯化的CB155典型地具有＞95％的经SDS-PAGE测定的纯度、＞90％的比活性并含有大约50-500EU/ml的内毒素。
实施例4
MT-SP1和突变体的大规模发酵
进行了基于实施例3所述方案的MT-SP1突变体的大规模发酵。选定的用突变体MT-SP1转化的大肠杆菌菌落的2升培养物在LB培养基(Difco)中过夜生长。将该过夜培养物接种到50L发酵液中并在37℃振荡培养约5小时直至OD600吸收值达到对数期。通过加入IPTG至终浓度为700μM而诱导蛋白酶在包涵体中的表达，以补料分批模式继续发酵4小时。离心收获培养物，得到约750g-1680g的湿重细胞沉淀。以每1g细胞沉淀10ml缓冲液在50mM Tris，pH8.0，0.5M KCl，10％甘油，1mM β-巯基乙醇中重悬细胞沉淀并超声处理。超声条件为脉冲开：4s，脉冲关：6s，700W，30分钟。超声裂解物在4℃以7000rpm离心30分钟。弃去上清并用刮铲以每1g包涵体在10ml缓冲液中将沉淀重悬于洗涤缓冲液I(50mM Tris pH8.0，0.5M KCl，10％甘油，1mM β-巯基乙醇，0.01％Tween 20)并振荡。离心包涵体并洗涤2次。包涵体收率约为176-506克。
实施例5
在巴斯德毕赤氏酵母中生产MT-SP1
用SMD1168/pPIC9K：MTSP1 Sac SCI克隆(Friedrich et al.(2002)J.Biol.Chem.，277：2160-2168)在配有3.3L容积的生物反应器的BioFlo 3000发酵罐(New Brunswick Scientific，NJ)中发酵生产多毫克量的MT-SP1蛋白酶结构域。用100ml巴斯德毕赤氏酵母转化体的过夜培养物接种ZA001复合培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，40g/L甘油，5g/L硫酸铵，0.2g/L无水硫酸钙，2g/L七水硫酸镁，2g/L硫酸钾，25g/L六偏磷酸钠，4.35ml/L PTM1)。培养物通过补料分批阶段补加50％甘油并用控制在0.025％的甲醇诱导18-24小时。
为了纯化分泌进培养基中的重组MT-SP1，在5000g离心30分钟除去细胞和细胞碎片。轻轻倒出所得的上清，用10N NaOH调节至pH8.0，并通过SartoBran 300 0.45+0.2μM胶囊(capsule)(Sartorius)过滤。用10kDa超滤筒(配有AG/Technologies UFP-10-C-5A滤膜的NC SRT UF系统)经超滤将上清浓缩至1升，通过交叉流过滤将缓冲液交换成缓冲液A(50mM tris-HCl，50mM NaCl，0.05％tween-80，pH 8.0)。用1L缓冲液A洗过滤装置1次，与浓缩液合并。
以8ml/分钟的流速将浓缩的含MT-SP1的溶液加到已经用缓冲液A平衡的150ml苯甲脒柱上。柱用3柱体积的缓冲液B(50mM tris-HCl，1.0M NaCl，0.05％tween-80，pH 8.0)洗并用3柱体积的缓冲液C(50mM tris-HCl，1.0M L-精氨酸，0.05％tween-80，pH8.0)洗脱。合并含有MT-SP1活性的级分并用JumboSep浓缩器(Pall Gelman)和10kDa截断膜浓缩至10ml。浓缩至10ml，将缓冲液更换成缓冲液D(50mM Na2HPO4，125mM NaCl，pH 5.5)，并将体积调整至5-10ml。除去保留物，用缓冲液D洗浓缩器，并加入到浓缩物中。总样品体积被调整至15ml。
使来自苯甲脒柱的部分纯化的MT-SP1流过用15ml缓冲液D预平衡的5ml Q-sepharose Fast Flow HiTrap柱(Amersham-Pharmacia Biotech)。收集流经液，通过OD280测量确定蛋白质浓度(使用2.012mg/OD280消光系数)。然后将纯化的MT-SP1去糖基化，通过每mg蛋白质添加0.1μl内切糖苷酶H(ProZyme，5U/ml)并在温和涡流下于4℃保温过夜进行，随后进行阴离子交换纯化步骤(CB155 MT-SP1突变体不需要)。
用Nanopure H2O将去糖基化的集合物的电导率调整至2.0-3.0mS/cm并将pH调整至6.5(约200-300ml终体积)。然后通过直接上样至Pharmacia AktaExplorer系统而用7ml Source 15Q阴离子交换柱(Amersham-PharmaciaBiotech)经阴离子交换层析进一步纯化MT-SP1。以6ml/min流速用10柱体积的含有50mM HEPES，pH 6.5和0-0.33M NaCl梯度的缓冲液洗脱蛋白质。合并含有蛋白质的级分，加入苯甲脒至用OD280测量和使用2.012mg/OD280的理论消光系数确定的终浓度。
实施例6
评价血浆活性
通过裂解包括MT-SP1自身活化位点的肽底物Ac-RQAR-AMC而测定野生型或修饰的蛋白酶的血浆活性。将1微升10μM蛋白酶原液稀释进9μlPBST或9μl集合的人柠檬酸化血浆(Innovative Research；Sarasota，Florida)(最终1μM)。反应在37℃保温5分钟。在保温结束时，将4μl保温的蛋白酶混合物稀释进250μl测定缓冲液中(50mM Tris，pH8.0，50mM NaCl，0.01％Tween-20)。向Nunc black微滴板的每一孔中加入1μl Ac-RQAR-AMC底物(6.25mM于DMSO中)，并向孔中加入50μl所述稀释的保温的蛋白酶混合物。用Spectromax荧光读板器通过激发波长为380nm和发射波长为450nm的动力学测量监测底物的裂解。蛋白酶的活性分数(Fractional activity)计算为血浆中的蛋白酶活性除以PBST中的活性的比率。
在溶血测定(见下述实施例7)中评价蛋白酶而平行测定野生型MT-SP1和一组MT-SP1突变体的血浆活性。结果见下表23。
实施例7
通过检测红血细胞的补体诱导的溶血而筛选和滴定蛋白酶活性的溶血测定
补体系统的功能活性可以用传统的溶血测定进行评价，所述溶血测定通过测定样品裂解红细胞的能力而筛选总补体途径的功能。将待分析的样品的系列稀释液与抗体致敏的绵羊红细胞在预定的温度保温。溶解的红细胞数用所释放的血红蛋白的分光光度吸光度确定，其在50％裂解范围内与补体蛋白水平有线性关系。结果通常以产生50％裂解所需的样品稀释度的倒数表示。因此，当评价经典途径的成分的活性时，可以确定CH50值。评价旁路途径的功能活性以确定AH50(发生50％溶血时的效价)的测试使用豚鼠、兔或鸡红细胞作为靶细胞。经典途径的激活通过向旁路途径溶血测定中添加EGTA和Mg而阻断。
可以修改溶血测定以确定给定蛋白酶对补体激活的作用。在与红细胞共保温之前将蛋白酶与血浆保温。补体产物被蛋白酶的裂解将导致补体活性降低。通过将血浆与蛋白酶的系列稀释液保温，可以确定IC50，其是达到50％补体活性抑制的蛋白酶浓度。
A.经典溶血测定
1.经典溶血测定：与20％血浆预保温
a.为评价用蛋白酶处理后的补体激活，在添加稀释至终浓度为0-1μM的野生型MT-SP1、CB155或CB42之前，将用柠檬酸钠作为抗凝剂的人类血浆(Innovative Research，Inc.)在PBST中稀释至终浓度为20％(10μl血浆于40μlPBST中)。反应在37℃保温1小时。在用IgG激活的绵羊红细胞的溶液中将所述血浆溶液进一步稀释至终浓度为0.5％(6.25μl血浆溶液于250μl绵羊红细胞溶液中，Diamedix(Miami，FL))。将所述溶液在室温振荡保温45分钟。在2000rpm离心2分钟沉淀细胞并取100μl上清置于干净的96孔微滴定板中。在415nm读取光密度(OD)来检测从裂解的红细胞释放的血红蛋白。野生型MT-SP1、CB155和CB42的溶血IC50(nM)分别是131nM、94nM和67nM。
测试了一组MT-SP1修饰的蛋白酶的溶血抑制。含有柠檬酸钠作为抗凝剂的稀释的人血浆与200nM的野生型MT-SP1、CB12、CB13、CB31、CB32、CB40、CB41、CB42、CB43、CB44、CB45、CB64、CB66、CB67和CB155保温。反应在37℃保温1小时。所述血浆溶液在用IgG激活的绵羊红细胞溶液中进一步稀释至终浓度为0.5％并如上所述测定溶血。测定了CH50值。溶血分数通过比较野生型或修饰的蛋白酶的CH50值和不含添加的蛋白酶的样品(阳性对照)而确定，其中阳性对照的溶血分数设为1.00。表22示出了原始溶血分数值。数据表明所有测试的蛋白酶与阳性对照相比均抑制溶血至少50％，其中在CB42存在下溶血完全被抑制。
表22：一组MT-SP1变体对溶血的抑制
  蛋白酶   溶血分数
  野生型   0.14
  CB12   0.22
  CB13   0.50
  CB31   0.51
  CB32   0.38
  CB40   0.48
  CB41   0.32
  CB42   0.00
  CB43   0.23
  CB44   0.48
  CB45   0.27
  CB64   0.34
  CB66   0.44
  CB67   0.33
  CB155   0.09
  阴性对照   0.00
  阳性对照   1.00
b.在另一个实验中，为了评价用蛋白酶处理后经典补体激活，将蛋白酶在PBST中最初稀释至浓度为5.0μM以用于筛选方案，而从50μM至0.390μM的蛋白酶系列稀释液用于确定IC50的方案。MT-SP1或修饰的蛋白酶在0.2ml试管中通过组合2μl稀释的蛋白酶溶液、10μl人血浆(以柠檬酸钠作为抗凝剂；Innovative Research，Inc.)和38μl PBST而与终浓度为20％的血浆预保温。这导致蛋白酶的进一步稀释以获得终浓度为200nM的蛋白酶用于筛选方案，以及2.0μM至0.0156μM的蛋白酶用于IC50方案。在这些测定中还包括无蛋白酶对照(10μl血浆和40μl PBST)和背景对照(仅50μl PBST)。反应在37℃保温1小时。以每孔120μl的体积向聚丙烯96孔板中加入致敏的绵羊红细胞(Diamdex，Miami，FL)，并且在每孔中混合3μl血浆/蛋白酶溶液以给出0.5％的最终血浆浓度。所述溶液在室温振荡下保温45分钟。在Sorvall台式离心机中以2000rpm离心5分钟沉淀细胞以沉淀未破裂的细胞，取100μl上清置于干净的96孔微滴定板中。在415nm读取光密度(OD)检测裂解的红细胞释放的血红蛋白。通过从所有孔中减去背景对照然后将实验样品除以无蛋白酶对照(阳性对照)而计算溶血分数，其中阳性对照的溶血分数设为1.00。蛋白酶所致溶血的IC50(nM)通过将溶血分数对蛋白酶浓度在4参数对数曲线拟合(SoftMax Pro software，Molecular Devices，CA)上作图而测定。
测试一组MT-SP1修饰的蛋白酶通过裂解经典补体途径的一或多个成分而对溶血的抑制。含有柠檬酸钠作为抗凝剂的稀释的人血浆与野生型MT-SP1(CB200)、CB12、CB16、CB17、CB20、CB21、CB42、CB43、CB44、CB45、CB66、CB80、CB82、CB155、CB212、CB213、CB214、CB216、CB218、CB219、CB232、CB235、CB238、CB244、CB245、CB251、CB252、CB255、CB257、CB268、CB274、CB331、CB332、CB349、CB350、CB351、CB353、CB357、CB367、CB373、CB377、CB381、CB383、CB385、CB387、CB388、CB403、CB409、CB412、CB413、CB421、CB422、CB423、CB450、CB451、CB458、CB464、CB486、CB487、CB488、CB489和CB490的200nM或从2.0μM至0.0156μM的系列稀释液保温。反应在37℃保温1小时。蛋白酶/血浆溶液进一步在致敏的绵羊红细胞中稀释并如上所述测定溶血。测定了溶血分数和ID50。表23描述了每一蛋白酶(20％血浆预保温)在200nM的溶血分数(经典200nM溶血)和IC50。
2.经典溶血测定：与90％血浆预保温
修饰的经典溶血测定可通过调节血浆和蛋白酶浓度而进一步适应于测量在更加生理学条件下的蛋白酶的抑制活性。蛋白酶最初在PBST中稀释至50μM浓度用于筛选方案，而从200μM至1.56μM的蛋白酶系列稀释液用于确定IC50的方案。MT-SP1或修饰的蛋白酶在0.2ml试管中通过组合2μl稀释的蛋白酶溶液、18μl人血浆(以柠檬酸钠作为抗凝剂；InnovativeResearch，Inc.)而与终浓度为90％的血浆预保温。这导致蛋白酶的进一步稀释以得到终浓度为5.0μM的蛋白酶用于筛选方案，以及20μM至0.156μM的蛋白酶用于IC50方案。在这些测定中还包括了无蛋白酶对照(18μl血浆和2μl PBST)和背景对照(仅20μl PBST)。反应在37℃保温1小时。通过添加70μl PBST而将反应混合物进一步稀释至20％血浆。通过3.0ml等份、除去2.7ml缓冲液并将细胞沉淀重悬于剩余的0.3ml缓冲液中而将致敏的绵羊红细胞(Diamdex，Miami，FL)浓缩10倍。浓缩的致敏的红细胞以每孔12μl的体积被加入到聚丙烯96孔板中。将6μl或60μl的预保温的蛋白酶/血浆混合物加入到红细胞中以分别给出终浓度为1％或10％血浆，终体积为120μl(加入PBST至终体积)。室温振荡下将所述溶液保温45分钟。2000rpm离心细胞5分钟以沉淀未破裂细胞，并取100μl上清置于干净的96孔微滴定板中。在415nm读取光密度(OD)检测裂解的红细胞释放的血红蛋白。通过从所有孔中减去背景对照然后将实验样品除以无蛋白酶对照(阳性对照)而计算溶血分数，其中阳性对照的溶血分数设为1.00。蛋白酶所致溶血的IC50(nM)通过将溶血分数对蛋白酶浓度在4参数对数曲线拟合(SoftMax Prosoftware，Molecular Devices，CA)上作图而测定。
