CN101955906A - 肝脏组织来源 - Google Patents

Abstract

本发明首次提供了来自心脏停止跳动的供体尸体器官作为用于各种医学目的的诸如祖细胞或干细胞的功能性细胞来源的用途。更具体的说，公开了通过其获得祖细胞的组织来源的丰富，包括从供体获得组织，其中供体心脏停止跳动长达大约死后30小时并处理尸体组织以提供祖细胞，该祖细胞作为细胞治疗、基因治疗、人造器官、生物反应器、器官再生等的工具用于各种医疗目的。

Description

肝脏组织来源

本申请是原申请号01806108.7、申请日为2001年1月19日、发明名称为“肝组织来源”的分案申请。

发明领域

本发明通常涉及从心脏停止跳动的供体尸体的组织获得包括祖细胞或干细胞的二倍体细胞。

发明背景

从肝脏分离和鉴定未成熟的祖细胞具有极大的临床和商业利益，因为该细胞群体在治疗肝脏疾病中具有效果。在美国每年有大约300,000例因为肝脏衰竭住院。肝移值对某些形式的肝衰竭具有疗效，且在美国每年进行大约4800例移植。肝脏移植中的一个限制性因素是供体肝脏的可得性，特别是受到器官移植的供体肝脏必须来自经历脑死亡但心跳未停止的病人的限制。尽管最近如果在死亡半小时内获得该肝脏时使用该供体的努力支持了使用它们的可能性，但是来自尸体(心搏停止)的供体肝脏尚未成功。

将细胞移植进肝脏对于大多数肝脏疾病而言是一种有吸引力的治疗选择。细胞移植的手术操作相对于完整器官移植所需的那些操作较小，因此，可用于有各种手术危险的病人，例如，老年人或衰弱病人。使用人肝细胞优于来自其它哺乳动物的肝细胞，因为潜在的病原体(如果有的话)是人类来源的，病人能更好地耐受且容易在用前筛选。

过去为获得认为是最多用的群体的肝脏祖细胞群体用于肝脏的细胞和基因治疗已作出了尝试。Reid等的美国专利号5,576,207和5,789,246使用细胞表面标记和侧面散射流式细胞术提供了肝脏中的限定亚群体。肝脏祖细胞是二倍体细胞，它们或其后代能分化成肝细胞。

肝脏祖细胞对于生长因子的生产也非常有用。这与其自身生长或肝脏中其它祖细胞(例如，造血或间充质祖细胞)的生长相联系且也可包括与将肝脏祖细胞供给特定谱系的早期步骤相关的尚未发现的生长因子。这些新生长因子在治疗肝脏疾病或控制肝脏癌症(现在认为是肝脏祖细胞的转化突变体)中具有潜力。

另外，肝脏祖细胞是基因治疗的载体，其中遗传插入转化的或正常的肝脏祖细胞可促进移植该肝脏祖细胞的个体的健康。

进行肝细胞移植的尝试利用了未分离的成熟肝细胞并显示了一定程度的功效。然而，该成就需要注射大量细胞(100-200亿个)，因为该细胞在体内的生长潜力有限。另外，导入大量的大型成熟肝细胞(平均细胞直径25-50μm)伴随着注射时形成大量聚集的倾向，导致潜在的致命栓塞。而且，这些细胞诱发显著的免疫学排斥反应，迫使病人靠免疫抑制药物来维持余生。

成熟的，分化的肝细胞通过一些标准可与肝脏祖细胞区分开来。分化的细胞倾向于形成团块或聚集，如果注射进病人，导致出现栓塞形成的危险。分化的细胞特别耐冷藏且具有显著的免疫原性。而且，由于分化细胞的增殖能力有限，用分化细胞移植与器官移植相比具有较小的优势(如果有的话)，且具有包括制备程序更精细的缺点。

需要供体组织的用于移植或其它医学目的的重要器官，例如，心脏，肝脏，胰腺，肺和肾的矩缺是由于仍然具有功能的器官的可获得性有限。当前，用于移植的器官从心脏仍在跳动的脑死亡的供体取得。如果心跳停止，血液循环就停止(局部缺血)，它中断了组织的氧合作用(缺氧)，因此，器官在极短的时间期间内受到局部缺血损伤导致出现这样一种几乎确定的可能性，即移植时该器官不发挥功能。一般来说，不使用心跳停止后的器官，在实验上，没有使用心跳停止或心搏停止时间超过1个半小时后的器官。通常，医院只有1-2％的死亡满足脑死亡有心跳的标准。然而，可获得大量且尚未利用的器官来源用于移植，其中许多来自事故的遇难者，他们或者在受伤时死亡，或者具有较短的伤后存活时间。这些事故遇难者由于局部缺血损伤而未被用作器官供体。诸如肝脏，脑和心脏的器官属于局部缺血最敏感的组织。例如，由于心跳停止的缺氧和局部缺血脑损伤在大约4分钟后导致脑和有关神经组织的损伤。心跳停止后心脏可完整存活达4小时。肝脏可有功能地存活不超过1小时，且来自无心跳的供体(NHBDs)的移植建议优选在出现暖局部缺血的前35分钟内进行[参见Ong HS，Soo KC，Joseph VT，Tan SY，Jeyaraj PR的文章(作为参考文献引用)的摘要。Ann Acad Med Singapore 1999年1月；28(1)：25-30，暖局部缺血延迟后用于移植的肝脏移植物的活力；Hong HQ，Yin HR，Zhu SL，Lin YT，来自选择的无心跳尸体供体的移植肝脏的结果，Hiroshima J Med Sci，1991年9月；40(3)：87-91]。在目前的医学法规下，在可抢救潜在可移植器官的时间之前的时间通常被耽搁。这是因为潜在的供体必须首先被带到医院或停尸室。然后家属必须填写器官捐赠表格。只有在器官捐赠程序完成后，才许可手术小组接近尸体以获取器官。在许多场合下由于这些程序导致时间流逝，器官已经不可逆地受到损伤或者不再有活力。因此，现有技术提供了大量方法和程序用于防止供体器官局部缺血损伤。参见，例如美国专利号5,702,881；5,660,976；5,752,929；5,863,296；5,855,617；5,843,024；5,827,222；5,723,282；5,514,536；和4,723,939等并以参考文献的形式在本文中引用。尽管大量的现有技术文献针对防止供体器官丧失功能的方法，但对于使用心跳停止超过不可逆时间点的尸体的情况现有技术没有记载。只有3篇美国专利(5,843,024；5,702,881；4,723,939)似乎涉及无心跳的供体。但该现有技术没有教导使用“不可修复的”器官用于从其中分离祖细胞。尽管分离肝脏前体细胞的方法在本领域是已知的(参见，例如美国专利号5,576,207和5,789,246，本文作为参考文献引用)，但直到本发明付诸实践时还不知道可从现有技术认为“无用”的器官分离前体肝脏细胞。

由本文所述的本发明的发明人开创的，从对人肝脏祖细胞及其分离和扩增的认识进展建立的技术通过提供对细胞移植进肝脏非常有用的新细胞群体产生对与肝脏疾病相关的发病率和死亡率的重要影响。

因此，对于使用来自血液循环停止或无心跳的尸体的器官作为医学目的的器官或器官等同物来源的有效方法存在长期需要。

发明概述

本发明涉及提供具有至少一种二倍体细胞群体的组织作为二倍体细胞来源的方法。该方法包括(a)从获取组织时无心跳的供体获取组织，所获取的组织被认为具有至少一种二倍体细胞群体；(b)处理获取的组织以获得基本上富含二倍体细胞的一种细胞群体。优选的是，供体不是胎儿且选自新生儿，婴儿，儿童，少年人或成年人。从该方法获得的二倍体细胞包括祖细胞。

在本发明的一个具体实施方案中，处理步骤包括处理获取的组织以提供基本上的单细胞悬液。经过将基本上的单细胞悬液分成两个或多个部分，一般三个或多个，优选4个或多个来进一步处理该单细胞悬液。在该分离步骤中，将大细胞与小细胞分离，高密度细胞与低密度细胞分离，或两种情况都分离。可使用本领域的普通技术人员已知的将细胞分成小部分的任何方法。一个方便的方法是离心，首先以较低速度，然后逐渐加快速率。进一步处理基本上由小细胞，低密度细胞，或两者组成的部分以提供基本上富含二倍体细胞的细胞群体。具体地说，所需的二倍体细胞的例子包括表达甲胎蛋白的祖细胞，特别是肝脏祖细胞。

本发明的优选组织是在供体心跳停止后大约6小时内，优选心跳停止后大约3小时内，更优选心跳停止后大约2小时内，最优选心跳停止后大约1小时内获取的那些组织。然而，供体心跳停止后获取该组织的时间越早越好。因此，在供体心跳停止后大约45，30或15分钟内获取的组织仍然是较优选的。可获取各种组织并进行处理以获得二倍体细胞，包括肾上腺，血管，骨髓，角膜，视网膜，胰岛，胆管，晶状体，肺，肾，心脏，肠，卵巢，胰腺，前列腺，甲状旁腺，松果体，脑垂体，皮肤，睾丸，膀胱，脑，脊髓，脾脏，胸腺，甲状腺或者肝脏。

本发明还涉及一种组合物，它含有一种基本上富含二倍体细胞的细胞群体，特别是用本发明的方法获得的，表达甲胎蛋白的那些细胞。

本发明在获得供体器官和组织的领域中取得了重要突破并提供了获得祖细胞和二倍体成年细胞的组织来源的方法。本发明是完全意想不到的，因为所有已知的现有技术文献都认为局部缺血损伤的器官对于任何有意义的目的都是完全无用的。优选的方法包括从供体获取组织，其中该供体无心跳，并处理该组织以提供包括祖细胞或干细胞的二倍体细胞。

优选的是，本发明包含提供包括祖细胞的肝脏二倍体细胞的组织来源的方法，它包括从供体获取肝脏组织，其中该供体无心跳，并处理该组织以提供二倍体细胞和/或肝脏祖细胞。例如，该细胞可用于在需要的宿主中恢复损伤的肝脏实质群体或重建肝脏。尽管任何动物供体是同样合适的，但优选的供体是人类。诸如猪和灵长类的动物是同样合适的。

因此，本发明的目的是在心跳停止后大约24小时或更长的时间内获得该器官或组织。即使该时间限制不受约束，也优选在心跳停止后大约16小时内获得该组织。更优选的是在心跳停止后大约10小时内获得该组织。另外更优选在心跳停止后大约6小时内获得该组织。甚至更优选在心跳停止后大约3小时内获得该组织。另一优选的时间期限是在心跳停止后大约1小时内获得该组织。尽管在该时间期限二倍体细胞和祖细胞耐局部缺血。获取的组织或者用合适的灌流培养基灌流或者不作灌流而用于进一步处理。

尽管优选将组织冷却到大约室温，但将组织冷却到大约4℃同样是具有优势的。组织可在全部或部分局部缺血时间内冷却。即，对器官可进行暖和冷局部缺血的组合。

在本发明范围内，优选供体是新生儿，婴儿，儿童，少年或成年人，在本发明范围内也包括由于推测的局部缺血而认为不合适的胎儿组织。尽管供体的年龄不是关键的，但需要供体在大约0岁至大约77岁之间，更优选不超过大约50岁。

用于本发明的优选组织包括肾上腺，血管，骨髓，角膜，胰岛，晶状体，肝脏，卵巢，胰腺，甲状旁腺，松果体，脑垂体，皮肤，睾丸，胸腺，甲状腺或者其组含。优选的组织是肝脏。

本发明的另一实施方案是提供了导致从该组织产生基本上的单细胞悬液的处理方法。优选的处理方法还包括压实(debulking)的步骤，它大量减少了悬液中多倍体细胞或成熟细胞的数目以提供富含表现出与至少一种细胞谱系相关的至少一种标记的二倍体细胞和/或祖细胞的压实的悬液。不作为对该方法的限制，处理步骤包括以大小或密度分离细胞。

优选的处理还包括从悬液选择那些表达与至少一种细胞谱系相关的至少一种标记的细胞，其中至少一种细胞谱系包括至少一种肝脏，造血，或间充质细胞谱系。本发明还有一个目的是提供具有发育成肝细胞，胆细胞，或其组合之能力的二倍体细胞和/或祖细胞。

优选的是本发明的供体细胞单独或者以有益组合表达包括甲胎蛋白，白蛋白，骨唾液蛋白，CD14，CD34，CD38，CD90，CD45，CD 117，ICAM-1，I型胶原蛋白，II型胶原蛋白，III型胶原蛋白，血型糖蛋白A，或骨桥蛋白的至少一种标记。

作为本发明的另一目的，提供了一种治疗方法，其中祖细胞用作细胞移植物，生物反应器，人造器官等。优选的医学症状和需要包括克-纳二氏综合征，酪氨酸血症，肝硬化，急性肝衰竭，糖尿病，和本领域已知的其它肝脏和肝脏相关性症状。一般来说，治疗的患者可患有至少一种肝脏疾病，该疾病选自肝脏炎症，病毒性肝炎，中毒性肝细胞损伤，肝脏纤维变性，肝硬化，肝充血，肝营养障碍，肝细胞脂肪变性，脂肪肝，解毒功能障碍，肝分泌功能障碍，肝接合功能障碍，由肝疾病引起的肝门高血压合成功能障碍，或肝衰竭昏迷，蛋白降解产物或氨中毒。这些机能障碍导致诸如阿拉惹综合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，胆闭锁，胆管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里综合征，Byler疾病，克-纳二氏综合征，Caroli疾病，胆汁郁积瘙痒症，胆石病，接合高胆红素血症，慢性移植物与宿主疾病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-约综合征，红细胞肝性原卟啉症，肝外胆管癌，家族性高胆固醇血症，半乳糖血症，吉尔伯综合征，糖原存储疾病，血管瘤，血色病，肝脑病，肝胆管炎，肝软化，肝大，肝癌，肝胚细胞瘤，遗传性血色病，黄胆，肝内胆汁郁积，肝囊肿，肝移植，与Bacillus cereus相关的肝衰竭，混合型冷球蛋白血症，鸟氨酸转氨甲酰基酶缺陷，紫癜肝病，迟发性皮肤血卟啉病，原发性胆肝硬化，顽固性腹水，罗托综合征，肉样瘤病，硬化性胆管炎，皮脂腺病，Summerskill综合征，血小板减少症，酪氨酸血症，静脉曲张性出血，肝脏静脉闭合疾病，和肝豆状核变性等的疾病，且用本发明的方法和组合物治疗是有益的。

不局限于上述实施方案，还包括基因治疗的方法，它包括本领域熟知的方法，包括但不限于将载体导入二倍体细胞和/或祖细胞，然后移植进需要的宿主中。症状和靶基因可包含家族性高胆固醇血症中的LDL受体基因，血友病中的因子VIII和IX的凝血因子基因，肺气肿中的α-1-抗胰蛋白酶基因，苯丙酮酸尿中的苯丙氨酸羟化酶基因，血氨过多中的鸟氨酸转氨甲酰酶基因，和在各种补体缺陷形式中的补体蛋白基因，可借助于基因治疗进行有益治疗或治愈的其它医学症状。

其它所需的实施方案包括编码甲氨酰合成酶1，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1-抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，低密度脂蛋白受体，胆色素原脱氨酶，甲氨酰合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，因子VIII或IX，胱硫醚β-合成酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰-CoA脱氢酶，丙酰CoA羧化酶，甲基丙二酰CoA变位酶，戊二酰CoA脱氢酶，胰岛素，转铁蛋白，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧化酶，肝脏磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，H-蛋白，T-蛋白，Menkes疾病蛋白，或肝豆状核变性基因产物的基因。

本发明还涉及从人肝脏分离和冷藏二倍体细胞和/或祖细胞的方法，包括(a)处理人肝脏组织以提供一种基本上的单细胞悬液，该悬液包括二倍体成年细胞，祖细胞和在人肝脏中发现的一种或多种细胞谱系的非祖细胞；(b)对该悬液进行压实的步骤，它大量减少了悬液中非祖细胞的数目，以提供富含表现出与至少一种细胞谱系相关的一种或多种标记的祖细胞的压实的悬液；和(c)从压实的悬液选择那些其自身，其后代或其更成熟的形式表达与一些肝脏细胞谱系相关的一种或多种标记的细胞；及(d)在对于冷藏最佳的条件下悬浮该细胞。更优选的是选择表达诸如甲胎蛋白的胞质蛋白的肝脏祖细胞。本发明的处理或压实的步骤优选包括根据与具有低浮力密度的一个或多个梯度部分相联系的其浮力密度和大小对肝细胞悬液进行密度梯度离心以分离该细胞。

肝细胞悬液的非祖细胞包括成熟的肝脏，造血，和间充质细胞。非祖细胞的负选择包括使用诸如连接蛋白32的与成熟肝细胞相关的标记，诸如血型糖蛋白A和CD45的与造血细胞相关的标记，诸如视网膜样蛋白(retinoids)或冯·维勒布兰德氏因子的与成熟间充质细胞相关的标记。

