CN101534858A - 预防和治疗癌症转移和癌症转移相关性骨丢失的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了通过将M－CSF－拮抗剂与治疗剂联合给予对象来预防和治疗骨质溶解、癌症转移和癌症转移相关性骨丢失的方法。
Description
技术领域
本发明涉及通过将M-CSF拮抗剂和另一种治疗剂联合给予对象来预防和治疗溶骨性疾病，包括癌症转移和癌症转移相关性骨丢失的方法。
发明背景
介导骨吸收的破骨细胞参与正常和异常的骨再塑过程，包括溶骨性疾病。破骨细胞是从造血细胞分化来的多核细胞。通常接受破骨细胞是由骨髓中的造血干细胞衍生的单核前体融合形成，而不是不完全的细胞分裂(Chambers，Bone and Mineral Research，6：1-25，1989；G
thling等，Clin Orthop Relat R.120：201-228，1976；Kahn等，Nature 258：325-327，1975；Suda等，EndocrRev 13：66-80，1-992；Walker，Science 180：875，1973；Walker，Science 190：785-787，1975；Walker，Science 190：784-785，1975)。它们共有相同的干细胞和单核细胞-巨噬细胞谱系细胞(Ash等，Nature 283：669-670，1980；Kerby等，J.Bone Miner Res 7：353-62，1992)。破骨细胞前体分化成成熟的多核破骨细胞需要不同的因素，包括激素和局部刺激(Athanasou等，BoneMiner 3：317-333，1988；Feldrnan等，Endocrinology 107：1137-1143，1980：Walker，Science 190：784-785，1975；Zheng等，Histochem J 23：180-188，1991)，现已证实活的骨头和骨细胞在破骨细胞发育中起着至关重要的作用(Hagenaars等，Bone Miner 6：179-189，1989)。成骨细胞或骨髓基质细胞也是破骨细胞分化所需。这些细胞产生的支持破骨细胞形成的因素之一是巨噬细胞集落刺激因子，M-CSF(Wiktor-Jedrzejczak等，Proc Natl Acad Sci USA87：4828-4832，1990；Yoshida等，Nature 345：442-444，1990)。NF-κB受体激活蛋白配体(RANKL，也称为TRANCE、ODF和OPGL)是另一种信号(Suda等，Endocr Rev 13：66-80，1992)，而成骨细胞/基质细胞通过该信号，经由位于破骨细胞和破骨细胞前体上的受体RANK(TRANCER)刺激破骨细胞形成和吸收(Lacey等，Cell 93：165-176，1998；Tsuda等，Biochem BiophysRes Co 234：137-142，1997；Wong等，J Exp Mcd 186：2075-2080，1997；Wong等，J Bio1.Chem 272：25190-25194，1997；Yasuda等，Endocrinology139：1329-1337，1998；Yasuda等，Proc Natl Acad Sci US 95：3597-3602，1998)。成骨细胞还分泌强烈抑制破骨细胞形成的蛋白质，称为骨保护素(OPG，也称为OCIF)，其用作RANKL的诱饵受体，因而抑制了破骨细胞和成骨细胞之间经由RNAK和RANKL的正信号。
破骨细胞负责矿物质和有机骨基质的溶解(Blair等，J Cell Biol 102：1164-1172，1986)。破骨细胞代表了表达独特极化形态的最终分化细胞，其具有专门膜区域与几个膜和胞质标记，例如酒石酸耐受性酸性磷酸酶(TRAP)(Anderson等，1979)、碳酸酐酶II(
等，Histochemistry 78：481-485，1983)、降钙素受体(Warshafsky等，Bone6：179-185，1985)和玻璃粘附蛋白受体(Davies等，J Cell Biol 109：1817-1826，1989)。多核破骨细胞通常含有不到10个核，但它们最多可含有100个直径在10-100μm之间的核(G
thling等，Clin Orthop Relat R 120：201-228，1976)。这使得可以较为方便地使用光学显微镜鉴别它们。它们处于活性状态时具有大量空泡，还含有许多线粒体，表明其代谢速率高(Mundy，刊于《代谢性骨病和矿物质代谢障碍入门》(Primer on the metabolic bone diseases and disorders ofmineral metabolism)，第18-22页，1990)。由于破骨细胞在溶骨性转移中的主要作用，本领域需要新的药物和方法来预防破骨细胞刺激和功能。
癌症转移是手术后或治疗后癌症患者复发的主要原因。尽管人们致力于开发治疗方法，但癌症转移仍然基本上是难以治疗的。骨头是各种类型的人癌症(例如，乳腺癌、肺癌、前列腺癌和甲状腺癌)转移的最常见部位。溶骨性骨转移的发生因难治的疼痛、极易骨折、神经压迫和高钙血症而造成严重的发病率。虽然这些临床问题至关重要，但癌症转移相关的骨丢失的治疗方法却很少。
目前正使用或开发几张以溶骨性疾病为目的的治疗方案，这些方案主要致力于开发药物，以图通过抑制破骨细胞的形成或活性来阻断骨吸收。目前，集中于骨中的二膦酸盐(BP)、焦磷酸盐类似物是骨吸收的最有效抑制剂。BP被破骨细胞吸收，抑制了它们的活性，进而导致这些细胞凋亡，从而抑制了骨吸收。阿伦膦酸盐(alendronate)是第一种骨吸收的BP抑制剂，其显示明显降低了脊柱/髋部骨折，并批准用于治疗骨质疏松。最新一代BP，佐美塔(Zometa)批准用于治疗实体瘤和多发性骨髓瘤中的高钙血症和骨疾病，正在研究其是否能用于治疗佩吉特病和实体瘤及多发性骨髓瘤导致的骨转移。佐美塔可在极低剂量起作用，可以每月一次的15分钟静脉内输注给予，但仍能影响成骨细胞并可导致副作用，例如肾脏毒性和颚骨坏死(Fromigue和Brody，J，Endocrinol.Invest.25：39-46，2002；Ibrahim，A等，Clin.Cane.Res.9：2394-99，2003；Body，JJ.，The Breast.S2-S37-44，2003；Yaccoby，S.等，Brit.J.Hemat.，116：278-80，2002；Corey，E.等，Clin.Cane.Res.9：295-306，2003；Coleman，R.E.，Sem.Oncol.，29(6)：43-49，2002；Coleman，R.E.，Eur.Soc.Med.Oncol.16：687-95，2005；Bamias等，J Clin Oncol 13：8580-8587，2005)。因此，本领域仍需要鉴定新的药物和方法来预防或治疗溶骨性疾病和/或癌症转移，包括溶骨性骨转移。
发明概述
本发明的组合物和方法实现了上述和本领域的其它相关需要。本发明的一个实施方式提供了治疗患有溶骨性疾病或具有该疾病危险的对象的方法，所述方法包括在约1天到1年的过渡期给予对象单一治疗量的M-CSF拮抗剂和单一治疗有效量的第二抗-破骨细胞剂，在此期间M-CSF拮抗剂将活性破骨细胞数量降低至治疗上可接受的水平。示范性M-CSF拮抗剂包括M-CSF抗体，而示范性第二抗-破骨细胞剂包括二膦酸盐和RANKL抑制剂，包括抗-RANKL抗体。涉及本文的抗-M-CSF抗体和破骨细胞抑制剂的方法和/或应用任选排除国际公布号WO 2005/068503披露的RX1、5H4、MC1和MC3-衍生抗体的应用。过渡期的持续时间可以是，例如至少一天到最多一年，并且可通过，例如破骨细胞生长或活性的相关标记物进行监测。或者，可以同时给予它们。
举例来说，骨形成的标记物包括但不限于：钙、总的和骨特异性的碱性磷酸酶(BAP)、骨钙蛋白(OC，β-gla-蛋白)、I型前胶原C前肽(PICP)、I型前胶原N前肽(PINP)和骨吸收的标记物，包括但不限于：NTX(骨胶原的N-末端交联端肽)和CTX(骨胶原的C-末端交联端肽)、吡啶交联(吡啶诺啉(pyridinoline)和脱氧吡啶诺啉[DPD])和缔合肽、I型骨胶原降解产物羟基脯氨酸和羟基赖氨酸糖苷、酒石酸耐受性酸性磷酸酶(TRACP)和骨涎蛋白(BSP)。参见Fohr等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，2003年11月，88(11)：5059-5075。
在相关的实施方式中，提供的上述方法在过渡期后停止给予所述第二抗-破骨细胞剂。在其它相关的实施方式中，提供的上述方法在过渡期后降低所述第二抗-破骨细胞剂的用量。在进一步相关的实施方式中，提供的所述方法在过渡期后降低M-CSF拮抗剂的用量。
本发明方法包括通过抑制M-CSF及其受体(M-CSFR)之间的相互作用实现其治疗潜力。还包括抑制M-CSF/M-CSFR相互作用来抑制破骨细胞增殖和/或分化。在本发明的任何方法和组合物中，M-CSF拮抗剂可以是包含抗-M-CDF抗体的多肽；包含抗-M-CSFR抗体的多肽；包含M-CSF突变蛋白或其变体的可溶性多肽；包含M-CSFR突变蛋白或其变体的可溶性多肽；或抑制M-CSF或M-CSFR表达的核酸分子。通过引用全文纳入本文的国际公布号WO 2005/068503描述了各种M-CSF拮抗剂的鉴定、产生和修饰。
M-CSF抗体可以是多克隆抗体；单克隆抗体；人源化抗体；人抗体；人工程改造抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；或上述任一的突变蛋白。
国际公布号WO 2005/068503描述了抑制骨质溶解的本发明M-CSF抗体，该份文献关于M-CSF抗体的指导通过引用全文纳入本文。
在一个实施方式中，提供了能与分别具有图1、3和4所示氨基酸序列的鼠科单克隆抗体RX1、MC1或MC3中任一种的相同M-CSF表位特异性结合的非鼠科单克隆抗体，包括功能片段。在一相关实施方式中，提供的上述抗体选自：多克隆抗体；单克隆抗体，包括Human EngineeredTM抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab′)2；Fv；Sc Fv或SCA抗体片段；双特异抗体(diabody)；线性抗体；或优选保留至少10-7、10-8或10-9或更高结合亲和力的这些抗体中任一种的突变蛋白。还包括与具有图1所示氨基酸序列的单克隆抗体RX1、MC1和/或MC3竞争结合超过75％的M-CSF的非鼠科单克隆抗体，包括功能片段。
在另一实施方式中，提供了非鼠科单克隆抗体，包括功能片段，其中所述非鼠科单克隆抗体或其功能片段结合包含图7所示氨基酸98-105的至少4、5、6、7或8个毗连残基的M-CSF表位。
在另一实施方式中，本发明提供非鼠科单克隆抗体，包括功能片段，其中所述非鼠科单克隆抗体或其功能片段结合包含图7所示氨基酸65-73或138-144的至少4、5、6、7或8个毗连残基的M-CSF表位(对应于5H4或MC3识别的M-CSF表位)。
在还有另一实施方式中，提供了结合包含图7所示氨基酸98-105的M-CSF表位的上述抗体或片段。在一相关实施方式中，提供的上述抗体包含图1A所示CDR3。在另一实施方式中，提供的抗体包含图1A所示鼠科连同RX1的至少1、2、3、4、5或6个CDR。包含鼠科抗体RX1的至少1、2、3、4或5个CDR的这种抗体还可包含图8A-B所示抗体5H4的任何6个CDR中至少1、2、3、4或5个CDR。或者，包含鼠科抗体RX1的至少1、2、3、4或5个CDR的这种抗体还可包含图8A-B所示抗体MC1的任何6个CDR中至少1、2、3、4或5个CDR。在还有另一实施方式中，上述抗体还可包含图8A-B所示抗体MC3的任何6个CDR中至少1、2、3、4或5个CDR。在一相关实施方式中，提供的包含鼠科抗体RX1的至少1、2、3、4或5个CDR的抗体可包含图8A-B所示的共同CDR中至少1、2、3、4或5个CDR。在还有另一相关实施方式中，在上述抗体中，共有CDR的一个或多个残基被鼠科抗体RX1、5H4、MC1或MC3的任何CDR的相应残基取代。可以保留所需结合亲和力，即使抗体中一个或多个氨基酸突变，例如CDR中的保守取代和/或低风险或中等风险残基中的保守性或非保守性改变。
在本发明的另一实施方式中，提供的上述抗体的变体包含与图1A、2、3或4所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的可变重链氨基酸序列。在另一实施方式中，所述抗体包含与图1A、2、3或4所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的可变轻链氨基酸序列。
在还有另一实施方式中，所述抗体包含人抗体序列的恒定区与一个或多个重链和轻链可变框架区。在一相关实施方式中，所述抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的修饰或未修饰恒定区。在一优选实施方式中，所述恒定区是人IgG1或IgG4，可任选进行修饰以增强或降低某些特性。以IgG1为例，对恒定区，特别是绞链区或CH2区的修饰可增强或降低效应物功能，包括ADCC和/或CDC活性。在其它实施方式中，可修饰IgG2恒定区以减少抗体-抗原凝聚物形成。以IgG4为例，对恒定区，特别是绞链区的修饰可减少半抗体(half-antibody)的形成。
在本发明的一个实施方式中，提供的非鼠科单克隆抗体特异性结合与国际公布号WO 2005/068503所述鼠科抗体RX1、5H4、MC1或MC3中任一种相同的M-CSF表位，或与上述任一种鼠科抗体竞争结合超过10％、优选超过25％、还要更优选超过50％、甚至更优选超过75％、最优选超过90％的M-CSF。WO2005/068503描述了衍生自这些鼠科抗体序列的抗体，包括嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、人工程改造抗体或它们的片段或突变蛋白或化学衍生形式。
术语“RX1-衍生抗体”包括保留结合M-CSF能力的以下任一种：
1)具有图1所示氨基酸序列的鼠科抗体RX1的氨基酸变体，包括含有与图1所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的可变重链氨基酸序列，和/或含有与图1所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的可变轻链氨基酸序列的变体，考虑了用于同源性测定的相似氨基酸；
2)包含具有图1所示氨基酸序列的鼠科抗体RX1的一个或多个互补决定区(CDR)的M-CSF-结合多肽(排除鼠科抗体RX1)，优选包含RX1的CDR3，优选包含2个或更多个，或3个或更多个，或4个或更多个，或5个或更多个，或所有6个CDR；
3)具有图9B-12B所示氨基酸序列的Human EngineeredTM抗体或它们的变体，所述变体包含与图9B-12B所示原始Human EngineeredTM重链或轻链有至少60％氨基酸序列相同性的重链或轻链，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，包括例如65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同；
4)包含图9B-12B所示Human EngineeredTM抗体的一个或多个CDR的高风险残基的M-CSF结合多肽(排除鼠科抗体RX1)，优选包含2个或更多个，或3个或更多个，或4个或更多个，或5个或更多个，或所有6个CDR的高风险残基；
5)保留图1B所示高风险氨基酸残基，并且在图1B所示低风险或中等风险残基处包含一个或多个改变的Human EngineeredTM抗体或变体；
例如，包含图1B所示低风险残基处的一个或多个改变和中等风险残基处的保守性取代，或
例如，保留图1B所示中等和高风险氨基酸残基并包含低风险残基处的一个或多个改变，
