CN102906120A

CN102906120A - 重组人g-csf二聚体及其在治疗神经系统疾病中的用途

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Publication number: CN102906120A
Application number: CN201180025773XA
Authority: CN
Inventors: 严孝强; 黄智华; 杨红舟; 孙乃超; 黄予良
Original assignee: Generon Shanghai Corp Ltd
Current assignee: Yiyi biopharmaceutical (Beijing) Co.,Ltd.
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-05-25
Also published as: EP2576624A1; HUE031872T2; CN104710535B; JP2013530148A; DK3121198T3; EP3121198A1; US8557546B2; CA2800688C; AU2011257734B2; US9273108B2; PL2576624T3; DK2576624T3; ES2750730T3; CN102906120B; PT2576624T; ES2611151T3; CA2800688A1; US20110293554A1; EP2576624B1; AU2011257734A1

Abstract

本发明提供了一种重组人G-CSF(rhG-CSF)二聚体，其具有比GCSF延长的血清半衰期和增强的生物活性，其中，所述的二聚体由二个G-CSF-Fc复合物通过Fc片段的二硫键配对形成，并且所述G-CSF-Fc复合物包含：G-CSF单体、IgG2的Fc片段、以及连接所述G-CSF单体和Fc片段的肽。所述的rhG-CSF可用于治疗神经性疾病。

Description

重组人G-CSF二聚体及其在治疗神经系统疾病中的用途

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(a)，本申请要求2010年5月25日提交的中国专利申请(申请号CN201010181623.5)的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表引用

一起提交的序列表硬拷贝(hard copy)和相应的计算机可读形式，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及生物学和医学技术领域，特别地，本发明涉及一种新的人G-CSF二聚体及其在治疗伴随神经损伤的疾病中的用途。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种含有204个氨基酸和30个氨基酸信号肽的糖蛋白。成熟的G-CSF蛋白分子量为18-20kDa，由174个氨基酸构成，不含信号肽，并被分泌到细胞外。主要负责这类分泌的人类细胞为单核细胞、成纤维细胞、和内皮细胞。

G-CSF主要具有三大生物学功能，即：

1.作用于骨髓前体细胞和干细胞，从而驱动嗜中性粒细胞的分化、发育和成熟；

2.激活成熟的嗜中性粒细胞，参与免疫反应；和

3.作用于其他造血生长因子，如干细胞因子、Flt-3配体、和GM-CSF，从而动员造血干细胞。

G-CSF受体(G-CSFR)已证实存在于骨髓造血干细胞Sca⁺Lin^-Th1^low、前体细胞CD34⁺、以及定向分化的嗜中性粒前体细胞(committed granulocyteprecursor)、和成熟的嗜中性粒细胞。G-CSFR是一种对G-CSF有高亲合力的特异性受体，具有812个氨基酸。

Tamada等人获得了G-CSF:G-CSFR复合物的晶体结构，2.8埃衍射分析(PNAS，2008，Vol.103:3135-3140)显示G-CSF:G-CSFR复合物是以2：2比例存在。换言之，每个复合物中，每一个G-CSF结合于一个受体链，从而形成G-CSF-受体复合物，当两个G-CSF-受体复合物相互靠近，相互作用形成2:2二聚体。在这种情况下，G-CSF受体的羧基端才能激活下游的信号分子JAK2(Janus tyrosinekinase，主要是JAK2)。因此，JAK2激活STAT3，从而启动对嗜中性粒细胞分化、增殖和激活至关重要的基因的转录。

2003年，Schabitz W.R等报道，重组人G-CSF(rhG-CSF)对神经细胞在缺血性动物模型中具有保护功能(Stroke，2003，34:745-751)。2006年后期，Shyu等报道，连续5天每天给病人施用重组人G-CSF，表明，rhG-CSF在急性中风病人的治疗中具有临床效果(CMAJ，2006，174:927-933)。皮下给药，鼠G-CSF在体内的半衰期约2小时，而人G-CSF的皮下给药半衰期只有3.5小时，因此，需要给需要的病人每天施用，或静脉注射药物，这会影响病人的生活质量。

发明内容

鉴于前述背景，本发明的目的是提供一种用于更有效治疗伴随神经损伤的疾病的替代药物及其制法。

因此，在本发明的第一方面，提供了一种式I所示的G-CSF二聚体：

(I) M1-L-M2

其中，M1是G-CSF的第一单体；M2是G-CSF的第二单体；L是连接所述第一单体和第二单体的接头(linker)，并位于所述第一单体和第二单体之间。

并且，所述的G-CSF二聚体保持G-CSF单体的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一或第二单体的2倍以上。

在本发明的一个优选例中，所述的L选自下组：

a)有机接头；

b)包含3-50个氨基酸的短肽；以及

c)式II所示的多肽：

(II) -Z-Y-Z-

其中，Y为载体蛋白；Z为包含0-30个氨基酸的短肽。在另一优选例中，没有氨基酸的短肽是指肽健。

在另一优选例中，接头对G-CSF二聚体具有足够小的空间位阻，以至于不影响或不显著影响第一单体和第二单体形成的正确的折叠和构象。

在一个优选例中，有机接头选自下组：氧甲基苯基乙酰胺基甲基(oxymethylphenylacetamidomethyl)(PAM)树脂、4-氧甲基-苯基乙酰胺基甲基树脂(4-oxymethyl phenylacetamidomethyl resin)、和氯甲基化聚苯乙烯树脂(chloromethyl polystyrene resin)。