本发明的另一方面提供了肝脏，造血，或间充质来源的肝脏祖细胞。通过选自CD14，CD34，CD38，CD45，CD 117，ICAM，血型糖蛋白A的抗原标记，和/或诸如甲胎蛋白样免疫反应性，白蛋白样免疫反应性的胞质标记，或者两者来选择这些细胞谱系，其后代或其更成熟的形式。甲胎蛋白来自mRNA的变异体形式。其中的一些是肝脏祖细胞特有的且一些是造血祖细胞特有的。本发明的肝脏相细胞可从胎儿，新生儿，婴儿，儿童，少年或成年人肝脏中分离。

根据本发明的另一方面，分离的人肝脏祖细胞，即一种二倍体细胞的亚群以高度富集到基本上纯的形式分离。该肝脏祖细胞含有肝脏，造血和间充质祖细胞。肝脏祖细胞具有发育成肝细胞，胆细胞或其组合的能力；造血祖细胞具有发育成巨噬细胞，噬中性白细胞，粒细胞，淋巴细胞，血小板，嗜中性白细胞，嗜曙红细胞，嗜碱细胞或其组合的能力。间充质祖细胞具有发育成内皮细胞，基质细胞，肝脏星形细胞(Ito cells)，软骨细胞，骨细胞或其组合的能力。本发明的方法可用于选择表达CD34，骨桥蛋白，骨唾液蛋白，I，II，或III型胶原蛋白或其组合的间充质祖细胞。

本发明人克服了许多上述困难来制备包括祖细胞的二倍体细胞，理想地用于细胞和基因治疗及用于人造生物器官。由于细胞较小，因此使大型栓塞的形成最小化。另外，该细胞具有广泛的生长潜力，意味着在患者中重建肝脏组织需要较少的细胞。最后，祖细胞具有最少的可诱发免疫学排斥的抗原标记，这给需要较小或没有免疫抑制的药物提供了希望。

本发明的另一方面提供了含有外源性核酸的肝脏祖细胞。该外源性核酸可编码一个或多个目的多肽，或者可启动一个或多个目的多肽的表达。

根据本发明的另一方面，提供了经过给遭受负效应的个体施用有效量的分离的人二倍体肝细胞和/或祖细胞减轻一种或多种人类疾病或机能障碍的负效应的方法。祖细胞可通过血管进行肠胃外给药，或者直接施用进肝脏。直接施用可通过门静脉，肠系膜静脉，肝胆管，或其组合经手术实现。另外，肝脏祖细胞可施用进个体的异位位置，例如脾脏。

可用本发明的方法减轻的人类病症或机能障碍包括：肝胆管炎，肝软化，肝大，肝硬化，纤维变性，肝炎，急性肝衰竭，慢性肝衰竭，或代谢先天错误，肝癌，或肝胚细胞瘤。肝癌可以是癌的原发性部位或者是转移进肝脏的癌。转移瘤可来自任意数量的原发性位点，包括肠，前列腺，胸部，肾，胰腺，皮肤，脑，肺或其组合。可用该方法治疗的肝脏疾病或机能障碍还包括与肝组织线粒体区室的损伤相关的肝脏疾病或机能障碍且可由慢性肝脏疾病，爆发性肝衰竭，病毒诱导的肝脏疾病，代谢型肝脏疾病和与脓毒症或肝脏创伤相关的肝脏机能障碍组成。

根据本发明的另一方面，提供了一种生物反应器，它包括(i)含有(a)从人肝脏，其后代，其成熟中的或分化的后代，或其组合分离的祖细胞，(b)细胞外基质，和(c)培养基的生物材料；(ii)容纳所述生物材料的一个或多个区室或含有所述生物材料的组件；和(iii)一个或多个连接口。该生物反应器的生物材料可任选还包括：(d)激素，生长因子，或营养补充物，或(e)血浆，血清，淋巴，或由其产生的产品。

生物反应器适用于将所述祖细胞维持在一种有活力的，有功能的状态，且可维持肝脏祖细胞大约一周或更长的时期。具体地说，该生物反应器适用于用作人造肝脏，用于产品生产，毒理学研究，或代谢研究，包括涉及细胞色素P450的活性，或其它类型的药物代谢的研究。

根据本发明的另一方面，提供了分离的人肝脏祖细胞的组合物，或从人类肝脏获得的富含祖细胞的悬液。该细胞悬液在药用上可接受的载体或稀释剂中提供且施用给需要治疗的受试者。本发明的组合物包含表现出与在人类肝脏中发现的一种或多种细胞谱系中的至少一种相联系的一种或多种标记的肝脏祖细胞且基本上不含成熟细胞。更具体的说，分离的肝脏祖细胞来自一种或多种肝细胞谱系，包括肝脏，造血，或间充质细胞谱系且它们自身，其后代，或该祖细胞的更成熟形式表达抗原标记CD14，CD34，CD38，CD90，或CD117，CD45，血型糖蛋白A，和甲胎蛋白样免疫反应性，白蛋白样免疫反应性的胞质标记，或者两者中的至少一种或多种。

根据本发明的另一实施方案，提供了一种肝脏祖细胞的细胞培养物，它包括来自人肝脏的分离的祖细胞，其后代，其成熟中的或分化的后代，或其组合。该细胞培养物还包括细胞外基质，该基质包括一种或多种胶原蛋白，一种或多种粘连蛋白(层粘连蛋白，纤连蛋白)，和其它组分，例如蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)；或独特的基质成分。所述基质成分包括基质成分的片断；基质模拟物，该模拟物可以是用来自一类细胞外基质的一种或多种因子包裹的合成的和/或可生物降解的材料(即微球体)。细胞培养物还包括基础培养基和其它营养成分；激素和/或生长因子，含有或不含诸如血清，血浆或淋巴的生物学液体。另外，该培养基可含有一个或多个区室以容纳诸如培养皿，瓶，转瓶，转移孔或其它这类容器的生物学材料。

本发明的培养物或生物反应器可用于产生各种医学上重要的细胞分泌因子，包括但不限于酶，激素，细胞因子，抗原，抗体，凝血因子，反义PNA，调控蛋白，核酶，融合蛋白等。该培养物适合于提供治疗性蛋白，例如因子VIII，因子IX，因子VII，红细胞生成素，α-1-抗胰蛋白酶，降钙素，生长激素，胰岛素，低密度脂蛋白，载脂蛋白E，IL-2受体和其拮抗剂，过氧化物歧化酶，免疫反应修饰剂，甲状旁腺激素，干扰素(IFNα，β，或γ)，神经生长因子，葡糖脑苷脂酶，集落刺激因子，白介素(IL)1至15，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞，巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板产生的生长因子(PDGF)，腺苷脱氨酶，胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-2)，巨核细胞启动配体MPL，血小板生成素等。

作为本发明的另一实施方案，提供了一种用于治疗和预防肝脏疾病的药物组合物。该组合物包含有效量的尸体肝脏祖细胞和药用载体。目的肝脏疾病包括中毒性，代谢性，遗传性，和/或传染源性或变性性质的急性或慢性肝脏疾病，或由于使用药物或对肝脏的物质损伤引起的肝脏损伤。其中优选的症状和疾病是肝脏炎症，病毒性肝炎，中毒性肝细胞损伤，肝脏纤维变性，肝硬化，肝充血，肝营养障碍，肝细胞脂肪变性，脂肪肝，解毒功能障碍，肝分泌功能障碍，肝接合功能障碍，由肝疾病引起的肝门高血压合成功能障碍，或肝衰竭昏迷，和蛋白降解产物或氨中毒。更具体的说，这些包括但不限于阿拉惹综合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，胆管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里综合征，胆闭锁，Byler疾病，克-纳二氏综合征，Caroli疾病，胆汁郁积瘙痒症，胆石病，接合高胆红素血症，慢性移植物与宿主疾病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-约综合征，红细胞肝性原卟啉症，肝外胆管癌，家族性高胆固醇血症，半乳糖血症，吉尔伯综合征，糖原存储疾病，血管瘤，血色病，肝脑病，肝胆管炎，肝软化，肝大，肝癌，肝胚细胞瘤，遗传性血色病，黄胆，肝内胆汁郁积，肝囊肿，肝移植，与Bacillus cereus相关的肝衰竭，混合型冷球蛋白血症，鸟氨酸转氨甲酰基酶缺陷，紫癜肝病，迟发性皮肤血卟啉病，原发性胆肝硬化，顽固性腹水，罗托综合征，肉样瘤病，硬化性胆管炎，皮脂腺病，Summerskill综合征，血小板减少症，酪氨酸血症，静脉曲张性出血，肝脏静脉闭合疾病，和肝豆状核变性及其组合。

参照下面的详细说明完成其它的主题对本领域的技术人员而言是已知的。

附图的简要描述

图1a和1b显示了暖局部缺血对具有小核和大核的分离细胞的比率的影响。

图2a和2b显示了对造血细胞中截短的甲胎蛋白(AFP)的PCR分析。

图3显示了在-170℃的贮存时间与复苏的胎儿肝细胞活力之间的关系。

图4a和4b显示了以荧光激活的细胞分选(FACS)分析的胎儿肝细胞悬液的典型单变量直方图。

图5显示了在未分离的肝细胞悬液中表达表面标记CD14，CD34，CD38，CD45和血型糖蛋白A(GA)的细胞的百分数。

图6显示了在原始细胞悬液中表达甲胎蛋白和其它抗原标记的细胞百分数。

图7a，7b和7c显示了在排除红血细胞之前和之后的甲胎蛋白表达。

图8a，8b，8c，8d，8e和8f显示了胎儿肝细胞悬液中CD14，CD38和AFP共表达的FACS分析。

图9显示了AFP-阳性细胞的CD14和CD38富集。

图10a，10b，10c和10d显示了人肝脏祖细胞的荧光显微镜检。

图11a，11b，11c和11d显示了用表达AFP选择的代表性细胞。

图12a，12b和12c显示了在该视野中有两个AFP阳性细胞。

图13a和13b显示了用钙黄绿素(A)标记的细胞以显示所有细胞类型。

本发明的详细描述

在下面的描述中，使用了许多术语广泛描述了本发明。为了提供对说明书和权利要求书的清楚和一致的理解，提供了下列定义。

甲胎蛋白样免疫反应性：由甲胎蛋白引起的任何免疫反应。甲胎蛋白由mRNA的变异体形式产生，其中一些变异体是肝脏祖细胞所特有的且有些是造血祖细胞所特有的。

定向祖细胞：具有单一命运的未成熟细胞，例如肝细胞定向祖细胞(产生肝细胞)或胆定向祖细胞(产生胆管)。定向过程在分子水平上尚不清楚。而且，认为当细胞命运从其祖先命运变窄时仅以经验发生该定向过程。

肝细胞：肝脏细胞的亚群体，包括肝细胞和胆细胞。

肝脏细胞：本文使用的术语“肝脏细胞”是指正常肝脏中存在的所有类型的细胞，不论其起源或命运。

干细胞：本文所用的术语“干细胞”是指可产生具有一种以上命运的子代细胞的未成熟细胞。一些子代细胞与亲代相同且一些“定型”为一种特定的命运。全能干细胞具有自我更新(自我维持)能力，而定向干细胞的自我更新能力有问题。干细胞在再生性增殖过程期间更新。

肝祖细胞：这些细胞产生肝细胞和胆细胞。肝祖细胞包括三种亚群体：“肝干细胞”，“定向肝细胞的祖细胞”，和“定向胆祖细胞”，后两种细胞是未成熟细胞，它们是肝干细胞的后代且具有单一命运，即或者肝细胞或者胆细胞，而不是两者。

肝干细胞：肝祖细胞的一种亚群体。

肝脏祖细胞：一种来自肝脏的细胞群体，包括肝祖细胞，造血祖细胞和问充质祖细胞。

卵形细胞：具有卵形核的小细胞(＜15微米)，在动物接触致癌损伤时增殖。据认为这些细胞来源于肝脏祖细胞且部分或完全转化。

“肝脏”是位于腹部最前部位的大型器官，安置在腹腔和胸腔之间的肌肉隔膜上。肝脏是生命所必需的且完成100种以上的重要功能，例如解毒毒物和药物，代谢脂肪，存储糖类，生产胆汁，血浆蛋白和其它物质，并辅助凝血。肝脏疾病通常难以检测，直到形成严重疾病，因为存在过多的肝脏组织，且肝脏能部分自我再生。肝脏疾病的征兆随损害的程度和位置而变化。各种血液化验对发现肝脏损伤的程度和性质是必须的。

本文使用的术语“生长因子”是指调节发育事件所需的或者调节编码可参与细胞通信和发育协调的其它分泌蛋白的基因表达所需的那些因子，且包括但不限于肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素样生长因子-I和II(IGF-I和II)，表皮生长因子(EGF)，a型和b型转化生长因子(TGF-α和TGF-β)，种经生长因子(NGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，肉瘤生长因子(SGF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子(GM-CSF)，血管内皮生长因子(VEGF)，催乳激素和生长激素释放因子(GHRF)和各种造血生长因子，例如白介素(IL)IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，等，红细胞分化因子(EDF)或促卵泡激素释放蛋白(FRP)，抑制素，干细胞增殖因子(SCPF)及这些蛋白质的活性片断，亚基，衍生物和其组合等本领域已知的许多其它因子。一般来说，下文所用的生长因子是指选自细胞因子，淋巴因子，自介素，集落刺激因子，激素，趋化因子，抗趋化因子，凝血因子，溶栓蛋白，补体蛋白，酶，免疫球蛋白和抗原的分泌蛋白。

血细胞生成：产生具有淋巴细胞(B和T)，血小板，巨噬细胞，嗜中性白细胞和粒细胞的细胞命运的血细胞。

间充质形成：产生具有内皮细胞，脂肪细胞，基质细胞，软骨细胞，甚至骨细胞的细胞命运的间充质衍生物(仅在疾病装态下在肝脏中出现后两种)。

细胞治疗：本文所用的术语“细胞治疗”是指体内或离开体内转移限定的细胞群体用作自身或同种异体材料并移植到患者特定靶细胞或其附近。细胞可在任何合适的的培养基，载体或稀释剂，或者包括微载体，珠，微粒体，微球体，囊泡等的任何类型的药物传递系统中移植。

基因治疗：本文所用的术语“基因治疗”是指将确定的遗传材料体内或离开体内转移到需要它的患者的特定靶细胞，从而改变基因型，且在大多数情况下，改变那些靶细胞的表型达到预防或改变特定疾病状态的最终目的。按照这一定义规定，隐含的前提是设计这些治疗性遗传操作最终预防，治疗或改变明显的或隐蔽的病理学状态。在大多数情况下，基因治疗操作的最终治疗目的是改变特定靶细胞群体的表型。

CD：“分化簇”或“共有决定簇”在本文中用于指被单克隆抗体识别的细胞表面分子。一些CDs的表达对于特定谱系或成熟途径的细胞是特异性的，其它CD的表达根据激活的状态，位置，或相同细胞的分化而变化。

倍性；细胞内的染色体数。

二倍体：每个细胞两组染色体。

四倍体：每个细胞4组染色体。

八倍体：每个细胞8组染色体。

多倍体：每个细胞有两组以上的染色体。

正常胎儿或新生儿肝脏的细胞是二倍体。到青年时期，肝脏是二倍体和多倍体细胞的混合物。在啮齿类中，肝脏大约90％是多倍体且仅有大约10％是二倍体细胞。在人类，青年人的肝脏由大约50％的二倍体和50％的多倍体细胞组成。

不限于肝脏，本发明公开并要求保护来自各种尸体组织的其它祖细胞。下文所用的术语“尸体组织”不包括来自经过手术方法以诸如成熟前终止妊娠的方式获得的死亡胎儿的组织。以自然或协助分娩生产的人类认为是新生儿或婴儿而不是胎儿。因此，人类的年龄在分娩或生产时开始为“0”，而不是从受孕的开始。因此在分娩时死亡的新生儿认为是尸体而不是胎儿。刚获得的胎儿组织已被用作一些祖细胞的来源且因此它们被排除在本发明的权利要求的范围之外。然而，由于推测的局部缺血效应而被认为不适合于进一步的医疗用途的胎儿组织仍然适合于本发明的目的。

当在本说明书中使用术语“一”时，是指“至少一个”或“一个或多个”，除非另有说明。

图2a和2b显示了在造血细胞中截短的AFP的PCR分析。使用引物组合hAFP1，hAFP2，hAFP3，和hAFP4进行RT-PCR。泳道1-3相应于Hep3B-细胞；泳道10-12相应于STO细胞；泳道13-15没有RNA或cDNA。注意，在泳道2，5，和8中有一条共有带，即截短的AFP同种型。在泳道1和4中明显有一条肝脏细胞特有的截短的AFP同种型。在泳道3和6中观察到完整的AFP种类。

图3显示了在-170℃下贮存时间与复苏的胎儿肝脏细胞活力之间的关系。数据表示为在处理时与复苏时测量的活力的改变百分数。这些数据表示冷藏方法不明显影响细胞的活力。贮存时间延长到550天时活力无明显改变。

