CN102209899A - 作为癌症的标记物的pacap - Google Patents
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Abstract
本发明涉及有助于评估癌症的方法。其公开了促凋亡胱天蛋白酶衔接蛋白（=PACAP）作为不同癌症类型的通用标记物的用途。PACAP有助于与肺有关的癌症或肺癌（LC），特别是非小细胞肺癌(NSCLC)的评估，而且还有助于其他特定类型的癌症的评估。此类特定癌症类型是例如结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌。此外，本发明特别是涉及用于通过测量来源于个体的液体样品中的PACAP来从所述样品评估癌症的方法。PACAP的测量可以例如用于癌症的早期检测或用于经历手术的患者的监测。
Description
描述
本发明涉及有助于评估癌症的方法。其公开了促凋亡胱天蛋白酶衔接蛋白（proapoptotic
caspase adaptor protein, =PACAP）作为不同癌症类型的通用标记物的用途。PACAP有助于评估与肺有关的癌症或肺癌(LC)，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)，而且还有助于评估其他特定类型的癌症。此类特定癌症类型是例如结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌。此外，本发明特别地涉及用于通过测量来源于个体的液体样品中的PACAP来从所述样品评估癌症的方法。PACAP的测量可以例如用于癌症的早期检测或用于经历手术的患者的监测。
癌症仍然是主要的公共卫生挑战，尽管在检测和治疗上已取得进步。癌细胞以不再服从机体生长控制机制的非典型和无限生长为特征。肿瘤细胞的去分化和赘生生长可能导致癌症相关标记蛋白的产生。在携带癌细胞的个体的组织和体液中都可能发现这些癌症相关蛋白。它们的水平在致癌性进展的早期通常很低，在疾病的进展过程中增加，或者在极少的情况下观察到癌症相关蛋白在疾病进展过程中显示降低的水平。新型癌症相关蛋白的鉴定及其灵敏检测对技术专家和公众健康系统均是巨大的挑战。最普遍的癌症类型是乳腺癌(BC)、肺癌(LC)和结直肠癌(CRC)。
用于实体瘤的最重要的治疗方法是：
a)肿瘤的手术切除，
b)化学疗法,
c)放射性疗法
d)使用生物制品如抗肿瘤抗体或抗血管生成抗体的疗法和
e)上述方法的组合。
肿瘤的手术切除已被广泛接受为早期实体瘤的一线疗法。然而，大多数癌症只有当它们显示症状，即当患者已处于疾病进展的相当晚期时才被检测到。
癌症的分期是根据程度、进展和严重度对疾病的分类。其将癌症患者分类，这样可对治疗的预后和选择进行归纳。
今天，TNM系统是最为广泛使用的癌症的解剖学范围的分类。其代表了国际上接受的统一的分期系统。存在3个基本变量：T(原发性肿瘤的范围)、N(区域淋巴结的状态)和M(远端转移的存在或不存在)。TNM标准由UICC (国际防癌联盟（International Union Against Cancer）), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification
of Malignant Tumours, 第6版，2002)公布。一旦TNM状态被确定，患者则被分类至由范围从I至IV（IV是最晚期疾病的分期）的罗马数字表示的疾病分期。TNM分期和UICC疾病分期彼此相应，如取自Sobin L.H.和Wittekind (eds.)（同上）的下表中所示的。
TNM
分期与
UICC
疾病分期的相互关系
| UICC 疾病分期 | T 分期 | N 分期 | M 分期 |
| 0期 | Tis | N0 | M0 |
| I期 | T1, T2 | N0 | M0 |
| IIA期 | T3 | N0 | M0 |
| IIB期 | T4 | N0 | M0 |
| IIIA期 | T1, T2 | N1 | M0 |
| IIIB期 | T3, T4 | N1 | M0 |
| IIIC期 | 任何T | N2 | M0 |
| IV期 | 任何T | 任何N | M1 |
尤其重要的是癌症例如结直肠癌（CRC）的早期诊断转变为好得多的预后。在CRC中，结肠直肠的恶性肿瘤起于良性肿瘤，即来自腺瘤。因此，最佳预后使患者在腺癌期被诊断。早在Tis、N0、M0或T1-3; N0; M0期被诊断的患者，如果经适当治疗，与对于当远端转移已存在时诊断的患者只有10%的5年存活率相比较，在诊断后具有90%以上的机会存活5年。
目前的检测方法（包括成像方法，例如X射线或核共振）在理论上可能至少部分适合用作一般筛查工具。然而，它们极其昂贵，因而对于卫生保健系统来说不能承担其在大量受试者（特别对于无任何肿瘤症状的受试者）的大规模筛选中普遍和广泛的使用。
本发明的目的之一是提供简单且成本效率的肿瘤评估方法，例如以鉴定怀疑患有癌症的个体。为此目的，可在组织样品或体液例如血液或血清或血浆中检测到的一般肿瘤标记物或一组此类标记物将是令人期待的。
许多血清肿瘤标记物已用于临床应用。例如细胞角蛋白 19的可溶性30 kDa
片段(CYFRA 21-1)、癌胚抗原（carcinoembryogenic antigen）(CEA)、神经元特异烯醇化酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最突出的LC标记物。然而，它们中没有一个满足筛查工具所需的灵敏度和特异性标准(Thomas,
L., Labor和Diagnose (2000) TH Books
Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany)。
为了具有临床效果（clinical utility），作为单个标记物的新型诊断标记物应当可与本领域内已知的其他标记物相当，或更好。或者，如果分别地将新型标记物单独使用或与一个或更多个其他标记物组合使用，其应当导致诊断灵敏度和/或特异性的提高。最好通过其受试者工作特性（将在下面进行详细地描述）评估检测的诊断灵敏度和/或特异性。
全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。可有助于可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期肿瘤标记物的鉴定可导致可大大促进该疾病的诊断和管理的方法。因此，存在提高癌症，特别地LC的体外评估的紧迫临床需要。提高癌症例如LC的早期诊断尤其重要，因为对于早期诊断的患者，存活的机会与在疾病的晚期（progressed
stage）诊断的患者相比要高得多。
已对肺癌中建立的生物化学标记物的临床功用进行了综述，例如Duffy, M.J. (Crit. Rev. Clin. Lab. Sci.
38 (2001) 225-262)，下面将简单讨论。
CYFRA 21-1目前被认为是当前已知的肺癌肿瘤标记物中最好的标记物。虽然不是器官特异性的，但其在肺组织中显著地发现。CYFRA 21-1对于肺癌的灵敏度在95%的针对其他良性肺病的特异性下被描述为在46至61%之间。增加的CYFRA 21-1血清水平还与明显的良性肝疾病、肾功能不全和浸润性膀胱癌相关。CYFRA 21-1检测被推荐用于术后治疗监测。
CEA属于胎儿癌性抗原类群，通常在胚胎发生过程中产生。CEA不是器官特异性的并且主要用于结直肠癌的监测。除了恶性肿瘤外，还有几种良性疾病例如肝硬化、支气管炎、胰腺炎和自身免疫疾病与增加的CEA血清水平相关。在对于良性肺疾病95%的特异性下，其对于肺癌的敏感度据报导为29-44%。CEA的主要用途是监视结肠癌，特别是当疾病已经转移时。然而，多种癌症可产生提高水平的CEA，包括乳腺癌。CEA的优选用途是肺癌的治疗监测。
NSE是SCLC的肿瘤标记物。通常，发现增加的NSE血清水平与神经外胚层和神经内分泌瘤相关。还在患者中发现增加的血清水平与良性肺病和脑病例如脑膜炎或脑的其他炎性疾病以及对头的跌打损伤相关。虽然对于SCLC（在95%的特异性下）的灵敏度据报导为60-87%，但对于NSCLC，NSE的性能较差(7-25%)。NSE被推荐用于SCLC的治疗监测。
CA
19-9(碳水化合物抗原19-9)，糖脂上的唾液酸化Lewis
(a)抗原是胃肠癌的肿瘤标记物。其存在于胎儿胃、肠和胰腺上皮细胞。在成年人肝、肺和胰腺组织中也可发现低浓度的CA
19-9。在肿瘤块和CA 19-9测定值中没有相关性。因此CA
19-9的测定不能用于胰腺癌的早期检测。因为黏蛋白仅通过肝分泌，有时即使轻微的胆汁郁积可导致明显升高的CA
19-9血清水平。在那些具有确认的胰腺癌患者中，标记物主要用于辅助检测疾病状态（灵敏度70-87%）。3-7%的人群具有Lewis a-阴性/b-阴性血型构成，不能够表达具有反应性的决定物CA19-9的黏蛋白。在解释发现时必须考虑这一点。
在高百分比的上皮来源非粘液性卵巢瘤中发现CA 125并可在血清中检测到。卵巢癌占妇科肿瘤的约20%。尽管最高的CA 125值发生在患卵巢癌的患者中，在子宫内膜、乳腺、胃肠道恶性肿瘤和各种其他恶性肿瘤中也观察到明显升高的值。有时在各种良性妇科疾病例如卵巢囊肿、卵巢组织转化、子宫内膜异位、子宫肌瘤或子宫颈炎中发现提高的值。此标记物的轻微升高还可发生在怀孕早期和各种良性疾病中（例如急性和慢性胰腺炎、良性胃肠疾病、肾功能不全、自身免疫疾病等等）。显著升高的水平已在良性肝疾病例如肝硬化和肝炎中发现。极端升高可发生在由恶性和良性疾病引起的任意种类的腹水中。尽管CA
125是相对非特异性的标记物，它是目前最重要的肿瘤标记物，用于监视具有严重卵巢恶性肿瘤的患者的治疗和进展。在82-93%特异性下，据报导灵敏度为69-79%。
SCC最初在子宫颈的鳞状上皮细胞CA中被鉴定。SCC对LC的灵敏度一般较低（18-27%）。因此，认为SCC检测不适于筛选。然而，由于对鳞状上皮细胞CA的较高灵敏度，SCC的优选用途是治疗监视，尽管CYFRA 21-1一般表现的更好。
proGRP是肿瘤标记物，在检测和监视SCLC中有用。在具有非恶性肺/肋膜疾病例如特发性肺纤维化或结节病的患者中也发现提高的血清水平。尽管proGRP在SCLC领域（在95%的特异性下）的灵敏度据报导为47-86%，在NSCLC领域的proGRP检测表现很差，因为据报导灵敏度为10%以下。
CA
15-3通常在患有晚期乳腺癌的患者中提高。在患有早期乳腺癌的女性中CA 15-3的水平很少升高(Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory
Sciences 38 (2001) 225-262)。卵巢、肺和前列腺癌也可能提高CA 15-3水平。CA 15-3的提高水平可能与非癌性病症例如良性乳腺或卵巢疾病、子宫内膜异位、骨盆炎症疾病和肝炎相关。怀孕和哺乳也可导致CA
15-3水平提高(National Cancer Institute, Cancer
Facts, Fact Sheet 5.18 (1998) 1-5)。
