CN101360826A - 抗α2整联蛋白抗体及它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗α2整联蛋白抗体和它们的用途。公开了与α2整联蛋白结构域I结合和抑制α2β1整联蛋白与胶原蛋白相互作用的人源化抗体。还公开了抗α2整联蛋白抗体，包括与α2整联蛋白结合而不激活血小板的抗α2整联蛋白抗体，在治疗α2β1介导的疾病中的治疗用途。

Description

抗α2整联蛋白抗体及它们的用途
相关专利申请的交互参考
本申请按照35 U.S.C.§119(e)，要求2005年11月18日提交的美国临时申请序号No.60/738,303的权益，此专利申请的内容全部并入本文作为参考。
技术领域
本发明总体上涉及抗α2β1整联蛋白抗体及它们的用途，包括人源化的抗α2整联蛋白抗体和用抗α2整联蛋白抗体进行治疗的方法。
发明背景
α2β1整联蛋白(极晚期抗原2；VLA-2)在多种类型细胞上表达，这些细胞包括血小板、血管内皮细胞、上皮细胞、活化的单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞、白细胞、淋巴细胞、活化的嗜中性白细胞和肥大细胞(Hemler，Annu Rev Immunol 8：365-400(1999)；Wu和Santore，Dev.Dyn.206：169-171，1994；Edelson等，Blood 103(6)：2214-20(2004)；Dikeson等，Cell Adhesion and Communication 5：273-281(1998))。α2β1的最典型配体包括胶原蛋白和层粘连蛋白，二者见于胞外基质中。通常α2整联蛋白的I-结构域以二价阳离子依赖方式结合胶原蛋白，而同一结构域以二价阳离子依赖和不依赖方式结合层粘连蛋白(Dikeson等，Cell Adhesion andCommunication 5：273-281(1998))。α2β1整联蛋白的特异性随细胞类型而不同，起着特定类型细胞的胶原蛋白受体和/或层粘连蛋白受体的作用，例如，α2β1整联蛋白称为血小板的胶原蛋白受体和内皮细胞的层粘连蛋白受体(Dikeson等，J Biol.Chem.272：7661-7668(1997))。艾柯病毒-1、饰胶蛋白聚糖、E-钙粘着蛋白、基质金属蛋白酶I(MMP-I)、endorepellin和多种胶原凝素及C1q补体蛋白也是α2β1整联蛋白的配体(Edelson等，Blood 107(1)：143-50(2006))。已知α2β1整联蛋白参与几种生物学和病理学过程，包括胶原诱导的血小板凝聚、细胞向胶原移行、胶原纤维的细胞依赖性重组构以及导致细胞因子表达和增殖的胶原依赖性细胞应答反应(Gendron，J.Biol.Chem.278：48633-486431(2003)；Andreasen等，JImmunol 171：2804-2811(2003)；Rao等，J Immunol 165(9)：4935-40(2000))，T细胞、肥大细胞和嗜中性白细胞的功能方面(Chan等，J.Immunol.147：398-404(1991)；Dustin和de Fougerolles，Curr Opinimmunol 13：286-290(2001)；Edelson等，Blood 103(6)：2214-20(2004)；Werr等，Blood 95：1804-09(2000))、迟发型过敏、接触性过敏和胶原诱导的关节炎方面(de Fougerolles等，J.Clin.Invest.105：721-20(2000)；Kriegelstein等，J.Clin.Invest.110(12)：1773-82(2002))、乳腺导管形态发生(Keely等，J.Cell Sci.108：595-607(1995)；Zutter等，Am.J.Pathol.155(3)：927-940(1995))、皮肤伤口愈合(Pilcher等，J.Biol.Chem.272：181457-54(1997))和与VEGF-诱导的血管生成相关的过程(Senger等，Am.J.Pathol.160(1)：195-204(2002))。
整联蛋白是由一个α亚基和一个β亚基组成的异源二聚体，包括一个介导细胞粘附至胞外基质(ECM)及血浆蛋白的细胞表面蛋白大家族，对于某些类型的细胞间相互作用具有关键作用。整联蛋白通过其胞外域与ECM组分相互作用(Pozzi和Zent，Exp Nephrol 94：77-84(2003))。通过结合配体，整联蛋白转导胞内信号给细胞骨架，调节对细胞粘附作用起反应的细胞活性，这称为外向内信号传递(见例如Hemler，Ann J.RevImmunol 8：365-400(1999)；Hynes，Cell 110(6)：673-87(2002))。这种信号传递也可激活同一细胞上表达的其它整联蛋白亚型，称为内向外信号传递。内向外信号传递也发生在通过胞浆中起源的调节信号，如α与β亚基之间交合的破坏，接下来传递给此受体的胞外配体结合域。整联蛋白在控制发育、器官形态发生、生理和病理以及正常组织的自身稳定和免疫力及凝血反应的细胞粘附活动中可能起着重要作用，此外，它们也对细胞起着环境传感器的作用。这些蛋白的特征是在正常状态下为闭合构象，激活时则经历迅速的构象变化暴露出配体结合位点。X-射线晶体结构是近年来用于研究整联蛋白结构和作用机制的一种工具，了解整联蛋白的结构特征有助于更好了解其结合位点、分化状态及其活化和失活形式。通常所有整联蛋白的配体/反受体结合位点位于α结构域内，包括一个金属离子依赖的结合位点，称为MIDAS结构域(Dembo等，J Biol Chem 274：32108-111(1998)；Feuston等，J Med Chem 46：5316-5325(2003)；Gadek等，Science295(5557)：1086-9(2002)；Gurrath等，Eur J Biochem 210：911-21(1992))。在结合胶原蛋白的整联蛋白(包括a1、a2、a10和a11整联蛋白)的α亚基中，MIDAS位点位于N-末端外插结构域内，称为I、A或I/A结构域，特点是它们分享有整联蛋白的白细胞β2家族的α亚基(Randi和Hogg，JBiol Chem 269：12395-8，1994；Larson等，J Cell Biol 108(2)：703-12，1989；Lee等，J Boil Chem 269：12395-8(1994)；Emsley等，J Biol Chem272：28512-28517(1997))和Cell 100：47-56(2000))。此结构域I在结构上与冯维勒布兰德(von Willebrandt)因子同源，具有被7个α螺旋围绕的6个β折叠链罗斯曼折叠拓扑构象(Colombatti和Bonaldo，Blood77(11)：2305-15(1991)；Larson等，J Cell Biol 108(2)：703-712(1989)；Emsley等，J Biol Chem 272：28512-28517(1997)；Nolte等，FEBS Letters452(3)：379-385(1999))。结合胶原蛋白的整联蛋白还有另一个α螺旋，称为αC螺旋(Emsley等，J Biol Chem 272：28512-28517(1997)和Cell100：47-56(2000)；Nolte等，FEBS Letters 452(3)：379-385(1999))。
在对炎性剌激的反应中，整联蛋白与配体的相互作用可促进白细胞外渗入炎症组织(Jackson等，J Med Chem 40：3359-3368(1997)；Gadek等，Science 295(5557)：1086-9(2002)；Sircar等，Bioorg Med Chem10：2051-2066(2002))，以及在引起白细胞从血循环外渗入组织后的下游活动(包括促炎细胞在炎症部位的迁移、募集和活化)中起作用(Eble J.A.，Curr.Phar.Des.11(7)：867-880(2005))。据报导，某些能阻断α2β1整联蛋白的抗体显示对迟发性过敏反应有影响，在鼠类风湿关节炎模型和炎性肠病模型中有效(Kriegelstein等，J.Clin.Invest.110(12)：1773-82(2002)；de Fougerolles等，J.Clin.Invest.105：721-720(2000))；还据报导，这些抗体体外能减弱内皮细胞的增殖和迁移(Senger等，Am.J.Pathol.160(1)：195-204(2002))，提示阻断α2β1整联蛋白可预防/抑制各种癌症中所见的异常或高于正常的血管发生。
血小板通常以无活性的静息状态在血液中循环，然而在损伤部位它们可迅速对多种激动剂反应。受剌激后血小板经历了形态变化，变得与血浆蛋白如血纤蛋白原和冯维勒布兰德因子(vWf)、其它血小板和血管壁内皮层有高度反应性。这些相互作用协同促进了止血性血纤蛋白血小板塞的形成(Cramer，2002，Hemostasis and Thrombosis一书第4版)。结合配体时，血小板受体转导外向内信号通路，进而触发内向外信号传递，导致次级受体如血小板血纤蛋白原受体、αIIbβ3整联蛋白活化，引起血小板凝聚。与血小板受体结合或相互作用的抗体或肽配体模拟物预期诱导类似的信号传递级联反应导致血小板激活。血小板即使微量激活即可导致血小板凝聚反应、血小板减少症和出血并发症。
α2β1整联蛋白是在血小板上表达的唯一结合胶原蛋白的整联蛋白，在参与血小板粘附胶原蛋白和自身稳定中起着某些作用(Gruner等，Blood102：4021-4027(2003)；Nieswandt和Watson，Blood 102(2)：449-461(2003)；Santoro等，Thromb.Haemost.74：813-821(1995)；Siljander等，Blood15：1333-1341(2004)；Vanhoorelbeke等，Curr.Drug Targets Cardiovasc.Haematol.Disord.3(2)：125-40(2003))。此外，血小板α2β1整联蛋白在调节血小板凝块的大小中也可能起作用(Siljander等，Blood 103(4)：1333-1341(2004))。
α2β1整联蛋白也被证明可作为结合层粘连蛋白的整联蛋白在内皮细胞上表达(Languino等，J Cell Bio.109：2455-2462(1989))。有人认为内皮细胞通过整联蛋白介导的机制附着于层粘连蛋白，然而有人提出α2结构域I的功能可能是参与介导内皮细胞相互作用的配体特异性序列(Bahou等，Blood 84(11)：3734-3741(1994))。
推测结合α2β1整联蛋白(包括血小板上的α2β1整联蛋白)的治疗性抗体可能导致出血并发症。例如，靶向其它血小板受体如GPIb的抗体(Vanhoorelbeke等，Curr.Drug Targets Cardiovasc.Haematol.Disord.3(2)：125-40(2003))或GPIIb/IIIa(Schell等，Ann.Hematol.81：76-79(2002)；Nieswandt和Watson，Blood 102(2)：449-461(2003)；Merlini等，Circulation109：2203-2206(2004))已被证明与血小板减少症相关，虽然其机制不大了解。有人假定抗体与血小板受体的结合可改变其三维结构，暴露出通常不暴露的表位，导致血小板清除(Merlini等，Circulation 109：2203-2206(2004))。的确，与口服GP IIa/IIIb拮抗剂有关的出血并发症被描述为此类化合物的“阴暗面(dark side)”(Bhatt和Topol，Nat.Rev.Drug Discov.2(1)：15-28(2003))。如果α2β1整联蛋白在白细胞迁移进入炎症组织中起着重要作用，则需要开发能针对包括癌症、炎性疾病和自身免疫性疾病在内的α2β1整联蛋白相关疾病和/或与此类疾病相关的细胞过程的治疗剂，如果这类治疗剂不会激活血小板的话。因此本领域需要开发能靶向α2β1整联蛋白(如白细胞上的α2β1整联蛋白)但不会引起不利的出血并发症的化合物。
抗人α2β1整联蛋白的封闭抗体BHA2.1由Hangan等人，(Cancer Res.56：3142-3149(1996))最先报导。已知还有其它抗α2β1整联蛋白抗体且已在体外应用，如市售抗体AK7(Mazurov等，Thromb.Haemost.66(4)：494-9(1991)、P1E6(Wayner等，J.Cell Biol.107(5)：1881-91(1988))、10G11(Giltay等，Blood 73(5)：1235-41(1989)、和A2-IIE10(Bergelson等，Cell Adhes.Commun.2(5)：455-64(1994)。Hangan等人(Cancer Res.56：3142-3149(1996))用BHA2.1抗体研究了体内阻断α2β1整联蛋白对人肿瘤细胞渗入肝脏的影响，以及在抗体治疗下这些肿瘤细胞发展成转移病灶的能力。已采用大鼠和小鼠α2β1整联蛋白特异性的Ha1/29抗体(Mendrick和Kelly，Lab Invest.69(6)：690-702(1993))体内研究T细胞被LCMV病毒活化后α2β1整联蛋白的上调(Andreasen等，J.Immunol.171：2804-2811(2003))，研究SRBC-诱导的迟发型过敏反应和FITC-诱导的接触性过敏反应及胶原蛋白诱导的关节炎(de Fougerolles等，J.Clin.Invest.105：721-720(2000))，研究α2β1整联蛋白在VEGF调节的血管发生中的作用(Senger等，Am.J.Pathol.160(1)：195-204(2002)；Senger等，PNAS 94(25)：13612-7(1997))和研究在对血小板活化因子(PAF)的反应中α2β1整联蛋白对PMN运动的作用(Werr等，Blood95：1804-1809(2000))。
采用鼠单克隆抗体(如以上所述的抗体)作为非免疫力低下患者的治疗药物，因可产生对所施与鼠抗体的强免疫应答反应(特别是重复施与时)而受到限制。此种反应不仅能缩短循环血中鼠抗体的半寿期也可导致注射部位的严重和/或过敏反应(Shawler等，J.Immunol.135(2)：1530(1985))。此外，当施与人类时，啮齿动物抗体的与恒定区(Fc)相关的效应子功能比人抗体的效力低得多，从而导致可能需要的补体激活和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)丧失。
因此，需要开发针对α2β1整联蛋白的抗体，包括治疗包括炎性疾病和自身免疫疾病的α2β1整联蛋白相关疾病、其机制和细胞过程的抗体。而且，需要开发不会在患者中产生相关的抗鼠抗体应答反应的抗α2β1整联蛋白抗体。
附图简述
图1：在小鼠EAE模型上，抗α2整联蛋白抗体在疾病最初出现症状时施用对瘫痪疾病的作用研究结果示意图(见实施例7)。
图2：抗α2整联蛋白抗体在疾病诱导期施用对瘫痪疾病的作用研究结果示意图(见实施例7)。
发明概述
本发明提供抗α2整联蛋白抗体和它们的使用方法，特别是人源化抗α2整联蛋白抗体和它们的使用方法。
在某些实施方案中，所述抗α2整联蛋白抗体包括一个或多个人抗体的恒定区(如CL和/或CH区)和含有SEQ ID NO：19氨基酸序列的轻链可变区，和/或含有SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链可变区，或它们的氨基酸序列变体。本发明考虑了多种形式的抗体。例如，抗α2整联蛋白抗体可以是全长抗体(如含有人免疫球蛋白的恒定区)或抗体片段(如Fab或F(ab’)2或Fab’或Fv或scFv片段)。而且，此抗体可用可检测标记物标记、固定在固相上、和/或与异源化合物(如细胞毒性剂)缀合。
考虑了抗α2整联蛋白抗体的诊断和治疗用途以及预防用途。对于诊断用途，提供了检测α2β1整联蛋白存在的方法，包括使怀疑含有α2β1整联蛋白的样品接触抗α2整联蛋白抗体和测定抗体与样品的结合。对于此种用途，提供了包含抗α2整联蛋白抗体和使用该抗体检测α2β1整联蛋白的说明书的试剂盒。治疗用途包括但不限于治疗α2β1整联蛋白相关疾病、其机制和细胞过程，所述疾病包括炎性疾病和自身免疫疾病，特别是多发性硬化症。
考虑了抗α2整联蛋白抗体的基因治疗应用。可将编码抗α2β1整联蛋白抗体重链和轻链基因序列的各种载体转移给细胞(如成纤维细胞、干细胞)以产生分泌抗α2β1 Mab的细胞群。这些细胞可具有向不同类型细胞、组织和/或器官的特异性“归巢”性能。进而可将这些抗体产生细胞引入患者体内以定位递送此抗α2β1 MAb。例如，可将用抗α2β1MAb的载体修饰的间充质干细胞注射入多发性硬化症患者的脑中。此干细胞可分化成为神经细胞和分泌抗α2β1 MAb以治疗多发性硬化症相关的炎症。此外，可将抗α2β1 MAb基因与病毒编码的治疗基因(如篦麻毒蛋白)缀合。这种修饰的病毒能特异性结合细胞表面表达的α2β1，而提高转基因转移效率。而且，由抗α2β1抗体-脂质体复合物组成的免疫缀合物包裹有编码治疗基因的核酸，可将其经静脉内引入患者体内。此种抗α2β1-免疫缀合物将结合表达α2β1整联蛋白的细胞并促进该治疗基因的有效摄入。
也提供编码抗α2整联蛋白抗体的分离的核酸；含有此核酸的载体(Vector)，所述核酸任选地有效连接至用此载体转化的宿主可识别的调控序列；含有该载体的宿主细胞；产生抗α2整联蛋白抗体的方法，包括培养所述宿主细胞以表达所述核酸，及任选地从宿主细胞培养物(如宿主细胞培养基)中回收该抗体。
也提供包含人源化抗α2整联蛋白抗体和药学上可接受的载体(Carrier)或稀释剂的组合物。治疗用的组合物可以是灭菌的和可以是冻干的。还提供治疗α2β1整联蛋白相关疾病的方法，包括施与哺乳动物对象药学有效量的抗α2整联蛋白抗体，如人源化的抗α2整联蛋白抗体。对于这种治疗用途，可在抗α2整联蛋白抗体之前、之后或同时共同施与哺乳动物其它药剂(如另一种α2β1整联蛋白拮抗剂)。
还提供一种人源化抗α2整联蛋白抗体，包含重链可变区，其包含氨基酸序列(a)HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQ ID NO：2)，(b)HCDR1(GFSLTNYGIH，SEQ ID NO：1)、HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQID NO：2)和HCDR3(ANDGVYYAMDY，SEQ ID NO：3)，或(c)SEQ IDNO：40。
在一实施方案中，上述重链可变区含氨基酸序列SEQ ID NO：185。
在另一实施方案中，上述重链可变区含氨基酸序列SEQ ID NO：185，其中(a)位置71是赖氨酸，(b)位置73是天冬酰胺，(c)位置78是缬氨酸，或(d)是(a)-(c)的任何一种组合。
在另一实施方案中，上述重链可变区包含选自SEQ ID NO：70-79和SEQ ID NO：109-111的氨基酸序列。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体还包含含有氨基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：13)的FW4区。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体包含氨基酸序列HCDR1(SEQ ID NO：1)、HCDR2(SEQ ID NO：2)和HCDR3(SEQ ID NO：3)。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体还包含轻链。
本发明还提供一种人源化抗α2整联蛋白抗体，包含轻链可变区，其包含氨基酸序列(a)LCDR1，选自SANSSVNYIH(SEQ ID NO：4)或SAQSSWNYIH(SEQ ID NO：112)，(b)LCDR2(DTSKLAS；SEQ ID NO：5)和(c)LCDR3(QQWTTNPLT，SEQ ID NO：6)。
在一实施方案中，上述轻链可变区含有氨基酸序列SEQ ID NO：186。
在一实施方案中，上述轻链可变区含有氨基酸序列SEQ ID NO：186，其中(a)位置2是苯丙氨酸，(b)位置45是赖氨酸，(c)位置48是酪氨酸，或(d)是(a)-(c)的任何一种组合。
在一实施方案中，上述轻链可变区含有选自SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：80-92和SEQ ID NO：108的氨基酸序列。
在一实施方案中，上述人源化抗α2整联蛋白抗体还包含含有氨基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：38)的FW4区。
在一实施方案中，上述人源化抗α2整联蛋白抗体含有氨基酸序列LCDR1(SEQ ID NO：4)、LCDR2(SEQ ID NO：5)和LCDR3(SEQID NO：6)。
在一实施方案中，上述人源化抗α2整联蛋白抗体还含有重链。
本发明还提供人源化的抗α2整联蛋白抗体，其包含
(i)重链可变区，其包含氨基酸序列(a)HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQ ID NO：2)，(b)HCDR1(GFSLTNYGIH，SEQ ID NO：1)、HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQID NO：2)和HCDR3(ANDGVYYAMDY，SEQ ID NO：3)，或(c)SEQ IDNO：40；和
(ii)轻链可变区，其包含氨基酸序列(a)LCDR1，选自SANSSVNYIH(SEQ ID NO：4)或SAQSSWNYIH(SEQ ID NO：112)，(b)LCDR2(DTSKLAS；SEQ ID NO：5)和(c)LCDR3(QQWTTNPLT，SEQID NO：6)。
还提供上述人源化抗α2整联蛋白抗体，其中(a)重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：185，(b)轻链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO：186，或(c)(a)和(b)二者。
还提供上述人源化抗α2整联蛋白抗体，其中(i)重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：185，其中(a)位置71是赖氨酸，(b)位置73是天冬酰胺，(c)位置78是缬氨酸，或(d)是(a)-(c)的任何一种组合；(ii)轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：186，其中(a)位置2是苯丙氨酸，(b)位置45是赖氨酸，(c)位置48是酪氨酸，或(d)是(a)-(c)的任何一种组合；或(iii)(i)和(ii)二者。
还提供上述人源化抗α2整联蛋白抗体，其中(a)重链可变区包含选自SEQ ID NO：70-79和SEQ ID NO：109-111的氨基酸序列；(b)轻链可变区包含选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：80-92和SEQ ID NO：108的氨基酸序列；或(c)(a)和(b)二者。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体识别人α2整联蛋白的结构域I。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体结合α2β1整联蛋白。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体结合α2整联蛋白的表位，该表位包含：
(a)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置192或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置40的赖氨酸残基；
(b)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置225或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置73的天冬酰胺残基；
(c)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置241或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置89的谷氨酰胺残基；
(d)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置245或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置93的酪氨酸残基；
(e)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置317或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置165的精氨酸残基；
(f)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置318或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置166的天冬酰胺残基；或
(g)(a)至(f)的任何一种组合。
还提供一种抗α2整联蛋白抗体，其中该抗体结合α2整联蛋白的表位，该表位包含：
(a)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置192或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置40的赖氨酸残基；
(b)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置225或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置73的天冬酰胺残基；
(c)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置241或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置89的谷氨酰胺残基；
(d)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置245或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置93的酪氨酸残基；
(e)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置317或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置165的精氨酸残基；
(f)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置318或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置166的天冬酰胺残基；或
(g)(a)至(f)的任何一种组合。
在一实施方案中，上述人源化抗α2整联蛋白抗体是全长抗体。
在一实施方案中，上述人源化抗α2整联蛋白抗体是抗体片段。
在一实施方案中，上述人源化抗α2整联蛋白抗体连接有可检测标记物。
在一实施方案中，上述人源化抗α2整联蛋白抗体被固定在固相上。
在一实施方案中，上述人源化抗α2整联蛋白抗体抑制α2或α2β1整联蛋白结合至α2β1整联蛋白配体。
在一实施方案中，上述α2β1整联蛋白配体选自：胶原蛋白、层粘连蛋白、艾柯病毒-1、饰胶蛋白聚糖、E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、endorepellin、胶原凝素和C1q补体蛋白。
本发明也提供测定样品是否含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白或二者的方法，该方法包括使样品与上述人源化抗α2整联蛋白抗体接触和确定抗体是否与样品结合，存在所述结合表明该样品含有α2整联蛋白或α2β1整联蛋白，或含有二者。
本发明还提供包含上述人源化抗α2整联蛋白抗体的试剂盒，盒中任选地包含如何用此抗体检测α2或α2β1整联蛋白的说明书。
本发明还提供编码上述人源化抗α2β1整联蛋白抗体的分离的核酸。
本发明还提供包含上述核酸的载体。
本发明还提供包含上述核酸或载体的宿主细胞。
本发明还提供生产人源化抗α2整联蛋白抗体的方法，包括在允许此抗体表达的条件下培养上述宿主细胞。在一实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收人源化抗α2整联蛋白抗体。在一实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞培养基中回收人源化抗α2整联蛋白抗体。
本发明还提供筛选方法，包括：在存在与不存在受试抗体时，检测α2或α2β1整联蛋白与包含SEQ ID NO：19所示VL区和SEQ ID NO：21所示VH区的抗体的结合；如果其存在与α2或α2β1整联蛋白和包含SEQID NO：19所示VL区和SEQ ID NO：21所示VH区的抗体的结合降低相关，则选择该受试抗体。在一实施方案中，所述α2或α2β1整联蛋白被固定在固相支持物上。
本发明还提供筛选方法，包括：在存在受试抗体时检测α2β1整联蛋白与胶原蛋白的结合，其中受试抗体指结合α2结构域I的抗体；在存在Mg++离子时检测受试抗体与α2结构域I的结合；在存在Ca++离子时检测受试抗体与α2结构域I的结合；在存在无阳离子的培养基时检测受试抗体与α2结构域I的结合；选择抑制α2β1整联蛋白与胶原蛋白结合和在存在Mg++离子和Ca++离子及无阳离子的培养基时结合至α2结构域I的受试抗体。
本发明还提供包含上述人源化抗α2整联蛋白抗体和可药用载体的组合物。
本发明还提供治疗受试者α2β1整联蛋白相关疾病的方法，该方法包括施与受试者治疗有效量的上述抗α2整联蛋白抗体或组合物。
本发明还提供抑制白细胞与胶原蛋白结合的方法，包括施与受试者抑制白细胞与胶原蛋白结合的有效量的上述抗α2β1整联蛋白抗体。
本发明还提供上述人源化抗α2整联蛋白抗体作为药物的用途。
本发明还提供上述人源化抗α2整联蛋白抗体或组合物治疗α2β1整联蛋白相关疾病的用途。
本发明还提供上述人源化抗α2整联蛋白抗体或组合物在制备治疗α2β1整联蛋白相关疾病的药物上的用途。
本发明还提供治疗α2β1整联蛋白相关疾病的组合物，该组合物包含上述人源化抗α2整联蛋白抗体和可药用载体或稀释剂。
本发明还提供了包装体(package)，包含上述人源化抗α2整联蛋白抗体或组合物以及治疗α2β1整联蛋白相关疾病的说明书。
在一些实施方案中，α2β1整联蛋白相关疾病选自：炎性疾病、自身免疫疾病和以异常或增加的血管发生为特征的疾病。
在一些实施方案中，α2β1整联蛋白相关疾病选自：炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎(optical neuritis)、脊髓损伤、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化症、雷纳德综合征(Reynaud’s syndrome)、实验性自身免疫脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、幼年型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、心血管疾病、牛皮癣、癌症以及诱发炎性反应的感染。
在一些实施方案中，α2β1整联蛋白相关疾病选自：多发性硬化症(如其特征为复发、急性期治疗、缓期治疗)、类风湿关节炎、视神经炎和脊髓损伤。
在一些实施方案中，上述方法不伴有(a)血小板活化，(b)血小板凝聚，(c)循环血小板数量减少，(d)出血并发症，或(e)以上(a)至(d)的任何一种组合。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体包含含有SEQ ID NO：174或SEQ ID NO：176的重链和含有SEQ ID NO：178的轻链。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体竞争性抑制含有SEQ IDNO：19的VL区和SEQ ID NO：21的VH区的抗体与人α2β1整联蛋白或其结构域I结合。
在一实施方案中，上述方法伴有多发性硬化症相关的潮红或神经病学后遗症的缓解。
在一实施方案中，上述抗α2整联蛋白抗体抑制α2β1整联蛋白与胶原蛋白结合，而且不是配体模拟物。
也提供将分子的一部分(如分子、蛋白质、核酸、载体、组合物、复合体等)靶向以存在α2β1整联蛋白配体为特征的部位的方法，该方法包括使该部分与上述人源化抗α2整联蛋白抗体附着或结合。
也提供结合抗α2整联蛋白抗体的α2整联蛋白表位，所述表位不含有α2整联蛋白的配体结合位点。在一些实施方案中，与此表位结合不会伴有(a)血小板活化，(b)血小板凝聚，(c)循环血小板数量减少，(d)出血并发症，(e)α2整联蛋白活化，或(f)以上(a)至(e)的任何一种组合。
优选结合人α2β1整联蛋白结构域I的抗体。具体说，优选的抗体能阻断细胞与胞外基质(ECM)(特别是与胶原蛋白和层粘连蛋白至少之一或二者)的α2整联蛋白依赖性粘附。提供的人源化抗体包括以本发明称为TMC-2206的抗体为基础的抗体。提供的抗α2整联蛋白抗体对人α2β1整联蛋白有高度特异性，它们的施用不伴有不良作用，如出血并发症或由于细胞活化所致的并发症。这些抗体的结合特异性(如表位特异性)与它们的出乎意料的非出血性能有关。
人源化抗α2β1整联蛋白抗体可具有重链可变区，包含氨基酸序列HCDR1(GFSLTNYGIH，SEQ ID NO：1)，和/或HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQ ID NO：；2)和/或HCDR3(ANDGVYYAM D Y，SEQ ID NO：3)。人源化抗α2β1整联蛋白抗体可具有轻链可变区，包含氨基酸序列LCDR1(SANSSVNYIH，SEQ ID NO：4或SAQSSWNYIH，SEQ ID NO：112)和/或LCDR2(DTSKLAS，SEQID NO：5)和/或LCDR3(QQWTTNPLT，SEQ ID NO：6)。在某些实施方案中，人源化抗α2β1整联蛋白抗体具有重链可变区，包含氨基酸序列HCDR1(GFSLTNYGIH，SEQ ID NO：1)，和/或HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQ ID NO：2)和/或HCDR3(ANDGVYYAM D Y，SEQ ID NO：3)，和轻链可变区，包含氨基酸序列LCDR1(SANSSVNYIH，SEQ ID NO：4)和/或LCDR2(DTSKLAS，SEQ ID NO：5)和/或LCDR3(QQWTTNPLT，SEQ ID NO：6)。在其它实施方案中，该抗体包含一个或多个此类CDR的氨基酸序列变体，所述变体在CDR残基内或毗连处含有一个或多个氨基酸插入、和/或在CDR残基内或毗连处含有一个或多个氨基酸缺失、和/或CDR残基替代，替代是产生此类变体的氨基酸改变的优选类型。
发明详述
本发明提供能与人α2整联蛋白特异性反应的抗体，包括人源化抗体，以及它们的使用方法。人源化抗体可具有人的构架区(FW)和非人(通常是小鼠)抗体的互补决定区(CDR)，能与人α2整联蛋白特异性反应。提供包含重链和轻链抗体的编码核苷酸序列和氨基酸序列。在优选的实施方案中，一个或多个CDR区衍生自或基于杂交瘤克隆BHA2.1分泌的鼠抗体[本发明称作TMC-2206抗体]。也提供具有类似结合性能的抗体和具有与本发明所述抗体类似功能的抗体(或其它拮抗剂)。优选的抗α2整联蛋白抗体包括：(a)结合α2整联蛋白结构域I、(b)抑制α2整联蛋白功能(如胶原蛋白或层粘连蛋白结合)、(c)结合静息血小板上的α2整联蛋白而不诱导血小板活化和(d)识别TMC-2206结合表位(如与TMC-2206竞争结合α2整联蛋白)的那些抗体。这类抗体可优先结合失活的或封闭构象的靶α2整联蛋白分子而不竞争配体结合位点。本发明所述的抗α2整联蛋白抗体的出乎意料的优点是在所治疗的受试者中能优先结合封闭构象的α2β1整联蛋白和/或结合α2β1整联蛋白而不竞争配体结合位点(例如，不是配体模拟物)，包括防止可能的血小板活化、血小板凝聚、循环血小板数减少和/或出血并发症。
“出血并发症”在本发明用来指对血液水平和生理状况的任何不良作用，包括血小板血栓形成反应、血小板减少、血凝时间增加、出血时间延长和血液丢失，它们限制了抗α2整联蛋白抗体的治疗用途。
α2β1整联蛋白是由α整联蛋白家族的α2整联蛋白亚基(参见例如人α2的DNA序列见SEQ ID NO：7，蛋白质序列见SEQ ID NO：8)和β整联蛋白家族的β1整联蛋白亚基(参见例如人β1的DNA序列见SEQ IDNO：9，蛋白质序列见SEQ ID NO：10)组成的分子，可以源自任何对象，包括哺乳动物，但优选源自人类。α2β1整联蛋白可从任何天然来源纯化，或可合成制备(如采用重组DNA技术)。α2整联蛋白和β1整联蛋白的编码核酸序列可分别参见Takada和Hemler，J Cell Biol 109(1)：397-407(1989；GenBank提交号X17033，后来更新为登录号NM 002203)和Argraves WS，J Cell Biol 105(3)：1183-90(1987；GenBank提交号X07979.1，和代表备选剪接变体的有关序列)。
α2β1整联蛋白分子的结构域I指α2亚基内该α2β1整联蛋白分子的一个区域，其描述例如可参见Kamata等，J Biol Chem 269：9659-9663(1994)；Emsley等，J Biol Chem 272：28512(1997)和Cell 101：47(2000)。人α2整联蛋白结构域I的氨基酸序列见SEQ ID NO：11(也见例如SEQ IDNO：107)。α2整联蛋白结构域I的氨基酸序列见SEQ ID NO：11(也见例如SEQ ID NO：107)。α2整联蛋白的结构域I含有MIDAS类型的配体结合位点(金属离子依赖的粘附位点)，该位点对支持配体结合的给定二价阳离子具有需求和特异性。大鼠α2整联蛋白结构域I的氨基酸序列见表28中的SEQ ID NO：93(也见如SEQ ID NO：113)，小鼠的见SEQ ID NO：94(也见如SEQ ID NO：114)。已从食蟹猴和弥猴的全血分离的白细胞克隆了其结构域I的序列，食蟹猴和弥猴的结构域I序列分别是SEQ IDNO：103(DNA)、SEQ ID NO：171(氨基酸)；和SEQ ID NO：104(DNA)、SEQ ID NO：172(氨基酸)。
TMC-2206(BHA2.1)表位指人α2整联蛋白结构域I中TMC-2206抗体结合的区域。此表位跨越包括α2整联蛋白结构域I的氨基酸残基K40、N73、Q89、Y93、R165和N166以及任选的α2整联蛋白结构域I其它氨基酸残基的区域。
α2整联蛋白相关疾病指涉及导致靶组织中异常细胞反应的α2整联蛋白依赖性过程/功能(如结合、活化)的疾病、紊乱或病症。与疾病相关的α2整联蛋白依赖性过程的例子包括：胶原蛋白依赖性细胞反应，如细胞因子表达增加和细胞增殖所涉及的反应，T细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞功能方面，炎性疾病，乳腺导管形态发生，表皮伤口愈合和血管发生。α2整联蛋白相关疾病的例子包括但不限于：包括但不限于炎性肠病(如节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)的炎性疾病和病症、移植反应(包括移植排斥)、视神经炎、脊髓损伤、类风湿关节炎、多发性硬化症(包括治疗与其相关的神经后遗症和以复发为特征的多发性硬化症)、自身免疫疾病或紊乱(包括系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、雷纳德综合征、实验性自身免疫脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病)、幼年型糖尿病、和血管生成异常或高于正常相关的疾病(如糖尿病性视网膜病变、衰老相关黄斑退变、心血管疾病、牛皮癣、类风湿关节炎和癌症)，以及诱发炎性反应的感染。
治疗α2β1整联蛋白相关疾病指本发明所述抗α2整联蛋白抗体的治疗性和预防性用途。需要治疗的那些患者包括已患有疾病或需要预防或延缓疾病发作的患者。
哺乳动物，包括用于治疗目的的哺乳动物，指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农牧动物、动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛等等。优选的哺乳动物是人。
间歇或定期施用是持续某一定时间和以有规律的时间间隔施用，宜分开剂量施用一天以上。
术语抗体或免疫球蛋白采用其最广义，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体和抗体片段，只要它们显示具有所需的生物学活性。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、双抗体、线形抗体、单链抗体分子、单结构域抗体(如骆驼的(Camelids))、鲨鱼NAR单结构域抗体和由抗体片段组成的多特异性抗体。抗体片段也可指包含CDR或抗原结合域的结合部分，包括但不限于：VH区(VH，VH-VH)、Anticalin、PepBodiesTM、抗体-T细胞表位融合物(Troybodies)或Peptibodies。
单克隆抗体指获自基本上均一的抗体群的抗体，如该群所含的各个抗体都相同，除了可能存在的微量天然产生的突变外。单克隆抗体具有高度特异性，是针对一个抗原位点的。此外，与常规的(如多克隆)包含针对抗原上不同决定簇(即表位)的不同抗体的抗体制品相反，各单克隆抗体只针对抗原上的至少一个决定簇。修饰的“单克隆抗体”表示该抗体的特征是获自基本上均一的抗体群，并不解释为要用任何特定方法产生该抗体。例如，单克隆抗体可用Kohler等，Nature 256：495(1975)最先报导的杂交瘤方法制备，或用重组DNA方法制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。也可从噬菌体抗体库，例如用Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)和Marks等人，J Mol Biol 222：581-597(1991)所述的技术分离得到单克隆抗体。也可用美国专利No.6,025,155和6,077,677以及美国专利申请公开号2002/0160970和2003/0083293中描述的技术分离获得单克隆抗体(也参见如Lindenbaum等，Nucleic Acids Research 32(21)：0177(2004))。
单克隆抗体可包括嵌合抗体，此抗体中的重链和/或轻链的一部分与一特定种类动物的抗体相同，或与其相应序列同源，或属于特定类型或亚类抗体，而重轻链的其余部分与源自另一种动物的抗体的相应序列相同，或与其相应序列同源，或属于另一类型或亚类抗体，以及单克隆抗体的片段，只要它们显示具有所需的生物学活性(小鼠-人嵌合抗体，见美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81：6851-6855(1984)。
超变区指抗体中负责结合抗原的氨基酸残基部分。超变区包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基(如轻链可变区的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区的残基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))，和/或轻链可变区中的超变环(如残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区中的超变环26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；见Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。构架或FR残基是可变区残基中除超变区残基以外的那些残基。对于本发明所述的抗体，基于Kabat编号体系鉴定CDR和构架区，除重链的CDR1按Oxford Molecular′s AbM定义限定为跨越残基26-35外。Oxford Molecular′s AbM抗体建模软件(http://people.cryst.cck.ac.uk/～ubc07s/)(Martin等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86，9268-9272(1989)；Martin等，Methods Enzymol.，203，121-153(1991)；Pedersen等，Immunomethods，1，126(1992)；和Rees等，刊登在Sternberg M.J.E.编，蛋白结构预测(Protein Structure Prediction)，牛津大学出版社，牛津，141-172.(1996))联合采用Kabat的CDR和Chothia超变区编号体系来定义CDR。
人源化的非人(如鼠)抗体可以是含有最少衍生自非人免疫球蛋白序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(接受者或受者抗体)，其中受者的超变区残基被具有所需特异性、亲和性和容量的非人动物(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物的超变区残基置换。此外，可用相应的非人残基置换人免疫球蛋白的各个或各组Fv构架区(FR)残基。而且，人源化抗体可含有受者或供者抗体中没有的残基。制造这些修饰可进一步净化抗体的性能。通常，人源化抗体基本上都含有至少一个、一般两个超变区或结构域，其中所有或基本上所有的超变环都对应于非人免疫球蛋白的超变环，所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地也含有免疫球蛋白通常是人免疫球蛋白的恒定区(如Fc)的至少一部分(参见Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：10029(1989)；以及Foote和Winter，J.Mol.Biol.224：487(1992))。
单链Fv或scFv抗体片段可含有抗体的VH和VL区或结构域，这些结构域存在于一条多肽链中。通常Fv多肽在VH与VL结构域之间还含有一多肽接头使scFv能形成所需的抗原结合结构(综述参见例如Pluckthun刊登在“单克隆抗体药理学(The Pharmacology of MonoclonalAntibodies)”，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，纽约，269-315页，1994)。
双抗体指含有两个抗原结合位点的小抗体片段，这种片段含有的重链可变区(VH)和相连的轻链可变区(LH)在同一条多肽链(VH-VL)中。所用的接头太短使得同一链中的此二区之间不能配对，而迫使此二区与另一条链的互补区配对产生抗原结合位点。双抗体的较全面描述可参见例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993)。
线形抗体指Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))所描述的抗体。简言之，这些抗体含有一对串连的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，形成一对抗原结合区。线形抗体可以是双特异性或单特异性的。
分离的抗体指经鉴定的与其天然环境成分相分离和/或从天然环境回收的抗体。抗体天然环境中的污染成分是可能干扰抗体诊断或治疗用途的物质，包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，所述抗体纯化至(1)以Lowry法测定高于95％重量的抗体，最优选高于99％重量的抗体，(2)用旋转杯测序仪足以获得N-末端或内部氨基酸序列至少15个残基的程度，或(3)用考马斯蓝或优选银染色的还原或非还原条件下SDS-PAGE显示均质性。分离的抗体包括重组细胞原位产生的抗体，因为其至少不存在一种该抗体天然环境中的成分。然而通常要至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
加表位标签的抗体(epitope tagged antibody)指本发明抗体融合了一表位标签。此表位标签多肽具有足够的残基可提供所制备抗体识别的表位，而且此表位还足够短从而不会干扰抗α2β1整联抗体的活性。此表位标签优选足够独特，使针对它的抗体基本上不会与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽一般具有至少6个氨基酸残基，通常长约8-50个氨基酸残基(优选约9-30个残基)。例子包括流感血凝素(flu HA)标签多肽及其抗体12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165，1988)；c-myc标签和8F9、3C7、6E10、G4、B7和其9E10抗体(Evan等，Mol.Cell.Biol.5(12)：3610-3616，1985)；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等，Protein Engineering 3(6)：547-553，1990)。在某些实施方案中，此表位标签是一个补救受体结合表位，是负责延长IgG分子体内血清半寿期的IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中的一个表位。
细胞毒性剂指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质，可包括放射性同位素(如131I、125I、90Y和186Re)、化疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。非细胞毒性剂指不抑制或阻止细胞功能和/或不引起细胞破坏的物质。非细胞毒性剂可包括能被激活变成细胞毒的药剂。非细胞毒性剂可包括小珠、脂质体、基质或颗粒(参见例如美国专利公开2003/0028071和2003/0032995，其内容并入本文作参考)。可将此类药剂与本发明所述的抗α2β1整联蛋白抗体缀合、偶联或连接。
化疗药物指用于治疗癌症的化学化合物。化疗药物的例子包括但不限于：阿霉素、羟基红比霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(″Ara-C″)、环磷酰胺、噻替哌、多西紫杉(多西他赛)、白消安、细胞毒素(Cytoxin)、紫杉醇、氨甲蝶呤、顺铂、苯丙氨酸氮芥、长春花碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、长春新碱、长春烯碱、卡铂、替尼泊苷、柔红霉素、去甲柔红霉素、氨基喋呤、放线菌素D、丝裂霉素、埃斯波霉素(参见美国专利号4,675,187)、苯丙氨酸氮芥和其它有关的氮芥化合物。
前药指药学活性物质的前体或衍生物，与母体药物相比它们对肿瘤细胞的细胞毒性弱但能被酶活化或转变成更具活性的母体药物形式(参见例如Wilman，″癌症化疗中的前药(Prodrugs in Cancer Chemotherapy)″，Biochemical Society Transactions，14，375-382页，615届大会Belfast(1986)和Stella等，″前药：一种靶向药物递送的化学方法(Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery)″，Directed Drug Delivery，Borchardt等主编，247-267页，Humana出版社(1985)。前药包括但不限于：可转变成更具细胞毒性游离药物的含磷酸根的前药、含硫代磷酸根的前药、含硫酸根的前药、含肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含β-内酰胺的前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前药。可衍生为前药形式的细胞毒性剂的例子可以是上面所述的化疗药物。
标记物指与所述抗体直接或间接缀合或偶联结合的可检测化合物或组分。标记物本身可自我检测(例如放射性同位素或荧光标记)，或在酶标记物情形时，它可催化底物化合物或组分发生化学变化而被检测到。
固相指本发明抗体所附着的非水性基质。固相的例子本发明包括部分或全部由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮构成的那些基质。在某些实施方案中，根据上下文，固相可包括试验板的孔，在其它方面，固相是纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语也包括由分离颗粒组成的不连续固相，如美国专利号4,275,149中描述的那些。
脂质体指用于向哺乳动物递送药物(如本发明的抗体和任选的化疗药物)的由不同类型脂质、磷脂和/或表面活性剂形成的小囊泡。脂质体的各组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。
分离的核酸分子指经鉴定的与该抗体核酸天然来源通常相伴随的至少一种污染核酸分子相分离的核酸分子。分离的核酸分子是其天然形式以外的核酸分子。因此分离的核酸分子可与天然细胞中存在的核酸分子相区别。然而，分离的核酸分子包括细胞中含有的通常可表达所述抗体的核酸分子，例如，该核酸分子在染色体中的位置不同于天然细胞中的分子。
病毒载体指通过病毒感染或转导将核酸(如DNA或RNA)转移给细胞的运载体(Vehicle)。病毒载体的例子包括逆转录病毒、腺病毒、痘病毒和杆状病毒。
非病毒载体指通过非病毒方法，如电穿孔、注射和阳离子试剂介导的转染向细胞递送核酸的运载体，如CAN、质粒或染色体。
表达调控序列指使有效连接的编码序列在特定宿主生物中表达所需的那些DNA序列。适合原核细胞的调控序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用的有启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当将某核酸置于与另一核酸序列功能相关处时称它们为有效连接。例如，将一DNA前体序列或分泌前导序列有效连接至某多肽的编码DNA，它们可表达为前体蛋白而参与此多肽的分泌；启动子或增强子有效连接至某编码序列可影响此序列的转录；或将核糖体结合位点有效连接至某编码序列可在此位置促进其翻译。通常有效连接的DNA序列是毗连的，如分泌前导序列是毗连的和都在阅读相内，然而，增强子可不毗连。在常规的限制性位点处相连而实现这种连接。如果不存在此种位点，在常规实践中可利用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
本发明另一方面内容是施与受试者本发明的编码抗α2整联蛋白抗体的核酸分子来治疗α2β1整联蛋白相关疾病。合适的施用方法包括基因治疗法(见下面)。
可采用例如DNA直接注射、受体介导的DNA摄取、病毒介导的转染或非病毒介导的转染和基于脂类的转染，将本发明的核酸递送给体内细胞。这些方法都涉及使用基因治疗载体。可用直接注射法将裸DNA引入体内细胞(见例如Acsadi等，Nature 332：815-818，1991；Wolff等，Science247：1465-1468，1990)。可采用注射DNA入体内细胞中的递送装置(如基因枪)。这类装置可在市场上购得(例如从BioRad购得)。也可使裸DNA与阳离子如聚赖氨酸形成复合物，和细胞表面受体的配体偶联而将其引入细胞中(参见例如Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.263：14621；Wilson等，J.Biol.Chem.267：963-967，1992和美国专利号5,166,320)。DNA-配体复合物与受体结合可通过受体介导的胞吞作用促进DNA摄取。可利用DNA-配体复合物连接腺病毒的壳体破坏内体，从而释放物质到胞浆中以避免被胞内溶酶体降解(参见例如Curiel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8850，1991；Cristiano等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2122-2126，1993)。
经充分鉴定的缺陷型逆转录病毒可用作基因治疗的载体(综述见Miller，A.D.Blood 76：271，1990)。制备重组逆转录病毒及用其感染体内外细胞的方法可见“分子生物学当前方法(Current Protocols inMolecular Biology)”，Ausubel，F.M.等主编，Greene出版协会(1989)，第9.10-9.14章，以及其它标准实验室手册。合适的逆转录病毒例子包括本领域技术人员熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适的包装病毒系包括.psi.Crip，.psi.Cre，.psi.2和.psi.Am。逆序转病毒已被用来将各种基因引入体外和/或体内的许多不同类型细胞中，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(参见例如Eglitis等，Science230：1395-1398，1985；Danos和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：6460-6464，1988；Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3014-3018，1988；Armentano等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-6145，1990；Huber等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8039-8043，1991；Ferry等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-8381，1991；Chowdhury等，Science254：1802-1805，1991；van Beusechem等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7640-7644，1992；Kay等，Human Gene Therapy 3：641-647，1992；Dai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10892-10895，1992；Hwu等，J.Immunol.150：4104-4115，1993；美国专利号4,868,116；美国专利号4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345和PCT申请WO 92/07573)。
为用作基因治疗载体，可操作腺病毒的基因组使之编码和表达本发明的核酸化合物，但不激活腺病毒在正常病毒裂解生命周期中的复制能力。参见例如Berkner等，BioTechniques 6：616，1988；Rosenfeld等，Science252：431-434，1991，和Rosenfeld等，Cell 68：143-155，1992。本领域技术人员熟知合适的腺病毒载体是衍生自腺病毒Ad5型dl324毒株或腺病毒其它病毒株，如Ad2、Ad3、Ad7等。重组腺病毒的优点是它们不需要分裂细胞即能进行有效的基因递送，因而可用于感染各种各样类型的细胞，包括气道上皮细胞(Rosenfeld等，1992，见上)、内皮细胞(Lemarchand等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6482-6486，1992)、肝细胞(Herz和Gerard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2812-2816，1993)和肌细胞(Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2581-2584，1992)。
可采用腺伴随病毒(AAV)作为递送DNA的基因治疗载体用于基因治疗目的。AAV是一种天然存在的有缺陷病毒，需要另一种病毒如腺病毒或疱疹病毒作为辅助病毒才能有效复制和进入生产性生命周期(Muzyczka等，刊登于Curr.Topics in Micro.and Immunol.158：97-129，1992)。可利用AAV将DNA整合入非分裂细胞中(参见例如Flotte等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-356，1992；Samulski等，J.Virol.63：3822-3828，1989和McLaughlin等，J.Virol.62：1963-1973，1989)。可使用如Tratschin等，Mol.Cell.Biol.5：3251-3260，1985所述的AAV载体将DNA引入细胞中(参见例如Hermonat等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470，1984；Tratschin等，Mol.Cell.Biol.4：2072-2081，1985；Wondisford等，Mol.Endocrinol.2：32-39，1988；Tratschin等，J.Virol.51：611-619，1984，和Flotte等，J.Biol.Chem.268：3781-3790，1983)。慢病毒基因治疗载体也适合用于本发明。
基因治疗的通用方法是本领域已知的。参见例如Anderson等人的美国专利号5,399,346。递送遗传物质的生物相容性胶囊的描述见Baetge等人的PCT公开文本WO 95/05452中先前曾报导的将基因转移入造血细胞的方法(参见Clapp，D.W等，Blood 78：1132-1139，1991；Anderson，Science 288：627-9，2000，和Cavazzana-Calvo等，Science 288：669-72，2000)。
细胞、细胞系、细胞培养物通常可互换使用，所有这类称呼都包括后代。转化子和转化细胞(例如获自核酸、载体、病毒等的转染、转化或转导)包括衍生自它们的原代细胞和培养物而不论转移的数目多少。也可理解所有的后代细胞DNA成分不会精确相同，这是由于精心考虑的或不经心的突变所致。原始转化细胞中经筛选具有相同功能或生物学活性的突变体后代细胞也包括在本发明中。当试图用不同的名称时，从上下文中即可知其含义。
本发明所述的人源化抗体包括具有源自受者人抗体分子的可变区构架、源自供者鼠抗体的超变区或CDR序列及(如果存在)源自人序列的恒定区的抗体。
所构建的本发明抗体含有鼠单克隆抗体克隆BHA2.1重链可变区和轻链可变区的CDR(Hangan等，Cancer Res.56：3142-3149，1996)。构建抗体的优选起始物质是抗α2整联蛋白抗体，如BHA2.1杂交瘤分泌的抗体(如TMC-2206)，它们是针对人α2整联蛋白的功能阻断性抗体，其结合活性依赖于靶向的α2整联蛋白中是否存在完整的结构域I。含有TMC-2206(或BHA2.1)识别的特异性表位的抗体优选包括能结合α2整联蛋白分子的失活构象和/或没有配体模拟物活性的抗体，优选地为具有TMC-2206(或BHA2.1)表位特异性的抗体，虽然它们能与白细胞和血小板上的α2β1整联蛋白相互作用，但在施用浓度(包括体内治疗剂量)时，不会导致血小板激活和导致活化血小板在胶原蛋白上凝聚、对出血只有极小作用或没有作用和/或不伴有出血并发症。
可构建抗体，其中受者人抗体分子轻链可变区的选择应根据可能的受者人抗体分子可变区与鼠抗体轻链可变区的同源性加以考虑。优选候选的胚系受者人抗体分子来降低潜在的抗原性。胚系数据库由通读重链FW3区末端和部分读入CDR3序列的抗体序列构成。对于FW4区的选择，宜检索所选择的胚系分子产生的成熟抗体序列的数据库，在重组抗体分子中也宜选择采用合适的同源性FW4区。受者人抗体分子宜选自与供者鼠抗体分子相同类型的轻链，并且是与供者鼠抗体分子相同标准结构类型的可变区。受者人抗体分子轻链可变区选择的第二种考虑包括供者鼠分子与受者人分子之间的CDR在长度上的同源性。受者人抗体分子宜通过同源性检索V-BASE数据库来选择，也可采用其它数据库，如Kabat数据库和公开的NCBI数据库。对于具有与TMC-2206相同或相似表位特异性和/或功能特性的人源化抗α2整联蛋白抗体，优选的受者人抗体分子轻链是SEQID NO：37，其具有FW 1-3区的胚系抗体序列A14，和FW4区的序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：38)，代表成熟κ1轻链的共同FW-4区(如轻链序列AAB24132(NCBI登录gi/259596/gb/AAB24132)。
受者人抗体分子的重链可变区的选择可基于可能的受者分子的可变区与鼠抗体重链可变区之间的同源性加以考虑，从而构建抗体。优选候选的胚系受者人抗体分子来降低潜在的抗原性。胚系数据库由通读重链FW3区末端和部分读入CDR3序列的抗体序列构成。对于FW4区的选择，宜检索所选择的胚系分子产生的成熟抗体序列的数据库，在重组抗体分子中也宜选择采用合适的同源性FW4区。受者人抗体分子宜选自与供者鼠抗体分子相同类型的重链，并且是与供者鼠抗体分子相同标准结构类型的可变区。受者人抗体分子重链可变区选择的第二种考虑包括供者鼠分子与受者人分子之间的CDR在长度上的同源性。受者人抗体分子宜通过同源性检索V-BASE数据库来选择，虽然也可采用其它数据库，如Kabat数据库和公开的NCBI数据库。对于具有与TMC-2206相同或相似表位特异性和/或功能特性的抗α2整联蛋白抗体，优选的受者人抗体分子重链是SEQ IDNO：39，其具有FW 1-3区的胚系抗体序列4-59(SEQ ID NO：12)，以及由FW 4区(SEQ ID NO：13)的4-59胚系序列产生的成熟抗体CAA48104.1(NCBI登录gi/33583/emb/CAA48104.1)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本发明所述的非人α2整联蛋白抗体的人源化方法包含在以下实施例中。为了人源化抗α2整联蛋白抗体，先获得非人抗体起始材料，包括免疫(动物)制备抗体或购买商品化抗体。本发明中描述了产生抗体的示范性技术。