图4a和4b显示了以荧光激活细胞分选法(FACS)分析的胎儿肝脏细胞悬液的典型单变量直方图。制备细胞悬液用于免疫荧光分析，使用与红色染料，Cy5偶连的抗体分析甲胎蛋白(AFP)，使用偶连到蓝色染料(AMCA)上的抗体分析白蛋白。筛选了3万个细胞的红色(AFP)和蓝色(白蛋白)荧光。结果显示了清楚的各蛋白质阳性的细胞组。进一步分析表明大约80％的各蛋白质的阳性群体是相同的细胞(即，共表达两种蛋白质)。

图5显示了在未分离的肝脏细胞悬液中表达表面标记CD14，CD34，CD38，CD45和血型糖蛋白A(GA)的细胞的百分数。注意GA数据在右轴上绘图以保护刻度。

图6显示了在原始细胞悬液中表达甲胎蛋白和其它抗原标记的细胞百分数。平均值±SFM表示甲胎蛋白(AFP)和特异性细胞表面标记(CD 14，34，38，45和血型糖蛋白A)阳性的细胞百分数。

图7a，7b和7c显示了去掉红血细胞之前和之后的甲胎蛋白表达。图7a显示了使用Percoll分离法选择性去掉红细胞或者没有去掉红细胞的胎儿肝脏细胞悬液中的甲胎蛋白的表达且图7b显示了白蛋白的表达。图7c显示了表达甲胎蛋白和白蛋白两者的细胞比例，表示为AFP或白蛋白阳性细胞百分数。显示了使用Percoll分离法去掉红细胞的细胞的数据。

图8a，8b，8c，8d，8e和8f显示了胎儿肝脏细胞悬液CD14，CD38和AFP共表达的FACS分析。双变量散点图(8a)显示了TriColor染色的CD14(纵坐标)与FITC染色的CD38(横坐标)的分布。根据CD14和CD38信号产生通道以选择特异性细胞分组。然后用于显示各亚组中AFP染色的强度(图8b，8c，8d和8e)。AFP结果表明通过选择CD38或者CD14阳性的细胞产生了AFP的高水平富集。全部细胞悬液(30,000个细胞)产生的AFP信号在图8f中显示。

图9显示了AFP-阳性细胞的CD14和CD38富集。通过选择具有阳性表面标记的细胞的标记CD38和CD14可显著增大从胎儿肝脏制备的细胞悬液中AFP-阳性细胞的比例。两种标记的组合产生的含有AFP的细胞的富集比用单一标记获得的富集明显更好。

图10a，10b，10c和10d显示了人肝祖细胞的荧光显微镜检。

来自胎儿肝脏的代表性肝祖细胞的AFP成分被染色。细胞大小表示同时存在早期的祖细胞和更进化的肝祖细胞。

图11a，11b，11c和11d显示了以表达AFP选择的代表性细胞。CD14染色阳性的细胞(11b和11d)是成肝细胞的特征。表面标记染色阴性的细胞(图11a和11c)较小且大小和形态与早期肝祖细胞一致。

图12a到12c是相同的视野且显示了在该视野中有两个AFP阳性细胞。图12a显示了一个聚焦相的图像。图12b显示了用AFP抗体的免疫荧光。图12c显示了(a)和(b)的覆盖图，显示了在肝脏细胞组中AFP阳性细胞的形态学。发现不论从胎儿还是从成年肝脏中分离的AFP阳性细胞都具有相似的细胞大小和形态学。

图13a和13b显示了用钙黄绿素标记的细胞(a)以显示所有细胞类型。图13(b)由共表达AFP的相同细胞组成并显示了只有两个细胞为AFP-阳性。细胞大小不是AFP阳性的要素。

肝脏的再生能力是广泛公认的，且通常通过正常情况下增殖静息的肝细胞进入细胞周期来实现这点。然而，当肝细胞再生受损时，小胆管增生并侵入相邻的肝细胞实质中。在人类和实验动物中，这些管细胞称为卵形细胞，其与缺陷型再生的联系导致相信它们是转化的干细胞或祖细胞。这些细胞具有极大的生物学益处，因为其正常相应细胞，即肝祖细胞可用作肝脏移植的替代选择且它们也可用作基因治疗以矫正先天性代谢错误的载体。尽管已经明确地证实了祖细胞分化成肝细胞的能力，但是由于供体肝脏组织的缺乏，对所述细胞的要求还不能满足所需的供应。

正如本文所公开的，从人尸体肝脏分离肝脏祖细胞是新的且是意想不到的，因为本领域流行的观点是由于局部缺血肝脏丧失了其实用性。

通过应用本发明人首次用于从尸体获得本发明的独特细胞群体的独特方法，标记和参数的组合获得了从本文所述的尸体供体分离人肝祖细胞。

甲胎蛋白和白蛋白这两种胞质蛋白质认为是肝细胞谱系特别可靠的标记。它们已成为从肝脏中的其它细胞类型鉴定肝细胞亚群体的策略的基础。在肝细胞的鉴定中两者都是关键性向导，但甲胎蛋白尤其是在经过流式细胞术纯化后的肝祖细胞的鉴定特征。甲胎蛋白，即AFP也已经被用于在任何类型的分离策略后评估肝祖细胞的纯度。

然而，在证实这两种标记在鉴定肝细胞谱系中的有效性的严格对照中，进行了PCR分析以检测在肝脏组织中已知的多种细胞类型中的表达。PCR分析是检测即使微量的特定mRNA种类的表达时最敏感的测定法。本文公开的本发明证实了在造血祖细胞中可发现AFP和白蛋白两者mRNA的具体同种型意味着当使用该敏感测定法时，必须使用其它标准，例如使用AFP的外显子1探针用于从造血细胞群体限定肝细胞。尽管PCR分析揭示了造血祖细胞可表达AFP和白蛋白mRNA种类，但mRNA表达水平极低。事实上，当在蛋白质水平上测量AFP和白蛋白时，在造血祖细胞中不致发现可检测的AFP或白蛋白。因此，对于常规蛋白测定法(免疫荧光，Western印迹等)和高水平表达mRNA的测定法(Northern印迹)，AFP和白蛋白仍然是确定肝细胞谱系的有价值的标记。

本发明还公开了RT-PCR特异性引物的设计和制备以测定肝细胞与造血细胞群体中AFP mRNA同种型的表达方式。人AFP RT-PCR引物的三种不同组合用于区别肝细胞和造血细胞谱系中AFP mRNA的表达。为了检测造血细胞中AFP的表达，如实施例1所举例，本发明人筛选了肝细胞与造血细胞来源的一些细胞系中AFP的完全与截短形式。在这些试验中使用RT-PCR，它是已知鉴定特定RNA模板时最敏感的技术。迄今的数据表明人AFP在来自肝祖细胞的两个人细胞系(HepG2和Hep3B)中以完全形式存在，在来自造血祖细胞的人细胞系K562中以截短形式存在。外显子1是肝祖细胞亚群体所特有的事实使得人们能够使用它作为鉴定肝细胞与造血祖细胞类型的探针。该试验用于鉴定本发明的肝脏祖细胞中的特定亚群体。

因此，为了检测肝脏祖细胞中人AFP mRNA的存在，本发明人设计了9个PCR引物。所有的引物组合检测人肝细胞系HepG2和Hep3B中的AFP mRNA。然而，除了用于全长hAFP mRNA的一个外所有的引物组合在人红白血病细胞系K562中都扩增AFP mRNA的部分。如上推测，这证实了在K562中表达AFP的一种截短形式，而不是全长形式。该结果表明鉴定肝细胞的有用引物仅仅是检测全长AFP的那些引物，更多证明其表达以组织特异性方式受到限制。筛选肝细胞与造血细胞来源的一些细胞系和原始组织中AFP的完全与截短形式。尽管在一些造血组织中发现了AFP的截短形式，但组织中哪一种细胞类型表达它仍是未知的。

由于在造血细胞的一些亚群体中发现了AFP的截短形式，所以也分析了肝细胞和造血细胞中的白蛋白。白蛋白的引物以类似于AFP(见上文)的方式形成并用于评估肝细胞与造血细胞系中白蛋白的表达(见图4)。对于AFP，在造血细胞系K562中发现了一种截短的形式，一种可被外显子12-14的引物检测的转录子。

在本文所述的研究之前，在关于造血祖细胞的大量文献中，没有一个曾报道在人的正常造血祖细胞中成熟的或截矩的AFP或白蛋白的表达。

人肝脏祖细胞的处理和冷藏

为了最理想地从胎儿或成年肝脏产生分离的人肝脏祖细胞，本文公开的方案使用密度梯度的上面部分并去掉沉淀。本文所公开的密度梯度离心的新变化是弃去沉淀并保留具有低浮力密度的细胞(即在梯度顶部收集的细胞)并用于进一步研究。本发明人发现了在Percoll密度梯度内或其顶部存在年幼的细胞(即，二倍体)和对于冷藏更健康的细胞。

本文所述的培养方法学是特有的且被进一步改良用于人和/或啮齿类肝脏细胞。另外，培养基可包括用纯化的细胞外基质成分包裹的可生物降解珠，然后可用于接种结合到珠上的细胞以用于生物反应器。

本发明的冷藏方法学是特有的且不同于现有技术中使用的方法。主要区别是由于使用了不同的缓冲液且冷藏包括祖细胞群体的二倍体肝细胞群体，该细胞密度低，因此在梯度离心中上浮。

成熟的人肝脏细胞的成功冷藏是非常需要的，但在本领域中从未实现。一般来说，成功冷藏定义为在液氮温度(-160℃到180℃)下冷冻细胞，然后复苏它们并获得＞75％的活力的能力且具有附着到培养皿上的能力。任何来源的细胞系，例如精子和卵子和来自胎儿组织的细胞可在含水缓冲液(即，诸如DME，Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基，或RPMI 1640的培养基)并补充10％血清+冷冻保护剂(最常见的是二甲基亚砜：DMSO)中成功冷冻并在复苏时70-90％有活力且具有极好的贴壁能力。

本发明的特殊冷藏方法学通过使用新缓冲液，新细胞群体和包括以细胞外基质的形式包埋细胞的改变来实现。该方法学首次实现了复苏时的活力与冷冻前细胞分散后立即测量的活力没有不同(参见图3)。实际活力由于到达时组织的状况而可变，在本试验中胎儿尸体肝脏细胞平均为77％。该冷藏方法学导致冷冻过程后的活力和复苏后离开体内的可贴壁和增殖的细胞不明显损失。

细胞标记和流式细胞术

使用我们现在的定义，即肝脏祖细胞是表达甲胎蛋白且表达或不表达白蛋白的未成熟细胞群体，评价了特异性选择这些细胞的标记。一个令人惊奇的发现是许多作为造血祖细胞传统标记的标记(即CD34)也可鉴定肝祖细胞亚群体。因此，对CD34的单一颜色分选导致明显富集(至少9-倍)表达AFP的细胞。然而，不是所有的这些AFP阳性细胞都被证实是肝祖细胞。根据白蛋白阳性的百分数，大约80-90％的细胞是肝祖细胞，其它是未成熟以致尚未表达白蛋白的肝祖细胞或者可能是表达甲胎蛋白的造血亚群体。

本发明使用了独特的流式细胞分选策略。使用AFP和白蛋白表达的组合作为肝祖细胞的两个独特限定特征，鉴定了限定肝祖细胞的抗原标记和其它流式细胞术参数。目前的分选策略包括分选小细胞(通过前向散射测量为＜15微米)，它是二倍体(使用Hoechst染料33342产生的荧光)，侧面散射无颗粒，且对某些造血细胞抗原(即血型糖蛋白A，红血细胞抗原和CD45)为阴性，接着是肝细胞亚群体和造血细胞亚群体共有的标记(即CD14和/或CD38)为阳性。

在本文所述的实验中，本发明人通过分选高度表达甲胎蛋白，表达已知是特异性造血干细胞标记的CD34，和任选微弱表达白蛋白的那些细胞来鉴定肝祖细胞。本文还描述了造血细胞也可表达AFP，尽管是一种截短形式的证据。本发明人描述了一种新细胞群体和分离、鉴定、培养的方法，以及使用该细胞群体的方法。本发明的特定细胞群体的分离、鉴定和培养的成功部分通过先进的分离方法，亲和压实，具有更大速度和精确度的高速荧光激活细胞分选，和改进的冷藏和培养技术实现。

设计流式细胞分选策略从新分离的细胞悬液或从复苏的冷藏肝脏细胞中纯化肝脏祖细胞，它包括1)用一些抗特异性细胞表面标记的荧光探针标记的抗体染色细胞和2)在多参数流式细胞技术中使用阴性和阳性分选的联合。从人肝细胞群体纯化特定谱系阶段的方法可用于来自任何年龄供体的肝脏，因为该标记似乎是谱系-位置特异性的。

改进的标记细胞的方法，和相对于过去使用的流式细胞仪(Becton Dickenson’s FACSTAR PLUS，以2000-6000个细胞/秒分选细胞且进行2-4种颜色分选)显著改进的流式细胞仪(来自Cytomation的“aMoFlo”流式细胞仪，以40,000个细胞/秒分选细胞且进行8种颜色分选)帮助成功分离，和鉴定了这一新的细胞群体。

在细胞悬液中完全确定了AFP和白蛋白样免疫反应性的表达，有清楚的一群细胞与背景信号表现出明显的区别(图6)。在未分离的细胞悬液中6.9±0.86％的细胞表达甲胎蛋白，而在7.7±1.1％中存在白蛋白。在AFP阳性细胞中，75.6±4.9％共表达白蛋白，而80±5.5％的白蛋白阳性细胞也表达AFP。因此，大约25％的表达甲胎蛋白的细胞不表达白蛋白且20％的表达白蛋白的细胞不表达甲胎蛋白。

完全细胞悬液(即包括红细胞)中带有本研究中使用的原则性表面标记的细胞比例在表1中显示(其中GA是血型胜蛋白A，红血细胞上的一种表面标记)：

表1：原始肝脏细胞悬液中CD阳性群体的百分数和AFP阳性的百分数

             CD14         CD34       CD38       CD45       GA

未分离的悬液

占群体％     3.7±0.8(8)  2.8±0.5   2.2±0.4   2.6±0.5   36.8±5

AFP阳性％    81.7±2.2    72.6±4.2  57.6±4.6  22.2±4.4  2.3±0.6

很明显，血型糖蛋白A(GA)阳性细胞(即红细胞)是细胞群体的主要组分，但AFP-阳性细胞是微小部分。因此，当通过Percoll分离法去掉细胞悬液中的红细胞时，表达AFP的细胞比例显著增加到12.9±1.9％且表达白蛋白的那些细胞增加到12.1±2.3％。共表达白蛋白的AFP阳性细胞百分数也增加到80.5+8.2％且共表达AFP的白蛋白阳性细胞比例增加到89+3.1％，尽管没有统计学上显著的改变。该操作对携带表面标记的细胞比例的结果与显示AFP染色阳性的各亚组的比例一起在表2中显示。

表2：去掉红细胞后肝脏细胞悬液中CD阳性群体的百分数和AFP阳性的细胞百分数

              CD14        CD34       CD38       CD45       GA

去掉红细胞

％占群体      7.4±1.3    3.4±0.5   4.8±0.9   8.2±0.3   27.5±4.7

％AFP阳性     89.8±1.3   77.1±2.9  53.5±7.2  32.5±1.3  1.8±0.9

在大多数情况下，在以细胞表面标记选择的亚组中AFP的存在连续分布，显示出染色强度在阳性范围内的细胞明显占优势。然而，对于共表达AFP的CD38阳性细胞的分布是独特的。在CD38-阳性细胞中，AFP共表达明显呈双峰分布，其中明显有两个不同组的细胞，一个为AFP阳性组，另一个为阴性。这点在图8a中显示，它显示了表达CD14和CD38的染色细胞的散点图以及在CD14和/或CD38阳性细胞中甲胎蛋白表达的单变量直方图。

结果表明甲胎蛋白(AFP)在胎儿肝脏组织的单细胞悬液(即原始细胞悬液)中的7％的细胞中存在。发现抗血型糖蛋白A(在红血细胞，即红细胞上的一种抗原)的抗体鉴定出不表达AFP的细胞亚群体。因此，从打算鉴定肝祖细胞的细胞中排除表达该抗原的细胞(即，红细胞)。CD38抗原鉴定了一群细胞，它们表现出AFP阳性细胞的比例显著提高(即，比未分离样品中的比例高7倍)。两种抗原都具有许多同种型，取决于是否有剪接变异体编码的分子片断存在。鉴定各种同种型的抗体是可获得的。

造血祖细胞的传统标记，即CD34存在于许多也表达AFP的细胞上。CD34阳性细胞的分选导致AFP阳性细胞的富集比原始细胞悬液中发现的高至少9倍(在CD34-阳性细胞中的67％与在原始细胞悬液中的7％)。然而，富集AFP阳性细胞最有效的单一抗体是CD14，它导致这些细胞的比例比原始群体增加11倍(81％相对于7％)。

因此，通过使用表面标记的组合提高了AFP阳性细胞的产率。因此，测定AFP与表面标记的选定组合共表达的程度以建立增加细胞内标记的选择程度。该数据表示为表达表面标记的AFP阳性细胞的比例(称为AFP阳性细胞的“产率”)和在表面标记限定的群体中出现的所有AFP阳性细胞的比例(称为AFP阳性细胞的“富集”系数)。CD14，CD34与CD38组合的结果以及用于比较的单个结果在表3中表示。

表3.

