CN102171234A - 光交联核酸水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用光交联方法来生产水凝胶核酸结构的方法和组合物。本发明还提供了使用光交联水凝胶进行非细胞蛋白质生产的方法，以及化合物包封和输运的方法。

Description

光交联核酸水凝胶
交叉引用
根据35USC§119的规定，本申请要求2008年8月5日提交的名称为“PHOTO-CROSSLINKING-BASED METHOD FOR CREATING DNA HYDROGELS”的第61/086,423号美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用的方式全文并入到本申请中。本申请涉及如下专利申请：美国专利申请第11/464,184号，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES FOR PROTEIN PRODUCTION”；美国专利申请第11/464,181号，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES”；美国专利申请第11/423,633号，其申请日为2006年6月12日，名称为“DETECTION OF TARGET MOLECULES WITH LABELED NUCLEIC ACID DETECTION MOLECULES”。所有这些专利申请都通过引用的方式全文并入到本申请中。
技术背景
DNA分子具有独特的的力学，物理学以及化学性质。从力学角度来看，DNA分子可以是刚性的(例如，当DNA分子小于50nm时，双链DNA的维持长度)(Bouchiat，C.等人，Biophys J 76：409-19(1999)；Tinland等人，Macromolecules30：5763-5765(1997)；Toth等人，Biochemistry 37：8173-9(1998))，NDA分子也可以是柔性的。从物理学角度来看，DNA是一种每个碱基对宽约2纳米，长约0.34纳米的小分子(B型DNA)。天然状态下，DNA分子以线性或者环状的形态存在。从化学角度来看，DNA通常表现出稳定、无毒性、可溶于水等性质，并且在市场上能够获得大量高纯度的DNA。此外，DNA分子能够很容易的用各种已知的酶如限制性内切酶和连接酶进行操作。在特定的条件下，DNA分子能够与其互补的核酸链(如DNA，RNA或者肽核酸(PNA))发生自组装。此外，DNA分子能够进行指数级的扩增，并被接合，例如，具体的来说，进行连接。因此，DNA分子是一种用以构建纳米材料的极佳的候选物。
目前仍迫切需要开发一种高效并快速的方法来生产含有核酸分子的组合物，该组合物可以用来作为构建具有多种应用价值的新结构的结构单元。
发明概述
本发明提供了涉及核酸类结构的组合物和方法，包括水凝胶，该核酸类结构通过交联方法生成，如光交联。
一方面，本发明提供了包含多个支化核酸分子的组合物，其中至少部分支化核酸分子与光反应基团偶联。在一些实施方式中，所述至少部分支化核酸分子在5′末端与光反应基团偶联。在一些实施方式中，所述至少部分支化核酸分子在3′末端与光反应基团偶联。在一些实施方式中，所述至少部分支化核酸分子在核酸分子的内部与光反应基团偶联。在一些实施方式中，所述至少部分支化核酸分子之间通过光反应基团进行交联。
在一些实施方式中，所述多个支化核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)或者它们的组合。所述支化核酸分子可包括寡核甘酸。所述核酸分子可包括编码以及非编码的核酸分子。
在一些实施方式中，所述多个支化核酸分子具有一种或多种如下型态的支链结构：X型、Y型、T型、哑铃型，或者类树状型态。
在一些实施方式中，至少部分的核酸分子与一种或者多种其它化合物相连接。这里提到的一种或多种其它化合物包括但不限于，肽、多肽、蛋白质、脂类、碳水化合物、核酸适体(aptamer)、抗体、抗原、细胞生长因子、DNA结合剂、可检测标签、可筛选标志物、生物素、药学试剂、药物、小分子、治疗性药剂、受体分子、配体、核酸分子或者底物。
其它的核酸分子包括但不限于，siRNA、miRNA、snRNA、寡核苷酸(ODN)、基因序列、内含子序列、外显子序列、非编码序列、肽核酸(PNA)、或mRNA序列。所述其它的核酸分子可以进一步包含编码区。
本发明所使用的其它肽包括，腺病毒核心肽、合成肽、流感病毒HA2肽、猴免疫缺陷病毒gp32肽、SV40T-Ag肽、VP22肽、Tat肽或Rev肽。在一些实施方式中，其它肽包括DNA缩聚肽、DNA保护肽、内含体靶向肽、膜融合肽、核定位信号肽或蛋白质转导域肽。
本发明所使用的可检测标签包括，放射性同位素标记探针、荧光标记探针、量子点标记探针、发色团标记探针、酶标记探针、亲和性配体标记探针、电磁旋转标记探针、重原子标记探针或者纳米颗粒光散射标记探针。在一些实施方式中，可检测标记包含发色团、荧光基团、酶、抗原、重金属、磁性探针、染料、纳米晶体、磷光基团、放射性材料、化学发光基团、散射纳米颗粒、荧光纳米颗粒、拉曼信号产生基团、或电化学检测基团。在一些实施方式中，可检测标记包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、链霉亲和素、亲和素、生物素、核酸适体、抗原、抗体、免疫球蛋白、抗免疫球蛋白抗体、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、TRITC、伊红、绿色荧光蛋白、四碘荧光素、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade BlueTM、得克萨斯红、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯、R-藻红蛋白、藻红蛋白、荧光稀土复合物、铕、铽、Cy3、Cy5、Cy7、地高辛、二硝基苯基、分子信标、荧光分子信标衍生物、发光氨、光散射材料、等离子共振材料、金、银、量子点、14C、123I、124I、125I、131I、锝-99m(Tc99m)、35S、32P、或者3H。
在一些实施方式中，上述一种或多种其它化合物包括聚合物。可使用的聚合物包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N-烷基丙烯酰胺)、聚(N-正丙基丙烯酰胺)、聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)、肽、多肽、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷、聚二芳基乙烯(DTEC)、葡聚糖-聚乳酸、弹力蛋白样多肽、聚酯、聚乳酸、聚(L-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙丙交酯(poly(lactide-co-glycolides))、生物素标记的乙二醇乳酸二嵌段共聚物、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚epsilon-己内酯、聚酸酐、聚(双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、聚苯乙烯、聚氨酯、聚氨基酸、聚环氧乙烷、聚环氧乙烷-聚丙烯-聚环氧乙烷、聚乳酸-g-聚乙烯醇、聚环氧乙烷-聚L-乳酸、聚D，L-乳酸羟乙酸共聚物-聚乙二醇、聚(L-乳酸-乙二醇)、聚乙二醇聚羟基酸共聚物、聚乙烯醇、聚(乳酸赖氨酸共聚物)-聚天冬氨酸、聚己内酯-三亚甲基碳酸酯共聚物、聚(L-乳酸-乙醇酸-L-丝氨酸)共聚物、聚富马酸丙二醇酯、寡聚(富马酸聚乙二醇酯)、聚(富马酸丙二醇酯-乙二醇)、聚乙二醇二[乙基磷脂酰(乙二醇)甲基丙烯酸酯]、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-聚乙二醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-明胶、聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸)或前述任意聚合物的衍生物。
在一些实施方式中，所述一种或多种其它化合物包括天然的或者合成的生物相容性材料，生物相容性材料的非限定性实例包括，聚乙二醇(PEG)水凝胶基质、N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)水凝胶基质、壳聚糖水凝胶基质、或者上述材料的任意衍生物。天然的生物相容性材料包括，壳聚糖、甲基纤维素、海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、纤维素、明胶、胶原蛋白、葡聚糖或它们的任意衍生物。合成的生物相容性材料包括，羟乙基甲基丙烯酸酯、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酸酯、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-异丙基丙烯酰胺、醋酸乙烯酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、聚乙二醇丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯/二甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、富马酸二羟丙酯，或它们的任意衍生物。
在一些实施方式中，至少有部分核酸分子与底物相连，例如与纳米颗粒或者微粒相连。在一些实施方式中，所述底物包括一种或者多种贵金属、过渡金属、半导体材料或磁性材料。在一些实施方式中，所述底物包括一种或者多种金、银、铜、钯、铂、硫化镉(CdS)、铯化镉(CdSe)、二氧化钛(TiO2)、氧化锌(ZnO)、炭黑、4-膦酰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧稳定自由基、二氧化钛、钴、镍、铁、铁-钴，以及磁铁矿(Fe3O4)。在一些实施方式中，底物包括玻璃或者聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
相互交联的核酸分子可以形成核酸水凝胶。所述水凝胶具有预先确定的几何结构。在一些实施方式中，该几何结构具有大量的孔。在一些实施方式中，这些孔的尺寸小于约15纳米。在一些实施方式中，这些孔的尺寸选自以下的组：大约5纳米、大约10纳米、大约15纳米、大约20纳米、大约30纳米、大约40纳米、大约50纳米、以及大约100纳米。在一些实施方式中，这些孔的尺寸范围选自，大约0.1微米至大约5微米、大约5微米至大约10微米、大约10微米至大约20微米、大约20微米至大约30微米、大约30微米至大约40微米、大约40微米至大约50微米、大约50微米至大约100微米，以及大约100微米至大约200微米。
所述核酸分子也可以形成三维结构。这样的三维结构可以作为宏观支架(macroscopic scaffold)。
另一方面，本发明提供了交联核酸分子的方法，包括：提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；以及光交联所述多个核酸分子。在一些实施方式中，所述方法进一步包括扩增核酸分子。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在光交联步骤之前先杂交核酸分子。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括纯化杂交的核酸分子。这样的纯化方法包括色谱学方法，例如高效液相色谱法(HPLC)。
本发明的方法可用于合成或者形成全部或部分本发明所述的组合物，例如使用核酸结构单元、组织和前面记载的其它化合物。在一些实施方式中，核酸分子以等摩尔比例提供。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括在光交联步骤之前将光反应基团与至少部分核酸分子偶联。所述光反应基团可以偶联到至少部分核酸分子的一个或者多个5’末端、一个或者多个3’末端，以及分子内部。在一些实施方式中，所述光反应基团包括，乙烯基、丙烯酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、胺类、羧酸酯基、或者硫醇基团。在一些实施方式中，所述光反应基团是伯胺修饰的基团、仲胺修饰的基团或者叔胺修饰的基团。
所述光交联步骤可以在电磁辐射条件下进行，例如在可见光下、紫外光(UV)下、近红外光下、红外光下、和/或微波波段下进行。所述光交联步骤也可以在γ射线、X射线或者适宜的无线电波波段下进行。
在一些实施方式中，所述光交联步骤在光引发剂存在的条件下进行，包括但不限于艳佳固(Irgacure)。所述光交联可以使用交联仪进行，例如UV交联仪。
在一些实施方式中，部分所述的核酸分子通过光交联或者其它方式与一种或者多种其它化合物相连接。所述一种或多种其它化合物包括但不限于前面所记载的化合物。
在一些实施方式中，本发明的方法用于交联核酸分子以形成核酸水凝胶。该水凝胶可以具有某种结构，例如，包括一种或者多种微薄膜、微垫衬、微薄纤维、纳米球、或者微米球。在一些实施方式中可以通过乳化、光蚀刻、微流体合成(microfluidic synthesis)、微模塑(micromolding)、或者微静电纺丝技术或这些技术的组合来促进这些结构的形成。也可以使用所述方法将核酸水凝胶包被到底物的表面。
另一方面，本发明的方法可以用于快速交联核酸以形成例如水凝胶。在一些实施方式中，交联可以进行10分钟或更短时间。在一些实施方式中，交联可以进行5分钟或更短时间。在另一些实施方式中，交联可以进行1分钟或更短时间。
另一方面，本发明提供了将一种或者多种化合物包封到核酸水凝胶中的方法，包括：提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；将一种或者多种化合物与所述多个核酸分子进行混合；光交联所述多个核酸分子与一种或者多种化合物以形成核酸水凝胶，从而将一种或者多种化合物包封到核酸水凝胶中。
在相关方面，本发明提供了将一种或多种化合物包封到核酸水凝胶中的方法，包括：提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；光交联所述多个核酸分子以形成核酸水凝胶；将一种或多种化合物与核酸水凝胶进行混合，从而将一种或者多种化合物包封到核酸水凝胶中。
所述一种或者多种被包封的化合物的非限定性实例包括，蛋白质、肽、脂类、核酸或碳水化合物。在一些实施例中，所述一种或者多种化合物包括治疗性药剂。治疗性药剂的包封非常有效，例如，可达到至少约90％的包封率。在一些实施方式中，所述治疗性药剂是小分子，例如阿霉素。在另一些实施方式中，所述一种或者多种化合物包括细胞，例如哺乳动物细胞。该方法也可以用于包封病毒。
另一方面，本发明提供了输运化合物的方法，包括：提供多个可以生成一种或多种支链结构的核酸分子；将化合物与所述的多个核酸分子进行混合；光交联与化合物混合的多个核酸分子，以形成含有包封了化合物的核酸水凝胶组合物；给予患者该组合物，其中该组合物以时间可控方式释放化合物，从而实现输运化合物的目的。
在相关方面，本发明提供了输运化合物的方法，包括：提供多个可以生成一种或多种支链结构的核酸分子；光交联所述多个核酸分子以形成核酸水凝胶；将所述化合物与核酸水凝胶进行混合，以形成含有包封了化合物的核酸水凝胶组合物；给予患者该组合物，其中该组合物以时间可控方式释放化合物，从而实现输运化合物的目的。
在一些实施方式中，输运的化合物包括治疗性药剂。在一些实施例中，所述化合物包括细胞。所述水凝胶可以为细胞生长提供三维结构的基质。可以将治疗性药剂输运到任何合适的部位，例如，细胞、体液、组织、器官或者皮肤。
在一些实施方式中，用于输运治疗性药剂的水凝胶具有孔。根据不同的用途，孔的尺寸可以大于约15纳米。类似的，孔的尺寸也可以是15纳米或者更小。
一方面，本发明提供了非细胞体系合成一种或者多种蛋白质的方法，包括：提供多个可以生成一种或者多种支链结构的核酸分子；光交联所述多个核酸分子以形成核酸水凝胶；在核酸水凝胶中表达一种或者多种蛋白质。
在一些实施方式中，水凝胶具有孔。在一些实施方式中，这些孔的尺寸范围为约5纳米至大约500纳米，例如，大约50纳米至大约500纳米。在一些实施方式中，这些孔的尺寸为，大约5纳米、大约10纳米、大约15纳米、大约20纳米、大约30纳米、大约40纳米、大约50纳米、和/或大约100纳米。
所述用于表达一种或者多种蛋白质的水凝胶可含有编码和非编码的核酸分子。水凝胶也可以含有核酸分子和一种或者多种进行蛋白质修饰所需要的大分子，从而能够生成修饰蛋白质。这样的修饰包括但不限于，磷酸化、糖基化、甲基化、泛素化、生物素化、烷基化、乙酰化、谷氨酰基化、甘氨酰化、异戊二烯化、脂化、磷酸泛酰巯基乙胺基化、硫化、瓜氨酸化、脱酰胺化、异构化、或者上述任意修饰的组合。
引用并入
本发明中所提及的所有文献、专利以及专利申请在此全部通过引用方式并入到本申请中，并入到本申请中的内容就如同这些文献、专利或专利申请各自分别通过引用方式并入到申请中的一样。
【附图简述】
本发明所附的权利要求书具体列出了本发明新的特征。通过参考以下利用了本发明构思的示例性实施例的详细描述，以及所附的附图可以更好的理解本发明的特征和优点。本发明的附图如下：
图1是核酸水凝胶的光交联示意图。
图2是生成图1所示核酸水凝胶的两种相关工艺的示意图。
图3A是生成包含X型核酸和编码目标蛋白质的线性核酸的网状基质的示意图。图3B示出了典型的X-DNA(SED ID NOs：56(也就是5’端以CTGA.....起始)，57(5’端以ACCT....起始)，58(5’端以GAAT....起始)以及59(5’端以TCCG....起始))。
图4示出了X型分子的形成。
图5示出了多个X型分子相连接的过程。
图6A示出了含有X型和Y型分子的基质的形成。图6B示出了含有X型，Y型以及T型分子的基质的形成。
图7A和7B示出了Y型DNA(SEQ ID NOs：102，108和112)。
图8A示出了X-，Y-，T-DNA结构单元。图8B示出了由图8A中的结构单元形成的基质。
图9示出了哑铃型的DNA(SEQ ID NOs：102，108以及112形成末端对末端连接的Y型态。)
图10A-C示出了树状样型态的分子及其结构。
图11示出了由末端Y型臂与各种化合物相连接的核酸组成的树状样结构。
图12示出了与各种化合物相连接的Y型DNA，包括通过μMu元件与Y型DNA相连的环状载体。
图13示出了T型DNA(SEQ IDNOs：44-46)。
图14示出了T型分子的形成。
图15A-C示出了由T型分子和X型(A)，Y型(B)以及T型(C)分子构成的基质。
图16示出了与各种化合物相连接的输运至细胞中的多价核酸树状物。
图17示出了一种使用核酸水凝胶结构在非细胞体系中合成蛋白质的工艺。
图18示出了整合有AuNP的X型核酸的网状基质。
图19示出了使用核酸水凝胶结构包封和传输化合物的过程。
图20示出了光聚合DNA-PEG水凝胶和PEG水凝胶之间的压力和张力比较的示意图。
图21A示出了DNA凝胶的制作后型态。图21B示出了DNA凝胶的微结构。图21C示出了包被了珠子的DNA-PEG水凝胶的共聚焦影像图。
图22示出了使用光聚合DNA水凝胶表达海肾荧光素酶蛋白的示意图。图22A示出了聚合了不同浓度质粒的水凝胶相比于液相系统(SPS)对照反应在荧光素酶活性方面的倍数变化。图22B示出了总基因量对于表达的影响，其通过改变反应中光交联的P凝胶微垫衬的数量来测定(蓝线)。等量的质粒用于液相系统(SPS)的对照实验(红线)。根据体积产率来计算，光交联的P凝胶产生高达约1mg/ml的功能蛋白。
发明详述
1.光交联的核酸水凝胶
光聚合技术，其是利用光诱导的聚合反应，已经被广泛地用来生产相对简单的水凝胶。参见，例如，Peppas等人，Hydrogels in Biology and Medicine；From Molecular Principles to Bionanotechnology.Adv.Mater.18：1345-60(2006)。DNA是一种高效的材料，其可以通过各种分子工具来加以操控，例如酶。参见Luo，D.The Road from Biology to Materials.Mater.Today 6：38-43(2003)。此前，我们已经通过酶连接方式开发了DNA水凝胶、DNA纳米条码、完全可编程的自组装的类树状DNA纳米结构、以及支化的DNA。参见，美国专利申请第11/464,184号，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES FOR PROTEINPRODUCTION”；美国专利申请第11/464,181号，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES”。我们的DNA水凝胶已经在各种不同的治疗应用中作为基本成分加以使用。近来，酶催化的DNA水凝胶已应用于非细胞蛋白质合成、可控的药物输运、以及细胞和组织培养中。参见，美国专利申请第11/464,184号，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES FOR PROTEIN PRODUCTION”；美国专利申请第11/464,181号，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES”。虽然酶连接合成DNA凝胶的方法所获得的产品具有生物相容性、生物可降解以及操控方法廉价的特点，但是这种方法需要花费数小时的反应时间才能获得具有柔性凝胶性能的凝胶。本发明提供了一种通过光交联快速制备DNA水凝胶的方法。光交联的水凝胶还具有更好的力学性能，例如增强的水凝胶强度。
这些可光交联的DNA杂交水凝胶可以用来在特定的微样式区域生产蛋白质。在一些实施方式中，具有光反应部分的DNA结构单元与金纳米颗粒(AuNP)偶联从而在光反应后获得修饰的AuNP-DNA偶联物。也可以使用其它的各种纳米颗粒。这些产物可用于表面化学和基因输运。此外，细胞在光交联水凝胶中能进行均匀地分布和培养。各种水凝胶基质可以通过UV曝光时间、光引发剂浓度以及DNA结构单元的性质来加以调节，从而修饰细胞的行为。这些方面使得光交联DNA水凝胶以及颗粒更有价值，并在DNA凝胶的工业生产上更具有可行性。这些水凝胶可用于崭新的生物学相关应用，特别是在非细胞蛋白质合成和可控的药物输运方面。
一方面，本发明为自组装DNA分子的光交联提供了一种简单快速地生成DNA水凝胶和颗粒的方法。光交联反应使得DNA材料能够在原位形成凝胶，并能够在1、2、3、4、5、6、7、8、9、或者10分钟内快速凝胶化，并且还能够使用其它材料，包括尺寸在纳米级别(50-500nm)至微米级别(20-30μm)的DNA纳米颗粒。
一方面，本发明提供了光交联核酸的组合物，其包含多个本发明所记载的支化核酸分子。至少部分的支化核酸分子含有光反应基团，所述光反应基团例如与核酸分子的5‘末端、3’末端或者分子内部偶联。与核酸分子内部偶联的基团在这里是指，该基团与核酸分子的结合部位既不在5’末端，也不在3’末端。在一些实施方式中，所述核酸分子与光反应基团不止在一个位点发生偶联。在这些实施方式中，所述光反应基团即使是在同一个分子中也可以全部是相同的基团，或者不同的基团。在水凝胶组合物中，至少部分所述的支化核酸分子通过光反应基团相互交联。所述支链核酸分子可以包括任何相关形式的核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)或者它们的组合。在一些实施方式中，所述多个支化核酸分子包括寡核苷酸。
所述核酸分子也可以与其它的水凝胶分子发生交联，这些水凝胶分子包括但不限于，聚乙二醇(PEG)水凝胶基质、N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)水凝胶基质、壳聚糖水凝胶基质或者它们的组合，从而提供了多样的方式来修饰凝胶的性质。在一些实施方式中，所述其它分子也与核酸分子光交联。这些修饰的杂交核酸水凝胶的孔尺寸以及机械强度可以通过使用其它聚合物来改变核酸单体的分子量和其聚合物部分来加以调节。在一些实施方式中，光聚合反应使用批量方式进行。在一些实施方式中，光聚合反应通过流过微流体模式(flow-through microfluidic schemes)来进行。也可以采用其它方法进行光聚合。成型的核酸-PEG杂交水凝胶的尺寸和形状可以通过结合光交联与其它方法来加以控制，这些方法例如是，使用微模塑的聚二甲基硅氧烷(PDMS)来生成微薄膜和微垫衬形状、使用微静电纺丝技术来形成微薄纤维和微球形状、通过在微流体通道中进行微乳化来形成微球形状。类似的纳米规模结构也可使用相应的方法来形成。可以通过调节核酸结构单元的尺寸、支化核酸单体的类型以及它们的起始浓度来精确调节核酸颗粒的交联度以及尺寸。本发明在此也提供了调节的方法。
在一些实施方式中，核酸与一种或者多种其它分子相连接，例如，肽、多肽、核酸适体、抗体、抗原、细胞生长因子、DNA结合试剂、可检测标签、可筛选的标志物、药物化合物、治疗性化合物、受体分子、配体或者核酸分子。在一些实施方式中，其它生物分子也与核酸分子光交联。所述核酸分子也可以，如通过光交联，与一种或者多种聚合物相连接。所述聚合物的非限定实例包括，聚乙二醇(PEG)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N-烷基丙烯酰胺)、聚(N-正丙基丙烯酰胺)、聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)、肽、多肽、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷、聚(DTEC)、葡聚糖-聚乳酸、弹力蛋白样多肽、聚酯、聚乳酸、聚(L-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙丙交酯、生物素标记的乙二醇-乳酸嵌段共聚物、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚己内酯、聚酸酐、聚(双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、聚苯乙烯、聚氨酯、聚氨基酸、聚环氧乙烷、聚环氧乙烷-聚丙烯-聚环氧乙烷、聚乳酸-g-聚乙烯醇、聚环氧乙烷-聚L-乳酸、聚D，L-乳酸羟乙酸共聚物-聚乙二醇、聚(L-乳酸-乙二醇)、聚乙二醇-聚羟基酸共聚物、聚乙烯醇、聚(乳酸-赖氨酸共聚物)-聚天冬氨酸、聚己内酯-三亚甲基碳酸酯共聚物、聚(L-乳酸-乙醇酸-L-丝氨酸)共聚物、聚富马酸丙二醇酯、寡聚(富马酸聚乙二醇酯)、聚(富马酸丙二醇酯-乙二醇)、聚乙二醇二[乙基磷脂酰(乙二醇)甲基丙烯酸酯]、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-聚乙二醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-明胶、聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸)或它们的任意衍生物。
除非特别指明，本发明各种实施方式的实现手段用到了传统的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学以及重组DNA技术，这些都是本领域的公知技术。参见Sambrook，Fritsch and Maniatis，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人，eds.，(1987))；the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)；PCR 2：APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))，Harlow and Lane，eds.(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney，ed.(1987)).