在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是相同的。

在一个优选例中，所述融合蛋白的生物活性包括：

(a)作用于嗜中性粒细胞和干细胞，从而驱动嗜中性粒细胞的分化、生长和成熟；和

(b)激活成熟的嗜中性粒细胞，参与免疫反应。

在另一优选例中，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。

在一个优选例中，所述的G-CSF二聚体的血清半衰期是所述第一和/或第二单体血清半衰期的3倍以上、5倍以上、或10倍以上。

在另一优选例中，所述的G-CSF二聚体由两个G-CSF-Fc复合物制得，其中，每个G-CSF-Fc复合物包含一个选自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种由第一多肽和第二多肽制备的融合蛋白，其中，所述的第一多肽和第二多肽包含一段如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且两个多肽无空间位阻地连接。

在一个优选例中，所述的第一和第二多肽为G-CSF单体。

在本发明的另一优选例中，所述的第一多肽和第二多肽之间的无位阻地连接通过接头实现。在该实施例中，所述的接头为：

a).具有足够小空间位阻的有机接头，不影响或不显着影响第一单体和第二单体形成的正确的折叠和构象；

b).包含3-50个氨基酸的短肽；以及

c).式II所示的多肽：

(II) -Z-Y-Z-

其中，Y为载体蛋白；Z为包含0-30个氨基酸的短肽。在一个优选例中，所述的没有氨基酸的短肽是指肽健。

在另一优选例中，所述的有机接头为：氧甲基苯基乙酰胺基甲基(oxymethylphenylacetamidomethyl)(PAM)树脂、4-氧甲基-苯基乙酰胺基甲基树脂(4-oxymethyl phenylacetamidomethyl resin)、和氯甲基化聚苯乙烯树脂(chloromethyl polystyrene resin)。

在本发明的另一方面，提供了一种包含以由两个G-CSF-Fc复合物制得的纯化的G-CSF二聚体作为活性成分的药物组合物，其中，每个G-CSF-Fc复合物包含一段选自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的G-CSF二聚体的纯度为90-100％；在另一优选例中，所述的G-CSF二聚体的纯度为95-100％；在另一优选例中，所述的G-CSF二聚体的纯度为99-100％。

在该特定方面的一个优选例中，提供了一种治疗神经系统疾病(neurologicaldisorder)的方法，包括：给需要治疗的对象施用有效量的前述的药物组合物。在另一优选例中，所述的有效量为0.001-1000mg二聚体每剂。在另一优选例中，所述的疾病选自下组：中风、脊柱损伤、以及伴随着血脑屏障损伤的神经系统疾病。

在该特定方面的另一优选例中，提供了一种激活神经细胞中STAT3的方法，包括：给需要治疗的对象施用有效量的前述的药物组合物。在另一优选例中，所述的有效量为0.001-1000mg聚体每剂。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的包含如SEQ ID NO:2-7任一所示的氨基酸序列的多肽。在一个实施例中，提供了一种以包含如SEQ ID NO:2-7任一所示的氨基酸序列的纯化的多肽作为活性成分的药物组合物。在一个优选例中，所述多肽的纯度为90-100％；在另一优选例中，所述多肽的纯度为95-100％；在另一优选例中，所述多肽的纯度为99-100％。

在该特定方面的一个优选例中，提供了一种治疗神经系统疾病的方法，包括：给需要治疗的对象施用有效量的前述的药物组合物。在另一优选例中，所述的疾病选自下组：中风、脊柱损伤、以及伴随着血脑屏障损伤的神经系统疾病。

在该特定方面的另一优选例中，提供了一种激活神经细胞STAT3的方法，包括：给需要治疗的对象施用有效量的前述的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供了本发明所述人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)二聚体或本发明分离的多肽在制备治疗神经系统疾病药物中的用途。

在在该特定方面的另一优选例中，所述的疾病选自下组：中风、脊柱损伤、以及伴随着血脑屏障损伤的神经系统疾病。

在本发明的另一方面，提供了人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)二聚体或本发明的分离的多肽在制备用于刺激神经细胞STAT3的组合物中的用途。

在本发明的另一方面，提供了一种制备G-CSF二聚体的方法，所述方法包括步骤：

a)用表达载体转化哺乳动物细胞，所述的表达载体包含一段编码G-CSF-Fc复合物的DNA序列，所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:9-10；

b)在适于表达G-CSF-Fc复合物和G-CSF二聚体的条件下，培养所述转化的哺乳动物细胞；和

分离和纯化步骤(b)得到的G-CSF二聚体；

其中，所述的G-CSF二聚体包含两个G-CSF-Fc复合物，其中，每个G-CSF-Fc复合物包含选自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种生产分离的多肽的方法，所述方法包括步骤：

a)用表达载体转化哺乳动物细胞，所述的表达载体包含一段编码所述多肽的DNA序列，所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:9-10；

b)在适于表达所述多肽的条件下，培养转化的哺乳动物细胞；和分离和纯化步骤(b)得到的多肽；

其中，所述的多肽包含选自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。

附图说明

图1显示了本发明的一个实施例中的序列如SEQ ID NO:1所示的一个G-CSF二聚体的结构。图中，“-”表示接头，标记为“G-CSF”椭圆形表示G-CSF单体。

在该实施例中，所述的G-CSF二聚体通过接头(氨基酸残基175-190位)将一个G-CSF单体(氨基酸残基1-174位)连接于另一个G-CSF单体(氨基酸残基191-364位)。

