CN102164942A - 三萜系化合物及其使用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了作为受体拮抗剂的治疗活性化合物和组合物及其使用方法。在一方面，所述化合物通过抑制包括PGE2 EP1、EP2和EP4受体在内的PGE2受体而用于缓解疼痛、炎症和急性期反应。

Description

三萜系化合物及其使用的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年9月19日递交的第61/098,666号美国临时专利申请的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文中并用于所有目的。
发明背景
PGE2属于前列腺素类(PG)家族，其实际上是在所有组织和器官中发现的一组生物活性化合物。通过环加氧酶使膜脂质、花生四烯酸新陈代谢为中间体PGH2来合成它们，所述中间体PGH2然后充当用于产生五个前列腺素类化合物的底物：PGE2、PGF2、PGD2、PGI2(前列环素)和TxA2(血栓烷A2)(Romanovsky et al.(2005)Fever and hypothermia in systemic inflammation：recent discoveries and revisions(系统性炎症中的发热和低体温：目前的发现和修订)Front Biosci.10：2193-2216)。PG在人体中具有多种功能，包括调节血压、凝血和睡眠。然而，它们也在疼痛和炎症的介导和调节中起主要作用，并由此成为NSAID(非甾体抗炎药)的靶点。
通过多种酶合成PGE2，所述酶包括许多的磷脂酶(PL)A2、环加氧酶(COX)-1和(COX)-2，以及数个新开发的终端PGE合酶。PGE2涉及重要的生物事件，例如雌性生殖、神经元功能、炎症、血管性高血压、肿瘤发生、肾功能，并且还在炎症和神经疾病中起关键作用(Kobayashi et al.，(2002)In vivo progestin treatments inhibit nitric oxide and endothelin-1-induced bovine endometrial prostaglandin(PG)E(PGE)secretion in vitro(体内孕酮治疗抑制了一氧化氮和内皮素-1诱导的牛体外的子宫内膜前列腺素(PG)E(PGE)分泌物)Prostaglandin and Other Lipid Medial；68-69：557-574)。PGE2通过称为EP1、EP2、EP3和EP4的四个G-蛋白偶联受体亚型发挥其作用，PGE2以相似亲和力与它们相连(Narumiya et al，(1999)Prostanoid receptors：structures，properties，and functions(前列腺素受体：结构、性质和功能)Physiol Rev.79：1193-1226)。
四种不同的受体亚型导致不同的功能性应答(Breyer et al.，(2001)Prostanoid receptors：subtypes and signaling(前列腺素受体：亚型和信号)Annu Rev Pharmacol Toxicol.41：661-690)。由于击昏小鼠研究导致降低的疼痛敏感性(Stock et al.，2001)，并且EP1拮抗剂降低了神经性疼痛的慢性压迫性损伤(CCI)模型中的痛觉过敏和异常性疼痛(Kawahara et al.，2001)，所以已经显示出EP1受体介导原痛觉(pro-algesic)应答。类似地，研究显示EP3受体拮抗剂也是止痛剂(Hosoi et al.，Prostaglandin E receptor EP3  subtype is involved in thermal hyperalgesia through its actions in the preoptic hypothalamus and
已经将通过EP2受体发信号的PGE2结合至在家族AD模型中(Liang et al，(2005)Deletion of the prostaglandin E2 EP2 receptor reduces oxidative damage and amyloid burden in a model of Alzheimer’s disease(在阿尔兹海默病模型中，前列腺素E2 EP2受体的缺失降低氧化损伤和淀粉样沉积)J Neurosci.25(44)：10180-7)沿阿尔兹海默病(AD)病理学的前炎症和淀粉样病变前期的通路，同时已经显示出在AD的发病机理中EP2和EP4受体的激活涉及β淀粉样多肽(Abeta)的体内产生(Hoshino et al.，(2007)Involvement of prostaglandin E2 in production of amyloid-beta peptides both in vitro and in vivo(体外和体内β淀粉样多肽产生所涉及的前列腺素E2)J Biol Chem.282：32676-32688)。
在前炎症应答中，目前的研究已经涉及EP4受体。已经显示出EP4受体信号涉及在类风湿关节炎中增加的炎症和疾病进展(McCoy et al.，(2002)The role of prostaglandin E2 receptors in the pathogenesis of rheumatoid arthritis(前列腺素E2受体在类风湿关节炎的发病机理中的作用)J Clin.Invest.110，pp.651-658)，而对EP4受体拮抗剂的研究已经证明在体外和动物模型中降低了炎症性疼痛。关于EP4拮抗剂以及EP4降低研究的调查导致炎症诱导的热和机械行为高度过敏的降低以及对辣椒素引起的体外DRG神经元电流的致敏作用的降低(Lin et al.，(2006)Prostaglandin E2 receptor EP4 contributes to inflammatory pain hypersensitivity(前列腺素E2受体EP4促进炎症性疼痛高度过敏)J Pharmacol Exp Ther.319：1096-103)。在其它研究中，给予佐剂诱导的关节炎大鼠的EP4受体拮抗剂将爪肿胀转化为正常水平(Murase et al.，(2008)Effect of prostanoid EP4 receptor antagonist，CJ-042,794，in rat models of pain and inflammation(前列腺素EP4受体拮抗剂CJ-042,794，在疼痛和炎症大鼠模型中的作用)Eur J Pharmacol.580：116-121)。因此，EP4受体是炎症和疼痛药理治疗的潜在靶点。
目前的研究已经证明EP2-EP4信号促进了T辅助(Th)1细胞分化，并且EP4信号是在Th17细胞的扩增中产生IL-23所必不可少的(Yao et al.，(2009)Prostaglandin E2-EP4 signaling promotes immune inflammation through Th1 cell differentiation and Th17 cell expansion(前列腺素E2-EP4信号通过Th1细胞分化和Th17细胞扩增来促进免疫性炎症)Nat.Med.15：633-640)。它们显示出每日口服给予(每日两次)EP4拮抗剂(ONO-AE3-208)能够抑制表现出多发性硬化样症状的实验性小鼠模型的症状，所述模型称为实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是用于多发性硬化(MS)的免疫介导影响的最常用的动物模型，将其用来研究轴突脱脊髓进展并通过候选化合物检测潜在的治疗作用效果(Gold et al.，(2006)Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models：70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research(通过动物模型理解多发性硬化的发病机理和疗法：在实验性自身免疫性脑脊髓炎研究中的70年的优点和缺点)Brain.129：1953-1971)。
在其中将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)直接注射到动物中的活性EAE模型中，EAE的慢性进展形式显示出对免疫的应答。MOG是在中枢神经系统的少突胶质细胞表面上表达的跨膜蛋白。将其用作促进脱脊髓作用的靶点抗原，所述脱脊髓作用导致在小鼠中发现多发性硬化(MS)样症状(Silber and Sharief，(1999)Axonal degeneration in the pathogenesis of multiple sclerosis(在多发性硬化发病机理中的轴突变性)J.Neurol.Sci.170：11-18)。在产生MOG时，在7至10日内，症状表现发生在任何地方。基于前述公开的文献，以9点计分量表给出临床评分(Stromnes and Goverman，(2008)Active induction of experimental allergic encephalomyelitis(实验性变态反应性脑脊髓炎的活性引入)Nat.Protoc.1：1810-1818)。
在EAE模型中有数个必须研究的分子靶点，以便证明候选化合物在变为用于治疗自身免疫病的潜在治疗剂中的效力(Sloane et al.，(2009)Anti-inflammatory cytokine gene therapy decreases sensory and motor dysfunction in experimental multiple sclerosis：MOG-EAE behavioral and anatomical symptom treatment with cytokine gene therapy(抗炎细胞因子基因治疗降低了实验性多发性硬化的感知和动力机能障碍：用细胞因子基因治疗MOG-EAE行为和组织症状)Brain，Behav.Immunity.22：600-605)。细胞因子是一种这样的靶点，其中许多研究显示与EAE的活性期一致的骨髓病炎症细胞因子增加，例如干扰素-γ(IFN-γ)(Zaheer et al.，(2007)Diminished cytokine and chemokine expression in the central nervous system of GMF-deficient mice with experimental autoimmune encephalomyelitis(在具有实验性自身免疫性脑脊髓炎的GMF-缺陷小鼠的中枢神经系统中减少的细胞因子和趋化因子表达)Brain Res.1144：239-247)。
细胞因子是小分泌蛋白，其介导和调节免疫、炎症和造血作用并被认为是EAE疾病进展的关键信号分子之一。在对免疫刺激应答时它们必须重新生成。在EAE中观察到的免疫应答被认为是通过T辅助(Th)1通路介导的，并且干扰素-γ(IFN-γ)是Th1免疫应答的标志细胞因子(Muthian et al.，(2006)1，25 Dihydroxivitamin-D3 modulates JAK-STAT pathway in IL-12/INF-γ axis leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis(1，25二羟微生物(Dihydroxivitamin)-D3调节导致实验性变态反应性脑脊髓炎的Th1应答的IL-12/INF-γ轴中的JAK-STAT通路)J.Neurosci.Res.83：1299-1309)。因此，能够降低诸如IFN-γ的细胞因子的量对于确定化合物作为用于EAE模型并最终治疗诸如多发性硬化的自身免疫病的潜在治疗剂的有效性是必须的。
现在，已经表明其它不同的称为Th17通路的辅助T子集作为自身免疫性病理的长期介质(Narumiya et al.，(2009)Prostaglndin E2-EP4 signaling promotes immune inflammation through Th1 cell differentiation and TH17 cell expansion(前列腺素E2-EP4信号通过Th1细胞分化和TH17细胞扩增促进了免疫性炎症)Nat.Med.15：633-640)。以前，在诸如EAE和MS的疾病中看到的T-细胞介导的免疫应答被认为是由Th1通路单独导致的。然后，现在的证据观点倾向于Th1/Th2与新发现和指定的Th17通路之间更多的复杂的平衡。已经表明虽然开始的病理应答仍然通过Th1通路开始，但通常在自身免疫病中观察到的持续的组织损伤是由Th17通路介导的(Steinman，(2007)A briefhistory of TH 17，the first major revision in the TH 1/Th2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage(TH17的简要历史，T-细胞介导的组织损伤的TH1/Th2假说的第一次重大修订)Nat.Med.13：139-145)。认为Th17分化的启动涉及TGF-β和IL-6，其反过来激活孤儿核受体RORγt(Korn et al.，2009IL-17和Th17(IL-17和Th17)cells.Annu.Rev.Immunol.27：485-517)。RORγt是IL-17的转录因子，过去已经广泛地证实了其在组织炎症和自身免疫性应答中的作用。
白介素-6(IL-6)是免疫应答中前炎症反应急性期的另一关键细胞因子。IL-6通过反过来激活JAK-STAT通路的细胞表面I型细胞因子受体配合物来发信号(Khoury et al.，(2005)Cytokines in multiple sclerosis：form bench to bedside(多发性硬化的细胞因子：从实验台到临床)Pharm.Ther.106：163-177)。另外，认为IL-6是T辅助(Th)17分化以及转化生长因子-β(TGF-β)和白介素-23(IL-23)的辅因子之一。
其它主要分子靶点是信号转导和转录激活因子(STAT)蛋白通路。STAT蛋白是涉及细胞存活、分化、前炎症反应和细胞因子信号的核蛋白。其是具有通过不同细胞因子激活的各个STAT蛋白的七元蛋白家族。另外，STAT蛋白是Janus(JAK)-STAT通路的一部分，所述通路是细胞因子和生长因子的主要信号通路之一。
当通过IL-6激活STAT3时，STAT3改变位置至核中，在核中其诱导基因表达(Ihle.(2001)The Stat family in cytokine signaling(细胞因子信号的Stat家族)Curr.Opin.Cell Biol.13：211-217)。认为STAT4是被IL-12激活的，并且敲除STAT4小鼠的研究显示其具有对获得性免疫依赖的受损的Th1应答(Bright et al.，(2008)Stat 4 isoforms differentially regulate inflammation and demyelination in experimental allergic encephalomyelitis(Stat 4异构体分别调节实验性变态反应性脑脊髓炎的严重和脱髓鞘作用)J.Immun.181：5681-5690)。通过IL-4和IL-13激活STAT6，并且缺少STAT6基因的小鼠已经显示出具有对体液免疫依赖的受损的Th2应答(Takeda and Akira.，(2000)STAT family of transcription factors in cytokine-mediated biological responses(细胞因子介导的生物应答的转录因子的STAT家族)Cytokine & Growth Factor Rev.11：199-207)。特别地，已经将STAT3与诸如多发性硬化和EAE的疾病联系，其中在EAE的急性期已经检测出了高水平的STAT 3(Yang et al.，STAT3 regulates cytokine-meidated generation of inflammatory helper T cells(STAT3调节了细胞因子介导的炎症性T辅助细胞的产生)J.Biol.Chem.282：9358-9363)。
除了诸如自身免疫病的慢性形式的炎症，急性炎症也是有机体使用的最基本的防卫机理之一。主要通过巨噬细胞和树突细胞引发急性炎症。在引入过敏原时，这些免疫细胞增加引发诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和INF-γ的细胞因子的前炎症应答。也增加了来自血管舒张的血流量。这种血流量的增加导致了炎症点周围的水肿和肿胀的形成。在前炎症细胞因子的内毒素诱导的体内模型(Tang et al.，(2007)LPS-induced TNF-alpha factor(LITAF)-deficient mice express reduced LPS-induced cytokine：Evidence for LITAF-dependent LPS signaling pathway(LPS-诱导的TNF-α因子(LITAF)-缺陷小鼠表达了降低的LPS-诱导的细胞因子：LITAF-依赖的LPS信号通路的证据)PNAS.103：13777-13782)和过敏原诱导的水肿形成中(Tamura et al.，(2004)Effects of olopatadine hydrochloride，an antihistamine drug，on skin inflammation induced by repeated topical application of oxazolone in mice(抗组胺药，盐酸奥洛他定对由对小鼠反复局部应用噁唑酮诱导的皮肤炎症的影响)Br.J.Dermatol.151(6)：1133-1142)测试许多潜在的免疫介导物质。
N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体是主要位于中枢神经系统(CNS)中的配体门控离子通道。它们属于离子型谷氨酸受体家族并由于能够表达的亚组-NR1、NR2(NR2A、NR2B、NR2C、NR2D)和NR3的不同组合而以多个亚型的形式存在。除了激动结合位点外，NMDA受体还具有用于增强、调节和抑制受体活性的多种化合物的多个不同的结合位点。
已知NMDA受体涉及神经元通讯并在突触可塑性和学习与记忆的机理中起重要作用。在正常条件下，NMDA受体通过神经递质谷氨酸调节突触传送，其调节和精修突触的生长和可塑性。然而，当存在异常的高水平谷氨酸(即在生理条件下)时，NMDA受体变为过度活化的，导致过量的Ca2+大量涌入神经元细胞，这又导致引发神经元凋亡的几个信号通路的兴奋性中毒和激活。谷氨酸诱导的脑组织中的细胞凋亡也伴随引起ATP减少、线粒体膜电位降低和导致相关的细胞损伤和死亡的反应活性氧类和反应活性氮类(例如H2O2、NO、OONO-、O2 -)释放的氧化应激。最终发生神经元功能降低和神经元细胞死亡。如果损害细胞的能量代谢，则兴奋性中毒也发生。
NDMA受体的过度活化与神经退行性疾病和其它神经相关的疾病状态有关，因为其导致神经元丢失和认知损伤，并且还对导致多种神经组织退化病症和诸如中风的疾病状态的神经元损伤的最终的共同通路起作用，所述病症，例如肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、阿尔兹海默病和亨廷顿舞蹈病。最近的发现已经暗示NMDA受体与许多其它神经病学病症，例如多发性硬化、脑瘫(脑室周围白质软化)和脊髓损伤，以及慢性和重度心境障碍有关(Mathew SJ et al.，Rev Bras Psiquiatr，27：243-248(2005))。
例如，已经发现谷氨酸兴奋性中毒与MS的炎症自身免疫性脱髓鞘作用相关。疾病病理学涉及由于对中枢神经系统的炎症性攻击导致的髓磷脂、少突胶质细胞和轴突的缺失。数个研究表明MS病理的过量谷氨酸的作用(Flanagan et al.(1995)Neurotoxin quinolinic acid is selectively elevated in spinal cords of rats with experimental allergic encephalomyelitis(在具有实验性变态反应性脑脊髓炎的大鼠脊髓中选择性地提高神经毒素喹啉酸)Journal of Neurochemistry；64(3)：1192-1196)；Sarchielli et al.，(2003)Excitatory amino acids and multiple sclerosis：evidence from cerebrospinal fluid(兴奋性氨基酸和多发性硬化：来自脑脊髓液的证据)Archives of Neurology.2003；60(8)：1082-1088)。
也已经在从患MS的患者得到的脑脊髓液中观察到了过度的谷氨酸水平(Stover et al.(1997)Neurotransmitters in cerebrospinal fluid reflect pathological activity(脑脊髓液中的神经递质反映了病理活性)European Journal of Clinical Investigation.27(12)：1038-1043)。此外，对诸如美金刚的NMDA受体拮抗剂的研究导致MS发病机理的抑制以及神经血管功能的改善(Paul和Bolton(2002)Modulation of blood-brain barrier dysfunctionand neurological deficits during acute experimental allergic encephalomyelitis by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist memantine(在急性实验性变态反应性脑脊髓炎期间，通过N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂美金刚调节血脑屏障机能障碍和神经病学缺陷)The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.2002；302(1)：50-57)。因此，为拮抗NMDA受体功能而设计的化合物能够潜在地为MS患者提供治疗益处并且目前正在开发中(Farrell et al.(2005)Emerging therapies in multiple sclerosis(多发性硬化的紧急疗法)Expert Opin Emerg Drugs.2005；10(4)：797-816)。
黑皮质素(MC)受体属于G蛋白偶联受体类。更具体地，它们是一组垂体肽激素，其包括促肾上腺皮质激素(ACTH)和α、β和γ促黑素细胞激素(MSH)。它们来自激素原阿黑皮素原(Adan et al.，(2000)Melanocortins and the brain：from effects via receptors to drug targets (黑皮质素和大脑：从通过受体发挥作用到药物靶点)Eur J Pharmacol 405：13-24)。MC通过许多设定的MC1至MC5的黑皮质素受体发挥作用。MC1受体在巨噬细胞和单核细胞、角化细胞和黑素细胞、内皮细胞、神经胶质瘤细胞和星形胶质细胞以及垂体和导水管四周灰质中表达，其中它们涉及黑素生成和抗炎过程(Kang et al.，(2006)A selective small molecule agonist of the melanocortin-1 receptor inhibits lipopolysaccharide-induced cytokine accumulation and leukocyte infiltration in mice(黑皮质素-1受体的选择性的小分子激动剂抑制了小鼠中脂多糖诱导的细胞因子聚集和白细胞渗透)J Leukoc Biol 80：897-904；和Slominski et al.，(2004)Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation(哺乳动物皮肤的黑色素沉着及其激素调节)Physiol Rev 84：1155-228)。
ACTH结合至MC2受体(ACTH受体)并且主要在肾上腺和肾上腺皮质中表达。而MC3在外周组织和神经组织中都表达，主要在CNS中发现MC4，并且其是第二神经MC受体，因为它们在包括皮层、丘脑、下丘脑、脑干和脊髓在内的大脑的多个区域中表达。所述受体也在室旁核中高度表达，并且涉及垂体功能的调节。与MC4高度类似的MC5是在骨骼肌中发现的唯一的MC受体。其在外周组织中广泛表达，也存在于特定的大脑区域。
已经将MC4受体活性连续至神经突起生长和末梢神经再生(Tanabe et al.，(2007)Melanocortin receptor 4 is induced in nerve-injured motor and sensory neurons of mouse(在小鼠的运动神经损伤和感觉神经元中诱导黑皮质素受体4)J Neurochem 101：1145-52；和Adan et al.，(1996)脑缺血中风的黑皮质素受体介导和神经保护(Giuliani et al.，2006)，和星形胶质细胞中的炎症应答(Caruso et al.，(2007)Activation of melanocortin 4 receptors reduces the inflammatory response and prevents apoptosis induced by lipopolysaccharide and interferon-gamma inastrocytes(黑皮质素4受体的激活降低了炎症应答并阻止了由星形胶质细胞中的脂多糖和干扰素-γ诱导的细胞凋亡)Endocrinology 148：4918-26)。
DA001还诱导在皮层神经细胞培养基中CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP-b)mRNA的表达。C/EBP-b是涉及免疫和炎症应答的基因的调节的重要的转录活化因子。其特别连接至IL-6基因的IL-1应答元件，并被认为是在急性期反应、炎症和造血作用的调节中起作用。其也涉及包括肝细胞、脂肪细胞和皮肤细胞在内的多种细胞类型的分化过程(Sebastian和Johnson的综述，(2006)Stop and go：anti-proliferative and mitogenic functions of the transcription factor C/EBPbeta(停和走：转录因子C/EBP-β的抗增生和促有丝分裂功能)Cell Cycle 5(9)：953-7；以及Kalvakolanu和Roy，(2005)CCAAT/enhancer binding proteins and interferon signaling pathways(CCAAT/增强子结合蛋白和干扰素信号通路)J Interferon Cytokine Res.25(12)：757-69)。用于靶向的无效突变的同质接合子表现出出生后致死性和未成年死亡。在神经元中，其涉及神经营养因子和神经元分化(Stemeck and Johnson，(1998)CCAAT/enhancer binding protein beta is a neuronal transcriptional regulator activated by nerve growth factor receptor signaling(CCAAT/增强子结合蛋β是由神经生长因子受体信号激活的神经元转录调节因子)J Neurochem.70(6)：2424-33；Menard et al.，(2002)An Essential Role for a MEK-C/EBP Pathway during Growth Factor-Regulated Cortical Neurogenesis(对生长因子调节的皮层神经形成期间的MEK-C/EBP通路的基本作用)Neuron 36，597-610；和Cortés-Canteli et al.，(2002)CCAAT/enhancer-binding protein beta plays a regulatory role in differentiation and apoptosis of neuroblastoma cells(CCAAT/增强子结合蛋白β在成神经瘤细胞的分化和细胞凋亡中起调节作用)J Biol Chem.277(7)：5460-7)。
目前，已经报道了C/EBP-b的新颖的细胞存活功能。在细胞死亡发作之前C/EBP-b的活性丢失，并且由缺氧诱导的皮层神经元中的病理应答涉及C/EBP-b-介导的存活信号(Halteman et al.，(2008)Loss of c/EBP-beta activity promotes the adaptive to apoptotic switch in hypoxic cortical neurons(c/EBP-β活性损失促进了对接入缺氧皮层神经元的细胞凋亡的适应性)MoI CellNeurosci.38(2)：125-37)。另一方面，C/EBP-b也是通过转录地激活再生相关基因表达来对神经元损伤应答所必须的(Nadeau et al.，(2005)A transcriptional role for C/EBP beta in the neuronal response to axonal injury(C/EBP-β在对轴突损伤的神经元应答中的转录作用)MoI Cell Neurosci.29(4)：525-35)。因此，C/EPB-b可以在DA001介导的活性中起作用。
因此，亟需开发其它有效的受体拮抗剂，例如NMDA、MC和PGE2受体拮抗剂，其具有高效能，并且能够预防、治疗和/或改善炎症和/或疼痛、中枢神经系统病症和其它疾病和疾病状态。本发明满足了这一需求和其它需求。
发明简述
本发明提供了一组表现出治疗作用的三萜系化合物。它们具有通过PG受体、NMDA受体和黑皮质素受体以调节疼痛和介导抗炎应答的潜力。
本发明的化合物和设计的DA化合物抑制了E型前列腺素(PGE2)与其受体家族而不是其它前列腺素受体的配体结合。此外，3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆-28-酸(DA001)特别地抑制PGE2的EP1和EP4受体，并且更弱地抑制EP2受体，其涉及炎症和淀粉样病变应答。
这些化合物也表现出对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的明显改善，EAE为在CNS和脊髓中表现出多发性硬化(MS)样炎症的常用模型。由于在这种特殊类型的EAE模型中发生的轴突损伤的性质，已知很少的治疗剂对改善EAE症状有效。然而，口服给予DA化合物减弱了EAE小鼠的神经病学缺陷。所述化合物也抑制了干扰素-γ(IFN-γ)在从EAE小鼠中分离的脾细胞中的水平。
此外，用CNS抗原再刺激分离的EAE脾细胞增加了前炎症STAT蛋白和细胞因子的表达，并且这能够通过外源性添加本发明的化合物和DA化合物被有效地抑制。另外，这些化合物也抑制了细菌和过敏原诱导的炎症。本发明的化合物共同在治疗多发性硬化和其它炎症疾病中表现出治疗作用。
在一个方面，本发明提供了式(I)的化合物或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体：
Figure BPA00001331005300121
其中：
R1是-H、烷基-C(O)-或芳基烷基-C(O)-；
R2选自羟基-C1-4烷基、烷氧基-C1-4烷基、芳氧基-C1-4烷基、烷基-C(O)O-C1-4烷基和芳基烷基-C(O)O-C1-4烷基；
R3选自-NH2、-NHRa、-N(Ra)2、-OH和-ORb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基、芳基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基；其中R3取代基的脂肪族部分任选地被1至2个Rc取代基取代，Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、烷氧基、芳基烷氧基、卤素、烷基-C(O)O-、芳基烷基-C(O)O、芳基-C(O)O、烷基-C(O)NH-、芳基烷基-C(O)NH-、芳基-C(O)NH-、烷基氨基或二烷基氨基；或者任选地任意两个相邻的Rc取代基与和它们相连的原子一起形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5或6元杂环，其中杂环任选地被1至2个C1-8烷基取代；
R4是C1-4烷基、卤代烷基、羟基烷基、烷基-C(O)O-C1-4烷基、芳基烷基-NH-C1-4烷基或烷氧基烷基；
其中R3或R4基团的芳香族部分任选地被1至2个Rd取代基取代，Rd取代基选自卤素、-CN、-NO2、-OH、-Re、-ORe、-OC(O)NHRe、-OC(O)N(Re)2、-OC(O)Re、-OC(O)H、-NH2、-NHRe、-N(Re)2、-S(O)2Re、-SO2NH2、-SO2NHRe、-SO2N(Re)2、-NHS(O)2Re、-NReS(O)2Re、-C(O)NH2、-C(O)NHRe、-C(O)N(Re)2、-C(O)H、-C(O)Re、-NHC(O)Re、-NReC(O)Re、-CO2Re、-NHCO2Re和-NReCO2Re，其中每一Re独立地为C1-8烷基；并且
前提是当R1为-H或CH3C(O)-，R2为-CH2OH或-CH2OC(O)CH3并且R4为-CH3或HOCH2-时，R3不是-OH、-OMe、-OEt、-NHCH2Ph、-O(CH2)2OH、-CH2CH(OH)CH2(OH)或2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基-甲基。
在其它方面，本发明提供了式(IA)的化合物或者其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体：
Figure BPA00001331005300131
其中
R12选自羟基烷基、烷基-OC(O)-、芳基-C1-4烷基-OC(O)-、烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷氧基或烷氧基烷基，其中其芳基部分任选地被选自卤素、烷基、芳基-C1-4烷基、羟基烷基、烷氧基、芳基-C1-4烷氧基、烷基-OC(O)-、烷基-C(O)O-、芳基-C1-4烷基-C(O)O-、芳基-C1-4烷基-OC(O)O-、烷氧基烷基或芳基-C1-4烷氧基-烷基的1至3个取代；并且R13选自C2-6烯基或C2-6环氧烷基，去各自任选地被选自-OH、-OC1-6烷基、芳基-C1-4烷基、烷基-C(O)O-、芳基-C1-4烷基-C(O)O-的1至3个取代。
在另一方面，本发明提供了抑制PGE2受体活性的方法。所述方法包括将式(I)的化合物或式(II)的化合物或DA001至090任意的化合物与细胞或PGE2受体接触。式(II)的化合物具有下列结构：
R5、R7、R8和R9各自独立地为C1-4烷基；
R6选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X1CN、-X1NO2、-X1C(O)Ra、-CRb＝NORc、-X1CO2Rc、-X1C(O)NRcRd、-X1C(NRcRd)＝NRc、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1ORe、-X1SRe、-X1NHRe和-X1N(Re)2以及-X1Re，其中每一X1独立地为键或C1-4亚烷基，其中每一Re独立地为被1至3个Rf取代的C1-6烷基、卤代烷基、芳基C0-6烷基或环烷基，并且其中Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H、C1-6烷基或芳基-C1-6烷基；其中每一R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中Rf选自卤素、CN、NO2、-OH、-Rg、-ORg、-OC(O)NHRg、-OC(O)N(Rg)2、-OC(O)Rg、-OC(O)H、-NH2、-NHRg、-N(Rg)2、-SH、-SRg、-S(O)2Rg、-SO2NH2、-SO2NHRg、-SO2N(Rg)2、-NHS(O)2Rg、-NRgS(O)2Rg、-C(O)NH2、-C(O)NHRg、-C(O)N(Rg)2、-C(O)H、-C(O)Rg、-NHC(O)Rg、-NRgC(O)Rg、-NHC(O)NH2、-NRgC(O)NH2、-NRgC(O)NHRg、-NHC(O)NHRg、-NRgC(O)N(Rg)2、-NHC(O)N(Rg)2、-COOH、-CO2Rg、-NHCO2Rg、-NRgCO2Rg和-OSi(Rg)3，其中每一Rg独立地为C1-6烷基；
A选自C＝Y1、C＝NORc、C＝NOC(O)H、C＝NOC(O)Rg、C＝NOCO2Rg、C＝NOC(O)NH2、C＝NOC(O)NHRg、C＝NOC(O)N(Rg)2和-CRcRh，其中Y1为＝O或＝S，并且Rh选自卤素、CN、NO2、-OH、-ORi、-OC(O)NHRi、-OC(O)N(Ri)2、-OC(O)Ri、-OC(O)H、-NH2、-NHRi、-N(Ri)2、-SH、-SRi、-S(O)2Ri、-SO2NH2、-SO2NHRi、-SO2N(Ri)2、-NHS(O)2Ri、-NRiS(O)2Ri、-C(O)NH2、-C(O)NHRi、-C(O)N(Ri)2、-C(O)H、-C(O)Ri、-NHC(O)Ri、-NRiC(O)Ri、-NHC(O)NH2、-NRiC(O)NH2、-NRiC(O)NHRi、-NHC(O)NHRi、-NRiC(O)N(Ri)2、-NHC(O)N(Ri)2、-COOH、-CO2Ri、-NHCO2Ri、-NRiCO2Ri、-OSi(Ri)3、-O-(Z)1-6、-S-(Z)1-6、-NH(Z)1-6和-NRc(Z)1-6，其中每一Ri独立地为任选地被1至3个Rf基团取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、芳基C0-6烷基或C3-6环烷基；-(Z)1-6为通过醚键连接在一起的1-6个独立选择的C4-7单糖残基的序列，任选地每一Z独立地被1至3个Rf基团取代；
R10选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X2CN、-X2NO2、-X2C(O)Ra、-X2OC(O)Ra、-CRb＝NORc、-X2CO2Rc、-X2C(O)NRcRd、-X2C(NRcRd)＝NRc、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2ORa、-X2SRa-X2NHRa和-X2N(Ra)2，其中每一X2独立地为键或C1-4亚烷基；其中R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中两个相邻的Rf取代基与和它们相连的原子一起任选地形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5元杂环，其中杂环任选地被1至3个Rg基团取代，并且R10的芳香环任选地被1至5个Rf基团取代；并且
R11选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、C2-6卤代烯基、C5-6环烯基和C2-6环氧烷基，每一R11任选地被1至3个Rf基团取代。在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含式I的化合物和药物可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在另一方面，本发明提供了预防和/或治疗和/或改善和/或调节诸如哺乳动物或人类的个体的疼痛和/或炎症和/或急性期反应和/或造血作用的方法。所述方法包括将治疗有效量的式I、IA、II或DA001至090任意的化合物或如本文所述的化合物或者其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体给予哺乳动物。
在另一方面，本发明提供了抑制NMDA和/或MC受体活性的方法。所述方法包括将DA048至DA090任意的化合物与NMDA和/或MC受体接触。
在另一方面，本发明提供了预防和/或治疗诸如哺乳动物或人类的个体的中枢神经系统病症的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于预防和/或治疗哺乳动物的神经退行性疾病和神经病理性疾病状态的方法。在另一实施方案中，本发明提供了用于增强哺乳动物大脑认知功能的方法。在另一实施方案中，本发明提供了在哺乳动物诸如中风的应激条件下预防神经元损伤的方法。在另一实施方案中，本发明提供了治疗由慢性疾病诱导的抑郁、焦虑和恶病质的方法。在上述实施方案中用于治疗和/或预防CNS病症的方法包括将治疗有效量的DA048至DA090任意的化合物或包含DA048至DA090化合物的药物组合物给予哺乳动物。
附图简述
图1DA001示出当配体(NDP-α-MSH)结合时，通过降低cAMP的增加，对MC4受体的剂量依赖性抑制效应(红线)。单独的DA001不能诱导cAMP增加(蓝色正方形点)。DA001在人类MC4受体中显示拮抗效应，IC50为1.7E-05M。
图2例示DA001降低了大脑缺血的梗塞面积和水肿。缺血后6h口服给予DA001(12.6mg/kg)显著地改善了缺血性大鼠的神经学评分。在12.6mg/kg和25.2mg/kg的剂量下，DA001还显著降低了MCAO大鼠的总梗塞，并且在42mg/kg的剂量下减小了水肿范围。
图3 DA001的预处理增加了中性粒细胞在皮层神经元中的表达，然后与NMDA共同处理。
用DA001或DMSO对照孵育皮层神经元24hrs，然后用NMDA(20μM)或水处理20min。以管家基因(house keeping gene)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为背景使基因表达标准化，并且将其与用NMDA处理的对照(DMSO)相比。将由DA001+NMDA诱导的基因表达的相对变化与DMSO+NMDA相比。
