CN102985553A - 沉默调节蛋白活化剂和活化测定 - Google Patents

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Abstract

本发明提供检测在体外激活沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物活性的化合物的方法和组合物。还提供式(I)至式(XXI)的沉默调节蛋白调节化合物以及相关化合物(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)，包括式(XL)、(XI)、(XII)和(XIII)的不含荧光基团的底物SIRT1活化剂化合物。

Description

沉默调节蛋白活化剂和活化测定
发明背景
基因的沉默信息调节剂(Silent Information Regulator，SIR)家族代表存在于范围从古细菌(archaebacteria)至真核生物的生物体的基因组中的高度保守性一组基因。编码的SIR蛋白质涉及从基因沉默的调节至DNA修复的各种不同程序。由SIR基因家族成员编码的蛋白质显示：在250氨基酸核心结构域中有高度序列保守。此家族中已相当特征化的基因为酿酒酵母SIR2(S.cerevisiae SIR2)，其涉及含有指定酵母交配型、端粒位置效应及细胞老化的信息的沉默HM基因座。酵母Sir2蛋白质属于组蛋白脱乙酰基酶的家族。于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中的Sir2同系物，CobB，起到NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)-依赖性ADP-核糖基转移酶的作用。
Sir2蛋白为使用NAD+作为协同底物的第III类脱乙酰基酶。不同于其它脱乙酰基酶，这些中的许多涉及基因沉默，Sir2对第I类及第II类组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，例如曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)不具敏感性。
通过Sir2进行的乙酰基-赖氨酸的脱乙酰基化，与NAD+水解作用紧密结合，产生烟酰胺与新的乙酰基-ADP核糖化合物。Sir2的NAD+-依赖性脱乙酰基酶活性对于将其生物学作用与酵母中的细胞代谢作用结合这一功能而言是必需的。哺乳动物Sir2同系物具有NAD+-依赖性组蛋白脱乙酰基酶活性。
生物化学的研究已显示，Sir2可容易地将组蛋白H3与H4的氨基末端尾部脱乙酰基化，导致形成1-O-乙酰基-ADP-核糖与烟酰胺。具有另外SIR2拷贝的菌株显示其rDNA沉默增加且寿命增长30%。最近已显示，秀丽隐杆线虫(C.elegans)SIR2同系物(sir-2.1)及果蝇(D.melanogaster)dSir2基因的另外拷贝会大大延长这些生物体的寿命。这暗示了，针对老化的SIR2-依赖性调节途径，其在演化早期已出现且已经是相当保守的(conserve)。现今，Sir2基因据相信已经演化以增强生物体的健康与抗应激反应，来增加其逆境存活(surviving adversity)的机会。
在人中有7种Sir2-类基因(SIRT1-SI RT7)，它们共享Sir2保守催化结构域。SIRT1为具有与Sir2最高程度序列相似性的核蛋白。SIRT1通过脱乙酰化作用调节多重细胞靶物，包括肿瘤抑制基因p53、细胞信号传导因子NF-kB和FOXO转录因子。
SIRT3为SIRT1的同系物，其在原核生物与真核生物中具保守性。SIRT3蛋白通过位于N-末端的独特结构域靶向至线粒体嵴(cristae)。SIRT3具有NAD+-依赖性蛋白质脱乙酰基酶活性，且被普遍地(upbiquitously)表达在，特别是在代谢活性的组织中。在转移至线粒体时，认为SIRT3被线粒体基质加工肽酶(MPP)裂解成更小的活性形式。
已知摄热量限制(caloric restriction)有70年以上，以增进健康并延长哺乳动物的寿命。酵母(如后生动物)的寿命也通过类似摄热量限制(例如低葡萄糖)的介入来增长。发现缺乏SIR2基因的酵母与蝇类在经摄热量限制时都不再存活，这为SIR2基因介导此类限制热量的饮食有益健康功效提供了证据。而且，降低酵母葡萄糖-响应性cAMP(腺苷3',5'-单磷酸)-依赖性(PKA)途径活性的突变，会延长野生型细胞的寿命，但在突变型sir2菌株中则不会延长，这证明SIR2可能是摄热量限制途径的关键下游组分。
另外，经过在小鼠中基因缺失或过度表达的研究(其中进行了SIRT1蛋白和活性水平的研究)已经验证了在几种疾病模型中升高的SIRT1活性的有益效果，所述疾病模型包括涉及代谢性应激的那些(Haigis,M.C.,和Sinclair,D.(2010)Annu Rev Pathol 5,253-259；Baur,J.A.(2010)Mech Aging Dev)。最近也在人中观察到该效果，其中在胰岛素-敏感的组织中降低的SIRT1表达与能量消耗的降低有关(Rutanen等，(2010)Diabetes)。因此，对于许多其中认为SIRT1起作用的疾病，预期治疗效果根据给药该酶的脱乙酰基酶活性的活化剂得到。在过去几年内，已经开发了SIRT1激活化合物(STAC)，包括白藜芦醇和更特异的，化学上不同的分子(Milne等，(2007)Nature 450,712-716；Bemis等，(2009)Bioorg Med Chem Lett 19,2350-2353；Vu等，(2009)J.Med.Chem.)。当在这些疾病的基于细胞的和动物模型中测试时，STAC产生与该酶的直接活化一致的效果(Milne等，(2007)Nature 450,712-716；Feige等，(2008)Cell Metab 8,347-358；Funk等，J Pharmacol Exp Ther；Jin等，(2009)Protein Sci 18,514-525；Liu等，(2008)Nature 456,269-273；Smith等，(2009)BMC Syst Biol 3,31；Yamazaki等，(2009)Am J Physiol Endocrinol Metab；Yoshizaki等，(2009)Mol Cell Biol 29,1363-1374)。