图2a和图2b显示了本发明的一个实施例中的G-CSF二聚体的结构。图中，“-”表示接头，标记为“G-CSF”的椭圆形表示G-CSF单体，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且所述的G-CSF单体位于载体蛋白的N-末端，标记为“Fc”的椭圆形表示人IgG2的Fc片段。

图3a和图3b显示了本发明的一个实施例中的具有氨基酸G-CSF二聚体的结构。图中，“-”表示连接，标记为“G-CSF”的椭圆形表示G-CSF单体，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，其中，所述的G-CSF单体位于载体蛋白的C-末端。标记为“Fc”的椭圆形表示人IgG2的Fc片段。

图4、6显示了本发明的一个实施例中的G-CSF二聚体在局灶性脑缺血动物模型(Focal cerebral ischemia)中的临床效果。

图5显示了本发明的一个实施例中的G-CSF二聚体在体外能够激活STAT3的效力。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，发明人成功创造了一种本发明所述的新G-CSF二聚体。所述的新G-CSF二聚体能够延长体内半衰期、改善药物的动力学性能、减少给药频率、增强体内药物活性以及促进神经功能的恢复。与等G-CSF摩尔比例的G-CSF单体相比，所述的G-CSF二聚体还显示了显著的STAT3激活能力，从而改善了药物的生物活性，提高了神经损伤的治疗效果。前述特征将在如下实施例中进一步描述。

G-CSF二聚体

本发明第一个实施例为如式(I)所示的G-CSF二聚体，其结构如图1-3所示。载体蛋白包括人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段，和人白蛋白。

在一个优选例中，G-CSF可以位于载体蛋白的C-末端或N-末端(如图2-3所示)。

如本文以及权利要求所用，术语“接头(linker)”指能将两个单体多肽连接在一起的分子，从而使产生的化合物保持生物活性或较单体多肽具有提高的生物活性。

在一个优选例中，“接头(linker)”指有机接头或由肽键连接的氨基酸序列，或指由肽键连合或连接的两个氨基酸；或指不是由常态肽键连合的两个氨基酸序列或多肽域。接头序列由一段多核苷酸读码框编码，所述的多核苷酸通过接头连接，介于编码两个多肽域的序列之间。

在另一个优选例中，“接头”还指位于两个G-CSF单体之间的、起连接作用的短肽。接头的长度没有特别限制。一段接头的长度通常为5-50个氨基酸残基，通常，一段接头不影响或不显著影响两个G-CSF单体形成正确的折叠和构象。

一些接头的例子包括：有机接头、包含3-50个氨基酸的短肽、和前述式(II)所示的多肽。

在一个优选例中，所述的有机接头可为氧甲基苯基乙酰胺基甲基(oxymethylphenylacetamidomethyl)(PAM)树脂、4-氧甲基-苯基乙酰胺基甲基树脂(4-oxymethyl phenylacetamidomethyl resin)、氯甲基化聚苯乙烯树脂(chloromethyl polystyrene resin)、或其组合，并具有足够小的空间位阻，以不影响或不显著影响两个G-CSF单体形成的正确的折叠和构象。

在另一优选例中，所述的接头包含具有相对较小结构的氨基酸，不影响或不显著影响两个G-CSF单体形成的正确的折叠和构象，例如甘氨酸(glysine)、丙氨酸、脯氨酸等。

在另一优选例中，所述的接头包含选自下组的氨基酸序列：

(a)疏水性氨基酸甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)构成的3-15个氨基酸残基的氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro；

(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常包含5-20个氨基酸残基；在一个优选例中，该序列包含10-20个氨基酸残基；

(c)来自于G-CSF单体之外的蛋白的氨基酸序列，例如IgG或白蛋白的氨基酸序列；

(d)包含上述(a)、(b)和(c)的任意组合的氨基酸序列。

在一个优选例中，所述的接头的序列是GSGGGSGGGGSGGGGS(例如SEQID NO:1中第175-190位氨基酸残基)。在另一优选例中，所述的接头具有ASTKGP(例如SEQ ID NO:4中的第175-180位氨基酸残基)的序列。

在另一优选例中，可在G-CSF二聚体的N端或C末端添加其他不影响G-CSF单体生物学活性的氨基酸序列。在一个优选例中，这些添加的氨基酸序列对表达(如信号肽)、纯化(如6×His序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点)有利，或提高G-CSF二聚体的生物活性。

序列表

SEQ ID NO:1表示如图1所示的G-CSF二聚体，包含通过接头(第175-190位氨基酸残基)，将一个G-CSF单体(第1-174位氨基酸残基)连接于另一个G-CSF单体(第191-364位氨基酸残基)。

SEQ ID NO:2表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图2a和图2b所示，其包含一个G-CSF单体(第1-174位氨基酸残基)，一个人IgG2的Fc片段(第191-418位氨基酸残基)，以及连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽(第175-190位氨基酸残基)。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过所述Fc片段的配对构成所述的二聚体。在一个实施例中，所述的Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫键配对；在另一个实施例中，所述的二硫键的数量为2或4。

SEQ ID NO:3表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图3a和图3b所示，其包含一个G-CSF单体(第245-418位氨基酸残基)，人IgG2的Fc片段(第1-228位氨基酸残基)，以及连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽(第229-244位氨基酸残基)。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一实施例中，所述的二硫键的数量为2或4。