其中的改变包括插入、删除或取代，并且可以是保守性取代或者可以产生序列更接近人轻链或重链序列、人种系轻链或重链序列、共有人轻链或重链序列、或共有人种系轻链或重链序列的工程改造抗体。
这些抗体优选以至少10-7、10-8或10-9或更高的亲和力结合M-CSF，优选能中和M-CSF的破骨细胞产生(osteoclastogenesis)诱导活性。
类似地，术语“MC3-衍生抗体”包括保留结合M-CSF能力的以下任一种：
1)具有图4所示氨基酸序列的鼠科抗体MC3的氨基酸变体，包括含有与图4所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的可变重链氨基酸序列，和/或含有与图4所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的可变轻链氨基酸序列的变体，考虑了用于同源性测定的相似氨基酸；
2)包含具有图4所示氨基酸序列的鼠科抗体MC3的一个或多个互补决定区(CDR)的M-CSF-结合多肽(任选包括或排除鼠科抗体MC3)，优选包含MC3重链的至少(1个)CDR3，优选包含2个或更多个，或3个或更多个，或4个或更多个，或5个或更多个，或所有6个CDR；
3)按照Studnicka等，美国专利号5,766,886和本文实施例4A所述方法改变鼠科序列产生的Human EngineeredTM抗体，采用图13C-13E所示Kabat编号鉴定了低、中等和高风险残基；这些抗体包含至少一个以下重链和至少一个以下轻链：(a)其中所有低风险残基(如果需要的话)修饰成人参比免疫球蛋白序列的相同残基的重链或(b)其中所有低风险和中等风险残基(如果需要的话)修饰成人参比免疫球蛋白序列的相同残基的重链，(c)其中所有低风险残基(如果需要的话)修饰成人参比免疫球蛋白序列的相同残基的轻链或(b)其中所有低风险和中等风险残基(如果需要的话)修饰成人参比免疫球蛋白序列的相同残基的轻链；
(4)上段(3)中所述抗体的变体，所述变体包含与原始HumanEngineeredTM重链或轻链有至少60％氨基酸序列相同性的重链或轻链，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，包括例如65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同；
5)包含图4所示鼠科MC3抗体的一个或多个CDR的高风险残基的M-CSF结合多肽(任选包括或排除鼠科抗体MC3)，优选包含2个或更多个，或3个或更多个，或4个或更多个，或5个或更多个，或所有6个CDR的高风险残基；
6)保留鼠科MC3抗体的高风险氨基酸残基，并且在低风险或中等风险残基处包含一个或多个改变的Human EngineeredTM抗体或变体；
例如，包含低风险残基处的一个或多个改变和中等风险残基处的保守性取代，或
例如，保留中等和高风险氨基酸残基并包含低风险残基处的一个或多个改变，
其中的改变包括插入、删除或取代，并且可以是保守性取代或者可以产生序列更接近人轻链或重链序列、人种系轻链或重链序列、共有人轻链或重链序列、或共有人种系轻链或重链序列的工程改造抗体。
这些抗体优选以至少10-7、10-8或10-9或更高的亲和力结合M-CSF，优选能中和M-CSF的破骨细胞产生诱导活性。
术语“5H4-衍生抗体”或“MC1-衍生抗体”根据上述类似限定。
如本文所详述的，RX1、5H4、MC1或MC3-衍生抗体，包括HumanEngineeredTM抗体或其变体，可以是不同的同种型，例如IgG、IgA、IgM或IgE。IgG类抗体可包含不同的恒定区，例如可修饰IgG2抗体以展示IgG1或IgG4恒定区。在优选的实施方式中，本发明提供含有修饰或未修饰的IgG1或IgG4恒定区的Human EngineeredTM或其变体。以IgG1为例，对恒定区，特别是绞链区或CH2区的修饰了增强或降低效应物功能，包括ADCC和/或CDC活性。在其它实施方式中，修饰IgG2恒定区以减少抗体-抗原凝聚物形成。以IgG4为例，对恒定区，特别是绞链区的修饰可降低半抗体形成。在具体的示范性实施方式中，使IgG4绞链序列Cys-Pro-Ser-Cys突变成Cys-Pro-Pro-Cys。
可按照本发明给予包含任何上述M-CSF拮抗剂或M-CSF抗体和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
还优选将两种或更多种M-CSF拮抗剂混合在一起，或共同给予M-CSF拮抗剂和第二抗-破骨细胞剂以增强抗本发明溶骨性疾病，包括癌症转移和/或癌症转移相关性骨丢失的效力。
在本发明的示范性实施方式中，提供的上述方法中第二抗-破骨细胞剂是二膦酸盐。在进一步的实施方式中，所述二膦酸盐是唑来膦酸盐、帕米膦酸盐、氯屈膦酸盐、羟乙磷酸盐、替鲁膦酸盐、阿伦膦酸盐、伊班膦酸盐或利塞膦酸盐。示范性的其它抗-破骨细胞剂包括二膦酸盐、PTHrP中和剂(例如，抗体、反义、siRNA)、组织蛋白酶K抑制剂、MIP-1-α拮抗剂、RANK/RANKL中和剂(例如，抗-RANK抗体、抗-RANKL抗体或反义、可溶性RANKL受体或其突变蛋白)、RANKL疫苗、骨保护素(OPG)、血小板衍生生长因子(PDGF)、src激酶抑制剂、麦芽糖镓(gallium maltolate)和基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。
本发明治疗方法可与第三治疗剂，例如癌症化疗剂或与放疗或外科手术联用。癌症化疗剂包括但不限于：烷化剂，例如碳铂或顺铂；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷化剂，例如卡莫司汀(BCNU)；抗代谢物，例如氨甲蝶呤；嘌呤类似物抗代谢物、巯基嘌呤；嘧啶类似物抗代谢物，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨；激素抗瘤剂，例如戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗瘤剂，例如阿地白介素、白介素-2、多西他赛、依托泊苷(VP-16)、干扰素α、紫杉醇和维甲酸(ATRA)；抗生素性天然抗瘤剂，例如博莱霉素、放线菌素、柔红霉素、阿霉素和丝裂霉素；和长春花生物碱天然抗瘤剂，例如长春花碱、长春新碱、长春地辛；羟基脲；乙酰葡醛酸内酯、阿霉素、异磷酰胺、依诺他滨、表硫雄醇、阿柔比星、安西他滨、尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、卡波醌、碳铂、卡莫氟、色霉素A3、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺、裂殖菌多糖、阿糖胞苷、达卡巴嗪、硫代肌苷、塞替派、替加氟、新制癌菌素、OK-432、博莱霉素、氟铁龙、溴尿苷、白消安、二磷酸己烯雌酚四钠(honvan)、培洛霉素、贝他定(Bestatin)(乌苯美司)、干扰素-β、美雄烷、二溴甘露醇、美法兰、层粘连蛋白肽、磨茹多糖、杂色革盖菌(Coriolus versicolor)提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(雌激素/氮芥)。
此外，用于癌症患者辅助治疗的其它药物包括EPO、G-CSF、更昔洛韦；抗生素、醋酸亮丙瑞林；哌替啶；齐多夫定(AZT)；白介素1-18，包括突变体和类似物；干扰素或细胞因子，例如干扰素α、β和γ；激素，例如促黄体激素释放激素(LHRH)和类似物及促性腺激素释放激素(GnRH)；生长因子，例如转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子-α和β(TNF-α和β)；侵袭抑制因子-2(invasion inhibitingfactor-2)(IIF-2)；骨形成蛋白1-7(BMP1-7)；生长激素抑制素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；补体因子；抗血管生成因子；抗原性物质；前药；生长因子受体激酶抑制剂；抗-Her2抗体；和VEGF中和抗体。
过渡期后，可以降低达到疗效所需的M-CSF拮抗剂用量或第二抗-破骨细胞剂用量。因此，在该时期后，M-CSF拮抗剂可提高第二抗-破骨细胞剂的效力，或降低给予第二抗-破骨细胞剂相关的副作用，或者提高第二抗-破骨细胞剂的安全性。M-CSF拮抗剂还能提高第三治疗形态，例如癌症化疗、其它辅助治疗、外科手术或放疗的效力、降低其副作用或提高其安全性。在本发明的另一实施方式中，提供了装有药品和使用说明书的包装、小瓶或容器，所述药品包含M-CSF拮抗剂，而所述使用说明书说明了该药品应与第二和/或第三治疗剂和/或外科手术或放疗联用。
预计许多溶骨性病症适合于按照本发明治疗。本文所用的“溶骨性病症”是破骨细胞活性升高导致的任何状况。具有溶骨性病症危险的对象可以是易患溶骨性病症的对象，或患有会导致或促进破骨细胞活性升高的疾病的对象。在本发明的示范性实施方式中，溶骨性病症可以是破骨细胞活性相对升高相关的代谢性骨病，包括内分泌病(皮质醇增多症、性腺机能减退、原发性或继发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进)、高钙血症、缺乏状态(佝偻病/骨软化症、坏血病、营养不良)、慢性病(吸收不良综合征、慢性肾衰竭(肾病性骨营养不良)、慢性肝病(肝性骨营养障碍))、药物(糖皮质激素类(糖皮质激素诱导的骨质疏松症)、肝素、酒精)，以及遗传性疾病(成骨不全、高胱氨酸尿症)，癌症，骨质疏松症、骨硬化症、与关节炎和类风湿性关节炎相关的骨炎症、牙周病、纤维性结构不良和/或佩吉特病。
在其它示范性实施方式中，溶骨性病症可以是骨的转移癌症，其中所述转移癌症是乳腺癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、前列腺癌、腺癌、包括白血病和淋巴瘤在内的血细胞恶性肿瘤；头颈癌；胃肠癌，包括食管癌、胃癌、结肠癌、肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆管或胆囊的癌症；雌性生殖道的恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌或宫颈癌；膀胱癌；脑癌，包括成神经细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；或皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状上皮细胞癌。
在本发明的示范性实施方式中，任何上述方法可防止或降低骨丢失，或防止或降低骨转移或疾病相关骨丢失的严重程度。
按照本发明给予的M-CSF抗体可以约2μg/kg-30mg/kg、0.1mg/kg-30mg/kg或0.1mg/kg-10mg/kg体重之间的剂量给予。
附图简述
图1A显示了M-CSF特异性鼠科抗体RX1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2和4)(由美国弗吉尼亚州马纳萨斯市美国模式培养物保藏所保藏的质粒的cDNA插入物编码，ATCC保藏号为PTA-6133)以及相应的核酸序列(SEQ ID NO：1和3)。CDR区编号以黑体字显示。
图1B和1C分别显示了M-CSF特异性鼠科抗体RX1轻链(SEQ ID NO：5)和重链(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列，其中按照Studnicka等，WO93/11794鉴定了高风险(黑体字)、中等风险(下划线)和低风险残基。
图2、3和4分别显示了M-CSF-特异性鼠科抗体5H4(SEQ ID NO：10和11)、MC1(SEQ ID NO：12和13)(以ATCC保藏号PTA-6263保藏的杂交瘤产生)和MC3(SEQ ID NO：14和15)(以ATCC保藏号PTA-6264保藏的杂交瘤产生)的氨基酸序列。
图5是M-CSFα的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图6是M-CSFβ的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图7是M-CSFγ的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。DNA序列中的许多多态性可导致氨基酸差异。例如，某种常见的多态性在104位提供Ala而非Pro。
图8A和B是人M-CSF-特异性鼠科抗体RX1；5H4；MC1；和MC3的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：16-38)的CDR区的比对。
图9显示了(a)鼠科RX1重链的风险线(risk line)(H＝高风险、M＝中等风险、L＝低风险)，(b)RX1重链氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，(c)与RX1作比对的最接近人共有序列(Kabat Vh2共有序列)的氨基酸序列(SEQ IDNO：39)和(d)为产生两条示范性Human EngineeredTM序列(SEQ ID NO：41和43)而作的改变。图9B显示了指定为“低风险”和“低+中等风险”的两条示范性重链Human EngineeredTM序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：41和43)，以及相应的核酸序列(SEQ ID NO：40和42)。
图10A显示了(a)鼠科RX1轻链的风险线(H＝高风险、M＝中等风险、L＝低风险)，(b)RX1轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：5)，(c)与RX1作比对的最接近人共有序列(Kabat Vk3共有序列)的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)和(d)为产生两条示范性Human EngineeredTM序列(SEQ ID NO：45和47)而作的改变。图10B显示了指定为“低风险”和“低+中等风险”的两条示范性轻链Human EngineeredTM序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：45和47)，以及相应的核酸序列(SEQ ID NO：44和46)。
图11A显示了(a)鼠科RX1轻链的风险线(H＝高风险、M＝中等风险、L＝低风险)，(b)RX1轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：5)，(c)与RX1作比对的最接近人共有序列(Kabat Vk3共有序列)的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)和(d)54-56位未改变的择一(alternate)示范性氨基酸序列(即，保留了鼠科序列)(SEQ ID NO：48)。图11B显示了两条示范性择一轻链HumanEngineeredTM序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：48、87)，以及相应的核酸序列(SEQ ID NO：88和86)。
图12A显示了(a)鼠科RX1轻链的风险线(H＝高风险、M＝中等风险、L＝低风险)，(b)RX1轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：5)，(c)与RX1作比对的最接近人共有种系序列(Vk6亚群2-1-(1)-A14)的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)和(d)为产生两条示范性Human EngineeredTM序列(SEQ ID NO：51和53)而作的改变。图12B显示了指定为“低风险”和“低+中等风险”的两条示范性轻链Human EngineeredTM序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：51和53)，以及相应的核酸序列(SEQ ID NO：52)。