除非上下文明确说明，否则本发明说明书和权利要求书中出现的单数形式“一”、“一种”和“所述”也包括复数形式。例如，“一种细胞”包括了多个细胞，也包括它们的混合。
在本发明中，“生物活性试剂”或者“生物活性剂”是同一概念，可以相互替换使用，其包括但不限于一种生物学的或者化学的化合物，例如简单的或者复杂的有机的或无机的分子、肽、模拟肽、蛋白质(如，抗体、血管生成因子、抗血管生成因子、以及细胞生长因子)、抗原或者免疫原、脂质体、小干扰RNA(siRNA)、或者多聚核苷酸(如，载体、病毒、病毒载体、或者反义核苷酸)、治疗性药剂；有机或者无机的分子可以包括相同的或混杂的化合物，包括药物、放射性同位素、粗提的或者纯化的植物提取物，和/或者细胞；能够改变、抑制、激活或者影响生物学或者生物化学过程的物质，包括在细胞和组织中存在的各种分子(如，蛋白质、氨基酸、肽、多聚核苷酸、核苷酸、碳水化合物、糖、脂类、核蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、类固醇、生长因子、化学吸引剂，核酸适体等)，不论这些分子本身是天然存在的还是人工合成的(例如通过合成或者重组方法)。这样的试剂可以是天然产生的，也可以是合成的。“治疗性药剂”包括在治疗中有效的分子或者原子。治疗性药剂的实例包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、抗体、抗体药物偶合物、光活性试剂或者染料、以及放射性同位素。
这样的试剂的实例包括但不限于，药物，例如，小分子、抗癌物质、止痛剂、鸦片类物质、抗艾滋物质、抗癌物、免疫抑制剂(例如环孢霉素)、抗病毒试剂、酶抑制剂、神经毒素、催眠药物、抗组胺药物、润滑剂、镇定剂、抗惊厥药物、肌肉松弛剂、抗帕金森药物、抗痉挛药物、以及包括通道阻断剂在内的肌肉收缩剂、缩瞳剂、胆碱能阻断剂、抗青光眼化合物、抗寄生虫药物、抗原虫药物、和/或抗真菌化合物、包括细胞生长抑制剂以及抗粘附分子在内的细胞-胞外基质相互作用调节剂、血管扩张剂、DNA、RNA或蛋白质合成抑制剂、抗高血压药剂、退烧药、甾体和非甾体抗炎药剂、抗血管生成因子、抗分泌因子、抗凝血剂和/或抗血栓试剂、局部麻醉药、滴眼液、前列腺素、靶向药剂、神经传递素、蛋白质、细胞响应修饰因子以及疫苗。
优选但并非必须的，所述药物已经被相应的政府机构或者当局认为是安全有效的。例如美国食品和药品监督管理局(FDA)根据美国联邦法规21C.F.R.§§330.5，#331至361，及440至460所列出的人用药物；FDA根据美国联邦法规21C.F.R.§§500至589所列的兽用药物，这些药物在此通过引用方式全部并入到本申请中以作参考，它们都被认为是本发明组合物和方法所适用的药物。
术语“支架”可以指能够支撑细胞的三维结构。细胞可以被该支架包封，或者淀积在支架表面的层内。所述支架的形成方法包括但不限于此处记载的核酸分子的自组装方法，所述核酸分子可以包括X型、Y型、T型、哑铃型或者树状型态，也包括线性和环状型态，或者上述型态的任意组合。这些核酸分子也可以和化合物相连接，例如化学吸引剂或者治疗活性的化合物。该支架可以通过一种或者多种不同种类的核酸分子形成，这些核酸分子相互互补并互相配对。如果排斥力不足以对抗核酸分子间的相互稳定作用，则含有不匹配碱基对的核酸也可以用来形成支架。在本发明中，支架也指基质、凝胶、核酸水凝胶结构、核酸凝胶组织、或者水凝胶结构。
术语“多聚核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”以及“寡核苷酸”在本发明中可以相互替换使用，根据所用术语的上下文语境也可以包含它们相应的复数形式。它们是指，任意长度的脱氧核糖核酸(DNA)、或者核糖核酸(RNA)或它们的类似物所构成的核苷酸的聚合物形式。多聚核苷酸可以拥有任意三维结构，可以起到任何已知或未知的功能。以下是多聚核苷酸的非限定性实例：基因或者基因片段的编码或者非编码区域、遗传连锁分析确定的基因位点、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、cDNA、重组多聚核苷酸、支化多聚核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA(A，B以及Z构象)、PNA、锁核酸(LNA)、TNA(treose nucleic acid)、任意序列的分离的RNA、核酸探针、以及引物。小干扰RNA(siRNA)有时候也被称为短链干扰RNA或者沉默RNA，其通常是20-25个核苷酸长度的双链RNA分子。siRNA能够干扰特定基因的表达。LNA通常是指无法反应的RNA，其是一种修饰的RNA核苷酸。LNA核酸的核糖基团的2’位和4’位碳通过外部引入的桥而相互连接。这个桥将核糖“锁定”在3’-edon结构构象，该构象在A型DNA和RNA中很常见，这种构象能够显著提高分子的热稳定性。miRNA是21-23个核苷酸长度的单链RNA分子。miRNA通常与一条或者多条信使RNA(mRNA)部分互补，通过与其杂交实现下调基因表达的水平。小核RNA(snRNA)是一类小RNA分子，其存在于真核细胞细胞核中。snRNA参与一系列的生物学过程，如RNA剪切、转录因子(7SK RNA)调控或RNA聚合酶II(B2RNA)调控、以及端粒结构的维持。它们与特定的蛋白质结合，其复合体称为小核核糖核蛋白(snRNP)或者“snurps”。
多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如，甲基化核苷酸以及核苷酸类似物。如果存在这样的修饰，则对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或者之后进行。所述核酸序列中可以插入非核苷酸组分。
多聚核苷酸在聚合之后可以被进一步修饰，例如与标记物偶联。本发明公开的各个实施方式中所用的核酸可以通过各种方式来进行修饰，包括交联、链内部修饰例如甲基化和加帽、以及共聚合化。此外，也可以将其它有用的分子连接到核酸链中。例如，将可光交联的基团连接到核酸链中。所述核酸可以是天然存在的序列或者人工合成的序列。所述核酸序列可以与本发明记载的多种方面无关。然而，特定的序列可以被用于防止一些重要效应的出现，这些效应的产生可以是因为核酸的信息编码的特征，或者因为引发了特定的细胞响应或者因为控制了分子的物理结构。
术语“核苷酸探针”或“探针”是指，在杂交反应中用于检测或者鉴定其相应靶点多聚核苷酸的多聚核苷酸。所述核酸可以包含内含子和外显子序列、修饰序列、RNA、DNA或者它们的类似物。
“核酸适体”通常是指，一种特定序列的寡核苷酸或者所述寡核苷酸的混合物，其中该混合物仍然保留了特异性地结合到靶点分子的能力。因此，本说明书中用到的“核酸适体”包含了核苷酸序列的单数和复数形式。从结构上来讲，本发明中的核酸适体特异性地与寡核苷酸结合。所述寡核苷酸不仅仅包括那些含有常规的碱基、糖基和核苷酸间键合的核苷酸，也包括上述这三种基团中的任意或者全部经修饰后获得的核苷酸。美国专利第5,756,291号对核酸适体作出了描述，并提供了制备、测试以及使用核酸适体的方法，该专利在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。寡核苷酸适体包含DNA和RNA。此外，肽核酸适体是设计用来干扰细胞内其它蛋白质间相互作用的多肽。它们可以由多种肽环与蛋白质支架的两端结合形成，并具有和抗体相似的结合亲和力。
术语“靶点分子”包括可以与本发明中的双特异性结合试剂的结合域特异结合的分子。
本发明中所提及的“纳米纤维”是指具有纳米尺寸直径的纤维。纳米尺寸纤维的直径通常在500nm或以下。根据本发明中的特定实施方式，纳米纤维的直径在100nm以下。根据本发明中的其它特定实施方式，纳米纤维的直径在50nm以下。根据本发明中的其它特定实施方式，纳米纤维的直径在20nm以下。根据本发明中的其它特定实施方式，纳米纤维的直径在10nm和20nm之间。根据本发明中的其它特定实施方式，纳米纤维的直径在5nm和10nm之间。根据本发明中的其它特定实施方式，纳米纤维的直径在5nm以下。
本发明中提到的术语“分离的和/或纯化的”是指体外制备、分离和/或纯化本发明中的核酸分子，从而使核酸分子不与体内物质结合，或者基本上从体外物质中纯化出来。
以下术语被用于描述两条或者多条多聚核苷酸序列之间的相互关系：(a)“参考序列”，(b)“比对窗口”，(c)“序列一致性”，(d)“序列一致性百分比”，(e)“基本一致”。
在本发明中，“参考序列”是指定义的作为序列比对基础的序列。参考序列可以是特定序列的片段或者完整序列。
在本发明中，“比对窗口”是指多聚核苷酸序列中的连续的特定片段，为了使两条序列进行最优比对，位于比对窗口中的该多聚核苷酸序列与参考序列(其不会存在添加或者删除)相比可以存在序列的添加或者删除(也就是序列缺失)。通常情况下，比对窗口长度至少为5、10或者20个连续的核苷酸，可选30、40、50、100或者更长。本领域的技术人员知道，为了避免出现因为在多聚核苷酸中引入缺失所产生的与参考序列的高相似度，可以引入缺失扣分方法并将其从匹配数中减除。
进行序列比对的方法为本领域所公知。因此，任意两条序列间的一致性百分比可以通过数学算法来完成。优选但非限定性的数学算法的实例包括，Myers and Miller，CABIOS，4：11(1988)中记载的算法，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考；Smith等人，Adv.Appl.Math.，2：482(1981)中记载的局部同源算法，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考；Needleman and Wunsch，JMB，48：443(1970)中记载的同源比对算法，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444(1988)中记载的检索相似度方法，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考；Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264(1990)中记载的算法，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考；Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264(1990)中记载的算法，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考；Karhn and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873(1993)中记载的改进算法，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。
这些数学算法可使用计算机程序来完成，从而用于确定序列一致性。这样的计算机程序包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可由Intelligenetics，Moutain View，California获得)；ALIGN程序(Version 2.0)以及Wisconsi Genetics第8版软件包(可由Genetics Computer Group(GCG)，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA获得)中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA完成。可使用这些程序的默认参数进行比对。CLUSTAL程序已经在Higgins等人，Gene，73：237(1998)，Higgins等人，CABIOS，5：151(1989)；Corpet等人，Nucl.Acids Res.，16：10881(1998)；Huang等人，CABIOS，8：155(1992)；以及Pearson等人，Meth.Mol.Biol.，24：307(1994)中作出了详细的说明，这些文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作为参考。ALIGN程序是基于Myers and Miller(出处同前)的算法。Altschul等人，JMB，215：403(1990)；Nucl.Acids Res.，25：3389(1990)所提供的BLAST程序是基于Karlin and Altschul(出处同前)提出的算法，这些文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。
进行BLAST分析的软件可以从美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.ih.gov)网站获得。该算法包括，首先通过确定查询序列中的长度为W的短句来确定高分序列对(HSPs)，该短句在与数据库序列相同长度的短句进行比对时，完全匹配或者满足正值的阈值T。T是指相邻语句分数阈值。这些初始的相邻语句的匹配作为种子，以启动搜索包含它们的更长的HSPs。找到的语句进一步向每条序列的两端延伸，延伸至比对分数的所能达到的最大值。核苷酸序列最大分数使用参数M(匹配碱基对加分，恒大于0)和N(非匹配碱基对扣分，恒小于0)计算。对于氨基酸序列的最大分数计算，使用了分数矩阵。找到的语句向每个方向延伸，当最大匹配分数相对其最大值降低了数量X时，由于一个或者多个负分残基的匹配带来的扣分使最大匹配分数降至0或以下时，或已经延伸至任意序列的末端时，延伸终止。
除了计算序列一致性的百分比，BLAST算法还进行了两条序列间的相似度统计分析。BLAST算法提供的一个相似度度量方法是最小和概率(P(N))，它通过一个概率指标来说明2条核酸序列或者2条氨基酸序列之间能够发生匹配的概率。例如，如果测试核酸序列和参考核酸序列比较得出的最小和概率小于大约0.1，更优选的是小于大约0.01，最优选的是小于0.001，则这个测试核酸序列被认为与参考序列相似。
为了获得含有缺失的比对以用作对比的目标，可使用Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389(1997)中所描述的Gapped BLAST(包含在BLAST 2.0中)，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作为参考。作为替代，也可使用PSI-BLAST(包含在BLAST 2.0中)进行检测分子间距离关系的迭代搜索。参见Altschul等人(出处同前)。当使用BLAST，Gapped BLAST，PSI-BLAST程序时，可使用相应程序的默认参数(例如，对核苷酸序列使用BLASTN，对蛋白质使用BLASTX)。BLASTN程序(用于核苷酸序列)的默认词长(W)为11，期望值(E)为10，截止值为100，M＝5，N＝-4，以及同时比对正负链。对于氨基酸序列，BLASTP的默认词长(W)为3，期望值为10，使用BLOSUM63评分矩阵。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。比对也可以在人工监测条件下进行。
在比较核酸序列与本说明书中给出的核酸序列的序列一致性百分比的时候，可以使用BlastN程序(版本1.4.7或者更高)的默认参数或使用等同的任意程序。此处“等同程序”是指任意序列比较程序，在比较任意2条查询序列时，所产生的比对结果具有一致的核苷酸或者氨基酸匹配结果，具有一致的序列一致性百分比，当相应结果与优选的程序结果比较时。
在本发明中，对于两条核苷酸序列而言，“序列一致性”或者“一致性”是指两条序列在一个特定的比较窗口中进行最大程度匹配时，通过序列比较算法或者肉眼观测，两条序列中相同残基的特定百分比。当使用序列一致性百分比比较蛋白质时，存在这样的情况，也就是有些位置上氨基酸的不同是由于保守氨基酸替换，即这些氨基酸残基被具有相似化学性质(如所带电荷，或者亲水性)的氨基酸残基所替代，从而并没有改变分子的功能属性。当序列间差异是由于保守替换造成时，序列一致性百分比应该上调以修正保守的自然替换。这样保守性替换所带来的具有差异的序列被认为“具有序列相似性”，或“相似性”。做出这样调节的方法为本领域的技术人员所公知。通常，这包括将其按照部分非匹配而不是完全非匹配进行计分，从而提高序列一致性百分比。因此，例如，完全一致的氨基酸记为1分，而非保守型替换记为0分，保守替换记为0到1分之间。保守替换的分数可以通过，例如，如PC/GENE程序(Intelligenetics，Mountain View，California)中使用的方法计算。
在本发明中，“序列一致性百分比”是指在比较窗口中两条最优配对的序列进行比较后获得的值，为了对两条序列进行最佳比对其中比对窗口中多聚核苷酸序列与参考序列(不会存在添加或者删除)相比，其序列的部分可以存在添加或者删除(如，缺失)。百分比由如下公式计算：由两条序列中存在的相同核酸碱基或者氨基酸残基位点的数目得到匹配位点的个数，将匹配位点的个数除以比较窗口中总位点个数，再乘以100得到序列一致性百分比。
多聚核苷酸序列“基本一致”是指多聚核苷酸序列使用上述的任一种比对程序的标准参数与参考序列进行比对时，具有至少51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％、优选至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更优选至少90％、91％、92％、93％或94％、以及最优选至少95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性。
核苷酸序列具有基本一致的另一种指标是两个分子在严格条件下能够相互杂交。通常情况下，严格条件是指在特定的离子强度和pH值下，低于特定序列热溶解温度(Tm)大约5℃的条件。但是，若符合本发明中的其它条件，则严格条件也可以根据想要达到的严格的程度而在大约1℃至大约20℃温度范围内变化。
进行序列比对时，通常一个序列作为参考序列，另一测试序列被用来与其比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列输入计算机，如有需要可以进一步指定序列的坐标，然后设定序列算法程序的参数。序列比较算法然后基于特定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如上文所说，说明两条核酸序列基本一致的另一个指标是两个分子在严格条件下能够互相杂交。术语“特异性的杂交”是指在严格条件下，在一个复杂的DNA或者RNA混合物中(如全细胞物质)，特定分子只与特定的核酸序列分子发生结合、配对或者杂交。“基本结合”是指一个探针核酸和一个靶点核酸分子之间进行的互补杂交，但该互补杂交包含微小的错配并且该错配可以通过降低杂交介质的严格程度来进行调节，从而达到检测靶点核酸序列的预期目的。
术语“杂交”是指一条或者多条多聚核苷酸通过核苷酸残基之间的氢键结合形成稳定的复合物的反应。氢键的结合可以通过，Waston-Crick碱基配对形成、Hoogstein结合形成、或者以任何其它的序列特异性的方式结合形成。形成的复合体可以包含2条链形成的双链结构、三条或者更多链形成的多链复合体、一条链形成的自杂交结构，或者上述情况的组合。杂交反应可以作为更多反应工艺中的一个步骤，例如作为PCR反应的起始步骤，或者作为使用核糖酶剪切多聚核苷酸的酶解反应中的一个步骤。
用在多聚核苷酸时，术语“杂交的”是指多聚核苷酸通过核苷酸残基间的氢键形成稳定复合体的能力。氢键的结合可以是通过Watson-Crick碱基配对形成、Hoogstein结合形成、或者其它的序列特异性的方式形成。形成的复合体可以包含2条链形成的双链结构、三条或者更多链形成的多链复合体、一条链形成的自杂交结构、或者上述情况的组合。杂交反应可以作为更多反应工艺中的一个步骤，例如作为PCR反应的起始步骤，或者作为使用核糖酶剪切多聚核苷酸的酶解反应中的一个步骤。
本领域的技术人员知道，杂交反应可以在各种严格条件下进行。合适的杂交条件例如是，可以使得探针和靶点内质网应激(ER-stress)相关基因之间的相互识别反应得以充分特异并且充分稳定地进行的条件。关于提高杂交反应严格程度的条件在本领域中已经是已知的或者是公开的。参见，例如，(Sambrook等人，(1989)，出处同前；Nonradioactive In Situ Hybrydization Application Manual，Boehringer Mannheim，第二版)。杂交分析可使用固定在任何固相支持物上的探针进行，包括但不限于，硝化纤维素、玻璃、硅片、以及各种基因芯片。优选的杂交分析是使用美国专利第5,445,934号中的高密度基因芯片来进行。
在核酸杂交实验的语境中，例如Southern和Northern杂交，“严格的杂交条件”和“严格的杂交洗涤条件”取决于序列，并且随着环境参数的改变而改变。序列越长则发生特异性杂交的温度越高。Tm值是指50％的靶点序列和其完全匹配的探针发生杂交时的温度(在特定离子强度和pH的条件下)。特异性通常是由杂交后的洗涤实现的，在这个过程中，重要的影响因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。
对于DNA-DNA间的杂交，Tm值可使用Meinkoth-Wahl方程估算，Anal.Biochem.，138：267(1984)，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考；Tm 81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是指DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸百分比率，％form是指杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是指杂交分子的碱基对长度。每增加1％的错配，Tm值会降低大约1℃；因此，可以对Tm值、杂交反应、和/或洗涤条件进行适当调整从而使得目标一致性的序列能够发生杂交。例如，如果想要使序列一致性大于90％，Tm值可以降低10℃。通常情况下，在特定离子强度和pH值下，使用特定序列与其互补序列的杂交的严格条件被设为低于热溶解温度(Tm)5℃。
但是，非常严格的条件是杂交反应和/或洗涤步骤在低于热溶解温度(Tm)1、2、3、或者4℃的条件下进行；温和的严格条件是杂交反应和/或洗涤步骤在低于Tm值6、7、8、9或者10℃条件下进行。低的严格条件是杂交反应和/或洗涤步骤在低于Tm值11、12、13、14、15、或者20℃下进行。使用上述方程，杂交反应以及洗涤溶液的组分，还有设定的T值，本领域的普通技术员能够理解本发明对杂交反应和/或洗涤溶液严格度变化的描述。如果需要的错配程度使得T值小于45℃(水溶液)或者32℃(甲酰胺溶液)，则优选提高SSC浓度使得杂交可以在更高温度下进行。更多有关核酸杂交的介绍请参见Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I Chapter 2“Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Probe Assays，”Elsevier，New York(1993)，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。通常情况下，在特定的离子强度和pH条件下，高严格度的杂交和洗涤条件被设为低于特定序列Tm值5℃。
高严格度洗涤条件的一个实例是，0.15M NaCl条件下72℃洗涤15分钟。严格洗涤条件的一个实例是，0.2X SSC条件下65℃洗涤15分钟(参见，Sambrook书中对SSC缓冲液的描述)。通常，在进行高严格度洗涤之前先使用低严格度洗涤条件洗涤，以去除背景探针信号。对于像超过100个核苷酸长度的DNA双链的中等严格度洗涤条件的实例是，1X SSC条件下45℃洗涤15分钟。对于例如超过100个核苷酸长度的双链的低严格度洗涤条件的实例是，4-6X SSC条件下40℃洗涤15分钟。对于短探针(例如，大约10至50个核苷酸长度)，严格条件通常是盐浓度小于大约1.5M，更优选钠离子浓度(或者其它盐离子)大约0.01至1.0M，pH在7.0至8.3之间，温度通常是至少为大约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸长度)温度则至少为大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂来实现，例如加入甲酰胺。通常情况下，特定的杂交分析中探针信号与非特异性探针信号的信噪比为2X(或者更高)即说明这是特异性杂交。如果核酸分子所编码的蛋白是基本一致，在严格条件下不发生相互杂交的核酸分子仍然有可能具有基本一致性。这种情况在核酸使用了遗传密码允许条件下的大量的简并密码子的时候会发生。
非常严格的条件通常选用与特定探针的Tm值相同的温度。对于在滤膜上进行的Southern或者Northern blot试验，含有超过100个互补碱基的互补核酸分子的严格杂交条件的实例是使用50％的甲酰胺，例如在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS、37℃下杂交，在0.1X SSC和60-65℃下洗涤。典型的低严格条件包括，在30至35％甲酰胺缓冲溶液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)37℃下杂交，并在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)在50至55℃下洗涤。典型的温和的严格条件包括，在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS、37℃下杂交，在0.5X至1X SSC、55至60℃条件下洗涤。
术语“多肽”，“肽”，“蛋白质”在本发明中可相互替换使用，它们都是指任意长度的氨基酸的聚合物。这样的聚合物可以是线性的或者是支化的，还可以含有修饰的氨基酸，其间也可以插入非氨基酸。该术语也包括被修饰的氨基酸聚合物，例如，形成二硫键、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任意其它的操作，例如与标记物偶联。在本发明中术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D或者L型旋光异构体，氨基酸类似物以及模拟肽。
在本发明中，术语“表达”是指多聚核苷酸转录形成mRNA的过程和/或转录的mRNA(也称为转录体)进一步被翻译成肽、多肽或者蛋白质的过程。该转录体以及其编码的多肽统称为“基因产物”。
在本发明中，术语“连接”是指将DNA分子通过共价键相连接的过程。例如，DNA连接包括在一个核苷酸的3’羟基与另一个核苷酸的5’磷酸基团之间形成磷酸二酯键。连接反应优选在4-37℃以及连接酶存在的条件下进行。合适的连接酶包括，极端嗜热菌连接酶、嗜热水生菌连接酶、大肠杆菌连接酶、T4连接酶以及嗜热菌连接酶。
术语“光化学反应”是指任何由吸收电磁辐射的量子能量形成激活态而引起的化学反应。“光反应(photoreactive)”是指参与光化学反应的事物性能。例如，可以形成偶联的光反应交联物，其中光反应试剂通过连接基团进行偶联。光反应氨基酸类似物包括，亮氨酸和甲硫氨酸的双吖丙啶(diazirine)类似物。L-光-亮氨酸和L-光-甲硫氨酸，是天然存在的L-亮氨酸和L-甲硫氨酸的类似物，在UV光照射下能够发生交联反应。在本发明中“光响应”和“光反应”可以相互替换。
术语“光交联”是指在适当波长的光的照射下一个聚合物链和另一个聚合物链之间形成化学键的过程。例如，两个偶联了光反应基团的核酸聚合物可以通过在光反应基团间形成的共价键来发生共价光交联。
术语“光引发剂”通常是指，在适当波长的光照射下形成自由基的试剂。例如CIBA的艳佳固(Igracure)是光照射下引发自由基聚合反应的光引发剂。可以作为光引发剂的化合物类型的非限定性实例包括但不限于，芳香族羰基化合物(例如，安息香衍生物、benziketals，苯乙酮衍生物、羟烷基苯基酮)和芳香酮类化合物(例如二苯甲酮和硫杂蒽酮)。光引发剂的非限定性实例包括，Lamberti spa的a-羟基环己基苯基酮(esacure)、二苯甲酮、二甲氧基苯基苯乙酮、2，2-二甲氧基、2-苯基乙酮、2，2-二乙氧基苯乙酮、1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙基-1-酮、乙曙红、伊红Y、荧光素、2，2-二甲氧基、2-苯基苯乙酮、2-甲基、2-苯基苯乙酮、I2959、樟脑醌、二碘曙红、亚甲基蓝、四碘荧光素、Phloxime、硫堇、核黄素、以及甲基绿。其它光引发剂已经记载在美国专利第3,715,293号和第3,801,329号中。还有其它的光引发剂包括，1-(4-氟苯基)-2-甲基-2-吗啉代-1-丙酮、1，7-二(9-吖啶基)庚烷、1-氯-4-丙氧基硫杂蒽酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2，2-二乙氧基苯乙酮、2，3，4，4′-四羟基二苯甲酮、2，3，4-三羟基二苯甲酮、2，4，6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化磷、2，4，6-三甲基二苯甲酮、2/4-二乙基噻吨酮、2/4-异丙基噻吨酮、2-苄基-2-二甲基氨基-1-[(4-(4-吗啉基)苯基)]-1-丁酮、2-氯噻吨酮、苯甲酸二甲基氨基乙酯、对二甲氨基苯甲酸异辛酯、2-羟基-2-甲基-苯基-1-丙酮、2-羟基-4′-羟乙氧基-2-甲基苯丙酮、2-异丙基噻吨酮、2-甲基二苯甲酮、2-甲基-1-[4-(甲基硫代)苯基]-2-(4-吗啉基)-1-丙酮、4-苯甲酰基-4′-甲基-二苯硫醚、4，4’-二氟二苯甲酮、4，4’-二甲氧基二苯甲酮、4-氯二苯甲酮、4-甲基苯乙酮、4-甲基二苯甲酮、4-苯基二苯甲酮、苯偶酰二甲基缩酮、二苯甲酮、二苯酮腙、4，4′-二甲苯基碘六氟磷酸盐、癸二酸二甲酯、二苯基碘六氟磷酸盐、2，4，6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯、4-二甲氨基苯甲酸乙酯、邻苯甲酰苯甲酸甲酯、苯甲酰甲酸甲酯、4，4′-双(二乙胺基)二苯甲酮、三溴甲基苯砜、酰基氧化膦(APO)和双酰基氧化膦(BAPO)、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮、2，2-二甲氧基-1，2-二苯乙酮、羟基环己基苯基甲酮、苯甲酰甲酸甲酯、氧基-苯基-乙酸2-[2-酮-2苯基-乙酰氧基-乙氧基]-乙基酯、氧基-苯基-乙酸2-[2-羟基-乙氧基]-乙基酯、α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮、2-苄基-2-二甲基氨基-1-(4-吗啉苯基)丁酮、(2，4，6-三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦、氧化膦、双2，6-二氟-3-吡咯苯基二茂钛、4-异丁基苯基-4′-甲基苯基碘六氟磷酸盐、二(2，6-二甲氧基苯甲酰)-2，4，4-三甲基苯基氧化膦。光引发剂也包括这些化合物的相关化合物和它们的任意衍生物。
本领域中有许多用于蛋白质分析的技术。这些技术包括但不限定于、放射性免疫检测、ELISA(酶联免疫放射检测)、“sandwich”免疫检测、免疫放射性检测、原位免疫检测(使用例如，胶体金、酶或者放射性同位素标签)、western blot分析、免疫沉淀检测、免疫荧光检测、以及SDS-PAGE。
术语“患者”，“个体”或者“病人”在本发明中可以替换使用，它们都是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括但不限于鼠类、猴子、人、畜牧动物、体育竞技动物、以及宠物。也包括组织和细胞，以及从一生物体获得的体内的或体外培养的子代。
在本发明的多个实施方式中，核酸类的基质可以具有纳米颗粒、纳米球、纳米壳、胶束、核壳、多核壳、多层膜、纳米凝胶、微粒、微球、微凝胶、大粒凝胶、纳米尺寸、大尺寸、宏观的(macroscopic)、块状的、支化的、超支化的、杂合的、树状的、梳状的、刷状的、接枝的、囊状的、螺旋的、球状的、螺旋-螺旋的、螺旋-球状的、棒状的、膜状的、薄膜状的、包被的、自组装的、环型的、微导管型的、微通道、纳米通道、多孔的、无孔的、管状的、微管状的、纳米管状、半互穿网状的、交联的、或者高度网状的结构。
在特定的方面，核酸分子提供了形成三维基质或者支架结构的结构单元单体和/或交联物单体。本发明的基质可以由X型、Y型、T型、哑铃型核酸分子、或者它们的组合所组成。本发明中的一种或者多种基质在此可以单独称为或者合称为“生物材料”、“基质”、“树状物”、“类树状物”、“水凝胶”、“凝胶”或者“支架”，并包括它们的复数形式。核酸(例如，DNA)的各种型态在美国专利申请第10/877,697号和第60/756,453中均有详细记载，这两件申请在此通过引用方式全文并入到本申请中以作为参考。
此外，在一些实施方式中，基质可以形成具有任意需要的型态和/或尺寸的凝胶。在一个实施方式中，这样的凝胶完全由支化DNA形成。在其它的实施方式中，该凝胶由线性核酸和支化核酸形成。在另一些实施方式中，线性或支化核酸可以是DNA、RNA、PNA、TNA、LNA或者它们的任意组合。例如，凝胶可以含有形成支持基质的结构单元的支化DNA，以及编码目标蛋白质的相连的线性DNA。在另一实施方式中，水凝胶可以完全由RNA结构单元和蛋白质编码序列构成。在另一实施方式中，凝胶是水凝胶。这种水凝胶当水合的时候大部分由水分子构成，因此并不昂贵，例如平均一块水凝胶成本不会超过5美元。此外，可以通过调节支化核酸结构单元的类型和浓度而容易精细地调控这些水凝胶的化学和物理性质，从而使水凝胶具有适用于特定应用的特殊物理/化学性质。
核酸具有不同的降解速率，从而可以加以修饰和利用。此外，特定的降解产物可能是目标产物(例如，具有特定序列的核酸)。可以对降解的位点或者时间进行修饰从而获得这些产物。所选用的核酸类型以及多种类型的核酸组合也会对核酸降解产生影响。例如，RNA通常比DNA降解的更快。不同的DNA结构通常具有不同的降解速率。这也受到所用核酸的来源组织的影响。各种疾病状态或者损伤也会影响到降解速率。在一些实施方式中，降解速率可以通过选用单种型态的核酸或者不同型态核酸(例如，X、Y、T、哑铃型)的组合来加以控制。
在另一些实施方式中，纯化的核酸可以通过与其它核酸或者其它化合物相连接以降低降解度。连接可以通过多种方式实现，包括，氢键、离子键和共价键、π-π键、极化键、范德华力。在本发明中，术语“连接“和”交联“可以替换使用。在特定的生物材料中可以存在多种类型的交联。例如，在生物材料中同时使用细胞中容易降解的交联和不易降解的交联类型，这将使生物材料具有两种相态，一种是当容易降解的交联被破坏时的相态，一种是当不易降解的交联或者核酸本身被降解时的相态。在一些实施方式中，交联是通过UV辐射、酯化作用、水解、嵌入剂、致癌剂、甲醛、福尔马林、或者硅化合物来实现。这样的方法已经记载在美国专利申请第11/464,181号中，其申请日为2006年8月11日，名称为“Nucleic Acid-Based Matrixes”。连接的实例包括但不限于，例如美国专利第5,214,134号中所记载的使用硅氧烷桥来实现。本发明进一步提供了核酸分子的光交联。在一些实施方式中，光反应基团在足以发生光交联的光照射下与核酸分子发生偶联。
