CN102206645B

CN102206645B - 利用慢病毒载体介导RNAi的方法

Info

Publication number: CN102206645B
Application number: CN2011101106442A
Authority: CN
Inventors: 胡康洪; 王薇薇; 彭洪泉
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Chengdu Luo Kang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2031-04-29
Also published as: CN102206645A

Abstract

本发明是一种利用慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是：先对相关病毒的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相关病毒保守区域的siRNA；将siRNA克隆到表达质粒pLVTH后，再与pCMV-dR8.91、pMD2.G共同转染293T细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，然后将其与LV-tTR-KRAB共转导入靶细胞，并且利用四环素类似物DOX来严格控制siRNA药物作用的时间及剂量。本发明因其高效的转导率及严格的控制体系可以真实的评价siRNA在体内的抗病毒作用，同时可以追踪药物干扰作用的全过程，从而为临床提供了使用前景。

Description

利用慢病毒载体介导RNAi的方法

技术领域

本发明涉及生物信息学及分子病毒学技术领域，具体涉及一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi研究抗病毒的方法。

背景技术

近年来世界上很多实验室利用siRNA干扰进行抗病毒研究，很多结果要么互相矛盾要么干扰效果不明显。关键的问题是，他们所使用的工作模型大都仅限于使用转染的细胞系。由于转染效率极其有限，难以对进入胞内的siRNA抗病毒效果真正进行评价。后来，RNAi常常利用病毒载体来表达siRNA，其中常见的是逆转录病毒载体和腺病毒载体。但是逆转录病毒只感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段不超过8kb；腺病毒载体感染细胞时，病毒DNA游离在细胞核内，并不能整合到宿主染色体中，在体内不能实现稳定的长期表达，而且反复应用容易引起免疫反应，所以来源于人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的慢病毒载体（Lentiviral vector）越来越受到人们的重视。

慢病毒载体既可以感染分裂细胞，也可以感染非分裂细胞如神经细胞、肝细胞、造血干细胞以及肌肉细胞等，转移的外源基因片段大，宿主范围很广，而且降低了重组的机会，最重要的特点是它可以整合到宿主的基因组中，从而可以高效持久的表达外源基因，因而成为广为关注的真核生物基因转移的载体。经修饰过后的慢病毒载体在真核细胞中可以实现诱导调控，比如在慢病毒载体上加入一个多重控制开关，通过四环素或四环素类似物就可以实现对外源基因的可控表达。

慢病毒载体的构建非常简单，原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件（如包装信号、长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序列进行分离。目前构建慢病毒有二质粒表达系统、三质粒表达系统以及四质粒表达系统。最常用的是三质粒表达系统（包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒）：包装质粒用来表达HIV-1复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒的包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）；转移质粒中含有H1启动子，能在宿主细胞中持续表达外源基因，同时表达由EF1（Elongation Factor1）启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP），用于病毒包装时转染效率及感染目的细胞的感染效率的检测。三质粒表达系统的最大优势是使序列重叠的机会大大降低，从而降低了载体重组过程中产生RCV的可能性。

拥有多重控制开关的慢病毒载体系统，能使转染效率大幅度提高到90%以上。为此，我们将利用该系统深入评价siRNA抗病毒的效果。由于极高的转染效率，将会使药物的抗病毒效果得到更真实的评价，将来也更有可能用于体内的特异靶向性药物释放。另外，该体系所拥有的四环素开关，不仅能使研究者详细调查siRNA药物的干扰效果，而且通过开关控制能够追踪药物干预的过程，为探索药物动力学、代谢学和毒理学提供了可能。因此，建立该系统将为抗病毒药物研究提供一个极为实用的工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：运用强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi技术，提供一种利用siRNA研究抗病毒的方法，以便对siRNA药物的干扰作用进行详细评价，而且通过开关控制来追踪药物作用的全过程，为抗病毒药物的研究作出贡献。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的是一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是：首先，运用相关的生物学软件对相关病毒的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相关病毒保守区域的siRNA；再将合成的siRNA克隆到表达质粒pLVTH中，然后将该表达质粒与pCMV-dR8.91、pMD2.G共同转染293T细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，最后将表达siRNA的慢病毒载体与控制四环素开关的慢病毒载体LV-tTR-KRAB共转导入靶细胞，并且利用四环素类似物DOX来严格控制siRNA药物作用的时间及剂量。

