CN102659802A

CN102659802A - 香豆素木脂体类化合物的制备方法及其抗海洋污损方面的应用

Info

Publication number: CN102659802A
Application number: CN201210127601XA
Authority: CN
Inventors: 王奇志; 陈雨; 冯煦; 赵友谊; 王鸣; 单宇; 管福琴; 印敏; 孙浩
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2032-04-27
Also published as: CN102659802B

Abstract

本发明涉及从锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)植物海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)中提取得到的一类香豆素木脂体类化合物及其制备方法，以及该类化合物抗癌、抗氧化和抗海洋污损方面的应用。特征是化合物A的结构式如右图所示，制备方法包括50-95％醇提取，低极性溶剂萃取，大孔树脂，得到香豆素木脂体类化合物集中的活性部位。本发明的提取工艺及方法获得的海滨木槿有效成分得率及纯度高，具有抑制HeLa、HepG2、HL-60等癌细胞活性及草苔虫幼虫和藤壶幼虫等附着活性，有抗海洋污损作用，可用于制备高效的海洋防污剂，同时明确了有效成分的含量，化合物A的含量不低于3％，易于掌握有效剂量，更安全、稳定。

Description

香豆素木脂体类化合物的制备方法及其抗海洋污损方面的应用

1、技术领域

本发明涉及从锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)植物海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)中提取得到的一类香豆素木脂体类化合物及其制备方法，以及该类化合物抗癌、抗氧化和抗海洋污损方面的应用。本发明制备的海滨木槿活性成分含量明确，易于掌握有效剂量，用于制备抗癌、抗氧化及抗海洋污损产品时更为安全、稳定。

2、背景技术

锦葵科木槿属植物全世界200余种分布于热带和亚热带地区；我国有24种和16变种，分布于全国各地。本属植物多数供药用，对治疗跌打损伤、阴囊湿疹、皮肤癣、痢疾腹泻、痔疮出血、心脏和神经系统疾病以及各类炎症有良效。从木槿属植物的花、树皮、根及心材中分离得到的单体化合物类型有木脂素、黄酮、萜类、mansonones类、环肽、有机酸、香豆素和香豆素木脂体(主要活性成分)等，这些化合物的药理作用有抗炎抑菌、抗氧化、抗肿瘤和抗生育等。海滨木槿(Hibiscus hamabo Sieb.et Zucc.)系锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)落叶灌木或小乔木，20世纪80年代，由浙江农业大学范文涛教授采集该树的标本并将其定名为海滨木槿，又名海槿、海塘木、海塘树。有关海滨木槿的研究较少，且多数集中在引种、驯化方面，为了进一步发掘海滨木槿的内在功效，合理、可持续利用资源，提升综合利用附加值，本发明通过多种活性筛选实验发现海滨木槿活性提取物具有很好的抗癌、抗氧化和抗海洋污损作用。

3、发明内容

本发明的目的在于从海滨木槿中提取具有多种生物活性的有效部位，寻找最适剂量，减少用量且得到显著的效果，以提供一种海滨木槿活性成分制备抗癌的药品、抗氧化保健食品和抗海洋污损生物幼虫附着方面的方法和用途。

本发明明确了海滨木槿活性成分的组成和性质及用途，其特征是提取物中总酚酸类活性成分含量为30-90％，其中化合物A含量不低于3％。

本发明海滨木槿活性成分的制备方法具体为：

方法1：

(1)将海滨木槿或枝叶切成3～10公分每段，置于提取釜中，加入3～10倍生药体积的低级醇，低级醇为C1～C5醇类，其浓度为50～95％，提取温度为25～70℃，过滤得到滤液，并反复提取2～4次，合并滤液得到粗提取液；

(2)提取液减压浓缩后，溶于25～70℃水中，浸膏与水的体积比为1∶2～3，按1∶1～3体积加入石油醚萃取，除去亲脂性杂质；

(3)按1∶1～3体积加入乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩至无有机溶剂味的固体，得到活性成分部位，得率为0.8～3重量％。

