CN102143975A - 特异性配体在msrv相关疾病中的治疗用途 - Google Patents

特异性配体在msrv相关疾病中的治疗用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102143975A
CN102143975A CN2009801348283A CN200980134828A CN102143975A CN 102143975 A CN102143975 A CN 102143975A CN 2009801348283 A CN2009801348283 A CN 2009801348283A CN 200980134828 A CN200980134828 A CN 200980134828A CN 102143975 A CN102143975 A CN 102143975A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
env
antibody
sequence
msrv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801348283A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102143975B (zh
Inventor
科里纳·伯纳德
阿罗伊斯·伯恩哈德特·朗
埃尔维·贝鸿
让-巴蒂斯特·贝特朗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Geneuro SA
Original Assignee
Geneuro SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Geneuro SA filed Critical Geneuro SA
Publication of CN102143975A publication Critical patent/CN102143975A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102143975B publication Critical patent/CN102143975B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明涉及一种配体，其包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的每种互补决定区(CDR)，或在所述序列内具有下面所示数目的取代氨基酸的序列，CDR1(SEQ ID No.1)中0到3个，CDR2(SEQ ID No.2)中0到2个，CDR3(SEQ ID No.3)中0到2个，CDR4(SEQ ID No.4)中0到1个，CDR5(SEQ ID No.5)中0到4个，CDR6(SEQ ID No.6)中0到2个，或在所述序列SEQ ID No.1到SEQ ID No.6内用具有等同化学功能和特性的其他氨基酸替代的氨基酸的序列。

Description

特异性配体在MSRV相关疾病中的治疗用途
本发明的目的是一种对靶分子(抗配体)显示显著结合的配体。
根据本发明，“抗配体”是MSRV-ENV(包膜)蛋白，MSRV是多发性硬化相关的逆转录病毒(Perron等，1997)。“Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis.The Collaborative Research Group on Multiple Sclerosis.”Proc Natl Acad Sci USA 94(14)：7583-8。“MSRV-ENV蛋白”应当被理解为MSRV env基因编码的完整或部分蛋白产物，如下定义：Komurian-Pradel，F等人(1999).Virology 260(1)：1-9，和Rolland A等(2006)J Immunol176(12)：7636-44或模拟MRSV-ENV的抗原或结合特性的任意分子(模拟位)。“ENV-T”对应于完整蛋白，这在实施例2中详述(残基1到542)，“ENV-SU”也称为ENV-1，对应于实施例2详述的S30到K316序列。Env-SU也可以参考Rolland A等人(2006)J Immunol176(12)：7636-44。如通常针对逆转录病毒来说，MSRV在其包膜蛋白-ENV-显示变异性(Perron，H等人(2000)J Neurovirol 6：S67-75；Voisset，C，O.Bouton等人(2000)AIDS Res Hum Retroviruses 16(8)：731-40)。已经显示存在模拟MSRV ENV部分蛋白片段的模拟位，其被来自多发性硬化患者的抗体选择性结合(Jolivet-Reynaud，C，H.Perron等(1999)。“Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes.”Clin Immunol 93(3)：283-93)。
更具体的，本发明的配体包括具有如下所示氨基酸序列的各种互补决定区(CDR)：氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6或具有以下所述的任意序列：
如下指示的所述序列内的大量取代的氨基酸，并且已知可用于获得功能等同的氨基酸序列(Huang 1986；Zabin，Horvath等人1991；Edgar and Schwartz 1992；Sardana，Emini等人1992；Xu，Kapfer等人1992；Lamande 和Bateman 1993；Verdoliva，Ruvo等1995；Yu，Schurr等人1995；Wehrmann，Van Vliet等人1996；Ullmann，Hauswald等人1997；Minuth，Kramer等1998；Ullmann，Hauswald等2000；Janke，Martin等人2003)：CDR1(SEQ ID No.1)中从0到3，CDR2(SEQ ID No.2)中从0到2，CDR3(SEQ ID No.3)中从0到2，CDR4(SEQ ID No.4)中从0到1，CDR5(SEQ ID No.5)中从0到4，CDR6(SEQ ID No.6)中从0到2，或
-在如SEQ ID No.1到SEQ ID No.6所示氨基酸序列内，氨基酸用具有等同化学功能和特性的其他氨基酸取代，以及按照例如下列表格的类似氨基酸(一个字母代码)所示用本领域技术人员已知的其他氨基酸取代(也称为“氨基酸相似性”)：G或A，F或Y，D或E，N或Q，K或R或H，S或T，C或M，V或L或I，W或P和/或根据现有领域的取代(Huang 1986；Zabin，Horvath等1991；Edgar and Schwartz 1992；Sardana，Emini等1992；Xu，Kapfer等1992；Lamande and Bateman 1993；Verdoliva，Ruvo等1995；Yu，Schurr等1995；Wehrmann，Van Vliet等1996；Ullmann，Hauswald等1997；Minuth，Kramer等1998；Ullmann，Hauswald等2000；Janke，Martin等2003)。
这些变体是SEQ ID Nos.1到6所示肽段中氨基酸的缺失、添加或取代的结果，也包括在本发明中，可以通过本领域已知的方法诸如定点诱变或化学合成获得。
本发明的配体具有结合本发明抗配体的能力。
根据本发明，“结合(bind)”或“结合(binding)”的表述应理解为配体明显识别根据实施例5所给标准的抗配体。
在本发明的另一个方面，所述配体包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述轻链可变区包括具有如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少80％同一性和更优选的90％同一性的任意序列的互补决定区(CDR)，所述重链可变区结构域包括具有如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少80％同一性和更优选的90％同一性的CDR。
在另一方面，本发明的配体包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述轻链可变区具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少75％同一性和更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列，所述重链可变区具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少75％同一性和更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列。根据本发明这些VH和VL序列的变体与抗配体显著结合。
“序列同一性”表示：例如在具有80％序列同一性的序列中，在序列比对时相同位置存在80％相同的氨基酸，所述比对可以通过本领域已知的方法进行，诸如描述于Sequence-Evolution-Function Computational Approaches in Comparative genomics.Koonon E.等，2003：Kluwer Academic Publishers或根据“Mac Vector″Software(UK)”说明书的缺省参数。
本发明的配体还可以被定义为包括于重组scFV蛋白之内。
根据本发明的另一方面，配体可以包括于抗体的Fab片段中，所述抗体可以是多克隆，单克隆，寡克隆，嵌合，改造或人源化的抗体。在本发明的具体方面，包括配体的抗体是人IgG，和更具体的是IgG1或IgG4。
多克隆，寡克隆，单克隆抗体可以利用如上所述的抗配体通过传统方法(诸如由Kohler和Milstein(1975)描述的那些方法)或使用描述于Sambrook等，A Guide to Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版(1989)的方法产生。
更具体的，用于获得抗体的本发明的抗配体是由SEQ ID No.20或SEQ ID No.32所示序列或与SEQ ID No.20或SEQ ID No.32所示序列具有至少75％序列同一性的任意序列或与其100％互补的任意序列组成的抗配体。
尤其是采用连接到载体蛋白的肽的形式，所述载体蛋白诸如用于免疫的血清白蛋白或KLH。
本发明还涉及包括本发明配体作为活性成分的药物组合物。该配体还能够以ScFv、Fab片段或抗体的形式存在于药物组合物中。本发明的药物组合物用于治疗MSRV相关疾病。
在本发明的含义中，“治疗”包括预防性或治愈性治疗。本发明药物组合物的给药量将是治疗有效和免疫原性的，并且是本领域已知的，给药的剂量取决于待治疗的个体。
在另一方面，本发明涉及一种治疗方法，包括给药配体、ScFv、Fab片段或抗体或在如上公开的维持其结合特性的任意分子或合适治疗载体中的配体或如上所述的药物组合物。
本发明的治疗方法目的在于治疗MSRV相关疾病。
MSRV是首先从多发性硬化患者分离的人逆转录病毒(Perron，H.，B.Lalande等(1991)，Lancet 337(8745)：862-3；Perron，H.，J.A.Garson 等(1997)，Proc Natl Acad Sci USA 94(14)：7583-8)。相关疾病或综合征被定义为在相应患者中存在以下情况中的一种：(i)特定MSRV RNA或抗原，.优选的在体液(血液，脑脊液，尿液...)中检测到，(ii)来自病变或功能障碍器官的细胞或组织中DNA或RNA拷贝数增加，(iii)涉及疾病或临床综合征的过程的细胞或组织中的特定MSRV蛋白或抗原，或(iv)患有疾病的个体或表现临床综合征的个体的体液中的MSRV蛋白或抗原(如实施例8所述，参见下文及其他部分)。因为MSRV与人内源逆转录病毒W型(HERV-W)家族具有遗传同源性(Blond等1999；Dolei，2005；Dolei and Perron，2008)，MSRV相关疾病的选择性或互补性定义还可以由用于相同检测试验的HERV-W核酸、抗原或蛋白获得(Antony等，2004；Arru等，2007；Karlsson等，2004；Mameli等，2007)。此外，MSRV表达与在致病性病变中共检测到的一些HERV-W拷贝的上调有关(Mameli等，2009)。因此MSRV相关疾病的定义隐含地包括与HERV-W元件相关联。
当与炎症或免疫失调有关以及与上文所述的MSRV表达产物的存在有关时，MSRV相关疾病选自多发性硬化、精神分裂症、临床孤立综合征(CIS，具有神经学症状)、慢性炎性脱髓鞘多神经病、癫痫症、银屑病、癌症、炎性胰腺炎和糖尿病，诸如1型或2型糖尿病。
在一个具体的实施方案中，MSRV相关疾病的治疗方法包括利用有规律地重复注射给药IgG4或IgG1抗体作为慢性治疗。
在另一个方面，本发明涉及一种核酸分子，其包括如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18所示序列的至少一种全长核酸序列或与所述序列具有至少70％，更优选的80％，甚至更优选的90％同一性的任意序列或与其100％互补的任意序列。
“序列同一性”表示：例如在具有80％序列同一性的序列中，在序列比对时相同位置存在80％相同的核苷酸，所述比对可以通过本领域已知的方法进行。(参见上文)
在本发明上述方面优选的实施方案中，核酸分子包括SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQ ID
No.18所示的每种序列，或与所述序列具有至少70％和更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列，或与其100％互补的任意序列。
在本发明的另一方面，核酸编码VH链，更具体的，所述核算由以下序列表示：SEQ ID No.10或12或与所述序列具有至少70％、更优选80％、甚至更优选90％同一性的任意序列，或与其100％互补的任意序列，但不限于维持原始配体或抗配体分子的抗原性和结合性的如先前描述的取代、插入和缺失百分比并(Huang 1986；Zabin，Horvath等1991；Edgar 和Schwartz 1992；Sardana，Emini等1992；Xu，Kapfer等.1992；Lamande 和Bateman 1993；Verdoliva，Ruvo等1995；Yu，Schurr等1995；Wehrmann，Van Vliet等1996；Ullmann，Hauswald等1997；Minuth，Kramer等1998；Ullmann，Hauswald等2000；Janke，Martin等2003)。
核酸序列还能够编码VL链，所述核算由以下序列表示：序列SEQ ID No.9或11，或与所述序列具有至少70％、更优选80％、甚至更优选90％同一性的任意序列，或与其100％互补的任意序列，但不限于维持原始配体或抗配体分子的抗原性和结合性的如先前描述的取代、插入和缺失百分比并(Huang 1986；Zabin，Horvath等1991；Edgar和Schwartz 1992；Sardana，Emini等1992；Xu，Kapfer等1992；Lamande和Bateman 1993；Verdoliva，Ruvo等1995；Yu，Schurr等1995；Wehrmann，Van Vliet等.1996；Ullmann，Hauswald等1997；Minuth，Kramer等1998；Ullmann，Hauswald 等2000；Janke，Martin等2003)。
本发明还包括在严格条件下与编码本发明至少一种肽的核酸杂交的任意核酸。如本文使用的，术语“严格条件”是指允许探针序列与待检测的核苷酸序列杂交的条件。合适的严格条件可以由以下确定：例如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度，或杂交温度，这是本领域公知的。尤其是，可以通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或提高杂交温度来增加严格性。通过计算目标核酸中嘌呤对嘧啶的比例进而改变温度可以进一步缩小对应于具体严格水平的温度范围。关于上述范围和条件的改变是本领域公知的。
本发明还涉及一种嵌合基因，其包括彼此功能性连接的至少一种启动子(在宿主生物体中具有功能)、本发明的核酸和终止子元件(在相同的宿主生物体中具有功能)。嵌合基因包含的各种元件是：首先是调节转录、翻译和蛋白成熟的元件，诸如启动子，编码信号肽或转运肽的序列，或构成多腺苷酸化信号的终止子元件，再者是编码蛋白的多核苷酸。表述“彼此功能性连接”意指嵌合基因的所述元件彼此连接使得这些元件其中一种的功能受到另一个元件的影响。举例来说，当启动子能够影响所述编码序列的表达时，启动子就是与编码序列功能性连接。本发明嵌合基因的构建及其各种元件的组装可以使用本领域技术人员公知的技术进行，尤其描述于Sambrook等(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Nolan C.ed.，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)。构成嵌合基因的调节元件的选择基本上取决于宿主生物体(其中它们必须具有功能)，本领域技术人员能够选择在指定宿主生物体中具有功能的调节元件。术语“具有功能”旨在表示能够在指定宿主生物体中发挥功能。
本发明嵌合基因包含的启动子是组成型或诱导型的。举例来说，常见用于哺乳动物细胞中表达的有效启动子是pCMV(巨细胞病毒启动子)。
根据本发明，嵌合基因还可以包括其他调节序列，其位于启动子和编码序列之间，诸如转录活化因子(增强子)。
本发明还涉及一种包括本发明嵌合基因的克隆和/或表达载体。本发明的载体用于转化宿主生物体及在该生物体中表达配体。这种载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒。优选的，本发明的转化载体是质粒。通常，该载体的主要性质是在宿主生物体的细胞中维持自身和自我复制的能力，尤其是借助于复制起点的存在，以及在其中表达配体的能力。为了宿主生物体的稳定转化，还可以将载体插入基因组。然后载体的组成限于宿主中合成配体需要的元件。这类载体的选择，以及将本发明嵌合基因插入该载体的技术，详尽的描述于Sambrook等(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Nolan C.ed.，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)，属于本领域技术人员的普通知识。有利地，除了本发明的嵌合基因之外，用于本发明的载体还包含编码选择性标记物的嵌合基因。这种选择性标记物使得能够选择有效转化的宿主生物体，即掺入载体的那些。上文所述的可以由编码容易鉴别的酶(诸如GUS酶)的基因，或编码色素或调节转化细胞中色素产生的酶的基因实现。这类选择性标志基因具体描述于专利申请WO 9I/02071、WO 95/06128、WO 96/38567和WO 97/04103。
本发明还涉及包含至少一种本发明嵌合基因的转化宿主生物体，或整合入它们的基因组或携带在染色体外遗传元件上，例如质粒。术语“宿主生物体”旨在表示任意低级或高级的单细胞或细胞外周生物体，本发明的嵌合基因可以被引入其中以产生本发明的配体。优选的，宿主生物体是中国仓鼠卵巢(CHO，Chinese Hamster Ovary)细胞或人胚肾细胞(HEK，Human Epthelium Kidney)细胞。
表述“转化的宿主生物体”旨在表示一种宿主生物体，其具有整合入其基因组或在染色体外遗传元件(例如质粒)中的至少一种本发明嵌合基因，从而在其组织或培养基中产生配体。为了获得本的发明宿主生物体，本领域技术人员可以使用许多已知的转化方法之一。
这些方法之一包括将待转化的宿主生物体的细胞或组织与聚乙二醇(PEG)和本发明载体接触(Chang and Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier and Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。电穿孔是另一种方法，其包括将待转化的细胞或组织和本发明的载体置于电场中(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigekawa和Dower，1989，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一种方法包括通过显微注射将载体直接注射入细胞或组织(Gordon和Ruddle.1985，Gene 33(2)，121-136)。有利地，可以使用“生物弹道学(biolistic)”方法。它包括用其上吸附本发明载体的颗粒轰击细胞或组织(Bruce等.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology 10(3)；286-291；U.S.Pat.No.4,945,050)。
本发明还包括用于产生如上所述的配体、ScFv、Fab片段或抗体的方法，包括在允许合成配体、Fab片段或抗体的条件下培养上述宿主细胞的步骤。
本发明配体的特征在于其结合抗配体的特性。在特定形式中，本发明抗配体的特征在于它包括SEQ ID No.20定义的氨基酸序列，优选的选择由SEQ ID No.32表示。
一种检测生物样品中抗配体的方法，使用本发明ScFv、Fab片段或抗体形式的配体，也是本发明的一部分。所述方法包括以下步骤：
(a)将样品与本发明的配体(如上所述的ScFv、Fab片段或抗体)接触，
(b)检测样品中抗配体的存在。
所述检测方法可以通过将样品与特异性结合MSRV GAG抗原(由MSRV gag基因编码，描述于“Komurian-Pradel等，Virology，1999；260(1)，第1-9页”)的配体接触的额外步骤实现。
根据另一个方面，本发明还涉及检测生物样品中抗配体的免疫测定试剂盒，所述试剂盒包括本发明的配体，如上所述的ScFV、Fab片段或抗体，以及用于检测抗配体与上述配体、Fab片段或抗原的特异性结合的试剂，所述试剂盒还包括免疫反应必需的所有试剂。所述试剂盒此外可以包括与先前定义的GAG抗原特异性结合的配体。
根据另一个方面，本发明还涉及如上所述的这类免疫测定试剂盒在检测MSRV相关疾病中的用途，所述MSRV相关疾病选自：多发性硬化症、精神分裂症、临床孤立综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、癫痫症、银屑病、癌症、炎性胰腺炎和糖尿病，更具体的是1型糖尿病或2型糖尿病。
生物样品可以是血清，尿液，唾液，活检材料等等。免疫测定法的设计是本领域常用的，实验方案诸如固相支持物或免疫沉淀的使用是公知技术。抗体可以被标记用于检测目的，使用酶促、荧光、化学发光、放射性或染料标记。扩大免疫复合物的信号的测定法(诸如使用生物素和抗生物素蛋白或链霉亲和素的测定法)以及酶联免疫测定诸如ELISA或夹心测定法属于本发明的一部分。
附图
图1：(A)VL氨基酸序列，(B)VH氨基酸序列，CDR序列用下划线表示
图2：完整ENV蛋白(ENV-T)和表面切割片段(ENV 1或ENV-SU)的结构
图3：利用过氧化物酶底物进行比色法测量的光密度，比较鼠GNbAC1抗体配体(鼠IgG1 perox)以及只含有配体的重组ScFv片段(ScFv VH+VL biot)。
包被抗体的浓度和每种检测配体的浓度均为5μg/ml；链霉亲和素-过氧化物酶偶联物稀释度是1/2000。
图4：利用过氧化物酶底物通过比色法测量的光密度，比较鼠GNbAC1抗体配体以及只含有配体的Fab结合片段。每种检测配体或IgG1的浓度是10μg/ml+1/250稀释的Jackson公司的过氧化物酶抗-Fab或抗-IgG。检测不同的ENV-T浓度。
图5：在ENV抗原(ENV-T)的系列稀释物上检测GNbAC1和本发明的嵌合抗体IgG1和IgG4。抗体浓度是1mg/ml，过氧化物酶标记的抗IgG二抗是1/250。2G5E12抗体是不与ENV抗原结合的无关抗体，本文中用做阴性对照。
图6：在恒定抗原浓度(ENV-T)的两个批次的配体(A)批次1，(B)批次2上检测GNbAC1和嵌合构建体IgG1和IgG4。抗原浓度为1到0.0078原始鼠单克隆抗体(GNb AC1)，标记为muIgG，含有配体的人IgG1或IgG4构建体(标记为huIgG1和huIgG4.μg/ml)。Jackson公司的抗小鼠或抗人IgG二抗的稀释度是：1/250。
图7：含有配体的GNbAC1、ScFv、IgG1和IgG4嵌合人抗体的构建体：由IL-6的减少表示的ENV抗原(ENV SU)对PBMC促炎性活化的抑制。抗体或ScFv与ENV抗原的比例是25/1。
图8：ApoH-ELISA结果。在独立的实验室对来自关于多发性硬化的欧洲多中心研究的血清进行盲测。
图9：精神分裂症患者和对照的MSRV-ENV和GAG抗原血。使用的抗体对于ENV是2A12A5和6A2B2，对于GAG是2G5E12。
图10：利用6A2B2特异性单克隆抗体检测MSRV-ENV抗原的ApoH-ELISA的光密度(OD)。
图11：患有急性神经炎症和脱髓鞘(实验性变应性脑脊髓炎，多发性硬化的动物模型)的人源化SCID小鼠的临床追踪：与未治疗组相比，不同抗体治疗组临床结果的比较。原始鼠单克隆抗体(GNbAC1)标记为muIgG，含有配体的人IgG1或IgG4构建体标记为huIgG1和huIgG4。
图12：患有急性神经炎症和脱髓鞘(实验性变应性脑脊髓炎，多发性硬化的动物模型)的人源化SCID小鼠的生存曲线：与未治疗组相比，不同抗体治疗组临床结果的比较。原始鼠单克隆抗体(GNbAC1)标记为muIgG，含有配体的人IgG1或IgG4构建体标记为huIgG1和huIgG4。
图13：本实验中检测的每只NOD-SCID小鼠的重量曲线。每只小鼠注射的ENV蛋白剂量标示在括号中。通过箭头标示在IFA和PTX(P14)中乳化的ENV蛋白的最后一次注射。根据它们接受的ENV剂量，将小鼠命名为M1到M6，这标示在图例的括号中编码后(从0到20微克)。曲线的间断对应于相应类型的动物死亡的日期。
图14：对照和ENV-注射的NOD-SCID小鼠(ENV)中的血糖(糖血)浓度：第一次注射的日期(P0)和最后一次注射后一周(P30)的比较。P30测量的血糖可以表示为模拟注射和ENV-注射组在P0(Y轴)测量的血糖的百分比(X轴：对照和“ENV”)。
图15：GNb AC1抗体重链的CDR定义
15A：根据Chothia定义鉴定的氨基酸用更小的字母表示。根据Kabat定义鉴定的氨基酸用加下划线的字母表示。
15B：根据组合两种确定的优选定义，用下划线表示考虑到移植人IgG4抗体可变重链的功能性配体的原始鼠CDR区。
图16：GNb AC1抗体轻链的CDR定义用下划线表示根据Kabat定义鉴定的CDR。根据Contact定义(不是标准的)鉴定的CDR具有更小的字母。