交联反应可以发生在双链核酸分子的两条链之间，或者两条双链核酸分子之间。交联也可以发生在两条单链之间。双链和单链之间的交联反应也可以发生，一条链的不同区域之间也可以发生交联。提高交联程度通常能够降低核酸分子的降解速率。连接物，例如小的有机分子(酯类、胺类)或者无机分子(硅，硅烷)，以及它们形成的微粒或者纳米颗粒，可以被用来将共聚物连接到核酸分子上。可以使用一种或多种此处记载的方法来连接或交联本发明中的任意不同形态的核酸。因此，X型、Y型、T型、哑铃型或者它们的任意组合均可以互相连接，也可以与其它的化学基团或者多聚化合物相连接。
此外，在特定方面，核酸可以与生物活性剂连接，包括药物、可筛选标记、可检测信号、其它的治疗剂、肽例如信号肽或细胞靶向肽、核酸序列、蛋白质(包括抗体)、质粒、病毒、病毒载体、小分子、无机化合物、金属或它们的任意衍生物。此外，还可以向核酸聚合物中添加任意的无机或者有机分子以产生特定的生物学效应，包括氨基酸、硅化物、细胞因子例如白介素、生物制品和药物。核酸提供了各种分子连接位点从而促使形成共价键、离子键和氢键的连接、以及范德华力的连接，或者其它形式的连接。在一些实施方式中，这些分子也可以通过光交联方式连接到核酸分子上。
在一实施方式中，核酸类的基质通过将纳米颗粒或者微粒交联到基质中的核酸上的方式来得到强化。在一实施方式中，核酸是支化DNA分子。在一些实施方式中，纳米颗粒或者微粒是金、银、铜、铁、炭黑、4-膦酰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧稳定自由基、二氧化钛以及磁性材料。
此外，核酸可以通过甲基化、乙基化、烷基化或者其它对骨架进行修饰的方式来影响其降解速率。一般来说，甲基化、半甲基化、乙基化或者烷基化的核酸降解速率会更慢。其它影响降解速率的骨架修饰包括，使用如美国专利第5,677,437号中所记载的杂原子寡核苷酸连接方式来进行修饰。此外，修饰可以用来阻止核酸在特定组织或者器官中被转录或者翻译。此外，可以通过加帽来阻止核酸降解。这样的帽子结构通常位于或者接近于核酸链的末端。加帽步骤的实例已经记载在美国专利第5,245,022号和第5,567,810号中。
在某些核酸是DNA分子的实施方式中，基质中DNA的量可以通过DNA特异性标签来进行测量。适用于该应用的DNA结合染料包括，SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙啶、Hoechste，SYBR金、溴化乙锭、吖啶类染料、原黄素、吖啶橙、啶黄素、荧光香豆素、椭圆玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、胡米溴铵、普卡霉素、钌多吡啶配合物、蒽霉素等等。
另一方面，也可以在扩增反应中使用其它荧光标签以便于检测和定量扩增产物，例如序列特异的探针。基于探针的定量扩增依赖于对目标扩增产物所进行的序列特异性检测。该方法使用荧光标记的靶点特异的探针(例如，
Figure BPA00001342885900241
探针)来提高检测的特异性和敏感性。在本领域中，进行基于探针的定量扩增的方法非常成熟，具体可参见美国专利第5,210,015号。
在本发明的其它一些方面，基质还包含可生物降解的或者不可生物降解的共聚物。优选可生物降解且对哺乳动物无毒性的共聚物。但在某些情况下，可以使用只有部分聚合物(例如核酸部分)降解而剩下为不可生物降解的框架的聚合物。可作为共聚物材料的例子包括但不限于，多聚氨基酸包括PGA、PLA、PLGA和聚脯氨酸，多糖例如纤维素、几丁质和葡聚糖，蛋白质例如纤维蛋白和酪蛋白，VICRYL.RTM.，MAXON.RTM.，PDS，聚(ε-己内酯)，聚酣，聚三亚甲级碳酸酯，聚β羟基丁酸酯，聚(DTH亚胺碳酸酯)，聚(双酚A亚胺碳酸酯)，聚原酸酯，聚腈基丙烯酸酯，聚N-异丙基丙烯酰胺，聚(N-烷基丙烯酰胺)，聚(N-正丙基丙烯酰胺)，聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)，聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷，聚二芳基乙烯(DTEC)，葡聚糖-聚乳酸，弹力蛋白样多肽，聚酯，聚乳酸，聚(L-乳酸)，聚(D，L-乳酸)，聚乙丙交酯，生物素标记的乙二醇乳酸二嵌段共聚物，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚ε己内酯，聚酸酐，聚(双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)，聚原酸酯，聚磷酸酯，聚磷腈，聚苯乙烯，聚氨酯，聚氨基酸，和透明质酸，其衍生物，脂肪族聚酯，聚氨基酸，聚醚酯，聚亚烷基草酸酯，聚酰胺，聚亚胺碳酸酯，聚原酸酯，聚氧杂酯，聚酰胺酯，含氨基的聚氧杂酯，聚酸酐，聚偶磷氮基烯，含有氨基和/或酰胺基的聚草酰胺和聚氧杂酯，以HOOC-C6H4-O(CH2)m-O-C6H4-COOH形式的二元酸形成的聚酸酐，其中m是2到8的整数，其含有多至12个碳原子的脂肪类α-ω二元酸聚合物，以及所述化合物的任意混合物。
脂肪族聚酯包括但不限于，丙交酯(包括乳酸，d-，1-以及内消丙交酯)形成的均聚物和共聚物，乙交酯(包括乙醇酸)，ε己内酯，对二氧杂环己酮(1，4-二氧六环-2-酮)，三亚甲基碳酸酯(1，3-二氧杂环己烷-2-酮)，三亚甲基碳酸酯的烷基衍生物，δ-戊内酯，β-丁内酯，γ-丁内酯，δ-癸内酯，γ-癸内酯，羟基丁酸(重复单元)，羟基戊酸(重复单元)，1，4-二氧杂环庚烷(包括其二聚体1，5，8，12-四氧杂环十四烷7，14-二酮)，1，5-二氧杂环庚烷，6，6二甲基-1，4-二氧杂环庚烷，2，5-吗啉二酮，新戊内酯，α，α二乙基丙内酯，碳酸乙烯酯，草酸酯，乙丙交酯，3，3-二乙基-1，4-二氧杂环-2，5-辛二酮，6，8-二氧杂环辛烷或者任意能够连接本法明核酸的聚合物材料。
其它可连接到本发明核酸基质上的共聚物的实例包括多肽序列。因此，一些实施方式中，核酸和共聚物如肽序列被用于形成核酸-肽基质。这样的肽的实例包括但不限于，美国专利第5,670,483号和第5,955,343号以及美国专利申请第09/778,200号中记载的序列，所有这些都通过引用方式全文并入到本申请中以作为参考。这些肽链由交替的亲水性和疏水性氨基酸构成，这些氨基酸能够在电解液存在下通过自组装方式形成超稳定的宏观β片层结构，所述电解液例如是单价阳离子溶液。
多肽链具有互补和结构相容性。肽链中的侧链在结构上分为两个面，一个具有带电离子侧链的极面，以及另一个带有丙氨酸或者其它疏水基团的非极面。这些带电离子侧链间能够通过正电和负电氨基酸残基相互吸引形成互补离子对而自互补。这些肽链因此称为离子自互补肽，或者I型自组装肽。如果含离子残基以一个正电一个负电残基交替的形式分布(-+-+-+-+)，这些肽链称为“模量I”；如果离子残基以两个正电两个负电残基交替的形式分布(--++--++)，这些肽链称为“模量II”。在一些实施方式中，本发明所用的多肽序列至少含有12个或者16个氨基酸残基。D型和L型的氨基酸均可用于构建肽链。它们可能在同一条链中混合使用，或者制备的多肽组合物同时含有仅由D型氨基酸构成的肽链和仅由L型氨基酸构成的肽链。本发明所用的肽链序列的实例包括表1中所列的序列。因此，在各种实施方式中，核酸基质或者核酸凝胶可以进一步包含一种或者多种本发明中所述的多肽以形成例如DNA-肽基质。这样的多肽可以与X型、Y型、T型、哑铃型或者树状型态的核酸结合，从而为合成所需型态及内部结构的基质提供了另一层面上的控制手段。表1
Figure BPA00001342885900251
N/A表明不适用*这些肽在含有NaCl的溶液中可以形成β片层结构，但并未发现它们可以自组装形成宏观尺寸的支架。
其它的自组装肽链可以通过改变任意自组装肽链中的一个或者多个氨基酸残基生成。此外，在肽支架中插入特异的细胞识别配体，如RGD或者RAD可以促进包封细胞的增殖。这些配体在体内时也可以吸引支架外的细胞进入到支架中，从而侵入支架或者与包封细胞相互作用。为了提高生成的支架的力学强度，可以参入半胱氨酸到肽链中以形成二硫键，或者掺入含有芳香环的残基并通过UV光照射进行交联。这些支架在体内的半衰期可以通过在支架中掺入蛋白酶裂解位点加以调节，从而使支架能够被酶降解。上述的任意变化的组合也可以用于生成同样的肽支架。
可以形成各种硬度和弹性的自组装纳米尺度结构。不受任何理论的束缚，低弹性对于使细胞迁移到支架中以及在进入支架后与支架中的其它成分相互作用这一点而言可能是个重要的因素。此处所述的肽支架通常具有低弹性的模量，用标准的锥板式流变仪计算其在1-10kPa范围内。这样的低值使得支架在细胞收缩的时候可以发生形变，这样的形变提供了细胞间作用的途径。此外，这样的模量可以促使支架向其中迁移的细胞传递生理学压力，刺激细胞形成类似于天然状态下的组织微结构而不是疤痕组织。支架的硬度可以通过各种方法来加以控制，包括改变肽序列、改变肽的浓度以及改变肽的长度。也可以使用其它提高硬度的方法，例如在肽链的氨基末端或者羧基末端上连接生物素分子，或者在氨基和羧基末端之间连接生物素分子使其可以被进一步交联。
可以被交联的肽链可以使用标准的f-moc化学合成，并用高压液相色谱的方法进行纯化(表2)。可以通过加入本发明中所描述的电解质引发肽支架的形成。可以通过UV照射法来交联含有芳香疏水残基的侧链。交联的程度可以通过预设的UV光照射时间和预设的肽链浓度来加以精确控制。交联的程度可以通过标准的光散射、凝胶过滤或者扫描电镜方法来进行检测。此外，交联的程度也可以通过HPLC或者质谱分析蛋白酶消化后的支架来进行检测，所述蛋白酶例如是金属基质蛋白酶。支架的材料强度可以在交联之前进行检测，也可以在交联之后进行检测。表2
Figure BPA00001342885900271
可以在肽的氨基或者羧基末端，或者氨基和羧基末端之间可选地加入软骨蛋白聚糖(Aggrecan)处理位点，例如表3中下划线所示的处理位点。同样的，也可以以同样方式引入其它基质的金属蛋白酶(MMP)裂解位点，例如胶原蛋白酶裂解位点。可以由这些肽链单独来组成肽支架或者由这些肽链与可以被交联的肽一起来形成肽支架，这些肽支架可以使用各种蛋白酶和肽浓度下处理各种时间长度。支架的降解速率可以通过HPLC、质谱仪或者NMR分析不同时间段时上清液中消化后的肽链来测定。另外，如果使用了放射性标记的肽链来形成支架，则释放到上清液中的放射性材料的数量可以通过使用闪烁计数的方法来进行测定。在一些实施方式中，自组装肽形成的β片层结构的降解速率足够快，从而不需要在肽链中掺入裂解位点。表3
Figure BPA00001342885900281
如果需要，肽支架可以形成各种预先确定的型态或者尺寸。为了生成需要的几何型态或者尺寸的支架，可以将含有多肽的水溶液加入到预成型的模具中，然后再向其加入此处所述的电解质以诱导肽链自组装形成支架。所生成的宏观尺寸的肽支架的几何型态以及尺寸，可以通过控制所用肽溶液的浓度、肽溶液的量、以及用于诱导支架自组装的电解质溶液浓度以及浇筑模具的尺寸来进行控制。
如有需要，可以使用各种生物物理以及光学仪器来对肽支架的性质进行测定，例如圆二色谱(CD)、动态光散射、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、原子力显微镜(ATM)、扫描电镜(SEM)以及透射电镜(TEM)。例如，可以使用生物物理学方法来检测肽支架中形成β片层二级结构的程度。此外，可以使用扫描电镜和透射电镜的定量图像分析来检测基质的纤丝和孔尺寸、纤维直径、长度、弹性以及体积分数。还可以使用一些标准的机械测试技术来测量支架的膨胀范围、pH和电解质溶液浓度对支架形成的影响、在各种条件下的水合程度、以及拉伸强度。
核酸聚合物或者共聚物的类型将会影响到最终形成的聚合生物材料的化学性质和物理结构。由核酸聚合物单独形成的基质或者由核酸聚合物和共聚物形成的基质可用于多种用途，包括用于实现此处记载的生物活性剂按照时间可控方式来释放(例如，药物输运)，包封和/或细胞培养，组织工程应用，组织工程应用例如包括为了提高组织的拉伸强度、作为组织形成的模板、指导组织形成、刺激神经生长、促进组织中血管生成、作为生物可降解的粘合剂、作为装置或植入物的包被、或者提高组织或者身体部分的机能。此外，由核酸聚合物单独形成的基质、或者由核酸聚合物和核酸共聚物一起形成的基质，也可以用在非细胞的蛋白质合成系统。
因此，一方面，基质由支化结构单元的核酸分子构成，所述核酸分子至少与一种本领域公知的聚合物或者本发明所记载的共聚物相连接，并且所述基质还含有编码一种或者多种目标蛋白的线性核酸分子用以在基质中表达目标蛋白。
可以通过多种方式来形成含有核酸以及共聚物的基质，这具体取决于所用共聚物的类型以及最终形成的基质的期望性质。共聚物与核酸分子可以通过共价键、离子键或者氢键、或者范德华力来连接。可以使用连接物来将共聚物连接到核酸上，所述连接物例如，小有机分子(酯类、胺类)或者无机分子(硅化物，硅氧烷)，包括它们形成的微粒或者纳米颗粒。最终形成的生物材料可以包含核酸和共聚物分子以各种形式的组合，包括，基本上是末端对末端、末端对侧面、侧面对侧面的形式，或者以上形式的任意组合，只要该组合含有一种或者多种连接以确保这样的结合。共聚物也可以包含一般的形式、或者嵌段共聚物和接枝共聚物。此外，对共聚物进行修饰可以影响到核酸聚合物的化学和生物学性质，例如，通过修饰可以影响聚合物或者共聚物的亲水性或者疏水性。
核酸类基质相对于蛋白质水凝胶和聚合水凝胶具有很多重要的优点。首先，因为可以使用各种各样的具有不同型态和不同长度的支化核酸结构单元来构建基质，从而可以精确地设计和容易地生产出各种具有独特性质的核酸水凝胶。不同型态和/或不同长度的核酸单体可以使最终形成的基质具有不同的孔尺寸，从而可以控制药物释放的速率，或者提供不同的三维支架，用于细胞培养或者组织工程。此外，由不同型态/长度核酸分子所构建的基质可以被用来作为支架用以改进蛋白质生产，该基质可以为蛋白质表达所必须的大分子(如，聚合酶)以及大量的编码一种或者多种蛋白的核酸序列提供附着点。
因此，在多个实施方式中，通过选用Y型、T型、X型DNA，或者上述的一种或者多种型态DNA的组合可以形成具有不同释放速率的水凝胶。
第二，由于生产核酸基质的条件非常温和(例如室温条件和中性pH值条件)，在多个实施方式中，该基质为许多生物技术或者生物医学应用提供了独特的工具。例如，因为很多生物活性剂例如药物和/或蛋白质或细胞(例如，哺乳动物细胞)可以溶解在或者分散在核酸水溶液中，所以可以对这样的生物活性剂例如药物和活细胞进行有效地原位包封，从而无需再次将药物加载到凝胶中去，这也可以避免变性条件的出现，例如不利于活细胞包封的变性条件。
因为在凝胶形成之前，生物活性剂和细胞都存在于生理条件相容的水相环境中，所以包封这类试剂的效率可以接近100％。此外，核酸结构单元还可以进一步与其它化学物质进行反应从而对核酸基质、生物降解过程和散布过程进行跟踪监测，所述化学物质例如是核酸特异的试剂，如荧光染料。
此外，核酸基质具有生物可降解性和非免疫原性(例如DNA链为体外全新合成，不存在免疫刺激的细菌CpG基序(Krieg等人，Nature 374，546(1995)；D.Schwartz等人，J Clin Invest 100，68(1997)))，这使得核酸水凝胶可以用作控制药物的理想载体。因为存在这些因素，所以核酸基质与许多现有的生物材料应用平台相比具有更多的优势。进一步来说，就如上文所述，因为温和的凝胶形成条件、原位包封以及内在的生物相容性和生物可降解这些特性，所以核酸凝胶也可以用来包封活细胞，从而可以用作3D细胞培养或者组织工程的基质。此外，这样的基质也可以作为细胞/组织移植的载体，将生物活性剂和/或细胞以有效浓度输运到体内指定的靶位点。
一方面，本发明提供了使用光交联生成核酸水凝胶的方法。该方法可用于合成本发明所述的任意类型的水凝胶，例如使用X型、Y型、T型、哑铃型结构单元、类树状型态等等。该方法包括，提供合适的核酸分子混合物以形成一种或者多种期望的侧链结构，和光交联核酸分子。该方法可以快速合成水凝胶，例如光交联反应可以在10分钟或者更短时间内完成。在一些实施方式中，光交联反应在1分钟以内、2分钟以内、3分钟以内、4分钟以内、5分钟以内、6分钟以内、7分钟以内、8分钟以内、9分钟以内、10分钟以内、11分钟以内、12分钟以内、15分钟以内、20分钟以内、25分钟以内、30分钟以内、35分钟以内、40分钟以内、45分钟以内、50分钟以内、55分钟以内或者1小时以内完成。如有需要，光交联反应可以更慢的方式进行，例如超过1分钟、超过2分钟、超过3分钟、超过4分钟、超过5分钟、超过6分钟、超过7分钟、超过8分钟、超过9分钟、超过10分钟、超过11分钟、超过12分钟、超过15分钟、超过20分钟、超过25分钟、超过30分钟、超过35分钟、超过40分钟、超过45分钟、超过50分钟、超过55分钟、或者超过1小时时间完成。如有需要，该反应时间可以超过1小时，例如，90分钟、2小时、过夜、或者更长。
在一些实施方式中，核酸结构单元首先进行了扩增，例如使用PCR。核酸在光交联步骤之前也可以先进行杂交。在一些实施方式中，杂交的分子在进行光交联之前至少进行了部分纯化。纯化技术的非限定实例包括，通过核酸尺寸分离核酸，例如色谱、电泳或者凝胶过滤。色谱技术包括高效液相色谱(HPLC)或者流动压力色谱(flow pressure chromatography，FPLC)。
为了促进光交联，核酸分子可以与光反应基团偶联。在一些实施方式中，进行光交联之前，至少部分核酸分子偶联了光反应基团。通常使用的光引发聚合类型包括，通过光裂解(例如C-C，C-Cl，C-O或者C-S键断裂)的自由基光聚合、通过夺氢反应进行的自由基光聚合、阳离子光聚合、缩聚反应(氨基和二丙烯酸酯)、丙烯酸酯系统(丙烯酸酯+丙烯酸酯)、电荷传递、基于巯基/烯基体系的光聚合(-SH+丙烯酸酯)。光反应基团的非限定性实例包括，含乙烯基的基团(例如，丙烯酸酯)、N-羟基丁二酰亚胺、氨基基团、羧基基团、以及含有巯基末端的基团。这样的基团可以包括，伯胺修饰基团、仲胺修饰基团、叔胺修饰基团等。其它这样的基团为本领域的技术人员所公知。
光反应基团(例如，氨基、巯基、羧基、丙烯酸酯等)还可以与被修饰的核酸相连接。可进行光交联的核酸分子可以在其5’末端、3’末端、分子内部、或者上述位点的组合具有可以结合光反应基团的位点。不同的光反应基团可以附着到不同的前述位点上，从而使形成的凝胶具有不同的性质，例如强度、构型、或者与其它分子的结合能力。例如，核酸结构单元可以在一个末端或者两个末端进行光交联，而另一个分子可以在其它位点进行光交联，例如在核酸结构单元的内部位点进行光交联。其它分子的非限定性实例包括，聚合物、生物相容性试剂、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、碳水化合物、核酸适体、抗体、抗原、细胞生长因子、DNA结合剂、可检测标签、可筛选标志物、生物素、药学试剂、药物、小分子、治疗性药剂、受体分子、配体、核酸分子、或者底物、或者以上可能的组合。分子间可以通过多种连接类型的组合进行光交联，例如丙烯酸酯-聚合物+氨基-DNA、N-羟基丁二酰亚胺-聚合物+氨基-DNA、丙烯酸酯-聚合物+巯基-DNA、巯基-聚合物+丙烯酸酯-DNA、氨基-聚合物+巯基-DNA、巯基-聚合物+氨基-DNA等等。
可以通过将杂交后的核酸曝露在适宜的电磁辐射源下照射的方式来进行光交联，例如，紫外(UV)或者可见光源、近红外、红外和微波光源。在一些实施方式中用到了伽玛射线、X射线、无线电波。发光的形式可以使用各种灯泡、激光或者纤维。在一些实施方式中使用的是发光二极管(LED)。可以使用不同的波长。在一些实施方式中，不同的照射源被用以形成一种水凝胶基质。在一个非限定性实例中，一个光源被用来光交联核酸支架，同时另一个光源被用来将一种或多种化合物光交联到核酸上。任何可以用来生成本法明水凝胶的光反应基团和光源的组合均在本发明的范围内。
在一些实施方式中，反应在引发剂存在下进行，例如，可以在适宜波长的光照射下形成自由基的光引发剂。在一些实施方式中优选CIBA的Igracure作为光引发剂，因为它已经通过了FDA的认证。其它的光引发剂在本发明中均有记载。光引发剂并不是必需的，这需要根据结构单元和反应条件的设计来加以确定。
图1示出了使用可光交联的DNA结构单元合成水凝胶的示意图。图2概括了合成方法的两个相关实施例。在一个实施方式中(图2最右边)，单链DNA(ssDNA)与光反应基团偶联，然后进行杂交形成DNA结构单元。在另一个实施方式中(图2最左边)，在连接光响应基团之前首先构建杂交的DNA结构单元，然后将光反应基团连接到结构单元上。在这两个实施方式中，在进行交联反应之前，都通过适当的方法将未连接上光反应基团的DNA结构单元移除掉，例如使用尺寸分离技术，如HPLC。
可进行光交联的结构单元可以被修饰，例如被生物相容性的聚乙二醇(PEG)链修饰。纯化的DNA-PEG偶联物可以通过HPLC片段收集器或类似物将其从合成的样品中分离出来。
在一些实施方式中，本发明所述方法被用于包被和/或形成底物的表面。这样的底物包括块状玻璃、PDMS以及其它材料。类似的，所述方法可用于包被各种类型的纳米颗粒和微粒的表面，这些纳米颗粒和微粒包括金、银、铜、铁、炭黑、4-膦酰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧稳定自由基、二氧化钛。在一些实施方式中，颗粒是磁性颗粒。根据需要的设计和性质，可以调节包被的凝胶的各种属性，例如，尺寸、厚度、形状。
本发明的方法还可以使用其它非光交联的方式来连接分子。例如，我们此前描述过的生成水凝胶的方法，其中核酸结构单元通过酶技术相连，例如通过酶连接。这样的方法已经记载在美国专利申请第11/464,184中，其申请日为2006年8月11日，名称为”NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES FOR PROTEIN PRODUCTION”；专利申请第11/464,181号中，其申请日为2006年8月11日，名称为”NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES”。在一些实施方式中，本发明的方法使用酶连接或者化学连接与光交联的联合反应来生成水凝胶。在一个非限定性的实例中，核酸水凝胶结构单元通过光交联来连接，而一种或者多种其它化合物则通过酶技术或者化学技术连接到结构单元上。本发明披露了许多适用的其它化合物，例如非结构单元核酸，如具有编码区的核酸。在另一个非限定性的实例中，核酸水凝胶结构单元相互连接在一起，而一种或者多种其它化合物则通过光交联连接。在另一实例中，一些结构单元核酸通过酶反应来连接，而其它的则进行光交联。在所有的这些实施方式中，光交联和酶连接/化学连接可以同时进行或者依次进行，或者以上方式的任意组合。
在一些实施方式中，核酸水凝胶和其它含有天然的或者合成的生物相容性材料的凝胶材料相连接。非限定性实例包括，聚乙二醇(PEG)水凝胶基质、N-异丙基丙烯酰胺水凝胶基质、壳聚糖水凝胶基质或以上任意的衍生物。这样的连接可以改变水凝胶的性质。替代的水凝胶基质可以来源于天然的材料，如壳聚糖、甲基纤维素、海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、纤维蛋白、几丁质、胶原蛋白、葡聚糖或者以上任意的衍生物。替代的水凝胶材料也可以含有合成材料，包括但不限于，羟乙基甲基丙烯酸酯、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酸酯、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-异丙基丙烯酰胺、醋酸乙烯酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、聚乙二醇丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯/二甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、富马酸二羟丙酯、或前述任意材料的衍生物。水凝胶材料也可以同时组合使用。例如天然的聚合物和合成的单体、天然聚合物和合成的单体、两种或者多种天然聚合物、两种或者多种合成的聚合物等。
根据应用的需要，本发明的水凝胶可以形成各种型态，例如微薄膜、微垫衬、微细纤维、纳米球或者微球。微米尺寸或者纳米尺寸的型态可以通过乳化、光蚀刻、微流体合成、微模塑、或者微电纺技术或者它们的组合方式形成。
不同型态的结构单元
本发明的一方面涉及包含核酸的基质，所述核酸包括X型、T型、Y型、哑铃型或者树状型态，该核酸分子可以用作新型的可设计的生物材料的结构单元。因此，核酸具有不同的型态，其中一种或者多种型态可以用作构建基质的单体或者连接物(例如，结构单元)。在一个实施方式中，支化核酸都是一种型态(X型、Y型、哑铃型或者T型)，这些核酸作为形成核酸水凝胶的单体或者连接物。在一些实施方式中，支化核酸分子通过杂交预先设计好的寡核苷酸互补序列的方式来制备。本发明提供了适用的支化核酸序列，但也可以使用任何含有适用序列的结构单元。在一些实施方式中，核酸是DNA、RNA、PNA、LNA或者TNA。在一些实施方式中，也可以使用一种或者多种这些核酸的组合来作为结构单元。在一些实施方式中，单体通过本发明中的光交联方法与其它单体交联。在另一些实施方式中，单体通过连接反应与其它单体连接。例如，单体之间可以使用核酸连接酶介导的连接反应来进行连接。在一些实施方式中，使用多种交联方法进行连接，例如同时使用光交联和连接反应。
核酸可以进行酶反应。在一些实施方式中，所述反应包括酶介导的反应，其中所述的一种或者多种酶是DNA聚合酶、RNA逆转录酶、末端转移酶、DNA连接酶、RNA连接酶、外切酶、核糖酶、内切酶、多聚核苷酸激酶、DNA甲基化酶或者DNA泛素化酶。此外，反应包括任何使用了一种或者多种可以缩短核酸或者延长核酸或者扩增核酸或者标记核酸的酶的反应，或者这些反应/酶的组合。
在本发明的一方面，基质包含不同型态的核酸分子，通过控制它们的比例可以决定产生的基质的几何型态、化学和物理性质。例如，基质可以含有一定比例的X型和Y型单体、X型和T型单体、X型和哑铃型单体、Y型和T型单体、Y型和哑铃型单体或者T型和哑铃型单体的核酸。在这样的实施方式中，每个单体可以是DNA、RNA、PNA、LNA、TNA或者它们的类似物。在一个实施方式中，基质由DNA组成。在另一实施方式中，基质由RNA和DNA组成。在另一实施方式中，基质由RNA组成。因此，一种或者多种基质可以完全由一种类型的核酸分子组成，或者由多种类型的核酸(例如DNA、RNA类型，等等)组成。
在一个实施方式中，生成的基质具有三维结构。在另一实施方式中，生成的基质可以发生凝胶化。在另一实施方式中，生成的基质是水凝胶。在本发明的另一方面，如本发明中所描述的，任意的一种或者多种本发明的基质可以与共聚物或者其它的化学基团相连接。此外，所述一种或者多种本发明基质的核酸分子可以是线性的、X型的、Y型的、T型的、哑铃型的、树状型的或者它们的任意组合。以下非限定性实例提供了，可以用在本发明所述的一种或者多种组合物或者方法中的核酸分子(例如结构单元)的一些特征。
X型
在本发明的一方面，本法明的基质全部或者至少部分是由X型的支化核酸组成。在一个实施方式中，X型核酸是DNA。在另一实施方式中，基质由X型DNA和/或RNA、或其类似物/衍生物组成。在另一实施方式中，基质由X型DNA以及线性DNA、RNA或者PNA组成。在一个优选的实施方式中，基质几乎全部由核酸组成。在另一实施方式中，X型核酸是RNA。
另一方面，基质由X型和线性核酸以及至少一种共聚物组成。在一个实施方式中，X型和线性核酸是DNA。在另一实施方式中，X型核酸是DNA，而线性核酸是DNA、RNA或者PNA。所述至少一种共聚物选自本领域中公知的那些共聚物，或者本发明前述记载的共聚物。在一个实施方式中，所述共聚物是多肽单体。
此外，本发明的某些方面涉及“强化的”X型核酸，通过将纳米颗粒连接到核酸上来强化核酸以产生更稳定和更具弹性的支架或者基质。在一个实施方式中，X型核酸是DNA。在另一实施方式中，X型核酸是RNA。在一些实施方式中，X型DNA连接到纳米颗粒或者微粒上。底物可以由任意适宜材料构成。例如，底物可以是金属底物，如贵金属或者过渡金属。这样的金属包括但不限于，金、银、钯、或者铂。所述底物也可以是半导体材料，例如硫化镉(CdS)、铯化镉(CdSe)、二氧化钛(TiO2)、氧化锌(ZnO)。在一些实施方式中，磁性材料被作为底物使用。适用于本发明的磁性材料包括钴、镍、铁、铁钴合金、磁铁(Fe3O4)。其它可预测的底物材料，如炭黑或者4-膦酰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧稳定自由基。
在一个实施方式中，通过退火工艺将4种不同的具有互补序列的寡核苷酸相互杂交以形成最终的X型DNA，所述4种寡核苷酸分别记为，X0a，X0b，X0c以及X0d(表5A)。多个所述的X型DNA可以进一步通过相同的或者不同的线性DNA相互连接进而形成独特的基质或者网状基质，所述线性DNA可以在序列和/或尺寸上不同。参见图3A-B。
在本发明的某些方面，将X型DNA的末端设计成可以进行酶反应的粘性末端。在一个实施方式中，酶反应是DNA连接酶介导的连接反应，该反应可以使两个或者多个单体发生共价相连。在另一个实施方式中，DNA连接酶是T4DNA连接酶。
一方面，用于构建基质的X型核酸可以构建出具有拉伸模量为大约0.4且拉伸强度为大约42％的基质。在一些实施方式中X型连接的DNA具有的拉伸模量为大约0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65或者0.7。在一些实施方式中，用于构建基质的X型DNA具有的拉伸强度(极限延伸)为大约35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或者50％，其中该百分比相对于其本身长度(延展长度)而言。
在一实施方式中，X型DNA分子可以设计和合成为X型DNA的每个臂都具有回文结构的互补粘性末端。
X型DNA分子可使用等量的4条寡核苷酸链混合合成。命名如下：X0a、X0b、X0c和X0d是4条形成X0核酸分子(X0)的相应单链寡核苷酸。类似的，X1a、X1b、X1c和X1d是4条形成X1核酸分子(X1)的相应单链寡核苷酸；Xna、Xnb、Xnc和Xnd是4条形成Xn核酸分子(Xn)的相应单链寡核苷酸。所述反应可以表示为：X0a+X0b+X0c+X0d→X0，X1a+X1b+X1c+X1d→X1，以及Xna+Xnb+Xnc+Xnd→Xn等等。参见图4和图5。
对于X型核酸分子，每条多聚核苷酸的区域2与其它三条多聚核苷酸中的一条多聚核苷酸的区域3互补。例如，参见表5A和5B中的序列：序列SEQID NO：56的区域2和序列SEQ ID NO：59的区域3互补，序列SEQ ID NO：57的区域2和序列SEQ ID NO：56的区域3互补，序列SEQ ID NO：58的区域2和序列SEQ ID NO：57的区域3互补，序列SEQ ID NO：59的区域2和序列SEQ ID NO：58的区域3互补。
在一个实施方式中，每个区域的长度可以进行变化。例如，在一些实施方式中，X型核酸分子的第二和/或第三区域，以及T型核酸分子的第二和/或第四区域的长度为约13个核苷酸。在一些实施方式中，这些区域的长度可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或者20个核苷酸长度。在一些实施方式中，这些区域可以大于20个核苷酸长度，例如可以是大约25、30、35、40、45、或者50个核苷酸长度。
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Figure BPA00001342885900371
Figure BPA00001342885900372
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因此，X型DNA可以相互光交联以形成DNA水凝胶。无论使用哪种类型的DNA结构单元(例如X型、Y型、哑铃型或者T型)形成的凝胶，都可以通过这种方法快速形成，例如，在几分钟内，如10分钟或更短。在一些实施方式中，所述凝胶形成时间小于1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10分钟。在一些实施方式中，也可以将线性核酸分子、Y型、T型、哑铃型或者树状型态的核酸分子掺入到X型核酸分子形成的基质或者凝胶结构中。因此，在一些实施方式中，基质由X型以及一种或者多种其它型态的核酸以需要的单体比例构成。参见图6A-B。
Y型
在另一方面，构成基质的核酸是如图7A和7B所示的Y型核酸。在一个实施方式中，Y型核酸是DNA。在另一实施方式中，基质含有Y型DNA和/或RNA，或者它们的类似物/衍生物。在另一实施方式中，基质由Y型DNA，和线性DNA或RNA构成。在一个实施方式中，基质完全由Y型核酸构成。在另一个实施方式中，基质含有需要的预先选定比例的Y型和X型核酸。
在一个实施方式中，树状物-线性DNA(DL-DNA)通过光交联Y型DNA分子来进行组装，其序列经过特别设计从而可以使Yi和Y型DNA间的交联只在i≠j的情况下发生，这里i和j是指代数n，例如，G1，G2，等等。此外，连接可以只发生在一个方向，即Y1→Y2→Y3→Y4，等等。当Y0和Y1以1∶3的摩尔计量关系连接时，1份Y0与3份Y1连接，形成第一代DL-DNA。G1随后与6份Y2(G1的6个自由分支中的每一个与1份Y2连接)连接，形成第二代DL-DNA(G2)。第三代(G3)，第四代(G4)，以及更高代的DL-DNA以类似方式组装生成。值得注意的是，因为使用这种单方向的连接策略，所以组装的DL-DNA(Gn)只可能具有一种构型。第n代DL-DNA的通式表示为：Gn＝(Y0)(3Y1)(6Y2)...(3*2n-1Yn)，其中n是代数，Yn是第n个Y型DNA。第n代DL-DNA中的Y型DNA的总数是3*2n-2个。DL-DNA从第n代生长到第(n+1)代需要3*2n个新的Yn+1-DNA。
三条特异的多聚核苷酸结合形成一个Y型DNA。每个多聚核苷酸可以包含3个区域。每个核苷酸的第一区域(区域1)可以包含能够在Y型DNA形成后形成5’粘性末端的核酸。术语“粘性末端”是指一条多聚核苷酸的单链突出部分。在各种实施方式中，任何X型、Y型、T型或者哑铃型核酸的粘性末端可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个核苷酸。在一些实施方式中，多聚核苷酸不含这种粘性末端。通常来说，粘性末端越短则结合时的选择性越低。例如，没有粘性末端的多聚核苷酸具有很低甚至没有选择性。在一些实施方式中，粘性末端是带有四个核苷酸的末端。
一些实施方式中，粘性末端是含四个核苷酸的末端。一些实施方式中，该粘性末端包括或者是，TGAC、GTCA、CGAT、ATCG、GCAT、ATGC、TTGC、GCAA或者GGAT(例如表4-6)。
每个多聚核苷酸的第二区域(区域2)与其它两个形成Y型DNA的多聚核苷酸中一个多聚核苷酸的第三区域(区域3)互补。每个核苷酸的第三区域与其它两个形成Y型DNA的核苷酸中的另一个核苷酸的第二区域互补。例如，参见表6A和6B中的序列：SEQ ID NOs 72-76的区域2，其由SEQ ID NO：96表示，与SEQ ID NOs 82-86中的区域3，其由SEQ ID NO：101表示，互补；SEQID NOs 72-76的区域3，其由SEQ ID NO：97表示，与SEQ ID NOs77-81中的区域2，其由SEQ ID NO：98表示，互补；SEQ ID NOs 82-86的区域2，其由SEQID NO：100表示，与SEQ ID NOs 77-81中的区域3，其由SEQ ID NO：99表示，互补。