本发明可以采用包括以下步骤的方法：

（1）筛选siRNAs：

先根据GeneBank中HBV的基因序列U95551，参考siRNA设计的原则，在siRNA设计网站http://rnadesigner.classic.invitrogen.com/rnaiexpress/index.jsp选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC%在45%-55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列。

（2）对筛选出的siRNAs的评价：

将不同的siRNAs构建到真核表达载体pSuper中，初步评价这几种siRNAs对病毒是否有影响，其方法是：利用Lipofectamine2000^TM（购自美国Invitrogen公司）将pSuper-siRNA转染进细胞中，收集转染后细胞上清及细胞，利用分子生物学技术检测相应的病毒指标的变化；

（3）构建表达siRNA的慢病毒载体：

分别将这几种siRNAs克隆到慢病毒转移质粒pLVTH中，然后将构建好的转移质粒pLVTH-HBV-siRNA与包装质粒pCMV-dr8.91、包膜质粒pMD2.G按照每60mm细胞培养皿15μg:10μg:5μg的比例用磷酸钙转染试剂盒（购自碧云天公司）共转染进汇合率为80%左右的293T细胞中，收集转导后48h的细胞上清，2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片，然后24500rpm离心2hours，弃去上清，最后用Opti-MEM（购自美国Gibco公司）重悬病毒；

（4）测慢病毒载体的滴度：

将重悬病毒按照10倍梯度稀释，然后分别加入96孔板的各空中，至培养箱中培养；孵育过夜后，换新鲜的细胞培养液继续培养；48h后观察荧光，数出荧光细胞占9-11%的孔中细胞的数目；再按照以下公式计算出病毒滴度：

Tilter(/ml)=10%GFP⁺cells×总细胞数×病毒稀释倍数，

（5）评价构建的慢病毒载体介导的RNAi对病毒的影响：

将构建好的慢病毒载体按照MOI=10的滴度转导进靶细胞，转导可同时加入6μg/mL的Polybrene（购自美国Sigma公司）以提高转导效率，然后详细评价转导后不同时间内病毒复制和表达水平的变化；

（6）构建强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi系统：

将表达四环素抑制蛋白tTR-KRAB的表达质粒与慢病毒包装质粒pCMV-dr8.91、包膜质粒pMD2.G共转导进293T细胞中，收集48h后的细胞上清2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤，然后24500rpm离心2hours，弃去上清，最后用Opti-MEM重悬病毒，使病毒的滴度与表达siRNA的慢病毒载体的滴度达到一致；

（7）观察DOX诱导的慢病毒载体介导的RNAi对病毒复制和表达的影响：将表达siRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒同转导进靶细胞中，第二天将细胞分为2组，一组加DOX处理，另一组不加DOX处理，4天后分别收集这两组细胞，抽提细胞内的HBV的核衣壳，一半直接用来做Western blotting，目的是检测HBV core蛋白表达水平的变化；另一半将核衣壳内的HBV DNA抽提纯化出来，用P³²标记的探针做Southern blotting检测，其目的是观察胞内HBV的复制情况。

本发明可以采用以下方法筛选siRNAs：

先根据GeneBank中HBV的基因序列U95551，参考siRNA设计的原则，在siRNA设计网站http://rnadesigner.classic.invitrogen.com/rnaiexpress/index.jsp选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC%在45%-55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列；然后根据pSuper载体的要求，设计60-64nt的两端分别包括Bgl II和Hind III的酶切位点的寡核苷酸链，同时设计一个无关的干扰序列作为阴性对照。

所述利用分子生物学技术检测相应的病毒指标的变化的方法是：利用包括ELISA、real-time PCR、RT-PCR、Western blotting、Southern blotting在内的分子生物学技术分别检测病毒的HBsAg和HBeAg、上清HBV的拷贝数、胞内HBV mRNA表达情况、胞内HBV core蛋白表达水平的变化以及胞内HBV复制水平的变化。

所述用Opti-MEM重悬病毒的方法是：慢病毒载体以24500rpm超速离心2hours之后，用100μl的冰的Opti-MEM重悬病毒，采用Opti-MEM的优点是可以优化病毒载体转导时的条件，提高病毒转导的水平。在用Opti-MEM重悬病毒的时候，要将病毒置于冰上至少2hours，并轻轻操作，不能产生气泡.