用于产生抗体的α2β1整联蛋白抗原，例如可以是可溶形式的α2β1整联蛋白或α2β1整联蛋白的其它片段(如含有人α2整联蛋白结构域I的α2β1整联蛋白片段(SEQ ID NO：11)；也参见SEQ ID NO：107)。本领域技术人员根据α2整联蛋白的序列(如SEQ ID NO：8所示的人α2整联蛋白)可知道用于产生抗体的其它形式α2整联蛋白。
宜通过给动物多次皮下(sc)、静脉内(iv)或腹膜内(ip)注射相关抗原(加或不加佐剂)来产生多克隆抗体。可采用双功能或衍生试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基连接)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R与R1是不同的烷基)，将相关抗原与在所免疫动物中具有免疫原性的蛋白质(如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)相缀合。
可将抗原、免疫原性缀合物或衍生物(例如家兔100μg，小鼠5μg)与3倍体积的弗氏完全佐剂混合，多点皮内注射此溶液来免疫动物。一个月后用该抗原或缀合物(如原先免疫所用量的1/5-1/10)和弗氏完全佐剂皮下多点注射进行加强免疫。7-14天后动物采血，取血清检测抗体滴度。给动物加强免疫直到抗体滴度达到平台。对于用缀合物免疫，优选用同样的抗原但与不同蛋白质缀合和/或通过不同的交联试剂缀合，给动物作加强免疫。也可在重组细胞培养物中将缀合物制成融合蛋白。还有，凝聚剂如明矾适合用于增强免疫应答反应。
可用Kohler等，Nature，256：495(1975)首先报导的杂交瘤方法，或用重组DNA方法(例如美国专利号6,204,023)制备单克隆抗体。也可用美国专利号6,025,155和6,077,677以及美国专利申请公开号2002/0160970和2003/0083293中所述的技术(也参见例如Lindenbaum，等，NucleicAcids Research 32(21)：0177，2004)制备单克隆抗体。
在杂交瘤技术中，免疫小鼠或其它合适的宿主动物如大鼠、仑鼠或猴(如以上所述)，以诱导淋巴细胞产生抗体或产生能特异性结合免疫用抗原的抗体。或者体外免疫淋巴细胞，然后用合适的融合试剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(参见例如Goding，单克隆抗体：原理和实施(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，59-103页(Academic Press，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种和在适合的优选含有抑制未融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基中培养。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤培养基一般包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是能有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定地高水平产生抗体和对培养基如HAT培养基敏感的那些细胞。其中优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如从获自Salk研究所细胞分配中心(Salk InstituteCell Distribution Center，美国加利福利亚圣地亚哥)的MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤和从获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.USA)的SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的那些骨髓瘤系。也已报导了用人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系来生产人单克隆抗体(例如Kozbor，J.Immunol.，133：3001，1984；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987))。
检测杂交瘤细胞生长的培养基中产生的抗所述抗原的单克隆抗体。优选用免疫沉淀法或体外结合试验(如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA))来检测杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
用例如Munson等，Anal.Biochem.，107：220，1980的斯卡查德分析法测定单克隆抗体的结合亲和性。
鉴定到能产生所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，将其克隆用有限稀释法亚克隆并用标准方法培养(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在体内如动物中生长为腹水瘤。
可用常规的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和/或亲和层析，将亚克隆杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分离。
易于用常规方法(例如用能特异性结合单克隆抗体重链和轻链编码基因的寡核苷酸探针)分离编码单克隆抗体的DNA并进行测序。杂交瘤细胞可作为这类DNA的优选来源。一旦分离得到此DNA，可将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，包括不能产生免疫球蛋白的细胞，以在重组的宿主细胞中合成单克隆抗体。以下进一步详细描述抗体的重组产生。
本发明描述了示范性抗α2整联蛋白抗体人源化方法的实施例。在某些实施方案中，希望产生人源化抗体的氨基酸序列变体，特别是当这样可改进人源化抗体的结合亲和性或其它生物学性能时。
通过在人源化抗α2β1整联蛋白抗体DNA中引入适当的核苷酸变化，或通过肽合成方法，来制备人源化抗α2β1整联蛋白抗体的氨基酸序列变体。此类变体包括例如在抗α2整联蛋白抗体TMC-2206(例如衍生自或根据SEQ ID NO：19和21所示的可变区序列)的氨基酸序列中删除和/或插入和/或替代残基。可制备氨基酸删除、插入和替代的任何组合以实现最终的构建体，只要该最终构建体具有所需的特性。这种氨基酸的变化也可能改变人源化抗α2整联蛋白抗体的翻译后加工，如糖基化位点数目或位置的改变。
有许多方法可用于制备人抗体或人样抗体(例如“人源化”)。抗体人源化的方法已经过多年的变化。一种方法是产生鼠可变区与人恒定区融合的所谓鼠-人FC嵌合体(参见例如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855，1984；美国专利No，5,807,715)。另一种方法揭示了根据超变性(Kabat等，J.Biol.Chem.252：6609-6616，1977；Kabat，Adv.Protein Chem.32：1-75，1978)和标准结构(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(4)：901-17，1987；Lazakani等，J.Mol.Biol.272：929，1997)不难鉴定CDR的事实，以及通过将非人动物抗体的CDR区(称为供者CDR)移植到人抗体构架(称为受者构架)上可将其人源化，参见例如Jones等，Nature321(6069)：522-5，1986；(也参见例如美国专利号5,225,539；美国专利号6,548,640)。根据结晶学分析这6个CDR环呈现簇状，不难鉴定关键的构架残基位于所谓的“游标(Vernier)”区中侧接这些CDR，或位于重-轻链介面(参见例如Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(4)：901-17，1987；Chothia等，J.Mol.Biol.186(3)：651-63，1985；Chothia等，Nature342(6252)：877-83，1989)。这些残基可能突变返回为鼠的残基而恢复这6个CDR的正确的相对方位(参见例如Verhoyen等，Science239(4847)：1534-6，1988；Reichman等，Nature 332(6162)：323-7，1988；Tempest等，Biotechnology(NY)9(3)：266-71，1991)。由于可变区在家族分类中小鼠与人之间具有相对较高的同源性(综述见例如Pascual和Capra，Adv.Immunol.49：1-74，1991)，这些早期研究也表明，通过选择与目的鼠抗体具有最高同源性的用作受者人抗体分子的人胚系序列，可最大程度减少亲和性丧失的可能性(参见例如美国专利号5,225,539；Verhoyen等，Science 239(4847)：1534-6，1988)。
已报导了构架之间的家族同源性和结构相关性可能影响到给定类型CDR标准结构的正确提呈(参见例如Al-Lazakani等，J.Mol.Biol.273(4)：927-48，1997，及其中的参考文献)。宜选择最佳拟合的人或胚系序列。可利用已有的抗体胚系序列数据库来确定给定的鼠重链和轻链家族亚型，及鉴定人亚家族中用作受者人抗体构架的最佳拟合序列。优选地考虑供者和受者构架的线性氨基酸同源性以及CDR标准结构这两者。
人源化抗α2整联蛋白抗体中可被替代的示范性重链残基包括以下构架残基成员H37、H48、H67、H71、H73、H78和H91(Kabat编号系统)中的任何一个或多个。优选替代这些构架残基中的至少4个。人源化抗α2整联蛋白抗体中特别优选替代的一组重链残基的示范例此处为H37、H71、H73和H78。同样也可替代轻链中的残基。要替代的示范性轻链残基包括以下残基成员L1、L2、L4、L6、L46、L47、L49和L71中的任何一个或多个。优选这些构架残基中至少三个被替代。人源化抗α2整联蛋白抗体中特别优选的一组替代轻链残基的示范例此处为L2、L46和L49。
用于鉴定人源化抗α2整联蛋白抗体中优选诱变位点的某些残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变法”(参见例如Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085，(1989))。鉴定了靶残基或残基组(例如带电荷残基，如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或负电荷氨基酸(优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代以影响该氨基酸与α2β1整联蛋白抗原的相互作用。然后通过在替代位点引入其它变化，精细构建功能上显示对替代敏感的那些氨基酸位点。因此，虽然可预设引入氨基酸变化的位点，但突变本身的性质不需要预先确定。例如为分析给定位点突变的性能，对靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机诱变，然后筛选所表达的具有所需活性的人源化抗α2整联蛋白抗体变体。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基至含百个或更多残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括含有N-末端甲硫氨酸残基的人源化抗α2整联蛋白抗体或与表位标签融合的抗体。人源化抗α2整联蛋白抗体分子的其它插入变体包括人源化抗α2整联蛋白抗体的N-或C-末端融合了能提高该抗体血清半寿期的酶或多肽(见下文)。
另一类型的变体是氨基酸替代变体。这些变体是人源化抗α2整联蛋白抗体分子中至少去除了一个氨基酸残基而其位点插入了不同的氨基酸。替代性诱变最感兴趣的位点包括超变环，但也可考虑构架区的改变。参与抗原结合的超变区残基或构架残基的替代通常为相对保守形式。这类保守性替代见以下冠以″优选的替代″的内容。如果此类替代导致生物学活性改变，那么可引入更实质性的变化，名为″示范性替代″或参见氨基酸分类的如下进一步描述，并筛选其产物。
  原先的残基  示范性替代   优选的替代
  Ala(A)  val；leu；ile   Val
  Arg(R)  lys；gln；asn   Lys
  Asn(N)  gln；his；lys；arg   Gln
  Asp(D)  glu   Glu
  Cys(C)  ser   Ser
  Gln(Q)  asn   Asn
  Glu(E)  asp   Asp
  Gly(G)  pro；ala   Ala
  His(H)  asn；gln；lys；arg   Arg
Ile(I)  leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L)  正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe Ile
  Lys(K)  arg；gln；asn   Arg
  Met(M)  leu；phe；ile   leu
  Phe(F)  leu；val；ile；ala；tyr   Leu
  Pro(P)  ala   Ala
  Ser(S)  thr   Thr
  Thr(T)  ser   Ser
  Trp(W)  tyr；phe   Tyr
  Tyr(Y)  trp；phe；thr；ser   Phe
Val(V)  ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 Leu
通过选择对维持(a)替代区多肽骨架结构例如折叠或螺旋构象、(b)分子靶位点电荷或疏水性或(c)侧链体积上有显著不同作用的替代来完成该抗体生物学性能的实质性修饰。天然存在的残基根据侧链的共同性质可分成几组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳族残基：trp、tyr、phe。
非保守性替代是使这些类型之一的氨基酸残基换成另一类型残基。不参与维持人源化抗α2整联蛋白抗体正确构象的半胱氨酸残基通常也可用丝氨酸替代以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可在该抗体中加入半胱氨酸连接键以改进其稳定性(特别是当该抗体是抗体片段如Fv片段时)。
抗体的另一类氨基酸变体是改变该抗体原先的糖基化模式。这种改变是指该抗体中缺失一个或多个糖部分和/或加入了一个或多个原先不存在于该抗体的糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接指糖部分附着在天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是糖部分酶促结合至天冬酰胺侧链的识别序列。因此多肽中存在此三肽序列就产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一结合至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可利用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
常规通过改变抗体的氨基酸序列使其含有或缺失一个或多个上述三肽序列来加入或删除糖基化位点(对于N-连接的糖基化位点)。也可在原始抗体的序列中添加、替代、或删除一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生这种改变(对于O-连接的糖基化位点)。用本领域已知的各种方法可制备编码人源化抗α2整联蛋白抗体氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源中分离(当氨基酸序列变体是天然存在时)，或用寡核苷酸-介导(或定点)的诱变、PCR诱变或基因盒诱变早先制备的变体或非变体的人源化抗α2整联蛋白抗体来进行制备。
人源化抗α2整联蛋白抗体的氨基酸序列变体的氨基酸序列通常与最初的人源化抗体重链或轻链氨基酸序列(例如SEQ ID NO：21或SEQ IDNO：19分别所示的可变区序列)至少具有75％氨基酸序列同一性，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％和最优选至少95％氨基酸序列同一性，包括例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％氨基酸序列同一性。关于此序列的同一性或同源性，本发明定义为：在排列序列和引入空位(如需要)以达到最大百分序列同一性，将候选序列中的氨基酸残基与人源化抗α2整联蛋白抗体残基相同的百分率，而不考虑任何保守性替代(如上所述)作为序列同一性的一部分。该抗体序列中的N-末端、C-末端或中间延伸、删除或插入都不构成对序列同一性或同源性的影响。可用常用于比较两条多肽氨基酸位置相似性的标准方法来测定这种序列同一性。利用计算机程序如BLAST或FASTA，将两条多肽排列它们的各个氨基酸(沿一条或两条序列的全长，或沿一条或两条序列的预定部分)至最佳匹配。这些程序提供缺省的开放罚分和缺省的空位罚分，以及评分矩阵如PAM250(一种标准的评分矩阵；参见Dayhoff等，刊登于Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，补充本3，1978)可与该计算机程序联用。例如，同一性百分率可计算如下：相同匹配的总数乘以100再除以匹配区中较长序列的长度与引入该较长序列中为对齐两条序列而加入的空位数之和。
用本发明所描述的方法筛选具有本发明所鉴定的人源化抗α2整联蛋白抗体所需特征的抗体。例如，提供筛选具有优选特征和功能的候选抗α2整联蛋白抗体的方法，包括筛选能结合感兴趣抗体(例如能与TMC-2206抗体竞争、抑制或阻断与α2β1整联蛋白结合的那些抗体)所结合的α2β1整联蛋白表位的抗体。示范性方法和材料的描述见实施例13。可进行交叉阻断试验，其描述例如可见Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Harlow和David Lane主编(1988)。此外，或者备选地，可进行表位作图(其描述可见例如Champe等，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995))来确定该抗体是否能结合感兴趣的表位(参见例如实施例12的TMC-2206表位作图研究)。
类似地，可利用固定的α2β1整联蛋白在竞争试验中测定Ki值(参见例如实施例2)来确定其相对的结合能力。例如，采用与上述相类似的试验系统，在存在不同浓度未标记的候选抗体时，用荧光标记的Eu-TMC-2206培育特定时间后，检测结合的Eu-TMC-2206量。用Prism软件(GraphPad公司，CA)将抑制曲线与“单点竞争模式”相拟合获得IC50值和用Cheng与Prusoff公式(Biochem，Pharmacol.22(23)：3099-108，1973)计算出Ki值。
例如，希望在实施例2所述的条件下制备、鉴定和/或选择具有有益结合性能的人源化抗α2整联蛋白抗体，在所述条件下检测候选抗体能否阻断α2β1整联蛋白介导的细胞粘附，如实施例2所述与TMC-2206和TMC-2206衍生的小鼠-人嵌合抗体作比较。例如，制备表达人α2整联蛋白和内源性仓鼠β1的CHO细胞(Symington等，J.Cell Biol.120(2)：523-35，1993)，并用CFSE(Molecule Probes，OR)标记。制备标记的细胞并调整细胞浓度，将细胞保存在暗处直到使用。制备胶原蛋白包被的平板(大鼠尾巴胶原蛋白1型；BD Biosciences)，将各种系列稀释的抗体溶液加入该胶原蛋白平板中。将标记细胞加入板孔中，培育平板。洗涤后裂解细胞，读取荧光强度(激发光485nm；发射光535nm)。计算各抗体的抑制活性。
此外，可按实施例2所述计算出候选抗体对固定的α2β1整联蛋白配体的结合常数。用血小板α2β1整联蛋白包被96孔微量滴定板(GTI公司，WI定制的人血小板α2β1包被板)的各孔，然后封闭。例如，为测定TMC-2206对其α2整联蛋白抗原的亲和性，可采用荧光标记的TMC-2206或同种型对照IgG抗体(参见以下实施例)。加入荧光标记的抗体，包括Eu-TMC-2206或Eu-同种型对照IgG以封闭α2β1整联蛋白微量滴定板。培育此封闭板使抗体-抗原相互作用达到平衡后，将各孔中的样品转移到含有增强溶液的新孔中测定游离(未结合)标记。也将增强溶液加入到空孔中测定结合的标记。用斯卡查德分析计算抗α2整联蛋白抗体的Kd值。通过在竞争试验中测定Ki值可测定TMC-2206衍生抗体(包括衍生自或基于TMC-2206的人源化抗体)的相对亲和性。例如，对于竞争试验，在不同浓度未标记抗α2整联蛋白抗体(包括TMC-2206或TMC-2206衍生的或以其为基础的嵌合抗体(包括人源化的))或同种型对照IgG的存在下，将Eu-标记的TMC-2206加到α2β1-包被孔中。培育一段时间达到平衡后，洗涤各孔，并将结合的标记抗体的水平测定为各孔中保留的Eu标记物。用上述直接结合试验获得的对Eu-TMC-2206抗体的Kd值从EC50值得到其Ki值。
在某些实施方案中，人源化抗α2整联蛋白抗体是一种抗体片段。已开发了各种技术来产生抗体片段。常规地，通过蛋白酶消化完整抗体来产生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117，1992和Brennan等，Science 229：81，1985)。然而可直接用重组的宿主细胞如细菌生产这些片段(参见例如Better等，Science 240(4855)：1041-1043，1988；美国专利号6,204,023)。例如，Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌中回收，用化学方法偶联形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167，1992)。按照另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离得到F(ab′)2片段。技术人员明白生产抗体片段的其它技术。
在某些实施方案中，可能需要产生对至少两个不同表位具有结合特异性的多特异性(例如双特异性)人源化抗α2整联蛋白抗体。示范性的双特异抗体(例如具有两个不同的结合臂)能结合α2β1整联蛋白的两个不同表位，或者，可将一个抗α2整联蛋白抗体臂与能结合白细胞上的触发分子如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγR1(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂相组合，以使细胞防御机制聚集到其表面具有结合的α2β1整联蛋白的细胞上。可利用双特异性抗体将细胞毒性剂定位于其表面具有结合的α2β1整联蛋白的细胞上。这些抗体拥有α2β1整联蛋白结合臂和细胞毒性剂结合臂(例如多花白树毒蛋白(gelonin)、肥皂草毒蛋白、抗干扰素α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链或放射性同位素半抗原)。制备的双特异性抗体可以是全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
按照制备双特异性抗体的另一方法，可对一对抗体之间的介面进行工程改造使从重组的细胞培养物回收得到的异源二聚体百分比最大。这种优选的介面包含抗体恒定区CH3区的至少一部分。此法中，将一个或多个小侧链氨基酸用大侧链氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)替代。在第二种抗体的介面上用小氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链产生与大侧链相同或较小的补偿性空穴。这提供了使异源二聚体产量增加超过其它不良终末产物如同源二聚体的机制(参见例如WO96/27011)。
双特异性抗体包括交联抗体或异质缀合抗体。例如，所述异质缀合抗体中的一个可与亲和素缀合，另一个可与生物素缀合。可用常规交联方法制备异质缀合抗体。合适的交联剂是本领域熟知的，其描述可参见例如美国专利号4,676,980和其中的一些交联技术。
从抗体片段产生双特异性抗体的技术文献中已有描述。可用化学连接法制备双特异性抗体。例如Brennan等(Science 229：81(1985))描述了一种方法，其中将完整的抗体经蛋白酶水解切割产生F(ab′)2片段。在二巯基化物络合剂亚砷酸钠存在下将这些片段还原而稳定邻近的二巯基，防止了分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab′片段转变成硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一用巯乙胺还原转变成Fab′-巯基，与等摩尔量的另一Fab′-TNB衍生物混合，形成双特异性抗体。产生的这种双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
可将从大肠杆菌回收的Fab′-SH片段化学偶联形成双特异性抗体。例如，Shalaby等(J.Exp.Med.175：217-225(1992))描述了产生完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的方法。将各Fab′片段分别分泌自大肠杆菌并在体外直接化学偶联形成双特异性抗体，形成的这种双特异性抗体能结合过量表达HER2受体的细胞和正常的人T细胞，以及触发人细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。
已报导了从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的技术。例如采用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体(参见例如Kostgelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992))。通过基因融合使Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链连接于两种不同抗体的Fab′部分。将此种同源二聚体抗体在绞链区还原形成单体，然后重新氧化形成异源二聚体抗体。也可用此法产生异源二聚体抗体。双抗体技术(参见例如Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))提供了制备双特异性抗体片段的另一种机制。这些抗体片段含有通过一接头与轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)，由于此接头太短不能使同一链上的两个结构域配对，因此一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对而形成两个抗原结合位点。另一种利用单链Fv(sFv或scFv)二聚体制备双特异性抗体的方法也已被报导(参见例如Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994))。或者，如Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)所述产生的双特异性抗体可以是线性抗体。
考虑了具有二价以上的抗体。例如可制备三特异性抗体(参见例如Tutt等，J.Immunol.147：60(1991))。
考虑了人源化抗α2整联蛋白抗体的其它修饰。例如，可能需要修饰抗体使之具有效应子功能，以提高或降低此抗体例如治疗癌症时的效力。可在Fc区中引入半胱氨酸残基以在此区中形成链间二硫键。如此产生的同源二聚体抗体可改进内化能力和/或提高补体介导的细胞杀伤(CMC)能力和/或抗体依赖性细胞毒(ADCC)能力(参见例如Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992))。也可利用异质双功能交联剂制备抗肿瘤活性增强的同源二聚体抗体(参见例如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)的描述)。或者，可工程改造抗体使之具有双Fc区从而增强CMC和/或ADCC能力(参见例如Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989))。
可将包含人源化抗α2整联蛋白抗体的免疫缀合物与某种物质相缀合，这种物质可以是例如分子、组合物、复合物，或药剂，例如细胞毒性剂如化疗药物、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的具有酶活性的毒素或其片段)，或放射性同位素(例如放射性缀合物)，使药物靶向表达α2整联蛋白的细胞、组织或器官。这种免疫缀合物可用于将药物靶向递送到以存在α2或α2β1整联蛋白为特征的特定作用部位。
以上描述了产生这种免疫缀合物所用的化疗药物。可采用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的)、篦麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(Phytolaca americana proteins)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素或单端孢菌毒素(tricothecenes)。可利用各种放射性核素来产生放射性缀合的抗α2整联蛋白抗体。例子包括212Bi、131In、90Y或186Re。
可采用各种双功能蛋白偶联试剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二酰亚胺二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(如2，6-二异硫氰酸甲代亚苯酯)、或双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)，来制备抗体与细胞毒性剂的缀合药物。例如可按Vitetta等，Science 238：1098(1987)所述制备篦麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是放射性核素与抗体缀合的一种示例性螯合剂(参见例如WO94/11026)。
在另一实施方案中，将抗体与受体(如链亲和素)缀合，施与患者这种抗体-受体缀合药物，先靶向表达α2整联蛋白的细胞、组织或器官，再用清除剂去除未结合的缀合物，然后施与缀合了药剂如细胞毒性剂(如放射性核素)的配体(如生物素)。
也可将本发明所述的抗α2整联蛋白抗体制剂成免疫脂质体。用本领域已知的方法，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)和美国专利号4,485,045和4,544,545描述的方法制备含此抗体的脂质体。循环时间延长的脂质体可参见美国专利号5,013,556中所述。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组分以逆相蒸发方法产生特别有用的脂质体。挤压脂质体通过精细孔径的滤器产生具有所需直径的脂质体。可如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)所述通过二硫交换反应使抗α2整联蛋白抗体的Fab′片段与脂质体缀合。可任选地将化疗药物(如阿霉素)包含在脂质体中(参见例如Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989))。
在抗体引导的酶前药治疗(ADEPT)方法中，也可采用人源化抗α2整联蛋白抗体，将该抗体与能使前药(例如肽基化疗药物，参见例如WO81/01145)转变为活性药物的前药活化酶缀合(参见例如WO88/07378和美国专利号4,975,278)。可用于ADEPT的免疫缀合物中的酶组分包括能作用于前药将其转变为更具活性形式的任何酶。可用的酶包括但不限于：用于将含磷酸的前药转变为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸酯的前药转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒性5-氟胞苷转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞苷脱氨酶；用于将含肽前药转变为游离药物的蛋白酶，如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；用于转变含D-氨基酸成分的前药的D-丙氨酰羧基肽酶；用于转变糖基化前药为游离药物的糖切割酶如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；以及用于分别将氨基氮上以苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变为游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可采用也称为抗体酶(abzyme)的具有酶活性的抗体将本发明的前药转变为游离的活性药物(参见例如Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如本发明所述制备抗体-抗体酶缀合物，包括向表达α2整联蛋白的细胞、组织或器官递送此种抗体酶。
可用本领域熟知技术，包括采用上述异质双功能交联试剂，使酶共价结合于抗α2整联蛋白抗体。或者，可用本领域熟知的重组DNA技术构建含有抗α2整联蛋白抗体至少一个抗原结合区与酶的至少一个功能活性部分相连的融合蛋白(参见例如Neuberger等，Nature 312：604-608(1984))。
在本发明的某些实施方案中，可能需要用抗体片段而不是完整抗体，例如来提高对组织或肿瘤的渗透。也可能需要修饰此种抗体片段以提高其血清半寿期，为此可在此种抗体片段中，例如通过突变其适当区域加入补救受体结合表位，或通过DNA或肽合成，在与此抗体片段一末端或中央相融合的标签肽中加入此种表位而实现(参见例如WO96/32478)。
例如，可通过化学合成、或酶或化学切割抗体来共价修饰人源化抗α2整联蛋白抗体。用能与所选侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生试剂与该抗体的靶氨基酸残基反应，将对此抗体的其它类型共价修饰引入分子中。例如，最常利用半胱氨酰残基与α-卤乙酸盐(和相应的酰胺)如氯乙酸或氯乙酰胺反应产生羧甲基或羧基酰胺甲基衍生物。也可利用半胱氨酰残基与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸盐、N-烷基马来亚胺、二硫化3-氮-2-吡啶、二硫2-吡啶甲酯、对-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚、或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应而衍生。组氨酰残基可利用例如与焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0反应而衍生，因为此试剂对组氨酰侧链具有相对特异性。也可用对溴苯甲基甲基溴，此反应宜在0.1M二甲砷酸钠(pH 6.0)中进行。可利用赖氨酰残基和氨基末端残基，例如与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。与这些试剂的衍生反应能有效逆转赖氨酰残基的电荷。衍生含α-氨基残基的其它适合试剂包括亚氨酸酯如甲基吡啶亚氨酸甲酯、吡哆醛磷酸、吡哆醛、氯氢硼化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮，及与乙醛酸的转氨基酶催化反应。精氨酰残基，例如可通过与一种或几种常规试剂反应而加以修饰，所述试剂有苯乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酰残基的衍生反应需在碱性条件下进行因为其胍功能基团的pKa高。此外，这些试剂可与赖氨酸和精氨酸的ε-氨基反应。酪氨酸残基的修饰特别使人感兴趣的是例如通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷的反应将光谱标记引入酪氨酸残基。最常见的是分别用N-乙酰基咪唑(N-acetylimidizole)和四硝基甲烷形成O-乙酰基酪氨酰类和3-硝基衍生物。将酪氨酰残基用125I或131I碘化制成标记蛋白质用于放射免疫试验。羧基侧链基团例如天冬氨酰基或谷氨酰基选择性地通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′，其中R和R′是不同的烷基)如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓4，4-二甲基戊基)碳二亚胺进行反应而加以修饰。此外，天冬氨酰基或谷氨酰基残基可通过与铵离子反应而转变为天冬酰胺酰基或谷氨酰胺酰基。天冬酰胺酰基或谷氨酰胺酰基经常脱去酰胺基分别形成天冬氨酰基和谷氨酰基残基。这些残基在中性或碱性条件下脱去酰胺基。这些残基的脱酰胺基形式落在本发明的范围内。其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酸或苏氨酰基残基的羟基磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))、N-末端胺的乙酰化和C-末端羧基的酰胺化。
另一类共价修饰包括化学或酶法将糖苷与抗体偶联。这些方法的优点是它们不需要在具有N-或O-糖基化连接糖能力的宿主细胞中产生该抗体。取决于所用的偶联方式，糖可结合于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基如半胱氨酸的巯基，(d)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基，(e)芳族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基(参见例如WO87/05330；Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，259-306页(1981))。
去除该抗体上的任何糖部分，例如可用化学或酶法实现。化学方法去糖基需要使该抗体接触化合物三氟甲磺酸或等同化合物。这种处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外大部分或所有的糖被切除，而留下完整抗体(参见例如Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)；Edge等，Anal.Biochem.，118：131(1981))。酶法切除抗体上的糖部分可利用各种内切-和外切-糖苷酶来实现(参见例如Thotakura等，Meth.Enzymol.138：350(1987))。
该抗体的另一类型共价修饰包括连接该抗体与各种非蛋白聚合物之一，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧乙烯(参见例如美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337)。
编码人源化抗α2整联蛋白抗体的分离的核酸、以及含有该核酸的载体和宿主细胞和产生该抗体的重组技术本发明已有所描述。为了重组产生该抗体，分离编码该抗体的核酸并将其插入到复制载体中进一步克隆(扩增此DNA)或表达。不难用常规方法(例如用能特异性结合编码该抗体重链和轻链的寡核苷酸探针)分离编码该抗体的DNA和进行测序。许多载体可购得。此种载体的组分通常包含但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
可重组产生抗α2整联蛋白抗体，包括含有异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选信号序列或在其成熟蛋白或多肽的N-末端含有特异性切割位点的其它多肽。此种优选的异源信号序列是宿主细胞可识别和加工的序列(例如被信号肽酶切割)。对于不能识别和加工真核细胞信号序列(例如免疫球蛋白信号序列)的原核宿主细胞，可用原核细胞信号序列替代该信号序列，包括采用例如果胶酸盐裂解酶(如pelB)、碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定的内毒素II的前导序列。对于酵母分泌，可利用的酵母信号序列包括例如：酵母转化酶前导序列、因子前导序列(包括酵母(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)的α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列、或WO90/13646中描述的序列。对于在哺乳动物细胞中的表达，可购得和利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹病毒gD信号序列。将这种前体区域(例如信号序列)读框内连接于编码抗α2整联蛋白抗体的DNA。
表达和克隆载体均含有能使该载体在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常在克隆载体中，此种序列能使该载体不依赖于宿主染色体DNA而独立复制，其含有复制起点或自身复制序列。各种细菌、酵母和病毒的这类序列是人们熟知的。例如质粒pBR322的这种复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌，其2μ质粒起点适合酵母和各种病毒(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)，可用于哺乳动物细胞克隆载体。通常哺乳动物表达载体不需要这种复制起点组分(例如通常只采用SV40起点，因为它含有早期启动子)。
表达和克隆载体可含选择基因，也称为可选择性标记。典型的选择基因所编码的蛋白(a)能赋予对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)的抗性，(b)能补充营养缺陷型缺陷，或(c)能提供不能从复合培养基得到的重要营养物质(如编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因)。
选择方案的一个例子采用能停止宿主细胞生长的药物。用异源基因成功转化的那些细胞可产生能赋予药物抗性的蛋白质而存活于此选择方案。这类优势选择的例子采用药物氨甲蝶呤、新霉素、组氨醇、嘌呤霉素、霉酚酸和潮霉素。
哺乳动物合适的可选择标记的另一个例子是能鉴定摄入抗α2整联蛋白抗体核酸的细胞的那些成分，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长动物的金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，先通过在含DHFR竞争性拮抗剂的氨甲蝶呤(Mtx)培养基中培养所有的转化细胞来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当使用野生型DHFR时，适合的宿主细胞是DHFR活性有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)用编码抗α2整联蛋白抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种可选择标记如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共同转化，可在含有该可选择标记的选择试剂(包括氨基糖苷类抗生素如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中培养细胞进行选择(参见例如美国专利号4,965,199)。
酵母所用的一种合适的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。此trp1基因可提供缺乏在色氨酸中生长能力的突变酵母菌株，如ATCC编号44076或PEP4-1菌株的选择标记(参见例如Jones，Genetics，85：12(1977))。酵母宿主细胞基因组中存在trp1缺损时，通过在缺乏色氨酸培养基中培养提供了检测转化情况的有效环境。类似地，可用已知含有Leu2基因的质粒弥补Leu2-缺陷的酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，可采用衍生自1.6μ环形质粒pKD1载体转化克鲁维酵母。或者，采用Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)报导的乳酸克鲁维酵母(K.lactis)大规模生产重组牛凝乳酶的表达系统。也已公开了用工业化克鲁维酵母菌株可稳定多拷贝表达分泌成熟的重组人血清白蛋白的载体(参见例如Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991))。
表达和克隆载体通常含有宿主生物可识别的与抗α2整联蛋白抗体核酸有效连接的启动子。适合原核宿主的启动子包括阿拉伯糖启动子(如araB)、phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子如tac启动子。然而其它已知的细菌启动子也适用。细菌系统用的启动子还含有有效连接至编码抗α2整联蛋白抗体DNA的SD序列。
已知用于核细胞的启动子序列。大多数真核基因含有位于转录起始位点上游约25-30个碱基处的AT-丰富区。许多基因转录起始位点上游70-80个碱基处的另一序列是CNCAAT(SEQ ID NO：115)区，其中的N可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3′末端是AATAAA(SEQ ID NO：116)序列，此序列可以是将聚腺苷酸尾加到编码序列3′末端的信号。这类序列适合插入到真核表达载体中。
适合用于酵母宿主的启动子序列例子包括但不限于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。可诱导的具有可用生长条件控制转录额外优点的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适合用于酵母表达中的载体和启动子可参见EP 73,657中的描述。也优选酵母增强子与酵母启动子一起使用。
调控载体在哺乳动物宿主细胞中抗α2整联蛋白抗体的转录，例如可采用获自病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒或猿猴病毒40(SV40))基因组的启动子，或异源哺乳动物启动子，如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热激蛋白启动子，只要这类启动子与宿主相容。常规获得的SV40病毒早期和晚期启动子是也含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段。常规获得的人巨细胞病毒立即早期启动子是HindIII E限制性片段。在哺乳动物宿主中表达DNA的系统采用牛乳头瘤病毒作为载体，这已在美国专利号4,419,446中公开，并且该系统的修饰在美国专利号4,601,978中公开(也参见Reyes等，Nature 297：598-601(1982)，是关于在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子调控下在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA)。或者，可采用罗斯肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
在载体中插入增强子序列常能提高高等真核细胞对抗α2整联蛋白抗体编码DNA的转录。已经知道哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而常常采用真核细胞病毒的增强子。其例子包括：位于复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子(也参见例如Yaniv，Nature 297：17-18(1982)关于增强真核启动子活性的元件)。可在抗α2整联蛋白抗体编码序列的5′或3′位置，但优选在启动子的5′位点处将增强子剪接到载体中。可采用本领域熟知的其它基因调节系统(例如，可诱导系统如四环素可诱导系统和GeneSwitchTM)来调控编码抗α2整联蛋白抗体的DNA的转录。
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其它多核细胞生物的有核细胞)中所用的表达载体也含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。这类序列通常获自真核细胞或病毒DNA或cDNA的5′非翻译区，偶尔获自3′非翻译区。这些区域所含核苷酸区段转录为编码抗α2整联蛋白抗体mRNA的非翻译区中的聚腺苷酸片段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素的聚腺苷酸区(参见例如WO94/11026和其中公开的表达载体)。
克隆或表达此处所述载体中的DNA的合适宿主细胞是上述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。用于此目的的合适原核细胞包括真细菌，包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科如大肠杆菌属，如大肠杆菌，肠道细菌属，欧文氏菌属，克雷伯氏杆菌属，变形菌属，沙门氏菌属如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌，以及芽胞杆菌属如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，假单胞杆菌属如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属。合适的大肠杆菌克隆宿主包括大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)。
除原核细胞外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是抗α2整联蛋白抗体编码载体的合适克隆和表达宿主。在低等真核宿主微生物中最常用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的面包酵母。然而，许多其它的菌属、菌种、菌株常常可获得和使用，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属宿主，包括乳酸克鲁维酵母，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)，威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)，瓦尔提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)，或马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶罗威亚酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌属；里氏木霉(Trichodermareesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，包括链孢菌属、青霉菌属、弯颈霉属(Tolypocladium)，或曲霉属宿主如构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。
表达糖基化抗α2整联蛋白抗体的合适宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已有许多杆状病毒株和变体以及相应的允许的昆虫宿主细胞，来自例如已鉴定的诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)宿主。公众可利用各种用于转染的病毒株，例如可用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且可以使用特别是转染草地夜蛾细胞的病毒。
也可采用棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，增殖脊椎动物细胞包括各种哺乳动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞的例子包括：SV40转化的猴肾CV1细胞系(例如COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾293细胞系或悬浮培养生长的亚克隆293细胞(参见例如Graham等，J.GenVirol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(例如BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞包括缺乏DHFR的CHO细胞(参见例如DHFRUrlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠足细胞(例如TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)、猴肾细胞(例如CV1ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如VERO-76，ATCC CRL-1587)、人子宫颈癌细胞(例如HELA，ATCC CCL 2)、猫肾细胞(例如MDCK，ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝细胞(例如BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(例如Hep G2，HB8065)、小鼠乳腺肿瘤细胞(例如MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(参见例如Mather等，Annals N.Y Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞或人肝细胞瘤细胞系(例如Hep G2)。
用上述用于生产抗α2整联蛋白抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，在改进的适合诱导启动子的常规营养培养基中进行培养，选择转化株和/或扩增编码目的序列的基因。
在各种培养基中培养用于产生抗α2整联蛋白抗体的宿主细胞。市售培养基例如Ham′s F10(Sigma)、基本必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM，Sigma)适合用于培养这种宿主细胞。此外，可采用Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90103430；WO87/00195；或美国专利再公开号30,985中所述的任何一种培养基作为此种宿主细胞的培养基。在这些培养基的任何一种中，如需要可添加激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常最终浓度为微摩尔量的无机化合物)和葡萄糖或等同的能源物质。也可包含适当浓度的本领域技术人员知道的其它任何必需的添加剂。本领域技术人员知道选择培养条件，如温度、pH等，包括以上选择的用于表达的宿主细胞所使用的那些培养条件。
可利用例如蛋白A层析、离子交换层析、疏水反应层析、凝胶电泳、透析和/或亲和层析，从细胞(包括微生物或哺乳动物细胞)纯化抗α2整联蛋白抗体。蛋白A作为亲和配体是否适合取决于动物种类和此抗体中存在的免疫球蛋白Fc区的同种型。可用蛋白A纯化的抗体是基于人γ1、γ2或γ4重链(参见例如Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G可用于小鼠同种型和人γ3(参见例如Guss等，EMBO J.5：1516-1517(1986)。亲和配体结合的基质最常用琼脂糖，但也可用其它基质。机械性能稳定的基质如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，可达到的流速比用琼脂糖更快、加工时间更短。当此抗体含有CH3结构域时，可用Bakerbond ABXTM(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)来纯化。蛋白质纯化可包括以下一种或多种技术，如离子交换柱层析、乙醇沉淀、反相HPLC，二氧化硅层析、肝素SEPHAROSETM层析、阴离子或阳离子交换树脂层析(例如聚天冬氨酸柱)、聚焦层析、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和/或疏水作用层析。例如，可采用以下纯化步骤，对含有感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，洗脱缓冲液pH约为2.5-4.5，优选地在低盐浓度(例如0-0.25M的盐)下进行。
将具有所需纯度的抗α2整联蛋白抗体与任选的生理学可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂混合(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.主编(1980))，制成冻干或水溶液形式的抗α2整联蛋白抗体制剂(包括用于治疗性施用的制剂)用于贮藏。可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下应对接受者无毒，包含：缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯己双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间-甲苯酚)；低分子量(少于10个残基)多肽、蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG))。
抗体制剂还可含有一种以上特别标明用于治疗的活性化合物，优选具有互补活性彼此之间无不良影响的那些化合物。可能需要将抗α2整联蛋白抗体与目前用于预防或治疗所述疾病的一种或多种药物联用。此外，也可能需要提供免疫抑制剂。这类分子以对所述目的有效的量联合使用为宜。
活性成分也可用例如凝聚技术或界面聚合技术制备的微胶囊包裹，例如在微胶囊胶体药物递送系统(如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒或纳米胶囊)或大乳剂中分别采用羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)。这类描述例如可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.主编(1980)。
用于体内施用的制剂优选地为无菌的。这不难通过除菌过滤膜过滤而实现。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含该抗体的固体疏水聚合物组成的半渗透性基质，基质可以是成型制品，例如膜或微胶囊。缓释基质的例子包括：聚脂、水凝胶(如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物如LupronDepotTM(由乳酸-羟乙酸共聚物和柳培林(leuprolide acetate)组成的可注射微球，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然有些聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-羟乙酸能释放分子100天以上，但某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当包裹的抗体长时间留在体内时它们可能由于37℃暴露于水分而变性或凝聚，导致丧失生物学活性和免疫原性可能变化。根据所涉及的机制可为稳定化设计合理的策略。例如，如果发现凝聚是由于分子间通过巯基形成二硫键，那么可通过修饰含巯基残基、冻干酸性溶液、控制水分量、利用合适的添加剂和开发特定的聚合基质组合物而达到稳定化。
可用抗α2整联蛋白抗体作为亲和纯化试剂。此过程中，用本领域熟知的方法将该抗体固定在固相如交联葡聚糖树脂或滤膜上。使固定的抗体与待纯化的含有α2β1整联蛋白(或其片段)的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤支持物基本上去除样品中除结合于固定抗体的α2β1整联蛋白以外的基本上所有物质。最后用另一种合适的溶剂如pH 5.0的甘氨酸缓冲液洗涤支持物，释放抗体结合的α2β1整联蛋白。
抗α2整联蛋白抗体也可用于α2β1整联蛋白的诊断试验，如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。对于诊断应用，该抗体通常用可检测分子标记。已有许多标记物可购得，它们通常可分为以下类型：放射性同位素标记、荧光标记和酶-底物标记。放射性同位素如35S、14C、125I、3H和131I是有用的标记。例如用“当代免疫学方法(Current Protocols inImmunology)”第1和第2卷，Coligen等主编，Wiley-Interscience，纽约，N.Y.，出版(1991)中所述的技术，用放射性同位素可标记该抗体，放射活性例如可用液闪计数检测。也可用荧光标记，例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红素和德克萨斯红。例如，可用“当代免疫学方法(Current Protocols inImmunology)”(同上)中所述的技术将荧光标记与该抗体缀合。可用荧光计测定荧光。也可采用各种酶-底物标记(综述参见例如美国专利号4,275,149)。所述酶一般催化产色底物发生化学变化，此化学变化可用各种技术测定。例如，酶可催化底物的颜色变化，该变化可用分光光度法检测。或者，酶可改变底物发出的荧光或化学发光。上面已描述了定量检测荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应激发电子，而发射可被检测(如用化学发光检测仪)的光或转移能量给荧光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(如荧火虫萤光素酶和细菌萤光素酶，美国专利号4,737,456)、荧光素、2，3-二氢氮杂萘二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶酶体酶、糖氧化酶(如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶与抗体缀合技术的描述可参见例如O′Sullivan等“制备用于酶免疫试验的酶-抗体缀合物的方法(Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay)”，刊登于“Methods inEnzym”中(主编J.Langone & H.Van Vunakis)，Academic出版社，N.Y.，73：147-166(1981)。酶-底物组合的例子包括例如(i)辣过氧化物酶(HRPO)与底物过氧化氢酶，此过氧化氢酶能氧化色素前体化合物(如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)与生色底物对-硝基苯磷酸盐，和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(如邻-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷。本领域技术人员可购得许多其它酶-底物组合物(综述参见例如美国专利号4,275,149和4,318,980)。
有时通过间接方法将标记与抗体缀合。本领域技术人员知道实现此目的的各种技术。例如，可将抗体与生物素缀合，可将上述三种类型标记物的任何一种与亲和素缀合，或反之也然。将生物素选择性地与亲和素结合，从而以间接方式使标记与抗体缀合。或者，为实现标记与抗体的间接缀合，可将该抗体与小的半抗原(如地高辛)缀合，将一种不同类型的上述标记物与抗该半抗原的抗体(如抗地高辛抗体)缀合，从而实现该标记物与该抗体的间接缀合。
抗α2整联蛋白抗体不需要标记，用与抗α2整联蛋白抗体结合的标记抗体可检测其存在。抗α2整联蛋白抗体可用于任何已知的试验方法中，如竞争结合试验、直接或间接夹心试验和沉淀试验(参见例如Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.1987))。竞争结合试验依据标记的标准品与试样中的分析物竞争结合有限量的抗体。例如，试样中的α2β1整联蛋白含量与标准品结合抗体的量成反比。为了有利于结合的标准品量的检测，竞争前或后抗体通常为固相，这样可以方便地将与抗体结合的标准品和分析物与保持未结合的标准品和分析物分离。夹心试验采用二种抗体，各自能结合不同的待检测蛋白质的免疫原性部分或表位。在夹心试验中，试样中的分析物与固定在固相上的一级抗体结合，然后二级抗体与该分析物结合，从而形成不溶性三重复合物(参见例如美国专利号4,376,110)。所述二级抗体本身标记有可检测部分(例如直接夹心试验)或可用标记有可检测分子的抗免疫球蛋白抗体进行检测(例如间接夹心试验)。例如，一种类型的夹心试验是ELISA试验，其所用的可检测部分是酶。
