CN101401940A - 白蛋白基聚丙烯酸纳米载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种白蛋白基聚丙烯酸纳米载体的制备方法，其以亲水性强、生物相容性好的生物大分子牛血清白蛋白作为模板，利用丙烯酸在白蛋白溶液中自组装并进一步原位聚合的方法成功制得了纳米级牛血清白蛋白基聚丙烯酸纳米微球及纳米囊。通过纳米粒径仪(DLS)、红外吸收光谱(FT－IR)、紫外－可见光谱及透射电镜(TEM)对制得的纳米微球与纳米囊结构及形貌进行了表征，发现纳米微球粒径为80～100nm，纳米囊外径为300～400nm，内径为100～200nm左右。纳米微球与纳米囊表面带正电荷，具有pH敏感性，对药物阿霉素的可控释放性长达150h，用于毒副作用大、稳定性差的药物载体，可实现这类药物的控制释放，使药物具有靶向性，提高药物疗效，降低毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种药物载体的制备，尤其涉及一种牛血清白蛋白基聚丙烯酸纳米微球及纳米囊药物载体及其制备方法。主要用于毒副作用大、稳定性差的药物载体，实现这类药物的控制释放，使药物具有靶向性，提高药物疗效，降低毒副作用。
背景技术
白蛋白是由近600个氨基酸单元组成的生物高分子，氨基酸之间都以肽链相连，并且扭曲成蚯蚓状或蜂窝状，具有无数的网状空隙，为镶嵌携带药物创造了有利空间条件。白蛋白具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点，因此白蛋白是一种多功能蛋白质，它有许多重要的生理学和药理学功能，能与许多内源和外源性物质如脂肪酸、氨基酸、荷尔蒙、阴阳离子和药物等结合，也能与一些功能性化合物结合。因此，白蛋白被广泛用于制备载药微球，而白蛋白纳米微球及纳米囊载体系统以其独特的靶向性、缓控释特性和保护药物作用，再加上白蛋白本身的良好生物学特性，应用前景非常广阔。
中国专利CN 1144714A公开了一种可生物降解的核壳结构的生物高分子微球的方法，其首先在水/油体系中制备白蛋白微球，粒径＜3μm，然后在油/水体系中制备以白蛋白微球为核，合成高分子为壳的生物高分子微球，粒径＜5μm。该法制备过程较为繁琐，且在制备过程中用到甲苯/氯仿等有毒有机溶剂，明显存在溶剂残留等诸多问题。2004年王恺利用超声乳化-化学交联方法制备了白蛋白纳米球，在制备过程中利用戊二醛甲苯溶液对白蛋白微球进行固化，也存在溶剂残留问题，且用超声乳化法虽可得到尺寸较为均一的纳米乳滴，但由于纳米乳滴的比表面积大，乳滴之间容易合并，所以交联过程中容易发生乳滴之间的交联，形成大微球甚至聚集体，对阿霉素的释放时间也比较短。2005年林本兰利用乳化高温固化法制备了磁性纳米粒阿霉素白蛋白微球，同样存在相同的问题。用两步法低温喷雾提取法虽然制备工艺简单，但仪器复杂，成本昂贵，不利于推广。2006年孟祥利用喷雾干燥法制备了茶多酚磁性白蛋白微球，不仅微球粒径大(30μm)，制备过程复杂，不易操作；而且喷雾干燥法制备纳米囊普遍存在仪器设备投资大，蛋白质药物在均匀分散到高分子材料有机溶液前需雾化冻干成粉末，以减小蛋白质颗粒的大小；制备过程中有可能造成微球粘连。因此，传统方法制备的纳米微球存在着生物相容性及生物降解性差等问题，而且制备过程繁琐，制备中要加入有机溶剂，还存在溶剂残留等问题。