图13A和24B显示了采用Kabat编号系统(成一直线显示的氨基酸编号指定为“POS”)比对鼠科RX1重链氨基酸序列(SEQ ID NO：54)与各种人共有和人种系共有序列(SEQ ID NO：55-83)。图13C-13E显示了抗体5H4、MC1和MC3的氨基酸残基如何与Kabat编号系统相对应(分别是SEQ ID NO：10和11；SEQ ID NO：12和13；SEQ ID NO：14和15)。
图14显示了佐美塔在动物模型中的抗吸收作用。
图15显示了各组中具有可检测骨质溶解的动物百分比。
图16显示了在该项研究的最后一天依据x-射线图像分析的平均骨质溶解评分。
图17显示了该项研究最后一天的代表性胫骨Faxitron x-射线图像(肿瘤接种部位)。箭头表示骨质溶解部位。
图18显示了RX1对破骨细胞活性的作用。
图19显示了佐美塔对破骨细胞活性的抑制作用。
图20显示了RX1在灵长类动物中的药代动力学研究结果。
图21显示了RX1在灵长类动物中的药代动力学研究结果。
详述
现已发现也称为巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的集落刺激因子(CSF-1)对于破骨细胞形成至关重要。此外，M-CSF显示能与其它可溶性因子协作调节成熟破骨细胞的破骨功能、它们的迁移和存活，以及成骨细胞和成纤维细胞提供的细胞-细胞相互作用(Fixe和Praloran，Cytokine 10：3-7，1998；Martin等，Critical Rev.in Eukaryotic Gene Expression 8：107-23(1998))。
全长人M-CSF mRNA编码554个氨基酸的前体蛋白。通过另路mRNA剪接和差异翻译后蛋白酶解加工，M-CSF可以作为糖蛋白或含蛋白多糖的硫酸软骨素分泌入循环系统，或者表达成M-CSF产生细胞表面的跨膜糖蛋白。细菌表达的人M-CSF氨基末端150个氨基酸(完全体外生物学活性所需的最小序列)的三维结构表明该蛋白质是二硫键连接的二聚体，其中各单体由4个α螺旋束和反平行β片层构成(Pandit等，Science 258：1358-62(1992))。通过另路mRNA剪接产生了三种不同的M-CSF。三种多肽前体是256个氨基酸的M-CSFα、554个氨基酸的M-CSFβ和438个氨基酸的M-CSFγ。M-CSFβ是不以膜结合形式产生的分泌蛋白。M-CSFα表达成通过蛋白酶解切割缓慢释放的膜内在蛋白。M-CSFα在图5所示序列的氨基酸191-197处切割。M-CSF的膜结合形式能与邻近细胞上的受体相互作用，因此能介导特异性细胞-细胞相互作用。术语“M-CSF”还可包括图7所示氨基酸36-438。
各种形式的M-CSF通过与其靶细胞上的受体M-CSFR结合而起作用。M-CSFR是具有5个胞外免疫球蛋白样结构域、1个跨膜结构域和1个胞内间断Src相关酪氨酸激酶结构域的跨膜分子。c-fms原癌基因编码M-CSFR。M-CSF与M-CSFR的胞外结构域结合导致受体二聚化，从而活化了胞质激酶结构域，进而造成其它细胞蛋白的自磷酸化和磷酸化(Hamilton J.A.，J Leukoc Biol.，62(2)：145-55，1997；Hamilton J，A.，Immuno Today.，18(7)：313-7，1997)。
磷酸化的细胞蛋白诱导生物化学事件的级联反应，从而导致以下细胞反应：有丝分裂、细胞因子分泌、膜褶皱和调节其自身受体转录的(Fixe和Praloran，Cytokine 10：32-37，1998)。
本文所用的“肿瘤”指所有无论是恶性或良性的赘生细胞生长和增殖以及所有癌前和癌性细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长不受调节为特征的生理状况。癌症的例子包括但不限于：癌；淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病。这些癌症的更具体例子包括：乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌症、膀胱癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肝脏癌症、肛门癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌。
“治疗”是以防止疾病的发生或改变疾病病状为意图而进行的干预。因此，“治疗”同时指治疗性治疗和预防性或防御性措施。需要治疗的对象包括已患病的对象以及需要预防疾病的对象。在肿瘤(例如，癌症)治疗中，治疗剂可直接减轻肿瘤细胞的病状，或使肿瘤细胞对其他治疗剂如放疗和/或化疗的治疗更敏感。癌症的“病状”包括损害患者健康的所有情况。这包括，但不限于；异常或不可控制的细胞生长、转移、干扰相邻细胞的正常功能、释放水平异常的细胞因子或其它分泌产物、抑制或加重炎症或免疫反应，等等。
就治疗目的而言，“哺乳动物”指归类为哺乳动物的任何动物，包括人，家养和农用动物，以及动物园动物(zoo animal)、运动动物(sports animal)和宠物，如狗、马、猫、母牛等。所述哺乳动物优选人。
本文所用的短语“转移性癌症”定义为有可能扩散到身体其他区域、尤其是骨中的癌症。许多癌症都可转移到骨中，但最常见的转移性癌症是乳腺癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌和前列腺癌。例如，有可能转移到骨中的其它癌症包括但不限于：腺癌，血细胞恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤；头颈癌；胃肠癌，包括食管癌、胃癌、结肠癌、肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆管或胆囊的癌症；雌性生殖道的恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌和宫颈癌；膀胱癌；脑癌，包括成神经细胞瘤；肉瘤，骨肉瘤；以及皮肤癌，包括恶性黑色素瘤和鳞状上皮细胞癌。本发明尤其包括预防和治疗肿瘤诱导的溶骨性骨损伤。
本文所用的短语“治疗有效量”指当按照所需治疗方案给药时将引起所需治疗性或预防性效力或反应的适合本发明实施方式的治疗性或原发性M-CSF拮抗剂，例如M-CSF抗体的用量。
本文所用的人“M-CSF”指具有与以下文献所述的成熟人M-CSFα、M-CSFβ或M-CSFγ多肽基本相同的氨基酸序列的人多肽：Kawasaki等，Science 230：291(1985)，Cerretti等，Molecular Immunology，25：761(1988)，或Ladner等，EMBO Journal 6：2693(1987)，各文献通过引用纳入本文。如上所述，该术语反映出，这三种成熟的M-CSF具有不同氨基酸序列，且M-CSF的活性形式是二硫键连接的二聚体；因此，当术语“M-CSF”指表示生物活性形式时指二聚体形式。“M-CSF二聚体”指已经二聚化的两个M-CSF多肽单体，同时包括同型二聚体(由两个相同类型的M-CSF单体构成)和杂二聚体(由两个不同单体构成)。如通过引用纳入本文的美国专利4,929,700所述，可在体外将M-CSF单体转变成M-CSF二聚体。
1.拮抗剂
本文所用的术语“拮抗剂”通常指例如，分子、化合物或其它药物通过空间位阻、构型改变或其它生物化学机制以干扰一种分子与另一种分子的结合或干扰另一种细胞对一种细胞的刺激的特性。在这点上，术语“拮抗剂”涉及某药物防止受体与其配体结合例如M-CSF与M-CSFR结合的特性，从而抑制M-CSF触发信号转导途径。术语“拮抗剂”不局限于任何具体的作用机制，而是泛泛地指本文所述的功能特性。本发明的拮抗剂包括但不限于：M-CSF抗体及其片段和突变蛋白和修饰物，可溶性M-CSF及其片段和突变蛋白和修饰物，M-CSFR抗体及其片段和突变蛋白和修饰物，可溶性M-CSFR及其片段和突变蛋白和修饰物，能结合M-CSF或M-CSFR的肽和其它化合物及分子，以及能抑制M-CSF和M-CSFR表达的核酸分子，例如反义或RNAi化合物。可以本领域已知的任何方式给予本发明的任何拮抗剂。例如，可经由基因治疗给予能结合M-CSF或M-CSFR的M-CSF突变蛋白、M-CSFR突变蛋白或抗体片段。
如果适用，本发明的M-CSF拮抗剂包括功能等价物。例如，分子的长度、结构、组成等可能不同，但仍保留了一种或多种所述功能。更具体地说，本发明的抗体、抗体片段或肽的功能等价物可包括模拟化合物，即设计以模拟抗原结合的适当构型和/或取向的构建物。
可通过加入侧基团等，例如通过氨基末端酰化、羧基末端酰胺化或通过使其它基团与氨基酸侧链偶联来任选修饰优选的M-CSF拮抗剂。拮抗剂还可包含一个或多个保守型氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”表示氨基酸序列中保留被取代氨基酸的总体电荷、疏水性/亲水性和/或空间体积的那些改变。例如，以下基团之间的取代是保守性的：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、Ser/Cys/Thr、和Phe/Trp/Tyr。这些修饰不会实质性降低M-CSF拮抗剂的效力，还可赋予所需特性，例如延长体内半衰期或降低毒性。
本发明还应包括携带除插入、删除或取代以外的氨基酸残基修饰的多肽。例如，在本质上所述修饰可以是共价的，包括，例如与聚合物、脂质、其它有机和无机部分的化学键合。可制备这些衍生物以延长多肽的循环半衰期，或可设计这些衍生物以改善多肽对于所需细胞、组织或器官的靶向能力。类似地，本发明还包括经共价修饰从而包含一个或多个水溶性聚合物附加物，例如聚乙二醇、聚氧乙烯甘油或聚丙二醇的M-CSF或M-CSFR多肽。
A.M-CSF抗体
术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括完全装配的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、能结合抗原的抗体片段(例如，Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双特异抗体(diabody))、和包括上述抗体的重组肽，只要它们具有所需生物学活性。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群(即除了可能存在少量天然产生的突变外，构成该群体的单个抗体相同)中获得的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原性位点。此外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制品相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。除了它们的特异性，单克隆抗体的优点在于可通过均质培养(homogeneous culture)合成它们，不会受具有不同特异性和特征的其它免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”表示该抗体的特征为获自基本均质的抗体群，不能解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，可通过最先由Kohler等(Nature，256：495[1975])描述的杂交瘤方法，或重组DNA法(参见，例如，美国专利4,816,567)制备本发明所用的单克隆抗体。还可采用例如Clackson等(Nature，352：624628[1991])和Marks等(J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
免疫球蛋白可根据它们重链恒定区的氨基酸序列分成不同类别。主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类还可分成亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。不同同种型具有不同的效应物功能；例如IgG1和IgG3同种型具有ADCC活性。
“抗体片段”包含完整的全长抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双特异抗体；线形抗体(Zapata等，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；和抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段和残留的“Fc”片段，两个“Fab”片段各具有一个抗原结合位点，而“Fc”片段的名称反映出其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个“单链Fv”的F(ab’)2片段或包含抗体的VH和VL结构域的“sFv”抗体片段，其中这些结构域存在于一条多肽链中。Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含能使Fv形成抗原结合所需结构的多肽接头。sFV的综述参见Pluckthun，刊于《单克隆抗体药理学》(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编，S-V公司(Springer-Verlag)，纽约，第269-315页，(1994)。
术语“超变”区指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。超变区包含CDR的互补决定区的氨基酸残基[即，如Kabat等，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，公共卫生服务部(Public Health Service)，国家卫生研究院，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州，(1991)所述，轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)]和/或重链可变区中超变环的那些残基(即，如Chothia等，J.MoI Biol.196：901-917(1987)所述，轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。
“框架”或FR残基是除超变区残基以外的那些可变区残基。
术语“双特异抗体”指含两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段将相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含在同一多肽链中(VH VL)。利用因太短而不能使同一链的两个结构域之间配对的接头，可迫使这些结构域与另一链的合并结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。例如，EP404，097；WO93/11161；和30Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)更详细地描述了双特异抗体。
在一些实施方式中，优选产生多特异性(例如，双特异性)单克隆抗体，包括对至少两种不同表位具有结合特异性的单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、Human EngineeredTM或抗-M-CSF抗体变体。示范性的双特异性抗体可以结合M-CSF的两种不同表位。或者，可将抗-M-CSF臂与结合白细胞上触发分子，例如T-细胞受体分子(如CD2或CD3)、或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂结合，从而使细胞防御机制对准M-CSF-表达细胞。还可利用双特异性抗体将细胞毒性剂固定于表达M-CSF的细胞。这些抗体具有M-CSF-结合臂和结合细胞毒性剂(例如，皂草素(saporin)、抗-干扰素-60、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab’)2双特异性抗体)。