对于免疫组化，其组织样品(包括肿瘤样品)可以是新鲜的或冻存的，或石蜡包埋和用防腐剂如甲醛固定的。
抗α2整联蛋白抗体也可用于体内诊断试验。通常用放射性核素(111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记该抗体，这样可利用免疫闪烁图定位组织，例如肿瘤组织。
为了方便，可在试剂盒中提供抗α2整联蛋白抗体，与预定量的各试剂和如何进行诊断试验的说明书包装在一起。在抗体用酶标记的情况下，试剂盒包括底物和酶需要的辅因子(例如提供可检测色素或荧光的底物前体)。试剂盒中可包括其它添加物，如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等等。试剂盒中提供的各种试剂的相对量可能有很大不同，例如提供的试剂溶液浓度能相当大地优化试验的灵敏度。提供的试剂也可以是干粉，通常是冻干粉，包括赋形剂，例如在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。
抗α2整联蛋白抗体可用于治疗本发明所述的各种α2β1整联蛋白相关疾病。可通过适当途径施与此抗α2整联蛋白抗体，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内或鼻内。如需要局部免疫抑制治疗，可病灶内施与此抗体(包括移植前用此抗体灌注或接触移植物。肠胃外施用包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，抗α2整联蛋白抗体适合用脉冲输注，例如递减剂量抗体施与。优选注射，最优选静脉内或皮下注射施用。这可能部分取决于施用是短期还是长期。
对于预防或治疗疾病，抗体的合适剂量取决于上述待治疗疾病的类型，疾病的严重程度和进程，抗α2整联蛋白抗体施用是治疗还是预防目的，先前的治疗，患者的临床病史和对该抗体的反应，和主治医师的处理决定。该抗体适合患者一次施用或系列治疗。
根据疾病的类型和严重程度，施与受试者此抗体的最初候选剂量约为1μg/kg-约15mg/kg或约0.05μg/kg-约20mg/kg，例如，分一次或多次施用或连续输注。一般日剂量范围是约1μg/kg-约100mg/kg或以上，取决于上述因素。根据病情可重复施用几天或更长，治疗持续直到疾病症状受到所需抑制。然而也可采用其它剂量方案。本领域技术人员不难监测这种治疗的进展。
配制抗α2整联蛋白抗体，确定剂量后以符合良好医学规范方式施用。这样做要考虑的因素包括待治疗的具体疾病、待治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病因、施用的时间安排、药理和毒性的结果研究、以及内科医生所知的其它因素。待施与该抗体的治疗有效量由这些考虑而定，是防止、缓解或治疗α2β1整联蛋白相关疾病的最小必须用量。此用量优选地低于对宿主有毒的或使宿主显著更易感染的用量。
抗α2整联蛋白抗体不需要，但也可任选地将其配制在共同施与的药物中或用作目前用于预防或治疗所述疾病的一种辅助治疗。例如，对类风湿关节炎，此抗体可与糖皮质激素Remicaid
Figure A20068005124900701
或已批准治疗类风湿关节炎的药物联用。对于多发性硬化症，此抗体可与干扰素β、Avonex、Copaxon或其它已批准的治疗多发性硬化症体症和症状的疗法联用。对于移植，此抗体可与上面所述的免疫抑制剂如环孢菌素A同时或分别使用来调节免疫抑制的效果。或者，还施与罹患α2β1整联蛋白相关疾病的哺乳动物α2β1整联蛋白拮抗剂。这类其它药物的有效量取决于制剂中抗α2整联蛋白抗体的量、疾病的类型或治疗、以及上述其它因素。这些药物通常采用与以前相同的剂量和施用途径，或以前所用剂量的约1-99％。
本发明提供用于治疗上述疾病的含有包括抗α2整联蛋白抗体在内的物质的制品(article)。这些制品包括容器和标签。合适的容器包括例如药瓶、小瓶、注射器和试管。容器可用各种材料如玻璃或塑料制成。容器中有能有效治疗疾病的组合物和具有灭菌的塞子(如容器可以是静脉输液袋或具有可用皮下注射针头穿剌的塞子)。该组合物中的活性药物是抗α2整联蛋白抗体。容器上(或所附)的标签标明该组合物用于治疗所选择的疾病。此制品也可包括第二容器，其包含可药用缓冲液如磷酸盐缓冲液、林格氏液或葡萄糖液。还可包含其它按商品化和用户观点所需的物质，包括其它缓冲液、稀释液、过滤器、针头、注射器和有使用说明的包装说明书。
上述原理可应用于例如BHA2.1杂交瘤分泌的抗α2整联蛋白抗体(Hangan等，Cancer Res.，56(13)：3142-9(1996))。此种抗体能结合人和大鼠的α2β1整联蛋白，但不结合鼠的α2β1整联蛋白。BHA2.1杂交瘤产生的此种抗体本发明称为TMC-2206，可从Chemicon(现为Millipore公司的一部分，目录号AB1998)购得。现已制得嵌合性(包括人源化的)TMC-2206变体并进行了体外分析。用TMC-2206抗体或类似抗体(包括能识别鼠α2β1整联蛋白的抗体)也进行了体内研究。提供以下实施例为了说明而非限制本发明。本说明书引用的所有文献的内容均并入本文作为参考。
                          实施例1
设计和制备了α2β1整联蛋白的特异性抗体。如本发明所述测定了先前未知的BHA2.1杂交瘤分泌的名为TMC-2206的鼠抗体的可变区序列。用RT-PCR从BHA2.1杂交瘤的mRNA克隆了VH和VL的cDNAs，所用的一组引物对应于鼠重链(VH)或轻链(VL)可变区N-末端的氨基酸，第二组引物分别对应于重链γ1和κ轻链的恒定区。按本发明所述标准方法分离mRNA，测定了从其合成的cDNA的序列。
用本领域技术人员所知的标准分子技术，从约1百万个(1x106个)表达TMC-2206的BHA2.1杂交瘤细胞分离获得胞浆mRNA。为分离poly AmRNA，将用5M硫氰酸胍裂解的细胞与oligo(dT)纤维素(Ambion，TX)混合，室温轻轻振摇培育60分钟。沉降oligo(dT)纤维素结合的poly(A)RNA，洗涤，然后加入洗涤旋转柱(Ambion，TX)。将此柱于3000×g离心1分钟，然后用200μL的10mM Tris、1mM EDTA(TE)缓冲液(pH 8.0)洗脱RNA，用0.1体积5M乙酸铵(NH4Ac)和2.5体积100％乙醇-20℃沉淀。离心沉淀此RNA，干燥，溶于DEPC-处理过的水。
用基于鼠重链(VH)或轻链(VL)可变区N-末端的引物，和对应于鼠γ1重链和κ轻链恒定区的第二组引物，通过逆转录合成了分离的BHA2.1mRNA的cDNAs。BHA2.1抗体的序列未知，因此采用了鼠抗体轻重链可变区N-末端的商品化简并引物(轻链引物混合物#27-1583-01和重链引物混合物#27-1586-01，购自Amersham Biosciences)，见表Table 1。据报告这些引物分别包含鼠轻重链N-末端的异源氨基酸组成。如下进行RT-PCR反应(Qiagen RT试剂盒)：0.5μg mRNA、10μL 5×RT缓冲液、2μL的10mMdNTP混合液、5μL各种10mM引物溶液和2μL酶混合液，总体积50μL。50℃进行逆转录反应30分钟，接着进行95℃ 15分钟PCR激活步骤，并以适合于扩增重轻链可变区的简并混合引物的PCR程序结束：94℃30秒，56℃ 30秒和72℃ 1分钟，28个循环，最后72℃延伸10分钟。后续PCR反应所用的引物对列于表2中，由Retrogen(圣地亚哥，CA)合成。所列的所有引物为5′-3′。
                表1
 引物名   核苷酸序列(5′-3′)
 VHL-正向(SEQ ID NO：14)   CCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT
 HC-反向(SEQ ID NO：15)   GGGGCCAGTGGATAGAC
 VLL-正向(SEQ ID NO：16)   CCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG
 LCκ-反向(SEQ ID NO：17)   GTTGGTGCAGCATCAGC
                            表2
  引物名   核苷酸序列(5′-3′)
  Igκ-S(SEQ ID NO：27)   TCGAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGAGACGCG
  Igκ-AS(SEQ ID NO：28)   AATTCGCGTCTCCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGGC
  TMC-2206-r5′(SEQ ID NO：22) CCCGAATTCACAGGTGCAGTTGAAGGAGTCA
  TMC-2206-r3′(SEQ ID NO：23)   CGGGATCCTTAGGATCATTTACCAGGAGAGTGGGA
  TMC-2206-k5′(SEQ ID NO：24)   CCCGAATTCACAATTTGTTCTCACCCAGTCT
  TMC-2206-k3′(SEQ ID NO：25) CGGGATCCTTATCTCTAACACTCATTCCTGTTGAA
  TMC-2206VH-hIgG1/4Fc-SalI(SEQ ID NO：29) CTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT
  引物名   核苷酸序列(5′-3′)
  TMC2206VL-hKc-SalI(SEQ ID NO：32) TCGTTTGATGTCGACCTTGGTCCCAGCACCGAACGTGAG
  hIgG1/4Fc-SaII-F(SEQ ID NO：30) TCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCSGTCTTC
  hIgG1/4Fc-NotI-RSEQ ID NO：31)   AAGGGAAGCGGCCGCTTATCATTTACCCYGAGACAGGGAGAGGCTCTT
  hKc-SalI-F(SEQ ID NO：33) ACCAAGGTCGACATCAAACGAACTGTGGCTGCACC
  κ-F(SEQ ID NO：95)   CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTT
  κ-BamHI-R(SEQ ID NO：96)   AATTCGGATCCTTACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
  hKc-NotI-RSEQ ID NO：34)   AAGGGAAGCGGCCGCTTATCARCACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
  TMC-2206VLwt-hKc-F(SEQ ID NO：35) AGGGTGGAGCTGAAACGAACTGTGGCTGC
  TMC-2206VLwt-hKc-R(SEQ ID NO：36) TCGTTTCAGCTCCACCCTGGTCCC
从VH和VL获得长约350bp的PCR产物。用1％琼脂糖凝胶回收这些PCR产物，克隆到pCR2.1-TOPO克隆载体(Invitrogen，CA)中并测序。
在CEQ DNA测序仪上用M13正向和反向引物(Invitrogen，CA)进行测序。用Qiagen试剂盒按厂商说明书制备1.5mL细菌培养物的质粒DNA。每次PCR测序反应均采用约300ng的DNA，体积通常为10μL。将此DNA 96℃变性2分钟，然后与终浓度0.3μM的测序引物混合。在混合物中加入4μL DTCS Quick Start Master Mix(Beckman Coulter，Fullerton，CA)，混合并进行30个循环的测序反应：96℃ 20秒，50℃ 20秒和60℃ 2分钟。在存在乙酸钠(NaAc)、EDTA和糖原下用乙醇沉淀测序反应物。用70％乙醇洗涤沉淀二次，风干，重悬浮于20μL样品加载溶液(试剂盒中提供)。用标准方法测定了8个分别的VH和VL克隆的序列，表3和4分别显示推导的氨基酸序列为VH(SEQ ID NO：21)和VL(SEQ IDNO：19)。从所有8个克隆获得的序列除了第一个或头二个氨基酸外均相同。在VL克隆中，Glu-Asn或Gln-Phe的存在频率相等。在VH克隆中，Gln或Glu的存在频率相等。将这些序列与NCBI蛋白BLAST数据库进行核查(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/，Ye等，Nucleic acids Res.，Jul 1：34(Web Server Issue)：W6-9)。所有序列(如TMC-2206的VH或VL)经CLUSTALW(多个序列比对(Multiple Sequence Alignment))，http://clustalw.genome.ip/(Aiyar，Methods Mol Biol.，132：221-41(2000))排列对比进行查询。这些克隆的插入物显示了与预期同种型的鼠重链(IgG1)和轻链(κ)的最佳匹配。此克隆的VH和VL区序列提示，可利用前导序列和侧翼的恒定区序列设计出更精确的引物来克隆从杂交瘤mRNA得到的TMC-2206的整个重轻链可变区。所有引物均由Retrogen(圣地亚哥，CA)合成。采用与上述相同的PCR条件，用引物对VHL-正向CCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT(SEQ ID NO：14)和HC-反向GGGGCCAGTGGATAGAC(SEQ ID NO：15；来自小鼠Fcγ CH1)重新克隆重链可变区，用引物对VLL-正向CCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG(SEQ ID NO：16)和LCκ-反向GTTGGTGCAGCATCAGC(SEQ ID NO：17)重新克隆此杂交瘤mRNA的轻链可变区。产物测序证实TMC-2206 VL的前两个残基是L1-Q和L2-F，重链的前两个残基是H1-Q和H2-V。其余的核苷酸序列与用简并混合引物克隆的相同。
                                表3
  名称   FW1   HCDR1   FW2   HCDR2
  ---------1---------2-----   ----3-----   ----4---------   5---------6-----
  Kabat编号：   1234567890123456789012345   6789012345   67890123456789   0123456789012345
  TMC-2206 VH(SEQ ID NO：21)   QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS   GFSLTNYGIH   WVRQPPGKGLEWLG   VIWARGFTNYNSALMS
 名称   FW3   HCDR3   FW4
  ----7---------8------------9----   ----10-----   -------11--
 Kabat编号：   67890123456789012ABC345678901234   567890ABC12   34567890123
 TMC-2206 VH(SEQ ID NO：21)   RLIITKDNSQSQVFLKMNSLQPDDSATYFCAR   ANDGVYYAMDY   WGQGTSVTVSS
                                        表4
  名称   FW1   LCDR1   FW2   LCDR2
  ---------1---------2---   ------3----   -----4---------   5------
  Kabat编号：   12345678901234567890123   45678901234   567890123456789   0123456
  TMC-2206 VL(SEQ ID NO：19)   QFVLTQSPAFLSASPGEKVTMTC   SANS-SVNYIH   WYQQKSGTSPKKWIY   DTSKLAS
  名称   FW3   LCDR3   FW4
  ---6---------7---------8--------   -9-------   -10------
  Kabat编号：   78901234567890123456789012345678   901234567   8901234567
  TMC-2206 VL(SEQ ID NO：19)   GVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYC   QQWTTNPLT   FGAGTRVELK
克隆的VL区长106个氨基酸，VH区长119个氨基酸。如表3和4所示，在克隆的重链(VH)和轻链(VL)可变区各有三个CDR(CDR1-3)和4个构架(FW1-4)序列。根据Kabat编号系统(Kabat等，1983)鉴定构架和CDR，除了重链的CDR1用Oxford Molecular′s AbM定义为跨越残基26-35外。Oxford Molecular′s AbM抗体建模软件(http://people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s/，Martin等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86，9268-9272(1989)；Martin等，Methods Enzymol.，203，121-153(1991)；Pedersen等，Immunomethods，1，126(1992)和Rees等，刊登在Sternberg M.J.E.(主编)，Protein Structure Prediction.OxfordUniversity Press，Oxford，141-172.(1996))将Kabat CDR和Chothia超变区编号系统结合来确定CDR。为了编号的一致性，将构架区与CDR区两者相对于标准编号的插入序列命名为残基位置后按字母顺序排列(如残基82A、82B、82C插入在重链残基82与83之间，如表3所示)。此VH和VL二序列具有较短的CDR3。克隆的轻链CDR1中可能有潜在的糖基化位点(Asp-Ser-Ser，NSS)。这与用SDS-PAGE观察到TMC-2206轻链分子量为29kD相符，用内切糖苷酶处理可将其转变为25kD(抗体轻链的典型分子量)。
为验证这些克隆序列代表了TMC-2206抗体的生物学活性VH和VL，对从杂交瘤培养基纯化的该抗体作Edman降解后肽N-末端测序。推断的VH和VL克隆氨基酸序列表明可能各自存在N-末端谷氨酰胺，因此提高了N-末端封闭由该N-末端谷氨酰胺环化产生焦谷氨酸(pGlu)所致的可能性。因此为了去除潜在的环化末端谷氨酰胺，用来自嗜热的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的耐热酶对此蛋白进行焦谷氨酸氨肽酶消化，然后进行重链和轻链的N-末端肽测序。在50μL消化缓冲液(50mM磷酸钠，pH 7.0，1mM EDTA和10mM二硫苏糖醇(DTT))中重建纯化的激烈热球菌的焦谷氨酸氨肽酶(0.01U)(Sigma，St.Louis，MO)。用1∶100摩尔比的焦谷氨酸氨肽酶：蛋白于95℃消化TMC-2206制品1小时。用标准10％SDS-PAGE凝胶(Tris-甘氨酸，BioRad Laboratories，Hercules，CA)，上槽中含巯基乙酸钠(0.1g/150mL电泳缓冲液)，电泳分辨消化的蛋白。在250mAmp下，将凝胶印迹转移到固定素(Immobilon)P PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上1小时，转移缓冲液为10mM CAPS，pH 10.5，0.5g/L DTT和15％甲醇。用1％乙酸配的新鲜0.1％丽春红S溶液将印迹染色1分钟，然后用1％乙酸脱色。对印迹肽测序时发现成功测定了头21个N-末端氨基酸的20个，显示与克隆获得的推导的肽序列精确相同。这证实克隆的VL的第一个氨基酸是谷氨酸。焦谷氨酸氨肽酶消化的VH没能产生任何肽序列数据。
                        实施例2
设计和制备了α2β1整联蛋白的特异性嵌合抗体，包括小鼠-人嵌合抗体。采用标准分子克隆技术，利用实施例1中所述克隆的TMC-2206的VH和VL区分别设计和制备嵌合性重链和轻链(参见例如Sambrook和Russell的“分子生物学手册(Molecular Biology Manual)”，2001)。
克隆的重链和轻链含有引入的限制性位点如下。利用引物TMC-2206-r5′CCCGAATTCACAGGTGCAGTTGAAGGAGTCA(SEQID NO：22)和TMC-2206-r3′CGGGATCCTTAGGATCATTTACCAGGAGAGTGGGA(SEQ IDNO：23)进行RT-PCR，从BHA2.1杂交瘤mRNA克隆出TMC-2206重链，利用引物TMC-2206-k5′CCCGAATTCACAATTTGTTCTCACCCAGTCT(SEQ ID NO：24)和TMC-2206-k3′CGGGATCCTTATCTCTAACACTCATTCCTGTTGAA(SEQ ID NO：25)克隆出TMC-2206轻链。这些引物分别在5′和3′末端引入了EcoRI和BamHI位点，可将克隆的重轻链分别克隆到pIRES2-GFP和pIRES2-Ds Red哺乳动物表达载体中(Clontech，目录号632306和632420)。工程改造此二载体使之携带Igκ前导序列METDTLLLWVLLLWVPGGSTGD(SEQ ID NO：26)。
为分离mRNA，低速(800转/分钟，10分钟)离心沉淀约1百万个表达TMC-2206的杂交瘤细胞，用PBS洗涤后用1mL Trizol(Invitrogen，CA)液裂解。强烈旋涡振荡后用0.2ml氯仿抽提细胞悬液，离心(14,000转/分钟4℃ 5分钟)后，将上清液转移到新试管中，与0.5ml异丙醇混合然后离心(14,000转/分钟4℃ 10分钟)沉淀RNA。用1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，然后溶于50μL DEPC-处理过的水中。
如上所述进行RT-PCR反应(Qiagen RT试剂盒)，采用0.5μg RNA、10μL 5x RT缓冲液、2μL 10mM dNTP混合物、各5μL 10mM引物溶液和2μL混合酶液，总体积50μL。用EcoRI和BamHI限制性酶消化PCR产物，将经1％琼脂糖凝胶纯化的片段连接到pIRES2-GFP(重链)载体和pIRES2-Ds Red(轻链)载体的EcoRI/BamHI位点中。随后对可变区序列进行测定证实RT-PCR没有引入突变。
选择pCI-neo(Promega，目录号E1841)作为克隆基于或衍生于上述TMC-2206的嵌合抗体分子包括人源化抗体分子的表达载体。为减少通过PCR在恒定区导入突变的可能性，制备了VH和VL二者的克隆盒。首先，将编码Igκ前导序列的DNA(SEQ ID NO：26)克隆到pCI-neo的XhoI和EcoRI克隆位点中，采用了表2所列寡核苷酸Igκ-S(SEQ ID NO：27)和Igκ-AS(SEQ ID NO：28)，使二者互相退火，然后用T4连接酶直接连接到XhoI-EcoRI消化的pCI-neo质粒中。这为所有后续克隆步骤提供了亲代载体。从此制备了两个表达盒：一个用于克隆毗连人IgG1 Fc(hFc)的VH区，第二个用于克隆人κ链(hKc)恒定区上游的VL区。
在人IgG1 Fc(hFc)或κ链(hκc)恒定区序列中没有发现EcoRI、XbaI、HindIII或SalI位点，因此将这些限制性位点中任何一个引入恒定区的5′末端有利于克隆。选择SalI作为克隆位点是因为可最大程度减少可变-恒定区连接处的氨基酸改变数目。对于重链嵌合体，在小鼠VH-人Fc连接处引入SalI位点不会导致氨基酸序列的任何改变。首先，用表2所示引物对TMC-2206-r5′(SEQ ID NO：22)和TMC2206VH-hIgG1/4Fc-SalI(SEQ IDNO：29)通过PCR制备EcoRI-SalI VH片段，将其引入小鼠VH序列3’末端SalI的限制性位点，采用pIRES-GFP载体中的克隆重链作为模板。扩增IMAGE克隆20688(Invitrogen，目录号4764519)DNA获得人IgG1 Fc，表2列出了所用的引物：hIgG1/4Fc-SalI-F(SEQ ID NO：30)和hIgG1/4Fc-NotI-R(SEQ ID NO：31)。分别用EcoRI/SalI和SalI/NotI消化两种PCR产物，纯化和连接于用EcoRI/NotI消化的pCI-neo-Igκ载体。所得载体命名为pCI-neo-Igκ-TMCVH-hFc。
对于轻链嵌合体，设计SalI位点不可能不导致VL-κC连接处的两个氨基酸E105D和L106I改变。用表2所示引物TMC-2206-k5′(SEQ IDNO：24)和TMC2206VL-hKc-SalI(SEQ ID NO：32)扩增质粒pIRES-DsRed2-TMC-2206LC的2206VL区产生的PCR产物可实现这点。用EcoRI/SalI消化此PCR产物，在1％琼脂糖凝胶上分离，用凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化后与从IMAGE克隆#4704496(ATCC)扩增的人Igκ轻链恒定区连接，采用的引物为hKc-SalI-F(SEQ ID NO：33)和hKc-NotI-R(SEQ ID NO：34)及上述载体pCL-neo-Igκ。得到的质粒命名为pCI-neo-Igκ-TMC2206VL-hKc。
为评价VL-κC连接处的两个氨基酸改变是否会影响抗体活性，构建了编码亲代氨基酸序列轻链嵌合质粒的第二种轻链嵌合体。首先，用引物对TMC-2206VLwt-hKc-R与TMC-2206-k5′(SEQ ID NO：36与24)和引物对TMC-2206VLwt-hKc-F与hKc-NotI-R(SEQ ID NO：35与34)分别扩增此VL和人κ轻链恒定区，采用上述pIRES2-DsRed2-Igk-TMC2206LC载体作为模板。其次，用TMC-2206-k5′(SEQ ID NO：24)和hKc-NotI-R(SEQID NO：34)引物进行重叠延伸PCR(Horton等，Gene 77(1)：61-8(1989))剪接连接这两种产物，消化最终PCR产物并克隆到pCI-neo-Igκ中。
为了验证所克隆的小鼠-人嵌合抗体的特异性是否与BHA2.1杂交瘤分泌的原始单克隆TMC-2206抗体相同，用瞬时转染方法在293F细胞中表达此小鼠-人嵌合抗体，所用转染混合液包含等量的DNA/OptiMEM和293fectin/OptiMEM(Invitrogen)。用预温至室温的OptiMEM配制各溶液。DNA/OptiMEM混合液包含20μg重链(HC)表达质粒、20μg轻链(LC)表达质粒和OptiMEM，总体积1.3mL。293fectin OptiMEM混合液含53μL 293fectin和OptiMEM，总体积1.3mL。将293fectin混合液加入DNA混合液中，混合，室温培育20分钟。将2.6mL转染混合液加入含40mL293F培养细胞(106个细胞/mL)的培养瓶中。37℃，8％ CO2 120转/分钟振摇培养此瓶。3天后离心细胞悬液并立即加入蛋白A亲和层析柱纯化该抗体。浓缩最终产物，用SDS-PAGE分析，用Lowry分析法测定蛋白浓度。
为了验证此纯化的小鼠-人嵌合抗体的结合活性是否与亲代TMC-2206抗体相同，检测了纯化的小鼠-人嵌合抗体阻断α2β1整联蛋白介导细胞粘附的能力。用含5mM EDTA的无Ca++/Mg++ PBS培育，使培养瓶中表达人α2整联蛋白(SEQ ID NO：8)和内源性仓鼠β1(Symington等，J Cell Biol.120(2)：523-35.(1993))的CHO细胞脱落。然后将细胞离心(1200转/分钟，8分钟，用Beckman GH 38转头)，将沉淀重悬浮于10mLRPMI-1640。将30μL 17mM CFSE(Molecular Probes，OR)加到此细胞悬液中，37℃培育混合物15分钟。低速沉淀标记的细胞，重悬浮于10mL含0.1％BSA的RPMI-1640中进行计数。将细胞浓度调节至8×105个细胞/mL，暗处保存直到应用。胶原蛋白包被的平板(大鼠尾胶原蛋白I型；BDBiosciences)的孔用100μL/孔的含0.1％BSA的PBS封闭，室温培育30分钟。将蛋白样品用无血清培养液作系列稀释，取每种抗体系列稀释液各50μL加入胶原蛋白包被板孔中。在孔中加入50μL/孔标记的细胞，37℃培育此板1.5小时。洗涤后，用0.1％Triton X-100裂解细胞，用Victor2 1420多标记计数仪(Perkin-Elmer)读取荧光强度(激发光485nm；发射光535nm)。克隆的TMC-2206嵌合抗体是α2β1-介导细胞粘附I型胶原的强效抑制剂，显示其效力等于TMC-2206，EC50值分别为1.8nM比1.2nM。在这些实验中，所用的对照Ig不能抑制结合，而所用的鼠TMC-2206或嵌合抗体在10-11-10-6摩尔浓度范围内检测时显示能抑制结合。
通过例如测定Ki值，比较了小鼠-人嵌合抗体与亲代抗体TMC-2206对固定的α2β1整联蛋白的亲和性，以了解其与Eu-标记的TMC-2206竞争与α2β1-包被板孔结合的能力。首先通过平衡结合测定亲代抗体TMC-2206对固定的α2β1-整联蛋白的亲和性。96孔微量滴定板的各孔用血小板α2β1-整联蛋白(用人血小板α2β1定制包被，GTI Inc.，WI)包被，然后用脱脂奶粉液封闭。对于结合和竞争试验，采用了荧光标记的TMC-2206或同种型对照IgG抗体。为用Eu-N1-ITC试剂标记抗体，将TMC-2206或同种型对照MOPC-21(Invitrogen)各约2mg悬浮在磷酸缓冲盐水(PBS；1.47mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4(pH 7.4)、138mM NaCl和2.67mM KCl)中进行透析。在预洗的MicroSep浓缩器(30-kDa截断值，Pall Life Sciences，9500转/分钟(7000xg)，JA-20转头(BeckmanInstruments，Inc.)20分钟4℃)中浓缩后，用含最终浓度100mM NaHCO3(pH 9.3)的PBS将抗体配成4.0mg/mL。将此mAb/碳酸氢盐混合液(0.250mL)轻轻混合后加入含0.2mg螯合有Eu3+的N1-(对-异硫氰酸基苄基)-二亚乙基三胺-N1，N2，N3，N3-四乙酸(Eu-N1-ITC；Perkin Elmer Life Sciences)的小瓶中，4℃不搅拌过夜。将各标记的抗体混合液加入不同的用运行缓冲液(50mM Tris，pH 7.4和138mM NaCl)预先平衡的PD-10柱(GEBiosciences，Piscataway，NJ)中。收集各级分(0.5mL)，采用SpectraMax384吸光平板读数仪检测总蛋白(Bradford试剂；Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，对于铕检测，用DELFIA增强溶液(Perkin-Elmer)作1∶10.000稀释后进行时间分辨荧光检测(TRF)，采用Victor2多种标记平板读数仪(Perkin Elmer)。合并蛋白和铕标记双阳性级分加入新的PD-10柱，收集样品并检测总蛋白和铕含量，用针对标准铕溶液(Perkin-Elmer)的TRF校验计算出荧光∶蛋白比例。然后用荧光标记抗体，Eu-TMC-2206或Eu-同种型对照IgG，10μL/孔，封闭α2β1-整联蛋白微量滴定板孔。37℃培育密封板1小时使结合达到平衡后，将各孔2μL样品转移到含DELFIA增强溶液(100μL/孔，Perkin-Elmer)的新孔中检测游离(未结合)的标记物。将增强溶液(100μL/孔)加到空孔中检测结合的标记物。振摇平板(滴定板振摇速度设置为5，室温5分钟)，用Victor2多种标记平板读数仪(Perkin-Elmer Wallac，Boston，MA)读取时间分辨荧光(TRF)强度。用斯卡查德分析计算出的TMC-2206的Kd值是0.374nM。
用与上述相似的试验系统，在存在不同浓度非标记TMC-2206抗体或嵌合抗体作为竞争物时，采用100pM的荧光标记Eu-TMC-2206测定竞争试验的Ki值，分析它们与固定的α2β1整联蛋白的相对结合效价。将测试的抗体组合加入α2β1整联蛋白包被孔中，测定的浓度范围是10-11-10-7M，经特定时间后测定结合的Eu-TMC-2206量。用Prism软件(GraphPad，Inc.)将抑制曲线与“单位点竞争”模型相拟合获得IC50值，用Cheng和Prusoff(1973)公式和以上的Kd＝0.374nM计算出Ki值。亲代TMC-2206抗体的Ki值为0.22±0.04nM(n＝10)，相比较野生型(wt)嵌合抗体此值为0.27±0.07nM(n＝5)。野生型嵌合抗体的此值与携带了经工程改造SalI位点引入两个LC突变的嵌合抗体相当(Ki也为0.27nM)，证实这些突变不影响活性。在这些实验中，用对照IgG或TMC-2206检测BSA包被的对照孔都没显示任何抗体结合。
                        实施例3
设计和制备了α2β1整联蛋白的特异性人源化抗体。确定克隆的TMC-2206抗体重轻链CDR区所含残基，如下制备其人源化变体。找出重轻链可变区中在较不可变构架区中的三个超变区。大多数情况下，这些超变区在大小上对应于CDR，但也可能超出CDR。表3和表4分别专门列出了TMC-2206重轻链可变区的氨基酸序列。利用通用的同源性检索算法和NCBI蛋白质BLAST数据库(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/，Ye等，Nucleic acids Res.，Jul 1：34(Web Server Issue)：W6-9))将通常按照Kabat(编号系统)说明的CDR区和构架区(除HCDR1外)与其它VH和VL区排列对比。按AbM定义，HCDR1为残基26-35。牛津分子单克隆抗体模型软件(Oxford Molecular′s AbM antibody modeling software)(http://people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s/，Martin等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86，9268-9272(1989)；Martin等，Methods Enzymol.，203，121-153(1991)；Pedersen等，Immunomethods，1，126(1992)；和Rees等，刊登于Sternberg M.J.E.(主编)，Protein Structure Prediction，牛津大学出版社，Oxford，141-172(1996))将Kabat和Chothia编号系统联用来定义CDR。因此重链CDR区的定义如下：
HCDR1    氨基酸26-35
HCDR2    氨基酸50-65
HCDR3    氨基酸95-102
类似地，轻链CDR区定义如下：
LCDR1    氨基酸24-34
LCDR2    氨基酸50-56
LCDR3    氨基酸89-97
人源化抗体需要保留鼠抗体的结合亲和性。需要选择与鼠抗体具有同源性的受者人分子。优选的受者人部分是人的胚系构架，因为其缺乏体细胞突变可降低其免疫原性程度。然而个体的成熟抗体构架也可用作受者分子。V-BASE数据库(http://base.mrc-cpe.cam.ac.uk)提供了综合的人重轻链胚系序列列表，可用作人胚系序列的来源与TMC-2206的VH和VL区作比较；也可利用Kabat数据库(http://kabatdatabase.com/，Johnson，G和Wu，T.T.(2001)，Nucleic Acids Res.，29，205-206)。
TMC-2206的VH与V-BASE数据库中51个人胚系序列中的三个人胚系序列4-59、4-61和4-30.4比对良好，构架3中没有序列显示良好拟合。在4-59中CDR H1和H2与TMC-2206 VH的CDR H1和H2长度相同，选择此4-59(SEQ ID NO：39)作为受者构架。它携带的CDR H1和CDR H2的标准1型结构与TMC-2206 CDR H1和CDR H2相同。在VBASE胚系序列中不包括VH的CDR3和FW4区，因为CDR3和构架4区部分衍生自各抗体成熟期间发生改变的不同的非毗连基因。可利用抗体CAA48104的序列(NCBI登录号：gi/33583/emb/CAA48104；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)来提供CDR3和FW 4序列进行比对，以及提供FW4受者分子序列。表5中提供了TMC-2206 VH与4-59和CAA48104抗体的CDR3和FW4区抗体序列的比较。
                                                                            表5
  名称   FW1   HCDR1   FW2   HCDR2
  ---------1---------2-----   ----3-----   ----4---------   5---------6-----
Kabat编号： 1234567890123456789012345   6789012345 67890123456789 0123456789012345
TMC-2206(SEQ ID NO：21) QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS   GFSLTNYGIH WVRQPPGKGLEWLG VIWARGFTNYNSALMS
4-59(SEQ ID NO：39) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS   GGSISSYYWS WIRQPPGKGLEWIG YIYYSGSTNYNPSLKS
  名称   FW3   HCDR3   FW4
  ----7---------8------------9---- ----10------- -------11--
Kabat编号： 67890123456789012ABC345678901234 567890ABCDE12   34567890123
  TMC-2206(SEQ ID NO：21)   RLIITKDNSQSQVFLKMNSLQPDDSATYFCAR   ANDGVYYAM--DY   WGQGTSVTVSS
  4-59(SEQ ID NO：39)   RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR   HNSSSWYGRYFDY   WGQGTLVTVSS
  CAA48104(SEQ ID.183)   HNSSSWYGRYFDY   WGQGTLVTVSS
胚系序列A14(SEQ ID NO：37)是V-BASE数据库中38个人VL抗体序列之一，选其作为受者VL构架。A14属于VK VI家族，它的LCDR1和LCDR2分别属于标准的2类和1类。TMC-2206 LCDR2也属于1类，虽然TMC-2206 LCDR1与标准的1类结构相似但不相同。胚系VL序列延伸入CDR-L3，因此选择了人VL FW4区的额外序列。选出的序列为成熟人抗体的κ轻链提供了常用的构架4基因(例如AAB24132，NCBI登录号gi/259596/gb/AAB24132；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。虽然引入了SalI位点，在嵌合轻链构建期间发生了两个氨基酸改变(E105D和L106I，不影响抗体结合，见以上)，受者人轻链FW-4的106位已成为异亮氨酸，从而在该人源化变体中引入了一个保守性氨基酸突变(E105D)。表6提供了TMC-2206 VL与A14和AAB24132抗体序列FW4区的比较。
                                    表6
 名称   FW1   LCDR1   FW2   LCDR2
  ---------1---------2---   ------3----   -----4---------   5------
 Kabat编号：   12345678901234567890123   45678901234   567890123456789   0123456
 TMC-2206(SEQ ID NO：19)   QFVLTQSPAFLSASPGEKVTMTC   SANS-SVNYIH   WYQQKSGTSPKKWIY   DTSKLAS
 A14(SEQ ID NO：37)   DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITC   QASEGIGNYLY   WYQQKPDQAPKLLIK   YASQSIS
  名称   FW3   LCDR3   FW4
  ---6---------7---------8--------   -9-------   -10------
  Kabat编号：   78901234567890123456789012345678   901234567   8901234567
  TMC-2206(SEQ ID NO：19)   GVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYC   QQWTTNPLT   FGAGTRVELK
  A14(SEQ ID NO：37)   GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYC   QQWTTNPLT   FGQGTKVEIK
  AAB24132(SEQ ID NO：184)   QQGNTLPWT   FGQGTKVEIK
利用TMC-2206 VH和VL序列中的CDR序列和上述选择的人构架序列制备了TMC-2206的人源化变体。为保持CDR的正确提呈，可将受者构架的一些标准残基(参见例如Chothia等，1985，1992；Queen等，1989；Foote和Winter，1992；http://people.cryst.bb k.ac.uk/～ubcg07s)变换成供者鼠标准残基，此过程称为回复突变(back-mutation)。表7和8分别列出了可能影响CDR构象和链间堆积(interchain packing)的残基，显示了TMC-2206供者VH和VL残基与对应的受者人构架残基(粗体斜线表示)之间的差异。表8中以星号标示的L46残基在两个CDR标准结构提呈和链间堆积中可能起作用。
如表7和8所示，有11个构架残基影响CDR标准提呈，两个残基影响到链间堆积，这在TMC-2206供者与A14和4-59受者人胚系序列之间有所不同，残基L46属于这两种范畴。具体说，这些差异存在于重链的H37、H48、H67、H71、H73、H78和H91位，轻链构架可变区的L2、L4、L46、L47、L49和L71位。鉴定和选择这些残基作为回复突变的候选残基。
                        表7
Figure A20068005124900871
                        表8
Figure A20068005124900872
*也影响CDR构象的突变
在第一个TMC-2206的人源化变体中包含了所鉴定的13个候选回复突变残基中有11个参与正确的标准结构提呈，2个参与链间堆积。此外，人源化VL中保留了氨基末端Q。鼠抗体鉴定中此位置被保留，因为它在L2中毗邻苯丙氨酸，这是此位罕见的氨基酸。将这些人源化的轻链和重链变体称为TMC-2206VH1.0和TMC-2206VL1.0。通过改变鼠残基回复到人构架残基来制备其它人源化变体，它们含有较少的回复突变。如此鉴定的构架残基对回复到人残基敏感(就维持抗体效力而言)。在平行研究中，进行了计算机模建以帮助选择能变回人抗体对应残基的候选残基。
利用实施例1所述的轻重链嵌合pCI-neo表达载体来表达所有的人源化抗体变体。在1.0版的人源化TMC-2206 VH(hVH1.0，SEQ ID NO：40)和1.0版的人源化VL(hVL1.0，SEQ ID NO：41)中利用Vector NT1软件，掺入了14个上述回复突变，翻译产生的核苷酸序列在哺乳动物细胞中表达最优。Retrogen(圣地亚哥，CA)将定制合成的这些序列串联在一个质粒构建体中，克隆到替代小鼠VH和VL区的亲代TMC-2206 LC和HC表达载体的EcoRI和SalI位点中。具体说，质粒DNA经EcoRI-SalI消化产生了两个大小不同的片段，较大的片段为hVH1.0，小片段为hVL1.0。然后将这两个片段克隆到亲代pCI-TMC-2206嵌合LC和HC表达载体的EcoRI和SalI位点，分别替代小鼠VH和VL区，然后分别用EcoRI和SalI消化及凝胶纯化从pCI-neoIgk-TMC2206VG-hFc和pCI-neoIgK-TMC-2206VLhκc产生的大片段。用此策略制备了后续变体。所得质粒包含Igκ前导序列、优化的Kozak翻译启动序列、可变区和人恒定区。
与嵌合抗体和实施例2所述的原始TMC-2206抗体一起，如上所述检测了具有1.0版人源化TMC-2206 VH(SEQ ID NO：40)和1.0版人源化VL(SEQ ID NO：41)的变体在α2β1整联蛋白介导的细胞粘附试验中的活性，和在竞争试验中结合固定的α2β1整联蛋白的活性。人源化原型的Ki值是0.32nM，与亲代抗体TMC-2206(0.21nM)以及嵌合抗体(0.27nM)测定的Ki值相当，表明此第一种人源化抗体保留了结合亲和性。类似地，第一种人源化原型抗体在阻断α2β1介导的细胞粘附胶原蛋白中显示了与TMC-2206亲代抗体相当的抑制活性(例如两者的EC50均为1.5nM)。
利用1.0版变体产生的数据，用PCR方法制备了一系列回复人VH或VL构架残基的突变，确定了避免损害原始TMC-2206mAb特异性和亲和性的回复突变(鼠残基)的最小数目。理想的人源化突变体包括保留了亲代鼠抗体生物学活性并且也含有较少的鼠残基以降低潜在的免疫原性的那些变体。
Sigma-Genosys合成了各个引物序列，它们的序列列于表9中。产生变体所用的引物对和模板见表10和11。用以下条件进行PCR反应：引物1和2(0.6μM终浓度)、dNTP(1mM终浓度)、DNA模板(1-10ng)和1单位的Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，最终体积一般为50μL。PCR程序由初始95℃变性2分钟，然后30个循环，每个循环95℃ 30秒、56℃ 45秒和68℃ 1分30秒组成。最终步骤是68℃ 10分钟。
                                    表9
 引物名   核苷酸序列(5′-3′)
 hVH3.0-F(SEQ ID NO：42) AGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTG
 hVH3.0-R(SEQ ID NO：43) GTTCTTGCTGGTGTCCACGCTGATGGTCACGCGGGACATGAGAGCGCTGTT
 hVH4.0-F(SEQ ID NO：44) CCTCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGTGATATGGGCTCGCGGC
 hVH4.0-R(SEQ ID NO：45) CTCCAGGCCCTTGCCTGGAGGCTGGCGTATCCAGTGGATGCCATAGTTGGT
 hVL3.0-F(SEQ ID NO：46) CCCAAGCTCCTGATCTATGACACTTCCAAGCTG
 hVL3.0-R(SEQ ID NO：47) AGTGTCATAGATCAGGAGCTTGGGGGCCTGGTCGGGCTTCTG
 hVL4.0-F(SEQ ID NO：48) GACGCGAATTCAGACGTGGTGATGACCCAGTCTCCAGCATTCCTG
 hVH2.0-F(SEQ ID NO：49) GTGACCATCAGCAAGGACAACAGC
 hVH2.0-R(SEQ ID NO：50) GCTGTTGTCCTTGCTGATGGTCACGCGGGACATGAGAGCGCTGTT
 hVH5.0-F(SEQ ID NO：51) ATCGGCGTGATATGGGCTCGCGGCTTC
 hVH5.0-R(SEQ ID NO：52) GCCGCGAGCCCATATCACGCCGATCCACTCCAGGCCCTTGCCTGG
  引物名   核苷酸序列(5′-3′)
  hVH6.0-F(SEQ ID NO：53) ATATGGGCTCGCGGCTTCACAAAC
  hVH6.0-R(SEQ ID NO：54) GTTTGTGAAGCCGCGAGCCCATAT
  hVH7.0-F(SEQ ID NO：55) GCCGCGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGCCAACGACGGG
  hVH7.0-R(SEQ ID NO：56) GTAGTACACGGCGGTGTCCGCGGCGGT
  hVH8.0-F(SEQ ID NO：57) ATATCCAACTATGGCATCCACTGGGTT
  hVH8.0-R(SEQ ID NO：58) CCAGTGGATGCCATAGTTGGATATGCTAAATCCAGAGACGGTACAGGT
  VH12.0-(K71V)-F(SEQ ID NO：97) GCCTGACCATCAGCGTGGACAACAGCAAGAACCAGGTGAG
  VH12.0-(K71V)-R(SEQ ID NO：98) CTCACCTGGTTCTTGCTGTTGTCCACGCTGATGGTCAGGC
  VH13.0-(N73T)-F(SEQ ID NO：99)   CTGACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAACCAGGTGAGCC
  VH13.0-(N73T)-R(SEQ ID NO：100) GGCTCACCTGGTTCTTGCTGGTGTCCTTGCTGATGGTCAG
  VH14.0-(V78F)-F(SEQ ID NO：101) GCAAGGACAACAGCAAGAACCAGTTTAGCCTGAAGCTGAGC
  VH14.0-(V78F)-R(SEQ ID NO：102)   GCTCAGCTTCAGGCTAAACTGGTTCTTGCTGTTGTCCTTGC
  hVL2.0-R(SEQ ID NO：59) CAGCTTGGAAGTGTCATAGATCAATTTCTTGGGGGCCTGGTCGGG
  hVL5.0-F(SEQ ID NO：60) GACGCGAATTCAGAC TTCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCATTCCTG
  hVL6.0-F(SEQ ID NO：61) GACGCGAATTCACAG TTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCATTCCTG
  hVL7.0-F(SEQ ID NO：62) GACGCGAATTCAGACTTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCATTCCTG
  hVL8.0-F(SEQ ID NO：63) TTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGGAG
  hVL8.0-R(SEQ ID NO：64) CTCCAGGCTGCTGATGGTGAAGGTGAAGTCGGTGCCGCTGCCGCTGCC
  引物名   核苷酸序列(5′-3′)
  VH12.0-(K71V)-F(SEQID NO：97)   GCCTGACCATCAGCGTGGACAACAGCAAGAACCAGGTGAG
  VH12.0-(K71V)-R(SEQ ID NO：98) CTCACCTGGTTCTTGCTGTTGTCCACGCTGATGGTCAGGC
  hLCQ3-F(SEQ ID NO：65) CCAATCAAGCGTGAACTACATTCACTGG
  hLCQ3-R(SEQ ID NO：66) CCAGTGAATGTAGTTCACGCTTGATTGGGCGCTGCAGGTGATGGTCAC
  Igκ-For(SEQ ID NO：67) ACTCCTGCTATGGGTACTGCTGC
  hIgG1 Fc-CH1-R(SEQ ID NO：68) GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG
  CI-neo-msc3′(SEQ ID NO：69) TTTCACTGCATTCTAGTTGTGG
                            表10
  VH变体   用于片段1的PCR引物   用于片段2的PCR引物   用于完整VH的PCR引物
  2.0   Igk-For &hVH2.0-R   hVH2.0-F & hIgG1Fc-CH1-R   Igk-For & hIgG1Fc-CH1-R
  3.0   Igk-For &hVH3.0-R   hVH3.0-F & hIgG1Fc-CH1-R   Igk-For & hIgG1Fc-CH1-R
  4.0   Igk-For &hVH4.0-R   hVH4.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igk-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  5.0   Igk-For &hVH5.0-R   HVH5.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igk-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  6.0   Igk-For &hVH6.0-R   hVH6.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igk-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  7.0   Igk-For &hVH7.0-R   hVH7.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igk-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  8.0   Igk-For &hVH8.0-R   hVH8.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igk-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  9.0   Igk-For &hVH7.0-R   hVH7.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igk-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  10.0   Igk-For &hVH7.0-R   hVH7.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igk-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  11.0   Igk-For &hVH2.0-R   hVH2.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igk-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  12.0   Igk-For &VH12.0-R   VH12.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igκ-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  13.0   Igk-For &VH13.0-R   VH13.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igκ-For &hIgG1 Fc-CH1-R
  14.0   Igk-For &VH14.0-R   VH14.0-F &hIgG1 Fc-CH1-R   Igκ-For &hIgG1 Fc-CH1-R
                        表11
  VL变体  用于片段1的PCR引物   用于片段2的PCR引物  用于完整VL的PCR引物
  2.0  Igk-For &hVL2.0-R   hVL2.0-F &CI-neo-msc3′  Igk-For &CI-neo-msc3′
  3.0  Igk-For &hVL3.0-R   hVL3.0-F &CI-neo-msc3′  Igk-For &′CI-neo-msc3′
  4.0  N/A   N/A  hVL4.0-F &CI-neo-msc3′
  5.0  N/A   N/A  hVL5.0-F &CI-neo-msc3′
  6.0  N/A   N/A  hVL6.0-F &CI-neo-msc3′
  7.0  N/A   N/A  hVL7.0-F &CI-neo-msc3′
  8.0  Igk-For &hVL8.0-R   hVL8.0-F &CI-neo-msc3′  Igk-For &CI-neo-msc3′
  9.0  Igk-For &hVL2.0-R   hVL2.0-F &CI-neo-msc3′  Igk-For &CI-neo-msc3′
  10.0  Igk-For &hVL8.0-R   hVL8.0-F &CI-neo-msc3′  Igk-For &CI-neo-msc3′
  11.0  Igk-For &hVL8.0-R   hVL8.0-F &CI-neo-msc3′  Igk-For &CI-neo-msc3′
  12.0  Igk-For &VL12.0-R   VL12.0-F &CI-neo-msc3′  Igκ-For &CI-neo-msc3′
表12列出了VH变体，表13列出了VL变体，将所选的受者人构架与初始的(1.0)VH和VL变体作比较。表12列出的VH变体包括：VH1.0(SEQ ID NO：21)；hVH2.0(SEQ ID NO：70)；hVH3.0(SEQ IDNO：71)；hVH4.0(SEQ ID NO：72)；hVH5.0(SEQ ID NO：73)；hVH6.0(SEQID NO：74)；hVH7.0(SEQ ID NO：75)；hVH8.0(SEQ ID NO：76)；hVH9.0(SEQ ID NO：77)；hVH10.0(SEQ ID NO：78)；hVH11.0(SEQ IDNO：79)；hVH12.0(SEQ ID NO：109)；hVH13.0(SEQ ID NO：110)；hVH14.0(SEQ ID NO：111)。表13列出的VL变体包括：hVL1.0(SEQ IDNO：41)；hVL2.0(SEQ ID NO：80)；hVL3.0(SEQ ID NO：81)；hVL4.0(SEQID NO：82)；hVL5.0(SEQ ID NO：83)；hVL6.0(SEQ ID NO：84)；hVL7.0(SEQ ID NO：85)；hVL8.0(SEQ ID NO：86)；hVL9.0(SEQ IDNO：87)；hVL10.0(SEQ ID NO：88)；hVL11.0(SEQ ID NO：89)；hVL12.0(SEQ ID NO：108)。保留的鼠残基用粗体表示。也显示了构建的其它各变体(见以下)。表12 VH1.0下方显示的各变体具有与VH1.0相同的序列(用划线[-]表示)，除非有特殊的氨基酸替代，显示了将保留的鼠残基改变为人构架残基。类似地，表13显示的各VL变体具有与VL1.0变体相同的序列，除了标出的特定氨基酸替代外。
                                                             表12
  名称   FW1   CDR1   FW2   CDR2
  Kabat   ---------1---------2-----   ----3-----   ----4---------   5---------6-----
  TMC-2206 VH   QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS   GFSLTNYGIH   WVRQPPGKGLEWLG   VIWARGFTNYNSALMS
  4-59 VH   QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS   GGSISSYYWS   WIRQPPGKGLEWIG   YIYYSGSTNYNPSLKS
  hVH1.0   QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS   GFSLTNYGIH   WVRQPPGKGLEWLG   VIWARGFTNYNSALMS
  hVH2.0   -------------------------   ----------   --------------   ----------------
  hVH3.0   -------------------------   ----------   --------------   ----------------
  hVH4.0   -------------------------   ----------   -I----------I-   ----------------
  hVH5.0   -------------------------   ----------   ------------I-   ----------------
  hVH6.0   -------------------------   ----------   ------------I-   ----------------
  hVH7.0   -------------------------   ----------   --------------   ----------------
  hVH8.0   -------------------------   ----IS----   --------------   ----------------
  hVH9.0   -------------------------   ----------   --------------   ----------------
  hVH10.0   -------------------------   ----------   --------------   ----------------
  hVH11.0   -------------------------   ----------   --------------   ----------------
  hVH12.0   -------------------------   ----------   -I------------   ----------------
  hVH13.0   -------------------------   ----------   ------------I-   ----------------
  hVH14.0   -------------------------   ----------   -I------------   ----------------
  名称   FW3   CDR3   FW4
  Kabat   ----7---------8--ABC-------9----   -----10-----   -------11--
  TMC-2206 VH   RLIITKDNSQSQVFLKMNSLQPDDSATYFCAR   ANDGVYYAM  DY   WGQGTSVTVSS
  4-59 VH   RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR   HNSSSWYGRYFDY   WGQGTLVTVSS
  名称   FW3   CDR3   FW4
  hVH1.0   RLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCAR   ANDGVYYAM  DY   WGQGTLVTVSS
  hVH2.0   -V------------------------------   ------------   -----------
  hVH3.0   -V---V-T----F-------------------   ------------   -----------
  hVH4.0   --------------------------------   ------------   -----------
  hVH5.0   --------------------------------   ------------   -----------
  hVH6.0   -V------------------------------   ------------   -----------
  hVH7.0   ----------------------------Y---   ------------   -----------
  hVH8.0   --------------------------------   ------------   -----------