方法2：

(2)粗提液浓缩至原来的1/3后，利用大孔吸附树脂吸附，用1倍柱体积的水洗去水溶性杂质，例如糖等，再用2倍柱体积的20％乙醇洗去大极性物质，改用30％～70％乙醇对其进行梯度洗脱，收集洗脱液；

(3)将洗脱液减压浓缩至无乙醇味固体，得到活性成分部位，得率为0.2％～2重量％。

上述方法2中所用的大孔吸附树脂为D101或HP-20或AB-8；上述方法1、2、3中所用的醇为无水或含水醇，所用石油醚、乙酸乙酯为分析纯。

将根据方法1、2得到的活性提取物进行常压硅胶柱层析，以氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-丙酮溶剂系统为洗脱剂，从体积比100∶0到0∶100进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并组分，将在薄层层析上能用体积比7∶3的氯仿-甲醇溶剂系统展开的组分，合并用体积比8∶2到7∶3的氯仿-甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集在薄层层析上用体积比7∶3氯仿-甲醇溶剂系统展开时Rf值为0.3-0.5的组分分别合并，得到化合物A的粗产物，重结晶后得到最终产物。

本发明利用HPLC法测定化合物A的含量：

仪器与试剂

高效液相色谱仪Aglient 1100系列，四元泵，自动进样器，检测器：Aglient 1100UV，254nm下检测，色谱柱：Aglient Zorbax SB-C₁₈柱(250×4.6mm，5.0μm)，甲醇为色谱纯，乙酸为分析纯。

色谱条件

流动相：0min，甲醇：0.2％乙酸溶液维持比例(20∶80)，1-20min，流动相比例由(20∶80)线形改变到(40∶60)，21-50min，流动相比例由(40∶60)线形改变到(80∶20)，柱温30℃，流速0.8mL/min。

对照品溶液的制备

分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的化合物A对照品，各加甲醇制成每1mL分别含0.05mg的溶液，作为对照溶液。

通过上述方法制备的海滨木槿活性成分在抗癌、抗氧化和抗海洋污损方面有显著的效果。通过本发明方法得到的海滨木槿活性部位，方法简单，生产成本低，产品中有效成分含量较高，质量稳定、易于控制。

4、附图说明：

图1、化合物A的结构示意图

图2、本发明工艺流程图

图3、化合物A的¹H-NMR

图4、化合物A的¹³C-NMR

图5、化合物A的ESI-MS

图6、海滨木槿活性部位的HPLC(254nm)检测图

5、具体实施方式：

实施例1

采用方法1，将海滨木槿鲜枝叶5公斤切成10公分每段，加入3倍生药体积的95％乙醇，室温下(25℃)提取3次，每次7天，粗提液抽滤合并。30℃减压旋转蒸发浓缩滤液，将所得浸膏分散于水中，浸膏体积/水体积为1∶2.5，先按1∶1体积加入石油醚对其进行萃取脱脂，再按1∶1体积加入乙酸乙酯萃取3次，减压回收乙酸乙酯后得到的酯浸膏，用1L的蒸馏水溶解，抽滤水可溶部分，减压浓缩、干燥得到海滨木槿活性成分。

实施例2：

采用方法1，将海滨木槿干枝叶1公斤切成5公分每段，加入6倍生药体积的80％乙醇，70℃的水浴中回流提取2次，每次2h，粗提液抽滤合并。70℃减压旋转蒸发浓缩滤液，将所得浸膏溶于热水中，浸膏体积/水体积为1∶2，先按1∶2体积加入石油醚对其进行萃取脱脂，再按1∶2体积加入乙酸乙酯萃取5次，减压回收乙酸乙酯后得到的酯浸膏，用1L的蒸馏水溶解，抽滤水可溶部分，减压浓缩、干燥得到海滨木槿活性成分。