SEQ ID NO:4表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图2a和图2b所示，其包含一G-CSF单体(第1-174位氨基酸残基)，人IgG2的Fc片段(第181-403位氨基酸残基)，连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽(第175-180位氨基酸残基)。与SEQ ID NO:2相比，SEQ ID NO:4连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽较短(少于10个氨基酸)。而且，SEQ ID NO:5删除了短序列ERKCC，因此除去了两个二硫键，从而减少了铰链的错配。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一个实施例中，所述的二硫键的数量为2或4。

SEQ ID NO:5表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图3a和图3b所示，其包含一个G-CSF单体(第230-403位氨基酸残基)，人IgG2的Fc片段(第1-223位氨基酸残基)，连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽(第224-229位氨基酸残基)。与SEQ ID NO:3相比，SEQ ID NO:5连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽较短(少于10个氨基酸残基)。而且，SEQ ID NO:5删除了短序列ERKCC，因此除去了两个二硫键，从而减少了铰链的错配。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一个实施例中，所述的二硫键的数量为2或4。

SEQ ID NO:6表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图2a和图2b所示，其包含一个G-CSF单体(第1-174位氨基酸残基)，人IgG2的Fc片段(第191-413位氨基酸残基)，连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽(第175-190位氨基酸残基)。与SEQ ID NO:2相比，SEQ ID NO:6删除了短序列ERKCC，因此除去了两个二硫键，从而减少了铰链的错配。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一个实施例中，所述的二硫键的数量为2或4。

SEQ ID NO:7表示构成G-CSF二聚体的G-CSF-Fc复合物，如图3a和图3b所示，其包含一个G-CSF单体(第240-413位氨基酸残基)，人IgG2的Fc片段(第1-223位氨基酸残基)，连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽(第224-239位氨基酸残基)。与SEQ ID NO:3相比，SEQ ID NO:7删除了短序列ERKCC，因此除去了两个二硫键，从而减少了铰链的错配。二个G-CSF-Fc复合物带有Fc片段，通过Fc片段的配对构成二聚体。在一个实施例中，所述Fc片段通过所述的Fc片段的多个二硫健配对；在另一个实施例中，所述的二硫键的数量为2或4。

SEQ ID NO:8表示G-CSF单体分子。

SEQ ID NO:9表示SEQ ID NO:2的DNA序列。

SEQ ID NO:10表示SEQ ID NO:6的DNA序列。

制备方法

编码本发明G-CSF二聚体或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。或者，也可用PCR扩增或合成获得第一G-CSF单体和/或第二G-CSF单体的DNA编码序列，然后将其连接在一起，形成本发明G-CSF二聚体或融合蛋白的DNA编码序列。

为了提高宿主细胞的表达量，可以对G-CSF二聚体编码序列进行改造。例如可以采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于转录及翻译的序列。在一个优选例中，可以采用酵母细胞或哺乳动物细胞偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对DNA二聚体基因进行检测，以排除不利于转录及翻译的序列。在一个优选例中，所述被排除的基因可为内含子切割位点，转录终止序列等。

在获得了本发明新融合蛋白的DNA编码序列之后，首先将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养、纯化转化的宿主细胞，得到本发明的新的融合蛋白。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6的DNA序列分别显示在SEQID NO:9和10中。

如本文以及权利要求中所用，“载体”指质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连接于表达调控序列，从而形成蛋白-表达载体。

如本文和权利要求所用，“可操作地连接于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果使用信号DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号DNA(分泌前导序列)就是“可操作地连接于”所述的多肽。如果一个启动子控制序列的转录，那么它是“可操作地连接于”所述的编码序列。如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么所述的核糖体结合位点是“可操作地连接于”编码序列。一般，“可操作地连接于”意味着重要残基相邻近；而对于分泌前导序列，则“可操作地连接于”意味着在阅读框中相邻。

如本文和权利要求所用，“宿主细胞”是指原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(B.subtilis)等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。在一个优选例中，使用的宿主细胞是真核细胞；在另一优选例中，使用的宿主细胞是哺乳动物细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。

如本文和权利要求所用，“神经系统疾病或神经性疾病”是指中风、脊柱损伤、和伴有血脑屏障损伤的神经系统疾病。

药物组合物和施用方法

由于本发明G-CSF二聚体具有优异的血清半衰期，因此G-CSF二聚体以及含有G-CSF二聚体为主要活性成分的药物组合物可用于治疗神经损伤相关的疾病，并保护神经元。在一个优选例中，所述的神经损伤相关的疾病选自下组：中风、脊柱损伤、和伴有血脑屏障损伤的神经系统疾病。

本发明的药物组合物包含安全和有效量的所述G-CSF二聚体及药理上可以接受的赋形剂或载体。“安全和有效量”是指：化合物的量足以明显改善所需要的病人的病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.001-1000mg的G-CSF二聚体/剂；在一个优选例中，药物组合物含有0.05-300mg的G-CSF二聚体/剂；在另一优选例中，药物组合物含有0.5-200mg的G-CSF二聚体/剂。

本发明的化合物及其药学上可接受的盐可制成不同的制剂，包含安全和有效量的所述G-CSF二聚体或其药学上可接受的盐以及药学上可以接受的赋形剂或载体。“安全和有效量”是指：化合物的量足以显著改善所需要的病人的病情，而不至于产生严重的副作用。化合物的安全和有效量根据治疗病人的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。

“药学上可以接受的赋形剂或载体”是指：一种或多种不同种类的相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”是指：组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。一些药学上可以接受的赋形剂或载体例子有：纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