图17：嵌合GNb AC1抗体与固定的ENV蛋白的结合活性。条件描述在相应实施例的正文中。Y轴代表通过比色法测定的每个点的光密度(OD)，并与结合靶ENV蛋白的抗体数量相关。X轴代表用于包被微板相应孔的ENV重组蛋白的浓度，清洗后，获得相应平板固定蛋白的宽泛量谱。
图18：人源化抗体H2/VK3与固定的ENV蛋白的结合活性。条件描述在相应实施例的正文中。Y轴代表通过比色法测定的每个点的光密度(OD)，并与结合靶ENV蛋白的抗体数量相关。X轴代表用于包被微板相应孔的ENV重组蛋白的浓度，清洗后，获得相应平板固定蛋白的宽泛量谱。
图19：人源化抗体H4/VK3与固定的ENV蛋白的结合活性。条件描述在相应实施例的正文中。Y轴代表通过比色法测定的每个点的光密度(OD)，并与结合靶ENV蛋白的抗体数量相关。X轴代表用于包被微板相应孔的ENV重组蛋白的浓度，清洗后，获得相应平板固定蛋白的宽泛量谱。
图20：人源化抗体H2/VK3(H2vk3)和嵌合抗体(GNbAC 1IgG4)与固定的ENV的结合活性的比较。条件描述在相应实施例的正文中。Y轴代表通过比色法测定的每个点的光密度(OD)，并与结合靶ENV蛋白的抗体数量相关。X轴代表用于包被微板相应孔的ENV重组蛋白的浓度，清洗后，获得相应平板固定蛋白的宽泛量谱。
图21：非还原性凝胶中纯化的H2VK3抗体
条件描述在相应实施例的正文中。左侧，KD数目表示具有指定分子量(KD)的标准蛋白在凝胶上迁移的水平(条状)，如附图左侧泳道所示。纯化的H2/VK3抗体在附图的中间泳道显示为单一条带(箭头)，而牛血清白蛋白(抗体缓冲液中的标准品，不同分子量处箭头显示的对照)，显示于附图的右侧泳道；
图22：纯化的H2/VK3(hH2+hVK3纯化)和纯化的嵌合抗体(GNbAC1IgG4)与固定的ENV(0.5微克/ml)的结合活性的比较。X轴代表单位为纳克/ml的IgG4嵌合抗体或挑选的人源化抗体浓度。Y轴代表通过比色法测定的光密度，并与测定中结合含量恒定的固定ENV蛋白的抗体数量相关。
图23：人源化抗体H2重链和VK3轻链的氨基酸序列。上标黑体字的氨基酸代表框架中保留的鼠氨基酸，基于数据库中分析的它们与人抗体序列的共有位置。
图24：通过HERV-W ENV相关蛋白刺激星形细胞强烈上调促炎性细胞因子
结果表示为三次重复值的平均数。ENV：MSRV-ENV；合胞素：来自染色体7q拷贝的HERV-W ENV；X：无关抗体(对照同种型)；鼠抗-ENV：GNb AC1鼠抗体；嵌合抗-ENV：GNb AC1嵌合人IgG4；Pg/ml：皮克每毫升。
图25：外周血单核细胞培养物
结果表示为三次重复值的平均数。ENV：MSRV-ENV；合胞素：来自染色体7q拷贝的HERV-W ENV；X：无关抗体(对照同种型)；鼠抗-ENV：GNb AC 1鼠抗体；嵌合抗-ENV：GNb AC 1嵌合人IgG4；Pg/ml：皮克每毫升。
图26：人的糖基化处理HERV-W ENV蛋白与三种形式的GNb AC1配体(鼠，嵌合和人源化抗体)的检测。A)人糖基化处理的HERV-W ENV蛋白与GNb AC1鼠抗体的检测。B)人糖基化处理的HERV-W ENV蛋白与GNb AC1嵌合抗体的检测。C)人糖基化处理的HERV-W ENV蛋白与GNb AC1人源化抗体的检测。Y轴：光密度；X轴：细菌MSRV-ENV蛋白(ENV-T 7A批次)；细菌MSRV-ENV表面片段(ENV-SU4A批次)；人糖基化合胞素；人糖基化MSRV-ENV蛋白(ENV-T P1批次)。
图27：脑内注射MSRV ENV模拟溶液(假)的大鼠的神经行为分数：
在假(PBS溶液)，ENV-icv(ENV注射的脑内室)和ENV-hipp大鼠中脑内注射后数个时间点(P5、P6、P7、P11和P12)，接触新鲜刺激后水平的-用Y轴穿越线的数目显示-(A)和垂直的-用Y轴后腿站立的次数显示-(B)运动活性。
图28：脑内注射MSRV ENV模拟溶液(假)的大鼠的神经行为分数：
在P11的假、ENV-icv和ENV-hipp大鼠中盐水注射后的水平的-通过穿越线的数目在Y轴上显示-(A)和垂直的-通过后腿站立的次数在Y轴上显示-(B)运动活性。
图29：脑内注射MSRV ENV模拟溶液(假)的大鼠的神经行为分数：
在P13的假、ENV-icv和ENV-hipp大鼠中受限应力后的水平的-通过穿越线的数目在Y轴上显示-(A)和垂直的-通过后腿站立的次数在Y轴上显示-(B)运动活性。
图30：脑内注射MSRV ENV的大鼠神经行为分数显示IgG4GNbAC1配体的治疗效果：
(A)在假大鼠、注射ENV(ENV+)的未治疗大鼠和IgG4治疗ENV+大鼠(如附图指示)中接触新鲜刺激后在P12和P32在开放野测量的水平运动活性-如X轴所示-，
(B)在P32通过受限应力后的水平运动活性观察IgG4配体治疗效果的确认；在假大鼠、未治疗的ENV+大鼠和IgG4治疗的ENV+大鼠(如附图指示)中取消全身性注射ENV蛋白后受限应力之后在开放野测量-Y轴上穿越线的数目。
图31：显示IgG1GNbAC1配体治疗效果的“ENV阳性”淋巴瘤移植裸鼠的研究
注射淋巴瘤细胞19天后从对照和IgG1治疗小鼠(X轴)计算的脾指数(Y轴)。如下计算脾指数：[(脾重量/体重)×100]。没有重叠的误差棒表明统计显著性。
图32：显示IgG1GNbAC1配体治疗效果的“ENV阳性”淋巴瘤移植SCID小鼠的研究
注射B淋巴瘤细胞7天后从未治疗的和IgG1治疗的SCID小鼠计算的脾/体重比(Y轴)。如下计算的脾/体重比进行估算：[(脾重量/体重)×100]。
图33：显示IgG1GNbAC1配体治疗效果的“ENV阳性”淋巴瘤移植SCID小鼠的研究
注射淋巴瘤细胞后7天和注射抗体后6天，从对照和IgG1治疗小鼠收集的腹膜液中活的和死的淋巴样干细胞的数目-Y轴-(A)其他白细胞的数目(B)-X轴-。
下列实施例是为了说明本发明，无论如何不是限制本发明。
实施例
实施例1：鼠特异性抗体(GNbAC1)的分析：鉴定对MSRV ENV蛋白及其等同物特异的分子配体的序列和结构
将小鼠骨髓瘤与来自Balb-C小鼠的脾细胞融合后获得鼠杂交瘤，所述小鼠用在大肠杆菌中产生并从MSRV“ENV”克隆纯化的重组MSRV蛋白免疫，描述于Komurian-Pradel，F.，G.Paranhos-Baccala等(1999)，Virology 260(1)：1-9)。
来自该IgG1/Kappa(GNbAC1)生成杂交瘤的VH和VL区的PCR扩增根据下列方案实现。
根据制造商的说明书，利用mRNA纯化试剂盒(Amersham Bioscience)从5×107个生成IgG1/Kappa的杂交瘤细胞提取并纯化Poly(A+)RNAs。根据制造商的说明书，使用RT-PCR试剂盒(Amersham Bioscience)从800ng mRNA进行逆转录。按照先前的描述(Ruberti等，1994，J.Immunol.Methods 173，33-39)，利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得轻链(VL)和重链(VH)的cDNA编码可变区基因序列。
正向引物如下：SEQ ID No.21(RACEforward)，反向引物：SEQ ID No.22(CL_Ala130_Fwd)用于VL扩增，正向引物SEQ ID No.23(CH1_Pro119_Fwd)用于VH扩增，字母代码R＝A/G，K＝G/T，H＝A/T/C。反向引物CL_Ala130_Backward和CH1_Pro1 19_Backward，从Kabat等(1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest.National Institute of Health Bethesda，MD)的共有序列推导得出，对小鼠kappa/CL结构域和IgG/CH1结构域的N端特异。
使用Taq DNA聚合酶获得PCR产物，然后根据制造商的说明书，使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将其直接连入
Figure BPA00001328779300141
载体。使用循环测序试剂盒(Dye Terminator Cycle S equencing Ready Reaction Kit，Applied Biosystems公司)在ABI310自动测序仪上测序来确定克隆的DNA的序列。
这些PCR扩增，继之以克隆和测序步骤分别提供SEQ ID No.7和8表示的VL和VH链的序列，它们的氨基酸序列从原始核苷酸序列推导得出。此外，这些氨基酸序列的分析允许鉴定涉及配体特异性的互补决定区(CDR)(根据Kabat，Wu和Kabat 1970，An analysis ofthe sequences of the variable regiohs of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity.J.Exp.Med.1 32：2 1 1-250；Kabat等人1987，1991，Sequences of proteins of immunological interest；第四版US Govt.Printing Off.No.165-492)或通过结构，根据Chothia和Lesk 1987，Canonical structures for the hypervahable regions of immunoglobulins.J.MoI.Biol.196：901-917；Chothia等人1989，Conformations of  immunoglobulin hypervariable regions.Nature 342：877-883)。
VH氨基酸序列上鉴定出3个CDR序列(图1B)，对应于SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID NO.6，在VL氨基酸序列上鉴定出3个CDR序列(图1A)，对应于SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID NO.3。这6个CDR序列代表配体结合特异性所需的核心“最小”序列，包括在保留当前鉴定的特异性配体的活性的任意组合物或分子构建体中。尽管如此，本领域技术人员都知道少数氨基酸可以被替代具有等同特性，因此保留原始配体序列的特异性，使其成为等同配体。已知这类变体可能在10-12％的最大范围内。
实施例2：MSRV ENV抗原产生和免疫的实施例——为了获得抗ENV反应性脾细胞用于产生特异性杂交瘤：
来源：来自MSRV病毒粒子(Perron，Jouvin-Marche等.2001)的质粒pV14，包括对应于数据库登录号(NCBI-Entrez/Genbank)：AF331500.1的蛋白序列。
图2代表完整ENV蛋白(ENV-T，SEQ ID No.19)和表面切割片段(ENV1或ENV-SU，SEQ ID No.24)的结构。图2中，信号肽起始于残基#1(甲硫氨酸)，终止于残基#29(苏氨酸)。
产生方法：
根据供应商的说明书，将Geneart(USA)提供的ENV-T编码序列连接入Novagen(EMD Chemicals，Inc.，Gibbstown，NJ，UNITED STATES)提供的表达质粒表达载体pET-15b，通过典型CaCl2透化转化细菌BL21大肠杆菌菌株，描述于“DNA Isolation and Sequencing”(Essential Techniques Series)by Bruce A.Roe，Judy S.Crabtree和Akbar S.Khan由John Wiley&Sons出版，ISBN 0-471-97324-0 QP625.N89R64 1996 John Wiley&Sons，以及描述于Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course(Paperback)中，Katharine G.Field(作者)，Walt Ream (作者)，转化的细菌在添加30μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃生长直至光密度
然后通过1mM IPTG诱导蛋白的表达，然后在37℃继续培养4小时。
提取方法.
在4℃下5000g离心20分钟后，将细菌沉淀重悬于20mL/L培养物裂解缓冲液(Tris 20mM pH7.5；NaCl 0.15M；胰蛋白酶醛肽(leupeptine)1μg/mL，胃蛋白酶抑制剂(pepstatine)1μg/mL，PMSF 1mM，MgCl2 2mM，溶菌酶50μg/mL)。溶液边搅拌边在4℃温育30分钟，然后在冰/乙醇中超声处理(4步，7分钟在80％0.5)。添加脱氧核糖核酸酶(DNase)1mM，溶液边搅拌边在4℃温育1小时。悬液在4℃下以40000g离心30分钟。
将沉淀重悬于7.5mL/L培养物溶解缓冲液(Tris 20mM pH7.5，NaCl150mM，尿素2M，SDS 1.5％，β巯基乙醇50mM)。将溶液在8℃边搅拌边温育2小时。
然后将悬液在10℃下40000g离心30分钟。
纯化方法：
将尿素上清用缓冲液Tris 20mM pH7.5，NaCl 150mM，尿素150mM，SDS 1.5％稀释5倍。利用镍柱(Ni Sepharose Fast Flow column，Amersham BioScience公司)通过亲和层析纯化1mL/L培养物。在用缓冲液Tris 20mM pH7.5，NaCl150mM，尿素500mM，SDS 1.5％，β-巯基乙醇10mM平衡后，将上清按2mL/mn上样到树脂上。通过30和50mM咪唑的步骤进行Env的洗脱。
利用脱盐柱(Amersham BioScience，25mL树脂)进行纯化。在用缓冲液Tris 20mM pH7.5，NaCl 150mM，SDS 1.5％，DTT 10mM平衡后将来自亲和层析的混合物按照2mL/min上样到树脂上。利用相同缓冲液洗脱蛋白。
然后，将蛋白按照1mL/min上样于用缓冲液Tris 20mM pH7.5，NaCl150mM，SDS 1.5％，DTT 10mM平衡的Superdex 200凝胶过滤(Amersham Bioscience)。利用相同缓冲液洗脱蛋白。
内毒素去除：
利用Acticlean柱(Amersham BioScience，8mL树脂)进行纯化。在用缓冲液Tris 20mM pH7.5，NaCl 150mM，SDS 1.5％，DTT 10mM平衡后，将混合物按照1mL/min上样到树脂上。利用相同缓冲液洗脱蛋白。
批次的质量控制
-质谱MALDI-TOFF：因为SDS所以不能使用。
-N端测序：ALPYXTFLFT
-内毒素测定：＜5UE/ml
批次性质：
表观溶解度：100％
纯度：＞90％
浓度：0.05mg/ml
保存：-80℃
数量：1.5mg
缓冲液：Tris 20mM pH 7.5，NaCl 150mM，SDS 1.5％，DTT 10mM
实施例3：对MSRV ENV抗原特异的配体结合活性的体外证据：
I-目标
我们通过免疫测定技术(ELISA)评价了配体对于重组抗配体(以来自克隆VH+VL序列的ScFv重组蛋白的形式或以从原始鼠GNbAC1切割的Fab片段的形式(包含缺失鼠抗体功能和结构的切割VH+VL链))的亲和力。将这种配体与原始鼠GNbAC1，以及将配体插入人IgG1或IgG4恒定链及其用作药理学载体的相应序列的分子构建体进行比较。
II-材料和方法
a)VH和VL克隆：
GNbAC1可变区轻链(VL)和重链(VH)的克隆和核苷酸测序
根据制造商的说明书，利用mRNA纯化试剂盒(Amersham Bioscience)从5×107个生成GNb AC1抗体的杂交瘤细胞提取并纯化Poly(A+)RNA。根据制造商的说明书，使用RT-PCR试剂盒(Amersham Bioscience)从800ng mRNA进行逆转录。
按照先前的描述(Ruberti等，1994，The use of the RACE method to clone hybridoma cDNA when V region primers fail.J.Immunol.Methods 173，33-39)，利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得轻链(VL)和重链(VH)的cDNA编码可变区基因序列。正向引物如下：RACE aller，(SEQ ID No.21)。反向引物如下：CL Ala130 retour(SEQ ID No.25)用于VL扩增，和CH1 Pro119 retour(SEQ ID No.26)用于VH扩增，字母代码R＝AIG，K＝G/T，H＝ATTIC。反向引物CL Ala130 retour 和CH1 Pro119 retour，从Kabat等(1991，Sequences of proteins of immunological interest.National Institute of Health Bethesda，MD)的共有序列推导得出，对小鼠kappa/CL结构域和IgG/CH1结构域的N端特异。
使用Taq DNA聚合酶获得PCR产物，然后根据制造商的说明书，使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将其直接连入
Figure BPA00001328779300181
载体。使用循环测序试剂盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，Applied Biosystems)在ABI310自动测序仪上测序来确定克隆的DNA的序列。
b)ScFv构建和表达：
根据“Mallano A等，2008，Generation and characterization of a human single-chain fragment variable(scFv)antibody against cytosine deaminase from Yeast.M.BMC Biotechnol.Sep 10；8：68”中描述的技术获得ScFV。
c)来自GNb AC1抗体的Fab
根据“Lefranc G，Lefranc M P.Antibody eng ineering and perspectives in therapy.Biochimie.1990Sep；72(9)；639-51”描述的技术获得Fab。
II-1材料
II-1a单克隆抗体
产生并纯化下列浓度的配体，人IgG分子构建体或GNbAC1：
表1：不同配体、ScFV、Fab和抗体的浓度
  名称   浓度
  GNbAC1   5.91/ml
  人IgG1中的配体   1mgml
  人IgG4中的配体   2mg/ml
  小鼠Fab   1mg/ml
  重组ScFv   1mg/ml
II-1b重组蛋白
MSRV完整ENV蛋白(ENV-T)和表面结构域片段(ENV-SU)重组蛋白，由蛋白专家(Protein Expert)在大肠杆菌中产生，并按照实施例2的描述进一步纯化。
  蛋白名称   浓度   内毒素
  ENV-T   0.15mg/ml   ＜5UI/ml
  ENV-SU   0.20mg/ml   ＜5UI/ml
表2：重组蛋白的浓度
II-1c夹心ELISA
-微孔用每孔100μl的50mM碳酸氢钠、pH 9.6稀释的抗-ENV捕获抗体(3C1D5，bioMerieux提供)包被。4℃密封板一夜。
-用每孔250μl的PBST 0.05％(含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲盐水：Sigma P7949)将微孔清洗3次。最后一次清洗后，将板倒置，在吸水纸上渗出以去除任何残余缓冲液。
-添加200μl每孔的PBST 0.05％+5％奶粉。将板密封，轻轻搅拌条件下在室温下温育1小时。
-用每孔250μl的PBST 0.05％将微孔清洗3次。最后一次清洗后将板倒置，在吸水纸上渗出以去除任何残余缓冲液。
-将微孔用每孔100μl的PBST 0.05％稀释的ENV抗原(ENV-T或ENV-SU)温育。将板密封，轻轻搅拌条件下室温温育2小时。
-用每孔250μl的PBST 0.05％将微孔清洗3次。最后一次清洗后，将板倒置，在吸水纸上渗出以去除任何残余缓冲液。
-添加每孔100μl的用PBST 0.05％+5％奶粉稀释的检测抗体(GNbAC1或重组片段ScFv)。将板密封，轻轻搅拌条件下室温温育1小时。通过Squarix公司(Germany)，GNbAC1用过氧化物酶标记，ScFv用生物素标记。
-将微孔用每孔250μl的PBST 0.05％清洗4次。最后一次清洗后，将板倒置，在吸水纸上渗出以去除任何残余缓冲液。
-添加每孔100μl底物溶液(将1片o-间苯二胺(OPD)稀释于10ml0.05M磷酸柠檬酸盐缓冲液pH5+10μl H2O230％(最后时刻制备))。将板在室温黑暗条件下温育30分钟。
-添加每孔50μl的终止溶液2N H2SO4。
-在反应停止后30分钟内，在490nm读取吸光度。
II-1d在包被ENV抗原(如上所述的ENV-T或ENV-SU)的微板上 的直接ELISA
-将微孔用每孔100μl的50mM碳酸氢钠，pH 9.6稀释的ENV抗原包被。将板密封，轻轻搅拌条件下37℃温育2小时。
-将微孔用每孔250μl的PBS(磷酸盐缓冲盐水)清洗4次。最后一次清洗后，将板倒置，在吸水纸上渗出以去除任何残余缓冲液。
-添加每孔100μl的用PBS+BSA 1％(PBS，含1％牛血清白蛋白)稀释的本发明检测抗体(GNbAC1或其Fab片段)。将板密封，轻轻搅拌条件下室温温育1小时。
-将微孔用每孔250μl的PBS清洗4次。最后一次清洗后，将板倒置，在吸水纸上渗出以去除任何残余缓冲液。
-添加每孔100μl的用PBS+BSA 1％稀释的检测二抗(抗IgG Jackson-1/250稀释；或，IgG抗人氧化物酶perox Jackson 115-035-146或，IgG抗小鼠perox Jackson 115-035-062，根据一抗)。将板密封，轻轻搅拌条件下室温温育1小时。
-将微孔用每孔250μl的PBS清洗6次。最后一次清洗后，将板倒置，在吸水纸上渗出以去除任何残余缓冲液。
-添加每孔100μl底物溶液(将1片o-间苯二胺(OPD)稀释于10ml0.05M磷酸柠檬酸盐缓冲液pH5+10μl H2O230％(最后时刻制备))。将板在室温黑暗条件下温育30分钟。
-添加每孔50μl的终止溶液2N H2SO4。
-在反应终止后30分钟内，在490nm读取吸光度。
III-结果
III-1夹心ELISA：鼠IgG1(GNbAC1)和ScFv
Figure BPA00001328779300211
表3：针对每种浓度的抗原或对照缓冲液的包被抗体对比过氧化物酶或生物素检测配体的浓度。结果对应于测量的光密度。PBST：含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水
在图3中显示不同条件下用ScFv和原始GNbAC 1平行进行的ELISA结果。
包被抗体和检测配体的浓度均是5μg/ml；链霉亲和素-过氧化物酶偶联物稀释度是1/2000。
我们在抗ENV-SU和ENV-T重组蛋白的夹心ELISA中分析GNbAC1和重组ScFv作为检测配体。从图3可以看出，在相同浓度，MAb和ScFv能够检测ENV蛋白，其中ScFv的OD超过IgG的一半，IgG是二价和ScFv是单价。因此，相对于每分子结合位点的数目，分离的配体产生比完整的鼠IgG更好的结果。因此，抗体功能不是必需的，利用所述分离配体的改善结果是出乎意料的。
III-2直接ELISA：GNb AC1和Fab
  Fab：100μg/ml   GNb Ac1：10μg/ml
  Env T 0.5μg/ml   2.83   3.00
  Env T 0.25μg/ml   1.85   2.75
  Env 0.125μg/ml   1.19   8
  Env T 0.0625μg/ml   0.77   NA
  Env T 0.013125μg/ml   0.56   0.51
  Env T 0.015625μg/ml   0.56   0.37
  Env T 0.0078125μg/ml   0.48   0.26
表4：针对每种浓度的抗原或对照缓冲液的包被抗体对比过氧化物酶标记的检测配体(直接标记)的浓度。结果对应于测量的光密度。NA：不适用的检测(技术问题求解)。
我们在抗ENV-T重组蛋白的夹心ELISA中分析鼠IgG1及其Fab片段作为检测配体。从图4可以看出，在相同浓度，单价Fab以优于或等于二价IgG的光密度检测出ENV蛋白。我们再一次看到分离的配体出人意料的产生比完整IgG更好的结果。
因此我们总结得出，重复地，抗体功能不是必需的，并且配体自身比“天然”鼠IgG更有效。
实施例4：具有人IgG1和IgG4恒定链和配体的分子构建体的设计、构建和体外分析。
在靶抗原的免疫测定检测中证明分离配体(具包括有天然(Fab)或重组(scFv)VH和VL序列的单价结合位点)出乎意料的改善性能后，我们设计并构建了重组序列用于产生包括配体序列(VH+VL)的嵌合人IgG1或IgG4分子。因此，我们产生了完整抗体作为配体的分子载体，并通过免疫测定与原始的鼠IgG比较以进行评价。
为了产生具有插入配体的这些重组抗体载体，采用适合在CHO细胞中表达的克隆，由“Polymmun”(Vienna，Austria)生产和纯化抗体。利用合适的载体产生这些抗体的技术条件概述如下：
重组CHO细胞系GNbAC1_IgG1和GNbAC1_IgG4的建立
本节描述重组表达为嵌合人/小鼠IgG1和IgG4的重组单克隆抗体GNb AC1的基因来源，而恒定区是人的，可变区是分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.7描述的原始VH和VL序列。
表达质粒
嵌合GNb AC1 IgG1轻链(LC)
基本上，该表达质粒是商品化供应的pClneo(Promega)，其用于第一步插入密码子优化的(用于CHO细胞中表达的密码子使用优化，通过GENEART设计，还包括mRNA结构的优化)、包括免疫球蛋白kappa信号序列的人kappa轻链骨架和具有中间限制性酶切位点的人c-kappa-恒定区以插入任意可变轻链区。根据VL的初级序列(SEQ ID No.7)，合成核苷酸插入物在GENEART AG(Regensburg，Germany)合成，包括信号序列3′端和kappa轻链区的5′位点的限制性酶切位点以将优化的可变区-VL密码子-(SEQ ID No.27)插入BsiWI和AccIII打开的真核表达载体(载有密码子优化的人kappa轻链主链-IgG1L密码子-在CMV启动子的控制下)。此外，载体包含新霉素磷酸转移酶以便用G418挑选CHO细胞。SEQID No.28显示带有用于在CHO细胞中表达的优化“IgG1L密码子和VL密码子”的构建体的核苷酸序列。
嵌会GNb AC1 IgG1重链(HC)
用于产生GNb AC1 IgG1真核表达载体的克隆载体包括具有相同调节区的两个真核表达盒。该载体包含密码子优化的(用于在CHO细胞中表达的密码子使用优化，通过GENEART设计，还包括mRNA结构的优化)人IgG1主链—包括免疫球蛋白重链的信号区和具有中间限制性酶切位点的人IgG1恒定区以插入任意可变重链区。