在本发明的一些实施方式中，每个区域的长度可以进行变化。例如，在一些实施方式中，每个第二和/或第三区域的长度为大约13个核苷酸。在一些实施方式中，第二和/或第三区域的长度可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20个核苷酸。在本发明的一些实施方式中，第二和/或第三区域的长度可以超过20个核苷酸，例如，它们可以是大约25、30、35、40、45或者50个核苷酸长度。
在本发明的一个实施方式中，每个多聚核苷酸的长度为30个核苷酸，其中，第一区域长4个核苷酸，第二区域长度为13个核苷酸，第三区域长度也是13个核苷酸。在本发明的一些实施方式中，Y型多聚核苷酸包括或者基本包括或者由，序列SEQ IDNOs：72-86或SEQ ID NOs：102-112组成。对于本发明中描述的各种实施方式中的核酸结构单元(例如，X型、Y型、T型、哑铃型、树状型态)，其5’末端可以含有磷酸化修饰从而使其可以包含本发明中所述的各种标签，包括Alexa Fluor488、BO630(参见，探针/标签，出处同前)。
Figure BPA00001342885900401
Figure BPA00001342885900411
Figure BPA00001342885900421
另一方面，基质可由Y型和线性核酸以及至少一种共聚物构成。在一个实施方式中，Y型和线性核酸是DNA。在另一实施方式中，Y型核酸是DNA，而线性核酸是DNA、RNA、TNA或者PNA。此外，所述至少一种共聚物为本领域所公知或在本发明中描述的共聚物。在一个实施方式中，共聚物是已为本领域所公知的或在本发明中描述的肽单体。
在本发明的某些方面，Y型DNA末端被设计成具有上文所述的能够进行反应的粘性末端。在一些实施方式中，该反应是连接可进行光交联的光反应基团的反应。在一些实施方式中，该反应是酶反应。在一些实施方式中，该酶反应被用以连接核酸分子，该反应是DNA连接酶介导的连接反应。在另一个实施方式中，DNA连接酶是T4DNA连接酶。
在一个实施方式中，Y型核酸结构单元通过尾对尾方式连接，以生成哑铃型结构单元或者类树状型核酸。参见，例如图7和图8B。
一方面，Y型核酸结构单元形成的基质的拉伸模量为大约0.4，拉伸强度为大约42％。在一些实施方式中，X型连接的DNA具有的拉伸模量为大约0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65或者0.7。在一实施方式中，用于构建基质的Y型DNA具有的拉伸强度为大约35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或者60％。在一个实施方式中，Y型核酸为DNA。在另一实施方式中，Y型核酸为RNA。
另一方面，本发明的Y型核酸用于形成树状物结构(典型的树状物结构如图10A-C所示)。此处提到的支化核酸为类树状物，因此可以通过同时或者逐步结合这样的核酸来形成树状物结构。此外，在一些实施方式中，所述构成树状物结构的Y型核酸的的各个臂与一种或者多种生物活性试剂相连接，这样的试剂在本发明中已有记载。因此，在一个实施方式中，这些臂与靶点肽或者信号肽、可筛选标志物、可检测标签、小化合物、药物、药学试剂或者质粒或者病毒载体或者病毒相连接。通过参见图11-12，本领域的技术人员可以非常容易地理解，Y型核酸形成的所述树状物支架可以连接多种相同的或者不同的化合物。换句话说，树状物结构是各向异性的和/或多价的。在其它实施方式中，可以使用X型、T型或者哑铃型核酸来形成树状物结构。
在一个实施方式中，Y型、X型、T型或者哑铃型的臂与肽基团相连接，所述肽基团包含，腺病毒核心肽、合成肽、流感病毒HA2肽、猴免疫缺陷病毒gp32肽、SV40T-Ag肽、VP22肽、Tat肽、Rev肽、DNA缩聚肽、DNA保护肽、内含体靶向肽、膜融合肽、核定位信号肽、蛋白转导域肽或者它们的任意组合。
在另一实施方式中，Y型、T型、X型、或者哑铃型核酸与一种或者多种生物活性剂相连接，所述生物活性剂包括前端肽、一种或者多种可筛选标志物、一种或者多种可检测标签、一种或者多种药物、小分子化合物、核酸序列、或者一种或者多种共聚化合物。
T型
在另一方面，形成基质的核酸是T型核酸(图13)。在一个实施方式中，T型核酸是DNA。在另一实施方式中，基质含有T型DNA和/或RNA，或其类似物/衍生物。此外，基质还可由T型以及一种或者多种不同类型的核酸组成，包括X型、Y型、哑铃型或者树状型态核酸以及它们的组合形式。
在一个实施方式中，T型核酸的拉伸强度为50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、或者65％。此外，T型核酸的膨胀度为100、105、110、115、120、125、130或135％。对于T型核酸分子，每条多聚核苷酸的第二区域(区域2)与其它两条多聚核苷酸中的一条的第四区域(区域4)互补。每条多聚核苷酸的第四区域与另外两条T型多聚核苷酸中的另一条的第二区域互补。第三区域或者缺失，或者是一个连接物以使其形成T型构象。例如，参见表4A和4B中的序列：SEQ ID NO：46的区域2与SEQ ID NO：44的区域4互补，SEQ ID NO：46的区域4与SEQ ID NO：45的区域2互补，SEQ ID NO44的区域2与SEQ ID NO：45的区域4互补。
T型核酸分子可以通过混合等量的三种寡核苷酸链合成。命名方法如下：T0a，T0b和T0c是形成T0型核酸分子(T0)的三条相应单链寡核苷酸链。类似的，T1a，T1b和T1c是形成T1型核酸分子(T1)的三条相应单链寡核苷酸链；Tna，Tnb和Tnc是形成Tn型核酸分子(Tn)的三条相应单链寡核苷酸链。反应式表示如下：T0a+T0b+T0c→T0，T1a+T1b+T1c→T1，Tna+Tnb+Tnc→Tn，等等。参见图13和图14。
在各种实施方式中，可选用X型、Y型或者T型DNA设计合成具有不同外部型态和内部结构的水凝胶。这些形态都已经记载在美国专利申请第11/464,184号中，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES FOR PROTEIN PRODUCTION”；美国专利申请第11/464,181号中，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES”，这两件专利申请在此通过引用方式全文并入到本申请中以作为参考。如其所述，例如，X型DNA凝胶干燥状态的表面型态是纠缠的型态，Y型DNA凝胶干燥状态的表面型态是纤维状型态，T型DNA凝胶干燥状态的表面型态是鳞状型态。进一步来说，X型DNA凝胶在其表面能展现出2个扁平的DNA凝胶条纹缠绕成结形成表面具有许多皱纹的薄片型态。Y型DNA凝胶展现出含有许多分叉结构的纤维的纤维型态。T型DNA凝胶展现出具有很多皱纹的薄片型态。在膨胀状态下，X型Y型和T型DNA凝胶的表面型态具有大量的不同大小的孔径和通道，在四周和垂直方向具有明显的纤维，呈鳞状结构。
在另一些实施方式中，凝胶可以由一种或者多种不同型态的核酸组成，这些核酸包括X型、Y型、T型、哑铃型或者树状型态的DNA(例如，Y型和X型DNA，或者Y型和T型DNA或者X型和T型DNA)。参见图15A-C。在还有一些实施方式中，适用于任意本发明所述基质的凝胶可以由核酸组成，这些核酸包括DNA、RNA、PNA、TNA或者它们的组合。
基质的孔径尺寸
在本发明的另一方面，通过选用特定的核酸或者核酸组合构建含有孔的基质。在一个实施方式中，孔的尺寸选自以下的组：5nm、大约10nm、大约15nm、大约20nm、大约30nm、大约40nm、大约50nm以及大约100nm。在另一实施方式中，所述孔的尺寸选自以下的组：大约0.1微米至大约5微米、大约10微米、大约20微米、大约30微米、大约40微米、大约50微米、大约100微米、大约200微米、大约300微米、大约400微米、大约500微米、600微米以及大约1000微米。因此，通过选用不同长度和/或不同型态的单体，可以构建出具有基本上符合预先确定的尺寸的基质。
本发明的另一方面涉及，通过使用支化核酸生成三维结构的基质，特别是使用X型、Y型、T型、哑铃型或者树状型态的核酸作为生成三维结构的基质的结构单元。在一个实施方式中，核酸是DNA分子。在另一实施方式中，核酸是RNA和/或PNA。此外，核酸可以是DNA、RNA或者PNA、或者任意其它本发明中提及的核酸的组合。在另一实施方式中，所述基质含有编码一种或者多种蛋白质的线性核酸。
一方面，通过选用特定的核酸类的结构单元来设计含有特定孔尺寸的三维基质结构，其中基质(水凝胶)由单种型态的单体结构单元构成，该单体可以是X型、Y型、T型、哑铃型或者树状型或者它们的组合型态。在一个实施方式中，核酸是预先确定的特定比例的X和Y型DNA，从而可以产生具有可预测孔尺寸或孔尺寸范围的网状基质结构。在另一实施方式中，核酸进一步包含线性核酸，所述线性核酸与选自X型、Y型、Y型、哑铃型、树状型态或它们的组合型态的核酸同时使用。在另一实施方式中，网状基质结构是脱水的，其中包含核酸类基质的干化合物的体积溶胀(在水或类似液体中)为大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500％。
水凝胶溶胀
DNA掺入和DNA水凝胶的溶胀度。
DNA水凝胶的溶胀度Q根据以下公式计算： Q = 1 + p 2 · ( m sw m d · p 1 - 1 p 1 )
其中msw是溶胀状态下样品的重量，md是干提物样品的重量，ρ1和ρ2分别是溶胀介质和聚合物相应的特定密度。ρ2根据对已精确知道其长度、宽度和厚度的样品进行称重测得(A.Lendin，A.M.Schmidt，R.Langer，Proc Natl Acad SciUSA 98，842(2001))。
含有表7所示序列的DNA凝胶可以通过使用一个已知尺寸和容积的圆柱形模具来进行构建。该凝胶先经过一整夜的充分冷冻干燥，然后再进行称重。对于溶胀凝胶，将300μl新鲜水加入干燥的凝胶管中，孵化一整天使DNA凝胶溶胀。表8所示的所有值均为至少三次重复测量后获得的平均值。N/D表示“未测定”。表8和表9对X型、Y型和T型凝胶的机械性能进行了比较。表7用于构建X型、Y型和T型核酸结构单元的寡核苷酸实例
Figure BPA00001342885900461
需注意的是，p代表寡核苷酸5’末端的磷酸化修饰。表8水凝胶溶胀
Figure BPA00001342885900471
表9A拉伸强度
Figure BPA00001342885900472
某一物质的特定向下重力是它的密度与水密度比值。百分比(极限延伸)表明凝胶被测量时接近断裂的程度。表9B干燥的和溶胀的水凝胶的机械性能
Figure BPA00001342885900481
为确认这些DNA结构单元是否形成，可以使用连接有DNA特异的荧光染料(SYBR I)的凝胶电泳迁移阻滞分析(GEMSA)。这样的确认方法已经记载在美国专利申请第11/464,184号中，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MATRIXES FOR PROTEIN PRODUCTION”；美国专利申请第11/464,181号中，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLEIC ACID-BASED MARIXES”，这些专利申请在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。对其尺寸(分子量)和纯度(多分散度)进行评估。通常情况下，因为它们具有较大的尺寸，所以完整的X型DNA迁移速率会比较慢。另一方面，X01，X02，X03，X04的不完全杂交会形成少量不完整的X型DNA。通常情况下，降低盐浓度能够提高碱基配对的特异性，而提高盐浓度则产生更强的静电相互作用。离子强度对于DNA的影响为本领域的普通技术员所公知(参见，例如，Macromolecules，1997，30：5763；J.Phys.Chem.2006；110：2918-2926；Biophys.J.1996；70：2838-46)。
同样可以使用类似的上述试验对Y型和T型DNA进行分析，从而可以实现可控地组装生成具有不同性质的水凝胶。在使用了连接反应的实施方式中，反应按照生产商商提供的实验流程来进行。ATP反应需要加入Mg++。水凝胶的凝胶化与连接酶的活性有关系。例如，当使用2倍量的连接酶(例如，60个单位)时，DNA水凝胶在30分钟内完全形成。不管DNA单体的类型(如X型、Y型或者T型)，所有水凝胶的凝胶化都可以在室温和中性pH条件下在2小时内完成。典型的连接酶反应使用10x连接酶缓冲液，其组分为300mM Tris-HCl(pH7.8)、100mM MgCl2、100mM DTT和10mMATP。T4DNA连接酶与10mM Tris-HCl(pH 7.4)、50mM KCl、1mM DTT、0.1mM EDTA和50％甘油配制在一起。通常情况下，通过光交联形成水凝胶的成型速度更快，并展现出更好的强度。
DNA结构单元的掺入量可以在凝胶化之后按照以下方式计算：初始的DNA浓度减去凝胶化之后上清液中的DNA浓度。
树状物结构
由于几乎所有的核酸分子不是线性的就是环状的，所以为了可以合理构建核酸生物材料，必须首先构建其它型态的核酸以作为结构单元。此外，这些核酸结构单元必须可以通过可控方式容易地掺入到更大的结构中去。因此，本发明的一方面涉及组装类树状核酸结构以提供生物材料化合物。参见图10A-C。
在本发明的另一方面，使用支化的或者DL-DNA来形成树状物结构。合成单分散的聚合物需要高水平的合成控制技术，这里通过逐步反应来实现，每次形成一个单体层或者一“代”。每个树状物由多功能的核心分子组成，所述核心分子通过树状楔子与每个功能位点相连接。核心分子称为“0代”。每个相继的重复单元沿着所有侧链形成下代，“1代”、“2代”，并依此类推至最终代，如图10C所示。
树状物的合成有两种定义的方法，发散法和汇聚法。在发散法中，分子按照从核心至四周的方式组装；而在汇聚法中，树状物由最外层开始合成而终止于核心。这两种方法都需要通过逐步工艺来实现，先将一代连接到上一代，然后纯化，最后改变官能团以进行下一步反应。例如，在图10C中，阴影部分的内核表示一步，接着非阴影的“Y”型分子作为另一个接下来的步骤，然后画点部分的“Y”型分子作为再下一个步骤。改变官能团对于防止出现不受控制的聚合反应而言是必须的。所述不受控制的聚合反应会导致高度支化分子的出现，其不是单点分散的型态而是超支化聚合物。
在发散法中，表面基团在开始的时候不具有反应活性或者是被保护起来的，其随后可以被转化成具有反应活性从而用来进行下一步的反应。汇聚法则相反，活性基团必须在树状楔子的焦点上。
由于空间位阻效应，继续反应树状重复单元会引起球面状或球状分子的出现，直到空间位阻过分拥挤从而在某一特定代时造成反应中止，并破坏分子的单点发散结构。可能的代数可以通过在核心分子的侧链处使用更长的空间单元来得到提高。树状物的单点发散性和球状空间扩张的特点可以产生多种有用的性能。树状楔子长度的空间限制会导致小分子尺寸的出现，而球状型态的密度则会导致相当高的分子量。球状型态也为分子拓扑学提供了一个有意义的研究课题。树状物具有两种主要的化学环境，位于树状球体表面的最终代官能团所引起的表面化学，以及球体的内部化学环境，由树状物结构的球体形态使其绝大部分与外界环境隔离。一个分子中存在两种完全不同的化学环境决定了树状物可以有很多方面的应用。
同样地，亲水性/疏水性和极性/非极性的相互作用可以在这两种环境中进行变化。树状物内部存在的空间为这两种相异的环境提供了进一步的可能性，该相异的环境在树状物化学领域扮演了重要的角色。因此在进一步的实施方式中，树状物结构除了通过一种或者多种末端单体(例如Y型)核酸分子的一个或者多个臂端连接其它分子，也可以在其分子内部容纳其它分子。树状物具有多种用途，例如作为分子量和尺寸的标准，基因转染试剂，转运生物学重要客体的载体，以及作为抗癌试剂，等等，在此不一一列举。树状物最有意义的性质是利用其高表面功能以及易于回收的性质来作为催化剂。树状物的球型态以及分子拓扑结构，使其在生物学系统中具有很高的使用价值。利用核酸分子作为树状物结构的结构单元并进一步连接生物活性剂这可以为生物技术和医学提供全新的机遇。
在本发明的一些方面，树状物结构可以在成形的逐步反应中的任何阶段形成，从而提供多化合价的结构。这样的树状物结构可以由Y型、X型、T型或者哑铃型的多聚体构成。在一个实施方式中，形成所述树状物结构的多聚体是DNA多聚体。在另一个实施方式中，树状物结构由DNA和/或RNA构成。如上文所述，树状物通过逐步添加不同的核酸单体(即结构单元)形成，例如，核酸单体的末端为接下来的连接反应提供了末端突出，从而扩展了树状物结构的三维结构。
因此，在选定的各种核酸中，可以使用不同长度的单体来形成具有不同内部和表面区域网状结构的树状物。进一步来说，可以使用各种粘性末端和/或单体单元来作为连接一种或者多种生物活性剂的底物。这样的生物活性剂为本领域所公知的或在本发明中描述的活性剂。
在本发明的一方面，本发明提供了一种涉及用Y型DNA(Y-DNA)可控组装类树状DNA(DL-DNA)的方法。参见图10-12以及图15。在一个实施方式中，产生的DL-DNA是稳定的并且是单分散的。在一个进一步的实施方式中，多价DNA树状物是各向同性或者各向异性的，因此可以与其它化合物相连接。参见图11-12。
在某些实施方式中，树状物结构与其它化合物相连接或者交联，所述化合物选自，腺病毒核心肽、合成肽、流感病毒HA2肽、猴免疫缺陷病毒gp32肽、SV40T-Ag肽、VP22肽、Tat肽、和Rev肽。这样的化合物也可以选自，DNA缩聚肽、DNA保护肽、内含体靶向肽、膜融合肽、核定位信号肽、蛋白转导域肽或者以上的组合。参见，例如图12。
在一个实施方式中，树状物结构用于将生物活性剂输运到细胞或者患者体内。在另一实施方式中，树状物结构与上述的信号肽或者靶向肽连接，并包含生物活性剂。
在另一实施方式中，树状物含有靶向肽、生物活性剂、可筛选标记以及可检测标签。可筛选标记包括，本领域公知的或者本申请中记载的用于真核与原核细胞的抗生素。因此，就如之前提到的，树状物可以是由多种不同分子组成的多价结构，这些分子与构成树状物的一种或者多种多聚体核酸分子的一条或者多条臂相连接。参见图11、12和16。
可检测分子的特定实例包括，放射性同位素如p32或者H3，荧光体如异硫氰酸荧光素(FITC)，TRITC，罗丹明，四甲基罗丹明，R-藻红蛋白，Cy-3，Cy-5，Cy-7，得克萨斯红，Phar-Red，别藻蓝蛋白(APC)，表位标签如FLAG或HA抗原表位，酶标签如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，I2-半乳糖苷酶，以及半抗原偶联物如地高辛或者二硝基苯，等等(图16)。其它可检测标签包括，化学发光分子和发色分子，光密度或电子密度标签，等等。探针也可以用半导体纳米晶体进行标记，例如美国专利第6,207,392号中记载的量子点。Qdots可以通过购买方式从Quantum Dot公司处获得。
可用于检测的试剂的其它实例还包括但不限于，放射性标记探针、荧光素标记探针、量子点标记探针、色团标记探针、酶标记探针、亲和配体标记探针、电磁旋转标记探针、重原子标记探针、用纳米颗粒光散射标签或者其它纳米颗粒或者球壳进行标记的探针、以及任意其它使用本领域所公知的产生信号的标签进行标记的探针。可用于本发明中的检测的标记基团的非限定性实例包括但不限于，适宜的酶，例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或者乙酰胆碱酯酶；能够形成复合物的结合对，如链霉亲和素/生物素，亲和素/生物素，核酸适体/靶点或者抗原/抗体复合物，例如，仅作为举例，兔IgG抗原和抗兔IgG抗体(也可以使用其它物种和其它免疫球蛋白类型或者相应的片段)；荧光基团，例如伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，四甲基罗丹明，伊红，绿色荧光蛋白，四碘荧光素，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀绿，二苯乙烯，荧光黄，Cascade BlueTM，得克萨斯红，二氯三嗪基氨基荧光素，丹磺酰氯，藻红蛋白，荧光稀土复合物，如含有铕和铽的配合物，Cy3，Cy5，分子信标以及它们的荧光衍生物，以及其它本领域中公知的荧光基团，例如，Principles of Fluorescence Spectroscopy，Joseph R.Lakowicz(Editor)，Plenum Pub Corp，2nd edition(July1999)和the 6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P.Hoagland中公开的荧光基团；发光材料如发光氨；光散射或者等离子共振材料，如金或银颗粒或者量子点；或者放射性材料，包括14C，123I，124I，125I，131I，锝-99m(Tc99m)，35S或者3H。对于抗体/抗原复合物以及检测系统，本领域的技术人员可以找到很多可用的检测系统。例如，来自不同物种的抗体，其非限定性实例包括，小鼠、兔子和鸡。可以使用不同类型的抗体，例如，IgA、IgD、IgG、IgM和IgE以及其变体、片段和嵌合物。也可以使用单克隆和/或多克隆抗体制剂。术语“单克隆抗体”(mAb)指获取自一群基本均质的抗体；也就是说，除了少量可能存在的自然突变，群体中的抗体是相同的。单克隆抗体具有很高的特异性，直接针对单个抗原决定簇，也称为抗原表位。相反的，多克隆抗体制剂中的抗体通常是免疫球蛋白同种型和/或类型的异质群体，并具有多种抗原表位特异性。
标签的例子包括但不限于，发色团、荧光基团、酶、抗原、重金属、磁性探针、染料、磷光基团、放射性材料、化学发光基团、散射纳米颗粒或者荧光纳米颗粒、拉曼信号产生基团以及电化学检测基团。可以使用多种方法、手段以及其改进方法对使用生物芯片的基因分型进行芯片-基因分型分析。
进一步的，骨架标签是一种通过非序列依赖性的方式与核酸分子相结合的核酸染料。骨架标签的实例包括，插入型染料如菲啶和吖啶(例如溴乙啶、碘化丙啶、hexidium iodide、二氢乙啶、溴乙非啶二聚体-1、溴乙非啶二聚体-2、单叠氮乙啶和ACMA)；一些小沟结合分子例如吲哚类和咪唑类(例如，Hoechst33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580和DAPI)；以及其它类核酸染料例如吖啶橙(也可以插入核酸分子)、7-AAD、放线菌素D、LDS751、以及羟芪巴脒。所有以上提及的核酸染料都可以通过购买方式从供应商处获得，如Molecular Probes，Inc。还有一些核酸染料的例子包括来自Molecular Probes的以下染料：菁染料如SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR DX，SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝色)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿色)，SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙色)，SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红色)。
在另一实施方式中，树状物结构与本发明中所述的多种生物活性剂相连接，所述多种生物活性剂包括靶向肽。因此本发明的树状物可以与一种或者多种肽相连接，所述肽选自：腺病毒核心肽、合成肽、流感病毒HA2肽、猴免疫缺陷病毒gp32肽、SV40T-Ag肽、VP22肽、Tat肽、Rev肽、DNA缩聚肽、DNA保护肽、内含体靶向肽、膜融合肽、核定位信号肽、蛋白转导域肽或者它们的组合。
在本发明的另一方面，树状物与核酸载体相连接(例如质粒或者病毒载体或者线性核酸序列)，其可以输运至细胞或者患者体内。这样的载体为本领域所公知，或者已经记载在本申请中。因此，在这样的实施方式中，树状物结构可以被应用在影响细胞转染或者遗传修饰的方法中。树状物结构的一个核心方面是它具有各向异性和多价性。2.蛋白质合 成【00233】在一些方面，核酸基质被应用在非细胞合成蛋白质体系中。这样的基质简化了蛋白质的表达，因为事实上所有的蛋白包括毒性蛋白或者多种蛋白的表达，都可以在没有任何活的有机体/细胞的蛋白生成基质(“P-gel”)中进行便捷的表达。此外，任意基因的突变都可以直接在蛋白水平进行研究而不需要进行转化和筛选。此外，非细胞体系可以使蛋白终产物的纯化变得简单容易。因为酶和P-gel可以重复利用，所以蛋白表达效率可以非常高，并且成本也相当低。因为省去了培养活细胞、维持培养箱和进行表达后纯化步骤，所以蛋白合成的成本可以得到进一步降低。
在本发明的一方面，核酸基质是P-gel基质，其由两类核酸分子构建而成。首先是选择核酸分子以提供结构支持或者形成网状基质三维结构(“结构单元”或“单体”或“交联物”)。此外，该基质还含有编码目标蛋白的线性核酸。基质可以被设计成编码一种或者多种蛋白的蛋白编码核酸。因此，特定的基质可以编码一种或者多种蛋白质。
一方面，非细胞合成一种或多种蛋白质的方法使用了多种核酸分子，这些核酸分子可以构建生成一种或多种此处记载的支链结构。图17示出了通用的构建流程图。根据本发明的方法，通过光交联多种核酸分子的方式使其形成核酸水凝胶。所述水凝胶可以表达一种或者多种蛋白质。可以对水凝胶进行各种各样的配置。例如，水凝胶可以同时含有编码和非编码核酸分子，例如，支架部分可含有非编码区域。水凝胶也可以含有一种或多种核酸分子或者其它进行蛋白修饰所需要的大分子，所述修饰例如是，磷酸化、糖基化、甲基化、泛素化、生物素化、烷基化、乙酰化、谷氨酰基化、甘氨酰化、异戊二烯化、脂化、磷酸泛酰巯基乙胺基化、硫化、瓜氨酸化、脱酰胺化或异构化。在这些实施方式中产生的蛋白包括，具有一种或者多种所列修饰或者与其类似的修饰的蛋白。
在一些实施方式中，P-gel基质可完全由DNA或者RNA构成，也可由DNA和RNA的组合构成，该组合可以包含作为结构单元的每种核酸或者蛋白编码核酸。蛋白表达/翻译所需的各种大分子为本领域所公知，例如兔网织红细胞、麦胚提取物和细菌提取物。这些基质可以选择性地提供DNA、RNA或它们的组合，因此可以选择合适的大分子提供“组合的”转录(DNA)和蛋白翻译，或者直接进行蛋白翻译(RNA)。
此外，通过改变基质或P-gel中结构单元核酸的浓度、蛋白表达核酸的浓度以及RNA和编码蛋白的DNA之间的比率，可以获得各种蛋白产量。
在一个实施方式中，结构单元单体核酸含有构成网状基质的X型核酸，该网状基质也含有编码至少一种或者多种目标蛋白的线性核酸。此外，结构单元可含有X型、Y型、哑铃型、T型、树状型态或者它们的组合型态的核酸。进一步的，P-gel可以由X型和Y型核酸以预定比例构成以形成特定的P-gel几何形态，其中线性核酸也被整合到生成的网状基质中。在另一实施方式中，所述结构单元单体为DNA或PNA。此外，线性核酸是DNA、RNA、TNA、PNA或它们的组合(包括任意两两组合)。
在另一实施方式中，P-gel完全由DNA构成。在进一步的实施方式中，P-gel单体的分子量选自：大约50kDa至大约500MDa。在各种实施方式中，分子量为50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、800、900、1000kDa。在其它的实施方式中，分子量为1、5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500或550MDa。在一优选的实施方式中，P-gel是水凝胶。
此外，P-gel是水合的，加入水后，其干燥形式体积溶胀至大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、或1500％。
此外，核酸构成的P-gel具有的拉伸强度为大约35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65％。
本发明的一方面涉及由支化核酸分子和线性核酸分子构成的核酸基质，以及该核酸基质在非细胞环境中生产蛋白。在一个实施方式中，该基质形成凝胶，且该基质完全由DNA构成(线性基因作为单体，支化的X型DNA作为交联物)。蛋白以体外转录翻译(TNT)的方式直接从凝胶中进行表达。由于该系统是非细胞体系并且其主要成分是表达后的蛋白，所以表达后纯化将不再困难。同时，凝胶和TNT酶可以被回收重复利用多次，这进一步降低了生产成本。该生产系统也不再需要维持细胞生长。在一个实施方式中，该凝胶是水凝胶，因此可以使用水进行水合。
在另一实施方式中，基质的蛋白产量是每立方厘米7.9mg。在其它的实施方式中，每立方厘米凝胶的产量为大约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或者25mg。
此外，在一个实施方式中，交联核酸是DNA，进一步说是X型DNA。在一些实施方式中，X型DNA分子长度为大约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30nm。在另一实施方式中，X型DNA的长度为大约10至20nm。在另一实施方式中，X型DNA的长度为14nm。
在一个实施方式中，水凝胶具有孔。可以通过调节核酸结构单元来调节孔径尺寸。在一个实施方式中，孔的尺寸为大约50nm至500nm，例如为大约5nm、大约10nm、大约15nm、大约20nm、大约30nm、大约40nm、大约50nm以及大约100nm。在一些实施方式中，水凝胶具有多种不同尺寸的孔。
在另一方面，凝胶被塑造形成具有一个闭合末端和一个开口末端或者两个闭合末端的空心基质结构，该结构具有内部表面区域和外部表面区域，蛋白可以在这两个表面区域之间进行转录。网状形式中的基因浓度，例如核酸水凝胶中的基因浓度，可以提供更高浓度的基因，这样高浓度的基因可以从酶动力学上提高转录速率。此外，核酸的网状支架为更多的酶活性和代谢回转提供了锚点。此外，空心管状结构为翻译或者转录翻译提供了高浓度的其所必须的大分子，从而大大提高了特定凝胶的表达产量。
在一个实施方式中，相对于开放式的基质，所述空心的“闭合末端”的网状基质将蛋白产量提高了1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10倍。
在多个实施方式中，蛋白生成基质或P-gel包含DNA、RNA、PNA、TNA型的核酸结构单元，或者包含它们的组合。在一个实施方式中，核酸全部为DNA、全部为RNA、或DNA和RNA的组合。在进一步的实施方式中，交联DNA选自：X型、Y型、T型、哑铃型或者树状形态的支化核酸，蛋白编码核酸是线性的或者环状的。
在本发明的另一方面，本发明的核酸所构建的基质进一步与至少一种(或者多种)共聚物或者其它化合物相连接，它们都是本领域公知的或在本申请中已经记载的共聚物或其它化合物。核酸分子可以进行各种酶反应，包括DNA聚合酶、RNA逆转录酶、末端转移酶、DNA连接酶、RNA连接酶、外切酶、核糖酶、内切酶、多聚核苷酸激酶、DNA甲基化酶和DNA泛素化酶。因此，核酸分子可以很容易地被所述共聚物或其它化合物修饰或连接。
在一些实施方式中，蛋白生成基质生产蛋白的产率为，每1ng DNA或1ng RNA产生10、15、20、25、30、35、40、45ng蛋白。
翻译后修饰
本发明的另一方面涉及核酸类的蛋白生成基质，其中生成的蛋白已经经过翻译后修饰。大部分真核生物的蛋白糖基化通常发生在ER，也就是，酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞在ER中具有共同的N-连接寡聚糖处理过程。虽然ER中形成的糖蛋白具有几乎相同的糖基结构，但是如果仅仅在ER中进行初步的糖基化是无法合成具有治疗效果的糖蛋白的。因此，在各种实施方式中，水凝胶可以包含对通过本发明的非细胞蛋白合成系统所生产的蛋白进行翻译后修饰所必需的大分子。
产生早熟的糖蛋白的原因可能是因为末端糖基化体的不足所造成，例如高尔基体不足，所述早熟的糖蛋白是指没有经过完全的翻译后修饰。换言之，在高尔基体中，不同细胞对寡糖的处理过程可能不同。哺乳动物细胞O-糖基化的起始步骤是将N-乙酰半乳糖胺共价连接到丝氨酸或者苏氨酸上。Asn-X-Ser/Thr模板是N-糖基化所必须的，但目前还没有发现与其类似的O-糖基化序列。与N-糖基化相反，脂类偶联的寡糖前体参与了哺乳动物O糖基化的起始步骤，但N糖基化反应并不包括该步骤。在O-连接过程中，糖核苷酸作为第一步以及所有后续反应步骤的底物。在N乙酰半乳糖胺共价连接到丝氨酸和苏氨酸后，哺乳动物高尔基体中的O-连接寡糖可以有多种不同的处理途径。糖蛋白的寡糖结构可能对人类治疗用途作用深远，它会对血浆清除率、抗原性、免疫原性、特异活性、溶解性、热失活耐受性、蛋白酶裂解耐受性产生影响。因此，使用本发明的蛋白生成基质可以构建一套有效的带有完整的翻译后修饰功能的非细胞蛋白合成系统，其中蛋白可以进行完整的翻译后修饰，从而使得非细胞蛋白合成技术可以应用在大规模合成糖蛋白中，以及快速地了解蛋白糖基化的功能从而研究蛋白稳定性、构象、功能和糖基化间的关系。
为了合成具有完整和正确结构的蛋白，本发明包含非细胞蛋白合成体系和共修饰和翻译后修饰的结构的组合，该共修饰和翻译后修饰的结构包含分离自细胞的以及与共修饰和翻译后修饰有关的细胞器。从水凝胶中合成蛋白的方法已经记载在美国专利申请第11/464,184号中，其申请日为2006年8月11日，名称为“NUCLIC ACID-BASED MATRIXES FOR PROTEIN PRODUCTION”。本发明提供了光交联的P-gel。该方法特别适用于大规模生产具有使用价值的蛋白。此外，该方法可直接用于生产需要含糖基化等翻译后修饰过程的生物活性蛋白。
如上文所述，因为只加入ER并不能合成完整的翻译后修饰蛋白，所以还需要在糖基化反应结束后加入用于共修饰和翻译后修饰的结构。向非细胞蛋白合成反应混合物中加入共修饰和翻译后修饰的结构可以促进完全的翻译后修饰蛋白的合成，所述共修饰和翻译后修饰的结构包含信号识别颗粒、ER、高尔基体、质膜等。完整的孵化混合物(含有非细胞蛋白合成的成分以及共修饰和翻译后修饰的结构)可以产生完全的翻译后修饰蛋白。可以在体外精确重现共修饰和翻译后修饰过程。
用于制备非细胞蛋白合成体系的细胞提取物或裂解物的细胞来源，可以与共修饰和翻译后修饰结构中所用的细胞提取物或裂解物的细胞来源相同或者不同。在使用相同细胞来源的情况下，用于非细胞蛋白合成体系的提取物或裂解物可以与用于共修饰和翻译后修饰的结构的提取物或裂解物分别制备或者同时制备。制备这样的提取物的方法的实例为本领域所公知，例如美国专利第6,780,607号中记载的方法，该专利在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。
共修饰和翻译后修饰的结构可以从组织或者细胞系培养物中制备获得。进行糖基化修饰时，最好是使用遗传工程改造过的细胞系，以提高糖基化反应相关酶的表达水平和/或富集作为糖基化反应中糖基供体的糖核苷酸。本领域的技术人员能够进行此类遗传操作；因此详细的解释在本说明书中略去。