施用本发明G-CSF二聚体包括：口服给药、直肠施用、肠胃外(静脉内、肌肉内、或皮下)给药、以及局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括：胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠、磷酸二钙，或与下述成分的任一种混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓冲剂，例如，石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂、和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。这些材料包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分如：聚合物质和蜡类物质。如果需要，活性化合物也可与以上描述的赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆、或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、和油，特别是棉籽油、花生油、蓖麻油、橄榄油、玉米胚油、芝麻油、或其混合物。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含添加剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂、和香料。

除了活性化合物外，悬浮液还可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝、琼脂、或其混合物。

用于肠胃外给药的组合物也可包含生理学上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液、或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水或无水载体、稀释剂、溶剂、或赋形剂包括水、乙醇、多元醇、及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明G-CSF二聚体的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂、和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理学上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明G-CSF二聚体可以单独给药，或者与任何药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全和有效量的本发明的G-CSF二聚体施用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上可接受的有效给药剂量。对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01-300mg；在一个优选例中，给药剂量为0.5-100mg。在决定实际剂量时，还应考虑本领域的已知因素，如给药途径、病人健康状况等。

本发明的G-CSF二聚体具有许多优点，包括(但不限于)：

1.更长的体内生物半衰期。

2.在神经细胞中更强的激活STAT3的生物活性。

3.在缺血性动物模型中，单次或两次注射，具有显著的临床效果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。尽管所述阐述涉及具体实施例，本领域技术人员应理解本发明可通过这些实施例的变体实现。因此，这些实施例不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

本发明的G-CSF二聚体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由具有如SEQ ID NO:2-7所示氨基酸序列的G-CSF-Fc复合物构成，结构如图1-3，用常规方法制备和纯化。实施例1-3描述了具体的实施方法。

实施例1 构建表达rh-G-CSF二聚体的哺乳动物载体

合成包含人G-CSF、接头肽、和人免疫球蛋白(IgG2)Fc片段的全长DNA序列。在5’端，引入包含限制性内切酶HindIII位点、Kozak序列、和信号肽的序列，在3’端，引入包含EcoRI位点的序列。G-CSF二聚体全长DNA序列被克隆至pUC19，得到pG-CSF-Fc。质粒在E.coli TG1中扩增，并用HindIII和EcoRI消化，亚克隆至pcDNA3(英杰公司)载体，得到表达载体pEX-G-CSF-Fc。pEX-G-CSF-Fc经线性化、通过电穿孔转染入CHO细胞。在选择性培养基中筛选转染的细胞并克隆。ELISA法检测个体克隆的蛋白水平。G-CSF-Fc二聚体表达水平最高的克隆被冻存、建立细胞库，并用于生成重组蛋白。

举例说明，上述的包含人G-CSF、接头肽、和人免疫球蛋白(IgG2)Fc片段的全长DNA序列具有SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸序列。同样的，根据上面描述的步骤，获得的表达载体pEX-G-CSF-Fc包含SEQ ID NO:2-7中相应的氨基酸序列，pEX-G-CSF-Fc经线性化、通过电穿孔转染入CHO细胞。在选择性培养基中筛选被转染的细胞，G-CSF-Fc单体和G-CSF-Fc二聚体的混合物被表达于所述培养基中，用ELISA法检测个体克隆的蛋白水平。首选表达有G-CSF-Fc二聚体的克隆，那些G-CSF-Fc二聚体表达水平最高的克隆被冻存、建立细胞库、并用于生成重组蛋白。

实施例2 在哺乳动物细胞中生产G-CSF二聚体

从所述细胞库中解冻一瓶细胞(约1×10⁷细胞/mL)，、并接种于10cm有盖培养皿中的10mL基础培养基中，37°C，5%CO₂培养大约24小时。

种子扩增：培养物在摇瓶中连续扩增体积3-4倍(例如10mL到30-40mL)，当细胞密度达到1.0-1.5×10⁶细胞/mL、且成活率≥90%时，培养物体积达到300-400mL。摇瓶以120rpm，37°C、5%CO₂培养。

生物反应器(3L-10L)培养物扩增的阶段一：当种子扩增至细胞密度达1.0-3.0×10⁶细胞/mL、300-400mL、且成活率≥90%时，种子扩增培养物被无菌转移至含有基础培养基的3-10L生物反应器，培养控制条件为37°C，pH 6.8，约50%溶解氧，搅拌速率65-100rpm。

生物反应器(30L-100L)培养物扩增的阶段二：当3.0-10L生物反应器中的细胞密度达到1.0-3.0×10⁶细胞/mL、且成活率≥90%时，培养物被无菌转移至含有基础培养基的30-100L生物反应器中，培养条件为37°C，pH 6.8，约50%溶解氧，搅拌速率65-100rpm。在收获之前添加补料培养基，培养12-48小时控制葡萄糖水平于1g/L或低于1g/L。

实施例3 重组人G-CSF二聚体蛋白的纯化

由于G-CSF聚体蛋白含有能结合Protein A的人Fc片段，采用亲和层析纯化G-CSF二聚体蛋白。从生物反应器中收集的上清含有G-CSF-Fc多聚体(或集合物)、二聚体、以及G-CSF-Fc复合物和代谢物。从生物反应器培养物中收获后，通过过滤获得细胞培养物的上清，室温下采用一系列的层析柱逐步纯化，获得纯化的重组产物。例如，采用典型的重组蛋白A琼脂糖凝胶FF(通用医疗集团，货号：17-1279-04)柱和含有50mM柠檬酸/柠檬酸钠、0.2M NaCl的洗脱液(pH3.7-3.8)，得到经反相HPLC分析纯度为>90%的纯G-CSF二聚体蛋白。额外的层析步骤包括采用Capto Adhere层析柱和含有50mM NaAc/HAC、0.2M NaCl的洗脱液(pH 4.5-5.0)，然后采用SP Sepharose FF(通用医疗集团，货号：17-0729-04)，上样缓冲液为50mM NaAC/HAC(pH4.5-5.0)，平衡缓冲液为10mM PB(pH6.0±0.1)。使用的洗脱缓冲液为10mM PB和0.2M NaCl(pH 7.2±0.1)，流速为10-200cm/hr并取决于柱子的大小。额外的工艺涉及低pH条件下病毒的活化、过滤、和透析平衡。