本发明可以采用以下方法详细评价病毒复制和表达的水平：

慢病毒载体转导进靶细胞后，在以下不同的时间点：24h、48h、72h、96h和1week时收集细胞上清，然后再收集1week后的细胞，用于检测不同的病毒指标的变化。细胞上清中HBV的HBsAg和HBeAg水平的变化是用科华ELISA试剂盒检测；上清中病毒拷贝数的变化是利用real-time PCR检测，其中上清HBV DNA的抽提按照TIANGEN病毒基因组 DNA/RNA提取试剂盒操作说明操作，最后在Aligent Technology软件中进行分析；胞内病毒RNA水平的变化是采用实时荧光RT-PCR检测方法（将细胞管家基因β-actin作为内参基因），然后在Aligent Technology软件中进行分析；而胞内病毒的复制水平的变化是利用P³²标记的Southern blotting检测细胞内核衣壳中HBV DNA的含量；胞内病毒蛋白的表达水平的变化是利用Western blotting检测胞内核衣壳中core蛋白的含量，并将胞内GAPDH含量作为内参。

本发明可以采用以下方法观察DOX加或DOX不加的情况下病毒复制和表达水平的变化：将表达siRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒同转导进靶细胞，第二天将细胞分为2组，一组加DOX处理，另一组不加DOX处理，4天后分别收集这两组细胞，抽提细胞内的HBV的核衣壳，一半直接用来做Western blotting，目的是检测HBV core蛋白表达水平的变化；另一半将核衣壳内的HBV DNA抽提纯化出来，用P³²标记的探针做Southern blotting检测，其目的是观察胞内HBV的复制情况。

本发明具有以下主要的技术优势和效果：

其一.利用生物信息学技术设计了针对乙肝病毒HBV保守区的三对siRNAs,分别是HBV的DR1区（1826nt-1845nt）、CP区(1775nt-1795nt)和RT区(672nt-692nt)，将合成好的这几对siRNAs分别构建到慢病毒载体中，转导进肝癌细胞系HepG2.2.15中。然后检测转导后24h、48h、72h、96h、1week时的细胞上清中HBsAg、HBeAg以及HBV病毒拷贝数的变化，以及细胞内病毒复制和表达的情况。发现基于强力霉素控制下的慢病毒载体介导的RNAi不仅强烈抑制了HBV复制和表达，而且这种抑制作用是受到强力霉素的严格控制的。这为抗病毒治疗提供了非常重要的应用价值。

其二.利用一种新型的强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi技术，建立一种抗病毒的新方法。由于该载体具有高效、安全、高度特异性的特点，能够有效的控制病毒的复制及表达情况，因而为控制病毒感染以及治疗病毒性疾病作出贡献。

其三.鉴于目前使用的siRNA表达载体如真核表达载体或者腺病毒载体有着各自的缺陷，基于上述效用，本发明还有以下的优点和效果：

利用强力霉素控制慢病毒载体介导的RNAi首先解决了siRNA转移效率低下的难题，利用慢病毒载体可以将siRNA高效的转导进各种细胞，包括分裂细胞和非分裂细胞；其次慢病毒载体可以整合到靶细胞的基因组中，实现了对siRNA的持续表达，本发明检测到慢病毒载体介导的RNAi对HBV的强抑制作用可以维持1周的时间；最重要的是本发明显示加入DOX后，慢病毒载体介导的RNAi不仅强烈抑制HBV复制，而且对细胞并未造成损伤，而一旦去除DOX，这种干扰效应立即消失。这表明这种干扰作用是受到强力霉素的严格控制的，这比其他载体更具安全性，避免了持续表达外源siRNA而可能导致的细胞毒副作用，同时通过DOX开关可以严密控制siRNA药物作用的时间和剂量，更有助于药物动力学的研究；而且利用三质粒表达系统（表达质粒、包膜质粒、转移质粒）构建的慢病毒载体，跟其他病毒载体相比，其构建更简单方便，更不会产生重组病毒。因此，该发明具有安全、高效、成本低等特点，非常适合用于抗病毒的治疗研究。这也为开发出抗病毒治疗更有效的方法提供了更为广阔的前景。