与CA 15-3抗原类似，CA 27-19在大多数乳腺癌患者血液中发现。CA 27-29水平可与其他方法（例如 乳房X光检查和其他肿瘤标记物水平的测量）联合使用以检查在以前接受II期和III期乳腺癌治疗的女性中的复发。CA 27-29水平还可被结肠癌、胃癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫癌和肝癌升高。怀孕的最初三个月，子宫内膜异位、卵巢囊肿、良性乳腺疾病、肾病和肝病是也可升高CA
27-29水平的非癌性病症。
AFP（α-胎蛋白）通常由发育的胎儿产生。AFP水平在出生后立刻开始降低，通常在健康成年人血液中检测不到（除非在孕期）。升高的AFP水平强烈提示原发性肝癌或卵巢或睾丸的生殖细胞癌（癌症开始于产生卵或精子的细胞）的存在。具有其他类型癌症（例如胃癌）的患者极少具有提高的AFP水平。可导致提高的AFP水平的非癌性病症包括良性肝病，例如肝硬化或肝炎；共济失调性毛细血管扩张症；Wiscott-Aldrich综合症；和怀孕。
PSA（前列腺特异性抗原）大量用作可信的预后标记物用于患有前列腺癌的患者的治疗(Catalona, W.J. 等人, N. Engl. J. Med. 324 (1991) 1156-1161; Osterling, J.E.,
J. Urol. 145 (1991) 907-923)。作为肿瘤标记物，其具有相当的优势，即其在健康人的血液中检测不到，或如果可以检测到，仅以极低的浓度存在。在晚期疾病中一般测量到大量升高的PSA值。PSA属于名为“激肽释放酶”的蛋白质/酶组。人激肽释放酶家族由3个成员组成，被称为hK1、hK2和hK3 (PSA)
(Clements, J.A., Endocr. Rev. 10 (1989) 393-419; Carbini, L.A. 等人, J. Hypertens. 11 (1993) 893-898)。前列腺特异性抗原(PSA)或hK3是具有约29kDa分子量的糖蛋白。其在前列腺上皮细胞中形成，是精液的一种成分。PSA具有中性丝氨酸蛋白酶的酶活性。其主要功能是切割seminogelins I和II及纤连蛋白，它们作为精液的主要成分阻碍精子的流动性。通过水解这些蛋白质，PSA使精子凝结物得以液化从而允许精子的流动性。
铁蛋白（ferritin）是具有至少440 kD分子量（取决于铁含量）的大分子，由24个亚基的蛋白质外壳（脱铁铁蛋白）和含有平均约2500个 Fe3+离子的铁核心（在肝和脾铁蛋白中）组成(Wick,
M. 等人, Ferritin in Iron Metabolism -
Diagnosis of Anemias, second edition, Springer-Verlag (1995), ISBN
3-211-82525-8和ISBN 0-387-82525-8)。铁蛋白易于形成低聚物，当其过量存在于贮藏器官的细胞中时，在溶酶体中存在凝结成半结晶血铁黄素的倾向。
在等电聚焦的辅助下可区分出至少20种异铁蛋白(Arosio, P. 等人, Heterogeneity of ferritin II: Immunological aspects,
In: Albertini A., Arosio P., Chiancone E., Drysdale J. (编), Ferritins and isoferritins as biochemical markers,
Elsevier, Amsterdam (1984) 第33-47页)。此微观不均一性是由于酸性H亚基和弱碱性L亚基含量的差异。碱性异铁蛋白在长期铁贮藏功能中起作用，并主要在肝、脾和骨髓中发现(Kaltwasser,
J.P. 等人, Serumferritin: Methodische und
Klinische Aspekte, Springer Verlag (1980))。
酸性异铁蛋白主要在心肌、胎盘和肿瘤组织中发现。它们具有较低的铁含量，推测其作为转运铁的中间体在多种合成中起作用(Morikawa,
K. 等人, Leuk. Lymphoma 18 (1995) 429-433;
Borch-Iohnson, B., Analyst 120 (1995) 891-903; Cook, J. 等人, Adv. Exp. Med. Biol. 356 (1994) 219-228)。
测定铁蛋白是确定铁代谢状况的合适方法。在治疗开始时测定铁蛋白提供了体内铁储存的代表性测量。临床上已证明20 µg/L
(ng/mL)的阈值对检测隐性缺铁前期（prelatent iron deficiency）有用。此数值提供了铁储存消耗的可信指标，即铁储存可被动员以供血红素的合成。当铁蛋白水平升高并可排除分布异常的可能性时，显示体内有铁负荷过量的存在。使用400 µg/L
(ng/mL)铁蛋白作为阈值。而患有下列肿瘤时铁蛋白值也会升高：急性白血病、何杰金氏症(Hodgkin’s disease)、肺癌、肝癌和前列腺癌。测定铁蛋白已证明在肝转移中有价值。研究显示在所有肝转移患者中有76%的患者具有超过400 ug/L(ng/mL)的铁蛋白值。升高值的原因可能是细胞坏死、红血球生成受阻或肿瘤组织的合成增加。
另一方面作为特征被描述的是血清铁蛋白水平在胃肠癌中不提高(Niitsu, Y. 等人, Rinsho Ketsueki 21 (1980) 1135-1143)。此外，已报导在具有晚期结肠直肠癌的患者中平均血清铁蛋白水平显著低于对照中的水平(Kishida, T. 等人, J. Gastroenterol. 29 (1994) 19-23)。血清铁蛋白水平的降低是由持续流血导致的，此失血与肿瘤的大小和位置相关(Li, F. 等人, J. Gastroenterol. 34 (1999) 195-199)。
关于标记物概况和针对肺癌的改进诊断，公开了使用基于模糊逻辑学的分类算法来组合CYFRA 21-1、NSE和C反应蛋白(CRP)（其为一般炎症标记物）的血清水平的方法(Schneider,
J., 等人, Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)。作者报导了在95%的特异性下的92%的灵敏度。然而，在该研究中，例如CYFRA 21-1作为单个肿瘤标记物的灵敏度据报导在95%的特异性下为72%，这比在许多其他报导的研究中报导的显著更高。Duffy,
M.J., in Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38 (2001) 225-262报导了46%至61%的灵敏度。由Schneider等人获得的该异常高的性能引起了一些怀疑，其可能由于几个因素造成。第一，对照患者群体似乎比患者群体更年轻，即群体年龄不十分匹配，并且患者群体包括许多晚期分期。第二且更至关重要地，在用于模糊逻辑限定词的确定的训练集的样品上检查算法的性能。因此，这些限定词严格来说是针对该集“特制的”并且不用于独立的验证集。在正常情况下，势必期望用于更大的、独立的且充分平衡的验证集的相同算法将导致显著降低的总体性能。
本发明的任务是研究是否可鉴定可用于评估癌症疾病的生物化学标记物。特别地，本发明的发明者研究是否可在组织样品或体液中鉴定生物化学标记物用于评估不同癌症类型例如肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆道癌。
令人惊讶地，已发现PACAP蛋白作为生物标记物的使用可至少部分地克服现有技术中目前已知的标记物的一些问题。
本发明涉及用于体外评估癌症的方法，其包括测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度以及将测量结果，特别地测定的浓度用于癌症的评估中。
令人惊讶地，发现受试样品中提高的PACAP蛋白和/或其片段的浓度与癌症的发生相关。可显示PACAP是对于单一类型的癌症无特异性但为不同类型癌症的标记物（即，其似乎是一般肿瘤标记物）的标记物。因为PACAP对致瘤过程表现出相当的特异性，因此新型肿瘤标记物PACAP对于不同种类的肿瘤类型具有潜在的临床效果。
本发明的方法适用于评估许多不同类型的癌症。已例如分别在特定的癌症类型如肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌中发现，与正常对照相比较，样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度提高。
根据本发明的优选实施方案，为了体外评估选自肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌的特定癌症类型，测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度。
根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌、结肠癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤或肾癌，测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度。
根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌或子宫内膜癌，测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度。
根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌（LC）或结直肠癌（CRC），测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度。
根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌（LC），测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度。
本发明的一个实施方案涉及区分可能不患癌症的个体与可能被分类为“疑似”病例的个体的人群的普查。然后可以例如利用成像方法或其他合适的方法使后一个个体群体经历进一步的诊断过程。
本发明的另外的实施方案涉及适合于诊断一般性癌症的肿瘤标记物组或适合于诊断特定肿瘤类型例如肺癌的肿瘤标记物组的改进。
本发明还涉及用于利用生物化学标记物体外评估癌症的方法，其包括测量样品中PACAP蛋白和/或其片段和任选地对癌症具有特异性的一个或更多个其他标记物的浓度，以及将测量结果，特别地测定的浓度用于癌症的评估。与PACAP组合使用的优选标记物在另一个方面是为一般性肿瘤标记物(即对单个肿瘤类型不具有特异性的标记物)的标记物或，在另一方面，是为特异性肿瘤标记物（对单个肿瘤类型具有特异性的标记物）的标记物。例如用于癌症例如肺癌的评估的优选标记物是Cyfra
21-1、CEA、CA19-9、SCC、CA125、NSE、proGRP、CA 15-3、CA 27-29、AFP、PSA和铁蛋白。此类标记物可各自单个地使用或以任何组合与PACAP一起使用。
如果，根据本发明的方法，评估癌症，则各癌症的一个或更多个其他标记物优选选自Cyfra 21-1、CEA、CA19-9、SCC、CA125、NSE、proGRP、CA 15-3、CA 27-29、AFP、PSA和铁蛋白。
因此，在优选实施方案中，本发明还涉及包括至少标记物PACAP和例如Cyfra