G-CSF二聚体蛋白的纯度>95%(采用反相HPLC检测)，估计分子量为47±5Kd(采用还原型SDS-PAGE分析)。G-CSF二聚体蛋白用寡糖进行糖基化，寡糖占总分子量的2-10%。该蛋白的等电点在pH5.8-pH6.8之间，最大UV吸收波长在280nm。

G-CSF二聚体融合蛋白表现出以下体外生物学活性，包括：剂量依赖性地刺激增殖和激活M-NSF-60细胞系中的STAT3。M-NSF-60细胞系中STAT3激活和增殖的ED50介于0.1-10ng/mL。G-CSF二聚体刺激M-NFS-60细胞的增殖可被抗人G-CSF抗体中和。此外，G-CSF二聚体蛋白能激活原代神经元细胞的STAT3。G-CSF二聚体融合蛋白表现出以下体内生物学活性，包括：迅速提高白细胞(WBC)数、正常或嗜中性粒细胞减少症的动物(包括小鼠、大鼠和猴子)的嗜中性粒细胞数。G-CSF二聚体蛋白还可以在体外激活原代神经元的STAT3，并且降低急性缺血性中风大鼠模型的脑梗死面积。

实施例4 G-CSF二聚体的体内半衰期

大鼠皮下单次注射100μg/kg本发明的G-CSF二聚体，其由两个G-CSF-Fc复合物(SEQ ID NO:3)构成，计算药代动力学参数，列于表1。

表1

由表1可知，G-CSF二聚体在大鼠体内的半衰期约7.7小时，而G-CSF单体在大鼠体内的半衰期约2小时。

实施例5 G-CSF二聚体在人体内的药代动力学性能

健康男性受试者接受递增剂量的单次皮下注射：30、60、120、240μg/kg的G-CSF二聚体(G-CSF-D；两个G-CSF-Fc复合物(SEQ ID NO:6)组成)。一共招募了24位健康的男性受试者，分为4个连续的单剂量G-CSF-D组(30、60、120、240μg/kg)。

给药前和给药后的0.5、1、2、4、8、16、24、36、48、72、96小时，第6(120小时)、7、9、11、13和15天，收集血液样本。分离血清并低于-70°C保存。用酶联免疫分析法(ELISA，Quantikine人G-CSF ELISA试剂盒，安迪生物公司(R&D Systerm)，明尼阿波利斯市，明尼苏达州，货号：PDCS50)检测G-CSF-D的血清浓度。

采用标准的非房室分析程序(WinNonlin v 5.2，Pharsight公司，美国)计算药代动力学参数。收集样本的真实时间用于药代动力学参数的计算中。C_max(采样时间内的观察到的最大血药浓度)和T_max(C_max出现的时间)从数据中直接提取。消除速率常数Kel(hr^-1)由至少3个点的线性回归计算。血药浓度时间曲线下的面积(AUC)采用线性梯形规则计算，其中，AUC_last为0点至最后浓度点(lastconcentration point)的AUC。AUC_(0-inf)为AUC_last+最后浓度点/Kel。如果可能，半衰期(t_1/2)根据t_1/2=0.693/Kel计算。表观清除率(CL)根据剂量/AUC_(0-inf)计算。

表2所示结果表明，G-CSF二聚体人体内的t_1/2介于43.9和62.8小时，而G-CSF单体的半衰期约为3.5小时。因此，G-CSF二聚体具有显著提高的药代动力学特性(至少提高12倍)。

表2

平均值(SD)

实施例6 G-CSF二聚体对信号转导及转录活化因子3(STAT3)的激活作用

血脑屏障受伤或受损的小鼠可用于显示G-CSF二聚体所提高的激活pSTAT3的生物活性。首先，受试小鼠可以被分成不同组：对照组接受对照物，G-CSF组接受G-CSF单体，G-CSF二聚体组接受G-CSF二聚体。该研究中所使用的G-CSF二聚体可以包含两个G-CSF-Fc复合物，并且该G-CSF-Fc复合物的氨基酸序列可选自SEQ ID NO:2-7中的任一序列。可以确定分别注射于G-CSF组、G-CSF二聚体组的G-CSF、G-CSF二聚体的量，以使得两组几乎接受等摩尔的G-CSF。试验结束时，小鼠可以被处死，取脑组织并裂解。用常规手段如ELISA试剂盒可以检测磷酸化的STAT3(pSTAT3)。