附图说明

图1是慢病毒介导的RNAi对细胞上清中HBsAg分泌水平的影响示意图。

图2是慢病毒介导的RNAi对细胞上清中HBeAg分泌水平的影响示意图。

图3是慢病毒介导的RNAi对细胞内HBV mRNA水平的影响示意图。

图4是DOX诱导的慢病毒介导的RNAi对HBVCore蛋白表达的调控效果示意图。

图5是DOX诱导的慢病毒介导的RNAi对HBV复制的调控效果示意图。

图6是DOX诱导的慢病毒载体的包装示意图。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明作进一步说明：

本发明提供的利用强力霉素控制的慢病毒载体系统介导RNAi的方法，包括以下步骤：

1.利用生物信息学筛选出针对HBV不同保守区的siRNAs，先根据GeneBank中HBV的基因序列U95551，参考siRNA设计的原则，在siRNA设计网站http://rnadesigner.classic.invitrogen.com/rnaiexpress/index.jsp选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC%在45%-55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列；然后根据pSuper载体的要求，设计60-64nt的两端分别包括Bgl II和Hind III（购自Takara公司）的酶切位点的寡核苷酸链，同时设计一个无关的干扰序列作为阴性对照，其过程见表1，然后合成设计好的干扰序列。（Invitrogen公司合成）

2.将不同的siRNAs构建到真核表达载体pSuper中，初步评价这几对siRNAs对HBV是否有影响：提前一天将能持续表达HBV的肝癌细胞系HepG2.2.15细胞按照5×10⁵/孔的密度接种到6孔板中，转染时细胞融合度要达到80-90%。第二天利用Lipofectamine2000^TM将pSuper-siRNA（按照质粒：Lipofectamine2000^TM=4μg：10μl的比例）转染进HepG2.2.15细胞中，6小时后换新鲜的含10%FBS的细胞培养液继续培养，然后收集转染后不同时间点的细胞上清及细胞，ELISA（ELISA试剂盒购自上海科华公司）、RT-PCR及real-time PCR（相关引物均由Invitrogen公司合成）分别检测HBsAg和HBeAg、HBV mRNA以及HBV拷贝数的变化。结果显示这几个干扰位点对HBV复制和表达都有一定的抑制作用。

3.构建表达siRNA的慢病毒载体：分别将这几种siRNAs克隆到慢病毒转移质粒pLVTH中，然后将构建好的转移质粒pLVTH-HBV-siRNA与包装质粒pCMV-dr8.91、包膜质粒pMD2.G按照每60mm细胞培养皿15μg:10μg:5μg的比例用磷酸钙转染试剂盒（购自碧云天公司）共转染进293T细胞中，收集转导后48h的细胞上清，2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤，然后用超速离心机（Beckman公司）在24500rpm、4℃超速离心2hours,小心弃去上清，冰浴至少2小时，最后用Opti-MEM重悬并分装病毒。

4.测慢病毒载体的滴度：测定前一天将HepG2.2.15细胞以5×10⁴/孔的密度接种于96孔板中。准备6-9个无菌的EP管，加入90μl的新鲜培养液。将待测定的病毒原液10μl加入第一个EP管中，混匀，取10μl加入到第二个EP管中，以此类推直至最后一管。将所选的细胞孔中吸出原有的细胞培养液，将稀释好的病毒液分别加入各孔中，至于培养箱中培养。孵育过夜后，换新鲜的细胞培养液100μl,继续培养。48h后观察荧光。数出荧光细胞占10%左右的孔中细胞的数目。按照以下公式计算出病毒滴度：

Tilter(/ml)=%GFP⁺cells×总细胞数×病毒稀释倍数。

5.评价构建的慢病毒载体介导的RNAi对HBV复制和表达的影响：提前一天将HepG2.2.15细胞以5×10⁵/孔的密度接种到6孔板中，第二天将构建好的慢病毒载体按照MOI=10的滴度转导HepG2.2.15细胞中，转导可同时加入6μg/mL的Polybrene（购自美国Sigma公司）以提高转导效率，病毒孵育12h后，换新鲜的含10%FBS的培养液继续培养，然后收集转导后不同时间点的细胞上清，最后收集细胞，利用ELISA、RT-PCR、real-time PCR、Western blotting和Southern blotting分别检测HBV的HBsAg及HBeAg、HBV mRNA、viral loads、HBV core蛋白以及HBV复制的情况。