传统的制备空心微囊和纳米囊结构的方法是通过界面聚合或从聚合物混合溶液中析相来制备，但普遍存在如多分散性、壳表面粗糙、核凝固等许多问题，并且制备条件苛刻，仅在特殊条件下才能制成大小、形态均一的空心微囊和纳米囊结构；此外，微囊和纳米囊壁厚的控制也非常困难，大多数情况下微囊和纳米囊的坚固性差，生物侵蚀会造成壳完整性的损坏，这些都限制了空心聚合物微囊和纳米囊的应用。近年来，国内外研究者进行了大量工作，以获得更好的制备空心聚合物微囊和纳米囊的方法，其中模板法受到了普遍关注。此法是在预先制备好的模板颗粒上形成聚合物壳，然后再将模板去除，留下空心聚合物微囊和纳米囊结构。2007陶彩虹利用两种不同大小的二氧化硅颗粒(微米级和亚微米级)作为模板，使蛋白质在其表面沉积，然后通过交联剂戊二醛交联使蛋白质固定在颗粒表面，最后除去二氧化硅模板得到微米级和亚微米级两种蛋白质中空微胶囊。此种方法虽然存在诸多优点，但制备过程中还要考虑很多因素，如只有采用单分散性好的颗粒作为模板，才能制成大小、形状均一的空心微囊和纳米囊。制备完毕还要将颗粒模板去除才能形成中空微胶囊。而且空心聚合物微囊和纳米囊的主要应用领域是医学和生物学，而迄今所制得的空心聚合物微囊和纳米囊材料的生物相容性和生物降解性都较差。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术制备纳米微球及纳米囊存在的工艺复杂、对设备要求高、使用有机溶剂、生物相容性及生物降解性差等方面的缺点，提供一种简便有效的白蛋白基聚丙烯酸纳米载体的制备方法。
一、白蛋白基聚丙烯酸纳米载体的制备
本发明白蛋白基聚丙烯酸纳米载体的制备方法，由以下工艺步骤完成：
①将牛血清白蛋白固体配成浓度为0.001～0.01mg/mL的白蛋白水溶液；
②将丙烯酸用减压蒸馏方法提纯；
③将提纯的丙烯酸加入到上述配制的白蛋白溶液中机械搅拌5～20min，使丙烯酸充分分散于白蛋白溶液中；丙烯酸与牛血清白蛋白的质量比为4∶1～30∶1；
④将所得混合溶液在氮气保护下搅拌2～3min后升温至35～85℃，加入丙烯酸质量1～5％的过硫酸钾(K2S2O8)作为引发剂和丙烯酸质量0.5～2％的N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)作为加速剂，机械搅拌下反应4～10小时；
⑤反应液冷却至室温后过滤，所得滤液在室温下渗析30～50小时以除去引发剂及未反应的丙烯酸及游离的丙烯酸低聚体，得白蛋白基聚丙烯酸纳米微球。
将上述步骤⑤渗析后的溶液在室温下静置5～10天，纳米微球经进一步的溶胀及自组装作用形成纳米囊。
二、白蛋白基聚丙烯酸纳米微球及纳米囊的表征
分别采用红外光谱，Malvern DTS 1060光散射仪，透射电子显微镜，对本发明制备的纳米微球及纳米囊的结构、粒径、电位、形貌及可控释放进行表征，并用紫外-可见光谱对纳米囊对药物的可控释放性进行测试。
1、红外光谱分析
分别测试了白蛋白基聚丙烯酸及原料的红外光谱，结果表明，1710cm-1为聚丙烯酸羧基的羰基伸缩振动峰；1653cm-1为牛血清白蛋白酰胺I带(C＝O和C-N的伸缩振动吸收峰)，1537cm-1为酰胺II带(-NH的弯曲振动峰)；在白蛋白基聚丙烯酸微球中，C＝O和C-N的伸缩振动吸收峰移至1651cm-1，这是由于羰基和其它键形成络合，使羰基的双键特性降低，吸收向低波数移动；说明牛血清白蛋白和聚丙烯酸之间发生了络合作用。证明核壳微球是通过络合诱导自组装而形成的。