测试了野生型MT-SP1(CB200)和MT-SP1突变体CB252和CB377在与90％血浆预保温后对溶血的抑制。预保温的蛋白酶/血浆混合物(终浓度为20nM至2000nM蛋白酶)与致敏的红细胞在10％最终血浆浓度保温，并如上所述评价了溶血。如上所述测定了溶血的IC50。CB200、CB252和CB377的IC50分别是967nM、379nM和205nM。
还评价了修饰的MT-SP1 CB450在与90％预保温后的体外经典途径诱导的溶血。预保温的蛋白酶/血浆混合物(终浓度为20nM至2000nM蛋白酶)与致敏的红细胞在1％和10％的最终血浆浓度保温并如上所述评价溶血。结果显示CB450剂量依赖性地降低了由1％或10％血浆诱导的溶血，其中观察到由1％血浆诱导时溶血抑制略高。例如，在存在100nM或更高的CB450时在1％血浆中诱导时未观察到可检测的溶血，而在10％血浆中诱导需要更高的蛋白酶收率以实现溶血的完全抑制(即约750nM或更高的CB450蛋白酶)。
B.旁路溶血测定
1.旁路溶血测定：与20％血浆预保温
为评价用蛋白酶处理后旁路补体激活，将蛋白酶最初在GVB/Mg/EGTA缓冲液中稀释，所述缓冲液含有明胶维罗那缓冲液(GVB；Comptech)以及10mM MgCl2和8mM EGTA。蛋白酶被稀释至7.5μM浓度用于筛选方案，而从30μM至0.2344μM的蛋白酶系列稀释液用于确定IC50的方案。MT-SP1或修饰的蛋白酶在96孔聚丙烯板中通过组合5μl稀释的蛋白酶溶液、15μl人血浆(以柠檬酸钠为抗凝剂；Innovative Research，Inc.)和55μl的GVB/Mg/EGTA缓冲液而与终浓度为20％的血浆预保温。这产生蛋白酶的进一步稀释液以产生终浓度为500nM的蛋白酶用于筛选方案，以及2.0μM至0.0156μM的蛋白酶用于IC50方案。在测定中还包括了无蛋白酶对照(15μl血浆和60μl GVB/Mg/EGTA)和背景对照(仅75μl GVB/Mg/EGTA)。反应在室温保温1小时。保温后，将5μl GVB/Mg/EGTA加入到保温混合物中，随后加入20μl洗涤的鸡Alsevers(鸡全血和alsevers溶液的50％混合物，其含有抗凝剂；Colorado Serum Company，CO)给出最终血浆浓度为15％。在加入之前，鸡Alsevers如以下实施例19所述进行致敏，离心细胞并在冷PBS中洗3次，重悬于10ml GVB/Mg/EGTA中并在冰上储存直至使用。将平板在37℃振荡1小时。以2000rpm离心细胞5分钟以沉淀未破裂的细胞，取100μl上清置于干净的96孔微滴定板。在415nm读取光密度(OD)监测裂解的红细胞释放的血红蛋白。通过从所有孔中减去背景对照然后将实验样品除以无蛋白酶对照(阳性对照)而计算溶血分数，其中阳性对照的溶血分数设为1.00。蛋白酶所致溶血的IC50(nM)通过将溶血分数对蛋白酶浓度在4参数对数曲线拟合(SoftMax Pro software，Molecular Devices，CA)上作图而测定。
测试了一组MT-SP1修饰的蛋白酶通过裂解旁路补体途径的一或多个成分而对溶血的抑制。含有柠檬酸钠作为抗凝剂的人血浆与野生型MT-SP1(CB200)、CB12、CB16、CB17、CB20、CB21、CB42、CB43、CB44、CB45、CB66、CB80、CB82、CB155、CB212、CB213、CB214、CB216、CB218、CB219、CB232、CB235、CB238、CB244、CB245、CB251、CB252、CB255、CB257、CB268、CB274、CB331、CB332、CB349、CB350、CB351、CB353、CB0357、CB367、CB373、CB377、CB381、CB383、CB385、CB387、CB388、CB403、CB409、CB412、CB413、CB421、CB422、CB423、CB450、CB451、CB458、CB464、CB486、CB487、CB488、CB489和CB490的500nM或2.0μM至0.0156μM的系列稀释液保温。反应在室温保温1小时。如上所述将蛋白酶/血浆溶液在鸡红细胞中进一步稀释并测定溶血。确定了溶血分数和ID50。表23描述了每一蛋白酶(20％血浆预保温)在500nM的溶血分数(旁路500nM溶血)和IC50。
Figure A20068004790001611
Figure A20068004790001621
Figure A20068004790001631
2.旁路溶血测定：与90％血浆预保温
修饰的旁路溶血测定可通过调节血浆和蛋白酶浓度而被进一步适应于测量蛋白酶例如具有低活性的蛋白酶的抑制活性。蛋白酶最初在GVB/Mg/EGTA中稀释至50μM浓度用于筛选方案，而从200μM至1.56μM的蛋白酶系列稀释液用于确定IC50的方案。MT-SP1或修饰的蛋白酶在96孔聚丙烯板中通过组合2μl稀释的蛋白酶溶液和18μl人血浆(以柠檬酸钠作为抗凝剂；Innovative Research，Inc.)而与终浓度为90％的血浆预保温。这导致蛋白酶的进一步稀释以得到终浓度为5.0μM的蛋白酶用于筛选方案，以及20μM至0.156μM的蛋白酶用于IC50方案。在这些测定中还包括了无蛋白酶对照(18μl血浆和2μl GVB/Mg/EGTA)和背景对照(仅20μlGVB/Mg/EGTA)。反应在室温保温1小时。保温后，将80μl GVB/Mg/EGTA加入到保温的血浆/蛋白酶混合物中，随后加入20μl洗涤的鸡细胞(上述)，得到最终血浆浓度为15％。平板在37℃振荡1小时。以2000rpm离心细胞5分钟以沉淀未破裂的细胞，取100μl上清置于干净的96孔微滴定板。在415nm读取光密度(OD)监测裂解的红细胞释放的血红蛋白。通过从所有孔中减去背景对照然后将实验样品除以无蛋白酶对照而计算溶血分数，其中阳性对照的溶血分数设为1.00。蛋白酶所致溶血的IC50(nM)通过将溶血分数对蛋白酶浓度在4参数对数曲线拟合(SoftMax Pro software，MolecularDevices，CA)上作图而测定。
还评价了修饰的MT-SP1 CB450在与90％预保温后的体外旁路途径诱导的溶血。预保温的蛋白酶/血浆混合物(终浓度为20nM至2000nM蛋白酶)与鸡细胞在15％的最终血浆浓度保温并如上所述评价溶血。结果表明CB450剂量依赖性地降低了15％血浆诱导的溶血，而在约500nM或更高的CB450蛋白酶时未观察到可检测的红细胞溶血。
实施例8
用补体耗竭血清(Complement-Depleted Sera)检测红细胞的补体诱导溶血
a.为评价在存在或不存在野生型MT-SP1、CB155或CB42蛋白酶时处理的纯化补体因子导致的补体激活，纯化的补体因子C2、C3、C4和C5以及C2-、C3-、C4-和C5-补体耗竭培养基购自Quidel。纯化的补体蛋白(C2，C3，C4或C5)与100nM野生型MT-SP1、CB155或CB42蛋白酶在37℃保温3小时。反应中使用的纯化的蛋白质的浓度是5μM。将1微升反应与1μl合适的补体耗竭血清加入到100μl致敏的绵羊红细胞中并如实施例7所述测定溶血活性。确定溶血的CH50值。样品的溶血分数通过比较样品的CH50值和设为1.00的不含添加的蛋白酶的含C2血清的样品而确定。表24描述了原始溶血分数值。根据溶血抑制测得，野生型MT-SP1、CB155和CB42蛋白酶失活C2和C3，但不失活C4和C5。
表24：加回到补体耗竭血清中的与蛋白酶保温的补体蛋白的溶血
  蛋白酶   溶血分数
  C2   1
  C2+WT   0
  C2+CB155   -0.00104
  C2+CB42   0.071429
  C3   1.032325
  C3+WT   0.008342
  C3+CB155   0.07195
  C3+CB42   0.122449
  C4   0.957766
  C4+WT   0.970027
  C4+CB155   0.944142
  C4+CB42   1.040816
  C5   0.983651
  C5+WT   0.888283
  C5+CB155   0.942779
  CB+CB42   1.020408
b.在另一个实验中，一组补体蛋白在MT-SP1(CB200)、CB252和CB377的存在或不存在下被处理以评价蛋白酶失活纯化的补体蛋白的后果。纯化的补体蛋白(全部购自Quidel；San Diego，CA)在它们的生理学血清浓度(C1q：180μg/ml；C2：25μg/ml；C3：1000μg/ml；C4：500μg/ml；C5：75μg/ml；C6：70μg/ml；C8：80μg/ml；C9：60μg/ml)下于PBST中与25nM CB200、CB252或CB377蛋白酶保温。在存在1μl被耗竭相应补体因子的血清的情况下(所有耗竭血清均购自Quidel)，将1μl反应物加入到100μl致敏的绵羊红细胞中。作为对照，在反应中包括无蛋白酶对照、仅耗竭血清和仅正常血清。样品在室温振荡下在96孔板的孔中保温1小时。离心细胞以沉淀未破裂的细胞，并取85μl上清转移至干净的96孔微滴定板中。在415nm读取光密度(OD)监测裂解的红细胞释放的血红蛋白。结果表明在不存在添加的相应纯化的补体蛋白时对照耗竭血清由OD415读数评价几乎不显示溶血，而对照正常血清由OD415评价显示约为0.4的溶血。对于相应的纯化补体蛋白被加回耗竭的血清的每个反应(无蛋白酶对照)，OD415读数与用正常血清观察到的相当。补体蛋C1q，C3，C4，C5，C6，C7，C8或C9与CB200，CB252或CB377的预保温显示与正常血清或无蛋白酶对照相比没有降低的溶血。相反，C2与CB200，CB252或CB377的预保温导致溶血抑制，这由OD415吸光度降低到与耗竭血清对照相当的水平而得出结论。
实施例9
由Western印迹显示人血浆中补体成分C2的蛋白酶解
a.为了显现蛋白酶解产物，将人血浆在40μl PBST中稀释至5％并加入纯化的CB155，CB200或CB42至终浓度在0到500nM之间。样品在37℃保温1小时。用Novex Mini-Cell Surelock装置(Invitrogen)在4-12％Tris-甘氨酸凝胶上以200V经SDS-PAGE分离20微升反应物或作为对照的纯化的补体C2(CompTech)35分钟，然后用Biorad Transblot SD半干转移池转移至PVDF膜(Invitrogen)。膜用5％在TBST(含1％Tween 20的tris缓冲盐水)中的奶粉封闭1小时，随后洗涤并与在5％奶粉/TBST中的1∶3000稀释度的山羊抗人C2抗血清(Quidel)在4℃保温过夜。膜再在TBST中洗3次，每次10分钟，并与在5％奶粉/TBST中的1∶10000HRP缀合的兔抗山羊抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)于室温保温1小时。滤膜在TBST中洗3次，每次10分钟，用ECL Plus Western印迹检测系统(Amersham Biosciences)根据厂商指导显色在血浆中的C2及其裂解产物。在FluorChem成像系统(AlphaInnotech Corp.)上使用AlphaEase FC Fluorchem 8800软件，版本3.1.2(AlphaInnotech Corp.)进行光密度测定。使用光密度测定确定未裂解产物与裂解产物的比率。测得裂解C2的蛋白酶的IC50如下：CB200：15.7nM；CB155：18.4nM；CB42：11.9nM。
b.在另一个实验中，比较了野生型MT-SP1(CB200)和突变体MT-SP1CB252和CB377对C2和C3的裂解。将9微升人柠檬酸化血浆(InnovativeResearch)与1μl蛋白酶保温以得到终浓度为0-2000nM的蛋白酶。在37℃保温1小时。将1微升预保温的蛋白酶/血浆反应物与10μl(用于评价C2)或1000μl(用于评价C3)NuPAGE LDS相同缓冲液和样品还原试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)合并并煮沸5分钟。平行地，将10μl煮沸样品上样至4-12％NuPAGE Bis-Tris梯度凝胶(Invitrogen)上并用用于蛋白质分离的NovexMini-Cell Surelock装置(Invitrogen)在200V电泳35分钟，随后用BioradTransblot SD半干转移池转移至PVDF滤膜(Invitrogen)。膜用5％在TBST(含1％Tween 20的tris缓冲盐水)中的奶粉(Biorad，Hercules，CA)封闭1小时。然后膜与1∶2000在5％奶粉/TBST中的山羊抗人C2(Quidel)或山羊抗人C3在4℃保温过夜。膜在TBST中洗3次10分钟，然后与在5％奶粉/TBST中的1∶2000 HRP缀合的抗山羊二抗(Zymed；San Francisco，CA)于室温保温1小时。膜在TBST中洗3次10分钟，并用ECL Plus Western印迹检测系统(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)显色。在FluorChem成像系统(Alpha Innotech Corp；San Leandro，CA)上使用AlphaEase FC Fluorchem 8800软件，版本3.1.2(Alpha Innotech Corp.)进行光密度测定。结果显示CB200，CB252和CB377均以剂量依赖方式裂解人血浆中的C2，而与无蛋白酶对照相比，即使在最高的蛋白酶浓度(2000nM)，所测试的蛋白酶也无一裂解人血浆中的C3。在500nM每种测试的蛋白酶下由Western印迹观察C2的降解，在1000nM下几乎无可检测到的C2，在2000nM测试的蛋白酶下观察到C2完全降解。
实施例10
旁路和经典溶血以及与人血浆中补体成分C3的蛋白酶解相关性的评价