      CD14       CD34       CD38       CD14±CD38  CD14±CD34

富集  80.6±2.6  66.7±4.7  53.8±4.5  66.9±3.5   68.2±3.9

产率  39.8±2.6  26.9±4.4  22.0±2.7  50.6±2.7   52.2±5.5

富集：表达任一(或两种)表面标记且同时为AFP阳性的细胞百分数。

产率：同时表达一种或两种表面标记组合的AFP阳性细胞百分数。

对于CD14/CD38标记组合的这些数据还显示在图9中。

AFP染色阳性的细胞形态学是可变的且包含来自胎儿肝脏而不是成人肝脏的细胞悬液中的细胞大小和形状的全部范围。最大的AFP-阳性细胞大约12-15微米，比大小范围为20-50微米的成熟肝细胞小得多。这点在图10中显示，该图显示了一些AFP-阳性细胞选择表达特异性抗体。

在所有情况下一定比例的AFP-阳性细胞显示出不表达在本研究中使用的任何表面抗体。这些AFP阳性“裸”细胞的外观在图11a和11c中表示，其中将它们与从相同悬液分选的CD14阳性/AFP阳性细胞的外观(图11b和11d)进行了比较。图11a和11b是微分干涉相差显微镜照片，图11c和11d是AFP免疫荧光。很明显尽管两种细胞类型都是AFP阳性，但表面抗原染色阴性的细胞比CD14阳性细胞更小且复杂度更低。

总之，分选肝祖细胞的标记是血型糖蛋白A^-，CD45^-，ICAM⁺，CD14⁺和/或CD38⁺，或者除了ICAM⁺外所有这些标记都无，且是二倍体，无颗粒(侧向散射)，不超过15微米(前向散射)。这些分选细胞的表型是小细胞(＜15微米)，细胞质较小(核/胞质比率高)，白蛋白和/或。该细胞的形态学见图10-12。

胎儿和成人肝脏中表达甲胎蛋白的细胞的聚焦鉴定

使用聚焦显微镜以获得表达甲胎蛋白的人胎儿，小儿，或成人细胞的图像。该方法学允许现察这些细胞的形态学和大小并直接显示诸如AFP和ALB的细胞内蛋白的位置和诸如CD34和CD38的膜表面标记的位置。表达AFP的细胞在胎儿，小儿，和成人肝脏中都有发现(图12a)。正如预期，胎儿肝脏具有最高百分数(6-7％)而成人肝脏具有小百分数(青年＜4％)且在中年人中随年龄减少到＜1％。在年龄超过57岁的供体肝脏中没有发现表达AFP的细胞。通过Percoll分离过程显著富集在尸体肝脏中发现的少量肝祖细胞使得在供体肝脏的Percoll馏分1和2中得到2％的细胞(表4)。

表4显示了来自Percoll-添加缓冲液的馏分的细胞大小和活力。在相同条件下分离后较小的细胞(馏分1-3)比较大的细胞(馏分4)具有更高的活力。

表4

Percoll

馏分     活力(％)   细胞大小(μm)％     AFP+细胞

馏分1    82         ＜12                0.5-1％

馏分2    84         10-15               2％

馏分3    85         15-25               ＜0.2％

馏分4    56         25-50               ＜0.01％

这些结果表明优选用于肝脏细胞治疗以及器官移植的供体器官包括来自年龄达到45岁的青年供体的器官且该肝脏优选从心跳停止的前30小时内分离。来自老年病人(年龄＞71岁)的肝脏对于细胞治疗且也许对于完全器官移植，特别是对于儿童不是合适的供体，因为它们具有较小(如果有的话)的来自肝祖细胞的再生能力且仅具有最小的已知从成熟细胞获得的再生能力。

成熟谱系

本发明的发明人显示了局部缺血损伤的肝脏含有在正常和疾病状态下都能生长并分化成肝细胞和胆细胞的肝祖细胞群体。本发明支持了这样的观点，即肝脏谱系中的每一位置是不同的成熟阶段且在肝脏中有多种干细胞群体。

令人惊奇的是本发明的肝脏提供了3种不同的成熟谱系：一种负责肝生成，产生肝脏组织且具有肝细胞和胆细胞(胆管)的细胞命运；另一种负责造血，产生血细胞，具有淋巴细胞(B和T)，血小板，巨噬细胞，嗜中性白细胞和粒细胞的细胞命运；第三种负责间充质形成，产生间充质衍生物且具有内皮细胞，脂肪细胞，基质细胞，软骨细胞，甚至是骨细胞的细胞命运。

本发明分离的细胞群体具有作为成功地肝脏定向细胞治疗和/或基因治疗的巨大潜力。如实施例所述，本发明在非人灵长类以及人肝祖细胞可成功进行细胞培养和维持同时仍保留其完全分化或成熟的能力的条件鉴定方面取得了巨大进展。按照本文公开的教导，可以从尸体分离并在培养基中维持未分化的肝祖细胞，然后更换成分化相关培养基用于移植。

由于其明显的体外扩增能力，本发明的细胞群体相似于造血谱系中的细胞，可用作细胞种子用于离开体内的扩增。这可消除对病人肝脏的主要侵入性手术切除术的必要性。

一旦在培养基中建立人肝祖细胞，可进行基因转移。这可用许多不同基因传递载体系统来实现(见下文提供的实施例)。在这点上的一个重要考虑因素是一些形式的基因转移需要迅速生长的细胞，由于本发明的人二倍体细胞和/或祖细胞在正常生理学条件下有效分裂，因此这些细胞是将基因转移进肝脏的理想候选者。另外，本发明的细胞群体的生长特征允许用于离开体内的基因转移，其中使用的某些基因传递病毒载体需要细胞增殖以便有效插入和表达基因。

本发明的祖细胞群体也适合于自体或同种异体肝脏定向细胞或基因治疗。很明显，使用自体肝祖细胞可消除有关移植细胞排斥的重要顾虑。本发明的细胞群体对于同种异体细胞转移特别有吸引力，因为其抗原分布情况表明它具有最小的免疫排斥现象。而且，已知具有高度免疫原性的诸如血细胞，内皮细胞，肝巨噬细胞的其它细胞成分通过该纯化过程基本上被剔除。

一旦分离和纯化了该自体或同种异体肝祖细胞，可对它们进行遗传修饰或原样使用，如果需要可进行增殖，然后移植回宿主。如果需要遗传修饰，在遗传修饰后和移植前，可扩增那些遗传修饰的细胞和/或根据显性选择标记的插入和表达进行选择。可移植回肝室或异位位点。为了移植进肝室中，可使用门静脉输注或脾内注射。脾内注射是可选择的施用途径，因为经脾内注射移植的大多数肝祖细胞可移动进肝脏。一旦在肝室中，移植的，遗传修饰的肝祖细胞成熟成正常肝细胞形态学。

另一医学方法可促进移植的肝祖细胞移入肝的效力。动物模型证实在部分肝切除术中，施用血管形成因子和其它生长因子帮助移植的肝细胞移入和有活力。一个替代方法是将遗传修饰的肝细胞移植进异位位点。

至今对于肝脏的细胞治疗方法仅显示出平常的效力。这可能是由于这样的事实，即使用的供体细胞主要是成人肝脏细胞且分离和再注射后寿命短。另外，使用成人细胞导致强烈的免疫排斥。在本案例中，肝祖细胞提供了更大的效力，因为其诱发免疫学排斥现象的能力有限且因为它们具有广泛的再生潜力。

对于基因治疗，正在进行的努力使用了“定向可注射载体”，它是开发中的用于临床治疗的最流行途径。这些方法的效力有限，因为免疫学问题和载体的瞬时表达都存在。用祖细胞进行离开体内的基因治疗(或者使用可注射载体以某种方式靶向那些祖细胞群体)可证实更有效，因为该载体可导入离开体内的祖细胞的纯化亚群体；选择修饰的细胞并重新导入体内。祖细胞的优势是它们有巨大的扩增潜力，最小的免疫反应诱导力(如果有的话)，和分化产生全部谱系的成熟细胞的能力。

共同或相互依赖的谱系

改进的方法学使得本发明人能够更严密地研究和鉴定肝祖细胞。这些研究揭示了肝祖细胞与造血祖细胞之间特别密切的关系，表明这两个谱系之间有近亲关系。事实上，这些研究表明肝祖细胞和造血谱系共有许多抗原标记(CD14，CD34，CD38，c-kit，卵形细胞抗原)，共有生化特性(即，转铁蛋白，谷胱甘肽-S-转移酶，和甲胎蛋白的截短同种型)，且在用于离开体内的扩增的培养要求(细胞外基质的形式和特定激素要求)上有广泛的重叠。两个谱系的祖细胞位于肝脏腺泡内的相同位点。最后，两个成熟谱系的细胞中存在旁分泌信号；它是由各谱系产生的调节另一谱系的细胞的信号。事实上，可推断在肝细胞和造血细胞之间有一个共同的谱系或至少是相互依赖的谱系。

可纯化本文公开的细胞群体并用于根据细胞的分离和培养条件产生骨髓造血细胞或肝细胞衍生物。因此，如果细胞被再导入体内进入血液中，它们可有效地产生骨髓造血细胞衍生物；如果被导入肝脏，它们会产生肝脏细胞。在离开体内维持的细胞中应出现相似的现象。因此，用同时限定肝和造血祖细胞的一组抗原(即，CD38⁺，c-kit⁺，CD45^-)分选的细胞群体接种的生物反应器系统可导致细胞群体具有多种命运。

本发明的细胞群体的另一重要方面是群体中的一些细胞展示出特异性的祖细胞表面抗原CD34。CD34已被用作骨髓造血干细胞的方便的阳性选择标记。本文公开的本发明显示了纯化任何祖细胞群体的更好方法，例如随后可用于临床和临床前期程序的造血和肝祖细胞群体。

人肝祖细胞的用途有许多且变化多样。它们包括：1)对人细胞的研究；2)产生疫苗或抗病毒剂；3)毒理学研究；4)药品开发；5)蛋白质生产(使用该细胞作为各种人特异性因子的宿主)；6)肝脏细胞治疗：7)肝脏基因治疗；8)可用于研究，毒理学和抗微生物试验，蛋白质生产，或者临床上用作肝脏辅助系统的人造生物肝脏。考虑到正如本发明的发明人所预言的，在造血和肝生成之间有共同谱系的可能性，相同的细胞可同时适合于肝细胞或者造血细胞命运，这取决于它们所放置的微环境。

高度纯化的人肝祖细胞的可获得性允许对人细胞进行更加广泛的研究，且肯定会帮助建立肝脏细胞治疗和基因治疗的成功方式，并允许建立人的人造生物肝脏用于研究和作为临床辅助装置。目前，健康人体组织的供应有限妨碍了在肝脏细胞治疗或人的人造生物肝脏中的临床计划。从尸体获得的包括其祖细胞群体的二倍体细胞具有足够的扩增潜力以极大地缓解这种有限的供应。

下面的实施例是举例性的且不打算进行限制性。

实施例

来自尸体的肝脏获取

来自尸体的肝脏经门静脉，腔静脉，或两者插入导管，用缓冲液灌流以清除血液；然后用含有胶原酶/蛋白酶的缓冲液灌流以酶促解离细胞。根据肝脏的大小通常进行15-30分钟的消化后，将组织挤压通过干酪包布或尼龙滤膜或用梳子耙过以机械完成细胞解离过程。用含有血清的缓冲液清洗解离的细胞以灭活胶原酶和在灌流过程中使用的其它酶。

灌流缓冲液P1和P2放在37℃水浴中。在Miller型灌流盒中进行灌流，该灌流盒在整个灌流过程中维持在37℃。灌流期间给缓冲液充氧。盒中的所有管道用70％的乙醇清洗，接着用蒸馏水清洗，然后用P1清洗以保证从系统中去掉空气。对于大块肝脏(100-300g)使用在肝脏的切口表面可利用的各种血管，使用配置在60ml注射器上的16号针头的Teflon插管进行肝脏插管以便用冰冷的P1缓冲液流过肝脏。对于可获得完整肝叶的情况，可对残留的腔静脉做插管。试验大块肝脏中的各种血管以获悉哪一条血管可提供最佳的组织灌流。该操作也从肝脏中去掉了任何剩余的血液。对选定的血管做插管并使用医疗级粘合剂(例如，医疗级“超级胶(superglue)”)密封固定。使用医疗级粘合剂密封所有其它的大血管和表面开口，且如果需要，使用带粘合剂的Q-滴头帮助密封开口。一旦粘合剂干燥，将肝脏样品放在合适大小的玻璃杯内的尼龙网上。将P1缓冲液加入杯中，并将肝脏浸没在缓冲液。将装有肝脏的杯子放在灌流盒内，并连接上插管的输出管道。用可接受的反压开始以大约24mls/分钟的低速，然后缓慢增加到58ml/分钟和90ml/分钟之间以优化流速将P1缓冲液再循环15分钟。必须确认没有过多的灌流液从肝脏泄露。15分钟后，从杯中取出P1缓冲液并用含有胶原酶的P2缓冲液代替。再循环P2缓冲液直到肝脏被充分消化(通过肝脏从深色微红棕色向淡棕色的颜色转变和通过获得肝脏的软糊状结构来评估)。P2缓冲液再循环不超过20-25分钟。一旦结束灌流，从杯中排出P2缓冲液并将肝脏在杯中转移到生物学包布上。

向杯中加入细胞培养基(DMEM)，去掉插管和粘合剂以及肝脏的任何未消化区。使用组织镊子和剪刀破坏肝脏被膜(肝被膜)。这允许将消化的组织释放进培养基中，剩下结缔组织和任何未消化的材料。将消化的材料放入DMEM中，然后通过一系列不同大小的滤膜过滤。滤膜放在大型漏斗的内侧以帮助过滤。消化的材料首先用单层干酷包布过滤，接着用400μ的尼龙滤膜过滤，然后通过70μ的特氟隆滤膜。将滤液平分进离心管并以70g离心4分钟。

离心后，在加入Percoll前，上清称为馏分1(F1)。向细胞沉淀中加入DMEM和等渗的Percoll以得到分别为3∶1的最终比率。例如，5ml体积的堆积细胞的小团悬浮于30ml的DMEM和10ml的等渗Percoll中。将样品以100g离心5分钟以产生称为F4馏分的沉淀。上清以200至400g再离心5分钟以获得称为F3馏分的沉淀。现在上清再以600-800g离心以获得称为F2馏分的沉淀。以1200-1800g进行最后的离心以获得称为F1馏分的沉淀。悬浮不同馏分的细胞并使用锥虫蓝染料排斥试验评估其活力。不同馏分的活力在表4中提供。

保留肝脏灌流后与肝脏组织的血管或胆管树保持结合的细胞。这些细胞在酶灌流后获得的原始细胞悬液中发现，且一般在悬液中的细胞通过后留在滤网(例如，干酪包布)的上部。用酶再次处理血管和胆管树的这些残留物，所得的细胞与其它细胞合并在一起。

大多数研究者在肝脏灌流中通常使用Percoll分馏法以排除他们认为是碎片和死亡细胞的成分；但这些研究者仅保留了最终的细胞沉淀。本文所公开的对常规灌流的新变化是，这里称为F4的第一细胞沉淀含有发现对局部缺血，无论是暖或冷局部缺血最敏感的细胞，且具有较低浮力密度的细胞(即，从以较高速度离心获得的沉淀收集的细胞)对局部缺血敏感性较小。在F1，F2，和F3馏分中的这些细胞较小，可能是年幼的实质细胞且具有更大的冷冻适应性(见冷藏部分)。而且，这些细胞基本上是二倍体细胞，而来自成人F4馏分中的细胞含有大量多倍体细胞。多倍体细胞可以是双核或单核的，且可以是四倍体或八倍体，或者甚至是更高水平的倍性。

倍性与细胞群体的分馏相关

发现上述成人肝脏细胞的馏分(F1-F4)含有不同的细胞群体；F1含有碎片，红血细胞，肝星形细胞，和含有祖细胞群体(肝谱系或造血谱系的祖细胞)的小肝细胞(＜12μm)；F2馏分含有是二倍体，小实质细胞的较大肝细胞(12-15μm)；F3馏分含有更大型的实质细胞(15-25μm)且由二倍体和四倍体细胞的混合物组成；F4馏分(所有其它研究者使用的馏分)由最大的实质细胞(25-50μm)组成且几乎全部是多倍体(例如，四倍体和八倍体)。

一般来说，F1-F3馏分中的实质细胞冷冻后79-95％具有活力；F4馏分中的实质细胞冷冻后具有50-80％的活力(依赖于到达时肝脏的状态)。鉴定的影响F4馏分中实质细胞活力的变量是：1)供体的年龄(供体的年龄越大，细胞的预后越差)；2)心跳停止到交付到实验室之间的时间(越短越好)。这些因素是相互影响的以致于迅速交付的年长供体的组织比花费太长运输时间的年轻病人的组织更有吸引力。