在分子水平，关于这些化合物加速SIRT1-催化的脱乙酰基化的机理仍需大量探索。一个感兴趣的方面为根据肽底物的结构特征的活化。
该SIRT1活化方面首先发现于2005，当时两篇文章报道白藜芦醇可以激活SIRT1-催化的Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC的脱乙酰基化，但不是该肽的简单酰胺或酸(见Howitz等，(2003)Nature 425,191-196；Borra等，(2005)J.Biol.Chem.280,17187-17195；Kaeberlein等，(2005)J.Biol.Chem.280,17038-17045)。最近，白藜芦醇的结果得以确证(Beher等，(2009)Chem BiolDrug Des)，而且被Pacholec等进一步扩展(Pacholec等，(2010)J.Biol.Chem.285，8340-8351)至包括三种之前报道的STAC：SRT1460、SRT1720和SRT2183，其最初被Milne等((2007)Nature 450，712-716)公开(见图1)。Pacholec等((2010)J.Biol.Chem.285，8340-8351)使用几种乙酰基化的肽底物研究了SIRT1的STAC-介导的活化，包括Milne等((2007)Nature 450，712-716)使用的TAMRA-标记的20mer (TAMRA-肽；该肽底物和其它肽底物的结构详见表3)，以及SIRT1的两种蛋白底物。该研究的主要观察为(i)TAMRA-标记物的存在对活化是必要的，因为用未修饰的肽或蛋白底物未观察到活化，(ii)SRT1460和SRT1720可以结合至TAMRA-肽上，以及(iii)SRT1460与SIRT1:TAMRA-肽复合物相互作用。这些观察使得该作者得出结论，通过STAC的SIRT1活化必须经过涉及活化剂与TAMRA-肽之间形成复合物的“间接”机理。尽管Pacholec等没有提出具体的机理假说，但SIRT1的活化假定来自该复合物的SIRT1-催化转化的有利动力学。该建议示于图2A中的原理图中，其被称为‘通过底物增强活化’。需要图2A的机理建议的彻底分析，以确定是否可以解释STAC-介导的SIRT1活化。
本发明提供了沉默调节蛋白激活化合物的作用机理的更好理解，其证明了通过底物增强活化的间接机理不足以解释通过STAC活化SIRT1。尤其是，虽然图2A的机理建议需要STAC的活化有效性与其底物亲和力之间存在联系，但是并不存在所述联系。另外，一些STAC显示出可以结合至游离的SIRT1。该结合并非受图2A的机理调节。最后，STAC活化SIRT1的数据集不能成功地符合图2A的机理的速率规律。总之，这些结果指出，通过底物增强活化的间接机理不足以解释通过STAC活化SIRT1。
因此，需要更好地理解沉默调节蛋白激活化合物的作用机理，以更好地理解沉默调节蛋白功能并对新的活化剂化合物开发增强的筛选。
概述
本发明部分地基于发现沉默调节蛋白底物结构的独特特征，其确定了SIRT1活化剂化合物(STAC)沉默调节蛋白酶活化的特征。尤其是，一些STAC可以加速TAMRA-肽类似物(其不含TAMRA荧光基团(即，desTAMRA-肽)但含有其它大基团(例如生物素))，以及含有一些未标记的肽(仅包括天然氨基酸(例如，Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Phe和Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp)，而不含其它肽(例如，Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Ala))的脱乙酰基化。因此，本发明提供不含荧光基团的肽、多肽和蛋白底物，其包括“活化辅因子”部分，例如吲哚(Trp)或苯基(Phe)，或携带活化辅因子的辅助蛋白，例如DBC1(乳腺癌缺失基因1(deleted in breast cancer 1))、HIC1(癌症过度甲基化基因1(hypermethylated in cancer 1))、AROS(SIRT1的活性调节剂)或CLOCK(Hirayma等，(2007)Nature 450:1086-90；Sassone-Corsi等，(2008)Cell 134，329-340)，以及提供使用这些底物检测激活沉默调节蛋白脱乙酰基酶(例如SIRT1)活性的化合物的有关方法。本发明还提供一些新的STAC化合物，其可激活不含荧光基团的活化底物。
另外，本发明提供新的SIRT1活化剂化合物、其盐，以及有关的药物组合物。