在如实施例7的A.1和B.1所述与人血浆预保温后，分别筛选了一组终浓度分别为200nM(经典)或500nM(旁路)的蛋白酶对于经典溶血或旁路溶血的作用。所测试的该组蛋白酶包括野生型(CB200)，CB238，CB331，CB349，CB357，CB367，CB377和CB387。CB200，CB357，CB367和CB387抑制经典和旁路溶血至不同程度。CB238和CB377显示极少的旁路溶血抑制，但确实显示对经典溶血的实质抑制。CB331和CB349显示极少的经典溶血抑制，但确实显示对旁路溶血的抑制。结果显示相比于经典途径，CB331，CB349和CB387对于裂解旁路途径是选择性的。
将溶血结果与在蛋白酶存在或不存在下观察C3得到的血浆中的C3裂解相关联。还如实施例9所述对于C3用Western印迹检查了来自旁路溶血测定的样品。与旁路溶血结果一致，结果表明CB331，CB349和CB387裂解C3，这是根据与无蛋白酶处理的血浆样品相比C3产物降低而表明的。
实施例11
纯化的补体成分的裂解和裂解位点的鉴别
为确定与支架或野生型蛋白酶相比修饰的蛋白酶对靶蛋白增加的特异性，纯化的补体因子C2，iC3和iC4购自Quidel Corporation(San Diego，CA)。在PBST中将5μg每种蛋白稀释至终浓度为5μM。加入MT-SP1，CB155或因子I至终浓度为100nM，并将反应在37℃保温5小时。通过变性蛋白质并用PNGaseF根据厂商指导处理(New England BioLabs，Ipswich，MA)而除去N-联糖基化。靶蛋白在4-12％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜。所得的膜用考马斯亮蓝R-250染料(TekNova，Hollister，CA)染色，用50％甲醇洗涤直至蛋白带被分辨，空气干燥。由UC Davis Molecular Structure Facility根据Edmans方案测序蛋白酶解片段而确定裂解序列。下表25描述了人C2、C3和C4的蛋白酶裂解序列。显示了当发生裂解时，由裂解产物的测序鉴别的C2、C3和C4上天然蛋白酶因子I、组织蛋白酶K、MT-SP1和修饰的MT-SP1(CB155)的各自裂解位点。相应的SEQ ID NO在序列后的括号中示出。
表25：蛋白酶裂解序列
实施例12
C2裂解与补体失活的相关性：评价C3转变酶的形成和溶血
C3转变酶是通过用C4和C2失活C1复合物而形成的。C1复合物中的C1r蛋白酶的激活裂解C1s，产生活性C1s蛋白酶。C4是C1s的敏感底物，由此导致C4裂解成C4a和C4b。活性C4b的产生提供了针对C2的结合位点，C2是C1s的第二个底物。C2的裂解导致形成片段C2a和C2b。由C1s裂解后，C4b和C2b片段结合在一起形成经典途径的C3转变酶。C2中存在的SLGR裂解位点是C2裂解的天然激活位点，产生C2a和C2b，而C2中的VFAK裂解序列存在于该分子C2a部分中的C2蛋白酶结构域中。为了评价C2中的裂解序列被野生型或修饰的MT-SP1的裂解是否影响C2的激活和C3转变酶的形成，评价了裂解并且在体外重构细胞表面溶血模型中确定了裂解的功能性后果。
A.C2裂解
在用野生型MT-SP1(CB200)，CB252或CB377裂解纯化的C2之后评价了C2a和C2b裂解产物的存在。为了评价纯化的C2与蛋白酶保温后的裂解产物，将5μg纯化的C2(Quidel)在37℃单独保温1小时或与终浓度为100nM的CB200，CB252或CB377蛋白酶在37℃保温1小时。在4-12％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上经SDS-PAGE分离整个反应物，之后转移到PVDF膜上。所得膜用考马斯亮蓝R-250染料(TekNova，Hollister，CA)染色，用50％甲醇洗涤直至蛋白条带被分辨，空气干燥。结果表明在存在100nM CB200，CB252或CB377时，C2几乎被完全降解，产生约70kD和23kD的裂解产物，分别相应于C2a和C2b。另外，在存在CB200时观察到约35kD的第三个裂解产物。
B.细胞表面溶解模型
MT-SP1或修饰的蛋白酶对C2蛋白的活性通过在补体激活的中间阶段分离细胞并将它们暴露于用蛋白酶处理的血浆或蛋白质而特异性测定。简而言之，用Nagaki et al的方法(1974，A New Method for the Preparation ofEAC14 cell with Human or Guinea-Pig Serum.Journal of ImmunologicalMethods 5：307-317.)将激活的红细胞终止在C1/C4b复合物阶段。购买的激活的红细胞(Diamedix Corp)如下洗涤3次，在2000rpm沉淀细胞，之后重悬于GGVB-TTHA(50％GVB0(Diamedix Corp.)+5％葡萄糖+5mM Ca-TTHA(等份的100mM CaCl2和100mM TTHA(Sigma))，并且在最后洗涤后以5×108细胞/mL重悬并储存于冰上。细胞与2.5体积的10％正常人血清(NHS；在GGVB-TTHA中制备并在30℃保温15分钟以保证Mg2+螯合)混合并在30℃保温5分钟。混合物用GGVB-TTHA洗2次，用GGVB-Ca(50％GVB0+5％葡萄糖+0.3mM CaCl2)洗2次，并用GGVB++(50％GVB0+5％葡萄糖+1mMMgCl2+0.15mM CaCl2)洗2次。在最后洗涤后，将细胞混合物在37℃保温2小时，每30分钟混合一次以避免细胞的过量沉积。保温的细胞混合物在GGVB++中洗1次并以1.5×108细胞/mL重悬。悬浮液在4℃储存直至1周。
在补体激活过程中，需要C1/C4b复合物裂解C2产生C3转变酶，并且所得的补体级联的其余部分的激活导致形成膜攻击复合物(MAC)和细胞裂解。为了评价蛋白酶对C2裂解的后果，将CB200，CB252，CB377任一的2X蛋白酶溶液系列稀释，这是将蛋白酶原液在GGVB++中稀释至2μM并在一不透明96孔测定板(Nunc)的11个孔中以1∶2系列稀释这一原液至最终蛋白酶浓度为0.2nM至2000nM。GGVB++缓冲液单独被加入到第12个孔中作为背景对照。用GGVB++稀释液制备C3耗竭血清(Sigma)的40％溶液。5微升系列稀释的2X蛋白酶(来自上述)与5μL稀释的C3耗竭血清混合并在37℃保温1小时。反应用GGVB++稀释至50μL并且加入50μL EAC14b细胞(1.5×108细胞/mL)。混合物在30℃保温6分钟以预形成C2复合物。向每孔中加入150μL在GGVB-EDTA(50％GVB0+5％葡萄糖+10mM EDTA)中1∶100稀释的C2耗竭血清。样品在温和振荡下于37℃保温1小时。2000rpm离心平板以沉淀细胞并将100μl上清转移至干净的96孔测定板中。在415nm读取光密度(OD)监测裂解的红细胞释放的血红蛋白。
结果表明与增加浓度的蛋白酶(CB200，CB252或CB377)预保温的C3耗竭血清当被加入以耗竭C2血清时导致含有预形成的C1/C4b的红细胞的溶血降低。每种测试的蛋白酶的影响是剂量依赖性的，在蛋白酶浓度为0.2nM至10nM时几乎无明显抑制，在增加蛋白酶浓度时发生相继抑制，在蛋白酶浓度为800nM或更高时几乎未观察到溶血。这些结果提示在蛋白酶存在下预保温含C2的血清不模拟补体激活和细胞裂解所需的由C1/C4b对C2的裂解。
实施例13
通过配对SDS-PAGE和溶血测定确定抑制性裂解位点
为了将补体成分的蛋白酶裂解与补体激活的抑制相关联，从Quidel和CompTech购买了纯化的补体因子。在PBST中将5μg每种蛋白质稀释至终浓度为5μM。支架或修饰的蛋白酶稀释至终浓度在0到500nM之间。样品在37℃保温1小时。取出0.5至1μg处理的补体成分并用PBST稀释至终体积为10μl。这一反应与250μl IgG激活的绵羊红细胞和5μl耗竭相应待测补体因子的培养基混合。溶液在室温保温45分钟。5000rpm离心细胞2分钟并将200μl上清转移至96孔微滴定板中，在415nm测量吸光度以确定从裂解的红细胞释放的血红蛋白。
根据针对PNGaseF的厂商方案(New England BioLabs)对剩余的4-4.5μg反应样品去糖基化。样品在4-12％Tris-甘氨酸梯度凝胶上经SDS-PAGE分离，之后用考马斯亮蓝染料染色。使用在Alpha Innotech成像仪上的光密度分析特征，确定每条带的面积并用于计算在整个分析过程中裂解的全长补体成分的百分比和所有主要降解产物的表观。
实施例14
通过在C2耗竭血清中溶血评价的C2裂解与补体失活的相关性
补体介导溶血的C2裂解的功能性结果在如实施例13所述的配对SDS-PAGE和溶血测定中评价。为了评价纯化补体因子导致的补体激活，从Quidel购买了纯化的C2和C2耗竭培养基。将0.5-1μg纯化的C2与10-500nM CB155蛋白酶在总体积10μl PBST中于37℃保温1小时。将完整反应与5μl耗竭待测C2补体因子的血浆一起加入到250μl IgG激活的绵羊红细胞中。将溶液置于室温45分钟。5000rpm离心细胞2分钟并将200μl上清转移到96孔微滴定板中，测定在415nm的吸光度以确定从裂解的红细胞释放的血红蛋白。
为了显现蛋白酶解产物，在4-12％Tris-甘氨酸凝胶上经SDS-PAGE分离20微升反应物或作为对照的纯化的补体C2(CompTech)，用考马斯蓝根据厂商方案染色凝胶而显现总蛋白。用凝胶光密度测定比较C2的裂解。C2的裂解以剂量依赖性方式发生，在500nM蛋白酶时C2发生几乎完全裂解。另外，溶血百分比随着蛋白酶浓度增加而降低。基于C2裂解产物的凝胶光密度分析得到的CB155的IC50是2.2nM。CB155在补加蛋白酶处理的C2的C2耗竭血清中的溶血的IC50是17nM。在体外，纯化的C2的完全降解是溶血中功能性降低所需的。
实施例15
通过ELISA检测C5b-9(膜攻击复合物)及MT-SP1或突变体对补体激活的作用
A.C5b-9ELISA
根据厂商方案进行C5b-9的ELISA(Quidel)。简而言之，在室温用SuperBlock(Pierce，Rockford，IL)再水合化用捕获抗体包被的微滴定板30分钟。在PBST中洗板，并且将20μl来自上述用80μl SuperBlock稀释的蛋白酶处理的补体刺激的血清溶液加入到微滴定板的孔中。板在室温保温1小时，然后在PBST中洗涤。加入100μl检测抗体-HRP缀合物溶液并保温平板1小时，然后在PBST中洗涤。最后，加入100μl底物溶液并且在室温保温平板15分钟以显色。为了终止显色反应，向每孔中加入100μl终止溶液，根据厂商方案测量450/650nm的吸收值。
B.野生型MT-SP1(CB200)，CB155或CB42对补体激活的作用
为了检测补体激活，将用柠檬酸钠作为抗凝剂的人血浆(InnovativeResearch，Inc.，Southfield，MI)在含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中稀释至终浓度为20％(10μl血清于40μl PBST中)，向其中加入野生型MT-SP1，CB155或CB42至终浓度为0-5μM。溶液在37℃保温15分钟。经典途径的激活和旁路途径的激活通过添加脂多糖(IgG或LPS，各为1mg/ml终浓度，Sigma)而起始。反应在37℃保温30分钟。通过添加Pefabloc(Roche)至终浓度为1mg/ml和EDTA至终浓度为50mM而猝灭反应。用20μl所述终溶液进行后续ELISA。如上述部分A进行ELISA。
测定了每种蛋白酶的C5b-9生成的IC50。对于野生型MT-SP1、CB155和CB42测定的经典途径激活后的IC50分别是103nm、47nm和23nm。对于野生型MT-SP1、CB155和CB42旁路途径激活后的IC50测定分别为195nm、84nm和41nm。
实施例16
在总补体系统筛选中野生型MT-SP1(CB200)，CB252或CB377对补体激活的作用
为了评价MT-SP1或突变体MT-SP1蛋白酶对经典、MBL或旁路补体途径的影响，将9μl人柠檬酸化血浆(Innovative Research)与1μl CB200，CB252或CB377蛋白酶在37℃保温1小时，蛋白酶终浓度为1μM。用TotalComplement System Screen Classical，Lectin，Alternative Pathways根据厂商方案(WiesLab；Sweden)评价了每个反应的补体激活作用。在这一测定中，由厂商提供的微滴定条的孔用经典、旁路或MBL(凝集素)途径的特异激活物包被。反应在由厂商提供的合适缓冲液中稀释以获得针对每一途径的血浆浓度，反应如厂商规定进行保温。对于经典途径，血浆样品在稀释剂CP中稀释并在分析前置于室温最多60分钟。对于凝集素途径，血浆样品在稀释剂LP中稀释并在分析前在室温保温超过15分钟但低于60分钟。对于旁路途径，血浆样品在稀释剂AP中保温并在分析前置于室温最多60分钟。向微滴定板中以100μl/孔一式二份加入样品。平板在37℃保温60-70分钟。在血清保温后，将微滴定板的孔用300μl洗涤溶液洗3次。在最后一次洗涤后，通过将平板在吸收性纸巾上轻叩而除去过量的洗涤缓冲液。通过检测C5b-9评价每一样品中的补体激活。将100μl含有碱性磷酸酶标记的C5b-9抗体的缀合物加入到每孔中并且将平板在室温保温30分钟。为了显色反应，将100μl底物溶液加入到每孔中并将平板在室温保温30分钟。反应通过以100μl/孔加入5mM EDTA而终止。用微滴定板读数器在405nm读取吸光度。通过比较样品的OD405值和无蛋白酶对照样品而确定产生的sC5b-9级分。
结果表明在由经典和MBL途径诱导的补体激活时产生的C5b-9级分在所测试的每种蛋白酶(CB200，CB252或CB377)的存在下几乎被完全抑制。相反，当补体激活由旁路途径诱导时，观察到C5b-9生成几乎不被所测试的任何蛋白酶抑制。由于经典和MBL途径需要C2，但是旁路途径不需要，因此这些结果提示经典和MBL途径的抑制是由于C2裂解所致。这一结果与观察到当每种测试的蛋白酶(CB200，CB252和CB377)与C2预保温时抑制溶血(见实施例8.b)一致。
实施例17
SLGR或GLAR相对于RQAR底物的优先裂解的筛选