  hVH9.0   -----V--------------------------   ------------   -----------
  hVH10.0   -------T------------------------   ------------   -----------
  hVH11.0   ------------F-------------------   ------------   -----------
  hVH12.0   ----------------------------Y---   ------------   -----------
  hVH13.0   -V--------------------------Y---   ------------   -----------
  hVH14.0   -V--------------------------Y---   ------------   -----------
                                                          表13
  名称   FW1   CDR1   FW2   CDR2
  Kabat   ---------1---------2---   ------3----   -----4---------   5------
  TMC-2206 VL   QFVLTQSPAFLSASPGEKVTMTC   SANSS VNYIH   WYQQKSGTSPKKWIY   DTSKLAS
  A14 VL   DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITC   QASEGIGNYLY   WYQQKPDQAPKLLIK   YASQSIS
  hVL1.0   QFVLTQSPAFLSVTPGEKVTITC   SANSS VNYIH   WYQQKPDQAPKKWIY   DTSKLAS
  hVL2.0   -----------------------   -----------   ------------L--   -------
  hVL3.0   -----------------------   -----------   -----------LL--   -------
  hVL4.0   DV-M-------------------   -----------   ---------------   -------
  hVL5.0   D----------------------   -----------   ---------------   -------
  hVL6.0   ---M-------------------   -----------   ---------------   -------
  hVL7.0   D--M-------------------   -----------   ---------------   -------
  hVL8.0   -----------------------   -----------   ---------------   -------
  hVL9.0   -----------------------   -----------   --------------K   -------
  hVL10.0   D--M-------------------   -----------   ------------L--   -------
  hVL11.0   D--M-------------------   -----------   ---------------   -------
  hVL12.0   D--M-------------------   -----------   ------------L--   -------
  名称   FW3   CDR3   FW4
  Kabat   ---6---------7---------8--------   -9-------   --10------
  TMC-2206 VL   GVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYC   QQWTTNPLT   FGAGTRVELK
  A14 VL   GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYC   QQGNKHPLT   FGQGTKVEIK
  Hvl1.0   GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLEAEDAATYYC   QQWTTNPLT   FGQGTKVEIK
  hVL2.0   --------------------------------   ---------   ----------
  hVL3.0   --------------------------------   ---------   ----------
  hVL4.0   --------------------------------   ---------   ----------
  hVL5.0   --------------------------------   ---------   ----------
  hVL6.0   --------------------------------   ---------   ----------
  hVL7.0   --------------------------------   ---------   ----------
  hVL8.0   --------------F-----------------   ---------   ----------
  hVL9.0   --------------------------------   ---------   ----------
  hVL10.0   --------------------------------   ---------   ----------
  hVL11.0   --------------F-----------------   ---------   ----------
  hVL12.0   --------------F-----------------   ---------   ----------
TMC-2206与胚系序列的氨基酸序列排列比对，显示在初始的人源化TMC-2206变体(TMC-2356)中已回复突变为鼠抗体的构架残基聚集成簇。如排列比对所示，有两个簇位于重链中的FW2和FW3内，类似地，轻链中也有两个簇，一个位于FW1，一个位于FW2。在感兴趣位点含有回复为人残基突变的两个hVH和hVL变体是3.0和4.0变体，它们被设计用来携带突变簇以利于确定这些感兴趣残基位于的区域(表12和13)。除了表7和表8中重点标出的VL区残基的差异外，VL4.0的L1位改变成人的天冬氨酸，因为这是人κ轻链的常见残基。以不同VH/VL组合将hVH3.0和hVH4.0重链与hVL3.0和hVL4.0轻链共同转染，将得到的抗体与上述hVH1.0/hVL1.0抗体通过与未标记的TMC-2206单克隆抗体的头对头比较来比较它们对配体的亲和性。表14中，回复为人残基的1.0版人源化VH或VL残基用粗体斜字表示。表14括孤中的数字代表与hVH1.0、hVL1.0变体相比，效力变化的倍数。
                    表14
Figure A20068005124900971
从Ki值可证明VH 3.0变体中的变化(在H67、H71、H73和H78处插入了人残基，命名为FW-3簇)导致了含hVH3.0的抗体效力大降；类似地，降低也见于hVL4.0变体(在L1、L2和L4处插入了人残基，命名为FW-1簇)。例外的是hVH1.0/hVL3.0和hVH4.0/hVL1.0组合抗体，当将它们与hVH1.0/hVL1.0抗体相比时，显示效力变化分别为1.9和1.3-倍，所有其余的组合抗体显示效力降低大于4倍(表14)。这些数据表明H37(V变为I)和H48(L变为I)回复突变两者都是保守性氨基酸变化而良好耐受。与hVH1.0变体联合，鼠残基L46(K变为L)和L47(W变为L)变回人残基的变化可被合理地良好耐受，但与hVH3.0变体联合时对抗体的亲和性有显著的协同性不良影响。
检测人与鼠VH和VL构架之间存在的残基差异，表明某些变化是保守性变化。此外，进行了对鼠TMC-2206 VH和VL、受者人抗体分子和hVH 1.0及hVL 1.0的三维结构计算机模建。为指导计算机模建，进行了BLAST检索来鉴定与TMC-2206 VL和VH密切拟合的数据库结构。对TMC-2206 VL选择到结构ISY6.pdb(2.0分辨)，对TMC-2206 VH选择到结构IGIG.pdb(2.3
Figure A20068005124900973
分辨)。对受者人轻链分子A14选择到结构ICE1.pdb(1.9
Figure A20068005124900974
分辨)，而对受者人VH重链分子选择到4-59，IDN0(2.3
Figure A20068005124900975
分辨)。
模建预测到人源化VL 1.0中保留的鼠残基可能接触抗原，除了两个(L1和L4)位点外。此模建也表明保留的人胚系构架残基不接触CDR，而保留的鼠构架残基通常在CDR周围聚集成簇。
重链可变区中鉴定到模拟的鼠与人VH区之间有三个区域不相同。第一个区域是残基H27-H33，预测其可能接触抗原和CDR H1。这些残基也可能影响到VL/VH界面的角度，对抗原结合有额外的间接作用。第二个区域是CDR H2的第一个环，此环可能需要FW残基H71。第三个区域是CDR H3。
对于轻链区域，也观察到模拟的鼠与人VL结构之间有三个区域不相同。第一个结构是CDR1，在鼠TMC-2206 VL中此结构长度多一个残基。鼠L71位的Y(A14中为F)可用于容纳此差异。第二个区域是L40-L43，与人相比在小鼠是凸出于溶剂中的环，表明人L40-43可能有问题，虽然第一种人源化原型抗体的活性证明hVL1.0中这些回复突变可被耐受。第三个区域是与鼠结构相比已替代的人构架残基L55-L59。预测构架残基L73(鼠为L，人为F)与这种差异有关，虽然在hVL1.0中回复突变被耐受。
利用硅片上(in silico)的分析，预测了感兴趣的特定重链残基的结果，总结于下表15。感兴趣的轻链残基的类似结果列于表16中。
                       表15
残基   鼠   人    位置                            变化类型
                                                                          
H37    V    I    可能在VH/VL界面                  保守性
H48    L    I    内部，远离结合位点，靠近H67      保守性
H67    L    V    内部，远离结合位点，靠近H48      保守性
H71    K    V    CDR H2残基H53-55之后             大
                 CDR H2之后，溶剂化的(solvated)，
H73    N    T                                     中等
                 靠近H71
H78    V    F    接触CDR H1残基H34，被包埋        大
H91    F    Y    位于VH/VL界面                    保守性
                                                                          
                        表16
残基   鼠    人    位置                             变化类型
                                                                          
L1     Q     D    CDR L3之后，溶剂化的              保守性
L2     F     V    与CDR L3广泛接触，部分溶剂化的    大
L4     L     M    CDR L3之后，部分溶剂化的          保守性
L46    K     L    位于VH/VL界面                     大
L47    W     L    VL内部CDR L2之后                  大
L49    Y     K    可能直接接触抗原                  大
L71    Y     F    CDR L1之后                        保守性
                                                                          
利用硅片上分析，评估能反映人残基替代导致对抗体性能影响可能性的氨基酸位置，导致这种影响的位置排序如下：H48，H67＜H37，H91＜H73＜H78，H71。此排序中，预测H48位回复人残基的突变最可能被最好耐受，而H78或H71位回复突变预测耐受最差。类似地，对轻链区内感兴趣位置预测的顺序如下：L1＜L4＜L71＜L2＜L47＜L46＜L49。这些排序通常与用hVH3.0、hVH4.0和hVL4.0变体获得的Ki值相一致。然而，在对hVL3.0变体活性的观察中，计算机模拟预测的替代效果与用构建的变体观察到的效果之间存在差异。例如，包含VH1.0/VL3.0之间组合的抗体变体产生应有的活性，虽然以上的计算机数据预测hVL3.0变体活性可能大大降低。通过构建其它人源化变体，包括8个VH和6个VL变体(各携带有一个从保留的鼠残基到其相应的人残基的突变)，进一步评估了保留的鼠构架残基的影响。检测了变化对活性的相对贡献。表12列出了VH变体，表13列出了VL变体。
从这些变体获得的Ki值表明，优选保留H71、H78、L2和L46位的小鼠残基可最大程度保留活性，而H37、H48、H67、H91、L1、L4和L71位残基可改变为它们相应的人残基但不导致活性显著丧失。利用计算机模拟，改变鼠残基L47(色氨酸，人抗体此位置罕见的残基)和H73预期会影响抗原结合。然而，如Ki测定，将其改变为人Val-L47对抗原结合无明显影响，改变为Thr-H73只导致微小变化(降低1.6倍)。通过硅片上模拟预测L49(酪氨酸)结合抗原，预测其改变成人赖氨酸可能导致效力的大变化。然而，该位置改变成人赖氨酸只导致以Ki测定的效力降低3.3倍。
通过Ki测定，观察到VH的H78位从鼠的缬氨酸变为人苯丙氨酸的这种改变导致hVH11.0、hVL1.0变体的效力与hVH1.0、hVL1.0变体相比降低70倍。模拟表明此残基对HCDR1的标准结构具有作用。这些结果提示，HCDR1在抗原结合中起作用。为了最大程度保留活性也要保留H71。用hVH9.0、hVL1.0抗体变体，将此残基从赖氨酸变为缬氨酸导致降低6.4倍。此外，轻链的标准残基中L2苯丙氨酸对变化敏感，证据是用hVL4.0变体与hVL5.0、hVL6.0和hVL7.0变体比较，观察到结合亲和性显著丧失。计算机模拟表明，此Phe-L2可能广泛接触LCDR3。对人和鼠抗体数据库的检索表明L2位为苯丙氨酸是罕见的，提示它可能代表体细胞突变而影响到抗原结合。
将上述分析后所选择的耐受回复突变的那些残基组合在hVH变体12.0至14.0和VL变体VL10.0至12中，将这些变体的活性与原始TMC-2206单克隆抗体和鼠-人嵌合TMC-2206抗体进行比较。结果表明，hVL中鼠残基的数目可减少到三个(例如L2[Phe]、L46[Lys]和L49[Tyr])而不会导致这些变体活性的任何丧失。类似地，hVH中鼠残基的数目可从7个减少到3个(例如H71[Lys]、H73[Asn]和H78[Val])而不会导致亲和性和效能在统计学意义上的显著改变。这些结果小结于表17中。
                                    表17
VH      VL     回复至人残基的变化          #鼠残    Ki(nM)        EC50 (nM)
                                           基       平均值±SD    平均值±SD
                                                                                                     
TMC-2206mAb    N/A                                  0.22±0.04    1.18±0.35
 嵌合抗体      N/A                                  0.26±0.07    1.66±0.64
1.0     1.0    N/A                         14       0.27±0.06    2.70±1.66
1.0     1.0Q   N/A                         14       0.35±0.03    3.00±1.20
12.0    10.0   H37，H48，H91，L1，L4，L47  8        0.29±0.05    2.20±0.58
12.0    10.0Q  H37，H48，H91，L1，L4，L47  8        0.31±0.05    2.36±1.06
               H37，H48，H91，H91，L1，                           2.90±2.71
14.0    10.0                               7        0.32±0.07
               L4，L47
               H37，H48，H91，H91，L1，                           2.98±1.98
14.0    10.0Q                              7        0.29±0.05
               L4，L47
               H37，H48，H67，H91，L1，                           2.93±1.37
14.0    12.0                               6        0.38±0.10
               L4，L47，L71
               H37，H48，H67，H91，L1，                           2.95±0.32
14.0    12.0Q                              6        0.33±0.11
               L4，L47，L71
[用Dunnett多重比较检验作ANOVA分析，显示用TMC-2206或嵌合抗体无统计学显著差异]
在平行研究中，构建了这些变体的LCDR1中共有糖基化序列改变的同源抗体。去除糖基化位点(NSS变为QSS)对开发下游制造和加工工艺可能有用。用表18所列的表9中提供的引物对，将hVL1.0、hVL10.0和hVL12.0变体(hVL1.0Q[SEQ ID NO：90]、hVL10.0Q[SEQ ID NO：91]和hVL12.0Q[SEQ ID NO：92])中的N26Q改变引入相关的变体VL中。此N26Q改变对任一得到的抗体(如表17所示)的活性没有统计学显著影响。虽然野生型TMC-2206抗体轻链CDR 1上有此糖基化位点，但这些数据表明，此位点对阻断TMC-2206抗体功能活性的亲和性看来没有作用。
                        表18
  VL变体   用于片段1的PCR引物   用于片段2的PCR引物   用于完整VL的PCR引物
  1.0Q   Igκ-正向 &hLCQ3-R   hLCQ3-F &CI-neo-msc3′   Igκ-正向 &CI-neo-msc3′
  10.0Q   Igκ-正向 &Hlcq3-R   Hlcq3-F &CI-neo-msc3′   Igκ-正向 &CI-neo-msc3′
  12.0Q   Igκ-正向 &Hlcq3-R   Hlcq3-F &CI-neo-msc3′   Igκ-正向 &CI-neo-msc3′
                            实施例4
γ1类人抗体具有结合补体的效应子功能和Fc受体介导的功能。本领域技术人员理解此类抗体可避免抗体依赖的细胞毒(ADCC)和补体反应，因为可优选缺乏此种功能的γ链，如人γ4恒定区。为产生VH12.0、VL10.0Q和VH14.0、VL10.0Q抗体的γ4形式，如下用VH12.0和VH14.0重链的γ4恒定区序列替代它们的γ1恒定区序列。γ4恒定区序列获自Genbank序列KO1316。如本发明所述用衍生自IMAGE克隆20688的γ1 Fc序列产生IgG1抗体的完整重链，具有hVH和hVL区，衍生自KO1316序列的γ4 Fc含有天然存在的Apa1限制性位点，靠近可变区与恒定区连接处。利用此位点来克隆γ4恒定区以替代γ1恒定区。将BamH1和Not1限制性位点安置在该序列的3′末端以利于将其亚克隆到pCI-neo表达载体中。然后由BlueHeron Biotechnology(Bothell，WA)合成γ4序列(SEQ ID NO：105和106)作为从头合成基因。Blue Heron Biotechnology产生的质粒含有从头合成的IgG4恒定区，用ApaI和NotI消化后，凝胶纯化1kb的γ4恒定区片段，将其连接入ApaI/NotI消化的pCI-VH12.0和pCI-VH14.0质粒中，以产生编码VH12.0-γ4和VH14.0-γ4的质粒。将这些质粒各自与pCI-VL10.0Q质粒组合转染到CHO细胞中。转染后4天，收集培养上清液，用蛋白A亲和层析纯化VH12.0、VL10.0Q和VH14.0、VL10.0Q抗体的IgG4同种型。平行进行这些变体γ1构建体的重新瞬时转染。
用酸洗脱和中和后，用HPLC进行分析型分子排阻层析，表明在蛋白A纯化的IgG4制品中存在高等寡聚形式抗体。因此通过Sephacryl S-30026/60分子排阻层析进行了二次纯化步骤获得单体组分。为此，用660ml的SEC运行缓冲液(40mM HEPES、pH 6.5、20mM L-组氨酸、100mMNaCl和0.02％吐温80)预先平衡Sephacryl S-300 26/60柱。通过Superloop(Amersham Biosciences)上样从蛋白A柱洗脱的含有蛋白质的合并级分(12.5ml注入样品)。收集SEC级分(每管5ml)，流速2.0ml/分钟。合并与单体形式相对应的级分(洗脱峰168.4ml)，用Lowry试验测定蛋白含量。
示范性IgG1抗体具有hVH 14.0γ重链(SEQ ID NO：181)或hVH12.0 γ1重链(SEQ ID NO：182)和hVL10.0Q轻链(SEQ ID NO：178)。示范性IgG4抗体具有hVH14.0 γ4重链(SEQ ID NO：174)或hVH12.0 γ4重链(SEQ IDNO：176)和hVL 10.0Q轻链(SEQ ID NO：178)。检测了纯化的抗体，在竞争试验中通过Ki值比较其效力，以及在细胞粘附胶原蛋白试验中效力测定表示为EC50值。不同变体同种型之间没有观察到显著差异，在两种试验中，它们与原始TMC-2206mAb的效力也没有显著差异，如表19所示。
                                表19
            同种型      VH      VL       Ki(nM)    EC50(nM)
                                                                            
TMC-2206    IgG1/κ     鼠      鼠       0.22      1.03±0.29
            hIgG1/κ    14.0    10.0Q    0.24      1.30±0.10
            hIgG1/κ    12.0    10.0Q    0.27      2.20±012
            hIgG4/κ    14.0    10.0Q    0.36      2.82±1.04
            hIgG4/κ    12.0    10.0Q    0.27      1.83±0.27
                        实施例5
在小鼠和大鼠炎症腹膜炎模型中研究了抗α2抗体对中性白细胞外渗的影响，腹膜内施用某些抗原，如酪蛋白、角叉菜聚糖或巯基醋酸盐诱导快速肥大细胞应答引起急性腹膜炎反应(Edelson等，Blood103(6)：2214-2220(2004))。此种腹膜炎的特征是中性白细胞快速渗入(几小时内)然后巨噬细胞慢性渗入和增殖(3-5天)。因此，第一次利用此模型评价使用抗α2整联蛋白抗体在功能上能否阻止或减弱中性白细胞应答反应。
在大鼠和小鼠上建立急性腹膜炎模型。TMC-2206抗体能识别大鼠α2β1整联蛋白，但不能识别小鼠α2β1整联蛋白。然而，进行了许多小鼠体内炎症模型，在小鼠急性腹膜炎模型中采用了替代的抗α2抗体Ha1/29(Pharmingen，Becton Dickenson，CA，目录号559987)。
攻击前15分钟经IV或IP给动物注射抗α2整联蛋白抗体或同种型对照抗体，剂量范围0.1至10mg/kg。IP注射1mL 9％酪蛋白(小鼠)或角叉菜聚糖(大鼠)后，将动物放回鼠笼一定时间：3小时(小鼠)或5小时(大鼠)(每组n＝4)。然后用氟烷麻醉动物，用含有5mM EDTA的5ml(小鼠)或10ml(大鼠)PBS灌洗腹膜腔。低速离心收集细胞，重悬浮于5mLPBS/EDTA，取100μL等份用显微镜观察，观察到大部分细胞具有与中性白细胞相符的多形核形态。低速离心剩余悬液中的细胞获得洗涤后的沉淀细胞。
通过测定髓过氧化物酶(MPO)的活性水平定量测定中性白细胞含量(例如Speyer等，Am J Pathol.163(6)：2319-28(2003))。将从灌洗液回收的细胞沉淀重悬浮于500μL含0.5％溴化十六烷基三甲基铵(HTAB；Sigma-Aldrich，MI)的50mM KH2PO4缓冲液(pH 6.0)中。超声破碎样品60-90秒，4℃ 14,000转/分钟离心5分钟。将50μL样品液转移到微量滴定板孔的50μL HTAB缓冲液中，然后将孔中的此液50μL转移到另50μL缓冲液中，如此进行系列稀释，制备澄清上清液的2∶1系列稀释液。各样品液中加入200μL含0.168mg/mL邻联二茴香胺和0.0005％双氧水的底物缓冲液(50mM KH2PO4缓冲液(pH 6.0))启动显色反应，用设置波长为460nm的Molecular Devices平板读数仪监测此反应。然后计算出最初细胞悬液(每只动物500μl洗涤过的细胞悬液)的酶活性单位数。建立校准曲线来滴定每ml(血)中对MPO具有活性的中性白细胞数量(直接计数中性白细胞进行评估)，表明在检测范围内U/ml与中性白细胞数度/ml之间为强线性关系。
如表20所示，通过测定腹腔灌洗液中回收的MPO总活性显示，抗小鼠α2β1-整联蛋白抗体Ha1/29和TMC-2206对用9％酪蛋白攻击小鼠或用1％角叉菜聚糖攻击大鼠后中性白细胞渗入腹腔有显著作用。小鼠用Ha1/29获得的ED50值为～0.07mg/kg，而大鼠用TMC-2206获得的ED50值为～5mg/kg。这种差异部分与抗人α2β1-整联蛋白抗体对大鼠α2β1-整联蛋白的亲和性与Ha1/29抗体对小鼠α2β1-整联蛋白的亲和性不同有关，部分与大鼠和小鼠模型中使用的抗原(分别为角叉菜聚糖与酪蛋白)不同有关。
                        表20
  剂量(mg/kg)   MPO含量(U)平均值±SEM(n)
 Ha 1/29小鼠(9％酪蛋白)   0.00.050.10.51.0   44.6±10.1 (4)28.1±3.4  (3)13.6±0.8  (4)  P＜0.017.3±2.7   (3)  P＜0.017.5±1.6   (4)  P＜0.01
 TMC-2206大鼠(1％角叉菜聚糖)   0.05.010.015.0   362±49    (5)172±41    (6)  P＜0.01136±24    (5)  P＜0.0182±18     (6)  P＜0.01
                        实施例6
研究了抗α2整联蛋白抗体在小鼠炎性肠病模型(硫酸葡聚糖诱导的结肠炎)中的作用。此模型中，通过饮用水施与5％硫酸葡聚糖钠溶液(DSS)诱导小鼠结肠炎(Elson等，Gastroenterology 109(4)：1344-67(1995)；EggerB等，Digestion 62(4)：240-8(2000))。评估了用抗小鼠α2β1-整联蛋白抗体治疗对结肠炎临床体征和症状发展的作用，以及对促炎白细胞渗入结肠的作用。
配对关养体重16-21克的Balb/C小鼠(Harlan，IN)。施与动物蒸馏水或含5％硫酸葡聚糖钠(DSS)(ICN，Irvine，CA)的水；自由饮水7天。在此期间小鼠出现腹泻和值得注意的体重减轻。研究设计为4组，每组6只小鼠；一组为无药对照，一组为DSS对照，第0、2、4和6天二组接受2或5mg/kg剂量的抗α2-整联蛋白抗体PS/2腹膜内注射。第7天(喂食DSS开始后168小时)麻醉处死小鼠。称体重观察从开始研究开始以来的变化，测量结肠长度，然后按如下0至2的等级对腹泻、结肠出血和直肠出血评分，2分为最严重：
直肠出血：0分＝未见出血；2分＝可见出血
粪便稠度：0分＝正常；1分＝松散；2分＝水泻
结肠出血：0分＝未见出血；2分＝可见出血。
然后对结肠作免疫组化检查。从盲肠到直肠小心切下结肠，用4％多聚甲醛(PFA)液4℃固定2小时，在20％蔗糖液中放置过夜然后用OCT冻存化合物液(Tissue Tek)快速冰冻。用Leica冰冻切片机切成一系列薄片(10μM厚)，空气干燥，用含3％山羊血清的PBS液封闭2小时，加入一级抗体室温培育过夜。所用的一级抗体包括大鼠抗小鼠CD11b/mac-1(巨噬细胞和活化的中性白细胞的一种标志，克隆M1/70，BD-Pharmingen)、仓鼠抗小鼠CD3(T细胞标志，BD-Pharmingen)和克隆F4/80(巨噬细胞标志，Research Diagnostics，Inc)。洗涤切片，用相应的Alexa 488-或TRITC-标记的二级抗体(Molecular Probes，OR)培育2小时，用PBS洗3次每次5分钟，用含DAPI的Vectashield培养基(Vector Labs，CA)包埋。用连接Spot RT照相机的Leica上视荧光显微镜(Research Diagnostics)观察切片。用ImagePro软件(Media Cybernectics，MD)，对每只动物5张不同切片共5个视野上所选择的感兴趣区域(ROI)中的荧光强度和荧光细胞数进行定量，观察肠内膜层与肠绒毛尖端之间的区域，但不观察浆膜表面(自发荧光高)和肠腔。
如表21所示，用抗鼠α2整联蛋白抗体治疗对逆转喂食DSS伴随的体重减轻和粪便稠度具有统计学显著性的剂量效应。两个治疗组(2mg/kg和5mg/kg)对直肠出血和结肠出血都有显著抑制作用，但对与结肠炎发展相关的结肠缩短无明显影响。治疗也与白细胞渗出数显著减少相关(数据未显示)。
                    表21
Figure A20068005124901081
*p＜0.05    **p＜0.01
在另一项研究中，检测了抗α4-整联蛋白抗体(克隆PS/2；SouthernBiotech，AL)、抗α2-整联蛋白抗体(克隆Ha1/29，BD Pharmingen，CA)和抗α1-整联蛋白抗体(克隆Ha8/31；Invitrogen，CA)的效果，与只用DSS-处理的小鼠作比较(每组n＝8)。抗体的治疗剂量为5mg/kg。据报导这些抗整联蛋白功能阻断抗体能缓解实验性结肠炎(Kriegelstein等，J ClinInvest.110(12)：1773-82(2002)；Watanabe等，Am J Physiol GastrointestLiver Physiol，283(6)：G1379-87(2002))。如表22所示，三种抗整联蛋白抗体与结肠缩短的逆转相关，但只有用抗α2抗体治疗与粪便稠度(腹泻)明显改善相关。抗α2和抗α4抗体治疗均显著改善了结肠出血。此研究中，抗体治疗对体重减轻均无明显作用。用抗CD3、F4/80和抗Mac1抗体作间接免疫荧光测定评估固有的T细胞、巨噬细胞和中性白细胞数(如上文所述)，如表23所示，三种抗整联蛋白抗体治疗组与盐水对照相比均显示显著降低。这些数据支持以下结论：在对DSS的反应中，拮抗α2-的功能对集聚到炎症结肠中的这些免疫效应细胞的稳态水平具有深刻的作用，这些变化同时与结肠炎相伴的临床检测结果的改善相关。
                        表22
*p＜0.05
**p＜0.01
                        表23
Figure A20068005124901092
*p＜0.05
**p＜0.01
                        实施例7
研究了抗α2整联蛋白抗体对多发性硬化症的实验性变应性脑脊髓炎模型(EAE)临床病征和症状的作用。SJL小鼠注射合成脑源性肽PLP139-151与弗氏佐剂诱导多发性硬化症的EAE模型被认为是一种复发-缓解多发性硬化症的预言性的模型(Encinas等，J Neurosci Res.45(6)：655-69(1996))。
在4组小鼠(每组8只，参见图1)研究中，两组小鼠在被认为是第一急性期的从疾病症状发作后至第20天内，在第10、11、12、14、15、18和20天施与5mg/kg剂量抗体(同种型对照抗体，或抗鼠α2整联蛋白抗体Ha1/29)。这是急性期的剂量方案。第0天定义为用合成肽PLP139-151加弗氏佐剂开始免疫的那天。疾病发作定义为连续体重减轻的第二天。其它两组小鼠以延迟剂量方案施用，它们接受5mg/kg抗鼠α2整联蛋白抗体或盐水，每周3次，从第18天至第36天，与第二急性期/第一次复发时间重叠。对小鼠的临床病征和症状评分标准如下：
0.5分＝连续两天体重减轻
1分＝尾巴软而无力
2分＝共济失调
3分＝后肢瘫痪
4分＝濒死
5分＝死亡
如表24所示，用5mg/kg抗α2整联蛋白抗体从第一次急性期开始治疗(例如急性治疗)减轻了第一次急性发作的程度也限制了第二次急性发作的程度。第一次急性发作结束后在第18天首次施用(例如延迟治疗，参见图1)，用5mg/kg抗鼠α2整联蛋白抗体治疗的小鼠在第一次复发至第32天中的临床评分也降低，此时间点，两组的疾病评分相似，见表24。当小鼠只在如图2所示的疾病诱导期内施用，抗α2整联蛋白mAb对EAE模型的第一次发作或疾病后续期只有很小疗效或无疗效，小鼠必然发生疾病与用同种型对照抗体治疗的基本相同。这些结果与前人(Yednock等，Nature 356(6364)：63-6(1992)；Theien等，J.Clin.Invest.107(8)：995-1006(2001))在EAE模型上用抗α4抗体PS/2所得结果相反，他们用抗α4抗体PS/2来支持抗α4抗体那他珠单抗(natalizumab)对复发性多发性硬化症的治疗(Miller等，N.Engl.J.Med.348(1)：15-23(2003))。这些结果表明，与α4整联蛋白在神经-炎性疾病中的作用相反，拮抗该受体可能延迟多发性硬化症相关的急性复发，而拮抗α2整联蛋白是降低和治疗急性发作(当它们出现时)的有用治疗方法。
                        表24
Figure A20068005124901111
对获自濒死(第4期)或研究结束时的小鼠脑和脊髓进行组织学分析。用氟烷麻醉濒死期(临床评分4分)小鼠或观察55-60天后的小鼠。给动物输注PBS然后输注4％多聚甲醛液。将脑分成5份纵切厚片，脊髓分成10-12份横切厚片，用石蜡包埋组织，切成4μ薄片，用Luxol蓝染色观察髓鞘形成。采用盲法对组织的髓鞘形成、渗入(脑脊膜炎)和血管周围白细胞渗出形成的套(perivascular cutting)打分。对于脊髓切片评分，将每张脊髓切片分成四个象限：前脊索、后脊索、两个侧索。给含脑脊膜炎、血管周围白细胞渗出形成的套，或脱髓鞘的各象限按病理分类各打1分。确定各病理类型阳性象限的总数，除以切片上的象限总数，再乘以100，得到各病理类型的百分比。如果象限中存在病损也给以阳性评分，计算出病理总评分。
脊髓中观察到显著的脱髓鞘炎症病损，最常见于后脊索和前侧索腹侧神经根区的细小束支。只观察到轻度血管周围白细胞渗出形成的套。脑膜炎和脱髓鞘表明与临床病征强烈相关(r分别为0.84和0.79)，抗α2-抗体治疗组的评分明显低(抗α2与对照IgG-治疗组相比，此二参数P＜0.01)。这些数据表明，用抗α2整联蛋白抗体治疗抑制了与急性发作相关的脑膜炎和脱髓鞘，和/或促进了髓鞘再生和修复。总体效果是改善了临床结局。
进行了另一项研究(每组n＝17-20)来比较抗α2整联蛋白抗体与抗α4整联蛋白抗体PS/2(购自Southern Biotech)的效果，治疗开始于第一次急性发作至出现缓解(第10-20天)。另二组用对照IgG或抗α2整联蛋白抗体治疗，从开始缓解(第18天)至第一次复发(第36天)和此病的慢性期开始。抗α2整联蛋白抗体治疗再次显示，对神经后遗症(瘫痪)的发生率有显著疗效，在第一次EAE发作及以后的复发期(EAE的慢性期；表24)临床最高平均评分有统计学显著性降低。在疾病的慢性期，延迟的抗α2整联蛋白抗体治疗对临床评分有轻度缓解效应。第一次施用期间的疾病发生率(抗α2为61％；对照IgG为85％)和慢性期治疗的发病率(抗α2为77％；对照IgG为100％)都是抗α2整联蛋白抗体治疗小鼠组低于对照组。在用抗α4治疗的情况下，第一次施用期间疾病发生率(抗α4治疗94％；对照为82％)和复发率(抗α4治疗为89％；对照为92％)，抗α4抗体治疗组与对照组结果相似，然而，以后复发的程度显著降低。抗α4抗体的这些数据与前人报告的抗α4抗体对EAE临床治疗(Theien等，J.Clin.Invest.107(8)：995-1006(2001))的效果相当。
                        实施例8
研究了结合血小板α2β1整联蛋白(α2β1在血小板表面表达)的作用，包括对血小板功能的影响。进行了不同组试验来研究这些效应。
第一项研究通过检测P-选择素的上调或血小板αIIbβ3整联蛋白的激活来评估TMC-2206结合是否会导致血小板活化，αIIbβ3整联蛋白的激活采用αIIbβ3活化特异性抗体如PAC-1进行检测。用21号针头收集停药至少10天的健康供血者前臂静脉血，注入1/10体积的酸化柠檬酸葡萄糖缓冲液(ACD：85mM柠檬酸钠、111mM葡萄糖和71mM柠檬酸，不必调pH)，如用于制备经洗涤的血小板，该缓冲液含有500ng/mL前列腺素I2(PGI2，Sigma-Aldrich)。室温160×g离心全血20分钟，不扰乱中间的黄色白细胞层而取出富含血小板的血浆(PRP)。用柠檬酸葡萄糖缓冲盐水(CGS；13mM柠檬酸三钠、120mM氯化钠和30mM葡萄糖，pH 7.0)和PGI2(500ng/ml)稀释PRP 2.5倍，室温160×g离心20分钟去除污染的白细胞，从而制备洗过的血小板。收集上清液，1100×g离心10分钟制备，将所得的血小板沉淀轻轻重悬浮于CGS缓冲液中，洗涤后用常规蒂罗德s-Hepes缓冲液(12mM NaHCO3、138mM NaCl、5.5mM葡萄糖、2.9mMKCl、10mM HEPES、1mM CaCl2、1mM MgCl2，pH 7.4)重悬浮。37℃使血小板恢复30分钟。计数洗过的血小板，然后加入CaCl2和MgCl2至1mM。用类似方法制备洗过的大鼠血小板，但从腔静脉抽血以最大程度减少抽血过程中血小板被激活。
取50μL新配制的PRP与5μg/mL TMC-2206或小鼠IgG对照抗体一起培育30分钟，洗涤后再与Alexa-594标记的山羊抗小鼠抗体在存在或缺乏Alexa 488-标记的P-选择素抗体(BD Pharmingen，目录号555523)、Alexa-488标记的-PAC-1抗体(BD Pharmingen，目录号340507)或150ngAlexa-488标记的血纤蛋白原(Molecular Probes)的情况下室温培育40分钟。P-选择素和PAC-1是血小板活化的标志物，活化的血小板能结合血纤蛋白原。培育结束时，用1/10体积的4％多聚甲醛固定血小板，用FACScaliburTM流式细胞计数仪进行分析。这些实验的结果出乎意料地显示血小板显然能结合TMC-2206，如在用TMC-2206处理的血小板中观察到荧光强度以对数值增加所表明的那样，但这在用对照IgG处理的血小板中没有观察到；P-选择素或PAC1染色不同时增强，表明TMC-2206结合不激活血小板。
下一项研究通过检测胶原蛋白诱导的血小板凝聚，评估了TMC-2206结合是否会导致血小板激活。可溶性胶原蛋白是血小板凝聚的强效激动剂，常规用来测量血小板反应性(参见例如Hemostasis and Thrombosis；(2001)，Colman等编)。用α2-敲除小鼠的研究结果提示，这些小鼠的血小板对胶原蛋白有轻度减小的反应(Holtkotter等，J.Biol.Chem.277(13)：10789-94(2002)，E.pub：2002年1月11日；Chen等，Am.J.Pathol.161(1)：337-344(2002))。为检测TMC-2206对血小板的胶原蛋白反应是否有不良作用，用Bio-data PAR4集合度计，以经典的光传输激发血凝进行了人和大鼠血小板的凝聚试验。如上所述制备PRP，将血小板计数调整为3×108个/mL。在37℃、5μg/mL TMC-2206存在下，用磁珠将450μL PRP或洗过的血小板搅拌1分钟，然后加入牛皮肤I型胶原蛋白(Biodata Corp)启动凝聚。加入蒂罗德缓冲液至终体积500μL进行洗过的血小板凝聚试验，加入贫血小板血浆(PPP)进行富含血小板血浆(PRP)试验。用500μL蒂罗德缓冲液或PPP作为这些试验的空白对照。在微量离心机中3000转/分钟离心5分钟沉淀PRP中的血小板来制备PPP。在存在或缺乏TMC-2206时加入可溶性胶原蛋白后血小板凝聚的速度和程度是可比较的。这些实验的结果显示，在体外用所测试浓度检测时TMC-2206与血小板的结合出乎意料地对胶原蛋白诱导的血小板凝聚没有影响。
下一项研究评估了TMC-2206结合是否导致血小板减少，这是体内抗体结合血小板的可能结果(Hansen和Balthasar，J Pharmacol Exp Ther.298(1)：165-71(2001))。为检测施与TMC-2206后是否发生血小板减少，通过腹腔注射施与大鼠10mg/kg TMC-2206或施与鼠IgG对照。用注射前的尾血测定基线血细胞数。在腹腔注射药物后特定时间点(例如10、30、60分钟和4、24及72小时)采血样，大鼠不麻醉，用毛细管眼眶取血。将约40μL血移入装有5μL ACD的试管中，立即取样，在Hemavet血细胞计数器(Drew Scientific)中计数。本研究的结果出乎意料地显示，施与5mg/kg或10mg/kg TMC-2206后，血小板计数距基线无显著变化。相反，注射0.1mg/kg的抗另一种血小板受体的抗体(αIIb，抗CD41抗体(BDPharmingen，CA))，诱导了血小板减少，在施与此抗体后15分钟血小板计数下降了约80％。
                        实施例9
研究了抗α2整联蛋白抗体对血小板粘附胶原蛋白包括粘附不同亚型胶原蛋白的作用。α2β1整联蛋白是唯一的能结合胶原蛋白的整联蛋白，虽然它不是唯一的血小板表达的胶原蛋白受体。但是，如上所述，尤其血小板激活存在其它机制，促进其牢固粘附于胶原基质。在本实施例中，评价了TMC-2206抗体阻断血小板(无论是静息的血小板或是以中等血小板激动剂ADP激活的血小板)粘附I、II、III、IV和VI型胶原蛋白的能力。
Immulon II血小板试验，采用溶解于5mM醋酸至终浓度1mg/mL的无泡沫的I、II、III、VI(Rockland Immunochemical)和IV(Sigma，St.Lousis，MO)型胶原蛋白包被孔。用不含Ca++或BSA而含2mM/Mg++的改良蒂罗德-HEPES缓冲液洗涤板孔两次，每孔用100μL不含Ca++而含2mM/Mg++和0.35％BSA的蒂罗德-HEPES缓冲液封闭。
用人静脉血制备血小板，包括实施例8中所述的PRP。室温1100×g离心10分钟获得贫血小板的血浆(PPP)。将获得的血小板沉淀温和重悬浮于1.0mL的CGS(13mM柠檬酸三钠、120mM氯化钠和30mM葡萄糖、pH＝7.0)液中，然后转移到5ml圆底管中加入3μL CFSE贮存液(53.7μM终浓度)轻轻摇晃精确20分钟进行标记。标记好的血小板用CGS缓冲液稀释和洗涤。将沉淀的血小板重悬浮于1mL CMFTH缓冲液(5mMHEPES、pH＝7.3、12mM碳酸氢钠、137mM NaCl、3mM KCl、0.3mMNaH2PO4、5mM葡萄糖和0.35％BSA)保存在尽可能的黑暗处。以类似方法制备洗涤的大鼠血小板，将血液从腔静脉中抽入注射器时，注射器中含有500ng/mL PGE1(ACD中)以最大程度减轻抽血时的血小板激活。
将CFSE标记的血小板用含0.35％BSA的蒂罗德-HEPES缓冲液稀释成2.0×105个/μL。将标记的血小板(1.0×107每孔)加入到含20μM ADP和0.35％BSA的蒂罗德-HEPES缓冲液和不同浓度受试抑制剂的孔中。将含血小板混合物的微量滴定板室温550×g离心10分钟后再于暗室中培育10分钟。用蒂罗德-HEPES缓冲液洗涤各孔。用Victor2荧光平板阅读器读取荧光强度。为了确定荧光强度与血小板数之间的关系，用含0.35％BSA(不含Ca++或ADP)的蒂罗德-HEPES缓冲液将标记的血小板稀释成不同水平后，加入到包被有I型或IV型胶原蛋白的孔中，离心，检测CFSE荧光。如表25所示，在这些静态条件下TMC-2206阻断了与胶原蛋白的结合，EC50为1.7nM。用TMC-2206与大鼠血小板进行了类似研究。抑制大鼠血小板与大鼠I型胶原蛋白结合的EC50值为6.3nM，表明与人血小板上的α2β1相比，大鼠的亲和性改变了约5倍。
                        表25
  胶原蛋白类型   人胶原蛋白来源   ADP刺激(μM)   EC50(nM)
  I型   胎盘   0   1.7
  20   9.5
  II型   膝软骨   0   1.9
  20   27
  III型   胎盘   0   1.6
  20   11
  IV型   胎盘   0   10
  20   ＞1000
  VI型   胎盘   0   2.3
  20   23
如表25所示，TMC-2206是血小板粘附至纤维性胶原蛋白的强效抑制剂，但对非纤维性IV型胶原蛋白效力较弱(10nm比1-2nm)。出乎意料的是当存在ADP时，此抗体抑制(血小板)结合至纤维性胶原蛋白的效力降低了约10-20倍而且不再有效防止(血小板)粘附IV型胶原蛋白。这些意外发现提示TMC-2206和具有TMC-2206特异性结合表位的抗体对抑制激活的血小板与纤维型胶质蛋白相互作用的活性较弱，对抑制(血小板)结合内皮管壁的主要胶质蛋白亚型IV型胶质蛋白只有很少的作用或没有作用(在治疗剂量范围内)。
                        实施例10
研究了抗α2整联蛋白抗体对出血时间的作用。本领域技术人员预计到急性损伤后施与抗血小板整联蛋白抗体，能引起接受此类抗体的对象产生出血疾病和导致其血凝时间延长。为了评价抗α2整联蛋白抗体是否提高了体内出血倾向，检测了TMC-2206对大鼠出血时间的影响。
大鼠通过IP或IV注射TMC-2206后15分钟后检测出血时间。将没有麻醉的大鼠固定于制动装置中，切断尾端0.8cm处以快速引起出血。将鼠尾迅速插入到37℃装有30ml PBS的烧杯中。记录鼠尾停止出血所需的时间为出血时间。表26所示数据表明施与10mg/kg剂量的TMC-2206对出血时间无明显影响。
            表26
  TMC-2206剂量mg/kg   出血时间(n)分钟
  0.0   3.86±0.32 (5)
  5.0   4.51±0.32 (4)
  10.0   4.62±0.67 (7)
                        实施例11
研究了抗α2整联蛋白抗体在动脉血栓形成模型中的作用。施与能与血小板上的α2β1反应的抗体后另一种可能出现的血液疾病可能是由于不希望有的血小板功能影响出现急性动脉损伤后血栓形成的时间延长。因此，用氯化铁诱导的大鼠动脉血栓形成模型检测抗α2整联蛋白抗体例如TMC-2206。这是已应用的开发抗血栓形成药物的一种标准模型，活性显示为血管壁内皮层接触氯化铁溶液后延迟阻塞(Kurz等，Thromb Res.60(4)：269-80.(1990)；Hoekstra等，J Med Chem.42(25)：5254-65(1999))。
大鼠尾静脉注射1-15mg/kg剂量的TMC-2206抗体后约30分钟诱导动脉损伤。对于静脉内注射，大多数抗体浓度为4-5mg/mL以减少高剂量所需的注射体积。治疗分组为1.0、2.5、5.0、10.0和15mg/kg TMC-2206，5.0mg/kg的对照鼠IgG1(κ)(克隆MOPC21)，5.0mg/kg的兔多克隆抗vWF(DAKO)或盐水；每个治疗组3-4只动物。
用60mg/kg戊巴比妥钠麻醉220-270g重Sprague-Dawley大鼠(Harlan)。一旦它们达到有效麻醉状态，曝露颈动脉将其置于一滤纸片(4mm×5mm)上，该滤纸沿4mm边缘折叠安置颈动脉为氯化铁(35％)浸浴颈动脉提供表面。加入12μL的35％FeCl3处理5分钟，随后移去滤纸将Transonic Systems公司流动系统(Ithaca，NY)流量探测器放置在颈动脉周围。测定流量45分钟。
纪录每组几只动物在施与氯化铁后特定时间点的血液流量平均值和SEM。与盐水对照组相比，用所测试的任何剂量的TMC-2206没有观察到时间-阻塞关系有明显差别，表明TMC-2206施用看来对血栓形成无不良作用。虽然动物之间开始的血液流量值变化非常大，但TMC-2206治疗组施与氯化铁后10-16分钟之间的时间-阻塞(各动物之间)相一致，与盐水和对照IgG处理组非常相似，它们的平均阻塞时间分别为12和14分钟。唯一与防止阻塞相关的所测试的处理是阳性对照多克隆抗vWf抗体，在加入氯化铁后长达45分钟时间内血流参数没有减少。
                        实施例12
研究了抗α2整联蛋白抗体的结合特性，包括表位图谱研究，以表征α2整联蛋白亚基上TMC-2206结合位点的性质。能直接结合靶结合位点并起着配体结合直接竞争者作用的抗α2整联蛋白抗体预计可导致在结合α2β1整联蛋白后，血小板激活。或者，与非激活状态α2β1整联蛋白结合且不导致整联蛋白激活的抗α2整联蛋白抗体，可能具类似的血小板非激活状态，这出乎意料地见于TMC-2206抗体。具有与TMC-2206相同或相似表位的抗体能抑制白细胞与胶原蛋白的细胞粘附，因此具有明显的治疗效果，但不会导致结合并激活α2β1整联蛋白可能产生的相关出血并发症。
有人进行了研究以确定TMC-2206识别表位是否位于α2整联蛋白亚基的配体结合结构域I中，或是否其仅依赖于完整结构域I的存在(Hangan等，Cancer Res.56：3142-3149(1996))。在这些研究中，用Tuckwell等，J.Cell Sci.108(Pt 4)：1629-37(1995)所述的改进方法制备了GST-α2结构域I融合蛋白。从大约106个表达人α2整联蛋白的CHO细胞分离的mRNA克隆得到人α2结构域I(Symington等，J Cell Biol.120(2)：523-35.(1993)。细胞先用Trizol试剂(Gibco)裂解，然后加入氯仿提取水相，再加入0.2体积的异丙醇离心沉淀收集RNA，用无RNA酶的水重悬浮。
由Sigma-Genosys合成侧接人α2结构域I的引物。引物的5′和3′端通过工程改造分别加入BamHI和EcoRI位点使能将其克隆入pGEX-2TK载体(GE Biosciences)中。采用标准的Qiagen试剂盒，在一步法RT-PCR反应中用引物halphaIF(5′GGGGATCCAGTCCTGATTTTCAGCTCTCAG；SEQ ID NO：117)和halphaI R(5′GGGAATTCAACAGTACCTTCAATGCTG；SEQ IDNO：118)(参见表27)扩增成熟α2整联蛋白亚基的123-346位氨基酸，并在氨基末端掺入BamHI位点(在结构域I的124位残基上游加入GS)和加入EFIVTD六肽作为EcoRI克隆位点的一部分直至终止密码子。用琼脂糖凝胶电泳检测为一条条带。用Qiagen PCR Quick试剂盒完成PCR反应，PCR产物经限制性酶消化后用标准分子生物学技术克隆到pGEX-2TK载体(Amersham，GE)中。筛选含有插入物的转化细菌，用Beckman-Coulter的CEQ系统对几个克隆进行测序。推导克隆的氨基酸序列与人α2结构域I的可获得序列相同(SEQ ID NO：11，见表28所示)。在DH5α细菌(Invitrogen)中扩增含有正确DNA插入物的单克隆后，重新转化入BL21电穿孔感受态细菌(Invitrogen)中。
                    表27
  引物名称   核苷酸序列(5′-3′)
  halphaI F(SEQ ID NO：117)   GGGGATCCAGTCCTGATTTTCAGCTCTCAG
  halphaI R(SEQ ID NO：118)   GGGAATTCAACAGTACCTTCAATGCTG
  malphaI F(SEQ ID NO：121)   GGGGATCCAGTCCAGACTTTCAGTTCTTG
  malphaI R(SEQ ID NO：122)   TGGGAATTCAACAGTGCCTTCAATGCTG
  引物名称   核苷酸序列(5′-3′)
  ralphaI F(SEQ ID NO：123)   GGGGATCCAGTCCAGACTTTCAGTCGTTGAC
  ralphaI R(SEQ ID NO：124)   TGGGAATTCTGCCATTTCCATCTGGAAGTTG
  halphaI I21 V F(SEQ ID NO：125)   CAGCCCTGCCCTTCCCTCGTAGATGTTGTGGTTG
  halphal I21 V R(SEQ ID NO：126)   CAACCACAACATCTACGAGGGAAGGGCAGGGCTG
  halphal E44V(SEQ ID NO：127)   CAGTAAAGAATTTTTTGGTAAAATTTGTCAAGG
  halphal E44V R(SEQ ID NO：128)   CCTTGACAAATTTTACCAAAAAATTCTTTACTG
  halphal Q48T F(SEQ ID NO：129)   TTTTGGAAAAATTTGTAACAGGCCTGGATATAGGC
  halphal Q48T R(SEQ ID NO：130)   GCCTATATCCAGGCCTGTTACAAATTTTTCCGGGG
  halphal N67E F(SEQ ID NO：131)   CAGTATGCCAATGAGCCAAGAGTTGTGTTTAAC
  halphal N67E R(SEQ ID NO：132)   GTTAAACACAACTCTTGGCTCATTGGCATACTG
  halphal V70I F(SEQ ID NO：133)   TGCCAATAATCCAAGAATTGTGTTTAACTTGAAC
  halphal V70I R(SEQ ID NO：134)   GTTCAAGTTAACACAATTCTTGGATTATTGGCA
  halphal V71I F(SEQ ID NO：135)   CCAATAATCCAAGAGTTATCTTTAACTTGAACAC
  halphal V71I R(SEQ IF NO：136)   GTGTTCAAGTTAAAGATAACTCTTGGATTATTGG
  halphal T76D F(SEQ ID NO：137)   GTGTTTAACTTGAACGACTATAAAACCAAAGAA
  halphal T76D R(SEQ ID NO：138)   TTCTTTGGTTTTATAGTCGTTCAAGTTAAACAC
  halphal Y77F F(SEQ ID NO：139)   TTTAACTTGAACACATTTAAAACCAAAGAAGAA
  halphal Y77F R(SEQ ID NO：140)   TTCTTCTTTGGTTTTAAATGTGTTCAAGTTAAA
  halphal K78E F(SEQ ID NO：141)   AACTTGAACACATATGAAACCAAAGAAGAAATG
  halphal K78E R(SEQ ID NO：142)   CATTTCTTCTTTGGTTTCATATGTGTTCAAGTT
  halphal Y93H F(SEQ ID NO：143)   TCCCAGACATCCCAACATGGTGGGGACCTCACA
  引物名称   核苷酸序列(5′-3′)
  halphal Y93H R(SEQ ID NO：144) TGTGAGGTCCCCACCATGTTGGGATGTCTGGGA
  halphal Y93F F(SEQ ID NO：145) ACATGGGAGACATCCCAATTTGGTGGGGACCTCACAAAC
  halphal Y93F R(SEQ ID NO：146) GTTTGTGAGGTCCCCACCAAATTGGGATGTCTCCCATGT
  halphal Q105E F(SEQ ID NO：147) TTCGGAGCAATTGAATATGCAAGAAAATATGCC
  halphal Q105E R(SEQ ID NO：148) GGCATATTTTCTTGCATATTCAATTGCTCCGAA
  halphal A114Q F(SEQ ID NO：149) AAATATGCCTATTCACAAGCTTCTGGTGGGCGACGAAGT
  halphal A114Q R(SEQ ID NO：150)   ACTTCGTCGCCCACCAGAAGCTTGTGAATAGGCATATTT
  halphal A115T F(SEQ ID NO：151)   AAATATGCCTATTCAGCAACTTCTGGTGGGCGACGAAGT
  halphal A115T R(SEQ ID NO：152)   ACTTCGTCGCCCACCAGA AGTTGCTGAATAGGCATATTT
  halphal A115Q F(SEQ ID NO：153)   AAATATGCCTATTCAGCACAGTCTGGTGGGCGACGAAGT
  halphal A115Q R(SEQ ID NO：154)   ACTTCGTCGCCCACCAGACTGTGCTGAATAGGCATATTT
  halphal R165D F(SEQ ID NO：155)   GTTCTTGGGTACTTAAACGACAACGCCCTTGATACTAAA
  halphal R165D R(SEQ ID NO：156)   TTTAGTATCAAGGGCGTTGTCGTTTAAGTACCCAAGAAC
  halphal N166D F(SEQ ID NO：157)   CTTGGGTACTTAAACAGGGACGCCCTTGATACTAAAAAT
  halphal N166D R(SEQ ID NO：158)   ATTTTTAGTATCAAGGGCGTCCCTGTTTAAGTACCCAAG
  halphal E195W F(SEQ ID NO：159)   TTCAATGTGTCTGATTGGGCAGCTCTACTAGAAAAGGCTG
  halphal E195W R(SEQ ID NO：160)   CAGCCTTTTCTAGTAGAGCTGCCCAATCAGACACATTGAA
  halphal K40D F(SEQ ID NO：161)   ATCCTTGGGATGCAGTAGACAATTTTTTGGAAAAATTT
  halphal K40D R(SEQ ID NO：162)   AAATTTTTCCAAAAAATTGTCTACTGCATCCCAAGGAT
  halphal R69D F(SEQ ID NO：163)   CAGTATGCCAATAATCCAGACGTTGTGTTTAACTTGAAC
  halphal R69D R(SEQ ID NO：164)   GTTCAAGTTAAACACAACGTCTGGATTATTGGCATACTG
  引物名称   核苷酸序列(5′-3′)
  halphal N73D F(SEQ ID NO：165)   AATCCAAGAGTTGTGTTTGACTTGAACACATATAAA
  halphal N73D R(SEQ ID NO：166)   TTTATATGTGTTCAAGTCAAACACAACTCTTGGATT
  halphal Q89H F(SEQ ID NO：167)   ATGATTGTAGCAACATCCCACACATCCCAATATGGTGGG
  halphal Q89H R(SEQ ID NO：168)   ATGATTGTAGCAACATCCCACACATCCCAATATGGTGGG
  malphaIH93Y F(SEQ ID NO：169)   CACATCTGAGACGCGCCAATATGGTGGGGACCTCACAAAC
  malphaIH93Y R(SEQ ID NO：170)   GTTTGTGAGGTCCCCACCATATTGGCGCGTCTCAGATGTG
用IPTG作为诱导剂，在对数生长期的BL21细菌中表达具有人α2结构域I的GST融合蛋白。诱导约4小时后，收集细菌于50mL锥底试管中，3000转/分钟离心沉淀。沉淀物用含蛋白酶抑制剂和1％Triton X-100的PBS重悬浮。超声裂解匀浆1分钟后，3000转/分钟离心去除裂解的细胞碎片。按照生产商说明书用谷胱甘肽-琼脂糖珠(GE-Amersham)纯化细菌裂解液中的GST融合蛋白，纯化蛋白用含20mM游离谷胱甘肽的TBS(pH＝8.0)洗脱。纯化的GST-α2结构域I结合胶原蛋白的特异性与之前报道(Tuckwell等，J Cell Sci.108(Pt 4)：1629-37(1995))的相同，即对I型胶原蛋白的亲和性比IV型胶原蛋白高。它结合固定的TMC-2206的表观Kd值为0.31nM(ELISA测定)，与实施例2中所述的直接结合研究中观察到的TMC-2206结合完整α2β1整联蛋白的亲和性0.37nM相当。然后如实施例2所述评价了可溶性GST-α2结构域I融合蛋白与Eu-标记的TMC-2206竞争结合α2β1包被板孔的能力。发现可溶性GSTα2结构域I的Ki值与非标记TMC-2206获得的值相似(0.18nM比0.28nM)，表明TMC-2206的结合位点位于α2结构域I中并且不需要β1亚基的存在。
进行实验研究了TMC-2206结合的阳离子依赖性。阳离子依赖表明结合部分靶向整联蛋白的二价阳离子结合位点(MIDAS)，因此起着配体模拟物作用。在正常生理条件下，胶原蛋白结合α2依赖Mg++，而将Mg++替换为Ca++时则不发生结合(Staatz等，Cell Biol.108(5)：1917-24(1989)；Emsley等，Cell 101(1)：47-56(2000))。在这些研究中，将GST-α2结构域I融合蛋白固定于Reacti-Bind谷胱甘肽包被的微量滴定板(PierceBiotechnology，Inc.Rockford，IL)上，检测了Eu-标记的TMC-2206在不同阳离子存在条件(无Ca和Mg，Ca++或Mg++的浓度范围在0.1μM至3mM)下的结合能力。滴定板每孔用100μL GST-α2 I融合蛋白(2.0μg/mL，用无二价阳离子的结合缓冲液(50mM HEPES、pH 7.4、150mM NaCl和0.5％吐温20)配制)室温培育1小时进行包被，再用无二价阳离子洗涤缓冲液洗涤各孔四次。每孔用100μL封闭缓冲液(含3.0mg/mL无IgG的BSA[Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA]的洗涤缓冲液)室温封闭1小时，用无二价阳离子的洗涤缓冲液洗涤四次，再用无二价阳离子洗涤缓冲液(每孔300μL)室温浸泡45分钟。各孔用含目的水平的二价阳离子的洗涤缓冲液(每孔300μL)平衡30分钟，再用41pM、199pM、345pM或1nM Eu-标记的TMC-2206或对照抗体37℃培育1小时。鼠TMC-2206抗体以浓度依赖方式结合，在所有条件下结合效力相似，表明其结合α2结构域I为非阳离子依赖性的，因此不涉及MIDAS位点。Eu-标记的对照IgG不结合包被α2β1整联蛋白的孔，证实了此种结合的特异性。
进行其它实验研究了TMC-2206的结合位点。整联蛋白配体通常具有关键氨基酸能与二价金属离子最终形成螯合键(Haas和Plow，Curr.Opin.Cell.Bio.1994；Lee等，Structure 1955)，许多整联蛋白拮抗剂具有该特征，包括抗α1整联蛋白mAb、AQC2(Karpusas等，J.Mol.Biol.2003)，其关键氨基酸是CDR-H3中的D101残基。类似地，TMC-2206CDR-H3的D100可能提供了与α2 MIDAS的这种相互作用。因此，制备了两种包含VH的鼠变体抗体，一种携带D100A突变，另一种携带D100R突变。在Ki测试中评价了它们与Eu-TMC-2206竞争结合的能力，与TMC-2206小鼠-人嵌合抗体进行比较。D100A突变抗体在直至浓度0.9μM时完全无活性，与小鼠-人嵌合TMC-2206抗体相比高出1600倍。相反，如相似的Ki值(0.41nM比0.52nM)所证明的那样，带相反电荷的突变抗体D100R的效力几乎与小鼠-人TMC-2206嵌合抗体相当。这提供证据针对TMC-2206的D100残基在与形成MIDAS配体位点的金属离子螯合复合物的对接中起作用。