小鼠单克隆抗体GNb AC1可变区(VH)的氨基酸序列信息显示在SEQ ID No.8。根据该初级序列，合成核苷酸插入物在GENEART合成，包括位于信号序列3′端和gamma链CH1区5′位点的限制性酶切位点，以便将优化的可变重链区(SEQ ID No.29)-VH密码子-插入AgeI和NheI打开的真核表达载体(载有密码子优化的人IgG1主链，在SV40启动子的控制下)。此外，载体包含小鼠二氢叶酸还原酶作为第二表达盒以便用作动物细胞培养物的挑选/扩增标记。SEQ ID No.30显示带有用于在CHO细胞中表达的优化人IgG1H-主链和优化的VH密码子的构建体的核苷酸序列。
嵌合GNb AC1 IgG4重链(HC)
用于产生GNb AC1 IgG4真核表达载体的克隆载体包括具有相同调节区的两个真核表达盒，并且与IgG1构建体相同。
但是，因为没有人IgG4恒定区提供包括信号序列的完整重链，小鼠GNb AC1可变重链(VH)区和人IgG4恒定区由GENEART合成。
SEQ ID No.31显示嵌合GNb AC 1IgG4优化的重链(IgG4H密码子)编码区的核苷酸序列。然后，将插入物引入NotI和SacII打开的真核表达载体，产生SEQ ID No.32所示的构建体，其带有用于在CHO细胞中表达的优化IgG4H密码子和优化VH密码子。
所有质粒在GENEART克隆，然后转化入大肠杆菌菌株TOP10。重组细菌在50ml LB/Amp培养基中增殖，利用Promega PureYieldTM质粒中量纯化系统(Plasmid Midiprep Systems)分离质粒。利用260nm和280nm的光密度比值光测控制质粒的产量和纯度，确定为至少1.5。
重组CHO细胞系GNB AC1_IGG1和GNB AC1_IGG4的建立
转染方法
挑选二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(称为CHO dhfr-，ATCC No.CRL 9096)作为产生最终表达系的亲本细胞系。这些细胞-来源于美国典型培养物保藏中心(ATCC)-在“培养基”中增殖，所述培养基由添加4mM L-谷氨酰胺，0.1mM次黄嘌呤，0.016mM胸苷(HT)，0.25g/l大豆蛋白胨，0.1％普朗尼克(Pluronic)F-68和无蛋白补充剂(Polymun Scientific)的DMEM组成，按照1∶6的分流比每周两次。
5×106个细胞用基础培养基清洗一次，然后重悬于10ml完全培养基用于转染。在室温下将900μl聚乙烯亚胺(1mg/ml PEI线性的，MW：25,000，Polysciences Inc.)与12μg HC和12μg LC质粒在2ml总体积中温育形成复合物(polyplexes)。在170g离心前，复合物与12ml的CHO细胞相互作用4小时，弃去上清，并在“培养基”中重悬细胞。24小时后，完全培养基用50ml选择培养基替换，所述选择培养基由添加4mML-谷氨酰胺，0.25g/l大豆蛋白胨，0.1％Pluronic F-68，无蛋白补充剂(Polymun Scientific)和0.5μg/ml G418的DMEM组成。在5块96孔板中每孔种入100μl细胞悬液。4个转染实验(对于嵌合GNbAC1-IgG1来说“IgG1H密码子+VH密码子”构建体与“IgG1 L密码子+VL密码子”共转染；对于嵌合GNbAC1-IgG4来说“IgG4H密码子+VH密码子”构建体与“IgG1L密码子+VL密码子”共转染)产生总共20×96孔板(对应于1920个孔)每种IgG亚型。
10到14天后，给形成的克隆添加100μl“扩增培养基”(由溶于选择培养基的0.048μM MTX组成)。给生长的克隆再次添加另一100ul包含0.048μM MTX的扩增培养基，此后用双夹心ELISA进行分析。ELISA使用抗人-γ特异性多克隆血清进行包被，使用抗人kappa链HRP偶联的多克隆抗体进行检测。
将挑选的高产生克隆与选择培养基中的0.19μM MTX相适应。
表5描述在T25Roux细颈瓶和Spinner管的0.096和0.19μM MTX中对GNb AC1 IgG1和GNb AC1 IgG4最佳生产株的挑选。
就GNb AC1_IgG1而言，我们确定克隆6B6，就GNb AC1_IgG4而言，我们确定克隆7C1。就GNb AC1_IgG1而言，完成3个克隆GNb AC1_IgG1_6B6，GNb AC1_IgG1_8H2和GNb AC1_IgG1_18A8的低温保存，就GNb AC1_IgG4而言，完成GNb AC1_IgG4_6C1和GNb AC1_IgG4_7C1的低温保存。最佳克隆通过有限稀释法进行亚克隆，例如，描述于“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第三版)，Joseph Sambrook，Peter MacCallum Cancer Institute，Melbourne，Australia；David Russell，Cold Spring Harbour Laboratory Books”。
最佳生成转染子GNb AC1_IgG1_6B6和GNb AC1_IgG4_7C1的亚克隆
亚克隆在96孔板中利用溶于扩增培养基的每孔90、30和10个细胞进行，所述扩增培养基含有：就GNb AC1_IgG1_6B6而言：0.19μM氨甲蝶呤(Sigma，MTX)和50％0.2μm过滤的GNb AC1_IgG1_6B6培养上清，就GNb AC1_IgG4_7C1而言：0.19μM MTX和50％0.2μm过滤的GNb AC1_IgG4_7C1培养上清。生长孔在96孔板中适应0.38μM MTX，通过ELISA分析，并在T25细颈瓶中增殖以便进一步筛选和适应0.77μM MTX。
表6描述在T25Roux细颈瓶和Spinner管的0.77μM MTX中对GNbAC1 IgG1_6B6亚克隆和GNb AC1_IgG4_7C1亚克隆的最佳生产株的挑选。
就GNb AC1_IgG1_6B6而言，最佳生产株是克隆GNb AC1_IgG1_6B6_10E4，就GNb AC1_IgG4_7C1而言，最佳生产者是克隆GNb AC1_IgG4_7C1_15B7。挑选这两个克隆作为进一步的细胞系开发。
完成两个GNb AC1_IgG1克隆的低温保存：GNb AC1_IgG1_6B6_1D1，GNb AC1_IgG1_6B6_10E4，和两个GNb AC1_IgG4克隆的低温保存：GNb AC1_IgG4_7C1_3E11和GNb AC1_IgG4_7C1_15B7。
最佳生成亚克隆GNb AC1-IgG1_6B6_10E4和GNbAC1-IgG4_7C1_15B7的亚克隆。
再在96孔板利用溶于扩增培养基的每孔90、30和10个细胞进行最终的亚克隆步骤，就GNb AC1_IgG1_6B6_10E4而言，扩增培养基含0.77μM MTX和50％0.2μm过滤的GNb AC1_IgG1_6B6_10E4培养上清，就GNb AC1_IgG4_7C1_15B7而言，扩增培养基含0.77μM MTX和50％0.2μm过滤的GNbAC1_IgG4_7C1_15B7培养上清。通过ELISA分析生长孔，在T25细颈瓶和spinner细颈瓶(Sp125)中增殖最佳生产株以便进一步筛选。
表7描述在T25Roux细颈瓶和spinner细颈瓶的0.77μM MTX中对GNb AC1 IgG1_6B6_10E4亚克隆和GNb AC1 IgG4_7C1_15B7亚克隆的最佳生产株的挑选。
在旋转器培养后，就GNb AC1_IgG1而言，将两个克隆GNbAC1_IgG1_6B6_10E4_18C7和GNb AC1_IgG1_6B6_10E4_18D12低温保存，就GNb AC1_IgG4而言，将两个克隆GNb AC1_IgG4_7C1_15B7_3E4和GNb AC1_IgG4_7C1_15B7_5G10低温保存。
表5：在转染和适应不同水平的MTX后挑选的孔
GNb AC1-IgG1：0.096μM MTX：
Figure BPA00001328779300271
￡：皮克每细胞每天。
在适应0.19μM MTX后：
Figure BPA00001328779300272
＊：皮克/细胞
GNb AC 1-IgG4：0.096μM MTX：
在适应0.19μM MTX后：
表6：在0.77μM MTX第一次亚克隆后挑选的亚克隆
GNbAC1-IgG1：
Figure BPA00001328779300291
GNbAC1-IgG4：
Figure BPA00001328779300292
表7：在0.77μM MTX第二次(最终)亚克隆后挑选的亚克隆
GNb AC1-IgG1：
Figure BPA00001328779300301
GNb AC1-IgG4：
Figure BPA00001328779300302
因此利用包括如实施例1所述的6个CDR序列的插入配体产生重组IgG1和IgG4抗体。在下列实施例中分析这些包括6个CDR的载体，以便确定载体的阳性和阴性影响，从而建议对它们中每一个的选择和/或适当用途。
实施例5：配体及其人IgG1和IgG4嵌合构建体对比原始鼠IgG1的
研究：体外亲和力。
材料和方法与实施例3和4描述的相同。
5.a.利用不同浓度的MSRV-ENV完整蛋白(ENV-T)的ELISA
Figure BPA00001328779300311
表8：利用不同的配体(1微克)或无关对照(2G5E12)对微量滴定板孔上色被的不同浓度的(左列，单位是微克)抗配体(ENV-T)的ELISA测量的光密度(OD)。由过氧化物酶标记的抗-Ig抗体(1/250；Jackson-USA)和过氧化物酶底物反应来显示结合。无关对照的全部OD的平均值是0.1004，它们的标准偏差(SD)是0.0205，因此能够确定截止值，低于其的所有值是具有99％置信区间的非特异的；平均值/3*SD＝0.1618。因此GNb AC1构建体的所有表现值显示对靶蛋白的特异性结合。
我们在抗ENV重组蛋白的夹心ELISA中分析抗体GNbAC1和嵌合形式的IgG1和IgG4作为检测抗体。从图5和表8可以看出，在相同浓度，鼠和嵌合MAbs能够检测ENV蛋白的存在浓度，具有类似的动态。新构建体(配体在人载体中)的特异性和相对亲和力从而被维持，包括配体的人IgG1和IgG4构建体提供能够检测皮克级重组ENV蛋白的人嵌合抗体。这好得出奇，证实在它们完整设计、构建和表达条件的自始至终实现了优化。这还验证了稳定并且有效的配体结构的挑选，如实施例1所述。
此外，这种经验提供了通过它们与原始抗配体(ENV)结合的显著性鉴定与所述配体等同的分子的方法，如此处配体(GNb AC1)对无关
“未结合”配体(2G5E12)所证明：
将Env-T按照1μg/ml到约0.01μg/ml的系列稀释范围包被微滴定板上的孔。
检测1μg/ml的参照配体(GNbAC1)和无关配体(2G5E12)，利用二抗(此处，来自Jackson Ltd，USA的抗IgG过氧化物酶标记二抗，1/250稀释，此后参照抗小鼠IgG(H+L)Jackson或抗人IgG；Jackson，USA)显示。
参照配体的曲线在最高ENV浓度显示信号饱和(光密度大于或等于3)，然后逐渐降至约1.0-0.5的光密度，从而证实了特异结合活性的典型剂量反应曲线(高于计算统计学截止值0.1618；参见表8)。平行的，无关分子(2G5E12)不显示剂量反应曲线(平稳的平均曲线)，并且在任意ENV浓度下在0.1和0.05的光密度之间摆动，低于计算的统计学截止值0.1618(表8)。
因此，与配体等同的任意分子可以通过以下证明，
1)利用本实施例条件的所述检测中剂量-反应曲线的存在，如段落5a所示，和
2)平缓曲线的缺失，低于从无关抗体获得的光密度(参见表8中的2G5E12)计算的统计学截止值(平均值+3倍标准偏差)摆动，与高于截止(利用参照GNbAC1对0.01微克的ENV浓度获得)(见表8)的值相比；或，
3)在如下段落5b(表9)所述利用配体系列稀释物和固定的抗配体浓度的检测中剂量-反应曲线的存在，和
4)平缓曲线的缺失，低于从无关抗体获得的光密度(参见表9中的2G5E12)计算的统计学截止值(平均值+3倍标准偏差)摆动，与高于截止(利用浓度为0.01微克/ml的相应参照GNbAC1获得，采用如段落5b所述的相同条件)(参见表9)的值相比。
5.b 利用不同MAb浓度的ELISA
Figure BPA00001328779300331
表9利用配体的系列稀释物和包被在微量滴定板孔上的固定抗配体浓度(ENV-T；0.01微克)的ELISA测量的光密度。由过氧化物酶标记的抗-Ig抗体(1/250；Jackson-USA)和过氧化物酶底物反应来显示结合。
利用抗小鼠二抗检测，来自无关对照的所有OD的平均值是0.0735，它们的标准偏差(SD)是0.0057，从而可以确定截止值，低于其的所有值是具有99％置信区间的非特异的：平均值+3*SD＝0.0907。因此对应鼠GNb AC1的所有表现值显示对靶蛋白的特异性结合。
利用抗人二抗检测，来自无关对照的所有OD的平均值是0.0513，它们的标准偏差(SD)是0.0094，从而可以确定截止值，低于其的所有值是具有99％置信区间的非特异的：平均值+3*SD＝0.0796。因此GNb AC1嵌合构建体的所有表现值显示对靶蛋白的特异性结合。
在图6中，我们观察到在抗ENV-T重组蛋白的夹心ELISA中，鼠IgG抗体GNbAC1和嵌合形式的IgG1和IgG4作为检测抗体都是有效的，数量低至数纳克的纯化IgG可以检测低于数纳克的ENV蛋白。
此外，因为在这些条件下抗人或小鼠IgG不与原始鼠抗体或含有人IgG1或IgG4主链的嵌合构建体发生交叉反应，插入的配体(VH+VL)不产生任意不想要的改变，并且在人构建体中没有检测到。
5c：GNbAC1对ENV-T的亲和力
Figure BPA00001328779300341
表10：插入IgG4和IgG1抗体载体的配体的结合亲和力的测定(单位显示在表格中)
5d：GNbAC1等电点
根据描述于“Fractionation of complex protein mixtures by liquid-phase isoelectric focusing.Hey J，Posch A，Cohen A，Liu N，Harbers A.Methods Mol Biol.2008；424：225-39.”的技术测定GNbAC1等电点。
构建体IgG1(pI 8.3)和IgG4(pI 7.53)的等电点是非常有用的，将决定用于治疗用途的稳定性和保存条件。因此对于治疗性MAb的制剂来说，IgG4的中性pI更好，其可以用做有规律地重复注射的慢性治疗。因此，从这点来说IgG4是有利的构建体。
实施例6：配体及其人IgG1和IgG4构建体对GNbAC1的研究：对人外周血单核细胞(PBMC)培养物中促炎性的抑制活性。
材料和方法：
培养基
在37℃ 6.5％CO2条件下，在RPMI Glutamax(Gibco)+10％FBS(Biowest S1810 South America)+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸+1％青霉素-链霉素中培养PBMC。
从白膜层制备PBMC
白膜层由HUG提供。
将用PBS-FBS 2％(4ml+31ml)稀释的血液缓慢倒在15ml聚蔗糖中，并在2850rpm(1650g)/20分钟/室温/无中断的条件下离心。
小心收集PBMC，用PBS-SVF 2％清洗3次，然后在1500rpm/10min离心。
然后计数细胞，将其在SVF 90％+DMSO 10％中冷冻。
来自冷冻细胞的PBMC制备
--80℃保存的PBMC在37℃解冻，用培养基清洗3次，并在1500rpm/10min离心。
-然后计数细胞，稀释到通常1×106个细胞/ml的浓度。
抑制试验
-在解冻PBMCs前制备ENV+MAb混合物。在48孔板的每个孔中，用100μl培养基混合MAb(选择与ENV的比例)+ENV(选择浓度)，并在+4℃温育1小时。
-然后向每孔添加PBMC到终浓度1×106个细胞/ml(最终0.5ml或1ml每孔)。
-细胞在37℃，5％CO2中温育24，48或72小时。
-在1400rpm/10min/RT通过离心收集上清，并保存在-20℃。
II-2d 细胞因子剂量
细胞因子与针对IL-6，IL-12p40，TNF-α和IFN-γ的BD PharmingenELISA集合一起施用。供应者的实验方案如下所示。
Figure BPA00001328779300351
表11：在有或没有不同配体的不同PBMC(外周血单核细胞)培养上清中的细胞因子剂量。
我们利用对PBMC的细胞试验检测我们的抗体或ScFv抑制ENV蛋白和细胞之间相互作用(通过TLR4受体)进而抑制促炎性细胞因子诸如IL-6(先天免疫)和IFN-γ(T淋巴细胞介导的免疫)的能力。不同的分子按照与蛋白相同的比例(mol/mol)(25/1)进行测试以便我们可以比较它们的性能。
从图7和表11可以看出，所有配体分子，具有鼠或重组来源(含有配体的scFv或IgG1和IgG4构建体)，具有并保持了它们的抑制特性，表现为PBMC产生的促炎性细胞因子(IL-6)的减少。
尽管如此，可以观察到GNb AC1和含有插入配体的重组人IgG4对于淋巴细胞活化是有效的(两者均减少干扰素-γ产生)，而scFv(此处最可能因为单价)和IgG1人构建体对于干扰素γ抑制的效率低得多。此处，以下事实：人IgG1Fc区对于人免疫细胞具有主动效果，清楚表明这种特性可以抗衡ENV对这类淋巴细胞活化的抑制作用。利用人IgG4载体中的相同配体(其不是免疫主动的)，显示与原始鼠IgG中相同的二价配体的抑制作用。
因此，就实施例5.d部分公开的内容而言，IgG4将是优选的构建体，同时应当避免抗体的免疫功能。如同本文显示的情况，抗体功能不是抑制作用必需的(考虑到产生二价配体，因为单价scFV效率较低)，而且显示对配体的抑制作用不利。
考虑对IL-6产生(来自单核细胞/巨噬细胞和，还有可能，B-淋巴细胞)的影响，IgG1和IgG4显示等同和较好的抑制，其不同于利用干扰素-gamma观察到的。有趣地是，单价scFv展示对这种“先天免疫”细胞因子稍低的但是显著的抑制。因此，一些免疫活化被含有配体的IgG1和IgG4人载体充分抑制，但IgG4显示对来自人PBMC的先天免疫(IL-6结果)和获得性免疫(IFN-gamma结果)细胞的独特抑制。有趣地是，尽管如此，IgG1载体提供对先天免疫促炎性细胞因子(本文由IL-6的实例表示)的更强抑制，并触发一些T细胞克隆(由干扰素gamma的剂量反映)，这表明可用于一些抗病毒防御机制。我们因此证实采用药物递送形式的配体(由具有普通结合亲和力和特异性的人抗体载体组成)的高亲和力和生物活性，但根据它们的同种型显示不同的免疫效果。
实施例7：靶ENV蛋白上配体结合位点(抗配体结合序列)的分子鉴定
原始鼠IgG1/kappa(GNb AC1)的表位作图已经由Pepscan BV，The Netherlands实现。
根据这些结果，配体结合位点的氨基酸序列经鉴定为包括在SEQ ID No.20所示的序列内。
包括在上述序列内，最好的目标表位包括完整ENV蛋白(ENV-T)中切割的SU(ENV1)结构域的C端部分，更具体的对应于下列SEQ ID No.32所示的氨基酸选择序列。
这些抗配体序列(及其选择序列)不仅仅是，而且包含在实施例2所述的MSRV包膜蛋白(ENV)初级氨基酸序列内。
尽管如此，本领域人员已知，氨基酸可以被它们的功能等同物取代，此处，可以提供具有不同序列的类似结合位点。此外，“MSRV ENV”模拟位已被描述，其可以有效结合特异性抗体(Jolivet-Reynaud，C，H.Perron 等.1999.“Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes.”Clin Immunol 93；3：283-93.)。
实施例8：MSRV相关疾病的患者中MSRV-ENV靶抗原存在的证据：
多发性硬化，临床孤立(神经学)综合征-CIS-，慢性炎性脱髓鞘多神经病-CIDP-，精神分裂症和癫痫中相关疾病或病理综合征的实例。
8a.多发性硬化，临床孤立综合征和多神经病：
材料和方法
ENV抗原血的免疫剂量
初步血清收集：
该研究得到University Hospitals of Creteil and Grenoble，France的伦理委员会的批准。包括来自两个中心的神经病学患者。在招募前所有患者都提交了他们书写的知情同意书。健康献血者从Grenoble和Montpellier 的输血中心招募。非神经病学对照获自Grenoble。患者的临床资料在结果部分显示。将MS患者和健康对照的血清样品等分试样编号，然后送到独立实验室利用比色读数条件通过ApoH ELISA进行盲试。
欧洲多中心血清收集：
该研究得到以下单位医学院的伦理委员会的批准：University of Würzburg in Germany，University of Sassari，Don Gnocchi′s Hospital of Milan in Italy，Marseille University Hospital in France和University of Pamplona in Spain。包括根据McDonald标准(McDonald，Compston等.2001)的74位明确MS患者，和14位临床孤立综合征(CIS)患者。相应的临床和治疗数据显示在下文的表12。(McDonald，Compston等.2001)。在MS复发情况下，在开始类固醇治疗前提取血液样品。将MS患者和健康对照的血清样品等分试样编号，然后送到独立实验室利用冷光检测(luminometric)读数条件通过ApoH ELISA进行盲试。
采样：收集1管(7ml B&D干燥管)血液。样品在收集后2小时内处理。血液凝固后，将其在14℃2800g离心10分钟。然后收集血清，将其在Eppendorf管中等分为250μL。等分试样在-20℃冻存。
ApoH-ELISA免疫测定比色法：ApoH包被的微量滴定板(APOH Technologies，Montpellier，France)上加载用Tris-HCI 50mM pH 7.6稀释的血清样品；板在37℃温育1.5h；然后用PBS将板清洗4次；用包含5％BSA的PBS将纯化的小鼠抗ENV mAb稀释到浓度为10μg/ml并添加。将板在37℃温育1h，然后用PBS清洗4次。添加过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L；Sigma)(用包含5％BSA的PBS按1∶5000稀释)，板在37℃温育1h，然后用PBS清洗6次。添加OPD底物溶液，板在暗处温育30分钟。用2N H2SO4终止显色反应。利用Tecan读数器在490nm读取吸光度。针对来自50名健康献血者(BD)的阴性血清系列确定该检测的统计学截止值(C.O.)，利用单个血清一式三份的平均值作为光密度(OD)结果。然后从统计上验证的阴性对照系列计算C.O.作为它们的平均值加3倍标准偏差(A+3SD；阳性显著性p＜0.01)，并在一组参照阳性和阴性样品中通过实验证实。因此用于确定检测阳性的置信区间代表99.9％。
冷光检测法：将Tris-HCl 50mM pH7.6稀释的样品加载到ApoH包被的微板(APOH Technologies，Montpellier，France)。将微板在37℃温育1小时30分钟，用PBS清洗4次。添加纯化的小鼠抗ENV mAb(1μg/ml，溶于PBS-BSA 5％)，将微板在37℃温育1h，用PBS清洗4次。添加过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体(Jackson，用PBS-BSA 5％稀释1/2000)，微板在37℃温育1h，然后用PBS清洗6次。添加SuperSignal femto(Pierce)底物溶液，利用TECAN读数器进行读取。
单克隆抗体
利用重组MSRV包膜(ENV)蛋白(从纯化胞外MSRV病毒粒子扩增的克隆RT-PCR区表达)免疫小鼠后，由bioMerieux(Marcy I′Etoile，France)开发单克隆抗体(Mab)。通过利用ENV的ELISA检测小鼠血清后，将脾细胞与非分泌骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14融合以获得杂交瘤。通过在相同的ELISA测定中筛选它们的抗体生成挑选特异性克隆。因此分离出约40个MSRV/ENV蛋白特异性Mab，约28个Mab被进一步挑选并验证它们的结合特异性。利用对人血清的ApoH-ELISA技术，最佳结合Mab是2A12A5。
结果
血清中MSRV ENV蛋白免疫剂量。我们开发出一种独创的微板免疫测定，其中捕获相依赖于载脂蛋白-H(ApoH)结合微生物蛋白(当与包膜结构和/或脂相关时)特别有效的性质(Stefas等，1997；Stefas等，2001)。ApoH允许，首先与蛋白自身氨基酸区的低亲和力相互作用，其随后活化异构反应引起ApoH C端结构域与脂或膜结合结构域的共价样结合。因此，病毒包膜蛋白或病毒粒子颗粒可以被不可逆的捕获，在清洗步骤去除初始样品后，可以通过添加针对“ApoH”捕获步骤后仍然暴露的表位的单克隆抗体来检测特异性抗原。
为了检测的技术确认，根据先前描述的条件(Perron等，1997a；Perron 等，1997b)，利用系列稀释物和不同的抗MSRV ENV Mab检测两种MSRV病毒粒子，从MS B细胞培养上清沉淀和纯化的，以及纯化的重组MSRV包膜蛋白(ENV)。利用公知的病毒进行比较，诸如丙肝病毒(HCV)和乙肝病毒(HBV)，通过相应的特异性Mab检测。在利用真正血清样品的附加试验后，Mab 2A12A5显示在ApoH捕获步骤后用于诊断免疫检测最为有效，被保留用于下次研究。
第一步盲初步研究：多发性硬化-MS-和慢性炎性脱髓鞘多神经病-CIDP。
为了在不同组的各种疾病患者中初步鉴定该免疫测定法，我们首先分析了29位MS患者、28位其他神经病学疾病患者、60位非神经病学疾病患者和50位健康献血者的血清(总共167例血清样品)。结果显示于表12，针对MS和其他神经病学疾病。
表12.鉴定MSRV相关疾病或MSRV相关患者亚组的ENV免疫检测实验。第一血清系列的APO-HELISA结果-多发性硬化(MS)患者，其他神经病学疾病(OND)患者，慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)患者和健康献血者(BD)。利用单克隆IgG(针对MSRV ENV的2A12AA5)(由bioMerieux，Marcy L′Etoile，France产生并针对特异性进行筛选)进行含有APO-H捕获步骤的ELISA检测(Stefa等，1997)。N＝患者数目，nr＝未记录，OD＝光密度，P＝进展的，RP＝进展减缓，RR＝复发减缓。CO＝确定极限值的截止值，低于该值的检测结果是阴性的。这从一系列健康献血者确定，如底部所示用它们的平均值加上3倍它们的标准偏差(99％置信区间)。比例OD/CO＝OD除以实验的CO，区分阳性结果(＞1)和阴性结果(＜1)。
结果等于1被认为是“未确定的”，来自同一个体的相应样品或新样品必须在单独的实验中再次检测以便确定。已经确定了受试者每组和亚组所有光密度的平均值(均值)和标准偏差-s.d.-，如下所示：
BD(N＝50)：平均值0.53，s.d.0.16.