实施例3

采用方法1，将海滨木槿干枝叶1公斤切成3公分每段，加入10倍生药体积的50％乙醇，50℃的水浴中提取4次，每次2h，粗提液抽滤合并。50℃减压旋转蒸发浓缩滤液，将所得浸膏溶于50℃热水中，浸膏体积/水体积为1∶1，先按1∶1体积加入石油醚对其进行萃取脱脂，再按1∶2体积加入乙酸乙酯萃取5次，减压回收乙酸乙酯后得到的酯浸膏，用1L的蒸馏水溶解，抽滤水可溶部分，减压浓缩、干燥得到海滨木槿活性成分。

实施例4

采用方法2，取海滨木槿鲜枝叶5公斤切成5公分每段，用3倍生药体积的95％乙醇，室温(25℃)下，浸泡7天，过滤得到粗提取液，反复浸泡3次，合并滤液。在40℃减压旋转蒸发浓缩滤液至原来体积的1/3，将浓缩液经过大孔吸附树脂D101，使液体中的有效成分吸附于树脂上，弃去流出液，再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，再用2倍柱体积的20％乙醇冲洗树脂柱，弃去流出液，续以30％、50％、70％、90％乙醇进行梯度洗脱，收集50％、70％乙醇洗脱液，减压浓缩后得到海滨木槿活性成分。

实施例5

采用方法2，取海滨木槿干枝叶1公斤切成10公分每段，用6倍生药体积的80％乙醇，在70℃下加热回流提取2h，抽滤得到粗提取液，反复提取4次，合并滤液。在70℃减压旋转蒸发浓缩滤液至原来体积的1/3，将浓缩液经过大孔吸附树脂HP20，使液体中的有效成分吸附于树脂上，弃去流出液，再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继而分别用2倍柱体积的10％、30％、50％、70％、95％乙醇进行梯度洗脱，收集30％、50％、70％乙醇洗脱液，减压浓缩后得到海滨木槿活性成分。

实施例6

采用方法2，取海滨木槿干枝叶1公斤切成3公分每段，用10倍生药体积的50％乙醇，在80℃下加热提取2h，抽滤得到粗提取液，反复提取2次，合并滤液。在60℃减压旋转蒸发浓缩滤液至原来体积的1/3，将浓缩液经过大孔吸附树脂AB-8，使液体中的有效成分吸附于树脂上，弃去流出液，再用1倍柱体积的蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继而分别用2倍柱体积的10％、30％、50％、70％、80％、95％乙醇进行梯度洗脱，收集30％、50％、70％乙醇洗脱液，减压浓缩后得到海滨木槿活性成分。

实施例7

HPLC法测定海滨木槿活性成分中化合物A的含量

仪器与试剂

高效液相色谱仪Aglient 1100系列，四元泵，自动进样器，检测器：Aglient 1100UV，254nm，365nm下检测，色谱柱：Aglient Zorbax SB-C₁₈柱(250×4.6mm，5.0μm)，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯。

色谱条件

对照品溶液的制备

供试品溶液的制备：分别称取以上实施例1、3、5的海滨木槿活性成分提取物0.1g至50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度为待测溶液。

实施例8

海滨木槿不同部位不同溶剂提取物的体外抗氧化活性研究

1材料、试剂与仪器

1.1材料

海滨木槿于2010年采自浙江省宁海县青珠农场，经江苏省中国科学院植物研究所袁昌齐研究员鉴定，标本现存放于江苏省中国科学院植物研究所药用植物研究开发中心。

1.2仪器

Infinite M200型酶标仪(TECAN公司)；旋转蒸发器R-210(瑞士Buchi公司)；LIBRORAEL-200电子天平(Shimadzu公司)；HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LTJ-12型冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司制造)；TGL-16M型离心机(Saitexiangyi公司)；GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.3试剂

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)(Solarbio公司)；没食子酸标准品(国药集团化学试剂有限公司)；Foline-Phenol(BIOSHARP公司)；其他试剂均为分析纯。

2方法

2.1海滨木槿不同部位不同溶剂提取物的制备

分别称取海滨木槿根、茎皮、叶干燥粉末各4份，每份各5g。将样品分别以正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、和甲醇为溶剂超声提取，料液比1∶20(mg/mL)，超声功率100W，提取2次，30min/次，合并提取液，减压浓缩，真空干燥后得到4种不同溶剂提取物以备用。