按照制备双特异性抗体的另一种方法，可工程改造一对抗体分子之间的界面以尽可能提高从重组细胞培养液中回收的杂二聚体百分比。优选的界面包括抗体恒定区的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链在第二抗体分子的界面上产生与上述大侧链相同或相似大小的补偿“空腔”。如此提供的机制能提高杂二聚体的产量，从而超过不良终产物，例如同二聚体。参见1996年9月6日公布的WO 96/27011。
双特异性抗体包括交联或“杂偶联物”抗体。例如，杂偶联物中的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联，另一个可与生物素偶联。可采用常规交联方法制备杂偶联物抗体。合适的交联剂是本领域熟知的，美国专利号4,676,980披露这些交联剂以及许多交联技术。
参考文献中还描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可采用化学连接制备双特异抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)描述了将完整的抗体酶解切割以产生F(ab’)2片段的方法。在二巯基化物络合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段以稳定邻近的二巯基化物并防止分子内二硫键形成。然后将形成的Fab’片段转化成硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后用巯基乙胺还原将一种Fab’-TNB衍生物再次转化成Fab’-硫醇，与等摩尔量的另一Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。可将产生的双特异性抗体用作选择性固定酶的物质。在还要进一步的实施方式中，可体外化学偶联从大肠杆菌中直接回收的Fab’-SH片段，从而形成双特异性抗体。(Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992))
Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。大肠杆菌分别分泌各Fab’片段，将这些片段在体外直接化学偶联，从而形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能结合过度表达HER2受体的细胞和正常细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶细胞的裂解活性。
直接从重组细胞培养液中制备和分离双特异性抗体片段的技术现已见诸描述。例如，已利用亮氨酸拉链制备双特异性抗体(Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992))。可通过基因融合将Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽以连接于两种不同抗体的Fab’部分。可还原抗体二聚体的绞链区以形成单体，然后重新氧化以形成抗体杂二聚体。还可采用该方法产生抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)所述的“双特异抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的另一机制。
这些片段包含通过接头相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述接头因太短而不能使同一链的两个结构域之间形成配对。因而迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。利用单链Fv(sFV)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种方法也已见诸报道。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
或者，双特异性抗体可以是如Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)所述产生的“线形抗体”。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，这些片段形成一对抗原结合区。线形抗体可以是双特异性或单特异性的。
还包括两价以上的抗体。例如，可制备三特异性抗体。(Tutt等，J.Immunol.147：60(1991))。
在某些实施方式中，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、HumanEngineeredTM或抗-M-CSF抗体变体是抗体片段，例如RX1、5H4、MC1或MC3抗体片段。现已开发了各种技术来产生抗体片段。一般通过蛋白酶解消化完整的抗体来衍生这些片段(参见，例如Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，目前可利用重组宿主细胞直接产生这些片段。Better等，Science 240：1041-1043(1988)披露了细菌分泌功能抗体片段(参见，例如Better等，Skerra等，Science 240：1038-1041(1988))。例如，可从大肠杆菌中直接回收Fab’-SH片段，将其化学偶联从而形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。在另一实施方式中，利用亮氨酸拉链GCN4形成F(ab’)2以促进F(ab’)2分子装配。按照另一种方法，可以从重组细胞培养液中直接分离Fv、Fab或F(ab’)2片段。技术人员知道产生抗体片段的其它技术。
“分离的”抗体是经鉴定和分离并从其天然环境组分中回收的抗体。其天然环境的污染性组分是会干扰该抗体的诊断或治疗应用的物质，包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方式中，将抗体纯化至(1)以抗体的重量计，罗氏蛋白定量法(Lowry method)测定到大于95％，最优选大于99重量％，(2)利用自旋杯式测序仪(spinning cup sequenator)纯化至足以获得内部氨基酸序列或N-末端的至少15个残基的程度，或(3)利用考马斯蓝，或优选银染色，通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE纯化至均匀。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为该抗体的天然环境的至少一种成分不存在。然而，一般通过至少一步纯化步骤制备分离的抗体。
抗体的结构和产生的详述参见通过引用全文纳入本文的Roth，D.B.和Craig，N.L.，Cell，94：411-414(1998)和美国专利号6,255,458。简言之，产生编码重链和轻链免疫球蛋白基因的DNA的过程主要发生在正发育的B-细胞中。发现V、D、J和恒定区(C)基因区段通常先位于一个染色体上较接近之处，再发生各种免疫球蛋白基因区段的重排和连接。在B-细胞分化期间，V、D、J(或在轻链基因的情况中只有V和J)基因区段的合适家族成员各自重组以形成功能性重排的重链和轻链免疫球蛋白基因。该基因区段重排过程看来是顺次的。首先，进行重链D-J连接，然后进行重链V-DJ连接和轻链V-J连接。
侧接重组感受态V、D和J区段的重组信号序列(RSS)介导各区域基因区段的重组以形成功能性重链和轻链可变区。RSS必需且足以指导重组，其包含二重对称(dyad-symmetric)七聚体、富含AT的九聚体和12或23个碱基对的间插间隔子区。这些信号在进行D-J(或V-J)重组的不同基因座和物种之间保守并且在功能上可互换。参见Oettinger等，(1990)，Science，248，1517-1523和其中引用的参考文献。七聚体包含序列CACAGTG或其类似物，其后是不保守序列的间隔子，然后是具有序列ACAAAAACC的九聚体或其类似物。在各V和D基因区段的J，或下游侧发现这些序列。紧邻种系D和J区段之前仍是两条重组信号序列，仍旧为不保守序列隔开的第一条九聚体和第二条七聚体。VL、VH或D区段后七聚体和九聚体序列和与之重组的JL、D或JH区段之前序列的互补。七聚体和九聚体序列之间的间隔子的长度可以是12个碱基对或22-24个碱基对。
除了V、D和J区段的重排，借助轻链中V和J区段连接位置和重链中D和J区段连接位置处的可变重组，可在一级免疫球蛋白重链和轻链库中产生其它多样性。轻链中的这种变化通常发生在V基因区段的最后一个密码子和J区段的第一的密码子中。连接中的类似不精确性发生在D和JH区段之间的重链染色体上，并可延伸最多10个核苷酸。此外，可在D和JH之间以及VH和D基因区段之间插入几个不由基因组DNA编码的核苷酸。加入这些核苷酸称为N-区多样性(N-region diversity)。
可变区基因区段中的这种重排和在这种连接期间可发生的可变重组的净效应(net effect)是产生了一级抗体库。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链和一个轻链可变区的紧密、非共价结合二聚体构成。各可变区的三个CDR就是以此构型相互作用，从而在VH V1二聚体的表面确定了抗原结合位点。六个CDR在整体上赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使一个可变区(或只含有3个抗原特异性CDR的半个Fv)也能识别并结合抗原，虽然亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab片段与Fab’片段的不同之处是在包含一个或多个抗体绞链区半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端加入了少许残基。本文将Fab’-SH指定为其中恒定区的一个或多个半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段最初制备成之间具有绞链半胱氨酸的一对Fab’片段。
“中和抗体”表示能消除或明显降低与之结合的靶抗原的效应物功能的抗体分子。因此，“中和”抗-靶标抗体能消除或明显降低效应物功能，例如酶活性、配体结合或胞内信号转导。
本文提供的用于治疗癌症转移和/或癌症转移相关性骨丢失的组合物和方法可单用一种或多种抗体或可与其它治疗剂联用以实现所需作用。可从因接触环境抗原或用该抗原免疫接种而产生抗体的动物中分离本发明抗体。或者，可利用本领域熟知的抗体表达系统之一，通过重组DNA方法产生抗体(参见，例如Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988))。这些抗体可包括重组IgG、具有免疫球蛋白衍生序列的嵌合型融合蛋白或“Human EngineeredTM”抗体，根据本发明这些抗体均可用于治疗癌症转移和/或癌症转移相关性骨丢失。除了完整的全长分子外，术语“抗体”还指其片段(例如，scFv、Fv、Fd、Fab、Fab′和F(ab)′2片段)或能结合M-CSF(或M-CSFR)的完整分子和片段的多聚体或凝聚体。这些抗体片段能结合抗原，并可经衍生，例如通过掺入半乳糖残基而表现出促进清除和摄取的结构特征。
在本发明的一个实施方式中，可基本上如通过引用纳入本文的Halenbeck等，美国专利号5,491,065(1997)所述制备M-CSF单克隆抗体。示范性M-CSF单克隆抗体包括与重组或天然二聚M-CSF相关表观构型表位结合并伴有中和生物活性的那些抗体。这些抗体基本上不与生物学无活性形式的M-CSF，包括单体和化学衍生的二聚体M-CSF反应。
在本发明的其它实施方式中，提供了Human EngineeredTM抗-M-CSF单克隆抗体。短语“Human EngineeredTM抗体”指衍生自非人抗体，通常是小鼠单克隆抗体的抗体。或者，Human EngineeredTM抗体可衍生自保留或基本上保留了亲代非人抗体的抗原结合特性，但与亲代抗体相比，在给予人后显示免疫原性降低的嵌合抗体。本文所用的短语“嵌合抗体”指含有衍生自两种不同抗体的序列的抗体(参见，例如美国专利号4，816,567)，而所述两种抗体通常源自不同物种。最常见的嵌合抗体含有人和小鼠抗体片段，通常是人恒定区和小鼠可变区。
短语“互补决定区”或术语“CDR”指整体决定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列(参见，例如Chothia等，J.MoI.Biol.196：901917(1987)；Kabat等，美国卫生与人类服务部NIH出版号(U.S.Dept.of Health and Human Services NIH Publication No.)913242(1991))。短语“恒定区”指抗体分子中赋予效应物功能的部分。在本发明中，小鼠恒定区优选被人恒定区取代。所述抗体的恒定区衍生自人免疫球蛋白。重链恒定区可选自以下5种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。
如果本发明抗体与抗原结合的Ka大于或等于约106M-1、优选大于或等于约107M-1、更优选大于或等于约108M-1、最优选大于或等于约109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1，则称其具有免疫特异性或能特异性结合。抗-M-CSF抗体可结合M-CSF的不同天然形式，包括宿主/对象的组织表达以及肿瘤表达的。本文披露的单克隆抗体，例如RX1、5H4、MC1或MC3抗体对M-CSF具有亲和力，这些抗体的特征在于解离平衡常数(Kd)至少是10-4M、优选至少约10-7M至约10-8M、更优选至少约10-8M、10-10M、10-11M或10-12M。采用常规技术不难测定这种亲和力，例如通过平衡透析；采用生产商概述的通用方法，利用BIAcore 2000仪器；利用125I标记的M-CSF进行放射性免疫测定；或采用技术人员已知的另一种方法。可分析亲和力数据，例如通过Scatchard等，Ann N.Y.Acad.Sci.，51：660(1949)所述的方法。因此，优选的M-CSF抗体对M-CSF表现出的特异性程度明显高，而与其它分子结合的亲和力基本上较低。优选的抗体与M-CSF结合的亲和力类似于图4所示鼠科RX1与M-CSF结合的亲和力，表现出低免疫原性并在转移性疾病动物模型中测试时能抑制癌细胞转移。其它示范性抗体与M-CSF结合的亲和力类似于如图2、3或4分别所示的鼠科5H4、MC1或MC3与M-CSF结合的亲和力。
用于产生抗体的抗原可以是，例如保留所需表位的完整M-CSF或M-CSF片段(任选与另一多肽融合)，从而能以其天然构型展示该表位。或者，可利用在其表面表达M-CSF的细胞产生抗体。可转化这些细胞以表达M-CSF，或者这些细胞可以是表达M-CSF的其它天然细胞。本领域技术人员知道可用于产生抗体的M-CSF的其它形式。
i.多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而在动物种产生多克隆抗体。可利用双功能试剂或衍生化试剂(derivatizing agent)，例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimideester)(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其它试剂，将相关抗原与在待免疫动物中有免疫原性的蛋白质，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联来增强抗体应答。