图4 DA001诱导了皮层神经元中的CEBPb mRNA。在3个不同的时间间隔，用DA001或DMSO对照孵育皮层神经元。以管家基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为背景使基因表达标准化，并且将其与对照(DMSO)处理相比。将由DA001诱导的基因表达的相对变化与DMSO相比。星号表示P＜0.05。
图5 DA001保护了神经元使其不受不同的红藻氨酸盐浓度影响。用DA001(40μM)或对照(DMSO)对照孵育皮层神经元24hrs，然后用不同浓度的红藻氨酸盐(KA，5μM至500μM)共同处理20min。然后测量释放入介质的LDH。
图6 DA021降低了Morris水迷宫模型的逃避潜伏期。
图7 DA021和DA034保护了神经元使其不受不同浓度的谷氨酸盐影响。A：DA021；B：DA034。
图8 DA021和DA034保护了神经元使其不受不同浓度的红藻氨酸盐影响。A：DA021；B：DA034。
图9 DA021和DA034保护了神经元使其不受不同浓度的NMDA影响。A：DA021；B：DA034。
图10 DA021保护了神经元使其不受不同浓度的NMDA影响。
图11 DA021保护了神经元使其不受海马神经元中的不同浓度的谷氨酸盐影响。
图12 DA001的衍生物解救了皮层神经元防止发生NMDA兴奋性中毒。在NMDA处理前，用衍生自DA001(30μM)的化合物处理皮层神经元24小时。在NMDA处理后24小时测量释放入介质的LDH。数据表示为平均值+s.e.m.，并将其与溶剂对照(DMSO)相比。*＝P＜0.05。
图13 DA001显示了在配体(PGE2)结合时，通过降低cAMP增加，对EP2和EP4受体的剂量依赖抑制效应。DA001显示了在IC50分别为3.6E-05M和2.0E-05M时，对人类EP2和EP4受体的拮抗效应。A：EP2的细胞功能测试；B：EP2的细胞功能测试。
图14 DA001的衍生物保护了皮层神经元防止发生Aβ25-35兴奋性中毒。在用Aβ25-35(10μM)共同处理前2小时，用衍生自DA001的化合物(多个[μM])孵育皮层神经元24小时。在Aβ25-35处理后进行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测试24小时。数据表示为与溶剂对照(DMSO)对比平均倍数改变±s.e.m.。暗点柱表示没有添加Aβ25-35的数据，空柱表示溶剂对照，黑柱表示具有强保护效应的化合物，而条纹柱表示具有中等效应的化合物，亮点柱表示没有或具有小于25％效应的化合物。*＝P＜0.05，**＝P＜0.005。
图15例示DA001改善了具有实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠的行为学评分。用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)/弗氏完全试剂(CFA)盒(Hooke实验室)在C57BL/6小鼠的后肢双侧皮下免疫C57BL/6小鼠，并按照生产者的指示进行。将白蛋白/CFA试剂盒(Hooke实验室)用作免疫对照。从免疫日开始每日口服给予DA001，浓度为100mg/kg。每日通过口服给药给MOG或白蛋白注射的小鼠提供介质(水)。每日称重并监测动物，并且基于临床规模定量行为损伤。本文给出的图是四个单独的EAE测试的组合。**＝p≤0.01。
图16例示DA002改善了具有实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠的行为学评分。用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)/弗氏完全试剂(CFA)盒(Hooke实验室)在C57BL/6小鼠的后肢双侧皮下免疫C57BL/6小鼠，并按照生产者的指示进行。从免疫日开始每日口服给予DA002，浓度为100mg/kg。通过口服给药给MOG注射的小鼠提供介质(水)。每日称重并监测动物，并且基于临床规模定量行为损伤。*＝p≤0.05。
图17示出DA021改善了具有实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠的行为学评分。用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)/弗氏完全试剂(CFA)盒(Hooke实验室)在C57BL/6小鼠的后肢双侧皮下免疫C57BL/6小鼠，并按照生产者的指示进行。从免疫日开始每日口服给予DA021，浓度为100mg/kg。通过口服给药给MOG注射的小鼠提供介质(水)。每日称重并监测动物，并且基于临床规模定量行为损伤。本文给出的图是三个单独的EAE测试的组合。**＝p≤0.01。
图18示出DA化合物降低了磷酸化的STAT3、STAT4和STAT6核蛋白在从介质处理的EAE小鼠的脾中分离的脾细胞中的表达。
图19示出DA001和DA021降低了从介质处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IFN-γ水平。
图20例示DA001降低了从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IFN-γ水平。
图21例示DA021降低了从DA021处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IFN-γ水平。
图22例示DA001和DA021降低了从介质处理的EAE小鼠的脾中分离出的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IL-6水平。
图23例示DA001降低了从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IL-6水平。
图24例示DA021降低了从DA021处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IL-6水平。
图25示出DA001和DA021降低了从介质处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IL-17水平。
图26例示DA001降低了从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IL-17水平。
图27示出DA021降低了从DA021处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞的外生MOG-诱导的IL-17水平。
图28例示DA001降低了EAE小鼠脊髓中的淋巴细胞渗透。
图29示出DA021降低了Swiss-Webster小鼠血清中的大肠杆菌(E-coli)脂多糖(LPS)-诱导的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。
图30例示DA021抑制了用噁唑酮处理的小鼠的耳水肿(ear edema)。
图31示出DA001抑制了黑皮质素与MC1和MC4受体的结合。获得了DA001在人类MC1或MC4受体中的竞争曲线。
发明详述
I.介绍
本发明提供了作为NMDA受体、黑皮质素受体和PG受体拮抗剂的治疗活性化合物和药物组合物，提供了抑制诸如NMDA受体、黑皮质素受体和PGE2受体的受体的方法，提供了治疗、预防或改善疼痛或炎症的方法，提供了在皮层神经元培养物中诱导CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP-b)mRNA的方法，以及提供了在哺乳动物和人类中调节急性期反应、炎症和造血作用的方法。特别地，化合物抑制PGE2的EP1、EP2和EP4受体。有利地，本发明提供了对多种疾病和疾病状态的疼痛和炎症具有治疗效力的PGE2受体拮抗剂。
II.定义
能够使用本发明的化合物抑制PGE2受体来治疗的疾病状态包括，但不限于自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自体免疫性爱迪生病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻(celiac sprue-dermatitis)、慢性疲劳免疫功能失调症(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、Crest综合征、克罗恩病、恶性萎缩性丘疹病、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盘状红斑狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、甲状腺机能亢进、格林巴利综合症、淋巴瘤性甲状腺肿、先天性肺纤维化、先天性血小板减少(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、青年期类风湿性关节炎、梅尼埃尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征(polyglancular syndromes)、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白(primary agammaglobulinemia)、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺氏症、莱特尔氏综合征、风湿热、结节病、硬皮病、干燥综合征、全身肌强直综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、脉管炎、白癜风以及眶坏死性肉芽肿病)、炎性肠疾病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、慢性前列腺炎)、肾小球肾炎、移植排斥反应、血管炎、再灌注损伤、哮喘、骨关节炎、鼻炎、结膜炎和皮炎，刺激物或神经反应引起的疼痛(例如，躯体痛和神经性疼痛)、慢性疼痛和急性疼痛，疾病状态或综合征的症状或结果的疼痛(例如炎症性疼痛、癌痛、AIDS疼痛、关节痛、偏头痛、三叉神经痛、心肌缺血性疾病和糖尿病性神经病)以及内脏痛。能够使用本发明的化合物抑制NMDA受体和/或MC受体活性并防止谷氨酸诱导的神经毒性来治疗的疾病状态包括，但不限于神经组织退化病症、头部和大脑外伤、遗传紊乱、传染病、炎性疾病、敷药、药物疾病和酗酒(drug and alcohol disorder)、神经性疼痛、癌症、代谢病、智力迟钝以及诸如与年龄相关的记忆丧失的学习和记忆障碍、阿尔兹海默病、轻度认知障碍、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿舞蹈病、遗忘症、B1缺陷、精神分裂症、抑郁症和双向抑郁症、中风、脑积水、蛛网膜下出血、血管机能不全、缺血性脑血管病、脑瘤、癫痫、帕金森病、脑微血管病(cerebral microangiopathy)、敷疼痛药、化疗，例如由心肺机、麻醉或溺水导致的缺氧、痴呆(血管痴呆、额颞痴呆、路易体痴呆、词义性痴呆、原发性进行性失语性痴呆、皮克病性痴呆)、进行性核上神经麻痹症、皮质基底退化、桥本脑病、ADD、ADHD、识字困难、唐氏综合征、易脆X综合征、特纳氏综合征、胎儿酒精综合征、抑郁症、焦虑症、厌食症、恶病质以及诸如在精神分裂症、大脑性瘫痪和孤独症中的认知恶化。
术语“炎症”是指炎症的所有类别，包括局部性的表现和系统性炎症；按时间归类的炎症，例如慢性炎症和急性炎症；按其严重性归类的炎症，例如温和的、中等的或急性的炎症；以及为疾病状态或综合征的症状或结果的炎症。如本文所用的炎症的特征在于作为数个局部性表现的“整体”水平，其包括血液动力学病症(例如充血和水肿)、疼痛、温度升高和机能性损害。虽然任何特殊的表现可以不一定在所有实例中都出现，但可以在某些实例中观察到所有的表现。以炎症为特征的伴随的细胞和分子水平变化可以包括白细胞溢出和血小板聚集。以炎症为特征的分子水平变化可以包括激活至少三种血浆防御体系以及细胞因子和类花生酸的合成。
如本文所用的术语“急性期反应”是指在炎症反应期间在血清内合成某种蛋白的变化，其通过非特异性防卫机理为宿主提供了对微生物的快速保护。例如，蛋白质的血浆浓度能够增加或降低对炎症的反应。示例性的急性期反应包括发热、炎症体液因子增加，以及通常在血浆中发现的许多蛋白质或糖蛋白的通过肝细胞的增加的合成。
术语“自身免疫性病症或疾病”是指其中机体免疫系统反抗其某些自身组织并产生攻击其本身的抗体的病症或疾病。示例性的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、红斑狼疮等。
术语“类风湿性关节炎”是指导致关节、包围关节的组织以及机体的其它器官的慢性炎症的自身免疫性疾病。示例性的关节包括周边缝，例如指关节、腕关节、脚趾和膝盖以及周围的肌肉、腱、韧带和血管。
如本文所用的术语“疼痛”是指疼痛的所有类别，包括从刺激物或神经反应方面描述的疼痛，例如躯体痛(对有害刺激物的正常神经反应)和神经性疼痛(受伤的或改变的感觉通路的异常反应，其通常不包括清除有害输入)；按时间归类的疼痛，例如慢性疼痛和急性疼痛；按其严重性归类的疼痛，例如温和的、中等的或严重的疼痛；以及为疾病状态或综合征的症状或结果的疼痛，例如炎症性疼痛、癌痛、AIDS疼痛、关节病、偏头痛、三叉神经痛、心肌缺血性疾病和糖尿病性神经病(参见例如，哈里森内科学，pp.93-98(Wilson et al.，eds.，第12版1991)；Williams et al.，J.of Medicinal Chem.42：1481-1485(1999)，以引用的形式以其整体各自并入本文)。疼痛包括与CNS病症相关的疼痛，其包括：多发性硬化、脊髓损伤、外伤性大脑损伤、帕金森病和中风。
如本文所用的术语“躯体痛”是指对有害刺激物的正常神经反应，所述有害刺激物例如伤害或疾病，如精神创伤、烧伤、感染、炎症或诸如癌症的疾病过程，并且包括皮肤疼痛(例如源于皮肤、肌肉或关节的疼痛)和内脏痛(例如源于器官的疼痛)。
如本文所用的术语“神经性疼痛”是指由外周和/或中枢感觉通路的损伤或慢性改变引起的疼痛，其中疼痛通常在没有明显有害输入的情况下发生或持续。示例性的神经性疼痛包括下列疾病状态，其包括代谢性神经病(例如糖尿病型神经病)、疱疹后神经痛、三叉神经痛、脑神经痛、中风后神经性疼痛(post-stroke neuropathic pain)、多发性硬化相关的神经性疼痛、HIV/AIDS-相关的神经性疼痛、癌症相关的神经性疼痛、腕管相关的神经性疼痛、脊髓损伤相关的神经性疼痛、复杂区域性疼痛综合征、纤维肌痛相关的神经性疼痛、反射性交感神经萎缩征、幻肢综合征或外周神经或脊髓损伤、包括外科手术、截肢和残端痛在内的神经横断，由抗癌和抗AIDS治疗的副作用导致的疼痛、手术后神经性疼痛，诸如先天的或外伤后的神经病和单神经炎的神经病相关的疼痛，以及由诸如类风湿性关节炎、瓦伦伯格氏综合征、系统性红斑狼疮、多发性硬化或结节性多动脉炎的结缔组织病导致的神经性疼痛。神经病能够分为神经根病、单神经病、复合性单神经病、多神经病或神经丛病。
如本文所用的术语“急性疼痛”是指以历时短或卒发为特征的疼痛。急性疼痛包括但不限于，与组织损伤相关的疼痛、手术后疼痛、外伤后疼痛、由烧伤导致的疼痛、由局部性或全身性感染导致的疼痛、与疾病相关的内脏痛，所述疾病包括：胰腺炎、膀胱肠瘘(intestinal cystitis)、痛经、肠易激综合征、克罗恩氏病、输尿管绞痛和心肌梗死。
如本文所用的“慢性疼痛”是指以长期或频繁发生为特征的疼痛。在优选的实施方案中，“疼痛”涉及慢性疼痛类型，其包括，但不限于头痛(例如偏头痛病症、复发性和慢性紧张性头痛、紧张性头痛、丛集性头痛和慢性阵发性半侧颅痛)、腰痛、癌痛、骨关节痛以及神经性疼痛。
如本文所用的术语“炎症性疼痛”是指以炎症或免疫系统病症的症状或结果的形式产生的疼痛。例如，与疾病相关的炎症性疼痛，其包括但不限于结缔组织病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化和关节炎。
如本文所用的“内脏痛”是指位于内部器官的疼痛。示例性的机能性内脏痛包括慢性胃肠炎症，例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胃炎、肠易激综合征；包括由内脏的外伤、炎症或退化损害导致的疼痛和由侵犯感觉神经分别的肿瘤产生的疼痛；以及治疗诱导的内脏痛，例如与化疗或放射治疗伴随的内脏痛。
如本文所用的“给予”是指口服给予，以栓剂的形式给予、局部接触给予、肠胃外给予、静脉内给予、腹膜内给予、肌肉内给予、病灶内给予、鼻内或皮下给予、鞘内给予或给个体灌输诸如袖珍渗透泵的缓释器具。
除非另作说明，术语“烷基”以其本身或作为其它取代基的一部分是指具有指定的碳原子数目(即C1-8是指一个至八个碳)的直链或支链烃基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。对于本文的每一定义(例如烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、烯基、卤代烷基、芳基烷基、芳基烷氧基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基)，当不包括表明烷基部分的主链碳原子数目的前缀时，基团或其部分将具有12个或更少的主链碳原子或8个或更少的主链碳原子。例如，C1-8烷基是指具有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的直链或支链烃基，并且包括但不限于C1-2烷基、C1-4烷基、C2-6烷基、C2-4烷基、C1-6烷基、C2-8烷基、C1-7烷基、C2-7烷基和C3-8烷基。
如本文所用的术语“烯基”是指具有一个或多个双键的直链或支链的不饱和烷基。示例性的C2-6烯基包括，但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)以及较高级的类似物和异构体。
如本文所用的术语“环烷基”是指具有指定数目的环原子的烃环(例如C3-6环烷基)并且是完全饱和的或在环端点之间仅具有一个双键。一个或两个C原子可以任选地被羰基取代。
如本文所用的术语“亚烷基”以其本身或作为其它取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价基，实例为-CH2CH2CH2CH2-。通常，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子，具有10个或更少碳原子的那些基团是优选的，并且在本发明中具有8个或更少碳原子的基团是更优选的。
除非另作说明，如本文所用的术语“芳基”是指6至14环碳原子的多重不饱和的、芳香的烃基，其能够为单环或多环(高达三环)，其稠合在一起或共价连接。芳基的非限制性实例包括苯基、萘基和二苯基。
如本文所用的术语“杂芳基”是指包含选自N、O或S的一个至五个杂原子的芳基(或环)，其中所述氮原子和硫原子被任选氧化，并且氮原子被任选季铵化。能够通过杂原子或通过碳原子将杂芳基连接至分子的剩余部分并且杂芳基能够包含5至10个碳原子。能够通过杂原子将杂芳基连接至分子的剩余部分。芳基的非限制性实例包括苯基、萘基和二苯基，而杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并三嗪基、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、异苯并呋喃基、异氮杂茚基、吲嗪基、苯并三嗪基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吡唑啉酮并嘧啶基、咪唑并嘧啶、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、异噻唑基、吡唑基、吲唑基、蝶啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、噻吩基等。简言之，术语芳基，当与其它基团(例如芳氧基、芳基烷基)组合使用时是指包括如上所述的芳基和杂芳基。
术语“杂环烷基”是指包含选自N、O和S的一个至五个杂原子的环烷基，其中所述氮原子和硫原子被任选氧化，并且氮原子被任选季铵化，剩余的环原子为C。杂环烷基可以为3至12个，优选为5至8个环原子的单环、双环或多环体系，其中一个至五个环原子为杂原子。杂环烷基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、咪唑烷基、吡唑烷基、丁内酰胺基、戊内酰胺基、咪唑啉酮基、乙内酰脲、二氧戊环基、苯邻二甲酰亚胺基、哌啶、1，4-二噁烷基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基-S-氧化物、硫代吗啉基-S，S-氧化物、哌嗪基、吡喃基、吡啶基、3-吡咯啉基、硫代吡喃基、吡喃酮基、四氢呋喃基、四氢苯硫基、奎宁环基等。能够通过环碳或杂原子将杂环烷基连接至分子的剩余部分。
如本文所用的术语“杂环”、“杂环基”或“杂环的”是指包含至少一个杂原子的饱和的或不饱和的非芳香性环基。如本文所用的术语“杂原子”是指包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。能够将每一杂环连接在任意的可用的环碳上或杂原子上。每一杂环可以具有一个或多个环。当存在多环时，它们能够稠合在一起或共价连接。每一杂环通常包含1、2、3、4或5个独立选择的杂原子。优选地，这些基团包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，0、1、2、3、4或5个氮原子，0、1或2个硫原子和0、1或2个氧原子。更优选地，这些基团包含1、2或3个氮原子，0至1个硫原子和0至1个氧原子。杂环基团的非限制性实例包括吗啉-3-酮、哌嗪-2-酮、哌嗪-1-氧化物、吡啶-2-酮、哌啶、吗啉、哌嗪、异噁唑啉、吡唑啉、咪唑啉、吡唑-5-酮、吡唑烷-2，5-二酮、咪唑啉-2，4-二酮、吡咯烷、四氢喹啉基、十氢喹啉基、四氢苯并氧氮杂卓二氢二苯并氧等。术语杂环包括如本文所定义的杂芳基环、杂环烷基和杂环。
如本文所用的术语“组合物”旨在包括含有特定量的具体成分的产品以及直接或间接由特定量的具体成分的组合产生的任何产品。
如本文所用的术语“环氧烷基”是指具有环氧基团的上文定义的烷基。更具体地，C2-6环氧烷基包括环氧乙基、环氧丙基、环氧丁基、环氧戊基、环氧己基以及它们的其它异构体形式。例如，C2-3环氧烷基包括环氧乙基和环氧丙基。如本文所用的术语“环氧化物”是指包含桥氧的化合物或试剂，其中也直接或间接地将所述桥原子相互连接。环氧化物的实例包括1，2-环氧乙烷(氧杂环丙烷)、环氧丙烷等。
以其常规含义使用术语“烷氧基”和“烷基氨基”，并且所述术语是指分别通过氧原子或氨基连接至分子剩余部分的那些烷基。另外，对于二烷基氨基，烷基部分能够为相同或不同的，并且其也能够组合以形成具有与其各自连接的氮原子的3至7元环。因此，以-NR’R”表示的基团是指包括哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、吖丁啶等。
除非另有说明，如本文所用的术语“卤”或“卤素”以其本身或作为其它取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。
如本文所用的术语“卤代烷基”包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“C1-4卤代烷基”是指包括三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基、溴甲基等。
如本文所用的术语“芳基烷基”是指-R’R”基，其中-R’为亚烷基(具有指定数目的碳原子，或者如果未具体指出则具有八个或更少的主链碳原子)并且R”为如本文所定义的芳基。芳基烷基的实例包括苯基、苯乙基等。
如本文所用的术语“芳基烷氧基”是指芳基烷基-O-基团，其中芳基烷基是如本文所定义的。芳基烷氧基的实例包括苄氧基、苯乙氧基等。
如本文所用的“羟基烷基”是指羟基-亚烷基-基团，其中亚烷基如本文所定义的。羟基烷基的实例包括HOCH2-、HOCH2CH2-、CH3CH(OH)-CH2-等。
如本文所用的“烷氧基烷基”是指烷氧基-亚烷基-基团，其中烷氧基和亚烷基如本文所定义的。烷氧基烷基的实例包括CH3OCH2-、CH3CH2OCH2CH2-等。
术语“氨基烷基”是指氨基-亚烷基-基团，其中亚烷基如本文所定义的。氨基烷基的实例包括NH2CH2-、NH2CH2CH2-、NH2CH2CH(CH3)CH2-等。
术语“芳氧基”是指-OR’基，其中R’是如本文所定义的芳基。芳氧基的实例包括苯氧基等。
术语“芳氧基烷基”是指芳氧基-亚烷基-基团，其中芳氧基和亚烷基如本文所定义的。烷基之前的前缀表示碳原子的数目，或者如果未明确指出则具有八个或更少的主链碳原子。芳氧基烷基的实例包括苯氧基甲基等。
术语“烷基-C(O)O-烷基”是指烷基-C(O)O-亚烷基-基团，其中烷基和亚烷基如本文所定义的。烷基之前的前缀表示碳原子的数目，或者如果未明确指出则具有八个或更少的主链碳原子。烷基-C(O)O-烷基的实例包括CH3C(O)OCH2-等。
术语“芳基烷基-C(O)O-烷基”是指芳基烷基-C(O)O-亚烷基，其中芳基烷基和亚烷基如本文所定义的。烷基之前的前缀表示碳原子的数目，或者如果未明确指出则具有八个或更少的主链碳原子。芳基烷基-C(O)O-烷基的实例包括苄基-C(O)O-CH2-等。
术语“烷基-NH-烷基”是指烷基-NH-亚烷基-，其中烷基和亚烷基如本文所定义的。烷基之前的前缀表示碳原子的数目，或者如果未明确指出则表示八个或更少的主链碳原子。烷基-NH-烷基的实例包括CH3-NH-CH2-等。
术语“芳基烷基-NH-烷基”是指芳基烷基-NH-亚烷基-，其中芳基烷基和亚烷基如本文所定义的。烷基之前的前缀表示碳原子的数目，或者如果未明确指出则表示八个或更少的主链碳原子。芳基烷基-NH-烷基的实例包括苄基-NH-CH2-等。
如本文所用的术语“抑制”是指部分或全部阻止特定作用或功能的化合物，或者部分或全部阻止特定作用或功能的方法。
如本文所用的术语“单糖”或者“糖”是指支链醛或酮的碳水化合物分子，其可以与缩醛或酮缩的形式组合。分子的剩余碳通常具有氢和多个羟基。单糖具有经验式(CH2O)n，其中n为3至7，并且优选4至7，甚至更优选5至7。在某些实施方案中，该术语是由单一的多羟基醛或酮单元组成的“单糖”。单糖的代表性实例包括，但不限于葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖。二糖的代表性实例包括，但不限于乳糖、麦芽糖和蔗糖。
如本文所用的术语“有需要的患者”、“有需要的哺乳动物”或“有需要的个体”是指患有如本文所述的炎性或疼痛疾病状态或急性期反应的患者或哺乳动物。非限制性实例包括类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、红斑狼疮、炎性肠疾病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、慢性前列腺炎)、肾小球肾炎、移植排斥反应、血管炎、再灌注损伤、哮喘、骨关节炎、鼻炎、结膜炎和皮炎、躯体痛和神经性疼痛、慢性疼痛和急性疼痛、炎症性疼痛、癌痛、AIDS疼痛、关节痛、偏头痛、三叉神经痛、心肌缺血性疾病和糖尿病性神经病和内脏痛。患有其它能用PGE2拮抗剂治疗的疾病状态的患者也能用本发明的方法治疗。使用本发明的方法治疗的患者是诸如哺乳动物的动物，其包括但不限于灵长类(例如人类)、母牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，患者是人类。
如本文所用的术语“前药”是指共价连接的载体，当将前药给予哺乳动物个体时，所述前药能够释放本发明的方法的活性剂。活性剂的释放发生在体内。能够通过本领域技术人员已知的技术制备前药。这些技术通常修饰给定化合物中的适当的官能团。然而，这些修饰的官能团通过常规操作或在体内再生出原始的官能团。本发明的活性剂的前药包括活性剂，其中羟基、氨基、胍基、氨基、羧基或类似基团是被修饰的。
如本文所用的术语“盐”是指本发明的方法中使用的化合物的酸式盐或碱式盐。药物可接受的盐的示例性实例为无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐、有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐、季铵(碘代甲烷、碘代乙烷)盐。应当理解药物可接受的盐是无毒的。能够在雷氏药学大全，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985中找到适当的药物可接受的盐的附加信息，其以引用的方式并入本文中。
如本文所用的本发明的碱性化合物的药物可接受的盐是与酸形成的盐，例如无机酸、有机羧酸和有机磺酸，如盐酸、甲磺酸、马来酸，其也可能是构成结构一部分的诸如吡啶基的碱基所提供的。根据在本文所述的化合物中发现的特定取代基，术语“药物可接受的盐”是指包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明的化合物包含相对酸性的官能度时，能够通过将这样的化合物的中性形式与足够量的纯的或在适当的惰性溶剂中的期望的碱接触来获得碱加成盐。衍生自药物可接受的无机碱的盐的实例包括铝、铵、钙、铜、三价铁、亚铁、锂、镁、锰、二价锰、钾、钠、锌等。衍生自药物可接受的有机碱的盐包括伯胺、仲胺、叔胺，其包括取代的胺、环胺、自然产生的胺等，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N’-二苄基乙基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺(glucamine)、葡萄糖胺(glucosamine)、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。当本发明的化合物包含相对碱性的官能度时，能够通过将这样的化合物的中性形式与足够量的纯的或在适当的惰性溶剂中的期望的酸接触来获得酸加成盐。药物可接受的酸加成盐的实例包括那些来自诸如盐酸、氢溴酸、硝酸、羧酸、单氢羧酸、磷酸、单氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、单氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的无机酸的盐，以及来自诸如乙酸、丙酸、异丁酸、丙二酸、安息香酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、酞酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的相对无毒的有机酸的盐。还包括诸如精氨酸等的氨基酸的盐，和诸如葡糖醛酸、半乳糖醛酸的有机酸的盐(参见例如Berge，S.M.，et al，“Pharmaceutical Salts(药物盐)”，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些具体化合物包含使化合物转化为碱或酸加成盐的酸性和碱性官能度。
如本文所用的“药物可接受的”是指必须与制剂的其它成分亲和并对其接受者无害的载体、稀释剂或赋形剂。
可以通过将盐与酸或碱接触并以常规方法分离母体化合物来再生化合物的中性形式。化合物的母体形式在诸如在极性溶剂中的溶解度的某些物理性质上与多种盐的形式不同，但是盐与用于本发明目的的化合物的母体形式等效。
如本文所用的术语“治疗有效量或剂量”或“治疗足够量或剂量”或“有效或足够量或剂量”是指对被给予的个体产生治疗效果的剂量。精确剂量将取决于治疗目的，并将由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(药物剂型)(vols.1至3，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(药物化合的领域、科学和技术)(1999)；Pickar，Dosage Calculations(剂量计算)(1999)；和Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷氏：药学的科学和实践)，第20版，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams & Wilkins)。在致敏细胞中，治疗有效量通常能够低于非致敏细胞的常规的治疗有效量。
如本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指成功治疗或改善损害、病理、疾病状态或症状(例如疼痛)中的任何迹象，其包括任何客观或主管参数，例如减轻；缓和；减少症状或产生症状、损害、病理或疾病状态更被患者耐受；降低症状或疾病状态的频率或持续时间；或者，在某些情况下，阻止症状或疾病状态发生。治疗或改善症状能够基于任何客观或主观参数；包括例如物理检测的结果。
术语“互变异构体”是指由现象产生的化合物，其中将分子的一个原子的一部分转化为其它原子。参见，Jerry March，Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms and Structures(高等有机化学：反应、机理和结构)，第四版，John Wiley & Sons，pages 69-74(1992)。互变异构体也指出现在平衡中的两个或多个结构异构体之一并且容易从一种异构体形式转为另一种异构体形式。实例包括酮-烯醇互变异构体，例如丙酮-丙-2醇、亚胺-烯胺互变异构体等，环链异构体，例如葡萄糖/2，3，4，5，6-戊羟基-己醛等，包含-N＝C(H)-NH-环原子重排的杂芳基的互变异构体形式，例如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑和四唑。本文所述的化合物可以具有一个或多个互变异构体并由此包括多种异构体。本领域技术人员将意识到其它互变异构的环原子重排是可能的。所有这些化合物的这样的异构体形式都特别地包括在本发明中。
本发明的某些化合物能够以非溶剂化物形式以及溶剂化物形式存在，其包括水合物形式。“水合物”是指由水分子与溶质的分子或离子结合形成的配合物。水合物是指与至少一个水分子络合的化合物。本发明的化合物能够与1至10个水分子络合。“溶剂化物”是指由溶剂分子与溶质的分子或离子结合形成的配合物。溶剂能够为有机化合物、无机化合物或二者的混合物。溶剂化物是指包括水合物。溶剂的某些实例包括，但不限于甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜和水。通常，溶剂化物的形式与非溶剂化物的形式等效并且包含在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以多种结晶的或无定形形式存在。通常，所有的物理形式与本发明预期的用途等效，并且旨在包含在本发明的范围内。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单独的异构体包含在本发明的范围内。这些异构体能够为溶解的或使用常规方法不对称合成的以使异构体为“光学纯的”，即基本没有其其它异构体。例如，如果期望本发明的化合物的特定对映异构体，则可以通过不对称合成制备或者通过手性助剂产生，其中分离所得非对映异构混合物，并将辅助基团分开以提供纯的期望对映异构体。或者，当分子包含诸如氨基的碱性官能团，或诸如羧基的酸性官能团，用适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构盐，然后溶解由此通过本领域熟知的分步结晶或色谱方法形成的非对映异构体，随后回收纯的对映异构体。
本发明的化合物也可以在构成这样的化合物的一个或多个原子中包含原子同位素的非天然部分。例如，可以用诸如氘(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)的放射性同位素标记化合物。本发明的化合物的所有同位素变体，无论是放射性的或非放射性的，都旨在包含在本发明的范围内。
III.化合物
在一方面，本发明提供了式(I)的化合物或者其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体：
在式(I)中，R1是-H、烷基-C(O)-或芳基烷基-C(O)-。在一个实施方案中，R1是-H、烷基-C(O)-或Ph-C1-4烷基-C(O)-。在另一实施方案中，R1是-H、CH3C(O)-或苄基-C(O)-。在又一实施方案中，R1是-H、烷基-C(O)-或Ph-C1-4烷基-C(O)-。在又一实施方案中，R1是-H、CH3C(O)-或苄基-C(O)-。其它取代基R2、R3和R4如以上本发明概述中所定义的。
在式(I)中，R2选自羟基-C1-4烷基、烷氧基-C1-4烷基、芳氧基-C1-4烷基、烷基-C(O)O-C1-4烷基和芳基烷基-C(O)O-C1-4烷基。在一组实施方案中，R2为羟基-C1-4烷基、烷氧基-C1-4烷基、或烷基-C(O)O-C1-4烷基。在某些实例中，R2为羟基甲基、CH3OCH2-或CH3C(O)OCH2-。在某些实施方案中，R2不是烷氧基-C1-4烷基或芳氧基-C1-4烷基。在某些实例中，R2为羟基-C1-4烷基、烷基-C(O)O-C1-4烷基或芳基烷基-C(O)O-C1-4烷基。其它取代基R1、R3和R4如本发明的任何上述实施方案和概述中所定义的。
在式(I)中，R3选自-NH2、-NHRa、-N(Ra)2、-OH和-ORb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基、芳基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基；其中R3取代基的脂肪族部分任选地被1至2个Rc取代基取代，Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、烷氧基、芳基烷氧基、卤素、烷基-C(O)O-、芳基烷基-C(O)O、芳基-C(O)O、烷基-C(O)NH-、芳基烷基-C(O)NH-、芳基-C(O)NH-、烷基氨基或二烷基氨基；或者任选地任意两个相邻的Rc取代基与和它们相连的原子一起形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5或6元杂环，其中杂环任选地被1至2个C1-8烷基取代。在某些实施方案中，R3任选地被1至2个Rd取代基取代，Rd取代基独立地选自卤素、-CN、-NO2、-OH、-Re、-ORe、-OC(O)NHRe、-OC(O)N(Re)2、-OC(O)Re、-OC(O)H、-NH2、-NHRe、-N(Re)2、-S(O)2Re、-SO2NH2、-SO2NHRe、-SO2N(Re)2、-NHS(O)2Re、-NReS(O)2Re、-C(O)NH2、-C(O)NHRe、-C(O)N(Re)2、-C(O)H、-C(O)Re、-NHC(O)Re、-NReC(O)Re、-CO2Re、-NHCO2Re和-NReCO2Re，其中每一Re独立地为C1-8烷基。其它取代基R1、R2和R4如本发明的任何上述实施方案和概述中所定义的。
在一组实施方案中，R3为-NH2、-NHRa、-N(Ra)2、-OH或-ORb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基，其中R3取代基的脂肪族部分任选地被1至2个Rc取代基取代，Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、卤素、烷基氨基或二烷基氨基，并且R3或R4基团的芳香族部分任选地被1至2个Rd取代基取代。在某些实例中，R3为-NH2、-NHRa、-N(Ra)2、-OH或-ORb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基、芳基-C1-4烷基、羟基-C1-4烷基或氨基-C1-4烷基，其中R3取代基的脂肪族部分任选地被Rc取代基取代，Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、卤素、烷基氨基或二烷基氨基，并且R3或R4基团的芳香族部分任选地被1至2个Rd取代基取代。在其它实例中，R3为-OH、-NH2、-NH-C1-4烷基、CH3NH-、EtNH-、异丙基-NH-、C1-8烷基-NH-、PhCH2NH-、PhCH2O-、PhO-、HO(CH2)n-NH-、-O(CH2)qOH、-O(CH2)2OH、-O(CH2)3OH、HO(CH2)2-NH-、HO(CH2)3-NH-、NH2(CH2)mNH-、NH2(CH2)2NH-、NH2(CH2)3NH-、NH2(CH2)p-O-、NH2(CH2)2-O-或NH2(CH2)3-O-，其中下标m、n、p和q各自独立地为1至4的整数，例如1、2、3或4。其它取代基R1、R2和R4如本发明的任何上述实施方案和概述中所定义的。
在式(I)中，R4是C1-4烷基、卤代烷基、羟基烷基、烷基-C(O)O-C1-4烷基、芳基烷基-NH-C1-4烷基或烷氧基烷基。在某些实施方案中，R4任选地被1至2个Rd取代基取代，Rd取代基独立地选自卤素、-CN、-NO2、-OH、-Re、-ORe、-OC(O)NHRe、-OC(O)N(Re)2、-OC(O)Re、-OC(O)H、-NH2、-NHRe、-N(Re)2、-S(O)2Re、-SO2NH2、-SO2NHRe、-SO2N(Re)2、-NHS(O)2Re、-NReS(O)2Re、-C(O)NH2、-C(O)NHRe、-C(O)N(Re)2、-C(O)H、-C(O)Re、-NHC(O)Re、-NReC(O)Re、-CO2Re、-NHCO2Re和-NReCO2Re，其中每一Re独立地为C1-8烷基。在一组实施方案中，R4为C1-4烷基、卤代CH2-、C1-4烷基、羟基烷基、烷基-C(O)-C1-4烷基、芳基烷基-NH-C1-4烷基或烷氧基烷基。在某些实例中，R4为-CH3、ClCH2-、BrCH2-、甲基、乙基、异丙基、丁基、异丁基、HOCH2-、羟基乙基、羟基丙基、羟基丁基、CH3C(O)CH2-、CH3C(O)C1-4烷基、苄基-NHCH2-、苄基-NH-C1-4烷基、C1-4烷氧基甲基、CH3OCH2-、CH3CH2OCH2-或(CH3)2CHOCH2-。其它取代基R1、R2和R3如本发明的任何上述实施方案和概述中所定义的。