2.2总酚含量测定实验

精密称取15mg没食子酸置于10mL容量瓶中，用蒸馏水溶解后定容至刻度，摇匀，配制成1.5mg/mL的标准品溶液，转移至棕色瓶中以备用；配制100mg/mL Na₂CO₃溶液。在96孔板中依次加入没食子酸标准品溶液0，1，2，4，6，8μL；在该96孔板的其它孔中加入质量浓度为100mg/mL的待检测样品1μL，用蒸馏水将每个加样孔补至50μL，然后分别加入50μL Folin-Ciocalteu试剂，震荡3min后加入50μL 100mg/mL Na₂CO₃溶液充分混匀，在室温下放置5h后，将96孔板放入酶标仪中在760nm波长处测定各样品的吸光值。每个检测做4个重复，取其平均值。最后根据没食子酸标准曲线求得各样品中总酚含量。

2.3抗氧化活性的测定

2.3.1清除DPPH自由基实验

取各组分不同溶剂提取物，DMSO溶解，配制成10mg/mL的母液。DPPH用无水乙醇配制成0.16mmol/L，置于棕色瓶中备用。在96孔板中，每孔分别加入100μL 0.16mmoL/L的DPPH，2μL样品溶液，98μL蒸馏水，反应体系200μL。加样后室温振荡15min，将96孔板放入酶标仪中在517nm波长处检测样品吸光度(Ai)；取20μL DMSO代替样品溶液测得空白吸光度(A0)；以100μL无水乙醇代替DPPH溶液测得样品本底吸光度(Aj)；每个浓度做4个平行，取其平均值。以Vc作阳性对照，按公式(1)计算清除率。

2.3.2对羟自由基(.OH)的清除作用

向干净的96孔板中分别加入质量浓度为10mg/mL的各组分不同溶剂提取物2μL，用蒸馏水补齐至50μL，然后每孔依次加入6mmoL/L的FeSO₄溶液50μL，6mmol/L的H₂O₂ 50μL，摇匀，静置10min后，再向其中加入6mmoL/L的水杨酸溶液50μL，混匀。在37℃条件下反应30min后将96孔板放入酶标仪中于510nm波长处测吸光值(Ai)；用DMSO代替体系中的样品，测得空白吸光值(Ao)；用蒸馏水代替体系中的水杨酸，测得样品本底吸光值(Aj)。每个检测做4个重复，取其平均值。以Vc作阳性对照，按公式计算清除率：

2.3.3对超氧阴离子自由基(O₂ ^-.)的清除作用^[8]

向干净的96孔板中分别加入质量浓度为10mg/mL的各提取物2μL，然后依次加入0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2)50μL，用蒸馏水补齐至190μL，摇匀，置于25℃水浴中预热20min后，再分别加入10μL用10mM HCl配成的25mM焦性没食子酸，混匀后于25℃水溶液中反应5min，于299nm处测吸光值(Ai)；用DMSO代替体系中的样品，测得空白吸光值(Ao)；用10mM HCl代替体系中的焦性没食子酸，测得样品本底吸光值(Aj)。每个检测做4个重复，取其平均值。以Vc作阳性对照，清除率计算公式为：

3结果与分析

3.1总酚含量的测定

在0～80μg/mL范围内，以吸光度(y)为纵坐标，没食子酸浓度(x)为横坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到回归方程：y＝0.0318x+0.0445(R＝0.9996)，该结果表明没食子酸在0～80μg/mL范围内吸光值与浓度之间存在良好的线性关系。

表1 海滨木槿不同部位不同溶剂提取物中总酚含量(mg/g)

总酚含量(mg/g)＝x/c，式中x(mg/mL)是指由吸光值根据回归方程计算出的样品溶液中总酚浓度，以没食子酸来表示，c(g/mL)为对应吸光值的样品浓度，由此计算出各样品中的总酚含量，结果见表1。