MS(N＝29)：阳性MS(N＝23)的平均值1.27s.d.0.22，阴性MS(N＝6)的平均值0.90s.d.0.25，所有MS的平均值1.20s.d.0.25。
OND(N＝20)：阴性OND的平均值0.88 s.d.0.10。
CIDP(N＝8)：阳性CIDP(N＝5)的平均值1.12s.d.0.09，阴性CIDP(N＝3)的平均值0.9s.d.0.03，所有CIDP的平均值1.04s.d.0.13。
我们分析了来自法国的29位MS患者(19位来自Creteil，10位来自Grenoble)的血清，以便在不同组的各种疾病患者中初步鉴定这种免疫测定法。MS患者的结果显示于表12a。10位健康献血者被用作阴性标准以便确定阳性的极限(截止值或CO，低于其的阈值检测不到特异性信号)。根据这些系列的统计学截止值，23位MS患者具有显著阳性的MSRV-ENV抗原血(平均OD＝0.88)，而6位被认为是阴性的，尽管非常接近阈值(“阴性MS”的平均OD＝0.62)。有趣地是，阴性MS病例具有相当良性形式更长的持续时间(#24，25，28)或正在接受环磷酰胺治疗方案。
平行地，我们分析了来自28位其他神经病学疾病(OND)患者的血清(12位来自Creteil，16位来自Grenoble)。5位患者具有阳性结果，从而代表了此处检测的约18％OND患者。尽管如此，所有阳性OND病例具有类似诊断：慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)，而具有其他诊断的OND患者都是阴性的(或对于急性Guillain-Barre′s综合征的一个病理在截止限是“未确定的”)。因此，OND患者的结果显示于表12b，无CIDP的OND与CIDP患者分开(表12c)。约一半的CIDP病例是阳性的，但考虑到较低数目，我们在本文中不分析“炎性”对“非炎性”神经病学疾病。
此外，我们平行检测了来自其他非神经病学疾病(ONND)(诸如15位慢性乙肝病毒感染患者以及15位慢性丙肝病毒感染患者)的血清。这30份样品中未发现阳性。来自30位患者的含有抗DNA、抗细胞核和抗类风湿因子(通常干扰许多血清试验)的多反应性血清不产生任何阳性结果。还平行检测了来自健康献血者的50份血清。未发现阳性。
MS组与任意其他组结果的比较显示显著差异，除了CIDP亚组外。当与无参数检验(正态性检验失败)比较时，来自完整MS和OND组(包括阴性MS和CIDP)的光密度值是相当显著不同的(p＝＜0.001；Mann-Whitney′s秩和检验T＝517,000)。当比较完整MS组与所有CIDP病例时，不再能发现统计学的差异(p＝0.053；Mann-Whitney′s秩和检验T＝99,000)。在“阳性MS”和“阳性CIDP”的OD值之间证明没有显著差异(P＝0.072；Mann-Whitney′s秩和检验T＝42,000)。
欧洲多中心血清系列的盲试：多发性硬化-MS-和临床孤立综合征-CIS。为了确认来自不同地理区域的更大组MS患者的第一个结果，我们从不同欧洲国家的神经病学部门的多中心合作单位募集血清。在这些样品中，我们使用冷光检测读数以便改进信号检测和区分非特异性背景“噪音”。
在利用比色法内部鉴定血清后，与冷光检测读数的比较证实增强的信号检测和动态。因此，在随机挑选的MS患者(具有疾病的所有形式和持续时间，大部分正在接受特效疗法，但代表当前临床网络的每个地理来源)中取样血清用于一式四份的测定。将它们编号，送到中心实验室(APO-H technologies，Montpellier，France)进行盲试。将未编号血清(10份阴性对照和10份阳性MS)送去进行技术确认以便确定截止值。此外，来自临床孤立综合征(CIS，单一神经病学发作和额外的成像和/或生物学异常)的14份血清送去编号并在该系列内进行盲试。这是在CIS中第一次鉴定，预期包括大部分第一次发作的MS。
结果显示于图8(在独立实验室盲测的欧洲多中心研究的血清的ApoH-ELISA结果)。它们可以表示为冷光检测单位(RLU)除以相同实验内确定的截止值的比例，因此可以与先前系列的比例(参见表9)进行比较。实际上，与比色法(1到2)相比，利用冷光检测获得的“阳性MS”血清内比例的范围(1到6)证实信号动态的技术优化。
在独立实验室盲测的欧洲多中心研究的血清的ApoH-ELISA结果。
使用的读数技术是冷光检测，结果显示于Y轴，作为个体冷光检测单位(RLU)除以相同实验内确定的参照阴性血清系列的截止值的比例。因此，值＞1是阳性的。
各组之间APO-H ELISA冷光检测结果的统计分析得到下列结果(Fisher检验p值)：(i)比较BD对所有MS，BD对所有MS+CIS，BD对RRMS，BD对PPMS，BD对SPMS，BD对CIS：p＜0.001；(ii)比较CIS对RRMS：p＝0.759，CIS对PPMS：p＝0.704，CIS对SPMS：p＝0.749，RRMS对PPMS，SPMS：p＝1，PPMS对SPMS：p＝1。
此处，74例未挑选MS病例中的54例(73％)，来源于本研究的不同国家和地区，对MSRV ENV蛋白具有阳性抗原血，但编号的26例BD没有(10例未编号BD用作实验的参照样品)。MS和BD之间的存在差异是高度显著的(卡方：p＜0,0001)，但利用更大数目(超过一百)的单独″非盲系列″检测很少的阳性健康或无症状的献血者(4/103；未显示)。有趣地是，14例CIS中的9例(约64％)是阳性的，但具有更低的值。
通过Fischer′s检验比较不同组(MS，BD，CIS)以及代表不同亚组(代表不同形式的，原发进展型(PPMS)，继发进展型(SPMS)和复发减缓(RRMS))的值。健康献血者的结果显著不同于所有MS和CIS组合(通常p＜0,001)，而在代表可能的(CIS)或明确的MS，或不同的MS疾病进展形式(71％是RRMS阳性的，78％PPMS阳性，70％SPMS阳性)的任意亚组之间证明在检测MSRV ENV抗原血时没有显著差异。尽管如此，CIS对MS亚组的微小异质性倾向由更低的p值显示：p＝0.7到0.75，到MS形式之间p＝1，后一值显示统计上相同的结果分布。
8b.精神病系列：精神分裂症-SCZ。
患者和方法
患者和健康对照
在法兰西大学附属精神病科，在因为急性事件住院治疗结束时随机挑选患者和健康的对照患者，符合DSM-IV(American Psychiatric Association：Diagnostic and statistical Manual of Mental Disorders，DSM-IV；1994)关于精神分裂症标准。神经系统疾病，急性或慢性感染，和人类免疫缺陷性病毒的阳性血清学(HIV1+2)，乙肝和丙肝病毒是排除标准。这些正常对照的年龄和性别分布与当前患者组没有统计上的不同。利用精神病尺度的体征和症状的法国版本-SSPI-(Houenou等，2007)评价精神病症状。利用Bech和Rafaelsen躁狂大鼠尺度以及Montgomery和Asberg抑郁大鼠尺度-MADRS-(Bech等，1978；Montgomery和Asberg，1979)评价心情症状。实验方案得到当地伦理委员会的批准。在由主管患者临床评估的精神科医师完整描述该研究后，获得所有受试者签署的知情同意书。
血清收集
收集后2小时内处理1管(7ml B&D干燥管)血液：凝血后它们在2800g和14℃离心10分钟。收集血清，将其等分于低结合管内，-80℃保存。
免疫测定
利用单克隆IgG(针对MSRV ENV的2A12A5，6A2B2和针对MSRVGAG的2G5E 12)(由bioMerieux，Marcy L′Etoile，France产生并针对特异性进行筛选)进行含有APO-H捕获步骤的ELISA检测(Stefas等，1997)。
将Tris-HCl 50mM pH7.6以1/10稀释的100μl每孔样品加载到ApoH包被的微板(APOH Technologies-Montpellier-France)。微板在37℃温育2小时，用每孔250μl PBS清洗4次。每孔添加100μl一抗(10μg/ml，溶于PBS-BSA 2％)，微板在37℃温育1小时，用PBST 0.05％清洗4次，再用PBS清洗2次。每孔添加100μl过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体(抗小鼠Jackson，用PBS-BSA 2％稀释1/250)，微板在37℃温育1小时，然后如前清洗。每孔添加100μl底物溶液(OPD)，微板在暗处温育30分钟，用H2SO42N(50μl/孔)终止反应。利用Biotek读数器在490nm读取吸光度。
统计分析：
利用SigmaStat软件进行统计分析。选择非参数检验Mann-Whitney秩和检验来比较数据系列，因为它们的分布从不拟合正态分布(正态性检验失败)。使用卡方检验比较每个群体中针对每种抗原和/或使用的每种抗体的阳性对阴性抗原血的发生率。每种条件的截止值(其下结果是)由阴性对照的统计系列计算得出，为它们的平均值加3倍标准偏差(M+3SD；阳性的显著性：p＜0.01)，并在参照阳性和阴性样品上进行确认。
结果
包括49位精神分裂症患者和49位对照，年龄(33+/-6.5岁)和性别(73％男性，27％女性)匹配。包括精神分裂症首次发作的8位患者，而大部分(N＝41)患有严重的慢性精神分裂症。从抑郁分数(平均MADRS＝5.6+6.6)和躁狂分数(平均Bech分数＝4.8+4.5)来看在被包括时，他们是愉快的。除了未治疗的1位患者之外，所有患者服用抗紧张药物(27％典型的和71％非典型的抗精神病药)。根据Kane标准(Kane 1996)，三分之一的患者(N＝13)是抗药的。
针对MSRV GAG抗原，检测了49位对照和49位精神分裂症患者。针对MSRV ENV，检测了30位对照(因为技术限制)和49位精神分裂症患者。免疫测定的结果表示为血清双份样品获得的平均光密度除以截止值，以便全部系列能用标准化的值进行比较(图22和表10)。
47％(N＝23)和43％(N＝21)的精神分裂症受试者具有阳性MSRV ENV抗原血，分别含2A12A5和6A2B2抗体。49％(N＝24)的精神分裂症患者具有阳性MSRV GAG抗原血，一种是阳性的和一种只对GAG是“不明确的(borderline)”。与健康对照的比较显示阳性发生率的显著差异(卡方检验：对于两种ENV检测p＜0.001；对于GAG p＜0.0001)。利用Mann-Whitney秩和检验比较患者相对对照的ELISA值还确认了较高的显著差异(p＜0.001；表2)。在对照中，1位受试者具有显著的阳性抗原血。有趣地是，在ENV蛋白和GAG蛋白获得的结果之间存在阳性相关性。将抗ENV 6A2B2获得的ELISA值与抗GAG 2G5E12获得的ELISA值进行比较的Mann-Whitney秩和检验显示没有显著差异(p＝0.744)，而抗ENV-2A12A5与抗GAG-2G5E12相比(p＝0.290)，和抗ENV-6A2B2与抗ENV-2A12A5相比(p＝0.159)也没有显示显著差异。因此，这些抗体检测MSRV抗原的等同和/或平行表达：
“ENV”抗原血ELISA值在阳性之间是不同的，如表10所示，与阴性对照(分别为0.09和0.08)相比显示标准偏差的增加(对于2A12A5抗体是0.28，对于6A2BA是0.48)。这证实了在一些精神分裂症患者中检测到MSRV抗原的动态产生。
表13：精神分裂症(SCZ)患者和对照的血清中MSRV衣壳(GAG)和包膜(ENV)剂量
Figure BPA00001328779300491
SCZ：精神分裂症患者；BD：血液
免疫测定(ELISA)检测比例(Y轴)是来自相同血清的复孔测量的平均光密度除以对应系列的截止值(参见：材料和方法)。利用标绘值在相应柱图中标明，ENV抗原施用2A12A5单克隆抗体或6A2B2单克隆抗体，GAG抗原施用2G5E12单克隆抗体。
在图9中，平均值和置信区间(0.01和0.001)用线条和框表示，每种抗原和抗体(在每个柱图顶端标明)最大和最小值的分布用点表示。在相应曲线的底部将精神分裂症患者的一系列值标为“SCZ”，而来自健康献血者的一系列值被标为“对照”(底部/X轴)。
8c.其他神经病学疾病：癫痫症。
如上所述(8b)进行ELISA检测。在癫痫症患者和正常对照的血清中平行检测MSRV-ENV蛋白的存在。结果显示于图10。
每个垂直线条代表单个癫痫症患者(左边38个)或对照(右边24个)的血清双份结果的平均OD。
水平的黑色线条代表检测的截止值，高于其的检测信号对血清中抗原存在是特异的。它由健康献血者(对照)结果的平均值加3倍它们的标准偏差确定。
因此，本文中，我们检测了患有MSRV-ENV相关癫痫症的8位患者的亚组，其简单对应于具有这种特定病原学的亚组，和其他病例具有不同病原学原因。只有MSRV阳性癫痫症与例如抗体载体中的抗ENV配体的治疗相关。
8d：银屑病患者。
长久以来已知银屑病患者表达类似的逆转录病毒(Iversen，O.J.(1990)，“The expression of retrovirus-like particles in psoriasis”J Invest Dermatol 95(5Suppl)：41S-43S/Bjerke，J.R.，G.Haukenes等(1983)，“Activated T lymphocytes，interferon，and retrovirus-like particles in psoriatic lesions.”Arch Dermatol 119(12)：955-6)。因此，它们对包括配体的当前治疗载体的相关性对本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例9：药物载体(包括配体并保留具有活性特性的配体亲和力)对GNbAC1的体内功效。采用载体化配体与合适的药理学载体复合物的形式输送的配体的抗炎、免疫保护和神经保护作用的体内证据：神经炎症，脱髓鞘和/或神经元退化动物模型中治疗效果的实例。
材料和方法：
人源化SCID(huSCID)小鼠模型中MSRV/ENV诱导的EAE。
无病原体的6到8周龄SCID小鼠购自Charles River，France。根据先前描述的方案(Firouzi等，2003)，使用健康献血者(Etablissement Frangaisdu Sang，Lyon，France)的PBMC实现小鼠的人源化。具体来说小鼠被γ辐射，在利用50×106个人PBMC进行人源化之前通过腹腔内(i.p.)注射接受抗NK抗体。然后通过特异性检测小鼠血清中的人免疫球蛋白控制人源化的质量。当每个系列需要不止一个供体时，将所有huSCID亚组制备为具有相同比例的小鼠(利用每份捐血进行人源化)以便比较。
包括在EAE方案前两周的延迟(在第一次注射髓磷脂抗原之前)是必需的。然后，给小鼠组注射髓磷脂碱蛋白(MBP)和弗氏不完全佐剂(IFA，只包括稀释剂)用于“模拟-对照”组，或注射MBP和纯化的无内毒素MSRV ENV蛋白(在IFA稀释剂中混匀)用于“ENV诱导的”EAE。当通过MRI临床监测的疾病活性已经造成病变和进展的临床缺陷时，在所有患病小鼠(在huSCID小鼠中由ENV诱导的MBP-EAE)中通过注射研究挑选的抗ENV配体与原始鼠单克隆抗体(GNb AC1)比较的效果。
为了诱导或“模拟诱导”EAE，在第0天给动物在颈部第一次皮下注射50μg人MBP+150μg MBP肽(MBP肽87-99)+20μg重组ENV蛋白+IFA(ENV组)或50μg人MBP+150μgMBP肽(MBP肽87-99)+只有IFA(对照组)。2天后在所有组中给每只动物腹腔内注射200ng百日咳毒素(PTX)。在指定的日子(表11)通过腹腔内(i.p.)途径第二次注射相同剂量(包括MBP肽和人MBP完整蛋白)的相同成分，对应于每组的先前描述。它还伴有每只动物200ng PTX的类似注射。在指定的日子在颈部另一边皮下完成相同免疫原的第三次和最后一次注射(表14)，伴有PTX的类似注射。
表14.抗体治疗鉴定临床前系列：Hu-SCID小鼠中针对ENV诱导的和对照″BP-EAE″的不同组和方案的说明。
为了后续检查，每周中有5天称重动物，并进行临床打分。根据下列标准进行临床打分：0＝无症状；1＝尾瘫痪或后肢反射亢进或单侧后肢无力；2＝双侧后肢或前肢无力；3＝加上一侧麻痹或严重缺陷；4＝完全后肢或前肢瘫痪；5＝加上部分瘫痪或对侧肢体的主要缺陷；6＝濒死的或死的。
Hu-SCID实验的总持续时间不超过两个月，除了涉及mAb治疗和对照小鼠的存活研究(4个月)以外。
MRI和免疫组化分析(图片未显示于当前实施例中)：
通过MRI T2-加权分析和尸体解剖组织学监测动物，其证实中枢神经系统中具有炎症和脱髓鞘的病变类型，以及显示(MRI)具有临床改善的治疗小鼠中炎性模式的惊人改进。
结果：
具有人淋巴系统的SCID小鼠(如上所述进行移植)提供具有功能性人免疫系统的杂交动物。这些动物在蓝色箭头指示的天数接受MSRVENV蛋白(用溶于含油稀释剂(IFA)的MBP乳化)的3次注射。当动物具有升高的临床分数(通过MRI(EAE)显示的正在进行的神经炎症)时，给它们注射单剂量(10μg腹膜内)原始鼠单克隆抗体(GNb AC1，在图10中标记为muIgG)或含有配体的人IgG1或IgG4构建体之一(在图11中标记为huIgG1和huIgG4)。留下一组不接受治疗，以便与治疗动物进行比较，注射溶于IFA的MBP但无ENV的“模拟-对照”组仍保持健康，但在与治疗的患病动物相同的天数接受原始鼠抗体(GNbAC1)的注射。
从图11和12显示的结果可以看出，所有未治疗小鼠在30天后死亡，在MSRV ENV蛋白3次注射的最后一次后具有严重的临床进展。通过组织学和免疫组织学观察到严重的病变，表现为脱髓鞘，淋巴样细胞浸润，神经元死亡，血脑屏障破坏和星形胶质细胞增生。有趣地是，在多发性硬化中，血脑屏障破坏还是活性CNS病变的标志。
因此，包括靶向ENV的鼠抗体或嵌合人IgG1或IgG4，可以从腹腔内注射弥散到全身，尤其是，弥散到患病动物的活性CNS病灶。
惊人地，在第35天生存曲线显示用IgG1或IgG4嵌合抗体治疗的动物中100％的存活率，与此相对未治疗动物中是0％。出人意料的，当注射相同剂量时，原始鼠IgG1/kappa(GNbAC1)具有更低的效率，因此1只动物在第28天死亡。此外，图11的临床曲线显示用人IgG1或或IgG4构建体治疗的动物中非常良好和持续的改善，但在用原始鼠抗体治疗的动物中只有稳定或适度的改善。与未治疗的对照相比，用人IgG1或IgG4载体中的配体治疗的动物的这种惊人改善还被MRI监测所证明。
因此，人嵌合IgG1或IgG4的临床效能在显示中枢神经系统中神经炎症，脱髓鞘，神经元死亡，血脑屏障破坏和星形胶质细胞增生的动物模型(CNS；参见注射MSRV ENV蛋白的Hu-SCID和C57/bl6模型)中得到确认。出人意料的，与包含相同配体的原始鼠IgG(VH+VL链)相比，效能被改进。
因此，当前神经炎症动物模型中的治疗效能使其明显可用于MSRV相关疾病或综合征的其他应用，如本发明正文所定义的。
此外，包括实施例1定义的6个CDR的最小组合物或构建体的出乎意料的“配体效果”使得有可能使用完全没有抗体功能的配体，还可以改变和选择不同载体(不止涉及IgG同种型)的增加值和相对利益用于可能的治疗应用。
实施例10：来自实体瘤患者的活检切片或淋巴组织增生病症或淋巴癌患者的活检切片的一些细胞中检测到大强度的MSRV-ENV蛋白。
材料和方法：
-检测抗体
GNb AC1，1.0ml，浓度：5.918mg/ml
-阴性对照抗体
小鼠骨髓瘤蛋白IgG1kappa(MOPC-21，Sigma)，1.0ml，浓度：1.0mg/ml
这种抗体与检测抗体同时使用。
-抑制蛋白
ENV-T(MSRV ENV，GeNeuro SA)，10ml(10×1ml小瓶)，浓度：0.05mg/ml
这种抗配体与检测抗体同时使用。
-人组织样品
具有完整患者同意书的合乎道德收集的人组织从外部来源获得。
所有组织都进行抗原性检测。常规表达蛋白的IHC染色切片；在确认组织可用于这项或之前对与各种组织有关的S100，CD45，结蛋白，细胞角蛋白或波形蛋白进行评价。
-分析确认
参数研究包括：
1.使用中性缓冲的福尔马林，多聚甲醛和丙酮固定的阳性对照组织的染色比较。
2.合适的免疫染色检测方法的使用。
3.检测抗体的最佳滴度确定，研究了0到5.0μg/ml(同种型对照抗体在相同浓度进行)。
4.通过去除检测抗体而用缓冲液替代来验证染色的特异性。此外，在组织温育前使用ENV-T蛋白封闭MSRV的抗原性结合位点。
5.使用内源材料(可能干扰靶抗原信号)的任何必需封闭。
-免疫组化(IHC)染色法
作为验证阶段发现的结果，每种组织样品同时采用下列方式进行筛选：
-染色步骤中去除GNbAC1
-MOPC-21抗体，1.0μg/ml
-GNbAC1，0.25、1.0和3.0μg/ml
使用光学显微镜评价每种组织样品。评分系统鉴定组织和细胞类型，并主观反映所述染色的强度。
用阴性对照抗体或无抗体处理的组织中的所有染色(其不是特异性的描述个体细胞)被假定为非特异的。当这些组织的免疫组化染色在强度和分布方面与未用检测抗体处理的组织相似并且其中个体细胞未被特异性描述时，用检测抗体处理的组织被记录为无特异性染色。
记录阳性染色，通过命名组织结构或细胞类型，然后如下显示强度：
0                阴性
+                弱
++               中等
+++              显著的
每种细胞类型鉴定的染色频率如下表示：
＜10％           很少
11-40％          数个
41-75％        许多
＞76％        大多数
如果切片被认为不适合鉴定，在结果表格里不包括它的数据，直至染色被重复(可能情况下)。
与检测的其他稀释度相比，在0.25μg/ml存在更低的膜染色。
在已知的阳性对照和最初未被鉴定为阳性的组织之间包括肝组织作为比较。
在阴性缓冲对照或同种型中没有鉴定出显著的染色。当ENV-T与MSRV/ENV GNbAC 1抗体反应时，与阳性染色组织相比的阳性染色实质上被消除。
对于将来的筛选工作，检测Mab，GNb AC1，使用1.00μg.ml-1作为最适浓度，3.00μg.ml-1作为高于其浓度的一步，和0.25μg.ml-1作为低浓度。
作为来自确认的发现的结果，采用下列IHC染色法筛选冷冻的正常人组织。
Figure BPA00001328779300551
Figure BPA00001328779300561
结果：
-乳腺癌。
Figure BPA00001328779300571
表15：从不同个体的乳腺癌组织获得的结果。
强度 阴性 0 弱 + 中等 ++ 显著的 +++
频率 很少 数个 许多 大多数
因此可以证明，在利用特异性GNbAC1检测的3/3乳腺肿瘤中，MSRVENV在导管/腺上皮细胞和环绕血管的内皮细胞中高表达。
因此，根据“MSRV相关疾病”的观点，现在证明乳腺癌是所述人类疾病之一。
淋巴癌和淋巴组织增生病症：
Figure BPA00001328779300581
表16：从不同个体的增生淋巴组织获得的结果。
强度 阴性 0 弱 + 中等 ++ 显著的 +++；频率 很少 数个 许多大多数；NP：不可行的。
因此证明，当用GNbAC1检测时，在来自淋巴组织增生病患者并具有显著增生的2/2扁桃体活检切片中，MSRV ENV在淋巴样细胞和环绕血管的内皮细胞中高表达。
因此，根据″MSRV相关疾病″的观点，现在证明淋巴组织增生病(包括淋巴样细胞癌)属于所述人类疾病。
-肾癌
Figure BPA00001328779300591
表17：从不同个体的肾癌组织获得的结果。
强度 阴性 0 弱 + 中等 ++ 显著的 +++；频率 很少 数个 许多大多数；NP：不可行的。
尽管在一种细胞类型(每种情况下不同)中的轻微背景染色，分析是可行的，因此证明当用特异性抗MSRV ENV抗体(GNbAC1)检测时，在来自肾癌患者的2/2肾活检切片中，MSRV ENV在肾细胞和环绕血管的内皮细胞中高表达。
因此，根据“MSRV相关疾病”的观点，现在证明肾癌是所述人类疾病之一。
来自组织切片(用特异性抗ENV抗体(GNb AC1)或无关对照抗体(MOPC-21)染色)的光学显微镜观测的相应照片证实了图15-17中存在的对于肾癌，淋巴癌，或淋巴组织增生病以及乳腺癌的发现。
实施例11：A.在患有糖尿病的一些急性病例的血清中检测到显著和一致水平的MSRV ENV和GAG蛋白：
在用于诊断和后续检查目的的常规检测后，从剩余体积里匿名采集急性胰岛素依赖性糖尿病患者的血清。从授权的血库组织获得健康献血者的血清。
按照本发明实施例的先前描述，使用APO-H捕获板和特异性配体检测根据免疫检测技术检验血清。
下表提供三次重复试验的平均光密度，从急性糖尿病患者(Diab.)和典型献血者(BD)的血清测得。
使用抗MSRV鼠单克隆抗体配体：
-一种抗包膜(ENV)GNbAC1(Geneuro，Switzerland)。
-一种抗基质和衣壳多聚蛋白(GAG)：2G5E12(bioMerieux France)。
通过抗小鼠二抗(Jackson，USA，ref.115-035-146)显示这些抗体的特异性结合。使用的稀释度或浓度在下表显示。
当平均光密度除以截止值(从健康对照的平均值加上相应系列的两倍标准偏差-SD-确定)的比例(P/N)大于1时，结果是显著的。
在P/N 2行这类值是粗体的，并且字母更大。
因此证明18位患者中的10位对至少ENV蛋白具有显著的抗原血，通过配体鼠单克隆抗体检测。所有“MSRV阳性”患者都被两种抗体检测到，并且对GAG和ENV蛋白都由显著的结果。
根据本发明别处描述的与MSRV的联系，这类符合靶向两种不同表位(代表两种不同的MSRV蛋白(ENV和GAG))的两种不同单克隆抗体检测的结果对于确定MSRV相关疾病是非常重要和有意义的。
因此，I型或其他炎症相关糖尿病包括一个亚组的患者，其疾病发病机理可能由MSRV ENV蛋白的促炎性和免疫病理作用引起。
表18：糖尿病患者(Diab.)与健康供体(BD)相比的APOH-ELISA抗原血结果。参见实施例正文的详细评述。
P/N2＝计算为样品结果的光密度除以截止值。后者是利用健康供体确定的，表示为健康组的平均值+两倍其标准偏差。
Figure BPA00001328779300621
实施例12：用于ENV诱导的糖尿病的合适动物模型的出人意料的发现。
1.介绍