用相应于所希望裂解序列的各个肽底物测定了与由底物文库确定的匹配所希望特异性谱的修饰的蛋白酶以确定特异性的量级变化。设计了一个天然靶底物：Ac-RQAR-AMC，其包括MT-SP1自身活化位点；设计了两个希望的底物裂解序列：Ac-SLGR-AMC(C2裂解位点)和Ac-GLAR-AMC(C3裂解位点)。
在Costar 96 well black half-area测定板中的孔中，底物在50μl总体积的MT-SP1活性缓冲液中被稀释成1mM和2μM之间的一系列12个浓度。将溶液加热至30℃5分钟，向测定孔中加入50μl蛋白酶溶液(野生型MT-SP1，CB42或CB155)。在荧光分光光度计(Molecular Devices Gemini XPS)中以激发波长380nm、发射波长450nm和使用435nm截断值滤镜测量荧光。荧光增加速率在30分钟内测量，以30秒间隔取读数。通过底物浓度倒数针对底物裂解速率倒数作图并拟合于Lineweaver-Burk等式(1/速率＝(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax；其中Vmax＝[E]*kcat)而计算动力学常数kcat，Km和kcat/Km(特异性常数)。野生型MT-SP1(CB200)，CB42和CB155蛋白酶分别以1.9×106，1.8×106和9.1×104M-1s-1切割Ac-RQAR-AMC底物。野生型MT-SP1(CB200)，CB42和CB155蛋白酶分别以2.0×104，5.9×104，3.7×103M-1s-1切割Ac-SLGR-AMC底物。野生型MT-SP1(CB200)，CB42和CB155蛋白酶分别以6.4×104，6.3×104和3.5×103M-1s-1切割Ac-GLAR-AMC底物。
实施例18
各个底物对全长蛋白的裂解筛选
通过比较特异性常数(kcat/km)确定了野生型或修饰的蛋白酶对底物裂解序列和全长补体蛋白的特异性以测量底物被特定蛋白切割的程度。设计了含有C2裂解序列的肽底物裂解序列：Ac-SLGR-AMC。如实施例17所述通过将底物裂解序列与蛋白酶(野生型MT-SP1(CB200)，CB42或CB155)保温而确定裂解的特异性常数(kcat/Km)并且确定了荧光增加的速率。
在凝胶中用动力学确定靶补体蛋白C2的特异性常数。C2靶蛋白的裂解动力学通过在存在少量蛋白酶时随时间经SDS-PAGE检测靶耗竭而测定。为进行这一测定，在MTSP活性缓冲液中将5mM C2与10nM蛋白酶(野生型MT-SP1(CB200)，CB42或CB155)在37℃保温5小时。在0、10、20、40、60、100、200和300分钟取等份并立即在还原剂中稀释和煮沸。样品用PNGase F(New England BioLabs)处理，经SDS-PAGE分离并用考马斯亮蓝染色。全长蛋白带的密度用Alpha Innotech Gel成像仪确定。特异性常数kcat/Km通过用等式：密度＝exp(-1*时间*[酶]*kcat/Km)非线性拟合由积分密度值对时间作图产生的曲线而确定。
结果显示底物肽序列和全长蛋白质被蛋白酶裂解的特异性常数呈现类似的模式。CB200野生型MT-SP1显示出几乎相同的底物肽序列和C2全长蛋白的裂解的特异性常数，而CB42和CB155在它们的特异性常数中显示出轻微的差异。由CB200，CB42和CB155裂解Ac-SLGR-AMC底物序列的特异性常数分别是2.0×104，5.9×104和3,7×103M-1s-1。由CB200，CB42和CB155裂解C2蛋白的特异性常数分别是1.95×104，3.60×104和7.20×104M-1s-1。
实施例19
猕猴溶血方案
猕猴补体系统在蛋白酶处理后的功能活性也可以用修改的溶血测定评价。
A.鸡红细胞的致敏
鸡红细胞分离自鸡Alsevers(来自鸡的全血与alsevers溶液的50％混合物，其含有抗凝剂，Colorado Serum Company，CO)。通过温和上下吸取重悬细胞直至无可见细胞沉淀并将50μl细胞稀释进1ml GVB++缓冲液。根据每一实验所需放大细胞体积，假定每孔10μl最终的1ml悬液需要加到每孔中从而50μl细胞的稀释液足够用于一个平板。通过在台式离心机中以2500rpm在4℃离心细胞1分钟，弃去上清，并通过温和上下吸取将细胞重悬于1ml GVB++中而洗涤细胞。洗涤步骤再重复2次或直至上清在最后一次离心后完全澄清。将1μl抗鸡红细胞抗体(Fitzgerald industries)加入以致敏细胞。在抗体-细胞悬液混合后，将溶液在冰上保温最少15分钟，然后在台式离心机中在4℃以2000rpm离心2分钟。弃去上清并将致敏的细胞重悬于1mL GVB++中，通过在2000rpm离心1分钟而洗涤细胞2次直至上清澄清。在最后洗涤后，将细胞沉淀重悬于终体积1ml GVB++中并将细胞以10∶50在GVB++中稀释(即1ml重悬的致敏细胞和5mL GVB++总体积为6ml)。鸡细胞用抗体的致敏在实验当天新鲜进行。致敏的细胞不保存过夜。
B.来自体内药物动力学(PD)实验的溶血测定
对于得自在致敏红细胞存在下蛋白酶处理的动物或载体对照(无蛋白酶)处理的动物的每一血浆样品建立终浓度为1％、2.5％和10％血浆的溶血反应。对于每一样品还平行设立了不含添加的浓缩致敏红细胞的吸光度对照。所有反应均在具有point divots的不透明平板中建立。对于1％血浆样品，用10μl致敏的红细胞，89μl GVB++和1μl来自蛋白酶或无蛋白酶处理的动物的血浆建立溶血样品(一式二份)；并且用99μl GVB++和1μl来自蛋白酶处理的动物的血浆建立相应的吸光度对照。对于2.5％血浆样品，用10μl致敏红细胞，87μlGVB++和2.5μl来自蛋白酶或无蛋白酶处理的动物的血浆建立溶血样品(一式二份)；并且用97μl GVB++和2.5μl来自蛋白酶处理的动物的血浆建立相应的吸光度对照。对于10％血浆样品，用10μl致敏红细胞，80μl GVB++和10μl来自蛋白酶或无蛋白酶处理的动物的血浆建立溶血样品(一式二份)；并且用90μl GVB++和10μl来自蛋白酶处理的动物的血浆建立相应的吸光度对照。平板在振荡下于37℃保温30分钟。以2000rpm离心细胞5分钟以沉淀未破裂的细胞，并取80μl上清置于干净的96孔圆底微滴定板中。要小心操作因为样品有时是凝胶状的。标注呈凝胶状的样品。上清转移的平板在2500rpm离心5分钟以除去气泡。重复离心直至无气泡存在或者用18G针挑破剩余气泡。通过在Biorad Microplate Reader Model680上读取415nm的吸光度而监测从裂解的红细胞释放的血红蛋白。如果吸光度大于1，则样品在GVB++中1∶3稀释并再次读数(即20μl加入到40μlGVB++中)。溶血分数如下计算：从相应的溶血孔中减去来自吸光度对照样品的吸光度，然后用实验样品除以无蛋白酶载体对照样品。通过以OD415nm值作为蛋白酶浓度的函数作图而确定ED50值。
C.体外滴定溶血测定
为进行用猕猴血浆体外滴定蛋白酶，将终反应体积为10％的蛋白酶与购买的猕猴血浆保温(即在聚丙烯96孔板中，将2μl蛋白酶溶液加入到18μl猕猴血浆中)以给出范围为20μM至0.156μM的最终蛋白酶浓度用于IC50滴定方案以及90％血浆浓度。无蛋白酶(18μl血浆和2μl GVB/Mg/EGTA)以及背景(仅20μl GVB/Mg/EGTA)对照也包括在测定中。反应在室温保温1小时。蛋白酶与90％血浆预保温后，如上述B部分进行溶血。在体外溶血滴定中未包括吸光度对照。
实施例20
小鼠溶血方案
A.来自体内药物动力学(PD)实验的溶血测定
蛋白酶处理后小鼠补体系统的功能活性也可以用修改的溶血测定评价。用于小鼠溶血方案中的红细胞也是如实施例19、A部分所述致敏的鸡红细胞。对于得自在致敏红细胞存在下蛋白酶处理的动物或载体对照(无蛋白酶)处理的动物的每一血浆样品，建立终浓度为40％血浆的溶血反应。对于血浆浓度一半(20％血浆)的每一样品平行建立无添加的浓缩致敏红细胞的吸光度对照，从而在如下分析中从溶血值中减去吸光度对照值2次。通过向每孔加入60μl浓缩致敏红细胞和40μl来自蛋白酶或无蛋白酶处理的动物的血浆而在具有divots的不透明平板中一式二份(如果足够血浆允许)建立溶血样品。通过向每孔中加入80μl GVB++和20μl来自蛋白酶或无蛋白酶处理的动物的小鼠血浆而建立相应的吸光度对照。平板在振荡下于37℃保温1小时。细胞在2000rpm离心5分钟以沉淀未破裂的细胞，取50μl上清置于干净的96孔圆底微滴定板中。要小心操作因为样品有时是凝胶状的。标注呈凝胶状的样品。上清转移的平板在2500rpm离心5分钟以除去气泡。重复离心直至无气泡存在或者用18G针挑破剩余气泡。通过读取415nm的吸光度而监测从裂解红细胞释放的血红蛋白。如果吸光度大于1，则样品在GVB++中1∶3稀释并再次读数(即20μl样品加入到40μlGVB++中)。溶血分数如下计算：从相应的溶血孔中减去2倍的来自吸光度对照样品的吸光度，然后用实验样品除以无蛋白酶载体对照。通过以OD415nm值作为蛋白酶浓度的函数作图而确定ED50值。
B.体外滴定溶血测定
为用小鼠血浆体外滴定蛋白酶，将终反应体积为10％的蛋白酶与购买的小鼠血浆或内部(in-house)对照血浆保温(即在聚丙烯96孔板中，将2μl蛋白酶溶液加入到18μl血浆中)以给出范围为20μM至0.156μM的最终蛋白酶浓度用于IC50滴定方案以及90％血浆浓度。无蛋白酶(18μl血浆和2μl GVB/Mg/EGTA)以及背景(仅20μl GVB/Mg/EGTA)对照也包括在测定中。反应在室温保温1小时。蛋白酶与90％血浆预保温后，如上述A部分进行溶血。在体外溶血滴定中未包括吸光度对照。
实施例21
经典C3b沉积ELISA
为检测和定量C3b沉积，96孔Maxisorp板(Nunc)用100μl/孔0.5％卵白蛋白在37℃包被2小时或在4℃包被过夜。用Molecular DevicesSkanWasher 300 Version B用250μl PBST洗板3次。板用100μl/孔在PBS中1∶1000稀释的兔抗鸡卵白蛋白抗体(MP Biomedicals)包被。板在室温保温1小时或在4℃保温过夜，之后用PBST洗3次。板用200μl封闭缓冲液(30％BSA溶液；Serologicals)封闭，并在室温振荡板1小时。在用PBST洗3次后，将100μl在GVB++(维罗那(巴比妥)-缓冲盐水，pH 7.4，含有142mM NaCl，4.9mM维罗那钠，0.1％明胶，0.15mM CaCl2和1mM MgCl2；Comptech)中稀释至希望的百分比(即1％，10％)的血浆样品加到每孔中，板在室温振荡30分钟。用PBST洗孔3次。在封闭缓冲液中1∶4000稀释的山羊抗人C3b抗体(Quidel)以100μl体积加入到孔中，板在室温振荡1小时。用PBST洗涤后，100μl在封闭缓冲液中1∶8000稀释的HRP-兔抗山羊缀合抗体(Zymed)被加入到孔中并在室温振荡保温1小时。孔用PBST洗涤，根据厂商指导通过加入100μl TMB底物(Pierce)而显色ELISA。加入100μl 2M H2SO4终止反应并在SpectraMax M5平板读数器(Molecular Devices)上读405nm吸光度。
实施例22
蛋白酶的小鼠药物动力学(PD)分析
A.CB450的药物动力学
小鼠(每剂n＝6)被静脉注射各种剂量范围的CB450(0mg/kg，2.5mg/kg，5mg/kg，10mg/kg和15mg/kg)注射剂(bolus)。在注射5分钟后经心脏穿刺从处理的小鼠收集血浆。来自不同处理组的血浆样品的补体活性通过实施例20所述的溶血测定或通过由实施例21所述的C3b ELISA确定的C3b沉积而测试。
溶血实验结果显示，如由415nm的吸光度水平所确定的，来自CB450处理的小鼠的小鼠血浆诱导剂量依赖性的红细胞溶血降低。在这一测定中，来自无蛋白酶处理的小鼠的血浆样品诱导溶血，415nm吸光度约为0.23，在2.5mg/kg CB450处理组降至约0.1，在来自5，20或15mg/kg CB450处理的小鼠的样品中几乎无可检测到的吸光度信号。
C3b ELISA用来自每个处理组的1％或10％血浆进行。来自无蛋白酶处理样品的溶血分数设为1.0，由此确定所有实验样品的溶血分数。因此，对于用无蛋白酶处理的小鼠的1％和10％血浆样品，C3b沉积分数测定为1。在10％血浆样品上的C3b ELISA结果表明来自用增加剂量的CB450处理的小鼠的血浆在2.5，5或10mg/kg的CB450剂量与无蛋白酶处理样品相比C3b水平无可测量差异，但是用15mg/kg处理的小鼠显示C3b沉积分数降低，其测得为约0.40。在1％血浆样品上的C3b ELISA的结果显示来自用CB450处理的小鼠的血浆与无蛋白酶处理的血浆样品相比在C3b沉积分数中有剂量依赖性降低，这与溶血实验中观察到的结果一致。来自用2.5mg/kg CB450处理的小鼠的血浆样品显示降低的C3b沉积，其测量为约0.40，而来自用5，20或15mg/kg CB450处理的小鼠的血浆显示几乎无可检测的C3b。
B.一组MT-SP1蛋白酶突变体的药物动力学
小鼠用增加浓度的一组MT-SP1突变体注射剂静脉注射，所述组包括CB200(野生型)，CB238，CB245，CB252，CB255，CB257，CB268，CB351，CB377，CB409，CB422，CB450，CB464和CB473。在注射5分钟后经心脏穿刺从处理的小鼠收集血浆。来自不同处理组的血浆样品的补体活性通过实施例19所述的溶血测定或通过由实施例20所述的C3b ELISA(在1％和10％血浆中测得)确定的C3b沉积测试。结果作为蛋白酶浓度的函数作图以确定ED50值。结果的总结见表26。该表还示出了蛋白酶的最大耐受剂量(MTD)以及作为MTD与ED50之比计算的治疗指数(TI)。结果显示出一些测试的蛋白酶的体内效力的差异。
Figure A20068004790001781
Figure A20068004790001791
实施例23
蛋白酶的大鼠药物动力学(PD)分析
A.CB252和CB377