一方面，本发明提供检测在体外激活沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性的化合物的方法。所述方法包括将所述沉默调节蛋白脱乙酰基酶与候选化合物和不含荧光基团的活化底物(例如所述沉默调节蛋白的乙酰基化的肽、多肽或蛋白底物)接触的步骤，然后检测在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性的水平。然后将在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性的水平与不存在候选化合物时沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平进行比较。因此，与不存在候选化合物时沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平相比，在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平增加表示，所述化合物为沉默调节蛋白活化剂。在优选的实施方式中，所述不含荧光基团的乙酰基化的肽、多肽或蛋白在赖氨酸残基的ε氨基上被乙酰基化。
在一些优选的实施方式中，用于本发明的方法的沉默调节蛋白脱乙酰基酶为SIRT1。在其它实施方式中，所述沉默调节蛋白脱乙酰基酶为SIRT2、SIRT3、SIRT4或SIRT5。
在具体实施方式中，所述候选化合物为含有荧光基团的肽底物(例如，TAMRA-肽Ac-EEK(生物素)GQSTSSHSKAcNle-STEGK(5-TMR)EE-NH2)的SIRT1活化剂。
在优选的实施方式中，在NAD+的存在下将所述沉默调节蛋白脱乙酰基酶与不含荧光基团的活化底物和候选化合物接触。在其它实施方式中，在可水解的NAD+类似物的存在下将所述沉默调节蛋白脱乙酰基酶与不含荧光基团的活化底物和候选化合物接触。
在一些优选的实施方式中，通过测量不含荧光基团的活化底物脱乙酰基化的速率检测沉默调节蛋白脱乙酰基酶的活性水平。在其它实施方式中，通过测量NAD+水解速率检测沉默调节蛋白脱乙酰基酶的活性水平。
在其它实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物为生物素化的多肽。在优选的实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物为乙酰基化的肽或多肽，其不含荧光基团TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明)和AMC(7-氨基(amido)-4-甲基香豆素)。在具体实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物为乙酰基化的desTAMRA-肽Ac-EEK(生物素)GQSTSSHSKAcNleSTEGKEE-NH2。在其它实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物为乙酰基化的肽，其选自Ac-RHKKAcF-NH2和Ac-RHKKAcW-NH2。在其它实施方式中，用于上述的本发明方法的不含荧光基团的活化底物包括沉默调节蛋白的乙酰基化的肽、多肽或蛋白底物以及携带活化辅因子的辅助蛋白或配体。例如，所述携带活化辅因子的辅助蛋白可为DBC1(乳腺癌缺失基因1)蛋白、HIC1(癌症过度甲基化基因1)蛋白、AROS(SIRT1的活化调节剂)蛋白或CLOCK和/或BMAL蛋白。在具体实施方式中，所述乙酰基化的蛋白为组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、p53、p300、FOXO 1、FOXO 3a、FOXO 4、p65、HIVTat、PGC-1α、PCAF、MyoD、PPARγ或Ku70。
在本发明方法的一些实施方式中，所述化合物为不含荧光基团的活化底物的SIRT1脱乙酰基化的活化剂。在具体的实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物的SIRT1脱乙酰基化的活化剂具有下式(XL)的结构：
Figure BDA00002598264500061
或其盐，其中R1选自–(CH2)3-CH3和–(CH2)CH(CH3)2；且R2为–哌啶或–(CH2)2-NH-CH3。在一些优选的实施方式中，所述化合物，或其盐，具有式(XI)、(XII)或(XIII)：
Figure BDA00002598264500062
在本发明方法的另一实施方式中，本发明还包括选择候选化合物(其为SIRT1活化剂)，以及将所述SIRT1活化剂与测试细胞接触并在测试细胞中检测SIRT1活化-特异性改变的步骤。在一些实施方式中，所述SIRT1活化-特异性改变为FGF21生成的增加。在其它实施方式中，所述SIRT1活化-特异性改变为LPS-诱导的TNFα生成的减少。
在其它实施方式中，本发明的方法还包括选择候选化合物(其为SIRT1活化剂)，并给药所述SIRT1活化剂至测试受治疗者并在测试受治疗者中检测SIRT1活化-特异性改变的步骤。在一些实施方式中，所述测试受治疗者为糖尿病模型小鼠并且所述SIRT1活化特异性改变为降低血糖。在其它实施方式中，所述测试受治疗者为神经变性疾病模型小鼠并且所述SIRT1活化特异性改变为神经变性疾病过程或标记(例如阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、亨廷顿病或多发性硬化(MS))的降低。
在另一个方面，本发明提供不含荧光基团的沉默调节蛋白底物，其具有结构式Ac-RHKKAcF-NH2或Ac-RHKKAcW-NH2。
在其它方面，本发明提供如下沉默调节蛋白调节化合物：结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)：
Figure BDA00002598264500081
Figure BDA00002598264500091
在其它方面中，本发明提供药物组合物，其包含式(I)至式(XXI)中任一个化合物，或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它活性剂。