非肥胖糖尿病SCID(NOD-SCID)自然变异小鼠模型具有转移到糖尿病易感NOD背景上的SCID突变。出人意料的，本申请人进行的初步实验显示，利用ENV蛋白(25μg)和鼠MBP(蛋白和肽)对人源化NOD-SCID小鼠的初始免疫系统导致所有被测动物的快速死亡，而接受相同免疫原但无ENV蛋白的所有人源化SCID小鼠(模拟-对照)都存活下来。在第一步，我们使用临床监测结合组织学方法按照剂量-反应方式评价了NOD-SCID小鼠中ENV蛋白的有害作用。在第二步，我们评价我们的嵌合IgG4配体阻止ENV蛋白诱导的损伤的有益作用。
2.NOD-SCID小鼠中ENV蛋白有害作用的鉴定
a.材料和方法
a.1.动物
6只无病原体SCID裸鼠(6到8周龄)购自Charles River，France。在标准亮暗循环条件下每笼3只喂养动物，它们可以随意获得食物和水，不打扰8天时间以便它们适应环境。采取专门管理以确保非常洁净的饲养条件。具体来说，将动物在装备过滤盖的专门笼中饲养。
a.2.NOD-SCID小鼠的人源化
为了获得去除淋巴免疫系统并具有移植的人免疫系统的NOD-SCID小鼠，将小鼠用人外周单核细胞进行人源化，从而提供了免疫病理学动物模型中研究人免疫系统的功能性作用的可能。这提供了更接近于真实人类情况的结果(从免疫病理学来说)和对人致病性蛋白诸如MSRV-ENV的应答。根据Firouzi等(2003)先前描述的方案实现小鼠的人源化，除了动物不被γ-射线辐射并且不用抗NK配体治疗，因此NOD-SCID小鼠自发去除NK细胞。来自2位健康对照的血液(白细胞-血小板层，45-50ml)获自里昂的输血中心(EFS)。通过免疫学和血液学分析确保血液的质量和安全性。在层流气流条件下并使用无菌手套进行所有实验步骤。通过Ficoll梯度密度分离法获得人外周血单核细胞(PBMC)，并通过腹腔内注射给NOD-SCID施用(50.106细胞)。因为使用两位不同供体的血液人源化所有动物，所以使用每位献血者人源化相同比例的小鼠。本文中已经证实在如下所述所有将来实验中没有观察到移植任一供体的动物之间的差异。
3.NOD-SCID小鼠中ENV蛋白有害作用的鉴定
ENV蛋白的注射
第0天(P0)，小鼠接受下列剂量ENV蛋白(PXTherapeutics，France)的单次腹膜内(i.p.)注射(0.5ml)：0.1，1，5，10和20μg。用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Lonza，France)稀释ENV蛋白。一只小鼠接受单独的PBS注射。
为了避免ENV蛋白浓度和生物活性的任何降低，在P7完成ENV蛋白(在0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma，France)中乳化)的第二次注射。每只小鼠在颈部接受单次皮下注射。每只小鼠使用的ENV蛋白剂量与P0的第一次注射相同。
P14在颈部进行ENV蛋白(在矿物油稀释剂-″IFA″-(0.5ml)中乳化)的第三次皮下注射。同一天，小鼠接受200ng(0.5ml)百日咳毒素-″PTX″-(Wako，Germany)每只动物的腹腔内注射，以瞬时打开血脑屏障以便CNS外免疫细胞通过。
临床评价
从P14到P37每周5天监测动物的全身健康状态(毛方面，饲养笼中的步态，姿势)和体重。
组织学检查
取出所有死亡动物的脑和内脏，保存于甲醛溶液(10％)用于后续的组织学检查。
b.结果
1.临床监测
在注射ENV蛋白(在IFA和PTX中乳化)后的前几天，所有接受最高剂量ENV蛋白的小鼠都显示与它们全身健康状态的明显恶化有关的体重减轻(参见图13)，表现为饲养笼中的低活性和疲劳行为。最后，所有这类小鼠在最后一次注射后4天内死亡。有趣地是，注射更低剂量ENV蛋白的小鼠显示与良好全身健康状态有关的轻微体重增加，尽管在注射低剂量ENV蛋白的两只剩余小鼠中逐渐出现轻度竖立的毛。
在最后一次注射后的一周期间，存活小鼠的体重是稳定的或稍微下降(参见图13)，但它们的全身健康状态没有改变。在最后一次注射的第二周期间，存活小鼠继续体重增加(参见图13)，它们的全身健康状态是稳定的。
2.组织学检查
研究目标
NOD小鼠M4、M5和M6的胰的组织病理学研究
材料和方法
已经受到用福尔马林固定的胰腺组织样品。
将组织样品用石蜡包埋，切成5μm厚切片。组织切片用苏木精-曙红-藏红花(hematoxylin-eosin-saffron)染色，并用光学显微镜检查。已经获得了典型数字化图片。
结果
M4胰：胰的整体结构被保留。存在病灶炎性病变：它们形成多态性组分的小浸润，具有明显的血管周和导管分布。外分泌胰没有显著改变。观察到内分泌胰岛的病变：炎性细胞沿着它们的外周存在，可见凋亡的内分泌细胞。
M5胰：存在胰腺炎。在外分泌胰内存在大的炎性浸润，与病灶腺泡细胞坏死有关。有时存在纤维素样坏死。
M6胰：
存在严重的病变。坏死的大、汇合区域存在于胰，导致大量腺泡细胞的完全坏死。此外，炎性病变还涉及具有新生儿脂肪坏死病灶的胰腺周脂肪组织。组织学方面显示典型的急性、引起坏死的胰腺炎。
概述：
-M4的胰中病灶和适度炎性病变。
-M5的胰中中等强度的急性胰炎。
-M6的胰中严重的急性引起坏死的胰腺炎。
c.讨论
总的说来，我们的结果表明，在NOD-SCID小鼠只有剂量高于5μg的ENV蛋白注射是致死性的。因为注射高剂量ENV蛋白的动物显示注射PTX前它们全身健康状态的恶化，所以主要CNS损伤不太可能解释NOD-SCID中观察到的ENV蛋白的有害作用。ENV蛋白更有可能触发一个或数个其他器官的主要功能障碍，导致动物的死亡。因为NOD-SCID小鼠带有糖尿病易感背景，上面所述的死亡动物的胰组织学状况清楚显示ENV诱导的胰炎症。有趣地是，在没有胰岛素分泌细胞(通过ENV诱导的炎症消除)情况下，最低的致死量只在beta-胰岛和内分泌胰中诱导病变，其显示对应于糖尿病病变，足以解释这个剂量的小鼠死亡。
利用更高的剂量，看起来我们有可能超过相对剂量/体重(可能在人类糖尿病中遇到)，在急性引起坏死的胰腺炎这类高水平的ENV诱导涉及完整胰包括外分泌部分的大得多的炎症。尽管如此，这些观察涉及胰腺炎，本文中显示其发生于注射更高剂量的MSRV-ENV蛋白时。
4：NOD-SCID小鼠中重复注射ENV蛋白后血糖的监测
A.介绍
在先前的实验中，我们证明在人源化NOD-SCID小鼠中重复皮下注射5μg ENV蛋白能够引起相应动物组的死亡，其可能与急性郎格罕氏岛β细胞损伤有关。为了避免在引起动物猝死的病症中对血糖动力学进展的模棱两可的解释，在本研究中我们使用次致死剂量ENV蛋白的重复注射来研究人源化NOD-SCID小鼠的血糖。
B.材料和方法
1.动物
参见上文2.a.1
2.NOD-SCID小鼠的人源化
参见上文2.a.2
3.ENV蛋白的注射
在这项研究中，给小鼠每周一次注射，共4周(P0，P9，P16和P23)。对于每个时间点，两只小鼠接受皮下颈部注射2.5μg ENV蛋白(PXTherapeutics，France)(在0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma，France)中乳化)。两只剩余小鼠(对照小鼠)接受皮下颈部注射0.5ml弗氏不完全佐剂。
4.血糖测量
在P0和P30，从清醒动物的外侧尾静脉采集血液样品。使用血糖读数器(Optium Xceed，Abbott，France)评价血糖浓度。
C.结果
与亚致死剂量的预期一致，接受ENV蛋白4次注射的小鼠在第四次注射后仍然存活，但是如先前描述逐渐出现轻度竖立的毛。
在P0(第一次注射ENV或对照中的模拟溶液的那一天)，在对照和ENV注射小鼠之间没有检测到明显的差异。有趣地是，在P30，发现ENV注射小鼠的血糖浓度(糖血)与对照小鼠相比增加，而对照小鼠的血糖浓度与它们在P0的先前值相同(图14)。
ENV治疗动物中的这种糖血变化显示ENV注射动物中相当清楚的向高血糖的进展，这是人糖尿病的标志，并确证了先前的组织病理学发现。
因此，这些结果进一步验证了我们的实验条件作为研究糖尿病的ENV靶向治疗药物的相关临床前模型。
实施例13：GNb AC1配体(采用嵌合IgG4配体的形式)在合适的动物模型中预防糖尿病相关疾病出现的证据。
1.材料和方法
a.1.动物
这项研究在先前实验使用的注射低剂量ENV蛋白(0.1和1μg)的两只存活小鼠中进行。
2.实验步骤
因为已经显示重复注射5μg ENV蛋白引起小鼠的快速死亡，我们使用这种攻击剂量来评价我们配体的有益作用。按照先前实验的描述，小鼠在P50、P57和P64接受ENV蛋白(在IFA(0.5ml)中乳化)的3次颈部皮下注射。对于每个时间点，小鼠在同一天接受单次腹腔内注射(0.5ml)100μg GNb AC1IgG4嵌合配体。从P50到P81每周5天监测每只小鼠的临床状况和重量。
3.结果
对治疗动物的观察(直至120天的后续检查)清楚显示这些动物具有长期的存活。因此，GNbAC 1注射保护了它们，使它们连续三次在注射致死剂量的MSRV-ENV条件下存活。
在所述后续检查期间，它们的全身健康状态保持良好并在生理范围内持续体重增加(没有观察到肥胖)。
可以总结得出，在显示糖尿病病变和此外可引起胰腺炎的这种动物模型中，GNb AC1 IgG4配体有效的拮抗MSRV ENV的致死剂量，并且在与炎症和MSRV ENV表达或抗原血有关的疾病诸如糖尿病或胰腺炎中具有感兴趣的治疗效果。
实施例14：具有IgG4同种型链(包括配体的6个CDR氨基酸序列)的GNb AC1人源化抗体的设计、构建和体外分析，(i)用于插入人源化IgG4可变链的第一步优化，(ii)针对IgG4载体中的最佳靶(ENV蛋白)结合活性挑选CDR序列的最佳组合，和(iii)针对CHO细胞中的IgG4稳定表达进行优化的挑选。
A.分子构建体的设计，构建体的产生和挑选，用于获得人源化和稳定的含有配体的IgG4抗体载体
1.GNb AC1鼠抗ENV抗体的Fv区的分析
为了发现用于人源化GNb AC1鼠抗体的合适人骨架，将GNb AC1重链和轻链Fv区的氨基酸序列与Panorama Research Institute(1230Bordeaux Drive，Sunnyvale，California 94089，USA)的人抗体种系基因数据库进行比对。人种系V基因中命中率最高的(top hits)被鉴定为人V基因候选物。
从数据库搜索，人VH1-46和VH1-69基因被鉴定为与鼠GNb AC1重链具有最接近的序列。因此我们选择VH1-69作为人骨架用于人源化。使用相同数据库，我们鉴定人JH4序列用于人源化重链的骨架4。
对于抗体轻链，VK1-5、VK3-11、VK1-33、VK1-39显示与鼠抗体轻链的高同源性。因此我们选择VK1-39用于轻链的人源化。使用相同方法，我们鉴定JK4用于构建人抗体轻链的骨架4。
为了确定适于移植入人源化抗体的人VH链的CDR区，我们重新评价了这些CDR区在原始鼠抗体可变重链内的适应和优化的描述。因此我们使用Kabat定义和Chothia定义(Johnson G，Wu TT.Kabat Database and its applications：future directions.Nucleic Acids Res 2001；29：205-6.and Chothia C，Gelfand I，Kister A.Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain.J Mol Biol 1998；278：457-79)的组合，作为我们的优选定义。总之，Chothia定义倾向于构象变异性，而Kabat定义倾向于序列变异性。GNb AC1鼠抗体重链的CDR区显示于图15(SEQ ID Nos.33，34和35)，并且根据先前描述的优选定义，选择优选的区域用于功能性插入人IgG4可变重链(VH)。
为了确定适于移植入人源化抗体的人VL链的CDR区，我们重新评价了这些CDR区在原始鼠抗体可变轻链内的适应和优化的描述。因此我们使用Kabat定义(Johnson G，Wu TT.Kabat Database and its applications：future directions.Nucleic Acids Res 2001；29：205-6)和Contact定义(Panorama Research Institute，CA，USA)的组合。在鉴定鼠抗体轻链后，我们使用Kabat定义作为我们的优选定义来限定CDR区。挑选的抗体轻链的CDR区显示于图16(SEQ ID 36和SEQ ID 38)。
2.人源化重链可变区
基于鼠抗体CDRs和人种系VH 1-69基因，设计7个VH序列用于GNb AC1重链的人源化。它们被命名为H1，H2，H3，H4，H4A，H4B和H4C。合成这些V区的DNA片段，将其与人IgG4恒定区cDNA的5′融合以产生7个全长IgG4重链。将全长IgG4重链插入pCMV质粒主链的CMV启动子下游(参见实施例4)。通过限制性内切酶消化鉴定包含正确重链插入物的克隆，然后通过测序分析确认它们的DNA序列，分别对应于SEQ ID No.39到SEQ ID No.45。
3.人源化轻链可变区
基于鼠抗体轻链CDRs和人种系VK1-39基因，设计并合成3个人源化VL序列。这些序列被命名为VK1、VK2和VK3。将这3个VK DNA片段与包含人kappa链序列的pTT5质粒主链中的kappa恒定区融合。每个轻链开放阅读框由CMV启动子驱动。为了增加基因表达，kappa轻链序列还在VL和轻链恒定区的接头中包括内含子。通过限制性内切酶消化鉴定含有正确插入物的质粒克隆，然后通过DNA测序分析确认它们的序列，分别对应于SEQ ID No.46到SEQ ID No.48。
4.人源化抗体变体的表达
为了表达抗体，使用DNA purification Maxi试剂盒(Qiagen)纯化7个重链和3个轻链的质粒。此外，使用相同的试剂盒纯化用于嵌合GNbAC1IgG4重链和嵌合GNb AC1kappa轻链的质粒(由GeNeuro提供)。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在6孔板的无血清培养基(Invitrogen)中培养，并用不同组合的重链和轻链质粒按1∶1DNA比例共转染。使用Invitrogen freestyle Max转染试剂进行转染。进行了共32次转染，包括8条重链(7条人源化重链加1条嵌合重链)和4条轻链(3条人源化轻链加1条嵌合轻链)的组合。在转染后第3天，收集细胞培养上清。上清中的抗体浓度通过人IgG4ELISA测定法确定，其中使用纯化的嵌合GNb AC 1IgG4抗体(由GeNeuro提供)产生标准曲线。
5.人源化抗体变体的初步筛选
为了评价人源化抗体变体，我们使用在CHO细胞中共转染嵌合重链和嵌合轻链产生的嵌合抗体作为针对ENV蛋白的结合活性的基准/阳性对照。因为嵌合GNb AC1抗体和所有人源化的抗体变体采用IgG4形式，可以方便的使用基于ELISA的结合测定法(利用固定的MSRV ENV蛋白)来评价相对抗体结合活性。在这种结合测定法中，用1μg/ml的纯化重组ENV蛋白(由GeNeuro提供)包被ELISA板。用1％BSA封闭板，并将各种稀释度的抗ENV抗体添加到孔中。检测结合的抗体，通过偶联HRP的抗人IgG Fc二抗，然后用HRP底物(KPL)进行显色。利用这种测定法，我们显示嵌合抗ENV IgG4抗体对固定的ENV具有非常好的结合活性(图17)。
使用相同的结合测定法，我们评价了从CHO培养物(用人源化重链和轻链序列的不同组合转染)收集的上清。设定两个标准来确定最佳抗体：
-人源化抗体应当具有接近于嵌合GNb AC1抗体的结合活性；
-人源化抗体应当具有适当的表达水平，即在共转染重链和轻链质粒后的上清中＞100ng/ml。
基于这些选择标准，挑选H2/VK3作为最佳抗体，因为其良好的结合活性(图18)和表达(6孔板中＞1μg/ml)。H4A/K3是第二好的抗体，因为其对ENV蛋白的结合活性低于H2/VK3(图19)。第三种抗体，H1/VK3具有良好的结合活性，但抗体表达较差(6孔板中＜10ng/ml)(数据未显示)。基于所述初步筛选，我们决定在进一步的鉴定中聚焦H2/VK3。
6.H2/VK3的进一步鉴定
在初步筛选后，我们使用标准化的抗体浓度在结合测定法中进一步比较了H2/VK3与嵌合抗ENV IgG4抗体。使用纯化的嵌合GNb AC1抗体作为标准品，利用我们的IgG4ELISA仔细测定上清中抗体H2/VK3的浓度。将上清中的H2/VK3抗体与纯化的嵌合GNb AC1IgG4抗体稀释到相同浓度，并在ENV结合ELISA测定法中进行比较。所述测定法显示人源化H2/VK3抗体具有和嵌合IgG4抗ENV蛋白几乎相同的ENV结合活性(图20)。
随后，我们扩大了H2/VK3的表达，这样的话可以纯化出足量的H2/VK3抗体。使用质粒纯化maxi试剂盒(Qiagen)制备pCMV H2和pTT5VK3质粒。CHO细胞在无血清CHO培养基中培养，并使用Invitrogen Freestyle Max转染试剂转染两种质粒。转导后5天，收集细胞培养上清，并在3400rpm离心15分钟。上清然后通过蛋白A柱(GE)，用PBS清洗，并用pH 3.5洗脱缓冲液进行洗脱。汇集包含蛋白的组分，通过Amicon 离心柱(分子量截断为10kD)浓缩到合适体积。通过人IgG4ELISA确定抗体浓度，并利用Bradford蛋白测定法(Bio-Rad)进行确认。在非还原性SDS-PAGE凝胶中检验纯化的H2/VK3抗体，在分子量约150kD观察到单一条带(图21)。
最后，在ENV结合测定法中比较了纯化的H2/VK3和纯化的嵌合GNb AC1抗体。结果显示纯化的H2/VK3具有与纯化的嵌合抗体几乎相同的结合活性(图22)。基于这些数据，我们总结得出H2/VK3符合我们的标准，被选为人源化GNb AC 1抗体。考虑到先前的结合活性数据(图3-6和8)，维持人源化抗体内配体活性必需的6个CDR序列被插入挑选的人源化IgG4抗体载体的H2和VK3链的氨基酸序列(图22)，显示于SEQ ID No.49到SEQ ID No.54。
通过在鼠VH和VL链中分析的CDR序列(其首先被挑选作为原始人VH和人VL构建体内的合适插入物(SEQ ID 33-38))的挑选和突变对其进行优化。挑选的人源化H2重链和VK3轻链(针对挑选的人源化IgG4构建体)的氨基酸序列和它们的残留鼠残基也显示于图23。
我们在无血清CHO培养基中从CHO细胞产生1mg H2/VK3完整的人源化抗体构建体(通过pCMV H2和pTT5VK3质粒的共转染)，并通过蛋白A柱纯化这种H2/VK3抗体。
7.具有S241P突变的人源化抗ENV mAb的产生
有时发现IgG4抗体在体内是功能单价的。最近的研究阐明这归因于IgG4分子中IgG一半分子(一个H-链加一个L-链)的体内替换。该步骤产生双特异性抗体，其在大部分情况下将起功能单价抗体的作用(Aalberse and Schuurman 2002，IgG4breaking the rules，Immunology.2002，105：9-19)。这主要是由于链间二硫桥的不稳定(归因于残基241位(铰链区)P到S的变化)造成的，有可能降低抗体特异性和功效。为了避免这种问题，我们进行了可能的氨基酸取代的3D蛋白鉴定(使用软件诸如www.NCBI-ENTREZ上提供的那些软件，例如Protein Cn3D viewer，或诸如M CLC Main Workbench，CLC Bio company，Aarhus，Denmark，或Panorama Research Institute，CA，USA开发的那些软件)。因此我们想到，初始核苷酸序列的最初改变(包括用脯氨酸(P)残基取代241位现有的丝氨酸(S))，来自核苷酸构建体内编码它的优化核苷酸序列，是含有配体的IgG4抗体载体的最终不稳定性的解决方案。因此，进行定点诱变，将PCR产物克隆入pCMV质粒，称为H2S241P。通过序列分析确认突变H2重链的DNA序列。
这种优化现在结合kappa轻链序列的改变(如上文已经提及的在VL和轻链恒定区的接头处包括内含子)，以增加基因表达。
从先前挑选的克隆优化的序列(通过对初级氨基酸结构或终产物的生产率有影响的核苷酸突变或插入)的这种最初组合显示于图24，其中具有氨基酸组成及其固有结构的对应于IgG4抗体产物的序列为本发明配体提供优化的、稳定的和高表达的载体，保留其对靶ENV蛋白抗原的功能结合特性。它显示抗ENV人源化抗体重链H2S241P的最终序列，及其编码核苷酸序列(SEQ ID 55)和其氨基酸序列(SEQ ID 56)。它还显示抗ENV人源化抗体轻链VK3的最终序列，及其编码核苷酸序列(SEQID 57)，其中内含子用下划线表示：(SEQ ID 58)。接着是没有内含子的轻链VK3的剪接核苷酸序列(SEQ ID 59)。最后显示的是对应于最终优化的轻链VK3的编码氨基酸序列(SEQ ID 60)。
最后我们从CHO细胞产生2mg具有S241P突变的人源化抗体的最终形式。通过Qiagen plamsid DNA Maxi试剂盒纯化pCMV H2S241P和pTT5VK3质粒。CHO细胞在无血清CHO培养基中培养，并使用Freestyle transfection Max试剂(Invitrogen)转染pCMV H2S241P和pTT5VK3质粒。5天后，收集细胞培养上清，并在3400rpm离心15分钟。使用蛋白A柱(GE)纯化抗体蛋白。
B.为了含有配体的嵌合和人源化IgG4抗体载体在CHO细胞表达而优化的氨基酸和核苷酸序列
B1.嵌合和人源化形式的抗体mAb GNb AC1的蛋白和密码子优化的(用于CHO细胞表达)核苷酸序列
B1.1嵌合GNb AC1
对应于chGNb AC1 IgG4成熟蛋白的序列显示于SEQ ID 61。
对应于chGNb AC1 LC成熟蛋白的序列显示于SEQ ID 62。
B1.2人源化GNb AC1
huGNb AC1 IgG4成熟蛋白的相应序列显示于SEQ ID 63。huGNbAC1 LC成熟蛋白的相应序列显示于SEQ ID 64。
B2.包括质粒序列的GNb AC1的人源化轻链和重链的核苷酸序列
huGNb AC1LC的核苷酸序列显示于SEQ ID 65。huGNb AC1 IgG4HC的核苷酸序列显示于SEQ ID 67。
C.挑选的人源化IgG4配体(稳定和密码子优化的人源化IgG4抗体载体)的结合活性的体外补充分析。
C1.生化抗体结合分析。
实验方案：在37℃将溶于重碳酸盐50mM pH9.6缓冲液的ENV温育2小时-利用PBS BSA 1％稀释的抗体在室温下检测1小时-分别利用过氧化物酶标记的抗小鼠二抗和抗人二抗(参考115-035-146和参考109-035-088，Jackson，USA)(用PBS BSA 1％1/1000稀释)检测，在室温下温育1小时。通过添加OPD底物进行显色，30分钟后利用分光光度计读取光密度(在每个步骤之间进行利用PBS的清洗步骤)。
表19：GNb AC1人源化抗体与靶蛋白MSRV-ENV的剂量-反应结合动力学。
Figure BPA00001328779300741
Figure BPA00001328779300742
这些结果清楚显示，在两个实验中，在固定的ENV蛋白靶和抗体系列稀释度(表格的上部)或固定的抗体浓度和靶蛋白稀释度(表格的下部)的条件下，人源化IgG4抗体具有可重复的剂量-反应动力学。它们与相同嵌合抗体同种型的相当，但比原始的GNb AC1抗体好得多，而没有观察到对无关对照抗体(2G5E12)的显著结合动力学。
C2.PBMC反应性试验
材料和方法：参见实施例6。
Figure BPA00001328779300751
表20：含MSRV ENV蛋白的PBMC培养物中IL-6和IFN-γ促炎性细胞因子的抑制，通过插入人源化和嵌合IgG4抗体载体的GNb AC1配体。NB.无ENV的背景信号如下所示(无ENV)，通过细菌LPS的对照正诱导显示于底部。
这些结果证明对以下的显著抑制：
(i)MSRV ENV蛋白诱导的白介素6(IL-6)(在外周血单核细胞培养物中峰值出现在24h)(利用完整的ENV蛋白，ENV-T，使用0.1微克/lm)在存在人源化抗体和嵌合抗体的条件下均被显著抑制。
(ii)MSRV ENV蛋白诱导的干扰素γ(IFN-γ)(在外周血单核细胞培养物中峰值出现在72h)(利用ENV蛋白的表面片段，ENV-SU，使用0.5微克/lm)在存在人源化抗体的条件下被强烈抑制，但在存在嵌合抗体的条件下未被抑制。因此证明了与嵌合抗体相比，人源化抗体对T细胞活化的改进作用。在后一嵌合载体中，残留的鼠VH和VL链可能通过人T细胞识别异抗原(移植入骨架的鼠蛋白链)引发不良免疫活化。通过挑选的结合ENV蛋白的配体的人源化IgG4载体，这种情况就不会发生。在24h对于IL-6没有观察到这种差异，因为其不涉及特异性抗原识别(利用T淋巴细胞的获得性免疫)，只涉及先天免疫活化，当结合目标免疫病理学ENV蛋白时被配体阻断。
实施例15：来自染色体7q的HERV-W包膜蛋白(合胞素)和MSRV颗粒均诱导对免疫和星形细胞的促炎性应答(其被抗MSRV-ENV抗体GNb AC1及其含配体的嵌合IgG4构建体抑制)。
人的免疫病理学特征与这些ENV蛋白的生物学效应之间的关系已经出现。因为MSRV-ENV和合胞素的序列具有超过81％的序列同一性(Mallet，Bouton等2004；Mameli，Astone等人2007)，我们研究了这两种姐妹蛋白是否能够显示类似的促炎效果。因为先前对外周血单核细胞(PBMC)和脑星形细胞的研究显示分别对MSRV-ENV或合胞素的反应性，我们在此对两种细胞类型进行了平行分析。
方法
蛋白制备和分离
参见实施例2
细胞分离和制备
通过在Ficoll-Paque上的密度梯度离心，从健康的供体白膜层(Transfusion Center-HUG-Geneva)分离人PBMC。人星形细胞从InVivogen定购。
细胞刺激
按照浓度为1×106/孔将PBMC种于24或48孔板的1ml培养基中，所述培养基由添加1％非必需氨基酸，1％青霉素/链霉素，1％丙酮酸钠和10％热灭活FCSR(BioWest)的PMI Glutamax 1640(Invitrogen)组成。在37℃5％CO2的湿润环境下将细胞孵育24、48或72h。
对于细胞培养实验，将溶于100μl培养基的合胞素，MSRV-ENV和LPS与针对ENV的抗体(GNb AC1单克隆小鼠IgG，GeNeuro)在4℃预温育1h，然后添加到细胞。
细胞因子生成测定
在24，48或72h收集培养上清，在通过ELISA鉴定细胞因子生成之前保存于-20℃。根据制造商的说明书，使用BD Bioscience的OptEIAELISA试剂盒检测人细胞因子。
结果
MSRV-ENV和Svncvtin是两种HERV-W相关蛋白
为了比较HERV-W合胞素包膜蛋白(登录号NCBI AF072056.2)与MSRV-ENV(登录号NCBI AF331500.1)的相关生物学特性，我们在相似条件下表达和产生了这两种蛋白用于本研究(条件描述于实施例2)。