局部缺血对细胞分馏的影响

检查由于局部缺血时间和温度的影响细胞活力的结果。肝脏保持在环境或以上温度的情况称为暖局部缺血。肝脏保持在环境温度以下的情况称为冷局部缺血。在通常实践中，暖局部缺血相应于活体温度与室温之间的温度，而冷局部缺血相应于室温以下的任何温度，例如，大约10℃或大约4℃。

在暖局部缺血中，肝脏保持在环境温度以上，然后灌流肝脏。在暖局部缺血的另一形式中，肝脏保持在环境以上温度一定时间，然后冷却，随后用暖解离溶液灌流。处理各灌流产生的单细胞悬液以提供具有不同比例的二倍体和多倍体细胞的细胞馏分。祖细胞是二倍体细胞的亚群体。而且，观察到分化的多倍体细胞对环境以上温度的局部缺血敏感。在下表中，择过用染色死细胞的细胞核的碘化丙锭(PI)染色区分活的大鼠肝脏细胞与死细胞。在以流式细胞术分选的活的和死亡细胞馏分中在固定，透化，以及用PI复染之后观察所有细胞中的细胞核来计数单核或双核细胞。

表5

暖局部缺血时间    活细胞双核％    死细胞双核％

无                32              30

2小时             27              47

使用大鼠作为模型测量了由于暖局部缺血时间的影响来自肝脏灌流的总细胞产量。使用大约8周龄，各250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠。测量无局部缺血的动物每个肝脏产生＞400x10⁶个分离的细胞。暖局部缺血时间不超过1小时时发现总细胞产量迅速下降到每个肝脏提供150到250x10⁶个细胞。时间在大约1小时到5小时之间时发现总细胞产量相对稳定在每个肝脏产生50到150x10⁶个之间的细胞。暖局部缺血时间不超过1小时时活细胞产量迅速下降，大于1小时时稳定在每个肝脏大约10x10⁶个细胞。因此，发现活细胞的比例与暖局部缺血呈双峰。在不超过1小时时，活细胞和死细胞都急剧降低以致于活力比不变。在大于1小时和达到5小时时观察到稳定的活细胞百分数。

使用上述大鼠模型测量由于暖局部缺血时间的影响肝脏细胞核的投射区。灌流肝脏，细胞分离为单细胞悬液，并用碘化丙锭染色。以流式细胞术收集活细胞(PI-阴性)，然后附着到显微镜载玻片上，固定，透化并用PI复染以观察细胞核。对于无局部缺血灌流的对照动物，发现细胞核面积具有双峰分布，相应于单核和双核活的肝脏细胞都存在。暖局部缺血1小时后和2小时后，发现双核细胞的比例降低。由于双核细胞必定是多倍体，认为这些数据表明多倍体细胞比二培体细胞对局部缺血更敏感。

通过分析单核细胞中细胞核的大小进一步支持了二倍体细胞对局部缺血的抗性。单核细胞可以是二倍体或者是多倍体，二倍体细胞具有比多倍体细胞更小的细胞核。上述大鼠模型用于制备测量细胞核面积的活细胞。图1a中提供了总细胞核的百分数，表明具有小核的细胞对局部缺血具有相对抗性。由于多倍体核倾向于比二倍体核更大，发现这些数据表明了二倍体细胞对暖局部缺血具有相对的抗性。发现在对照肝脏和局部缺血2小时后的肝脏中细胞核大小之间的改变无区别，如图1b所示。

也有利地检查了由于低温局部缺血时间的影响细胞的活力，见表6和7。在该实施方案中，肝脏基本上在死后立即迅速冷冻到大约10℃。甚至更有利的是，肝脏基本上在死后立即迅速冷冻到大约4℃。通过本领域的技术人员已知的一些任何方法可实现冷冻，包括但不限于在供体尸体腹部堆积冰块或冰冷的液体袋的简单权宜之计。肝脏保持在一种上述环境温度以下，然后在时间达到大约30小时，或更有利的是在时间达到20小时时按所述进行灌流。处理灌流产生的单细胞悬液以提供祖细胞。观察到多倍体细胞对即使温度维持在环境温度以下和甚至在4℃的局部缺血敏感。

表6

人胎儿肝脏

#	冷局部缺血(小时)	平均活力+/-标准差(标准误差)
			139	18	75.4±15.9(1.7)
5	66	24±8.9(4)

表7

小儿和成年人肝脏

馏分	肝脏#	冷局部缺血(小时)	活力±标准差(标准误差)
				F1	9	＜20	67.9±18.3(6.1)
F1	4	＞20	62.5±17.5(8.8)
				F2	7	＜20	83.4±10.3(3.9)
F2	6	＞20	73±16(6.5)

F3	8	＜20	81.9±8(2.8)
				F3	5	＞20	75.2±14.5(6.5)
F4	16	＜20	81.6±7.4(1.9)
				F4	13	＞20	21.2±24.9(6.6)

按一种或多种上述方法所述从供体肝脏制备的祖细胞适用于冷藏，流式细胞术，细胞染色，细胞分选，肝脏再生，生物反应器，人造肝脏和按下文上述作为治疗性疗法。

在人供体中的暖局部缺血

样品Ren#200是1999年5月21日接受的男性成年供体。该供体被宣告脑死亡且评估为用于器官移植的供体。然而，在移植的外科医生能获取器官前，供体心跳停止。外科医生能在心跳停止的30-60分钟内取出肝脏，该时期构成“暖局部缺血时间”。交叉夹紧的时间是1999年5月20日21:19。用运输缓冲液(Viaspan)冲洗肝脏并放在冰上运回UNC。UNC在第二天上午11点收到(构成13小时41分钟的冷局部缺血)并立即处理。发现该处理产生了具有所示活力的下列细胞悬液：

表8

因此，对经历暖局部缺血以致于导致其不适合于器官移植的人肝脏组织进行的处理发现产生含有二倍体细胞的分离细胞馏分。

在从人肝脏分离的二倍体细胞中甲胎蛋白的表达

车辆碰撞后冲击创伤单位(Shock Trauma Unit)收到且宜告DOA的男性病人，37岁，估计在冲击创伤单位接受前25分钟死于心跳停止。经过外部消毒准备供体尸体用于器官捐赠。无菌取出肝脏，包装进无菌袋中，冷却用于转移到附近的细胞实验室中。通过使用无菌表面温度探针测量供体肝脏核心温度。在估计的死亡时间后45分钟记录到10℃的温度。开始用暖解离溶液(见上文)灌流肝脏。按上文所述制备供体肝脏细胞悬液，经过按上文所述在补充了Percoll的缓冲液中离心来分离活的二倍体细胞。将分离的细胞分成等分试样用于冷藏，用于包括抗原定型的进一步鉴定，和用于在移植进抗原匹配的受体前在细胞培养基中的扩增。

第二例男性病人，34岁，在交通事故后急诊室收到且宣告DOA，死于内部撕裂引起的失血且因此估计在急诊室收到前45分钟时心搏停止。经过外部消毒准备供体尸体用于器官捐赠。无菌取出肝脏，包装进无菌袋中，冷却用于转移到附近的细胞实验室中。通过使用无菌表面温度探针测量供体肝脏的温度。在估计的死亡时间后80分钟记录到10℃的温度。开始用溶液(见上文)灌流肝脏。按上文所述制备供体肝脏细胞悬液，经过按上文所述在补充了Percoll的缓冲液中离心来分离活的二倍体细胞。将分离的细胞分成等分试样用于冷藏，用于包括抗原定型的进一步鉴定，和用于在移植进抗原匹配的受体前在细胞培养基中的扩增。

按上述从两个供体制备分离细胞的样品用于以抗甲胎蛋白的抗体染色，和经过在FACStar细胞计数器上的细胞分选进行分析。将相应于基本上是二倍体细胞的具有小核的单核实质细胞的细胞亚馏分与相应于多倍体细胞，即具有大核的单核细胞和双核细胞的细胞亚馏分进行比较。来自经历不同时间的暖局部缺血的年龄和性别匹配的供体的细胞比较用于评估二倍体和多倍体肝脏细胞对暖局部缺血影响的相对敏感性。表达甲胎蛋白的肝祖细胞是肝脏二倍体细胞的亚群体。评估出表达甲胎蛋白的细胞在冷或暖局部缺血中存活的能力等于或好于其它二倍体肝脏细胞群体。

用于PCR研究的引物形成

在肝细胞与其它细胞类型中差别表达的甲胎蛋白(AFP)同种型分析。细胞系：两种人肝细胞瘤，Hep3B和HepG2，在补充了1mM丙酮酸钠，2mM L-谷酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，0.1mMMEM非必需氨基酸溶液，5μg/ml胰岛素和10％FBS的Eagle’s MEM中维持。人红白血病细胞系，K562和小鼠胚胎成纤维细胞系，STO在补充了2mM L-谷酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，5x10-5M2-ME和10％ FBS的DMEM/F12中维持。

RT-PCR：用标准方法从Hep3B，HepG2，和STO中提取总RNAs。经过寡聚-dT引发合成cDNA并使用本发明人设计和制备的用于人甲胎蛋白(AFP)的引物组进行PCR扩增。引物序列如下，

hAFP1：5’-ACCATGAAGTGGGTGGAATC-3’，

hAFP2：5’-CCTGAAGACTGTTCATCTCC-3’，

hAFP3：5’-TAAACCCTGGTGTTGGCCAG-3’，

hAFP4：5’-ATTTAAACTCCCAAAGCAGCAC-3’，

hAFP外显子2：5’-CTTCCATATTGGATTCTTACCAATG-3’，

hAFP外显子3：5’-GGCTACCATATTTTTTGCCCAG’，

hAFP外显子4：5’-CTACCTGCCTTTCTGGAAGAAC-3’，

hAFP外显子5：5’-GAGATAGCAAGAAGGCATCDC-3’，和

hAFP外显子6：5’-AAAGAATTAAGAGAAAGCAGCTTG-3’，

引物的组合如下：

hAFP1和hAFP2，

hAFP3和hAFP4，

hAFP1和hAFP4，

hAFP外显子2和hAFP4，

hAFP外显子3和hAFP4，

hAFP外显子4和hAFP4，

hAFP外显子5和hAFP4，和

hAFP外显子6和hAFP4。

在由1μM各引物，200μM各dNTP，50mM KCl，1.6mM MgCl₂，10mMTris HCl，pH8.3，和1.25U Amplitaq聚合酶(Cetus Corp)组成的50μl总体积中进行PCR。样品加热到94℃3分钟，接着94℃下2分钟，62℃下2分钟，72℃下3分钟扩增30个循环。最后一个循环后，在72℃进行最后的延伸步骤7分钟。然后在Tris-醋酸盐EDTA缓冲液中含有5μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上对5μl的各PCR反应液走电泳。人AFP基因由15个外显子组成。为了区分截短的转录子与功能性完全的AFP mRNA，选择AFP cDMA序列的两个不同部分作为RT-PCR的靶分子。hAFP1和hAFP2的引物组合用于扩增含有起始MET的外显子1至外显子3，而hAFP3和hAFP4的组合扩增外显子12至含有终止密码子的外显子14。PCR的结果是两种引物组合部导致在来自Hep3B和HepG2的RNA中检测到强烈的扩增带(泳道1，2，4，和5)。相反，用hAFP3和hAFP4引物组在来自K562的RNA中仅检测到C-末端部分的特异性带(泳道7和8)。该结果表明红白血病细胞系K562仅表达无N-末端的AFP的截短形式。为支持该假设，使用hAFP1和hAFP4引物进行了AFP全编码区的PCR。正如所预期的，Hep3B和HepG2 cDNA的PCR显示出2.1 Kb的单一显著带(泳道3和6)，而在K562中没有带(泳道9)。对照是无RNA的样品和来自小鼠胚胎成纤维细胞系(STO)的样品。两者都没有显示出任何可检测的带型。接着，构建了从外显子2至外显子6的一系列5’引物以观察在hAFP mRNA的正常和变异体形式之间的区别。结果表明K562中hAFP的变异体形式具有除了外显子1外所有的编码区。用于人AFP RT-PCR的hAFP1和hAFP4引物的组合适合于检测含有完全AFP mRNA种类的肝细胞谱系中的AFP mRNA表达。使用该特异性引物组合的RT-PCR分析可排除在肝细胞或非肝细胞中表达任何截短形式的可能性。该试验用于鉴定肝脏祖细胞的特异性亚群体或区分共有表面标记的肝细胞或造血细胞群体。

供体肝脏的处理

尸体肝脏；在死后不同时间，但优选在至少24小时，最多在30小时内获得的肝脏。使用酶消化和机械解离的组合处理肝脏，胎几“尸体”肝脏首先通过机械解离制备，而成人尸体肝脏首先通过酶消化解离。各种处理的描述在下面给出。胎儿和成人肝脏都在酶缓冲液中消化不同的时间长度，该酶缓冲液用于解离将组织中的细胞结合在一起的细胞外基质。混合用于分离肝脏细脏的胶原酶是由Boehringer-Mannheim生产的高纯度的“释放酶(Liberase)”的酶制品，它由纯化的胶原酶和弹性蛋白酶的混合物组成。该酶混合物以小得多的浓度使用且有害的“副作用”更小。

酶溶液：胶原酶溶液，60-70mg/100ml缓冲液(Sigma的IV型胶原酶，目录号#C5138或Worthington的B型胶原酶，目录号#LS005273；两者都是富含胶原酶但具有许多酶杂质的细菌制品)或者在P2缓冲液(见下文)中制备且以0.23mg/ml使用的释放酶(Boehringer-Mannheim的纯化胶原酶/弹性蛋白酶制品，目录号1814184)。

细胞洗涤溶液：补充了胰岛素(5μg/ml)，转铁蛋白(5μg/ml)，与纯化的牛或人血清白蛋白以1∶1的摩尔比结合的游离脂肪酸混合物(见下文)的RPMI 1640(Gibco)。

游离脂肪酸的混合物：未成熟的细胞群体和损伤的老年肝脏细胞需要脂类维持和合成其细胞膜。尽管完全成熟的肝细胞可从单一脂肪酸来源(亚油酸)合成其细胞膜，但幼年实质细胞不能，因此需要许多不同脂肪酸的混合物来实现其脂类需要。我们提供了一种复杂的混合物，然后与高度纯化的牛血清白蛋白或高度纯化的人白蛋白以1∶1的摩尔比结合。一般来说，优选人白蛋白以避免与“疯牛病”或牛海绵型脑病相关的问题。因此，游离脂肪酸的混合物在细胞培养基中以大约7.6μeq/L(7.6μM)的终浓度使用。

组合的总共100mM的游离脂肪酸的贮液制备如下：

棕榈酸    31.0mM     油酸      13.4mM

棕榈油酸  2.8mM      亚油酸    35.6mM

硬脂酸    11.6mM     亚麻酸    5.6mM

单个脂肪酸成分的制备；

按如下将单个成分分别溶于100％的乙醇中：

棕榈酸     1M贮液，溶于热乙醇中

棕榈油酸   1M贮液，易溶于乙醇

硬脂酸     151mM贮液，以1g/21ml溶于热乙醇中

油酸       1M贮液，易溶于乙醇

亚油酸     1M贮液，易溶于乙醇

亚麻酸     1M贮液，易溶于乙醇

然后混合这些单个贮液以获得100mM的FFA混合物。使用通氮气制备单个FFA和FFA混合物的等分试样以减少氧化和增加稳定性。贮液冷冻在-20℃。

P1灌流缓冲液—无钙和镁的灌流缓冲液(pH7.2)，对下列各成分的终浓度限定为：118mM NaCl，4.7mM KCl，1.2mM KPO₄，pH 7.4，2.5mM NaHCO₃，0.5mM EDTA，5.5mM葡萄糖，0.5％牛血清白蛋白(BSA)，抗坏血酸(50μg/ml)，胰岛素(4μg/ml)，和地塞米松(1μM).