在另一方面中，本发明提供治疗罹患或易患胰岛素抵抗、代谢综合症、糖尿病或其并发症的受治疗者，或增加受治疗者胰岛素敏感性的方法，通过给药包含式(I)至式(XXI)中任一个化合物的药物组合物至需要的受治疗者。
在另一方面中，本发明提供结构式(XXXI)的沉默调节蛋白-调节化合物，或其盐：
Figure BDA00002598264500101
其中：
X和Y之一选自-NH-C(=O)-R1或–C(=O)-NH-R1，且X和Y的另一个为H，其中R1选自苯基或稠和杂环，且R1任选地被1个至2个独立地选自以下的取代基取代：–C≡N、氟-取代的C1-C2烷基和–(C0-C2烷基)-饱和杂环，且当R1为苯基时，R1任选地被–CH2-O-饱和杂环取代，其中所述饱和杂环选自哌啶、吡咯烷或哌嗪，且当R1选自稠和杂环时，所述稠和杂环选自苯并[d]噻唑，并且R1还任选地被–OCH3取代；且Z1和Z2之一为N，且另一个为CR2，其中R2选自-NH(C1-C3烷基)、-NH(C1-C3烷基)-N(CH3)2、–(C0-C2烷基)-吗啉、–(C0-C2烷基)-哌嗪或-N(C1-C4烷基)2，其中当R2为–(C0-C2烷基)-饱和杂环时，所述饱和杂环选自吗啉或哌嗪。
在具体实施方式中，本发明提供结构式(XXXI)的化合物，或其盐，其具有结构式(XIII)-(XXI)：
在具体方面中，本发明提供结构式(XXXII)的沉默调节蛋白-调节化合物，或其盐：
Figure BDA00002598264500121
其中：
R1为任选地被–(C0-C2烷基)-吡咯烷或–(C0-C2烷基)-哌嗪取代的苯基；且R2选自–C1-C3烷基或–(C1-C3烷基)-N(CH3)2。
在具体实施方式中，本发明提供结构式(XXXII)化合物，或其盐，其具有结构式(XIII)、(XIV)和(XV)：
Figure BDA00002598264500122
在具体方面中，本发明提供结构式(XXXIII)的沉默调节蛋白-调节化合物或其盐，：
Figure BDA00002598264500123
其中：
R1为苯基，其任选地被-(C0-C2烷基)-哌嗪取代；且R2选自-C1-C3烷基和–(C1-C3)-N(CH3)2。
在具体实施方式中，本发明提供结构式(XXXIII)化合物，或其盐，其具有结构式(XVI)和(XVIII)：
Figure BDA00002598264500131
在具体方面中，本发明提供结构式(XXXIV)的沉默调节蛋白-调节化合物，或其盐：
Figure BDA00002598264500132
其中：
Z1和Z2之一为N，且另一个选自CR2，其中R2选自–(C0-C2烷基)-吗啉、–(C0-C2烷基)-哌嗪和-N(C1-C4)2；且R1选自苯基和苯并[d]噻唑，其任选地被-OCH3取代，其中R1进一步任选地被1个至2个独立地选自以下的取代基取代：-C≡N、氟-取代的C1-C2烷基，且当R1为苯基时，R1进一步任选地被-CH2-O-哌啶取代。
在具体实施方式中，本发明提供结构式(XXXIV)的化合物，或其盐，其具有结构式(XVII)、(XIX)、(XX)和(XXI)：
Figure BDA00002598264500133
Figure BDA00002598264500141
本发明还提供药物组合物，其包含结构式(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)的沉默调节蛋白-调节化合物，包括结构式(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)和(XI)的化合物。
在其它方面中，本发明提供药物组合物，其包含式(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)中任一个的化合物，包括结构式(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)和(XI)的化合物，或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它活性剂。
在另一方面中，本发明提供治疗罹患或易患胰岛素抵抗、代谢综合症、糖尿病或其并发症的受治疗者，或增加受治疗者胰岛素敏感性的方法，通过给药包含式(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)的化合物，包括结构式(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)和(XXI)的化合物的药物组合物，至需要的受治疗者。
在另一个方面，本发明提供了使用沉默调节蛋白-调节化合物的方法、或包含沉默调节蛋白-调节化合物的组合物。在一些实施方式中，提高沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白-调节化合物可以用于各种治疗应用，包括，例如，提高细胞寿命，治疗和/或预防多种疾病和病症，包括，例如，与衰老或应激反应有关的疾病或病症，糖尿病，肥胖症，神经变性疾病，化学疗法引起的神经病，与缺血事件有关的神经病，眼睛疾病和/或病症，心血管疾病，血液凝固病症，炎症，和/或潮红，等等。提高沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白调节化合物也可以用于治疗患者的受益于线粒体活性提高的疾病或病症，用于增强肌肉性能，用于提高肌肉ATP水平，或用于治疗或预防与缺氧或缺血有关的肌肉组织伤害。在其它实施方式中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白-调节化合物可以用于各种治疗应用，包括，例如，提高细胞对应激反应的敏感性，提高细胞程序死亡，治疗癌症，刺激食欲，和/或刺激体重增加，等等。如下面进一步所描述的，该方法包括给药需要的患者药物有效量的沉默调节蛋白-调节化合物。在一些方面，沉默调节蛋白的调节性化合物可单独给药，或与其它化合物包括其它沉默调节蛋白的调节性化合物，或其它治疗剂组合给药。在一些优选的实施方式中，本发明提供治疗罹患或易患胰岛素抵抗、代谢综合症、糖尿病或其并发症的受治疗者，或增加受治疗者胰岛素敏感性的方法，通过向所述受治疗者给药结构式(XL)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)的沉默调节蛋白-调节化合物，包括式(I)至式(XXI)中任一个的化合物，或其盐。