在式(I)中，当R1为-H或CH3C(O)-，R2为-CH2OH或-CH2OC(O)CH3并且R4为-CH3或HOCH2-时，R3不是-OH、-OMe、-OEt、-NHCH2Ph、-O(CH2)2OH、-CH2CH(OH)CH2(OH)或2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基-甲基。在某些实施方案中，当R1为-H或CH3C(O)-，R2为-CH2OH或-CH2OC(O)CH3并且R4为-CH3或HOCH2-时，R3不是-OH、-OC1-8烷基、-NHCH2芳基、-O-C1-4亚烷基-OH或-O-(CH2)o-OH，其中下标o是1-4的整数。在其它实施方案中，当R1为-H或CH3C(O)-，R2为-CH2OH或-CH2OC(O)CH3并且R4为C1-4烷基或HOCH2-时，R3不是-OH、-OC1-8烷基、-NHCH2芳基、-O-C1-4亚烷基-OH。在另一些实施方案中，当R4为CH3-或C1-4烷基时，R3不是-OH、-OC1-8烷基、-NHCH2芳基、-O-C1-4亚烷基-OH。在又一些实施方案中，当R1为-H或C1-4烷基C(O)-、R2为HO-C1-4烷基或C1-4烷基-C(O)OCH2-、R4为C1-4烷基或HO-C1-4烷基时，R3不是-OH、-OC1-4烷基、芳基烷基-NH-或HO-C1-4烷氧基。其它取代基如本发明的任何上述实施方案和概述中所定义的。
在某些实施方案中，当R1为-H、烷基-C(O)-或芳基烷基-C(O)-时，R2为羟基-C1-4烷基、烷基-C(O)O-C1-4烷基或芳基烷基-C(O)O-C1-4烷基。其它取代基R3和R4如本发明的任何上述实施方案和概述中所定义的。
在一组实施方案中，具有子式(Ia)的式(I)的化合物：
Figure BPA00001331005300341
其中R2a为-OH、烷氧基或烷基-C(O)O-。在某些实例中，R2a为-OH或-OAc。在其它实例中，R1为-H或CH3C(O)-。在另一些实例中，R1为-H、烷基-C(O)-或Ph-C1-4烷基-C(O)-。在又一些实例中，R1为-H、CH3C(O)-或苄基-C(O)-。在某些实例中，R3为-NH2、-NHRa或-N(Ra)2，其中Ra为烷基、芳基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基；其中R3取代基的脂肪族部分任选地被1至2个Rc取代基取代，Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、烷氧基、芳基烷氧基、卤素、烷基-C(O)O-、芳基烷基-C(O)O、芳基-C(O)O、烷基-C(O)NH-、芳基烷基-C(O)NH-、芳基-C(O)NH-、烷基氨基或二烷基氨基。在某些实例中，其中R3为-NH2、-NHRa或-N(Ra)2，其中Ra为烷基、芳基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基。在又一些实例中，R3为-NH2、-NHRa或-N(Ra)2，其中Ra选自HOCH2CH2-、-CH3、C1-6烷基、NH2CHCH2CH2-、HO(CH2)3-和NH2(CH2)3-。其它取代基如本发明的任何上述实施方案和概述中所定义的。
在一组实施方案中，具有子式(Ib)的式(I)的化合物：
Figure BPA00001331005300351
其中R2a为-OH、烷氧基或烷基-C(O)O-，并且R4a为-H、-OH、烷氧基、烷基-C(O)-或芳基烷基-NH。在某些实例中，R1为-H或CH3C(O)-。在其它实例中，R1为-H、烷基-C(O)-或Ph-C1-4烷基-C(O)-。在一个实例中，R1为苄基-C(O)-。在某些实例中，R4a为-H、-OH或CH3C(O)-。在另一些实例中，R4a为烷氧基或芳基烷基-NH。在其它实例中，R4a为-H、-OH、-OAc或PhCH2NH-。R3如任何上述实施方案所定义的。
在又一组实施方案中，具有子式(Ib-1)的式(I)的化合物：
其中R2b为-H或烷基-C(O)-或芳基烷基-C(O)-。在某些实例中，R2b为-H、CH3C(O)-或PhCH2C(O)-并且R1为-H或CH3C(O)-。在其它实例中，R3为-OH、-NH2、-ORb、-NHRa或-N(Ra)2。取代基Ra、Rb如上面式(I)中所定义的。R4a如上面式Ib中所定义的。
在其它方面，本发明提供了式(IA)的化合物或者其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体：
Figure BPA00001331005300361
其中
R12选自羟基烷基、烷基-OC(O)-、芳基-C1-4烷基-OC(O)-、烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷氧基或烷氧基烷基，其中其芳基部分任选地被选自卤素、烷基、芳基-C1-4烷基、羟基烷基、烷氧基、芳基-C1-4烷氧基、烷基-OC(O)-、烷基-C(O)O-、芳基-C1-4烷基-C(O)O-、芳基-C1-4烷基-OC(O)O-、烷氧基烷基或芳基-C1-4烷氧基-烷基的1至3个取代；并且R13选自C2-6烯基或C2-6环氧烷基，它们各自任选地被选自-OH、-OC1-6烷基、芳基-C1-4烷基、烷基-C(O)O-或芳基-C1-4烷基-C(O)O-的1至3个取代。
在一组实施方案中，R12为羟基烷基、烷基-OC(O)-、芳基-C1-4烷基-OC(O)-、烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷氧基或烷氧基烷基，其中其芳基部分任选地被选自Cl、Br、F、C1-6烷基、苄基、OHCH2-、CH3O-、CH3C(O)O-、C1-4烷基-O-C(O)-或苄氧基的1至3个取代。在某些实例中，R12为苄氧基羰基、C1-6烷基-OC(O)-、EtOC(O)-、CH3C(O)OCH2-、HOCH2-、苄氧基甲基或CH3OCH2-。R13为如上所定义的。
在另一组实施方案中，R13为C2-6烯基或C2-6环氧烷基，它们各自任选地被选自-OH、-OC1-6烷基、苄基-C1-4烷基、C1-6烷基-C(O)O-或苄基-C(O)O-的1至3个取代。在某些实例中，R13为任选地被选自-OH、-OC1-6烷基、苄基-C1-4烷基、C1-6烷基-C(O)O-或苄基-C(O)O-的1至3个取代的2-丙烯基、3-羟基-2-丙烯基、3-乙酰氧基-2-丙烯基或2-甲基-2-环氧乙基。在其它实例中，R13为2-丙烯基、2-丁烯基、2-戊烯基、3-羟基-2-丙烯基、3-甲氧基-2-丙烯基、3-苄氧基-丙烯基、3-苯基-2-丙烯基、3-乙酰氧基-2-丙烯基、3-苯甲酸基-2-丙烯基、2-甲基-2-环氧乙基、2-乙基-环氧乙基、2-甲氧基甲基-2-环氧乙基、2-乙酰氧基甲基-2-环氧乙基、2-乙酰氧基乙基-2-环氧乙基、2-苄基-2-环氧乙基、2-苄氧基甲基-2-环氧乙基或2-苯甲酸基甲基-2-环氧乙基。在优选的实施方案中，R13为2-丙烯基、3-羟基-2-丙烯基、3-乙酰氧基-2-丙烯基或2-甲基-2-环氧乙基。
表1和表2列出了根据本发明的某些实施方案选择的化合物。示例性的化合物包括选择的3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆-28-酸(DA001)衍生物。
表1
Figure BPA00001331005300371
Figure BPA00001331005300381
表2
Figure BPA00001331005300382
制备化合物
如下面的实施例所示，技术人员通过多种合成路径能够制备本发明的化合物和中间体。方案1至5例示了制备某些3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆-28-酸(白头翁皂苷)衍生物的数个方法。在每一这些方案中，R、R”和R”’是无扰取代基。
下面的方案提供了能够按其获取本发明的某些白头翁皂苷衍生物的某些合成路线。下面给出的其它路线或路线的修饰对于技术人员来说是显而易见的并且在本发明的范围内。
方案1示出了通过在C28位的修饰，本发明的某些化合物的一般合成。
方案1
Figure BPA00001331005300391
方案2示出了通过在C30位的修饰，本发明的某些化合物的一般合成。
方案2
Figure BPA00001331005300392
能够通过上面方案1至2所述的方法和本文下面所述的方案3至5所述的方法制备具有式I、Ia、Ib和Ib-1的化合物以及表1所列的化合物DA048至079。
IV.药物组合物
除了上面给出的化合物，本发明提供了包含式I、IA、Ia、Ib、Ib-1的化合物或DA001至090的任何化合物或者如本文所述的化合物和药物载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在一个方面，用于调节PGE2EP1、EP2和EP4受体活性并诱导CCAAT/增强子结合蛋白β在人类和动物中表达的组合物通常包含式I、IA、Ia、Ib、Ib-1的化合物或DA001至090的任何化合物或者如本文所述的化合物和药物载体、赋形剂或稀释剂。在其它方面，组合物用于调节NMDA受体和黑皮质素受体活性。
用于给予本发明的化合物的药物组合物可以方便地以单位剂型的形式给出并可以通过药物和给药领域熟知的任何方法制备。所有的方法包括将活性成分带入以与载体结合的步骤，所述载体构成了一个或多个助剂。通常，通过均匀地和紧密地将活性成分带入以与液体载体或精细分离的固体载体或二者结合来制备药物组合物，然后根据需要将产品做成期望的制剂。在药物组合物中，以足以在疾病过程或状态中产生期望效果的量包含活性目标化合物。
包含活性成分的药物组合物可以为适于口服的形式，例如片剂、药片(troch)、锭剂、水性或油性悬浮剂、可分散的散剂或颗粒剂、如美国专利申请2002-0012680所述的乳剂和自乳化剂，硬胶囊剂或软胶囊剂、糖浆剂、酏剂、溶液剂、口腔贴剂、口服凝胶剂、咀嚼胶剂、咀嚼片剂、泡腾散剂和泡腾片剂。可以根据用于制备药物组合物的本领域已知的任何方法来制备希望用于口服的组合物，并且这样的组合物可以包含一种或多种选自甜味剂、芳香剂、着色剂、抗氧化剂和防腐剂的试剂以便提供药学上简洁的并合意的制剂。片剂包含与适于制备片剂的无毒药物可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以为例如惰性稀释剂，例如纤维素、二氧化硅、氧化铝、碳酸钙、碳酸钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如PVP、纤维素、PEG、淀粉、明胶或阿拉伯胶和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以为未包衣的或它们可以为肠包衣的或其它包衣的，通过已知技术包衣以延迟在胃肠道的崩解和吸收并由此提供长时间的持续作用。例如，可以使用诸如单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯的时间延迟材料。也可以通过在第4,256,108号、第4,166,452号和第4,265,874号美国专利中描述的技术将它们包衣以形成用于控释的渗透治疗片剂。
也可以硬胶囊剂的形式给出用于口服的制剂，其中将活性成分与惰性固体稀释剂混合，所述惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或者以软胶囊剂的形式给出，其中将活性成分与水或油介质混合，所述油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油。另外，能够用诸如油的非水易混合成分制备乳剂并用诸如单甘油二酯、PEG酯等的表面活性剂来稳定乳剂。
水悬浮剂包含与适于制备水悬浮剂的赋形剂混合的活性材料。这样的赋形剂为悬浮剂，例如羟甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂可以为天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧乙烷与脂肪酸的缩合产物，例如硬脂酸聚氧乙烯酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七烷乙烯氧鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、或环氧乙烷与来自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与来自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水悬浮剂也可以包含一种或多种防腐剂，例如苯甲酸乙酯，或苯甲酸正丙酯、对羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种芳香剂，和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
可以通过将活性成分悬浮在植物油中来配制油性悬浮剂，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或者在诸如液体石蜡的矿物油中。油性悬浮剂可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加诸如上面所列的那些甜味剂和芳香剂以提供合意的口服制剂。可以通过加入诸如抗坏血酸的抗氧化剂来保存这些组合物。
通过加入水使适于制备水悬浮剂的可分散的散剂和颗粒剂提供与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或湿润剂和悬浮剂是上述例示的那些。诸如甜味剂、芳香剂和着色剂的其它赋形剂也可以存在。
本发明的药物组合物也可以为水包油乳剂的形式。油相可以为植物油，例如橄榄油或花生油或矿物油，例如液体石蜡或这些的混合物。适当的乳化剂可以为天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，以及来自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如单油酸山梨醇酐酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate)。乳剂也可以包含甜味剂和芳香剂。
可以用甜味剂配制糖浆剂和酏剂，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。这样的制剂也可以包含缓和剂(demulcent)、防腐剂和芳香剂以及着色剂。可以与例如环糊精、PEG和表面活性剂结合制备口服溶液剂。
药物组合物可以为无菌可注射的水性悬浮剂或油性悬浮剂的形式。可以根据已知领域使用上面已经描述了的那些适当的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制该悬浮液。无菌可注射制剂也可以为无菌可注射溶液剂或在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的悬浮剂，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。可接受的介质和溶剂中采用的是水、林格溶液和生理盐溶液。另外，无菌、不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，在可注射的制剂中使用诸如油酸的脂肪酸。
也可以用于药物的直肠给药的栓剂的形式给予本发明的化合物。能够通过用在普通温度下是固体，但在直肠温度下是液体的并将由此在直肠中融化以释放药物的适当的无刺激性赋形剂与药物混合来制备这些组合物。这样的材料包括可可油和聚乙二醇。另外，能够通过视觉传递使用溶液剂或软膏剂给予化合物。此外，能够使用离子电渗贴剂(iontophoretic patch)等完成主题化合物的经皮传递。对于局部使用，使用包含本发明化合物的乳膏剂、软膏剂凝胶剂、溶液剂或悬浮剂等。如本文所用的局部使用也指包括使用漱口剂和漱口药。
本发明的化合物也可以与作为可靶向的药物载体的适当的聚合物的载体偶合。这样的聚合物能够包括被棕榈酰残基取代的聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟基-丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、多羟基乙基-天冬酰胺-苯酚或者聚环氧乙烷-聚赖氨酸。此外，可以将本发明的化合物与载体耦合，所述载体为用于实现药物控释的一类可生物降解的聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物，聚∈己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸，和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。聚合物和半透性聚合物基体可以形成成形的物体，例如阀、支架、管形材料、假体等。在本发明的一个实施方案中，将本发明的化合物耦合至形成支架或支架接枝器具的聚合物或半透性聚合物基体。
V.治疗由PGE2EP1、EP2和EP4受体介导的疾病和病症的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法
在其它方面中，本发明提供了抑制PGE2 EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。方法包括将任何式I、IA、Ia、Ib和Ib-1的化合物或DA001至090任何化合物或如本文所述的化合物或药物可接受的盐或溶剂化物或其药物组合物与细胞接触。方法也包括将有效量的任何式I、Ia、Ib和Ib-1的化合物或DA001至090任何化合物或药物可接受的盐或溶剂化物或其药物组合物给予哺乳动物。在一个实施方案中，方法包括将DA001至DA090任何化合物与PGE2 EP1、EP2和EP4受体接触。
在其它方面中，本发明提供了抑制PGE2 EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。方法包括将式(II)的化合物或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体与细胞或PGE2受体接触。示例性受体包括PGE2EP1、EP2和EP4受体。
在式II中，R5、R7、R8和R9各自独立地为C1-4烷基。在一个实施方案中，R5、R7、R8和R9各自独立地选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和仲丁基。在另一实施方案中，R5、R7、R8和R9各自独立地为甲基。
在式II中，R6选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X1CN、-X1NO2、-X1C(O)Ra、-CRb＝NORc、-X1CO2Rc、-X1C(O)NRcRd、-X1C(NRcRd)＝NRc、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1ORe、-X1SRe、-X1NHRe和-X1N(Re)2以及-X1Re，其中每一X1独立地为键或C1-4亚烷基，其中Re为被1至3个Rf取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、芳基C0-6烷基或C3-6环烷基，并且其中Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H、C1-6烷基或芳基-C1-6烷基；其中每一R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中Rf选自卤素、CN、NO2、-OH、-Rg、-ORg、-OC(O)NHRg、-OC(O)N(Rg)2、-OC(O)Rg、-OC(O)H、-NH2、-NHRg、-N(Rg)2、-SH、-SRg、-S(O)2Rg、-SO2NH2、-SO2NHRg、-SO2N(Rg)2、-NHS(O)2Rg、-NRgS(O)2Rg、-C(O)NH2、-C(O)NHRg、-C(O)N(Rg)2、-C(O)H、-C(O)Rg、-NHC(O)Rg、-NRgC(O)Rg、-NHC(O)NH2、-NRgC(O)NH2、-NRgC(O)NHRg、-NHC(O)NHRg、-NRgC(O)N(Rg)2、-NHC(O)N(Rg)2、-COOH、-CO2Rg、-NHCO2Rg、-NRgCO2Rg和-OSi(Rg)3，其中每一Rg独立地为C1-6烷基。Rg也能够任选地被芳基取代。在某些实例中，Rg中的芳基能够被1至3个Rf进一步取代。在一个实施方案中，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H、C1-6烷基或苯基-C1-6烷基。
在具有式II的化合物的一组实施方案中，R6选自-X1C(O)Ra、-CRb＝NORc、-X1NHRe、-X1N(Re)2和-X1Re。在某些实例中，X1为键。在某些其它实例中，X1为CH2。在另一些实例中，Re为被1至3个Rf取代的C1-6烷基。在某些实例中，Re为-CH2-Rf。
在具有式II的化合物的其它组实施方案中，R6选自-CH2OH、-CH2OAc、-CH2OC1-6烷基、-CHO、-CH＝NORc、-CH2NHRe、-CH2OSi(Re)3和-CH2OSi(Rf)3。在某些实例中，R6为-CH2OH、-CH2OAc、-CH2OC1-6烷基、-CHO、-CH2OSiTBS、-CH＝NOH、-CH2NH-C1-6烷基-芳基和-CH＝NORg。在某些其它实例中，R6选自-CH2OH、-CH2OAc、-CH2OTBS、-CHO、-CH＝NOH和-CH2NHBn。
在式II中，符号A选自C＝Y1、C＝NORc、C＝NOC(O)Rg、C＝NOCO2Rg、C＝NOC(O)NH2、C＝NOC(O)NHRg和C＝NOC(O)N(Rg)2以及-CRcRh，其中Y1为＝O或＝S，并且Rh选自卤素、CN、NO2、-OH、-ORi、-OC(O)NHRi、-OC(O)N(Ri)2、-OC(O)Ri、-OC(O)H、-NH2、-NHRi、-N(Ri)2、-SH、-SRi、-S(O)2Ri、-SO2NH2、-SO2NHRi、-SO2N(Ri)2、-NHS(O)2Ri、-NRiS(O)2Ri、-C(O)NH2、-C(O)NHRi、-C(O)N(Ri)2、-C(O)H、-C(O)Ri、-NHC(O)Ri、-NRiC(O)Ri、-NHC(O)NH2、-NRiC(O)NH2、-NRiC(O)NHRi、-NHC(O)NHRi、-NRiC(O)N(Ri)2、-NHC(O)N(Ri)2、-COOH、-CO2Ri、-NHCO2Ri、-NRiCO2Ri、-OSi(Ri)3、-O-(Z)1-6、-S-(Z)1-6、-NH(Z)1-6和-NRc(Z)1-6，其中每一Ri独立地为任选地被1至3个Rf基团取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、芳基C0-6烷基或(Z)1-6；-(Z)1-6为通过醚键连接在一起的1至6个独立选择的C4-7单糖残基的序列，Z被任选地1至3个C1-6烷基或Rf取代。
在具有式II的化合物的一组实施方案中，A为CRc-O(Z)1-6。在一个实例中，Z为独立地C4-7单糖。在其它实例中，Z为独立地C5-6单糖残基。示例性的C4-7单糖包括，但不限于赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、核糖、核酮糖、木糖、木酮糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、山梨糖、塔罗糖和塔格糖、景天庚酮糖。优选地，Z为C5-6单糖残基，其选自阿拉伯糖、核糖、核酮糖、木糖、木酮糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、山梨糖、塔罗糖和塔格糖，它们中的每一个都被任选地乙酰化。在另一实例中，-(Z)2选自：
Figure BPA00001331005300461
其中波形线表示与分子剩余部分的连接点。
在具有式II的化合物的其它组实施方案中，A选自C＝O、CRcRh、C＝NORc、C＝NOC(O)Rg、C＝NOCO2Rg、C＝NOC(O)NH2、C＝NOC(O)NHRg和C＝NOC(O)N(Rg)2。在一个实例中，A选自C＝O、CRc-ORd、CRc-OC(O)Ri、C＝NORc、C＝NOC(O)Rg、C＝NOCO2Rg、C＝NOC(O)NH2、C＝NOC(O)NHRg、C＝NOC(O)N(Rg)2、CRc-NH2、CRc-NHRi、CRc-OSi(Ri)3和CRc-N(Ri)2。在其它实例中，A选自C＝O、CRc-β-OH、CRc-OBn、CRc-OAc、C＝NOH、CRc-NHRc和CRc-SiTBS。在一个实例中，Rc是H。在某些其它实例中，A选自CH-OH、CHOAc、C＝O、C＝NOAc、CHO、
Figure BPA00001331005300462
R10选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X2CN、-X2NO2、-X2C(O)Ra、-CRb＝NORc、-X2CO2Rc、-X2C(O)NRcRd、-X2C(NRcRd)＝NRc、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2ORa、-X2SRa、-X2NHRa和-X2N(Ra)2以及-X2Re，其中每一X2独立地为键或C1-4亚烷基；其中每一R10取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中两个相邻的Rf取代基与和它们相连的原子一起任选地形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5元杂环，其中杂环任选地被1至3个Rg取代，并且每一R10的芳香环任选地被1至5个Rf取代。在一组实施方案中，R10选自X2OC(O)Ra、-X2CO2Rc、-X2C(O)NRcRd、-X2Re、-X2C(O)Ra和-CRb＝NORc。在某些实例中，R10选自-COOH、-COORg、-CH2OH、-CH2ORg、-CHO、-CH2NHCH2Ph和-CH＝NORc、-CH2OAc、-CH2CH2OH、-C1-6亚烷基-OH、CO2-C1-6亚烷基-OH、-CH2CH(OH)-CH2OH、CO2-CH2CH(OH)-CH2OH、-C1-6亚烷基-NH2、CONH-C1-6亚烷基-NH2、-C(O)NH2、-C(O)NHRc和其中Rc任选地被-OH或NH2取代。在某些其它实例中，R10选自-COOH、-CH2OH和-CH＝NORc。在一个实例中，Rc为-H。在其它实例中，R10选自-COOH、-COOMe、-COOEt、-CH2OH、-CHO、-CH＝NOH、-CH2OAc、-CH2CH2OH、-CO2CH2CH2OH、-C1-6亚烷基-OH、-CO2-C1-6亚烷基-OH、-CO2CH2CH2OH、-CH2CH(OH)-CH2OH、CO2-CH2CH(OH)-CH2OH、-C1-6亚烷基-NH2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)NHCH2Ph、-C(O)NH-C1-6亚烷基-OH、-CONHCH2CH2OH、-C(O)NH-C1-6亚烷基-NH2、-CONHCH2CH2NH2和
Figure BPA00001331005300472
在其它实例中，R10选自-COOH、-COOMe、-COOEt、-CH2OH、-CHO、-CH＝NOH、-CH2OAc、-CO2CH2CH2OH、-CH2CH2OH、-CO2CH2CH(OH)-CH2OH、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)NHCH2Ph、-C(O)NH-CH2CH2-NH2和
Figure BPA00001331005300473
其中波形线表示与分子剩余部分的连接点。
R11选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、C2-6卤代烯基、C5-6环烯基和C2-6环氧烷基，R11任选地被1至3个Rf取代。在某些实例中，Rf中的芳基能够被1至3个Rf基团进一步取代。
在具有式(II)的化合物的一组实施方案中，R11选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6环氧烷基，它们中的每一个被1至3个Rf任选取代。在某些实例中，R11为C1-6烷基或C2-6烯基。在某些其它实例中，R11为任选地被1至3个Rf取代的环氧乙烷基团。例如，R11为任选地被1至3个C1-6烷基取代的环氧乙烷。示例性的R11包括环氧乙基、环氧丙基、环氧丁基、环氧戊基、环氧己基及其其它异构体形式，例如1，2-环氧丙基、1，2-环氧-2-丙基、1，2-环氧-3-丙基、1，2-环氧丁基、1，2-环氧-2-丁基、1，2-环氧-3-丁基、2，3-环氧丁基等。在某些其它实例中，R11选自-CH＝CH2、-C(CH3)＝CH2、-C(CH2OH)＝CH2、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)CH3、环氧乙基、环氧丙基、环氧丁基和1，2-环氧-2-丙基。在一个实例中，R11选自-C(CH3)＝CH2、-C(CH2OH)＝CH2和1，2-环氧-2-丙基。
在一组实施方案中，本发明提供了抑制PGE2 EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。所述方法包括将式(IIa)的化合物：
Figure BPA00001331005300481
或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体与受体PGE2接触。示例性的受体包括EP1、EP2和EP4受体。
式(IIa)中的取代基R6、R10、R11和A如上面的式(II)中所定义的。在具有式IIa的化合物的一组实例中，A为CRc-OH。在一个实例中，R10为-COOH。在具有式IIa的化合物的其它组实例中，R6为被1至3个羟基取代的C1-6烷基、卤代烷基或环烷基，并且A不是CRc-OC(O)C1-6烷基。在其它组实例中，R6为被羟基取代的C1-6烷基。例如，R6为-CH2OH。
在第二组实施方案中，本发明提供了抑制PGE2 EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。所述方法包括将式(IIa-1)的化合物：
Figure BPA00001331005300491
或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体与受体PGE2接触。示例性的受体包括EP1、EP2和EP4受体。取代基R6和R10如上面的式II或IIa中所定义的。
在第三组实施方案中，本发明提供了抑制PGE2EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。所述方法包括将式(IIa-2)的化合物：
Figure BPA00001331005300492
或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体与受体PGE2接触。示例性的受体包括EP1、EP2和EP4受体。取代基R6和R10如上面的式II或IIa中所定义的。
在第四组实施方案中，本发明提供了抑制PGE2 EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。所述方法包括将式(IIa-3)的化合物：
Figure BPA00001331005300501
或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体与受体PGE2接触。示例性的受体包括EP1、EP2和EP4受体。取代基R6和R10如上面的式II或IIa中所定义的。
在第五组实施方案中，本发明提供了抑制PGE2 EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。所述方法包括将式(IIa-4)的化合物：
Figure BPA00001331005300502
或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体与受体PGE2接触。示例性的受体包括EP1、EP2和EP4受体。取代基R6和R10如上面的式II或IIa中所定义的。
在第六组实施方案中，本发明提供了抑制PGE2 EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。所述方法包括将式(IIa-5)的化合物：
Figure BPA00001331005300511
或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体与受体PGE2接触。示例性的受体包括EP1、EP2和EP4受体。取代基R6和R10如上面的式II或IIa中所定义的。
在其它组实施方案中，本发明提供了抑制PGE2 EP1、EP2和EP4受体活性的方法和诱导CCAAT/增强子结合蛋白β表达的方法，其用于预防、治疗或改善哺乳动物的疼痛或炎症和/或用于调节急性期反应、炎症和造血作用。所述方法包括将选自DA001至DA047的具有式的化合物或其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体与受体PGE2接触。示例性的受体包括EP1、EP2和EP4受体。化合物DA001至DA047如下表3所列。
表3
Figure BPA00001331005300512
Figure BPA00001331005300521
Figure BPA00001331005300531
任何式II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA047的化合物也在第PCT/CN2008/000348号PCT专利申请中描述了，其以引用的方式整体并入本文中。能够根据第PCT/CN2008/000348号PCT专利申请中描述的步骤制备任何式II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA047的化合物，其以引用的方式并入本文中。化合物DA001是从草本植物白头翁中分离出的三萜系化合物3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基]-3，23-二羟基-20(29)-羽扇豆-28-酸(参见Chen et al.“Saponins from Pulsatilla Chinensis(来自白头翁的皂苷)”Acta Chimica Sinica 1990，48，501)。
在一个实施方案中，本发明提供了任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或如本文所述的化合物，其能够用于在体外或体内抑制PGE2受体配体与PGE2受体的结合。示例性的PGE2受体包括PGE2 EP1、EP2和EP4受体。通常，这样的方法包括在含PGE2 EP1、EP2和EP4受体配体的水溶液存在的情况下，和在其它适于使配体与PGE2 EP1、EP2和EP4受体结合的条件下，将PGE2 EP1、EP2或EP4受体与足量的一种或多种如本文所提供的PGE2 EP1、EP2和EP4受体拮抗剂接触的步骤。PGE2 EP1、EP2和EP4受体可以存在于悬浮液(例如分离的膜或细胞制剂(cell preparation))中，或存在于培养基或分离的神经元细胞中。
优选地，根据测量，与受体接触的PGE2 EP1、EP2和EP4受体调节剂的量应当足以抑制与体外PGE2 EP1、EP2和EP4受体的结合，例如使用如本文所述的全细胞膜片钳研究、钙流实验、荧光成像阅读仪(fluormetric imaging plate reader)(FLIPR)实验，或者神经元存活实验(neuronal survival assay)。
在一个实施方案中，在适于使调节剂与受体结合的条件下，例如，通过将一种或多种任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5和DA001至DA090的化合物与PGE2 EP1、EP2或EP4受体(体外或体内)接触来将任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或如本文所述的化合物用于调节，优选抑制PGE2 EP1、EP2或EP4受体的活性。受体可以存在于溶液或悬浮液中，培养基或分离的细胞制剂中或在患者体内。可以使用膜片钳、FLIPR或钙实验技术通过检测穿过神经元表面的离子电流或通过存活实验，或免疫细胞化学分析来检测活性的任何调节。通常，有效量的任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090以足以调节体外PGE2 EP1、EP2或EP4受体活性的量在膜片钳研究和钙流实验和随后的神经元存活实验中拮抗。
在其它实施方案中，进行比较研究以确定其与已知拮抗剂美金刚相比的效力。在动物模型中使用Morris水迷宫试验评价化合物在认知功能上的效果，例如在测试个体中治疗痴呆，改善记忆的效果。
在另外的方面，本发明提供了任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物在治疗、预防和/或改善哺乳动物或人类的疼痛或炎症中的方法和用途。所述方法包括将治疗有效量的任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物给予哺乳动物或人类。
在其它方面，本发明提供了任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物在皮层神经元培养物中诱导CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP-b)mRNA的方法和用途。所述方法包括将任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物与细胞接触。
在另外的方面，本发明提供了任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物在调节哺乳动物的急性期反应、炎症或造血作用中的方法和用途。所述方法包括将治疗有效量的任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物给予哺乳动物。
在其它方面，本发明提供了任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物在调节哺乳动物的前炎症蛋白表达中的用途。所述用途包括用任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物进行外因治疗(exogenous treatment)。本发明进一步提供了任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物在改善哺乳动物的实验性自身免疫性脑脊髓炎的症状中的用途。所述用途包括将有效量的任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物给予哺乳动物。本发明还提供了任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或本文所述的化合物在降低淋巴细胞渗入哺乳动物脊髓中的用途。
在另一方面，本发明提供了抑制红藻氨酸盐受体(kainate receptor)活性的方法。所述方法将如本文所述的化合物或任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或者其药物可接受的盐或溶剂化物与红藻氨酸盐受体接触。
在另一方面，本发明提供了保护神经元防止β淀粉样多肽兴奋性中毒的方法。所述方法包括将如本文所述的化合物或任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或者其药物可接受的盐或溶剂化物与神经元细胞接触。在一个实施方案中，神经元是皮层神经元。本发明进一步提供了抑制β淀粉样多肽产生的方法。所述方法包括将如本文所述的化合物或任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或者其药物可接受的盐或溶剂化物与PGE2受体接触。
在一个实施方案中，本发明提供了用作药物的如本文所述的化合物或任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或者其药物可接受的盐或溶剂化物。
在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗疼痛和炎症的如本文所述的化合物或任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或者其药物可接受的盐或溶剂化物。在某些实例中，疼痛包括，但不限于急性疼痛、慢性疼痛、内脏痛、炎症性疼痛和神经性疼痛和如本文所述的疼痛。在其它实例中，炎症包括慢性炎症和急性炎症；按其严重性分类的炎症，例如温和的、中等的或严重的；以及为疾病状态或综合征的症状或结果的炎症。
在又一实施方案中，本发明提供了如本文所述的化合物或任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或者其药物可接受的盐或溶剂化物在制备用于治疗疼痛和炎症的药物中的用途。在某些实例中，疼痛包括，但不限于急性疼痛、慢性疼痛、内脏痛、炎症性疼痛和神经性疼痛和如本文所述的疼痛。在其它实例中，炎症包括慢性炎症和急性炎症；按其严重性分类的炎症，例如温和的、中等的或严重的；以及为疾病状态或综合征的症状或结果的炎症。
能够通过PGE2受体拮抗剂治疗的疾病状态：