6.构建强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi系统：将表达四环素抑制蛋白tTR-KRAB的表达质粒与慢病毒包装质粒pCMV-dr8.91、包膜质粒pMD2.G按照每60mm细胞培养皿15μg:10μg:5μg的比例用磷酸钙转染试剂盒（购自碧云天公司）共转染进293T细胞中，8小时后换新鲜的含10%FBS的培养液继续培养，收集48h后的细胞上清，2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤，然后用超速离心机（Beckman公司）在24500rpm、4℃超速离心2hours,小心弃去上清，冰浴至少2小时，最后用Opti-MEM重悬并分装病毒，使病毒的滴度与表达siRNA的慢病毒载体的滴度达到一致。

7.将表达siRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒同转导进靶细胞中，然后观察DOX加或者不加对HBV复制和表达的影响：提前一天将HepG2.2.15细胞以5×10⁵/孔的密度接种到6孔板中，第二天将将表达siRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒都以MOI=10的滴度转导进HepG2.2.15细胞，同时加入6μg/mL的Polybrene（购自美国Sigma公司），病毒孵育12h后，将细胞一分为二，一半加入含5μg/mLDOX（购自美国Sigma公司）的新鲜培养液；另一半加入不含DOX的新鲜培养液，继续培养；4天后收集细胞，抽提胞内的HBV核衣壳，一半用来做Western blotting检测HBV Core蛋白表达水平的变化，另一半抽取核衣壳内的HBV DNA，然后用P³²标记的探针做Southern blotting以检测HBV DNA复制水平的变化。

8.结果分析：

（1）慢病毒介导的针对HBV不同保守区的siRNA对HBV都有不同程度的抑制，参见图1、图2、图3和表2。结果说明如下：

每个样品取三次实验的平均值，将未处理组HepG2.2.15细胞上清中HBeAg和HBsAg值设为100，可见LV-HBV-siRNA2(1775-1795i)和LV-HBV-siRNA3(1826-1845i)在HBsAg和HBeAg的水平上都有显著的抑制作用。其中，在转导后72h时，LV-HBV-siRNA3(1826-1845i)对HBsAg的抑制达到最大，抑制率为98.5%；而相应的LV-HBV-siRNA2(1775-1795i)对HBsAg 的抑制则达到90.9%。这种抑制的趋势同样体现在HBeAg上：在转导后96h时，LV-HBV-siRNA3(1826-1845i)对HBeAg的抑制达到最大，抑制率为73.5%；而LV-HBV-siRNA2(1775-1795i)对HBeAg的抑制率则达到44.9%（如图1和图2）。

在转导后96h时，LV-HBV-siRNA3使上清中HBV的DNA拷贝数降低了10倍以上，而LV-HBV-siRNA2可以将上清中HBV的DNA拷贝数降低约9倍，抑制效率最小的LV-HBV-siRNA1也能将HBV的DNA拷贝数降低4倍左右（表2）。

胞内HBV mRNA水平的变化是根据HBV特异性引物水平的量除以内参基因β-actin的量得出来的。每个样品都是取均值。将未处理组的比值设为100，比值大于100则表示HBV mRNA水平高于未处理组，即mRNA水平上升；相反，若比值小于100，则表示HBV mRNA水平降低，值越小表示干扰效果越好。结果显示：跟未处理组相比，LV-HBV-siRNA3（1826-1845i）可以将HBV的mRNA水平降低98.1%；而LV-HBV-siRNA2（1775-1795i）使HBV mRNA水平降低了82.8%(图3)；这同样和前面的ELISA及real time PCR结果相符合，说明LV-HBV-siRNA3（1826-1845i）及LV-HBV-siRNA2（1775-1795i）对HBV的转录产物同样有很强的抑制作用。

（2）利用DOX控制的慢病毒载体系统不仅可以强烈控制HBV的复制和表达，并且这种抑制作用是受到DOX的严格控制的（图4和图5）。

图4是没有DOX的情况下，即使LV-HBV-siRNA3与LV-tTR-KRAB同时感染，HBV的core蛋白依旧正常表达，但是一旦加入DOX（5μg mL-1），慢病毒介导的RNAi立即显示出很强的干扰效果，HBV的core蛋白的表达量立即下降。而如果仅仅是LV-HBV-siRNA3感染HepG2.2.15细胞，不管有没有DOX的存在，都表现出强烈的抑制效果。而内参GAPDH的表达水平却没有任何的变化。