附图说明
图1表示SRT1460、SRT1720和SRT2183的化学结构。
图2A表示SIRT1酶(E)对乙酰基化的底物(S)的酶激活的“间接”机理，其中活化剂X结合至底物S上，并且活化由X:S转换的有利动力学引起。
图2B显示SIRT1酶(E)对乙酰基化的底物(S)的酶激活的变构机理，其中在活性位点结合底物和在变构外位点结合活化剂导致形成(X:E:S)’，并且当γ/β<1时活化发生。
图3表示在Kd的指示值(假定图2A的‘间接’活化机理)，相对初速度对活化剂浓度的相关性的模拟。如下进行模拟：使用等式(5)，等式(8)对游离底物浓度的表达式，以及[S]o设定为0.5μM时在本文中给定的参数设定。该插图表示对于图2A的机理，Kx，ap对Kd为线性相关性。
图4A表示SIRT1活化剂(图5中的结构4)与TAMRA-肽之间相互作用的量热研究，其证明活化剂与TAMRA-肽没有结合。
图4B表示SIRT1活化剂(图5中的结构7)与TAMRA-肽之间相互作用的量热研究，其证明活化剂结合至TAMRA-肽，且Kd为36μM。插图表示相对速度对比[3]o的活化滴定曲线，由该曲线计算出EC50为0.5μM(EC1.5=0.1μM)。
图5表示对于活化剂结合至TAMRA-肽的Kd与对于活化SIRT1的EC1.5没有相关性。显示了本文讨论的具体化合物的结构。空心圆表示化合物的Kd≥100μM。灰色条强调了Kd值范围为2.5μM至大于100μM，但具有约0.3μM的相同EC1.5值的一系列化合物。
图6表示对于SIRT1-催化的TAMRA-肽的脱乙酰基化，活化剂(图5中的结构22)的相对速度的相关性。两种符号对应于两次独立的实验，而且使用根据等式(1)的最佳拟合参数EC50=3.9±0.5μM，RVmax=6.8±0.3绘制实心线。
图7A表示在TAMRA-肽底物浓度为0.5μM时相对速度与[SRT1460]o的相关性，其使用来自Milne等((2007)Nature 450，712-716)的数据使用底物。使用等式(5)和(8)以及最佳拟合参数Km,x=90±8nM，γ=0.20+0.01绘制通过数据的实心线。在该拟合中，使用了以下限制：Kd=140μM，[S]o=0.05μM和Km=14.5μM。
图7B表示拟合至Michaelis-Menten方程的各个数据集，其使用最佳拟合参数(表5)绘制实心线(符号：▲，37μM；Δ，1μM；
Figure BDA00002598264500161
3μM；O，0μM)。
图8A表示化合物11(见表6)结合至SIRT1上。ITC证明化合物11结合至SIRT(183-664)上且Kd为0.32μM。
图8B表示化合物11(见表6)的荧光随着SIRT(183-664)的浓度增加而增加。
图8C表示化合物11(见表6)结合至SIRT(183-664)上且Kd为0.27μM，其使用来自图8B的数据绘制滴定曲线。
图9表示活化剂化合物22、23和24(结构如下所示)调节SIRT1的催化活性。实心符号对应于desTAMRA-肽脱乙酰基化的活化。数据点拟合至等式(1)，并且得到：化合物22EC50=1.7±0.1μM，RVmax=2.6+0.1；化合物23EC50=2.2±0.3μM，RVmax=2.8±0.2；24EC50=1.5±0.1μM，RVmax=2.1+0.1。空心符号对应于脱乙酰基化p53-20mer的抑制。数据点拟合至等式RV=1/(1+([X]o/Ki,app))，并且得到：化合物22Ki,app=9±4V，23Ki,app=10±1.0μM，24Ki,app=9±3.0μM。
图10表示化合物10(图9)和SRT1460(图1)激活Ac-Arg-His-Lys-LysAc-X的SIRT1-催化的脱乙酰基化。上图：X=TrpNH2，EC1.5=1.9μM；X=AMC，EC1.5=3.1μM。下图：X=TrpNH2，EC1.5=5.0μM，EC50=27±8.0μM，并且RVmax=4.1±0.1；X=PheNH2，EC1.5=26.0μM。这些滴定代表了3-5次独立的实验，而且各个点为这些实验的平均值±标准偏差。
图11表示两种SIRT1活化剂的结构和EC1.5值，这两种活化剂仅区别于核心杂环的取向。
图12为Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp-NH2结合至SIRT1的活性位点的模型。
图13为对连接至SIRT1的活性位点的Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp-NH2的基于SIRT3的结构同源模型的描述。Trp残基的吲哚松散地夹在SIRT1同源模型的Phe414和Arg446之间，形成一种分子‘钳’，用于结合在该位置的大基团。
图14为涉及活化辅因子要求的SIRT1活化机理的体外和体内模型的描述。
发明详述
1.定义
用于本文的下列术语及短语应具有于下文所叙述的含义。除非另行定义，所有于本文中所使用的技术与科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