在此作为获取用于非细胞蛋白合成的细胞提取物方法的实例，例如，从中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系中制备核糖酶处理的RRL和初级匀浆，以及从初级匀浆中制备含有信号识别颗粒的ER、高尔基体和质膜，上述方法都已经记载在美国专利第6,780,607号中。这样的提取物可以从任意相关哺乳动物的细胞中获得。
使用一种或多种本发明的基质进行非细胞蛋白合成所产生的糖蛋白，可以在与侧链修饰相关的酶的作用下通过糖类添加和/或删除和/或替换反应对其进行进一步的修饰，例如糖基转移酶、糖苷酶、转糖苷酶等等。这样进一步实现了对侧链进行糖基的添加、删除或替换操作。此外，在另一实施方式中，偶联了所需大分子的一种或者多种蛋白生成基质，可以合成具有一般糖蛋白结构不具有的糖侧链的蛋白质，或者合成具有全新结构的人工合成糖蛋白，从而能够研发新的糖蛋白种类。例如，进一步通过转糖苷酶，其为一种糖链添加酶，将水杨酸添加到糖添加反应产物中或从中分离的促红细胞生成素(EPO)的末端，如此相连后生成的糖蛋白具有更高的活性。
因此，在一些实施方式中，蛋白生成基质可用于合成具有治疗价值、商业价值或者研究价值的蛋白。这样的蛋白包括如生长激素、粒细胞集落刺激因子、白介素、干扰素、血小板蛋白、组织性纤维蛋白溶酶原激活剂、以及人源单克隆抗体。此外，在某些实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含能够合成完整的翻译后修饰蛋白的核酸基质以及前面讨论过的翻译后修饰所需的提取物，因此该试剂盒可以作为研究蛋白共修饰和翻译后修饰的工具从而对蛋白功能进行研究。
可回收利用性
在本法明的其它方面，蛋白生成基质可以被重复使用至少3次，并能在凝胶微垫衬被核糖酶(获取自裂解物)降解之前存放7天。但是，通过将本发明的核酸类基质与至少一种共聚物或者至少一种其它化合物相连接，该基质可以构建出高机械强度的凝胶。在一个实施方式中，可以通过掺杂金纳米颗粒(AuNP)的方法来构建出更高强度的凝胶，其中金与DNA链的连接方式可以是通过直接交联AuNP与DNA，或者通过将AuNP悬浮在凝胶的方式将其交联到DNA链之间。图18示出了AuNP与DNA交联的示意图，代表由此构建出的凝胶。此外，核糖酶活性可以通过添加本领域公知的化合物(例如DNA酶，核酸外切酶III等)来加以显著抑制，或者通过常规的蛋白分离方法和抗体亲和柱分离方法对用于体外蛋白表达的提取物进行纯化的方式来加以显著抑制。
在本发明的另一方面，可以进一步对核酸基质的骨架进行修饰从而使其更加稳定而不易降解。这样的修饰已经记载在本申请中或者已为本领域所公知，例如美国专利公开第2005/32068号、2004/161844号、2001/49436号以及美国专利第5,610,289号、第5,965,721号、第6,201,103号(教导了含有修饰骨架的肽核酸)或第6,025,482号记载的方法，以上专利或专利申请在此通过引用方式全文并入到本申请中以作为参考。
在另一方面，通过将基质中的核酸与共聚物相连接的方式来进一步稳定基质，这些共聚物为本领域所公知或者已经记载在本申请中。在一个实施方式中，使用了支化DNA-聚苯乙烯杂合分子。因此，在一些实施方式中，通过完全使用DNA-共聚物杂合分子或者通过使用X型DNA和DNA-聚苯乙烯混合物的方式来构建特定的凝胶DNAP-gel。由此，本发明提供了一种杂合DNAP-gel，所述DNAP-gel的骨架由耐核糖酶的聚苯乙烯基团构成。其它可以与核酸连接的共聚物都已经记载在本申请中。
如此，基质得到了显著的强化，从而可进行回收利用。因此，在一个实施方式中，蛋白生成基质可以被重复使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或者15次。
3.包封和输运
本发明的另一核心方面涉及一种由本申请记载的核酸组成的基质，进而提供了一种用于输运一种或者多种生物活性剂的结构。在一个实施方式中，该基质可以同时输运细胞和一种或者多种生物活性剂。在另一实施方式中，该基质可以为体内或体外的三维结构的细胞生长或者组织再生提供支架。在另一实施方式中，该基质提供了一种用于细胞生长和组织生产的平台，该平台还可以同时输运并释放包含在其内的一种或者多种生物活性剂。
一方面，本发明提供了一种将一种或者多种目标化合物包封到核酸水凝胶中的方法。图19给出了一般性的示意图。该方法使用了多个本发明所述的可以生成一种或多种支链结构的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子与一种或者多种目标化合物进行混合，光交联所述的多个核酸分子以形成组合物，所述组合物包含有其内包封了一种或多种化合物的核酸水凝胶。在一些实施方式中，所述多个核酸分子被光交联形成核酸水凝胶，然后该水凝胶与化合物混合并吸纳化合物，从而形成一种组合物，该组合物包含有其内包封了一种或多种化合物的核酸水凝胶。可以使用多种包封化合物的方法来形成一种水凝胶制剂。在相关方面，本发明提供了向患者给予这些组合物的方法。所述组合物可以通过时间可控的方式来将化合物释放到患者体内。化合物可以被输运至各种有效部位，例如，细胞、组织、器官、皮肤或者体液如血液或淋巴液。该组合物可以通过常规方式给药。非限定性的给药方式包括，口服、静脉注射(当水溶性时)、鼻腔给药、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射或者栓剂给药或者移植。
本发明的DNA水凝胶可以形成各种形式的毫米尺寸和微米尺寸的结构。通过选用不同类型的DNA单体，例如选用本申请中记载的不同结构单元，或者通过改变所述结构单元的长度、序列或型态，可以获得各种类型的水凝胶表面型态以及内部结构，包括凝胶的孔尺寸和释放动力学参数。在一些实施方式中，孔尺寸为大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20纳米。例如，孔尺寸可以达到15纳米。例如，可控的胰岛素释放可以在无突释效应的情况下实现超过一个月的连续给药，并且凝胶的CPT释放可以达到零级释放。这些生物可降解的生物相容性的核酸水凝胶可以被应用在各种生物医学用途中，包括持续给药、组织工程、3D细胞培养、细胞移植治疗以及其它生物医学应用。
由于本发明的包封方法具有非常温和、水相条件以及高效凝胶化的特点，各种试剂(从小分子到蛋白质乃至活细胞)都可以在凝胶中进行原位包封。这些特征不仅简化了凝胶化后的药物装载步骤，还可以实现接近100％的包封效率，例如，至少大约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者大约100％的包封效率。因为没有使用有机溶剂或者有损害的操作，所以可以使药物和活细胞得到很好的保存和存放。在一些实施方式中，这些化合物是生物分子，例如，蛋白质、肽、脂类、核酸、碳水化合物或者它们的任意组合。在一些实施方式中，所述一种或者多种化合物包括治疗性药剂，例如小分子或者其它药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、抗体、抗体-药物偶联物、光活性试剂或者染料、和/或放射性同位素。在一些实施方式中，所述目标小分子药物是阿霉素。所述方法也可以用于包封活细胞，例如哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述水凝胶为细胞生长提供了三维基质。在一些实施方式中，目标化合物包含载体或者病毒，包括病毒载体。
在一实施方式中，所述基质由DNA型的支化核酸构成。在另一实施方式中，该DNA型态为X型、Y型、T型、哑铃型或者树状形态、或者它们的组合型态。在另一实施方式中，基质包含支化DNA和线性的DNA或RNA。在另一实施方式中，基质包含支化核酸，所述支化核酸包含DNA和RNA。在另一实施方式中，基质包含至少一种本领域公知的或者本申请已经记载的共聚物。例如，共聚物与基质中的一种或者多种结构单元核酸相连接。其它实施方式涉及通过交联方式将其它成分或化学基团连接到基质中的核酸或者共聚物上。此处所指的其它成分已经记载在本申请中，包括小分子、纳米颗粒、微粒、纳米纤维、金属、或者肽。在一个实施方式中，其它成分是金属纳米颗粒，例如，金、银、铁或铜。在一个实施方式中，其它成分是金属微粒，更优选金、银、铁或铜。在一些实施方式中，该金属具有磁性。其它成分也可以包含炭黑、4-膦酰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧稳定自由基、二氧化钛。
可以掺入基质中的生物活性剂包括但不限于，单独输运的或者与另一种化合物和/或细胞一起输运的生物活性剂。生物活性剂的非限定性实例包括，干扰素、白介素、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、干细胞因子(SCI)、瘦蛋白(OB protein)、干扰素(α，β，γ)、环丙沙星、阿莫西林、乳酸杆菌、头孢噻肟、左旋氧氟沙星、头孢吡肟、甲苯咪唑、氨比西林、乳酸杆菌、氯洒西林、诺氟沙星、磺甲硝咪唑、头孢泊肟、普塞(proxetil)、阿奇霉素、加替沙星、罗红霉素、头孢菌素、抗血栓生成剂、阿司匹林、噻氯匹定、苯磺唑酮、肝素、华法林、生长因子、分化因子、肝细胞刺激因子、浆细胞瘤生长因子、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3(NT3)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、血小板转化生长因子、牛奶中的生长因子、内皮生长因子、内皮细胞源性生长因子(ECDGF)、α-内皮生长因子、β-内皮生长因子、神经营养生长因子、神经生长因子(NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、4-1BB受体(4-1BBR)、TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体)、青蒿琥酯(GFRα3-RET配体)、BCA-1(B细胞吸引化学趋化剂)、B淋巴细胞化学吸引剂(BLC)、B细胞成熟蛋白(BCMA)、脑源神经营养因子(BDNF)、骨生长因子如骨保护素(OPG)、骨源生长因子、促血小板生成素、巨核细胞源生长因子(MDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经营养因子4(NT4)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、巨噬细胞集落刺激因子(mCSF)、骨型态生成蛋白2(BMP2)、BRAK、C-10、心肌营养蛋白(CT1)、CCR8、抗炎药物、扑热息痛、双水杨酯、二氟尼柳、甲灭酸、双氯高灭酸、吡罗昔康、苯酮苯丙酸、安乃近、乙酰水杨酸、抗生素类阿莫西林、氨比西林、先锋霉素族抗菌素、红霉素、四环素类、青霉素类、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、喹诺酮类、阿莫西林、克拉维酸、阿奇霉素、克林霉素、抗癌药物阿利维A酸、六甲蜜胺、阿那曲唑、硫唑嘌呤、比卡鲁胺、白消安、卡培他滨、卡铂、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿霉素、表柔比星、ectoposide、依西美坦、长春新碱、长春瑞滨、激素、甲状腺刺激激素(TSH)、性激素结合球蛋白(SHBG)、泌乳刺激素、促黄体激素(LTH)、催乳激素、甲状旁腺激素(PTH)、黑色素聚集激素(MCH)、促黄体激素(LHb)、生长激素(HGH)、促卵泡激素(FSHb)、氟哌丁苯、茚甲新、阿霉素、表柔比星、两性霉素B、紫杉酚、环磷酰胺、顺铂、甲氨蝶呤、芘、两性霉素B、抗运动障碍药剂、阿尔兹海默疫苗、抗帕金森药剂、离子、依地酸、营养物、糖皮质激素、肝素、抗凝结药物、抗病毒药物、抗HIV药物、多元胺、组胺及其衍生物、半胱胺及其衍生物、苯海拉明及其衍生物、邻甲苯海明及其衍生物、蕈毒碱拮抗剂、苯氧苯扎明及其衍生物、蛋白A、链亲合素、氨基酸、β半乳糖苷酶、亚甲基蓝、蛋白激酶、β淀粉样蛋白、脂多糖、真核起始因子4G、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子结合蛋白(TNF-bp)、白介素1(至18)受体拮抗剂(IL-Ira)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、新的促红细胞生成蛋白(NESP)、促血小板生成素、组织血浆酶原激活因子(TPA)、尿激酶、溶栓酶、激肽释放酶、胰岛素、类固醇、乙酰水杨酸、对乙酰氨基酚、止痛剂、抗肿瘤药剂、抗癌药剂、抗增殖药剂或促凋亡药剂。
在一些方面，本发明的基质只包封有载体，或者还同时包封有其它本申请中记载的细胞和/或生物活性剂。载体的实例包括，腺病毒载体、腺病毒相关载体、逆转录病毒载体、和/或质粒载体。
在本发明的其它方面，核酸载体被淀积在本发明的基质中并输运到靶点细胞或者组织中。在其它方面，这样的载体可以编码治疗性蛋白或者反义mRNA。在本发明的其它方面，通过本发明中的装置，将一种或多种分别编码不同治疗性蛋白的载体输运至细胞或者组织中。因此，本发明的装置可以可控地释放载体从而实现有效的基因输运，例如在基因治疗中。基因输运可以是内源控制，或者由外源控制。内源控制的例子包括，使用对生理信号如低氧或者血糖浓度升高敏感的启动子来加以控制。外源控制系统涉及通过给予小分子药物来控制基因表达。这样的例子包括使用四环霉素、强力霉素、蜕皮激素及其类似物、RU486、化学二聚体如雷帕霉素及其类似物等。
在本发明的另一方面，该装置能够输运小分子药物，例如在上文中提到的那些小分子药物，其中该装置被用于输运载体和可诱导试剂(例如，小分子药物)、单独的载体或者它们之间的组合。
载体包括SV-40衍生物、腺病毒、逆转录病毒来源的DNA序列以及源自实用的哺乳动物载体和实用的质粒和噬菌体DNA的穿梭载体。众所周知的真核表达载体，例如P J Southern and P Berg，J Mol Appl Genet 1：327-341(1982)；Subramini等人，Mol Cell.Biol.1：854-864(1981)，Kaufinann and Sharp，J Mol.Biol.159：601-621(1982)；Scahill等人，PNAS USA 80：4654-4659(1983)和Urlaub and Chasin PNAS USA 77：4216-4220(1980)中记载的真核表达载体，这些文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。本申请中的一种或者多种方法所使用的载体可以是病毒载体，优选逆转录病毒载体。优选复制缺陷型腺病毒载体。例如，可以使用“单基因载体”，所述“单基因载体”是一种其逆转录病毒的结构基因被一个目标基因所替换并受到包含在长末端重复单元中的病毒调控序列所调控的基因载体，例如Moloney小鼠白血病病毒(MoMulV)、Harvey小鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)、小鼠骨髓瘤病毒(MuMPSV)、鸡逆转录病毒如禽网状内皮组织增生症病毒(Rev)和劳氏肉瘤病毒(RSV)，它们已经记载在Eglitis and Andersen，BioTechniques 6(7)：608-614(1988)中，该文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。
在本发明的基质或者方法中也可以使用可导入多个基因的重组逆转录病毒载体。如前述Eglitis and Adersen文献中记载的带有内部启动子的载体，含有受独立启动子调控的cDNA，例如SAX载体，其可通过向含有可筛选标记的(noe.sup.R)N2载体中插入人腺苷脱氨酶(hADA)和其自身的调控序列得到，SV40病毒(SV40)中的早期启动子也可以依照本发明中的方法或者本领域所公知的方法设计和使用。
在本法明的一些方面，首先将包含重组核酸分子的载体导入(例如转染)到淀积在本发明基质中的细胞中。例如，按照Eglitis和Andersen BioTechniques6(7)：608-614(1988)中记载的方法，通过将5e5BM-MNC涂覆在载体生成细胞中培养18-24小时的方式将包含重组核酸分子的载体导入例如转染到BM-MNCs中，随后将所述细胞淀积到所述装置的存储空间中。前述文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。
在本发明的一些方面，核酸分子编码蛋白质，如生长因子，包括但不限于，VEGF-A、VEGF-C、P1GF、KDR、EGF、HGF、FGF、血管生成素-1以及细胞因子。在一优选的实施方式中，核酸分子编码内皮型一氧化氮合成酶eNOS和iNOS、G-CSF、GM-CSF、VEGF、aFGF、SCF(c-kit配体)、bFGF、TNF、血红素氧合酶、AKT(丝氨酸-苏氨酸激酶)、HIF.alpha.(低氧诱导因子)、Del-1(developmental embryonic locus-1)、NOS(一氧化氮合成酶)、BMPs(骨型态发生蛋白)、SERCA2a(肌浆网钙-ATP酶)、β2肾上腺素受体、SDF-1、MCP-1、其它的趋化因子、白介素以及它们的组合。
在本发明的另一些方面，本发明的基质包含可以被导入到自体同源的BM-MNC中的基因，所述基因导入可以通过采用本发明中的一种或者多种方法来完成。所述基因包括但不限于，编码VIII/von Willebrand因子的基因、编码IX因子和胰岛素的基因、NO生成基因如eNOS和iNOS、抗血小板(plaque fighting)基因、抗血栓基因。因此，在这样的实例中，本发明的基质含有分泌治疗性药剂的细胞，其可以从基质的孔洞中分泌出治疗性药剂，其所分泌的治疗性药剂可以进入到周围细胞中(例如，体外或者体内)。应当理解，前面述及的生长因子也同样可以通过合成或者重组蛋白的形式来进行输运。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种病毒类的表达系统。当一个腺病毒被作为表达载体使用时，可以将目标核酸序列(例如编码一个治疗性药剂)连接到腺病毒转录或翻译控制复合体上，例如后期启动子和三联前导序列。这个嵌合基因随后通过体外或者体内重组插入到腺病毒基因组中。如果该嵌合基因被插入到病毒基因组的非必要区域(例如E1或者E3区)，则可以构建出一个能够在被感染宿主中增殖和表达AQP1基因产物的重组病毒。(参见，例如，Logan&Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci USA 81：3655-3659(1984))。
为了对插入的治疗性核酸序列进行有效翻译，这也可能需要特异的初始信号。这些信号包括ATG起始密码子和临近序列。当插入到适宜的表达载体中的核酸序列是包含起始密码子和临近序列的完整治疗基因或者cDNA时，则不再需要额外的翻译控制信号。但是，当插入的序列只包含部分治疗性编码序列时，则必须要提供外源的翻译控制信号，此外，还有可能需要提供ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与目标编码序列的读码框保持一致，以保证整条插入片段的正确翻译。这些外源的翻译控制信号以及起始密码子可以有多种来源，包括天然的和合成的。表达的效率可以通过引入适宜的转录增强元件、转录终止子等来加以增强(参见，例如，Bittner等人，Methods in Enzymol，153：516-544(1987))。
细胞和组织培养
虽然此前的描述与治疗性应用相关，但本发明也可以通过提供三维结构的支架和/或输运生物活性剂(例如，细胞生长因子，血管生成因子)的方式应用在非治疗方面，例如细胞培养和组织工程。因此，可以通过本发明的实施方式来使试剂实现以时间可控方式释放，所述试剂包括治疗性药剂、细胞培养试剂和组织工程试剂。
因而，本发明的一方面涉及用于包封细胞的基质或者方法。在一个实施方式中，该基质可用于体外繁殖和培养细胞。此外，通过将基质用作结构性支架或者同时用作结构性支架和生长促进因子的来源，本发明的基质还可以在体外用于组织生成或者组织再生。在另一实施方式中，该基质被移植到患者的靶位点。术语“移植”是指本领域公知的任意输运方式，而不局限于介入性方法(例如，局部应用或基于皮肤的应用)。
在一个实施方式中，该基质被用于细胞培养中以实现可控地释放特定试剂，进而监测这种试剂对细胞或组织培养的作用。例如，本发明的装置可以用来筛选不同化合物以检测这些化合物在诱导细胞分化过程中的作用机制，例如，研究其对干细胞分化的作用机制。使用细胞和组织培养的方法为本领域所公知，如美国专利第7,008,634号中记载的方法(使用细胞生长底物和束缚细胞生长的效应物分子)；美国专利第6,972,195号中记载的方法(体外培养潜在的可再生细胞和具有功能的组织器官)；美国专利第6,982,168号或第6,962,980号中记载的方法(使用细胞培养分析治疗癌症的化合物)；美国专利第6,902,881号中记载的方法(鉴定调控细胞分化的物质的培养技术)；美国专利第6,855,504号中记载的方法(毒理学筛选的培养技术)；或者美国专利第6,846,625号中记载的方法(使用细胞培养技术鉴定有效靶点药物的开发)，这些专利公开的内容在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。本领域的普通技术人员可以很容易的将本发明的基质应用到这样的细胞培养技术中。
在本法明的一些方面，基质包封了细胞和生物活性剂，从而为细胞的体外或者体内生长/分化提供了三维支架。进一步的，该基质的核酸可以与其它共聚物连接以提供界定组织接触表面的底物表面，其中该表面分布有增强细胞/组织生长的多肽或肽。基质可以释放生物活性剂，所述生物活性剂也能增强细胞/组织的生长，其中所述多肽/肽包括PDGF、EGF、FGF、TGF、NGF、CNTF、GDNF、VEGF和I型胶原多肽、或者它们的功能活性片段、和/或它们的组合。
核酸基质或基质，不管其是否连接了其它聚合物，都可用于各种组织工程应用，包括但不限于，提高组织拉伸强度、改善伤口愈合、促进伤口愈合、作为组织形成的模板指导组织形成、刺激神经生长、促进组织中的血管形成、作为生物可降解的粘合剂、作为装置或植入物的包被、或者提高组织或身体部位的机能。
在一些实施方式中，基质也可以特别地用作缝合物、支架以及创伤敷料。所使用的核酸聚合物或共聚物类型可能会对最终形成的聚合生物材料的化学性质和物理结构产生影响。
在另一实施方式中，基质被置于创伤区域表面或内部，该基质除了为细胞再生/再造提供支架以促进伤口改善或加快愈合之外，还可以可控地释放需要的治疗性药剂以促进伤口愈合。例如，治疗性药剂可以包括本申请中记载的细胞生长因子或血管生成因子。
输运或移植的靶点
应当理解，本发明的基质可以使用本领域所公知的任意方法进行移植，包括介入性的、手术的、微创的、和非手术的手段。根据患者、靶点、所输运的试剂的不同情形，本发明所述的微加工技术可以制作出各种合适尺寸和形状的输运支架。本发明所述基质适用于身体的各个部位。例如，它们可以移植到皮肤表面、皮下、或者内部组织或器官附近。在一些实施方式中，支架位于或接近消化道、呼吸组织或者器官、心血管组织或器官、或者神经组织或器官。移植靶点的其它实例包括但不限于，眼睛、胰腺、肾、肝、胃、肌肉、心脏、肺、淋巴系统、胸腺、脑下垂体、卵巢、前列腺、皮肤、内分泌腺、耳、乳房、尿道、脑部或者动物的任意其它位点。
在某些实施方式中，本发明的凝胶或者支架可装入非生物降解的材料中，这些非生物降解的材料为本领域所公知。例如，当本发明的基质结构与临时性的移植物连接时，该基质可以被包封在非生物降解的壳中。适用包封的材料包括但不限于，聚二甲基硅氧烷、硅氧烷弹性体、聚氨基甲酸乙酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚异丁烯酸甲脂、聚2羟乙基丙烯酸甲酯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚(乙烯-co-乙酸乙烯酯)共聚物、聚苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蜡、矿脂胆固醇、硬脂醇、白蜡、白矿脂、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十二醇硫酸钠、丙二醇、甘油明胶、凝胶试剂如卡波姆934、纤维素衍生物、天然树脂、渗透促进剂如二甲基亚砜、乙醇丙二醇、甘油、尿素、甘油明胶、着色剂、乳糖、硬脂酸、羟基乙酸淀粉、糖、明胶、非挥发性的植物油和脂肪、甘油、丙二醇、乙醇、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、二甲替乙酰胺，或者这些材料的水溶物或油溶物。
基质(凝胶或者支架)移植位点的选择属于本领域的现有技术。例如，眼睛中合适的移植位点包括前房、后房、玻璃体腔、脉络膜上腔、结膜下、外巩膜、角膜内、角膜外以及巩膜。玻璃体外部合适的位点包括，脉络膜上腔、睫状体等。脉络膜上腔是内巩膜壁与相对的脉络膜之间的潜在空间。根据药物从植入物中扩散出来的情况，以及植入物所含药物的浓度等情况，移植到脉络膜上腔的基质可以将药物输运到脉络膜以及处在其解剖学上相对位置处的视网膜。其它可以用来将本发明装置植入到各种组织/器官部位的方法和手段都为本领域所公知，如美国专利第7,013,177、7,008,667、7,006,870、6,965,798、6,963,771、6,585,763、6,572,605或6,419,709中记载的方法和手段，这些专利所公开的内容在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。
在另一实施方式中，基质提供了局部输运的手段，例如输运到皮肤。例如，可以将基质或者凝胶包封在非降解的外壳内(例如，塑料或绷带或补片)，该外壳带有与靶位点(即皮肤)接触的装置或表面。随后，该凝胶能够以时间可控的方式将目标药物释放到靶位点。
本发明的一方面涉及在伤口愈合中使用本发明的基质或支架。通常，身体能够再生创伤组织以产生与原组织性质类似的新组织。例如，小伤口愈合不会产生疤痕，干净的骨断面可以通过在两个断骨片段之间形成结合骨断面的新骨的方式进行愈合。但是，结缔组织细胞以及其它器官细胞具有贴壁依赖性--它们需要通过支架来行使正常的生理功能。当组织创伤非常广泛或者存在较大创面时，迁移至伤口的细胞由于找不到合适的贴壁而可能形成疤痕组织以连接伤口和健康组织。疤痕组织不具有与原组织相同的机械和生物学性质。例如，皮肤上的疤痕组织没有原组织那么柔软。骨形成的疤痕组织没有原来完整骨组织的强度，而且该处通常容易再次发生骨折。有些组织，如关节软骨，无法自然再生，并且只能通过形成疤痕组织来实现愈合。在另一实施方式中，基质为特定靶位点提供了伤口愈合(如烧伤、切口、深层组织损伤)的支架，该支架可以包封在可降解或者不可降解的材料中，或者也可以不使用这样的壳。该支架可以在释放目标药物化合物的同时为细胞生长和组织(例如皮肤)再生提供支架/支柱。
本发明所使用的药物
本发明的方法和组合物包括药物例如胰岛素敏化剂的研究和使用，以及包括进行相关研究以确定与药物例如胰岛素敏化剂应答有关的基因型和/或表面型性质，以及包括进行相关研究以筛选对药物例如胰岛素敏化剂反应敏感例如副作用的个体，和/或基于所述筛选结果来确定给予或不给予所述个体药物(例如，胰岛素敏化剂)。本节描述了本发明某些实施方式中用到的药物。更多适用于本发明的药物已经记载在IVC中各类药物的相关研究和方法章节。
胰岛素敏化剂
在本发明的某些实施方式中用到的一类药物是胰岛素敏化剂。术语“胰岛素敏化剂”或“胰岛素敏化试剂”是指，任何能够增强胰岛素分泌或者更通常的是能够增强组织对于胰岛素的敏感性的试剂。胰岛素敏化剂的非限定性实例包括，甲福明二甲双胍、磺脲类药物、α葡萄糖苷酶抑制剂和PPAR调节因子、噻唑烷二酮类药物。胰岛素敏化剂的其它实例将在本申请以下部分进行更多的记载。
噻唑烷二酮类药物是PPAR调节因子的实例，它们是一类胰岛素敏化剂。本发明中提到的“PPAR调节因子”是指，过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂、部分激动剂和拮抗剂。调剂因子可以选择性地或者偏向性地影响PPAR α受体、PPAR γ受体、或者两者。调节因子通常是提高胰岛素敏感性。根据本发明的一方面，调节因子是PPARγ的激动剂。本发明实施方式中所用的一种PPARγ激动剂是5-[{6-(2-氟苄基)氧基-2-萘基}甲基]-2，4-噻唑烷二酮；(MCC-555或萘格列酮)。
胰岛素敏化剂--PPAR调节因子
本发明的一类胰岛素敏化剂是PPAR调节因子，特别是PPARγ调节因子，例如，PPAR-γ激动剂。PPAR调节因子包括PPAR-α、PPAR-delta(也称为PPAR-β)，以及PPAR-γ激动剂。特别有用的是噻唑烷二酮类药物(TZDs)，该类药物是在70年代和80年代通过筛选新合成的化合物降低糖尿病啮齿动物血糖的能力而开发出来的一类药物。这类化合物中的三种，即曲格列酮、罗西格列酮以及匹格列酮已经被批准用于治疗II型糖尿病。虽然这些化合物在开发时并不清楚它们的分子作用机制，直到90年代早期开始有证据表明噻唑烷二酮类药物作用于核受体PPAR-γ。最终证明这些分子是PPAR-γ的高亲和性配体，它们能够提高受体的转录活性。不受理论限制地，多种证据表明噻唑烷二酮类药物的抗糖尿病活性是通过它们与受体直接相互作用并随即调节PPAR-γ靶基因表达来实现。
本发明方法中用到的噻唑烷二酮类药物包括：(1)罗西格列酮；(2)匹格列酮；(3)曲格列酮；(4)萘格列酮(也被称为MCC-555或isaglitazone或neoglitazone)；以及(5)5-BTZD。
本发明用到的其它PPAR调节因子包括最近进入到临床实验的调节因子：(1)莫格列扎(PPARγ和α激动剂，Bristol-Myers/Merck)；(2)Galida替格列扎(PPAR γ和α激动剂，AstraZeneca)；(3)677954(PPAR γ，α，和δ激动剂，GlaxoSmithKline)；(4)MBX-102(PPARγ部分激动剂/拮抗剂，Metabolex)；(5)T131(PPARγ选择性调节因子，Tularik/Amgen)；(6)LY818(PPARγ和α部分激动剂，Eli Lilly/Ligand)；(7)LY929(PPARγ和α激动剂，Eli Lilly/Ligand)；和(8)PLX204(PPARγ，α，和δ激动剂，Plexxikon)。参见，例如BioCentury，June 14，2004。其它PPAR调节因子包括LY 519818、L-783483、L-165461和L-165041。
此外，可以作为胰岛素敏化剂的非噻唑烷二酮类药物包括但不限于：(1)JT-501(JTT501、PNU-1872、PNU-716-MET-0096、或PNU 182716：4-(4-(2-(5-甲基-苯基-噁唑-4-yl)乙氧基)苯甲基)异噁唑烷-3，5-二酮)；(2)KRP-297(5-(2，4-二氧杂噻唑烷基-5甲基)-2甲氧基-N-(4-(三氟甲基)苯基)甲酰胺或5-((2，4-二氧基-5-噻唑烷基)甲基)-2-甲氧基-N-((4-(三氟甲基)苯基)甲基)苯甲酰胺)以及(3)法格立他扎(L-酪氨酸，N-(2-苯甲酰苯基)-o-(2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)乙基)或者N-(2-苯甲酰苯基)-O-(2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)乙基-L-酪氨酸，或者(S)-2-(2-苯甲酰苯氨基)-3-(4-12-(5-甲基-2-苯基-噁唑-4-基)-乙氧基苯基)丙酸，或GW2570或GI-262570)。
其它试剂也具有PPAR调节因子活性，例如具有PPAR-γ、SPPAR-γ、和/或PPAR-α/δ激动剂活性。其实例为：(1)AD5075(5-(4-(2-羟基-2-(5-甲基-2-苯基-噁唑-4-基)乙氧基)苯甲基)-噻唑烷-2，4二酮)；(2)R 119702(或Cl1037或CS011)；(3)CLX-0940(过氧化物酶体增殖物激活受体α激动剂/过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂)；(4)LR-90(2，5，5-三(4-氯苯基)-1，3-二恶烷-2-羧酸，PPARα/γ激动剂)；(5)CLX-0921(PPARγ激动剂)；(6)CGP-52608(PPAR激动剂)；(7)GW-409890(PPAR激动剂)；(8)GW-7845(2((S)-1-羧基-2-(4-(2-(5-甲基-2-苯基噁唑-4-基)-乙氧基)-苯基)-乙氨基)-苯甲酸甲酯，PPAR激动剂)；(9)L-764406(2-苯磺酰基甲基-3-氯喹喔啉，PPAR激动剂)；(10)LG-101280(PPAR激动剂)；(11)LM-4156(PPAR激动剂)；(12)Risarestat(CT-112，(+)-5-(3-乙氧基-4-(戊氧基)苯基-2，4-噻唑烷二酮，醛糖还原酶抑制剂)；(13)YM440(PPAR激动剂)；(14)AR-H049020(PPAR激动剂)；(15)GW 0072((+)-(2S，5S)-4-(4-(5-((二甲苯氨基甲酰)甲基)-2-庚基-4-氧噻唑烷-3-基丁基)苯甲酸；(16)GW 409544(GW-544GW-409544)；(17)NN2344(DRF2593)；(18)NN622(DRF2725)；(19)AR-H039242(AZ-242)；(20)GW 9820(非诺贝特)；(21)GW 1929(N-(2-苯甲酰苯基)-O-(2-(甲基-2-吡啶基氨基)乙基)-L-酪氨酸，又名GW2331，PPAR激动剂)；(22)SB219994((S)-4-(2-(2-苯并噁唑甲基氨基)乙氧基-α-(2，2，2-三氟乙氧基)苯丙酸或3-(4-(2-(N-(2-苯并噁唑)-N-甲基氨基)乙氧基)苯基)-2(S)-(2，2，2-三氟乙氧基)丙酸或苯丙酸，4-(2-(2-苯并噁唑甲基氨基)乙氧基)-α-(2，2，2-三氯乙氧基)-，(αS)-，PPARα/γ激动剂)；(23)L-796449(PPARα/γ激动剂)；(24)非诺贝特(丙酸，2-[4-(4-氯甲苯基)苯氧基]-2-甲基-，1-甲基乙基酯，又名TRICOR，LIPCOR，LIPANTIL，LIPIDIL MICRO PPARα激动剂)；(25)GW-9578(PPARα激动剂)；(26)GW-2433(PPARα/γ激动剂)；(27)GW-0207(PPAγ激动剂)；(28)LG-100641(PPARγ激动剂)；(29)LY-300512(PPARγ激动剂)；(30)NID525-209(NID-525)；(31)VDO-52(VDO-52)；(32)LG 100754(过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂)；(33)LY-510929(过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂)；(34)贝沙罗汀(4-(1-(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氢化-2-萘基)乙基)苯甲酸，又名TARGRETIN，TARGRETYN，TARGREXIN，也称为LGD1069，LG100069，LG1069，LDG1069，LG69，RO264455)；以及(35)GW-1536(PPARα/γ激动剂)。