21-1、CEA、CA19-9、SCC、CA125、NSE、proGRP、CA 15-3、CA 27-29、AFP、PSA和铁蛋白中的至少一个其他肿瘤标记物的标记物组在评估癌症例如肺癌和/或结肠癌中的用途。
优选，本发明涉及用于利用生物化学标记物评估癌症例如肺癌的方法，其包括测量样品中PACAP蛋白和/或其片段以及任选地一个或更多个其他癌症标记物，例如肺癌的一个或更多个其他标记物的浓度，以及将测量结果，特别地测定的浓度用于癌症评估中。优选，一个或更多个其他标记物选自Cyfra
21-1、CEA、CA19-9、SCC、CA125、NSE和/或proGRP。
在优选实施方案中，本发明还涉及包括至少PACAP和CYFRA 21-1的标记物组在评估癌症，特别是LC以及更特别是NSCLC中的用途。
本发明还涉及包括至少PACAP和CEA的标记物组用于评估癌症，特别是LC，以及更特别是NSCLC中的用途。
本发明还涉及包括至少PACAP和CA
19-9的标记物组用于评估癌症，特别是LC，以及更特别是NSCLC中的用途。
本发明还涉及包括至少PACAP和SCC的标记物组用于评估癌症，特别是LC，以及更特别是NSCLC中的用途。
本发明还涉及包括至少PACAP和CA
125的标记物组用于评估癌症，特别是LC，以及更特别是NSCLC中的用途。
本发明还涉及包括至少PACAP和NSE的标记物组用于评估癌症，特别是LC，以及更特别是NSCLC中的用途。
本发明还涉及包括至少PACAP和proGRP的标记物组用于评估癌症，特别是LC，以及更特别是NSCLC中的用途。
本发明还涉及PACAP蛋白和/或其片段在评估癌症中的用途，其中提高的PACAP和/或其片段的浓度预示着癌症。
本发明还涉及PACAP在评估几种特定类型的癌症，特别是肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌中的用途。
本发明还涉及抗PACAP蛋白和/或其片段的抗体在评估癌症中的用途，其中提高的PACAP蛋白和/或其片段的浓度预示着癌症。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异性测量PACAP蛋白和/或其片段和任选地一个或更多个其他癌症标记物所需的试剂。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异地测量PACAP蛋白和/或其片段和任选地一个或更多个癌症标记物（例如上述肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌的标记物）所需的试剂，其中其他标记物可各自单个地使用或以其任何组合使用。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别特异性地测量PACAP和CYFRA 21-1所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别地特异性地测量PACAP和CEA所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别特异性地测量PACAP和CA 19-9所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别特异性地测量PACAP和SCC所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别特异性地测量PACAP和CA 125所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别特异性地测量PACAP和NSE所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别特异性地测量PACAP和proGRP所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。
在优选实施方案中，本发明涉及用于体外评估癌症的方法，其包括(a)测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度, (b)测量样品中任选地一个或更多个其他癌症标记物的浓度，和(c)将步骤(a)和任选地步骤(b)的测量结果用于癌症的评估，其中提高的PACAP蛋白和/或其片段的浓度预示着癌症。
术语“测量”优选包括样品中PACAP蛋白和/或其片段的定性、半定量或定量测量。在优选实施方案中，测量是半定量测量，即，确定PACAP的浓度是高于还是低于截止值（cut-off value）。如本领域技术人员将理解的，在是-（存在）或否-（不存在）测定中，通常将测定灵敏度设置至匹配截止值。可以例如根据健康个体组的检测来确定截止值。优选地，将截止值设置至引起90%的特异性，还优选地将截止值设置至引起95%的特异性，或还优选地将截止值设置至引起98%的特异性。高于截止值的值可以例如预示癌症的存在。特别地，高于截止值的PACAP值可以例如预示着肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌的存在。在另外的优选实施方案中，PACAP的测量是定量测量。在另外的实施方案中，PACAP的浓度与基本诊断问题如例如疾病的分期、疾病进展或对治疗的反应相关。
促凋亡胱天蛋白酶衔接蛋白（PACAP, SwissProt数据库ID：PACAP_HUMAN, SwissProt数据库登记号：Q8WU39）的特征在于SEQ ID NO:1给出的序列（图6）。PACAP分子由189个氨基酸（=aa）组成，具有20.7 kDa的分子量。PACAP的其他同义词为FLJ32987,
gxHOMSA73848, HSPC190, 胱天蛋白酶-2结合蛋白或假定的蛋白质MGC29506。对应的人基因（编码PACAP的序列）位于染色体带5q23-q31。
Katoh和Katoh使用EST信息和生物信息学鉴定和表征了人MGC29506基因和其编码的蛋白质(Katoh,
M.和Katoh, M., Int. Journal of Oncology 23
(2003) 235-241)。从人MGC29506基因中由于选择性剪接可得到3个蛋白质：具有189aa的全长PACAP蛋白（SEQ ID NO: 1）以及剪接变体Q8WU39-2蛋白（SwissProt数据库ID：PACAP_HUMAN_S2,
SwissProt数据库登记号：Q8WU39_2，具有123aa；SEQ ID NO: 5）和Q8WU39-3蛋白（SwissProt数据库ID：PACAP_HUMAN_S3, SwissProt数据库登记号：Q8WU39_3，具有61aa；SEQ ID NO: 6）。蛋白质Q8WU39和Q8WU39-2在N-端区域相同，包含1-59位氨基酸，但在C-端区域完全不同。Katoh和Katoh报导了Q8WU39 (PACAP)和Q8WU39-2 (PACAP-2)是具有N-端信号肽和6个保守半胱氨酸残基的分泌型蛋白质。Q8WU39已显示为MGC29506基因主要表达的同种型。已发现PACAP基因在肠型胃癌中常常被下调（Katoh和Katoh）。因为此下调，他们推测PACAP可能是涉及肠型胃癌的候选肿瘤抑制基因。没有描述在组织样品或体液中测定PACAP蛋白。所述文献没有包含任何数据或迹象指示提高的PACAP蛋白水平可能作为与癌症鉴定、预后和/或诊断相关的标记物。
Bonfoco
等人 (J. Biol. Chem. 276 (2001) 29242-29250)报导了通过酵母双杂交系统克隆促凋亡分子PACAP。他们鉴定了具有13.6
kDa计算分子量的123个氨基酸的蛋白质PACAP-2。使用体外蛋白质结合测定和蛋白质印迹分析，Bonfoco 等人发现PACAP-2与胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-9相互作用，将PACAP-2鉴定为凋亡诱导蛋白。然而，作者没有描述PACAP-2与癌症评估的任何联系。
US
2006/0252057公开了一组基因的基因表达产物或产物组合。PACAP基因作为331个基因之一被提及。对一些基因，大多为角蛋白而不是PACAP，通过IHC在蛋白质水平证实了不同的表达。因为仅针对癌症组织进行了IHC分析，没有显示于正常组织相比改变的表达。
WO
2006/121991公开了通过定量乳腺癌患者一组基因的表达水平（与对照组相比较）预后乳腺癌。文中描述了PACAP与67个其他基因一起（通过mRNA测量）指示了良好的预后。给出的实施例仅通过QPCR方法测定这些基因的对应mRNA水平。实施例没有显示任何蛋白质水平，无论是在组织还是在血液循环中。
相同的作者在WO 2007/112330中描述了测定和预后结肠癌的一组基因。文中公开了来自具有8个其他基因的组的PACAP基因的低表达指示了结肠癌的糟糕的预后。
后2个专利申请的实施例仅使用RNA检测方法用于鉴定和定量。没有测量对应的蛋白质水平。
因此，本领域的上述文献中没有一个表明测定组织样品和体液样品中的PACAP。
另外，众所周知的是mRNA水平与蛋白质水平之间的相关性强烈地变化(Kadota,
K. et al., Genome Letters 2 (2003) 139-148; Greenbaum, D.等人, Genome Biology 4 (2003) 117)。因此，蛋白量不能从相应的mRNA水平得出。失调的mRNA水平同时引起失调的蛋白质水平的结论不能成立。
WO
1997/38003描述了人造血特异性蛋白质(hHSP蛋白质)。在一个具体实施方案中，WO 1997/38003公开了PACAP 蛋白作为人造血特异性蛋白质和其在调节免疫系统细胞的分化和成熟以及治疗和/或预防特征在于hHSP蛋白质低表达的病症中的用途。未描述测定组织样品或体液中的PACAP
蛋白。另外，文件不含有PACAP蛋白可以是与癌症并且特别是肺癌、乳腺癌和/或结肠癌相关的标记物的任何数据。
因此，本领域的上述文献中没有一个表明测定组织样品和体液中的PACAP允许癌症的评估。
令人惊讶地，在本发明中发现在没有形态学或组织学信息，特别是在没有测定亚细胞定位的情况下，测定组织样品和/或体液中PACAP的存在和/或量允许评估癌症例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌或肾癌疾病，特别是肺癌疾病。
如本文中所使用的，每一个下列术语在该部分中具有与其相关的意义。
冠词“一”（“a”和“an”）在本文中用于指一个或更多个（即，至少一个）物体的语法对象。例如，“一个标记物”意指一个标记物或更多个标记物。术语“至少”用于表示任选地一个或更多个另外的对象可存在。例如，包括至少（标记物）PACAP和CYFRA 21-1的标记物组可任选地包括一个或更多个其他标记物。
表述“一个或更多个”表示1至50，优选1至20，还优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。