2、粒径和电位分析
经过粒径电位测试发现，随反应的进行纳米微球粒径和电位不断增大，反应刚开始时测得粒径为5nm左右，此时粒径分布显示为多峰，纳米微球的多分散性(PDI)高达0.5左右。引发聚合反应一段时间后，微球粒径发生了明显增大，达到50.6nm；随反应的进行，微球粒径进一步增大，当反应结束时，微球尺寸增大到80nm左右。此外，在反应后期，反应溶液中微球的PDI值已下降到了0.1左右。这说明在反应初始阶段，只有少部分丙烯酸与白蛋白发生氢键及静电吸引作用，流体力学直径较小和粒径分布较广。随聚合反应的进行，一部分丙烯酸转化为聚丙烯酸链后，通过自组装及氢键静电吸引作用缠绕在白蛋白分子上，一部分聚丙烯酸链则通过以上作用将白蛋白/聚丙烯酸连接形成类似半互穿网络结构的络合物。所以随反应的进行，微球的粒径不断增大。
同时在这一聚合反应过程中体系的ξ电位变化趋势和粒径变化趋势有一定的相似性。在反应的初期体系的ξ电位为17.16mv左右，随聚合反应的进行，粒子的ξ电位逐渐增大，至反应结束ξ电位增大到在29.12mv左右。
3、透射电镜分析
通过透射电镜观察发现白蛋白基聚丙烯酸纳米微球的粒径为80～100nm，且粒径分布均匀；经溶胀后形成的纳米囊的外径为300～400nm，内部空腔直径为100～200nm纳米。
三、纳米载体的pH敏感性与对药物的可控释放性
1、纳米微球的pH敏感性
对白蛋白基聚丙烯酸纳米微球在不同pH溶液中的粒径(Dh)及电位变化进行了研究，发现白蛋白基聚丙烯酸纳米微球对pH具有敏感性。当pH从3.0降到1.5时，粒子的粒径从最初的70nm左右增大到100nm左右；当pH从3.0升到5.9时，粒径从最初的70nm左右增大到180nm左右。同时随着pH的增大，微球的电位在pH＝1.5～2.7时呈上升趋势，在pH＝2.7～5.9时呈下降趋势。这主要是由于当pH从3.0降到1.5时，PAA的离子化程度下降导致白蛋白/聚丙烯酸纳米微球中-COO-与-NH3 +之间强烈的静电吸引作用被-COOH与-CONH-之间较弱的氢键作用取代，造成微球粒径增大，相对应的微球电位也随之下降。而当pH从3.0升到5.9时位于核中的PAA中的部分-COOH处于质子化态，随pH的增大质子化程度下降，链-链间电离出的-COO-静电排斥增大，导致粒子发生膨胀粒径增大，此时增大的程度较大。同时由于BSA位于粒子的壳层，当pH＜4.6时在BSA的等电点以下，而且大部分羧基以质子化形式存在，所以粒子带正电荷，当pH＞4.6时在BSA的等电点以上，同时PAA电离出大量-COO-使粒子带负电荷。在实验过程中还发现，当白蛋白/聚丙烯酸溶液的pH值在4.6左右时，白蛋白/聚丙烯酸粒子就发生团聚现象从溶液中沉降下来。这是因为pH在4.6左右时接近BSA的等电点(pI＝4.7)此时由于粒子表面的电位几乎为零，白蛋白/聚丙烯酸粒子之间的静电斥力减弱导致粒子发生团聚。同时对发生团聚溶液的上清液进行紫外测试，发现白蛋白的浓度为10mmol/L，明显低于最初的白蛋白浓度150mmol/L。
2、对药物的可控释放性
