CN101775435A - 检测线粒体nd1基因单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测线粒体ND1基因mtDNA 3970位点的SNP的方法以及检测该位点SNP的试剂盒和该试剂盒的应用。本发明方法对于样本没有特殊的限制，无论是体液和组织细胞均可作为本发明检测样本，使得检测方便简捷；本发明所设计的特异性引物对待扩增区的碱基长度无严格要求，通过本发明特异性引物可获得本发明所述的PCR产物并进行高分辨熔解曲线的分析；在PCR反应前加入饱和荧光染料，lightscanner仪器通过光学检测荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线可以准确区分野生型、杂合突变、纯和突变。本发明操作简便，检测成本低廉，且检测结果准确，具有很好的应用价值和市场价值。

Description

检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性(SNP)的方法，具体地说是一种检测线粒体ND1基因mtDNA 3970位点的SNP的方法以及检测该位点SNP的试剂盒和该试剂盒的应用。

背景技术

健康长寿一直是各国研究的热点，这是由于长寿老人在衰老的过程中并不患衰老相关的退行性疾病如中风，心血管疾病，2型糖尿病，帕金森病，老年性痴呆，癌症等，而健康的生活。这些衰老相关的退行性疾病不仅给患者带来沉重的经济负担、影响生活质量，同时由于我国自1998年进入老龄化社会以来，老龄人口占全人口构成比(10％)在逐年增高，预计到2020年，我国大于60岁的人口将占全人口的27％，所以也会给社会造成巨大的压力，将会成为影响我国社会福利和卫生经济的重大医学问题。长寿的机制研究可以为衰老相关疾病的病理机制提供线索并可以预测衰老相关疾病的发病风险。

与患衰老相关的退行性疾病是受多个遗传和环境因素影响的一种复杂遗传性状，包括基因之间及基因和环境之间的相互作用。基因和(或)环境通过减少衰老相关的退行性疾病或减缓衰老来促进长寿。但是影响长寿的确切因素迄今为止尚未阐明。双生子研究表明长寿表型25％是由遗传因素决定的(Christensen K，Johnson TE，Vaupel JW.The quest for genetic determinants of human longevity：challengesand insights.Nature，2006；7：436-448)。同时，家系分析中也表明百岁老人的兄弟姐妹的寿命要比一般人群高约4倍(Christensen K，Johnson TE，Vaupel JW.Thequest for genetic determinants of human longevity：challenges andinsights.Nature，2006；7：436-448)。这些研究证明了遗传因素在长寿的机制中起到重要作用。并且，在病例对照的关联研究中发现了与长寿相关的一些遗传标记，如4号染色体和一些基因如，APOE，HLA，mtDNA等。

由于线粒体在细胞中的重要作用及线粒体的突变可以引起衰老相关的疾病(Audesh Bhat，Anil Koul，Swarkar Sharma，et al.The possible role of 10398Aand 16189C mtDNA variants in providing susceptibility to T2DM in two NorthIndian populations：a replicative study.Hum Genet，2007，120：821-826.)，因此线粒体DNA可能在长寿的机制中起到重要的作用。更重要的是衰老相关的疾病多表现为母系遗传，这与线粒体DNA的遗传方式非常相似。这样，我们推测长寿人群是遗传了母亲的线粒体DNA，而这些线粒体DNA的表达在功能上可以保护长寿人群不得衰老相关疾病，从而延长了其寿命。这样，线粒体DNA变异与衰老相关的退行性疾病关系正在越来越受到研究者的关注。线粒体是细胞浆中的小细胞器，含有自己的双链环状DNA编码氧化磷酸化过程所需的蛋白及合成这些蛋白所需的tRNA和rRNA。每一细胞含有数千个线粒体，每个线粒体中含有2-10个DNA，因此，每个细胞中含有数万个DNA拷贝。目前进行的与衰老相关的退行性疾病因研究多采用关联分析方法，已证明，以SNPs作为基因组标志是有效的。如在日本长寿群体中发现线粒体DNA编码区的SNP5178A与长寿相关(Tanaka，M.，Gong，J.S.，Zhang，J.，Yoneda，M.，andYagi，K.Mitochondrial genotype associated with longevity.Lancet，1998；351，185-186)。此后国内外的许多研究进一步证实了5178A这一突变位点与长寿相关。随后也发现了另一些与长寿相关的SNPs如9055A(Ross OA，McCormack R，Curran MDet al：Mitochondrial DNA polymorphism：its role in longevity of the Irishpopulation.Exp Gerontol 2001；36：1161-1178.)。