为了阐明和比较两种HERV-W相关蛋白的生物学效应，我们研究了它们诱导促炎性细胞因子的作用。我们发现利用HERV-W ENV相关蛋白的刺激强烈上调促炎性白介素6(IL-6)星形细胞应答。最重要地，这种刺激不受无关抗体(不结合任一种ENV)的影响，但被GNb AC1鼠抗体和GNb AC1人嵌合IgG4强烈抑制，这清楚表明我们任一种抗体载体形式的配体抑制HERV-W ENV相关变体的促炎性作用，而不只是MSRV-ENV的。
在图24中，在具有各种HERV-W ENV相关蛋白的条件下培养上清中的IL-6释放的剂量显示了这种类似生物学效应的实例。这是一种特异性的作用，因为还被GNbAC1配体(采用鼠或IgG4嵌合抗体的形式)抑制。因此，还证明了配体对不同HERV-W ENV相关蛋白的类似抑制效率。
除了星形细胞(其涉及局部脑病变和炎症)外，我们证明了MSRV-ENV和合胞素的全身性免疫作用，其在人外周血单核细胞(PBMC，即淋巴细胞和单核细胞)培养物中刺激促炎细胞因子的产生。在图25中，IL12P40(先天性免疫应答的特征)的检测证实了对PBMC的这种类似生物学效应的实例，并且培养上清中针对两种HERV-W ENV相关蛋白的IL-6释放的相同剂量也确认了这一点。此外，对于星形细胞的实验，这种IL-6释放也被GNb AC1配体(采用鼠或IgG4嵌合抗体形式)特异性抑制。
实施例16：GNb AC1配体和重组人嵌合IgG4GNb AC1抗体和包括配体的人源化IgG4抗体结合MSRV-ENV和具有人细胞糖基化的HERV-W ENV 7q/合胞素蛋白。
1.材料和方法：
a.按照实施例2的描述获得ENV细菌重组蛋白。
b.由P′X therapeutics，Grenoble，France产生人糖基化MSRV ENV蛋白用于Geneuro，根据下列步骤：利用相同的方案产生HERV-W-ENV类似蛋白，称为合胞素。
来自人细胞表达的ENV糖基化纯化蛋白的生产步骤。
转染：
将HEK-Freestyle细胞按106个细胞/mL接种，并使用293Fectin转染试剂将Env-MSRV pMCMVHE/1转染所述细胞。
收集和裂解：
转染后3天，收集细胞并离心。将细胞沉淀用裂解缓冲液(添加抗蛋白酶的PBS)重悬，通过超声处理进行细胞裂解。
溶解：
离心后，沉淀用溶解缓冲液(50mM Tris pH8，100mM NaCl，2M尿素，2％FOS-Choline10)重悬，在+4℃搅拌条件下溶解过夜。
纯化前的稀释：
第二天，溶解的蛋白用稀释缓冲液(50mM Tris pH8，100mM NaCl)稀释4倍，并在纯化前进行均质化。
混合物1(Pool 1)EnvMSRV His标签纯化法：Ni琼脂糖凝胶亲和层析
进行Ni琼脂糖凝胶亲和层析(GE Heathcare，4ml)以纯化His标签的Env-MSRV。
平衡缓冲液：50mM Tris pH8、100mM NaCl、0.5％FOS-胆碱10、0.5M尿素。
洗脱缓冲液：50mM Tris pH8、100mM NaCl、0.5％FOS-胆碱10、0.5M尿素、1M咪唑。
洗脱步骤：从0％到100％洗脱缓冲液，30个柱体积的梯度。
混合物浓缩：使用Amicon截留30kDa浓缩7倍
混合物2EnvMSRV His标签纯化法：Ni琼脂糖凝胶亲和层析
进行第二个亲和层析，使用第一个的流出液作为起始原料＝上样，用50mM Tris pH8、100mM NaCl、0.2％FOS-胆碱10、0.5M尿素稀释。
平衡缓冲液：50mM Tris pH8、100mM NaCl、0.2％FOS-胆碱10、0.5M尿素。
洗脱缓冲液：50mM Tris pH8、100mM NaCl、0.2％FOS-胆碱10、0.5M尿素、1M咪唑，
洗脱步骤：从0％到100％洗脱缓冲液，30个柱体积的梯度。
质量控制：
通过考马斯蓝染色和利用GNb AC1鼠抗体的Western印迹分析进行SDS-PAGE质量控制分析。N端测序证实纯化蛋白的性质。
批量透析和冷冻
将两批Env-MSRV50mM用Tris pH8、100mM NaCl、0.5％或0.2％FOS-胆碱10透析，然后添加10％甘油并在液氮中冷冻。
c.利用ELISA试验的特异性结合检测
所有ENV制品用CaCO2缓冲液50mM pH9.6稀释；将它们在ELISA微板孔中37℃温育2h，以便在ELISA微板上包被蛋白。虽然如此，由于更低的产出比，包被的合胞素的浓度低于MSRV-ENV。
检测抗体用PBS BSA 1％稀释，并在室温下在3个微板孔中温育1h。针对鼠单克隆抗体的过氧化物酶标记的抗小鼠二抗(参考115-035-14)和针对人源化和人嵌合重组体的抗人二抗(参考115-035-088)用PBS BSA1％缓冲液按1/1000稀释，并在室温下温育1小时。OPD对过氧化物酶的显影进行30分钟，然后在490nm读取光密度。每次温育步骤间的清洗分别进行、4和6个清洗循环。
2.结果：
从下面的图26可以看出，MSRV-ENV的细菌和人糖基化的纯化蛋白制品被含有配体的所有抗体类型(鼠的，嵌合的和人源化的)轻易的检测到，在冷光检测光密度测量中产生良好信号。有趣地是，在当前ELISA条件下，只有人源化抗体GNb AC1配体对人糖基化合胞素产生良好识别，而在这个包被浓度，鼠和嵌合抗体产生对合胞素的较低信号。
这些结果清楚的显示，本发明的配体，无论用于结合靶表位(鼠，嵌合IgG4或人源化IgG4抗体)的其分子载体是什么，被发现有效地结合所有形式的包括所述表位的靶蛋白，即细菌和人糖基化的ENV蛋白和，尤其是人源化抗体，HERV-W相关蛋白，MSRV-ENV和HERV-W 7q ENV蛋白，也称为合胞素。
因此，治疗性配体结合靶ENV蛋白的人糖基化形式。
实施例17：在MSRV-ENV诱导的精神分裂症行为异常的动物模型中体内分析含有IgG4同种型的GNb AC1嵌合抗体的治疗效果。
I.介绍
在实施例8中，我们证明了MSRV-ENV蛋白在精神分裂症患者血清中的存在。该结果表明探究ENV蛋白的存在与合适动物模型中脑改变和行为缺陷的出现之间联系的必要性。精神分裂症的神经发育理论假定，疾病是临床显示疾病之前很久的初始损伤的行为结果(Weinberger和Lipska，1995；Lewis和Levitt，2002)。因此，在设计模拟精神分裂症相关病症的合适动物模型时，必须考虑这种病理生理特征。
II.实验1：在成年早期接受ENV诱导的免疫初免的大鼠中重复单侧脑室内注射ENV蛋白后，IgG4嵌合抗体对行为和解剖改变的影响。
A.材料和方法
1.动物
雄性Sprague-Dawley大鼠(6到8周龄)(n＝8)购自Charles River，France。在标准亮暗循环条件下每笼3只喂养动物，它们可以随意获得食物和水，不打扰8天时间以便它们适应环境。所有步骤都遵守1986年11月24日的European Communities Council Directive(86/609/EEC)和1987年10月19日的National Council Directive(87848，“Ministere de I′Agriculture et de Ia Foret，Farnce”)。尽所有努力将使用动物的数目以及它们的痛苦降到最低。
2.ENV-诱导的免疫初免
第一天，被称为“0点”(P0)，将大鼠随机分配到假注射组(n＝2)(注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Lonza，France))和ENV注射组(n＝6)(注射250ng溶于PBS的重组ENV蛋白(His-ENVT-081206-1，PXTherapeutics，France))。
通过腹腔内施用甲苯噻嗪10mg/kg(
Figure BPA00001328779300811
Alcyon，France)和氯胺酮80mg/kg(
Figure BPA00001328779300812
Alcyon，France)的混合溶液将每只大鼠麻醉。在从耳朵到刚好在眼睛前之间延伸的区域修剪毛。插入耳塞，将动物固定于立体定位装置上，上门牙条在耳内线上5mm。用基于氯己定的防腐溶液(Alcyon，France)擦拭修剪的头皮区域，在耳朵到眼睛之间的一点进行切口。利用钳子拉开皮肤，去除下面的组织(包括骨膜)以暴露清晰、干燥的颅骨(大约15×18mm)区域。
塑料插管(o.d.＝0.457mm和i.d.＝0.267mm)(Plastic One，USA)目的在于植入右侧脑室。将插管插在立体定位装置上，前囟上顶端“零”。在侧脑室上方钻孔穿过颅骨(前-后0.92mm；中部-外侧，相对前卤±1.7mm)。插管的点位于中心孔上以便顶端与颅骨表面一样高。插管降低3.5mm通过大脑皮层进入侧脑室。
对于每只大鼠，单独的PBS或与ENV蛋白的注射通过不锈钢注射器(放置并伸出低于插管顶端0.5mm)实现。注射器通过聚乙烯管道与Hamilton注射器(VWR，France)连接以便在3分钟时段内人工分配溶液。在注射完成后3分钟撤回注射器，以防止PBS或ENV蛋白沿着注射器轨迹流动。
在持针器上使用手术合缝闭合伤口。动物在单个笼中恢复2天时间。然后，动物被随机分为3个每笼，不受打扰直至进一步的实验。
3.潜伏期后重复单侧脑室内注射ENV蛋白
8个月后，将允许重复脑室内(icv)注射的颅插管植入所有大鼠。
在手术当天(P0)，通过腹腔内施用甲苯噻嗪10mg/kg(
Figure BPA00001328779300813
Alcyon，France)和氯胺酮80mg/kg(
Figure BPA00001328779300814
Alcyon，France)的混合溶液将每只大鼠麻醉。在从耳朵到刚好在眼睛前之间延伸的区域修剪毛。插入耳塞，将动物固定于立体定位装置上，上门牙条在耳内线上5mm。用基于氯己定的防腐溶液(Alcyon，France)擦拭修剪的头皮区域，在耳朵到眼睛之间的一点进行切口。利用钳子拉开皮肤，去除下面的组织(包括骨膜.)以暴露清晰、干燥的颅骨(大约15×18mm)区域。钻3个洞，两个在颅骨左侧和右侧上前卤之前大约7mm，第三个在前卤后7mm。将尼龙螺钉(直径＝0.50mm)(Plastic One，USA)穿过以坚固的吻合所述洞口作为牙齿结合剂的锚定点。开始护理以保留这些方法中的硬脑膜。塑料插管(o.d.＝0.457mm和i.d.＝0.267mm)(Plastic One，USA)目的在于植入右侧脑室。将插管插在立体定位装置中，前卤顶端“零”和点标记在零点标记后0.92mm和外侧1.7mm。在这个标记位点钻出一个洞。插管的点位于中心孔上以便顶端与颅骨表面一样高。插管降低3.5mm通过大脑皮层进入右侧脑室。插管固定在立体定位装置的夹盘，在插管和锚定螺钉周围构建少量牙齿堵缝(
Figure BPA00001328779300821
Heraeus Kulzer，France)。在持针器上使用手术合缝闭合伤口。当牙齿材料构建好时撤回固定的针头，并将从立体定位装置上拿开。
在植入颅插管后同一天(P0)和第25天(P25)完成PBS或ENV蛋白的注射。
在每个时间点，通过不锈钢注射器(置于并伸出低于插管顶端0.5mm)施用单独的PBS或250ng重组ENV蛋白(His-ENVT-081206-1，PXTherapeutics，France)。注射器通过聚乙烯管道与Hamilton注射器(VWR，France)连接以便在3分钟时段内人工分配溶液(3μl)。在注射完成后3分钟撤回注射器，以防止PBS或ENV蛋白沿着注射器轨迹流动。
4.IgG4嵌合抗体的全身性给药
在第二次恢复注射ENV蛋白的那天(P26)，随机挑选ENV注射大鼠接受单次腹腔内(i.p.)注射PBS(n＝3)或100μg用PBS稀释的IgG4嵌合抗体(n＝3)。
5.体内磁共振成像(MRI)
在P12和P37通过体内MRI检查大鼠的脑形态。首先利用得到核准的系统(TEM Sega，France)麻醉大鼠，利用0.6l/min含30％氧的空气的流速吸入异氟烷3％。诱导后，利用1.5到2％的异氟烷气体和0.6l/min流速维持麻醉。使用循环水加热板将体温控制并维持在37±1℃。在整个实验过程中监测呼吸频率。将大鼠按俯卧位置于装备了立体定位固定装置(齿条和耳针)的塑料床(Bruker Biospec Animal Handling Systems，Germany)。然后将22-gauge静脉内导管放入大鼠的尾静脉用于后续注射。
在装备了400mT/m梯度设置的Bruker 7T Biospec系统(Bruker，Germany)上使用传输体线圈(o.d.＝112mm和i.d.＝72mm)进行扫描，并使用25mm直径的表面螺旋用于信号接收。利用3个正交方向和5cm视野的快速梯度回波定位仪被首次用于鉴定脑区域，允许计算固定的空间座标用于后续扫描。进行轴平面上两种快速采集弛豫增强(RARE)序列分析。使用4200ms的重复时间(TR)，36ms回声时间(TE)的单次回声，35714Hz接收器带宽和4min扫描时间，利用自旋回波脉冲测序获得第一个T2加权的图像。使用3000ms的重复时间(TR)，17ms和51ms的TE的两次回声，55555Hz接收器带宽和5min扫描时间，利用自旋回波脉冲测序获得第二个T2加权的图像。对于两个序列，利用2.56cm的视野和256×256的采集矩阵大小获得总共30个切片(800μm厚)，产生100×100μm的平面分辨率。
为了评价注射ENV蛋白的大鼠中脑膜和脑室屏障的动力学，使用钆增强的MRI方法。Coronal precontrast T1-weighted images were acquired with fast low angle shot利用快速低角度镜头(FLASH)序列和重复时间/回声时间＝2.2/1.4ms获得冠强化前T1加权图像。利用2.56cm的视野和256×192的采集矩阵大小获得总共30个切片(800μm厚)，产生100×133μm的平面分辨率。然后，动物接受钆0.5M(
Figure BPA00001328779300831
Guerbet，France)(1mL/kg体重的推注)。在如上所述的相同条件下，在钆施用10min后进行强化后T1扫描。
6.行为分析
在P15和P40，使用与PC计算机连接的自动化数码扫描装置(Imetronic，Pessac，France)检测大鼠的运动活性。在装备一排4个平行水平的红外光束(两个在前面和两个在后面)(置于高于地面0.7cm以便测量水平活性)的光电管检测笼中监测运动活性。光束中断的次数被自动记录。水平活性以笼交换的形式表示(即，笼任一侧的连续中断)。笼交换的次数被连续记录，在10分钟区间内累加。
对于所有大鼠，在适度应力条件(即，接触新的环境后或腹腔内盐水注射后)和安非他明攻击下评价运动活性。所有这些检测在无活性期(光照期)进行。对于新鲜刺激检测，从它们的饲养笼中取出大鼠，将其放入单个光电管笼，测量运动活性共1小时。然后，大鼠接受盐水注射(1mL/kg，i.p.)，再监测它们的运动活性1小时。最后，给动物注射D-安非他明(硫酸酯1.5mg/kg，i.p.，Sigma Aldrich，A-5880，批次90K3354)，再记录它们的活性2小时。
B.结果
1.体内磁共振成像
a)ENV蛋白的第一次恢复(recall)注射后
在P12，大部分动物T2加权图像的定性分析显示对应于侧脑室的大高信号(hypersignals)。与新生大鼠脑的典型MRI图像相比，在本研究中观察到的高信号的增大表明相应动物中侧脑室的增大。此外，在假和ENV注射的动物中观察到右侧脑室(即，被注射的一个)的更大扩张。对应于注射ENV蛋白的动物中观察到的侧脑室的高信号程度不同于注射PBS的动物，表明ENV蛋白触发神经炎性过程。
在钆注射前后获得的T1加权图像的比较显示注射PBS或ENV蛋白的动物的差异。这些结果表明，在脑室内(icv)注射ENV蛋白后12天脑膜和脑室屏障可以被改变。
b)ENV蛋白的第二次恢复注射后
如ENV蛋白的恢复注射后所描述的，第二次恢复注射(P37)后获得的T2加权图像的定性分析显示对应于大部分动物中侧脑室的大高信号。在假大鼠中，我们没有检测到任意显著的高信号(考虑到信号的增加超过脑脊液的正常背景信号，其通常通过脑室内MRI显像)，其对应于两个时间点之间的侧脑室。惊人地的，ENV注射的大鼠在第二次注射后显示这些高信号的明显增大。甚至更显著的，高信号可以扩展到周围组织，尤其是海马区。用IgG4嵌合抗体治疗的ENV注射大鼠中获得的MR图像显示对应于侧脑室的高信号的明显增大。
有趣地是，在用IgG4嵌合抗体治疗的ENV注射大鼠中，周围组织(如海马区)的所述T2加权高信号的扩展受到限制。因为抗体注射在中枢神经系统-CNS-周围(腹膜内)，后一点突出以下事实：
1-仅与用于本动物模型的具体方案有关的脑室中速发促炎性效果(其表示MSRV ENV蛋白的直接icv注射)没有立即被在ENV icv注射后(因此，在局部脑室炎症开始后)超过24h注射的IgG4嵌合抗体配体抑制。必须清楚局部脑室炎症不是精神病发病机理的主要特征，最有可能不参与当前模型的神经行为障碍。因此这种速发型icv后局部炎症被认为是当前模型的副作用。
2-已知与精神病表现有联系的相关特征，诸如海马区的病原性联系，在注射本发明治疗性配体(在ENV icv注射后，在CNS的远端以及CNS的周围注射人嵌合IgG4抗体的形式)的大鼠中被抑制。这从以下得到证明：从脑室到海马区的关键脑区通过MRI观察到高信号的扩展。
在钆注射前后获得的T1加权图像的比较在所有组中未显示任意明显差异。这些结果表明，在第二次恢复注射ENV蛋白后脑膜和脑室屏障看起来未被进一步改变。
在第一组实验中，我们第一次证明ENV蛋白的两次icv恢复注射可以引起大鼠(在成年早期接受ENV诱导的免疫初免)心室和海马区的神经炎性过程。惊人地是，海马区的解剖和功能损伤与精神分裂症患者(患有与神经元损伤和心室肿大有关的长期认知减退)中报道的MRI研究一致(Bornstein等，1992)。有趣地是，在诱导ENV诱导的发病机理后，通过ENV蛋白的重复恢复注射诱导的海马损伤被人嵌合IgG4抗体的施用抑制，这与配体的治疗效果(在精神分裂症的临床前模型中施用这种嵌合抗体的制剂时)一致。
III实验2：在大鼠侧脑室的海马区单次双侧注射ENV蛋白后神经行 为损伤的评价
A.材料和方法
1.动物
雄性Sprague-Dawley大鼠(6到6周龄)(n＝6)购自Charles River，France。在标准亮暗循环条件下每笼3只喂养动物，它们可以随意获得食物和水，不打扰8天时间以便它们适应环境。所有步骤都遵守1986年11月24日的European Communities Council Directive(86/609/EEC)和1987年10月19日的National Council Directive(87848，“Ministere de I′Agriculture et de Ia Foret，Farnce”)。尽所有努力将使用动物的数目以及它们的痛苦降到最低。
2.ENV蛋白在海马区或侧脑室的双侧注射
手术当天(P0)，将大鼠随机分配到假组(n＝2)(注射PBS(Lonza，France))和两个检测组(icv(ENV-icv大鼠，n＝2)或海马内(ENV-hipp大鼠，n＝2)注射250ng溶于PBS的重组ENV蛋白(ENVT，批次081206-1，PXTherapeutics，Grenoble，France))。
通过腹腔内施用甲苯噻嗪10mg/kg(
Figure BPA00001328779300861
Alcyon，France)和氯胺酮80mg/kg(
Figure BPA00001328779300862
Alcyon，France)的混合溶液将每只小鼠麻醉。
在从耳朵到刚好在眼睛前之间延伸的区域修剪毛。插入耳塞，将动物固定于脑立体定位装置上，上门牙条在耳内线上5mm。用基于氯己定的防腐溶液(Alcyon，France)擦拭修剪的头皮区域，在耳朵到眼睛之间的一点进行切口。利用钳子拉开皮肤，去除下面的组织(包括骨膜)以暴露清晰、干燥的颅骨(大约15×18mm)区域。
塑料插管(o.d.＝0.457mm和i.d.＝0.267mm)(Plastic One，USA)目的在于双侧植入侧脑室或海马区。将插管插在立体定位器上，前囟上顶端“零”。在侧脑室(前后，0.92mm；中间-外侧，相对前卤±1.7mm或海马区(前后，4.8mm；中间-外侧，相对前卤±5.0mm)上方通过颅骨双侧钻洞。插管的点位于中心孔上以便顶端与颅骨表面一样高。插管降低3.5mm通过大脑皮层进入侧脑室或降低7.5mm进入海马区。
对于每只大鼠，单独的PBS或与ENV蛋白的注射通过不锈钢注射器(放置并伸出低于插管顶端0.5mm)实现。注射器通过聚乙烯管道与Hamilton注射器(VWR，France)连接以便在3分钟时段内人工分配溶液。在注射完成后3分钟撤回注射器，以防止PBS或ENV蛋白沿着注射器轨迹流动。
在持针器上使用手术合缝闭合伤口。动物在单个笼中恢复2天时间。然后，动物被随机分为3个每笼，不受打扰直至进一步的实验。
3.行为分析
在开放野使用3种模式：新鲜刺激，盐水注射和受限应力在适度应力条件下检测大鼠的运动应答。在P5、P6、P7、P11和P12检测对新鲜刺激的运动应答，而在P11和P13分别检测一次盐水注射和受限应力后的运动活性。
开放野装置包括由木材制成的四方框(80×75cm×40cm)，其被微暗照亮。开放野的底面被分成同等大小的9个正方形区域。对于新鲜刺激试验，将大鼠分别放入开放野的中心，研究所述野5分钟。然后将大鼠送回它们的饲养笼。在动物之间用盐溶液清洁场地。对于P11的盐水注射试验，大鼠接受盐水注射(1mL/kg，i.p.)，并立即放入开放野的中心，研究所述野5分钟。对于受限应力试验，通过在Plexiglas管(5.5cm×21cm)中固定15分钟约束动物，将其放入开放野的中心，并研究所述野5分钟。
对于所有试验，由实验者观察每只动物的行为。总的水平运动活性被定量为5min时段内穿越线的数目。此外，后腿站立(用后腿站立，前腿在空中或靠着墙)的次数如下打分：0＝没有，1＝很少，2＝适度，3＝高，4＝非常高。
B.结果
1.对新鲜刺激的运动应答
对于全部时间点，在接触新鲜刺激后，所有大鼠在5分钟期间内在开放野显示程度较高的水平和垂直运动活性。
在不同实验时间点的新鲜刺激试验的总体结果显示于图27。在所有ENV注射动物中，水平运动活性的增加在注射后早期(P5)不存在，但随着时间的过去逐渐出现，尤其是在注射到海马区的大鼠中(ENV-hipp大鼠)(图27A)。有趣地是，只有ENV-hipp大鼠在P12显示水平活性的持久加剧。此外，在ENV-hipp大鼠中在P5和P6就检测到垂直运动活性的增加，而在相同的时间点没有关于假动物与ENV-icv大鼠差异的报道。
2.盐水注射后的运动活性
在接触盐水注射后，所有大鼠在5分钟期间内在开放野显示程度较高的水平和垂直运动活性。
与假动物相比，只有ENV-hipp大鼠显示水平运动活性的明显增加(图28A)，而所有组的垂直运动活性是相似的(图28B)。
3.受限应力后的运动活性
在接触受限应力后，所有大鼠在5分钟期间内在开放野显示程度较高的水平和垂直运动活性。对于水平和垂直活性来说，ENV-hipp大鼠显示比假动物更高的运动活性，而在假和ENV-icv大鼠之间没有检测到明显的差异(图29)。
在这个第二系列实验中，我们证明ENV蛋白在侧脑室或海马区的单次双侧注射可能引起对适度应力条件的感觉加剧。此外，行为改变在ENV-Hipp大鼠中显示显著更严重和持久。此外，只在ENV-Hipp大鼠中观察到对受限应力攻击的异常运动应答。具有ENV蛋白双侧海马注射的大鼠提供了优于icv注射模型的相关模型，以便在临床前模型中研究精神分裂症的治疗。
因此我们在这种优化的模型中进一步评价了人嵌合IgG4配体的治疗效果。
IV.在大鼠的海马区单次双侧注射ENV蛋白后，嵌合IeG4配体对神 经行为精神病症状的治疗效果的鉴定。
A.材料和方法
1.动物
与本实施例的部分III一样。
2.ENV蛋白在海马区或侧脑室的双侧注射
与本实施例的部分III一样，如下所述在一些动物中另外注射抗体。
对于每只大鼠，每种溶液(PBS，ENV和IgG4)的注射通过不锈钢注射器(放置并伸出低于插管顶端0.5mm)实现。注射器通过聚乙烯管道与Hamilton注射器(VWR，France)连接以便在3分钟时段内人工分配溶液。在注射完成后3分钟撤回注射器，以防止PBS或ENV蛋白沿着注射器轨迹流动。对于IgG4治疗的ENV大鼠，在两个半球的相同坐标注射ENV蛋白后灌注2μg抗体10分钟。在持针器上使用手术合缝闭合伤口。动物在单个笼中恢复2天时间。然后，动物被随机分为3个每笼，不受打扰直至进一步的实验。
3.结果
这些结果第一次提供了利用ENV蛋白在海马区立体定位注射(具有对适度应力条件的感觉的加剧)的先前实验的再现，如下面图31A关于P12举例说明的实施例。
出人意料的并且没有在先前的实验中观察到，12天后(P12)终止动物后续检查，(未治疗的)ENV+大鼠的行为改变显示从对适度应激的高反应性(在P12仍然观察到)显著进展到低反应性(安静的)(该组中在P32观察到)(用图30A直方图的中间条表示)。除了关于第32天IgG4配体治疗效果的进一步结果之外，所述观察是相当有趣的，因为它复制了人精神分裂症亚型(经鉴定与血液中升高的ENV抗原血和CRP的存在有关(如实施例8中所证明))的天然临床进展的关键特征：在特征为阳性症状(对于本动物模型来说，对应激的高反应性)的初期阶段后，“阴性症状阶段”的出现(对于本动物模型来说，对应激的低反应性)。
实际上，这通常是与神经元损伤有关的随后效果，可以由脑室肿大得到证明(如对初始ENV icv注射后9个月提取的大鼠脑的本研究期间进行的MRI观察)。另外有趣地是，尽管这没有通过本实验的相应行为试验进行客观定量，在这种较长的延迟期间这些大鼠逐渐的进展到明显的低反应性；这可能是主观地但可以恒定的观察到。
本文中，利用相对SHAM对照的定量的和合适的试验，从“阳性症状”到“阴性症状”的这种变化被在海马区注射ENV蛋白的动物在P32(图30B)利用受限应力的第二个试验证实。因此它强调了在用IgG4配体治疗(在平行的MSRV ENV蛋白注射后)的类似动物中现在报道的治疗效果的显著性和重要性。