分析执行上述操作所获得的数据，显示G-CSF二聚体组具有比G-CSF单体组更强的激活STAT3的生物活性。

实施例7 体外G-CSF二聚体在原代神经元中对STAT3的激活作用

取孕17天雌性SD大鼠的胎鼠大脑。将完整的胎鼠大脑放入置于冰上的D-Hanks液中。在解剖显微镜下取大脑皮层，剪碎成约1mm³大小。切碎的大脑皮层置于10mL 0.125%胰酶中消化，37℃，15min。用移液器吹打数次，将上清转移到含10%FBS的DMEM中以终止胰酶消化。细胞被离心下来并在12孔板中重悬于无血清神经元培养物基础培养基(英杰公司，货号：21103049)和B27(英杰公司，货号：17504044)，细胞数为5×10⁵/孔，37°C，5%CO₂孵育8天。每2天换一次培养基。

原代神经元细胞培养第八天后，分别用对照溶剂、G-CSF、或G-CSF二聚体(G-CSF二聚体由两个G-CSF-Fc复合物(SEQ ID NO:6)组成，G-CSF摩尔浓度相同)处理15分钟。接着细胞用PBS洗涤两次，用含20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM Na₂EDTA、1mM EGTA、1%Triton、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸盐、1mM Na₃VO₄、1μg/ml亮抑酶肽、1mM PMSF(英杰公司，货号：9803)的裂解缓冲液裂解。裂解液中的蛋白浓度用Bradford蛋白分析法进行测定，细胞裂解液中pSTAT3的含量用STAT3ELISA试剂盒(英杰公司，货号：KH00481)检测。

结果如图5所示，G-CSF和G-CSF二聚体(图5中表示为G-CSF-D)均能够在原代大鼠神经元中激活pSTAT3，与对照培养物相比，显著提高了pSTAT3的含量。在相同摩尔数的G-CSF下，G-CSF二聚体激活的pSTAT3是G-CSF单体激活的至少2倍。因而，G-CSF二聚体具有比G-CSF单体更强的STAT3激活的生物活性。

实施例8 G-CSF二聚体在局灶性脑缺血动物模型中的临床效果

大脑中动脉，MCA是人类的易卒部位。大脑中动脉闭塞(MCAO)模型被普遍认为是用于学习局灶性脑缺血的标准动物模型，主要方法之一为：大脑中动脉线栓法(thread occlusion of the middle cerebral artery)。

在本研究中使用雄性SD大鼠(250-300g)。经腹腔注射戊巴比妥钠(50-60mg/kg的剂量)麻醉后，将大鼠仰卧位固定。切开右侧颈部皮肤，钝性分离胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌，显露右侧颈总动脉(CCA)及迷走神经。结扎CCA、颈外动脉(exterial cerebral artery，ECA)及其分支动脉。分离颈内动脉(interial cerebralartery，ICA)，至鼓泡(tympanic bulla)处可见其颅外分支翼腭动脉，于根部结扎该分支。在ICA近端备线、远端放置动脉夹。在ECA结扎点(距颈内、颈外动脉分叉5mm处)剪一小口，将一直径为0.22-0.249mm的尼龙线经ECA上剪口插入。插入前加热处理使插入端变钝，并做好进入线长度标记。扎紧备线，松开动脉夹，将尼龙线经ECA、ICA分叉处送入ICA。向前进入17-19mm到达大脑前动脉的起始部。堵塞MCA开口，造成脑组织局部缺血。

大鼠被分成3组，每组8只。在局部缺血后30分钟皮下注射G-CSF二聚体(由两个G-CSF-Fc(SEQ ID NO:3)构成)100μg/kg。造模后72小时，再注射一次G-CSF二聚体。G-CSF组的大鼠，每天皮下注射重组人G-CSF 16μg/kg/天，连续注射5天。试验结束时，两组动物注射了等同摩尔数剂量的G-CSF。溶剂对照组的大鼠注射相同剂量的PBS。缺血90分钟后，各组缓慢取出尼龙线。

由图4的结果可知，在等同摩尔剂量下，G-CSF单体虽然有一定程度的临床效果，但是G-CSF组和溶剂对照组无统计学差异。另一方面，注射等同摩尔剂量下，G-CSF显示出显著的临床效果。

实施例9 G-CSF二聚体在大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型中的效果

SD大鼠(雄性，体重250-300g)被用于本研究。动物被分为五组：模型组(MCAO模型，n=12)；G-CSF二聚体(G-CSF-D，由两个G-CSF-Fc复合物(SEQ IDNO:6)构成)(MCAO+G-CSF-D 30μg/kg，n=12)，G-CSF-D(MCAO+rhG-CSFD 100μg/kg，n=12)，G-CSF(MCAO+40μg/kg，n=12)，假手术组(外科手术模型，n=12)。在血液再灌后0.5小时、48小时皮下注射G-CSF-D。在血液再灌后0.5、12、24和48小时皮下注射G-CSF。在麻醉状态下，通过颈部正中进行开口，分别暴露出右侧颈总动脉(CCA)，颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。一根商用单丝(硅包被)作为栓线(occluder)，通过颈外动脉插入。栓线超过颈动脉分叉点(the carotid bifurcation)到达颈内动脉18±0.5mm深处。轻微的阻力表明栓线已经恰当地插入到大脑前动脉，并且阻塞了流向大脑中动脉(MCA)的血液。60分钟以后，通过拔出栓线约10mm进行再灌。在整个手术过程中用头板(heading pad)维持大鼠体温在36.5°C。

手术后72小时，大鼠进行再麻醉和断头。移除大脑，并且对大脑进行冠状切片，切为6片，每片厚度2-mm。将大脑切片在37°C下置于2%氯化三苯基四氮唑溶液(TTC)溶液中孵育30分钟，将其浸入到10%缓冲的福尔马林溶液中固定。对切片进行拍照，未染色的区域被定义为损伤体积。损伤体积采用Image-ProPlus 5.1.进行检测。