3.2对DPPH自由基的清除作用

DPPH是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517nm波长处有较大吸收，当加入抗氧化剂时，一部分自由基被清除掉，使该波长下吸收强度减弱，可借此来评价某物质的抗氧化活性。

表2 100μg/ml的海滨木槿不同部位不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除作用(％)

3.3对羟基自由基(.OH)的清除作用

参照Fenton反应的方法建立反应体系模型，利用H₂O₂与Fe²⁺混合产生.OH，但由于.OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉.OH，并产生有色产物。该产物在510nm波长处有强吸收，若在反应体系中加入具有清除.OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争.OH，而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系加入一系列不同浓度的小麦麸皮总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，通过在510nm波长处测量各浓度下的吸光度A，便能检测被测物对.OH的清除作用。

表3 100μg/ml的海滨木槿不同部位不同溶剂提取物对羟基自由基的清除作用(％)

3.4对超氧阴离子自由基(O₂ ^-.)的清除作用

在碱性条件下邻苯三酚发生自氧化反应生成O₂ ^-.和中间体，该中间产物在299nm波长处有一特征吸收峰，当加入O₂ ^-.清除剂时，O₂ ^-.的生成受到抑制，邻苯三酚自氧化过程受阻，溶液在299nm波长处吸收减弱。因此，通过测定某物质对邻苯三酚自氧化的抑制作用，即可表征其对超氧阴离子自由基的清除作用。

表4 100μg/ml的海滨木槿不同部位不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除作用(％)

实施例9

体外抗肿瘤活性筛选实验

选择人体癌细胞株，采用MTT法测定96孔板上各被测孔OD值，计算细胞生长抑制率，采用Logit法计算50％生长抑制浓度IC₅₀值。MTT法：分别收集对数生长期的肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株Hela、肝癌细胞株HegG-2、人组织细胞淋巴瘤细胞株U-937、人原髓细胞白血病细胞株HL-60、人乳腺癌细胞株MCF-7、脑癌细胞株U-251，用10％胎牛血清及100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养液培养，使其悬浮，隔天用0.25％胰酶-0.02％EDTA消化传代，接种于96孔培养板，每孔细胞数为5000/80μL，置于5％CO₂培养箱，37℃孵育。用10％血清DMEM培养液将化合物A、B分别稀释成浓度为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL的实验溶液。次日于实验组1的培养板中加入浓度为25μg/mL的实验液20μL，实验组2的培养板中加入浓度为50μg/mL的实验液20μL，实验组3的培养板中加入浓度为100μg/mL的实验液20μL，并使每孔中的终浓度达到测试(实验组浓度采用对倍稀释)。另外阴性对照组中加入等量的10％血清DMEM培养液。48h后，吸弃实验组和对照组中的培养液，每孔加入MTT溶液20μL(2.5mg/mL)，继续培养4h。再每孔加入DMSO100μL终止反应，37℃放置20min，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度A值，计算细胞生长抑制率，用下面公式计算药物处理后肿瘤细胞的存活率：细胞存活率％＝(A_570加药组-A_690加药组)/(A_570对照组-A_690对照组)×100％。

Tanble 5.In vitro cytotoxicity of A against Hela，U-937，U-251，HL-60，MCF-7，HepG2 and A549 cell lines(IC₅₀μM).

NA＝not active up to 100μM

实施例10

对多室草苔虫幼虫的抗附着活性筛选试验

该实验用的是聚苯乙烯24孔径板，将化合物A作为测试样品分别溶于二基亚砜(DMSO)，然后加入经高压灭菌器过滤(0.22μM)的海水(FSW)配成不同的浓度(0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)。在每个孔板中加入20个游动的幼虫和1mL配制好的测试样品，每个样品做4个平行孔，用加有DMSO的FSW海水作为阴性对照物。将配有测试样品的24孔径板放于28℃的培养箱中放置1小时后，观察实验结果。通过显微镜计算：1)已附着在板壁上的幼虫个数；2)没有附着在板壁上的幼虫个数；3)已死了的幼虫个数。计算已附着在板壁上的幼虫个数占实验用的总幼虫个数的百分比，再通过EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM VERSION 1.5软件计算其抑制幼虫附着的半数有效抑制浓度EC₅₀，结果显示，化合物A对多室草苔虫幼虫附着的半数有效抑制浓度EC₅₀为12.3μg/mL，半数有效致死浓度LC₅₀＞100μg/mL。