用CB252(23mg/kg)注射剂静脉注射大鼠随后以3.3mg/kg/hr输注1小时，或者用CB377(18mg/kg)注射剂静脉注射大鼠随后以1.8mg/kg/hr输注1小时。本研究中还包括用载体对照处理的大鼠。在注射后不同时间点收集血浆(其中t＝0是注射前；即0，5，15，30，60或120分钟)，并如实施例9所述通过Western印迹测定C2裂解(例外是仅使用1.5μl血浆)来分析补体活性以及使用如实施例19所述的猕猴溶血方案用1％或10％大鼠血浆分析溶血。
结果表明在来自CB252和CB377处理的大鼠的血浆中C2裂解增加。CB252显示更高的C2裂解，因为甚至在注射后仅5分钟通过Western印迹评价血浆样品中几乎没有可检测到的C2，在注射后60或120分钟无可检测到的C2存在。CB377也在早期时间点显示了与载体对照相比减少的C2水平，但是到60分钟和120分钟，C2水平与来自载体对照样品的水平相当。
由来自处理的大鼠的10％血浆诱导的溶血结果显示来自CB377的血浆与载体对照相比对溶血抑制无作用，而来自CB252的血浆显示出明显的溶血抑制。在注射后5、15、30和60分钟收集的来自用CB252处理的大鼠的血浆样品显示几乎无可检测到的溶血。在后面的时间点(即到90分钟和120分钟)溶血被来自CB252处理的小鼠的血浆增加至与载体对照相当的水平。当溶血被来自每种处理的大鼠的1％血浆诱导时，CB252和CB377的作用更显著。被来自载体对照大鼠的1％血浆诱导的溶血分数(针对t-＝0时间点载体对照样品设为1.0)在所测试的时间点无变化并且总是在约1.0附近。来自用CB252处理的大鼠的血浆在任何收集的时间点均不诱导可检测的溶血。来自CB377处理的大鼠的血浆在全部时间点也显示与来自载体对照处理的动物的血浆相比降低的溶血，但是比来自CB252处理的大鼠的血浆程度低。与血浆对照处理的小鼠相比，在注射CB377后15分钟收集的血浆中溶血被降低至最大程度，报道的溶血分数约为0.2，并且在注射后更长时间点稳定增加至在注射后120分钟约为0.6。
B.CB200，CB155和CB42的比较
大鼠被静脉注射2mg/kg，10mg/kg和25mg/kg的CB200(野生型)，CB155和CB42注射剂。在注射后各时间点收集血浆(其中t＝0是注射前)直至注射后约1380分钟，并用实施例19所述的猕猴溶血方案用1％血浆测定溶血而分析补体活性。结果表明来自用2mg/kg和10mg/kg CB200或CB42处理的大鼠的血浆展现与在注射蛋白酶前t＝0时观察到的水平相当的溶血水平。来自用25mg/kg CB200或CB42处理的大鼠的血浆在早期时间点诱导降低的红细胞溶血，在注射蛋白酶后直至约60分钟的时间点观察到几乎无溶血。从注射CB200或CB42后1380分钟收集的血浆样品的溶血增加至与t＝0注射蛋白酶前的溶血相当的水平。然而，来自CB155处理的大鼠的血浆在所有测试的剂量均显示降低的溶血。与t＝0注射蛋白酶前相比，用2mg/kg或10mg/kg处理大鼠显示出由在早期时间点收集的血浆诱导的稍稍但可再现的降低的溶血。与t＝0(无蛋白酶)血浆样品的约0.45相比，在大鼠接受2mg/kg或10mg/kg剂量的CB155后约30分钟收集的血浆样品导致观察到的溶血OD415分别为约0.3或0.25。在注射2mg/kg和10mg/kg CB155后240分钟或更长时间收集的血浆诱导的溶血水平与从t＝0处理的动物观察到的水平相当。来自用25mg/kg CB155处理的大鼠的血浆在早期时间点诱导降低的红细胞溶血，到蛋白酶注射后直至约240分钟的时间点几乎未观察到溶血。在注射CB155后1380分钟收集的血浆样品中溶血增加至与t＝0蛋白酶注射前的溶血相当的水平。这些结果表明CB155对补体失活的体内药物动力学功效比这一实验中评价的CB200和CB42要高。
实施例24
蛋白酶的猕猴药物动力学(PD)分析
A.CB252猕猴离体补体抑制
2只未进行过实验的雄性猕猴和2只未进行过实验的雌性猕猴(处理开始时约2.2-4.4kg，年龄为2-4岁)被分配到一个处理组。每只动物用独特的身份编号永久纹身并在给药前进行14天驯化期。研究动物被静脉给予1和3mg/ml剂量的体积为5mg/kg的CB252。用于离体药物动力学分析的血样在规定的时间点收集(注射前，即t＝0；注射后5分钟、30分钟和60分钟)。从受限制的有意识动物的周围静脉经静脉穿刺收集血液。从剩下的动物收集血样用作基线值。将约1ml血液转移至用肝素锂处理的试管中，置于冰上，然后在收集30分钟内以2000g于4℃离心15分钟。获得的血浆被分成大致相等的两等份，然后转移至在干冰上冷冻的冻存管(cyrovials)中。样品在融化分析前在约-60℃或更冷温度储存。如下测试了血浆样品对补体激活的作用，经Western印迹测定C2裂解，在1％和10％血浆浓度经ELISA测定C3b沉积，以及通过在1％，2.5％和10％血浆的致敏鸡红细胞溶血测定。
1.C2裂解
如实施例9所述经Western印迹评价血浆样品中的C2裂解，做如下修改：分析中使用1μl血浆，所述血浆与NuPAGE LDS样品缓冲液和样品还原剂(Invitrogen)煮沸5分钟；山羊抗人C2在5％奶粉/TBST中1∶2000稀释；HRP缀合的抗山羊二抗在5％奶粉/TBST中1∶4000稀释。结果表明来自用1或3mg/kg CB252静脉内推注给药的猕猴的离体血浆仅在3mg/kg产生C2的部分裂解。来自用1mg/kg CB252处理的猴的血浆没有可分辨的C2裂解。从用3mg/kg CB252处理的猴收集的血浆对于所有三个提供血浆样品的动物均观察到显著的C2裂解。由C2 Western印迹的光密度分析确定的C2降解的平均程度在5分钟是60％降解，在30分钟是50％降解，在60分钟是40％降解。由来自用3mg/kg CB252处理的所有动物的血浆中的C2裂解评价的补体抑制百分比见下表27。
Figure A20068004790001811
2.C3b沉积
血浆样品中的C3b沉积如实施例21所述经ELISA评价。在C3b沉积测定中，在任何测定时间点对于任何动物，在来自用1mg/kg CB252给药的猴的血浆样品中未观察到明显补体抑制。在3mg/kg剂量的CB252，在10％血浆，在5分钟时间点C3b沉积平均被抑制约50％，在30分钟时间点为30％，在60分钟为15％。当在1％血浆中测量时观察到被CB252抑制的水平更高。对3mg/kg剂量的CB252，在1％血浆，在5分钟C3b沉积平均被抑制约70％，在30分钟为55％，在60分钟为50％。由在来自用3mg/kg CB252处理的所有动物的血浆中的C3b沉积评价的补体抑制百分比见下表28。
Figure A20068004790001821
3.溶血
在实施例19所述的致敏鸡红细胞(RBC)溶血测定中评价了溶血。结果表明，对于任何动物、任何测定时间点，来自用1mg/kg剂量的CB252处理的猴的血浆不显示对致敏鸡RBC的溶血具有可观察到的作用。来自用3mg/kg CB252处理的猴的血浆样品在各种测定时间点均显示显著的溶血抑制，在1％，2.5％和10％血浆观察到抑制。在10％血浆中，来自用3mg/kgCB252处理的猴的血浆在5分钟显示平均80％的溶血抑制，在30分钟为45％抑制，在60分钟为25％抑制。在2.5％血浆中，来自用3mg/kg CB252处理的猴的血浆在5分钟显示平均92％的溶血抑制，在30分钟为80％抑制，在60分钟为65％抑制。在1％血浆中，来自用3mg/kg CB252处理的猴的血浆在5分钟显示平均99％的溶血抑制，在30分钟为98％抑制，在60分钟为90％抑制。由在来自用3mg/kg CB252处理的所有动物的血浆导致的鸡RBC溶血评价的补体抑制百分比见下表29。
Figure A20068004790001831
ND：未测定
总之，通过C2降解、C3b沉积ELISA或致敏鸡红细胞的溶血测量，来自用单次静脉推注1mg/kg CB252处理的猴的猕猴血浆不显示显著的补体抑制。来自用单次静脉推注3mg/kg CB252处理的猴的猕猴血浆确实显示在5分钟和30分钟时间点的所有离体补体测定的显著抑制。在最不严格的测定水平，1％血浆于C3b沉积ELISA和1％溶血，显著抑制持续至60分钟时间点。
B.在猕猴中CB252与其它MT-SP1突变体相比的药物动力学功效
以1mg/kg和3mg/kg蛋白酶静脉推注CB252或CB377给猴。在注射后各个时间点收集血浆(其中t＝0是注射前；即0，5，30和60分钟)，并如实施例9所述通过Western印迹测定C2裂解来分析补体活性以及用实施例19所述的猕猴溶血方案用1％、2.5％或10％猴血浆分析溶血。
结果表明在用3mg/ml蛋白酶处理后，在来自CB252和CB377处理的猴的血浆中C2裂解增加，但用1mg/kg蛋白酶处理后则不是。从用3mg/kgCB252和CB377蛋白酶处理的猴收集的血浆显示时间依赖性C2裂解，最大C2裂解发生在蛋白酶处理后5分钟从猴收集的血浆中，在后来的时间点裂解降低。结果还显示在所有测试的时间点与CB377处理的猴相比在从CB252处理的猴收集的血浆中发生更高的C2裂解。
溶血实验结果与C2裂解结果相关，因为与由来自未用蛋白酶处理的猴的血浆诱导的溶血相比(即t＝0)，在任何收集的时间点在由来自用1mg/kgCB252或CB377蛋白酶处理的猴的2.5％血浆或10％血浆诱导的溶血中没有观察到差异。结果还表明用来自用3mg/kg CB252或CB377处理的猴的2.5％或10％血浆观察到的溶血是类似的。在这些测定条件下，来自用3mg/kgCB377处理的猴的血浆与来自t＝0的血浆相比仅显示红细胞溶血的轻微降低。在t＝0时的溶血分数设为1.0，来自CB377处理的猴的血浆观察到的溶血分数在所有测试的时间点均为约0.7。在这一实验中CB252比CB377显著更强效。在注射后5分钟收集的来自用3mg/kg CB252处理的猴的血浆未诱导可检测到的红细胞溶血，观察到的溶血分数为0或接近0。CB252对溶血的作用是时间依赖性的，因为从来自用3mg/kg CB252处理的猴的血浆诱导的溶血分数在分别于30分钟和60分钟收集自CB252处理的猴的血浆中增加至约0.4和约0.7。
在另一个实验中，在给予猕猴时比较了蛋白酶CB238、CB252和CB377的药物动力学功效。用每种蛋白酶最大耐受剂量(MTD)(即分别为2mg/kg，3mg/kg和3mg/kg)给猴静脉推注CB238，CB252或CB377。在注射后各时间点收集血浆(其中t＝0是注射前；即0，5，30和60分钟)，并如下分析补体活性，用实施例19描述的猕猴溶血方案使用2.5％或10％猴血浆测定支持鸡红细胞溶血的能力。通过与收集自t＝0猴的2.5％或10％血浆诱导的溶血相比确定％溶血抑制。结果见下表30。
Figure A20068004790001841
实施例25
在兔心脏中离体检查蛋白酶的补体介导的心血管作用
用Langendorff测定检查兔心脏中的心脏损伤而离体评价了蛋白酶对于补体介导的损伤的作用。对于分离心脏的研究使得能同时观察化合物的血液动力学、心电图和电生理学作用。新西兰白兔被用于这项研究因为兔Iκr通道的氨基酸序列与人Iκr通道序列有99％同源性(Wymore et al.(1997)Circ Res.，80：261-268)。兔已被广泛用于心血管研究并且是模拟对人心脏的潜在作用的合适物种，因为兔心脏动作电位(类似于人类心脏动作电位)似乎由Iκr强驱动(Weirich et al.(1998)Basic Res Cardiol.，93：125-132；Carmeliet et al.(1992)J Pharmacol Exp Ther.，262：809-817)。另外，人血浆与兔心脏组织之间的相互作用在先前已经被鉴定并且已经示出主要是补体介导的(Kilgore et al.(1998)J Pharmacol Exp.Ther.，285：987-94)。例如，人血浆与外源兔心脏表面的接触激活补体，补体随后介导对心肌的损害，最终导致无收缩。因此，这一模型适于确定补体抑制剂如靶向一或多个补体成分的蛋白酶或修饰的蛋白酶的功效。
A.实验设计和方法
兔经击昏进行安乐死，随后进行心脏切除术。快速取出心脏，置于Langendorff装置上，用改良的并加氧的Krebs-Henseleit缓冲液灌注(37℃；Krebs-Henseleit缓冲液：118.1mM NaCl，4.7mM KCl，1.17mM MgSO4，1.18mM KH2PO4，11.1mM d-葡萄糖，2.5mM CaCl2，24.8mM NaHCO3和2.0mM丙酮酸；通过添加2.5g牛血清白蛋白/1000ml灌注介质而改良；经压缩氧气/二氧化碳(95％/5％)而加氧)。用在心耳的荷包缝合术将心室引流和充液乳胶气囊绑定在左心室。绑定肺动脉引流。通过置于右心房上的起搏电极起搏心脏。如果在整个平衡期间心脏显示出可接受的血液动力学参数(例如，dP/dT＞1000mm Hg/sec)，则视作这些心脏可用于这项研究。
蛋白酶测试化合物(终浓度为1μM)与保温介质(含有在灌注缓冲液中稀释至50％的人血浆；即12ml人血浆稀释进12ml灌注介质)在37℃保温1小时。保温后，将测试化合物混合物加入到实验灌注介质中，重循环，以给出在300ml总体积中最终血清浓度约为4-6％。先用灌注介质平衡10-15分钟随后收集基线测量值10分钟的分离的兔心脏被暴露于含有保温的测试化合物混合物的灌注介质约1小时，如下所述连续收集测量值。如果发生不可逆心室纤颤则终止实验。如果在启动90秒内心脏不自发恢复则认为心室纤颤是不可逆的。在暴露于测试化合物后，将心脏在O.C.T.固定，在干冰上冷冻，然后在冰箱中于-80℃储存用于免疫组织化学评价。
1.血液动力学测量
将左心室(LV)中的乳胶气囊用水扩大以达到约5mmHg的LV舒张期末压(LVEDP)。用管线将气囊与压力传感器连接以测量LEPD，LV舒张压(LVDP)和LV收缩压(LVSP)。用连接至主动脉插管的侧臂端口(side-armport)的压力传感器测量冠状动脉灌注。用Notocord HEM(Kalamazoo，MI)v3.5数据捕获系统连续监测血液动力学测量。用数字标识器指示测试化合物暴露时间。LVDP被定义为LVEDP和LVSP之间的差异。测量LV压的最大增加速率(+dP/dt)和LV压的最小降低速率(-dP/dt)，以分别作为LVEDP至LVSP和LVSP至LVEDP的时间的一阶导数。还测量了冠状动脉灌注压(CPP)。