从图31A可以看出，用IgG4治疗的“ENV+”动物未患有这种认知减退(在P32具有这种行为低反应性(“安静的”)的出现)，在这个时间点上不能与SHAM对照区分(如直方图上的重叠误差线所示)，而与未治疗动物的这种差异是显著的(直方图上没有误差线的重叠)。此外，受限应力后的第二个行为试验重复了用IgG4配体治疗的“ENV+”大鼠与未治疗动物之间的这种差异，在两组之间的结果中甚至具有更大的差异：未治疗的“ENV+”动物与治疗动物相比其活性被显著降低几乎二分之一，后者的结果与SHAM对照无法区分(图31B)。这样的话，因为在实施例8中鉴定出精神分裂症的亚型(具有升高的CRP血清水平)与MSRV有关，其特征在于与认知减退和神经元损伤有关的“阴性症状学”的这种较晚阶段，这类显著的症状学出乎意料地证明了在IgG4配体治疗的临床前模型中有益治疗效果的证据；在MSRV ENV注射已经引发该模型的相关致病过程后，其仅仅证实了本发明配体在精神分裂症这种形式中的治疗效果(Dickerson，F.，C.Stallings等人2007)。
实施例18：在移植人淋巴瘤细胞的癌症动物模型中体内分析含有IgG1同种型的GNb AC1嵌合抗体的治疗效果。
I.实验1：IgG1嵌合GNb AC1抗体对裸鼠皮下注射的人B淋巴瘤细胞迁移的影响
A.材料和方法
1.动物
无病原体雌性裸鼠(6到8周龄)(n＝4)购自Charles River，France。动物在标准亮暗循环的相同笼中喂养，可以随意获得食物和水，不打扰8天时间以便它们适应环境。所有步骤都遵守1986年11月24日的European Communities Council Directive(86/609/EEC)和1987年10月19日的National Council Directive(87848，″Ministere de I′Agriculture et de Ia Foret″，Farnce)。尽所有努力将使用动物的数目以及它们的痛苦降到最低。
2.细胞培养
Akata细胞系是Epstein-Barr病毒阳性细胞系，来自患有伯基特氏淋巴瘤的患者。细胞系在37℃下，5％的CO2，湿润环境下在RPMI 1640培养基(Sigma，France)中培养，所述培养基添加有10％胎牛血清(Invitrogen，France)，40U青霉素每ml和50μg链霉素每ml。
3.细胞注射和抗体施周
在P0(第一天)，给裸鼠皮下注射15×107个淋巴瘤细胞。在6h延迟后，两只对照小鼠接受腹腔内注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Lonza，France)，一只小鼠接受腹腔内注射IgG1嵌合抗体(100μg/动物)。在注射淋巴瘤细胞72h后，后一只小鼠用相同抗体进行类似治疗。
4.组织学检查
在P19，通过过量戊巴比妥处死所有小鼠，进行尸体解剖以评价解剖病理学异常情况的存在。利用数码相机[型号Coolpix S500(即，7百万像素)，Nikon，France)获取照片，将其从相机转到PC计算机。
B.结果
出乎意料地，在未治疗小鼠中没有检测到可见的皮下组织团块(肿瘤)，而两只IgG1治疗小鼠显示注射部位局部轮廓的团块。
在尸检中，我们观察到两只对照小鼠中明显的脾肿大，而两只IgG1治疗小鼠没有显示肉眼可见的脾改变。为了更好的估算脾肿大，如下计算脾指数：[(脾重量/体重)×100]。有趣地是，与IgG1治疗裸鼠相比，未治疗裸鼠展示脾/体重比的2倍增加，如图32所示。此外，与IgG1治疗小鼠相比，对照小鼠中也可见微小的肝肿大。其他器官(心脏、肺、肾、脑、肠和胃)的肉眼检查未显示任何主要异常。
C.讨论
在第一个实验中，我们显示淋巴样干细胞对裸鼠的皮下注射可以导致淋巴瘤细胞在淋巴器官的传播(通过明显的脾肿大证明)，而原位注射的细胞看起来几乎全部迁移。在嵌合IgG1治疗小鼠中，我们报道了未出现脾肿大，伴随局部注射的淋巴瘤细胞群局限在原位的持久性。
根据当前数据，IgG1嵌合GNb AC1抗体能够通过其配体功效阻止淋巴瘤细胞的迁移。这些结果因此是有说服力的论断，本发明包括配体的IgG1嵌合抗体在治疗ENV阳性人肿瘤中是有效的治疗工具。
II.实验2：SCID小鼠模型中注射IgG1嵌合抗体形式的MSRV-ENV 结合配体后抗人B细胞淋巴瘤的细胞的细胞毒性的体内证据。
A.材料和方法
1.动物
无病原体的雌性SCID(严重联合免疫缺陷；没有功能性T和B淋巴细胞，含有减少的NK群)小鼠(6到8周龄，n＝5)购自Charles River，France。动物在标准亮暗循环的相同笼中喂养，可以随意获得食物和水，不打扰8天时间以便它们适应环境。所有步骤都遵守1986年11月24日的European Communities Council Directive(86/609/EEC)和1987年10月19日的National Council Directive(87848，″Ministere de I′Agriculture et de Ia Foret，Farnce″)。尽所有努力将使用动物的数目以及它们的痛苦降到最低。
2.细胞培养
淋巴瘤细胞系是Epstein-Barr病毒阳性细胞系，来自患有伯基特氏淋巴瘤的患者。细胞系在37℃下，5％的CO2，湿润环境下在RPMI 1640培养基(Sigma，France)中培养，所述培养基添加有10％胎牛血清(Invitrogen，France)，40U青霉素每ml和50μg链霉素每ml。
3.细胞注射和抗体施用
第一天P0，给所有SCID小鼠腹腔内注射15×107个Akata淋巴样干细胞(LC)。24h延迟后，3只对照小鼠接受腹腔内注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Lonza，France)，两只小鼠接受腹腔内注射100μg IgG1嵌合抗体。
4.组织学检查和细胞计数
在P7，通过过量戊巴比妥处死所有小鼠。
然后，将腹膜洗涤细胞收集在5ml PBS中。LC的活性测定基于腹膜液的台盼蓝染料染色。观察LC和其他白细胞，并用低功率显微镜计数。可以通过它们的形态轻易鉴别人伯基特氏淋巴瘤细胞，利用抗Eptein-Barr病毒单克隆(对潜在的表达蛋白特异)以及对人B细胞标记物特异的单克隆(未显示)进行的免疫细胞化学确认它们的特异性。
还对小鼠进行尸体解剖以评价解剖病理学异常的存在。具体来说，可能的脾改变通过如下计算的脾/体重比进行估算：[(脾重量/体重)×100]。
B.结果
所有小鼠的肉眼检查未显示明显肿瘤的存在，这与本研究非常短的持续时间吻合，通过淋巴瘤细胞注射后及随后抗体或模拟-注射短的延迟中解决抗体依赖的细胞毒性问题的必要性证明是合理的。但是，在两只对照小鼠中可以轻易检测到脾肿大，而两只IgG1治疗小鼠未显示肉眼可见的脾改变。与先前将相同细胞皮下注射裸鼠的实验一样，与IgG1治疗SCID小鼠相比，未治疗SCID小鼠显示脾/体重比的2倍增加(图32)。其他器官(心脏、肺、肾、脑、肠和胃)的肉眼检查未显示任何主要异常。
IgG1治疗小鼠的腹膜液分析显示，与对照小鼠相比，活的和死的淋巴瘤细胞数目均降低(图33A)。最有趣地是，在抗体注射6天后，从嵌合GNb AC1 IgG1治疗小鼠的腹膜腔收集的淋巴瘤细胞中约50％是死细胞。平行地，与对照小鼠相比，在IgG1治疗小鼠中观察到其他单核白细胞(在SCID小鼠主要是单核细胞来源的巨噬细胞细胞和少数NK细胞)数目的增加(图33B)。
C.讨论
在第二个实验中，我们观察到SCID小鼠中伯基特氏淋巴瘤细胞的腹腔内注射可以在7天后诱导脾肿大，与我们先前对裸鼠的研究中19天后显示相同的结果一致。有趣地是，IgG1治疗小鼠不显示这类脾肿大。
此外，(i)与非治疗动物相比，从腹膜腔收集的活淋巴瘤细胞数目的减少，(ii)死的恶性细胞的主要比例，(iii)其他单核白细胞数目的增加，这些组合在一起清楚表明对肿瘤细胞的抗体依赖的直接细胞毒作用或细胞介导的细胞毒作用。该作用因此反映(i)配体(结合表达目标表位的肿瘤细胞，所述目标表位在人肿瘤细胞上暴露的MSRV-ENV蛋白中)的特异性，如实施例8证明，和(ii)增加的IgG1同种型介导的体液免疫作用(参与肿瘤细胞破坏)。后一作用可以通过以下介导：例如，IgG1活性位点的补体激活，和，例如，通过结合肿瘤MSRV-ENV抗原的GNb AC 1IgG1与Fc受体的相互作用诱导的巨噬细胞杀肿瘤活性。
无论涉及该嵌合IgG1抗体作用的机制是什么，我们的结果显示在人肿瘤细胞临床前动物模型中淋巴瘤细胞增殖的抑制，从而证明抗ENV配体抗体在治疗这类ENV阳性癌症中的治疗潜力。
参考文献：
Johnson G， Wu TT.Kabat Database and its applications：future directions.Nucleic Acids Res 2001；29：205-6.Chothia C，Gelfand I，Kister A.Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain.J Mol Biol 1998；278：457-79.
Bech P，Rafaelsen OJ，Kramp P，Bolwig TG(1978)The mania rating scale：scale construction and inter-observer agreement.Neuropharmacology 17：430-431.
Edgar PP，Schwartz RD(1992)Functionally relevant gamma-aminobutyric acidA receptors：equivalence between receptor affinity(Kd) and potency(EC50)Mol Pharmacol 41：1124-1129.
Firouzi R，A.R，Michel M，E.J-M，Hauw JJ，Malcus-vocanson C，Lazarini F，Gebhurer L，Seigneurin JM，Touraine J，Sanhadji K，Marche P，Perron H(2003)Multiple Sclerosis Associated Retrovirus Particles Cause T-Lymphocyte Dependent Death with Brain Hemorrhage，in Humanized SCID Mice Model.Journal of Neurovirology 9：79-93.
Houenou J，Szoke A，Meary A，Loze J-Y，Mathieu M，Leboyer M，Schurhoff F(2007)Psychometric properties of the French version of the signs and symptoms of psychotic illness(SSPI)scale.Encephale 33：744-750.
Huang WM(1986)The 52-protein subunit of T4DNA topoisomerase is homologous to the gyrA-protein of gyrase.Nucleic Acids Res 14：7379-7390.
Janke C，Martin D，Giraud-Panis MJ，Decoville M，Locker D(2003)Drosophila DSP 1and rat HMGB 1have equivalent DNA binding properties and share a similar secondary fold.J Biochem 133：533-539.
Kane JM(1996)Treatment-resistant schizophrenic patients.J Clin Psychiatry 57Suppl 9：35-40.
Lamande SR，Bateman JF(1993)A type I collagen reporter gene construct for protein engineering studies.Functional equivalence of transfected reporter COL1A1 and endogenous gene products during biosynthesis and in vitro extracellular matrix accumulation.Biochem J 293(Pt2)：387-394.
McDonald Wl，Compston A，Edan G，Goodkin D，Hartung HP，Lublin FD，McFarland HF，Paty DW，Polman CH，Reingold SC，Sandberg-Wollheim M，Sibley W，Thompson A，van den Noort S，Weinshenker BY，Wolinsky JS (2001)Recommended diagnostic criteriafor multiple sclerosis：guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis.Ann Neurol 50：121-127.
Minuth T，Kramer B，Lehle K，Jaenicke R，Kohnert U(1998)The spectroscopic analysis，inhibition and binding studies demonstrate the equivalence of Erythrina caffra trypsin inhibitor and the recombinant substitution variant recSerETI.J Biotechnol 62：231-239.
Montgomery SA，Asberg M(1979)A new depression scale designed to be sensitive to change.Br J Psychiatry 134：382-389.
Perron H，Firouzi R，Tuke P，Garson JA，Michel M，Beseme F，Bedin F，Mallet F，Marcel E，Seigneurin JM，Mandrand B(1997a)Cell cultures and associated retroviruses in multiple sclerosis.Collaborative Research Group on MS.Acta Neurol Scand Suppl 169：22-31.
Perron  H，Garson  JA，Bedin F，Beseme  F，Paranhos-Baccala G，Komurian-Pradel F，Mallet F，Tuke PW，Voisset C，Blond JL，Lalande B，Seigneurin JM，Mandrand B(1997b)Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis.The Collaborative Research Group on Multiple Sclerosis.Proc Natl Acad Sci USA 94：7583-7588.
Perron H，Jouvin-Marche E，Michel M，Ounanian-Paraz A，Camelo S，Dumon A，Jolivet-Reynaud C，Marcel F，SouilletY，Borel E，Gebuhrer L，Santoro L，Marcel S，Seigneurin JM，Marche PN，Lafon M(2001)Multiple sclerosis retrovirus particles and recombinant envelope trigger an abnormal immune response in vitro，by inducing polyclonal Vbeta 16T-lymphocyte activation.Virology 287：321-332.
Rolland A，Jouvin-Marche E，Viret C，Faure M，Perron H，Marche PN (2006)The envelope protein of a human endogenous retrovirus-W family activates innate immunity through CD 14/TLR4 and promotes Th1-like responses.J Immunol176：7636-7644.**
Sardana VV，Emini EA，Gotlib L，Graham DJ，Lineberger DW，Long WJ，Schlabach AJ，Wolfgang JA，Condra JH(1992)Functional analysis of HIV-1 reverse transcriptase amino acids involved in resistance to multiple nonnucleoside inhibitors.J Biol Chem 267：17526-17530.
Stefas E，Rucheton M，Graafland H，Moynier M，Sompeyrac C，Bahraoui EM，Veas F(1997)Human plasmatic apolipoprotein H binds human immunodeficiency virus type  1and type 2 proteins.AIDS Res Hu m Retroviruses 13：97-104.
Stefas I，Rucheton M，D′Angeac AD，Morel-Baccard C，Seigneurin JM，Zarski JP，Martin M，Cerutti M，Bossy JP，Misse D，Graafland H，Veas F (2001)Hepatitis B virus Dane particles bind to human plasma apolipoprotein H.Hepatology 33：207-217.
Ullmann GM，Hauswald M，Jensen A，Knapp EW(2000)Structural alignment of ferredoxin and flavodoxin based on electrostatic potentials：implications for their interactions with photosystem I and ferredoxin-NADPreductase.Proteins 38：301-309.
Ullmann GM，Hauswald M，Jensen A，Kostic NM，Knapp EW(1997)Comparison of the physiologically equivalent proteins cytochrome c6 and plastocyanin on the basis of their electrostatic potentials.Tryptophan 63 in cytochrome c6 may be isofunctional with tyrosine 83 in plastocyan in.Biochemistry 36：16187-16196.
Verdoliva A，Ruvo M，Cassani G，Fassina G(1995)Topological mim icry of cross-reacting enantiomeric peptide antigens.J Biol Chem 270：30422-30427.
Wehrmann A，Van Vliet A，Opsomer C，Botterman J，Schulz A(1996)The similarities of bar and pat gene products make them equally applicable for plant engineers.Nat Biotechnol 14：1274-1278.
Xu GL，KapferW，Walter J，Trautner TA(1992)Bsu B I-an isospecificrestriction and modification system of Pstl：characterization of the BsuBI genes and enzymes.Nucleic Acids Res 20：6517-6523.
Yu H，Schurr MJ，Deretic V (1995)Functional equivalence of Escherichia coli sigma E and Pseudomonas aeruginosa AIgU：E.coli rpoE restores mucoidy and reduces sensitivity to reactive oxygen intermediates in algU mutants of P. aeruginosa.J Bacteriol 177：3259-3268.
Zabin HB，Horvath MO，Terwilliger TC(1991)Approaches to predicting effects of single amino acid substitutions on the function of a protein.Biochemistry 30：6230-6240.
Antony JM，Ellestad KK，Hammond R，Imaizumi K，MalletF，Warren KG，Power C(2007).The human endogenous retrovirus envelope glycoprotein，Syncytin-1，regulates neuroinflammation and its receptor expression in multiple sclerosis：a role for endoplasmic reticulum chaperones in astrocytes.J Immunol 179：1210-24.
Antony JM，van Marie G，OpiiW，Butterfield DA，Mallet F，Yong VW，Wallace JL，Deacon RM，Warren K，Power C(2004).Human endogenous retrovirus glycoprotein-mediated induction of redox reactants causes oligodendrocyte death and demyelination.Nat Neurosci 7：1088-95.
Blond JL，Beseme F，Duret L，Bouton O，Bedin F，Perron H，Mandrand B，Mallet F(1999).Molecular characterization and placental expression of HERV-W，a new human endogenous retrovirus family.J Virol 73：1175-85.
Cheynet V， Oriol G，Mallet F(2006).Identification of the hASCT2-binding domain of the Env ERVWE1/Syncytin-1 fusogenic glycoprotein.Retrovirology 3：41.
Christensen T，Dissing Sorensen P，Riemann H，Hansen HJ，Moller-Larsen A(1998).Expression of sequence variants of endogenous retrovirus RGH in particleform in multiple sclerosis.Lancet 352：1033.
Deb-Rinker P，Klempan TA，O′Reilly RL，Torrey EF，Singh SM(1999).Molecular characterization of a MSRV-like sequence identified by RDA from monozygotic twin pairs discordant for schizophrenia.Genomics 61：133-44.
Dolei A，Serra C，Mameli G，Pugliatti M，Sechi G，Cirotto MC，Rosati G，Sotgiu S(2002).Multiple sclerosis-associated retrovirus(MSRV)in Sardinian MS patients.Neurology 58：471-3.
Firouzi R，Rolland A，Michel M，Jouvin-Marche E，Hauw JJ，Malcus-Vocanson C，Lazarini F，Gebuhrer L，Seigneurin JM，Touraine JL，Sanhadji K，Marche PN，Perron H(2003).Multiple sclerosis-associated retrovirus particles cause T lymphocyte-dependent death with brain hemorrhage in humanized SCID mice model.J Neurovirol 9：79-93.
Flockerzi A，Ruggieri A，Frank O，Sauter M，Maldener E，Kopper B，Wullich B，Seifarth W，Muller-Lantzsch N，Leib-Mosch C，Meese E，Mayer J (2008).Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2)loci in human tissues and the need for a HERVTranschptome Project.BMC Genomics 9：354.
Garson JA，Tuke PW， Giraud P，Paranhos-Baccala G， Perron H(1998).Detection of virion-associated MSRV-RNA in serum of patients with multiple sclerosis.Lancet 351：33.