进行其它实验研究了TMC-2206的结合特异性，包括研究这种鼠单克隆抗体所针对的人α2β1整联蛋白结构域I的表位图谱。TMC-2206与大鼠α2β1整联蛋白有交叉反应，但与小鼠α2β1整联蛋白无交叉反应。因为α2β1整联蛋白在物种间有高度同源性，采用能鉴定那些动物之间交叉反应差异的此抗体，与不能交叉反应的抗体作比较，这种方法能鉴定出α2β1中对抗体结合起重要作用的残基(例如Champe等，J.Biol.Chem.270(3)：1388-94(1995)；Karpusas等，J.Mol.Biol.327(5)：1031-41(2003)；Bonnefoy等，Blood 101(4)：1375-83)。已分析了α2整联蛋白结构域I单独的晶体结构和与其靶配体胶原蛋白形成的复合物的晶体结构(Emsley等，J.Biol.Chem.272(45)：28512-7(1997)；Emsley等，Cell 101(1)：47-56(2000))。从Genbank中获取到人α2 I(SEQ ID NO：11)、大鼠α2 I(SEQ ID NO：93)和小鼠α2 I(SEQ ID NO：94)结构域的序列比较见28中所示。这种分析显示小鼠结构域I包含14个与大鼠和人α2结构域I均不同的残基(在表28中以粗体和下划线表示)。这些残基可以用于进一步研究TMC-2206的结合表位。
                        表28
Figure A20068005124901251
人α2I   181 ASIPTERYFF NVSDEAALLE KAGTLGEQIF SIEGTVQGGD NFQMEM
大鼠α2I   181 ASTPTERYFF NVADEAALLE KAGTLGEHIF SIEGTVQGGD NFQMEMAQ
小鼠α2I   181 ASTPTERYFF NVSDEAALLE KAGTLGEQIF SIEGTVQGGD NFQMEMSQ
用实施例3所述PCR方法将小鼠和大鼠的GST-α2结构域I克隆为GST融合蛋白以验证各自的结构域I是否保留了合适的交叉反应性。以RT-PCR法，用引物malphaI F(SEQ ID NO：121)和malphaI R(SEQ IDNO：122)从分离自Balb/C小鼠肾的mRNA克隆小鼠α2结构域I，用引物ralphaI F(SEQ ID NO：123)和ralphaI R(SEQ ID NO：124)从分离自Sprague Dawley大鼠肾的mRNA克隆大鼠α2结构域I。此外，从恒河猴和食蟹猴抽取的新鲜血液经低速离心后获得白细胞沉淀，分别克隆这两种非人灵长类动物的α2结构域I。然后将白细胞快速冻存于液氮中。分别用1mL Ttrizol(Invitrogen，Cat#15596-026)裂解总数为5×106(恒河猴)和2×106(食蟹猴)个细胞，如上文所述制备总RNA。将最终得到的RNA重悬浮于50μl DEPC处理的水中。将此RNA作为第一步逆转录(RT)的模板。逆转录反应包括8μl细胞RNA(恒河猴mRNA 2.24μg，食蟹猴mRNA1.44μg)、1μl(10mM)DNTP和1μl(2μM)人结构域I正向引物(GGGGATCCAGTCCTGATTT；SEQ ID NO：119)。将此混合物65℃培育5分钟后用冰冷却。然后取5μL此cDNA作为PCR扩增反应的模板，扩增反应用人的正向和反向引物(正向：GGGGATCCAGTCCTGATTT，SEQ ID NO：119；反向：GGAATTCAACAGTACCTT，SEQ ID NO：120)。循环时间为：94℃ 30秒一个循环；94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 1分钟40个循环；和68℃ 5分钟一个循环。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，直接从琼脂糖凝胶中纯化预期大小的条带后，用BamHI和EcoRI消化，克隆入PGEX-2TK载体中的相同位点并转化BL21细菌。
分离单菌落并对插入序列测序，用Beckman CEQ 8000 DNA分析仪确认小鼠和大鼠α2结构域I的身份，以及检测两种猴与人序列的同源性。克隆的小鼠序列显示与保藏的序列NM_008396.1的结构域I精确相同。类似地，克隆的大鼠序列与Genbank中的大鼠整联蛋白序列XM_34156.1相同，除了此克隆序列比保藏序列多含了6个残基外，这6个残基使大鼠该结构域的16-21位残基(完整α2整联蛋白的139-144位残基)之间的区域得以准确翻译。此段氨基酸序列ACPSLV与小鼠这些位点的残基相同。
在核苷酸水平上，这两种灵长类动物的序列显示与人α2结构域I序列高度同源。恒河猴α2结构域I的核苷酸序列(SEQ ID NO：104)与人核苷酸序列只有一个核苷酸差异，第50个密码子中CTT变为CTG，但是因为两者皆编码亮氨酸，推导的蛋白序列与人相同。食蟹猴α2结构域I的核苷酸序列(SEQ ID NO：103)与人相同，除第40个密码子从人的AAG变为GAC，导致此位从赖氨酸变为天冬氨酸残基外。但是，进一步的研究表明此核苷酸改变是由于动物种间的非保守多态性所致，因为其它食蟹猴显示与人α2结构域I为100％相同(参见实施例18)。
表达融合蛋白，并用上文所述纯化人GST-α2结构域I融合蛋白的方法进行纯化。对谷胱甘肽-琼脂糖凝胶柱洗脱物的分析表明此种啮齿类融合蛋白包含聚集形式。因此，通过FPLC，在Akta-Basic FPLC系统(GE-Amersham)的交联葡聚糖75 10/30(GE-Amersham)柱(灵长动物蛋白)上进行分子排阻层析进一步纯化这些蛋白和灵长类融合蛋白以产生单体组分。然后检测GST融合蛋白结合固定的TMC-2206的能力以及与Eu-标记的TMC-2206竞争结合固定的人α2β1整联蛋白的能力。如上文实施例2所述进行Ki测试。为了评价与TMC-2206的直接结合，用50μL含5μg/ml TMC-2206的碳酸氢盐溶液(pH＝9.0)包被4个Immulon滴定板的孔，4℃密封滴定板包被过夜。次日早上，用TBS溶液洗涤滴定板两次，然后用200μl上文所述的封闭液室温轻摇封闭1小时。封闭后，去除封闭液但不洗涤。而是制备GST融合蛋白的系列稀释液，将其加入孔中室温摇动培育2小时。吸弃孔中液体后加入TBS洗涤缓冲液室温保持5分钟。重复洗涤步骤两次然后加入二级抗体。二级抗体步骤包括将Amersham的HRP缀合的兔抗GST抗体用封闭液作1∶2000稀释。将100μL二级抗体液加入各孔室温轻摇培育1.5小时。再次吸弃孔中液体，用洗涤缓冲液洗涤三次后加入底物反应混合液。每孔加入100μL底物反应混合液(TMB试剂盒1∶1稀释)维持6分钟。加入100μL 0.1M H2SO4终止反应。用Molecular Dynamics平板读数仪和伴随的Softmax软件分别读取板孔中反应液的分光光度吸光值进行定量。用Prism软件(Graphpad，CA)从EC50值估测Kd值。
与人α2相比，大鼠α2 I结合TMC-2206的Kd相差三倍，而小鼠α2I-GST融合蛋白在最高浓度时只有少许特异性结合，表明亲和性差异超过1500倍(参见表29)。恒河猴GST-α2 I显示的亲和性与人α2相当，而出乎意料的是食蟹猴GST-α21在浓度高至1μMa时未显示可测及的对TMC-2206的亲和性。这些相关浓度范围也在Ki测试中见到。食蟹猴结构域I-GST融合蛋白对TMC-2206缺乏交叉反应性，表明K40残基可能是表位决定簇。克隆的大鼠GST-α2 I(Kd为0.54nM和Ki值为3.8nM)与人GST-α2 I融合蛋白(Kd为0.18和Ki值为0.33nM)相比亲和性的差异，与TMC-2206试验中所见的EC50值差异相符，如上文实施例9所述该试验是比较TMC-2206拮抗新鲜的大鼠血小板与人血小板相比较粘附I型胶原蛋白的能力。类似地，GST小鼠α2 I融合蛋白对TMC-2206缺乏交叉反应性与完整小鼠α2β1整联蛋白对该抗体缺乏交叉反应性相符。
                表29
  融合蛋白   Kd(nM)   Ki(nM)
  人α2I   0.18   0.33
  大鼠-α2   0.54   3.8
  小鼠-α2   ND*   ND*
  食蟹猴α2   ND@40nM   ND*
  融合蛋白   Kd(nM)   Ki(nM)
  恒河猴α2   0.04   4.4
  GST   ND*   ND*
*ND表示高至浓度～1μM时不可检测
在其它研究中，用标准的分子生物学方法作PCR(引物序列见表30)分别使克隆的人α2结构域I-融合蛋白中14个残基突变，这14个残基对应的小鼠α2结构域I与人和大鼠α2结构域I相比是具有唯一差异的的残基。对单个细菌克隆进行测序以确认在结构域I中已掺入了正确的突变。一个需要的变体G101R突变体没有产生正确的克隆，因此不作进一步研究。设计的产生Y93H突变的引物导致一组克隆携带有Y93D替代突变。评价了这两种Y93变体。其余克隆的序列都正确。表达获得的蛋白变体并按上文所述野生型人α2结构域I-GST融合蛋白的纯化方法进行纯化。然后用三种方法检测它们的活性：第一，它们结合不同胶原蛋白的相对能力以确定这些突变没有产生大的构象干扰作用而干扰配体结合；第二，对TMC-2206的表观亲和性(用ELISA检测与固定TMC-2206的直接结合)；第三，在Ki测试中作为竞争配体的能力。Ki和表观Kd数据小结于表30。
                表30
  融合蛋白中的突变 Kd 表观(nM)  Ki(nM)
  hα2结构域I 0.31   0.18
  hα2结构域I I21V 0.28   0.24
  hα2结构域I E44V 0.23   0.35
  hα2结构域I Q48T 0.19   0.73
  hα2结构域I N67E 0.28   0.40
  融合蛋白中的突变   Kd 表观(nM)   Ki(nM)
  hα2结构域I V70I   0.44   0.86
  hα2结构域I V71I   0.19   0.83
  hα2结构域I T76D   0.17   0.15
  hα2结构域I Y77F   0.22   0.39
  hα2结构域I K78E   0.16   0.51
  hα2结构域I Y93D   ND@440nM   ND*
  hα2结构域I Y93H   6.1   ND*
  hα2结构域I Q105E   0.15   0.38
  hα2结构域I A114Q   0.19   0.64
  hα2结构域I A115T   0.19   0.76
*ND表示高至浓度～1μM时仍不可检测。
在评价的13个残基中，12个残基变化为鼠对应物对亲和性的影响轻微，但如表31所示，Y93的变化导致亲和性显著丧失。Y93D突变破坏了其结合抗原的能力，即使在浓度比野生型结构域I-GST融合蛋白的Kd值高3-logs时也如此。突变为鼠组氨酸(Y93H)导致对TMC-2206抗体的表观亲和性下降23倍。两种突变都破坏了GST-结构域I拮抗Eu-标记抗体结合此抗原的能力。鼠H93突变为Y赋予了鼠α2结构域I结合TMC-2206的能力，虽然与野生型人α2结构域I相比效力低200倍，如表31所示。
                        表31
 融合蛋白中的突变   使用的引物   ki(nM)
 hα2结构域I   0.28
 hα2结构域I E195W   halphaIE195W F(SEQ ID NO：159)halphaIE195W R(SEQ ID NO：160)   12.8
 hα2结构域I R165D   halphaIR165D F(SEQ ID NO：155)halphaIR165D R(SEQ ID NO：156)   1987
 hα2结构域I N166D   halphaIN166G F(SEQ ID NO：157)halphaIN166G R(SEQ ID NO：158)   ND
 hα2结构域I Y93F   HalphaIY93F F(SEQ ID NO：145)halphaIY93F R(SEQ ID NO：146)   ND
 hα2结构域I K40D   halphaIK40D F(SEQ ID NO：161)halphaIK40D R(SEQ ID NO：162)   ND
 hα2结构域I N73D   halphaIN73D F(SEQ ID NO：165)halphaIN73D R(SEQ ID NO：166)   2.17
 hα2结构域I Q89H   halphaIQ89H F(SEQ ID NO：167)halphaIQ89H R(SEQ ID NO：168)   4.46
 鼠α2I中的突变
 mα2结构域I H93Y   malphaIH93Y F(SEQ ID NO：169)malphaIH93Y R(SEQ ID NO：170)   20.2
比较人α2结构域I闭合(NCBI PDB入口1AOX)和开放时的晶体结构，配体结合(PDB入口1DZI)构象显示Y93位于结构域I的表面α7螺旋之后，表明在配体结合时经历较大的向下运动(Emsley等，J.Biol.Chem.272：28512(1997)和Cell 100：47(2000)。尽管之前没有鉴定到配体结合的相关构象变化，但晶体结构的观察表明在闭合构象时Y93的芳香环凸出于蛋白表面，而在开放的配体结合构象时，Y93向边缘和向下翻转沿结构域I表面排列。为了研究TMC-2206与α2β1整联蛋白结合是否依赖于给定的构象状态，在结构域I中引入突变使结构域I倾向开放构象。已报道E195W突变(完整α2整联蛋白中的E318)将α2结构域I锁定于开放构象(Aquilina等，Eur.J.Biochem.269(4)：1136-44(2002))，因此可利用这一点来区分抗体识别是否依赖于激活的构象。此外，晶体图研究显示E195与αC环中的R165残基形成埋藏的盐桥，起着保持αC环处于屏蔽配体结合位点的构象的作用(Emsley等，Cell 100：47(2000))。假定αC环在开放位置中为延伸构象，并假定R165与毗邻的R166残基对结合胶原蛋白都有贡献(Emsley等，J Biol Chem 272：28512(1997)和Cell 100：47(2000)；
Figure A20068005124901321
等，J Biol Chem 275：3348(2000))。因此，构建了四个突变，E195W突变；R165D突变，使所带电荷逆转因而破坏了闭合构象中与E195W形成的盐桥；N166D突变，也逆转αC螺旋内所带的电荷。E195W改变导致如表31所示Ki值降低了45倍，表明TMC-2206抗体对闭合构象显示较高亲和性。R165D和N166D改变使结构域I丧失结合TMC-2206表位的能力，即使在浓度高达1μM时也如此，再次提示MC-2206抗体识别闭合构象。
从诱变和构象研究可明白，在闭合构象中Y93对TMC-2206结合具有重要作用，可能提供了一个种属特异性结合决定簇。用食蟹猴结构域I多态性获得的此意外结果表明K40残基在抗原-TMC-2206相互作用中也可能起着重要作用。TMC-2206的电脑模拟表明诸CDR形成了一个相对扁平的结合位点，提示此抗体可产生多点抗原接触。由于CDR内的几个残基带有电荷，闭合位置时Y93周围的带电残基在开放构象中也显示有显著位置变化，从开放和闭合两种构象的PDB结构鉴定到这些残基为K40、R69、N73和Q89。这些残基中的三个所带电荷通因产生以下突变K40D、R69D和N73D而逆转，第四个残基经修饰产生表31所示的Q89H变体。此外，使第三个残基93变体从酪氨酸变为苯丙氨酸，以判断酪氨酸的芳香族特征是否是重要的结构特征，或活性是否依赖于酪氨酸的芳香族羟基特征。就这组突变为例，用HPLC纯化所有突变蛋白以富集从谷胱甘肽-琼脂糖亲和柱获得的单体组分蛋白制品。对每种突变蛋白先评价其结合胶原蛋白的功能。除R69D外，所有突变蛋白结合胶原蛋白的EC50值都与野生型人α2结构域I相似。在其它突变蛋白中，导入K40D突变破坏了竞争结合TMC-2206表位的能力。此结果与显示该残基为多态性(赖氨酸变为天冬氨酸)的克隆的食蟹猴结构域I获得的结果相符。同样地，Y93F突变也破坏了竞争结合Eu-TMC-2206的能力。N73D和Q89H突变显示Ki值分别降低了7.8和15.9倍(表30)。综合这些突变数据，表明K40、Y93、R165和N166残基可能是TMC-2206结合其表位的决定簇，N73和Q89对结合能也有所贡献。
这些数据表明TMC-2206抗体及其衍生物和能识别与TMC-2206相同或相似表位的TMC-2206样(例如AK47)抗体是α2β1胶原蛋白相互作用的非典型、非配体模拟拮抗剂。该结论得到以下支持：1)它们以二价阳离子非依赖方式阻断α2β1整联蛋白介导的胶原蛋白粘附的能力，2)这种抑制不涉及关键的酸性基团如H-CDR3中的D100与MIDAS的相互作用，3)此抗体所结合的结构域I表面远离直接配体结合位点，4)TMC-2206结合位点喜爱受体的闭合构象，并包含K40、N73、Q89、Y93、R165和N166氨基酸残基。因此，TMC-2206和TMC-2206样抗体(例如能识别与TMC-2206相同或相似表位的抗体)的结合不支持同类胶原蛋白配体被占据时通常发生的整联蛋白介导的外向内信号传递，并且这种结合方式可能对此抗体和TMC-2206样抗体不会导致出血有所贡献。
                        实施例13
进行试验研究比较其它功能性阻断抗α2整联蛋白抗体与TMC-2206的结合。如实施例12所述的谱图研究结果表明，TMC-2206抗体看来是结合α2整联蛋白结构域I的闭合构象，和/或不具有配体模拟物的作用。这些出乎意料的结果以及实施例8、9、10和11与血小板相关的研究中得到的出乎意料的结果证明了TMC-2206(识别的)表位极其有益，且功能特性与TMC-2206类似的抗体极其有用。本发明描述了开发鉴定这种相似抗体的筛选方法，并用这些方法鉴定抗体。
为了确定何者功能性阻断抗α2整联蛋白抗体以相似方式结合TMC-2206，进行了一系列交叉竞争试验研究。该研究中，将市售抗人α2整联蛋白抗体、人GST-α2 I融合蛋白按上文所述固定于微量滴定板孔上。检测抗体分别为AK7(Mazurov等，Thromb.Haemost.66(4)：494-9(1991))；P1E6(Wayner等，J.Cell Biol.107(5)：1881-91(1988))；10G11(Giltay等，Blood 73(5)：1235-41(1989))和A2-IIE10(Bergelson等，Cell Adhes.Commun.2(5)：455-64(1994))，购自Chemicon，(Temecula，CA；目录号CBL477(AK7)；MAB1950(P1E6)；MAB1988(10G11)和Upstate(Waltham，MA；A2-IIE10，目录号05-227)。将待测抗体与表位谱图研究中所用的包被血小板α2β1的同一批微量滴定板一起，检测它们拮抗Eu-标记TMC-2206结合的能力。在另一组研究中，检测了此抗体拮抗新鲜分离的静息血小板结合I型胶原蛋白的能力。因此，检测了不同的抗人α2整联蛋白抗体拮抗Eu-标记TMC-2206抗体结合包被有血小板α2β1的微量滴定板孔的能力，表示为Ki值，以及在静态条件下拮抗静息血小板粘附I型胶原蛋白的能力，表示为EC50值。表32所示结果表明，AK7抗体是TMC-2206的有效竞争者。克隆10G11清晰显示能与TMC-2206双相竞争，提示它的作用不仅仅是简单的竞争性拮抗剂。A2-IIE10阻断血小板粘附与TMC-2206相比有10倍差异，但与Eu-标记的TMC-2206竞争能力相差约350倍，再次表明了两种抗体之间没有直接协同作用。P1E6在二试验中没有显示任何作用，表明它识别的是激活构象。
                表32
  竞争性抗体   Ki(nM)   EC50
  TMC-2206   0.11   6
  AK7   0.07
  10G11   高亲和性：0.05低亲和性：7.7   ＞200
  A2-IIE10   29.6   68
  竞争性抗体   Ki(nM)   EC50
  P1E6   *[没有竞争]   *[无作用]
  对照IgG   *[没有竞争]   *[无作用]
*在所述试验条件下没有检测到。
这些数据第一次证明不是所有的功能性阻断抗体以同样的方式结合α2整联蛋白，还显示了具有类似阻断活性的对TMC-2206有类似表位特异性的抗体新亚组的鉴定方法。这些数据还证明了这种抗α2抗体新亚组(包括TMC-2206和对TMC-2206有类似表位特异性的抗体)的特征是意想不到的不会诱发体内出血并发症和/或不激活血小板α2β1整联蛋白。表位特异性、功能性阻断活性和诸如不激活血小板的优点并非是所有抗人α2β1功能性阻断抗体的特征，而是包括TMC-2206及其类似抗体在内的抗体新亚组的新特征，所述类似抗体包括按本发明所述鉴定和/或选择的TMC-2206抗体的衍生物和/或变体。
已证明并非所有能结合α2结构域I的功能性阻断抗体都能结合与TMC-2206相同或似(例如重叠)的表位。进行了研究以确定鼠效应研究中所用的替代抗体是否具有类似于TMC-2206的特性。因为Ha1/29抗体与大鼠和小鼠α2整联蛋白有交叉反应，而TMC-2206抗体能结合人和大鼠α2整联蛋白二者，所以用大鼠GST融合蛋白来测定这两种抗体是否能结合重叠的位点(如分享表位特异性)。为此，将大鼠GSTα2结构域I融合蛋白固定于Reacti-Bind谷胱甘肽包被的微量滴定板孔(PierceBiotechnology，Inc.Rockford，IL)上。先按照实施例2所述测定37℃时Eu-TMC-2206结合固定的人和大鼠GST-α2结构域I的Kd值。结合与游离Eu-TMC-2206的斯卡查德分析表明人α2结构域I的Kd值为0.2nM，大鼠α2结构域I的Kd值为1.3nM(低6倍)。然后，按实施例2所述，利用此Kd值1.3nM，从所观察的EC50值推论Ki值，评价在不同浓度竞争抗体存在下Eu-标记的TMC-2206结合大鼠α2结构域I的能力。Eu-TMC-2206结合的有效拮抗剂是Ha1/29(Mendrick和Kelly，Lab Invest.69(6)：690-702(1993))而不是HMα2抗体(Miyake等，Eur.J.Immunol.24：2000-2005(1994))，表明Ha1/29抗体结合位点类似(如重叠)于TMC-2206结合位点。
                        实施例14
进行另一项试验研究了具有hVH14.0 γ4重链(SEQ ID NO：174)或hVH12.0 γ4重链(SEQ ID NO：176)和hVL 10.0Q轻链(SEQ ID NO：178)的示范性IgG4抗体。通过检测对胶原蛋白诱导的血小板凝聚的影响，该试验评价了这些IgG4抗体的结合能否导致血小板激活。静脉刺穿肘前血管收集血样品，弃去最先自然流出的3ml血液后将血样收集到含3.8％柠檬酸钠的真空管中。所有抗体都用盐水稀释到终浓度140μg/ml。每个一次性使用试管(含一次性使用电极装置)可分装0.5mL含柠檬酸盐的全血和0.5mL盐水或抗体溶液。将每个试管在集合度计(591A型，Chrono-Log，Havertown，PA)的温热孔中37℃预热5分钟，然后放入反应孔中，设定基线，然后每孔中加入20μl盐水或胶原蛋白液(1mg/ml；马I型胶原，Chrono-Log)诱发凝聚反应。在凝聚期间，产生血小板累积于电极曝露表面导致电阻升高。通过图表记录器(707型，Chrono-Log)记录6分钟内的电阻变化(ΔΩ，欧姆)数据。
用Kruskal-Wallis检验分析所得数据(表33)，检测对四组中每组(盐水或胶原蛋白)的群体中位数相等的假设，如果P值小于或等于0.05时拒绝这种假设(95％置信度)。对于盐水组(P值＝0.148)，与盐水阴性对照相比，同种型对照或两种人源化抗体都不诱导人血小板凝聚。对于胶原蛋白组(P值＝0.201)，与盐水阴性对照相比，同种型对照和两种人源化抗体都不抑制胶原蛋白诱导的凝聚。该研究和实施例8的结果表明，在所有的体外检测浓度下TMC-2206和两种人源化IgG4变体抗体的结合对胶原蛋白诱导的血小板凝聚都没有作用。
                         表33
Figure A20068005124901371
                       实施例15
按照实施例2所述程序，用CHO-α2细胞、HT1080(人纤维肉瘤)细胞和人血小板检测人源化TMC-2206(hIgG4/κVH12.0/VL10.0Q)阻断α2β1整联蛋白介导细胞粘附I型胶原蛋白的能力。人源化TMC-2206是细胞结合胶原蛋白的强效抑制剂，其EC50值与TMC-2206相当(表34)。
                         表34
  I型胶原蛋白来源 细胞   TMC-2206EC50(nm)(平均值±SEM)   人源化TMC-2206EC50(nm)(平均值±SEM)
  大鼠尾 人血小板   3.1±0.3   4.7±0.3
HT1080   0.90±0.02   0.90±0.27
CHO-α2   0.58±0.51   1.9±1.5
  人胎盘 人血小板(n＝1)   8.44   13.1
                       实施例16
评价了人源化TMC-2206结合固定于ELISA板上的人α1β1整联蛋白的能力。人α1β1整联蛋白(Chemicon International)用包被缓冲液(25mMTris、pH 7.5、150mM NaCl、1mM MgCl2)稀释成终浓度0.5μg/ml。96孔板每孔用50ng的α1β1整联蛋白包被，4℃培育过夜。用洗涤缓冲液(50mM Tris、pH 7.5、150mM NaCl、2mM MgCl2、0.5％吐温20)洗涤三次，用含5％(W/V)脱脂乳的洗涤缓冲液室温封闭1小时。人源化TMC-2206、人IgG4/κ(同种型对照)、小鼠抗人α1(FB-12，Chemicon International)抗体用结合缓冲液(含0.1mg/ml BSA的无IgG洗涤缓冲液)连续稀释。将每孔50微升的抗体稀释液加入到α1β1整联蛋白包被孔中，室温培育1小时后洗涤三次。将缀合碱性磷酸酶的山羊抗人IgG(二级抗体；JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)加入到含同种型对照和人源化TMC-2206的孔中；将缀合碱性磷酸酶的羊抗小鼠IgG(Sigma)加入到含FB-12的孔中。室温培育1小时后洗涤三次，用底物溶液(1mg/ml磷酸4-硝基苯、0.1M二乙醇胺、5mM MgCl2、pH 9.8)培育20分钟后用NaOH终止反应。用带Softmax Pro软件的Spectramax Plus平板读数器读取吸光度。与TMC-2206相似，人源化TMC2206和IgG4/κ抗体不结合α1β1整联蛋白。对照抗α1β1抗体(FB-12)结合α1β1的EC50为0.79±0.15nM。
                      实施例17
用竞争结合试验测定了TMC-2206和人源化TMC-2206单克隆抗体结合固定的α2β1整联蛋白的KD和Ki值。96孔微量滴定板孔用血小板α1β1整联蛋白包被(用人血小板α2β1整联蛋白定制包被，GTI Inc.，WI制)后用脱脂乳封闭。用Eu-N1-ITC试剂标记人源化抗体，用磷酸盐缓冲液(PBS；1.47mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4、pH 7.4、138mM NaCl和2.67mM KCl)重悬浮约2mg抗体并进行透析。用预洗过的MicroSep离心浓缩器浓缩后(30-kDa截断值；Pall Life Sciences 9500转/分钟(7000xg)和JA-20转头(Beckman Instruments，Inc.))4℃离心20分钟，用含100mMNaHCO3(pH 9.3)的PBS将抗体浓度调整至4.0mg/ml。在含0.2mg螯合有Eu3+的N1-(对-异硫氰酸基苄基)-二亚乙基三胺-N1，N2，N3，N3-四乙酸(Eu-N1-ITC；Perkin Elmer Life Sciences)的试管中轻轻加入MAb/碳酸氢盐混合液(0.250ml)并混合，4℃静置培育过夜。将此标记的抗体混合物加到用运行缓冲液(50mM Tris、pH 7.4和138mM NaCl)预平衡的PD-10柱(GE Biosciences，Piscataway，NJ)上。收集各级分(0.5ml)，用SpectraMax384吸光度平板阅读器检测总蛋白(Bradford试剂；Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，以DELFIA增强液(Perkin-Elmer)1∶10.000稀释后用Victor2多种标记平板阅读器(Perkin Elmer)进行时间分辨荧光(TRF)检测铕荧光。合并蛋白和铕标记物皆为阳性的级分，上样到新的PD-10柱上，收集样品检测总蛋白，用经铕标准液(Perkin-Elmer)校正的TRF检测铕含量，计算出荧光：蛋白比。然后将Eu-人源化-TMC-2206按每孔10μL体积加入到封闭后的α2β1胶原蛋白微量滴定板孔中。密封平板37℃培育1小时使结合达到平衡后，将2μL的样品从各孔转移到含DELFIA增强液(每孔100μL)的新孔中检测游离(未结合)的标记物。将增强液(每孔100μL)加入到空孔中以测定结合的标记。振荡平板(滴定板振荡器，设定速度为5，室温5分钟)，用Victor2多种标记平板阅读器读出TRF强度。用斯卡查德分析计算出KD值。
通过竞争试验测定的ki值分析对固定α2β1整联蛋白的相对结合效应，该试验使用100pM Eu-人源化-TMC-2206，存在不同浓度的未标记TMC-2206抗体或人源化TMC-2206作为竞争抗体，所用的试验系统类似于本实施例上文所述。将受试抗体混合液加入到α2β1整联蛋白包被孔中，检测浓度范围为10-11-10-7M，经特定时间后检测结合的Eu-人源化-TMC-2206量。用Prism软件(GraphPad，Inc.)将抑制曲线与“单一位点竞争”模式拟合得到IC50值，用Cheng和Prusoff方程式(1973)计算出Ki值和从上文中得到各自的KD值。
TMC-2206和人源化TMC-2206的KD和Ki值两者之差都在两倍以内(表35)。因此，TMC-2206和人源化TMC-2206对固定的α2β1整联蛋白结合亲和性相似。
                    表35
  亲和性参数   TMC-2206   人源化TMC-2206
  KD   0.72±0.18nm   1.29±0.17nm
  Ki   0.21±0.08nm   0.41±0.06nm
对TMC-2206和人源化TMC-2206进行表面等离子体振子共振(surface plasmon resonance，SPR)分析，分别测定对α2结构域I的动力学解离常数和结合常数kd和ka(也称为koff和kon)。SPR是一种特征分析大分子相互作用的方法，是一种利用瞬时波现象精确检测极其靠近传感器表面折射率微小变化的光学技术。溶液中的抗原(例如融合蛋白)与其MAb受体(固定于芯片传感器表面)之间的结合导致折射率变化。实时监测这种相互作用，可高精确度检测结合抗原量以及结合和解离速率常数。用公式：KD＝kd/ka＝koff/kon不难计算出平衡解离常数。克隆人α2结构域I以及纯化表达的GST-人α2结构域I融合蛋白在实施例12中已有描述。在20℃用带有研究级别CM5传感器芯片的Biacore 2000光学传感器(BiacoreLife Sciences，Uppsala，Sweden)进行分析，用运行缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCl、0.25mM MgCl2、0.25mM CaCl2、0.5％吐温20、0.1mg/mlBSA、pH 7.4)进行平衡。为了将TMC-2206捕捉在传感器芯片上，将两个芯片流动小室表面包被抗小鼠IgGs；另外两个流动小室包被蛋白A以捕捉人源化TMC-2206。每轮抗原(GST-人-α2结构域I融合蛋白)结合于包被抗小鼠IgGs的表面包括三个步骤。在第一步中，TMC-2206被捕捉于一个抗小鼠IgG表面，然后人源化TMC-2206被捕捉于一个蛋白A表面(其它两个表面(一个为抗小鼠，另一个为蛋白A)作为分析参照)。在第二步中，GST-人-α2结构域I融合蛋白经过注射穿过四个表面。将从反应表面获得的反应(强度)减去从参照表面获得的反应强度(由于抗原和流动缓冲液之间的折射率错配)。在第三步中，使抗原/抗体复合物从表面脱离使该表面能进行另一轮结合。最高的GST-人-α2结构域I融合蛋白浓度为41nM。抗原溶液以50μl/分钟流经表面2分钟，监测从表面解离的抗原6分钟。发现检测到的GST-人-α2结构域I融合蛋白与TMC-2206的结合速率常数和与人源化TMC-2206的结合速度常数相似(表37)。
竞争结合试验和SPR分析都证实了人源化过程不影响人源化TMC-2206与人α2结构域I的结合亲和性。
                        实施例18
用生化分析技术评价人源化TMC-2206的种间交叉反应。在第一项研究中，通过与铕标记的人源化TMC-2206竞争结合α2β1包被板(实施例17)检测了TMC-2206、人源化TMC-2206和不同动物种属的GST-α2-结构域I融合蛋白的结合亲和性(Ki值)。克隆人、恒河猴、大鼠和小鼠的α2结构域I在实施例12中已有描述。从皮肤组织提取的总RNA获得的cDNA中克隆了食蟹猴和其它恒河猴的α2结构域I(MediCorp，Inc.，Montreal，QC)。与人α2结构域I相比，大鼠α2 I结合人源化TMC-2206的Ki值低9倍，而小鼠α2 I-GST融合蛋白在最高浓度(4μM；表36)时只表现出轻微特异性结合。[GST-融合蛋白阴性对照和IgG4/k同种型阴性对照在0.4μM浓度时没有显示任何竞争结合效力]。恒河猴、食蟹猴和人α2I-GST融合蛋白显示可比较的结合。因此，所有四种动物的α2 I都证明与人源化TMC-2206有交叉反应。
                        表36
  竞争抗体   Ki(nM)
  TMC-2206   0.14±0.01
  人源化TMC-2206   0.34±0.00
  GST-人-α2结构域I融合蛋白   0.57±0.06
  GST-食蟹猴-α2结构域I融合蛋白   0.47±0.00
  GST-恒河猴-α2结构域I融合蛋白   0.40±0.02
  GST-大鼠-α2结构域I融合蛋白   5.23±0.14
  GST-小鼠-α2结构域I融合蛋白   4.0μM时未检测到
 GST融合蛋白(阴性对照)   0.4μM时未检测到
 人IgG4/κ(阴性同种型对照)   0.4μM时未检测到
在第二项研究中，用SPR分析评价了TMC-2206和人源化TMC-2206与选择的α2 I-GST融合蛋白的速率和平衡结合常数(表37)。亲代和人源化TMC-2206对人和大鼠α2结构域I的所有的动力学和平衡常数相似。此外，人源化TMC-2206对人和食蟹猴α2结构域I的速率常数相似。人源化TMC-2206在小鼠α2 I-GST融合蛋白浓度为4.0μM时不与小鼠α2结构域I结合。GST-食蟹猴-α2-结构域I融合蛋白与人源化TMC-2206的可比较的结合与实施例12结果不一致，在浓度高达1μM时未见竞争性结合(表29)。但对衍生自从猴提取的mRNA的cDNA种群(Medicorp Inc.)进行的DNA序列分析，显示与人α2结构域I相比有一个氨基酸(40位)具有多态性。这种多态性在动物间不保守，因为一只食蟹猴和一只恒河猴显示(此位点为)异态性而其它动物显示与人α2结构域I 100％同源。本实施例中通过竞争性结合和SPR分析研究的GST-食蟹猴-α2-结构域I编码的序列与人α2结构域I相同。这些生化研究证明了人源化TMC-2206与人、恒河猴、食蟹猴和大鼠α2结构域I有交叉反应，而与小鼠α2结构域I没有交叉反应。进行体外细胞交叉反应研究(实施例20)证实了人源化TMC-2206与不同种动物的血细胞有交叉反应。
                                    表37
  MAb   GST-α2 I结构域   kd(s-1)   ka(M-1s-1)   KD(＝kd/ka；nM)
  TMC-2206   人   (11.0±0.5)x10-4   (3.8±0.1)x105   2.9±0.1
  大鼠   (8.2±0.1)x10-4   (4.2±0.1)x105   2.0±0.1
  人源化TMC-2206   人   (8.2±0.3)x10-4   (3.5±0.0)x105   2.3±0.1
  大鼠   (5.7±0.4)x10-4   (3.3±0.3)x105   1.7±0.1
  人   (2.4±0.9)x10-4   (5.8±0.6)x105   4.0±0.1
  食蟹猴   (3.0±0.1)x10-4   (5.0±0.1)x105   5.0±0.1
  小鼠   4.0μM时未检出   4.0μM时未检出   4.0μM时未检出
                        实施例19
用流式细胞计数对人源化TMC-2206与不同动物血细胞的结合进行研究，进一步评价了种间交叉反应性。在第一项研究中，评价了人源化TMC-2206与不同种动物血小板的交叉反应性。经静脉刺穿获得人供者、大鼠和恒河猴/食蟹猴的血样品。人血收集于3.8％柠檬酸钠中；恒河猴和食蟹猴血收集于10mM EDTA中；大鼠血收集于肝素中。将灵长类全血(人、恒河猴、食蟹猴)与终浓度140μg/ml的人源化TMC-2206室温共同培育10分钟，然后与小鼠抗人IgG4-FITC缀合的MAb(克隆HP6023，Southern Biotech)共同培育10分钟，再与缀合荧光分子的物种特异性血小板标记抗体一起培育。人血小板用PE-缀合的小鼠抗人CD42b(BDBiosciences)鉴定，恒河猴/食蟹猴血小板用PE-缀合的小鼠抗人CD41a(BDBiosciences)鉴定。将大鼠全血与缀合至Alexa-488的500μg/ml人源化TMC-2206(Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒，A10235，Molecular Probes)室温培育10分钟，然后与PE缀合的仓鼠抗小鼠CD61(大鼠血小板标记物；BD Biosciences)共同培育。所有样品洗涤一次后悬浮于磷酸盐缓冲液，然后进行流式细胞计数分析。(前散射光和侧散射光的门控设置成对数比例以进一步区分血小板与较大的血红细胞和白细胞)。人源化TMC-2206能结合所有四种动物的血小板(表38)。
在第二项研究中，评价了人源化TMC-2206与不同种动物白细胞的交叉反应。获得同样四种动物的血样品，但是人血收集于10mM EDTA中。将缀合Alexa488的人源化TMC-2206加入全血中(终浓度为225-400μg/mL)，10分钟后与标记抗体室温培育30分钟。用抗CD45抗体染色所有白细胞：人白细胞用PE-Cy5缀合的小鼠抗人抗体(克隆H130，BDBiosciences)；恒河猴和食蟹猴白细胞用PE-Cy5缀合的小鼠抗人抗体(克隆Tü116，BD Biosciences)；大鼠白细胞用PE-Cy5缀合的小鼠抗大鼠抗体(BD Biosciences)。用标记抗体染色血小板：人血小板用PE-Cy5-缀合的小鼠抗人-CD42b(BD Biosciences)；恒河猴和食蟹猴血小板用R-PE-缀合的小鼠抗人-CD41a(BD Biosciences)；大鼠血小板用R-PE-缀合的仓鼠抗小鼠-CD61(BD Biosciences)。将1ml水加入到反应混合物中(约250μl)，室温培育5分钟以裂解红细胞，然后加入2ml PBS(提高渗透压水平防止白细胞裂解)并离心。细胞沉淀重悬浮于0.5ml PBS进行流式细胞计数分析。[侧散射通道设置为线性比例，CD45通道设置为对数比例以区分粒细胞、单核细胞和淋巴细胞]。不同水平的内源性血小板激活将导致血小板-白细胞微聚集体形成，这是鉴定未与血小板(组成型表达α2β1整联蛋白)结合的白细胞的关键。因此只评价了CD45+/CD41a-、CD45+/CD42b-或CD45+/CD61-细胞与人源化TMC-2206的结合。人源化TMC-2206能结合所有四种动物的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞(表38)。
这些结果与实施例19中的人源化TMC-2206能与人、恒河猴、食蟹猴和大鼠GST-α2-结构域I融合蛋白交叉反应(通过Ki和SPR分析)的结果相符。大鼠血细胞与人源化TMC-2206结合的百分率相对灵长类血细胞较低。在上文的三项研究中(实施例9、19和12)，亲代和人源化TMC-2206抗体对大鼠α2整联蛋白亚基的结合亲和性比对人α2亚基的结合亲和性低一个数量级。在实施例9的第一项研究中，TMC-2206抑制大鼠血小板和人血小板结合大鼠胶原蛋白I型的EC50值分别为6.3nM和1.7nM。在实施例19的第二项研究中(表38)，竞争者GST-人-α2-结构域I和GST-大鼠-α2-结构域I融合蛋白抑制人源化TMC-2206结合固定的α2β1整联蛋白的Ki值分别为0.57nM和5.23nM。类似地，在实施例12的第三项研究中(表29)，GST-人-α2-结构域I和GST-大鼠-α2-结构域I融合蛋白抑制TMC-2206结合α2β1整联蛋白的Ki值分别为0.33nM和3.8nM。此外，在血小板和白细胞的研究中，所有细胞样品在作流式细胞计数分析前进行了洗涤，从低亲和性的大鼠α2亚基上洗脱下来的人源化TMC-2206多于从灵长类α2亚基上洗脱下来的。结合前面的结果，导致与灵长类血细胞相比，大鼠血细胞的较低百分率被评为“阳性”(假设α2β1受体的密度相似)。综上所述，四种测试动物(人、恒河猴、食蟹猴和大鼠)的血小板、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞都能结合人源化TMC-2206抗体。
                        表38
Figure A20068005124901451
                      实施例20
在另一项研究中用流式细胞计数检测评价了人源化TMC-2206与α2β1结合能否导致血小板激活。衡量血小板激活是P-选择素上调或GPIIbIIIa(αIIbβ3)整联蛋白激活。静脉穿刺从肘前静脉收集血样品，弃去最先自然流出的3ml血液后，将血样品收集入含3.8％柠檬酸钠的真空试管中。全血用TBS(pH 7.4)作1∶10稀释，然后在室温下分别与盐水、IgG4/κ同种型对照(终浓度132μg/ml)、或人源化TMC-2206(终浓度144μg/ml)培育10分钟。对血小板激活，将凝血酶受体激活肽-6(TRAP-6，终浓度10μM；AnaSpec Inc.，San Jose，CA)或腺苷二磷酸(ADP，终浓度20μM；Sigma)加入样品室温培育5分钟。细胞与标记抗体培育后进行流式细胞计数：用PE-Cy5-缀合的小鼠抗人-CD42b(BD Biosciences)染色血小板；用PE缀合的小鼠抗人-CD62b(BD Biosciences)染色P-选择素；用FITC-缀合的PAC-1(BD Biosciences)染色激活的GPIIbIIIa(PAC-1结合GPIIbIIIa整联蛋白的活化构象)。每份样品的取样误差率低于5％(95％置信水平)。
第一个实验通过检测P-选择素上调评价了人源化TMC-2206的结合是否导致血小板激活。评分激活采用P-选择素标记抗体(CD62P)染色血小板(CD42b+)的百分率(表39)。通过ANOVA分析(单向ANOVA，95％置信区间)，与盐水、IgG4/κ同种型对照和人源化TMC-2206共培育的血小板的P-选择素表达没有统计学差异(P＝0.96)。因此，人源化TMC-2206与血小板结合不会导致血小板激活。在平行试验中，TRAP-6诱导P-选择素表达明显升高。与盐水或同种型对照相比，加入人源化TMC-2206在统计学上不影响TRAP-6诱导的P-选择素表达(P＝0.96；单ANOVA，95％置信区间)。因此，人源化TMC-2206的结合并不抑制TRAP-6诱导的血小板激活。
                            表39
Figure A20068005124901461
下一项研究评价了与或不与激动剂ADP共培育后P-选择素的上调(血小板表达P-选择素的百分比，表40)。如前文所述，与人源化TMC-2206、IgG4/κ和盐水共培育的血小板有可比较的P-选择素表达，因此人源化TMC-2206抗体不诱导血小板激活。ADP诱导的P-选择素表达与TRAP-6诱导的相当。血小板与ADP共培育、然后与IgG4/κ或人源化TMC-2206共培育时，P-选择素表达呈现额外增加。但是，这种P-选择素表达上调的增加对同种型对照和人源化TMC-2206这两者是相似的；再次表明了人源化TMC-2206与血小板结合不导致血小板激活。同样，与IgG4/κ或人源化TMC-2206共培育时，ADP诱导的血小板的P选择素表达不减少。因此，人源化TMC-2206的结合不抑制ADP诱导的血小板激活。
                       表40
Figure A20068005124901471
下一项研究通过记录血小板结合PAC-1标记抗体(其结合于GPIIbIIIa的激活构象；表41)的百分比来评价与或不与激动剂TRAP-6或ADP共培育后GPIIbIIIa的激活。与人源化TMC-2206、IgG4/k和盐水共培育的血小板上表达激活的GPIIbIIIa的水平相当，人源化TMC-2206不诱导血小板激活。IgG4/k和人源化TMC-2206均不抑制TRAP-6也不抑制ADP诱导的激活。
                       表41
Figure A20068005124901472
综上所述，人源化TMC-2206既不诱导血小板激活(不提高P-选择素上调或GPIIbIIIa激活)也不抑制激动剂(TRAP-6、ADP)诱导的血小板激活。这些数据补充了血小板的凝聚研究结果(实施例15，表34)，该研究表明人源化TMC-2206既不诱导血小板凝聚也不抑制胶原蛋白诱导的凝聚。
                      实施例21
通过检测凝血酶原时间(PT)和激活的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)评价了人源化TMC-2206对外在和内在血凝途径的影响。用合格的人血浆冻干制品(Citrex I，Bio/Data Corporation，Horsham，PA)检测PT和aPTT。将人源化TMC-2206加入血浆中至终浓度为179、214和286μg/mL(分别对应于抗体单剂量Cmax为12.5、15.0和20.0mg/kg时的Cmax)，然后进行样品血凝试验。按标准程序用BBL纤维计量仪(fibrometer)(BD，Franklin Lakes，NJ)检测PT和aPPT。表42总结了一组六个试验的数据(3个PT和3个aPTT)。每个试验都有盐水对照。各配对(人源化TMC-2206和盐)的Student-t统计学分析表明各试验的人源化TMC-2206与盐水相比，平均血凝时间无统计学显著差异。(假设如果分别计算的P值小于0.05，血凝时间有差别的拒绝置信度为95％)因此人源化TMC-2206不影响用PT和aPTT检测的血凝作用。
                        表42
Figure A20068005124901481
                      实施例22
评价了人源化TMC-2206对大鼠出血时间的影响。给Sprague-Dawley大鼠(190-200g)静脉内(尾静脉)注射盐水、肝素(0.6mg/kg，阳性对照)或5和15mg/kg剂量的人源化TMC-2206抗体，1小时后标准化切断每只大鼠尾尖(0.5mm)。大鼠不麻醉，观察出血期间其意识状态。将每只大鼠切断的尾尖立即浸入装有盐水的37℃试管的液面下2cm深处。记录开始出现出血停止15秒所需要的时间为出血时间。所用的最大截断时间为20分钟。试管中收集的血溶血后释放的血红蛋白量(分光光度测定)计为出血量。所检测的两种剂量人源化TMC-2206与原初动物
Figure A20068005124901491
和盐水对照相比，对出血时间的影响均无统计学差异(表43：P＝0.08，单向ANOVA分析)。所检测的两种剂量人源化TMC-2206与原初动物和盐水对照相比，对出血量的影响均无统计学差异(P＝0.22，单向ANOVA分析)。因此，人源化TMC-2206不影响体内出血时间和出血量。
                        表43
Figure A20068005124901492
                      实施例23
研究检测单剂量人源化TMC-2206对大鼠循环的细胞因子水平的影响，作为确定人源化TMC-2206导致体内白细胞可检测的激活的方法。将盐水(阴性对照)、人IgG4/κ同种型对照(15mg/kg)、人源化TMC-2206(15mg/kg)或脂多糖(LPS，阳性炎症对照，0.75mg/kg)静脉内施与大鼠。没有注射的大鼠作为原初对照。注射后2、4、6和8小时，经隐静脉收集血样，加工得到血浆。将血浆样品用于基于微珠的多重免疫试验(MIA；Linco Diagnostics，St.Charles，MO)以检测IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α(表44；pg/mL，平均值±SEM)水平。MIA包括在不同光谱的各组微球体上联合进行数种抗原/抗体的结合反应，从而在同一样品体积(25μl)中同时检测多种分析物(可高达100种)。MIA的灵敏度取决于抗原，在1.5-50pg/ml之间。对每种细胞因子数据组用双向ANOVA分析其95％置信区间，以检验所有四个时间点和四种物质(原初、载体、IgG4/k和人源化TMC-2206)各自导致的细胞因子水平相等的假设。当P-值小于0.05时拒绝该假设。注射载体、IgG4/k、人源化TMC-2206的大鼠或不注射(原初)大鼠上观察到十种细胞因子水平每种都没有统计学上的明显差异(所有P-值范围在0.18-1.0之间，表44)。因此，单剂量(15mg/kg)静脉内注射人源化TMC-2206不诱导参与炎症的细胞因子表达的增加。
                            表44
Figure A20068005124901511
虽然参照具体实施例对本发明进行了说明，但是应该理解这些实施方案只是为了阐述本发明的各个方面。因此，应当理解对这些阐述性实施方案可进行各种修改和设计，而不脱离本发明的构思和范围。
                    序列表
<110>格兰马克药品股份有限公司
<120>抗α2整联蛋白抗体及它们的用途
<130>14575.2
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<151>2005-11-18
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<170>PatentIn版本3.3
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<213>人(Homo Sapiens)
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accaaaaatc cagatgagat tgatgagacc acagagctca gtagctgaac cagcagacct  3600
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tttttaaatc ccatattttt tttatcatgt cgtaggtaaa ctaacctggt attttaagag  3720
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caagaatttg acttggaaaa g                                            5361
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<211>1181
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>人α2整联蛋白
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Met Gly Pro Glu Arg Thr Gly Ala Ala Pro Leu Pro Leu Leu Leu Val
1               5                   10                  15
Leu Ala Leu Ser Gln Gly Ile Leu Asn Cys Cys Leu Ala Tyr Asn Val
            20                  25                  30
Gly Leu Pro Glu Ala Lys Ile Phe Ser Gly Pro Ser Ser Glu Gln Phe
        35                  40                  45
Gly Tyr Ala Val Gln Gln Phe Ile Asn Pro Lys Gly Asn Trp Leu Leu
    50                  55                  60
Val Gly Ser Pro Trp Ser Gly Phe Pro Glu Asn Arg Met Gly Asp Val
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Cys Pro Val Asp Leu Ser Thr Ala Thr Cys Glu Lys Leu Asn
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Ser Thr Ser Ile Pro Asn Val Thr Glu Met Lys Thr Asn
            100                 105                 110
Met Ser Leu Gly Leu Ile Leu Thr Arg Asn Met Gly Thr Gly Gly Phe
        115                 120                 125
Leu Thr Cys Gly Pro Leu Trp Ala Gln Gln Cys Gly Asn Gln Tyr Tyr
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Thr Thr Gly Val Cys Ser Asp Ile Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala
145                 150                 155                 160
Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val
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Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys
            180                 185                 190
Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys
        195                 200                 205
Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe
    210                 215                 220
Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser
225                 230                 235                 240
Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile
                245                 250                 255
Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg
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Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp
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Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile
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Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu
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Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro
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Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu
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Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gln Met Glu Met Ser Gln Val Gly Phe Ser
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Ala Asp Tyr Ser Ser Gln Asn Asp Ile Leu Met Leu Gly Ala Val Gly
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Ala Phe Gly Trp Ser Gly Thr Ile Val Gln Lys Thr Ser His Gly His
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Val Thr Thr Gly Ser Val Pro Val Ser Met Ala Thr Val Ile Ile His
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aacagaccac tgtatgttta cttctcacca tttgagttgc ccatcttgtt tcacactagt  3600
cacattcttg ttttaagtgc ctttagtttt aacagttcac tttttacagt gctatttact  3660
gaagttattt attaaatatg cctaaaatac ttaaatcgga                        3700
<210>10
<211>798
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>人β1整联蛋白
<400>10
Met Asn Leu Gln Pro Ile Phe Trp Ile Gly Leu Ile Ser Ser Val Cys
1               5                   10                  15
Cys Val Phe Ala Gln Thr Asp Glu Asn Arg Cys Leu Lys Ala Asn Ala
            20                  25                  30
Lys Ser Cys Gly Glu Cys Ile Gln Ala Gly Pro Asn Cys Gly Trp Cys
        35                  40                  45
Thr Asn Ser Thr Phe Leu Gln Glu Gly Met Pro Thr Ser Ala Arg Cys
    50                  55                  60
Asp Asp Leu Glu Ala Leu Lys Lys Lys Gly Cys Pro Pro Asp Asp Ile
65                  70                  75                  80
Glu Asn Pro Arg Gly Ser Lys Asp Ile Lys Lys Asn Lys Asn Val Thr
                85                  90                  95
Asn Arg Ser Lys Gly Thr Ala Glu Lys Leu Lys Pro Glu Asp Ile Thr
            100                 105                 110
Gln Ile Gln Pro Gln Gln Leu Val Leu Arg Leu Arg Ser Gly Glu Pro
        115                 120                 125
Gln Thr Phe Thr Leu Lys Phe Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Pro Ile Asp
    130                 135                 140
Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Glu
145                 150                 155                 160
Asn Val Lys Ser Leu Gly Thr Asp Leu Met Asn Glu Met Arg Arg Ile
                165                 170                 175
Thr Ser Asp Phe Arg Ile Gly Phe Gly Ser Phe Val Glu Lys Thr Val
            180                 185                 190
Met Pro Tyr Ile Ser Thr Thr Pro Ala Lys Leu Arg Asn Pro Cys Thr
        195                 200                 205
Ser Glu Gln Asn Cys Thr Ser Pro Phe Ser Tyr Lys Asn Val Leu Ser
    210                 215                 220
Leu Thr Asn Lys Gly Glu Val Phe Asn Glu Leu Val Gly Lys Gln Arg
225                 230                 235                 240
Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met
                245                 250                 255
Gln Val Ala Val Cys Gly Ser Leu Ile Gly Trp Arg Asn Val Thr Arg
            260                 265                 270
Leu Leu Val Phe Ser Thr Asp Ala Gly Phe His Phe Ala Gly Asp Gly
        275                 280                 285
Lys Leu Gly Gly Ile Val Leu Pro Asn Asp Gly Gln Cys His Leu Glu
    290                 295                 300
Asn Asn Met Tyr Thr Met Ser His Tyr Tyr Asp Tyr Pro Ser Ile Ala
305                 310                 315                 320
His Leu Val Gln Lys Leu Ser Glu Asn Asn Ile Gln Thr Ile Phe Ala
                325                 330                 335
Val Thr Glu Glu Phe Gln Pro Val Tyr Lys Glu Leu Lys Asn Leu Ile
            340                 345                 350
Pro Lys Ser Ala Val Gly Thr Leu Ser Ala Asn Ser Ser Asn Val Ile
        355                 360                 365
Gln Leu Ile Ile Asp Ala Tyr Asn Ser Leu Ser Ser Glu Val Ile Leu
    370                 375                 380
Glu Asn Gly Lys Leu Ser Glu Gly Val Thr Ile Ser Tyr Lys Ser Tyr
385                 390                 395                 400
Cys Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Gly Glu Asn Gly Arg Lys Cys Ser
                405                 410                 415