来自平衡期最后一分钟(0分钟)和测试化合物暴露的那个小时期间内每15分钟期间的最后1分钟(即15分钟、30分钟、45分钟、60分钟)中的血液动力学测量被评价并用于确定测试化合物的作用。取自未被异位心博干扰打断的5个连续心动周期的平均值被用于分析血液动力学参数。来自每个个体心脏的值被合并以确定各个浓度下每个变量的平均值。基线和每一浓度之间每一变量的平均变化百分比也被测定。使用重复测量方差分析(ANOVA)及随后的当证实后用于组比较的post-hoc检验而检查每一测试化合物对血液动力学参数作用的统计学显著性。p＜0.05被认为是统计学显著的。数据以平均值±SEM表示或当合适时以基线变化百分比表示。
2.肌酸激酶浓度分析
在每个15分钟测试期间即将结束前收集来自肺动脉引流的约2.0ml灌注介质。在实验早期终止(例如由于心室纤颤所致)之前，取样进行分析。样品在干冰上冷冻，然后-80℃储存在冰箱中留待分析。
B.实验结果
1微摩尔CB200，CB155或CB42与在灌注介质中稀释至50％的人血浆在37℃预保温1小时。然后将蛋白酶测试化合物混合物稀释至终浓度为6％血浆并灌注到分离的兔心脏上以诱导补体激活，基于血液动力学测量确定蛋白酶对补体激活的作用。用热失活血浆灌注心脏作为阴性对照。LV压最大增加速率(+dP/dt)在基线(0分钟)和用测试化合物蛋白酶灌注后15、30、45和60分钟测定。结果显示血浆单独诱导了LV压增加速率下降，表明对心肌的损害。+dP/dt从基线值降低了约5倍，并且在所有测试时间点均是相似的。相反，先被热失活的血浆显示与在基线观察到的相比+dP/dt值无变化，表明无补体激活。用蛋白酶测试化合物灌注兔心脏保护心脏免于补体介导的损伤。CB42和CB155给出对心脏功能的完全保护，这由在所有测量的时间点+dP/dt值与基线水平相当而表明。然而，CB200(野生型)在这一模型中仅给出对心脏功能的部分保护。在用CB200灌注后15分钟，观察到的心脏功能表明几乎完全的保护，其中+dP/dt值与基线水平相当。到30分钟时，CB200显示出对心脏功能几乎无保护，观察到+dP/dt值降低高过3倍，接近仅用血浆处理兔心脏所观察到的水平。在CB200存在下灌注的兔中的LV压水平的增加速率在45和60分钟仍很低，表明在这些时间点的心脏损害。
实施例26
修饰的MT-SP1 CB238在摇瓶中的表达和纯化
如实施例1和2所述克隆CB238和相关重组MT-SP1突变体或野生型MT-SP1并在大肠杆菌中作为包涵体表达。通过优化MT-SP1突变体CB238的生产而使MT-SP1或突变体的生产适应于实验室规模，优化是集合约44个1L摇瓶以用于随后分离包涵体沉淀以增溶并重折叠。简而言之，将1μl质粒DNA(来自DNA微量制备纯化)与50μl BL-21细胞混合。细胞与质粒DNA在冰上保温30分钟，然后在42℃热休克45秒。之后将细胞在冰上保温2分钟以恢复。向细胞加入500μl LB(LB；Difco LB Broth Lennox，大概配方每升：10.0g胰胨，10.0g酵母提取物，5.0g氯化钠)，培养物在37℃于振荡下保温1小时。然后将50μl细胞在含有用于选择的50μg/ml羧苄青霉素的琼脂板上铺板。平板在37℃保温16-18小时。
25ml含有50μg/ml羧苄青霉素的LB被接种一个单菌落并生长直至完全铺满。将0.5ml所述种子培养物加入到800ml含有10μg/ml羧苄青霉素的2XYT中并培养过夜(～12-16小时，约44个摇瓶)。在Sorvall转子#SLC4000中于6,000xg离心收获细胞。集合细胞沉淀并称重。从35.2L大肠杆菌培养物中获得了320g湿细胞沉淀。将600ml含有50mM磷酸钾(KPO4)pH 7.4和300mM氯化钠(NaCl)的缓冲液加入到细胞沉淀中。细胞完全重悬后，将细胞分成2份，每份在冰上的玻璃容器中超声处理。超声仪设定为60％工作期，输出水平8，4分钟。每一样品的超声程序重复2次。所得超声样品在4℃于16,900xg离心20分钟。倾倒上清并用～300ml新鲜缓冲液置换，所述新鲜缓冲液含有50mM KPO4 pH7.4，300mM NaCl和0.5％月桂基二甲基胺氧化物(LDAO)体积/体积。用刮铲重悬包涵体并搅拌溶液直至均质。搅拌的样品然后再次离心并倾倒上清。总共进行三次LDAO洗涤，随后用不含LDAO的含有50M KPO4 pH 7.4，300mM NaCl的缓冲液洗3轮。
将70g纯化的湿包涵体中加入700ml变性缓冲液(6M胍HCl于100mMTris pH 8.0中，20mM二硫苏糖醇(DTT))，溶解蛋白质。然后将样品在22℃于20,400xg离心30分钟，收集上清。然后将蛋白质溶液在强搅拌下缓慢滴进35升重折叠溶液(100mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，1.5M精氨酸，5mM还原型谷胱甘肽，0.05mM氧化型谷胱甘肽)中。将该蛋白质溶液置于4℃下72小时。
所得蛋白质溶液通过中空过滤至～1-2L浓缩然后在4℃过夜透析进16L含有50mM Tris pH 8.0，50mM NaCl的缓冲液。在第二天早晨将缓冲液更换为新鲜缓冲液，样品再透析8小时。然后从透析管中取出蛋白酶样品并在室温保温直至通过裂解前区释放成熟酶而发生蛋白酶自身活化。如实施例3所述用产荧光RQAR-AMC底物和SDS-PAGE监测活性。在完全活化后，将样品于4℃过夜透析进含有50mM HEPES pH 6.5的缓冲液。
然后将蛋白质溶液上样到Source 15S柱(Amersham)上并用从50mMHEPES pH 6.5到含有0.15M NaCl的50mM HEPES pH 6.5的缓冲液梯度洗脱。在所有层析步骤之前，每个柱用0.5N NaOH逆向洗涤，然后用水冲洗。合并活性级分。加入等柱体积的含有2M(NH4)2SO4于50mM PO4 pH7.0中的缓冲液，所得溶液上样到用含有50mM PO4 pH7.0，1M(NH4)2SO4的缓冲液预平衡的Phenyl Sepharose HP柱上。活性蛋白质用从50mM PO4 pH7.0，1M(NH4)2SO4到50mM PO4 pH7.0的缓冲液梯度洗脱。合并活性级分并将缓冲液交换至50mM HEPES pH6.5。样品然后如第一个层析步骤中一样重新上样至Source 15Q并纯化。然后合并活性级分，用搅拌池将缓冲液交换至PBS，并浓缩至～10mg/ml。取样测量蛋白质浓度，A280。然后向剩余样品中加入苯甲脒至终浓度为20mM，之后用0.2uM注射器式过滤器过滤蛋白质样品。蛋白质溶液在液氮中冷冻并保存在-80℃。最终收率为～800mg纯蛋白(～20mg蛋白酶/升培养物)。如实施例3所述测定纯化的蛋白质的比活性、纯度和内毒素水平。
对于其它MT-SP1突变体或野生型MT-SP1也采用类似策略。根据具体突变体对该方案进行修改。对于在Phenyl Sepharose上纯化不良的突变体，采用Benzamidine Sepharose。例如，MT-SP1突变体CB450在苯甲脒柱上纯化。
实施例27
通过一组MT-SP1突变体评价溶血和血浆活性
如实施例7的A.1.b部分和实施例7的B.1部分所述，测试了一组蛋白酶在与20％血浆预保温后支持经典溶血或旁路溶血的能力。另外，如实施例6所述测试了这些蛋白酶的血浆活性。表31描述了在200nM的经典溶血分数、在500nM的旁路溶血分数和每一蛋白酶对经典和旁路溶血的IC50。
另外，还测定了未被α-2巨球蛋白(a2M)结合的蛋白酶百分比。α-2巨球蛋白对蛋白酶的失活是将蛋白酶捕获在一复合体中，在复合体中蛋白酶仍可转化小的荧光底物，但是不能接触到大的蛋白质底物。α-2巨球蛋白的这一性质使得评价血浆中的蛋白酶活性更为复杂。为了测定血浆中游离的未复合的蛋白酶的实际活性，需要两步测定。首先，测定样品对荧光底物的活性。其次，加入大分子抑制剂以结合所有游离的蛋白酶(ATIII或M84R大肠杆菌素)，并测量捕获在α-2巨球蛋白中的(并因此被保护而免于抑制的)蛋白酶活性。未被α-2巨球蛋白结合的活性的百分比是通过添加大肠杆菌素被抑制的血浆残留活性的百分比。简而言之，在一个0.2mL PCR管中，将1μL 10X蛋白酶与9μL于柠檬酸盐中的人血浆(Innovative Research)混合。还制备了未被抑制的对照，其含有与9μL PBST混合的1μL 10X蛋白酶。混合物在37℃保温5分钟。样品在PBST中稀释250倍并在冰上储存。将每一样品的两个50μL等份转移到含有2μL PBST或2μL 520nM M84R大肠杆菌素的不透明分析平板(Costar#3694)。将平板在室温保温10分钟。加入5微升0.4mM Ac-RQAR-AMC底物并用SpectraMax M5荧光分光光度计(Molecular Devices)在30℃随时间测量荧光，该SpectraMax M5荧光分光光度计已被设置成每20秒读数1次，共30分钟(Ex：380nm，EM：450nm，Cut-off：435nm)。用下式计算未被α-2巨球蛋白结合的百分比：(1-([(血浆中的蛋白酶/PBST中的蛋白酶)-(血浆+大肠杆菌素中的蛋白酶/PBST中的蛋白酶)]/(血浆中的蛋白酶/PBST中的蛋白酶)))*100。所测试的一组蛋白酶的％未结合的α-2巨球蛋白的结果见下表31。
Figure A20068004790001891
实施例28
其它突变体
如本文所述制备其它突变体。这些突变体包括但不限于表32所列的那些。
  表32：其它突变   SEQ ID   SEQ ID
  I41T/Y146D/G151L/K224N   681   696
  Y146D/Q175D/K224N   682   697
  I41T/Y146D/K224N   683   698
  Y146D/G151L/K224N   684   699
  Y146D/Q175R/K224N   685   700
  Y146D/Q175K/K224N   686   701
  Y146D/Q175H/K224N   687   702
  I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F   688   703
  I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F   689   704
  I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F   690   705
  I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F   691   706
  I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N   692   707
  I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N   693   708
  I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N   694   709
  I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N   695   710

Claims (144)

1.一种调节补体激活的方法，包括将非补体蛋白酶与补体途径的任一或多种靶底物接触，从而靶底物蛋白被裂解，由此改变包含所述靶底物的途径中的补体激活。
2.权利要求1的方法，其中所述非补体蛋白酶与补体途径的任一或多种靶底物的接触在体外发生。
3.权利要求1的方法，其中所述非补体蛋白酶与补体途径的任一或多种靶底物的接触在体内发生。
4.权利要求1的方法，其中所述非补体蛋白酶与补体途径的任一或多种靶底物的接触离体发生。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中补体激活被抑制。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中补体激活被增加。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中补体途径选自补体的经典途径、旁路途径和凝集素途径中的一或多个途径。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述靶底物是如下任一或多种靶底物：C1q、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子B、因子D、因子P、MASP-1、MASP-2、C1r、C1s、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba和Bb。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述靶底物包含如下所示任一氨基酸序列或者包含所述序列的呈现补体活性的片段：SEQ ID NO：298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340和344。
10.权利要求1-7任一项的方法，其中所述靶底物是纤维胶凝蛋白。
11.权利要求10的方法，其中所述靶底物包含SEQ ID NO：660-662任一所示氨基酸序列。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述非补体蛋白酶与未修饰的或支架蛋白酶相比包含在任一或多个氨基酸残基的修饰，其中修饰的氨基酸残基使得对于靶底物的特异性增加或者对于靶底物的活性增加或者使这二者增加。
13.权利要求12的方法，其中未修饰的或支架蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或者金属蛋白酶的任一种。