本文中术语“药物(agent)”用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗体、蛋白或其部分例如肽)、或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制得的提取物。此类药物的活性可使其适宜用作在受治疗者体内局部地或全身性地起作用的在生物学上、生理学上或药理学上是活性物质的“治疗剂”。
术语“生物可利用的”当涉及化合物时为本领域所认知的，且所考虑到的涉及化合物形式或所给药化合物的一部分的量，能够被所给药的受治疗者或患者吸收、引入或以其它方式在生理学上被利用。
“沉默调节蛋白的生物学上具活性的部分”是指具有生物活性，例如脱乙酰基化能力的沉默调节蛋白的一部分。沉默调节蛋白的生物学上具活性的部分可包含沉默调节蛋白的核心结构域。具有GenBank登录编号NP_036370的SIRT1的生物学上具活性部分，包括NAD+结合结构域与底物结合结构域，例如，可包括但不限于GenBank登录编号NP_036370的氨基酸62-293，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸237至932所编码。因此，此区域有时被称作核心结构域。SIRT1的其它生物学上具活性部分(也有时也被称作核心结构域)包括GenBank登录编号NP_036370的大致氨基酸261至447，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸834至1394所编码；GenBank登录编号NP_036370的大致氨基酸242至493，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸777至1532所编码；或GenBank登录编号NP_036370的大致氨基酸254至495，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸813至1538所编码。
术语“陪伴动物”是指猫与狗。用于本文的术语“狗”是指犬科家族(Canisfamiliaris)的任一成员，其中有许多不同品种。术语“猫”是指猫科动物，包括驯养猫及猫科猫属(family Felidae，genus Felis)的其它成员。
“糖尿病”是指高血糖或酮酸中毒，以及因长期高血糖状态或葡萄糖耐受性减低所引起的慢性、一般性代谢异常。“糖尿病”包含该疾病的I与II型(非胰岛素依赖性糖尿病或NIDDM)两种形式。糖尿病的危险因素包括下列因素：男子腰围超过40英寸或女子腰围超过35英寸，血压为130/85mmHg或以上，甘油三酸酯高于150mg/dl，空腹血糖大于100mg/dl，或高密度脂蛋白男子中少于40mg/dl或女子中少于50mg/dl。
术语“ED50”为本领域公知。在一些实施方式中，ED50是指药物产生其最大响应或功效的50%时的剂量，或者在50%的测试的受治疗者或制剂中产生预定响应的剂量。术语“LD50”为本领域公知。在一些实施方式中，LD50是指药物使50%的测试受治疗者致死的剂量。术语“治疗指数”为本领域所认知的术语，是指药物的治疗指数，定义为LD50/ED50。
术语“不含荧光基团的活化底物（fluorecent-free activation substrate）”是指沉默调节蛋白脱乙酰基酶(例如，SIRT1)的乙酰基化的底物，其不包含本领域公知的荧光标记基团(例如TAMRA或AMC)，但其可以包含天然氨基酸残基，例如苯基丙氨酸和色氨酸，其具有荧光性质，而且还允许通过沉默调节蛋白活化剂化合物(STAC)活化不含荧光基团的沉默调节蛋白(例如SIRT1)。该不含荧光基团的活化底物可以包括乙酰基化的肽、多肽和蛋白底物，包括全长SIRT1蛋白底物，例如组蛋白H1、H3和H4、p53、p300、FOXO 1、3a和4、p65、HIVTat、PGC-1α、PCAF、MyoD、PPARγ和Ku70，以及其具有该STAC-活化性质的肽和多肽片段。该不含荧光基团的活化底物还可以包括具有非-荧光大基团(例如生物素)的肽、多肽和蛋白乙酰基化的底物，其还允许沉默调节蛋白的STAC活化。该不含荧光基团的活化底物还包括可以不受STAC活化的乙酰基化的肽、多肽和蛋白沉默调节蛋白底物，与携带活化辅因子的辅助蛋白或配体组合使其具有对该底物的STAC活化性质，因此，底物和辅因子的该组合提供了功能性“不含荧光基团的活化底物”。合适的所述辅因子包括DBC1、HIC1、AROS和CLOCK蛋白，其可以对不被STAC激活的沉默调节蛋白底物提供STAC-可激活性质。
术语“高胰岛素血症”是指个体血液中胰岛素水平高于正常值的状态。
术语“胰岛素抵抗”是指这样的一种状态，其中相对于在不具有胰岛素抵抗的受治疗者中的生物响应而言，正常量胰岛素产生低于正常(subnormal)生物响应的状态。
本文所讨论的“胰岛素抵抗病症”是指由胰岛素抵抗所引起或引起的任何疾病或病症。实例包括：糖尿病、肥胖症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征、综合征X、胰岛素抵抗、高血压、血压过高、高血胆固醇、血脂异常、高脂血症、血脂异常、动脉粥样硬化疾病，包括中风、冠状动脉疾病或心肌梗塞、高血糖症、高胰岛素血症和/或高胰岛素原血症、葡萄糖耐受性不良、延迟胰岛素释放、糖尿病并发症包括冠心病、心绞痛、充血性心脏衰竭、中风、痴呆的识别功能、视网膜病、周围神经病、肾病、肾小球肾炎、肾小球硬化症、肾病变综合征、高血压性肾硬化、一些类型癌症(例如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌与结肠癌)、妊娠并发症、雌性生殖健康变差(例如月经不规则、不孕、不规则排卵、多囊卵巢性综合征(PCOS))、脂肪代谢障碍、胆固醇相关病症，例如胆结石、胆囊炎与胆石病，痛风、阻塞性睡眠呼吸暂停与呼吸问题、骨关节炎，以及预防和治疗骨丢失(bone loss)，例如骨质疏松症。