本文中使用的术语“标记物”或“生物化学标记物”是指被用作靶以分析患者的受试样品的分子。此类分子靶的实例是蛋白质或多肽。在本发明中用作标记物的蛋白质或多肽预期包括所述蛋白质的天然发生的变体以及所述蛋白质或所述变体的片段，特别是免疫学可检测片段。免疫学可检测片段优选包括所述标记物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员认识到由细胞释放的或存在于细胞外基质中的蛋白质可在例如炎症期间被改变，并且可开始降解或被切割成这样的片段。某些标记物以无活性的形式合成，所述形式随后可通过蛋白质水解激活。如本领域技术人员将理解的，蛋白质或其片段还可作为复合物的部分存在。这样的复合物在本发明的意义上也可用作标记物。标记物多肽的变体由相同基因编码，但作为备选的mRNA或pre-mRNA剪接的结果，可在它们的等电点(=pI)或分子量 (=MW)或两者上不同。变体的氨基酸序列与相应的标记物序列达到95%或更多的同一。此外，或备选地，标记物多肽或其变体可具有翻译后修饰。翻译后修饰的非限定性实例是糖基化、酰基化和/或磷酸化。
PACAP：
在适当的样品检测PACAP蛋白，特别是PACAP蛋白和/或其片段的可溶性形式。优选样品是组织样品或体液例如血液、血浆、血清、尿、粪便、支气管肺泡灌洗液（BAL）、上皮细胞衬液（ELF）或痰等。优选，样品来自人受试者，例如肿瘤患者或处于肿瘤的风险中的人或怀疑患有肿瘤的人。也优选在血清或血浆样品中检测PACAP。
根据本发明的一个优选的实施方案，测定PACAP蛋白和/或其片段的浓度。在一个实施方案中，通过使用特异性结合剂从样品特异性地测量标记物PACAP。
特异性结合剂是例如PACAP的受体、结合PACAP的凝集素或PACAP的抗体。特异性结合剂对于其相应的靶分子具有至少107
l/mol的亲和力。特异性结合剂优选对于其靶分子具有108
l/mol或也优选109 l/mol的亲和力。如本领域技术人员将理解的，术语特异性用于表示存在于样品中的其他生物分子不显著结合对PACAP具有特异性的结合剂。优选，对除了靶分子外的生物分子的结合水平分别导致至多仅为10%或更少，仅为5%或更少，仅为2%或更少或仅为1%或更少的对于靶分子的亲和力的结合亲和力。优选特异性结合剂将满足上述关于亲和力以及特异性的最低标准。
特异性结合剂优选是与PACAP反应的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及指包含抗体的结合结构域的基因构建体。
可使用保持特异性结合剂的上述标准的任何抗体片段。通过现有技术方法，例如Tijssen描述（Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays,
11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, the whole book, 特别是第43至78页）的方法，产生抗体。此外，本领域技术人员十分了解可用于抗体的特异性分离的基于免疫吸附剂的方法。通过此类方法，可提高多克隆抗体的质量，从而增强它们在免疫测定中的性能。(Tijssen,
P., 同上, 第108至115页)。
为了达到本发明中公开的成就，可使用在兔子中产生的多克隆抗体。然而，也很显然，还可使用来自不同物种例如绵羊或山羊的多克隆抗体以及单克隆抗体。因为单克隆抗体可以以任何需要的量和恒定的性质产生，它们代表了用于临床常规测定的开发的理想的工具。在根据本发明的方法中抗PACAP的单克隆抗体的产生和应用分别代表了其他优选实施方案。
正如本领域技术人员现将认识到PACAP已被鉴定为用于评估癌症优选肺癌或结肠癌的标记物。不同的免疫诊断方法可用于获得可与本发明的成就相当的结果。例如，可使用产生抗体的可选策略。这样的策略除其他以外还包括合成肽的使用，其提供PACAP的表位以进行免疫。备选地，可使用也称为DNA疫苗接种的DNA免疫。
为了进行测量，将获自个体的样品在适合于结合剂PACAP复合物形成的条件下与PACAP的特异性结合剂一起温育。这样的条件不必详细说明的，因为本领域技术人员无需任何创造性劳动就可容易地鉴定这样的合适的温育条件。在癌症优选肺癌的评估中测量结合剂PACAP复合物的量和使用这样测量的PACAP浓度。本领域技术人员将理解，存在许多测量特异性结合剂PACAP复合物的量的方法，其全都详细地描述于相关教科书(参见，例如，Tijssen,
P., 同上, 或Diamandis,
E.P., 和Christopoulos, T.K. (eds.), Immunoassay,
Academic Press, Boston (1996))中。
优选，在夹心类型测定形式中检测PACAP。在这样的测定中，将第一特异性结合剂用于将PACAP捕获在一侧，并且将经标记可被直接或间接检测的第二特异性结合剂用于另一侧。用于夹心类型测定形式的特异性结合剂可以是特异性抗PACAP抗体。可通过使用不同的捕获和标记抗体（即，识别PACAP蛋白上的不同表位的抗体）进行检测。
在本发明的意义上“癌症的标记物”和特别是“肺癌的标记物”是如果与标记物PACAP组合可在癌症的评估中,例如在一般性癌症的评估中或在某些癌症类型的评估中（例如在LC的评估中）增加相关信息的任何标记物。如果可通过将所述标记物包括到已包含标记物PACAP的标记物组合中来分别提高对于癌症评估的的附加值即敏感度（在给定的特异性下）或特异性（在给定的灵敏度下），则信息被认为是相关的。在优选的癌症评估的实施方案中，灵敏度或特异性的提高分别地在p =
.05、.02、.01或更低的显著性水平上是统计学上显著的。优选，一个或更多个其他肿瘤标记物选自Cyfra 21-1、CEA、CA 19-9、SCC、CA 125、NSE和/或proGRP。
本文中使用的术语“样品”是指获得用于体外评估目的的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选可包括任何体液或组织样品。优选样品是全血、血清、血浆、支气管肺泡灌洗物（BAL）、上皮细胞衬液(ELF)、尿或痰，最优选血浆或血清。
本文中使用的术语“组织样品”和/或“组织切片”是指在手术、治疗切除术或活组织检查（例如切取活组织检验、切除活组织检查、中心活检或针吸活组织检查）中从患者中取出的生物样品，包括去除细胞或组织以用于体外评估。当进行根据本发明的分析时，组织样品材料或直接使用，或作为“组织裂解液”使用。本文中使用的“组织样品”还指薄组织切片，通常通过使用显微镜用薄片切片机得到。在包含生物样品的任意公开的方法实施方案中，这些生物样品可（但不是必需的）被置于显微镜载玻片上，其为组织切片（例如用福尔马林固定的和石蜡包埋的组织切片），和/或肿瘤组织（例如肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、胃癌或成胶质细胞瘤）。
本文中使用的“组织裂解液”、“细胞裂解液”、“裂解液”、“裂解的样品”、“组织提取物”或“细胞提取物”是指包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已被破坏。为了释放细胞或组织样品的内含物，通常用酶和/或用化学试剂处理材料以溶解、降解或破坏这些组织或细胞的细胞壁和细胞膜。本领域熟练技术人员非常熟悉得到裂解液的合适方法。术语“裂解”包含此过程。
术语“评估癌症”和特别是“评估肺癌”用于表示根据本发明的方法将（单独地或与其他标记物或变量一起，例如由UICC所示的标准(参见上文))例如帮助医师确定或确认癌症特别是LC的不存在或存在，在预后、检测复发（术后患者的随访）和/或监测治疗特别是化学治疗中帮助医师。
如本领域技术人员将理解的，任何此类评估是在体外进行的。之后弃去患者样品。患者样品只用于本发明的体外诊断方法，并且不将患者样品的材料转移回患者体内。通常，样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。
除非另外指出，根据传统用法使用技术术语。在细胞和分子生物学中的通常术语的定义可在Lewin, B., Genes
V, Oxford University Press 出版(1994), ISBN
0-19-854287 9); Kendrew 等人 (eds.), The
Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版 (1994), ISBN 0-632-02182-9);和Meyers, R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology:
a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 出版(1995), ISBN 1-56081-569 8)中找到。
在优选实施方案中，本发明涉及利用生物化学标记物体外评估癌症例如LC的方法，其包括测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度和将测定的浓度用于癌症例如LC的评估。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及利用生物化学标记物体外评估LC的方法，其包括测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度和将测定的浓度用于LC的评估。
本发明的发明者已令人惊讶地能够在显著百分比的来源于患有癌症特别是患有肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌的患者的样品中检测到提高的标记物PACAP的浓度。更令人惊讶地，他们已能够证明获自个体的此类样品中提高的PACAP蛋白和/或其片段的浓度可用于癌症特别是上述类型癌症的评估。
进行诊断的理想的情形是其中单个事件或过程可在例如感染性疾病中引起各自疾病的情形。在所有其他情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学未完全弄清楚时，对于许多癌症类型例如对于LC的情况就是如此。如本领域技术人员将理解的，不存在对于给定的多因子疾病例如LC的诊断既具有100%的特异性同时又具有100%的灵敏度的生物化学标记物。相反，生物化学标记物例如CYFRA 21-1、CEA、CA 125、proGRP、SCC，或如本文中所显示的PACAP可用于以某种可能性或预测值例如存在、不存在或严重度来评估疾病。因此在常规临床诊断中，通常在潜在的疾病的诊断、治疗和管理中同时考虑不同的临床症状和生物学标记物。
可以单个地测定生物化学标记物或在本发明的优选实施方案中使用基于芯片或基于珠的阵列技术同时测量它们。然后例如使用各标记物的个体截止值独立地解释生物标记物的浓度，或将它们组合以进行解释。
在另外的优选实施方案中，在方法中进行根据本发明的癌症的评估，所述方法包括(a)测量样品中PACAP蛋白和/或其片段的浓度, (b)测量样品中一个或更多个其他癌症标记物的浓度，以及c)将测量结果，例如分别在步骤(a)和步骤(b)中测定的浓度用于癌症的评估。
在癌症的评估中，标记物PACAP在一个或更多个下列方面中是有利的：筛查；诊断帮助；预后；治疗例如化学治疗、放射治疗和免疫治疗的监测。
筛查：
筛查定义为为了疾病的指示，例如癌症的存在，鉴定个体例如处于风险中的个体的检测的系统性应用。优选筛查群体由已知处于比平均水平更高的癌症风险中的个体组成。例如，肺癌的筛查群体由已知处于比肺癌的平均风险更高的风险中的个体（如吸烟者、曾吸烟者（ex-smoker）和暴露于铀、石英和石棉的工人）组成。