14.权利要求13的方法，其中所述支架蛋白酶选自如下蛋白酶：粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白质C、u-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。
15.权利要求14的方法，其中所述支架蛋白酶包含如下所示任一氨基酸序列：SEQ ID NO：2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、377、379、381、383、385、387、547、549和551及其催化活性部分。
16.权利要求14的方法，其中所述支架蛋白酶是MT-SP1蛋白酶。
17.权利要求16的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分包含SEQ ID NO：2或10所示氨基酸序列或是其等位基因或物种变体。
18.权利要求16或17任一项的方法，其中所述靶底物是C2或C3。
19.权利要求16的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号在第224位和/或第146位具有修饰的蛋白酶。
20.权利要求18的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号在第224位和/或第146位具有修饰的蛋白酶。
21.权利要求16的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号在第151位具有修饰的蛋白酶。
22.权利要求18的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号在第151位具有修饰的蛋白酶。
23.权利要求21或22的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于基于糜蛋白酶编号具有选自如下修饰的蛋白酶：I41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、及I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。
24.权利要求16或17的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰是有助于扩展的底物特异性或相互作用二级位点的任一或多个氨基酸的修饰。
25.权利要求24的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于基于糜蛋白酶编号MT-SP1蛋白酶的第97、146、192和224位中的任一或多个氨基酸位置。
26.权利要求25的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于基于糜蛋白酶编号MT-SP1蛋白酶的氨基酸F97、Y146、Q192和K224中的任一或多个。
27.权利要求26的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自F97D、F97E、F97A、F97W、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q192R、Q192V、K224A和K224F中的任一或多个。
28.权利要求16或17的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于具有如下所示任一氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽：SEQID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659或663-710。
29.权利要求27的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰是Y146D/K224F或Y146E。
30.权利要求28的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于具有SEQ ID NO：596或650所示氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽。
31.权利要求16或17的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号的F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、F97W、F99A、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、Y146D/K224F、D96A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K24F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N、及I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。
32.权利要求31的方法，其中MT-SP1蛋白酶在底物识别位点裂解靶底物。
33.权利要求32的方法，其中所述靶底物是C2或C3。
34.权利要求33的方法，其中所述靶底物是C2，底物识别位点包括氨基酸序列SLGR(SEQ ID NO：392)。
35.权利要求1-24任一项的方法，其中非补体蛋白酶裂解靶底物的底物识别位点。
36.权利要求35的方法，其中非补体蛋白酶裂解因子I底物识别位点。
37.一种治疗患有补体介导疾病的对象的方法，所述方法包括给予非补体蛋白酶，其中所述非补体蛋白酶裂解补体途径的任一或多个靶底物，由此包含所述靶底物的途径中的补体激活被改变。
38.权利要求37的方法，其中补体激活被抑制。
39.权利要求38的方法，其中补体激活的抑制导致与选自炎症疾病、神经变性疾病和心血管疾病的补体介导疾病相关的炎症症状减轻。
40.权利要求39的方法，其中补体介导疾病选自脓毒症、类风湿性关节炎(RA)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(IC)-介导的急性炎症性组织损伤、阿尔茨海默病(AD)及缺血-再灌注损伤。
41.权利要求39的方法，其中所述补体介导的疾病是Guillan-Barre综合征。
42.权利要求40的方法，其中缺血-再灌注损伤是由选自如下的事件或治疗引起的：心肌梗塞(MI)、中风、血管成形术、冠状动脉旁路搭桥术、心肺旁路分流术(CPB)和血液透析。
43.权利要求37-42任一项的方法，其中补体介导的疾病得自对对象进行的治疗。
44.权利要求43的方法，其中在对对象进行治疗之前给予非补体蛋白酶。
45.权利要求37-44任一项的方法，其中通过将体液或组织样品在体外、离体或在体内与非补体蛋白酶接触而给予所述非补体蛋白酶。
46.权利要求43的方法，其中治疗导致补体介导的缺血-再灌注损伤。
47.权利要求46的方法，其中所述治疗是血管成形术或冠状动脉旁路搭桥术。
48.权利要求37-47任一项的方法，其中补体途径是经典途径、旁路途径和凝集素途径中的一或多个途径。
49.权利要求37-48任一项的方法，其中靶底物是如下任一或多种靶底物：C1q、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子B、因子D、因子P、MASP-1、MASP-2、C1r、C1s、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba和Bb。
50.权利要求37-49任一项的方法，其中所述靶底物包含如下所示任一氨基酸序列或者包含所述氨基酸序列的呈现补体活性的片段：SEQ ID NO：298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340或344。
51.权利要求37-48任一项的方法，其中所示靶底物是纤维胶凝蛋白。
52.权利要求49的方法，其中所述非补体蛋白酶与未修饰的或支架蛋白酶相比包含在任一或多个氨基酸残基的修饰，其中修饰的氨基酸残基使得对于靶底物的特异性增加或者对于靶底物的活性增加或者这二者增加。
53.权利要求52的方法，其中未修饰的或支架蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或者金属蛋白酶中的任一种。
54.权利要求53的方法，其中所述支架蛋白酶选自如下蛋白酶：粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白质C、u-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。
55.权利要求54的方法，其中所述支架蛋白酶包含如下所示任一氨基酸序列：SEQ ID NO：2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、377、379、381、383、385、387、547、549和551及其催化活性部分。
56.权利要求54的方法，其中所述支架蛋白酶是MT-SP1蛋白酶。
57.权利要求56的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分包含SEQ ID NO：2或10所示氨基酸序列或其等位基因或物种变体。
58.权利要求56或57的方法，其中所述靶底物是C2或C3。
59.权利要求56的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰包含基于糜蛋白酶编号在第224位的修饰。
60.权利要求58的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰包含基于糜蛋白酶编号在第224位的修饰。
61.权利要求56的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰包含基于糜蛋白酶编号在第151位的修饰。
62.权利要求58的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰包含基于糜蛋白酶编号在第151位的修饰。
63.权利要求61或62的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号的：I41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、及I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N及I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。
64.权利要求56或57的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰是有助于扩展的底物特异性或相互作用二级位点的任一或多个氨基酸的修饰。
65.权利要求64的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于基于糜蛋白酶编号MT-SP1蛋白酶第97、146、192和224位的任一或多个氨基酸位置。
66.权利要求65的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于基于糜蛋白酶编号MT-SP1蛋白酶的氨基酸F97、Y146、Q192及K224中的任一或多个。
67.权利要求66的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自F97D、F97E、F97A、F97W、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q192R、Q192V、K224A及K224F中的任一或多个。
68.权利要求56或57的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于具有如下任一氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽：SEQ IDNO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659或663-710。
69.权利要求67的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰是Y146D/K224F或Y146E。
70.权利要求68的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于具有SEQ ID NO：596或650所示氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽。
71.权利要求56或57的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号的F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、F97W、F99A、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、Y146D/K224F、D96A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F  、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N及I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。