SNP是指基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需＞1％。SNPs这种单碱基变化中有70.1％为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1％为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多态性的80-90％，是最常见的遗传变异。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个(Brookes AJ.The essence of SNPs.Gene，1999；234：177-186.)。SNPs以其密度高，平均每1kb就有1个；代表性强，位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNPs在人群中为等位基因标记，可简单以“+/-或1/0”直接分型，成为很好的遗传标志(Collins FS，Brooks LD，Chakravarti A.A DNA polymorphismdiscovery resource for research on human genetic variation.Genome Res，1998；8：1229-1231)。

HRMA技术是基因分型的一种新方法，样品在聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)扩增后直接进行HRMA，实现了闭管操作。由于HRMA完全是基于核酸的物理性质进行分析，无需序列特异性探针，因而HRMA检测不受突变碱基位点和种类的局限，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。所以，相比定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本。因而HRMA越来越受到关注，同时饱和荧光染料的使用也大大减少了非饱和荧光染料对PCR反应的抑制作用。HRMA与以往分型方法中变性高压液相色谱(denaturing highpressure liquidchromatography，dHPLC)和温度梯度毛细管电泳(temperature-gradient capillaryelectrophoresis，TGCE)相同。但是后两者方法对于一些野生型和纯合突变的很难分型。尽管可以通过一个已知的纯合样本与未知样本混合，从而形成异源链进行分型，但是这样会使实验过程重复两次，第一次区分杂和与纯合变异，第二次将已知的纯合样本与未知样本混合，从而使工作更加繁琐。同时，两次操作也不能实现闭管操作，增加PCR产物污染问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法。

本发明的再一目的在于提供检测线粒体ND1位点为mtDNA 3970的单核苷酸多态性的方法及特异性扩增引物。

本发明的第三目的在于提供检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的试剂盒及该试剂盒的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：

本发明所述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，其具体步骤如下：

(1)提取基因组DNA；

(2)线粒体ND1基因单核苷酸多态性识别：

制备混合液：步骤(1)制备的基因组DNA溶液、PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、PLUS+饱和荧光染料、C1和C2寡核苷酸内参和纯水；

PCR条件：在95℃5分钟，95℃1分钟，56℃30秒，72℃3秒，72℃7分钟，进行35个循环；反应完成后，将PCR产物再进行两个变性和复性的循环，95℃变性30秒，25℃复性2分钟，共2个循环；

(3)将步骤(2)制备的样本进行高分辨熔解曲线分析。

将步骤(2)制备的样本进行测序，识别和验证高分辨熔解曲线分型结果。该测序为常规方法，由上海生工生物工程技术服务公司提供。该测序结果证实了本发明高分辨溶解曲线分析方法的准确性。

上述方法中提取基因组DNA的来源可以为离体的体液也可以为组织细胞，无具体限定。

上述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法，其中所述的提取基因组DNA的方法为：将除去血清的人外周血加入细胞裂解液37℃孵育过夜；然后用Tris饱和酚提取DNA 2次；收集上层水项，加入氯仿和异丙醇混合液抽提1次；收集水相，加入1/10体积冰醋酸和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜沉淀细胞DNA；然后离心，加入冷70％乙醇离心1次；使这样获得的基因组DNA溶解于TE缓冲液中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率；DNA工作液浓度调整至30ng/ul，置-20℃冰箱保存。

上述PCR引物为：

碱基序列如SEQ ID No.1所示的F1：5’-CTAGTCTCAGGCTTCAACATC-3’；

碱基序列如SEQ ID No.2所示的R1：5’-TGTTTGTGTATTCGGCTAT-3’。

本发明上述的检测方法可用于检测ND1基因mtDNA 3970位点突变情况。

本发明还提供了一种用于检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的特异性引物，其长度为19～21bp，碱基序列如SEQ ID No.1所示的F1：5’-CTAGTCTCAGGCTTCAACATC-3’；碱基序列如SEQ ID No.2所示的R1：5’-TGTTTGTGTATTCGGCTAT-3’。上述特异性引物可以准确扩增出含有mtDNA 3970位点的ND1基因序列。