Asn Ile Ser Ile Gly Asp Glu Val Gln Phe Glu Ile Ser Ile Thr Ser
            420                 425                 430
Asn Lys Cys Pro Lys Lys Asp Ser Asp Ser Phe Lys Ile Arg Pro Leu
        435                 440                 445
Gly Phe Thr Glu Glu Val Glu Val Ile Leu Gln Tyr Ile Cys Glu Cys
    450                 455                 460
Glu Cys Gln Ser Glu Gly Ile Pro Glu Ser Pro Lys Cys His Glu Gly
465                 470                 475                 480
Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Ala Cys Arg Cys Asn Glu Gly Arg Val
                485                 490                 495
Gly Arg His Cys Glu Cys Ser Thr Asp Glu Val Asn Ser Glu Asp Met
            500                 505                 510
Asp Ala Tyr Cys Arg Lys Glu Asn Ser Ser Glu Ile Cys Ser Asn Asn
        515                 520                 525
Gly Glu Cys Val Cys Gly Gln Cys Val Cys Arg Lys Arg Asp Asn Thr
    530                 535                 540
Asn Glu Ile Tyr Ser Gly Lys Phe Cys Glu Cys Asp Asn Phe Asn Cys
545                 550                 555                 560
Asp Arg Ser Asn Gly Leu Ile Cys Gly Gly Asn Gly Val Cys Lys Cys
                565                 570                 575
Arg Val Cys Glu Cys Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Ser Ala Cys Asp Cys
            580                 585                 590
Ser Leu Asp Thr Ser Thr Cys Glu Ala Ser Asn Gly Gln Ile Cys Asn
        595                 600                 605
Gly Arg Gly Ile Cys Glu Cys Gly Val Cys Lys Cys Thr Asp Pro Lys
    610                 615                 620
Phe Gln Gly Gln Thr Cys Glu Met Cys Gln Thr Cys Leu Gly Val Cys
625                 630                 635                 640
Ala Glu His Lys Glu Cys Val Gln Cys Arg Ala Phe Asn Lys Gly Glu
                645                 650                 655
Lys Lys Asp Thr Cys Thr Gln Glu Cys Ser Tyr Phe Asn Ile Thr Lys
            660                 665                 670
Val Glu Ser Arg Asp Lys Leu Pro Gln Pro Val Gln Pro Asp Pro Val
        675                 680                 685
Ser His Cys Lys Glu Lys Asp Val Asp Asp Cys Trp Phe Tyr Phe Thr
    690                 695                 700
Tyr Ser Val Asn Gly Asn Asn Glu Val Met Val His Val Val Glu Asn
705                 710                 715                 720
Pro Glu Cys Pro Thr Gly Pro Asp Ile Ile Pro Ile Val Ala Gly Val
                725                 730                 735
Val  Ala Gly Ile Val LeuIle Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ile Trp Lys
             740                 745                 750
Leu Leu Met Ile Ile His Asp Arg Arg Glu Phe Ala Lys Phe Glu Lys
        755                 760                 765
Glu Lys Met Asn Ala Lys Trp Asp Thr Gly Glu Asn Pro Ile Tyr Lys
    770                 775                 780
Ser Ala Val Thr Thr Val Val Asn Pro Lys Tyr Glu Gly Lys
785                 790                 795
<210>11
<211>226
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>人α2结构域I
<400>11
Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro
1               5                   10                  15
Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser
            20                  25                  30
Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln
        35                  40                  45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr
    50                  55                  60
Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys
65                  70                  75                  80
Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp
                85                  90                  95
Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tyr
            100                 105                 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val
        115                 120                 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile
    130                 135                 140
Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu
                165                 170                 175
Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val
            180                 185                 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln
        195                 200                 205
Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gln Met
    210                 215                 220
Glu Met
225
<210>12
<211>71
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>FW1-34-59[FW＝1-25；FW2＝26-39；FW3＝40-71]
<400>12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
            20                  25                  30
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
        35                  40                  45
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
    50                  55                  60
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
65                  70
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>FW4 4-59[NCBI登录gi/33583]
<400>13
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VHL-for[正向引物]
<400>14
ccatggctgt cttggggctg ctcttct                                        27
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>HC-rev[反向引物]
<400>15
ggggccagtg gatagac                                                   17
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VLL-for[正向引物]
<400>16
ccatggattt tcaagtgcag attttcag                                       28
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>LCκ-rev[反向引物]
<400>17
gttggtgcag catcagc                                                   17
<210>18
<211>318
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>TMC-2206 VL
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(318)
<400>18
caa ttt gtt ctc acc cag tct cca gca ttc ttg tct gct tct cca ggg    48
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc aac tca agt gtg aat tac att    96
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
cac tgg tac cag cag aag tca ggc acc tcc ccc aaa aaa tgg att tat   144
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
gac act tcc aaa ctg gct tct gga gtc cct gtt cgc ttc agt ggc agt   192
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag act gag   240
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu
65                  70                  75                  80
gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg act act aac cca ctc acg   288
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
ttc ggt gct ggg acc agg gtg gag ctg aaa                           318
Phe Gly Ala Gly Thr Arg Val Glu Leu Lys
            100                 105
<210>19
<211>106
<212>PRT
<213>人
<400>19
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Arg Val Glu Leu Lys
            100                 105
<210>20
<211>357
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(357)
<223>TMC-2206 VH
<400>20
cag gtg cag ttg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag    48
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
agc ctg tcc atc act tgt act gtc tct gga ttt tca tta acc aac tat    96
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
ggt att cac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg    144
Gly Ile His Trp Val Arg Gln ProPro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
gga gtg ata tgg gct cgt gga ttc aca aat tat aat tcg gct ctc atg   192
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
tcc aga ctg atc atc aca aaa gac aat tcc cag agt caa gtc ttc tta   240
Ser Arg Leu Ile Ile Thr Lys Asp Asn Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
aaa atg aac agt cta caa cct gat gac tca gcc act tac ttc tgt gcc   288
Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
aga gcg aac gac ggg gtc tat tat gct atg gac tac tgg ggt cag gga   336
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
acc tca gtc acc gtc tcc tca                                       357
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>21
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>21
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ile Ile Thr Lys Asp Asn Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>22
<211>31
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>TMC-2206-r5’[正向引物]
<400>22
cccgaattca caggtgcagt tgaaggagtc a                                   31
<210>23
<211>35
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>TMC-2206-r3’[反向引物]
<400>23
cgggatcctt aggatcattt accaggagag tggga                               35
<210>24
<211>31
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>TMC-2206-k5’[正向引物]
<400>24
cccgaattca caatttgttc tcacccagtc t                                   31
<210>25
<211>35
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>TMC-2206-k3’[反向引物]
<400>25
cgggatcctt atctctaaca ctcattcctg ttgaa                               35
<210>26
<211>22
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>Igκ(Igk)前导序列
<400>26
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Thr Gly Asp
            20
<210>27
<211>76
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>Igκ-S寡核苷酸[引物]
<400>27
tcgagccacc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg    60
ttccactgga gacgcg                                                    76
<210>28
<211>76
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>Igκ-AS寡核苷酸[引物]
<400>28
aattcgcgtc tccagtggaa cctggaaccc agagcagcag tacccatagc aggagtgtgt    60
ctgtctccat ggtggc                                                    76
<210>29
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>TMC2206VH-hIgG1/4Fc-SalI
<400>29
cttggtcgac gctgaggaga cggtgactga ggt                                 33
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hIgG1/4Fc-SalI-F[正向引物]
<400>30
tcagcgtcga ccaagggccc atcsgtcttc                                     30
<210>31
<211>48
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hIgG1/4Fc-NotI-R[反向引物]
<400>31
aagggaagcg gccgcttatc atttacccyg agacagggag aggctctt                  48
<210>32
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>TMC2206VL-hKc-SalI[反向引物]
<400>32
tcgtttgatg tcgaccttgg tcccagcacc gaacgtgag                           39
<210>33
<211>35
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hKc-SalI-F[正向引物]
<400>33
accaaggtcg acatcaaacg aactgtggct gcacc                               35
<210>34
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hKc-NotI-R[反向引物]
<400>34
aagggaagcg gccgcttatc arcactctcc cctgttgaag ctctt                    45
<210>35
<211>29
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<222>TMC-2206VLwt-hKc-F[正向引物]
<400>35
agggtggagc tgaaacgaac tgtggctgc                                      29
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>TMC-2206VLwt-hKc-R[反向引物]
<400>36
tcgtttcagc tccaccctgg tccc                                           24
<210>37
<211>107
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>A14 VL胚系蛋白
<400>37
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Gly Ile Gly Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>成熟κ轻链的FW4
<400>38
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>39
<211>121
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>4-59 VH胚系蛋白
<400>39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg His Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>40
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH1.0
<400>40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>41
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL1.0
<400>41
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>42
<211>48
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH3.0-F[正向引物]
<400>42
agcgtggaca ccagcaagaa ccagttcagc ctgaagctga gcagcgtg                 48
<210>43
<211>51
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH3.0-R[反向引物]
<400>43
gttcttgctg gtgtccacgc tgatggtcac gcgggacatg agagcgctgt t             51
<210>44
<211>48
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH4.0-F[正向引物]
<400>44
cctccaggca agggcctgga gtggatcggc gtgatatggg ctcgcggc                 48
<210>45
<211>51
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH4.0-R[反向引物]
<400>45
ctccaggccc ttgcctggag gctggcgtat ccagtggatg ccatagttgg t             51
<210>46
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL3.0-F[正向引物]
<400>46
cccaagctcc tgatctatga cacttccaag ctg                                 33
<210>47
<211>42
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL3.0-R[反向引物]
<400>47
agtgtcatag atcaggagct tgggggcctg gtcgggcttc tg                       42
<210>48
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL4.0-F[正向引物]
<400>48
gacgcgaatt cagacgtggt gatgacccag tctccagcat tcctg                    45
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH2.0-F[正向引物]
<400>49
gtgaccatca gcaaggacaa cagc                                           24
<210>50
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH2.0-R[反向引物]
<400>50
gctgttgtcc ttgctgatgg tcacgcggga catgagagcg ctgtt                    45
<210>51
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH5.0-F[正向引物]
<400>51
atcggcgtga tatgggctcg cggcttc                                        27
<210>52
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH5.0-R[反向引物]
<400>52
gccgcgagcc catatcacgc cgatccactc caggcccttg cctgg                    45
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH6.0-F[正向引物]
<400>53
atatgggctc gcggcttcac aaac                                           24
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH6.0-R[反向引物]
<400>54
gtttgtgaag ccgcgagccc atat                                           24
<210>55
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH7.0-F[正向引物]
<400>55
gccgcggaca ccgccgtgta ctactgcgcc agagccaacg acggg                    45
<210>56
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH7.0-R[反向引物]
<400>56
gtagtacacg gcggtgtccg cggcggt                                        27
<210>57
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH8.0-F[正向引物]
<400>57
atatccaact atggcatcca ctgggtt                                        27
<210>58
<211>48
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVH8.0-R[反向引物]
<400>58
ccagtggatg ccatagttgg atatgctaaa tccagagacg gtacaggt                 48
<210>59
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL2.0-R[反向引物]
<400>59
cagcttggaa gtgtcataga tcaatttctt gggggcctgg tcggg                    45
<210>60
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL5.0-F[正向引物]
<400>60
gacgcgaatt cagacttcgt gctgacccag tctccagcat tcctg                    45
<210>61
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL6.0-F[正向引物]
<400>61
gacgcgaatt cacagttcgt gatgacccag tctccagcat tcctg                    45
<210>62
<211>45
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL7.0-F[正向引物]
<400>62
gacgcgaatt cagacttcgt gatgacccag tctccagcat tcctg                    45
<210>63
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL8.0-F[正向引物]
<400>63
ttcaccttca ccatcagcag cctggag                                        27
<210>64
<211>48
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hVL8.0-R[反向引物]
<400>64
ctccaggctg ctgatggtga aggtgaagtc ggtgccgctg ccgctgcc                 48
<210>65
<211>28
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hLCQ3-F[正向引物]
<400>65
ccaatcaagc gtgaactaca ttcactgg                                       28
<210>66
<211>48
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hLCQ3-R[反向引物]
<400>66
ccagtgaatg tagttcacgc ttgattgggc gctgcaggtg atggtcac                 48
<210>67
<211>23
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>Igk-For[正向引物]
<400>67
actcctgcta tgggtactgc tgc                                            23
<210>68
<211>22
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hIgG1Fc-CH1-R[反向引物]
<400>68
gaagtagtcc ttgaccaggc ag                                             22
<210>69
<211>22
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>CI-neo-msc3’[引物]
<400>69
tttcactgca ttctagttgt gg                                             22
<210>70
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH2.0
<400>70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>71
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH3.0
<400>71
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>72
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH4.0
<400>72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>73
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH5.0
<400>73
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>74
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH6.0
<400>74
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>75
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH7.0
<400>75
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>76
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH8.0
<400>76
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>77
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH9.0位置48可以是亮氨酸或异亮氨酸
<400>77
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>78
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH10.0
<400>78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Lau Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>79
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH11.0位置48可以是亮氨酸或异亮氨酸
<400>79
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>80
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL2.0
<400>80
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>81
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL3.0
<400>81
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>82
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL4.0
<400>82
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>83
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL5.0
<400>83
Asp Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>84
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL6.0
<400>84
Gln Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>85
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL7.0
<400>85
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
             20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>86
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL8.0
<400>86
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>87
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL9.0
<400>87
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
             20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Lys
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>88
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL10.0
<400>88
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>89
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL11.0
<400>89
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>90
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL1.0Q
<400>90
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>91
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL10.0Q
<400>91
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>92
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL12.0Q
<400>92
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>93
<211>222
<212>PRT
<213>Rattus rattus
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>大鼠α2整联蛋白结构域I蛋白质
<400>93
Ser Pro Asp Phe Gln Ser Leu Thr Ser Phe Ser Pro Ala Val Gln Asp
1               5                   10                  15
Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Pro Trp Glu Ala
            20                  25                  30
Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln Gly Leu Asp Ile Gly Pro
        35                  40                  45
Lys Lys Thr Gln Val Ala Leu Ile Gln Tyr Ala Asn Asp Pro Arg Val
    50                  55                  60
Val Phe Asn Leu Thr Thr Tyr Lys Asn Lys Glu Asp Met Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Thr Ser Glu Thr Arg Gln Tyr Gly Gly Asp Leu Thr Asn Thr Phe Lys
                85                  90                  95
Ala Ile Gln Phe Ala Arg Asp Ile Ala Tyr Leu Pro Glu Ser Gly Gly
            100                 105                 110
Arg Pro Gly Ala Thr Lys Val Met Val Val Val Thr Asp Gly Glu Ser
        115                 120                 125
His Asp Gly Ser Lys Leu Gln Thr Val Ile Gln Gln Cys Asn Asp Asp
    130                 135                 140
Glu Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu Gly Tyr Leu Asn Arg Asn
145                 150                 155                 160
Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu Ile Lys Ala Ile Ala Ser
                165                 170                 175
Thr Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val Ala Asp Glu Ala Ala Leu
            180                 185                 190
Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu His Ile Phe Ser Ile Glu Gly
        195                 200                 205
Thr Val Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gln Met Glu Met Ala Gln
    210                 215                 220
<210>94
<211>228
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>小鼠α2整联蛋白结构域I蛋白质
<400>94
Ser Pro Asp Phe Gln Phe Leu Thr Ser Phe Ser Pro Ala Val Gln Ala
1               5                   10                  15
Cys Pro Ser Leu Val Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser
            20                  25                  30
Ile Tyr Pro Trp Glu Ala Val Lys Asn Phe Leu Val Lys Phe Val Thr
        35                  40                  45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Lys Lys Thr Gln Val Ala Leu Ile Gln Tyr
    50                  55                  60
Ala Asn Glu Pro Arg Ile Ile Phe Asn Leu Asn Asp Phe Glu Thr Lys
65                  70                  75                  80
Glu Asp Met Val Gln Ala Thr Ser Glu Thr Arg Gln His Gly Gly Asp
                85                  90                  95
Leu Thr Asn Thr Phe Arg Ala Ile Glu Phe Ala Arg Asp Tyr Ala Tyr
            100                 105                 110
Ser Gln Thr Ser Gly Gly Arg Pro Gly Ala Thr Lys Val Met Val Val
        115                 120                 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Lys Leu Lys Thr Val Ile
    130                 135                 140
Gln Gln Cys Asn Asp Asp Glu Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu
                165                 170                 175
Ile Lys Ala Ile Ala Ser Thr Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val
            180                 185                 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln
        195                 200                 205
Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gln Met
    210                 215                 220
Glu Met Ser Gln
225
<210>95
<211>26
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>K-F
<400>95
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtctt                                         26
<210>96
<211>41
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>K-BamHI-R
<400>96
aattcggatc cttactaaca ctctcccctg ttgaagctct t                        41
<210>97
<211>40
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VH12.0-(K71V)-F
<400>97
gcctgaccat cagcgtggac aacagcaaga accaggtgag                          40
<210>98
<211>40
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VH12.0(K71V)-R
<400>98
ctcacctggt tcttgctgtt gtccacgctg atggtcaggc                          40
<210>99
<211>40
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VH13.0-(N73T)-F
<400>99
ctgaccatca gcaaggacac cagcaagaac caggtgagcc                          40
<210>100
<211>40
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VH13.0-(N73T)R
<400>100
ggctcacctg gttcttgctg gtgtccttgc tgatggtcag                          40
<210>101
<211>41
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VH14.0-(V78F)-F
<400>101
gcaaggacaa cagcaagaac cagtttagcc tgaagctgag c                        41
<210>102
<211>41
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VH14.0(V78F)-R
<400>102
gctcagcttc aggctaaact ggttcttgct gttgtccttg c                        41
<210>103
<211>648
<212>DNA
<213>食蟹猴(Macaca fascicularis)
<220>
<221>misc_feature
<223>食蟹猴α2结构域I
<400>103
agtcctgatt ttcagctctc agccagcttc tcacctgcaa ctcagccctg cccttccctc    60
atagatgttg tggttgtgtg tgatgaatca aatagtattt atccttggga tgcagtagac   120
aattttttgg aaaaatttgt acaaggcctg gatataggcc ccacaaagac acaggtgggg   180
ttaattcagt atgccaataa tccaagagtt gtgtttaact tgaacacata taaaaccaaa   240
gaagaaatga ttgtagcaac atcccagaca tcccaatatg gtggggacct cacaaacaca   300
ttcggagcaa ttcaatatgc aagaaaatat gcctattcag cagcttctgg tgggcgacga   360
agtgctacga aagtaatggt agttgtaact gacggtgaat cacatgatgg ttcaatgttg   420
aaagctgtga ttgatcaatg caaccatgac aatatactga ggtttggcat agcagttctt   480
gggtacttaa acagaaacgc ccttgatact aaaaatttaa taaaagaaat aaaagcgatc   540
gctagtattc caacagaaag atactttttc aatgtgtctg atgaagcagc tctactagaa   600
aaggctggga cattaggaga acaaattttc agcattgaag gtactgtt                648
<210>104
<211>648
<212>DNA
<213>恒河猴(Macaca mulatta)
<220>
<221>misc_feature
<223>恒河猴α2结构域I
<400>104
agtcctgatt ttcagctctc agccagcttc tcacctgcaa ctcagccctg cccttccctc    60
atagatgttg tggttgtgtg tgatgaatca aatagtattt atccttggga tgcagtaaag   120
aattttttgg aaaaatttgt acaaggcctg gatataggcc ccacaaagac acaggtgggg   180
ttaattcagt atgccaataa tccaagagtt gtgtttaact tgaacacata taaaaccaaa   240
gaagaaatga ttgtagcaac atcccagaca tcccaatatg gtggggacct cacaaacaca   300
ttcggagcaa ttcaatatgc aagaaaatat gcctattcag cagcttctgg tgggcgacga   360
agtgctacga aagtaatggt agttgtaact gacggtgaat cacatgatgg ttcaatgttg   420
aaagctgtga ttgatcaatg caaccatgac aatatactga ggtttggcat agcagttctt   480
gggtacttaa acagaaacgc ccttgatact aaaaatttaa taaaagaaat aaaagcgatc   540
gctagtattc caacagaaag atactttttc aatgtgtctg atgaagcagc tctactagaa   600
aaggctggga cattaggaga acaaattttc agcattgaag gtactgtt                648
<210>105
<211>997
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>IgG4恒定区
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(978)
<400>105
tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc      48
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
1               5                   10                  15
acc tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc      96
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
            20                  25                  30
ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc     144
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
        35                  40                  45
gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc     192
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
    50                  55                  60
agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acg aag acc tac     240
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
65                  70                  75                  80
acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga     288
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
                85                  90                  95
gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca gca cct gag     336
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu
            100                 105                 110
ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag gac     384
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac     432
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc     480
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc aac     528
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg     576
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc ccg     624
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag     672
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag aac     720
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc     768
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc     816
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc agg     864
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
        275                 280                 285
cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca tgc     912
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
tcc gtg atg cat  gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc ctc    960
Ser Val Met His Glu Ala Leu Hi s Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
tcc ctg tct ctg ggt aaa tgataggatc cgcggccgc                        997
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>106
<211>326
<212>PRT
<213>人
<400>106
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
1               5                   10                  15
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
            20                  25                  30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
        35                  40                  45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
    50                  55                  60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
                85                  90                  95
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu
            100                 105                 110
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>107
<211>648
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>人α2结构域I
<400>107