P2灌流缓冲液-Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基或补充了0.5％BSA，抗坏血酸(50μg/ml)，胰岛素(4μg/ml)和地塞米松(1μM)的RPMI 1640。

DMEM一含有葡萄糖，丙酮酸钠和L-谷酰胺且进一步补充了5％胎牛血清，胰岛素(4μg/ml)和地塞米松(1μM)的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(Gibco)。补充了ITS+TM培养基添加剂(5mls/500mls)和地塞米松(0.1μM)的Chee’s培养基。Percoll(Pharmacia)用10XDulbecco’s磷酸盐缓冲液以9∶1稀释。

冷藏实验

用于冷藏方法的肝脏来自尸体供体，年幼的如胎儿肝脏(妊娠期12周至25周)，年老的如77岁。新的冷藏缓冲液使用如下；补充2％人血清(Gibco)或胎牛血清(Biowhittaker)，专用于成熟实质细胞的10％冷冻保护剂二甲基亚砜(Sigma目录号#D5879或D8779)或用于祖细胞的二甲基亚砜或甘油(Sigma目录号#G6279)的Viaspan(Dupont目录号#1000-46-06)。缓冲液还添加了抗生素(青霉素200U/ml；链霉素100μg/ml)。缓冲液还补充了激素和生长因子：胰岛素(5μg/ml)，转铁蛋白(5μg/ml)，表皮生长因子(50μg/ml)，FGF(10ng/ml)，IGF II(10ng/ml)。缓冲液还添加了与牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)结合的脂类：游离脂肪酸(7.6μM)和高密度脂蛋白(10μg/ml)。缓冲液还进一步添加了微量元素(硒(10^-9M)，铜(10^-7M)，锌(5X10^-11M)和抗氧化剂，AEOL 10112(一种专卖抗氧化剂，porphorin是过氧化物歧化酶模拟物，以10μg/ml使用)，它是一种由Incara的子公司AEOLUS制备的产品。

在本文所述的组合物中的改变是将鉴定为肝脏细胞特制的无血清激素限定的培养基的组成部分的主要营养成分，脂类，激素和生长因子组合起来。新缓冲液导致F4馏分中肝脏细胞的活力从低到大约10％或更低(在死后大约30小时的上限时间收集的状态极差的样品)到高达80％(在接近1小时或以上的早期时间期间收集的好样品)。F1-F3馏分的活力稳定在40％以上，该事实支持这些馏分显具有倍性状态和代谢活力更有益于合成细胞外基质成分和/或为活力和生长所需的其它细胞因子的“幼年”细胞；因此它们很可能更易于冷冻。在缓冲液中使用过氧化物歧化酶模拟物将细胞的活力提高了5-10％。

上述组合物的另一选择是使用一种改良的缓冲液，其中去掉Viaspan且在基础培养基(例如RPMI 1640)中补充胰岛素(5μg/ml)，转铁蛋白(5μg/ml)，与BSA结合的游离脂肪酸(7.6μM)，高密度脂蛋白(10μg/ml)，微量元素[硒(10^-9M)，铜(10^-7M)，锌(5X10^-11M)]，和AEOL 10112。以诸如与层粘连蛋白混合的IV型胶原蛋白或与纤连蛋白混合的III型胶原蛋白的细胞外基质的形式包裹细胞。

按上述处理的胎儿“尸体”肝脏细胞悬浮于冷藏缓冲液(上述)中，以5-10X10⁸个细胞/ml等分进3ml的冷冻小瓶中并在该条件下维持1-2小时。然后使用计算机控制速率的冷冻库(Forma Cryomed)将细胞冷冻到-160℃的液氮温度，然后贮存在大型蒸发相的液氮(-160℃)贮存罐中。细胞在该过程中存活良好且在50-270天的贮存期间不出现明显的活力损失(见图4)。

处理和冷冻后F4馏分活力的最大范围随着实验室“夹紧时间”和接受样品之间的时间长度的改变而改变，也随着肝脏状态(纤维变性，局部缺血等)的不同而改变。一般来说，F4馏分对肝脏的处理变化和组织的一般健康状况最敏感。明显的是，F2和F3馏分通常是有活力的且容易冷冻保存，即使它从状况较差的肝脏样品获得。F1馏分是更易变的，它含有大量碎片，脂肪小滴以及包括小实质细胞(假定包括肝祖细胞)和各种造血亚群体(即，红细胞)的许多小细胞。

表9.冷藏：胎儿肝脏

处理后的平均活力：75-85％

处理后的平均活力：相当于处理后。

表10.冷藏：成人肝脏

活力(冷冻后)

F1-F3：＞75％，具有较好的贴壁能力

F4：＜60％具有较差的贴壁能力

流式细胞术

下面的分选方法是任选的。细胞以单个排列通过流动室，在其中细胞暴露于激光中。通过“前向散射”，或者由于光束交错折射的光量来测定各细胞的近似体积。散射光，即来自诸如细胞核，内质网高尔基体，囊泡等的细胞内结构的“侧向散射”用于测定细胞内复杂性的量(即，活细胞和更成熟的细胞含有比静息细胞或年幼细胞更多的细胞内组分)。通过高度特异性，特征性抗原与细胞表面上的蛋白质复合物的结合获得更多关于细胞特征的选择性信息。这些抗体可共价结合到荧光分子上，例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE)，和PE的串连偶合物和细胞色素，它们被激光束激发，各荧光团以特定的波长产生发射光。通过选择一组与特定的抗体偶连的区别性发色团，可选择感兴趣的细胞群体。

根据其参数输入分析细胞。使用各种收集装置以每秒达到40,000次或更高的速度收集所需细胞，包括使用Eppendorf管和锥形管，和任意大小的多孔板。

表11.染色程序中使用的抗体和试剂

抗体                         供应商，Cat#，           Lot#

山羊抗人AFP                  Chemicon，               AB635，C4P168

单克隆小鼠抗人Thy            Chemicon，               MAB1294，293OCD

单克隆小鼠抗人

AFP-PE偶连物                 Chromaprobe，            P41020，A45P7

生物素标记的兔抗山羊         Vector Laboratories，    BA-5000，J0313

生物素标记的兔抗山羊，       Jackson Immunochemicals  200-152-096，25985

链霉抗生物素蛋白/AMCA偶连物，Jackson Immunochemicals，016-150-084，40001

驴抗绵羊AMCA偶连物，         Jackson Immunochemicals，713-156-4732202

驴抗山羊CY5偶连物，          Jackson Immunochemicals，705-156-147，38756

山羊IgG，                    Jackson Immunochemicals，005-000-002，38837

绵羊IgG，                    Jackson Immunochemicals，013-000-002，39945

绵羊抗人白蛋白，             Serotec，            ABP102，210498

小鼠单克隆抗人：

CD14/TriColor偶连物          Pharmingen

ICAM                         Pharmingen

CD34/FITC偶连物              Pharmingen           34374X

CD38/PE偶连物                Pharmingen           31015X

CD38/FITC偶连物              Pharmingen           31014X

血型糖蛋白A PE偶连物         Pharmingen           32591A

CD 45/PE偶连物               Pharmingen           31255X

CD 45/FITC偶连物             Pharmingen           31254X

同种型对照IgG1 PE            Pharmingen           33815X

IgG2 FITC                    Pharmingen           33814X

Kit RE偶连物                 Caltag               MHCK04

兔抗人AFP-FITC偶连物Accurate

未偶连的山羊抗人AFP          ″                   AXL625 061

7氨基放线菌素D(7AAD)Mol Probes                    A-1310，4981-1

在用于流式细胞术的细胞制品中使用的主要溶液：

BSA：牛血清白蛋白(Pentex V)

PBS＝磷酸盐缓冲液；

FBS＝胎牛血清；

AFP＝甲胎蛋白

含激素的Dulbecco’s改良的Eagles培养基：HC_DMEM

500mL DMEM，高葡萄糖无酚红

25mL胎牛血清(FBS)

20mL 5mM EGTA

胰岛素(5μg/ml)，转铁蛋白(5μg/ml)

微量元素[硒(10^-9M)，铜(10^-7M)，锌(5X10^-11M)]

抗生素(青霉素-100μg/ml，链霉素-100μg/ml)

500mg牛血清白蛋白(BSA)30mg DNase

38μl与BSA结合的游离脂肪酸溶液。

通过带0.2μm孔的Nalgene过滤器过滤灭菌。

Hanks缓冲盐溶液-改良型：HBSS-mod

50mL 10X HBSS

10mL 1M Hepes

青霉素-100μg/ml/链霉素-100μg/ml

500mg BSA

30mg DNase

定容到400mL

pH调到7.3

最终定容到500mL

0.2μm的无菌过滤

用于免疫化学的封闭缓冲液

100ml的HBSS_mod

2.2mL 45％硬骨鱼胶和

0.8BSA

0.5mL 1％皂苷溶于HBSS

用于免疫荧光显微镜的固定介质

0.5mL2X PBS

0.25g n-丙基没食子酸

5.7g甘油

冷冻肝脏组织制品用于流式细胞术的方法

在37℃下迅速复苏冷冻的肝脏组织。用HC-DMEM在冰上以每分钟1ML的速度将各肝脏的冷冻小瓶(各含大约3mL的含5-10X10⁶个细胞/mL的缓冲液)定容到10mL。然后在4℃下将样品以1200RPM离心5分钟。弃去上清，细胞沉淀重悬于5mL HC-DMEM中。反复洗涤细胞直到上清清澈。然后计数细胞并使用锥虫蓝染料排斥试验以血细胞计数器评估活力。按照实验方案将细胞分成多份。制备标准管用作含1-2X10⁶个细胞之间的对照数据，通常通过从5～10X10⁶/mL的细胞悬液中各取200μl实现。需要下列标准管：

1)OCS.由未染色的对照细胞组成的原始细胞悬液。

2)单独的FITC用于补偿调节。将5μL FITC-标记的抗血型糖蛋白A加入200μl细胞悬液中。另一选择是将FITC-标记的CD34，CD38和CD45各7μl加入200μl细胞中的混合物。

3)单独的PE用于补偿调节。使用血型糖蛋白-PE(2μl到1mL的HC-DMEM且将其30μL加入200μL细胞中)。

4)单独的7AAD用于补偿。通过用2％低聚甲醛固定200μL细胞悬液并然后将5μl的100μM 7AAD和5μL去污剂(1％皂苷)加入在HBSS-mod中的1mL这些细胞悬液中可产生良好的信号。7AAD强烈染色透化处理的细胞。

5)单独的Cy5用于补偿。200μL固定的细胞(2％低聚甲醛)在2％山羊血清中培养40分钟以便用绵羊IgG标记细胞表面。然后将细胞用Cy5偶连的驴抗山羊IgG(1∶800)培养40分钟。

6)单独的AMCA用于补偿。与7AAD一样，产生人工强信号用于补偿调节。将200μL固定细胞(2％低聚甲醛)在2％绵羊血清中培养40分钟以便用绵羊IgG标记细胞表面。然后将细胞用AMCA偶连的驴抗绵羊IgG(1∶800)培养90分钟。

7)AMCA/Cy5对照。用AMCA-偶连的驴抗绵羊IgG和Cy5偶连的驴抗山羊IgG培养固定(2％低聚甲醛)和透化处理(0.05％皂苷)的细胞90分钟。

8)单克隆同种型对照。用小鼠IgG1 PE偶连物和小鼠IgG2 FITC偶连物培养细胞。浓度应与用于标记分析和分选管的浓度匹配。

9)细胞内同种型对照。用未免疫的绵羊IgG和山羊IgG培养固定(2％低聚甲醛)和透化处理(0.05％皂苷)的细胞90分钟作为用于鉴定白蛋白和甲胎蛋白的抗体的对照。用Cy5偶连的驴抗山羊IgG和AMCA-偶连的驴抗绵羊IgG继续培养90分钟。

制备分选管用于获得表达特定组合的CD标记的选定细胞群体。正常情况下这些管含有50-70X10⁶个细胞。将细胞重悬于1mL含有HC_DMEM+1％BSA+500pM 7AAD(5μL的100μM贮液)的染色缓冲液中。根据细胞数将各15到25μL之间的CD 34FITC，CD38 PE，或CD 45 PE加入染色缓冲液中(正常情况下每10X10⁶个细胞3μL的Pharmingen抗体)。以1∶60的稀释度加入抗c-Kit抗体，血型糖蛋白A以1∶500的稀释度使用。在黑暗中在冰上染色40分钟。染色后用HBSS-mod洗涤细胞两次并用在PBS中的2％低聚甲醛在冰上固定30分钟。

细胞内染色用于细胞分选

为了进行细胞的细胞内染色用于以流式细胞术分析甲胎蛋白(AFP)，将细胞悬液用在HBSS_mod中的皂苷(Sigma S4521)0.05％的溶液在冰上透化处理10分钟。然后将细胞在含有1％硬骨鱼胶和0.8％BS和0.005％皂苷的HBSS_mod溶液中封闭20分钟，接着用山羊抗人AFP和绵羊抗人白蛋白(均在封闭缓冲液中以1∶800稀释)在黑暗中在室温下培养90分钟。细胞用含有0.01％皂苷的HBSS_mod洗涤两次，接着用Cy5-偶连的驴抗山羊IgG和AMCA-偶连的驴抗绵羊IgG培养90分钟。

另一选择是，在第一抗体之后，细胞用生物素标记的兔抗山羊IgG(在含有2％人血清和0.01％皂苷的封闭缓冲液中1∶500稀释，在黑暗中室温下培养90分钟)培养。接着用含有0.01％皂苷的HBSS_mod洗涤两次，然后用在0.01％皂苷/HBSS_mod中的9μg/mL链霉抗生物素蛋白/Cy5偶连物黑暗中室温下培养90分钟。最后，细胞用HBSS_mod洗涤两次并重悬于HBSS_mod中，通过50μm的筛子过滤以去掉细胞团块用于在流式细胞器上分析和分选。

如果打算选择肝祖细胞，免疫选择包括去掉是多倍体和/或表达与肝脏成熟造血细胞相关的诸如红血细胞上的血型糖蛋白A的标记的细胞。另外展示出在所有成熟造血细胞上表达的CD45的细胞；展示出与成熟肝细胞相关的诸如在所有肝细胞和胆细胞中发现的连接蛋白32的标记的细胞；和表达与成熟间充质细胞相关的诸如在肝星形细胞中的视网膜样蛋白(retinoids)或冯.维勒布兰德氏因子或内皮中的因子8的标记的细胞都被去掉。

分选的细胞群体的免疫组织化学染色

流式细胞器分析和分选后染色细胞的甲胎蛋白。在含有1％BSA的0.3％HBSS-mod中收集分选的细胞馏分。回到实验室时，调节所收集的样品的体积以提供0.5X10⁶个细胞/mL且用Shandon细胞旋转(Cytospin)器将200μL等分试样旋转到显微镜玻片上。细胞旋转玻片标本空气干燥并贮存用于后来染色甲胎蛋白和/或白蛋白。用橡皮障圈住显微镜玻片上的附着细胞“盘”以产生一个“井”用于使用免疫组织化学试剂。玻片在含有0.3％ Triton X的tris缓冲液(“低盐”的含0.9％NaCl的10mM Tris，pH7.4)中浸泡10分钟，接着在单独的低盐Tris中浸泡10分钟。

然后细胞在上述含10％兔血清的硬骨鱼胶封闭溶液中室温下封闭90分钟。在低盐Tris中洗涤两次后，细胞用在含有2％兔血清的封闭缓冲液中以1∶100稀释的山羊抗人AFP抗体4℃下培养过夜。在Tris缓冲液中洗涤两次后，接着用在封闭缓冲液中的生物素标记的兔抗山羊IgG(1∶200)室温下培养90分钟。用链霉抗生物素蛋白/AMCA复合物(以9μg/mL存在于低盐Tris缓冲液中)的最终培养用于通过AMCA荧光染料与生物素标记的兔抗体的结合定位AFP-样免疫反应。用Tris缓冲液洗涤两次后，使得细胞制品接近干燥，之后在抗褪色封固培养基(0.25g n-丙基没食子酸在含1mL PBS的5.7g甘油中)上盖上盖玻片。当复染合适细胞的白蛋白时，使用包括德克萨斯红偶连的兔抗人抗白蛋白抗体与第一抗甲胎蛋白抗体。

通过删去第一或第二抗体制备对照玻片以证实在没有抗甲胎蛋白的抗体或生物素标记的第二抗体时细胞没有AMCA标记。使用紫外激发发射蓝光(450nm)区光的AMCA染料用表面荧光显微镜术检查玻片。

借助于细胞和/或基因治疗的肝脏再生

本发明具有治疗诸如下列疾病的直接实践应用：克-纳二氏综合征，杜-约(Dubin-Johnson)综合征，酪氨酸血症，肝硬化，纤维变性，脂肪肝，肝炎，急性肝脏衰竭，慢性肝脏衰竭，肝胆管炎，肝软化，肝大，肝癌，肝胚细胞瘤，或其组合。本实施例的其它肝脏疾病和肝脏疾病的其它相关例子同样适合作为本疗法的候选者且包括阿拉惹综合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，巴德-希阿里综含征，胆闭锁，Byler疾病，诸如肝外胆管癌和肝细胞癌的癌症，Caroli疾病，半乳糖血症，吉尔伯综合征，糖原存储疾病，血管瘤，血色病，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，戊型肝炎，庚型肝炎，肝脏移植，迟发性皮肤血卟啉病，原发性胆肝硬化，原卟啉症，红细胞肝病，罗托综合征，硬化胆管炎，和肝豆状核变性。肝脏的先天性遗传疾病也是可矫正的。例如，遗传性疾病苯丙酮酸尿(PKU)由婴儿不能使用氨基酸苯丙氨酸引起。如果早期不治疗，PKU会导致大脑和神经损伤和智力迟钝。在生命的前几周开始特别低蛋白的饮食是目前唯一可能的治疗方法。可适用这种形式的疗法的其它靶基因及其相关肝脏疾病的例子包括，但不限于，家族性高胆固醇血症中的LDL受体基因，血友病中的因子VIII和IX的凝血因子基因，肺气肿中的α-1-抗胰蛋白酶基因，苯丙酮酸尿中的苯丙氨酸羟化酶基因，血氨过多中的鸟氨酸转氨甲酰酶基因，和在各种补体缺陷形式中的补体蛋白基因。