本发明所述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒由以下试剂组成、来源如下：本发明试剂盒供10人份检测应用，-20℃保存

(1)108ul纯水(自制)；

(2)20ul 10X PCR缓冲液(Takara)；

(3)4ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)；

(4)20ul 1unit/ul Taq DNA聚合酶(Takara)；

(5)各2ul 10pmol/ulF1和R1引物(自制)；

(6)20ul 1XLCGreen PLUS+饱和荧光染料(Idaho)；

(7)内参：各1ul 10pmol/ul C1-1(自制)和C1-2(自制)；各1ul 10pmol/ul C2-1(自制)和C2-2(自制)；

其中引物F1碱基序列如SEQ ID No.1所示，R1如SEQ ID No.2所示；内参C1-1为SEQ ID No.3所示碱基序列3’端加3个碳烷基修饰，C1-2为SEQ ID No.4所示碱基序列3’端加3个碳烷基修饰；C2-1为SEQ ID No.5所示碱基序列3’端加3个碳烷基修饰，C2-2为SEQ ID No.6所示碱基序列3’端加3个碳烷基修饰。

内参(C1-1、C1-2、C2-1、C2-2)中3’端需要被阻断，避免其在PCR扩增中的延伸。而3’阻断通常使用3’-磷酸化，2’3’-双脱氧核核苷酸，3’-脱氧核苷酸，3’-3个碳烷基。但3’-3个碳烷基，稳定性较好。

本发明试剂盒的使用方法：

1)通过PCR扩增ND1基因，先制备混合液，加入基因组DNA溶液2ul、2ul 10X PCR缓冲液、0.4ul 10mM dNTP、2ul Taq DNA聚合酶、分别0.2ul的F1和R1为正义引物和反义引物，2ul LCGreen PLUS+饱和荧光染料，分别0.2ul的C1和C2为内参。接着，加入纯水，使总体积为20ul。反应在95℃5分钟，95℃1分钟，56℃30秒，72℃3秒，72℃7分钟，进行35个循环。

2)反应完成后，将PCR产物再进行两个变性和复性的循环，95℃变性30秒，25℃复性2分钟，共2个循环。然后将样本在Lightscanner TM HR-I 96仪中进行熔解曲线分析。通过仪器以0.3C/秒的速度从50℃升温到98℃，获得样品的熔解曲线。

3)多态性分型：根据样品的熔解曲线，如果为T，荧光信号随温度升高首先开始下降，如果为C，荧光信号随温度升高而后开始下降。

上述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的试剂盒可用于预测衰老相关的退行性疾病的应用。当检测结果基因型为T时，受试者与与衰老相关的退行性疾病关系不大；如果基因型为C时，受试者与衰老相关的退行性疾病可能有一定的遗传关系，可做进一步检测或者适当注意改变不良的生活习惯。

上述与衰老相关的退行性疾病为：中风、心血管疾病、2型糖尿病、帕金森病、老年性痴呆和/或癌症。

本发明引物设计是根据剑桥参考序列提供的人类线粒体基因组全序列(轻链)Genbank：REFSEQ AC_000021.2 gi：115315570(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝11531 5570)，在第3970位为C，其反义链为G的突变。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。

从基因组DNA中，可扩增含ND1基因突变点的DNA片段，以获得用于测定的大量样本。这种通过扩增含ND1基因突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。例如，可按PCR方法，使用引物进行扩增，此引物经合理设计以便仅扩增含ND1基因多态性的部分。本发明特异性引物为本发明的发明点之一，该引物本领域技术人员可经常规制备引物的方法制备。待扩增区的碱基长度不受限制。当按本发明所述制备引物时，可获得适宜的测定样品，其作为扩增的DNA片段，并具有特异性长度。