72.权利要求71的方法，其中MT-SP1蛋白酶裂解靶底物的底物识别位点。
73.权利要求72的方法，其中所述靶底物是C2或C3。
74.权利要求73的方法，其中所述靶底物是C2，所述底物识别位点包括氨基酸序列SLGR(SEQ ID NO：392)。
75.权利要求37-74任一项的方法，其中所述非补体蛋白酶裂解靶底物的底物识别位点。
76.权利要求75的方法，其中所述非补体蛋白酶裂解因子I底物识别位点。
77.权利要求37-76任一项的方法，其中非补体蛋白酶或其催化活性部分与治疗补体介导疾病的另一种药物组合给予。
78.权利要求77的方法，其中所述另一种药物是抗炎剂或抗凝剂。
79.权利要求78的方法，其中所述另一种药物选自如下任一或多种：NSAID、抗代谢药、皮质类固醇、镇痛药、胞毒剂、促炎细胞因子抑制剂、抗炎细胞因子、B细胞靶向剂、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、PPAR-γ配体、补体抑制剂、肝素、华法林、醋硝香豆素、苯茚二酮、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定和希美加群。
80.一种组合，其包含：
(a)非补体蛋白酶，其裂解补体途径的任一或多种补体靶底物，由此改变包含所述靶底物的途径中的补体激活；及
(b)治疗补体介导的疾病的另一种或另一些药物。
81.权利要求80的组合，其中所述另一种或另一些药物是抗炎剂或抗凝剂。
82.权利要求81的组合，其中所述抗炎剂选自如下任一或多种：NSAID、抗代谢药、皮质类固醇、镇痛药、胞毒剂、促炎细胞因子抑制剂、抗炎细胞因子、B细胞靶向剂、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、PPAR-γ配体、补体抑制剂、肝素、华法林、醋硝香豆素、苯茚二酮、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定和希美加群。
83.权利要求80-82任一项的组合，其中补体激活被抑制。
84.一种修饰的非补体蛋白酶，其包含支架蛋白酶的任一或多个氨基酸中的修饰，其中：
修饰的氨基酸残基使得对于靶底物的特异性增加或者对于靶底物的活性增加或者这二者增加，其中所述靶底物是补体蛋白质。
85.权利要求84的修饰的非补体蛋白酶，其中所述靶底物是如下任一或多种：C1q、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子B、因子D、因子P、MASP-1、MASP-2、C1r、C1s、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba或Bb。
86.权利要求84或85的修饰的非补体蛋白酶，其中所述靶底物包含如下所示任一氨基酸序列或者包含所述氨基酸序列的呈现补体活性的片段：SEQ ID NO：298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340和344。
87.权利要求84的修饰的非补体蛋白酶，其中所述靶底物是纤维胶凝蛋白。
88.权利要求87的修饰的非补体蛋白酶，其中所述靶底物包含SEQ IDNO：660-662所示任一氨基酸序列。
89.权利要求84的修饰的非补体蛋白酶，其中所述支架蛋白酶选自丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
90.权利要求89的修饰的非补体蛋白酶，其中所述支架蛋白酶选自粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白C、u-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。
91.权利要求90的修饰的非补体蛋白酶，其中所述支架蛋白酶包含如下所示任一氨基酸序列：SEQ ID NO：2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、377、379、381、383、385、387、547、549和551及其催化活性部分。
92.权利要求90的修饰的非补体蛋白酶，其中所述支架蛋白酶是MT-SP1蛋白酶。
93.权利要求92的修饰的非补体蛋白酶，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分包含SEQ ID NO：2或10所示氨基酸序列。
94.权利要求92或93的修饰的非补体蛋白酶，其中所述靶底物是C2或C3。
95.权利要求92的修饰的非补体蛋白酶，其包含至少两或多个修饰，其中基于糜蛋白酶编号，一个修饰位于第146位，另一个修饰位于第224位，条件是：
(i)在所述蛋白酶仅包括两个修饰的情况中，所述蛋白酶的两个修饰不包括Y146D和K224F；及
(ii)在所述蛋白酶含有三个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括F99V或I或L或T与Y146D和K224F。
96.权利要求94的修饰的非补体蛋白酶，其包含至少两或多个修饰，其中基于糜蛋白酶编号，一个修饰位于第146位，另一个修饰位于第224位，条件是：
(i)在所述蛋白酶仅包括两个修饰的情况中，所述蛋白酶的两个修饰不包括Y146D和K224F；及
(ii)在所述蛋白酶含有三个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括F99V或I或L或T与Y146D和K224F。
97.权利要求92的修饰的非补体蛋白酶，其包含至少一个在基于糜蛋白酶编号第151位的修饰。
98.权利要求94的修饰的非补体蛋白酶，其包含至少一个在基于糜蛋白酶编号第151位的修饰。
99.权利要求97或98的修饰的非补体蛋白酶，其中MT-SP1或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号的I41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、及I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N及I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。
100.权利要求99的修饰的非补体蛋白酶，其中MT-SP1或其催化活性部分中的修饰相应于基于糜蛋白酶编号的I41T/I46D/G151L/K224F修饰。
101.权利要求92的修饰的非补体蛋白酶，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号的如下任一或多个修饰：D96A、D96V、D96F、D96F、D96S、D96T、F99S、F99G、Q174H、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、Q174L、Q174Y、Q192L、Q192I、Q192E、Q192K、Q192Y、D217Q、D217N、D217H、K224A。
102.权利要求92的修饰的非补体蛋白酶，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号的：Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/K224F、I41L/Y146D/K224F、I41T/Y146D/G151L/K224F、I41A/Y146D/K224F、I41E/Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/Q175D/K224R、I41T/Y146D/Q175D/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、及I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N及I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。
103.权利要求92的修饰的非补体蛋白酶，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于具有如下所示任一氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽：SEQ ID NO：41-51、56、57、60-64、67、69、419-429、431、434、435、438-442、445、524、525、527-530、532、533、552-659或663-710。
104.权利要求92的修饰的非补体蛋白酶，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰相应于具有SEQ ID NO：596或650所示氨基酸序列的修饰的MT-SP1多肽。
105.权利要求103的修饰的非补体蛋白酶，其中MT-SP1蛋白酶裂解靶底物的底物识别位点。
106.权利要求105的修饰的非补体蛋白酶，其中所述靶底物是C2或C3。
107.权利要求106的修饰的非补体蛋白酶，其中所述靶底物是C2，所述底物识别位点包括氨基酸序列SLGR(SEQ ID NO：392)。
108.一种药物组合物，其包含权利要求84-107、131和132任一项的修饰的非补体蛋白酶。
109.一种组合，其包含：
(a)权利要求108的药物组合物；及
(b)治疗补体介导疾病的另一种或另一些药物。
110.权利要求108的药物组合物，其进一步包含药物学可接受的赋形剂。
111.权利要求110的药物组合物，其中所述药物组合物配制为经全身、口、鼻、肺、局部给予。
112.一种试剂盒，其包含权利要求108或109任一项的药物组合物、给予所述组合物的装置，及任选的给药说明书。
113.一种核酸分子，其包含编码权利要求84-107任一项的修饰的非补体蛋白酶的核苷酸序列。
114.一种载体，其包含权利要求113的核酸分子。
115.一种细胞，其包含权利要求114的载体。
116.一种治疗方法，包括给予对象权利要求113的核酸分子。
117.权利要求116的治疗方法，其中所述核酸分子导入载体中用于给药。
118.权利要求117的方法，其中所述载体是表达载体。
119.权利要求118的治疗方法，其中所述载体是附加型载体。
120.权利要求117或118的治疗方法，其中所述表达载体选自腺病毒载体、腺伴随病毒载体、EBV、SV40、巨细胞病毒载体、豆苗病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或人工染色体。
121.权利要求117-120任一项的治疗方法，其中所述核酸是在体内或离体给予。
122.权利要求121的治疗方法，其中离体治疗包括将所述核酸在体外给予细胞，随后将该细胞给予对象。
123.权利要求122的方法，其中所述细胞来自合适的供体或者来自治疗对象。
124.权利要求116-123任一项的治疗方法，其中所述对象是人。
125.一种融合蛋白，其包含与非蛋白酶多肽融合的权利要求84-107、131和130任一项的蛋白酶的催化活性部分。
126.权利要求16的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号在第41位具有修饰的蛋白酶。
127.权利要求18的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自基于糜蛋白酶编号在第41位具有修饰的蛋白酶。
128.权利要求56的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰包含基于糜蛋白酶编号在第41位的修饰。
129.权利要求58的方法，其中MT-SP1蛋白酶或其催化活性部分中的修饰包含基于糜蛋白酶编号在第41位的修饰。
130.权利要求92的修饰的非补体蛋白酶，其包含至少一个在基于糜蛋白酶编号第41位的修饰。
131.权利要求94的修饰的非补体蛋白酶，其包含至少一个在基于糜蛋白酶编号第41位的修饰。
132.权利要求84-107、131和130任一项的非补体蛋白酶在制备治疗补体介导疾病或病变的药物中的应用。
133.权利要求84-107、131和130任一项的非补体蛋白酶用于治疗补体介导疾病或病变的应用。
134.非补体蛋白酶在制备治疗补体介导疾病或病变的药物中的应用。
135.非补体蛋白酶在治疗补体介导疾病或病变中的应用。
136.权利要求132-135任一项的应用，其中非补体蛋白酶裂解补体途径的任一或多个靶底物，由此包含所述靶底物的途径中的补体激活被改变。
137.权利要求136的应用，其中补体激活被抑制。
138.权利要求137的应用，其中补体激活的抑制导致选自炎症疾病、神经变性疾病和心血管疾病的补体介导疾病相关的炎症症状减轻。
139.权利要求138的应用，其中所述补体介导的疾病选自：脓毒症、类风湿性关节炎(RA)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(IC)-介导的急性炎症性组织损伤、阿尔茨海默病(AD)及缺血-再灌注损伤。
140.权利要求138的应用，其中补体介导疾病是Guillan-Barre综合征。
141.权利要求139的应用，其中缺血-再灌注损伤是由于选自心肌梗塞(MI)、中风、血管成形术、冠状动脉旁路搭桥术、心肺旁路分流术(CPB)及血液透析的事件或治疗而引起的。
142.权利要求132-141任一项的应用，其中所述补体介导疾病得自对对象进行的治疗。
143.权利要求142的方法，其中所述治疗导致补体介导的缺血-再灌注损伤。
144.权利要求143的方法，其中所述治疗是血管成形术或冠状动脉旁路搭桥术。
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