Claims

1.香豆素木脂体类化合物A的结构式为：

。

2.一种海滨木槿活性提取物的制备方法，其特征是，包括以下工艺步骤：

(1)将海滨木槿细枝切碎置于提取釜中，加入3～10倍海滨木槿细枝体积的低级醇进行提取，提取温度为30～70℃，提取时间为6～12h，过滤得到滤液；按以上提取温度和时间反复提取1～4次，过滤，合并滤液得到粗提取液；所述低级醇为C1～C5的醇类，浓度为50～95％；

(2)将粗提取液进行减压浓缩(仪器：

旋转蒸发仪R-210，水浴60℃，Vacuum PumpV-700减压泵，70-100mbar(7-10kPa))，减压浓缩后的粗提取浸膏溶于30～70℃的热水中，粗浸膏与热水的体积比为1∶2～3；再按体积比1∶1～3加入石油醚萃取，除去亲脂性杂质；

(3)按体积比1∶1～3加入乙酸乙酯进行萃取，萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至无有机溶剂味的干固体，得到乙酸乙酯浸膏；

(4)向乙酸乙酯浸膏中加入一定量的水溶解(约20mg乙酸乙酯浸膏加水1mL)，抽滤后的水溶液(滤去水不溶的固体)浓缩至干即得到海滨木槿活性物，该活性物的得率为0.8％～3重量％(即海滨木槿的重量(g)÷海滨木槿枝叶(g)×100％)，化合物A的含量为1-3％，化合物B含量为3-5％。

3.一种海滨木槿活性提取物的制备方法，其特征是，包括以下工艺步骤：

(1)将海滨木槿枝叶切碎置于提取釜中，加入3～10倍海滨木槿枝叶体积的低级醇进行提取，提取温度为30～70℃，提取时间为6～12h，过滤得到滤液；按以上提取温度和时间反复提取1～4次，过滤，合并滤液得到粗提取液；所述低级醇为C1～C5的醇类，浓度为50～95％；

(2)将粗提液减压浓缩(仪器：旋转蒸发仪R-210，水浴60℃，Vacuum Pump V-700减压泵，70-100mbar(7-10kPa))至原来体积的1/3(约500mL)后，利用大孔吸附树脂1Kg进行吸附，先用1000mL的水洗去水溶性杂质，再用浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇各3000mL进行梯度洗脱，收集洗脱液；

(3)将洗脱液减压浓缩(仪器：

旋转蒸发仪R-210，水浴60℃，Vacuum Pump V-700减压泵，70-100mbar(7-10kPa))至无有机溶剂味干固体，得到海滨木槿活性提取物；该海滨木槿活性物的得率为0.2％～2重量％(即海滨木槿活性物的重量(g)÷海滨木槿枝叶(g)×100％)，化合物A的含量为3-5％，化合物B含量为5-7％。

4.权利要求3中所用的大孔吸附树脂为D101或HP-20或AB-8。

5.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤：

将权利要求2、3得到的活性提取物进行常压硅胶柱层析，以氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-丙酮溶剂系统为洗脱剂，从体积比100∶0到0∶100进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并组分，将在薄层层析上能用体积比7∶3的氯仿-甲醇溶剂系统展开的组分，合并用体积比8∶2到7∶3的氯仿-甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集在薄层层析上用体积比7∶3氯仿-甲醇溶剂系统展开时Rf值为0.3-0.5的组分分别合并，得到化合物A的粗产物，重结晶后得到最终产物。

6.一种海滨木槿活性提取物在制备抗氧化、清除自由基方面的应用。

7.一种海滨木槿活性提取物在制备治疗癌症药物方面的应用。

8.一种海滨木槿活性提取物抗海洋污损生物幼虫附着方面的应用。