HRMA技术的主要的原理主要是依据杂合异源双链的形成。在PCR反应前加入饱和荧光染料，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，使DNA双链逐渐解链，此时荧光染料分子逐渐从DNA双链上脱落，荧光信号会下降。如果某个体是杂合突变，该个体的PCR产物中会形成杂合异源双链及不配对的碱基对，那么该样品在温度逐渐升高的时候会首先发生解链，其荧光信号首先开始下降，而此时的纯合个体的样品由于解链温度较高，荧光信号没有下降或者下降的较慢，lightscanner仪器通过光学检测荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯和突变。

进行高分辨熔解曲线分析时，为了减少分型的过程中温度差异造成的误差，则需要在PCR反应中加入高于和低于扩增片段Tm值的互补双链寡核苷酸作为内参。此内参序列的3’端需要加3个碳烷基修饰，以避免其在PCR反应中的延伸。

因此，本发明根据PCR方法扩增的所需DNA片段，通过上述合理引物，内参得以设计。光学检测荧光信号变化产生温度熔解曲线证实，它们显示不同的熔解曲线。根据在上述方法中获得的熔解曲线，可测定mtDNA C3970T单核苷酸多态性。

在进行本发明的基因检测时，优选使用用于测定根据mtDNA C3970T单核苷酸多态性的突变类型存在的试剂，检测试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定mtDNA C3970T单核苷酸多态性突变类型的方法。特定的试剂按采用的测定方法来适当地选择。试剂的特征是，组成测定由mtDNA C3970T单核苷酸多态性定义的突变类型的手段是必要的，如，DNA片段或高分辨熔解曲线分析。试剂，例如特定制备的用于PCR扩增步骤的引物，该步骤用于包含高分辨熔解曲线分析单核苷酸多态性的突变点的特定扩增片段，不被认为是本发明诊断试剂的必要成分，它们也包含于本发明的诊断试剂之中。

本发明的优点和有益效果是：

综上所述，本发明所提供的检测ND1的SNP方法，为一种生物学的检测方法，与现有检测方法相比较，具有显著的进步，如本发明方法对于样本没有特殊的限制，无论是体液和组织细胞均可作为本发明检测样本，使得检测方便简捷；本发明所设计的特异性引物对待扩增区的碱基长度无严格要求，通过本发明特异性引物可获得本发明所述的PCR产物并进行高分辨熔解曲线的分析；本发明在PCR反应前加入饱和荧光染料，lightscanner仪器通过光学检测荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线可以准确区分野生型、杂合突变、纯和突变。本发明与现有技术相比操作简便，检测成本低廉，且检测结果准确，具有很好的应用价值和市场价值。

本发明为一种生物学的基因位点检测方法，与现有检测方法比较有显著的效果，本发明检测目的为得知mtDNA C3970T单核苷酸多态性，其检测结果可以为与衰老相关的退行性疾病预测提供中间信息，但并不能作为最终确定或者预测与衰老相关的退行性疾病患病依据，因此本发明并不属于疾病的诊断和治疗方法。

上述内容已经充分的说明了本发明的技术方案和有益效果，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对发明内容有更深入的了解，具体实施方式的实施例均为最佳的技术方案，而并非对本发明的限制。

附图说明

图1为mtDNA C3970T的基因分型数据图；左图为熔解曲线图，右图为样本分布图。

图2为PCR-直接测序法所得的多核苷酸序列结果经生物信息学比对后识别线粒体ND1基因mtDNA C3970T SNP标记。

图3-1和3-2为本发明方法检测结果由PCR-直接测序法验证图；线粒体ND1基因mtDNA 3970基因位点使用本专利试剂盒基因型分型结果与DNA测序结果一致。

具体实施方式

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下。

需要时，用高压锅(120℃，20分钟)灭菌

EDTA：乙二胺四乙酸二钠市售

SDS：十二烷基硫酸钠 市售

TE缓冲液：30ug/mlRNaseA，10mmol/LTris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA 10PCR缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化镁(MgCl2)0.01％(W/V)白明胶自制

dNTP：脱氧核苷三磷酸 市售

实施例1：血液样本收集和基因组DNA的提取

一、样本选择

入户调查广西巴马地区的长寿老人，年龄≥90岁。意识清楚，生活自立，能配合检查，无心脑血管疾病，老年痴呆，帕金森氏症，癌症等衰老相关的退行性性疾病，共358例。记录所有受试者的基本信息并由本人或亲属签署知情同意。这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。