通过白蛋白基聚丙烯酸纳米囊对抗癌药物阿霉素包封率及释放性的测试，发现纳米囊对阿霉素的包封率达90％以上，且对阿霉素具有很好的可控释放性，释放时间长达150小时，而且在不同pH值的释放液中，纳米囊对阿霉素的释放速率不同，在酸性释放液中释放速率明显大于弱碱性释放液中的释放速率。说明可以通过调节溶液pH值控制纳米囊对药物的释放速率。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明首次选用了亲水性强，生物相容性好的生物大分子牛血清白蛋白作为模板，利用丙烯酸在白蛋白溶液中自组装并进一步原位聚合的方法成功制得了纳米级牛血清白蛋白基聚丙烯酸纳米微球及纳米囊，为白蛋白纳米载体的制备开辟了新途径，对医药领域及生物大分子领域的发展起到重要的作用。
2、本发明制备工艺简单，制备过程中不使用任何有机溶剂，环保、安全。
3、本发明制得的纳米微球及纳米囊粒径较小，粒径分布均匀；纳米囊既具有pH敏感性，而且对抗癌药物阿霉素的包封率高，达90％以上，对抗癌药物阿霉素的可控释放时间长，释放时间在150h以上。
4、本发明制备的白蛋白纳米载体可广泛用于毒副作用大、稳定性差的药物载体，实现这类药物的控制释放，使药物具有靶向性，提高药物疗效，降低毒副作用。
附图说明
图1为本发明制备白蛋白基聚丙烯酸纳米载体的工艺流程图
图2为本发明制备的白蛋白基聚丙烯酸纳米微球的透射电镜图
图3为本发明制备的白蛋白基聚丙烯酸纳米微球的红外光谱图
图4为本发明制备的白蛋白基聚丙烯酸纳米微球的纳米微球的pH敏感性
图5为本发明制备的白蛋白基聚丙烯酸纳米微球对抗癌药物阿霉素包封率及释放性的测试
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：(a)称取一定量牛血清白蛋白固体，配成浓度为0.005mg/mL的白蛋白溶液；(b)将丙烯酸用减压蒸馏方法提纯；(c)取上述配制的白蛋白溶液10mL于50mL三颈烧瓶中，加入提纯的丙烯酸0.2mg，机械搅拌5min使丙烯酸充分分散于白蛋白溶液中；(d)将混合溶液在氮气保护下搅拌10min后升温至80℃，加入0.006mg K2S2O8作为引发剂、0.004mg TEMED作为加速剂，机械搅拌下反应4小时；(f)反应结束后溶液冷却至室温，过滤，滤液在室温下渗析45小时以除去引发剂及未反应的丙烯酸及游离的丙烯酸低聚体，得白蛋白/聚丙烯酸纳米微球；(e)将渗析后的溶液在室温下静置15天，纳米微球经进一步溶胀及自组装作用形成纳米囊。
制备的纳米微球粒径为110～150nm。纳米微球与形成的纳米囊表面带正电荷，具有pH敏感性，对药物阿霉素的可控释放性长达90h。
实施例2：(a)称取一定量牛血清白蛋白固体，配成浓度为0.005mg/mL的白蛋白溶液；(b)将丙烯酸用减压蒸馏方法提纯；(c)取上述配制的白蛋白溶液10mL于50mL三颈烧瓶中，加入提纯的丙烯酸1.0mg，机械搅拌10min使丙烯酸充分分散于白蛋白溶液中；(d)将混合溶液在氮气保护下搅拌10min后升温至80℃，加入0.03mg K2S2O8、0.02g TEMED作为引发剂，机械搅拌下反应4小时；(f)反应结束后溶液冷却至室温，过滤，滤液在室温下渗析45小时以除去引发剂及未反应的丙烯酸及游离的丙烯酸低聚体，得白蛋白/聚丙烯酸纳米微球；(e)将渗析后的溶液在室温下静置15天，纳米微球经进一步溶胀及自组装作用形成纳米囊。
制备的纳米微球的粒径为100～120nm。纳米微球与形成的纳米囊表面带正电荷，具有pH敏感性，对药物阿霉素的可控释放性长达100h。