Karlsson H，Bachmann S，Schroder J，McArthur J，Torrey EF，Yolken RH(2001).Retroviral RNA identified in the cerebrospinal fluids and brains of individuals with schizophrenia.Proc Natl Acad Sci USA 98：4634-9.
Karlsson H，Schroder J，Bachmann S，Bottmer C，Yolken RH(2004).HERV-W-related RNA detected in plasma from individuals with recent-onset schizophtenia or schizoaffective disorder.Mol Psychiatry 9：12-3.
Kim HS(2001).Seq uence and phylogeny of H ERV-W pol fragments.AIDS Res Hum Retroviruses 17：1665-71.
Knerr I，Huppertz B，Weigel C，Dotsch J，Wich C，Schild RL，Beckmann MW, Rasch er W(2004).Endogenous retroviral Syncytin：compilation of experimental research on Syncytin and its possible role in normal and disturbed human placentogenesis.Mol Hum Reprod 10：581-8.
Komurian-Pradel F，Paranhos-Baccala G，Bed in F，Ounan ian-Paraz A，Sodoyer M，Ott C，Rajoharison A，Garcia E，Mallet F，Mandrand B，Perron H (1999).Molecular cloning and characterization of MSRV-related sequences associated with retrovirus-like particles.Virology 260：1-9.
Langbein M，Strick R，Strissel PL，Vogt N，Parsch H，Beckmann MW，Schild RL(2008).Impaired cytotrophoblast cell-cell fusion is associated with reduced Syncytin and increased apoptosis in patients with placental dysfunction.Mol Reprod Dev 75：175-83.
Laufer G，Mayer J，Mueller BF，Mueller-Lantzsch N，Ruprecht K(2009).Analysis of transcribed human endogenous retrovirus W env loci clarfies the origin of multiple sclerosis-associated retrovirus env sequences.Retrovirology 6：37.
Lavillette D，Marin M，Ruggieri A，Mallet F，Cosset FL，Kabat D(2002).The envelope glycoprotein of human endogenous retrovirus type W uses a divergent family of amino acid transporters/cell surface receptors.J Virol 76：6442-52.
Linial ML，Miller AD(1990).Retroviral RNA packaging：sequence requirements and implications.In：Retroviruses-strategies of replication.Swanstrom R，Vogt PK，(eds).Springer-Verlag：Berlin，pp 125-152.
Malassine A，Handschuh K，Tsatsaris V， Gerbaud P，Cheynet V， Oriol G，Mallet F，Evain-Brion D(2005).Expression of HERV-W Env glycoprotein (Syncytin)in the extravillous trophoblast of first trimester human placenta.Placenta 26：556-62.
Mallet F，Bouton O，Prudhomme S，Cheynet V，Oriol G，Bonnaud B，Lucotte G，Duret L，Mandrand B(2004).The endogenous retroviral locus ERVWE1 is a bona fide gene involved in hominoid placental physiology.Proc Natl Acad Sci USA 101：1731-6.
Mameli G， Astone V，Arm G，Marconi S，Lovato L，Serra C，Sotgiu S，Bonetti B，Dolei A(2007).Brains and peripheral blood mononuclear cells of multiple sclerosis(MS)patients hyperexpress MS-associated retrovirus /HERV-W endogenous retrovirus，but not Human herpesvirus 6.J Gen Virol 88：264-74.
Noorali S，Rotar IC，Lewis C，Pestaner JP，Pace DG，Sison A，Bagasra O (2009).Role of HERV-W Syncytin-1 in Placentation and Maintenance of Human Pregnancy.Appl Immunohistochem Mol Morphol.
Perron H，Bernard C，Bertrand JB，Lang AB，Popa I，Sanhadji K，Portoukalian J (2009).Endogenous retroviral genes，Herpesviruses and gender in Multiple Sclerosis.J Neurol Sci.
Perron H，Firouzi R，Tuke P，Garson JA，Michel M，Beseme F，Bedin F，Mallet F，Marcel E，Seigneurin JM，Mandrand B(1997a).Cell cultures and associated retroviruses in multiple sclerosis.Collaborative Research Group on MS.Acta Neurol Scand Suppl 169：22-31.
Perron H，Garson JA，Bedin F，Beseme F，Paranhos-Baccala G，Komurian-Pradel F，Mallet F，Tuke PW，Voisset C，Blond JL，Lalande B，Seigneurin JM，Mandrand B(1997b).Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis.The Collaborative Research Group on Multiple Sclerosis.Proc Natl Acad Sci USA94：7583-8.
Perron H，Jouvin-Marche E，Michel M，Ounanian-Paraz A，Camelo S，Dumon A，Jolivet-Reynaud C，Marcel F，SouilletY，Borel E，Gebuhrer L，Santoro L，Marcel S，Seigneurin JM，Marche PN，Lafon M(2001).Multiple sclerosis retrovirus particles and recombinant envelope trigger an abnormal immune response in vitro，by inducing polyclonal Vbeta16T-lymphocyte activation.Virology 287：321-32.
Perron H，Lalande B，Gratacap B，Laurent A，Genoulaz O，Geny C，Mallaret M，Schuller E，Stoebner P，Seigneurin JM(1991).Isolation of retrovirus from patients with multiple sclerosis.Lancet 337：862-3.
Perron H，Lazarini F，Ruprecht K，Pechoux-Longin C，S eilhean D，Sazdovitch V， Creange A，Battail-Poirot N，Sibai G， Santoro L，Jolivet M，Darlix JL，Rieckmann P，Arzberger T，Hauw JJ，Lassmann H(2005).Human endogenous retrovirus(HERV)-W ENV and GAG proteins：physiological expression in human brain and pathophysiological modulation in multiple sclerosis lesions.J Neurovirol 11：23-33.
Perron H，Mekaoui L，Bernard C，Veas F，Stefas I，Leboyer M(2008).Endogenous retrovirus type W GAG and envelope protein antigenemia in serum of schizophrenic patients.Biol Psychiatry 64：1019-23.
Perron H，Perin JP，Rieger F，Alliel PM(2000).Particle-associated retroviral RNA and tandem RGH/HERV-W copies on human chromosome 7q：possible components of a′chain-reaction′triggered by infectious agents in multiple sclerosis？J Neurovirol 6Suppl 2：S67-75.
Rasmussen HB，Perron H，Clausen J(1993).Do endogenous retroviruses have etiological implications in inflammatory and degenerative nervous system diseases？Acta Neurol Scand 88：190-8.
Rolland A，Jouvin-Marche E，Saresella M，Ferrante P，Cavaretta R，Creange A，Marche P，Perron H(2005).Correlation between disease severity and in vitro cytokine production mediated by MSRV (multiple sclerosis associated retroviral element)envelope protein in patients with multiple sclerosis.J Neuroimmunol 160：195-203.
Rolland A，Jouvin-Marche E，Viret C，Faure M，Perron H，Marche PN (2006).The envelope protein of a human endogenous retrovirus-W family activates innate immunity through CD14/TLR4 and promotes Th1-like responses.J Immunol176：7636-44.
Saresella M，Rolland A，Marventano I，Cavarretta R，Caputo D，Marche P，Perron H，Clerici M(2009).Multiple sclerosis-associated retroviral agent (MSRV)-stimulated cytokine production in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis.Mult Scler 15：443-7.
Serra C，Sotgiu S，Mameli G，Pugliatti M，Rosati G， Dolei A(2001).Multiple sclerosis and multiple sclerosis-associated retrovirus in Sardinia.Neurol Sci 22：171-3.
Sotgiu S，Arm G，Mameli G，Serra C，Pugliatti M，Rosati G，Dolei A (2006).Multiple sclerosis-associated retrovirus in early multiple sclerosis：a six-year follow-up of a Sardinian cohort.Mult Scler 12：698-703.
Sotgiu S，Serra C，Mameli G， Pugliatti M，Rosati G，Arm G，Dolei A (2002).Multiple sclerosis-associated retrovirus and MS prog nosis：an observational study.Neurology 59：1071-3.
Voisset C，Blancher A，Perron H，Mandrand B，Mallet F，Paranhos-Baccala G(1999).Phylogeny of a novel family of human endogenous retrovirus sequences，HERV-W，in humans and other primates.AIDS Res Hum Retroviruses 15：1529-33.
Voisset C，Bouton O，Bedin F，Duret L，Mandrand B，Mallet F，Paranhos-Baccala G(2000).Chromosomal distribution and coding capacity of the human endogenous retrovirus HERV-Wfamily.AIDS Res Hum Retroviruses 16：73-40.
Weis S，Llenos IC，Dulay JR，Verma N，Sabunciyan S，Yolken RH (2007).Changes in region-and cell type-specific expression patterns of neutral amino acid transporter 1(ASCT-1)in the anterior cingulate cortex and hippocampus in schizophrenia，bipolar disorder and major depression.J Neural Transm 114：261-71.
Yolken RH，Karlsson H，Yee F，Johnston-Wilson NL，Torrey EF(2000).Endogenous retroviruses and schizophrenia.Brain Res Brain Res Rev 31：193-9.
Bornstein，R.A.，S.B.Schwarzkopf等(1992).″Third-ventricle enlargement and neuropsychological deficitin schizophrenia.″Biol Psychiatry 31(9)：954-61.
Dickerson，F.，C.Stallings等(2007).″C-reactive protein is associated with the severity of cognitive impairment but not of psychiatric symptoms in individuals with schizophrenia.″Schizophr Res 93(1-3)：261-5.
Aalberse and Schu urman 2002，IgG4breaking the rules，Immunology.2002，105：9-19
Figure IPA00001328778700011
Figure IPA00001328778700031
Figure IPA00001328778700041
Figure IPA00001328778700051
Figure IPA00001328778700061
Figure IPA00001328778700081
Figure IPA00001328778700091
Figure IPA00001328778700101
Figure IPA00001328778700111
Figure IPA00001328778700121
Figure IPA00001328778700131
Figure IPA00001328778700141
Figure IPA00001328778700151
Figure IPA00001328778700171
Figure IPA00001328778700201
Figure IPA00001328778700211
Figure IPA00001328778700221
Figure IPA00001328778700231
Figure IPA00001328778700241
Figure IPA00001328778700251
Figure IPA00001328778700261
Figure IPA00001328778700271
Figure IPA00001328778700281
Figure IPA00001328778700301
Figure IPA00001328778700311
Figure IPA00001328778700321
Figure IPA00001328778700341
Figure IPA00001328778700351
Figure IPA00001328778700361
Figure IPA00001328778700371
Figure IPA00001328778700391
Figure IPA00001328778700401
Figure IPA00001328778700411

Claims (26)

1.一种配体，其包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列显示的各种互补决定区(CDR)，或
-在所述序列内具有下面所示数目的取代氨基酸的任意序列，CDR1(SEQ ID No.1)中0到3个，CDR2(SEQ ID No.2)中0到2个，CDR3(SEQ ID No.3)中0到2个，CDR4(SEQ ID No.4)中0到1个，CDR5(SEQ ID No.5)中0到4个，CDR6(SEQ ID No.6)中0到2个，或
-在SEQ ID No.1到SEQ ID No.6所示氨基酸序列内用具有等同化学功能和特性的其他氨基酸替代的氨基酸序列。
2.一种配体，包括：
-轻链可变区(VL)，其包括如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少80％同一性和更优选的90％同一性的任意序列，和
-重链可变区(VH)，其包括如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少80％同一性和更优选的90％同一性的任意序列。
3.配体，包括：
-轻链可变区(VL)，具有如SEQ ID No.7所示氨基酸序列，或与该序列具有至少75％同一性，更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列，和
-重链可变区(VH)，具有如SEQ ID No.8所示氨基酸序列，或与该序列具有至少75％同一性，更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列。
4.ScFV片段，包括如权利要求1到3所述的配体。
5.Fab片段，包括如权利要求1到3所述的配体。
6.一种抗体，包括如权利要求1到3所述的配体。
7.权利要求6的抗体，其特征在于，它是嵌合、改造或人源化的抗体。
8.权利要求6或7的抗体，其是IgG。
9.权利要求8的抗体，其是人IgG1或人IgG4。
10.一种药物组合物，包括作为活性成分的如权利要求1到3所述的配体、如权利要求4所述的scFV片段、如权利要求5所述的Fab片段或如权利要求6到9所述的抗体。
11.一种核酸分子，其包括如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18所示的至少一种全长核酸序列，或与所述序列具有至少70％和更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列，或与其100％互补的任意序列。
12.权利要求11的核酸分子，其包括如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的各种核酸序列，或与所述核酸序列具有至少70％和更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列，或与其100％互补的任意序列。
13.一种核酸，包括如SEQ ID No.10或12所示核酸序列中的至少一种全长序列，或与所述核酸序列具有至少70％和更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列，或与其100％互补的任意序列。
14.一种核酸，包括如SEQ ID No.9或11所示核酸序列中的至少一种全长序列，或与所述序列具有至少70％和更优选的80％和甚至更优选的90％同一性的任意序列，或与其100％互补的任意序列。
15.一种载体，包括如权利要求11到14中任意一项所述的核酸。
16.一种用权利要求15所述的载体转化的宿主细胞。
17.一种用于制造如权利要求1到3所述的配体、如权利要求4所述的ScFV片段、如权利要求5所述的Fab片段或如权利要求6到9所述的抗体的方法，包括在能够使配体、scFV抗体、Fab片段或抗体合成的条件下培养如权利要求16所述宿主细胞的步骤。
18.一种治疗方法，包括施用如权利要求1到3所述的配体、如权利要求4所述的scFV片段、如权利要求5所述的Fab片段或如权利要求6到9所述的抗体，或者药学上可接受形式的如权利要求1到3所述的配体、如权利要求4所述的scFV片段、如权利要求5所述的Fab片段或如权利要求6到9所述的抗体，或者如权利要求10所述的药物组合物。
19.权利要求18的治疗方法，用于治疗选自以下组的MSRV相关疾病：多发性硬化，精神分裂症，临床孤立综合征，慢性炎性脱髓鞘多神经病，癫痫症，银屑病，癌症，炎性胰腺炎和糖尿病，具体而言所述糖尿病是1型糖尿病。
20.权利要求18或19中任意一项所述的MSRV相关疾病的治疗方法，包括利用有规律地重复注射给药如权利要求9所述的IgG4或IgG1抗体作为慢性治疗。
21.抗配体，其特征在于它由以下序列组成：SEQ ID No.20或SEQ IDNo.32所示的氨基酸序列，与SEQ ID No.20或SEQ ID No.32所示氨基酸序列具有至少75％序列同一性的序列，或与SEQ ID No.20或SEQ IDNo.32所示氨基酸序列100％互补的任意序列。
22.一种检测生物样品中抗配体的方法，使用如权利要求1到3所述的配体、如权利要求4所述的scFV片段、如权利要求5所述的Fab片段或如权利要求6到9所述的抗体，包括以下步骤：
(a)将样品与权利要求1到3所述的配体、如权利要求4所述的scFV片段、如权利要求5所述的Fab片段或如权利要求6到9所述的抗体接触，(b)检测样品中抗配体的存在。
23.权利要求22的检测抗配体的方法，还包括以下步骤：
(c)将所述样品与特异性结合GAG抗原的配体接触。
24.一种检测生物样品中抗配体的免疫测定试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1到3所述的配体、如权利要求4所述的scFV片段、如权利要求5所述的Fab片段或如权利要求6到9所述的抗体，以及用于检测抗配体与上述配体、scFv、Fab片段或抗原的特异性结合的试剂。
25.权利要求24的检测生物样品中抗配体的免疫测定试剂盒，所述试剂盒还包括特异性结合GAG抗原的配体。
26.权利要求24或25的免疫测定试剂盒用于检测MSRV相关疾病的用途，所述MSRV相关疾病选自：多发性硬化，精神分裂症，临床孤立综合征，慢性炎性脱髓鞘多神经病，癫痫症，银屑病，癌症，炎性胰腺炎和糖尿病，具体而言所述糖尿病是1型糖尿病。
CN200980134828.3A 2008-07-08 2009-07-08 特异性配体在msrv相关疾病中的治疗用途 Active CN102143975B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12961308P 2008-07-08 2008-07-08
US61/129,613 2008-07-08
US20258109P 2009-03-13 2009-03-13
US61/202,581 2009-03-13
US21318909P 2009-05-15 2009-05-15
US61/213,189 2009-05-15
PCT/EP2009/058663 WO2010003977A1 (en) 2008-07-08 2009-07-08 Therapeutic use of specific ligand in msrv associated diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102143975A true CN102143975A (zh) 2011-08-03
CN102143975B CN102143975B (zh) 2014-12-31

Family

ID=41165692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980134828.3A Active CN102143975B (zh) 2008-07-08 2009-07-08 特异性配体在msrv相关疾病中的治疗用途

Country Status (24)

Country Link
US (4) US8715656B2 (zh)
EP (2) EP2315777B1 (zh)
JP (3) JP6058264B2 (zh)
KR (1) KR101682040B1 (zh)
CN (1) CN102143975B (zh)
AU (1) AU2009268025B2 (zh)
BR (1) BRPI0915667B8 (zh)
CA (1) CA2729869C (zh)
CY (2) CY1119185T1 (zh)
DK (1) DK3211005T3 (zh)
EA (1) EA024655B1 (zh)
ES (2) ES2875762T3 (zh)
HK (2) HK1158232A1 (zh)
HR (2) HRP20171067T1 (zh)
HU (2) HUE033803T2 (zh)
IL (1) IL210204A (zh)
LT (2) LT2315777T (zh)
MX (1) MX2010014319A (zh)
NZ (1) NZ590515A (zh)
PL (2) PL2315777T3 (zh)
PT (2) PT3211005T (zh)
SI (2) SI3211005T1 (zh)
WO (1) WO2010003977A1 (zh)
ZA (1) ZA201100446B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104684927A (zh) * 2012-10-02 2015-06-03 吉纳罗公司 用于治疗与herv-w包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物
CN106536550A (zh) * 2014-05-28 2017-03-22 吉纳罗公司 靶向人内源性反转录病毒的抗反转录病毒药物

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2064325B1 (en) 2006-09-01 2011-12-07 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
PT3211005T (pt) * 2008-07-08 2021-06-15 Geneuro Sa Utilização terapêutica de ligandos específicos nas doenças associadas a msrv
FR2945538B1 (fr) * 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
CN113862300A (zh) * 2015-10-29 2021-12-31 豪夫迈·罗氏有限公司 具有共同轻链的转基因兔
JP2018028538A (ja) * 2016-08-12 2018-02-22 公立大学法人名古屋市立大学 統合失調症とその関連疾患の診断用マーカー及びその使用
WO2019201908A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Geneuro Sa Method for the detection of the soluble hydrophilic oligomeric form of herv-w envelope protein
EP3916015A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-01 Geneuro SA Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases
CN113940993B (zh) * 2021-12-20 2022-02-22 深圳万可森生物科技有限公司 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m亚单位疫苗及其制备方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
DE69031711T2 (de) 1989-08-09 1998-04-09 Dekalb Genetics Corp Methoden und zusammensetzungen für die herstellung von stabil transformierten, fruchtbaren mais pflanzen und zellen dafür
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7473423B2 (en) * 1994-04-29 2009-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
JP2003512844A (ja) 1999-10-28 2003-04-08 ユニヴェルシテ・ドゥ・ジュネーブ 多発性硬化症関連スーパー抗原
JP5010281B2 (ja) * 2003-05-31 2012-08-29 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト Ｅｐｃａｍに対する二重特異性抗体を含む薬学的組成物
FR2865403B1 (fr) 2004-01-23 2009-06-12 Biomerieux Sa Composition pour le traitement d'une pathologie associee a la msrv/herv-w
NZ579543A (en) 2004-07-09 2011-07-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican 3 antibody
EP2145954A1 (en) 2004-09-06 2010-01-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-A33 antibody
JPWO2006067847A1 (ja) * 2004-12-22 2008-06-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
US8475798B2 (en) 2005-06-16 2013-07-02 Inhibitex, Inc. Monoclonal antibodies recognizing a coagulase-negative staphylococcal protein
US7741448B2 (en) 2005-06-21 2010-06-22 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. Antibody having inhibitory effect on amyloid fibril formation
FR2912314B1 (fr) 2007-02-09 2012-08-03 Geneuro Sa Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w.
PT3211005T (pt) * 2008-07-08 2021-06-15 Geneuro Sa Utilização terapêutica de ligandos específicos nas doenças associadas a msrv

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104684927A (zh) * 2012-10-02 2015-06-03 吉纳罗公司 用于治疗与herv-w包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物
CN105709224A (zh) * 2012-10-02 2016-06-29 吉纳罗公司 用于治疗与herv-w包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物
CN104684927B (zh) * 2012-10-02 2018-06-19 吉纳罗公司 用于治疗与herv-w包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物
CN105709224B (zh) * 2012-10-02 2020-06-05 吉纳罗公司 用于治疗与herv-w包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物
CN106536550A (zh) * 2014-05-28 2017-03-22 吉纳罗公司 靶向人内源性反转录病毒的抗反转录病毒药物
US10894820B2 (en) 2014-05-28 2021-01-19 Geneuro Sa Antiretroviral drug targeting human endogenous retrovirus
CN114276444A (zh) * 2014-05-28 2022-04-05 吉纳罗公司 靶向人内源性反转录病毒的抗反转录病毒药物

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110031969A (ko) 2011-03-29
JP2011527887A (ja) 2011-11-10
WO2010003977A1 (en) 2010-01-14
EA024655B1 (ru) 2016-10-31
JP6495361B2 (ja) 2019-04-03
CA2729869A1 (en) 2010-01-14
PL2315777T3 (pl) 2017-10-31
IL210204A0 (en) 2011-03-31
SI2315777T1 (sl) 2017-09-29
US9815888B2 (en) 2017-11-14
HRP20171067T1 (hr) 2017-10-06
IL210204A (en) 2015-03-31
PL3211005T3 (pl) 2021-11-29
BRPI0915667B8 (pt) 2021-05-25
KR101682040B1 (ko) 2016-12-02
US20170107274A1 (en) 2017-04-20
HUE054712T2 (hu) 2021-09-28
MX2010014319A (es) 2011-05-19
JP2015157812A (ja) 2015-09-03
CN102143975B (zh) 2014-12-31
US20110243962A1 (en) 2011-10-06
ES2633965T3 (es) 2017-09-26
HK1158232A1 (zh) 2012-07-13
HK1243436A1 (zh) 2018-07-13
NZ590515A (en) 2013-01-25
US20180057569A1 (en) 2018-03-01
BRPI0915667B1 (pt) 2020-10-13
BRPI0915667A2 (pt) 2017-01-17
EP3211005B1 (en) 2021-03-17
HRP20210892T1 (hr) 2021-11-26
SI3211005T1 (sl) 2021-06-30
DK3211005T3 (da) 2021-06-07
US10059758B2 (en) 2018-08-28
PT3211005T (pt) 2021-06-15
JP6058264B2 (ja) 2017-01-11
AU2009268025A1 (en) 2010-01-14
EP2315777A1 (en) 2011-05-04
PT2315777T (pt) 2017-07-25
JP6109869B2 (ja) 2017-04-05
US9550824B2 (en) 2017-01-24
LT2315777T (lt) 2017-10-25
LT3211005T (lt) 2021-08-25
EP3211005A1 (en) 2017-08-30
CA2729869C (en) 2018-02-13
US8715656B2 (en) 2014-05-06
ZA201100446B (en) 2012-01-25
HUE033803T2 (en) 2018-01-29
EP2315777B1 (en) 2017-04-26
ES2875762T3 (es) 2021-11-11
CY1119185T1 (el) 2018-02-14
EA201100160A1 (ru) 2011-08-30
CY1124281T1 (el) 2022-07-22
US20140220026A1 (en) 2014-08-07
JP2017158550A (ja) 2017-09-14
AU2009268025B2 (en) 2014-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102143975B (zh) 特异性配体在msrv相关疾病中的治疗用途
CA2703667C (en) Anti-rsv g protein antibodies
EP2231704B1 (en) Hepatitis c virus antibodies
KR101870277B1 (ko) 특히, 대숙주성 이식편병(gvhd)을 예방하기 위한 항 cd4 항체
JP2008508859A (ja) 狂犬病ウイルスを中和することができる結合分子およびそれらの用途
CN106132987A (zh) 抗乙型流感病毒血凝素抗体和使用方法
US20170158753A1 (en) Monoclonal antibodies directed against envelope glycoproteins from multiple filovirus species
US20190375825A1 (en) Antibodies that potently neutralize rsv and uses thereof
CN109641955A (zh) 人源化抗claudin-1抗体及其用途
CN107428819A (zh) 强力地中和狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒的抗体和其用途
CN104945505A (zh) 抗体组合物及使用方法
CN109475625A (zh) 用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的组合物和方法
CN105934443A (zh) 抗h7病毒抗体治疗h7n9流感
WO2021070883A1 (ja) Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）のヒト肝細胞への感染を阻害できるヒトｎｔｃｐに結合する抗体
CA3224804A1 (en) Neutralizing antibodies against sars-cov-2 and uses thereof
US20240101645A1 (en) Monoclonal antibodies against coronaviruses and uses thereof
EP4282880A1 (en) Fully human broad-spectrum neutralizing antibody 76e1 against coronavirus, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1158232

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1158232

Country of ref document: HK