二、制备基因组DNA

在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5ml受试者外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入5ml细胞裂解液(含10mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L EDTApH8.0，15mmol/L Nacl，0.4％SDS，0.1mg/ml蛋白酶K)37℃孵育过夜。然后用Tris饱和酚(pH8.0)5ml提取DNA 2次(12000r/min，10min)。收集上层水项，加入5ml氯仿和异丙醇(24∶1)混合液抽提1次(离心12000r/min，10min)。收集水项，加入1/10体积3M冰醋酸和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜沉淀细胞DNA。然后离心12000r/min，30min，加入冷70％乙醇1ml洗1次(离心12000r/min，10min)。使这样获得的基因组DNA溶解于TE缓冲液中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度调整至30ng/ul，置-20℃冰箱保存。

实施例2：SNP的识别确定

本发明采用HRMA和PCR测序技术同时对C3970T位点(其等位位点对为A/G)进行检测。

一.特异性引物如下：

F1：5’-CTAGTCTCAGGCTTCAACATC-3’(SEQ ID NO.1)

R1：5’-TGTTTGTGTATTCGGCTAT-3’(SEQ ID NO.2)

二.通过PCR扩增C3970T附近部分片段；制备混合液：加入上述实施例1制备基因组DNA溶液2ul、2ul 10X PCR缓冲液、0.4ul 10mM dNTP、2ul Taq DNA聚合酶、分别0.2ul上述步骤1)叙述的每种引物，2ul LCGreen PLUS+饱和荧光染料，分别0.1ul的C1和C2寡核苷酸内参。接着，加入纯水，使总体积为20ul。反应在95℃5分钟，95℃1分钟，56℃30秒，72℃3s，2℃7分钟，进行35个循环。反应完成后，将PCR产物再进行两个变性和复性的循环，95℃变性30秒，25℃复性2分钟，共2个循环。

三.通过将样本在Lightscanner TM HR-I 96仪中进行熔解曲线分析。仪器以0.3C/秒的速度从50℃升温到98℃，获得样品的熔解曲线。如图1所示，图1为mtDNA C3970T的基因分型数据图；左图为熔解曲线图，右图为样本分布图，根据样品的熔解曲线，如果为T，荧光信号随温度升高首先开始下降，如果为C，荧光信号随温度升高而后开始下降。图谱中曲线和方格为同一样本的不同表示形式；黑色曲线和方格代表mtDNA 3970T；灰色曲线和方格代表为mtDNA 3970C；方格中的S代表该样本为阳性对照。

上述实施例结果验证：

利用PCR-直接测序法将实施例1制备的样本进行DNA测序，识别和验证实施例2高分辨熔解曲线分型结果。该测序为常规方法在此不赘述，该测序由上海生工生物工程技术服务公司提供。该测序结果证实了本发明高分辨溶解曲线分析方法的准确性。如图2所示，为PCR-直接测序法所得的多核苷酸序列结果经生物信息学比对后识别线粒体ND1基因mtDNA C3970T SNP标记；如图3-1和3-2所示，图3-1和3-2为本发明方法检测结果由PCR-直接测序法验证图；线粒体ND1基因mtDNA 3970基因位点使用本专利试剂盒基因型分型结果与DNA测序结果一致。

实施例3：mtDNA 3970单核苷酸多态性与与衰老相关的退行性疾病的相关

一.统计方法：利用STATA8.0和SPSS11.0软件中Yates卡方检验计算mtDNA 3970单核苷酸多态性的携带者频率，进行连续校正和单侧渐近概率分析，统计学的显著性水平设定为P＜0.05。采用单因素Logistic回归分析计算长寿的风险OR值及其95％可信区间(CI)。

二.结果

1.健康人mtDNA 3970单核苷酸多态性分布

按实施例1和2的方法测定了362个健康人(无心脑血管疾病，癌症等，年龄≤60岁)的基因多态性。285人在第3970位碱基有C多态性(78.1％)，77人有T的多态性(21.3％)。