本发明提供了对疼痛、炎症、急性期反应和造血作用的治疗、预防、改善、调节和介导。将作为PGE2受体拮抗剂的任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090用于对炎性疾病和疼痛疾病状态的治疗、预防、改善、调节或介导。炎性疾病和疾病状态包括所有类型的炎症，其包括局部性表现和全身性炎症；按时间归类的炎症，例如变态反应性炎症、慢性炎症和急性炎症；按其严重性归类的炎症，例如温和的、中等的或急性的炎症；以及为疾病状态或综合征的症状或结果的炎症。在某些实施方案中，炎性疾病和疾病状态包括自身免疫性病症。在其它实施方案中，炎性疾病和疾病状态包括炎性肠疾病。在另一些实施方案中，炎性疾病和疾病状态包括肾小球性肾炎、移植排斥反应、脉管炎、再灌注损伤、哮喘、骨关节炎、鼻炎、结膜炎和皮炎。能够用任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090治疗的疼痛疾病状态包括所有类型的疼痛。在某些实施方案中，所述疼痛疾病状态包括，但不限于急性疼痛、慢性疼痛、内脏痛、炎症性疼痛、躯体痛或神经性疼痛。能够用任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5和DA001至DA090的化合物治疗的疾病状态包括，但不限于，自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自体免疫性爱迪生病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻、慢性疲劳免疫功能失调症(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、Crest综合征、克罗恩病、恶性萎缩性丘疹病、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盘状红斑狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、甲状腺机能亢进、格林巴利综合症、淋巴瘤性甲状腺肿、先天性肺纤维化、先天性血小板减少性紫癜(ITP)、Iga肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、青年期类风湿性关节炎、梅尼埃尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺氏症、莱特尔氏综合征、风湿热、类肉状瘤病、硬皮病、干燥综合征、全身肌强直综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风以及眶坏死性肉芽肿病)、炎性肠疾病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、慢性前列腺炎)、肾小球性肾炎、移植排斥反应、脉管炎、再灌注损伤、哮喘、骨关节炎、鼻炎、结膜炎和皮炎，刺激物或神经反应引起的疼痛(例如，躯体痛和神经性疼痛)、慢性疼痛和急性疼痛，疾病状态或综合征的症状或结果的疼痛(例如炎症性疼痛、癌痛、AIDS疼痛、关节痛、偏头痛、三叉神经痛、心肌缺血性疾病和糖尿病性神经病)以及内脏痛。
在本发明的一个实施方案中，任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5和DA001至DA090的化合物能够用于调节急性期反应、炎症或造血作用。
能够通过NMDA和MC受体拮抗剂治疗的疾病状态
本发明还提供了神经保护以及改善了认知缺陷。将作为NMDA和MC受体拮抗剂的本发明的化合物和如本文所述的化合物用于治疗CNS的急性和慢性病症，所述病症的范围从神经病理学疾病状态至神经退行性疾病和与兴奋性中毒相关的疾病状态。能够使用本发明的化合物和如本文所述的化合物治疗的疾病状态包括，但不限于，例如，神经组织退化病症、头部和大脑外伤、遗传紊乱、传染病、炎性疾病、敷药、药物疾病和酗酒、神经性疼痛、癌症、代谢病、智力低下以及诸如年龄相关的记忆丧失的学习和记忆障碍、阿尔兹海默病、轻度认知障碍、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿舞蹈病、遗忘症、B1缺陷、精神分裂症、抑郁症和双向抑郁症、脑血管病、中风、脑积水、蛛网膜下出血、脉管机能不全、脑瘤、癫痫、帕金森病、脑微血管病、疼痛治疗、化疗，例如由心肺机、麻醉或溺水导致的缺氧、痴呆(血管痴呆、额颞痴呆、路易体痴呆、词义性痴呆、原发性进行性失语性痴呆、皮克病性痴呆)、进行性核上神经麻痹症、皮质基底退化、桥本脑病、ADD、ADHD、诵读困难、唐氏综合征、脆性X综合征、特纳氏综合征、胎儿酒精综合征、抑郁症、焦虑症、厌食症和恶病质。
本文提供的治疗方法通常包括将有效量的一种或多种本文提供的化合物(例如口服、鼻内、肠胃外、局部或直肠)给予个体、患者或哺乳动物。适当的患者包括患有或易感(即预防性治疗)本文定义的病症或疾病的那些个体、患者或哺乳动物。用于如本文所述的治疗的典型患者包括哺乳动物、特别是灵长类，尤其是人类。其它适当的患者包括驯养的伴生动物，例如狗、猫、马等，或者家畜动物，例如牛、猪、羊等。
通常，本文提供的治疗方法包括将有效量的一种或多种本文提供的化合物给予个体、患者或哺乳动物，所述化合物例如任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090。在优选的实施方案中，优选将本发明的化合物口服给予患者(例如人类)。有效量可以为足以调节NMDA、MC或PGE2受体活性的量和/或足以减轻或缓和患者表现出的症状的量。优选地，给予的量足以使化合物(如果化合物为前药，或其活性代谢物)产生足够高以可检测地抑制体外PGE2受体的血浆浓度。治疗方案可以根据使用的化合物和要治疗的特定疾病状态变化；对于大多数病症的治疗，每日4次或更少的给药频率是优选的。通常，每日2次的剂量方案是更优选的，并且每日一次的剂量是特别优选的。然而，应当理解对于任何特定患者的具体的剂量水平和治疗方案将取决于多种因素，其包括使用的具体化合物的活性、年龄、体重、普遍健康状况、性别、饮食、给药次数、给药方式、排泄速率、药物组合(即给予患者的其它药物)和进行治疗的特定疾病的严重性，以及开药医生的判断。通常，使用足以提供有效治疗的最小剂量是优选的。通常可以使用适于治疗或预防的疾病状态的医学或兽医学标准监测患者的治疗效果。
能够以必要的频率给予本发明的化合物，所述频率包括每小时、每日、每周或每月。剂量频率也可以根据使用的化合物和治疗的特定疾病变化。然而，对于大多数病症的治疗，每日4次、每日3次或更少的剂量方案是优选的，并且每日1次或2次的剂量方案是特别优选的。以每日约0.0001mg/kg至约1000mg/kg的起始剂量给予本发明的药物方法中采用的化合物。能够使用约0.01mg/kg至约500mg/kg，或约0.1mg/kg至约200mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量。然而，剂量可以根据患者的需要，待治疗的疾病状态的严重性和待使用的化合物来改变。例如，能够考虑特定患者的诊断的疾病类型和状态以经验地确定剂量。在本发明的背景下，给予患者的剂量应该足以实现一段时间内对患者的有益治疗应答。还通过任何伴随给予特定患者的特定化合物的有害副作用的存在、性质和程度来确定剂量的大小。然而，应当理解任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括采用的具体化合物的活性，年龄、体重、普遍健康状况、性别、饮食、给药次数、给药方式和排泄速率、药物组合(即给予患者的其它药物)和进行治疗的特定疾病的严重性和其它因素，包括处方医生的判断。特定情况的适当剂量的确定不超出从业者的技能。通常，用小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，通过较小增量的增加剂量直到达到环境下的最佳效果。为了方便，如果需要，可以将总日剂量分开并在一天内以部分地给予。根据治疗医生的判断，能够每日给予剂量，或者在交替地给予剂量。也能够以规律的或连续的基础在较长的时间内(周、月或年)给予剂量，例如通过使用皮下胶囊剂、香囊或注射液，或通过贴剂。
能够以包括局部、肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、结肠内、直肠或腹膜内在内的多种方式给予患者药物组合物。优选地，肠胃外、局部、静脉内、肌肉内或口服给予药物组合物。
也能够将任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或如本文所述的化合物与另外的治疗剂联合给予，或者能够将诊断剂与任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的化合物和DA001至DA090或如本文所述的化合物联合给予以带来期望效果。其它试剂的选择将很大程度上取决于期望的靶向治疗(参见例如Turner，N.et al Prog.Drug Res.(1998)51：33-94；Haffner，S.Diabetes Care(1998)21：160-178；和DeFronzo，R.et al.(eds.)，Diabetes Reviews(1997)Vol.5 No.4)。许多研究关注与口服剂联合治疗的益处(参见例如Mahler，R.，J.Clin.Endocrinol.Metab.(1999)84：1165-71；United Kingdom Prospective Diabetes Study Group(英国前瞻性糖尿病研究组)：UKPDS 28，Diabetes Care(1998)21：87-92；Bardin，C.W.，(ed.)，Current Therapy In Endocrinology And Metabolism(内分泌学和代谢的现行疗法)，第6版(Mosby-Year Book，Inc.，St.Louis，MO 1997)；Chiasson，J.et al.，Ann.Intern.Med.(1994)121：928-935；Coniff，R.et al，Clin.Ther.(1997)19：16-26；Coniff，R.et al.，Am.J.Med.(1995)98：443-451；和Iwamoto，Y.et al，Diabet.Med.(1996)13 365-370；Kwiterovich，P.Am.J.Cardiol(1998)82(12A)：3U-17U)。联合治疗包括包含给予具有任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的一般结构的化合物和DA001至DA090和一种或多种另外的活性剂的单一的药物给药剂型，以及以其自身单独的药物给药剂型给予任何式I、IA、Ia、Ib、Ib-I、II、IIa、IIa-1至IIa-5的一般结构的化合物和DA001至DA090和每一活性剂。
VI.治疗由NMDA和MC受体介导的疾病和病症的方法
在另一方面，本发明提供了抑制诸如MC1或MC4受体的NMDA受体和/或MC受体活性以用于治疗和/或预防CNS病症的方法。所述方法包括将任何化合物DA048至090或其药物组合物与NMDA受体或MC1或MC4受体接触。优选地，NMDA受体是活化的NMDA受体。
在一个实施方案中，本发明的化合物为能够在体外或体内用于抑制NMDA和/或MC受体配体(例如谷氨酸盐)与NMDA受体结合的NMDA和/或MC拮抗剂。通常，这样的方法包括在含NMDA或MC受体配体的水溶液和另外的适于使配体与NMDA或MC受体结合的条件的存在下，将NMDA受体或MC与足量的一种或多种如本文所提供的NMDA或MC受体拮抗剂接触的步骤。NMDA或MC受体可以存在于悬浮液(例如分离的膜或细胞制剂)中或者存在于培养基或分离的神经元细胞中。
优选地，根据测量，与受体接触的NMDA或MC受体调节剂的量应该足以抑制NMDA或MC与NMDA或MC受体体外结合，所述测量例如使用如本文所述的全细胞膜片钳研究、钙流实验、荧光成像阅读仪(FLIPR)检测，或者神经元存活实验。
在本发明的一个实施方案中，例如在适于将调节剂与受体结合的条件下，通过将一种或多种本发明的化合物与NMDA或MC受体(体外或体内)接触，使用本发明的NMDA或MC受体拮抗剂以调节，优选抑制NMDA或MC受体活性。受体可以存在于溶液或悬浮液中，培养基或分离的细胞制剂中或在患者体内。可以使用膜片钳、FLIPR或钙检测技术，通过检测穿过神经元表面的离子电流或通过存活检测，或免疫细胞化学分析来检测活性的任何调节。通常，有效量的NMDA或MC以足以调节体外NMDA或MC受体活性的量在膜片钳研究和钙流实验和随后的神经元存活实验中拮抗。
在其它实施方案中，进行比较研究以确定其与已知拮抗剂美金刚相比的效力。在动物模型中使用Morris水迷宫试验评价化合物对认知功能的效果，例如在测试个体中治疗痴呆，改善记忆的效果。
在其它方面，本发明提供了化合物DA048至DA090在预防和/或治疗哺乳动物或人类的神经退行性疾病或神经病理学疾病状态中的方法和用途。所述方法包括将治疗有效量的本发明的任何化合物DA048至DA090给予哺乳动物或人类。
在其它方面，本发明提供了化合物DA048至DA090在增强哺乳动物或人类的大脑认知功能中的方法和用途。所述方法包括将治疗有效量的本发明的任何化合物DA048至DA090给予个体。
在另一方面，本发明提供了化合物DA048至DA090在抑制MC受体活性中的方法和用途。所述方法包括将化合物与MC受体接触。在一个实施方案中，MC受体为MC1或MC4受体。在另一实施方案中，MC受体为MC4受体。
在另一方面，本发明提供了治疗由哺乳动物的慢性疾病诱导的抑郁、焦虑和恶病质的方法。所述方法包括将治疗有效量的任何化合物DA048至DA090给予哺乳动物。能够诱导恶病质的非限制性慢性疾病包括癌症、AIDS、肾衰竭、肝功能衰竭、充血性心力衰竭和肺部疾病。
在另一方面，本发明提供了治疗哺乳动物的神经退行性疾病或神经病理学疾病状态的方法。所述方法包括将治疗有效量的任何化合物DA048至DA090给予哺乳动物。在一个实施方案中，所述疾病选自肌萎缩性侧索硬化、阿尔兹海默病、帕金森病和亨廷顿舞蹈病。在另一实施方案中，所述疾病状态选自神经性疼痛、中风、脑外伤和癫痫。
在另一方面，本发明提供了预防哺乳动物应激条件下的神经损伤的方法。所述方法包括将治疗有效量的任何化合物DA048至DA090给予哺乳动物。在一个实施方案中，所述应激条件为中风。
在另一方面，本发明提供了治疗由哺乳动物的慢性疾病诱导的抑郁、焦虑和恶病质的方法。所述方法包括将治疗有效量的化合物DA048至DA090给予哺乳动物。在一个实施方案中，所述慢性疾病选自癌症、AIDS、肾衰竭、肝功能衰竭、充血性心力衰竭和肺部疾病。
VII.实施例
在实施例和整个发明描述中使用下列缩写：
NMDA：N-甲基-D-天冬氨酸
Ac：乙酰基
DMSO：二甲亚砜
Bn：苄基
MC：黑皮质素
能够按照下面的描述使用多种本领域技术人员已知的反应合成在本发明范围内的化合物。本领域技术人员也将认识到可以使用变通方法来合成本发明的目标化合物，并且在本文本范围内描述的步骤是非穷举的，但提供了感兴趣的化合物的宽地可使用的和实践的路线。
在本文章中用来合成关键化合物的实验步骤的详述导致了由鉴定它们的物理数据以及与它们相关的结构描述的说明的分子。
本领域技术人员还将意识到在有机化学的标准发展过程中，频繁地使用了酸和碱。在描述母体化合物的实验过程中，如果该母体化合物具有必须的固有酸度或碱度，则有时产生它们的盐。
方案3
根据方案3所描述的合成步骤来合成化合物DA048至DA059。
实施例1：3，23-二乙酰氧基-桦木酸酰胺(DA048)的制备
3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐(1)的合成：3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐：在室温下搅拌含23-羟基-桦木酸(1.0g，2.12mmoL)的20mL吡啶和10mL乙酸酐的混合物48h。用50mL乙酸乙酯稀释混合物，用10％HCl(30mL×3)、盐水(30mL×1)洗涤混合物，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱在硅胶柱上纯化所得残余物，用含1％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色泡沫状固体的期望产物(1.24g，2.08mmoL，98％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)4.77(dd，J＝11.1，4.5Hz，1H)，4.74(s，1H)，4.61(s，1H)，3.84(d，J＝11.4Hz，1H)，3.69(d，J＝11.4Hz，1H)，3.03-2.95(m，1H)，2.29-2.22(m，2H)，2.11(s，3H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，2.01-1.95(m，1H)，1.68-0.99(m，21H)，0.97(s，3H)，0.93(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)182.5，177.0，170.9，170.6，150.0，109.6，74.4，65.3，56.3，50.4，49.1，47.9，46.8，42.3，40.6，40.5，38.3，37.9，37.0，36.9，33.9，32.0，30.5，29.6，25.4，23.1，21.1，20.9(2)，20.8，19.3，17.9，16.6，15.9，14.6，12.9。
3，23-二乙酰氧基-桦木酸酰胺(DA048)的合成：在氮气下，向溶于35mL干燥二氯甲烷的3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐(211mg，0.35mmoL)溶液中加入草酰氯(0.31mL，3.52mmoL)。在室温下搅拌混合物4h，然后减压浓缩。加入铵饱和的THF溶液(5mL)和0.2mL三乙胺，并在室温下搅拌过夜。加入水并分离层。用氯仿萃取水层(×3)。用硫酸钠干燥混合的有机层，过滤并浓缩。通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得的残余物，用含30％乙酸乙酯的石油醚洗脱以给出为白色固体的期望产物(196mg，100％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.55(br s，1H)，5.39(br s，1H)，4.75(dd，J＝11.1，4.6Hz，1H)，4.74(s，1H)，4.60(s，1H)，3.84(d，J＝11.1Hz，1H)，3.68(d，J＝11.1Hz，1H)，3.09(dt，J＝11.1，4.6Hz，1H)，2.53-2.40(m，1H)，2.06(s，3H)，2.04-1.86(m，2H)，2.02(s，3H)，1.84-0.79(m，22H)，1.69(s，3H)，0.97(s，6H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ178.69，170.86，170.51，150.59，109.38，74,49，65.42，55.75，50.66，49.83，48.05，46.57，42.50，40.75，40.61，38.38，38.05，37.61，37.02，34.06，34.00，30.76，29.74，29.51，25.58，23.18，21.32，21.03，19.51，18.01，16.71，16.20，14.61，12.99。MS(ESI)m/z 566.45(M+H+)。
实施例2：3，23-二乙酰氧基-桦木酸2-羟基乙基酰胺(DA049)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐(52mg，0.087mmoL)溶液中加入草酰氯(76μL，0.87mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩。加入乙醇胺的2mL干燥二氯甲烷溶液，并在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得的残余物，用含50％乙酸乙酯的石油醚洗脱以提供为白色固体的期望产物(52mg，100％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.22(t，J＝7.1Hz，1H)，4.77(dd，J＝11.4，4.6Hz，1H)，4.74(s，1H)，4.60(s，1H)，3.84(d，J＝11.4Hz，1H)，3.69(d，J＝11.4Hz，1H)，3.70(s，2H)，3.52-3.33(m，2H)，3.19(br s，1H)，3.10(dt，J＝11.1，4.6Hz，1H)，2.51-2.39(m，1H)，2.10-1.90(m，2H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，1.83-0.72(m，22H)，1.69(s，3H)，0.97(s，3H)，0.94(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(400MHz，CDCl3)δ177.80，170.93，170.56，150.57，109.35，74.52，74.44，65.39，62.98，55.63，50.59，50.03，48.00，46.72，42.39，42.25，40.70，40.55，38.38，37.98，36.94，33.96，33.71，30.83，29.37，25.52，23.11，20.97，19.46，17.90，16.58，12.90。MS(ESI)m/z600.39(M+H+)。
实施例3：3，23-二乙酰氧基-桦木酸甲基酰胺(DA050)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐(54mg，0.090mmoL)的溶液中加入草酰氯(78μL，0.90mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩。加入甲胺的乙醇溶液(33％wt，112μL，0.90mmoL)，并在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得的残余物，用含25％乙酸乙酯的石油醚洗脱以提供为白色固体的期望产物(51mg，100％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.70(br s，1H)，4.77(dd，J＝10.6，4,6Hz，1H)，4.74(s，1H)，4.59(s，1H)，3.85(d，J＝10.6Hz，1H)，3.68(d，J＝10.6Hz，1H)，3.14(dt，J＝10.6，4.6Hz，1H)，2.79(d，J＝4.6Hz，3H)，2.52-2.40(m，1H)，2.07(s，3H)，2.05-1.87(m，2H)，2.02(s，3H)，1.80-0.75(m，22H)，1.68(s，3H)，0.96(s，3H)，0.94(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(400MHz，CDCl3)δ176.64，170.92，170.56，150.76，109.26，74.53，74.46，65.39，55.56，50.61，50.12，48.00，46.74，42.39，40.68，40.56，38.34，37.99，36.95，34.01，33.77，30.84，29.39，25.52，23.12，20.97，19.45，17.93，16.62，16.58。MS(ESI)m/z 570.47(M+H+)。
实施例4：3，23-二羟基-桦木酸酰胺(DA051)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23-二乙酰氧基-桦木酸酰胺(22mg，0.040mmoL)溶液中加入氢氧化钠水溶液(20wt％，0.2mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。浓缩混合物，并通过柱色谱法在硅胶柱上纯化混合物，用含5％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色固体的期望产物(15mg，0.032mmoL，80％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ4.69(s，1H)，4.56(s，1H)，3.58(dd，J＝11.3，5.7Hz，1H)，3.50(d，J＝11.3Hz，1H)，3.27(d，J＝11.3Hz，1H)，3.07(dt，J＝11.3，5.7Hz，1H)，2.59-2.38(m，1H)，2.14-0.48(m，23H)，1.67(s，3H)，0.99(s，3H)，0.97(s，3H)，0.88(s，3H)，0.67(s，3H)。13C NMR(400MHz，CD3OD)δ182.11，152.10，109.86，73.90，67.44，56.94，51.95，51.10，48.01，47.94，43.58，43.32，41.87，39.71，39.38，38.07，35.06，34.28，31.81，30.58，27.56，26.94，22.13，19.67，19.09，17.12，16.78，15.08，12.54。MS(ESI)m/z 943.16(2M+H+)。
实施例5：3，23-二羟基-桦木酸2-羟基乙基酰胺(DA052)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23-二乙酰氧基-桦木酸2-羟基乙基酰胺(44mg，0.073mmoL)溶液中加入氢氧化钠水溶液(20wt％，0.5mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。浓缩混合物，并通过柱色谱法在硅胶柱上纯化混合物，用含7.5％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色固体的期望产物(34mg，0.066mmoL，90％)。1H NMR(300MHz，吡啶-d5)δ8.26(t，J＝5.4Hz，1H)，6.40(br s，2H)，5.80(br s，1H)，4.93(brs，1H)，4.75(br s，1H)，4.31-4.13(m，2H)，4.12-4.00(m，2H)，3.99-3.84(m，1H)，3.80-3.55(m，3H)，3.14-2.99(m，1H)，2.44(br d，J＝13.5Hz，1H)，2.32-2.05(m，2H)，2.03-0.97(m，20H)，1.77(s，3H)，1.13(s，3H)，1.06(s，3H)，1.00(s，3H)，0.92(s，3H)。13C NMR(75MHz，吡啶-d5)δ177.59，152.07，1 10.01，73.65，68.04，62.27，56.30，51.45，51.09，49.09，47.63，43.37，43.17，43.10，41.53，39.48，39.03，38.09，37.72，34.84，33.98，31.76，30.27，28.25，26.58，21.64，19.92，18.92，17.19，16.88，15.18，13.33。MS(ESI)m/z 516.46(M+H+)。
实施例6：3，23-二羟基-桦木酸甲基酰胺(DA053)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23-二乙酰氧基-桦木酸甲基酰胺(48mg，0.084mmoL)溶液中加入氢氧化钠水溶液(20wt％，0.3mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。浓缩混合物，并通过柱色谱法在硅胶柱上纯化混合物，用含5％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色固体的期望产物(36mg，0.032mmoL，88％)。1H NMR(300MHz，吡啶-d5)δ8.04(br d，J＝4.2Hz，1H)，6.35(br s，1H)，5.79(br s，1H)，4.92(br s，1H)，4.75(br s，1H)，4.29-4.10(m，2H)，3.72(d，J＝9.8Hz，1H)，3.68-3.54(m，1H)，3.14-2.99(m，1H)，2.96(d，J＝4.2Hz，3H)，2.37(d，J＝12.7Hz，1H)，2.27-0.77(m，22H)，1.77(s，3H)，1.13(s，3H)，1.05(s，3H)，1.00(s，3H)，0.92(s，3H)。13C NMR(75MHz，吡啶-d5)δ177.58，152.04，1 10.03，73.68，68.09，56.21，51.43，51.07，49.10，47.58，43.34，43.09，41.49，39.46，38.99，38.04，37.71，34.91，33.95，31.71，30.27，28.21，26.80，26.55，21.63，19.88，18.92，17.18，16.95，15.16，13.31。MS(ESI)m/z 485.45(M+H+)。
实施例7：3，23-二乙酰氧基-桦木酸2-氨基乙基酰胺(DA054)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐(47mg，0.078mmoL)溶液中加入草酰氯(68μL，0.78mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩。将所得残余物溶于2mL干燥二氯甲烷中，并加入1，2-二氨基乙烷(52μL，0.78mmoL)。在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得的残余物，用含7％至8％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色固体的期望产物(47mg，100％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.15(t，J＝5.6Hz，1H)，4.77(dd，J＝10.3，3.8Hz，1H)，4.74(br s，1H)，4.60(br s，1H)，3.84(d，J＝10.3Hz，1H)，3.68(d，J＝10.3Hz，1H)，3.43-3.19(m，2H)，3.13(dt，J＝10.3，3.8Hz，1H)，2.82(t，J＝5.6Hz，2H)，2.53-2.39(m，1H)，2.07(s，3H)，2.05-1.85(m，2H)，2.02(s，3H)，1.83-0.73(m，21H)，1.69(s，3H)，0.97(s，3H)，0.94(s，3H)，0.87(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ176.44，170.97，170.61，150.82，109.32，74.43，65.34，55.60，50.57，50.02，47.95，46.70，42.35，41.86，41.72，41.58，40.65，40.50，38.37，37.94，37.61，36.89，33.94，33.63，30.82，29.35，25.47，23.05，21.18，20.89，19.39，17.83，16.60，16.11，14.52，12.92。MS(ESI)m/z 599.22(M+H+)。
实施例8：3，23-二乙酰氧基-桦木酸3-羟基-丙基酰胺(DA055)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐(47mg，0.078mmoL)溶液中加入草酰氯(68μL，0.78mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩。将所得残余物溶于2mL二氯甲烷中，并加入3-氨基-1-丙醇(59μL，0.78mmoL)。在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得的残余物，用含50％乙酸乙酯的石油醚洗脱以提供为白色固体的期望产物(48mg，100％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.07(t，J＝5.6Hz，1H)，4.77(dd，J＝11.2，4.7Hz，1H)，4.74(s，1H)，4.61(br s，1H)，3.85(d，J＝11.2Hz，1H)，3.68(d，J＝11.2Hz，1H)，3.62(br s，2H)，3.51-3.32(m，2H)，3.10(dt，J＝11.2，4.7Hz，1H)，2.53-2.40(m，1H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，2.03-1.85(m，2H)，1.81-0.85(m，23H)，1.69(s，3H)，0.97(s，3H)，0.95(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ177.94，171.05，170.71，150.67，109.45，74.48，65.38，58.99，55.68，50.61，49.96，47.98，46.55，42.37，40.69，40.52，38.66，37.95，37.60，36.91，35.65，33.97，33.68，32.53，30.79，29.40，25.49，23.81，23.05，21.19，20.90，19.43，17.84，16.52，15.99，14.43，12.77。MS(ESI)m/z 614.37(M+H+)。
实施例9：3，23-二乙酰氧基-桦木酸3-氨基-丙基酰胺(DA056)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐(45mg，0.075mmoL)溶液中加入草酰氯(66μL，0.78mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩。将所得残余物溶于2mL干燥二氯甲烷中，并加入1，3-二氨基丙烷(63μL，0.78mmoL)。在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得的残余物，用含8％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色固体的期望产物(46mg，100％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.49(t，J＝5.69Hz，1H)，4.77(dd，J＝10.7，4.8Hz，1H)，4.73(s，1H)，3.84(d，J＝10.7Hz，1H)，3.68(d，J＝10.7Hz，1H)，3.47-3.25(m，2H)，3.14(dt，J＝10.7，4.8Hz，1H)，2.90-2.69(m，2H)，2.59-2.34(m，1H)，2.49(br s，2H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，2.03-1.86(m，2H)，1.80-0.76(m，23H)，1.68(s，3H)，0.96(s，3H)，0.94(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ176.49，170.98，170.62，150.86，109.31，74.43，65.34，55.53，50.58，49.99，47.95，46.65，42.34，40.66，40.50，39.57，38.43，37.93，37.59，37.13，36.89，33,95，33.58，31.87，30.82，29.34，25.47，23.05，21.18，20.90，19.38，17.84，16.50，16.13，14.51，12.78。MS(ESI)m/z 613.38(M+H+)。
实施例10：3，23-二羟基-桦木酸2-氨基乙基酰胺(DA057)
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23-二乙酰氧基-桦木酸2-氨基乙基酰胺(42mg，0.070mmoL)溶液中加入氢氧化钠水溶液(20wt％，0.3mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。浓缩混合物，并通过柱色谱法在硅胶柱上纯化混合物，用含10％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色固体的期望产物(34mg，0.066mmoL，94％)。1H NMR(300MHz，吡啶-d5)δ8.14(t，J＝5.2Hz，1H)，4.92(br s，1H)，4.75(s，1H)，4.28-4.05(m，1H)，4.18(d，J＝10.9Hz，1H)，3.79-3.36(m，3H)，3.72(d，J＝10.9Hz，1H)，3.16-2.87(m，1H)，3.02(t，J＝5.2Hz，2H)，2.44(d，J＝13.0Hz，1H)，2.29-2.03(m，2H)，2.02-1.86(m，2H)，1.85-0.87(m，22H)，1.77(s，3H)，1.12(s，3H)，1.05(s，3H)，1.00(s，3H)，0.92(s，3H)。13C NMR(75MHz，吡啶-d5)δ177.30，152.04，110.01，73.63，68.02，56.29，51.44，51.05，49.08，47.58，43.35，43.24，43.12，43.08，41.51，39.48，39.05，38.07，37.71，34.89，33.97，31.75，30.26，28.22，26.57，21.65，19.92，18.93，17.20，16.92，15.17，13.32。MS(ESI)m/z 515.33(M+H+)。
实施例11：3，23-二羟基-桦木酸3-羟基-丙基酰胺(DA058)
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23-二乙酰氧基-桦木酸3-羟基-丙基酰胺(43mg，0.070mmoL)溶液中加入氢氧化钠水溶液(20wt％，0.5mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。浓缩混合物，并通过柱色谱法在硅胶柱上纯化混合物，用含8％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色固体的期望产物(23mg，0.043mmoL，61％)。1H NMR(300MHz，吡啶-d5)δ8.26(t，J＝5.7Hz，1H)，6.34(br s，1H)，6.05(br s，1H)，5.79(br s，1H)，4.92(br s，1H)，4.75(s，1H)，4.29-4.13(m，1H)，4.20(d，J＝9.6Hz，1H)，3.98(t，J＝5.7Hz，2H)，3.88-3.55(m，3H)，3.73(d，J＝9.6Hz，1H)，3.13-2.97(m，1H)，2.42(br d，J＝11.7Hz，1H)，2.29-2.05(m，2H)，2.02(t，J＝5.7Hz，2H)，1.98-1.86(m，2H)，1.86-0.96(m，18H)，1.77(s，3H)，1.14(s，3H)，1.06(s，3H)，1.01(s，3H)，0.92(s，3H)。13C NMR(75MHz，吡啶-d5)δ177.59，152.03，110.05，73.65，68.05，60.27，56.26，51.46，51.02，49.09，47.56，43.37，43.09，41.54，39.49，39.13，38.09，37.72，37.30，34.90，34.17，33.99，31.75，30.27，28.24，26.59，21.65，19.91，18.93，17.21，16.95，15.17，13.32。MS(ESI)m/z 530.26(M+H+)。
实施例12：3，23-二羟基-桦木酸3-氨基-丙基酰胺(DA059)
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23-二乙酰氧基-桦木酸3-氨基-丙基酰胺(38mg，0.062mmoL)溶液中加入氢氧化钠水溶液(20wt％，0.5mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。浓缩混合物，并通过柱色谱法在硅胶柱上纯化混合物，用含10％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供为白色固体的期望产物(27mg，0.051mmoL，82％)。1H NMR(300MHz，吡啶-d5)δ8.25(t，J＝6.5Hz，1H)，4.93(br s，1H)，4.76(br s，1H)，4.30-4.15(m，1H)，4.20(d，J＝10.8Hz，1H)，3.80-3.48(m，3H)，3.72(d，J＝10.8Hz，1H)，3.15-3.00(m，1H)，2.91(t，J＝6.5Hz，2H)，2.40(br d，J＝13.0Hz，1H)，2.29-2.02(m，2H)，1.89-0.79(m，22H)，1.77(s，3H)，1.15(s，3H)，1.06(s，3H)，1.01(s，3H)，0.92(s，3H)。13C NMR(75MHz，吡啶-d5)δ177.14，152.08，110.02，73.66，68.06，56.24，51.47，51.04，49.11，47.57，43.37，43.10，41.55，40.46，39.49，39.13，38.06，37.73，37.50，34.94，34.08，33.98，31.76，30.28，28.25，26.60，21.67，19.92，18.95，17.23，16.98，15.18，13.33。MS(ESI)m/z 529.33(M+H+)。
方案4
根据方案4所描述的合成步骤合成化合物DA060至DA071。
实施例13：3，23-二乙酰氧基-桦木酸(2)