在一个优选实施方案中，组织样品或任意体液例如血浆、血清、粪便、尿或痰在癌症例如肺癌的筛查中用作样品。
在另一个LC的优选实施方案中，痰在肺癌的筛查中用作样品。
对于许多疾病，循环中没有单个生物化学标记物可以总是满足筛查目的所需的灵敏度和特异性标准。这对于癌症，特别是肺癌似乎也是如此。势必期望必须将包括多个标记物的标记物组用于癌症的筛查。本发明中确定的数据表明标记物PACAP将形成适合用于筛查目的的标记物组的构成整体所必需的（integral）部分。本发明因而涉及PACAP作为癌症标记物组（即包括PACAP和一个或更多个另外的用于癌症筛查目的的标记物的标记物组）的一个标记物的用途。特别是，本发明涉及PACAP作为一般性癌症标记物组中的一个标记物的用途。这样的标记物组包括标记物PACAP和一个或更多另外的标记物，例如一般性癌症标记物和/或用于上述类型的癌症的标记物。
PACAP还可能贡献于用于某些特定类型癌症例如肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌的标记物组。
使用包括PACAP的标记物组评估的其他优选类型的癌症是肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、肾癌或前列腺癌。
使用包括PACAP的标记物组评估的其他优选类型的癌症是肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤或肾癌。
使用包括PACAP的标记物组评估的其他优选类型的癌症是肺癌或结肠癌。
使用包括PACAP的标记物组评估的优选类型的癌症是肺癌(LC)。
本数据还表明标记物的某些组合在癌症的筛查中是有利的。例如，参考筛查LC的优选实施方案，本发明还涉及包括PACAP和CYFRA 21-1的标记物组、或包括PACAP
和CEA的标记物组、或包括PACAP和CA 19-9的标记物组、或包括PACAP和SCC的标记物组、或包括PACAP和CA 125的标记物组、或包括PACAP和NSE的标记物组、或包括PACAP和proGRP的标记物组、或包括PACAP和两种或更多种选自Cyfra 21-1、CEA、CA 19-9、SCC、CA 125、NSE和/或proGRP的标记物组的用途。
诊断辅助物：
标记物可以有助于特定器官中良性对恶性疾病的鉴别诊断，帮助区分不同的组织学类型的肿瘤或在手术前建立基线标记物值。
当今，用于检测肺癌的重要方法是放射学和/或计算机断层(CT)扫描。可通过这些方法显现小瘤（small nodule）即可疑组织的小区域。然而，许多此类小瘤-90%以上（通过CT）-代表良性组织变化，只有少数小瘤代表癌性组织。标记物PACAP的使用可有助于良性对恶性疾病的区分。
在一个优选的实施方案中，在免疫组织学方法中使用标记物PACAP以确定或确认肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌（优选LC）的不同组织学类型。
因为作为单个标记物的PACAP可能优于其他标记物，例如在LC的情况下优于其他标记物，如Cyfra 21-1或CEA，因此势必期望将PACAP用作诊断辅助物（特别是通过在手术前确定基线值）。本发明因此还涉及PACAP用于在癌症的手术之前确定基线值的用途。
预后：
预后指示可定义为以一定的可能性预测疾病结果的癌症患者和他们的肿瘤的临床、病理学或生物化学特性。它们的主要用途是帮助合理地计划患者管理，即分别避免对侵袭性疾病的处理不足和对怠惰性疾病（indolent
disease）的治疗过度。Molina, R., 等人, Tumor Biol. 24 (2003) 209-218评估了CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC和NSE在NSCLC中的预后价值（prognostic value）。在他们的研究中，标记物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的异常血清水平似乎表示更短的存活时间。
由于PACAP单独地显著促进癌症患者例如LC患者与健康对照的区分，因此势必期望其将有助于评估患有癌症优选患有LC的患者的预后。将最可能把术前PACAP的水平与一个或更多个其他癌症标记物和/或TNM分期系统组合。在优选实施方案中，PACAP用于患有LC的患者的预后。
化学疗法的监测:
Merle, P., 等人, Int. J. of
Biological Markers 19 (2004) 310-315已评估了用诱导化学疗法治疗的患有局部晚期NSCLC的患者中CYFRA 21-1血清水平的变化。他们得出CYFRA
21-1血清水平的早期监测可以是III期NSCLC患者中肿瘤反应和存活的有用的预后工具。此外，报告已描述了CEA在监测患有LC的患者的治疗中的用途(Fukasawa, T., 等人, Gan
to Kagaku Ryoho 13 (1986) 1862-1867)。大多数此类研究是基于回忆的、非随机化的并且包括少数患者。如在使用CYFRA
21-1的研究的情况下，CEA研究表明：a)CEA水平降低同时接受化学治疗的患者通常具有比其CEA水平未能降低的患者更好的结果以及(b)对于所有患者，CEA水平的增加与疾病的进展相关。
预期PACAP将是分别与CYFRA 21-1或CEA至少一样好的用于化学治疗的监测的标记物。本发明因此还涉及PACAP在监测处于化学治疗中的癌症患者，优选肺癌（LC）患者中的用途。在一个优选实施方案中的治疗监测中，可将对于PACAP的测量与对于至少一种选自Cyfra 21-1、CEA、CA 19-9、 SCC、 CA 125、 NSE和/或proGRP的标记物的测量组合，并将其用于LC的评估。
随访：
大部分经历目的在于完全清除癌性组织的手术切除的LC患者日后发生复发性或转移性疾病(Wagner, H., Chest 117 (2000) 110S-118S; Buccheri,
G., 等人, Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。大部分此类复发在术后前2至3年内发生。因为如果检测得太迟，复发性/转移性疾病常常是致命的，因此相当多的研究集中在处于早期,从而潜在地可治疗的阶段的癌症复发上。
因此，许多癌症患者例如LC患者经历了频繁地包括使用CEA的定期监测的术后监测方案。已显示手术切除术后一年使用CEA的系列监测甚至在疑似症状或体征不存在的情况下，在大约97%的特异性下以大约29%的灵敏度检测到早期术后复发/转移性疾病(Buccheri, G., 等人,
Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。因此，术后患有LC的患者的随访是合适的生物化学标记物的用途的最重要的领域之一。由于PACAP在被调查的LC患者中的高度灵敏度，PACAP（单独地或与一个或更多个其他标记物组合）可能极大地帮助LC患者的随访，尤其在术后LC患者的随访。包括PACAP和一个或更多个LC的标记物的标记物组在LC患者的随访中的用途代表了本发明的另外的优选实施方案。
本发明在优选实施方案中涉及PACAP在癌症的诊断领域中的用途。优选，PACAP
分别用于肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌的评估。
在另外的优选实施方案中，本发明涉及PACAP作为与一个或更多个另外的癌症标记分子组合的癌症例如一般性癌症或特定类型的癌症（例如肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌）的标记分子的用途。另外的标记分子可以是癌症类型非特异性一般性标记分子和/或癌症类型特异性标记分子，例如肺癌或结肠癌的标记物。PACAP和至少一个另外的标记物用于获自个体的液体样品中癌症例如肺癌或结肠癌的评估。优选选择的可将PACAP的测量与其组合的其他癌症标记物是Cyfra 21-1、CEA、CA19-9、SCC、CA125、NSE、proGRP、CA 15-3、CA 27-29、AFP、PSA和铁蛋白。特别是，优选选择的可将PACAP的测量与其组合的其他LC标记物Cytra 21-1、CEA、CA 19-9、SCC、CA 125、NSE和/或proGRP。用于评估癌症例如LC的还进一步优选的标记物组包括PACAP和至少一个选自CYFRA 21-1和CEA的其他标记分子。
如本领域技术人员将理解的，存在许多使用两个或更多个标记物的测量以改进调查中的诊断问题的方法。在相当简单但通常有效的方法中，如果样品对于至少一种被调查的标记物是阳性的，则假定为阳性结果。这可以例如是当诊断感染性疾病如AIDS时的情况。
然而，频繁地，评估标记物的组合。优选，将测量的标记物组的标记物例如PACAP和CYFRA 21-1的值进行数学组合，并且使组合的值与基本诊断问题相关联。可通过任何合适的现有技术数学方法来组合标记物值。用于使标记物组合与疾病相关联的熟知的数学方法使用方法如判别分析(DA)(即线性-、二次-、正则化-DA)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类器（k-Nearest-Neighbor
Classifiers）)、PLS (偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法（Random Forest
Method）、Boosting/Bagging法)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于组成分的方法（Principal
Components based Method）(即SIMCA)、广义加法模型、基于模糊逻辑的方法（Fuzzy
Logic based Method）、神经网络和基于遗传算法的方法。本领域技术人员在选择合适的方法评估本发明的标记物组合中将没有问题。优选，用于使本发明的标记物组合例如与LC的不存在或存在相关联的方法选自DA(即线性-、二次-、正则化判别分析)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类器)、PLS (偏最小二乘法)、基于树的方法（Tree-Based
Method）(即逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting法)或广义线性模型(即逻辑回归)。关于此类统计方法的详细内容见于下列参考文献：Ruczinski, I.,等人, J. of Computational and Graphical Statistics, 12 (2003)
475-511; Friedman, J. H., J. of the American Statistical Association 84 (1989)
165-175; Hastie, T., 等人, The Elements
of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001); Breiman, L., 等人，Classification and regression trees, California:
Wadsworth (1984) ; Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001)
5-32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for
Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series 28 (2003); 和Duda, R.O., 等人,
Pattern Classification, Wiley Interscience, 第2版(2001)。
本发明的优选实施方案是使用生物学标记物的基本组合的最优化多变量截止值并区分状态A与状态B（例如区分患病的与健康的）。在该类型的分析中,标记物不再是独立的而是形成标记物组。
诊断方法的精确性通过其受试者工作特性(ROC) (特别是参见Zweig,
M.H., 和Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)
561-577)得到最佳描述。ROC图是由在整个观察到的数据范围内连续改变决策阈值产生的所有灵敏度/特异性对的曲线。
实验室检测的临床性能取决于其诊断精确性或正确地将受试者分类至临床相关亚组的能力。诊断精确性测量检测的正确区分被调查的受试者的两个不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或良性疾病对恶性疾病。
在各情况下，ROC曲线通过在完全的决策阈值范围内将灵敏度对1-特异性作图来描述两个分布之间的重叠。灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性检测结果的数目)/(真阳性检测结果的数目 + 假阴性检测结果的数目)] 在y轴上。这也称为在疾病或病状存在的情况下的阳性。其只根据受影响的亚组来计算。假阳性分数或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性结果的数目 + 假阳性结果的数目)] 在x轴上。其是特异性的指数并且完全根据未受影响的亚组来计算。因为通过使用来自两个不同亚组的检测结果完全分别地计算真阳性分数和假阳性分数，因此ROC曲线不依赖于样品中疾病的流行性（prevalence）。ROC曲线上的各点代表相应于特定决策阈值的灵敏度/1-特异性对。具有完美区分（两个结果的分布中无重叠）的检测具有通过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数是1.0或100%(完美的灵敏度)，并且假阳性分数为0(完美的特异性)。无区分(对于两组为相同的结果分布)的检测的理论曲线是从左下角至右上角的45°对角线。大部分曲线落在这两个极端值之间。(如果ROC曲线完全落在45°对角线以下，这可通过将“阳性”标准从“大于”转变成“小于”或反之亦然来容易地矫正)。定性地，曲线越接近左上方的角，检测的总体精确性越高。
定量实验室检测的诊断精确性的一个优选方法是利用单个数字表示其性能。这样的总体参数例如称为“总误差（total error）”或备选地“曲线下的面积=AUC”。最普遍的全局测量是ROC曲线下的面积。按常规，该面积总是大于0.5(如果不是，可颠倒决策规则来使其大于0.5)。值在1.0(两组的检测值完全分离)至0.5(两组检测值之间无显著分布差异)之间变化。面积不仅取决于曲线的特定部分例如离对角线最近的点或在90%特异性下的灵敏度，而且还取决于整个曲线。这是ROC曲线接近完美曲线(面积 = 1.0)的程度的定量描述性表述。
将PACAP和其他标记物如CYFRA 21-1或CEA，或有待发现的其他LC标记物的测量分别组合，PACAP导致和将导致LC评估的进一步改进。
在优选实施方案中，本发明涉及用于改进癌症例如LC对健康对照的诊断精确性的方法，其通过分别测量样品中至少PACAP和CYFRA 21-1以及任选地CEA、CA 19-9、SCC、CA 125、NSE和/或proGRP的浓度，然后使测定的浓度与癌症例如LC的存在或不存在相关联来进行，当与基于任何单个的单独调查的标记物的分类相比较时，所述改进导致更多的患者被正确地分类为患有癌症，例如LC对健康对照。
在根据本发明的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP和CYFRA 21-1的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP和CEA的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP和CA
19-9的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP和SCC的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP和CA
125的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP和NSE的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP和proGRP的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP、CYFRA 21-1和CEA的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP、CYFRA 21-1和CA 19-9的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP、CYFRA 21-1和SCC的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP、CYFRA 21-1和CA 125的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP、CYFRA 21-1和NSE的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物PACAP、CYFRA 21-1和proGRP的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC。
提供下列实施例、序列表和图来帮助理解本发明，其真实范围示于所附权利要中。应当理解，可在所示的方法中进行变动而不背离本发明的精神。
附图说明
图1：图1显示了加入肿瘤样品的代表性2D-凝胶（图B）和加入匹配的对照样品的代表性凝胶（图A）的放大部分。
B =图B，肿瘤样品；
A =图A，对照样品。
图2：图2显示了受试者工作特性的作图（ROC-图），用于评估从LC患者处得到的60个样品，其与从30个明显的健康个体和30个表面上健康的吸烟者处得到的60个对照样品比较。
图3：图3显示了肺癌组织裂解液的蛋白质印迹分析。分析了20份肺癌组织裂解液（10例腺癌和10例鳞状细胞癌）和匹配的对照组织裂解液的5 μg 总蛋白，如实施例5中所描述。
M=分子量标记物；
T =肿瘤组织裂解液；
N=匹配的对照组织裂解液；
箭头指示PACAP的位置。
图4：图4显示了乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌组织裂解液的蛋白质印迹分析。分析了20份癌组织裂解液和匹配的对照组织裂解液的5 μg 总蛋白，如实施例6中所描述。
M=分子量标记物；
T =肿瘤组织裂解液；
N=匹配的对照组织裂解液；
乳腺= 乳腺癌组织裂解液；
结肠= 结肠癌组织裂解液；
前列腺= 前列腺癌组织裂解液；
肾= 肾癌组织裂解液；
Bl.=膀胱癌组织裂解液；箭头指示PACAP的位置。
图5：图5显示了肺癌、乳腺癌和结肠癌组织裂解液的蛋白质印迹分析比较。分析了癌症组织裂解液，如实施例5和6中所描述。
M=分子量标记物；
Lu=肺癌组织裂解液；
Ma=乳腺癌组织裂解液；
Co=结肠癌组织裂解液；
箭头指示PACAP的位置。
图6：图6显示了PACAP蛋白（SEQ ID NO:1）的氨基酸序列。
序列说明
SEQ ID NO: 1 显示了根据图6的序列。人PACAP蛋白序列（SwissProt数据库登记号：Q8WU39）。
SEQ
ID NO: 2 显示了合成的正向引物LC13Bfor-EcoRI。
SEQ
ID NO: 3 显示了合成的反向引物LC13Brev-HindIII。
SEQ
ID NO: 4 显示了合成的肽延伸。
SEQ
ID NO: 5 显示了人PACAP基因的剪接变体：PACAP_HUMAN-S2 (Swissprot数据库登记号：Q8WU39-2)。
SEQ
ID NO: 6 显示了人PACAP基因的剪接变体：PACAP_HUMAN-S3 (Swissprot数据库登记号：Q8WU39-3)。
实施例1
鉴定PACAP为肺癌标记物。
组织来源：
为了将肿瘤特异性蛋白鉴定为肺癌的诊断标记物，使用蛋白质组学方法进行了2种不同类型的组织的分析。
总而言之，分析了患有肺癌（10位腺癌和10位鳞状细胞癌）的20位患者的组织样品。在治疗性切除术中从每个患者处收集了2种不同的组织类型：肿瘤组织（>80%肿瘤）（T）和邻近的健康组织（N）。后者作为匹配的健康对照样品。组织在切除后立即速冻并在处理前贮存于–80℃。通过组织病理学标准诊断肿瘤。
组织制备：
将0.8-1.2 g冷冻的组织切成小块，转移至预冷的混合球磨机的研磨罐中并用液氮完全冷冻。在球磨机中将组织研磨成粉，在10倍体积（w/v）的裂解液（40 mM 柠檬酸钠, 5 mM MgCl2, 1% Genapol X-080,
0.02% 叠氮化钠, Complete® EDTA-free [Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号1 873
580]）中溶解，之后在Wheaton®玻璃匀浆器中匀浆（20 x 松配合（loose fitting）, 20 x 紧密配合（tight fitting））。将匀浆液离心（10’，5,000 x g），将上清转移至另一个小管并再次离心(15’，20,000
x g)。得到的上清包含可溶性蛋白质并用于进一步分析。
白蛋白的消耗
为了从制备的组织裂解液中消耗高丰度的白蛋白，对裂解液进行免疫亲和层析，应用偶联单克隆抗-人-白蛋白IgG的CNBr-活化的Sepharose 4B(GE
Healthcare Europe GmbH, Munich, Germany)。使用Amicon®
Ultra-15仪器(Millipore GmbH, Schwalbach, Germany)根据制造商的说明书浓缩组织裂解液。将1 ml浓缩的裂解液注射至免疫亲和柱并以最大1
ml/min流速进行层析。运行缓冲液是不含Genapol X-080的裂解缓冲液。收集消耗的流出液并用于进一步分析。
等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE：
用于IEF，将3ml的白蛋白消耗的肝素结合级分与12ml样品缓冲液（7 M 尿素、2 M 硫脲、2% CHAPS、0.4% IPG缓冲液 pH 4-7、0.5% DTT）混合并孵育1h。样品在Amicon® Ultra-15仪器(Millipore