术语“家畜动物”是指经驯化的四足动物，其包括那些为肉类与各类副产品而饲养的动物，例如牛类动物包括牛与牛属(genus Bos)的其它成员，猪类动物包括驯养猪与猪属(genus Sus)的其它成员，羊类动物包括绵羊与其它羊属(genus Ovis)的成员、驯养山羊与山羊属(genus Capra)的其它成员；为特定任务例如用做为负重的兽而饲养的经驯化的四足动物，例如马类动物包括驯养马与马科马属(family Equidae，genus Equus)的其它成员。
术语“哺乳动物”为本领域已知的，且例举性哺乳动物包括人、灵长类、家畜动物(包括牛类、猪类等)、陪伴动物(例如犬类、猫类等)及啮齿类(例如小鼠与大鼠)。
“肥胖的”个体或患有肥胖症的个体，一般指具有的体重指数(BMI)为至少25或以上的个体。肥胖可能或不可能与胰岛素抵抗相关。
术语“经肠胃外给药”及“经肠胃外进行给药”为本领域所认知的，且指除了肠内与局部给药以外的给药型式，一般经由注射，且包括但不限定于：静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内与胸骨内注射及输注(infusion)给药。
“患者”、“受治疗者”、“个体”或“宿主”是指人或非人动物。
术语“药学上可接受的载体”为本领域所认知的，且是指与携带或运送任何主体组合物或其组分有关的药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物料。各种载体就其可与主体组合物或其组分相容的意义而言必须为“可接受的”，且对患者是无害的。例如，药学上可接受的载体可以具有至少1g/kg、3g/kg或甚至5g/kg的LD50。或者，药学上可接受的载体可为国家管理机构(例如，美国食品与药品管理局)通常认为是安全的物质(GRAS物质)。可用作药学上可接受载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖与蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉与马铃薯淀粉；(3)纤维素与其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)成粉末的西黄耆胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂与栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、蓖麻油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油与大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇与聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯与月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁与氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热源水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；及(21)其它用于医药制剂的无毒性相容物质。
术语“预防性”或“治疗性”治疗为本领域所认知的，且指将药物给药至宿主。如果在临床显现不希望病症(例如，宿主动物的疾病或其它不希望状态)之前进行给药，则该治疗为预防性，即其保护宿主不会发展成该不希望病症，而如果在显现不希望病症之后进行给药，则该治疗为治疗性的(即意在减少、改善或维持现有的不希望病症或由其产生的副作用)。
术语“无热源(pyrogen-free)”在关于组合物时，是指不含有热源的组合物，而其含量会在已给药该组合物的受治疗者中导致有害作用(例如，刺激、发热、炎症、腹泻、呼吸窘迫、内毒素性休克等)。例如，该术语意包括不含或基本上不含诸如脂多糖(LPS)等内毒素的组合物。
细胞的“复制寿命”是指由单个“母细胞”所产生的许多子细胞。另一方面，“时序衰老(chronolo gical aging)”或“时序寿命”是指一群不分裂的细胞当被除去养分时仍保持存活的时间长度。“增加细胞寿命”或“延长细胞寿命”当应用于细胞或生物体时，是指增加由一个细胞所产生的许多子细胞；增加细胞或生物体对抗应激及对抗损伤，例如对DNA、蛋白的应激和损伤的能力；和/或增加细胞或生物体可于特别条件例如应激(如热休克、渗透压力、高能量照射、化学诱导的应激、DNA损伤、不适当的盐水平、不适当的氮水平或不充足的营养物水平)下存活和生存的状态存在较长时间的能力。使用本文中所述的方法，寿命可增加至少约20%、30%、40%、50%、60%，或20%至70%、30%至60%、40%至60%或以上。
“沉默调节蛋白的活化化合物”是指增加沉默调节蛋白水平，和/或增加沉默调节蛋白的至少一种活性的化合物。在例举性的实施方式中，沉默调节蛋白的活化化合物可使沉默调节蛋白的至少一种生物活性增加至少约10%、25%、50%、75%、100%或以上。沉默调节蛋白的例举性生物活性包括例如组蛋白与p53的脱乙酰基化；延长寿命；增加基因组的稳定性；沉默转录作用；及调控母细胞与子细胞间的经氧化蛋白的分离。