由于人尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)可激活跨种的纤溶酶原，因此为了诱导肝脏再生可构建从RSV-LTR启动子表达人尿激酶的重组腺病毒载体Ad-RSV-uPA。仅仅以例证的方式选择了该基因，因为包括但不限于下列基因的任何其它目的基因同样是合适的：甲氨酰合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1-抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，低密度脂蛋白受体，胆色素原脱氨酶，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合成酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰-CoA脱氢酶，丙酰CoA羧化酶，甲基丙二酰CoA变位酶，戊二酰CoA脱氢酶，胰岛素，转铁蛋白，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧化酶，肝脏磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，H-蛋白，T-蛋白，Menkes疾病蛋白，或肝豆状核变性基因pWD的产物，和/或CFTR。

为了构建和产生重组腺病毒载体，按如下方法制备人uPA的cDNA。将含有该蛋白质编码序列的L.326 kb HindIII/Asp718 uPA片断插入pXCJL.1中在Rous肉瘤病毒LTR(RSV)启动子转录控制下的且在牛生长激素多聚腺苷化信号上游的HindIII/Asp718位点。本领域的技术人员可选择肝脏细胞特异性启动子，例如乙肝启动子，甲肝启动子，丙肝启动子，白蛋白启动子，α-1-抗胰蛋白酶启动子，丙酮酸激酶启动子，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶启动子，转铁蛋白启动子，运甲状腺素蛋白启动子，甲胎蛋白启动子，α-纤维蛋白原启动子，和β-纤维蛋白原启动子等许多其它合适的启动子。

在用pJMI7和命名为Ad-RSV-uPA的载体共转染后制备病毒。通过在293细胞中扩增单个噬菌斑进行Ad-RSV-uPA的筛选。感染3天后以ELISA检测上清的免疫学反应性uPA和以纤维蛋白噬斑试验检测纤维蛋白裂解活性证实Ad-RSVuPA感染时产生uPA的催化活性。纯化的病毒以等分试样贮存在-80℃并在注射前用HgDMEM培养基立即稀释。通过OD测量和标准噬斑试验测定病毒滴度。载体的构建基本上按美国专利号5,980,886所述进行，本文引用以供参考。病毒在208F细胞中滴定。

年龄为5至6周的C57BL/6雌性小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)在无特定病原体的环境中圈养。从安乐死的小鼠获得各种时间期限的局部缺血肝脏样品且按上文所述分离肝脏祖细胞。对于门静脉插管，通过腹膜内施用0.5ml 20mg/ml的2，2，2-三溴乙醇麻醉受体小鼠。做一个腹部中线切口并分离皮肤与腹膜以产生一个皮下袋。打开腹膜并暴露门静脉。在门静脉中插入硅氧烷管(0.02″I.D.，0.037″0.D.，S/P Medical Grade，Baxter，III.)并用含肝素的盐水灌流。之后将插管穿过腹膜并用4.0丝缝合固定。3cm长的插管在末端结扎并放在皮下以前产生的袋中。在不早于24小时之后给小鼠提供病毒感染的祖细胞。在一些小鼠中门静脉插管与2/3肝切除术一起进行。然后进行部分肝切除术。为了灌流门静脉，麻醉小鼠，在已存在的腹部切口的邻近位置打开皮肤。暴露插管并连接到注射器泵上。为了进行病毒灌注，将在DMEM中的腺病毒制品在5到10分钟内通过插管注射进门静脉。为达到细胞治疗的目的，可使用任何细胞群体作为自体或同种异体材料并移植进诸如本实施例的情况的患者的特定靶器官或其附近。细胞可在任意合适的培养基，载体或稀释剂或包括微载体，珠，微粒体，微球体，囊泡等的任何类型的药物传递系统中移植。

在腺病毒感染的肝祖细胞通过插管注射进门静脉后进行所有生物化学和组织学分析。对uPA的ELISA试验以针对uPA的催化结构域和受体结合结构域的两个不同单克隆抗体为基础。一个单克隆抗体用过氧化物酶标记。在临床病理学实验室中以常规自动方法分析血清总蛋白和白蛋白。已知腺病毒灌注进C57BI/6小鼠的门静脉导致100％的肝细胞转导，每个细胞有超过1拷贝的腺病霉DNA。相同剂量的Ad-RSV-uPA导致90％的死亡率，至少部分与出血相关。当使用较低剂量的Ad-RSV-uPA时，死亡率不超过5％且选择该剂量用于肝脏再生实验。灌注Ad-RSV-uPA导致血清尿激酶瞬时升高，在4天后达到大约350ng/ml的峰值(比内源性水平高70到100倍)，到第12天下降到背景浓度。uPA的升高也与血清SGPT浓度的升高相关。在腺病毒灌注后不同的时间时，用³H-胸苷灌注动物，并测定掺入肝脏DNA的放射性量作为定量细胞增殖的方法。用AdRSV-uPA处理的动物胸苷摄入的增加时期在第3天开始且持续8天。因此，用Ad-RSV-uPA/卵形细胞处理时肝脏³H-胸苷摄入的时期比用只有部分肝切除术获得的长得多。阴性对照腺病毒的受体显示出在第4天达到肝脏³H-胸苷摄入峰值，其在24小时后回到基线水平且在第11天³H-胸苷摄入增加最小。总之，通过SGPT水平测量肝脏反应且³H-胸苷摄入的高速率归功于肝内尿激酶生产表明发生了明显的肝脏生物合成性再生。无uPA灌注的肝祖细胞比无uPA插入的腺病毒更好。

用重组腺病毒/来自无心跳的尸体供体的祖细胞处理的动物的显微镜组织学发现表明到第3天，处理的小鼠具有含有巨噬细胞和嗜中性白细胞的中度炎症性浸润，肝细胞中的退化改变包括空泡形成，致密且较少有丝分裂的细胞核。施用Ad-RSV-uPA/卵形细胞8至10天后，有肝脏恢复的证据，包括存在多病灶再生，异源性大小的细胞核和大量减少的炎症反应以及较少的退化肝细胞。到3至4周，浸润消散且肝脏出现正常。

总之，这些研究表明尿激酶表达与肝祖细胞结合诱导明显的肝脏实质细胞再生。

生物反应器

使用高效生物反应器(HPBR)培养从尸体供体分离的人肝细胞祖细胞。该方法可提供大量细胞进一步用于医学目的或生物反应器，该生物反应器自身可用作生物学上有用的细胞分泌蛋白和因子的生产装置，该因子可包括但不限于肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素样生长因子-I和II(IGF-I和II)，表皮生长因子(EGF)，a型和b型转化生长因子(TGF-α和TGF-β)，神经生长因子(NGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，肉瘤生长因子(SGF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子(GM-CSF)，血管内皮生长因子(VEGF)，催乳激素和生长激素释放因子(GHRF)和各种造血生长因子，例如白介素(IL)IL-1，IL2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，等，红细胞分化因子(EDF)或促卵泡激素释放蛋白(FRP)，抑制素，干细胞增殖因子(SCPF)及这些蛋白质的活性片断，亚基，衍生物和其组合等本领域已知的许多其它因子。一般来说，本文所用的这些细胞因子是指选自细胞因子，淋巴因子，白介素，集落刺激因子，激素，趋化因子，抗趋化因子，凝血因子，溶栓蛋白，补体蛋白，酶，免疫球蛋白和抗原的分泌蛋白。在该生物学活性蛋白中，本领域的技术人员可选择因子VIII，因子IX，因子VII，红细胞生成素，α-1-抗胰蛋白酶，降钙素，生长激素，胰岛素，低密度脂蛋白，载脂蛋白E，IL-2受体和其拮抗剂，过氧化物歧化酶，免疫反应修饰剂，甲状旁腺激素，干扰素(IFNα，β，或γ)，神经生长因子，葡糖脑苷脂酶，集落刺激因子，白介素(IL)1至15，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞，巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板产生的生长因子(PDGF)，腺苷脱氨酶，胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-2)，巨核细胞启动配体MPL，血小板生成素，或其组合。

不局限于在生物反应器中生长细胞的该具体方案，在本领域的方法中其它已知的方案是同样合适的且可容易地从公开的美国专利号6,001,585；5,998,184；5,846,817；5,622,857；5,571,720；5,563,068；5,512,474；5,443,985；5,342,781；5,330,915；5,320,963；5,202,254；4,833,083；和4,760,028中采用，本文引用以供参考。

本装置含有450 10kD的纤维素纤维和540聚丙烯纤维，其它参数的详情参见，例如美国专利号5,622,857，本文引用以供参考。按上述分离细胞。所有必须材料从Sigma Chemical Co.或者LifeTechnologies获得。长期培养基的附着培养基如下：RPMI 1640(500mL)；50mL(10％)FBS；4mM L-谷酰胺；1x青霉素/链霉素；庆大霉素；15mM HEPES；10mU/mL胰岛素；10mU/mL转铁蛋白；硒；在使用附着培养基前用培养基冲洗HPBr系统1天。将500mg预先膨胀的Cytodex 3微载体接种到HPBr的内部环形空间。充氧器纤维作为微载体的支架且防止它们分布在整个ECS中。将活的人肝细胞祖细胞也接种进内部环形空间，用手摇动和旋转装置以实现细胞与微载体的均匀混合。假定肝细胞直径在10-20μm之间，细胞与微载体的接种量比率为大约500。细胞和微载体的表观粘稠度迅速增加，表明细胞与微载体和细胞与细胞的附着正迅速且正常地进行着。在该混合2-3分钟内，在内部环形空间形成细胞与微载体的离散型凝胶。在附着培养基中37℃下培养(以静止状态)过夜后，将培养基换成长期培养基(2L)。不以任何方式局限于这些体积，因为本领域的技术人员可容易地按比例确定生产以达到所需水平。肝细胞培养5周，每周给系统更换新鲜培养基。通过每天检测样品监测细胞的代谢功能。5周后，通过下列程序获得大于90％的活细胞和载体回收率：使用与0.44mL(0.23M)EDTA混合的在PBS中的0.1％胶原酶冲洗培养的ECS和HPBr10分钟；用注射筒的无菌空气排出ECS的内含物；用长期培养基重复该过程且洗涤和分离所收集的材料。

HPBr同样适合于细胞的培养和遗传转化(例如，HGF基因表达)。下面是用于固着依赖型细胞(例如，SW 480 P3；ATDC#CCL228)的遗传无病毒方案。该方案可由本领域的技术人员从使用培养孔和培养皿的公开方法适当改良和优化。在HPBr中优选具有10kD性质的培养纤维。按上文所述以几乎相同的方式操作该生物反应器。Cytodex 1微载体(Pharmacia，Sigma Chemical Co.销售)广泛用于培养固着依赖型细胞。可将大范围的细胞密度接种进HPBr的ECS中，密度范围为：按需要从1x10⁴到1x10¹¹个细胞或更高。推荐的细胞与微载体的接种量比率是大约10的范围，尽管本领域的技术人员可按需要进行修改。在整个实验过程中以大约10cpm(或更大)轻轻旋转该装置。培养细胞大约1天(或者更长，取决于具体细胞)后，达到最佳汇合以获得有效转染。可调节细胞与微载体接种量的比率以明确影响为治疗和经济效率进行的时间设计。在转染的当天，制备DNA质粒溶液(例如，pCMV)和阳离子脂类溶液(例如，LIPOFECTIN试剂，LifeTechnologies)。这些试剂必须是无血清的，即使总体过程需要存在血清。混合合适量的DNA和脂类溶液，然后将混合物注射进装置的ECS中。转染大约几个(和甚至好几个)小时后，如果合适，可恢复使用血清，且继续按以前培养大约几天。当扩增永久转化的细胞时可使用更长的时间。按与前面所述相似的方式收获细胞。

人造肝脏

作为上面实施例的延伸，本领域的技术人员可容易地采用该生物反应器作为体外肝脏支持系统。异种移植(种间器官移植)通过使用动物器官可帮助缓解供体肝脏矩缺。然而将动物器官移植进人类的潜在危险是感染供体动物的病毒可能会感染受体。由于器官移植受体可能服用药物以抑制免疫系统和防止器官排斥，因此他们不能抵抗感染的动物病毒。另外，动物病毒可在感染的宿主中变异成可感染具有正常免疫系统的人类的形式。结果，可能产生一种新的致病性人类病毒。体外肝脏支持系统可克服这些缺点。用于人类器官移植的优选动物种类是猪和灵长类。然而，很明显如果可获得以人细胞为基础的人造肝脏，它会优于动物肝脏。

在培养所需时间后，获得来自尸体肝脏祖细胞的成熟肝细胞。按常规获得20至50亿个高(超过80％)活力的细胞。一般来说，使用的培养基是补充了激素的Waymouth培养基。为了供应20到50亿个细胞，生物反应器按比例扩充到两个节制容器，每个具有40mm的内部直径和100mm的高度。在该具体情况下每个节制容器使用直径大约2mm且总体积250ml的玻璃珠。以360ml/分钟的循环速率供应培养基。以稳定的耗氧率证实肝细胞的高活力。然后将该生物反应器固着在由于全部肝脏衰竭而通过手术去掉了肝脏的无肝脏的人类受体上。另外，可以不去掉肝脏，但该生物反应器会帮助机能障碍的肝脏更好地恢复。

本领域的技术人员会知道作为体外肝脏支持系统的生物反应器的固着方法或者会知道本领域已如的替代方法，例如在美国专利号6,008,049；5,981,211；5,976,870；5,891,713；5,827,729；5,643,794；5,622,857；5,605,835；和5,270,192中所述，本文分别引用其各自的全文以供参考。根据这些参考文献很明显供体人造肝脏的细胞不必局限于人类，该细胞的跨种使用现在是可能的。例如，来自猪或灵长类的肝脏细胞同样适合于人类使用。

将来自左股动脉的血液导入Minntech血浓缩器中。将12fringeelecath插管插入股动脉中并以1/4″PVC管道连接到血浓缩器上。血浓缩器将血液分成无细胞的超滤液部分和血细胞部分。血细胞部分通过相似的管道返回股静脉。超滤液通过1/4″PVC管道流出血浓缩器并使用滚动泵调到40ml/分钟的流速进入肝细胞生物反应器系统。灌流通过生物反应器后，超滤液经过左颈静脉返回病人。为了证实体外肝脏代谢的提供，在生物反应器的入口向超滤液中施加已知被肝脏代谢的两种不同化学品7-乙氧基香豆素和利多卡因。在超滤液返回病人前在生物反应器的出口测量各自的代谢物，7-OH-香豆素和monoethylglycinexylidide(MEGX)。观察到7-乙氧基香豆素和利多卡因都被明显代谢。因此该结果证实使用生物反应器作为支持系统可提供体外肝脏代谢。分离血细胞与血浆使受体对外源性肝细胞的免疫学反应最小化。因此，来自人类供体的肝细胞，如在我们的例子中从尸体获得的肝脏细胞和诸如猪的非人来源可用于生物反应器以提供体外肝脏支持。

非肝脏细胞的尸体祖细胞

本发明还涉及从非肝脏的组织获得富含祖细胞的细胞群体的方法。该组织的例子包括但不限于肾上腺，血管，骨髓，角膜，胰岛，胆管，晶状体，肺，肾，心脏，肠，卵巢，胰腺，甲状旁腺，松果体，脑垂体，皮肤，睾丸，膀胱，脑，脊髓，胸腺，或甲状腺。

提供了下列实施例作为一般性策略，可根据具体需要对其进行修改而不改变本发明的范围和实质。在一个举例性的实施方案中，提供受试者祖细胞用于患有任何胰岛素缺陷疾病的病人。

在这些研究中使用了胎儿和非胎儿尸体。放血后，原位鉴定总胆管(CBD)，取出并放入Dulbecco’s改良的Eagles培养基(DMEM)溶液中。然后通过用镊子解剖取出相连的胰腺腺泡和胰岛出口以及附着的血管。然后将CBD，与其相连的分支，主要胰腺管一起横切成大约300μm长的微器官外植块或逐个分散的单细胞。然后将这些样品在添加了生长因子，含有或不含1型胶原蛋白或基质胶作为生长底物的DMEM中培养。通过响应细胞将溴化脱氧尿苷(BrdU)掺入DNA来判断生长因子刺激增生的效力。使用抗BrdU的抗体来观察和鉴定短期反应(24-48小时)。通过作为特定生长因子添加的结果这些细胞群体在细胞培养基中生长和增殖的能力来判断长期反应。以1ng/ml，10ng/ml和100ng/ml的浓度使用三种不同的生长因子(EGF，TGF-α，和bFGF)来区分祖细胞。通过BrdU标记评估到的增殖激活在施用10ng/ml生长因子EGF时在24小时的时间长度内出现。在10和100ng/ml剂量之间没有观察到区别。向CBD组织外植块中加入EGF导致不同细胞的增殖和这些细胞的聚簇。初步的长期生长实验表明CBD尸体组织内确实存在较大的增殖潜力且可在培养基中维持至少21天。

用于治疗肝脏疾病的祖细胞

d-半乳糖胺是一种能诱导相似于人类病毒性肝炎损害的损伤的化合物并用于诱导肝炎模型。四氯化碳通过肝脏细胞中药物代谢酶系统的作用产生具有极高反应性的游离基团，且这些游离基团通过与肝脏细胞膜蛋白结合强烈抑制细胞活性或可引起细胞器膜脂类的过氧化作用，从而导致肝脏细胞的坏死和肝脏脂肪的累积。因此，这些化合物广泛用作急性药物诱导的诸如脂肪肝，慢性肝炎和肝硬化的人类肝炎的试验模型。