通过混合，例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别对于家兔或小鼠)与3体积的完全弗氏佐剂并将该溶液经真皮内注射至多个部位，从而用抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物。一个月后，通过将1/5到1/10初始量的完全弗氏佐剂配制肽或偶联物皮下注射至多个部位来加强免疫动物。在加强注射后7-14天，采集动物血液，检验血清的抗体滴度。加强免疫动物直至滴度达到峰值。优选用抗原相同，但与不同蛋白质和/或经不同的交联剂偶联的偶联物加强免疫动物。还可在重组细胞培养液中将偶联物制备成融合蛋白。还可适当地用凝聚剂(aggregating agent)，例如明矾增强免疫应答。
ii.单克隆抗体
可采用最先由Kohler等(Nature，256：495(1975))描述的杂交瘤方法，或重组DNA法制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他合适宿主动物，如仓鼠或猕猴以引发淋巴细胞产生或能够产生特异性结合免疫接种所用蛋白质的抗体。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后用合适的融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，《单克隆抗体：原则和实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页(学术出版社(Academic Press)，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基上并使其生长，所述培养基优选含有一种或多种能抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质能阻止HGPRT-缺陷型细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些有效融合的、支持选出的抗体产生细胞以高水平稳定产生抗体的、并对培养基敏感的细胞。用人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人单克隆抗体也已见诸描述(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，《单克隆抗体的制造技术和应用》(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，第51-63页(纽约MD有限公司(Marcel Dekker，Inc.，New York)，1987))。示范性鼠科骨髓瘤系包括那些可获自美国加利福尼亚州圣迭戈市索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)的衍生自MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤的细胞系以及可获自美国马里兰州罗克维尔美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA)的SP-2或X63-Ag8-653细胞。
检验生长杂交瘤细胞的培养基产生针对抗原的单克隆抗体的情况。优选通过免疫沉淀反应或通过体外结合试验，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。例如，可通过Scatchard分析(Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980))来测定单克隆抗体的结合亲和力。
鉴定出能产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释法对克隆进行亚克隆并在通过标准方法培养(Goding，《单克隆抗体：原则和实践》，第59-103页(学术出版社，1986))。用于该目的的合适培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可将杂交瘤细胞作为腹水肿瘤在动物体内培养。亚克隆分泌的单克隆抗体适合通过诸如A蛋白-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等常规免疫球蛋白纯化方法从培养基、腹水液或血清中分离。
如果本发明抗体与抗原结合的Ka大于或等于约106M-1、优选大于或等于约107M-1、更优选大于或等于约108M-1、最优选大于或等于约109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1，则称其具有免疫特异性或能特异性结合。抗-M-CSF抗体可结合M-CSF的不同天然形式，包括宿主/对象的组织表达的以及肿瘤表达的。本文披露的单克隆抗体，例如RX1、5H4、MC1或MC3抗体对M-CSF具有亲和力，这些抗体的特征在于解离平衡常数(Kd)至少是10-4M、优选至少约10-7M至约10-8M、更优选至少约10-8M、10-10M、10-11M或10-12M。采用常规技术不难测定这种亲和力，例如通过平衡透析；采用生产商概述的通用方法，利用BIAcore 2000仪器；利用125I标记的M-CSF进行放射性免疫测定；或采用技术人员已知的另一种方法。可分析亲和力数据，例如通过Scatchard等，Ann N.Y.Acad.Sci.，51：660(1949)所述的方法。因此，优选的M-CSF抗体对M-CSF表现出的特异性程度明显高，而与其它分子结合的亲和力基本上较低。优选的抗体与M-CSF结合的亲和力类似于图1所示鼠科RX1与M-CSF结合的亲和力，表现出低免疫原性并在转移性疾病动物模型中测试时能抑制癌细胞转移。其它示范性抗体与M-CSF结合的亲和力类似于如图2、3或4分别所示的鼠科5H4、MC1或MC3与M-CSF结合的亲和力。
标题为“优选取代”的表1显示了保守性取代。如果这些取代导致生物学活性改变，则可将多个实质性改变(表1中称为“示范性取代”或以下参考文献中进一步描述的氨基酸类别)引入筛选的产物。
表1
初级示范性优选残基取代
Ala(A)val；leu；ile val Arg(R)lys；gln；asn lys
Asn(N)gln；his；asp，lys；gln arg Asp(D)glu；asn glu
Cys(C)ser；ala ser Gln(Q)asn；glu asn
Glu(E)asp；gln asp Gly(G)ala
His(H)asn；gln；lys；arg Ile(1)leu；val；met；ala；leu phe；正亮氨酸
Leu(L)正亮氨酸；ile；val；ile met；ala；phe
Lys(K)arg；gln；asn arg Met(M)leu；phe；ile leu
Phe(F)leu；val；ile；ala；tyr Pro(P)ala
Ser(S)thr Thr(T)ser ser
Trp(W)tyr；phe tyr Tyr(Y)trp；phe；thr；ser phe
Val(V)ile；leu；met；phe；leu ala；正亮氨酸
可通过选择在维持以下方面中的作用明显不同的取代来实现对抗体生物学特性的实质性修饰：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如片层或螺旋结构，(b)靶位分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共有侧链特性将天然残基分成几组：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；和
(6)芳族：trp、tyr、phe。
非保守性取代包括用另一类的成员替换这些类别中某一类的成员。
通常还可用丝氨酸取代不涉及维持人源化抗体或抗体变体的适当构型的任何半胱氨酸残基，从而改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可向抗体中加入半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是例如Fv片段等抗体片段时)。
B.M-CSF突变蛋白
本发明还提供可用作本发明方法的MCSF拮抗剂的M-CSF突变蛋白。
本文所用的“片段”表示完整的天然分子的一部分，例如片段多肽是其中N-末端或C-末端的一个或多个氨基酸被删除的天然多肽的片段。
就多肽而言，本文所用的“突变蛋白”表示完整的天然分子的变体或天然分子片段的变体，其中一个或多个氨基酸被取代、插入或删除。这种取代、插入或删除可以在分子的N-末端、C-末端或内部。因此，术语“突变蛋白”的范围包括天然分子的片段。插入型突变蛋白包括在N-或C-末端进行融合，例如与免疫球蛋白的Fc部分融合，从而能延长半衰期。
采用检索参数如下所示的仿射空位检索(gap search)，用MSPRCH程序(牛津分子公司(Oxford Molecular))执行史密斯-获特满(Smith-Waterman)同源性检索算法(Meth.MoI.Biol.70：173-187(1997))，测定到本发明的优选突变蛋白显示与天然多肽有至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高的序列相同性(同源性)：空位开放罚分12，空位延伸罚分1。其它熟知和常规使用的同源性/相同性扫描算法程序包括Pearson和Lipman，PNASUSA，85：2444-2448(19138)；Lipman和Pearson，Science，222：1435(1985)；Devereaux等，Nuc.Acids Res.，12：387-395(1984)；或Altschul等，Mol.Biol.，215：403-410(1990)的BLASTP、BLASTN或BLASTX算法。还可使用利用这些算法的计算机化程序，所述程序包括但不限于：GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，这些程序可购自美国威斯康星州麦迪逊市遗传学计算组(GCG)软件包，第八版(Genetics Computing Group(GCG)package，Version 8，Madison Wis.，USA)和加利福尼亚州芒廷维尤市智力遗传公司的PC/Gene程序中的CLUSTAL(CLUSTALPC/Gene program byIntellegenetics，Mountain View Calif)。最好通过这些程序利用默认参数测定序列相同性百分比。
本文所用的“修饰”表示天然多肽、片段或突变蛋白的任何修饰，例如糖基化、磷酸化、聚合物偶联(例如与聚乙二醇偶联)或加入其它外来部分，只要能保留所需活性(激动剂或拮抗剂)。
通过引用全文纳入本文的美国专利号6,025，16和Koths，Mol.Reprod.Dev.1997年1月；46(1)：31-38描述了M-CSF单独的结晶情况和M-CSF与M-CSFR形成复合物的结晶情况，并表征了M-CSF的三维结构以及参与受体结合的残基。美国专利号6，025,146还描述了根据结构信息，在M-CSF中选择候选氨基酸取代的方法。该形式的M-CSF的总拓扑学是反平行的四α-螺旋束，其中与大多数四螺旋束中更常见的上-下-上-下连接关系不同，这些螺旋是上-上-下-下。长的跨越连接将螺旋A与螺旋B相连，螺旋C与D之间也见到相似的连接。在二硫键连接的二聚体形式中，这些螺旋束尾对尾相连，形成极平的延伸结构(维数约85×35×25)。各单体中有三个分子内二硫键(Cys7-Cys90，Cys48-Cys139，Cys102-Cys146)，所有这些二硫键均在该分子的远端。一个链间二硫键(Cys31--Cys31)位于非结晶双面对称轴(noncrystallographic two-fold symmetry axis)穿过其中的二聚体界面，如图2所示。突变实验表明该形式M-CSF中所有半胱氨酸残基可能是完整的生物学活性所必需。本文所述的结构提示它们的作用主要是结构性的，而非与受体识别有关。美国专利号6,025,146提供了通过序列中氨基酸残基的α碳位置测定的截断重组M-CSFα二聚体的三维结构。
螺旋A、C和D中的特定残基看来涉及受体结合相互作用的特异性。由于M-CSFβ具有涉及半胱氨酸157和/或159的链内二硫键，M-CSF的C-末端区域可能从该结构的“尾部”延伸，从而提供膜连接形式M-CSF的长度可变的“系带”。因此，M-CSF的“前端”或受体结合区域位于这些分子的相对侧，由天然M-CSF的螺旋A、C和D中或附近的溶剂可接近残基(分别包括约6-27、71-90和110-130个残基)构成。通过定点诱变改变这些区域中的溶剂可接近残基以增强或降低侧链与受体的相互作用，从而可产生M-CSF激动剂或拮抗剂。根据三肽(trypeptide)gly-x-gly中可接近氨基酸的表面区域标准化(Kabsch，W.等，Biopolymers 22：2577(1983))，优选溶剂可接近表面区域大于约0.25，更优选大于约0.4的残基。优选不与蛋白质的其它部分，例如二聚体界面相互作用的残基，从而能维持单体的相对取向并避免干扰蛋白质折叠过程。其它任选的考虑是选择在人和不识别人M-CSF受体的小鼠M-CSF之间不保守的残基。优选用不保守的氨基酸取代候选氨基酸，从而能干扰氢键和/或与MCSF-R残基的疏水相互作用。例如，将一个或多个组氨酸改变成大小类似的非氢供体氨基酸可产生受体结合能力改变的M-CSF。用于取代的优选氨基酸包括但不限于：H15；Q79；R86；E115；E41；K93；D99；L55；S18；Q20；I75；V78；L85；D69；N70；H9；N63；和T34。据信，在受体信号转导中至关重要的M-CSF残基由M-CSF的不连续区域构成。为尽量降低给予M-CSF蛋白药物潜在的形成抗体可能性，优选尽可能维持溶剂可接近的亲代M-CSF残基(从而类似于天然分子)。
诱变N-末端/A螺旋区域中的氨基酸H15和H9获得生物学活性明显较低和MCSF-R结合能力明显较低的突变蛋白。这些结果表明受体结合亲和力降低导致生物学活性降低；因此，这些组氨酸氨基酸代表了对于M-CSF受体结合亲和力至关重要的接触，如果需要完整的受体结合能力则不应改动这些氨基酸。附近的残基，例如Y6和S13以及其它残基也代表了M-CSF受体接触残基。构建了M-CSF的双重突变体(Q20A、V78K)来检验溶剂可接近残基在螺旋A和C的中心部分中溶剂可接近残基的重要性。该双重突变蛋白的生物学活性略低(8-10倍)和相应的受体结合活性较低。残基Q17、R21、E15和E119的突变改变了感兴趣区域中溶剂可接近氨基酸的侧链特性，但未影响特定的生物学活性，提示无需改变这些残基来设计具有拮抗剂活性的突变蛋白。
在一个实施方式中，本发明包括其中参与受体结合的螺旋A和/或C和/或D的残基(例如，氨基酸6-26、71-90和/或110-130)发生非保守性突变的M-CSF突变蛋白的应用。这些突变蛋白优选与螺旋A、C或D中的天然序列维持至少65％、70％、75％、80％、85％或90％的相似性(即，相同或具有相似特性的氨基酸)，但与该多肽其余部分中天然序列的相似性更高，例如至少95％、98％或99％相似性。此外，支持受体结合位点的三维构型的残基可发生非保守性突变。
在另一实施方式中，M-CSF突变蛋白是单体形式的M-CSF。二聚体形式的M-CSF是生物学活性形式，单体形式的M-CSF通常无活性。单体的二硫键看来经Cys31-Cys31链间连接键产生。因此，估计单体形式的M-CSF适合用作拮抗剂。这些形式包括Cys31和/或其它半胱氨酸的半胱氨酸缺失和/或半胱氨酸取代(例如，半胱氨酸至丙氨酸取代)的突变蛋白，或一个或多个半胱氨酸，特别是Cys31经化学修饰而不能形成二硫键的突变蛋白。