GmbH, Schwalbach, Germany)中浓缩，使用Bio-Rad®蛋白质测定 (货号500-0006;
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany)根据供应商手册的说明测定蛋白质浓度。在对应1.5 mg蛋白质的体积中加入样品缓冲液至终体积350 µl。此溶液用于再水合IPG条带pH 4-7
(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)过夜 。使用以下梯度方案进行IEF：1.) 1分钟至500V；2.)2h至3500V；3.) 在恒定的3500V下22 h以得到82 kVh。IEF之后，条带在–80 ℃贮存或直接用于SDS-PAGE。
在SDS-PAGE之前，在平衡缓冲液（6 M 尿素, 50 mM Tris/HCl, pH 8.8, 30%甘油, 2% SDS）中孵育条带，加入DDT进行还原（15分钟, + 50 mg
DTT/10 ml），加入IAA进行烷基化(15分钟, + 235 mg碘乙酰胺/10 ml)。将条带置于12.5%聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳，以1W/凝胶电泳1h，之后以17W/凝胶电泳。之后，将凝胶固定（50%甲醇, 10%醋酸盐）和使用Novex® Colloidal Blue Staining试剂盒 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany, 货号LC6025, 45-7101)染色过夜。
PACAP蛋白作为肺癌的潜在标记物的检测：
通过图像分析使用ProteomeWeaver® 软件(Definiens AG, Munich, Germany)分别分析每个患者。此外，通过采集机器人切除凝胶的所有点并通过MALDI-TOF质谱(UltraflexTM Tof/Tof, Bruker Daltonik GmbH,
Bremen, Germany)鉴定点中存在的蛋白质。对每个患者，比较来自肿瘤样品的3块凝胶和来自邻近的正常样品的3块凝胶，并分析对应差异表达的蛋白质的有区别的点。通过此方法，发现PACAP蛋白在肿瘤组织中特异性表达或强烈地过表达。在13位肺癌患者的2D-凝胶中检测和鉴定出PACAP蛋白点，但仅在4个对照样品中检测和鉴定出PACAP蛋白点。在腺癌（AdCa）和鳞状细胞癌(SCC)中的过表达类似（见表1和图1）。因此PACAP有资格作为候选标记物用于诊断肺癌。
表1：
PACAP蛋白在肺肿瘤中的过表达
实施例2
生成针对肺癌标记物蛋白PACAP的抗体。
生成了针对肺癌标记物蛋白PACAP的多克隆抗体以将抗体进一步用于测量PACAP的血清、血浆和血液水平，通过免疫检测分析，例如蛋白质印迹和ELISA来进行。
重组蛋白质在大肠杆菌中的表达：
为了生成针对PACAP的抗体，在大肠杆菌中生产重组抗原。因此，从全长cDNA克隆IRALp962G1939Q（从德国基因组研究资源中心（German
Resource Center for Genome Research）(RZPD,
Berlin, Germany)获得）中经PCR扩增PACAP编码区，使用以下引物：
正向引物LC13Bfor–EcoRI:
反向引物LC13Brev–HindIII:
正向引物（除了EcoRI克隆位点和核糖体结合位点以外）的特征是编码依读框引入PACAP蛋白的N-端MRGSHHHHHHIEGR肽延伸(SEQ ID NO: 4)的寡核苷酸。将EcoRI/HindIII消化的PCR片段连接至对应的pQE-30 (Qiagen,
Hilden, Germany)载体片段，之后将其转化进大肠杆菌XL1-blue感受态细胞。在进行序列分析后，将质粒转化进大肠杆菌BL21感受态细胞，根据制造商的说明书进行在pQE载体系列的IPTG-可诱导型T5启动子控制下的表达。
用于纯化MRGSHHHHHHIEGR-PACAP融合蛋白，通过离心沉淀1 l过夜诱导的细菌培养物，通过在100 mM 磷酸钠缓冲液,
pH 8.0, 7 M 盐酸胍, 5 mM 咪唑, 20 mM 硫代甘油中重悬来裂解细胞沉淀。通过离心沉淀不溶物质，将上清用于镍-次氨基三乙酸(Ni-NTA)金属亲和层析：用数倍床体积的裂解缓冲液清洗柱，之后用a）100 mM 磷酸钠缓冲液, pH 8.0,
10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 8 M 尿素, 20
mM 硫代甘油; b) 100 mM 磷酸钠缓冲液, pH 8.0, 0.5% 十二烷基硫酸钠
(SDS), 20 mM 硫代甘油;和c)
100 mM 磷酸钠缓冲液, pH 8.0, 0.1% SDS, 20 mM 硫代甘油清洗。最后，使用100 mM 磷酸钠缓冲液, pH 5.0,
0.1% SDS, 20 mM 硫代甘油在酸性条件下洗脱结合的抗原，并在相同的缓冲液中于4℃贮存。
多克隆抗体的生成：
a）免疫。
用于免疫，制备1:1比例的蛋白质溶液（100 µg/ml
PACAP蛋白）和弗氏完全佐剂的新鲜乳状液。在第1、7、14 和30、60和90天用1ml乳状液免疫各只兔。抽取血液，得到的抗-PACAP血清用于如实施例3和4中描述的进一步试验。
b）使用辛酸和硫酸铵通过顺序沉淀纯化兔血清中IgG（免疫球蛋白G）。
1倍体积的兔血清使用4倍体积的醋酸缓冲液(60 mM,
pH 4.0)稀释。用2M Tris-碱将pH调整为4.5。在剧烈搅拌下逐滴加入辛酸（25 µl/ml稀释样品）。30分钟后离心样品(13 000 x
g, 30分钟, 4℃)，弃沉淀，收集上清。通过加入2 M Tris-碱将上清的pH调整为7.5并过滤(0.2 µm)。
在剧烈搅拌下通过逐滴加入4M硫酸铵溶液至2M的终浓度来沉淀上清中的免疫球蛋白。通过离心收集沉淀的免疫球蛋白(8000 x g, 15分钟, 4℃)。
弃上清。在10 mM NaH2PO4/NaOH,
pH 7.5, 30 mM NaCl中溶解沉淀并彻底透析。离心透析液(13 000
x g, 15分钟, 4℃)并过滤(0.2 µm)。
多克隆兔IgG的生物素化：
使多克隆兔IgG在10 mM
NaH2PO4/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl中达到10 mg/ml。每 ml
IgG溶液加入50 µl 生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6 mg/ml于DMSO中)。在室温下进行30分钟后，将样品在Superdex 200
(10 mM NaH2PO4/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl)上进行层析。收集含有生物素化的IgG的级分。根据相同的方法生物素化单克隆抗体。
多克隆兔IgG的地高辛化：
使多克隆兔IgG在10 mM
NaH2PO4/NaOH, 30 mM NaCl, pH 7.5中达到10 mg/ml。每 ml
IgG溶液加入50 µl地高辛-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂(Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany, 货号1 333
054) (3.8 mg/ml 于DMSO中)。在室温下进行30分钟，将样品在Superdex® 200 (10 mM NaH2PO4/NaOH,
pH 7.5, 30 mM NaCl)上进行层析。收集含有地高辛化的IgG的级分。根据相同的方法用地高辛标记单克隆抗体。
实施例3
用于测量人血清和血浆样品中PACAP的ELISA。
为了检测人血清或血浆中的PACAP，发展了夹心ELISA。用于捕获和检测抗原，将等分抗PACAP多克隆抗体(参见实施例 2)分别缀合生物素和地高辛。
将链霉抗生物素包被的96-孔微量滴定板与100 µl以10 µg/ml浓度在10 mM
磷酸盐, pH 7.4, 1% BSA, 0,9% NaCl和0.1% Tween 20中的生物素化抗-PACAP多克隆抗体孵育60分钟。孵育后，将板用0.9% NaCl , 0.1%
Tween 20洗3次。之后将孔与连续稀释的作为标准抗原的重组蛋白（见实施例2）或与稀释的患者血浆样品孵育2h。在结合PACAP之后，将板用0.9% NaCl , 0.1% Tween 20洗3次。用于结合的PACAP的特异性检测，将孔与100 µl 以10 µg/ml浓度在10 mM
磷酸盐, pH 7.4, 1% BSA, 0,9% NaCl和0.1% Tween 20中的地高辛化抗-PACAP多克隆抗体在孵育60分钟。之后，将板洗3次以去除未结合的抗体。在下一步骤中，用20 mU/ml在10 mM
磷酸盐, pH 7.4, 1% BSA, 0,9% NaCl和0.1% Tween 20中的抗地高辛-POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号1633716)温育孔60 分钟。之后用相同的缓冲液洗板3次。为检测抗原-抗体复合物，将孔与100 µl ABTS溶液(Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 货号
11685767)孵育，在30-60分钟后用ELISA读数器在450 nm测量OD。
实施例4
PACAP在肺癌中的临床应用。
通过分析从良好表征的患者同期组(cohort)中得到的血清样品来评估PACAP的临床应用。在对照和患者的不同数目和人群的2个研究人群中进行了评估。通过ROC分析评估诊断值，在95%特异性上测定灵敏度。
第一研究
使用来源于60位良好表征的NSCLC患者(30例腺癌，30例鳞状细胞癌)的样品，使用表2给出的UICC分类。
表
2
研究人群
| 根据UICC的分期 | 样品的数目 |
| UICC I/II | 24 |
| UICC III | 17 |
| UICC IV | 19 |
| 明显健康的血液供体 | 30 |
| 表面上健康的吸烟者 | 30 |
与没有任何已知恶性肺病的30个明显健康个体和30个表面上健康的吸烟者（=对照同期组）处得到的60个对照样品相比较，评估表2的LC样品中的PACAP水平。
发现通过曲线下面积测量的区分LC组患者和健康个体的区分能力为82%（LC相对健康对照）（图2）。
在95%的特异性上，对所有LC样品的灵敏度为37%，分别地，对腺癌的灵敏度为23%，对鳞状细胞癌的灵敏度为50%。
第二研究
在多中心研究中收集大量临床良好表征的血清样品（表3）。除了来自健康人和来自表面上健康的吸烟者或曾抽烟者的样品以外，全部对照集合（233个样品）包括来自通过工作相关暴露具有提高的肺癌风险的个体和来自具有0-II期慢性阻塞性肺病（COPD）的受试者的样品。
在年龄匹配的肺癌组中（表4）描述了来自所有时期的NSCLC的最重要组织学类型和SCLC患者的样品。ROC分析的AUC值对NSCLC样品为69%，对SCLC样品为68%。通过UICC分期的NSCLC样品分组得到62-74%的值。在不同组织学组中，大细胞癌样品区分的最好（77% AUC）。因此在95%选择性上对此组织学类型的灵敏度最高。