向溶于13mL MeOH和3mL氯仿的3，23-二乙酰氧基-桦木酸乙酸酐(500mg，0.84mmoL)溶液中加入1mL的5％HCl的水溶液。在室温下搅拌所得混合物过夜。在减压下除去溶剂。用水处理所得残余物，并用二氯甲烷萃取(×3)。干燥、过滤和浓缩混合的有机层。通过柱色谱法在硅胶上纯化，用含20％乙酸乙酯的石油醚洗脱以提供为白色固体的期望产物(380mg，0.68mmoL，82％)。1H NMR(400MHz，CDCl3，δppm)：4.75-4.79(m，2H)，4.62(s，1H)，3.84(d，J＝11.6Hz，1H)，3.69(d，J＝11.6Hz，1H)，2.95-3.06(m，1H)，2.18-2.29(m，2H)，2.07(s，3H，CH3)，2.02(s，3H，CH3)，1.70(s，3H，CH3)，1.02-1.68(m，23H)0.98(s，3H，CH3)，0.94(s，3H，CH3)，0.88(s，3H，CH3)，0.81(s，3H，CH3)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ182.0，179.9，170.6，150.2，109.7，74.5，65.4，56.4，50.5，49.2，48.0，46.9，42.4，40.7，40.6，38.4，38.0，37.1，37.0，34.0，32.1，30.6，29.7，25.5，23.2，21.3，21.0，19.4，18.0，16.6，16.1，14.7，13.0。
实施例14：3，23-二乙酰氧基-30-溴-桦木酸(3)的合成
向溶于20mL四氯化碳的3，23-二乙酰氧基-桦木酸(374mg，0.67mmoL)中加入NBS(122mg，0.72mmoL)和AIBN(5mg，0.03mmoL)。在氮气下加热所得混合物至80℃，时间为22h。停止反应并通过硅藻土塞过滤混合物。浓缩滤液。通过柱色谱法在硅胶上纯化，用含20％乙酸乙酯的石油醚洗脱。获得为白色固体的期望产物(242mg，0.38mmoL，57％)并回收起始材料25mg(7％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.16(s，1H)，5.05(s，1H)，4.77(m，1H)，4.00(s，2H)，3.84(d，J＝11.5Hz，1H)，3.70(d，J＝1 1.5Hz，1H)，3.02(m，1H)，2.30-2.15(m，2H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，1.99-1.97(m，1H)，1.74-1.01(m，22H)，0.99(s，3H)，0.93(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ181.8，171.0，170.7，151.0，113.4，74.5，65.4，56.4，50.7，50.4，47.9，42.9，42.3，40.6，40.5，38.4，37.9，37.0，36.9，36.7，33.9，33.0，32.0，29.6，26.7，23.1，21.2，20.9，17.9，16.6，16.0，15.6，12.9。
实施例15：3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸(DA060)的制备
向溶于4mL乙酸的3，23-二乙酰氧基-30-溴-桦木酸(242mg，0.38mmoL)的溶液中加入乙酸银(635mg，3.81mmoL)。在氮气下加热所得混合物至120℃，时间为2天。冷却混合物至室温并通过硅藻土塞过滤混合物，用二氯甲烷冲洗。浓缩滤液，并通过柱色谱法在硅胶上纯化，用含20％至25％乙酸乙酯的石油醚洗脱。获得为白色固体的期望产物(169mg，0.28mmoL，72％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.99(s，1H)，4.97(s，1H)，4.77(dd，J＝11.2，4.5Hz，1H)，4.57(m，2H)，3.85(d，J＝11.4Hz，1H)，3.69(d，J＝11.4Hz，1H)，2.96(td，J＝11.4，4.2Hz，1H)，2.32-2.29(m，1H)，2.11(s，3H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，2.18-1.96(m，2H)，1.73-1.16(m，21H)，0.98(s，3H)，0.93(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ181.8，171.1，170.8，170.7，149.0，110.4，74.3，66.0，65.4，56.3，50.4，49.8，47.9，43.2，42.3，40.6，40.5，38.3，38.0，36.9，36.7，33.9，31.9，31.8，29.6，26.4，23.1，21.2，21.1，20.9(2)，17.8，16.6，16.0，14.6，12.9。MS(ESI)m/z 637.34(M+Na+)。
实施例16：3，23，30-三羟基-桦木酸(DA061)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸(23mg，0.037mmoL)中加入氢氧化钠水溶液(20％，0.5mL)。搅拌混合物过夜并减压浓缩混合物。通过柱色谱法在硅胶上纯化所得残余物，用含6％甲醇的二氯甲烷洗脱以给出为白色固体的期望产物(16mg，0.033mmoL，88％)。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ4.96(d，J＝1.2Hz，1H)，4.88(s，1H)，4.04(m，2H)，3.58(dd，J＝10.5，5.7Hz，1H)，3.50(d，J＝10.8Hz，1H)，3.27(d，J＝10.8Hz，1H)，2.87(td，J＝11.1，4.2Hz，1H)，2.32-2.22(m，2H)，2.04-1.08(m，22H)，1.01(s，3H)，0.96(s，3H)，0.88(s，3H)，0.67(s，3H)。13C NMR(75MHz，CD3OD)δ180.0，156.3，107.0，73.8，67.3，65.3，57.5，52.0，51.0，44.2，43.6，43.4，41.9，39.8，39.6，38.1，38.0，35.1，33.5，33.3，30.9，28.0，27.6，22.2，19.1，17.1，16.7，15.1，12.6。MS(ESI)m/z 487.49(M-1，负离子模式)。
实施例17：3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸苄基酰胺(DA062)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸(31mg，0.050mmoL)溶液中加入草酰氯(44μL，0.50mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩。将所得残余物溶于2mL二氯甲烷中，并加入三乙胺(70μL，0.50mmoL)和苄胺(11μL，0.10mmoL)。在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得残余物，用含25％乙酸乙酯的石油醚洗脱以提供为白色固体的期望产物(23mg，65％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.33-7.27(m，5H)，5.91(t，J＝5.7Hz，1H)，4.98(，1H)，4.94(d，J＝0.9Hz，1H)，4.77(dd，J＝11.1，4.5Hz，1H)，4.56(m，2H)，4.48(dd，J＝14.7，5.7Hz，1H)，4.35(dd，J＝14.7，5.7Hz，1H)，3.16(td，J＝11.7，4.2Hz，1H)，2.50(m，IH)，2.10(s，3H)，2.06(s，3H)，2.02(s，3H)，1.93-1.89(m，1H)，1.78-1.00(m，22H)，0.96(s，3H)，0.91(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ175.6，171.0，170.8，170.7，149.6，139.0，128.6(2)，127.7(2)，127.3，74.5，66.1，65.4，55.5，50.8，50.6，48.0，43.3，43.0，42.3，40.7，40.6，38.1，38.0，37.6，37.0，34.0，33.5，32.0，29.3，26.5，23.1，21.2，21.1(2)，20.9，17.9，16.6，16.1，14.5，12.9。MS(ESI)m/z 704.26(M+H+)。
实施例18：3，23，30-三羟基-桦木酸苄基酰胺(DA063)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸苄基酰胺(15mg，0.021mmoL)中加入氢氧化钠水溶液(20％，0.5mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。浓缩混合物，并通过柱色谱法在硅胶上纯化所得残余物，用含6％甲醇的二氯甲烷洗脱以给出为白色固体的期望产物(9mg，0.016mmoL，77％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.13(t，J＝6.0Hz，1H)，7.29-7.21(m，5H)，4.95(d，J＝1.2Hz，1H)，4.88(s，1H)，4.42(dd，J＝14.7，6.0Hz，1H)，4.25(dd，J＝14.7Hz，6.0Hz，1H)，4.04(m，2H)，3.58(dd，J＝11.1，5.4Hz，1H)，3.51(d，J＝11.1Hz，1H)，3.26(d，J＝1 1.1Hz，1H)，2.95(td，J＝10.8，3.9Hz，1H)，2.55(m，1H)，2.19-2.14(m，1H)，2.06-1.05(m，22H)，1.01(s，3H)，0.88(s，3H)，0.87(s，3H)，0.67(s，3H)。13C NMR(125MHz，CD3OD)δ179.0，156.7，141.1，129.4(2)，128.6(2)，128.0，106.7，73.9，67.3，65.3，56.9，52.1(2)，49.1，43.9，43.8，43.6，43.4，42.0，39.8，39.2，38.9，38.1，35.2，34.0，33.6，30.6，28.1，27.7，22.3，19.1，17.2，16.9，15.1，12.6。MS(ESI)m/z 578.37(M+H+)。
实施例19：3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸酰胺(DA064)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸(30mg，0.049ramoL)溶液中加入草酰氯(42μL，0.49mmoL)。在室温下搅拌所得混合物2h，然后减压浓缩混合物。将所得残余物溶于2mL干燥二氯甲烷中并加入铵(在甲醇中饱和，2mL)。在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得残余物，用含40％乙酸乙酯的石油醚洗脱以给出为白色固体的期望产物(29mg，97％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.59(br s，1H)，5.46(br s，1H)，4.98(s，1H)，4.94(s，1H)，4.78(m，1H)，4.56(m，2H)，3.85(d，J＝11.7Hz，1H)，3.68(d，J＝11.7Hz，1H)，3.06(td，J＝11.2，3.7Hz，1H)，2.47(m，1H)，2.10(s，3H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，1.90-1.20(m，23H)，0.97(s，3H)，0.95(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ178.7，170.9，170.7，170.6，149.3，110.0，74.5，66.0，65.4，55.6，50.6，50.5，48.0，42.9，42.4，40.7，40.6，38.1，38.0，37.5，37.0，34.0，33.8，31.9，29.4，26.5，23.9，23.1，21.3，21.0.(2)，20.9，18.0，16.7，16.2，14.6，12.9。MS(ESI)m/z 637.35(M+Na+)。
实施例20：3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸甲基酰胺(DA065)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸(30mg，0.049mmoL)溶液中加入草酰氯(42μL，0.49mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩混合物。将所得残余物溶于2mL干燥二氯甲烷中并加入甲胺(在乙醇中33％wt，0.2mL)。在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得残余物，用含1.5％甲醇的二氯甲烷洗脱以给出为白色固体的期望产物(27mg，0.043，88％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.63(q，J＝4.6Hz，1H)，4.98(s，1H)，4.93(s，1H)，4.77(dd，J＝11.5，4.6Hz，1H)，4.56(m，2H)，3.85(d，J＝11.7Hz，1H)，3.67(d，J＝11.7Hz，1H)，3.14(td，J＝11.5，3.7Hz，1H)，2.79(d，J＝4.6Hz，3H)，2.46(m 1H)，2.10(s，3H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，1.90-1.93(m，1H)，1.77-1.24(m，17H)，1.16-1.13(m，2H)，1.06-1.00(m，1H)，0.96(s，3H)，0.93(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ176.3，170.8，170.6，170.5，149.5，109.9，74.5，66.1，65.4，55.5，50.9，50.6，48.0，43.1，42.3，40.7，40.6，38.1，38.0，37.6，37.0，34.1，33.7，32.1，29.4，26.5，26.2，23.1，21.2，21.1(2)，21.0，17.9，16.6，16.2，14.6，13.0。MS(ESI)m/z 628.33(M+H+)。
实施例21：3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸2-羟基乙基酰胺(DA066)的制 备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸(27mg，0.044mmoL)溶液中加入草酰氯(38μL，0.44mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩混合物。将所得残余物溶于1.5mL干燥二氯甲烷中并加入乙醇胺(13μL，0.22mmoL)。在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得残余物，用含1.5％甲醇的二氯甲烷洗脱以给出为白色固体的期望产物(29mg，0.044，100％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.13(t，J＝5.6Hz，1H)，4.98(s，1H)，4.94(s，1H)，4.76(dd，J＝11，4.9Hz，1H)，4.55(m，2H)，3.84(d，J＝11.5Hz，1H)，3.71(m，2H)，3.68(d，J＝12.0Hz，1H)，3.48(m，IH)，3.36(m，1H)，3.09(td，J＝11，3.9Hz，1H)，2.84(br s，1H)，2.45(m，1H)，2.10(s，3H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，2.00-1.94(m，1H)，1.79-1.00(m，21H)，0.97(s，3H)，0.94(s，3H)，0.87(s，3H)，0.81(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ177.5，170.9，170.7，170.5，149.3，110.0，74.4，66.1，65.4，63.1，55.6，50.8，50.6，48.0，43.0，42.4，42.4，42.3，40.7，40.6，38.2，38.0，37.6，37.0，34.0，33.6，32.0，29.4，26.5，23.1，21.3，21.1(2)，21.0，17.9，16.6，16.1，14.6，13.0。MS(ESI)m/z 658.28(M+H+)。
实施例22：3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸2-羟基乙酯(DA067)的制备
在氮气下，向溶于2mL干燥二氯甲烷的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸(30mg，0.049mmoL)溶液中加入草酰氯(34μL，0.39mmoL)。在室温下搅拌混合物2h，然后减压浓缩混合物。将所得残余物溶于2mL干燥二氯甲烷中并加入乙二醇(22μL，0.39mmoL)和三乙胺(27μL，0.20mmoL)。在室温下搅拌混合物过夜。水后处理，然后通过柱色谱法在硅胶柱上纯化所得残余物，用含3％甲醇的二氯甲烷洗脱以给出为白色固体的期望产物(27mg，0.041，84％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.96(s，1H)，4.93(s，1H)，4.74(m，1H)，4.53(m，2H)，4.20(m，2H)，3.80-3.79(m，3H)，3.66(d，J＝11.7Hz，1H)，2.92(m，1H)，2.12-2.28(m，2H)，2.07(s，3H)，2.03(s，3H)，1.98(s，3H)，1.84-2.00(m，2H)，1.67-1.58(m，5H)，1.50-0.98(m，19H)，0.94(s，3H)，0.89(s，3H)，0.84(s，3H)，0.78(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ176.2，170.9，170.6，170.5，149.0，110.4，74.4，66.2，65.7，65.4，61.5，56.6，50.5，50.1，48.0，43.1，42.3，40.7，40.6，38.3，38.0，37.0，36.8，34.0，32.0，31.9，29.6，26.6，23.1，21.3，21.1(2)，21.0，17.9，16.6，16.0，14.7，13.0。MS(ESI)m/z681.51(M+Na+)。
实施例23：3，23，30-三羟基-桦木酸甲基酰胺(DA068)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸甲基酰胺(23mg，0.037mmoL)中加入氢氧化钠水溶液(20％，0.5mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。用HCl水溶液中和混合物并浓缩。通过柱色谱法在硅胶上纯化所得残余物，用含5％甲醇的二氯甲烷洗脱以给出为白色固体的期望产物(9mg，0.018mmoL，49％)。1H NMR(400MHz，CD3OD/CDCl3)δ7.43(q，J＝4.4Hz，1H)，4.94(s，1H)，4.85(s，1H)，4.03(m，2H)，3.57(dd，J＝10.7，5.1Ha，1H)，3.51(d，J＝11Hz，1H)，3.27(d，J＝11Hz，1H)，2.94(td，J＝11，3.9Hz，1H)，2.69(d，J＝4.4Hz，3H)，2.49(m，1H)，2.07(m，1H)，1.96(m，1H)，1.77-1.22(m，18H)，1.15-1.03(m，3H)，0.99(s，3H)，1.94(s，3H)，0.87(s，3H)，0.68(s，3H)。13C NMR(125MHz，CD3OD/CDCl3)δ179.3，156.2，106.4，64.2，67.9，65.1，56.6，51.8，51.7，43.5，43.3，43.1，41.7，39.5，39.0，38.7，37.9，34.9，33.9，33.4，30.4，27.8，27.4，26.4，22.1，19.0，17.1，16.7，15.1，12.4。MS(ESI)m/z 502.36(M+H+)。
实施例24：3，23，30-三羟基-桦木酸2-羟基乙基酰胺(DA069)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸2-羟基乙基酰胺(22mg，0.033mmoL)中加入氢氧化钠水溶液(20％，0.5mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。用HCl水溶液中和混合物并浓缩。通过柱色谱法在硅胶上纯化所得残余物，用含7％至8％甲醇的二氯甲烷洗脱以给出为白色固体的期望产物(18mg，0.033mmoL，100％)。1H NMR(300MHz，CD3OD/CDCl3)δ4.94(d，J＝1.5Hz，1H)，4.86(s，1H)，4.53(br s，1H)，4.03(m，2H)，3.59-3.54(m，3H)，3.51(d，J＝10.8Hz，1H)，3.38-3.18(m，2H)，2.91(td，J＝11.4，4.2Hz，1H)，2.49(m，1H)，2.12-2.08(m，1H)，1.98(m，IH)，1.82-1.17(m，20H)，0.99(s，3H)，0.94(s，3H)，0.86(s，3H)，0.69(s，3H)。13C NMR(125MHz，CD3OD/CDCl3)δ180.0，156.1，106.4，74.3，67.9，65.1，61.9，56.7，51.8，51.7，43.5，43.3，43.1，42.4，41.7，39.5，38.0，38.6，37.9，34.9，33.9，33.4，30.4，27.8，27.3，22.1，19.0，17.1，16.7，15.1，12.4。MS(ESI)m/z 532.28(M+H+)。
实施例25：3，23，30-三羟基-桦木酸酰胺(DA070)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸酰胺(25mg，0.041mmoL)中加入氢氧化钠水溶液(20％，0.5mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。用HCl水溶液中和混合物并浓缩。通过柱色谱法在硅胶上纯化所得残余物，以给出为白色固体的期望产物(15mg，0.031mmoL，76％)。1H NMR(400MHz，CD3OD/CDCl3)δ4.97(s，1H)，4.89(s，1H)，4.06(m，2H)，3.61-3.55(m，1H)，3.56(d，J＝10.6Hz，1H)，3.32(d，J＝10.6Hz，1H)，2.91(m，1H)，2.49(m，1H)，2.11-2.02(m，2H)，1.85(dd，J＝11.8，7.4Hz，1H)，1.72-1.18(m)，1.01(s，3H)，0.97(s，3H)，0.88(s，3H)，0.75(s，3H)。13C NMR(125MHz，CD3OD/CDCl3)δ181.4，155.6，106.3，75.0，69.2，64.9，56.4，51.4，51.2，43.1，43.0，42.6，41.4，39.2，38.7，38.2，37.7，34.7，33.9，33.1，30.2，27.4，26.9，21.8，18.9，17.0，16.5，15.0，12.1。MS(ESI)m/z 488.34(M+H+)。
实施例26：3，23，30-三羟基-桦木酸2-羟基乙酯(DA071)的制备
向溶于1mL THF和2mL MeOH的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸2-羟基乙酯(23mg，0.035mmoL)中加入氢氧化钠水溶液(20％，0.5mL)。在室温下搅拌所得混合物过夜。用HCl水溶液中和混合物并浓缩。通过柱色谱法在硅胶上纯化所得残余物，用含5％至6％甲醇的二氯甲烷洗脱以给出为白色固体的期望产物(15mg，0.033mmoL，81％)。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ4.96(s，1H)，4.91(s，1H)，4.13(m，2H)，4.04(br s，2H)，3.72(t，J＝5.1Hz，2H)，3.58(dd，J＝10.8，4.9Hz，1H)，3.50(d，J＝11Hz，1H)，3.27(d，J＝11Hz，1H)，2.88(td，J＝11，4.2Hz，1H)，2.31-2.21(m，2H)，2.02-1.87(m，2H)，1.77(t，J＝11.4Hz，1H)，1.69-1.07(m，19H)，1.01(s，3H)，0.94(s，3H)，0.91(s，3H)，0.88(s，3H)，0.67(s，3H)。13C NMR(125MHz，CD3OD)δ177.4，156.1，107.0，73.8，67.3，66.3，65.2，61.1，57.9，51.9，51.2，44.0，43.6，43.4，41.9，39.7，39.6，38.1，37.7，35.0，33.4，33.0，30.9，28.0，27.6，22.1，19.1，17.1，16.7，15.2，12.6。MS(ESI)m/z 1087.31(2M+Na+)。
方案5
Figure BPA00001331005300801
根据方案5所描述的合成步骤合成化合物DA072至DA079。
实施例27：30-N-苄基氨基-3，23-二乙酰氧基-桦木酸(DA072)的制备
向3，23-二乙酰氧基-30-溴-桦木酸(22.8mg，35.9μmol)的DMF(1.00mL)溶液中加入Ag2CO3(17.1mg，62.0μmol)和BnNH2(10.0μL，91.5μmol)。在室温下搅拌混合物22h。通过SiO2的短衬垫过滤反应混合物，用AcOEt洗脱。在蒸干有机层后，通过柱色谱法(CHCl3∶MeOH＝100∶1→60∶1→30∶1)纯化16.2mg的残余物以获得为无色油状物的3.20mg(23％)期望化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.40-7.26(m，5H)，4.98(s，1H)，4.91(s，1H)，4.75(dd，J＝11.7，4.5Hz，1H)，4.66(br s，1H)，3.95(d，J＝15.1Hz，1H)，3.84(d，J＝15.1Hz，1H)，3.82(d，J＝11.7Hz，1H)，3.68(d，J＝11.7Hz，1H)，3.36-3.24(m，2H)，2.95(dt，J＝11.7，4.5Hz，1H)，2.30-0.65(m，24H)，2.06(s，3H)，2.02(s，3H)，0.94(s，3H)，0.87(s，3H)，0.85(s，3H)，0.80(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ180.93，171.10，170.77，152.20，137.80，128.73，127.70，74.67，65.59，56.68，52.20，51.37，50.70，48.20，42.58，40.91，40.80，38.44，38.24，37.31，37.17，34.18，32.77，29.93，27.51，23.36，21.50，21.38，21.19，18.16，16.88，16.25，14.81，13.18，0.247。MS(ESI)m/z 662(M+H+)。
实施例28：30-N-苄基氨基-23-羟基-桦木酸(DA073)的制备
向DA072(10.7mg，16.2μmol)的MeOH溶液(500μL)中加入K2CO3(4.24mg，30.7μmol)。在室温下搅拌混合物19.5h。在0℃用H2O稀释反应混合物，并用浓HCl溶液酸化。用CHCl3×3(20.0mL)萃取混合物并干燥(Na2SO4)和浓缩混合的有机层。通过柱色谱法(CHCl3∶MeOH＝10∶1)纯化获得的残余物(6.30mg)以获得为白色固体的3.20mg(34％)期望化合物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.56-7.37(m，5H)，5.14(s，1H)，4.99(s，1H)，4.15-4.05(m，2H)，3.62(dd，J＝11.0，4.7Hz，1H)，3.54(d，J＝11.0Hz，1H)，3.47(d，J＝11.0Hz，1H)，3.09-2.98(m，1H)，2.50-1.94(m，4H)，1.80-0.80(m，20H)，1.32(s，3H)，1.00(s，3H)，0.91(s，3H)，0.70(s，3H)。13C NMR(125MHz，CD3OD)δ182.50，151.61，144.29，131.28，130.74，130.47，1 11.10，74.65，68.09，53.83，53.00，52.79，52.47，46.57，44.47，44.25，42.76，40.68，40.26，39.06，38.95，35.98，34.64，34.11，32.85，31.79，31.63，29.16，28.48，23.12，20.00，16.91，16.81，15.98，13.46。MS(ESI)m/z 578(M+H+)。
实施例29：3，23-二乙酰氧基-30-甲氧基-桦木酸(DA074)的制备
向3，23-二乙酰氧基-30-溴-桦木酸(17.5mg，27.5μmol)的MeOH溶液(1.00mL)中加入Ag2CO3(12.9mg，46.8μmol)。在40℃下搅拌混合物5h。通过SiO2的短衬垫过滤反应混合物，用AcOEt洗脱。在蒸干有机层后，通过柱色谱法纯化(己烷∶AcOEt＝6∶1)14.6mg残余物以获得为无色油状物的11.3mg(70％)期望化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.94(d，J＝2H)，4.76(dd，J＝11.7，4.5Hz，1H)，3.88(s，2H)，3.84(d，J＝15.1Hz，1H)，3.68(d，J＝15.1Hz，1H)，3.36(s，3H)，2.89(dt，J＝11.7，4.5Hz，1H)，2.28-0.65(m，24H)，2.06(s，3H)，2.01(s，3H)，0.98(s，3H)，0.92(s，3H)，0.88(s，3H)，0.80(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ181.42，171.15，170.80，151.17，109.30，75.21，74.68，70.08，65.60，58.55，56.54，50.71，50.03，48.20，43.24，42.57，40.91，40.82，38.60，38.22，37.20，37.08，34.21，32.27，29.94，29.91，26.80，23.36，21.51，21.21，18.15，16.86，16.28，14.84，13.18。MS(ESI)m/z 585(M-H+)，1061(2M-H+)。
实施例30：23-羟基-30-甲氧基-桦木酸(DA075)的制备
向DA074(8.50mg，14.5μmol)的MeOH溶液(500μL)中加入K2CO3(6.52mg，47.2μmol)。在室温下搅拌混合物20h并在50℃下搅拌28h。在0℃用H2O稀释反应混合物，并用浓HCl溶液酸化。用CHCl3×3(20.0mL)萃取混合物并干燥(Na2SO4)和浓缩混合的有机层。通过柱色谱法(CHCl3∶MeOH＝50∶1)纯化获得的残余物(7.20mg)以获得为白色固体的6.30mg(86％)期望化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.95(br s，2H)，4.62(br s，1H)，3.93(s，2H)，3.62(dd，J＝11.1，5.6Hz，1H)，3.54(d，J＝11.1Hz，1H)，3.37(s，3H)，2.96(dt，J＝11.1，3.9Hz，1H)，2.37-2.23(m，2H)，2.13-0.85(m，22H)，1.05(s，3H)，1.00(s，3H)，0.92(s，3H)，0.71(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ153.63，110.57，76.98，74.66，68.12，59.39，58.37，52.77，51.88，50.14，45.41，44.47，44.24，42.75，40.61，40.50，35.96，34.15，34.10，31.75，28.92，28.49，23.10，19.99，17.98，17.59，15.98，13.46。MS(ESI)m/z 501(M-H+)，1003(2M-H+)。
实施例31：3，23-二乙酰氧基-30-乙氧基-桦木酸(DA076)的制备
向3，23-二乙酰氧基-30-溴-桦木酸(21.7mg，34.1μmol)的EtOH溶液(1.00mL)中加入Ag2CO3(28.1mg，102μmol)。在40℃下搅拌混合物6h。通过SiO2的短衬垫过滤反应混合物，用AcOEt洗脱。在蒸干有机层后，通过柱色谱法(己烷∶AcOEt＝10∶1)纯化18.3mg残余物以获得为无色油状物的13.7mg(67％)期望化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.96(s，1H)，4.92(s，1H)，4.76(dd，J＝11.7，4.5Hz，1H)，3.93(s，2H)，3.84(d，J＝15.1Hz，1H)，3.78(d，J＝15.1Hz，1H)，3.50(q，J＝7.2Hz，1H)，2.89(dt，J＝11.7，4.5Hz，1H)，2.35-0.65(m，24H)，2.07(s，3H)，2.03(s，3H)，0.98(s，3H)，0.93(s，3H)，0.88(s，3H)，0.80(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ181.43，171.16，170.81，151.40，109.13，74.68，73.02，56.55，50.73，49.92，48.21，43.38，42.59，41.07，40.91，40.82，38.62，38.23，37.20，37.10，34.21，32.27，29.93，26.71，24.08，23.36，21.51，21.22，18.15，17.75，17.55，16.86，16.28，15.45，14.88，13.17。MS(ESI)m/z 599(M-H+)，1199(2M-H+)。
实施例32：23-羟基-30-乙氧基-桦木酸(DA077)的制备
向DA076(10.4mg，17.3μmol)的MeOH溶液(500μL)中加入K2CO3(7.18mg，51.9μmol)。在室温下搅拌混合物20h，并在50℃下搅拌混合物8.5h。在0℃用H2O稀释反应混合物，并用浓HCl溶液酸化。用CHCl3×3(20.0mL)萃取混合物并干燥(Na2SO4)和浓缩混合的有机层。通过柱色谱法(CHCl3∶MeOH＝500∶1→100∶1)纯化获得的残余物(8.50mg)以获得为白色固体的6.40mg(72％)期望化合物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ4.82(br s，2H)，3.85(s，2H)，3.48(dd，J＝11.1，5.5Hz，1H)，3.42(br d，J＝11.1Hz，1H)，3.40(q，J＝6.9Hz，2H)，3.25-3.15(m，1H)，2.83(dt，J＝12.0，5.5Hz，1H)，2.23-2.11(m，2H)，1.98-1.85(m，1H)，1.77(dd，J＝12.4，8.2Hz，1H)，1.69-0.69(m，23H)，1.10(t，J＝6.9Hz，3H)，0.92(s，3H)，0.87(s，3H)，0.79(s，3H)，0.58(s，3H)。13C NMR(125MHz，CD3OD)δ179.88，153.10，109.73，74.16，73.89，67.35，66.99，57.58，52.02，51.03，44.74，43.72，43.47，41.97，39.84，39.76，38.19，38.04，35.18，33.35，33.30，30.98，30.87，28.08，27.72，22.33，19.22，17.21，16.81，15.59，15.26，12.68；MS(ESI)m/z 1031(2M-H+)。
实施例33：23-二乙酰氧基-30-异丙氧基-桦木酸(DA078)的制备
向3，23-二乙酰氧基-30-溴-桦木酸(23.2mg，36.5μmol)的2-丙醇溶液(1.00mL)中加入Ag2CO3(30.3mg，110μmol)。在50℃下搅拌混合物19h。通过SiO2的短衬垫过滤反应混合物，用AcOEt洗脱。在蒸干有机层后，通过柱色谱法(己烷∶AcOEt＝8∶1)纯化20.4mg残余物以获得为无色油状物的12.7mg(57％)期望化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.97(s，1H)，4.90(s，1H)，4.76(dd，J＝11.7，4.5Hz，1H)，3.93(s，2H)，3.84(d，J＝15.1Hz，1H)，3.68(d，J＝15.1Hz，1H)，3.61(七重峰，J＝7.2Hz，1H)，2.88(dt，J＝11.7，4.5Hz，1H)，2.30-0.70(m，24H)，2.06(s，3H)，2.03(s，3H)，1.18(br d，J＝7.2Hz，6H)，0.98(s，3H)，0.93(s，3H)，0.88(s，3H)，0.80(s，3H)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ181.40，171.14，170.78，151.95，108.85，74.68，71.42，70.40，65.60，56.57，50.74，49.86，48.22，43.44，42.59，40.91，40.82，38.62，38.23，37.21，37.09，34.21，32.29，29.94，26.67，23.36，22.33，21.50，21.22，18.15，16.87，16.28，14.91，14.38，13.18，0.282。MS(ESI)m/z 613(M-H+)，1227(2M-H+)。
实施例34：23-羟基-30-异丙氧基-桦木酸(DA079)的制备
向DA078(9.10mg，14.8μmol)的MeOH溶液(500μL)中加入K2CO3(4.09mg，29.6μmol)。在50℃下搅拌混合物18h。在0℃用H2O稀释反应混合物，并用浓HCl溶液酸化。用CHCl3×3(20.0mL)萃取混合物并干燥(Na2SO4)和浓缩混合的有机层。通过柱色谱法(CHCl3∶MeOH＝500∶1)纯化获得的残余物(8.50mg)以获得为白色固体的4.60mg(58％)期望化合物6d。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ4.83(brs，2H)，4.49(br s，1H)，3.86(s，2H)，3.53(七重峰，J＝6.0Hz，1H)，3.50(br s，1H)，3.42(d，J＝10.6Hz，1H)，3.18(d，J＝10.6Hz，1H)，2.83(dt，J＝10.6，3.8Hz，1H)，2.25-2.10(m，2H)，1.98-1.83(m，1H)，1.77(dd，J＝12.0，8.0Hz，1H)，1.70-0.70(m，20H)，1.07(dd，J＝6.0，2.0Hz，6H)，0.92(s，3H)，0.87(s，3H)，0.79(s，3H)，0.58(s，3H)。13C NMR(125MHz，CD3OD)δ180.04，153.69，109.43，73.92，72.60，71.66，67.39，57.65，52.04，51.04，44.75，43.74，43.48，41.99，39.86，39.76，38.19，38.07，35.20，33.42，31.01，30.88，28.09，27.73，22.53，22.48，22.34，19.24，17.22，16.84，15.31，12.69。MS(ESI)m/z 529(M-H+)，1059(2M-H+)。
化合物DA080至DA090的合成如方案6至9所示。如果需要，可以将23-羟基-桦木酸的3，23-二羟基保护为乙酸酯或双-TBS酯。C28羧酸的修饰涉及酯的形成，将所得酯还原为醇和醇的反应以形成不同的醚和酯。C20-C29链烯烃区域的修饰涉及与mCPBA的反应以形成环氧化物，或与NBS反应以形成3-溴-2-丙烯基。可以通过与乙酸银反应来用乙酰氧基取代溴以形成3-乙酰氧基-2-丙烯基，可以将其脱保护以得到2-羟基-2-丙烯基。
方案6
Figure BPA00001331005300851
根据方案6所描述的合成步骤合成化合物DA080至DA084。
实施例35：23-羟基-桦木酸苄酯(DA080)的制备