图5是没有DOX的情况下，LV-HBV-siRNA3与LV-tTR-KRAB同时感染，HBV的复制依旧正常进行，但是一旦加入DOX（5μg mL-1），慢病毒介导的RNAi立即显示出很强的干扰效果，HBV的复制被抑制，RC-DNA、DL-DNA以及ssDNA的含量都显著降低，而如果仅仅是LV-HBV-siRNA3感染HepG2.2.15细胞，不管有没有DOX的存在，都表现出了强烈的抑制效果，这跟Western blotting的结果是一致的。HBV在胞内核衣壳中完成其复制过程的，HBV的复制中间体包括RC-DNA、DL-DNA以及ssDNA的含量一旦被降低，其复制的过程就无法完成。

本实施例提供了如图6所示的DOX诱导的慢病毒载体的包装示意图，其过程是：首先在293T细胞中构建表达siRNA的慢病毒载体LV-siRNA和表达四环素抑制蛋白的慢病毒载体LV-tTR-KRAB；其过程是利用磷酸钙转染试剂盒（购自碧云天公司）按照pLVTH-siRNA：pCMV-dr8.91：pMD2.G=15μg:10μg:5μg以及pLV-tTR-KRAB：pCMV-dr8.91：pMD2.G=15μg:10μg:5μg的比例分别加入到前一天接种了293T细胞的60mm的细胞皿（购自美国Corning公司）中，然后分别收集转染后48h的细胞上清，2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤，然后用超速离心机（Beckman公司）在24500rpm、4℃超速离心2hours, 小心弃去上清，冰浴至少2小时，最后用Opti-MEM重悬病毒；其次，将这两个病毒载体以同样的病毒滴度转导进靶细胞中，慢病毒载体一旦进入靶细胞，其基因组会整合到宿主的基因组上，然而，表达四环素抑制蛋白的慢病毒载体进入靶细胞后，表达tTR-KRAB蛋白，该蛋白通过DNA结合结构域结合到表达siRNA的慢病毒载体的tetO上，从而关闭相关基因的表达；此时，若加入四环素类似物强力霉素（DOX）,则DOX会立刻结合到tTR-KRAB蛋白上，改变其结构域，从而使其不能结合tetO，进而开启相关干扰基因的表达，siRNA在细胞核内转录后进入细胞质中，继而被细胞质中的Dicer酶切割成19-21nt的siRNA，然后siRNA与胞内的蛋白聚合形RNA沉默复合体（RISC），最后降解与之同源的靶mRNA，达到其抑制作用。

附表

表1利用生物信息学筛选出针对HBV不同保守区的siRNAs

Figure DEST_PATH_RE-GDA00003372264100081

表2慢病毒介导的RNAi对细胞上清中HBV病毒颗粒分泌水平的影响

Time（HBV DNA copy×10⁴mL^-1）

序列表

<110>中国科学院武汉病毒研究所

<120>利用慢病毒载体介导RNAi的方法

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>针对HBV保守区的siRNA(N)的靶序列

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>1

CTAGTGAAGGGCGTATGATTA

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>针对HBV保守区的siRNA1的靶序列

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>2

GCTCAGTTTACTAGTGCCA

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>针对HBV保守区的siRNA2的靶序列

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>3

CTAGGAGGCTGTAGGCATAAA

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>针对HBV保守区的siRNA3的靶序列

<220>

<221>

<222>

<223>

<400>4

TTCACCTCTGCCTAATCAT

Claims

1.一种利用慢病毒载体介导RNAi的方法，其特征是一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是：首先，运用相关的生物学软件对乙型肝炎病毒HBV的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出下表所列的针对乙型肝炎病毒HBV保守区域的siRNA：

再将合成的siRNA克隆到表达质粒pLVTH中，

然后将该表达质粒与pCMV-dR8.91、pMD2.G共同转染293T细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，

最后将表达siRNA的慢病毒载体与控制四环素开关的慢病毒载体LV-tTR-KRAB共转导入HepG2.2.15细胞中，并且利用强力霉素来严格控制siRNA药物作用的时间及剂量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用包括以下步骤的方法：

（1）筛选siRNAs：

利用生物信息学筛选出针对相应病毒的几种siRNAs：先根据GeneBank中乙型肝炎病毒HBV的基因序列，参考siRNA设计的原则，选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC%在45%-55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列；

（2）对筛选出的siRNAs的评价：

将不同的siRNAs构建到真核表达载体pSuper中，初步评价这几种siRNAs对病毒是否有影响，其方法是：利用Lipofectamine2000^TM将pSuper-siRNA转染进细胞中，收集转染后细胞上清及细胞，利用分子生物学技术检测相应的病毒指标的变化；