在还有另一实施方式中，M-CSF突变蛋白单独包含螺旋A、C或D中的一个或多个，或其参与受体结合的各部分，或与其它多肽融合，从而能以合适的三维构型展示这些片段。
采用本领域熟知的技术不难制备含有任何所需保守性和/或非保守性突变蛋白的突变蛋白，包括重组产生或化学合成。
预计保守性取代，特别是直接参与配体-受体结合的区域外的取代不会显著改变M-CSF突变蛋白(或M-CSFR突变蛋白)的结合特性。可根据物理特性以及对二级和三级蛋白质结构的贡献分类氨基酸。本领域将用特性类似的另一种氨基酸取代某种氨基酸视作保守性取代。示范性保守性取代见下表2(WO97/09433，第10页，1997年3月13日公布(PCT/GB96/02197，1996年9月6日提交)。
表2
保守性取代I
侧链
特征 氨基酸
脂族
非极性 G A P I L V
极性-不带电荷 C S T M N Q
极性-带电荷 D E K R
芳族 H F W Y
其它 N Q D E
或者，可如Lehninger(《生物化学》(Biochemistry)，第二版；沃斯出版公司(Worth Publishers，Inc.)，纽约：纽约州(1975)，第71-77页)所述分组保守性氨基酸，如下表3所示。
表3
保守性取代II
侧链
特征 氨基酸
非极性(疏水性)
A.脂族： A L I V P
B.芳族： F W
C.含硫： M
D.临界(Borderline)： G
不带电荷-极性
A.羟基： S T Y
B.酰胺： N Q
C.巯基 C
D.临界 G
带正电荷(碱性)： K R H
带负电荷(酸性)： D E
再或者，示范性的保守性取代如下表4所示。
表4
保守性取代III
原始残基 示范性取代
Ala(A) VaI、Leu、Ile
Arg(R) Lys、Gln、Asn
Asn(N) Gln、His、Lys、Arg
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
His(H) Asn、Gln、Lys、Arg
Ile(I) Leu、Val、Met、Ala、Phe
Leu(L) Ile、Val、Met、Ala、Phe
Lys(K) Arg、Gln、Asn
Met(M) Leu、Phe、Ile
Phe(F) Leu、Val、Ile、Ala
Pro(P) Gly
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp、Phe、Thr、Ser
Val(V) Ile、Leu、Met、Phe、Ala
编码M-CSF的DNA序列可用于各种表达系统以产生所需多肽。可通过本领域熟知的方法构建表达载体并从合适的DNA序列产生重组体。通常按照通过引用纳入本文的以下文献实施这些技术和各种其它技术：Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港，纽约(1989)；和Kriegier，M.，《基因转移和表达，实验室手册》(Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)，斯托克顿出版社(Stockton Press)，纽约(1990)。
可按照熟知的重组DNA技术删除、添加或改变DNA序列编码的氨基酸而不破坏所需结构(例如，M-CSF的受体结合能力)，来对M-CSF一级序列作出某些修饰。此外，技术人员可知道可通过氧化、还原或其它修饰方法取代或修饰单个氨基酸，可切割多肽以获得保留活性结合位点和结构信息的片段。这种取代和改变获得的多肽所具有的氨基酸序列属于“具有与成熟M-CSFα(SEQID ND：7)、M-CSFβ(SEQ ID NO：8)和M-CSFγ(SEQ ID NO：9)多肽基本上相同氨基酸序列”的多肽的定义。
可通过本领域已知的化学合成或重组技术成熟多肽。
还可通过蛋白质的编码核酸的关联性表征蛋白质的关联性。测定多核苷酸序列的相同性和/或相似性的方法如上所述。此外，可如下所示实施通过检验多核苷酸序列在中等或高严格性条件下杂交的能力来测定它们相似性的方法。示范性中等严格性杂交条件如下所示：42℃，在含有50％甲酰胺、1％SDS、1MNaCl、10％硫酸葡聚糖的溶液中杂交，在60℃用含有0.1×SSX和1％SDS的洗涤溶液洗涤30分钟。高度严格性条件包括在68℃用含有0.1×SSX和1％SDS的溶液洗涤。本领域知道可通过改变温度和缓冲液护盐浓度获得等效严格性的条件，如本领域所述(Ausubel等(编)，《分子生物学方案》(Protocols inMolecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley & Sons)(1994)，第6.0.3-6.4.10页)。可通过探针的鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的长度和百分比而精确计算或凭经验确定杂交条件中的变化。可如Sambrook等(编)(《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约(1989)，第9.47-9.51页)所述计算杂交条件。
C.可溶性M-CSFR
本发明的示范性M-CSFR片段可包含一个或多个，或两个或更多个参与M-CSF/受体结合的结构域(据信是结构域1、2和3)。优选的M-CSFR片段包含M-CSFR的结构域1、2和3中的所有三个。还考虑了对M-CSFR的这些片段或整个胞外结构域的其它突变和/或修饰，可如上文M-CSF突变蛋白章节所述产生其它突变和/或修饰。
M-CSFR(SEQ ID NO：84和85)是具有5个胞外免疫球蛋白样结构域(其中据信结构域1-3参与配体-受体结合)、1个跨膜结构域和1个胞内间断Src相关酪氨酸激酶结构域的跨膜分子。参考SEQ ID NO：85，上述结构域的位置如下所示：Ig结构域1：氨基酸27-102；Ig结构域2：氨基酸112-196；Ig结构域3：氨基酸215-285；Ig结构域4：氨基酸308-399；Ig结构域5：氨基酸410-492；跨膜结构域：氨基酸515-537；和激酶结构域：氨基酸582-910。“典型的”免疫球蛋白样结构域含有通常由各环端部的半胱氨酸之间的二硫键锚定的环结构。在M-CSFR中，形成Ig样环的这些半胱氨酸位于以下氨基酸位置：结构域1：42、84；结构域2：127、177；结构域3：224、278；结构域4：不涉及半胱氨酸；结构域5：419、485。
可利用保留了抗原性的M-CSFR的完整胞外部分或其任何片段，例如一个或多个Ig-样环来产生能与天然受体结合的抗体。可如上文M-CSF的抗体所述制备多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和它们的抗原结合片段。可采用本文中标题为“筛选方法”的章节所述试验或采用本领域已知的合适试验筛选抗体产物作为MCSF拮抗剂的活性以及是否适合于本发明治疗方法。
受体的胞外结构域内的一个或多个上述Ig-样环可能足以抑制M-CSF和M-CSFR之间的相互作用。因此，采用本领域熟知的重组或化学合成方法不难制备M-CSFR及其突变蛋白的胞外结构域的片段。可采用本文中标题为“筛选方法”的章节所述试验或采用本领域已知的合适试验筛选这些产物作为MCSF拮抗剂的活性以及是否适合于本发明治疗方法。
D.基因治疗
采用本领域已知的合适方法，包括采用物理DNA转移方法(例如，脂质体或化学处理)或利用病毒载体(例如，腺病毒、腺伴随病毒或逆转录病毒)，通过离体、原位或体内基因治疗可实现将治疗性蛋白质递送给合适的细胞。本发明还提供了反义化合物和利用它们的方法。采用熟知的反义、基因“敲除”、核酶、三螺旋或RNAi方法来降低基因表达水平，从而能降低M-CSF或M-CSFR的活性水平。本领域技术人员熟知产生和利用这些分子的技术。
本文所用的术语“肽模拟物(peptidomimetic)”是包含氨基酸侧链装配体、或药效团或其合适衍生物的非肽化合物，这些部分由支架所支持从而使得药效团的空间取向基本上能模拟天然肽的生物学活性构型。例如，肽模拟物可缺乏氨基酸或肽键，但保留了结合活性所需亲代肽的肽链基团的特定三维排列。支架可包含双环、三环或更高级的多环碳或杂原子骨架，或可依据一个或多个环结构(例如，吡啶、吲唑等)或酰胺键。该支架可通过间隔臂在一端与酸性基团(例如羧酸官能团)相连，而在核心的另一端与碱性基团(例如含-N部分，例如脒或胍)相连。2003年10月23日公布的美国专利号申请号20030199531、2004年7月24日公布的美国专利号申请号20030139348描述了合成肽模拟物的示范性技术。
除了抗体和其它蛋白质外，本发明还包括其它M-CSF拮抗剂，包括但不限于也能有效抑制M-CSF和M-CSFR之间相互作用或M-CSFR活化的肽或较小的有机分子。
II.组合治疗
共同给予本发明的两种治疗剂，例如M-CSF拮抗剂和第二抗-破骨细胞剂不需要同时或经由相同途径给予这些药剂，只要这些药剂发挥其治疗效果的时期有重叠即可。包括同时或依次给药，也可在不同天或不同周给药。
发现在用M-CSF抗体(示范性M-CSF拮抗剂)开始治疗后观察到疗效有明显滞后对于在该过渡期共同给予第二抗-破骨细胞剂的更快起作用是理想的。在过渡期，两种药剂必须以单一治疗有效量给予。过渡期后，可停止第二抗-破骨细胞剂，或降低其剂量。如果M-CSF拮抗剂和第二抗-破骨细胞剂施加协同作用，可在过渡期后降低一种或二者的剂量。
将用量足以预防下述疾病发展或使之部分停滞的本发明组合物给予早已患有，或易患溶骨性疾病，包括癌症转移和/或癌症转移相关性骨丢失或其它骨丢失相关疾病，例如骨质疏松症的哺乳动物。单独给予(不与第二治疗剂联用)某治疗剂时足以实现该目的的治疗剂用量称为“单一治疗有效剂量”。
在本发明的组合治疗方法中，可依次或在不同时间给予M-CSF拮抗剂，例如M-CSF抗体和第二抗-破骨细胞剂。所述两种药剂彼此可以在，例如8小时、1天、14天、30天、3个月、6个月、9个月或1年内给予。
示范性第二抗-破骨细胞剂包括二膦酸盐，包括但不限于：唑来膦酸盐、帕米膦酸盐、氯屈膦酸盐、羟乙磷酸盐、替鲁膦酸、阿伦膦酸盐、伊班膦酸盐或利塞膦酸盐。示范性的其它抗-破骨细胞剂包括二膦酸盐、PTHrP中和剂(例如，抗体、反义、siRNA)、组织蛋白酶K抑制剂、MIP-1-α拮抗剂、RANK/RANKL中和剂(例如，抗-RANK抗体，如Amg-162，或反义、可溶性RANKL受体或其突变蛋白)、RANKL疫苗、骨保护素(OPG)、血小板衍生生长因子(PDGF)、src激酶抑制剂、麦芽糖镓和基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。
二膦酸盐的示范性剂量包括静脉内给予4mg。还可给予较低的剂量，包括3.5mg、3.3mg或3.0mg。其它给药途径也是可能的，包括皮下和WO明02/087555所述的。M-CSF的有效量可以不同，取决于所治疗疾病的严重程度以及患者的体重和总体状况，但其范围通常是每次应用约1.0mg/kg至约100mg/kg体重，或约10mg/kg至约30mg/kg，更常用的剂量为约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约10mg/kg。例如，约10μg/kg-5mg/kg或约30Mg/kg-1mg/kg的抗体是给予患者的初始候选剂量，而无论，例如通过一次或多次单独给药或通过连续输注。根据对疾病的反应和患者对治疗的耐受，可视需要以每日一次、隔天一次或每周一次或以更低的频率给药。可能需要在较长的时期，例如4、5、6、7、8、10或12周或更长的时期内维持剂量，直至疾病症状得到理想的抑制，可视需要调整剂量。通过常规技术和试验不难监测该治疗的进程。
虽然本发明方法可用于癌症的所有阶段，但特别适用于晚期或转移癌症。对于未接受过化疗治疗的患者，优选组合采用化疗或放疗方案的治疗方法，而对于接受过一种或多种化疗的患者可用本发明治疗方法治疗。此外，本发明治疗方法还能利用剂量较低的同期化疗(concomitant chemotherapy)，特别是对于极不耐受化疗剂毒性的患者。
本发明方法包括给予一种抗-M-CSF抗体以及不同抗体的组合或“混合物”。这种抗体混合物具有某些优点是因为它们包含利用不同效应物机制的抗体或直接组合了细胞毒性抗体与依赖于免疫效应物功能的抗体。联用这些抗体能表现出协同疗效。
本发明方法可与另一种治疗，例如癌症治疗联用。示范性的癌症治疗剂和/或方法包括但不限于：各种化疗剂、雄激素阻断剂和免疫调节剂(例如，IL-2、GM-CSF、SLC)、二膦酸盐，(例如，阿可达(Aredia)(即，帕米膦酸盐、帕米膦酸、帕米膦酸二钠、帕米膦酸二钠五水合物)；佐美塔(即，骨力强(Aclasta)、唑来膦酸、唑来膦酸盐)；氯屈膦酸盐(即，骨膦、洛龙(Loron)、氯屈膦酸二钠、氯屈膦酸钠)；福善美(Fosamax)(即，阿伦膦酸盐、阿伦膦酸钠盐三水合物、阿伦膦酸)；福善文(Fosavance)(即，用维生素D配制的福善美)；骨得宁(Bondronat)或邦维尔(Bonviva)或邦维(Boniva)(即，伊班膦酸盐、伊班膦酸、伊班膦酸钠)；阿克托耐尔(Actonel)(即，利塞膦酸盐、利塞膦酸钠、利塞膦酸)；迪多奈尔(Didronel)或迪多卡尔(Didrocal)(即，依替膦酸盐、依替膦酸、依替膦酸二钠)；奈里克希尔(Nerixia)(即，奈立膦酸盐、奈立膦酸)；替鲁膦酸钠片(Skelid)(即，替鲁膦酸盐、替鲁膦酸)；二甲基-APD(即，奥帕膦酸盐、奥帕膦酸)；和亚甲磷酸(medronic acid)或亚甲磷酸盐(medronate))、外科手术、放疗、细胞毒性化疗、激素疗法(例如，他莫昔芬；抗-雄激素治疗)、抗体治疗(例如，KANKL/RANK中和性、PTHrP中和性、抗-Her2、抗-CD20、抗-CD40、CD22、VEGF、IGFR-1、EphA2、IIAAH、TMEFF2、CalX的抗体)、治疗性蛋白质治疗(例如，可溶性RANKL受体、OPG和PDGF及MMP抑制剂)、小分子药物治疗(例如，Src-激酶抑制剂)、生长因子受体的激酶抑制剂、RANKL抑制剂、寡核苷酸治疗(例如，RANKL或RANK或PTHrP反义)、基因治疗(例如，RANKL或RANK抑制剂，如抗RANKL抗体)、肽治疗(例如，RANKL的突变蛋白)以及本文所述的那些蛋白、肽、化合物和小分子。
癌症化疗剂包括但不限于：烷化剂，例如碳铂或顺铂；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷化剂，例如卡莫司汀(BCNU)；抗代谢物，例如氨甲蝶呤；亚叶酸；嘌呤类似物抗代谢物、巯基嘌呤；嘧啶类似物抗代谢物，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨(Gemzar
)；激索抗瘤剂，例如戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗瘤剂，例如阿地白介素、白介素-2、多西它赛(docetaxel)、依托泊苷(VP-16)、干扰素α、紫杉醇(Taxol)和维甲酸(ATRA)；抗生素性天然抗瘤剂，例如博莱霉素、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、道诺霉素和丝裂霉素；和长春花生物碱天然抗瘤剂，例如长春花碱、长春新碱、长春地辛；羟基脲；乙酰葡醛酸内酯、阿霉素、异磷酰胺、依诺他滨、表硫雄醇、阿柔比星、安西他滨、尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、卡波醌、碳铂、卡莫氟、色霉素A3、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺(Cytoxirr)、裂殖菌多糖、阿糖胞苷(阿拉伯糖胞苷)、达卡巴嗪、硫代肌苷、塞替派、替加氟、多拉司他汀、多拉司他汀类似物，例如奥里斯他汀(auristatin)、CPT-11(依立替康)、米托蒽醌、长春瑞滨、替尼泊苷、氨基蝶呤、洋红霉素、埃斯泊拉米星(esperamicin)(参见，例如美国专利号4,675,187)、新制癌菌素、OK-432、博莱霉素、氟铁龙、溴尿苷、白消安、二磷酸己烯雌酚四钠、培洛霉素、贝他定(Ubenimex)、干扰素-β、美雄烷、二溴甘露醇、美法兰、层粘连蛋白肽、磨茹多糖、杂色革盖菌提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(雌激素/氮芥)。