在氮气下，在室温下搅拌23-羟基-桦木酸(325mg，0.69mmoL)、溴苄(0.12mL，1.03mmoL)和碳酸钾(190mg，1.38mmoL)在DMF(3.5mL)中的混合物24h。在根据TLC显示反应结束后，加入冰水(～20mL)。通过过滤收集所得白色沉淀。通过在硅胶上的柱色谱法纯化，用含2％至4％甲醇的二氯甲烷洗脱，得到期望的为白色固体的苄酯(351mg，0.62mmoL，90％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：7.35-7.36(m，5H)，5.15(d，J＝12.2Hz，1H)，5.09(d，J＝12.2Hz，1H)，4.72(s，1H)，4.59(s，1H)，3.70(d，J＝10.3Hz，1H)，3.60(m，1H)，3.40(d，J＝10.5Hz，1H)，3.01(m，1H)，2.28(m，1H)，2.18(m，1H)，1.84-1.93(m，2H)，1.67(s，3H)，1.55-1.65(m，6H)，1.20-1.32(m，12H)，0.98-1.12(m，2H)，0.93(s，3H)，0.86(s，3H)，0.84(s，3H)，0.76(s，3H)。13CNMR(100MHz，CDCl3)：175.6，150.3，136.2，128.3(2)，128.0(2)，127.9，109.5，76.3，71.4，65.6，56.4，50.4，49.8，49.3，46.8，42.3，41.7，40.6，38.4，38.1，37.0，36.9，34.0，32.0，30.5，29.5，26.7，25.5，20.8，19.3，18.3，16.5，15.8，14.7，11.4。ESI-MS：1125.70(2M+1)。
实施例36：23-羟基-20：29-环氧-桦木酸苄酯(DA081)的制备
向溶于干燥THF(4mL)的23-羟基-桦木酸苄酯(122mg，0.22mmoL)溶液中加入mCPBA(73mg，0.33mmoL)。在室温下搅拌所得混合物24h。用10％Na2S2O3淬灭反应并用二氯甲烷萃取。通过在硅胶上的柱色谱法纯化，提供为白色固体的期望产物(101mg，0.17mmoL，79％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：7.32-7.34(m，5H)，5.09(m，2H)，3.69(d，J＝10.2Hz，1H)，3.61(m，1H)，3.39(d，J＝10.2Hz，1H)，2.61-3.64(m，2H)，2.26-2.30(m，1H)，2.09-2.17(m，2H)，1.26-1.95(m，21H)，1.24(s，3H)，1.05(m，1H)，0.92(s，3H)，0.84(s，3H)，0.83(s，3H)，0.74(s，3H)。13CNMR(100MHz，CDCl3)：175.3，136.1，128.3(2)，128.1(2)，127.9，76.3，71.4，65.7，60.1，56.7，56.4，50.3，50.0，49.8，45.3，42.3，41.7，40.5，38.4，37.2，37.0，36.7，33.9，31.9，29.2，27.0，26.8，26.6，20.9，18.3(2)，16.4，15.8，14.6，11.4。ESI-MS：579.75(M+1)，1157.76(2M+1)。
实施例37：3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸苄酯的合成
在氮气下，在室温下搅拌3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸(DA060，15mg，0.024mmoL)、碳酸钾(7mg，0.05mmoL)和溴苄(0.004mL，0.036mmoL)在DMF(0.5mL)中的混合物18h。在根据TLC显示反应结束后，加入水。用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。干燥、过滤并浓缩混合的提取物。通过在硅胶上的柱色谱法纯化所得残余物，用含15％乙酸乙酯的石油醚洗脱以得到期望的苄酯产物(14mg，0.02mmoL，83％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.31-7.38(m，5H)，5.15(d，J＝12.3Hz，1H)，5.08(d，J＝12.3Hz，1H)，4.96(d，J＝7.5Hz，2H)，4.70-4.78(m，1H)，4.54(s，2H)，3.83(d，J＝11.7Hz，IH)，3.68(d，J＝11.6Hz，1H)，2.93-3.00(m，1H)，2.28-2.32(m，1H)，2.13-2.22(m，IH)，2.09(s，3H)，2.06(s，3H)，2.02(s，3H)，1.88-1.97(m，2H)，1.00-1.75(m，20H)，0.94(s，3H)，0.85(s，3H)，0.80(s，3H)，0.75(s，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：175.6，171.1，170.8，170.7，149.2，136.3，128.5(2)，128.2(2)，128.1，110.2，74.4，66.0，65.8，65.4，56.5，50.5，50.0，47.9，43.1，42.3，40.6，40.5，38.1，38.0，36.9，36.6，33.9，31.9，31.8，29.5，26.5，23.1，21.2，21.1，20.9，17.9，16.6，15.8，14.6，12.9。
实施例38：23，30-二羟基-桦木酸苄酯(DA083)的制备
向溶于THF/MeOH(0.5mL/1mL)的3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸苄酯(14mg，0.02mmoL)混合物中加入氢氧化钠(在水中20％，0.3mL)。在室温下搅拌5h后，用饱和氯化铵淬灭反应并用二氯甲烷(×3)萃取。浓缩混合的提取物并通过在硅胶上的柱色谱法纯化所得的残余物以提供为白色固体的期望产物(7mg，0.012mmoL，61％)。1HNMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：7.36-7.39(m，5H)，5.15(d，J＝12.3Hz，1H)，5.09(d，J＝12.2Hz，1H)，4.97(s，1H)，4.89(s，1H)，3.54-3.62(m，3H)，3.31-3.36(m，1H)，2.84(m，1H)，2.27-2.31(m，1H)，2.10-2.18(m，1H)，1.86-1.96(m，2H)，1.03-1.75(m，21H)，0.95(s，3H)，0.84(s，3H)，0.81(s，3H)，0.74(s，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3/CD3OD)：175.8，154.3，136.0，128.3，128.0，127.9，105.8，75.7，70.4，65.6，64.2，56.3，50.2，49.7，49.4，42.3，42.1，41.4，40.4，38.1，37.9，36.7，36.4，33.7，32.0，31.7，29.3，26.4，26.0，18.0，16.1，15.5，14.3，11.0。ESI-MS：1157.43(2M+1)，1180.32(2M+Na)。
实施例39：3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸乙酯的制备
使用与制备苄酯所述的相同步骤从DA060开始，通过用溴乙烷代替溴苄来制备3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸乙酯。收率为89％。1HNMR(300MHz，CDCl3)：4.98(s，1H)，4.95(s，1H)，4.77(dd，J＝10.8，4.2Hz，1H)，4.56(m，2H)，4.08-4.19(m，2H)，3.84(d，J＝11.6Hz，1H)，3.70(d，J＝11.6Hz，1H)，2.94-3.00(m，1H)，2.18-2.28(m，2H)，2.11(s，3H)，2.07(s，3H)，2.02(s，3H)，1.87-1.98(m，2H)，1.01-1.70(m，23H)，0.97(s，3H)，0.92(s，3H)，0.88(s，3H)，0.81(s，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：175.9，171.1，170.8，170.7，149.3，110.2，74.4，66.1，65.4，59.9，56.3，50.5，50.0，48.0，43.2，42.3，40.7，40.6，38.1，38.0，36.9，36.7，33.9，31.9，31.8，29.5，26.5，23.1，21.2，21.1，21.0(2)，17.9，16.6，15.9，14.6，14.3，12.9。
实施例40：3，30-二羟基-桦木酸乙酯(DA084)的制备
使用与合成DA083所述的相同步骤从3，23，30-三乙酰氧基-桦木酸乙酯开始，通过碱水解来制备DA084。收率为81％。1HNMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：4.97(s，1H)，4.90(s，1H)，4.08-4.16(m，4H)，3.55-3.64(m，2H)，3.35(d，J＝10.4，1H)，2.82-2.92(m，1H)，2.17-2.27(m，2H)，1.83-2.06(m，2H)，1.04-1.74(m，23H)，0.97(s，3H)，0.91(s，3H)，0.85(s，3H)，0.83(s，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3/CD3OD)：176.3，154.6，106.1，76.1，91.1，64.5，59.8，56.3，50.3，49.9，49.7，42.4，42.2，41.5，40.5，38.3，38.0，36.9，36.7，33.9，32.2，31.9，29.5，26.6，26.2，20.8，18.2，16.3，15.8，14.5，14.1，11.2。ESI-MS：1033.32(2M+1)，1055.20(2M+Na)。
方案7
Figure BPA00001331005300891
根据方案7所描述的合成步骤合成化合物DA085至DA087。
实施例41：28-乙酰氧基-30-溴-3.23-二-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)- 羽扇烯的制备
向溶于四氯化碳(7mL)的28-乙酰氧基-3，23-二-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)-羽扇烯(207mg，0.28mmoL)溶液中加入NBS(53mg，0.30mmoL)和AIBN(2mg，0.014mmoL)。在氮气下加热所得混合物至80℃，时间为3h。在用TLC检查后，加入更多的NBS(10mg)和AIBN(1mg)，并在80℃下继续反应2h，并在室温下使反应过夜。过滤反应并用四氯化碳冲洗。浓缩滤液并通过在硅胶上的柱色谱法纯化，用含2％乙酸乙酯的石油醚洗脱。获得被未反应的起始材料污染的期望产物的混合物，将其直接用于下一步骤中，而不进行进一步的纯化。
实施例42：28，30-二乙酰氧基-3.23-二-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)- 羽扇烯的制备
将从前面的溴化反应获得的混合物(186mg，0.23mmoL)溶于乙酸(5mL)中，并加入乙酸银(77mg，0.46mmoL)。在120℃加入所得混合物，时间为18h。停止反应并减压除去溶剂。水后处理，然后通过在硅胶上的柱色谱法纯化，用含3％至5％乙酸乙酯的石油醚洗脱，获得期望产物(105mg，0.13mmoL，58％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：4.93(s，1H)，4.92(s，1H)，4.53(s，2H)，4.20(d，J＝11.0Hz，1H)，3.83(d，J＝11.1Hz，1H)，3.65(dd，J＝10.7，4.9Hz，1H)，3.33(d，J＝9.7Hz，1H)，3.12(d，J＝9.7Hz，1H)，2.36(m，1H)，2.08(s，3H)，2.05(s，3H)，1.06-1.85(m，24H)，1.00(s，3H)，0.92(s，3H)，0.90(s，9H)，0.84(s，9H)，0.81(s，3H)，0.53(s，3H)，0.00(s，12H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：171.6，170.7，148.7，110.4，71.6，65.9，63.8，62.4，50.4，49.3，46.2，46.1，43.8，43.3，42.6，40.8，38.3，37.5，36.5，34.3，33.6，31.0，29.7，27.4，26.9，26.6，26.0(3)，25.9(3)，21.0，20.8，18.0(2)，17.8，16.3，16.1，14.5，12.3，-3.7，-5.0，-5.4，-5.9。
实施例43：28，30-二乙酰氧基-3，23-二羟基-20(29)-羽扇烯(DA085)的制 备
向溶于THF/MeOH(1.2mL/1.2mL)的28，23-二乙酰氧基-3，23-二-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)-羽扇烯(37mg，0.047mmoL)溶液中加入盐酸水溶液(37％，8滴)，并搅拌所得混合物2.5h。用饱和碳酸氢钠中和反应并减压除去挥发物。加入水并用二氯甲烷(×5)萃取混合物。通过在硅胶上的柱色谱法纯化，用含3％至6％甲醇的二氯甲烷洗脱以提供三个主要产物28，30-二乙酰氧基-3，23-二羟基-20(29)-羽扇烯(DA085，6mg，23％)，1HNMR(300MHz，CDCl3)：4.94(s，1H)，4.93(s，1H)，4.54(s，2H)，4.23(d，J＝10.8Hz，1H)，3.82(d，J＝11.0Hz，1H)，3.71(d，J＝10.5Hz，1H)，3.58-3.63(m，1H)，3.41(d，J＝10.2Hz，1H)，2.37(m，1H)，2.10(s，3H)，2.07(s，3H)，1.05-1.87(m，23H)，1.03(s，3H)，0.97(s，3H)，0.86(s，6H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：171.7，170.8，148.7，1 10.6，76.7，72.0，65.9，62.4，50.3，49.8，49.4，46.3，43.9，42.7，41.9，40.8，38.4，37.4，37.0，34.3，33.9，31.0，29.7，27.0(2)，26.5，21.1(2)，20.8，18.4，16.4，16.0，14.8，11.2。ESI-MS：581.37(M+Na)，1117.25(2M+1)。
实施例43：28-乙酰氧基-3，23，30-三羟基-20(29)-羽扇烯(DA086)的制备
以相似方式制备DA086(收率7mg，29％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：4.95(s，1H)，4.89(s，1H)，4.22(d，J＝12.3Hz，1H)，4.10(s，2H)，3.82(d，J＝11.0Hz，1H)，3.70(d，J＝10.2Hz，1H)，3.58-3.63(m，1H)，3.40(d，J＝10.2Hz，1H)，2.28-2.33(m，IH)，2.08-2.10(m，1H)，2.06(s，3H)，1.60-1.86(m，10H)，1.05-1.41(m，13H)，1.02(s，3H)，0.96(s，3H)，0.86(s，6H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：171.7，154.1，107.1，76.6，71.9，64.9，62.4，50.3，49.8，49.3，46.3，43.3，42.6，41.8，40.8，38.4，37.4，37.0，34.3，33.9，31.5，29.7，27.0，26.9，26.6，21.0，20.8，18.4，16.4，16.0，14.7，11.2。ESI-MS：1033.29(2M+1)。
实施例44：3，23，38，30-四羟基-20(29)-羽扇烯(DA087)的制备
3，23，28，30-四羟基-20(29)-羽扇烯(DA087，6mg，27％)。1HNMR(300MHz，CDCl3/CD3OD)：4.86(s，1H)，4.79(s，1H)，3.92-4.02(m，2H)，3.63-3.67(m，2H)，3.16-3.30(m，3H)，2.16(m，1H)，2.01(m，1H)，1.82(m，2H)，0.98-1.58(m，21H)，0.94(s，3H)，0.89(s，3H)，0.77(s，3H)，0.74(s，3H)。13CNMR(75MHz，CDCl3/CD3OD)：154.8，106.6，75.7，70.2，64.5，59.7，50.7，49.7，49.6，48.0，43.8，43.0，42.1，41.2，38.8，37.6，37.3，34.2，34.1，32.0，29.5，27.3，27.0，26.6，21.3，18.6，16.7，16.2，14.9，11.7。ESI-MS：971.30(2M+1)。
方案8
根据方案8所描述的合成步骤合成化合物DA088和DA090。
实施例45：28-乙酰氧基-30-羟基-3，23-二-(叔丁基二甲基硅氧 基)-20(29)-羽扇烯的制备
向溶于MeOH/THF(10mL/2mL)的28，30-二乙酰氧基-3，23-二-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)-羽扇烯(110mg，0.14mmoL)溶液中加入甲醇钠溶液(在MeOH中0.5M，0.2mL)。在室温下搅拌反应6h并用饱和氢氧化铵淬灭反应。减压除去挥发物。加入水并用二氯甲烷(×3)萃取混合物。干燥、过滤并浓缩提取物。通过在硅胶上的柱色谱法纯化，提供期望产物(78mg，0.11mmoL，75％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：4.93(s，1H)，4.87(s，1H)，4.19(d，J＝11.0Hz，1H)，4.09(m，2H)，3.84(d，J＝10.5Hz，1H)，3.63-3.66(m，1H)，3.33(d，J＝9.7Hz，1H)，3.11(d，J＝9.7Hz，1H)，2.30(m，1H)，2.04(s，3H)，2.03(m，1H)，1.06-1.85(m，23H)，1.00(s，3H)，0.92(s，3H)，0.90(s，9H)，0.84(s，9H)，0.81(s，3H)，0.53(s，3H)，0.00(s，12H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：171.6，154.2，107.0，71.6，64.9，63.8，62.5，50.4，49.4，46.2，46.1，43.3，42.6，40.8，38.3，37.5，36.5，34.3，33.6，31.5，29.7，27.4，26.9，26.8，26.0(3)，25.9(3)，21.0，20.9，18.0(2)，17.8，16.3，16.1，14.5，12.3，-3.7，-5.0，-5.3，-5.9。
实施例46：28-羟基-3，23，30-三-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)-羽扇烯 的制备
向溶于二氯甲烷(1mL)的28-乙酰氧基-30-羟基-3，23-二-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)-羽扇烯(58mg，0.078mmoL)溶液中加入咪唑(18mg，0.16mmoL)和TBSCl(18mg，0.12mmoL)。在氮气下，在室温下搅拌所得混合物过夜。用饱和氯化铵淬灭反应并用二氯甲烷(×3)萃取反应。干燥、过滤并浓缩提取物。将所得残余物溶于THF(5mL)中并加入甲醇钠的甲醇溶液(0.5M，5mL)。在室温下搅拌混合物过夜。在用饱和氯化铵中和后，减压除去挥发物。加入水并用二氯甲烷萃取混合物(×3)。干燥、过滤并浓缩提取物。通过在硅胶上的柱色谱法纯化，提供期望产物(46mg，0.056mmoL，2步的收率为72％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：4.93(s，1H)，4.80(s，1H)，4.03-4.09(m，2H)，3.76(d，J＝10.8Hz，1H)，3.66(dd，J＝11.2，4.9Hz，1H)，3.33(d，J＝9.5Hz，1H)，3.27(d，J＝10.8Hz，1H)，3.12(d，J＝9.5Hz，1H)，2.14(m，1H)，2.04(m，1H)，1.80-1.92(m，2H)，1.03-1.70(m，21H)，0.99(s，3H)，0.92(s，3H)，0.90(s，18H)，0.84(s，9H)，0.81(s，3H)，0.53(s，3H)，0.05(s，6H)，0.00(s，12H)。13CNMR(100MHz，CDCl3)：153.8，106.2，71.7，65.5，63.9，60.3，50.5，49.4，47.8，46.2，43.4，42.7，40.9，38.4，37.3，36.6，33.8，33.7，32.0，29.2，27.5，27.0，26.9，26.0(m)，21.0，18.5，18.2，18.1，18.0，16.4，16.1，14.6，12.5，-3.6，-4.9，-5.2，-5.3(2)，-5.7。
实施例47：28-苄氧基-3，23，30-三羟基-20(29)-羽扇烯(DA088)的制备
在氮气下，向溶于THF(1.5mL)的28-羟基-3，23，30-三-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)-羽扇烯(26mg，0.032mmoL)溶液中加入溴苄(0.016mL，0.12mmoL)和氢化钠(在矿物油中60％，10mg)。加热所得混合物至70℃，加热过夜。用饱和氯化铵淬灭反应并用二氯甲烷(×3)萃取反应。干燥、过滤并浓缩提取物。
将所得残余物溶于THF/MeOH(0.5mL/0.5mL)中并加入浓盐酸(3滴)。在室温下搅拌混合物5h，并用20％NaOH(4滴)淬灭。减压除去挥发物。加入水并用二氯甲烷萃取所得混合物(×3)。干燥、过滤并浓缩混合的提取物。通过在硅胶上的柱色谱法纯化，用含5％甲醇的二氯甲烷洗脱，提供期望产物(11mg，0.02mmoL，2步的收率为61％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：7.33(m，5H)，4.92(s，1H)，4.86(s，1H)，4.56(d，J＝12.5Hz，1H)，4.45(d，J＝12.5Hz，1H)，4.08(m，2H)，3.70(d，J＝10.2Hz，1H)，3.57-3.62(m，1H)，3.48(d，J＝8.6Hz，1H)，3.40(d，J＝10.3Hz，1H)，3.07(d，J＝8.6Hz，1H)，2.25(m，1H)，1.96-2.03(m，3H)，0.97-1.64(m，21H)，0.93(s，3H)，0.86(s，3H)，0.83(s，6H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：154.6，138.9，128.3(2)，127.5(3)，106.8，76.6，73.4，72.1，67.7，64.9，50.2，49.8，49.4，47.2，43.6，42.5，41.8，40.8，38.3，37.2，37.0，34.7，33.9，31.9，29.9，27.0，26.9，26.6，20.9，18.4，16.4，15.7，14.8，11.2。ESI-MS：1129.29(2M+1)。
实施例48：28-甲氧基-3，23，30-三羟基-20(29)-羽扇烯(DA090)的制备
使用与DA088所述的相似步骤，使用相同的起始材料，但在第一步中用碘代甲烷代替溴苄来制备28-甲氧基-3，23，30-三羟基-20(29)-羽扇烯(DA090)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：4.95(s，1H)，4.89(s，1H)，4.10(m，2H)，3.70(d，J＝10.4Hz，1H)，3.58-3.64(m，1H)，3.47(d，J＝9.1Hz，1H)，3.40(d，J＝10.4Hz，1H)，3.35(s，3H)，3.03(d，J＝9.1Hz，1H)，2.26-2.31(m，1H)，2.06-2.13(m，1H)，1.05-1.96(m，23H)，1.03(s，3H)，0.97(s，3H)，0.87(s，6H)。13CNMR(100MHz，CDCl3)：154.6，106.8，76.7，72.0，71.1，64.9，59.7，50.3，49.9，49.4，47.1，43.6，42.6，41.8，40.9，38.4，37.3，37.0，34.5，33.9，31.9，29.9，27.2，26.8，26.7，20.9，18.4，16.4，16.0，14.8，11.3。ESI-MS：977.23(2M+1)。
方案9
根据方案9所描述的合成步骤合成化合物DA089。
实施例49：28-甲氧基-3，23-二羟基-20(29)-羽扇烯(DA089)的制备
使用与DA088所述的相似的步骤，在两步中从28-羟基-3，23-二-(叔丁基二甲基硅氧基)-20(29)-羽扇烯和碘代甲烷开始制备28-甲氧基-3，23-二羟基-20(29)-羽局烯(DA089)。1HNMR(300MHz，CDCl3)：4.68(s，1H)，4.57(s，1H)，3.71(d，J＝10.1Hz，1H)，3.59-3.64(m，1H)，3.48(d，J＝9.1Hz，1H)，3.41(d，J＝10.2Hz，1H)，3.35(s，3H)，3.05(s，J＝9.1Hz，1H)，2.39-2.41(m，1H)，1.85-1.96(m，3H)，1.68(s，3H)，1.14-1.64(m，21H)，1.04(s，3H)，0.96(s，3H)，0.87(s，6H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：150.7，109.6，76.8，72.1，71.3，59.7，50.3，49.9，48.8，47.9，47.1，42.7，41.8，40.8，38.3，37.4，37.0(2)，34.7，33.9，29.9，27.2，26.9，25.1，20.8，19.0，18.4，16.4，16.0，14.8，11.2。ESI-MS：964.67(2M+1)。
实施例50：材料和方法
1.实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)诱导
在第0日，用100μg髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)/在尾部基底双侧皮下注射完全弗氏佐剂(CFA)乳剂盒(Hooke Laboratories)使六周龄的雄性C57BL/6小鼠(香港科技大学，动物养殖实验所)免疫。在免疫日腹膜内注射250ng百日咳毒素(PTX)(Hooke Laboratories)，并在24h后再次腹膜内注射250ng百日咳毒素(PTX)(Hooke Laboratories)。将白蛋白/CFA试剂盒(100μg，Hooke Laboratories)用作免疫对照组。每日通过口服给药用DA001和H2O(介质对照)喂养动物，剂量为100mg/kg或者用DA021和H2O(介质对照)喂养动物，剂量为100mg/kg。也称重动物，并且基于前面公开的标准，定量神经病学损伤。
2.原代脾细胞培养
在第21日，通过颈部错位处死EAE小鼠，并无菌除去脾。然后用已灭菌的剪刀切除除去的脾，并通过70μM筛网(BD Bioscience)用5mL注射器(BD Bioscience)的活塞过滤，注射器中含有具有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Sigma)9mL的RPMI 1640(Invitrogen)。然后向9mL淋巴细胞(Cedarlane Laboratories)中加入细胞混合物，以通过在1500g离心20min将脾细胞从红血细胞中梯度分离。离心分离后，小心除去含脾细胞的淋巴细胞层，并用10mL RPMI 1640以800g洗涤三次，时间为10min。将分离的脾细胞接种在不同样式的板上并用补充了10％热灭活的胎牛血清(Invitrogen)和100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(Invitrogen)在37℃的CO2培养箱中培养。
3.蛋白质印迹分析
在6-孔板(Falcon)中以1×107细胞的密度培养EAE小鼠的脾细胞，并在不存在或存在MOG肽(25μg/mL)(Hooke Laboratories)、DA001、和DA021(30μM)的情况下处理24h。在过夜孵育后，用含抗痛素二盐酸盐(antipain dihydrochlorid)、胰蛋白酶抑制剂、亮肽素、抑肽酶、原钒酸钠、苄脒和苯甲基磺酰氟的RIPA溶解脾细胞。在14000rpm，4℃下离心分离15min后，通过DcProtein Assay kit(Bio-Rad)检测蛋白浓度。对20μg的每个样品进行20mA的10％SDS-PAGE，时间为3h。通过使用微型转印仪(Bio-Rad)将蛋白质转移在硝化纤维膜上来进行免疫印迹分析。在用牛奶封闭2h后，在4℃下用特定的原代Abs(1∶1000)：anti-phospho-Stat 3(细胞信号)、anti-phospho-Stat 4(BD Bioscience)，和anti-phospho-Stat 6(细胞信号)过夜孵育膜。将抗-α-微管蛋白(Sigma)用作内标。在洗涤后，在室温下用抗-兔或抗-鼠HRP-共轭二级抗体(1∶3000)(细胞信号)进行后续孵育1h。通过ECL蛋白质印迹检测试剂盒(GE Healthcare)检测信号。
4.QuantikineTM ELISA检验
在不存在或存在MOG肽(25μg/mL)(Hooke Laboratories)、DA001和DA021(30μM)的情况下，用补充了10％热灭活的胎牛血清(Invitrogen)和100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(Invitrogen)在12-孔板(Falcon)中以1×106细胞的密度培养EAE小鼠的脾细胞48h。在48h后，以300g在4℃下，通过沉淀细胞收集上清液持续10min。向由Quantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)的生产商提供的微量滴定板中加入50μL的每个样品。加入另外的50μL检验稀释缓冲液，并在室温下孵育2h。在孵育后，丢弃上清液并用洗涤缓冲液洗涤细胞。向细胞中加入100μL缀合物，并在室温下再次孵育板2h。在另外的洗涤后，加入100μL底物溶液，然后在室温下孵育30min。随后，向每孔中加入100μL终止液，并在450nm波长下，在微板读出器(Dynex Revelation 2.2)上读板。
5.苏木精和伊红染液
在第21日，用4％(w/v)水合氯醛(BDH)的0.9％(w/v)盐溶液(USB)腹膜内麻醉动物。一旦进行麻醉，随后用50mL的37℃，0.005％(w/v)肝素化(Sigma)盐溶液(USB)穿心灌注(Gilson)动物，然后用80mL冰冷的4％(w/v)多聚甲醛(Sigma)的Dulbecco’s磷酸缓冲盐(GIBCO)穿心灌注动物。然后在4℃下，用4％(w/v)多聚甲醛(Sigma)进一步固定灌注的脊髓过夜。在过夜孵育后，在自动组织加工器中制备样品以用于脱水、清洁和石蜡渗透(Leica EG1 150H)及随后的石蜡包埋(Leica RM2255)。在室温下孵育过夜后，在6μm厚的切片机(Leica 1250)上切断块并将其放在Histobond载玻片(Merienfeld)上。在染色前，在60℃烘箱中孵育载玻片24h。在染色日，在一系列EtOH溶液中再水化载玻片。然后在室温下，在苏木精溶液中淹没再水化的载玻片20min。在被固定在一系列EtOH溶液，然后被固定在伊红中20min前，在室温下在酸性溶液中分化载玻片。在显微镜下将载玻片安在用于可目视的DPX抗淬灭剂(mounting media)(Sigma)前，在蒸馏水中洗涤载玻片，并在一系列EtOH溶液中使其脱水。
6.评价在脂多糖诱导的细胞因子产生的鼠科模型中的DA021
Washington Biotechnology Inc.，Columbia，MD，protocol 1077进行了合同研究。称重Swiss-Webster小鼠(雌性，Harlan Sprague-Dawley，5-6周)，并将10ml/kg水、剂量为10mg/kg的泼尼松龙或剂量为30mg/kg或100mg/kg的DA021经口给予小鼠。口服给药后三十分钟，注射剂量为2mL/kg的脂多糖(LPS)。在LPS注射后两小时，麻醉小鼠，并将血抽入血清分离器微容器管中。将血液加工成血清。根据生产标准通过ELISA(Pierce)分析血清样本的肿瘤坏死因子-α(TNFα)的浓度。
7.评价在噁唑酮诱导的耳水肿的鼠科模型中的DA021
Washington Biotechnology Inc.，Columbia，MD，protocol 1041进行了合同研究。在第0日，在右耳的腹部表面上剃42只BALB/c小鼠(雌性，Harlan Sprague-Dawley，5-6周)的毛发。然后将100μl的5％噁唑酮溶液(Sigma)用于保留的耳朵。然后将处理的小鼠送回笼子，并保留另外的6天。在第7天，称重小鼠并用10ml/kg水或剂量为30mg/kg或100mg/kg的DA021口服给药，或者将25μl倍他米松局部用于双耳的两侧。在口服给药后三十分钟，将5μl的3％噁唑酮应用于右耳的两侧并将5μl丙酮应用于对侧耳部的两侧。在3％噁唑酮/丙酮应用后二十四小时，使小鼠安乐死，除去耳朵并称重。
8.评价在减少缺血性大脑的梗塞面积和水肿中的DA001
进行MCAO(中颈动脉闭塞模型)以研究当大脑暴露于诸如中风期间的短暂的局灶性缺血(或缺氧)时DA001对大脑的保护效应。在缺血后6小时测量用化合物处理的实验个体的半球形脑肿胀和梗塞体积(由不充足的血供导致的死组织面积)，并将其与对照组比较。DA001有效地降低了缺血疾病状态下的梗塞体积(由不充足的血供导致的死组织面积)和水肿范围。
9.Morris水迷宫
将6至8周龄远系繁殖的重量为25g至35g的雄性I.C.R.小鼠安置在两个笼子中，每个笼子为在12小时亮/暗循环下的气候控制动物室(23℃至25℃)。允许动物没有限制地接触水和食物。将用于实验的小鼠带至特殊的实验室条件下两日。在14:00至18:00间进行所有的实验。将氢溴酸东莨菪碱(Sigma，USA)溶于盐水中，浓度为0.1mg/kg，并且以10ml/kg体重的体积给药。将实验小鼠随机分成4或6组，每组包括具有相似平均体重和年龄的12只小鼠。在每日实验前，将测试化合物溶于生理盐水中。在游泳任务前，通过腹腔内注射(i.p.)给予东莨菪碱(0.1-4mg/kg)30分钟以诱导记忆减退。在任务第一天开始口服(p.o.)样品(0.1、0.2、0.4、30和100mg/kg)或其盐溶液(0.9％NaCl)，并根据10ml/kg体重的体积给药。在游泳任务前45分钟提供口服给药，并直到任务结束时在4个连续日中进行口服给药。
在5个连续日内每日对每只小鼠进行4个测试。当持续面对水池壁的小鼠淹没在水中时测试开始。然后给小鼠60秒寻找平台。如果小鼠未能在该时间段内逃离，则引导它并将其放置在平台上。不管小鼠能否找到平台，其停留在这20秒。在测试之间有30秒的恢复期。从远离平台的2点(北部和西部)开始4次测试。在行为测试(一个实验)的第五日在60秒内估计探索测试(没有平台)，计算地记录在训练期间，在其中已经放置了逃离平台的东南部象限花费的时间，并将其表示为空间偏好的百分数。
因为在行为实验中小鼠的逃离潜伏期和游泳距离二者显示出相似的组差异，应将找到水迷宫中平台的逃离潜伏期用于评价实验小鼠的记忆能力。用重复测试的二因素的ANOVA用于分析潜伏期值，并将其算为每只小鼠的平均潜伏周期。(通过使用2-因素ANOVA，数据表示为平均值±S.E.M.)。将单因素ANOVA，然后是Duncan’s多重范围检验(数据表示为平均值±S.E.M.*P＜0.05和**P＜0.01对东莨菪碱)用于分析在探索测试期间收集的数据的组差异。
RNA提取、cDNA合成和实时定量PCR
用DA001或DMSO预孵化11DIV-12DIV的皮层神经元24小时。在没有镁的Locke’s介质中洗涤细胞15min，然后用NMDA(20μM)或水处理20min。用正常生长的介质孵育神经元，并在NMDA处理后，或在没有NMDA处理的情况下，以不同的时间间隔提取总RNA。根据生产标准使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)提取总RNA，并将总RNA反转录至具有上标II反转录酶(Invitrogen)和oligo-dT引物的单链cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在Mx3000P实时PCR系统(Stratagene)上进行实时定量PCR。用10-min变性步骤，在95℃开始热循环，然后进行95℃的40个循环，时间为30秒，60℃的循环1分钟，和72℃的循环30秒。在反应结束时对最终产品进行Meltcurve检测。在管家基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的背景下使基因表达的调节标准化。实时PCR引物如下：
正向BDNF：TTGAGCACGTGATCGAAGAG
反向BDNF：CCAGCAGAAAGAGCAGAGGA
正向NT-3：GGGGGATTGATGACAAACAC
反向NT-3：ACAAGGCACACACACAGGAA
正向Bcl-2：ATAACCGGGAGATCGTGATG
反向Bcl-2：CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
正向c-fos：GGAGCCGGTCAAGAACATTA
反向c-fos：TGCTGCATAGAAGGAACCAG
正向HPRT1：TGACACTGGTAAAACAATGCA
反向HPRT1：GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT
正向GAPDH：TGCACCACCAACTGCTTAGC
反向GAPDH：GGCATGGACTGTGGTCATGAG
正向NGF：CAACAGGACTCACAGGAGCA
反向NGF：GTCCGTGGCTGTGGTCTTAT
正向NT-4：TCCCCTGCGTCAGTACTTCT
反向NT-4：CGCACATAGGACTGTTTTAGCC
正向C/EBPb：ATCGACTTCAGCCCCTACCT
反向C/EBPb：CGTAGTCGGACGGCTTCTT
抵御NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)兴奋性中毒的海马/皮层神经元存活检验
从Sprague-Dawley大鼠的第18胚胎日制备海马神经元/皮层神经元。在已经从大脑除去皮质后，使用具有B27添加剂(17504-044，Gibco)、青霉素/链霉素(15140，Gibco)和1mM L-谷氨酸盐(25030，Gibco)的Neurobasal介质(NB)(21103-049，Gibco)将分离的细胞培养在多聚d-赖氨酸(PDL)(P0899，Sigma)涂布的48孔板上(150687，NUNC)，板密度为每孔2×105细胞。在37℃下，在含5％CO2的空气的潮湿环境下，孵育细胞培养基。在3小时后将介质变为生长介质(growth medium)(具有青霉素/链霉素和B27添加剂的Neurobasal介质)。在体外(DIV10)，每隔2至3日将半介质与生长介质对调以保持细胞直到第10日。在生长介质中制备连续稀释的样品，并将DMSO用作介质对照。对于预处理检验，从孔中除去一半介质，并替换为等量的稀释样品。然后在37℃下，在含5％CO2的空气的潮湿环境下，孵育细胞2小时。随后用Locke’s溶液(含5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM磷酸氢二钠、5mM HEPES和10mM葡萄糖的Milli-Q水)冲洗培养基，然后在N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)(M-3262，Sigma)处理前，用Locke’s溶液在甘氨酸(10μM)存在的情况下孵育15分钟。然后替换溶于Locke’s加甘氨酸溶液的NMDA，并在37℃下孵育20分钟。对于共处理NMDA检验，在Locke’s溶液加甘氨酸和20μMNMDA溶液中制备连续稀释的样品，并在37℃，5％CO2下，孵育20分钟。然后，在生长介质中孵育细胞18至24小时，并用细胞毒性检测试剂盒(1644793，Roche)检测。
抵御谷氨酸盐兴奋性中毒的海马/皮层神经元存活检验
从Sprague-Dawley大鼠的第18胚胎日制备海马/皮层神经元。在已经从大脑除去皮质后，使用具有B27添加剂(17504-044，Gibco)、青霉素/链霉素(15140，Gibco)和1mM L-谷氨酸盐(25030，Gibco)的Neurobasal介质(NB)(21103-049，Gibco)将分离的细胞培养在聚d-赖氨酸(PDL)(P0899，Sigma)涂布的48孔板上(150687，NUNC)，板密度为每孔2×105细胞。在37℃下，在含5％CO2的空气的潮湿环境下，孵育细胞培养基。在3小时后将介质变为生长介质(具有青霉素/链霉素和B27添加剂的Neurobasal介质)。在体外(DIV10)，每隔2至3日将半介质与生长介质对调以保持细胞直到第10日。在生长介质中制备连续稀释的样品，并将DMSO用作介质对照。对于预处理检验，从孔中除去一半介质，并替换为等量的稀释样品。然后在37℃下，在含5％CO2的空气的潮湿环境下，孵育细胞2小时。随后用Locke’s溶液(含5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM磷酸氢二钠、5mMHEPES和10mM葡萄糖的Milli-Q水)冲洗培养基，然后在N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)(M-3262，Sigma)处理前，用Locke’s溶液在甘氨酸(10μM)存在的情况下孵育15分钟。然后替换溶于Locke’s加甘氨酸溶液的谷氨酸盐，并在37℃下孵育20分钟。对于共处理谷氨酸盐检验，在Locke’s溶液加甘氨酸和谷氨酸盐溶液中制备连续稀释的样品，并在37℃，5％CO2下，孵育20分钟。然后，在生长介质中孵育细胞18至24小时，并用细胞毒性检测试剂盒(1644793，Roche)检测。