在本发明的一些方面，可以通过本发明中的可移植装置来输运放射性同位素。例如本领域中公知的，可以使用各种放射疗法来治疗癌症和其它病理症状，例如，Harbert，“Nuclear Medicine Therapy”，New York，Thieme Medical Publishers，1987，pp.1-340中记载的方法。熟知这些手段的临床医师能够轻易地将本申请中的可移植装置应用到适用于放疗方法的手段中去以减轻或者治疗疾病。
在一些方面，放射性同位素包括但不限于，具有短半衰期的同位素和同位素的盐：例如Y-90、P-32、I-131、Au 198。因此在本发明的一方面，可移植的装置可用于输运放射性同位素。
已知放射性同位素、药物、毒素可以与抗体或者抗体片段偶联，所述抗体或者抗体片段可以特异性地结合到癌细胞产生的标志物上或者与癌细胞结合的标志物上，从而这样的抗体偶联物可以用于向肿瘤位点靶向输运放射性同位素、药物或毒素，进而提高它们的治疗效果并使副作用最小化。这些试剂和方法的例子可参见，Wawrzynczak和Thorpe(in Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer，L.M.Franks and N.M.Teich，eds，Chapter 18，pp.378-410，Oxfor University Press，Oxford，1986)。Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer(C.-W.Vogel，ed.，3-300，Oxford University Press，New York，1987)，Dillman，R.O.(CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1：357，CRC Press，Inc.，1984)，Pastan等人(Cell 47：641，1986)，Vitetta等人(Science 238：1098-1104，1987)和Brady等人(Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.13：1535-1544，1987)。其它使用免疫偶联物用于癌症和其它形式的治疗也已经记载在Goldenberg的美国专利第4,331,647、4,348,376、4,361,544、4,468,457、4,444,744、4,460,459、4,460,561和4,624,846号中，以及Rowland的美国专利第4,046,722中，以及Rodwell等人的美国专利第4,671,958号中，和Shih等人的美国专利第4,699,784号中，所有这些专利在此都通过引用方式并入到本申请中以作参考。
其它本发明所用的噻唑烷二酮类药物和非噻唑烷二酮类药物的胰岛素敏化剂已经记载在例如以下文献中：Leffand Reed(2002)Curr.Med.Chem.-Imun.，Endoc.，& Metab.Agents 2：33-47；Reginato等人，(1998)J.Biol.Chem.，27832679-32654；Way等人，(2001)J.Biol.Chem.27625651-25653；Shiraki等人，(2005)JBC Papers in Press，2005年2月4日所发表的手稿M500901200；美国专利第4,703,052、6,008,237、5,594,016、6,838,442、6,329,423、5,965,589、6,677,363、4,572,912、4,287,200、4,340,605、4,438,141、4,444,779、4,572,912、4,687,777、4,725,610、5,232,925、5,002,953、5,194,443、5,260,445、6,300,363、6,034,110和6,541,493号；美国专利申请公开第2002/0042441、2004/0198774和2003/0045553号；欧洲专利第0139421和0332332号；PCT专利申请公开第WO 95/35314、WO 00/31055、WO 01/3640号。所有这些文献在此都通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。
萘格列酮
本发明方法所用的一种噻唑烷二酮类PPAR调节因子是萘格列酮(netoglitazone)(5-[{6-(2-氟苄基)氧基-2-萘基}甲基]-2，4-噻唑烷二酮；MCC-555)。有关萘格列酮的结构和制备方法，以及萘格列酮在本发明中的各种使用形式都已经记载在例如以下文献中：美国专利第5,594,016、6,541,493、6,541,493、6,838,442号；美国专利申请第2004/0198774和2003/045553号；PCT专利申请第WO00/31055、WO 01/36401、WO 03/018010，以及WO 00/73252号；日本专利未经审查的公开(KOKAI)第(Hei)6-247945/1994号和(Hei)10-139768/1998号；日本专利案2001172179和2003040877；以及Reginato et al.(1998)J.Biol.Chem.273：32679-32684；所有这些文献在此都以引用方式全文并入到本申请中以作参考。
已有报道表明，萘格列酮在降低血糖、胰岛素以及甘油三酯水平方面比吡格列酮和曲格列酮效果更好，并且它的药效是罗格列酮的三倍多。萘格列酮的活性表现出环境特异性，即在一些细胞类型中，它是PPAR-γ的完全激动剂，而在另一些细胞中，它却是部分激动剂或拮抗剂。此外，有报道表明它也能调节PPAR-α和δ。参见美国专利申请公开第2004/0198774号。
药物形式
本发明所用的有些化合物在结构上可以包含一个或者多个不对称碳原子，这些化合物包括TZD PPAR调节因子例如萘格列酮。此外，也可以使用本发明所记载的一种或者多种基质来输运这些化合物的纯立体化学异构体以及它们的消旋体。纯立体化学异构体可以通过本领域的已知技术来获得。非对映异构体可以通过物理分离方法来进行分离，例如分步结晶和色谱技术分离，对映异构体可以通过选择性结晶非对映异构体与光学活性的酸或光学活性的碱形成的盐来进行分离，或通过手性色谱方法进行分离。纯立体异构体也可以通过以合适的纯立体异构体单体作为起始材料来合成获得，或通过立体专一性的反应获得。
本发明所用的一些化合物可以具有各种单独的异构体，例如顺式和反式，以及各种α和β连接形式(位于图形平面的下面和上面)。此外，在根据本发明的方法制备这些化合物的过程中会生成立体异构体的混合物，这些异构体可以通过传统技术如制备色谱来进行分离。这些化合物可以制备成纯立体异构体，或者制备成由一些可能存在的异构体组成的外消旋形式的混合物。非外消旋形式可以通过合成或者拆分方法获得。这些化合物可以例如通过标准的方法拆分成组成它们的对映异构物，例如通过成盐方式拆分成非对映异构体对。这些化合物也可以通过先共价连接手性助剂然后色谱分离和/或结晶分离最后移除手性助剂的方法来进行拆分。另外，化合物也可以通过手性色谱进行分离。除非特别指明，本发明基质所包含的生物活性剂涵盖所有这样的异构体或立体异构体本身，也涵盖顺反异构体混合物，以及非对称异构体混合物以及对映体(光学异构体)外消旋混合物。
此外，本发明基质输运的或含有的化合物可以制备成多晶形物。例如，本发明所使用的胰岛素敏化剂可以以多晶形物型式存在，任何或者所有这些胰岛素敏化剂的多晶形物形式都可以用在本发明中。药物中的多晶形可以改变药物的稳定性、溶解性和溶解速率，从而使某个特定药物的不同多晶形物之间具有不同的治疗效果。术语“多晶形”包括不同的物理形式、晶体形式、以及晶体形式/液体晶体形式/非晶体(无定形)形式。治疗用化合物的多晶型具有非常重要的意义，这一点可以通过以下现象加以证实，例如很多抗生素、抗菌药物、镇定剂等药物都具有多晶型物，并且特定药物的某些/某一种多晶形物呈现出优越的生物利用度进而比其它多晶形物具有更高的活性。例如，舍曲林、夫仑替唑、雷尼替丁、磺胺噻唑、以及吲哚美辛都是具有多晶形物的药品。
本发明的一些实施方式包括萘格列酮的一种多晶型物的使用。萘格列酮可以制备成各种多晶型。本发明方法可以单独使用或者组合使用萘格列酮的任何多晶型。因此，本发明的方法包括使用任意或者所有萘格列酮多晶形物进行的相关研究，以及使用任意或者所有萘格列酮多晶形物进行的筛选和治疗，以及基于这些多晶形物的组合物和试剂盒。
萘格列酮的多晶型形式包括A，B，C，D，E和无定形晶体形式，PCT公开第WO 01/36401号以及美国专利第6,541,493号已经记载这些晶体形式；例如，PCT申请公开第WO 01/36401号中记载了E晶体形式。
本申请此处记载的一些化合物可以存在氢原子连接的双键在不同连接点之间发生迁移的现象，这称为互变异构体。互变异构体的一个例子是羰基(例如酮)和它的烯醇形式，通常称为酮-烯醇互变异构体。单个的互变异构体以及其混合物均在本发明的范围之内。
药物前体是在给药时或给药后能够转化为所需化合物的化合物。本发明中的药物前体以及药物前体的活性代谢产物均在本发明化合物的范围内。
本发明方法中的其它有用试剂包括但不限于：
1.双胍类药物，其可以抑制肝的葡萄糖合成和提高葡萄糖吸收。双胍类药物的实例包括二甲双胍，例如(1)1，1-二甲双胍(例如，Metformin-DepoMed；Metformin-Biovail Corporation，或METFORMIN GR(二甲双胍胃残留聚合物))；和(2)盐酸二甲双胍(N，N-二甲基双胍盐酸盐，也称为LA6023、BMS 207150、GLUCOPHAGE、或GLUCOPHAGE XR)。
2.α糖苷酶抑制剂，其可以抑制α糖苷酶从而延缓碳水化合物的消化。未消化的碳水化合物随后在肠道中分解从而降低餐后血糖的峰值。α糖苷酶抑制剂的实例包括但不限于：(1)阿卡波糖(D-葡萄糖，O-4，6-双脱氧-4-(((1S-(1α，4α，5β，6α))-4，5，6-三羟基-3-(羟甲基)-2-环己稀-1-基)氨基)-α-D-吡喃葡萄糖-(1-4)-O-α-D-吡喃葡萄糖-(1-4)-，也称为AG-5421、Bay-g-542、BAY-g-542、GLUCOBAY、PRECOSE、GLUCOR、PRANDASE、GLUMIDA，或ASCAROSE)；(2)米格列醇(3，4，5-哌啶三醇，1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-，(2R(2α，3β，4α，5β))-或(2R，3R，4R，5S)-1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3，4，5-哌啶三醇，也称为BAY1099、BAYM 1099、BAY-m-1099、BAYGLITOL、DIASTABOL、GLYSET、MIGLIBAY、MITOLBAY、PLUMAROL)；(3)CKD-711((0-4-脱氧-4-((2，3-环氧-3-羟甲基-4，5，6-环己三醇-1-基)氨基)-α-b-吡喃葡萄糖-(1-4)-α-D-吡喃葡萄糖)；(4)乙格列酯(4-(2-((2R，3R，4R，5S)-3，4，5-三羟基-2-(羟甲基)-1-哌啶基)乙氧基)苯甲酸乙酯，也称为BAYo 1248或MKC 542)；(5)MOR 14(3，4，5-哌啶三醇，2-(羟甲基)-1-甲基-，(2R-(2α，3β，4α，5β))-，也称为N-N-甲基脱氧野尻霉素或N-甲基吗啉)；以及(6)伏格列波糖(3，4-双脱氧-4-((2-羟基-1-(羟甲基)乙基)氨基)-2-C-(羟甲基)-D-表氧肌醇或D-表氧肌醇，3，4-双脱氧-4--((2-羟基-1-(羟甲基)乙基)氨基)-2-C-(羟甲基)-，也称为A 71100、AO 128、BASEN、GLUSTAT、VOGLISTAT)。
3.胰岛素，包括普通胰岛素，短效、中效和长效胰岛素，可注射、不可注射或吸入胰岛素，经皮给药胰岛素，组织选择性胰岛素，磷酸葡糖苷细胞分裂素(D-手性肌醇)，胰岛素类似物如和胰岛素天然氨基酸序列有细微差异的胰岛素分子以及模拟胰岛素功能的小分子(胰岛素拟态药物)，以及内含体调节因子。胰岛素的实例包括但不限于：(1)Biota；(2)LP 100；(3)(SP-5-21)-氧二(1-吡咯烷二硫代羧酸-S，S’)，(4)天冬胰岛素(人胰岛素(28B-L-天冬氨酸)或B28-天冬胰岛素，也称为X14胰岛素，INA-X14，NOVORAPID，NOVOMIX，或NOVOLOG)；(5)地特胰岛素(人29B-(N6-(1-十四烷酰基)-L-赖氨酸)-(1A-21A))，(1B-29B)-胰岛素或NN 304)；(6)赖脯人胰岛素(“28B-L-赖氨酸-29B-L脯氨酸人源胰岛素，或Lys(B28)，Pro(B29)人员胰岛素类似物，也称为lys-pro胰岛素，LY 275585，HUMALOG，HUMALOG MIX 75/25，或HUMALOG MIX 50/50)；(7)甘精胰岛素(人源(A21-甘氨酸，B31-精氨酸，B32-精氨酸)胰岛素HOE901，也称为LANTUS，OPTISULIN)；(8)结晶性胰岛素锌混悬液(Ultralente)，也称为HUMULIN U或ULTRALENTE(9)胰岛素锌混悬液(Lente)，70％晶体和30％无定形胰岛素混悬液，也称为LENTE ILETIN II，HUMULIN L或NOVOLINL；(10)HUMULIN 50/50(50％低精蛋白胰岛素和50％胰岛素注射液)；(11)HUMULIN 70/30(70％低精蛋白胰岛素NPH和30％胰岛素注射液)，也称为NOVOLIN 70/30，NOVOLIN 70/30笔芯注射剂，NOVOLIN 70/30载药注射器；(12)低精胰岛素混悬液如NPH ILETIN II，NOVOLIN N，NOVOLIN N笔芯注射剂，NOVOLIN N载药注射器，HUMULIN N；(13)普通胰岛素注射剂例如ILETIN II Regular，NOVOLIN R，VELOSULIN BR，NOVOLIN R笔芯注射剂，NOVOLIN R载药注射器，HUMULIN R或Regular U-500(浓缩型)；(14)ARIAD；(15)LY 197535，(16)L-783281；以及(17)TE-17411。
4.胰岛素分泌调节因子，例如(1)胰高血糖激素样肽-1(GLP-1)及其拟态药物；(2)葡萄糖依赖性促胰岛素胜肽(GIP)及其拟态药物；(3)毒蜥外泌肽及其拟态药物；(4)二肽酰肽酶(DPP或DPPIV)抑制剂如(4a)DPP-728或LAF 237(2-氰基吡咯烷，1-(((2-((5-氰基--2-吡啶基)氨基)乙基)氨基)乙酰基)，也称为NVP-DPP-728，DPP-728A，LAF-237)；(4b)P3298或P32/98(二(3N-((2S，3S)-2-氨基-3-甲基-戊酰基-)-1，3，-噻唑烷)富马酸酯)；(4c)TSL 225(色氨酰-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)；(4d)缬氨酰吡咯烷(valpyr)；(4e)1-氨烷基异喹啉酮-4-羧酸酯及其类似物；(4f)SDZ 272-070(1-(L-缬氨酰)吡咯烷)；(4g)TMC-2A，TMC-2B，或者TMC-2C；(4h)二肽氰基衍生物(2氰吡咯烷类)；(4i)CD26抑制剂；以及(4j)SDZ 274-444；(5)胰高血糖素拮抗剂如AY-279955；和(6)糊精激动剂，包括但不限于，普兰林肽(AC-137，醋酸普兰林肽制剂，tripro-糊精或者醋酸普兰林肽)。
5.胰岛素促分泌因子，其可以通过刺激胰腺β细胞促进胰岛素合成，例如：(1)米格列奈，((2(S)-顺)-8氢化-γ-氧-α-(苯甲基)-2H-异吲哚-丁酸钙盐，也称为米格列奈钙水合物，KAD1229，或S21403)；(2)Ro 34563；(3)那格列奈(反N-((4-(1-甲基乙基)环己基)羰基)-D-苯丙氨酸，也称为A4166，AY4166，YM026，FOX988，DJN608，SDZ DJN608，STARLIX，STARSIS，FASTIC，TRAZEC)；(4)JTT 608(反-4-甲基-γ-环己酮丁酸)；(5)磺脲类如：(5a)氯磺丙脲(1-[(对氯苯基)磺基]-3-丙脲，也称为DIABINESE)；(5b)格列本脲(5-氯-N-[2-[4-[[[(环己基氨基)羰基]氨基]磺酰基]苯基]乙基]-2-甲氧基苯甲酰胺，也称为Glibeclamide，DIABETA，MICRONASE，GLYNASE PresTab，或DAONIL)；(5e)格列甲嗪(1-环己基-3-{4-[2-(5-甲基吡嗪-2-酰胺)-乙基]苯磺酰}脲，也称为GLUCOTROL，GLUCOTROL XL，MINODIAB或GLIBENESE)；(5f)格列美脲(1H-吡咯-1-甲酰胺，3-乙基-2，5-二氢-4-甲基-N-[2-[4-[[[[(4-甲基环己基)氨基]羰基]氨基]磺基]苯基-]乙基]-2-氧代-，反式-，也称为Hoe-490，或AMARYL)；(5g)乙酰苯磺酰环己脲(DYMELOR)；(5h)格列齐特(DIAMICRON)；(5i)格列太特(STATICUM)；(5j)格列喹酮(GLURENORM)；和(5k)格列索脲(DIABENOR)；(6)钾离子通道阻断剂包括但不限于，氯茴苯酸类如(6a)瑞格列奈((S)-2-乙氧基-4-(2-((3-甲基-1-(2-(1-哌啶基)苯基)丁基)氨基)-2-乙氧基)苯甲酸，也称为AGEE623，AGEE 623ZW，NN 623，PRANDIN或NovoNorm)；(6b)咪唑啉类；和(6c)α2肾上腺素受体拮抗剂；(7)垂体腺苷酸环化酶激活肽(PAcAP)；(8)血管活性肠肽(VIP)；(9)氨基酸类似物；和(10)葡糖激酶激活因子。
生长因子，例如：(1)类胰岛素生长因子(IGF-1，IGF-2)；(2)小分子神经营养素；(3)生长激素抑制素；(4)生长荷尔蒙释放肽(GHRP)；(5)生长荷尔蒙释放因子(GHRF)；和(6)人生长荷尔蒙片段。免疫调节因子如：(1)疫苗；(2)T细胞抑制因子；(3)单克隆抗体；(4)白介素1(IL-1)拮抗剂；和(5)BDNF。葡萄糖再吸收抑制因子，如美国专利申请案2003/0045553中所描述的那些。其它抗糖尿病制剂：(1)rHu-胰高血糖素；(2)DHEA类似物；(3)棕榈酰肉碱转移酶(CPT)抑制剂；(4)胰岛新生相关蛋白；(5)胰腺p淀粉样蛋白抑制剂和(6)UCP(非偶联蛋白)-2和UCP-3调节剂。
一方面，本发明的基质结构可用于诱发患者体内的免疫应答。因此，在一个实施方式中，基质可以以时间可控的方式释放抗原或者免疫原从而引发患者体内的免疫应答。这样的免疫应答可以产生保护性免疫，或者“预防接种”动物以使其免疫特定的抗原或者免疫原。在可替代的实施方式中，抗原或者免疫原可以连接到部分核酸基质(或凝胶或支架)上，或者连接到核酸基质-共聚物结构上。
本发明所用的其它的试剂包括，任何本领域公知的用于治疗血糖调节混乱和/或其并发症的试剂。这样的试剂包括但不限于，降胆固醇药剂如(i)HMG-CoA还原酶抑制剂(洛伐他汀、斯伐他汀和普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、利伐他汀和其它他汀类药物)，(ii)结合剂(消胆胺、考来替泊和交联葡聚糖的二烷基氨基烷基衍生物)，(iii)烟醇，烟酸或其盐形式，(iv)PPARα激动剂如非诺贝酸衍生物(二甲苯氧庚酸、降固醇酸、非诺贝特和苯扎贝特)，(v)胆固醇吸收抑制剂，例如β谷甾醇和(乙酰辅酶A：胆固醇乙酰转移酶)抑制剂例如甲亚油酰胺和(vi)丙丁酚；PPARδ激动剂例如WO97/97/28149中记载的那些；抗肥胖化合物如氟苯丙胺、右旋酚氟拉明、非尼拉敏、舒布硫胺、奥利斯特、神经肽Y5抑制剂、和β3肾上腺素受体激动剂；以及回肠胆汁酸转运体抑制剂。
药物类型
药物可以分为机制类药物，结构类药物，药理学效果药物以及其它基于化学或者生物学本质的药物，或者基于经验的药物。
机制类药物是基于药物的作用机制进行的分类，例如，作用于受体或者其它靶点的药物。例如，主要作用于自主神经系统的药物可分为胆碱受体激活药物、或胆碱酯酶抑制药物、或胆碱受体阻断药物、或肾上腺素受体激活药物、或肾上腺素受体阻断药物。
但是，如本领域所公知，如果药物通常并没有已知的靶点或者精确明晰的作用机制，则可以根据药物其它方面的相似性对其进行分类，例如化学结构上的相似性被认为对于药物的作用非常重要。这种相似性包括结构组分、光学异构、晶体结构等等。
药物也可以根据它们主要的药理作用进行分类，例如，降脂药物、抗抑郁类药物、镇静药物等等。通过体外和/或体内研究，第二种药物可能和第一种药物分为同一类；在一些实施方式中，可以通过结构分析来预测药物的相同或者相似作用机制。
在一些实施方式中，药物根据它们在一种或者多种体外、细胞、组织、器官或者动物模型中的效果来进行分类。这种效果可以是分子水平的、分子水平之上的、细胞水平的、组织水平的、器官水平的或者个体水平的效果，或者它们的组合。在一些实施方式中，药物根据它们在一种或者多种动物模型中的效果以及基因型和应答之间的相关性来进行分类。例如，药物A可以在基因型为X(例如在一个或者多个SNP位点上的基因型)的哺乳动物例如大鼠、鼠或者灵长类动物中引起M应答，以及可以在基因型Y的灵长类动物中引起N应答。如果药物B发现在基因型为X的哺乳动物中引起M反应，在基因型为Y的哺乳动物中引起N反应，那么药物B可以被认为和药物A是一类药物。应当理解，这样的分类将会在很大程度受到基因型中遗传变异的数量，以及检测到的应答的数量等条件的限制。动物模型使得能够进行大范围的药物测试，以及使用更激进的参数作为反应的测量指标，并且相对于人体实验，其还可以在相对更短的时间内建立更广泛的数据库。
在其它实施方式中，可以通过药物在模型体系中的表达特征来对药物进行分类。例如，可以在动物模型中对一类药物中的所有或者大部分或者部分药物进行测试，其中已知所述类别的药物对人体有效(例如降低心脏病风险的抑制素)。服用药物的动物对于药物应答可能会表现出一致的基因表达特征(例如一个或一组与抗炎症活性相关的基因表达水平升高)。其它类别的其它药物可以在动物模型中进行测试。而特定类型的药物的表达特征可能具有相关性。新药可以根据它在一种或者多种动物模型中的表达特征来对其进行分类。该类别中的一种或者多种药物在一种或者多种遗传变异和药物应答之间的相关性可用于帮助调整新药的使用，例如，新药使用在研究中(例如，临床试验)和/或临床环境。
在一些实施方式中，一类药物中的新药首先在模型中进行测试，例如，该类药物中的其它药物已经测试过的动物模型，可以使用这种动物模型中的特定基因型来预测动物对新药的应答。动物实验的结果可有限地用于预测人体中的遗传变异和新药应答之间的相关性。可以开发新的动物模型也可以使用已有的动物模型。动物模型可以是特定生理、生化或者代谢状态的模型，例如，疾病或者病理状态。也可以使用健康或者超健康状态的模型(例如，延缓衰老模型)。
可以对药物进行进一步的分类或分为同类中的亚类，例如通过它们的给药方式(例如，静脉注射、肌肉注射、皮下注射、眼用、吸入、口服、舌下、栓剂，微泵给药等等)，剂型(例如快速作用、持续释放、肠溶型等等)，吸收和输运到的作用位点，代谢模式(例如，通过I期反应如通过肝微粒体P450系统及其亚类氧化代谢的药物、通过非微粒体机制及其亚类氧化代谢的药物、通过还原反应、通过水解反应及其亚类代谢的药物；通过II期反应例如糖脂化、乙酰化、硫醇尿酸形成、硫酸结合、N-，O-，以及S-甲基化、转硫作用，以及它们的组合反应代谢的药物)、代谢产物和/或副产物以及它们的结构和/或功能、药代动力学、药效动力学、药物消除等因素来进行分类。
应当理解，这些分类只是示例性的，事实上可以使用任何可以提高该类药物效果可预测性的方法来进行分类。进一步的药物分类体系以及每个类别所包含的特定药物可以从本领域的现有技术中获得。参见，例如，Anderson，Philip O.；Knoben，James E.；Troutman，William G，eds.，Handbook of Clinical Drug Data，Tenth Edition，McGraw-Hill，2002；Pratt and Taylor，eds.，Principles of Drug Action，Third Edition，Churchill Livingston，New York，1990；Katzung，ed.，Basic and Clinical Pharmacology，Ninth Edition，McGraw Hill，20037ybg；Goodman and Gilman，eds.，The Pharmacological Basis of Therapeutics，Tenth Edition，McGraw Hill，2001；Remingtons Pharmaceutical Sciences，20th Ed.，Lippincott Williams & Wilkins.，200；Martindale，The Extra Pharmacopoeia，Thirty-Second Edition(The Pharmaceutical Press，London，1999)；所有这些文献在此通过引用方式全文并入到本申请中以作参考。
此处记载的方法和组合物的对象包括了任何合适类别的药物，只要该类别中至少有一种药物可以用来进行基因型分析和相关性研究。这类药物包括此处记载的胰岛素敏化剂，例如PPAR调节因子。因此，在一些实施方式中，本发明提供了用于预测个体对胰岛素敏化剂例如PPAR调节因子的应答的方法，该方法基于个体的基因型以及基因型和对另一胰岛素敏化剂例如PPAR调节因子的应答研究的结果进行预测。在一些实施方式中，个体对胰岛素敏化剂例如PPAR调节因子的应答结果可以被用来预测是否可以使用该个体来进行临床试验。在一些实施方式中，个体对胰岛素敏化剂例如PPAR调节因子的应答结果可以被用来调节另一种胰岛素敏化剂例如PPAR调节因子的个体给药方案。在一些实施方式中，这样的调节发生在临床试验中。在一些实施方式中，个体对胰岛素敏化剂例如PPAR调节因子的应答结果被用来预测决定该个体是否应该用其它药物而不是胰岛素敏化剂来进行治疗，或者在一些实施方式中，使用PPAR调节因子进行治疗。
药物作用机制类型
作为可以用其所属类别的一种药物所进行的基因型和相关性研究获得的结果来预测该类别中的另一种药物效果的一个非排他的示例性的药物类别是，用于治疗糖尿病的机制类药物(包括PPAR调节因子)。这类药物也可以用来说明如何将药物进一步分成亚类，例如通过给药方式来作进一步的分类。例如，可以将胰岛素和胰岛素类似物配制成适用于注射给药、鼻腔喷雾给药、经皮给药、口服给药或者吸入给药。每种类型的剂型都具有独特的响应特征和相关的遗传变异。表10给出了通过作用机制对这些药物进行分类的例子，同时也列出这些机制类药物中的代表性药物。表10：用于治疗糖尿病的药物类型
Figure BPA00001342885900781
Figure BPA00001342885900791
Figure BPA00001342885900801
在其它实施方式中，本发明的方法或组合物也同时用到了，用于治疗血液中胆固醇和/或甘油三酯水平异常的机制类药物。这些机制类药物包括，他汀类药物、苯氧酸类药物、胆固醇吸收抑制剂、烟酸衍生物、胆汁酸结合剂、胆固醇酯转运蛋白，脂质逆向传送通路激活剂、抗氧化剂/血管保护剂、乙酰辅酶A胆固醇乙酰转移酶抑制剂、过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂、微粒体甘油三酯转运蛋白抑制剂、鲨烯合酶抑制剂、脂蛋白脂酶激活因子、脂蛋白拮抗剂，以及胆酸再吸收抑制剂。表11给出了通过作用机制对这些药物进行分类的例子，同时也列出这些机制类药物中的代表性药物。表11：治疗血液中胆固醇和/或甘油三酯水平异常的药物类型
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Figure BPA00001342885900821
在其它实施方式中，本发明的方法或组合物也同时使用了用于治疗抑郁症的机制类药物。已有的或者正处在开发中的抗抑郁药物可以通过各种作用机制来产生治疗效果，例如，选择性5-羟色胺再吸收阻抗剂(SSRIs)、5-羟色胺能药剂/去甲肾上腺素药剂、5-羟色胺/去甲肾上腺素/多巴胺能药剂、三环抗抑郁药剂、单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)、去甲肾上腺素/多巴胺能药剂、5-羟色胺拮抗剂、5-羟色胺激动剂、P物质拮抗剂、β3肾上腺素受体激动剂。表12给出了通过作用机制对这些药物进行分类的例子，同时也列出这些机制类药物中的代表性药物。表12：治疗抑郁症的药物分类
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Figure BPA00001342885900831
Figure BPA00001342885900841
在其它实施方式中，本发明方法或组合物也同时使用了，用于治疗多发性硬化的机制类药物。这些药物可以分为，例如，重组干扰素、修饰肽配体、化疗药剂、免疫抑制剂、皮质激素类、单克隆抗体、趋化因子受体拮抗剂、AMPA受体拮抗剂、重组人源胶质生长因子、T细胞受体疫苗，以及口服免疫调节剂。表13给出了通过作用机制对这些药物进行分类的例子，同时也列出这些机制类药物中的代表性药物。表13：治疗多发性硬化的药物分类
Figure BPA00001342885900842
Figure BPA00001342885900851
在其它实施方式中，本发明的方法或组合物也同时使用了，用于治疗帕金森氏病的机制类药物。这些类型的药物包括，多巴胺前体、多巴胺激动剂、COMT抑制剂、MAO-B抑制剂、抗谷氨酸能药物、抗胆碱能药物、混合多巴胺能药物、腺苷酸A2a拮抗剂、α2肾上腺素拮抗剂、抗凋亡药剂、生长因子刺激因子、细胞替代物。表14给出了通过作用机制对这些药物进行分类的例子，同时也列出这些机制类药物中的代表性药物。表14：用于治疗帕金森氏病的药物类型
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Figure BPA00001342885900861
上述分类只是示例性的。应当理解，一种药物类型并不一定限制在治疗单种疾病的药物，一种特定的机制类型可以包含许多治疗各种疾病的药物成分。例如，MAO-B抑制剂可以同时治疗帕金森氏病和抑郁症；又例如，他汀类药物对于治疗异常脂血症有效同时也被普遍用于治疗炎症主导的疾病，例如，多发性硬化和其它疾病。
通过作用机制对药物进行进一步的分类属于本领域的现有技术。通常可以通过结构来作进一步的分类。适用于本发明的方法和组合物的非排他性的药物类型的实例，以及这些药物类型中的代表性药物，包括如下：
镇静催眠药物，其包括可以与GABAA受体结合的药物，例如苯二氮平类药物(包括阿普唑仑、氨二氮草、安定羧酸、氯硝西泮、安定、艾司唑仑、氟胺安定、哈拉西泮、氯羟安定、咪达唑仑、去甲羟基安定、夸西泮、羟基安定、三唑仑)，巴比妥类药物(包括，异戊巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥)以及非苯二氮平类药物(如氟马西尼)。其它通过非GABA能机制起作用的镇静催眠药物如通过与5羟色胺和多巴胺能受体相互作用起作用的药物，包括丁螺环酮、伊沙匹隆、吉哌隆、和坦度螺酮。作用机制并不十分清楚的老药，包括水合氯醛、乙氯维诺、甲丙安酯和三聚乙醛。
在一些实施方式中，与GABA受体相互作用的镇静催眠药物，例如苯二氮平类药物和非苯二氮平类药物，可以根据它们与GABAA受体发生相互作用的亚基来进一步分类，例如，α(该类可进一步分为六种亚类，包括α-1，2，3，和5)，β(进一步分为四种不同类型)，γ(三种不同类型)，δ，ε，π，ρ等等。这样的分类可以进一步限定遗传变异和特定的与特定亚类相互反应的镇静催眠药物响应之间的关联性，并可以预测新的可以作用于相同亚类受体的镇静催眠药物。
鸦片类止痛剂和鸦片受体拮抗剂。绝大部分当前使用的鸦片类药物主要通过与μ鸦片受体作用来发挥效果。但是，相互作用同样发生在δ和κ受体。与镇静催眠类药物类似，在一些实施例中鸦片类受体进一步根据它们主要作用的受体亚型来进行分类，根据药物与它相互作用的受体，进一步限定了药物应答和遗传变异之间的关联性，从而提高了新药的可预测性。鸦片类止痛剂包括阿芬他尼、丁丙诺啡、布托啡诺、可待因、地佐辛、芬太奴、氢吗啡酮、左醋美沙朵、左旋吗泛、杜冷丁、美沙酮、硫酸吗啡碱、纳布啡、羟考酮、羟氢吗啡酰、戊唑辛、丙氧芬、雷米芬太尼、舒芬太尼、曲马多；混合止痛剂例如可待因/醋酸氨基诺芬、可待因/阿司匹林、氢可酮/醋酸氨基诺芬、氢可酮/布洛芬、羟考酮/醋酸氨基诺芬、羟考酮/阿司匹林、丙氧芬/阿司匹林或醋酸氨基诺芬。鸦片类拮抗剂包括纳美芬、纳洛酮、环丙甲羟二羟吗啡酮。镇咳药包括可待因、右美沙芬。
非甾体抗炎症药物主要通过抑制前列腺素合成起作用，例如，通过抑制COX-1，COX-2或者同时抑制两者。早期NSAIDS(例如水杨酸盐)对抑制的COX类型没有选择性，而新型的药物具有很好的选择性(例如COX-2抑制剂)。非选择性COX抑制剂包括，阿司匹林、乙酰水杨酸、水杨酸胆碱、双氯高灭酸、依托度酸、非诺洛芬、氟联苯丙酸、布洛芬、茚甲新、酮洛芬、克妥洛、水杨酸镁、甲氯灭酸盐、萘普酮、萘普生、恶丙嗪、保泰松、吡罗昔康、双水杨酯、水杨基水杨酸、水杨酸钠、硫代水扬酸钠、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬、阿扎丙酮、卡洛芬，以及托美汀。选择性COX-2抑制剂包括，塞来考昔、艾托考昔、美洛昔康、罗非考昔和伐地考昔。
组胺激动剂和拮抗剂可以根据受体亚型来进行分类。H1激动剂或部分激动剂包括2-(m-氟苯基)组胺，拮抗剂包括氯苯吡胺、莨菪碱、美吡拉敏、特非那定、阿司咪唑、和曲普立啶；其它拮抗剂(可以进一步通过它们的化学结构进行分类)包括乙醇胺、卡比沙明、乘晕宁、苯海拉明、扑尔敏；以及其它类型的拮抗剂包括赛庚啶、氯雷他定、塞替利嗪。H2激动剂包括S-(3-二甲氨基丙基)异硫脲、双咪硫胍、amthamine；以及拮抗剂(对治疗胃酸分泌有效)包括甲氰咪胺、甲胺呋硫、尼扎替丁和法莫替丁；H3激动剂包括R-α-甲基组胺、imetit和immepip，拮抗剂包括噻普酰胺、iodophenpropit和clobenpropit；及H4激动剂包括clobenpropit、imetit和氯氮平，拮抗剂包括噻普酰胺。可获得的制剂包括H1阻断剂氮卓斯丁、溴非尼腊明、布可利嗪、卡比沙明、塞替利嗪、扑尔敏、克立马丁、赛克利嗪、赛庚啶、地氯雷他定、乘晕宁、依美斯汀、非索非那定、羟嗪、甲哌噻庚酮、左卡巴司汀、氯雷他定、美克洛嗪、奥洛他定、苯茚达明、异丙嗪。
用于治疗哮喘的药物包括拟交感神经类药物(作为“止痛药”或支气管扩张剂使用)如沙丁胺醇、沙丁胺醇/异丙托铵、比托特罗、麻黄碱、肾上腺素、福莫特罗、异他林、异丙肾上腺素、左旋沙丁胺醇、间羟异丙肾上腺、吡布特罗、沙美特罗、沙美特罗/氟替卡松、特布他林；皮质类甾醇喷雾剂(作为控制剂或抗炎症药剂)如倍氯米松、布地缩松、氟尼缩松、氟替卡松、氟替卡松/沙美特罗、去炎松、白三烯抑制剂如孟鲁司特、扎鲁司特、齐留通、色甘酸钠和奈多罗米钠；甲基黄嘌呤类药物如异丙托铵；以及抗体类药物如奥马佐单抗。
治疗勃起功能障碍药物包括cGMP增强剂如昔多芬(伟哥)、他达拉非、伐地那非、前列地尔，以及多巴胺释放剂如阿朴吗啡。