此外，用作癌症患者治疗剂的其它药剂包括：EPO；G-CSF；更昔洛韦；抗生素；醋酸亮丙瑞林；哌替啶；齐多夫定(AZT)；白介素1-18，包括突变体和类似物；干扰素或细胞因子，例如干扰素α、β和γ；激素，例如促黄体激素释放激素(LHRH)和类似物及促性腺激素释放激素(GnRH)；生长因子，例如转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子-α和β(TNF-α和β)；侵袭抑制因子-2(IIF-2)；骨形成蛋白1-7(BMP1-7)；生长激素抑制素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；补体因子；抗血管生成因子；抗原性物质；和前药。
前药指药学活性物质的前体或衍生形式，与亲代药物相比，其对肿瘤细胞的细胞毒性较低或无细胞毒性，但能经酶活化或转化成活性或更具活性的亲代形式。参见，例如Wilman，“癌症化疗中的前药”(Prodrugs in CancerChemotherapy)，《生物化学协会论文集》(Biochemical Society Transactions)，14，第375-382页，第615届贝尔法斯特大会(615th Meeting Belfast)(1986)和Stella等，“前药：靶向药物递送的化学方案”(Prodrugs：A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery)，《定向药物递送》(Directed DrugDelivery)，Borchardt等编，第247-267页，人类出版社(Humana Press)(1985)。前药包括但不限于：含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含β-内酰胺的前药、任选取代的含苯氧基乙酰胺前药或任选亲代的含苯基乙酰胺前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶，这些前药可转化成更具活性的细胞毒性游离药物。可衍生成本文所用前药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于：上述那些化疗剂。
III.给药和制备
M-CSF拮抗剂的有效量可以不同，取决于所治疗疾病的严重程度以及患者的体重和总体状况，但其范围通常是每次应用约1.0μg/kg至约100mg/kg体重，更常用的剂量为约10μg/kg至约10mg/kg。可通过本领域熟知的标准经验方法测定本发明组合物的有效量。例如，可如Cenci等，J Clin.Invest.1055：1279-87，2000所述，采用能体外测定血清阻断M-CSF诱导鼠科单核细胞(CD11b+细胞，CD11细胞的亚组，表达高水平的M-CSF受体)增殖和存活的能力的试验来评估用给定剂量的M-CSF拮抗剂治疗对象的血清体内中和活性。
根据对疾病的反应和患者对治疗的耐受，可视需要以每日一次、每两天一次、每三天一次、每周两次、每周一次或以更低的频率给药。可能需要在较长的时期内维持剂量，可视需要调整剂量。
可采用主治医师选择的剂量水平和模式一次或多次给予这些组合物。
可将用于实施本发明方法的M-CSF拮抗剂，包括抗-M-CSF抗体配制成含有适合所需递送方法的载体的药物组合物。合适的载体包括当与M-CSF拮抗剂混合时能维持该拮抗剂的抗肿瘤功能且不与对象的免疫系统发生反应的任何材料。例子包括，但不限于，任何标准药物载体，如无菌磷酸缓冲盐溶液、抑菌水，等等。可采用各种水性载体，如水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，并可包含其它蛋白质以增强稳定性(如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)、进行温和化学修饰，等等。
将具有所需纯度的拮抗剂与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol，A.编(1980))混合可制备用于储存的拮抗剂治疗制剂，所述制剂的形式可以是冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对受者无毒，包括缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苯索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯类如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文的制剂还可包含所治疗的特定适应症所需的一种以上活性化合物，优选具有不会彼此不利地影响的互补活性的那些化合物。例如，优选还提供免疫抑制剂。这些分子的合适混合量应对所需目的有效。
还可将活性成分截留在，例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，还可截留在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂(macroemulsion)中。《雷明顿药物科学》(第16版，Osol，A.编(1980))披露了这些技术。
体内给药的制剂必须无菌。利用除菌滤膜进行过滤不难做到这点。
可通过任何合适的方式给予拮抗剂，，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，通过需要还可以是局部治疗、伤口内给药。胃肠外输注包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、真皮内或皮下给药。此外，拮抗剂适合通过脉冲输注给予，特别是给予剂量递减的拮抗剂。优选通过注射给予给药剂量，最优选静脉内或皮下注射，这部分取决于给药是简短的还是延续性的。还包括其它给药方法，包括局部，特别是透皮、经粘膜、直肠、口服或局部给药，例如通过放置在接近所需部位的导管。
本发明组合物的形式可以是，例如粒剂、粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射液、乳剂、酏剂、悬液或溶液。可为各种给药途径，例如口服给药、鼻部给药、直肠给药、皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射或腹膜内注射配制即时组合物。
可注射剂型通常包括利用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂制备的水性悬液或油性悬液。可注射形式可以是用溶剂或稀释剂制备的溶液相或悬液形式。可接受的溶剂或载体包括无菌水、林格液或等渗盐水溶液。或者，无菌的油可用作溶剂或悬浮剂。油或脂肪酸优选无挥发性，包括天然或合成的油、脂肪酸、甘油一酯、二酯或三酯。
对于注射，药物制剂和/或药物可以是适合用上述合适溶剂重建的粉末。这些粉末的例子包括但不限于：冻干的、旋转干燥的或喷雾干燥的粉末、稳定性粉末、粒剂、沉淀物或颗粒。对于注射，制剂可任选含有稳定剂、pH修饰剂、表面活性剂、生物利用度稀释剂和这些试剂的组合。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质采取成形物品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然共聚物，如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能在100天期间释放分子，但某些水凝胶能在较短的时期内释放蛋白质。当包裹化的拮抗剂在体内长期维持时，它们会因在37℃接触水分而变性或凝聚，从而丧失生物学活性并可能改变免疫原性。可根据所涉及的机制来设计合理的稳定方案。例如，如果发现凝聚机制是通过巯基-二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、用酸性溶液冻干、控制水分含量、利用合适的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物以实现稳定。
可将本发明制剂设计成本文所述的短效、快速释放、长效或缓释(制剂)。因此，还可将药物制剂配制成控释或缓释。
本组合物还可包含，例如胶束或脂质体，或者一些其它包裹形式，或可以延长释放的形式给予以提供长期保存和/或递送效果。因此，可将药物制剂和药物压制成丸状或圆柱形，并通过肌肉内或皮下植入作为长效注射剂或植入物，例如支架。这些植入物可利用已知的惰性物质，例如硅酮和生物可降解的聚合物。
除了上述那些代表性剂型，本领域技术人员通常知道药学上可接受的赋形剂和载体，因此本发明包括这些赋形剂和载体。通过引用纳入本文的《雷明顿药物科学》(Remingtons Pharmaceutical Sciences)，马克出版社(Mack Pub.Co.)，新泽西州，(1991)描述了这些赋形剂和载体。
可根据疾病的情况、对象的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、剂量间隔、给药途径、分泌率和药物组合调整具体的剂量。常规实验即可确定含有有效量的任何上述剂型，因此这些剂型当然属于本发明的范围。
可用作本发明治疗剂的M-CSF拮抗剂或抗体常制备成基本上不含其它天然产生的免疫球蛋白或其它生物学分子。给予患或易患溶骨性疾病，包括癌症转移和/或癌症转移相关性骨丢失的哺乳动物后，优选的M-CSF拮抗剂还表现出极低的毒性。
可通过常规、熟知的灭菌技术使本发明组合物灭菌。可将得到的溶液包装待用，或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制品先与无菌溶液混合再施用。如果需要，这些组合物可含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和稳定剂(例如，1 20％麦芽糖，等)。
还可经由脂质体给予本发明M-CSF拮抗剂，所述脂质体是由各类脂质和/或磷脂和/或表面活性剂构成、用于递送药物(例如，本文披露的拮抗剂和任选的化疗剂)的小囊泡。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不可溶单层、磷脂分散体、层状片层(lamellar layer)等，脂质体可用作载体以将M-CSF拮抗剂靶向具体组织并延长组合物的半衰期。如美国专利号4,837,028和5,019,369所述，可采用各种方法制备脂质体，该两篇专利通过运用纳入本文。
可通过本领域已知，例如Epstein等，Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；和美国专利号4,485,045及4,544,545所述的方法制备含拮抗剂的脂质体。美国专利号5,013,556披露了循环时间增加的脂质体。通过反相蒸发方法，用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG_PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。利用孔径确定的滤膜挤出脂质体从而产生具有所需直径的脂质体。可如Martin等(J.Biol.Chem.257：286-288(1982))所述，通过二硫键互换反应将本发明M-CSF抗体的Fab’片段偶联于脂质体。脂质体内任选含有化疗剂(例如阿霉素)[参见，例如Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)]。
这些组合物中M-CSF拮抗剂的浓度变化很大，即以重量计，从低于约10％，通常是至少约25％到最高75％或90％，并且可按照所选择的具体给药方式基本上根据流体体积、粘度等作出选择。本领域技术人员已知或明白制备可口服、局部和胃肠外给予的组合物的实际方法，其细节描述于，例如《雷明顿药物科学》，第19版，马克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼州(1995)，该份文献通过引用纳入本文。
可通过本领域熟知的标准经验方法测定本发明组合物的有效量。例如，可如Cenci等(J Clin.Invest.1055：1279-87，2000)所述，采用体外测定血清阻断M-CSF诱导鼠科单核细胞(CD11b+细胞，CD11细胞的亚组，其表达高水平的M-CSF受体)增殖和存活的能力的试验来评估用给定剂量M-CSF拮抗剂治疗对象的血清的体内中和活性。
可将本发明组合物给予早已患有或易患溶骨性疾病，包括癌症转移和/或癌症转移相关性骨丢失的哺乳动物，其用量足以防止这种疾病的发展或使其至少部分停滞。M-CSF拮抗剂的有效量可以根据疾病的严重程度和所治疗患者的体重及总体状况而不同，但其范围通常是每次施用约1.0mg/kg至约100mg/kg体重，或约10mg/kg至约90mg/kg，剂量约20mg/kg至约80mg/kg或约30mg/kg至约70mg/kg或约40mg/kg至约60mg/kg。例如，约10mg/kg-50mg/kg或约20mg/kg-60mg/kg的抗-MCSF抗体是给予患者的初始候选剂量，而无论，例如通过一次或多次单独给药或通过连续输注。根据对疾病的反应和患者对治疗的耐受，可视需要以每日一次、隔天一次或每周一次或以更低的频率给药。可能需要在较长的时期，例如4、5、6、7、8、10或12周或更长的时期内维持剂量，直至疾病症状得到理想的抑制，可视需要调整剂量。通过常规技术和试验不难监测该治疗的进程。
可根据治疗医师选择的剂量水平和模式一次或多次给予组合物。如上所述，对于预防或治疗疾病，M-CSF拮抗剂，包括抗-M-CSF抗体的合适剂量取决于待治疗疾病的类型，疾病的严重程度和进程，给予拮抗剂是预防目的还是治疗目的，以前的治疗，患者的临床史和对拮抗剂的反应以及主治医师的判断。可一次或在一系列治疗期间将拮抗剂适当地给予患者。
拮抗剂组合物的配制、给药和施用方式应与优质医学规范(goodmedical practice)一致。在这点应考虑的因素包括所治疗的具体疾病、所治疗的具体哺乳动物、各患者的临床状况、疾病的诱因、药物的递送部位、给药方法、给药时间表和医师已知的其它因素。所给予的拮抗剂的治疗有效量取决于这些因素，并且是预防、改善或治疗M-CSF介导疾病、病情或病症，特别是治疗癌细胞，尤其是治疗肿瘤细胞转移的尽可能低的用量。这种用量优选低于对宿主有毒或使得宿主对感染明显更敏感的用量。
在本发明的另一实施方式中，提供了含有用于治疗上述疾病、病症或病情的物质的制品。该制品装有容器和标签。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器和试管。可用各种材料，例如玻璃或塑料制成这些容器。这些容器装有能有效治疗所述疾病的组合物，还可装有无菌存取口(例如，所述容器可以是静脉内乳液袋或具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性物质是本发明的M-CSF拮抗剂或抗体。容器上或与之相关的标签表明组合物用于治疗选择的疾病。该制品还可装有第二容器，该第二容器装有药学上可接受的缓冲剂，例如磷酸缓冲盐水、林格液和葡萄糖溶液。从商品化和用户的角度出发，还可装有其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和使用说明的包装插页。
以下实施例描述了本发明，但这些实施例并非以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1