结果如图6的所示，在G-CSF等摩尔剂量的情况下，两次给予G-CSF二聚体组的梗塞面积仅为接受G-CSF单体四次给药组的54%。在大鼠中风模型中，G-CSF二聚体显示出比G-CSF单体组更优异的治疗效果。

本文完整说明了本发明的实施例。尽管所述说明涉及具体实施例，本领域技术人员应理解本发明可通过这些实施例的变体实现。因此，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

Claims

1.一种式I所示的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)二聚体，

(I)M1-L-M2

式中，

M1是G-CSF的第一单体；

M2是G-CSF的第二单体；和

L是位于所述的第一单体和第二单体之间、将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头；

其中，所述的G-CSF二聚体保持了G-CSF的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。

2.如权利要求1所述的二聚体，其特征在于，所述的L选自下组：

a)有机接头；

b)包含3-50个氨基酸的短肽；和

c)式(II)所示的多肽：

(II)-Z-Y-Z-

其中，

Y为载体蛋白；和

Z为包含0-30个氨基酸的短肽。

3.如权利要求2所述的二聚体，其特征在于，所述的有机接头选自下组：氧甲基苯基乙酰胺基甲基(PAM)树脂、4-氧甲基-苯基乙酰胺基甲基树脂、和氯甲基化聚苯乙烯树脂。

4.如权利要求1所述的二聚体，其特征在于，所述的第一单体和第二单体是相同的。

5.如权利要求1所述的二聚体，其特征在于，所述的生物活性包括：

(a)作用于嗜中性粒细胞和干细胞，从而驱动嗜中性粒细胞的分化、生长、和成熟；和

(b)激活成熟的嗜中性细胞，参与免疫反应。

6.如权利要求2所述的二聚体，其特征在于，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。

7.如权利要求2所述的二聚体，其特征在于，所述的“-”为肽健。

8.如权利要求1所述的二聚体，其特征在于，所述的二聚体由两个G-CSF-Fc复合物制得，每个G-CSF-Fc复合物包含一段选自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。

9.一种药物组合物，其特征在于，权利要求8所述的纯化的二聚体作为活性成分。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的二聚体的纯度为90-100％。

11.如权利要求8所述的二聚体，其特征在于，每一个所述的G-CSF-Fc复合物包含一个G-CSF单体、一个人IG2的Fc片段、以及连接所述G-CSF单体和所述Fc片段的肽；所述二聚体通过两个所述Fc片段的多个二硫健配对形成。

12.如权利要求11述的二聚体，其特征在于，所述二硫键的数量为2或4。

13.一种包含第一和第二多肽的融合蛋白，其特征在于，

a)所述的第一多肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

b)所述的第二多肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；和

c)所述的第一多肽与所述第二多肽无空间位阻连接。

14.如权利要求13述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一多肽和第二多肽为G-CSF单体。

15.如权利要求13述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一多肽和第二多肽之间的无位阻连接通过接头实现，所述接头选自下组：

a)具有足够小空间位阻的有机接头，不影响或不显著影响由第一单体和第二单体形成的正确的折叠和构象；

b)包含3-50个氨基酸的短肽；

c)式II所示的多肽：

(II)-Z-Y-Z-

式中，

Y为载体蛋白；和

Z为包含0-30个氨基酸的短肽。

16.如权利要求15述的融合蛋白，其特征在于，所述的有机接头选自下组：氧甲基苯基乙酰胺基甲基(PAM)树脂、4-氧甲基-苯基乙酰胺基甲基树脂、和氯甲基化聚苯乙烯树脂。

17.一种包含SEQ ID NO:2-7所示氨基酸序列的分离的多肽。

18.一种药物组合物，其特征在于，权利要求17所述的分离的多肽作为活性成分。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的多肽的纯度为90-100％。

20.一种治疗神经系统疾病的方法，其特征在于，包括：给需要治疗的对象施用有效量的权利要求9或权利要求18所述的药物组合物。

21.一种权利要求1所述的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)二聚体或权利要求17所述的分离的多肽在制备用于治疗神经系统疾病药物中的用途。

22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述的疾病选自下组：中风、脊柱损伤、以及伴随血脑屏障损伤的神经系统疾病。

23.一种权利要求1所述的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)二聚体或权利要求17所述分离的多肽在制备激活神经元细胞中的STAT3的药物中的用途。

24.一种生产权利要求1所述二聚体的方法，其特征在于，包括步骤：

a)用表达载体转化哺乳动物细胞，所述的表达载体包含一段编码G-CSF-Fc复合物的DNA序列，所述核酸序列选自SEQ ID NO:9-10；

b)在足以表达所述G-CSF-Fc复合物和所述二聚体的条件下，培养转化的哺乳动物细胞；和

c)分离和纯化步骤(b)得到的所述二聚体；

其中，所述的二聚体包含两个所述的G-CSF-Fc复合物，每一个所述的G-CSF-Fc复合物包含一段选自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。

25.一种生产权利要求17所述的分离的多肽的方法，其特征在于，包括步骤：

a)用表达载体转化哺乳动物细胞，所述的表达载体包含一段编码所述多肽的DNA序列，所述核酸序列选自SEQ ID NO:9-10；

b)在足以表达所述多肽的条件下，培养所述转化的哺乳动物细胞；和

c)分离和纯化步骤(b)得到的多肽；

其中，所述的多肽包含选自SEQ ID NO:2-7的氨基酸序列。