2.健康长寿老人(无与衰老相关的退行性疾病者，年龄≥90岁)mtDNA 3970单核苷酸多态性分布。

按实施例1和2的方法测定个上述健康长寿老人的基因多态性。249人在第3970位有C碱基多态性(69.5％)，发现109人有T碱基多态性(30.5％)。

3.健康长寿老人组和健康人对照组比较

比较健康长寿老人组和健康对照组mtDNA 3970单核苷酸多态性的频率分布，详见表1。

表1 mtDNA 3970单核苷酸多态性(SNP)频率风险性在健康长寿老人组和健康人的比较

由表1可见，mtDNA第3970位的常见SNP位点的C等位位点，即在其DNA互补链上为G等位位点，当突变为T时，在健康长寿老人群体中的分布频率大大高于对照群体中的频率，相差约9％，有显著性差别(P＝0.005)。而且OR值反映位点T的频率在健康老人人群中高出正常人1.6倍，95％CI下限＞1，均表明这是与衰老有关的退行性疾病的一个相关等位基因。C3970T位于ND1基因，其表达产物为NADH脱氢酶(复合体I)亚单位1，该突变为同义突变，该突变可能是与衰老有关的退行性疾病相关遗传标记，也可能在功能上通过影响DNA的序列和空间结构，影响了DNA的转录等。

实施例4：检测试剂盒

本发明试剂盒供10人份检测应用，保存温度为-20C，包括：

108ul纯水，

20ul 10X PCR缓冲液，

4ul 10mM dNTP混合液，

20ul(1unit/ul)Taq DNA聚合酶，

各2ul(10pmol/ul)F1(SEQID No.1)和R1(SEQ ID No.2)引物，

20ul   1XLCGreen PLUS+饱和荧光染料，

各1ul  (10pmol/ul)C1-1(SEQ ID No.4)和C1-2(SEQ ID No.5)，

各1ul  (10pmol/ul)C2-1(SEQ ID No.6)和C2-2(SEQ ID No.7)。

引物序列为：

F1：5’-CTAGTCTCAGGCTTCAACATC-3’(SEQ ID NO：1)

R1：5’-TGTTTGTGTATTCGGCTAT-3’(SEQ ID NO：2)

内参序列为：

C1-1：(SEQ ID NO：3)

5’-TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA-C3-3’

C1-2：(SEQ ID NO：4)

5’-TATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3-3’

C2-1：(SEQID NO：5)

5’-GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGG-C3-3’

C2-2：(SEQ ID NO：6)

5’-CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3-3’

本试剂盒经PCR-HRMA检测后，可轻易检测出第3970位的C→T的SNP。

本发明具有实用性的例证：

1.本发明的mtDNA 3970单核苷酸多态性的检测方法，可用于分析人线粒体的ND1基因上的常见SNP的T等位位点，应用对个体是否与衰老相关的退行性疾病有关系进行考察，以利于开展早期干预和生活习惯的改进。

2.利用本发明阐述mtDNA 3970碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，促进老年相关疾病新药开发。

3.本发明建立的检测mtDNA 3970单核苷酸多态性的核酸序列和相关位点，可高灵敏度，特异性地应用于长寿基因检测用的试剂盒。

如上所述，得出结论，mtDNA单核苷酸多态性在第3970位碱基的多态性与衰老相关的退行性疾病具显著相关性。

本发明叙述了与衰老相关的退行性疾病相关的新突变点，并提供了一种测定mtDNA 3970单核苷酸多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定mtDNA 3970单核苷酸多态性的多态性。

按照1990年前后死亡水平的估算表明，80岁老人活到100岁以上高寿的平均概率分别为0.65％。如此稀少的人有可能活到100岁高寿，充分说明，与一般人群相比，长寿老人比较有可能携带有利于老龄健康的基因，根据概率计算可知本实验所抽样结果约代表6万群体的抽样结果，具有可行性和准确性，符合统计学标准，可用于其他地区其他人群的检测。