用于治疗肠胃疾病的药物通过多种作用机制发挥作用。用于中和胃酸(解酸剂)的药物包括氢氧化铝凝胶剂、碳酸钙、氢氧化铝氢氧化镁混合制剂。作为质子泵抑制剂发挥作用的药物包括艾美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑。H2组胺阻抗剂包括甲氰咪胺、法莫替丁、尼扎替丁、甲胺呋硫。抗胆碱能类药物包括阿托品、颠茄酊、双环胺、甘吡咯溴、I型莨菪碱、甲基东莨菪碱、普鲁本辛、东莨菪碱、三乙己苯铵。粘膜保护剂包括迷索前列醇、硫糖铝。消化酶包括胰脂肪酶。治疗胃肠动力障碍药物和止吐剂包括阿洛司琼、西沙比利、多拉司琼、屈大麻酚、格拉司琼、甲氧氯普胺、昂丹司琼、普鲁氯嗪、替加色罗。用于肠胃道疾病的抗炎症药物包括巴柳氮、布地缩松、氢羟肾上腺皮质素、美沙拉嗪、甲基强的松、奥沙拉嗪、柳氮磺吡啶、英夫利昔单抗。止泻药包括水杨酸亚铋、地芬诺新、苯乙哌啶、白陶土果胶、洛哌丁胺。泻药包括比沙可啶、鼠李皮、蓖麻油、多库酯、甘油液、乳果糖、氢氧化镁[镁乳，Epson Salt]、甲基纤维素、矿物油、聚卡波非、聚乙二醇电解质溶液、欧车前、赭石。分解胆石的药物包括甘油辛酸酯癸酸酯混合物、熊去氧胆酸。
胆碱受体激活药物，其可以通过激活蕈毒碱受体和/或烟碱受体来产生作用，包括胆碱酯类(例如，乙酰胆碱、乙酰甲胆碱、氨基甲酸、碳酰胆碱和氨甲酰甲胆碱)和生物碱类(例如蕈毒碱、毛果芸香碱、洛贝林和烟碱)；通常作用于胆碱酯酶活性位点的胆碱酯酶抑制剂类药物包括含有四价氨基醇类(例如，滕喜隆)，氨基甲酸酯类和相关药剂(例如，新斯的明、毒扁豆碱、吡啶斯的明、安贝农以及癸二胺苯酯)，以及磷酸有机衍生物(例如，二乙氧膦酰硫胆碱、索曼、对硫磷、马拉硫磷)；胆碱受体阻滞类药物通常作为烟碱受体拮抗剂使用(进一步分为神经节阻滞剂，如六甲铵、梅坎米胺、四乙铵和咪噻吩；神经肌肉接点阻滞剂，参见骨骼肌缓和剂)或蕈毒碱受体拮抗剂(例如，阿托品、普鲁本辛、吡咯糖、哌仑西平、双环胺、托品酰胺、异丙托铵、苯托品、加拉明、美索曲明、AF-DX116、替伦折平、三己芬迪、达非那新、东莨菪碱、后马托品、赛克罗奇、辛托品、可利啶、异丙胺、甲哌佐酯、甲基东莨菪碱、奥芬铵、普鲁本辛、奥昔布宁、羟苄利明、丙哌凡林、托特罗定、三乙己苯铵)，它可以进一步根据蕈毒碱受体的主要作用位点再分为亚类，例如，M1、M2、M3、M4或M5，从而可以提高根据药物主要作用位点对遗传变异和新药响应之间关联性的预测。可用的抗毒蕈碱的药物制剂包括但不限于阿托品；颠茄生物碱、抽提物或酊剂；可利啶；赛克罗奇；双环胺；黄酮哌酯；吡咯糖；后马托品；1-莨菪碱；异丙托铵；甲哌佐酯；乙胺太林；甲基东莨菪碱；奥昔布宁；普鲁本辛；东莨菪碱；托耳替罗；三乙己苯铵；托品酰胺。可获取的神经节阻滞剂包括梅坎米胺和咪噻吩。可获取的胆碱酯酶再生剂包括磷定。
肾上腺素受体激活药剂以及其它拟交感神经类药物可根据它们所激活的受体类型进行分类，例如，α-1型(包括亚型A，B，D)，α-2型(包括亚型A，B，C)，β型(包括亚型1，2，3)，多巴胺型(包括亚型1，2，3，4，5)。典型的药物包括，肾上腺素、去甲肾上腺素、苯肾上腺素、甲氧胺、甲氧安福林、麻黄碱、丁苄唑啉、安非他命、甲基苯丙胺、苯甲吗啉、利他林、甲基去甲肾上腺素、多巴酚丁胺、可乐宁、BHT920、羟甲唑啉、异丙肾上腺素、丙卡特罗、特布他林、奥西那林、沙丁胺醇、羟苄羟麻黄碱、BRL37344、多巴胺、非诺多泮、溴麦角环肽、喹吡罗、右旋美托咪啶、酪胺、可卡因(多巴胺再吸收抑制剂)、安普尼定、溴莫尼定、羟苄羟麻黄碱、特布他林，以及莫达非尼。
肾上腺素受体拮抗剂药物可以按照与肾上腺素受体激动剂相同的方式来根据其受体类型进行分类，包括苄唑啉、地苯那明、哌唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪、苯氧苄胺、芬妥胺、萝芙素、育亨宾药、拉贝洛尔、卡维地洛、美托洛尔、醋丁洛尔、阿普洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、麦角胺、双氢麦角胺、坦舒罗新、阿夫唑嗪、吲哚拉明、呱胺甲尿啶、比索洛尔、纳多洛尔、甲磺胺心定、心得平、波引洛尔、美沙洛尔、布新洛尔。可获取的药剂包括：α阻滞剂多沙唑嗪、苯氧苄胺、芬妥胺、哌唑嗪、坦舒罗新、特拉唑嗪和苄唑啉；β阻滞剂醋丁洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、艾司洛尔、拉贝洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔；以及合成抑制剂甲基酪氨酸。
抗高血压药剂包括通过各种作用机制起效的药剂，它们与其它分类存在重叠。这些药剂包括，利尿剂如噻嗪类利尿剂和保钾利尿剂：作用于中枢神经系统的药物如甲基多巴和可乐宁；神经节阻滞药物，同上；肾上腺素神经阻滞药剂如胍乙啶、胍那决尔、苄二甲胍、异喹胍和利血平；肾上腺素受体拮抗剂如普萘洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、卡替洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、吲哚洛尔、醋丁洛尔、以及喷布洛尔、拉贝洛尔、卡维地洛、硝普钠、氯甲苯噻嗪、非诺多巴以及钙离子通道阻滞剂(例如，戊酸丙胺、地尔硫卓、氨氯地平、非洛地平、依拉地平、尼卡地平、硝苯吡啶和尼索地平)；ACE抑制剂如卡托普利、依那普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、莫昔普利、哌道普利、喹那普利、雷米普利、和群多普利；血管紧缩素受体阻滞剂如氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦和替米沙坦。可用药剂包括：β肾上腺素受体阻滞剂醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、艾司洛尔、拉贝洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔；中枢交感神经药物氯压定、胍那苄、胍法新、甲基多巴；节后交感神经末端阻滞剂胍那决尔、胍乙啶以及利血平；α1型选择性肾上腺素受体阻滞剂多沙唑嗪、哌唑嗪、特拉唑嗪；神经节阻滞剂梅坎米胺；血管扩张剂氯甲苯噻嗪、非诺多巴、肼苯哒嗪、米诺地尔、硝普盐；钙离子通道阻滞剂氨氯地平、地尔硫卓、非洛地平、依拉地平、尼卡地平、尼索地平、硝苯吡啶、戊酸丙胺；ACE抑制剂贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、哌道普利、喹那普利、雷米普利和群多普利；以及血管紧缩素受体阻滞剂坎地沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦和缬沙坦。
用于心绞痛的血管扩张剂包括，一氧化氮释放型药物如多元醇的硝酸酯、亚硝酸酯例如硝化甘油、三硝酸异山梨酯、亚硝酸戊酯、单硝酸异山梨酯；钙离子通道阻滞剂如氨氯地平、非洛地平、依拉地平、尼卡地平、硝苯吡啶、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、苄普地尔、地尔硫卓以及戊酸丙胺；和β肾上腺素受体阻滞剂(见上)。可用的药剂包括：硝酸盐和亚硝酸盐、亚硝酸戊酯、二硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯、硝化甘油；钙离子通道阻滞剂氨氯地平、苄普地尔、地尔硫卓、非洛地平、依拉地平、尼卡地平、硝苯吡啶、尼莫地平、尼索地平，和戊酸丙胺；以及β阻滞剂醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、艾司洛尔、拉贝洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔。
用于治疗心力衰竭的药物包括，强心剂例如地高辛；磷酸二酯酶抑制剂如氨力农和米力农；如前面所述的β肾上腺素受体刺激物；如下所述的利尿剂；如前面所述的ACE抑制剂；同时抑制ACE和中性内肽酶的药物如奥马曲拉；血管扩张剂如合成脑钠素(奈西立肽)和波生坦；如前面所述的β肾上腺素受体阻滞剂。可用的药剂包括：洋地黄地高辛；洋地黄抗体地高辛免疫抗原结合片断；类交感神经多巴酚丁胺和多巴胺；ACE抑制剂卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、喹那普利、雷米普利、和群多普利；血管紧缩素受体阻滞剂坎地沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦和缬沙坦。β阻滞剂比索洛尔、卡维地洛和美托洛尔。
治疗心律紊乱的药物包括阻断钠离子通道的药物如奎纳定、胺碘酮、丙吡胺、氟卡胺、利多卡因、美西律、morcizine、普鲁卡因胺、普罗帕酮和妥卡胺。β肾上腺素受体阻滞药物，如普萘洛尔、艾司洛尔、索他洛尔；通过延长动作电位延长有效不应期的药物如胺碘酮、溴苄胺、索他洛尔、多非利特、和伊布利特；钙离子通道阻滞剂如维拉帕米、地尔硫卓，和苄普地尔；以及类型的药剂如腺苷酸、洋地黄、镁离子和钾离子。可用的药剂包括：钠离子通道阻滞剂丙吡胺、氟卡胺、利多卡因、美西律、morcizine、普鲁卡因胺、普罗帕酮、硫酸奎尼丁、葡糖酸奎尼丁，以及聚半乳糖醛酸奎尼丁；β阻滞剂醋丁洛尔、艾司洛尔、普萘洛尔；动作电位延长药剂胺碘酮、溴苄胺、多非利特、伊布利特和索他洛尔；钙离子通道阻滞剂苄普地尔、地尔硫卓和维拉帕米；以及腺苷酸和硫酸镁。
利尿剂包括通过作为碳酸酐酶抑制剂来发挥作用的药物，如乙酰唑胺、双氯非那胺、甲醋唑胺；髓袢利尿剂如利尿磺胺、丁尿胺、托塞米、依他尼酸，以及汞类利尿药；抑制NaCl在远曲小管中运输的或者在某些情况下也作为碳酸酐酶抑制剂的药物，如苄氟噻嗪、苄噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、二氢氯噻、氢氟甲噻、吲达帕胺、甲氯噻嗪、美托拉宗、泊利噻嗪、喹乙宗，以及三氯噻嗪；保钾利尿剂如安体舒通、氨苯喋啶、依匹乐酮和阿米洛利；渗透性利尿剂如甘露醇；抗利尿荷尔蒙激动剂如抗利尿激素和去氨加压素；抗利尿荷尔蒙拮抗剂如锂和地美环素。可用的药剂包括乙酰唑胺、阿米洛利、苄氟噻嗪、苄噻嗪、布林唑胺、丁尿胺、氯噻嗪、氯噻酮、地美环素、双氯非那胺、多佐胺、依匹乐酮、依他尼酸、利尿磺胺、双氢克尿塞、氢氟噻嗪、吲达帕胺、甘露醇、甲醋唑胺、甲氯噻嗪、甲苯喹唑磺胺、泊利噻嗪、喹乙宗、安体舒通、托塞米、三氨蝶呤，以及三氯噻嗪。
5-羟色胺及影响5-羟色胺的药物包括5-羟色胺激动剂如氟苯丙胺和右旋酚氟拉明、丁螺环酮、舒马曲坦、普瑞博斯、替加色罗；5-羟色胺拮抗剂对氯苯丙氨酸、对氯苯异丙胺、和利血平；和5-羟色胺受体拮抗剂苯氧苄胺、赛庚啶、酮舍林、利坦色林，和昂丹司琼；5-羟色胺重吸收抑制剂，其已经记载在本申请的其它部分中。5-羟色胺受体激动剂包括阿莫曲坦、依立曲坦、夫罗曲普坦、那拉曲坦、利扎曲坦、舒马曲坦和佐米曲坦。
麦角生物碱在治疗例如周期性偏头痛等方面具有效果，其作用于各种靶点，包括α肾上腺素受体、5羟色胺受体和多巴胺受体。包括，溴麦角环肽、卡麦角林、培高利特、麦角新碱、麦角胺、麦角酰二乙胺，和二甲麦角新碱。可用的药剂包括双氢麦角胺、麦角新碱、麦角胺、酒石酸麦角胺，和甲基麦角新碱。
血管活化肽包括阿瑞匹坦、勃森坦。
类花生酸类药物包括前列腺素类、凝血素类和白三烯类药物。类花生酸调节剂药物包括前列地尔、比马前列素、卡波前列素氨丁三醇、地诺前列酮、依前列醇、拉坦前列素、迷索前列醇、孟鲁司特、曲伏前列素、曲前列环素、乌诺前列酮、扎鲁司特。其它类花生酸调节剂已经作为非甾体抗炎症药物(NSAIDs)记载在本申请的其它部分。
治疗急性酒精戒断药物包括苯甲二氮、氯羟安定、去甲羟基安定、硫胺素；预防酗酒类药物包括戒酒硫、纳曲酮；治疗急性甲醇或乙烯乙二醇中毒类药物包括乙醇、甲吡唑。
抗癫痫类药物包括卡巴咪嗪、氯硝西泮、氯卓酸钾、苯甲二氮、乙琥胺、乙苯妥英、非尔氨酯、磷苯妥英、加巴喷丁、拉莫三嗪、左乙拉西坦、氯羟安定、美芬妥英、甲苯巴比妥、奥卡西平、戊巴比妥钠、苯巴比妥米那、苯妥英、扑米酮、噻加宾、托吡酯、三甲双酮、丙戊酸。
全身麻醉剂包括地氟烷、右旋美托咪啶、苯甲二氮、氟哌利多、安氟醚、甲苄咪唑、氟烷、异氟醚、凯特明、氯羟安定、美索比妥、甲氧氟烷、咪达唑仑、一氧化二氮、普鲁泊福、七氟烷、硫戊巴比妥。
局部麻醉剂包括阿替卡因、苯坐卡因、布比卡因、苦味酸氨苯丁酯、氯普鲁卡因、可卡因、二丁卡因、达克罗宁、左旋布比卡因、利多卡因、利多卡因和依替卡因低共熔混合物、马比佛卡因、丙吗卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙美卡因、罗哌卡因、丁卡因。
骨骼肌弛缓药包括神经肌肉组织药物如阿曲库铵、顺-阿屈库铵、杜什库铵、氯二甲箭毒、氯化米哇库铵、巴夫龙、哌库溴铵、罗库溴铵、琥珀酰胆碱、筒箭毒碱、维库溴铵；肌肉弛缓药(解痉药)如巴氯芬、A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、肌安宁、氯苯甘醚、氯唑沙宗、环苯扎林、丹曲洛林、苯甲二氮、加巴喷丁、美他沙酮、美索巴莫、邻甲苯海明、利鲁唑和替扎尼定。
抗精神病药物包括阿立哌唑、氯丙嗪、氯氮平、氟非那嗪、氟非那嗪酯类、氟哌啶醇酯、洛沙平、美索达嗪、吗茚酮、奥氮平、羟哌氯丙嗪、匹莫齐特、氯吡嗪、普马嗪、喹硫平、利培酮、甲硫哒嗪、甲哌硫丙硫蒽、三氟拉嗪、三氟普马嗪、齐拉西酮；情绪稳定剂包括卡巴咪嗪、双丙戊酸钠、碳酸锂、和丙戊酸。
用于贫血症的药剂包括造血生长因子如阿法达贝泊汀、去铁胺、阿法依伯汀(促红细胞生成素，epo)、非格司亭(G-CSF)、叶酸、铁、奥普瑞白介素(白介素11)、培非司亭、沙莫司亭(GM-CSF)、以及维生素B12。
调整疾病的抗风湿药剂包括阿那白滞素、阿达木单抗、金诺芬、金硫葡萄糖、依那西普、金硫苹果酸钠、羟化氯喹、英夫利昔单抗、来氟米特、甲氨蝶呤、青霉胺、硫氮磺胺吡啶。
用于治疗凝血功能障碍的药物包括阿昔单抗、阿替普酶重组片段、氨基己酸、茴茚二酮、抗血友病因子[因子VIII，AHF]、抗抑制子凝血复合物、抗凝血酶III、抑蛋白酶肽、阿加曲班、比伐卢定、西洛他唑、氯吡格雷、凝血因子VIIa重组片段、达替肝素、达那肝素、双嘧达莫、依诺肝素、依替巴肽、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、方达帕鲁、肝素钠、重组水蛭素、维生素K1、鱼精蛋白、瑞替普酶、溶栓酶、替奈普酶、噻氯匹定、亭扎肝素、替罗非班、凝血酸、尿激酶、华法令阻凝剂。
下丘脑与垂体类激素包括溴麦角环肽、卡麦角林、西曲瑞克、绒膜促性腺激素[hCG]、绵羊促肾上腺皮质激素释放因子、促肾上腺皮质激素、促皮质素、去氨加压素、促卵泡素α、促卵泡素β[FSH]、加尼瑞克、醋酸高纳瑞林[GnRH]、盐酸高纳瑞林[GnRH]、醋酸性瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、促生育素[hMG]、纳发阮林、奥曲肽、催产素、培高利特、普罗瑞林、舍莫瑞林、索吗托诺、促生长激素、促甲状腺素α、曲普瑞林、尿促卵泡素、血管加压素。
甲状腺及抗甲状腺药剂包括甲状腺制剂：左甲状腺素[T4]、碘塞罗宁[T3]、复方甲状腺素[T4∶T3以4∶1混合]、甲状腺粉[USP]；以及抗甲状腺制剂：泛影酸钠、碘化物、碘番酸、胺碘苯丙酸钠、甲硫咪唑、碘化钾、丙硫氧嘧啶[PTU]、促甲状腺素；重组人源TSH。
肾上腺皮质激素类药物和肾上腺素拮抗剂包括口服和非口服的糖皮质激素：倍他米松、倍他米松磷酸钠、氢羟肾上腺皮质素[皮质醇]、醋酸氢化可的松、氢化可的松环戊丙酸酯、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、甲氢泼尼松龙、醋酸甲基泼尼松龙、甲氢泼尼松琥珀酸钠、氢化泼尼松、醋酸氢化泼尼松、氢化泼尼松磷酸钠、叔丁乙酸氢化泼尼松、强的松、氟羟泼尼松龙、曲安奈德、曲安西龙双醋酸酯、己曲安奈德。其它类型的肾上腺皮质激素为盐皮质激素类，例如，醋酸氟氢可的松。肾上腺素拮抗剂包括氨鲁米特、酮康唑、米托坦。
性腺激素及其抑制剂类药物包括雌激素类：结合雌激素、双烯雌酚、二磷酸己烯雌酚、酯化雌激素、油溶环戊丙酸雌二醇、雌二醇、外敷雌二醇、油溶雌二醇戊酸酯、雌激素酮水悬剂、哌嗪雌酮硫酯、乙炔雌二醇；孕激素类：己酸羟孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋炔诺酮、甲基炔诺酮、孕酮；雄激素和合成代谢类固醇：甲睾酮、癸酸南诺龙、氧雄龙、羟甲烯龙、羟甲雄烷吡唑、睾内酯、睾酮水混悬液、油溶环戊丙酸睾酮、油溶庚酸睾酮、油溶丙酸睾酮、睾酮透皮贴、睾酮药丸。药物可进一步分为性腺激素的拮抗剂和抑制剂类：阿那曲唑、比卡鲁胺、克罗米酚、达那唑、度他雄胺、依西美坦、非那司提、氟他米特、氟维司群、来曲唑、米非司酮、尼鲁米特、雷洛昔芬、它莫西芬，和托瑞米芬。
影响骨矿物质平衡的药剂包括维生素E、其代谢物和类似物：骨化二醇、骨化三醇、维生素D3、二氢速留醇[DHT]、度骨化醇、维生素D2、和帕立骨化醇；钙类：醋酸钙[25％钙]、碳酸钙[40％钙]、氯化钙[27％钙]、柠檬酸钙[21％钙]、葡乳醛酸钙[6.5％钙]；葡庚糖酸钙[8％钙]、葡糖酸钙[9％钙]、乳酸钙[13％钙]，以及磷酸三钙[39％钙]；磷酸及磷酸结合剂如磷酸和司维拉姆；以及其它药物如阿伦膦酸盐、鲑降钙素、1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸、硝酸镓、氨羟二磷酸二钠、光神霉素、利塞膦酸盐、氟化钠、特立帕肽、二膦酸盐、唑来膦酸。
β内酰胺类抗生素以及其它细胞壁合成抑制剂包括青霉素类，如阿莫西林、阿莫西林克拉维酸钾、氨比西林、氨比西林舒巴坦钠、羧苄青霉素、双氯青霉素、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、苄星青霉素G、普鲁卡因青霉素G、苯氧甲基青霉素、氧哌嗪青霉素、氧哌嗪青霉素他唑巴坦钠、替卡西林、替卡西林-克拉维酸钾；头孢菌素类以及其它β内酰胺类药物，如窄谱(第一代)头孢菌素类，如头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢菌素、头孢匹林，以及头孢拉定；第二代(中谱)头孢菌素类，例如，头孢克洛、头孢孟多、头孢美唑、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢罗齐、头孢呋辛，和洛拉卡比；以及广谱(第三和第四代)头孢菌素类，例如，头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟酯、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟，和头孢三嗪。其它的类型还包括碳青霉烯和单菌霉素，例如，噻肟单酰胺菌素、厄他培南、亚胺培南/西司他丁、和美罗培南；以及其它药物如环丝氨酸(丝氨霉素胶囊)、磷霉素、万古霉素。
其它抗生素类药物包括氯霉素，四环素类药物，例如，地美环素、强力霉素、甲烯土霉素、米诺环素、土霉素，和四环素；大环内酯类药物，例如，氯林可霉素；链阳性菌素类药物，例如，奎奴普丁和达福普汀；以及恶唑烷酮类药物，例如，利奈唑胺。
氨基糖甙类和奇霉素类抗生素包括氨丁卡霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、巴龙霉素、奇霉素、链霉素，和妥布霉素。
磺酰胺类，甲氧苄啶，以及喹诺酮类抗生素包括通用的磺胺类药物，例如，磺胺嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲恶唑、磺胺，和磺胺异恶唑；特殊应用的磺酰胺类药物，例如，磺胺米隆、磺胺嘧啶银盐、乙酰磺胺钠。甲氧苄啶类药物包括三甲氧苄二氨嘧啶、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑[增效磺胺甲基异晤唑，TMP-SMZ]；喹诺酮类和氟喹诺酮类药物包括西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、施怕沙星，和曲伐沙星。
抗分支杆菌类药物包括治疗肺结核类药物，例如，对氨基水杨酸钠、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布丁、利福平、利福喷丁、和链霉素；以及用于治疗麻疯病的药物，例如，氯苯吩嗪、氨苯砜。
抗真菌类药物包括两性霉素B、布康唑、布替萘芬、卡泊芬净、克霉唑、益康唑、氟康唑、氟胞嘧啶、灰黄霉素、伊曲康唑、甲酮康唑、咪康唑、萘替芳、游霉素、制真菌素、奥昔康唑、硫康唑、特比萘芬、特康唑、噻康唑、托萘酯，和伏立康唑。
抗病毒类药剂包括阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、三环癸烷胺、安泼那韦、西多福韦、地拉夫定、地达诺新、依法韦仑、恩夫韦地、泛昔洛韦、福米韦生、膦甲酸、更昔洛韦、碘甙、咪喹莫特、印地那韦、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素-2b，干扰素α-n3、干扰素α-1、拉米夫定、洛匹那韦/利托那韦、那非那韦、奈韦拉平、奥塞米韦、帕利珠单抗、脱氧胸苷、替诺福韦、三氟尿苷、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、扎西他滨、扎那米韦，和叠氮胸腺。
其它的抗菌药物，杀菌剂，防腐剂和消毒剂包括其它类型的抗菌药物，例如，马尿酸乌洛托品、乌洛托品扁桃酸盐、甲硝哒唑、莫匹罗星、呋喃妥英、多粘菌素B；以及杀菌剂、防腐剂和消毒剂，例如，苯甲烃铵、过氧苯酰、氯胍、戊二醛、六氯酚、碘药水、碘酊、呋喃西林、氧氯苯磺酸钠、聚维酮碘、硝酸银、和水杨乙汞。
抗原虫药包括阿苯达唑、阿托伐醌、阿托喹酮-氯胍、氯奎、氯林可霉素、强力霉素、去氢依米丁、依洛尼塞、卤泛曲林、双碘喹啉、甲氟奎、美拉胂醇、甲硝哒唑、硝呋莫司、硝噻醋柳胺、巴龙霉素、戊双脒、伯氨喹、乙嘧啶、葡糖酸奎尼定、奎宁、葡萄糖酸锑钠、周效磺胺和乙胺嘧啶，以及苏拉明。
驱虫剂包括阿苯达唑、硫双二氯酚、乙胺嗪、伊维菌素、左咪唑、甲苯咪唑、美曲膦脂、氯硝柳胺、羟胺硝喹、双羟萘酸甲嘧烯酚、哌嗪、吡喹酮、噻吩嘧啶、苏拉明、噻苯咪唑。
免疫药理制剂包括阿昔单抗、阿达木单抗、阿法赛特、阿仑单抗、抗胸腺细胞球蛋白抗体、硫唑嘌呤、巴利昔单抗、BCG、环磷酰胺、环孢霉素、达利珠单抗、依那西普、吉姆单抗、格拉默、替伊莫单抗、静脉注射用免疫球蛋白、英夫利昔单抗、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ-1b、白介素2、IL-2、阿地白介素、来氟米特、左咪唑、淋巴细胞免疫球蛋白、甲氢泼尼松琥珀酸钠、鼠CD3单克隆抗体[OKT3]、麦考酚酯、腺苷脱氨酶、聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b、强的松、微剂量RHo(D)球蛋白、利妥昔单抗、西罗莫司、他克莫司[FK506]、萨立多胺，和曲妥珠单抗。
重金属螯合剂包括去铁胺、二巯基丙醇、依地酸钙钠[Ca-EDTA]、青霉胺、二硫琥珀酸，和二巯基丙醇磺酸钠。
药物结构类型
在另一药物分类实施方式的实例中，药物可以根据其结构类型或者其所属的族来进行分类；某些药物可能被分入多种结构类型或族。因此，在一些实施方式中，药物根据结构进行分类。具有共同效果的药物可以具有不同的结构，药物结构通常是预测其效果的一个最佳指标。仅作为示例，通过此处记载的化学结构类型对某些特定药物作进一步的分类。一个非限定性的实例是抗生素类药物。下表15给出了根据化学结构对抗生素类药物作进一步分类的非限定性实例。表15：抗生素药物的结构类型
在一些实施方式中，药物按照光学异构体进行分类，其中一类药物是指具有相同化学式的化合物的两种或多种光学异构体或者外消旋体。因此，本发明提供了用于筛选具有遗传变异和/或表型变异个体的方法和组合物，所述遗传变异和/或表型变异可以用来预测个体对第一种药物的反应，并利用这种关联性来确定是否需要使用第二种药物来调整个体的治疗方案，其中所述第一和第二种药物是光学异构体。在一些实施方式中，第一种药物是外消旋体，第二种药物是该外消旋体中的立体异构体。在一些实施方式中，第一种药物是立体异构体，第二种药物是包含该立体异构体的外消旋体。在一些实施方式中，第一种药物是化合物的第一立体异构体，而第二种药物是化合物的第二立体异构体。
在一些实施方式中，药物按照相同化学式的不同晶体结构进行分类。被分为具有相同化学式而具有不同晶体结构的类别。因此，本发明提供了用于筛选具有遗传变异和/或表型变异个体的方法和组合物，所述遗传变异和/或表型变异可以用来预测个体对第一种药物的反应，并利用这种关联性来确定是否需要使用第二种药物来调整个体的治疗方案，其中所述第一和第二种药物具有的相同化学式但却具有不同的晶体结构。
在一些实施方式中，通过共同的结构单元来对药物进行分类。因此，本发明包括了用于筛选具有遗传变异和/或表型变异个体的方法和组合物，所述遗传变异和/或表型变异可以用来预测个体对第一种药物的反应，并利用这种关联性来确定是否需要使用第二种药物来调整个体的治疗方案，其中所述第一和第二种药物包含相同的结构单元。仅作为示例，可以按照结构将药物分成，非环式酰脲；乙酰脲；乙醛；氨基酸类似物；氨烷基醚(克立马丁、多西拉敏)；氨基糖苷类；蒽环霉素；氮杂内酯，唑类；巴比妥酸盐；苯二氮类；氨基甲酸酯(例如，非班酯、氨甲丙二酯、氨甲酸叔己酯、苯丙氨酯)；碳青霉烷；碳水化合物；酰胺类(例如，酰胺咪嗪、奥卡西平)；类胡萝卜素(例如，叶黄素、玉米黄质)；头孢菌素；自念珠藻环肽；环式糊精；二苯丙胺；扩展卟啉(例如，rubyrins、sapphyrins)；脂肪酸；糖肽；高级醇；妥因类(例如，苯妥英)；羟化蒽醌；林可胺类；脂类；脂相关化合物；大环内酯物；芥末；硝基呋喃；硝基咪唑；非天然核苷酸；非天然核苷；寡核苷酸；有机金属化合物；恶唑烷二酮类；青霉素类；吩噻嗪衍生物(阿利马嗪，异丙嗪)；苯基哌啶；酞菁；哌嗪衍生物(塞替利嗪、美其敏)；铂络合物(例如，顺铂)；多烯类；聚酮化合物；多肽；卟啉；前列腺素(例如，迷索前列醇、恩前列素)；嘌呤；吡唑啉酮；嘧啶；吡咯烷(左乙拉西坦)；喹诺酮；苯醌；类维生素A(例如，异维甲酸、维甲酸)；水杨酸盐；鞘脂类；类固醇(例如，强的松、曲安西龙、氢羟肾上腺皮质素)；取代烷基胺(例如，他拉斯丁、氯苯那敏)；取代乙二胺(美吡拉敏、桑西胺)；琥珀酰亚胺(乙琥胺、苯琥胺、甲琥胺)；磺胺制剂；磺胺(磺胺塞唑、磺胺米隆)；砜；紫杉烷；四环素(氯四环素、氧四环素)；金属配位的卟啉衍生物(例如，莫特沙芬钆、安特林)；噻嗪化物；噻唑烷二酮；生育酚，生育三烯酸，三嗪(例如，拉莫三嗪)；尿素；黄嘌呤(可可碱、氨茶碱)；以及两性离子。
实施例
实施例1.制备DNA结构单元(例如，X型DNA、Y型DNA、T型DNA)
根据进行此处记载的实验的目的来选择适当的DNA结构单元(X型DNA、Y型DNA或T型DNA)。表16示出了合适的DNA结构单元的序列。表16.用于制备光交联DNA水凝胶和DNA纳米球的DNA结构单元的寡核苷酸序列
Figure BPA00001342885900991
设计三条寡核苷酸，其中两条具有部分互补序列，从而形成Y型DNA的一条臂，剩下的第三条寡核苷酸具有和其余部分互补的序列。这三条寡核苷酸能够最终杂交形成Y型DNA(SEQ ID NOs 127-129)。其它结构单元如X型DNA(SEQ IDNOs 123-126)和T型DNA(SEQ IDNOs 130-132)也可以使用相同的步骤和原理来进行构建。这些DNA结构单元在其5’末端含有伯氨基修饰的基团，该基团可用将各种光反应修饰剂连接到寡核苷酸上。
聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的5’末端磷酸化的且氨基修饰的寡核苷酸，可以通过购买方式获得或者根据设计的序列合成获得，然后将其溶解在最终浓度为0.2mM的退火缓冲液中以制备DNA结构单元。
X型DNA凝胶
设计出含有表16所示序列的X型DNA支化核酸。选择X01至X04作为形成X型DNA的4条相应单链寡核苷酸。不需要进一步的纯化，将寡核苷酸(购于Integrated DNAtechnologies)溶于最终浓度为50mM的退火缓冲液(10mMTris，pH＝8.0，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，和50mM NaCl)中。在无菌的Milli-Q水中混合四种寡核苷酸链(具有相同的摩尔比例)以构建获得X型DNA，其中每条寡核苷酸链的最终浓度为40mM。杂交通过以下步骤进行：(i)95℃变性2分钟；(ii)冷却至65℃并孵化2分钟；(iii)在60℃下退火5分钟；以及(iv)在60℃下进一步退火0.5分钟，然后温度以每分钟1℃的速率连续下降。退火步骤重复40次。最终的退火产物在4℃下进行保存。
将光活性部分结合到DNA结构单元上并使其功能化
为了在X型DNA结构单元4条臂上的每条臂都合成连接上光反应基团，通过在无菌的0.5mL微离心管中混合摩尔比例为10∶1的光反应基团和DNA结构单元，从而将光反应基团偶联到DNA结构单元的臂上。反应混合物在室温下孵化过夜。使用HPLC除去未反应DNA结构单元和官能团，从而获得合成的DNA偶联物。通过凝胶电泳迁移阻滞试验(GEMSA)对纯化后的可进行光交联的DNA偶联物进行检测。交联获得的DNA分子越大，则在凝胶中的迁移速度越慢。
将聚乙二醇单丙烯酸酯(PEGA)偶联到Y型DNA上
将PEGA(0.5mM，3,400Da)加入到含有5’氨基修饰的ssDNA、Y型DNA或X型DNA的水中(0.2mM)。反应在室温下进行一整夜。未反应的氨基修饰的Y型DNA和PEGA通过装有光二极管矩阵检测器的HPLC(Waters)除去。
通过光聚合反应形成DNA纳米球
纯化的可光交联的DNA偶联物在含有5wt％光引发剂Irgacure(Ciba Geigy)的水溶液中进行光交联，光交联使用UV交联仪(Spectronics Corporation，XL-1000)并在265nm UV光(8mW cm-2)下照射10分钟完成。
溶胀DNA水凝胶的表征。原子力扫描显微镜(AFM)(Nanoscope III，Digital Instruments)在空中选择轻敲模式进行操作，该显微镜带有矩形悬臂和四面体探针(Olympus)。选用干净环境中新鲜切割的云母作为固相底物。对于样品制备，通过将硅烷溶解在去离子的蒸馏水(DDI水)中的方式来完成表面修饰。简要的来说，将新鲜的云母片放置在含有10mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(2％w/w)的容器中15分钟，随后使用DDI水充分冲洗APTES浸泡的云母片数次，再用温和的氮气流进行干燥。将一片DNA凝胶装载在云母上放置7分钟，随后使用DDI水冲洗DNA凝胶数次并进行干燥。对于SEM成像，从干燥的DNA凝胶中切出数个细条，并将其放在SEM支架的端部从而获得高解析度图片，其中SEM支架带有碳带并使用Au/Pd金属包被。
力学性质。通过动态力学分析仪(DMA2980，TA Instruments，Inc)进行力学性质的测量。将水凝胶夹在直径为1.0cm的平行板压迫钳之间。使用一块直径为7.0mm及高度为3.0mm的圆柱形DNA凝胶来进行该测试。拉伸测试所使用的DNA水凝胶将近3.0mm厚，其可以在一个圆柱型模具(将近5mm×5mm)中浇铸而成。
图20示出了光交联的DNA-PEG水凝胶和单独的PEG水凝胶这两者在压力-张力性能方面的对比。如图所示，相比于PEG水凝胶，DNA-PEG水凝胶更强，且在特定水平的压力条件下受到的张力更小。
体外降解试验。干凝胶称重后转移至含有pH＝7.4的PBS的微离心管中。37℃下缓慢震荡离心管。除去凝胶样品的上清液后立即称重样品重量。然后向样品加入新鲜的PBS缓冲液，并将样品重新放回到37℃的摇床震荡器中。
生物相容性
在96孔板中接种中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，每孔添加200μL生长培养基介质。细胞在37℃下用5％CO2进行孵化。CHO细胞生长一天后向含有CHO细胞的96孔板加入浓度为0.01，0.05，0.25，1和5nM的DNA凝胶。36个小时后，通过CellTiter Aueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay试剂盒(Promega)来检测细胞存活性。没有检测到各个浓度之间存在显著差异。
微样式DNA凝胶的制作
在微米尺寸下具有固定型态的DNA凝胶可以通过光蚀刻制作的具有该形态的PDMS模具来产生。型态的直径在微米尺寸，例如，每种型态的大小约为500×400μm2，高20μm。向APTES修饰的玻璃片上滴加DNA预胶化溶液(2μL)，将PDMS模具置于溶液上。凝胶化进行2小时后，剥去PDMS模具。形成的凝胶使用DNA特异性染料SYBR I染色，并使用荧光显微镜进行荧光拍照以观察DNA凝胶的微样式。图21A示出了DNA凝胶制作后的形态。
为了验证溶胀的微米尺寸的DNA水凝胶确实含有DNA分子，可以使用DNA特异性染料(SYBR I，绿色：Ex/Em，494nm/520nm)对凝胶进行染色。染色之后，强烈的绿色荧光表明水凝胶由DNA分子构成。可以使用不同的DNA特异性荧光染料(EtBr，红色：Ex/Em，518nm/605nm)来获得类似结果。
这些DNA凝胶在宏观尺寸下可以形成预先确定的不同型态。例如，毫米尺寸(即宏观尺寸)的矩形、圆形、三角形、十字形，和星形的DNA水凝胶。图21B示出了DNA凝胶的微样式。此外，DNA水凝胶也可以在微观尺寸下制成复杂的型态。可以使用传统的光蚀刻技术来制造特定型态的微米尺寸DNA凝胶。即便经过连续干燥和水合，这些DNA水凝胶可以回复到它们的初始形态而不会塌陷成片状或者粉末。
可以通过调节DNA单体的起始浓度和类型(如表16所示)来使DNA水凝胶具有不同的溶胀性质，起始DNA单体浓度越高则形成的水凝胶的溶胀度越高。例如，基于Y型DNA的水凝胶(Y-DNA凝胶)在最高的DNA单体起始浓度(0.2mM)下可以溶胀超过400％；而在最低起始浓度(0.03mM)下，它只能溶胀100％。除了起始浓度外，不同的DNA单体类型也会影响溶胀度。一般来说，基于X型DNA的水凝胶(X-DNA凝胶)比Y型DNA凝胶和T型DNA凝胶表现出更高的溶胀度。
可以进一步使用各种可视化方法来对DNA水凝胶的型态和结构进行研究，包括AFM、FE-SEM以及激光共聚焦显微镜。图21C示出了包被了珠子的DNA-PEG水凝胶的激光共聚焦显微镜照片。DNA水凝胶在干燥和溶胀状态下的表面型态和内部结构因其所用DNA单体类型的不同而不同。这些技术可以被用来观察表面形态(例如，X型DNA凝胶的编织型态，Y型DNA凝胶的纤维状型态，以及T型DNA凝胶的鳞状型态)。在溶胀状态下，DNA水凝胶的内部结构可以在被SYBR染色后使用激光共聚焦显微镜光学断层扫描拍照获得。同样的，DNA水凝胶的内部结构因所用DNA单体类型的不同而具有显著差异。可以进一步使用AFM在分子水平下对DNA水凝胶的内部结构进行更为详细的研究。
图像结果表明，初始的DNA单体型态可以显著性地影响最终形成的DNA水凝胶的表面型态和内部结构。更重要的是，通过选择不同型态的DNA单体以及通过调节侧链的长度，可以设计出具有需要结构和性质的DNA水凝胶。
不同DNA单体制作的DNA水凝胶具有特异的化学和物理性质。DNA水凝胶的力学性质可以使用动态力学分析仪(DMA2980，TA Instruments)进行测试，例如，根据前述方法来测量拉伸强度。
此外，也可以通过选用不同类型和/或不同浓度的DNA单体来调节凝胶的降解性。空的DNA水凝胶的降解过程可以通过，测量它们在各种介质存在下每天损失的DNA质量来进行测定。例如，凝胶在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中在室温下测定10天。介质也可以是含有10％血清的培养基。降解过程取决于DNA凝胶的内部结构以及环境(例如，存在含有大量核糖酶的血清)。例如，X型DNA水凝胶比Y型和T型水凝胶更稳定。期望不受理论的束缚，X型核酸凝胶可以阻止DNA分子轻易地接触到核糖酶。为证明此点，可以在绝大多数酶失活的低温(4℃)下进行降解试验。如预期的一样，所有DNA凝胶即使存放一个月后也都几乎没有发生降解。该结果展现了DNA水凝胶的另一优点，即在冷藏条件下(4℃)DNA水凝胶可以稳定储存很长时间。