agtcctgatt ttcagctctc agccagcttc tcacctgcaa ctcagccctg cccttccctc    60
atagatgttg tggtggtgtg tgatgaatca aatagtattt atccttggga tgcagtaaag   120
aattttttgg aaaaatttgt acaaggcctg gatataggcc ccacaaagac acaggtgggg   180
ttaattcagt atgccaataa tccaagagtt gtgtttaact tgaacacata taaaaccaaa   240
gaagaaatga ttgtagcaac atcccagaca tcccaatatg gtggggacct cacaaacaca   300
ttcggagcaa ttcaatatgc aagaaaatat gcctattcag cagcttctgg tgggcgacga   360
agtgctacga aagtaatggt agttgtaact gacggtgaat cacatgatgg ttcaatgttg   420
aaagctgtga ttgatcaatg caaccatgac aatatactga ggtttggcat agcagttctt   480
gggtacttaa acagaaacgc ccttgatact aaaaatttaa taaaagaaat aaaagcgatc   540
gctagtattc caacagaaag atactttttc aatgtgtctg atgaagcagc tctactagaa   600
aaggctggga cattaggaga acaaattttc agcattgaag gtactgtt                648
<210>108
<211>106
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVL12.0
<400>108
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>109
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH12.0位置48可以是亮氨酸或异亮氨酸
<400>109
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>110
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH13.0
<400>110
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>111
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH14.0位置48可以是亮氨酸或异亮氨酸
<400>111
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>112
<211>10
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>LCDR1[N26Q]
<400>112
Ser Ala Gln Ser Ser Trp Asn Tyr Ile His
1               5                   10
<210>113
<211>681
<212>DNA
<213>Rattus rattus
<220>
<221>misc_feature
<223>大鼠α2结构域I
<400>113
agtccagact ttcagtcgtt gacaagcttc tcacctgcag ttcaagcttg cccttccctc    60
gtagatgtcg tagttgtctg tgatgaatca aacagtattt atccctggga agcagtaaag   120
aattttttgg aaaagtttgt gcaaggcctg gatataggac ctaaaaagac acaggtggcg   180
ttaattcaat atgccaacga cccaagagtt gtctttaact tgaccactta caaaaacaaa   240
gaagatatgg ttcaggccac atccgagacg cgccagtatg gtggggacct cacaaacacc   300
ttcaaggcta tccaatttgc aagagacatt gcttatttac cggagtctgg cgggcgccca   360
ggtgctacaa aagtcatggt agttgtgact gatggggaat cccatgatgg gtcgaagctg   420
caaactgtga tccagcaatg caatgatgac gagatactga ggtttggcat agcggttctt   480
ggatatttaa acagaaatgc tcttgatact aaaaatctaa tcaaagaaat taaagcaatc   540
gctagcactc caacggagag gtactttttc aatgtggccg atgaggcggc tcttctggag   600
aaagctggca ctctagggga gcacatattc agcattgaag gcactgttca aggaggagac   660
aacttccaga tggaaatggc a                                             681
<210>114
<211>648
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>misc_feature
<223>小鼠α2结构域I克隆
<400>114
agtccagact ttcagttctt gaccagcttt tcacctgcag ttcaggcttg cccttccctc    60
gtggatgttg tagttgtatg tgatgaatca aacagtattt atccttggga agcagtaaag   120
aactttttgg taaagtttgt gacaggcctg gatataggac ctaaaaagac acaggtggcg   180
ttaattcaat atgccaatga gccgagaatt atatttaact tgaacgattt cgaaaccaaa   240
gaggatatgg tccaggccac atctgagacg cgccaacatg gtggggacct cacaaacacc   300
ttcagagcta tcgaattcgc aagagactac gcttattcac agacttctgg cgggcgcccg   360
ggtgctacaa aagtcatggt agttgtgacc gatggcgagt cccatgatgg gtcgaagctg   420
aaaactgtga tccagcaatg caatgatgac gagatactga ggttcggcat agcagttctt   480
gggtatttaa acagaaatgc tcttgatact aaaaatttaa tcaaagaaat aaaagcaatt   540
gctagtactc caaccgagag atactttttc aatgtggccg acgaagcggc tcttctggag   600
aaggctggaa ctctagggga gcaaatattc agcattgaag gcactgtt                648
<210>115
<211>6
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>基因转录起始的示例性上游序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>n是a，c，g，或t
<400>115
cncaat                                                                6
<210>116
<211>6
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>基因3’端的示例性序列
<400>116
aataaa                                                                6
<210>117
<211>31
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI F
<400>117
ggggatccag tcctgaattt tcagctctca g                                   31
<210>118
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI R
<400>118
gggaattcaa cagtaccttc aatgctg                                        27
<210>119
<211>19
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>人结构域I正向引物
<400>119
ggggatccag tcctgattt                                                 19
<210>120
<211>18
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>人结构域I反向引物
<400>120
ggaattcaac agtacctt                                                  18
<210>121
<211>29
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>mαI F
<400>121
ggggatccag tccagacttt cagttcttg                                      29
<210>122
<211>28
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>mαI R
<400>122
tgggaattca acagtgcctt caatgctg                                       28
<210>123
<211>31
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>rαI F
<400>123
ggggatccag tccagacttt cagtcgttga c                                   31
<210>124
<211>31
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>rαI R
<400>124
tgggaattct gccatttcca tctggaagtt g                                   31
<210>125
<211>34
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI  I21V F
<400>125
cagccctgcc cttccctcgt agatgttgtg gttg                                34
<210>126
<211>34
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI  I21V R
<400>126
caaccacaac atctacgagg gaagggcagg gctg                                34
<210>127
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI E44V F
<400>127
cagtaaagaa ttttttggta aaatttgtca agg                                 33
<210>128
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI E44V R
<400>128
ccttgacaaa ttttaccaaa aaattcttta ctg                                 33
<210>129
<211>35
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Q48T F
<400>129
ttttggaaaa atttgtaaca ggcctggata taggc                               35
<210>130
<211>35
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Q48T R
<400>130
gcctatatcc aggcctgtta caaatttttc cgggg                               35
<210>131
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI N67E F
<400>131
cagtatgcca atgagccaag agttgtgttt aac                                 33
<210>132
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI N67E R
<400>132
gttaaacaca actcttggct cattggcata ctg                                 33
<210>133
<211>34
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI V70I F
<400>133
tgccaataat ccaagaattg tgtttaactt gaac                                34
<210>134
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI V70I R
<400>134
gttcaagtta acacaattct tggattattg gca                                 33
<210>135
<211>34
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI V71I F
<400>135
ccaataatcc aagagttatc tttaacttga acac                                34
<210>136
<211>34
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI V71I R
<400>136
gtgttcaagt taaagataac tcttggatta ttgg                                34
<210>137
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI T76D F
<400>137
gtgtttaact tgaacgacta taaaaccaaa gaa                                 33
<210>138
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>haplhaI T76D R
<400>138
ttctttggtt ttatagtcgt tcaagttaaa cac                                 33
<210>139
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Y77F F
<400>139
tttaacttga acacatttaa aaccaaagaa gaa                                 33
<210>140
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Y77F R
<400>140
ttcttctttg gttttaaatg tgttcaagtt aaa                                 33
<210>141
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI K78E F
<400>141
aacttgaaca catatgaaac caaagaagaa atg                                 33
<210>142
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI K78E R
<400>142
catttcttct ttggtttcat atgtgttcaa gtt                                 33
<210>143
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Y93H F
<400>143
tcccagacat cccaacatgg tggggacctc aca                                 33
<210>144
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Y93H R
<400>144
tgtgaggtcc ccaccatgtt gggatgtctg gga                                 33
<210>145
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Y93F F
<400>145
acatgggaga catcccaatt tggtggggac ctcacaaac                           39
<210>146
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Y93F R
<400>146
gtttgtgagg tccccaccaa attgggatgt ctcccatgt                           39
<210>147
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Q105E F
<400>147
ttcggagcaa ttgaatatgc aagaaaatat gcc                                 33
<210>148
<211>33
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI Q105E R
<400>148
ggcatatttt cttgcatatt caattgctcc gaa                                 33
<210>149
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI A114Q F
<400>149
aaatatgcct attcacaagc ttctggtggg cgacgaagt                           39
<210>150
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI A114Q R
<400>150
acttcgtcgc ccaccagaag cttgtgaata ggcatattt                           39
<210>151
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI A115T F
<400>151
aaatatgcct attcagcaac ttctggtggg cgacgaagt                           39
<210>152
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI A115T R
<400>152
acttcgtcgc ccaccagaag ttgctgaata ggcatattt                           39
<210>153
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI A115Q F
<400>153
aaatatgcct attcagcaca gtctggtggg cgacgaagt                           39
<210>154
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hαI A115Q R
<400>154
acttcgtcgc ccaccagact gtgctgaata ggcatattt                           39
<210>155
<211>39
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
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atgattgtag caacatccca cacatcccaa tatggtggg                           39
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<213>人
<220>
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<223>mαI H93Y R
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gtttgtgagg tccccaccat attggcgcgt ctcagatgtg                          40
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<212>PRT
<213>食蟹猴
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>食蟹猴
<400>171
Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro
1               5                   10                  15
Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser
            20                  25                  30
Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Asp Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln
        35                  40                  45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr
    50                  55                  60
Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys
65                  70                  75                  80
Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp
                85                  90                  95
Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tyr
            100                 105                 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val
        115                 120                 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile
    130                 135                 140
Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu
                165                 170                 175
Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val
            180                 185                 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln
        195                 200                 205
Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val
    210                 215
<210>172
<211>216
<212>PRT
<213>恒河猴
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>恒河猴
<400>172
Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro
1               5                   10                  15
Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser
            20                  25                  30
Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln
        35                  40                  45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr
    50                  55                  60
Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys
65                  70                  75                  80
Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp
                85                  90                  95
Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tyr
            100                 105                 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val
        115                 120                 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile
    130                 135                 140
Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu
                165                 170                 175
Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val
            180                 185                 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln
        195                 200                 205
Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val
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<213>人
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<223>hvH14.0 IgG4重链
<220>
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<222>(22)..(1416)
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                        Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu
                        1               5                   10
ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act gga cag gtg cag ttg cag gag tca      99
Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
                15                  20                  25
ggc cct ggc ctg gtg aag ccc agc gag acc ctg agc ctg acc tgt acc     147
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
            30                  35                  40
gtc tct gga ttt agc tta acc aac tat ggc atc cac tgg ata cgc cag     195
Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln
        45                  50                  55
cct cca ggc aag ggc ctg gag tgg ctg ggc gtg ata tgg gct cgc ggc     243
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly
    60                  65                  70
ttc aca aac tat aac agc gct ctc atg tcc cgc gtg acc atc agc aag     291
Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys
75                  80                  85                  90
gac aac agc aag aac cag gtg agc ctg aag ctg agc agc gtg acc gcc     339
Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
                95                  100                 105
gcg gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc aga gcc aac gac ggg gtc tac     387
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr
            110                 115                 120
tat gcc atg gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc agc tca     435
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        125                 130                 135
gcg tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg     483
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
    140                 145                 150
agc acc tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac     531
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
155                 160                 165                 170
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc     579
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
                175                 180                 185
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc     627
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
            190                 195                 200
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acg aag acc     675
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
        205                 210                 215
tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag     723
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
    220                 225                 230
aga gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca gca cct     771
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
235                 240                 245                 250
gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag     819
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                255                 260                 265
gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg     867
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
            270                 275                 280
gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat     915
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
        285                 290                 295
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc     963
Gly Val Glu Val Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
    300                 305                 310
aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac    1011
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
315                 320                 325                 330
tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc    1059
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
                335                 340                 345
ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga    1107
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
            350                 355                 360
gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag    1155
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
        365                 370                 375
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac    1203
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
    380                 385                 390
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag    1251
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
395                 400                 405                 410
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc    1299
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
                415                 420                 425
agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca    1347
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
            430                 435                 440
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc    1395
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
        445                 450                 455
ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa tgataggatc cgcggccgc                   1435
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    460                 465
<210>174
<211>465
<212>PRT
<213>人
<400>174
Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly
1               5                   10                  15
Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
        35                 40                  45
Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser
65                 70                  75                  80
Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln
                85                  90                  95
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
225                 230                 235                 240
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
                245                 250                 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
            260                 265                 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
        275                 280                 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
    290                 295                 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305                 310                 315                 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                325                 330                 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
            340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    370                 375                 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385                 390                 395                 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
                405                 410                 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
            420                 425                 430
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
        435                 440                 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
    450                 455                 460
Lys
465
<210>175
<211>1435
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>hvH12.0 IgG4重链
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(1416)
<400>175
tctcgagaag cttccaccat g gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg      51
                        Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu
                        1               5                   10
ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act gga cag gtg cag ttg cag gag tca      99
Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
                15                  20                  25
ggc cct ggc ctg gtg aag ccc agc gag acc ctg agc ctg acc tgt acc     147
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
            30                  35                  40
gtc tct gga ttt agc tta acc aac tat ggc atc cac tgg ata cgc cag     195
Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln
        45                  50                  55
cct cca ggc aag ggc ctg gag tgg ctg ggc gtg ata tgg gct cgc ggc     243
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Gllu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly
    60                  65                  70
ttc aca aac tat aac agc gct ctc atg tcc cgc ctg acc atc agc aag     291
Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys
75                  80                  85                  90
gac aac agc aag aac cag gtg agc ctg aag ctg agc agc gtg acc gcc     339
Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
                95                  100                 105
gcg gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc aga gcc aac gac ggg gtc tac     387
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr
            110                 115                 120
tat gcc atg gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc agc tca     435
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        125                 130                 135
gcg tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg     483
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
    140                 145                 150
agc acc tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac     531
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
155                 160                 165                 170
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc     579
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
                175                 180                 185
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc     627
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
            190                 195                 200
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acg aag acc     675
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
        205                 210                 215
tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag     723
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
    220                 225                 230
aga gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca gca cct     771
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
235                 240                 245                 250
gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag     819
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                255                 260                 265
gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg     867
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
            270                 275                 280
gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat     915
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
        285                 290                 295
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc     963
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
    300                 305                 310
aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac    1011
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
315                 320                 325                 330
tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc    1059
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
                335                 340                 345
ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga    1107
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
            350                 355                 360
gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag    1155
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
        365                 370                 375
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac    1203
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
    380                 385                 390
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag    1251
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
395                 400                 405                 410
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc    1299
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
                415                 420                 425
agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca    1347
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
            430                 435                 440
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc    1395
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
        445                 450                 455
ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa tgataggatc cgcggccgc                   1435
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    460                 465
<210>176
<211>465
<212>PRT
<213>人
<400>176
Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly
1               5                   10                  15
Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
        35                  40                  45
Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln
                85                  90                  95
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
225                 230                 235                 240
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
                245                 250                 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
            260                 265                 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
        275                 280                 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
    290                 295                 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305                 310                 315                 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                325                 330                 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
            340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
        355                 360                 365
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    370                 375                 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385                 390                 395                 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
                405                 410                 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
            420                 425                 430
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
        435                 440                 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
    450                 455                 460
Lys
465
<210>177
<211>744
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>VL10.0Q轻链
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(720)
<400>177
ctatctcgag aagcttccac c atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta      51
                        Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val
                        1               5                   10
ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act gga gac ttc gtg atg acc cag      99
Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Phe Val Met Thr Gln
                15                  20                  25
tct cca gca ttc ctg agc gtg acc ccc ggc gag aag gtg acc atc acc     147
Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr
            30                  35                  40
tgc agc gcc caa tca agc gtg aac tac att cac tgg tac cag cag aag     195
Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys
        45                  50                  55
ccc gac cag gcc ccc aag aaa ttg atc tat gac act tcc aag ctg gcc     243
Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
    60                  65                  70
agc ggc gtg ccc agc cgc ttc agc ggc agc ggc agc ggc acc gac tac     291
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
75                  80                  85                  90
acc ttc acc atc agc agc ctg gag gcc gag gac gct gcc acc tat tac     339
Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
                95                  100                 105
tgc cag cag tgg acc act aac cca ctg acc ttc ggc cag ggc acc aag     387
Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
            110                 115                 120
gtc gaa atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg     435
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
        125                 130                 135
cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg     483
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
    140                 145                 150
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat     531
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
155                 160                 165                 170
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac     579
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                175                 180                 185
agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa     627
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
            190                 195                 200
gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag     675
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
        205                 210                 215
ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt         720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    220                 225                 230
tgataggatc cgcggccgca tagg                                          744
<210>178
<211>233
<212>PRT
<213>人
<400>178
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser
        35                  40                  45
Val Asn Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys
    50                  55                  60
Lys Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr
            100                 105                 110
Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
        115                 120                 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
    130                 135                 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
                165                 170                 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
            180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
        195                 200                 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
    210                 215                 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>179
<211>1460
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>h2206-VH14 IgG1重链(DANS)；位置-24至-5是前导序列；位置-4至-1是额外的氨
基酸；DANS在位置-4至-1优选是缺失的
<220>
<221>CDS
<222>(22)..(1440)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(94)..(1440)
<400>179
ataggctagc ctcgagccac c atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta      51
                        Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val
                                            -20             -15
ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act gga gac gcg aat tca cag gtg      99
Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asn Ser Gln Val
                -10                 -5              -1  1
cag ttg cag gag tca ggc cct ggc ctg gtg aag ccc agc gag acc ctg     147
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu
        5                   10                  15
agc ctg acc tgt acc gtc tct gga ttt agc tta acc aac tat ggc atc     195
Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Ile
    20                  25                  30
cac tgg ata cgc cag cct cca ggc aag ggc ctg gag tgg ctg ggc gtg     243
His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val
35                  40                  45                  50
ata tgg gct cgc ggc ttc aca aac tat aac agc gct ctc atg tcc cgc     291
Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg
                55                  60                  65
gtg acc atc agc aag gac aac agc aag aac cag gtg agc ctg aag ctg     339
Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu
            70                  75                  80
agc agc gtg acc  gcc gcg gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc aga gcc    387
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala
        85                  90                  95
aac gac ggg gtc tac tat gcc atg gac tac tgg ggc cag gga acc ctg     435
Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
    100                 105                 110
gtc acc gtc agc tca gcg tcg acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg     483
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125                 130
gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc     531
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
                135                 140                 145
ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tca tgg aac tca     579
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
            150                 155                 160
ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc     627
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
        165                 170                 175
tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc     675
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
    180                 185                 190
ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac     723
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205                 210
acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac     771
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
                215                 220                 225
aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc     819
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
            230                 235                 240
ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc     867
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
        245                 250                 255
cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag     915
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
    260                 265                 270
gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag     963
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285                 290
aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc    1011
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
                295                 300                 305
gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag    1059
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
            310                 315                 320
tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc    1107
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
        325                 330                 335
tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc    1155
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
    340                 345                 350
cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg    1203
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355                 360                 365                 370
gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat    1251
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
                375                 380                 385
ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc    1299
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
            390                 395                 400
gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg    1347
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
        405                 410                 415
tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg    1395
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
    420                 425                 430
cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa        1440
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
tgataagcgg ccgcttccct                                              1460
<210>180
<211>473
<212>PRT
<213>人
<400>180
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
                -20                 -15                 -10
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asn Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
            -5              -1  1               5
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
    10                  15                  20
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro
25                  30                  35                  40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe
                45                  50                  55
Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp
            60                  65                  70
Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
        75                  80                  85
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr
    90                  95                 100
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
105                 110                 115                 120
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
                125                 130                 135
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
            140                 145                 150
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
        155                 160                 165
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
    170                 175                 180
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
185                 190                 195                 200
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
                205                 210                 215
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
            220                 225                 230
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
        235                 240                 245
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
    250                 255                 260
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
265                 270                 275                 280
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
                285                 290                 295
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
            300                 305                 310
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
        315                 320                 325
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
    330                 335                 340
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
345                 350                 355                 360
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
                365                 370                 375
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
            380                 385                 390
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
        395                 400                 405
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
    410                 415                 420
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
425                 430                 435                 440
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                445
<210>181
<211>469
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH14.0 IgG1重链[DANS-缺失的]
<400>181
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                 15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
            20                  25                  30
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
    50                  55                  60
Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>182
<211>469
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>hVH12.0 IgG1重链[DANS-缺失的]
<400>182
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
            20                  25                  30
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
    50                  55                  60
Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>183
<211>24
<212>PRT
<213>人
<400>183
His Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
1               5                   10                  15
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            20
<210>184
<211>19
<212>PRT
<213>人
<400>184
Glu Glu Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
1               5                   10                  15
Glu Ile Lys
<210>185
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化VH区
<220>
<221>变体
<222>(30)..(30)
<223>Xaa在位置30可以是Thr或Ile
<220>
<221>变体
<222>(31)..(31)
<223>Xaa在位置31可以是Asn或Ser
<220>
<221>变体
<222>(37)..(37)
<223>Xaa在位置37可以是Val或Ile
<220>
<221>变体
<222>(48)..(48)
<223>Xaa在位置48可以是Leu或Ile
<220>
<221>变体
<222>(67)..(67)
<223>Xaa在位置67可以是Val或Leu
<220>
<221>变体
<222>(71)..(71)
<223>Xaa在位置71可以是Lys或Val
<220>
<221>变体
<222>(73)..(73)
<223>Xaa在位置73可以是Asn或Thr
<220>
<221>变体
<222>(78)..(78)
<223>Xaa在位置78可以是Val或Phe
<220>
<221>变体
<222>(94)..(94)
<223>Xaa在位置94可以是Phe或Tyr
<400>185
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Xaa Xaa Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Xaa Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Xaa Ser Lys Asn Gln Xaa Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>186
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化VL区
<220>
<221>变体
<222>(1)..(1)
<223>Xaa在位置1可以是Gln或Asp
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
<223>Xaa在位置2可以是Phe或Val
<220>
<221>变体
<222>(4)..(4)
<223>Xaa在位置4可以是Leu或Met
<220>
<221>变体
<222>(45)..(45)
<223>Xaa在位置48可以是Lys或Leu
<220>
<221>变体
<222>(46)..(46)
<223>Xaa在位置46可以是Trp或Leu
<220>
<221>变体
<222>(48)..(48)
<223>Xaa在位置48可以是Tyr或Lys
<220>
<221>变体
<222>(70)..(70)
<223>Xaa在位置70可以是Tyr或Phe
<400>186
Xaa Xaa Val Xaa Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Xaa Xaa Ile Xaa
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105

Claims (106)

1、人源化抗α2整联蛋白抗体，包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列(a)HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQ ID NO：2)，(b)HCDR1(GFSLTNYGIH，SEQ ID NO：1)、HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQ ID NO：2)和HCDR3(ANDGVYYAMDY，SEQ ID NO：3)，或(c)SEQ ID NO：40。
2、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：185。
3、如权利要求2所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：185，其中(a)位置71是赖氨酸，(b)位置73是天冬酰胺，(c)位置78是缬氨酸，或(d)(a)-(c)的任何一种组合。
4、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO：70-79和SEQ ID NO：109-111的氨基酸序列。
5、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其还包含含有氨基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：13)的FW4区。
6、如权利要求5所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其包含氨基酸序列HCDR1(SEQ ID NO：1)、HCDR2(SEQ ID NO：2)和HCDR3(SEQ IDNO：3)。
7、如权利要求1-6中任意一项所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其还包含轻链。
8、人源化抗α2整联蛋白抗体，包含轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列(a)LCDR1，选自SANSSVNYIH(SEQ ID NO：4)或SAQSSWNYIH(SEQ ID NO：112)，(b)LCDR2(DTSKLAS；SEQ ID NO：5)和(c)LCDR3(QQWTTNPLT，SEQ ID NO：6)。
9、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：186。
10、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：186，其中(a)位置2是苯丙氨酸，(b)位置45是赖氨酸，(c)位置48是酪氨酸，或(d)(a)-(c)的任何一种组合。
11、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中轻链可变区包含选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：80-92和SEQ ID NO：108的氨基酸序列。
12、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其还包含含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列FGQGTKVEIK的FW4区。
13、如权利要求12所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其包含氨基酸序列LCDR1(SEQ ID NO：4)、LCDR2(SEQ ID NO：5)和LCDR3(SEQ IDNO：6)。
14、如权利要求8-13中任意一项所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其还包含重链。
15、人源化抗α2整联蛋白抗体，包含：
(i)重链可变区，其包含氨基酸序列(a)HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQ ID NO：2)，(b)HCDR1(GFSLTNYGIH，SEQ ID NO：1)、HCDR2(VIWARGFTNYNSALMS，SEQ ID NO：2)和HCDR3(ANDGVYYAMDY，SEQ ID NO：3)，或(c)SEQ ID NO：40；和
(ii)轻链可变区，其包含氨基酸序列(a)LCDR1，选自SANSSVNYIH(SEQ ID NO：4)或SAQSSWNYIH(SEQ ID NO：112)，(b)LCDR2(DTSKLAS；SEQ ID NO：5)和(c)LCDR3(QQWTTNPLT，SEQID NO：6)。
16、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中(a)重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：185，(b)轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：186，或(c)(a)和(b)二者。
17、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中(i)重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：185，其中(a)位置71是赖氨酸，(b)位置73是天冬酰胺，(c)位置78是缬氨酸，或(d)(a)-(c)的任何一种组合；(ii)轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：186，其中(a)位置2是苯丙氨酸，(b)位置45是赖氨酸，(c)位置48是酪氨酸，或(d)(a)-(c)的任何一种组合；或(iii)(i)和(ii)二者。
18、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中(a)重链可变区包含选自SEQ ID NO：70-79和SEQ ID NO：109-111的氨基酸序列；(b)轻链可变区包含选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：80-92和SEQ IDNO：108的氨基酸序列；或(c)(a)和(b)二者。
19、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体识别人α2整联蛋白的结构域I。
20、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体识别人α2整联蛋白的结构域I。
21、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体识别人α2整联蛋白的结构域I。
22、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体结合α2β1整联蛋白。
23、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体结合α2β1整联蛋白。
24、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体结合α2β1整联蛋白。
25、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体结合α2整联蛋白的表位，所述表位包含：
(a)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置192或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置40的赖氨酸残基；
(b)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置225或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置73的天冬酰胺残基；
(c)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置241或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置89的谷氨酰胺残基；
(d)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置245或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置93的酪氨酸残基；
(e)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置317或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置165的精氨酸残基；
(f)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置318或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置166的天冬酰胺残基；或
(g)(a)至(f)的任何一种组合。
26、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体结合α2整联蛋白的表位，所述表位包含：
(a)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置192或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置40的赖氨酸残基；
(b)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置225或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置73的天冬酰胺残基；
(c)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置241或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置89的谷氨酰胺残基；
(d)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置245或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置93的酪氨酸残基；
(e)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置317或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置165的精氨酸残基；
(f)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置318或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置166的天冬酰胺残基；或
(g)(a)至(f)的任何一种组合。
27、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体结合α2整联蛋白的表位，所述表位包含：
(a)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置192或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置40的赖氨酸残基；
(b)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置225或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置73的天冬酰胺残基；
(c)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置241或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置89的谷氨酰胺残基；
(d)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置245或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置93的酪氨酸残基；
(e)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置317或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置165的精氨酸残基；
(f)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置318或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置166的天冬酰胺残基；或
(g)(a)至(f)的任何一种组合。
28、人源化抗α2整联蛋白抗体，其中抗体结合α2整联蛋白的表位，所述表位包含：
(a)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置192或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置40的赖氨酸残基；
(b)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置225或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置73的天冬酰胺残基；
(c)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置241或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置89的谷氨酰胺残基；
(d)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置245或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置93的酪氨酸残基；
(e)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置317或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置165的精氨酸残基；
(f)对应于SEQ ID NO：8所示α2整联蛋白氨基酸序列位置318或SEQ ID NO：11所示α2整联蛋白结构域I氨基酸序列位置166的天冬酰胺残基；或
(g)(a)至(f)的任何一种组合。
29、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体是全长抗体。
30、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体是全长抗体。
31、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体是全长抗体。
32、如权利要求28所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体是全长抗体。
33、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体是抗体片段。
34、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体是抗体片段。
35、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体是抗体片段。
36、如权利要求28所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体是抗体片段。
37、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体结合至可检测标记物。
38、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体结合至可检测标记物。
39、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体结合至可检测标记物。
40、如权利要求28所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体结合至可检测标记物。
41、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体固定在固相上。
42、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体固定在固相上。
43、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体固定在固相上。
44、如权利要求28所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，所述抗体固定在固相上。
45、如权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中所述抗体抑制α2或α2β1整联蛋白结合至α2β1整联蛋白配体。
46、如权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中所述抗体抑制α2或α2β1整联蛋白结合至α2β1整联蛋白配体。
47、如权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中所述抗体抑制α2或α2β1整联蛋白结合至α2β1整联蛋白配体。
48、如权利要求28所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中所述抗体抑制α2或α2β1整联蛋白结合至α2β1整联蛋白配体。
49、如权利要求45所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中α2β1整联蛋白配体选自：胶原蛋白、层粘连蛋白、艾柯病毒-1、饰胶蛋白聚糖、E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶I(MMP-I)、endorepellin、胶原凝素和C1q补体蛋白。
50、如权利要求46所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中α2β1整联蛋白配体选自：胶原蛋白、层粘连蛋白、艾柯病毒-1、饰胶蛋白聚糖、E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶I(MMP-I)、endorepellin、胶原凝素和C1q补体蛋白。
51、如权利要求47所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中α2β1整联蛋白配体选自：胶原蛋白、层粘连蛋白、艾柯病毒-1、饰胶蛋白聚糖、E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶I(MMP-I)、endorepellin、胶原凝素和C1q补体蛋白。
52、如权利要求48所述的人源化抗α2整联蛋白抗体，其中α2β1整联蛋白配体选自：胶原蛋白、层粘连蛋白、艾柯病毒-1、饰胶蛋白聚糖、E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶I(MMP-I)、endorepellin、胶原凝素和C1q补体蛋白。
53、确定样品是否含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白或二者的方法，所述方法包括将样品与权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体接触和确定抗体是否与样品结合，所述结合表明该样品含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白、或含有二者。
54、确定样品是否含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白或二者的方法，所述方法包括将样品与权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体接触和确定抗体是否与样品结合，所述结合表明该样品含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白、或含有二者。
55、确定样品是否含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白或二者的方法，所述方法包括将样品与权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体接触和确定抗体是否与样品结合，所述结合表明该样品含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白、或含有二者。
56、确定样品是否含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白或二者的方法，所述方法包括将样品与权利要求28所述的人源化抗α2整联蛋白抗体接触和确定抗体是否与样品结合，所述结合表明该样品含有α2整联蛋白、α2β1整联蛋白、或含有二者。
57、一种试剂盒，包含权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和用此抗体检测α2或α2β1整联蛋白的使用说明书。
58、一种试剂盒，包含权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和用此抗体检测α2或α2β1整联蛋白的使用说明书。
59、一种试剂盒，包含权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和用此抗体检测α2或α2β1整联蛋白的使用说明书。
60、一种试剂盒，包含权利要求28所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和用此抗体检测α2或α2β1整联蛋白的使用说明书。
61、编码权利要求1所述人源化抗α2β1整联蛋白抗体的分离的核酸。
62、编码权利要求8所述人源化抗α2β1整联蛋白抗体的分离的核酸。
63、包含权利要求61所述核酸的载体。
64、包含权利要求62所述核酸的载体。
65、宿主细胞，其包含：
(a)权利要求61所述的核酸；
(b)权利要求62所述的核酸；
(c)权利要求63所述的载体；
(d)权利要求64所述的载体；或
(e)(a)到(d)的任何组合。
66、产生人源化抗α2整联蛋白抗体的方法，所述方法包括在允许所述抗体表达的条件下培养权利要求65所述的宿主细胞。
67、如权利要求66所述的方法，其还包括从宿主细胞回收人源化抗α2整联蛋白抗体。
68、如权利要求67所述的方法，其中所述人源化抗α2β1整联蛋白抗体是从宿主细胞培养基中回收的。
69、一种筛选方法，包括：
(a)在存在与不存在受试抗体时，检测α2或α2β1整联蛋白与包含SEQID NO：19所示VL区和SEQ ID NO：21所示VH区的抗体的结合；和
(b)如果受试抗体的存在与α2或α2β1整联蛋白和包含SEQ ID NO：19所示VL区及SEQ ID NO：21所示VH区的抗体的结合降低相关，则选择所述受试抗体。
70、如权利要求69所述的方法，其中所述α2或α2β1整联蛋白被固定在固相支持物上。
71、一种筛选方法，包括：
(a)在受试抗体存在下检测α2β1整联蛋白与胶原蛋白的结合，其中受试抗体指结合α2结构域I的抗体；
(b)在Mg++离子存在下检测受试抗体与α2结构域I的结合；
(c)在Ca++离子存在下检测受试抗体与α2结构域I的结合；
(d)在无阳离子的培养基存在下检测受试抗体与α2结构域I的结合；和
(e)如果受试抗体抑制α2β1整联蛋白与胶原蛋白结合并在Mg++离子和Ca++离子及无阳离子的培养基存在下结合至α2结构域I，则选择所述受试抗体。
72、一种组合物，包含权利要求1所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和可药用载体。
73、一种组合物，包含权利要求8所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和可药用载体。
74、一种组合物，包含权利要求15所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和可药用载体。
75、一种组合物，包含权利要求28所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和可药用载体。
76、治疗受试者α2β1整联蛋白相关疾病的方法，所述方法包括施与受试者治疗有效量的权利要求1-52中任意一项所述的抗α2整联蛋白抗体或权利要求72-75中任意一项所述的组合物。
77、抑制白细胞与胶原蛋白结合的方法，包括施与受试者抑制白细胞与胶原蛋白结合有效量的权利要求28所述的抗α2β1整联蛋白抗体。
78、如权利要求76所述的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自：炎性疾病、自身免疫疾病和以异常或增加的血管发生为特征的疾病。
79、如权利要求76所述的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自：炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓损伤、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化症、雷纳德综合征、实验性自身免疫脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、幼年型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、心血管疾病、牛皮癣、癌症以及诱发炎性反应的感染。
80、如权利要求76所述的方法，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自：多发性硬化症、类风湿关节炎、视神经炎和脊髓损伤。
81、如权利要求76所述的方法，其中所述方法不伴有(a)血小板活化，(b)血小板凝聚，(c)循环血小板数量减少，(d)出血并发症，或(e)(a)至(d)的任何一种组合。
82、如权利要求76所述的方法，其中所述抗α2整联蛋白抗体包含含有SEQ ID NO：174或SEQ ID NO：176所示的重链和含有SEQ ID NO：178所示的轻链。
83、如权利要求76所述的方法，其中所述抗α2整联蛋白抗体竞争性抑制包含SEQ ID NO：19的VL区和SEQ ID NO：21的VH区的抗体与人α2β1整联蛋白或其结构域I结合。
84、如权利要求80所述的方法，其中多发性硬化症以复发为特征。
85、如权利要求80所述的方法，其中所述方法伴有与多发性硬化症相关的潮红或神经病学后遗症的缓解。
86、如权利要求76所述的方法，其中所述抗α2整联蛋白抗体抑制α2β1整联蛋白与胶原蛋白的结合，而且不是配体模拟物。
87、将分子、组合物或复合体靶向以存在α2β1整联蛋白配体为特征的部位的方法，所述方法包括将所述分子、组合物或复合体附着或结合至权利要求1所述人源化抗α2整联蛋白抗体。
88、将分子、组合物或复合体靶向以存在α2β1整联蛋白配体为特征的部位的方法，所述方法包括将所述分子、组合物或复合体附着或结合至权利要求8所述人源化抗α2整联蛋白抗体。
89、将分子、组合物或复合体靶向以存在α2β1整联蛋白配体为特征的部位的方法，所述方法包括将所述分子、组合物或复合体附着或结合至权利要求15所述人源化抗α2整联蛋白抗体。
90、将分子、组合物或复合体靶向以存在α2β1整联蛋白配体为特征的部位的方法，所述方法包括将所述分子、组合物或复合体附着或结合至权利要求28所述人源化抗α2整联蛋白抗体。
91、权利要求1-52中任意一项所述的人源化抗α2整联蛋白抗体作为药物的用途。
92、权利要求1-52中任意一项所述的人源化抗α2整联蛋白抗体或权利要求44所述的组合物用于治疗α2β1整联蛋白相关疾病的用途。
93、权利要求1-52中任意一项所述的人源化抗α2整联蛋白抗体在制备治疗α2β1整联蛋白相关疾病的药物中的用途。
94、如权利要求91-93中任意一项所述的用途，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自炎性疾病、自身免疫疾病和以不适当的血管发生为特征的疾病。
95、如权利要求91-93中任意一项所述的用途，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓损伤、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化症、雷纳德综合征、实验性自身免疫脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、幼年型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、心血管疾病、牛皮癣、癌症以及诱发炎性反应的感染。
96、如权利要求91-93中任意一项所述的用途，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自多发性硬化症、类风湿关节炎、视神经炎和脊髓损伤。
97、治疗α2β1整联蛋白相关疾病的组合物，所述组合物包含权利要求1-52中任意一项所述的人源化抗α2整联蛋白抗体和可药用载体或稀释剂。
98、如权利要求97所述的组合物，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自炎性疾病、自身免疫疾病和以不适当的血管发生为特征的疾病。
99、如权利要求97所述的组合物，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓损伤、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化症、雷纳德综合征、实验性自身免疫脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、幼年型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、心血管疾病、牛皮癣、癌症以及诱发炎性反应的感染。
100、如权利要求97所述的组合物，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自多发性硬化症、类风湿关节炎、视神经炎和脊髓损伤。
101、包装体，包含权利要求1-52中任意一项所述的人源化抗α2整联蛋白抗体或权利要求72-75中任意一项所述的组合物，以及治疗α2β1整联蛋白相关疾病的使用说明书。
102、如权利要求101所述的包装体，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自炎性疾病、自身免疫疾病和以不适当的血管发生为特征的疾病。
103、如权利要求101所述的包装体，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自炎性肠病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓损伤、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化症、雷纳德综合征、实验性自身免疫脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、幼年型糖尿病、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、心血管疾病、牛皮癣、癌症以及诱发炎性反应的感染。
104、如权利要求101所述的包装体，其中所述α2β1整联蛋白相关疾病选自多发性硬化症、类风湿关节炎、视神经炎和脊髓损伤。
105、结合抗α2整联蛋白抗体的α2整联蛋白表位，其中所述表位不包含α2整联蛋白的配体结合位点。
106、如权利要求105所述的表位，其中与所述表位的结合不伴有(a)血小板活化，(b)血小板凝聚，(c)循环血小板数量减少，(d)出血并发症，(e)α2整联蛋白活化，或(f)(a)至(e)的任何一种组合。
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