序列表

<110>卫生部北京医院

<120>检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>正向引物人工序列

<400>1

ctagtctcag gcttcaacat c                    21

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>反向引物人工序列

<400>2

tgtttgtgta ttcggctat                       19

<210>3

<211>50

<212>DNA

<213>内参C1-1

<400>3

ttaaattata aaatatttat aatattaatt atatatatat aaatataata               50

<210>4

<211>50

<212>DNA

<213>内参C1-2

<400>4

tattatattt atatatatat aattaatatt ataaatattt tataatttaa               50

<210>5

<211>63

<212>DNA

<213>内参2-1

<400>5

gcgcggccgg cactgacccg agactctgag cggctgctgg aggtgcggaa gcggaggggc    60

ggg                                                                  63

<210>6

<211>63

<212>DNA

<213>内参2-2

<400>6

cccgcccctc cgcttccgca cctccagcag ccgctcagag tctcgggtca gtgccggccg    60

cgc                                                                  63

Claims (10)

1.一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，其具体步骤如下：

(1)提取基因组DNA；

(2)线粒体ND1基因单核苷酸多态性识别：

制备混合液：步骤(1)制备的基因组DNA溶液、PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR引物、PLUS⁺饱和荧光染料、C1和C2寡核苷酸内参和纯水；

PCR条件：在95℃5分钟，95℃1分钟，56℃30秒，72℃3秒，72℃7分钟，进行35个循环；反应完成后，将PCR产物再进行两个变性和复性的循环，95℃变性30秒，25℃复性2分钟，共2个循环；

(3)将步骤(2)制备的样本进行高分辨熔解曲线分析。

2.根据权利要求1所述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述提取基因组DNA的来源可以为体液和/或组织细胞。

3.根据权利要求2所述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的提取基因组DNA来源为体液中的血液时，具体方法为：将除去血清的人外周血加入细胞裂解液37℃孵育过夜；然后用Tris饱和酚提取DNA 2次；收集上层水项，加入氯仿和异丙醇混合液抽提1次；收集水相，加入1/10体积冰醋酸和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜沉淀细胞DNA；然后离心，加入冷70％乙醇离心1次；使这样获得的基因组DNA溶解于TE缓冲液中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率；DNA工作液浓度调整至30ng/ul，置-20℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述PCR引物为：

碱基序列如SEQ ID No.1所示的F1：5’-CTAGTCTCAGGCTTCAACATC-3’；

碱基序列如SEQ ID No.2所示的R1：5’-TGTTTGTGTATTCGGCTAT-3’。

5.根据权利要求1所述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的ND1位点为mtDNA 3970。

6.一种用于检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的特异性引物，其特征在于，其长度为19～21bp，

碱基序列如SEQ ID No.1所示的F1：5’-CTAGTCTCAGGCTTCAACATC-3’；

碱基序列如SEQ ID No.2所示的R1：5’-TGTTTGTGTATTCGGCTAT-3’。

7.根据权利要求5所述的一种用于检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物可以扩增出含有mtDNA 3970位点的ND1基因序列。

8.一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由以下试剂组成：

(1)108ul纯水；

(2)20ul 10X PCR缓冲液；

(3)4ul 10mM dNTP混合液；

(4)20ul 1unit/ul Taq DNA聚合酶；

(5)各2ul 10pmol/ulF1和R1引物；

(6)20ul 1XLCGreen PLUS+饱和荧光染料，

(7)内参：各1ul 10pmol/ul C1-1和C1-2；各1ul 10pmol/ul C2-1和C2-2；

其中引物F1碱基序列如SEQ ID No.1所示，R1如SEQ ID No.2所示；内参C1-1为SEQ ID No.3所示碱基序列3’端加3个碳烷基修饰，C1-2为SEQ ID No.4所示碱基序列3’端加3个碳烷基修饰；C2-1为SEQ ID No.5所示碱基序列3’端加3个碳烷基修饰，C2-2为SEQ ID No.6所示碱基序列3’端加3个碳烷基修饰。

9.权利要求8所述的一种检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的试剂盒用于预测衰老相关的退行性疾病的应用。

10.根据权利要求9所述的检测线粒体ND1基因单核苷酸多态性的试剂盒的应用，其特征在于，所述衰老相关的退行性疾病为：中风、心血管疾病、2型糖尿病、帕金森病和/或老年性痴呆。

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