实施例3：(a)称取一定量牛血清白蛋白固体，配成浓度为0.005mg/mL的白蛋白溶液；(b)将丙烯酸用减压蒸馏方法提纯；(c)取上述配制的白蛋白溶液10mL于50mL三颈烧瓶中，加入提纯的丙烯酸1.0mg，机械搅拌10min使丙烯酸充分分散于白蛋白溶液中；(d)将混合溶液在氮气保护下搅拌10min后升温至65℃，加入0.03mg K2S2O8，0.02mg TEMED作为引发剂，机械搅拌下反应4小时；(f)反应结束后溶液冷却至室温、过滤，滤液在室温下渗析45小时以除去引发剂及未反应的丙烯酸及游离的丙烯酸低聚体，得白蛋白/聚丙烯酸纳米微球；(e)将渗析后的溶液在室温下静置15天，纳米微球经进一步溶胀及自组装作用形成纳米囊。
制备的纳米微球的粒径为90～120nm。纳米微球与形成的纳米囊表面带正电荷，具有pH敏感性，对药物阿霉素的可控释放性长达100h。
实施例4：(a)称取一定量牛血清白蛋白固体，配成浓度为0.005mg/mL的白蛋白溶液；(b)将丙烯酸用减压蒸馏方法提纯；(c)取上述配制的白蛋白溶液10mL，加入提纯的丙烯酸1.0mg，机械搅拌10min使丙烯酸充分分散于白蛋白溶液中；(d)将混合溶液在氮气保护下搅拌10min后升温至65℃，加入0.03mg K2S2O8、0.02mg TEMED作引发剂，在机械搅拌下反应8小时；(f)待反应结束后将溶液冷却至室温，过滤，滤液在室温下渗析45小时以除去引发剂及未反应的丙烯酸及游离的丙烯酸低聚体，得白蛋白/聚丙烯酸纳米微球；(e)将渗析后的溶液在室温下静置15天，纳米微球经进一步溶胀及自组装作用形成纳米囊。
制备的纳米微球的粒径为80～100nm。纳米微球与形成的纳米囊表面带正电荷，具有pH敏感性，对药物阿霉素的可控释放性长达150h。
Claims (4)
1、一种白蛋白基聚丙烯酸纳米载体的制备方法，是由以下工艺步骤完成：
①将牛血清白蛋白固体配成浓度为0.001～0.01mg/mL的白蛋白水溶液；
②将丙烯酸用减压蒸馏方法提纯；
③将提纯的丙烯酸加入到上述配制的白蛋白溶液中机械搅拌，使丙烯酸充分分散于白蛋白溶液中；丙烯酸与牛血清白蛋白的质量比为4∶1～30∶1；
④将所得混合溶液在氮气保护下搅拌2～3min后升温至35～85℃，加入丙烯酸质量1～5％的过硫酸钾作为引发剂，机械搅拌下反应4～10小时；
⑤反应液冷却至室温后过滤，所得滤液在室温下渗析30～50小时以除去引发剂及未反应的丙烯酸及游离的丙烯酸低聚体，得白蛋白基聚丙烯酸纳米微球。
2、如权利要求1所述白蛋白基聚丙烯酸纳米载体的制备方法，其特征在于：所述步骤④中还加入丙烯酸质量0.5～2％的N，N，N′，N′-四甲基乙二胺作为加速剂。
3、如权利要求1所述白蛋白基聚丙烯酸纳米载体的制备方法，其特征在于：将上述步骤⑤渗析后的溶液在室温下静置5～10天，纳米微球经进一步溶胀及自组装作用形成纳米囊。
4、如权利要求1所述方法制备的白蛋白基聚丙烯酸纳米载体。
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| CN103495177A (zh) * | 2013-09-27 | 2014-01-08 | 西北师范大学 | 白蛋白复合温敏性高分子微囊的制备及作为药物载体的应用 |
| CN115068669A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-09-20 | 湖南工业大学 | 一种三重网络多孔栓塞微球及其制备方法 |
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