（3）构建表达siRNA的慢病毒载体：

分别将这几种siRNAs克隆到慢病毒转移质粒pLVTH中，然后将构建好的转移质粒pLVTH-HBV-siRNA与包装质粒pCMV-dr8.91、包膜质粒pMD2.G共转导进293T细胞中，收集转导后48h的细胞上清，2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤，然后24500rpm离心2hours，弃去上清，最后用Opti-MEM重悬病毒；

（4）测慢病毒载体的滴度：

将重悬病毒按照10倍稀释，然后分别加入各孔中，至培养箱中培养；孵育过夜后，换新鲜的细胞培养液继续培养；48h后观察荧光，数出荧光细胞占9-11%的孔中细胞的数目；再按照以下公式计算出病毒滴度：

Tilter(/ml)=10%GFP⁺cells×总细胞数×病毒稀释倍数，

（5）评价构建的慢病毒载体介导的RNAi对病毒的影响：

将构建好的慢病毒载体按照MOI=10的滴度转导进细胞，然后详细评价病毒复制和表达的水平；

（6）构建强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi系统：

将表达四环素抑制蛋白tTR-KRAB的表达质粒与慢病毒包装质粒pCMV-dr8.91、包膜质粒pMD2.G共转导进293T细胞中，收集48h后的细胞上清，2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤，然后24500rpm离心2hours，弃去上清，最后用Opti-MEM重悬病毒，使病毒的滴度与表达siRNA的慢病毒载体的滴度达到一致；

（7）将表达siRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒同转导进靶细胞中，然后观察强力霉素加或者不加的情况下病毒复制和表达水平的变化。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于采用以下方法筛选siRNAs：

先根据GeneBank中HBV的基因序列U95551，参考siRNA设计的原则，选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC%在45%-55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列；然后根据pSuper载体的要求，设计60-64nt的两端分别包括Bgl II和Hind III的酶切位点的寡核苷酸链，同时设计一个无关的干扰序列作为阴性对照。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于利用分子生物学技术检测相应的病毒指标的变化的方法是：

利用包括ELISA、real-time PCR、RT-PCR、Western blotting、Southern blotting在内的分子生物学技术分别检测病毒的HBsAg和HBeAg、上清HBV的拷贝数、胞内HBV mRNA表达情况、胞内HBV core蛋白表达水平的变化以及胞内HBV复制水平的变化。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于用Opti-MEM重悬病毒的方法是：

慢病毒载体以24500rpm超速离心2hours之后，用100μl的冰的Opti-MEM重悬慢病毒，此时要将慢病毒置于冰上至少2h，并轻轻操作，不能产生气泡。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于采用以下方法详细评价病毒复制和表达的水平：

慢病毒载体转导进HepG2.2.15细胞后，在24h、48h、72h、96h和1week的时间点分别收集细胞上清，然后收集1week后的细胞，用于检测不同的病毒指标的变化；细胞上清中HBV的HBsAg和HBeAg水平的变化是用科华ELISA试剂盒检测；细胞上清中病毒拷贝数的变化是利用real-time PCR检测，其中上清HBV DNA的抽提按照TIANGEN病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒操作说明操作，最后在Aligent Technology软件中进行分析；细胞内病毒RNA水平的变化是采用实时荧光RT-PCR检测方法，检测时将细胞管家基因β-actin作为内参基因，然后在Aligent Technology软件中进行分析；而细胞内病毒的复制水平的变化是利用P³²标记的探针做Southern blotting检测细胞内核衣壳中HBVDNA的含量；细胞内病毒蛋白的表达水平的变化是利用Western blotting检测胞内核衣壳中core蛋白的含量，并将细胞内GAPDH含量作为内参。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用以下方法观察强力霉素加或强力霉素不加的情况下病毒复制和表达水平的变化：

将表达siRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒同转导进靶细胞，第二天将细胞分为2组，一组加强力霉素处理，另一组不加强力霉素处理，4天后分别收集这两组细胞，抽提细胞内的HBV的核衣壳，一半直接用来做Western blotting，目的是检测HBV core蛋白表达水平的变化；另一半将核衣壳内的HBV DNA抽提纯化出来，用P³²标记的探针做Southern blotting检测，其目的是观察胞内HBV的复制情况。