抵御红藻氨酸盐兴奋性中毒的皮层神经元存活检验
从Sprague-Dawley大鼠的第18胚胎日制备皮层神经元。在已经从大脑除去皮质后，使用具有B27添加剂(17504-044，Gibco)、青霉素/链霉素(15140，Gibco)和1mM L-谷氨酸盐(25030，Gibco)的Neurobasal介质(NB)(21103-049，Gibco)将分离的细胞培养在聚d-赖氨酸(PDL)(P0899，Sigma)涂布的48孔板上(150687，NUNC)，板密度为每孔2×105细胞。在37℃下，在含5％CO2的空气的潮湿环境下，孵育细胞培养基。在3小时后将介质变为生长介质(具有青霉素/链霉素和B27添加剂的Neurobasal介质)。在体外(DIV10)，每隔2至3日将半介质与生长介质对调以保持细胞直到第10日。在生长介质中制备连续稀释的样品，并将DMSO用作介质对照。对于预处理检验，从孔中除去一半介质，并替换为等量的稀释样品。然后在37℃下，在含5％CO2的空气的潮湿环境下，孵育细胞2小时。随后用Locke’s溶液(含5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM磷酸氢二钠、5mM HEPES和10mM葡萄糖的Milli-Q水)冲洗培养基，然后在N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)(M-3262，Sigma)处理前，用Locke’s溶液在甘氨酸(10μM)存在的情况下孵育15分钟。然后替换溶于Locke’s加甘氨酸溶液的红藻氨酸盐，并在37℃下孵育20分钟。对于共处理红藻氨酸盐检验，在Locke’s溶液加甘氨酸和红藻氨酸盐溶液中制备连续稀释的样品，并在37℃，5％CO2下，孵育20分钟。然后，在生长介质中孵育细胞18至24小时，并用细胞毒性检测试剂盒(1644793，Roche)检测。
抵御β淀粉样多肽兴奋性中毒的皮层神经元存活检验
从Sprague-Dawley大鼠的第18胚胎日制备皮层神经元。在已经从大脑除去皮质后，使用具有B27添加剂(17504-044，Gibco)、青霉素/链霉素(15140，Gibco)和1mM L-谷氨酸盐(25030，Gibco)的Neurobasal介质(NB)(21103-049，Gibco)将分离的细胞培养在聚d-赖氨酸(PDL)(P0899，Sigma)涂布的48孔板上(150687，NUNC)，板密度为每孔1×105细胞。在37℃下，在含5％CO2的空气的潮湿环境下，孵育细胞培养基。在3小时后将介质变为生长介质(具有青霉素/链霉素和B27添加剂的Neurobasal介质)。在体外，每隔2至3日将半介质与生长介质对调以保持细胞直到第7日(7DIV)。在生长介质中制备连续稀释的样品，并将DMSO用作介质对照。对于预处理部分，从孔中除去一半介质，并替换为等量的稀释样品。然后在37℃下，在含5％CO2的空气的潮湿环境下，孵育细胞2小时。随后用衍生自DA001的化合物(不同浓度，[μM])以及Aβ25-35(10μM，Sigma)孵育皮层神经元24小时。通过在Aβ25-35处理后24小时进行的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑，USB)检验检测活细胞的数量。在活细胞的线粒体中将黄色MTT还原为紫色甲
Figure BPA00001331005301021
加入增溶溶液[10％SDS(十二烷基硫酸钠)/0.01M盐酸]以将不溶的紫色甲产物溶解为有色溶液，随后在570nm波长下，使用分光光度计(DYNEX Technologies)将其定量。
实施例51：DA001拮抗MC1和MC4受体活性
DA001抑制配体与MC1和MC4受体结合。为了检测抑制效应是否由于激动或拮抗活性，在评估受体功能的细胞检验中在6或8种浓度下评价DA001。当配体结合时，激活MC1或MC4受体，这导致细胞内环AMP增加。在MC1或MC4受体配体、α-MSH的存在下，在过度表达MC1或MC4受体的细胞中，DA001显示出对环AMP的剂量依赖性抑制，而单独的DA001不诱导在MC4受体上的cAMP增加。图1例示当配体(NDP-α-MSH)结合(红线)时，DA001显示出通过降低cAMP而对MC1和MC4受体的剂量依赖性抑制效应增加。单独的DA001不能诱导cAMP增加(蓝色正方形点)。DA001显示出对人类MC1和MC4受体的拮抗效应，IC50分别为5.0E-05M(KB为5.3E-06M)和1.7E-05M。用MC2受体功能检验进一步评价DA001。当配体结合时，激活MC2受体，这导致细胞内环AMP增加。在存在或不存在MC2受体配体，促肾上腺皮质激素[ACTH 1-39]的情况下，在如下表所示的过度表达MC2受体的细胞中，DA001不显示出对MC2受体的任何作用。
  MC2受体   cAMP检测
  拮抗效应   0
  激动效应   -8
实施例52：DA001抑制对EP受体的E型前列腺素结合
以32受体结合检验为背景进一步评价DA001。通过在两份一种浓度(10uM)下检验DA001来进行放射配体竞争检验。根据生产标准的50％的切断抑制，DA001显著抑制了E型前列腺素(PGE2)与其受体家族EP1、EP2和EP4的配体结合。这可以与放射配体[3H]PGE2与EP1和EP4受体结合竞争，并且较弱地与EP2和FP受体竞争。
实施例53：DA001拮抗EP1和EP4受体
为了检测DA001对与EP受体的配体结合的抑制效应是否产生激动或拮抗活性，以单一的浓度(10μM)在细胞特异性受体功能检验中评价DA001。在配体结合时，激活EP受体，这导致细胞内环AMP增加。在不存在受体配体的情况下，DA001不显示出对EP受体的任何效应，但在过度表达这些受体的细胞中，显示拮抗EP1和EP4受体活性的效应。对于EP1和EP2受体，在存在PGE2的情况下，DA001显示出对环AMP诱导的抑制分别为38％和41％，而单独的DA001不导致cAMP在这些受体中增加。
表4
  cAMP检测   EP1受体   EP2受体   EP4受体
  激动效应   8.1   -0.8   -11
  拮抗效应   38   2.2   41
在表4中，DA001表现出对EP1和EP4受体的中等拮抗效应。
用人类EP1或EP4受体过度表达CHO细胞对DA001(10μM)进行配体结合检验。结果表示为在DA001存在下，获得的对照特异性激动应答的百分数[100-(测得的特异性应答/对照特异性激动应答)×100]。
实施例54：DA001降低了缺血性大脑的梗塞面积和水肿
当暴露于诸如中风期间的短暂局灶性缺血(或缺氧)时，进行MCAO(中颈动脉闭塞模型)以研究DA001对大脑的保护效应。在缺血后6小时，在用化合物处理过的试验个体上检测神经学评分、半球形脑肿胀和梗塞体积(由不充足的血供导致的死组织面积)，并将其与对照组比较。在如图2所示的缺血疾病状态期间，DA001有效减弱了神经病学缺失，降低了梗塞体积(由不充足的血供导致的死组织面积)，尤其是在3至5号脑切片中，以及水肿范围。
在局部缺血后6h口服给予的DA001(12.6mg/kg和25.2mg/kg)显著改善了缺血大鼠的神经病学评分。DA001在剂量为12.6mg/kg和25.2mg/kg时也显著降低了MCAO大鼠的总梗塞，并在42mg/kg的剂量下降低了水肿范围。
实施例55：依据NMDA处理，DA001诱导NGF、BDNF、NT-3和 NT-4表达
在对细胞进行NMDA损伤后，用DA001预处理皮层神经元。在三个不同时间间隔检测神经营养因子的表达。DA001诱导了NGF、BDNF和NT-3表达，但在相同条件下不诱导NT-4表达。图3例示用DA001或DMSO对照孵育皮层神经元24hrs，然后用NMDA(20μM)或水处理皮层神经元20min。以管家基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为背景使基因表达标准化，并且将其与用NMDA处理的对照(DMSO)对比。将由DA001+NMDA诱导的基因表达的相对变化与DMSO+NMDA对比。
用DA001或DMSO对照孵育皮层神经元24hrs，然后用NMDA(20μM)或水处理皮层神经元20min。以管家基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为背景使基因表达标准化，并且将其与用NMDA处理的对照(DMSO)对比。将由DA001+NMDA诱导的基因表达的相对变化与DMSO+NMDA对比。
实施例56：DA001诱导皮层神经元中的CEBPb mRNA
在不同的时间间隔用DA001处理皮层神经元。在三个不同的时间间隔，通过实时PCR检测CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP-b)和c-fos的表达。在2日处理后，DA001诱导C/EBP-b表达，但在相似条件下不影响c-fos的表达。如图4所示，DA001诱导皮层神经元中的CEBPbmRNA。在三个不同的时间间隔用DA001或DMSO对照孵育皮层神经元。以管家基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为背景使基因表达标准化，并且将其与对照(DMSO)处理对比。将由DA001诱导的基因表达的相对变化与DMSO对比。星号表示P＜0.05。
实施例57：DA001保护神经元不受不同浓度红藻氨酸盐的影响
用DA001处理皮层神经元并随后使用不同浓度的红藻氨酸盐。然后进行存活检验以确定DA001有效保护神经元细胞不受红藻氨酸盐诱导的兴奋性中毒影响的能力。如图5所示，在高浓度红藻氨酸盐条件下，当用DA001处理时，与DMSO对照相比，细胞死亡存在显著降低。
图5例示DA001保护神经元不受不同浓度红藻氨酸盐影响。用DA001(40μM)或对照(DMSO)孵育皮层神经元24hrs，然后用不同浓度的红藻氨酸盐(KA，5-500μM)共处理20min。然后测量释放入介质的LDH。
实施例58：在体内研究中，DA021增强了学习和记忆
使用Morris水迷宫任务，即研究海马依赖性学习和记忆的优选的试验，证明新颖的化合物对小鼠空间学习和记忆的治疗效应。
对于化合物DA021，在5天的训练后，对照组(油/盐水)的试验个体花费了30秒发现平台。相比之下，在相同的训练期后，东莨菪碱诱导的记忆损伤组需要将近两倍的时间量来找出平台。在第4和第5日，DA001显著反转了通过东莨菪碱诱导的增加的逃避潜伏期。图6例示DA021降低了Morris水迷宫模型的逃避潜伏期。首先腹膜内给予小鼠东莨菪碱(SCOP；4mg/kg)以损伤其记忆。然后将DA021(10mg/kg)口服给予东莨菪碱诱导的记忆损伤小鼠，并在5日内使小鼠进行Morris水迷宫。每天，在很短的时间内，测量在水迷宫中小鼠发现隐藏的平台花费的时间。将测定的数据计算为每只小鼠的平均潜伏期，每组n＝12。将数据表示为平均值±s.e.m.，并将其与油/SCOP组比较。剂量表示为mg/kg。
实施例59：DA021抑制特定的前列腺素和褪黑激素受体
为了检测DA化合物的靶点，在用于前列腺素受体家族的结合检验中评价化合物。以两份单一浓度(10μM)检测两种化合物。DA001和DA021抑制前列腺素E2受体EP1、EP2和EP4的配体结合，并适度抑制前列腺素(PGF)与其受体(FP)的结合，但不抑制前列腺素I(PGI2)、血栓素A和前列腺素D2与其受体的结合。
Figure BPA00001331005301071
实施例60：DA021和DA034保护神经元不受不同浓度谷氨酸盐的影 响
用DA021或DA034预处理皮层神经元并随后使用不同浓度的谷氨酸盐(10-200μM)。谷氨酸盐是激活NMDA受体的神经递质。然后进行存活检验以确定DA021或DA034有效保护神经元细胞不受兴奋性中毒影响的能力。如图7所示，在高浓度谷氨酸盐条件下，当用DA021或DA034处理时，与DMSO对照相比，细胞死亡存在显著降低。图7例示DA021和DA034保护神经元不受不同浓度谷氨酸盐影响。用DA021(30μM)、DA034(30μM)或对照(DMSO)孵育皮层神经元24hrs，然后用不同浓度的谷氨酸盐(10μM至200μM)处理20min。然后测量释放入介质的LDH。
实施例61：DA021和DA034保护神经元不受不同浓度红藻氨酸盐的 影响
用DA021或DA034处理皮层神经元并随后使用不同浓度的红藻氨酸盐。然后进行存活检验以确定DA021或DA034有效保护神经元细胞不受红藻氨酸盐诱导的兴奋性中毒影响的能力。图8例示DA021和DA034保护神经元不受不同浓度红藻氨酸盐影响。用DA021(30μM)、DA034(30μM)或对照(DMSO)孵育皮层神经元24hrs，然后用不同浓度的红藻氨酸盐(KA，5-500μM)共处理20min。然后测量释放入介质的LDH。
实施例62：DA021和DA034保护神经元不受不同浓度NMDA的影响
用DA021或DA034处理皮层神经元并随后使用不同浓度的NMDA。然后进行存活检验以确定DA021或DA034有效保护神经元细胞不受NMDA诱导的兴奋性中毒影响的能力。如图9所示，在高浓度NMDA条件下，当用DA021或DA034处理时，与DMSO对照相比，细胞死亡存在显著降低。图9例示DA021和DA034保护神经元不受不同浓度NMDA影响。用DA021(30μM)、DA034(30μM)或对照(DMSO)孵育皮层神经元24hrs，然后用不同浓度的NMDA(10μM至200μM)共处理20min。然后测量释放入介质的LDH。
实施例63：DA021保护神经元不受海马神经元中不同浓度NMDA的 影响
用DA021处理海马神经元并随后使用不同浓度的NMDA。然后进行存活检验以确定DA021有效保护神经元细胞不受NMDA诱导的兴奋性中毒影响的能力。图10例示DA021保护神经元不受不同浓度NMDA影响。用DA021(30μM)或对照(DMSO)孵育海马神经元24hrs，然后用不同浓度的NMDA(10μM至200μM)共处理20min。然后测量释放入介质的LDH。
实施例64：DA021保护神经元不受海马神经元中不同浓度谷氨酸盐的 影响
用DA021处理皮层神经元并随后使用不同浓度的谷氨酸盐。然后进行存活检验以确定DA021有效保护神经元细胞不受谷氨酸盐诱导的兴奋性中毒影响的能力。图11例示DA021保护神经元不受海马神经元中不同浓度谷氨酸盐影响。用DA021(30μM)或对照(DMSO)孵育海马神经元24hrs，然后用不同浓度的谷氨酸盐(10μM至200μM)处理20min。然后测量释放入介质的LDH。
实施例65：DA001的衍生物保护皮层神经元不受NMDA兴奋性中毒 的影响
合成DA001的总共90种衍生物，并且图12显示了它们在NMDA存活检验中的存活数据。具有抗NMDA兴奋性中毒的强保护效应(＞80％存活)的化合物为DA001原型、衍生物DA010、DA021、DA034、DA040、DA081和DA088。那些具有中等效应的化合物为DA002、DA005、DA007、DA008、DA017、DA032、DA035、DA036、DA042和DA046。图12例示DA001的衍生物解救皮层神经元不受NMDA兴奋性中毒影响。在NMDA处理前24小时，用衍生自DA001的化合物(30μM或在括号中另外显示)处理皮层神经元。在NMDA处理后24小时检测释放入介质的LDH。数据表示为以溶剂对照(DMSO)为背景计算的细胞存活(±s.e.m)的平均百分数，并将其与没有NMDA对照(表示为100％存活)的相比。实心柱表示具有强保护效应(＜80％)的化合物，而阴影柱表示具有中等效应(50％至80％)的化合物，空心柱表示没有或具有小于50％保护效应的化合物。根据学生T检验，P＜0.05，所有的强和中等神经保护化合物表现出细胞存活的显著增加。
实施例66：DA001剂量依赖地拮抗EP2和EP4受体活性
如图13所示，当PGE2配体结合时，DA001抑制EP2和EP4受体活性。在评价受体功能的细胞检验中，在6种浓度下评价DA001。当配体结合时，激活EP2和EP4受体，这导致细胞内环AMP增加。在过度表达EP2或EP4受体的细胞中，在PGE2存在的情况下，DA001显示出对环AMP的剂量依赖性抑制。
实施例67：DA021拮抗EP1受体活性
DA021抑制PGE2配体与EP1、EP2和EP4受体的结合。为了检测抑制效应是否归因于激动或拮抗活性，在评价受体功能的细胞检验中，在1种浓度(30uM)下评价和比较DA021。当配体结合时，激活EP受体，这导致细胞内环AMP增加。在PGE2存在的情况下，DA021显示出对EP1受体的强拮抗效应，而单独的DA021不导致在所有这些受体上的任何应答。
  cAMP检测   EP1受体   EP2受体   EP4受体
  激动效应   9   -3   TBD
  拮抗效应   87   4   18
实施例68：DA001衍生物保护皮层神经元不受β淀粉样多肽兴奋性中 毒的影响
合成DA001的总共90种衍生物，并且检测它们对皮层神经元存活防止β淀粉样多肽(Aβ25-35)兴奋性中毒的影响。图14显示了这些化合物的数据。用星号标注的化合物显著保护了原代神经元，防止其发生Aβ25-35诱导的细胞死亡。具有强保护效应的化合物为DA002、DA005、DA007、DA016、DA018、DA019、DA042、DA044、DA060和DA072。
实施例69：DA001改善了具有实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠的行 为学评分
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型是表现CNS和脊髓中多发性硬化(MS)样炎症的广泛使用的研究。通过刺激直接对抗CNS抗原、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的免疫应答来将其诱导。它是在CNS的少突细胞表面表达的跨膜蛋白。将其用作促进脱髓鞘作用的靶点抗原，所述脱髓鞘作用导致在小鼠中观察到MS样症状。
检测DA001改善EAE症状的效力。用MOG使C57BL/6小鼠免疫，并按照“Materials and Methods(材料和方法)”中描述的进行。当引入MOG时，在9至10天内，症状表现发生在任何地方。基于前面公布的文献“Active induction of experimental allergic encephalomyelitis(实验性过敏性脑脊髓炎的活性诱导)”(2006：1(4)：1810-1818，Nature Protocol)在分数表上给出临床评分。从第11日开始并持续到第21日，MOG注射的小鼠显示出分数的显著缺陷(分数越高，缺陷越严重)。与MOG注射的小鼠相比，白蛋白注射的小鼠没有显示出缺陷症状并像往常一样正常表现。由于在这种类型的EAE模型中轴突损坏的本性发生，所以已知少数治疗剂对改善EAE症状有效。与介质处理的EAE小鼠相比，口服给予溶于水(介质)的剂量为100mg/kg的DA001显示出EAE分数的明显降低，这表明DA001的效力成功缓解了EAE的症状。图15例示所述研究。
实施例70：DA002改善实验性自身免疫性脑脊髓炎分数
DA002为DA001的苷元。检测DA002缓解EAE小鼠症状的效力(参见根据“Materials and Methods(材料和方法)”描述产生的EAE小鼠)。如图16所示，当与介质处理组相比时，剂量为100mg/kg的DA002显示出EAE分数的显著降低。
实施例71：DA021改善实验性自身免疫性脑脊髓炎分数
DA021是DA002的结构类似物之一。检测DA021缓解EAE小鼠症状的效力。根据“Materials and Methods(材料和方法)”的描述产生EAE小鼠。如图17所示，当与介质处理的对照相比时，剂量为100mg/kg的DA021显示出EAE分数的显著降低。
实施例72：在从介质处理的EAE小鼠的脾中分离的脾细胞中，DA001 和DA021降低了磷酸化的STAT 3、STAT 4和STAT 6核蛋白的表达
检测DA化合物调节前炎症蛋白表达的效力。在从EAE小鼠的脾中分离的培养脾细胞上进行蛋白质印迹分析，并且检测信号转导和转录蛋白激活子(STAT)对MOG(25μg/mL)、DA001(30μM)和DA021(30μM)的外源性处理的应答的表达。显示向EAE脾细胞中外源添加MOG[MOG(Ex)]以有力地增加STAT3、STAT4和STAT6的磷酸化作用。
如图18所示，当用剂量为30μM的DA001和DA021外源性处理时，与介质处理的对照相比，MOG诱导的STAT3和STAT4磷酸化作用显著降低。当DA021处理时，STAT6磷酸化也明显降低，表明DA化合物降低了被认为是EAE分子病理学关键分子事件之一的STAT蛋白表达的效力。相比之下，来自白蛋白注射的小鼠的脾细胞不对MOG刺激做出应答，并被用作阴性对照。
如图18所示，用补充了10％热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基培养来自介质处理的EAE小鼠的脾的脾细胞，并在存在DA001和DA021(30μM，Ex)的情况下，用MOG肽(25μg/mL，Ex)(Hooke Laboratories)处理所述脾细胞。根据方法学的描述进行蛋白质印迹分析。
实施例73：在从介质处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA001和DA021降低了MOG-诱导的IFN-γ水平
细胞因子被认为是EAE病情进展中的关键信号分子之一。在EAE模型中观察到的自身免疫性应答被认为是通过Th1通路调节的，并且干扰素-γ(IFN-γ)是Th1免疫应答的特征性细胞因子。因此，关键是要检测化合物调节EAE小鼠的细胞因子水平的效力。最后，培养从EAE小鼠的脾中分离的脾细胞，并用外源性MOG肽处理，并且使用ELISA检测对外源性DA001和DA021(30μM)处理应答的IFN-γ的量。在图19中，响应外源性MOG处理的脾细胞中的IFN-γ水平显著地增加。有趣地，当与介质对照相比时，发现外源性添加DA001和DA021抑制了MOG诱导的IFN-γ水平。DA001和DA021的处理分部导致了MOG诱导的IFN-γ的量减少71％和62％，这强调了两种DA化合物都成功降低了响应体外脾细胞的外源性MOG处理的原发合成的IFN-γ的效力。
如图19所示，由介质处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA001或DA021(30μM，Ex)的MOG(25μg/mL，Ex)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据生产标准使用IFN-γQuantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IFN-γ的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001、**＝p≤0.001、*＝p≤0.01。
实施例74：在从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA001降低了MOG-诱导的IFN-γ
如上所述进行相似研究，但使用DA001处理的EAE小鼠。培养从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的脾细胞，并用外源性MOG肽处理，并检测响应外源性DA001(30μM)处理的IFN-γ的量。MOG+DA001表示已经用MOG免疫并且通过口服给予每日接受溶于水(介质)的DA001(100mg/kg)给药的小鼠组。如图20所示，DA001处理的EAE小鼠的脾细胞显示出响应外源性MOG处理的IFN-γ水平的增加。然而，IFN-γ的水平显著低于介质处理的EAE小鼠的脾细胞中的IFN-γ水平，105pg/ml对623pg/ml(表5)，这表明DA001降低IFN-γ原发合成的效力。另外，在DA001处理的EAE小鼠的脾细胞中的响应外源性DA001处理的IFN-γ的量也显著降低了91％。
表5
如图20所示，从DA001处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA001(30μM)的MOG(25μg/mL)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据使用说明使用IFN-γQuantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IFN-γ的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001。
实施例75：在从DA021处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA021降低了MOG-诱导的IFN-γ
如上所述进行相似研究，但使用DA021处理的EAE小鼠。培养从DA021处理的EAE小鼠的脾中分离的脾细胞，并用外源性MOG(25μg/ml)处理，并检测响应DA021(30μM)处理的IFN-γ的水平。MOG+DA021表示已经用MOG免疫并且通过口服给予每日接受溶于水(介质)的DA021(100mg/kg)给药的小鼠组。如图21所示，DA021处理的EAE小鼠的脾细胞显示出响应外源性MOG处理的IFN-γ水平的增加。IFN-γ的水平再次显著低于介质处理的EAE小鼠的脾细胞中的IFN-γ水平，135pg/ml对623pg/ml(表)，表明DA021降低IFN-γ原发合成的效力。另外，在DA021处理的EAE小鼠的脾细胞中的响应外源性DA021处理的IFN-γ的量接着显著降低了78％。
如图21所示，从DA021处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA021(30μM，Ex)的MOG(25μg/mL)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据使用说明使用IFN-γQuantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IFN-γ的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001。
实施例76：在从介质处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA001和DA021降低了MOG-诱导的IL-6水平
白介素-6(IL-6)是免疫应答中前炎症反应的急性期中的关键细胞因子。IL-6激活了JAK-STAT通路，并被认为是辅助T17(Th17)分化以及转化生长因子-β(TGF-β)和白介素-23(IL-23)的共同效应物因子(co-affector)之一，其调节在诸如EAE和MS的疾病中所见的T细胞免疫应答。因此，主要感兴趣的是检测DA化合物对涉及细胞因子的Th17通路的作用。在图22中，EAE小鼠脾细胞中的响应外源性MOG处理的IL-6水平显著地增加。有趣地，当与介质对照相比时，发现外源性添加DA001和DA021抑制了MOG诱导的IL-6水平。DA001和DA021的处理分别导致了MOG诱导的IL-6的量减少73％和79％，这强调了两种DA化合物都成功降低了响应体外脾细胞的外源性MOG处理的原发合成的IL-6的效力。基于迄今获得的结果，DA001和DA021处理的脾细胞中的IL-6水平降低可以在STAT3磷酸化的向下调节中起主要作用。这表明了证明作为用于治疗自身免疫性疾病的潜在药物候选者的DA化合物效力的其他关键证据。
Figure BPA00001331005301151
如图22所示，从介质处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA001或DA021(30μM，Ex)的MOG(25μg/mL，Ex)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据使用说明使用IL-6 Quantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IL-6的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001、**＝p≤0.001。
实施例77：在从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA001降低了MOG-诱导的IL-6
如上所述进行相似研究，但使用DA001处理的EAE小鼠。培养从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的脾细胞，并用外源性MOG肽处理，并检测响应外源性DA001(30μM)处理的IL-6的量。MOG+DA001表示已经用MOG免疫并且通过口服给予每日接受溶于水(介质)的DA001(100mg/kg)给药的小鼠组。如图23所示，DA001处理的EAE小鼠的脾细胞显示出响应外源性MOG处理的IL-6水平的增加。有趣地，通过外源性DA001处理，在DA001处理的EAE小鼠的脾细胞中的IL-6的量接着显著降低。
如图23所示，从DA001处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA001(30μM，Ex)的MOG(25μg/mL，Ex)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据使用说明使用IL-6 Quantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IL-6的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001、*＝p≤0.01。
实施例78：在从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA021降低了MOG-诱导的IL-6
如上所述进行相似研究，但使用DA021处理的EAE小鼠。培养从DA021处理的EAE小鼠的脾中分离的脾细胞，并用外源性MOG肽处理，并检测响应外源性DA021(30μM)处理的IL-6的量。MOG+DA021表示已经用MOG免疫并且通过口服给予每日接受溶于水(介质)的DA021(100mg/kg)给药的小鼠组。如图24所示，DA021处理的EAE小鼠的脾细胞显示出响应外源性MOG处理的IL-6水平的增加。有趣地，通过外源性DA021处理，在DA021处理的EAE小鼠的脾细胞中的IL-6的量接着显著降低。
如图24所示，从DA021处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA021(30μM，Ex)的MOG(25μg/mL)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据使用说明使用IL-6 Quantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IL-6的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001、**＝p≤0.001。
实施例79：在从介质处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA001和DA021降低了MOG-诱导的IL-17水平
白介素-17(IL-17)是涉及Th17通路和介导自身免疫性应答的最重要的效应物细胞因子之一。Th17分化的启动被认为涉及依次激活造成组织炎症和自身免疫性应答转录的TGF-β和IL-6。
研究DA001和DA021调节在从EAE小鼠的脾中分离的外源性MOG处理的脾细胞中的IL-17产生的效力。如图25所示，观察到响应外源性MOG处理的大量IL-17。正如IFN-γ和IL-6两者观察到的，响应DA001和DA021(30μM)处理的IL-17的量分别降低65％和68％。这表明DA化合物降低IL-17的量的效力，IL-17是涉及EAE模型中的Th17介导的免疫应答的主要细胞因子之一。
如图25所示，从介质处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA001或DA021(30μM，Ex)的MOG(25μg/mL，Ex)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据使用说明使用IL-17 Quantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IL-17的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001、**＝p≥0.001。
实施例80：在从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA001降低了MOG-诱导的IL-17水平
如上所述进行相似研究，但使用DA001处理的EAE小鼠。培养从DA001处理的EAE小鼠的脾中分离的脾细胞，并用外源性MOG肽处理，并检测响应外源性DA001(30μM)处理的IL-17的量。MOG+DA001表示已经用MOG免疫并且通过口服给予每日接受溶于水(介质)的DA001(100mg/kg)给药的小鼠组。如图26所示，DA001处理的EAE小鼠的脾细胞显示出响应外源性MOG处理的IL-17水平的增加。在DA001处理的EAE小鼠的脾细胞中来自外源性MOG处理的响应外源性DA001处理的IL-17的量显著降低了51％。
如图26所示，从DA001处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA001(30μM，Ex)的MOG(25μg/mL，Ex)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据使用说明使用IL-17 Quantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IL-17的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001、**＝p≥0.001。
实施例81：在从DA021处理的EAE小鼠的脾中分离的原代脾细胞中， DA021降低了MOG-诱导的IL-17
如上所述进行相似研究，但使用DA021处理的EAE小鼠。培养从DA021处理的EAE小鼠的脾中分离的脾细胞，并用外源性MOG肽处理，并检测响应外源性DA021(30μM)处理的IL-17的量。MOG+DA021表示已经用MOG免疫并且通过口服给予每日接受溶于水(介质)的DA021(100mg/kg)给药的小鼠组。如图27所示，DA021处理的EAE小鼠的脾细胞显示出响应外源性MOG处理的IL-17水平的增加。在DA021处理的EAE小鼠的脾细胞中来自外源性MOG处理的响应外源性DA021处理的IL-17的量显著降低了89％。
如图27所示，从DA021处理的EAE小鼠的脾制备脾细胞。在不存在或存在具有或没有DA021(30μM，Ex)的MOG(25μg/mL，Ex)的情况下，在补充了10％热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养细胞。在48hrs后收集上清液，并根据使用说明使用IL-17 Quantikine ELISA检测试剂盒(R和D系统)。基于在检验中建立的标准曲线计算IL-17的量。列出的图表是两个单独试验与每次实验的两份样品的组合。***＝p≤0.0001。
实施例82：DA001降低了EAE小鼠脊髓中的淋巴细胞渗透
渗入脊髓的淋巴细胞被认为是在EAE模型中观察到的广泛的轴突损伤原因之一。发现来自EAE小鼠脊髓腰段的组织学特征以便确定淋巴细胞渗透的程度和DA001最小化渗透程度的效果。最后，使用苏木精和伊红(H&E)染色技术以将来自用介质或DA001处理的EAE小鼠的脊髓染色。H&E染色是显示在EAE的脊髓中淋巴细胞渗透程度常用的组织学技术。在显示的图片中，将在EAE小鼠的脊髓中观察到的淋巴细胞染成具有蓝色细胞质的鲜红色或紫色颗粒。在介质处理的EAE小鼠的外侧索(红色长方形框住的)中存在比DA001处理的EAE小鼠明显更多的具有紫色颗粒的细胞质。也增加了促进由MOG处理导致的超免疫应答的外周轴突中的淋巴细胞，并且在DA001处理的小鼠的组织中这种反应显著减少。
如图28所示，用4％多聚甲醛穿心灌注来自EAE小鼠(第15日)的脊髓，并固定(postfix)所述脊髓过夜。然后将固定的脊髓包埋入石蜡，并在6μm处切下切片，并将其装在HistobondTM载玻片(Merienfeld，德国)上。在烘箱内孵育过夜后，如方法学章节所述，再水化载玻片并用苏木精和伊红(H&E)染色。使用Leica显微镜在10×和20×视野拍照。所有给出的脊髓都是在EAE小鼠的L-3和L-5腰段之间。
实施例83：DA021降低了小鼠中大肠杆菌脂多糖诱导的肿瘤坏死因子 -α
对口服给予DA021抑制小鼠中脂多糖(LPS)诱导的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放的效力和效能进行评价。LPS是从细菌，大肠杆菌中分离出的广泛使用的内毒素，其诱导有机体的急性炎症。泼尼松龙是广泛用于炎症反应的合成的皮质甾类药物。其是广谱免疫抑制剂。基于图29，在小鼠中LPS处理时血清中TNF-α的量明显增加。更有趣地，剂量为30mg/kg和100mg/kg的DA021显著降低了小鼠血清的LPS-诱导的TNF-α，这表明在该模型中DA021发挥了抗炎效应。口服给予DA021，剂量为30mg/kg和100mg/kg进行的三十分钟预处理分别导致LPS应答73％和77％的抑制。剂量为10mg/kg的阳性对照泼尼松龙的处理显著地降低了应答LPS的LPS-诱导的TNF-α的水平。
如图29所示，在口服给予小鼠泼尼松龙(PNS，mg/kg)或DA021(mg/kg)后三十分钟，腹膜内注射脂多糖(LPS，10mg/kg)以诱导炎症。在LPS注射后两小时，从小鼠收集血清。根据使用说明通过ELISA(Pierce)分析血清样品的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。N＝10，使用学生T检验计算对LPS+介质的显著性，*＝p≤0.05，#＝p≤1×10-4。
实施例84：DA021抑制小鼠对噁唑酮处理响应的耳水肿
为了评价DA021在急性炎症中的效力和效能，在小鼠中实施噁唑酮诱导的耳水肿模型。噁唑酮诱导的耳水肿模型是广泛使用的皮肤炎症动物模型。噁唑酮(OA)是诱导导致表面水肿的免疫应答的变应原。由水肿中形成的流体导致的耳朵的重量在OA处理后显著增加。如图30所示，如耳朵重量降低所揭示的，DA021显著降低了OA诱导的小鼠耳水肿。剂量为30mg/kg和100mg/kg的DA021分别显著抑制响应噁唑酮处理的耳朵变重31.7％和52.9％(表6)，这表明作为皮肤炎症潜在抗炎剂的效力。用作阳性对照的倍他米松(BMS)是用作抗瘙痒乳膏剂和其他抗炎药品的皮质甾类。BMS显示耳朵重量减轻75.4％。
表6
Figure BPA00001331005301201
如图30所示，将噁唑酮(OA)溶液施用于剃过的小鼠耳朵以诱发水肿。然后用倍他米松(BMS，mg，局部)或DA021(mg/kg，p.o.)处理小鼠，并除去耳朵，称重。每组N＝10，使用学生T检验计算对OA+介质的显著性(p-值)，*＝p≤1×10-7，#＝p≤1×10-12。
实施例85：DA001抑制黑皮质素与MC1和MC4受体的结合
通过109种受体结合检验和17种酶检验来评价DA001，所述检验包括选择的、中央的和外围的治疗相关靶点。通过以双份一种浓度检验DA001(10μM)来进行放射配体竞争检验。DA001显著抑制了黑皮质素与黑皮质素-1(MC1)和黑皮质素-4(MC4)受体的结合(基于使用说明，在50％抑制时切断)。其可以同放射配体[125I-NDP-α-促黑细胞激素(α-MSH)]竞争与MC1和MC4的结合，但不是MC3和MC5，也不是相关家族，黑色素聚集激素受体(MCH1和MCH2)。也观察到了DA001对红藻氨酸盐、褪黑激素(MT1)和5-羟色胺(5-HT1D亚型)受体的温和抑制的调节。
  结合检验   对照特异性结合的抑制百分数   靶点
  MC1   64   黑皮质素
  MC3   12   黑皮质素
  MC4   59   黑皮质素
  MC5   11   黑皮质素
  MCH1   -9   黑色素聚集激素
  MCH2   -12   黑色素聚集激素
  红藻氨酸盐   35   红藻氨酸盐
  MT1   28   褪黑激素
  5-HT1D   30   5-羟色胺
为了检测DA001抑制α-MSH与MC1和MC4受体结合的IC50，通过剂量依赖性研究进一步表征化合物。在MC1和MC4受体结合检验中用8种浓度评价DA001。DA001对MC1和MC4显示的IC50分别为10μM和6.8μM。
Figure BPA00001331005301211
图31显示用DA001在人类MC1或MC4受体中获得的竞争曲线。将特定的配体与受体的结合定义为在未标记配体过量的存在下确定的总结合与非特异性结合之间的差异。结果表示为在DA001的存在下得到的对照特异性结合的百分数[(测量的特异性结合/对照特异性结合)×100]和对照特异性结合的抑制百分数{100-[(测量的特异性结合/对照特异性结合)×100]}。使用希尔方程曲线拟合(Y＝D+[(A-D)/(1+(C/C50)nH)]，其中Y＝特异性结合，D＝最小特异性结合，A＝最大特异性结合，C＝化合物浓度，C50＝IC50，并且nH＝斜率)通过平均重复值(mean replicate value)产生的竞争曲线的非线性回归分析确定IC50值(导致对照特异性结合的一半最大抑制的浓度)和希尔系数(nH)。使用Cerep开发的软件(Hill software)进行这种分析并通过与由商业软件Windows