本实施例在动物模型中建立了佐美塔(唑来膦酸盐)的剂量依赖性抗-吸收作用(图14)。用≥0.03mg/kg佐美塔治疗抑制了骨部位处肿瘤细胞生长所致的溶骨性损伤。此外，当用浓度渐增的佐美塔治疗小鼠时观察到剂量应答作用。抗-小鼠和抗-人M-CSF mAb 5A1和5H4组合也能保护免遭骨损伤。在治疗严重的溶骨性损伤时单用M-CSF抗体比0.03m/kg佐美塔更有效。研究最后一天基于x-射线图像的骨质溶解评分为(图14)：
0＝正常；
1＝可疑或最小病损，皮层结构正常；
2＝明确的溶解病损，少量皮层/结构破坏；
3＝大的病损，皮质/结构破坏；
4＝全面破坏，无结构保留
由此初步研究，可利用0.03mg/kg亚有效剂量的佐美塔进行组合研究。胫骨内接种6×105MDA-MB-231Luc细胞两周后，用5A1/5H4(10mg/kg，每周一次)、佐美塔(0.03mg/kg，每周两次)或同时用抗体和二膦酸盐治疗Nu/Nu小鼠。通过Faxitron分析(x-射线技术)每周监测骨病损，该项研究结束时所有小鼠进行最终x-射线(分析)，收集图像并分配来对病损严重程度进行评分。分析结果显示抗-MCSF mAb和佐美塔均能有效治疗骨质溶解，但与单用任一种相比，佐美塔和M-CSF mAb组合治疗对骨溶解发生率(图15)和程度(图16)的抑制程度更大。
图16显示用0.03mg/kg佐美塔或10mg/kg抗-MCSF抗体(5A1+5H4)治疗抑制骨部位处肿瘤生长所致的溶骨性损伤。佐美塔加抗-MCSF抗体的组合方案还抑制了骨溶解。可从1)三位独立的志愿者评分的平均分和2)组平均值(最初10只动物/组)计算平均骨质溶解评分。
研究最后一天基于x-射线图像的骨质溶解评分为：
0＝正常；
1＝可疑或最小病损，皮层结构正常；
2＝明确的溶解病损，少量皮层/结构破坏；
3＝大的病损，皮质/结构破坏；
4＝全面破坏，无结构保留
检查代表性Faxitron图像进一步证明与佐美塔和抗-MCSF抗体治疗动物中病损较少相比，未治疗动物中的病损严重(图17)。组合治疗组中未观察到不利的相互作用。
总之，抗-MCSF抗体和佐美塔均能有效抑制骨质溶解，与单用每种疗法相比，联用该两种疗法能增强抗-吸收作用这提示组合疗法可能是二膦酸盐不耐受或早已用二膦酸盐治疗过的骨疾病患者的有效选择。
实施例2
本实施例显示抑制M-CSF活性对分化破骨细胞活性没有作用(图18)。用人源化Chir-RX1和佐美塔测试M-CSF-中和抗体和二膦酸盐对分化破骨细胞活性的作用。
在本文所述实验条件下将人骨髓CD34+细胞(拜尔怀泰克公司(Biowhittaker)，目录号2M-101A，3×105个细胞/小瓶)诱导分化成破骨细胞。第1天，将1个冷冻小瓶的CD34+细胞融化后加入10ml培养基中(AlphaMEM，含10％ FCS、1×青霉素链霉素(Pen Strep)和1×两性霉素B)。将细胞洗涤一次，重悬于2ml培养基并以100ul/孔接种于OsteoLyse平板(OsteoLyseTM试验试剂盒(人胶原公司(Human Collagen))，坎布莱克斯(Cambrex))。
在第2天，在无需除去原始培养基的条件下，向各孔中加入50ul 4×CSF-1至终浓度为30ng/ml，和4×RANKL(sRANKL，开米康公司(Chemicon)，目录号GF091，10ug/包)至终浓度为100ng/ml。在第7天，向各孔中加入50ul 5×RANKL至终浓度为100ng/ml。
在第15天，加入所示浓度的抗体(Chir-RX1或对照抗体)或佐美塔。在第17天，取样10ul细胞培养液的上清液，在黑色96-孔板(装在OsteoLyse试验试剂盒中)的各孔中与200μl荧光团释放试剂(Fluorophore ReleasingReagent)混合。
实施例3
本实施例显示佐美塔以剂量依赖性方式抑制分化破骨细胞活性(图19)。用人源化Chir-RX1和佐美塔测试M-CSF-中和抗体和二膦酸盐对分化破骨细胞活性的作用。
在本文所述实验条件下将人骨髓CD34+细胞(拜尔怀泰克公司，目录号23M-101A，3×105个细胞/小瓶)诱导分化成破骨细胞。第1天，将1个冷冻小瓶的CD34+细胞融化后加入10ml培养基中(Alpha MEM，含10％ FCS、1×青霉素链霉素和1×两性霉素B)。将细胞洗涤一次，重悬于2ml培养基中并以100ul/孔接种于OsteoLyse平板(OsteoLyseTM试验试剂盒(人胶原公司)，坎布莱克斯)上。
在第2天，在无需除去原始培养基的条件下，向各孔中加入50ul 4×CSF-1至终浓度为30ng/ml，和4×RANKL(sRANKL，开米康公司，目录号GF091，10ug/包)至终浓度为100ng/ml。在第7天，向各孔中加入50ul 5×RANKL至终浓度为100ng/ml。
在第15天，加入所示浓度的抗体(Chir-RX1或对照抗体)或佐美塔。在第17天，取样10ul细胞培养液的上清液，在黑色96-孔板(装在OsteoLyse试验试剂盒中)的各孔中与200μl荧光团释放试剂混合。
实施例4
本实施例显示利用RX1在灵长类动物中进行药代动力学和药效学研究的结果(图20和图21)。
本项研究的目的是研究人源化抗-人M-CSF抗体heRX1-10.G1在给予短尾猴(cynomolgus monkey)时的药效学和药代动力学，所述抗体作为单次缓慢推注静脉内注射(第1天，组2和组3)给予，然后是13-周观察期，或作为多次剂量(第1、43、50和57天，组1)给予，然后是10-周观察期。经臂静脉或隐静脉通过缓慢推注静脉内(IV)注射给予人源化抗-M-CSF IgG1单克隆抗体。
使用动物是新药安全性评价全球管理机构所要求的。抗体在啮齿类动物中没有交叉反应，但在短尾猴中已显示有活性。因此生物学家选择短尾猴作为静脉内注射研究的可接受的非啮齿类动物。
将动物随机分成以下各组：
组编号 剂量水平 剂量体积 动物编号
鉴定 (mg/kg) (mL/kg) 雄性 雌性
1heRX1-10.G1 0.2/10a 4 2 2
2heRX1-10.G1 2 4 2 2
3heRX1-10.G1 20 4 2 2
a在第1天，组1接受0.2mg/kg/剂，在第43、50和57天，同一动物接受10mg/kg/剂。
在第1天，组2和3通过静脉内缓慢推注注射在约10分钟期间给予测试制剂(分别是2和20mg/kg/剂)。利用导管和套管针(abbocath)经隐静脉给予制剂。剂量体积是4ml/kg，实际剂量基于每只动物最近的实际体重。在第1天，组1给予0.2mg/kg的剂量，然后在第43、50和57天给予10mg/kg/剂的剂量。利用导管和套管针经隐静脉通过静脉内缓慢推注注射给予制剂(在约10分钟期间)。剂量体积是4mL/kg，实际体积根据每只动物最近的实际体重。
收集所有动物的血液用于血液学和/或临床生物化学(分析)，如下所示：
检测了以下参数：
血液学：血细胞形态；红细胞指数(MCV、MCH、MCHC和RDW)；红细胞比容；血红蛋白；平均血小板体积；血小板计数；红细胞计数；网织红细胞(绝对数和百分数)；和白细胞计数(总数、绝对数和差异百分数)。
临床生物化学：A/G比(计算值)；丙氨酸氨基转移酶；白蛋白；碱性磷酸酶；天冬氨酸氨基转移酶；血液尿素氮；钙；氯化物；胆固醇；肌酸酐；球蛋白(计算值)；葡萄糖；无机磷；钾；钠；总的、直接和间接胆红素；总蛋白；甘油三酯；和C反应性蛋白。
如下所示分析骨更新的生物化学标记(收集所有动物的约2mL血液来测定骨生物标记)：
(NTX：骨胶原的N-末端交联端肽)
(CTX：骨胶原的C-末端交联端肽)
药代动力学评估和血清M-CSF活性
对于组2和3，在第1天(输注结束后立即和输注结束后4小时)和第3、8、15、22、29、43、57、71和85天在给药前通过静脉穿刺将各剂量的血液(各1.5mL)收集在SSR试管中。对于组1动物，在第1天(输注结束后立即和输注结束4小时后)和第3、8、15、22、29、43天(给药前和输注结束后4小时)、第50天(给药前和输注结束后4小时)、第57天(给药前和输注结束后4小时)、第59、64、71、78、92、106和120天通过静脉穿刺将各剂量的血液(各1.5mL)收集在SSR试管中。分析样品的药代动力学评估和血清M-CSF活性以及残余heRX1-10.G1活性。
先使血液样品在室温下凝结约30分钟，再离心。在约4℃以2700rpm离心10分钟获得血清，将得到的血清分成四等份。
本说明书述及和/或申请一览表中所列的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用全文纳入本文。
从上文应该知道，虽然出于说明的目的描述了本发明的具体实施方式，但可以作出各种改进而不脱离本发明的构思和范围。
序列表
<110>刘(Liu)等
<120>预防和治疗癌症转移和癌症转移相关骨丢失的方法
<130>028099.001
<140>待指定
<141>
<150>
<151>
<160>88
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1401
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
<210>2
<211>447
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<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
<210>3
<211>702
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<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
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<222>(27)..(27)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
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<222>(29)..(29)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
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<222>(31)..(36)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
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Claims (30)
1.一种治疗溶骨性疾病患者的方法，所述方法包括将单一治疗有效剂量的抗-M-CSF抗体与单一治疗有效剂量的破骨细胞抑制剂给予所述患者的步骤。
2.一种治疗溶骨性疾病患者的方法，所述方法包括将单一治疗有效剂量的抗-M-CSF抗体与单一治疗有效剂量的二膦酸盐给予所述患者的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破骨细胞抑制剂是RANKL抑制剂。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗体是RX1-衍生抗体、MC1-衍生抗体、MC3衍生抗体或5H4-衍生抗体。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗体是heRX1。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述溶骨性疾病是骨质疏松症、癌症转移相关性骨丢失、佩吉特病或假体周围骨丢失。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述破骨细胞抑制剂和MCSF抗体同时给予。
8.如权利要求所述的方法，其特征在于，所述RANKL抑制剂选自下组：抗-RANKL抗体、可溶性RANKL受体和RANKL疫苗。
9.如权利要求3、4、6和7所述的方法，其特征在于，所述抗-RANKL抗体是AMG-162。
10.如权利要求2、4、6和7所述的方法，其特征在于，所述二膦酸盐选自下组：唑来膦酸盐、帕米膦酸盐、氯屈膦酸盐、羟乙磷酸盐、替鲁膦酸、阿伦膦酸盐、伊班膦酸盐和利塞膦酸盐。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述二膦酸盐是唑来膦酸盐。
12.一种治疗溶骨性疾病患者的方法，所述方法包括在过渡期将单一治疗有效剂量的抗-M-CSF抗体与单一治疗有效剂量的二膦酸盐给予所述患者的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述破骨细胞抑制剂是二膦酸盐或RANKL抑制剂。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述过渡期约为1-7天。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述过渡期为1周-1个月。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述过渡期是1个月-3个月。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述过渡期是3-6个月。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述过渡期是6-12个月。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在过渡期后停止所述二膦酸盐治疗的步骤。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在过渡期后降低所述二膦酸盐剂量的步骤。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在过渡期后立即降低所述二膦酸盐剂量的步骤。
22.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在过渡期后降低所述抗-MCSF抗体剂量的步骤。
24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在过渡期后立即降低所述抗-MCSF抗体的剂量。
25.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在过渡期后给予所述二膦酸盐至少一次。
26.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗体包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示鼠科RX1抗体的CDR中的至少两个。
27.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗体包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示鼠科RX1抗体的CDR中的至少三个。
28.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗体与SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示鼠科RX1抗体竞争结合至少75％的M-CSF。
29.如权利要求6、13和20所述的方法，其特征在于，所述破骨细胞抑制剂是唑来膦酸盐，所述MCSF抗体是RX1-衍生抗体。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述唑来膦酸盐的给药剂量在0.5mg-4mg之间。
31.如权利要求4、6、8、10、11或12所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗体结合与RX1、MC1、MC3或5H4抗体相同的表位。
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