因此，在本实施例中，本发明人按照美国专利号4,898,890(本文引用以供参考)中详细报道的方法进行了试验以证实根据本发明的尸体祖细胞的效力。每千克体重250mg的d-半乳糖胺溶于每千克体重5ml的生理盐溶液中经过腹膜内注射各重180至200g的Wistar品系的雄性大鼠。通过以自动分析器测量谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(GOT)，谷氨酸-丙酮酸转氨酶(GPT)，和ALP来检查血液样品的血清。除了安慰剂组中的大鼠用培养基安慰剂溶液代替祖细胞悬液给药外，以完全相同于将大约1-5x10⁴-10⁷个肝脏尸体祖细胞直接施用到损伤肝脏的小组的方式处理诱导肝脏损伤的安慰剂对照组。在另一系列的实验中，用四氯化碳代替来损伤大鼠肝脏。当与未损伤的对照组相比时诱导肝脏损伤的动物显示出GOT，GPT，和ALP明显增加。当与未用肝祖细胞处理的诱导肝脏损伤的对照相比时，用祖细胞处理的大鼠证实GOT，GPT，和ALP的增加受到显著抑制。该结果表明祖细胞抑制或甚至逆转且肯定防止d-半乳糖胺和四氯化碳诱导的肝脏损伤。

一个11岁的女孩患有肝脏疾病高胆红素血症，引起一种由肝脏产生的物质胆红素在其血液中过量积聚，作为治疗，她每天需要在紫外光下度过12至15小时，一种称为光线疗法的过程。将来自尸体供体的肝细胞直接移植进其肝脏(门静脉)后，注意到其胆红素水平显著下降，尽管她仍然需要花费大约4到6小时进行光线疗法，但她现在已起作用。

因此，这种尸体肝祖细胞的应用可用于预防和治疗包括但不限于病毒性肝炎，脂肪肝，慢性肝炎，纤维变性和肝硬化的肝脏机能障碍和损伤。另外很清楚本方法允许预防和/或治疗由诸如化学疗法，或药物滥用，或者酗酒的其它原因引起的肝脏代谢机能障碍和/或损伤。有许多药物和物质具有引起肝脏损伤的倾向，它们包括但不限于止痛剂，退热剂，消炎药物，和抗风湿病药物，例如，对乙酰氨基酚，阿斯匹林，保泰松，舒林酸，异丁芬酸，金化合物等。抗生素：氨基苷类，多肽，头孢菌素，青霉素，四环素等。化疗剂：磺胺药物，异烟肼等。抗癌药：丝裂霉素C，顺式铂氨，6-MP，亚硝基脲等。麻醉剂：卤烷，甲氧氟烷等。治疗精神病药物：氯丙嗪，安定，巴比妥等，利尿剂：噻嗪类等。

这些及其它有用的应用对本领域的技术人员是显而易见的。可预见的肝脏疾病的具体例子包括但不限于阿拉惹综合征，酒精肝疾病，α-1-抗胰蛋白酶缺陷，自身免疫肝炎，胆闭锁，胆管缺乏，骨髓衰竭，巴德-希阿里综合征，Byler疾病，克-纳二氏综合征，Caroli疾病，胆汁郁积瘙痒症，胆石病，接合高胆红素血症，慢性移植物与宿主疾病，原因不明性肝疾病，糖尿病，杜-约综合征，红细胞肝性原卟啉症，肝外胆管癌，家族性高胆固醇血症，半乳糖血症，吉尔伯综合征，糖原存储疾病，血管瘤，血色病，肝脑病，肝胆管炎，肝软化，肝大，肝癌，肝胚细胞瘤，遗传性血色病，黄胆，肝内胆汁郁积，肝囊肿，肝移植，与Bacillus cereus相关的肝衰竭，混合型冷球蛋白血症，鸟氨酸转氨甲酰基酶缺陷，紫癜肝病，迟发性皮肤血卟啉病，原发性胆肝硬化，顽固性腹水，罗托综合征，肉样瘤病，硬化性胆管炎，皮脂腺病，Summerskill综合征，血小板减少症，酪氨酸血症，静脉曲张性出血，肝脏静脉闭合疾病，和肝豆状核变性。

祖细胞的制备

本实施例提供了分离定向和未定向肝脏祖细胞的步骤。尽管各种技术在本领域是已知的，但仍然详细公开了一个优选的实施方案且应明白其它的制备技术同样是适合的，只要它们与所需目标相适应。例如，优选的非限制性技术参见美国专利号5,807,686，5,916,743，5,672,346，5,681,559，5,665,557，5,672,346，和5,663,051，本文引用以供参考。

使用Percoll或者诸如Histopaque 的其它合适的密度梯度可初步分离多能或定型肝细胞，即低密度的肝脏细胞，离心后用培养基洗涤两次且重悬于10ml淘洗培养基中。对于逆流淘洗，经过将取样位点偶连到装配有JE-5转子和标准室的Beckman JGM/E离心机的入口液流上注射洗涤的低密度单核细胞。然而，可使用任何商品连续流动的离心机和淘洗机，优选采用包括室装置的一次性塑料插管以利于以密度为基础的分离，例如，使用Deerfield，IL的BaxterInternational Inc.销售的“Fenwal Models CS 3000”和“Autopheresis C”；Cobe manufacturing of Lakewood，CO.销售的“IBM Model 12997”。仪器的选择取决于本领域的技术人员。蠕动泵(Cole Palmer Instruments，Chicago，IL)提供了淘洗培养基的连续流动，该培养基是含有100mg/dl D-葡萄糖，0.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)二钠和50mg/dl牛血清白蛋白且pH调到7.2的0.9％生理盐溶液。用前灭菌该培养基。以15ml/分钟的总体流速，900g的转速室温下传递细胞。收集100ml的洗脱物后，流速增加到25ml/分钟。转速保持恒定，流速依次增加到29ml/分钟，33ml/分钟，和37ml/分钟，每次增加时收集200ml。通过卸下转子并用100ml淘洗培养基冲洗室捕获室中保留的细胞。洗涤各细胞馏分并以300g离心10分钟。收集合适的馏分，以锥虫蓝染料排斥法测定活力并用细胞计数器(Coulter Electronics，Hialeah，FL)测定细胞回收率。

作为选择，肝脏细胞可不通过密度梯度分离处理并悬浮于含有5％胎牛血清，0.01％EDTA重量/体积，1.0g/l D-葡萄糖的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.4中，且使用JA-17转子和标准分离室(BeckmanInstruments)在10℃下以1,950rpm的转速直接注射进Beckman逆流离心淘洗系统中，样品以12到14ml/分钟之间的流速洗脱。因此该方法是通用的且不必依赖于密度梯度分离。

在合适馏分中获得的祖细胞一般具有8.0到9.4微米范围的细胞直径；大多数细胞具有落入8.3至9.2微米范围内的直径。这些直径根据本领域已知的技术测量。如果需要，可进一步进行基于细胞标记的阳性或阴性选择。

可单独使用本领域的技术人员已知的各种其它抗体或与上述肝脏祖细胞标记结合使用。该选择取决于需要分离或富集的细胞类型且包括但不限于，对造血细胞和淋巴细胞抗原特异性的抗体，例如，对T-细胞特异性的抗-CD2，抗-CD2R，抗-CD3，抗-CD4，抗-CD5和抗-CD8；对T-细胞亚群和B-细胞亚群特异性的抗-CD6；对大多数T-细胞亚群特异性的抗-CD7；对B-细胞特异性的抗-CD12，抗-CD19和抗-CD20，抗-CD72，抗-CDw78；对单核细胞特异性的抗-CD13和抗-CD14；对天然杀伤细胞特异性的抗-CD16和抗-CD56；对血小板特异性的抗CD41；对皮质胸腺细胞和胰岛细胞特异性的抗-CD1a，CD1b和CD1c；对前体B-细胞，单核细胞和血小板特异性的抗-CD9；对淋巴祖细胞，C-All和粒细胞特异性的抗-CD10；白细胞特异性的抗-CD11a；粒细胞，单核细胞和天然杀伤细胞特异性的抗-CD11b；对单核细胞，粒细胞，天然杀伤细胞和多毛细胞白血病特异性的抗-CD11c；粒细胞特异性的抗-CD15；粒细胞，单核细胞和血小板特异性的抗-CDw17；白细胞特异性的抗-CD18；成熟B-细胞特异性的抗-CD21；B-细胞细胞质和成熟B-细胞特异性的抗-CD22；激活的B-细胞特异性的抗-CD23；B-细胞和粒细胞特异性的抗-CD24；激活的T-细胞和B-细胞和激活的巨噬细胞特异性的抗-CD25和抗-CD26；主要T-细胞亚群特异性的抗-CD27和抗-CD28；激活的T-细胞和B-细胞和Sternberg Reed细胞特异性的抗-CD30；血小板，单核细胞/巨噬细胞，粒细胞和B-细胞特异性的抗-CD31；巨噬细胞，粒细胞，B-细胞和嗜曙红细胞特异性的抗-CDw32；单核细胞，骨髓祖细胞和骨髓白血病特异性的抗-CD33；造血前体细胞特异性的抗-CD34；粒细胞，单核细胞，B-细胞，一些NK细胞，和红细胞特异性的抗-CD35；单核细胞/巨噬细胞和血小板特异性的抗-CD36；成熟B-细胞特异性的抗-CD37；血浆细胞，胸腺细胞和激活的T-细胞特异性的抗-CD38；成熟B-细胞特异性的抗-CD39；B-细胞和癌特异性的抗-CD40；血小板和巨核细胞特异性的抗-CD42和42b；除循环B-细胞外的白细胞特异性的抗-CD43；白细胞和红细胞特异性的抗-CD44；白细胞特异性的抗-CD45；T-细胞，B-细胞亚群，单核细胞和巨噬细胞特异性的抗-CD45RO；B-细胞，单核细胞和T-细胞亚群特异性的抗-CD45RA；B-细胞，T-细胞亚群，单核细胞，巨噬细胞和粒细胞特异性的抗-CD45RB；造血细胞和非造血细胞特异性的抗-CD46，CD55，CD58和CD59；所有细胞类型特异性的抗-CD47；白细胞和嗜中性白细胞特异性的抗-CD48；血小板，激活的和长期培养的T-细胞特异性的抗-CDw49b；对单核细胞，T-细胞和B-细胞特异性的抗-CDw49d；血小板和巨核细胞特异性的抗-CDw49f；白细胞特异性的抗-CDw50和CDw52；血小板特异性的抗-CD51；包括正常和肿瘤血浆细胞的白细胞特异性的抗-CD53；内皮细胞特异性的抗-CD54；T-细胞亚群和血小板特异性的抗-CDw60；血小板和巨核细胞特异性的抗-CD61；激活的血小板特异性的抗-CD62；激活的血小板，单核细胞/巨噬细胞特异性的抗-CD63；单核细胞(上调干抗素γ)特异性的抗-CD64；粒细胞和与单核细胞的异源性反应特异性的抗-CDw65；粒细胞特异性的抗-CD66和67；单核细胞和巨噬细胞特异性的抗-CD68；激活的B-细胞和T-细胞，激活的巨噬细胞和天然杀伤细胞特异性的抗-CD69；激活的T-细胞和B-细胞，Sternberg-Reed细胞，和退行发育的大细胞淋巴瘤特异性的抗-CDw70；激活的T-细胞B-细胞，巨噬细胞，增生细胞特异性的抗-CD71；B-细胞亚群和T--细胞亚群特异性的抗-CD73；B-细胞和单核细胞/巨噬细胞特异性的抗-CD74；成熟B-细胞特异性的抗-CDw75；成熟B-细胞和T-细胞亚群特异性的抗-CD76；滤泡中心B-细胞特异性的抗-CD77；抗细胞因子和生长因子的抗体(例如，IL1-IL13，EGF，IGF I和II，TGF-α和β，TNF-α和β，FGF，NGF，CIF，IFN-α和β，CSF的抗体)：病毒抗原(例如，乙型肝炎包膜蛋白或HIV包膜蛋白)，激素，细胞或肿瘤相关抗原或标记，粘连分子，止血分子和内皮细胞。本领域已知的其它标记和富集方法同样合适，例如在作为参考文献引用的美国专利号5,840,502中所公开的。

所有上面引证的参考文献和出版物分别以其各自的整体在本文中引用以供参考。

尽管已经举例说明和描述了本发明的优选实施方案，但可预料到可对其作出各种修改而不偏离本发明的实质和范围。本领域的技术人员将认识到，或者使用不超过常规的实验能确定，许多与本文所述的本发明的具体实施方案等同的方案。

Claims (30)

1.一种处理局部缺血性损伤的非胎儿供体组织以获得富集的祖细胞群体的方法，所述方法包括：

(a)提供死后约2小时到30小时之间的非胎儿供体组织，所述的供体组织在这期间保持在活体温度和室温之间的温度；和

(b)处理所述的非胎儿供体组织以获得富集的祖细胞群体。

2.权利要求1的方法，其中所述供体组织在心跳停止后大约2-6小时内获得。

3.权利要求1的方法，其中所述供体组织在心跳停止后大约2-3小时内获得。

4.权利要求1的方法，其中所述供体组织是冷却的。

5.权利要求1的方法，其中所述供体组织冷却到大约4℃。

6.权利要求1的方法，其中所述供体是新生儿，婴儿，儿童，少年或成人。

7.权利要求1的方法，其中所述供体是猪或灵长类。

8.权利要求1的方法，其中所述组织是肝脏。

9.权利要求1的方法，其中所述处理步骤提供了基本上的单细胞悬液或外植块。

10.权利要求9的方法，其中所述处理步骤还包括从悬液中选择那些表达与至少一种祖细胞谱系阳性或阴性相关的至少一种标记的细胞。

11.权利要求10的方法，其中所述处理步骤还包括压实的步骤以提供富集表现出与至少一种祖细胞谱系相关的至少一种标记的祖细胞的压实的细胞悬液。

12.权利要求10的方法，其中至少一种祖细胞谱系包括肝细胞，造血细胞，基质细胞或间充质细胞谱系中的至少一种。

13.一种从缺血性损伤的非胎儿肝脏中获取肝脏祖细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供非胎儿无心跳供体作为肝脏组织来源；

(b)从死亡约2-30小时后的所述非胎儿供体中获得肝脏组织，所述的供体组织在这期间保持在活体温度和室温之间的温度；以及

(c)处理肝脏组织以获得肝脏祖细胞。

14.权利要求13的方法，其中所述供体是哺乳动物。

15.权利要求13的方法，其中所述哺乳动物是人。

16.权利要求13的方法，其中所述祖细胞具有形成肝细胞，胆细胞或其组合的能力。

17.权利要求13的方法，其中所述供体的细胞表达甲胎蛋白，白蛋白，骨唾液蛋白，CD14，CD34，CD38，CD90，CD45，CD117，ICAM-1，I型胶原蛋白，II型胶原蛋白，III型胶原蛋白，血型糖蛋白A，或骨桥蛋白中的至少一种。

18.一种处理具有至少一种祖细胞群体的组织作为祖细胞来源的方法，所述方法包括：

(a)提供死后约2-30小时的无心跳非胎儿供体，所述的供体组织在这期间保持在活体温度和室温之间的温度；

(b)从该非胎儿供体收获组织，所述组织具有至少一种祖细胞群体；和

(c)进一步处理收获的组织以获得祖细胞。

19.一种处理缺血性损伤的非胎儿组织以获得富集二倍体细胞的细胞群体方法，所述方法包括：

(a)收获组织时从无心跳的非胎儿供体中提供组织，所收获的组织死后约2-30小时，推测具有至少一种二倍体细胞群体，所述的供体组织在这期间保持在活体温度和室温之间的温度；

(b)处理收获的组织以获得富含二倍体细胞的细胞群体。

20.权利要求19的方法，其中所述供体是新生儿，婴儿，少年或成人。

21.权利要求19的方法，其中所述二倍体包括祖细胞。

22.权利要求19的方法，其中所述处理步骤包括处理收获的组织以提供单细胞悬液。

23.权利要求22的方法，其中所述处理步骤还包括将单细胞悬液分成2个或多个馏分。

24.权利要求23的方法，其中分离步骤将较大的细胞与较小的细胞分离，较高密度的细胞与较低密度的细胞分离，或者两者都分离。

25.权利要求24的方法，其中进一步处理基本上由较小细胞，较低密度的细胞，或两者组成的一个或多个馏分以提供富集二倍体细胞的细胞群体。

26.权利要求25的方法，其中所述二倍体细胞包括表达甲胎蛋白的祖细胞。

27.权利要求26的方法，其中所述祖细胞包括肝脏祖细胞。

28.权利要求27的方法，其中所述组织在心跳停止大约2-6小时之间收获。

29.权利要求19的方法，其中所述组织在心跳停止后大约2-3小时之间收获。

30.权利要求19的方法，其中所述组织是肝脏。

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