Figure BPA00001331005301221
的SigmaPlot
Figure BPA00001331005301222
4.0(
Figure BPA00001331005301223
1997 by SPSS Inc.)产生的数据进行比较来证实这种分析。
实施例86：研究确定新颖化合物的抗炎性质
新颖化合物表现出抗炎性质。进行额外的体外和体内研究以评价新颖化合物对炎症的治疗效果。本研究是为了确定前炎症细胞因子是否减少。
方法：
体外研究
动物模型和处理
将重量为30g至40g的雄性ICR小鼠用于这种研究。将动物安置在可随意使用食物和水的笼中。自动控制(在上午7:00打开并在下午7:00关闭)光循环，将室温恒温地调节至22℃±1℃。在实验前，在这些条件下安置动物3天至4天以使其适应。将小鼠分组，每组由五只小鼠组成。用异氟烷轻微麻醉动物，并腹膜内注射(每只小鼠0.5mL)溶于盐水中的1mg/kg脂多糖(LPS)(来自Escherichia coli 0111：B4，Sigma，Deisenhofen，德国)。在LPS注射前，在不同的时间间隔口服给予测试化合物(每只小鼠0.25mL)。对照组分别接受等体积盐水。在LPS注射后1、2或6h，在用异氟烷麻醉期间通过断头处死小鼠。在EDTA管中收集血液，并在4℃下，以4000rpm离心10min。获得血浆并在-20℃下储存直到使用。快速除去心脏、肺、肾和肝，在液氮下冷冻并在-80℃下储存直到使用。
RNA提取和反转录
按照使用说明用RNA提取柱(Invitrogen)分离来自心脏、肺、肾和肝的总RNA，并用分光光度法定量。根据标准操作，在总量为22uL，含2ug总RNA、0.5mg/mL oligo(dT)15引物(Promega，Madison，USA)、20U核糖核酸酶抑制剂(RNAsin)(Promega，Madison，USA)、2.5mMdNTP(Promega，Madison，USA)、200 U superscript II(Invitrogen)和生产商的5-RT缓冲液中进行反转录。在-20℃下储存cDNA直到使用。
实时PCR分析
通过实时PCR使用Fast 7500系统(ABI)评价TNFα、IL-1β、IFNγ和β-肌动蛋白mRNA的表达。在总体积为22uL时，使用ABI DNASYBR Green I试剂盒(ABI)进行所有的PCR。每一反应包含2uLcDNA、3.0uM(TNFα，IL-1β，β-肌动蛋白)或5.0uM(IFNγ)MgCl2、分别为1uL正义引物和反义引物(10pmol/uL)和2uL的Mix(包含缓冲液，dNTPs，SYBR Green和热启动Taq聚合酶)。在95℃下开始变性步骤10min后，开始总共40个循环的温度循环。每一循环包括95℃下的变性期10秒，58℃下的退火期7秒和72℃下的伸长期18秒。溶解曲线分析后扩增以检验扩增子的正确性。在每个PCR期间，进行用水代替cDNA的阴性对照以评估反应特异性。为了检验扩增的准确性，在溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上进一步分析PCR产物。结果表示为TNFα、IL-1β、IFNγ的量与β-肌动蛋白mRNA的量的比率。
使用下列引物：正义TNFα(NM_013693)：CCC GG CTC AGC CTC TTC TCA TTC，反义：GGA TCC GGT：GGT TTG CTA CGA CGT(201bp)；正义IL-1β(NM_008361)：TCT CGC AGC AGC ACA TCA，反义：CAC ACA CCA GCA GGT TAT(197bp)；正义IFNγ(NM_008337)：CAC AGT CAT TGA AAG CCT，反义：AGA CTT CAA AGA CTC TGA(169bp)；正义β肌动蛋白(NM_007393)：CCG CCC TAG GCA CCA GGG TG，反义：GGC TGG GGT GTT GAA GGT CTC AAA(285bp)。
蛋白提取和测定
在磷酸盐缓冲液(Sigma，Deisenhofen，德国)中使用在冰冷水浴中的均质机(ultraturrax)均质化组织60秒。然后以10,000rpm，4℃下离心匀浆10min以除去碎片。收集上清液并通过喹啉酸(bicinchoninic acid)(BCA)检测试剂盒(Sigma，Deisenhofen，德国)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品来测量蛋白质水平。
细胞因子的检验
根据使用说明，通过使用酶联免疫吸附测定试剂盒检验组织中TNFα、IL-1β和IFNγ水平。
体内研究
用硫喷妥钠(40mg/kg；i.p.)麻醉Sprague-Dawley大鼠(250g至300g)，并通过对大鼠膝部的滑膜腔进行单一的单侧注射125μl弗氏完全佐剂(FCA；含125μg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))来诱发关节炎；用125μl生理盐水注射对侧膝部以作为内部对照。在第1天后，该过程产生关节水肿，并从第3天起产生组织学变化。在21天的时间内监测大鼠。
通用过程：
在第0天，如上所述，麻醉大鼠并用单关节炎诱导大鼠。为了研究药物对关节炎症状进展的作用，通过口服途径在第0、1、2、4、7、11、14和18日将药物给予3同龄组大鼠，每组8只。另外8只大鼠的同龄组接受平行给予介质以作为介质对照，并且另一8只大鼠的同龄组接受平行给予10mg/kg吲哚美辛以作为阳性对照。
在诱发关节炎前的第0日，测量大鼠引起挣扎行为的伸膝角度，膝关节大小和体重，并在诱发关节炎后的第1、2、4、7、11、14、18和21日测量大鼠引起挣扎行为的伸膝角度，膝关节大小和体重以分别提供异常性疼痛(allodynia)、浮肿和药物毒性的指标。通过在实验结束后处死动物前的第21日检测膝关节血流量来估计充血，然后切离膝关节并进行组织学检查以提供作为关节炎疾病状态另外指标的免疫细胞渗透、组织增生和软骨病损程度的分数。
评价镇痛效应
将Yu等人(2002)描述的方法改良。温和地抑制清醒的大鼠。当通过用一只手的拇指和第二根手指抓住大鼠来固定大腿时，通过另一只手的手指伸长腿来确定大鼠显示挣扎行为(异常性疼痛)的伸膝角度。使用量角器通过在枢轴上固定大腿来直接测量伸长角度。在3分钟的间隔内将每一关节测量三次并将三次的平均值作为最终值。
评价膝关节浮肿
方法是由Lam等人(2004)前述的方法。在麻醉的大鼠中，将数字测微计(Mitutoyo，日本)放在保持肌肉的膝关节为内侧的任一侧上，放置力量适当以使其接触但不压在这些肌肉上。然后记录测微计上的读数。每一关节测量三次并将三次的平均值作为最终值。
评价膝关节充血
将激光多普勒灌注成像(LDI)的方法用于测量膝关节血流量。在麻醉的大鼠中，除去膝关节上的皮肤以暴露关节囊的前内侧。对于暴露表面，每隔5分钟添加0.1ml盐水以避免组织脱水。放在关节上28cm处的激光多普勒灌注成像仪(Moor Instruments，英国)控制氦氖激光器(633nm)指向组织，并在20秒内，在2×2cm的方形中扫描关节表面。以2分钟间隔将每一关节扫描三次。然后产生颜色编码的灌注图像并在显示器上显示。在光盘上储存图像中每一点的实际通量值，并且通过使用图像处理软件(Moor Instrument)能够将所述值用于计算给定区域内的平均通量值。选择的区域是基于以下标准：其应该包括具有包围关节的较小良好灌注肌肉的最小内含物的最多关节组织。
评价形态学变化
对麻醉大鼠抽血，切开膝关节以与肌肉分离，并用10％福尔马林固定。将关节脱钙，包埋入蜡中，切开并用苏木素和伊红染色。通过(不知情)观察者进行组织学分析，尤其集中在多形核细胞渗透、组织增生和软骨病损上。将损伤严重性分为四级：0＝无变化；1＝轻微变化；2＝中等变化；和3＝明显变化。
虽然已经为了清楚地理解的目的通过示例性说明和实施例部分详细地描述了上述发明，但是本领域技术人员将意识到在附属权利要求的范围内可以实现某些变化和修饰。另外，本文提供的每一参考文献以其整体通过引用的方式并入本文中，仿佛每一参考文献独立地以引用的方式并入本文中。

Claims (65)

1.式(I)的化合物或者其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体：
Figure FPA00001331005200011
其中：
R1是-H、烷基-C(O)-或芳基烷基-C(O)-；
R2选自羟基-C1-4烷基、烷氧基-C1-4烷基、芳氧基-C1-4烷基、烷基-C(O)O-C1-4烷基和芳基烷基-C(O)O-C1-4烷基；
R3选自-NH2、-NHRa、-N(Ra)2、-OH和-ORb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基、芳基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基；其中R3取代基的脂肪族部分任选地被1至2个Rc取代基取代，所述Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、烷氧基、芳基烷氧基、卤素、烷基-C(O)O-、芳基烷基-C(O)O、芳基-C(O)O、烷基-C(O)NH-、芳基烷基-C(O)NH-、芳基-C(O)NH-、烷基氨基或二烷基氨基；或者任选地，任意两个相邻的Rc取代基与和它们相连的原子一起形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5或6元杂环，其中所述杂环任选地被1至2个C1-8烷基取代；
R4是C1-4烷基、卤代烷基、羟基烷基、烷基-C(O)O-C1-4烷基、芳基烷基-NH-C1-4烷基或烷氧基烷基；
其中所述R3或R4基团的芳香族部分任选地被1至2个Rd取代基取代，所述Rd取代基独立地选自卤素、-CN、-NO2、-OH、-Re、-ORe、-OC(O)NHRe、-OC(O)N(Re)2、-OC(O)Re、-OC(O)H、-NH2、-NHRe、-N(Re)2、-S(O)2Re、-SO2NH2、-SO2NHRe、-SO2N(Re)2、-NHS(O)2Re、-NReS(O)2Re、-C(O)NH2、-C(O)NHRe、-C(O)N(Re)2、-C(O)H、-C(O)Re、-NHC(O)Re、-NReC(O)Re、-CO2Re、-NHCO2Re和-NReCO2Re，其中每一Re独立地为C1-8烷基；并且
前提是当R1为-H或CH3C(O)-，R2为-CH2OH或-CH2OC(O)CH3并且R4为-CH3或HOCH2-时，R3不是-OH、-OMe、-OEt、-NHCH2Ph、-O(CH2)2OH、-CH2CH(OH)CH2(OH)或2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基-甲基。
2.如权利要求1所述的化合物，其具有式(Ia)：
Figure FPA00001331005200021
其中R2a为-OH、烷氧基或烷基-C(O)O。
3.如权利要求2所述的化合物，其中R2a为-OH或-OAc。
4.如权利要求2所述的化合物，其中R1为-H或CH3C(O)-。
5.如权利要求1所述的化合物，其具有式(Ib)：
Figure FPA00001331005200022
其中R2a为-OH、烷氧基或烷基-C(O)O，并且R4a为-H、-OH、烷氧基、烷基-C(O)-或芳基烷基-NH-。
6.如权利要求5所述的化合物，其中R1为-H或CH3C(O)-。
7.如权利要求5所述的化合物，其中R4a为-OH或CH3C(O)-。
8.如权利要求5所述的化合物，其中R4a为烷氧基或芳基烷基-NH。
9.如权利要求1至3和5中任一权利要求所述的化合物，其中R1为-H、烷基-C(O)-或Ph-C1-4烷基-C(O)-。
10.如权利要求9所述的化合物，其中R1为-H、CH3C(O)-或苄基-C(O)-。
11.如权利要求1所述的化合物，其中R2为羟基-C1-4烷基、烷氧基-C1-4烷基或烷基-C(O)O-C1-4烷基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中R2为羟基甲基、CH3OCH2-或CH3C(O)OCH2-。
13.如权利要求1至8中任一权利要求所述的化合物，其中R3为-NH2、-NHRa、-N(Ra)2、-OH或-ORb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基，其中R3取代基的脂肪族部分任选地被1至2个Rc取代基取代，所述Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、卤素、烷基氨基或二烷基氨基，并且所述R3或R4基团的芳香族部分任选地被1至2个Rd取代基取代。
14.如权利要求13所述的化合物，其中R3为-NH2、-NHRa、-N(Ra)2、-OH或-ORb，其中Ra和Rb各自独立地为烷基、芳基-C1-4烷基、羟基-C1-4烷基或氨基-C1-4烷基，其中R3取代基的脂肪族部分任选地被Rc取代基取代，所述Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、卤素、烷基氨基或二烷基氨基，并且所述R3或R4基团的芳香族部分任选地被1至2个Rd取代基取代。
15.如权利要求14所述的化合物，其中R3为-OH、-NH2、-NH-C1-4烷基、CH3NH-、CH3CH2NH-、异丙基-NH-、C1-8烷基-NH-、PhCH2NH-、PhCH2O-、PhO-、HO(CH2)n-NH-、NH2(CH2)mNH-或NH2(CH2)p-O-，其中下标m、n或p各自独立地为1至4的整数。
16.如权利要求2所述的化合物，其中R3为-NH2、-NHRa或-N(Ra)2，其中Ra为烷基、芳基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基；其中R3取代基的脂肪族部分任选地被1至2个Rc取代基取代，所述Rc取代基独立地选自-OH、-NH2、烷氧基、芳基烷氧基、卤素、烷基-C(O)O-、芳基烷基-C(O)O、芳基-C(O)O、烷基-C(O)NH-、芳基烷基-C(O)NH、芳基-C(O)NH、烷基氨基或二烷基氨基。
17.如权利要求16所述的化合物，其中Ra为烷基、芳基、芳基烷基、羟基烷基或氨基烷基。
18.如权利要求17所述的化合物，其中Ra选自HOCH2CH2-、-CH3、C1-6烷基、NH2CHCH2CH2-、HO(CH2)3-和NH2(CH2)3-。
19.如权利要求5至7中任一权利要求所述的化合物，其中R3为-OH、苄基-NH-、Ph-C1-4亚烷基-NH-、-NH2、CH3NH-、CH3CH2NH-、异丙基-NH-、C1-8烷基-NH-、HO(CH2)NH-或HO(CH2)2O-。
20.如权利要求1所述的化合物，其中R4为卤代CH2-、烷基、羟基烷基、烷基-C(O)-C1-4烷基、芳基烷基-NH-C1-4烷基或烷氧基烷基。
21.如权利要求20所述的化合物，其中R4为ClCH2-、BrCH2-、甲基、乙基、异丙基、HOCH2-、羟基乙基、羟基丙基、羟基丁基、CH3C(O)CH2-、CH3C(O)C1-4烷基、苄基-NHCH2-、苄基-NH-C1-4烷基、C1-4烷氧基甲基、CH3OCH2-、CH3CH2OCH2-或(CH3)2CHOCH2-。
22.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为选自表1中所列的DA048至DA079的化合物。
23.式(IA)的化合物或者其药物可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体：
Figure FPA00001331005200051
其中
R12选自羟基烷基、烷基-OC(O)-、芳基-C1-4烷基-OC(O)-、烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷氧基或烷氧基烷基，其中其芳基部分任选地被选自卤素、烷基、芳基-C1-4烷基、羟基烷基、烷氧基、芳基-C1-4烷氧基、烷基-OC(O)-、烷基-C(O)O-、芳基-C1-4烷基-C(O)O-、芳基-C1-4烷基-OC(O)O-、烷氧基烷基或芳基-C1-4烷氧基-烷基的1至3个取代；并且
R13选自C2-6烯基或C2-6环氧烷基，其各自任选地被选自-OH、-OC1-6烷基、芳基-C1-4烷基、烷基-C(O)O-或芳基-C1-4烷基-C(O)O-的1至3个取代。
24.如权利要求23所述的化合物，其中R12为羟基烷基、烷基-OC(O)-、芳基-C1-4烷基-OC(O)-、烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷基-C(O)O-烷基、芳基-C1-4烷氧基或烷氧基烷基，其中其芳基部分任选地被选自Cl、Br、F、C1-6烷基、苄基、OHCH2-、CH3O-、CH3C(O)O-、C1-4烷基-O-C(O)-或苄氧基的1至3个取代。
25.如权利要求24所述的化合物，其中R12为苄氧基羰基、C1-6烷基-OC(O)-、CH3C(O)OCH2-、HOCH2-、苄氧基甲基或CH3OCH2-。
26.如权利要求23所述的化合物，其中R13为2-丙烯基、3-羟基-2-丙烯基、3-乙酰氧基-2-丙烯基或2-甲基-2-环氧乙基。
27.如权利要求23所述的化合物，其中所述化合物为选自表2所列的DA080至DA090的化合物。
28.药物组合物，其包含：权利要求1或23所述的化合物和药物可接受的载体或赋形剂。
29.药物组合物，其包含：DA001至DA090中任一化合物和药物可接受的载体或赋形剂。
30.抑制用于调节疼痛并介导抗炎应答的受体的活性的方法，所述方法包括：使权利要求1或23所述的化合物与所述受体接触。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述受体选自PG受体、NMDA受体和黑皮质素受体。
32.抑制PGE2受体的活性的方法，所述方法包括：使权利要求1或23所述的化合物与所述PGE2受体接触。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述PGE2受体选自EP1、EP2或EP4受体。
34.治疗、预防或改善哺乳动物疼痛或炎症的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1或23所述的化合物。
35.诱导皮层神经元培养物中的CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP-b)mRNA的方法，所述方法包括：使权利要求1或23所述的化合物与细胞接触。
36.调节哺乳动物急性期反应、炎症或造血作用的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1或23所述的化合物。
37.抑制PGE2受体活性的方法，所述方法包括：使DA001至DA090中任一化合物与所述PGE2受体接触。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述PGE2受体选自EP1、EP2或EP4受体。
39.治疗、预防或改善哺乳动物疼痛或炎症的方法，所述方法包括：给予需要这样的治疗的所述哺乳动物治疗有效量的DA001至DA090中任一化合物。
40.诱导皮层神经元培养物中的CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP-b)mRNA的方法，所述方法包括：使DA001至DA090中任一化合物与细胞接触。
41.调节哺乳动物急性期反应、炎症和造血作用的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物治疗有效量的DA001至DA090中任一化合物。
42.抑制PGE2受体活性的方法，所述方法包括：使式(II)的化合物与所述PGE2受体接触
其中：
R5、R7、R8和R9各自独立地为C1-4烷基；
R6选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X1CN、-X1NO2、-X1C(O)Ra、-CRb＝NORc、-X1CO2Rc、-X1C(O)NRcRd、-X1C(NRcRd)＝NRc、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1ORe、-X1SRe、-X1NHRe和-X1N(Re)2以及-X1Re，其中每一X1独立地为键或C1-4亚烷基，其中每一Re独立地为被1至3个Rf取代的C1-6烷基、卤代烷基、芳基C0-6烷基或环烷基，并且其中Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H、C1-6烷基或芳基-C1-6烷基；其中每一R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中Rf选自卤素、CN、NO2、-OH、-Rg、-ORg、-OC(O)NHRg、-OC(O)N(Rg)2、-OC(O)Rg、-OC(O)H、-NH2、-NHRg、-N(Rg)2、-SH、-SRg、-S(O)2Rg、-SO2NH2、-SO2NHRg、-SO2N(Rg)2、-NHS(O)2Rg、-NRgS(O)2Rg、-C(O)NH2、-C(O)NHRg、-C(O)N(Rg)2、-C(O)H、-C(O)Rg、-NHC(O)Rg、-NRgC(O)Rg、-NHC(O)NH2、-NRgC(O)NH2、-NRgC(O)NHRg、-NHC(O)NHRg、-NRgC(O)N(Rg)2、-NHC(O)N(Rg)2、-COOH、-CO2Rg、-NHCO2Rg、-NRgCO2Rg和-OSi(Rg)3，其中每一Rg独立地为C1-6烷基；
A选自C＝Y1、C＝NORc、C＝NOC(O)H、C＝NOC(O)Rg、C＝NOCO2Rg、C＝NOC(O)NH2、C＝NOC(O)NHRg、C＝NOC(O)N(Rg)2和-CRcRh，其中Y1为＝O或＝S，并且Rh选自卤素、CN、NO2、-OH、-ORi、-OC(O)NHRi、-OC(O)N(Ri)2、-OC(O)Ri、-OC(O)H、-NH2、-NHRi、-N(Ri)2、-SH、-SRi、-S(O)2Ri、-SO2NH2、-SO2NHRi、-SO2N(Ri)2、-NHS(O)2Ri、-NRiS(O)2Ri、-C(O)NH2、-C(O)NHRi、-C(O)N(Ri)2、-C(O)H、-C(O)Ri、-NHC(O)Ri、-NRiC(O)Ri、-NHC(O)NH2、-NRiC(O)NH2、-NRiC(O)NHRi、-NHC(O)NHRi、-NRiC(O)N(Ri)2、-NHC(O)N(Ri)2、-COOH、-CO2Ri、-NHCO2Ri、-NRiCO2Ri、-OSi(Ri)3、-O-(Z)1-6、-S-(Z)1-6、-NH(Z)1-6和-NRc(Z)1-6，其中每一Ri独立地为任选地被1至3个Rf基团取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、芳基C0-6烷基或C3-6环烷基；-(Z)1-6为通过醚键连接在一起的1至6个独立选择的C4-7单糖残基的序列，任选地每一Z独立地被1至3个Rf基团取代；
R10选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X2CN、-X2NO2、-X2C(O)Ra、-X2OC(O)Ra、-CRb＝NORc、-X2CO2Rc、-X2C(O)NRcRd、-X2C(NRcRd)＝NRc、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2ORa、-X2SRa、-X2NHRa和-X2N(Ra)2，其中每一X2独立地为键或C1-4亚烷基；其中R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中两个相邻的Rf取代基与和它们相连的原子一起任选地形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5元杂环，其中所述杂环任选地被1至3个Rg基团取代，并且R10的芳香环任选地被1至5个Rf基团取代；并且
R11选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、C2-6卤代烯基、C5-6环烯基和C2-6环氧烷基，每一R11任选地被1至3个Rf基团取代。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述PGE2受体选自EP1、EP2或EP4受体。
44.治疗、预防或改善哺乳动物疼痛或炎症的方法，所述方法包括：给予需要这样的治疗的所述哺乳动物治疗有效量的式(II)的化合物：
Figure FPA00001331005200101
其中：
R5、R7、R8和R9各自独立地为C1-4烷基；
R6选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X1CN、-X1NO2、-X1C(O)Ra、-CRb＝NORc、-X1CO2Rc、-X1C(O)NRcRd、-X1C(NRcRd)＝NRc、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1ORe、-X1SRe、-X1NHRe和-X1N(Re)2以及-X1Re，其中每一X1独立地为键或C1-4亚烷基，其中每一Re独立地为被1至3个Rf取代的C1-6烷基、卤代烷基、芳基C0-6烷基或环烷基，并且其中Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H、C1-6烷基或芳基-C1-6烷基；其中每一R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中Rf选自卤素、CN、NO2、-OH、-Rg、-ORg、-OC(O)NHRg、-OC(O)N(Rg)2、-OC(O)Rg、-OC(O)H、-NH2、-NHRg、-N(Rg)2、-SH、-SRg、-S(O)2Rg、-SO2NH2、-SO2NHRg、-SO2N(Rg)2、-NHS(O)2Rg、-NRgS(O)2Rg、-C(O)NH2、-C(O)NHRg、-C(O)N(Rg)2、-C(O)H、-C(O)Rg、-NHC(O)Rg、-NRgC(O)Rg、-NHC(O)NH2、-NRgC(O)NH2、-NRgC(O)NHRg、-NHC(O)NHRg、-NRgC(O)N(Rg)2、-NHC(O)N(Rg)2、-COOH、-CO2Rg、-NHCO2Rg、-NRgCO2Rg和-OSi(Rg)3，其中每一Rg独立地为C1-6烷基；
A选自C＝Y1、C＝NORc、C＝NOC(O)H、C＝NOC(O)Rg、C＝NOCO2Rg、C＝NOC(O)NH2、C＝NOC(O)NHRg、C＝NOC(O)N(Rg)2和-CRcRh，其中Y1为＝O或＝S，并且Rh选自卤素、CN、NO2、-OH、-ORi、-OC(O)NHRi、-OC(O)N(Ri)2、-OC(O)Ri、-OC(O)H、-NH2、-NHRi、-N(Ri)2、-SH、-SRi、-S(O)2Ri、-SO2NH2、-SO2NHRi、-SO2N(Ri)2、-NHS(O)2Ri、-NRiS(O)2Ri、-C(O)NH2、-C(O)NHRi、-C(O)N(Ri)2、-C(O)H、-C(O)Ri、-NHC(O)Ri、-NRiC(O)Ri、-NHC(O)NH2、-NRiC(O)NH2、-NRiC(O)NHRi、-NHC(O)NHRi、-NRiC(O)N(Ri)2、-NHC(O)N(Ri)2、-COOH、-CO2Ri、-NHCO2Ri、-NRiCO2Ri、-OSi(Ri)3、-O-(Z)1-6、-S-(Z)1-6、-NH(Z)1-6和-NRc(Z)1-6，其中每一Ri独立地为任选地被1至3个Rf基团取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、芳基C0-6烷基或C3-6环烷基；-(Z)1-6为通过醚键连接在一起的1至6个独立选择的C4-7单糖残基的序列，任选地每一Z独立地被1至3个Rf基团取代；
R10选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X2CN、-X2NO2、-X2C(O)Ra、-X2OC(O)Ra、-CRb＝NORc、-X2CO2Rc、-X2C(O)NRcRd、-X2C(NRcRd)＝NRc、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2ORa、-X2SRa、-X2NHRa和-X2N(Ra)2，其中每一X2独立地为键或C1-4亚烷基；其中R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中两个相邻的Rf取代基与和它们相连的原子一起任选地形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5元杂环，其中所述杂环任选地被1至3个Rg基团取代，并且R10的芳香环任选地被1至5个Rf基团取代；并且
R11选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、C2-6卤代烯基、C5-6环烯基和C2-6环氧烷基，每一R11任选地被1至3个Rf基团取代。
45.诱导皮层神经元培养物中的CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP-b)mRNA的方法，所述方法包括：使式(II)的化合物与细胞接触，
Figure FPA00001331005200111
其中：
R5、R7、R8和R9各自独立地为C1-4烷基；
R6选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X1CN、-X1NO2、-X1C(O)Ra、-CRb＝NORc、-X1CO2Rc、-X1C(O)NRcRd、-X1C(NRcRd)＝NRc、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1ORe、-X1SRe、-X1NHRe和-X1N(Re)2以及-X1Re，其中每一X1独立地为键或C1-4亚烷基，其中每一Re独立地为被1至3个Rf取代的C1-6烷基、卤代烷基、芳基C0-6烷基或环烷基，并且其中Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H、C1-6烷基或芳基-C1-6烷基；其中每一R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中Rf选自卤素、CN、NO2、-OH、-Rg、-ORg、-OC(O)NHRg、-OC(O)N(Rg)2、-OC(O)Rg、-OC(O)H、-NH2、-NHRg、-N(Rg)2、-SH、-SRg、-S(O)2Rg、-SO2NH2、-SO2NHRg、-SO2N(Rg)2、-NHS(O)2Rg、-NRgS(O)2Rg、-C(O)NH2、-C(O)NHRg、-C(O)N(Rg)2、-C(O)H、-C(O)Rg、-NHC(O)Rg、-NRgC(O)Rg、-NHC(O)NH2、-NRgC(O)NH2、-NRgC(O)NHRg、-NHC(O)NHRg、-NRgC(O)N(Rg)2、-NHC(O)N(Rg)2、-COOH、-CO2Rg、-NHCO2Rg、-NRgCO2Rg和-OSi(Rg)3，其中每一Rg独立地为C1-6烷基；
A选自C＝Y1、C＝NORc、C＝NOC(O)H、C＝NOC(O)Rg、C＝NOCO2Rg、C＝NOC(O)NH2、C＝NOC(O)NHRg、C＝NOC(O)N(Rg)2和-CRcRh，其中Y1为＝O或＝S，并且Rh选自卤素、CN、NO2、-OH、-ORi、-OC(O)NHRi、-OC(O)N(Ri)2、-OC(O)Ri、-OC(O)H、-NH2、-NHRi、-N(Ri)2、-SH、-SRi、-S(O)2Ri、-SO2NH2、-SO2NHRi、-SO2N(Ri)2、-NHS(O)2Ri、-NRiS(O)2Ri、-C(O)NH2、-C(O)NHRi、-C(O)N(Ri)2、-C(O)H、-C(O)Ri、-NHC(O)Ri、-NRiC(O)Ri、-NHC(O)NH2、-NRiC(O)NH2、-NRiC(O)NHRi、-NHC(O)NHRi、-NRiC(O)N(Ri)2、-NHC(O)N(Ri)2、-COOH、-CO2Ri、-NHCO2Ri、-NRiCO2Ri、-OSi(Ri)3、-O-(Z)1-6、-S-(Z)1-6、-NH(Z)1-6和-NRc(Z)1-6，其中每一Ri独立地为任选地被1至3个Rf基团取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、芳基C0-6烷基或C3-6环烷基；-(Z)1-6为通过醚键连接在一起的1至6个独立选择的C4-7单糖残基的序列，任选地每一Z独立地被1至3个Rf基团取代；
R10选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X2CN、-X2NO2、-X2C(O)Ra、-X2OC(O)Ra、-CRb＝NORc、-X2CO2Rc、-X2C(O)NRcRd、-X2C(NRcRd)＝NRc、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2ORa、-X2SRa、-X2NHRa和-X2N(Ra)2，其中每一X2独立地为键或C1-4亚烷基；其中R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中两个相邻的Rf取代基与和它们相连的原子一起任选地形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5元杂环，其中所述杂环任选地被1至3个Rg基团取代，并且R10的芳香环任选地被1至5个Rf基团取代；并且
R11选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、C2-6卤代烯基、C5-6环烯基和C2-6环氧烷基，每一R11任选地被1至3个Rf基团取代。
46.调节哺乳动物急性期反应、炎症或造血作用的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物治疗有效量的式(II)的化合物：
Figure FPA00001331005200131
R5、R7、R8和R9各自独立地为C1-4烷基；
R6选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X1CN、-X1NO2、-X1C(O)Ra、-CRb＝NORc、-X1CO2Rc、-X1C(O)NRcRd、-X1C(NRcRd)＝NRc、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1C(O)NRcS(O)Rd、-X1ORe、-X1SRe、-X1NHRe和-X1N(Re)2以及-X1Re，其中每一X1独立地为键或C1-4亚烷基，其中每一Re独立地为被1至3个Rf取代的C1-6烷基、卤代烷基、芳基C0-6烷基或环烷基，并且其中Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为H、C1-6烷基或芳基-C1-6烷基；其中每一R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中Rf选自卤素、CN、NO2、-OH、-Rg、-ORg、-OC(O)NHRg、-OC(O)N(Rg)2、-OC(O)Rg、-OC(O)H、-NH2、-NHRg、-N(Rg)2、-SH、-SRg、-S(O)2Rg、-SO2NH2、-SO2NHRg、-SO2N(Rg)2、-NHS(O)2Rg、-NRgS(O)2Rg、-C(O)NH2、-C(O)NHRg、-C(O)N(Rg)2、-C(O)H、-C(O)Rg、-NHC(O)Rg、-NRgC(O)Rg、-NHC(O)NH2、-NRgC(O)NH2、-NRgC(O)NHRg、-NHC(O)NHRg、-NRgC(O)N(Rg)2、-NHC(O)N(Rg)2、-COOH、-CO2Rg、-NHCO2Rg、-NRgCO2Rg和-OSi(Rg)3，其中每一Rg独立地为C1-6烷基；
A选自C＝Y1、C＝NORc、C＝NOC(O)H、C＝NOC(O)Rg、C＝NOCO2Rg、C＝NOC(O)NH2、C＝NOC(O)NHRg、C＝NOC(O)N(Rg)2和-CRcRh，其中Y1为＝O或＝S，并且Rh选自卤素、CN、NO2、-OH、-ORi、-OC(O)NHRi、-OC(O)N(Ri)2、-OC(O)Ri、-OC(O)H、-NH2、-NHRi、-N(Ri)2、-SH、-SRi、-S(O)2Ri、-SO2NH2、-SO2NHRi、-SO2N(Ri)2、-NHS(O)2Ri、-NRiS(O)2Ri、-C(O)NH2、-C(O)NHRi、-C(O)N(Ri)2、-C(O)H、-C(O)Ri、-NHC(O)Ri、-NRiC(O)Ri、-NHC(O)NH2、-NRiC(O)NH2、-NRiC(O)NHRi、-NHC(O)NHRi、-NRiC(O)N(Ri)2、-NHC(O)N(Ri)2、-COOH、-CO2Ri、-NHCO2Ri、-NRiCO2Ri、-OSi(Ri)3、-O-(Z)1-6、-S-(Z)1-6、-NH(Z)1-6和-NRc(Z)1-6，其中每一Ri独立地为任选地被1至3个Rf基团取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、芳基C0-6烷基或C3-6环烷基；-(Z)1-6为通过醚键连接在一起的1至6个独立选择的C4-7单糖残基的序列，任选地每一Z独立地被1至3个Rf基团取代；
R10选自C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、-X2CN、-X2NO2、-X2C(O)Ra、-X2OC(O)Ra、-CRb＝NORc、-X2CO2Rc、-X2C(O)NRcRd、-X2C(NRcRd)＝NRc、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2C(O)NRcS(O)Rd、-X2ORa、-X2SRa、-X2NHRa和-X2N(Ra)2，其中每一X2独立地为键或C1-4亚烷基；其中R6取代基的脂肪族部分任选地被1至3个Rf基团取代，其中两个相邻的Rf取代基与和它们相连的原子一起任选地形成具有选自N、O或S的1至3个杂原子的5元杂环，其中所述杂环任选地被1至3个Rg基团取代，并且R10的芳香环任选地被1至5个Rf基团取代；并且
R11选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-6环烷基、C2-6烯基、C2-6卤代烯基、C5-6环烯基和C2-6环氧烷基，每一R11任选地被1至3个Rf基团取代。
47.如权利要求34、39或44中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛选自急性疼痛、慢性疼痛、内脏痛、炎症性疼痛、躯体痛或神经性疼痛。
48.如权利要求34、36、39、41、44和46中任一权利要求所述的方法，其中所述炎症为变态反应性炎症、急性炎症或慢性炎症。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述炎症为选自类风湿关节炎、多发性硬化、重症肌无力或红斑狼疮的自身免疫性病症。
50.抑制NMDA受体或MC4受体的活性的方法，所述方法包括：使D048至D090中任一化合物与NMDA受体或MC4受体接触。
51.治疗哺乳动物神经退行性疾病或神经病学疾病状态的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物治疗有效量的D048至D090中任一化合物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述疾病选自肌萎缩性侧索硬化、阿尔兹海默病、帕金森病和亨廷顿舞蹈症。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述疾病状态选自神经性疼痛、中风、脑外伤和癫痫。
54.预防哺乳动物应激条件下神经元损伤的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物治疗有效量的D048至D090中任一化合物。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述应激条件为中风。
56.治疗哺乳动物由慢性疾病诱导的抑郁、焦虑和恶病质的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物治疗有效量的D048至D090中任一化合物。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述慢性疾病选自癌症、AIDS、肾衰竭、肝功能衰竭、充血性心力衰竭和肺部疾病。
58.增强哺乳动物大脑认知功能的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物治疗有效量的D048至D090中任一化合物。
59.抑制红藻氨酸盐受体活性的方法，所述方法包括：使权利要求1或23所述的化合物与红藻氨酸盐受体接触。
60.保护神经元不受β淀粉样多肽兴奋性中毒影响的方法，所述方法包括：使权利要求1或23所述的化合物与神经元细胞接触。
61.抑制红藻氨酸盐受体活性的方法，所述方法包括：使DA001至DA090中任一化合物与红藻氨酸盐受体接触。
62.保护神经元不受β淀粉样多肽兴奋性中毒影响的方法，所述方法包括：使DA001至DA090中任一化合物与神经元细胞接触。
63.权利要求1或23所述的化合物或DA001至DA090中任一化合物在调节哺乳动物前炎症蛋白质表达中的用途。
64.权利要求1或23所述的化合物或DA001至DA090中任一化合物在改善哺乳动物中实验性自身免疫性脑脊髓炎症状的用途。
65.权利要求1或23所述的化合物或DA001至DA090中任一化合物在降低淋巴细胞渗入哺乳动物脊髓中的用途。
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