此外，在体外动物实验中(B57L小鼠)，将250ug空白DNA凝胶注射到小鼠体内，并将其与注射了PBS对照的小鼠进行比较。
实施例2.包封和输运
DNA纳米球的包封
将需要输运的化合物装载到NDA水凝胶中然后制成DNA纳米球用于药物输运。使用该技术来包封带正电的试剂、DNA结合剂以及可检测标签。在一组实验中，通过光聚合反应来制备装载阿霉素的DNA水凝胶和DNA纳米球。光交联的水凝胶和DNA纳米球可以根据实施例1中记载的标准制备方法来进行制备。
为了装载阿霉素，在一个无菌的0.5mL微离心管中将含有光交联DNA水凝胶和DNA纳米球的大分子溶液和溶解了阿霉素的溶液以摩尔比1∶5的比例混合溶解在水中。
反应混合物在室温下孵化一整夜。通过离心除去未反应的阿霉素，然后即可获得装载了阿霉素的DNA水凝胶和DNA纳米球。
在光聚合反应过程中的包封
在光反应过程中也可以包封各种化合物，例如，制药化合物、治疗性化合物、核酸分子(基因序列、寡核苷酸、siRNA、miRNA、snRNA、mRNA等等)、肽、蛋白、脂类、抗原、抗体、细胞生长因子、可筛选标志物、受体分子、配体。在一组实验中，包封了可进行光交联的基因。
将光反应基团连接到基因上
为了将光反应基团偶联到基因的一个或者多个部位，在一个无菌的0.5mL微离心管中，先将光反应基团与设计好的DNA引物序列按照5∶1的摩尔比例混合溶解在水中以进行偶联。反应在室温下进行一整夜。随后通过HPLC将未反应的DNA结构单元和光反应基团除去。通过凝胶电泳迁移阻滞试验(GEMSA)来对纯化后的可进行光交联的基因进行确认。
将聚乙二醇单丙烯酸酯(PEGA)偶联到基因上
将PEGA(1.0mM，3,400Da)加入到含有5’和3’氨基修饰基因的水溶液(0.2mM)中。反应在室温下进行一整夜。使用装有光二极管矩阵检测器的HPLC(Waters)除去未反应的氨基修饰基因和PEGA。
通过光聚合反应制备包封了基因的DNA纳米球
根据实施例1中记载的标准方法来制备可进行光交联的DNA结构单元和基因。纯化的可光交联的DNA结构单元和基因在含有5wt％光引发剂Irgacure(Ciba Geigy)的水溶液中进行光交联，光交联使用UV交联仪(Spectronics Corporation，XL-1000)并在UV光(8mW cm-2)下照射10分钟完成。
上述化合物的释放速度与DNA单体的类型有关。本领域技术人员应当知道，虽然核酸与候选药物之间存在不同的亲和性，但可以选用特定的本发明基质来实现特定药物按照时间可控方式来释放。例如，大尺寸的孔可以避免或者消除任何药物-核酸之间可能存在的相互干扰性。因此，通过选择不同的核酸分子，以及不同型态、不同序列或不同长度的核酸分子来组成基质，可以为任何靶点药物设计出适用的凝胶，所述药物包括，例如，任意生物活性剂、细胞、病毒、小分子、肽、多肽，和抗生素。因此，DNA水凝胶是一种可以对其力学性质进行精确控制的软性材料。
由于凝胶化的条件非常温和，而且也没有使用有机溶剂或高温条件，所以DNA凝胶可用于包封哺乳动物的活细胞。先用CellTrackerTM Red CMTPX探针(Molecular Probes，Carlsbad，California)对中华仓鼠卵巢(CHO)细胞进行染色，然后将其包封到0.2mM X型DNA凝胶中。在凝胶化之前，先使用DNA特异性染料(SYBR I，绿色)对X型DNA结构单元进行染色。在被包封到DNA水凝胶后，仍可以观察到CHO细胞发生分裂并产生子细胞。因此，DNA水凝胶可以用来为细胞移植、3D细胞培养和组织工程提供支架。
为了评估DNA水凝胶系统是否适用于细胞移植以及体内给药，对DNA水凝胶的生物相容性进行评估。使用传统的CellTiter Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay(Promega，Madison，Wisconsin)方法对中华仓鼠卵巢(CHO)细胞进行细胞毒性检测。结果表明所有的DNA水凝胶对培养的细胞均无毒性。
实施例3非细胞蛋白合成
使用核酸构建新的DNA水凝胶，其中将含有海肾荧光素酶基因的线性化质粒载体用于光交联X型DNA(X-DNA)，然后将基因引入到DNA水凝胶中。海肾荧光素酶是36kDa的单体蛋白，其不需要进行翻译后修饰便可具有活性。线性化质粒载体可以通过使用Mlu I限制性内切酶在一个位点消化载体的方式制备获得。X型DNA结构单元通过互补杂交4种不同的寡核苷酸来制备获得。凝胶电泳的结果显示，经过MluI消化后，环状DNA已被完全线性化。
X型DNA与线性化质粒的光交联可以通过使用了下述两种方法中的一种将海肾荧光素酶基因连接到DNA水凝胶上的方式来进行。在一个方法中，基因被交联到DNA结构单元上，其中该基因使用了一个或者多个光响应基团进行了修饰。随后，杂交DNA结构单元。在另一个方法中，DNA结构单元首先进行了杂交，然后通过光交联反应连接上修饰过的基因序列。不管使用哪种方法都可以基本上按照实施例1中记载的方法来进行操作。
DNA凝胶微垫中海肾荧光素酶(Rluc)的体外表达通过使用基因转录和翻译(TNT)试剂盒(Promega)来进行。传统的非细胞体系是液相体系(SPS)，其中基因模板散布在溶液中。在此，SPS被用作标准来评估光交联的P-gels生产蛋白的能力(效率和产量)。在预实验中，使用与SPS相同的条件通过光交联的P-gel来生产Rluc蛋白。
图22示出了P-gel和溶液体系的比较。图22A示出了光交联的蛋白生产凝胶，该凝胶包含部分作为凝胶支架的基因。柱状图上方的数值表示光交联的P-gel与SPS对照相比其功能蛋白表达效率所增加的倍数。结果表明，在DNA凝胶中的基因表达比溶液系统中的效率要高约72倍。图22B示出了总基因量对表达的影响，其通过改变反应中光交联P-gel微垫的数量来进行检测(蓝线)。在单位体积产量上，光交联的P-gel产生高至约1mg/ml功能蛋白。由于DNA凝胶垫只含有DNA，因此不存在其它固相系统中所存在的降低蛋白表达的非特异性结合。在其它固相体系中，生物素标记的线性质粒固定在亲和素包被的固体微粒上，其中T7RNA聚合酶会与生物素标记的线性化质粒非特异性结合，干扰基因表达。
制备线性海肾荧光素酶报告基因。含有T7RNA聚合酶启动子启动的海肾荧光素酶的质粒DNA，pRL-null购自Promega(Madison，WI)。该质粒DNA(pDNA)在合适的大肠杆菌中进行扩增，并使用
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PlasmidMini试剂盒(Westbury，NY)进行纯化。扩增和纯化的pDNA使用限制性内切酶Mlu I(Promega)进行消化，该酶会对质粒上位于T7启动子之前的一个位点进行切割。
构建DNA结构单元和蛋白质合成DNA水凝胶。使用可以通过商业渠道获得的寡核苷酸合成服务来设计和合成支化DNA序列(表16)。通过实施例1中记载的方法来对形成X型DNA所需的X01至X04单链寡核苷酸进行扩增和官能化。使用相似的方法来对X型DNA(X-DNA浓度，13ug/ul)进行官能化并进行混合，从而构建蛋白合成X型DNA凝胶。光交联反应按照实施例1中记载的方法来进行。
制作DNA凝胶微垫衬。通过将DNA制胶溶液在PDMS复制品中进行浇铸的方式来制备微米尺寸的DNA凝胶微垫衬，所述PDMS复制品通过使用光蚀刻构建获得。凝胶微垫衬的尺寸为20μm×200μm×400μm。将DNA制胶溶液(1μl)滴到APTES修饰的玻璃片上，并将PDMS复制品置于溶液上。在室温下凝胶化8小时，剥去PDMS复制品。使用DNA特异染料SYBRI染色后，在荧光显微镜下观察DNA凝胶的微样式。
溶胀DNA水凝胶的表征。AFM在流动细胞水溶液中，使用PicoPlusAFM(Molecular Imaging，Tempe，AZ)，MAC模式，II型MAClevers探针(Molecular Imaging，Tempe，AZ)。使用在干净环境下新鲜制备的云母作为固体底物。通过将硅烷溶解在MilliQ水中的方式来完成表面修饰，然后用于样品制备。简要的来说，将新鲜的云母片放置在含有10mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(2％w/w)的容器中15分钟，随后使用MilliQ水充分冲洗APTES浸泡的云母数次，再用温和的氮气流进行干燥。将一片DNA凝胶装载在云母上用于成像。
体外转录和翻译。偶联的转录和翻译通过使用50μl体积的TNT Coupled Transcription/Translation System(Promega，Madison，WI)进行。将15个通过微模塑设备制作的凝胶垫衬加入到表达溶液中，用作蛋白合成DNA水凝胶。在30℃水浴中进行75分钟时间的孵化。所有的样品在进行荧光素酶活性分析之前均储存在-80℃环境下。荧光素酶活性使用Renilla Luciferase Assay System(Promega，Madison，WI)来进行评估，并使用荧光光度计测量。
本领域技术人员知道，此处所记载的本发明的优选实施方式只是示例性的。在不背离本发明原理的前提下，本领域技术人员可以进行各种变化、改变和替换。本领域技术人员应当理解，可以使用此处记载的实施方式的各种替代方案来实施本发明。以下权利要求意图界定本发明的范围，权利要求所覆盖的方法和结构及其等同物都在本发明的保护范围内。

Claims (116)

1.一种含有多个支化核酸分子的组合物，其中至少有部分所述的支化核酸分子与光反应基团偶联。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述的至少部分支化核酸分子通过其5′末端与光反应基团发生偶联。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述的至少部分支化核酸分子通过其3′末端与光反应基团发生偶联。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述的至少部分支化核酸分子通过其内部与光反应基团发生偶联。
5.如权利要求1所述的组合物，其中至少部分所述的支化核酸分子通过光反应基团相互交联。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述的多个支化核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)，或它们的组合。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述的多个支化核酸分子包括寡核苷酸。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述的多个支化核酸分子的支链结构包含一个或多个X型、Y型、T型、哑铃型或者类树状型。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述支链结构基本上呈X型。
10.如权利要求8所述的组合物，其中所述支链结构基本上呈Y型。
11.如权利要求8所述的组合物，其中所述支链结构基本上呈T型。
12.如权利要求8所述的组合物，其中所述支链结构基本上呈哑铃型。
13.如权利要求8所述的组合物，其中所述支链结构基本上呈类树状型。
14.如权利要求1所述的组合物，其中至少部分所述的核酸分子与一种或者多种其它化合物相连。
15.如权利要求14所述的组合物，其中一种或者多种其它化合物包括肽、多肽、蛋白质、脂类、碳水化合物、核酸适体、抗体、抗原、细胞生长因子、DNA结合剂、可检测标签、可筛选标志物、生物素、药学试剂、药物、小分子、治疗性药剂、受体分子、配体、核酸分子或者底物。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述的核酸分子包含编码区。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所述的核酸分子包括siRNA、miRNA、snRNA、寡核苷酸(ODN)、基因序列、内含子序列、外显子序列、非编码序列、肽核酸(PNA)或mRNA序列。
18.如权利要求15所述的组合物，其中所述的肽包括腺病毒核心肽、合成肽、流感病毒HA2肽、猴免疫缺陷病毒gp32肽、SV40T-Ag肽、VP22肽、Tat肽或Rev肽。
19.如权利要求15所述的组合物，其中所述的肽包括DNA缩聚肽、DNA保护肽、内含体靶向肽、膜融合肽、核定位信号肽或蛋白转导域肽。
20.如权利要求15所述的组合物，其中所述的可检测标签包括放射性标记探针、荧光标记探针、量子点标记探针、发色团标记探针、酶标记探针、亲和配体标记探针、电磁旋转标记探针、重原子标记探针、纳米颗粒光散射标记探针。
21.如权利要求15所述的组合物，其中所述的可检测标签包括发色团、荧光基团、酶、抗原、重金属、磁性探针、染料、纳米晶体、磷光基团、放射性材料、化学发光基团、散射纳米颗粒、荧光纳米颗粒、拉曼信号产生基团或电化学检测基团。
22.如权利要求15所述的组合物，其中所述的可检测标签包括，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、链霉亲和素、亲和素、生物素、核酸适体、抗原、抗体、免疫球蛋白、抗免疫球蛋白抗体、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、TRITC、伊红、绿色荧光蛋白、四碘荧光素、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、萤光黄、Cascade BlueTM、德克萨斯红、Phar-red、别藻蓝蛋白(APC)、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯、R-藻红蛋白、藻红蛋白、荧光稀土复合物、铕、铽、Cy3、Cy5、Cy7、地高辛、二硝基苯基、分子信标、荧光分子信标衍生物、发光氨、光散射材料、等离子共振材料、金、银、量子点，14C，123I，124I，125I，131I，锝-99m(Tc99m)，35S，32P或3H。
23.如权利要求14所述的组合物，其中一种或者多种其它化合物包括聚合物。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述的聚合物为聚乙二醇(PEG)，聚(N-异丙基丙烯酰胺)，聚(N-烷基丙烯酰胺)，聚(N-正丙基丙烯酰胺)，聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)，肽，多肽，聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷，聚二芳基乙烯(DTEC)，葡聚糖-聚乳酸，弹力蛋白样多肽，聚酯，聚乳酸，聚(L-乳酸)，聚(D，L-乳酸)，聚乙丙交酯，生物素标记的乙二醇乳酸二嵌段共聚物，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚己内酯，聚酸酐，聚(双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)，聚原酸酯，聚磷酸酯，聚磷腈，聚苯乙烯，聚氨酯，聚氨基酸，聚环氧乙烷，聚环氧乙烷-聚丙烯-聚环氧乙烷，聚乳酸-g-聚乙烯醇接枝共聚物，聚环氧乙烷-聚L-乳酸，聚D，L-乳酸羟乙酸共聚物-聚乙二醇，聚(L-乳酸-乙二醇)，聚乙二醇聚羟基酸共聚物，聚乙烯醇，聚(乳酸赖氨酸共聚物)-聚天冬氨酸，聚己内酯-三亚甲基碳酸酯共聚物，聚(L-乳酸-乙醇酸-L-丝氨酸)共聚物，聚富马酸丙二醇酯，寡聚(富马酸聚乙二醇酯)，聚(富马酸丙二醇酯-乙二醇)，聚乙二醇二[乙基磷脂酰(乙二醇)甲基丙烯酸酯]，聚(N-异丙基丙烯酰胺)-聚乙二醇，聚(N-异丙基丙烯酰胺)-明胶，聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸)，或任意它们的衍生物。
25.如权利要求14所述的组合物，其中一种或者多种其它化合物包括天然的或者合成的生物相容性材料。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述的生物相容性材料包括聚乙二醇(PEG)水凝胶基质、N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)水凝胶基质、壳聚糖水凝胶基质，或任意它们的衍生物。
27.如权利要求25所述的组合物，其中所述天然的生物相容性材料包括壳聚糖、甲基纤维素、海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、纤维素、明胶、胶原蛋白、葡聚糖，或任意它们的衍生物。
28.如权利要求25所述的组合物，其中所述合成的生物相容性材料包括，羟乙基甲基丙烯酸酯，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酸酯，N-乙烯基-2-吡咯烷酮，N-异丙基丙烯酰胺，醋酸乙烯酯，丙烯酸，甲基丙烯酸，聚乙二醇丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯，聚乙二醇二丙烯酸酯/二甲基丙烯酸酯，聚乙烯醇，富马酸二羟丙酯，或任意它们的衍生物。
29.如权利要求15所述的组合物，其中所述底物包括一种或多种纳米颗粒或者微粒。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述底物包括一种或者多种贵金属、过渡金属、半导体材料或磁性材料。
31.如权利要求29所述的组合物，其中所述底物包括一种或者多种金、银、铜、钯、铂、硫化镉(CdS)、铯化镉(CdSe)、二氧化钛(TiO2)、氧化锌(ZnO)、炭黑、4-膦酰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧稳定自由基、二氧化钛、钴、镍、铁、铁-钴，以及磁铁矿(Fe3O4)。
32.如权利要求15所述的组合物，其中所述底物包括玻璃或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
33.如权利要求5所述的组合物，其中所述交联的核酸分子形成核酸水凝胶。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述的水凝胶具有预先确定的几何样式。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述的几何样式具有多个孔。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述孔的尺寸小于大约15纳米。
37.如权利要求35所述的组合物，其中所述孔的尺寸选自包含以下尺寸的组：大约5纳米、大约10纳米、大约15纳米、大约20纳米、大约30纳米、大约40纳米、大约50纳米，以及大约100纳米。
38.如权利要求35所述的组合物，其中所述孔的尺寸选自包含以下尺寸范围的组：大约0.1微米至大约5微米、大约5微米至大约10微米、大约10微米至大约20微米、大约20微米至大约30微米、大约30微米至大约40微米、大约40微米至大约50微米、大约50微米至大约100微米，以及大约100微米至大约200微米。
39.如权利要求5所述的组合物，其中所述的核酸分子形成三维结构。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述的三维结构作为宏观支架。
41.如权利要求1所述的组合物，其中所述的核酸分子包括编码和非编码的核酸分子。
42.交联核酸分子的方法，包括：
提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；以及
光交联所述的多个核酸分子。
43.如权利要求42所述的方法，其进一步包括扩增核酸分子。
44.如权利要求42所述的方法，其进一步包括在光交联步骤前先杂交核酸分子。
45.如权利要求44所述的方法，其进一步包括对杂交后的核酸分子进行纯化。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述的纯化包括色谱法。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述的色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。
48.如权利要求42所述的方法，其中所述的多个核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)，或它们的组合。
49.如权利要求42所述的方法，其中所述的核酸分子包括寡核苷酸。
50.如权利要求42所述的方法，其中所述的支链结构包含一种或者多种X型、Y型、T型、哑铃型或类树状型的形态。
51.如权利要求42所述的方法，其中所述的核酸分子为等摩尔配比。
52.如权利要求42所述的方法，其进一步包括在光交联步骤之前先将光反应基团与至少部分所述的核酸分子进行偶联。
53.如权利要求52所述的方法，其进一步包括在光交联步骤之前将光反应基团与至少部分所述核酸分子的5’末端偶联。
54.如权利要求52所述的方法，其进一步包括在光交联步骤之前将光反应基团与至少部分所述核酸分子的3’末端偶联。
55.如权利要求52所述的方法，其进一步包括在光交联步骤之前将光反应基团与至少部分所述核酸分子的内部进行偶联。
56.如权利要求52所述的方法，其中所述光反应基团包括乙烯基、丙烯酸酯基、N-羟基琥珀酰亚氨基、氨基、羧酸酯基或者巯基。
57.如权利要求52所述的方法，其中所述光反应基团是伯胺修饰的基团、仲胺修饰的基团，或叔胺修饰的基团。
58.如权利要求42所述的方法，其中所述的光交联反应是在可见光、紫外光(UV)、近红外、红外和/或微波波段的电磁辐射下进行。
59.如权利要求42所述的方法，其中所述光交联反应在γ射线、X射线或无线电波下进行。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述的光交联反应在存在光引发剂的条件下进行。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述的光引发剂是艳佳固。
62.如权利要求42所述的方法，其中所述的光交联使用UV交联仪进行。
63.如权利要求42所述的方法，其中至少部分所述的核酸分子连接了一种或者多种其它化合物。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述的一种或者多种其它化合物包括肽、多肽、蛋白质、脂类，碳水化合物、核酸适体、抗体、抗原、细胞生长因子、DNA结合剂、可检测标签、可筛选标志物、生物素、药学试剂、药物、小分子、治疗性药剂、受体分子、配体、核酸分子或底物。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述的核酸分子含有编码区。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述的核酸分子包括siRNA、miRNA、snRNA、寡核苷酸(ODN)、基因序列、内含子序列、外显子序列、肽核酸(PNA)或mRNA序列。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述的肽包括腺病毒核心肽、合成肽、流感病毒HA2肽、猴免疫缺陷病毒gp32肽、SV40T-Ag肽、VP22肽、Tat肽，或Rev肽。
68.如权利要求64所述的方法，其中所述的肽包括DNA缩聚肽、DNA保护肽、内含体靶向肽、膜融合肽、核定位信号肽或者蛋白转导域肽。
69.如权利要求64所述的组合物，其中所述的可检测标签包括放射性标记探针、荧光标记探针、量子点标记探针、发色团标记探针、酶标记探针、亲和配体标记探针、电磁旋转标记探针、重原子标记探针，或纳米颗粒光散射标记探针。
70.如权利要求64所述的组合物，其中所述的可检测标签含有发色团、荧光基团、酶、抗原、重金属、磁性探针、染料、纳米晶体、磷光基团、放射性材料、化学发光基团、散射纳米颗粒、荧光纳米颗粒、拉曼信号产生基团，或者电化学检测基团。
71.如权利要求64所述的组合物，其中所述的可检测标签包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、链霉亲和素、亲和素、生物素、核酸适体、抗原、抗体、免疫球蛋白、抗免疫球蛋白抗体、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、TRITC、伊红、绿色荧光蛋白、四碘荧光素、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade BlueTM、得克萨斯红、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯、R-藻红蛋白、藻红蛋白、荧光稀土复合物、铕、铽、Cy3、Cy5、Cy7、地高辛、二硝基苯基、分子信标、荧光分子信标衍生物、发光氨、光散射材料、等离子共振材料、金、银、量子点、14C、123I、124I、125I、131I、锝-99m(Tc99m)、35S、32P或3H。
72.如权利要求63所述的方法，其中所述的一种或者多种其它化合物包括聚合物。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述的聚合物是，聚乙二醇(PEG)，聚(N-异丙基丙烯酰胺)，聚(N-烷基丙烯酰胺)，聚(N-正丙基丙烯酰胺)，聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)，肽，多肽，聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷，聚二芳基乙烯(DTEC)，葡聚糖-聚乳酸，弹力蛋白样多肽，聚酯，聚乳酸，聚(L-乳酸)，聚(D，L-乳酸)，聚乙丙交酯，生物素标记的乙二醇乳酸二嵌段共聚物，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚己内酯，聚酸酐，聚(双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)，聚原酸酯，聚磷酸酯，聚磷腈，聚苯乙烯，聚氨酯，聚氨基酸，聚环氧乙烷，聚环氧乙烷-聚丙烯-聚环氧乙烷，聚乳酸-g-聚乙烯醇接枝共聚物，聚环氧乙烷-聚L-乳酸，聚D，L-乳酸羟乙酸共聚物-聚乙二醇，聚(L-乳酸-乙二醇)，聚乙二醇聚羟基酸共聚物，聚乙烯醇，聚(乳酸赖氨酸共聚物)-聚天冬氨酸，聚己内酯-三亚甲基碳酸酯共聚物，聚(L-乳酸-乙醇酸-L-丝氨酸)共聚物，聚富马酸丙二醇酯，寡聚(富马酸聚乙二醇酯)，聚(富马酸丙二醇酯-乙二醇)，聚乙二醇二[乙基磷脂酰(乙二醇)甲基丙烯酸酯]，聚(N-异丙基丙烯酰胺)-聚乙二醇，聚(N-异丙基丙烯酰胺)-明胶，聚(N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸)或任意它们的衍生物。
74.如权利要求63所述的方法，其中所述的一种或者多种其它化合物包括天然的或者合成的生物相容性材料。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述的生物相容性材料包括聚乙二醇(PEG)水凝胶基质、N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)水凝胶基质、壳聚糖水凝胶基质或任意它们的衍生物。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述天然的生物相容性材料一种或多种其它化合物包括壳聚糖、甲基纤维素、海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、纤维素、明胶、胶原蛋白、葡聚糖或任意它们的衍生物。
77.如权利要求74所述的方法，其中所述合成的生物相容性材料包括羟乙基甲基丙烯酸酯，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酸酯，N-乙烯基-2-吡咯烷酮，N-异丙基丙烯酰胺，醋酸乙烯酯，丙烯酸，甲基丙烯酸，聚乙二醇丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯，聚乙二醇二丙烯酸酯/二甲基丙烯酸酯，聚乙烯醇，富马酸二羟丙酯，或任意它们的衍生物。
78.如权利要求64所述的方法，其中所述底物包括一种或多种纳米颗粒或微粒。
79.如权利要求64所述的方法，其中所述底物包括一种或者多种贵金属、过渡金属、半导体材料或磁性材料。
80.如权利要求64所述的方法，其中所述底物包括一种或者多种金、银、铜、钯、铂、硫化镉(CdS)、铯化镉(CdSe)、二氧化钛(TiO2)、氧化锌(ZnO)、炭黑、4-4-膦酰基氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧稳定自由基、二氧化钛、钴、镍、铁、铁-钴，以及磁铁矿(Fe3O4)。
81.如权利要求42所述的方法，其中所述交联的核酸分子形成核酸水凝胶。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述核酸水凝胶包括一种或者多种微薄膜、微垫衬、微薄纤维、纳米球或微球。
83.如权利要求81所述的方法，其中所述的核酸水凝胶具有通过乳化反应、光蚀刻、微流体合成、微模塑或微电子自旋或它们的组合的方法制造的结构。
84.如权利要求81所述的方法，其进一步包括在底物表面上包被核酸水凝胶。
85.如权利要求42-84中任一项所述的方法，其中所述交联进行10分钟或更短时间。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述交联进行5分钟或更短时间。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述交联进行1分钟或更短时间。
88.一种交联核酸分子的方法，包括：
提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；以及
交联所述的多个核酸分子10分钟或者更短时间。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述交联进行5分钟或更短时间。
90.如权利要求88所述的方法，其中所述交联进行1分钟或更短时间。
91.将一种或者多种化合物包封到核酸水凝胶中的方法，包括：
提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；
将一种或者多种化合物与所述多个核酸分子混合；以及
光交联所述多个核酸分子与一种或者多种化合物的混合物以形成核酸水凝胶，从而将所述一种或者多种化合物包封到核酸水凝胶中。
92.将一种或者多种化合物包封到核酸水凝胶中的方法，包括：
提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；
光交联所述多个核酸分子以形成核酸水凝胶；以及
将一种或者多种化合物与所述核酸水凝胶进行混合，从而将所述一种或者多种化合物包封到核酸水凝胶中。
93.如权利要求91-92中任一项所述的方法，其中所述的一种或者多种化合物包括蛋白质、肽、脂类、核酸，或碳水化合物。
94.如权利要求91-92中任一项所述的方法，其中所述的一种或者多种化合物包括治疗性药剂。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述治疗性药剂的包封效率至少达到大约90％。
96.如权利要求94所述的方法，其中所述治疗性药剂是小分子。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述小分子是阿霉素。
98.如权利要求91-92任一项所述的方法，其中所述一种或者多种化合物包括细胞。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
100.如权利要求91-92中任一项所述的方法，其中所述一种或者多种化合物包括病毒。
101.输运化合物的方法，包括：
提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；
将化合物与所述多个核酸分子进行混合；
光交联所述多个核酸分子与化合物的混合物以形成含有包封了所述化合物的核酸水凝胶组合物；以及，
给予患者所述组合物，其中所述组合物可以以时间可控方式来释放所述化合物，从而实现化合物的输运。
102.输运化合物的方法，包括：
提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；
光交联所述多个核酸分子以形成核酸水凝胶；
将所述化合物与核酸水凝胶进行混合以形成含有包封了所述化合物的核酸水凝胶组合物；以及，
给予患者所述组合物，其中所述组合物可以以时间可控方式来释放所述化合物，从而实现化合物的输运。
103.如权利要求101-102中任一项所述的方法，其中所述化合物包括治疗性药剂。
104.如权利要求101-102中任一项所述的方法，其中所述化合物包括细胞。
105.如权利要求101-102中任一项所述的方法，其中输运到达的地方是细胞、体液、组织、器官或皮肤。
106.如权利要求101-102中任一项所述的方法，其中所述水凝胶具有孔。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述孔的尺寸大于约15纳米。
108.如权利要求106所述的方法，其中所述孔的尺寸小于等于约15纳米。
109.如权利要求104所述的方法，其中所述水凝胶提供了细胞在其中生长的三维基质。
110.非细胞体系合成一种或者多种蛋白质的方法，包括：
提供多个可以形成一种或者多种支链结构的核酸分子；
光交联所述多个核酸分子以形成核酸水凝胶；以及
在核酸水凝胶中表达一种或者多种蛋白质。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述水凝胶具有孔。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述孔的尺寸范围为大约50纳米至500纳米。
113.如权利要求111所述的方法，其中所述孔的尺寸选自以下尺寸的组：大约5纳米、大约10纳米、大约15纳米、大约20纳米、大约30纳米、大约40纳米、大约50纳米，以及大约100纳米。
114.如权利要求110所述的方法，其中所述水凝胶含有编码和非编码的核酸分子。
115.如权利要求110所述的方法，其中所述水凝胶包含核酸分子，以及一种或者多种蛋白质修饰必需的大分子，从而合成有修饰的蛋白质。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述修饰包括选自以下组的一种或者多种：磷酸化、糖基化、甲基化、泛素化、生物素化、烷基化、乙酰化、谷氨酰基化、甘氨酰化、异戊二烯化、脂化、磷酸泛酰巯基乙胺基化、硫化、瓜氨酸化、脱酰胺化，或异构化。
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