表3
第二研究人群的对照样品表征
表4
第二研究人群的鉴别分析
。
实施例5
使用如实施例2中生成的多克隆抗体，进行蛋白质印迹用于检测人肺癌组织中的PACAP。
如实施例1“组织制备”中所述制备来自肿瘤样品和健康对照样品的组织裂解液。
使用Invitrogen, Karlsruhe, Germany的试剂和设备进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。对每个检测的组织样品，15 µg组织裂解液在还原性NuPAGE® (Invitrogen) SDS样品缓冲液中稀释并在95℃加热10分钟。样品在4-12% NuPAGE® 凝胶（Tris-甘氨酸）上在MES运行缓冲系统中运行。使用Invitrogen XCell
II® Blot Module (Invitrogen)和NuPAGE®
转移缓冲系统将凝胶分离的蛋白质混合物印迹（blotted）至硝酸纤维素膜上。将膜在PBS/0.05% Tween-20中洗3次，用Roti®-Block封闭缓冲液(A151.1;
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany) 封闭2h。将第一抗体多克隆兔抗-Q8WU39血清（在实施例2中描述了生成）以1:10,000在Roti®-Block封闭缓冲液中稀释并与膜孵育1h。将膜在PBS/0.05%
Tween-20中洗6次。特异性结合的第一兔抗体用在0.5 x
Roti®-Block封闭缓冲液中稀释至10 mU/ml的POD缀合的多克隆绵羊抗兔IgG抗体标记。孵育1h后，将膜在PBS/0.05%
Tween-20中洗6次。为检测结合的POD缀合的抗兔抗体，将膜与Lumi-LightPLUS蛋白质印迹底物(Order-No. 2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Germany)孵育并在放射自显影底片上曝光。
在从20位不同LC患者处得到的20个肿瘤组织裂解液中，有16个样品的PACAP信号强度提高（图3）。表达水平为>100 ng/mg。因此，如实施例1中通过MALDI检测到的肺癌组织中PACAP提高的丰度通过蛋白质印迹分析得到确认。
实施例6
使用如实施例2中生成的多克隆抗体，进行蛋白质印迹用于检测人乳腺和结肠组织中的PACAP。
如实施例1“组织制备”中所述制备来自肿瘤样品和健康对照样品的组织裂解液。
如实施例5中所述进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。
对于乳腺癌和结肠癌，分析了5位患者的肿瘤和邻近的正常组织。与正常组织相比，在3例乳腺癌和4例结肠癌中发现PACAP蛋白的过表达。表达水平在样品中不同，并且在所有乳腺癌和结肠癌中的表达水平略微低于肺癌。在乳腺癌和结肠癌组织中PACAP提高的丰度通过蛋白质印迹分析得到确认（图4和5）。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 作为癌症的标记物的PACAP
<130> 25485 WO
<150> EP08019731
<151> 2008-11-12
<160> 6
<170> PatentIn 版本3.2
<210> 1
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Arg
Leu Ser Leu Pro Leu Leu Leu
Leu Leu Leu
Gly Ala Trp Ala
1 5 10 15
Ile Pro Gly Gly Leu Gly Asp Arg
Ala Pro Leu Thr Ala Thr Ala Pro
20 25 30
Gln Leu Asp Asp Glu Glu Met Tyr
Ser Ala His Met Pro Ala His Leu
35 40 45
Arg Cys Asp Ala Cys Arg Ala Val Ala Tyr Gln Met Trp Gln
Asn Leu
50 55 60
Ala Lys
Ala Glu Thr Lys Leu His Thr
Ser Asn Ser Gly Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Leu Ser Glu Leu Val Tyr Thr
Asp Val Leu Asp Arg Ser Cys Ser
85 90 95
Arg Asn Trp Gln Asp Tyr Gly
Val Arg Glu Val Asp Gln Val Lys Arg
100 105 110
Leu Thr Gly Pro Gly Leu Ser Glu
Gly Pro Glu Pro Ser Ile Ser Val
115 120 125
Met Val Thr
Gly Gly Pro Trp Pro Thr Arg
Leu Ser Arg Thr Cys Leu
130 135 140
His Tyr
Leu Gly Glu
Phe Gly Glu
Asp Gln Ile Tyr Glu Ala His Gln
145 150 155 160
Gln Gly Arg Gly Ala Leu Glu
Ala Leu Leu Cys Gly Gly
Pro Gln Gly
165 170 175
Ala Cys
Ser Glu Lys Val Ser Ala Thr Arg Glu
Glu Leu
180 185
<210> 2
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 2
acgtacgtga attcattaaa gaggagaaat
taactatgag aggatcgcat caccatcacc 60
atcacattga aggccgtagg ctgtcactgc
cactgctgc 99
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 3
acgtacgtaa gctttcatta gagctcttct
cttgtggctg 40
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 4
Met Arg
Gly Ser His His His His His
His Ile Glu
Gly Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Arg
Leu Ser Leu Pro Leu Leu Leu
Leu Leu Leu
Gly Ala Trp Ala
1 5 10 15
Ile Pro Gly Gly Leu Gly Asp Arg
Ala Pro Leu Thr Ala Thr Ala Pro
20 25 30
Gln Leu Asp Asp Glu Glu Met Tyr
Ser Ala His Met Pro Ala His Leu
35 40 45
Arg Cys Asp Ala Cys Arg Ala Val Ala Tyr Gln Ser Leu Leu
Val Pro
50 55 60
Asp Val Ala Lys
Ser Gly Lys Gly Arg Asp Gln
Thr Ser Tyr Leu Lys
65 70 75 80
Leu Trp Gly Ala Ala Gly Ala Glu
Arg Val Gly Leu His Gly Cys
Pro
85 90 95
Gly Pro Glu Leu Leu Pro Glu Leu
Ala Gly Leu Arg Ser Ser Arg
Ser
100 105 110
Gly Pro Ser Glu Thr Ser
His Arg Pro Arg Thr
115 120
<210> 6
<211> 61
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Val Thr
Gly Gly Pro Trp Pro Thr Arg
Leu Ser Arg Thr Cys Leu
1 5 10 15
His Tyr
Leu Gly Glu
Phe Gly Glu
Asp Gln Ile Tyr Glu Ala His Gln
20 25 30
Gln Gly Arg Gly Ala Leu Glu
Ala Leu Leu Cys Gly Gly
Pro Gln Gly
35 40 45
Ala Cys
Ser Glu Lys Val Ser Ala Thr Arg Glu
Glu Leu
50 55 60
Claims (15)
1.一种用于体外评估癌症的方法，其包括测量样品中下列物质的浓度：
(a)促凋亡胱天蛋白酶衔接蛋白（PACAP）和/或其片段,
(b)任选地一个或更多个其他癌症标记物，和
(c)在癌症的评估中使用步骤(a)和任选地步骤(b)的测量结果，其中提高的PACAP蛋白和/或其片段的浓度预示着癌症。
2.根据权利要求1的方法，其进一步特征在于所述方法用于评估癌症如肺癌、结肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆道癌，特别是肺癌和/或结肠癌。
3.根据权利要求2的方法，其进一步特征在于所述癌症为肺癌。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其进一步特征在于步骤（b）中所述一个或更多个其他标记物选自Cyfra 21-1、CEA、CA 19-9、SCC、CA 125、NSE和/或proGRP。
5.根据权利要求1至4的任一项的方法，其进一步特征在于所述样品为血液、血浆、血清、痰、尿、粪、支气管肺泡灌洗液（BAL）或上皮细胞衬液（ELF）样品。
6.根据权利要求1至4的任一项的方法，其进一步特征在于所述样品为组织样品。
7.根据权利要求1至6的任一项的方法，其进一步特征在于所述浓度通过免疫学方法测量。
8.PACAP蛋白和/或其片段在癌症评估中的用途。
9.根据权利要求8的用途用于评估肺癌和/或结肠癌。
10.根据权利要求8的用途用于评估肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。
11.抗PACAP蛋白和/或其片段的抗体在癌症评估中的用途，其中提高的PACAP蛋白和/或其片段的浓度预示着癌症。
12.包括PACAP蛋白和/或其片段和任选地一个或更多个其他癌症标记物的标记物组在癌症评估中的用途，其中提高的PACAP蛋白和/或其片段的浓度预示着癌症。
13.根据权利要求12的标记物组的用途，其进一步特征在于所述任选地一个或更多个其他标记物选自Cyfra
21-1、CEA、CA 19-9、SCC、CA 125、NSE和/或proGRP。
14.根据权利要求12或13的标记物组的用途用于评估肺癌，特别是NSCLC。
15.用于进行根据权利要求1的方法的试剂盒，所述试剂盒包括特异性地测量PACAP蛋白和/或其片段和任选地一个或更多个其他癌症标记物所需的试剂。
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