“沉默调节蛋白”是指沉默调节蛋白的脱乙酰基酶蛋白家族或优选指sir2家族的成员，其包括酵母Sir2(GenBank登录编号P53685)、秀丽隐杆线虫Sir-2.1(GenBank登录编号NP_501912)及人SIRT1(GenBank登录编号NM_012238与NP_036370(或AF083106))与SIRT2(GenBank登录编号NM_012237、NM_030593、NP_036369、NP_085096与AF083107)蛋白。其它家族成员包括四种称作“HST基因”(Sir2的同系物)的其它酵母Sir2类基因HST1、HST2、HST3与HST4，及五种其它人同系物hSIRT3、hSIRT4、hSIRT5、hSIRT6与hSIRT7(Brachmann等人，(1995)Genes Dev.9：2888及Frye等人(1999)BBRC 260：273)。优选的沉默调节蛋白是那些和SIRT2相比，与SIRT1，即hSIRT1和/或Sir2共有更多相似性的沉默调节蛋白，例如那些具有至少一部分存在于SIRT1中而不存在于SIRT2中的，例如SIRT3所具有的N-末端序列的成员。
“SIRT1蛋白”是指沉默调节蛋白的脱乙酰基酶的Sir2家族的成员。在一个实施方式中，SIRT1蛋白包括酵母Sir2(GenBank登录编号P53685)、秀丽隐杆线虫Sir-2.1(GenBank登录编号NP_501912)、人SIRT1(GenBank登录编号NM_012238或NP_036370(或AF083106))，和人SIRT2(GenBank登录编号NM_012237，NM_030593，NP_036369，NP_085096或AF083107)蛋白，及其等同物与片段。在另一个实施方式中，SIRT1蛋白包括多肽，其包含由或基本上由列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的氨基酸序列所组成的序列。SIRT1蛋白包括含有下列氨基酸序列的全部或一部分的多肽及其功能性片段：列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的氨基酸序列；列示于GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中的具有1至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75或更多保守性氨基酸取代的氨基酸序列；与GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。本发明中的多肽也包括GenBank登录编号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685的同源物(直向同源物(orthologs)与侧向同源物(paralogs))、变体或片段。
“SIRT3蛋白”是指沉默调节蛋白的脱乙酰基酶蛋白家族的成员和/或SIRT1蛋白的同源物。在一个实施方式中，SIRT3蛋白包括人SIRT3(GenBank登录编号AAH01042、NP_036371或NP_001017524)与小鼠SIRT3(GenBank登录编号NP_071878)蛋白，及其等同物与片段。在另一个实施方式中，SIRT3蛋白包括多肽，其包含由或基本上由列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的氨基酸序列所组成的序列。SIRT3蛋白包括含有下列氨基酸序列的全部或一部分的多肽及其功能性片段：列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的氨基酸序列；列示于GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中的具有1至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75或更多保守性氨基酸取代的氨基酸序列；与GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。本发明中的多肽也包括GenBank登录编号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878的同源物(直向同源物与侧向同源物)、变体或片段。在一个实施方式中，SIRT3蛋白包括以线粒体基质加工肽酶(MPP)和/或线粒体中间体肽酶(MIP)裂解而产生的SIRT3蛋白片段。
术语“全身性给药”、“全身地给药”、“周围性给药”及“周围地给药”为本领域所认知的，且指主体组合物、治疗剂或其它物质的除了直接进入中枢神经系统以外的给药方式，以使其能进入患者的全身，而因此进行代谢作用及其它类似过程。
术语“治疗剂”为本领域所认知的，且是指生物学上、生理学上或药理学上具活性的、可于受治疗者内局部或全身性起作用的任何化学部分(moiety)。该术语也是指欲用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病的任何物质，或用于增进动物或人的希望的身体或精神发育和/或状况的物质。
术语“治疗功效”为本领域所认知的，且指动物(特别是哺乳动物，且更特别地为人)中由药理学上具活性的物质产生的局部或全身性功效。术语“治疗上有效量”是指，使物质能以可应用至任何治疗的合理效益/风险比，产生某种所希望的局部或全身功效的量。此类物质的治疗上有效量将随欲受治疗的受治疗者与疾病状况、受治疗者的体重与年龄、疾病状况的严重度、给药方式等而有所变化，其可由本领域普通技术人员容易地确定。例如，本文所述的一些组合物可以以可应用至此类治疗的合理效益/风险比产生所希望功效的足够量来进行给药。
“治疗”病症或疾病是指治愈以及改善该病症或疾病的至少一种症状。
术语“视力损伤”是指视力减弱，其在进行治疗(例如手术)时往往仅部分可逆或不可逆。特别严重的视力损伤称为“盲”或“视力丧失”，其是指视力完全丧失、视力变差于20/200以致无法经由矫正镜片改善，或视野小于20度直径(10度半径)。
2.沉默调节蛋白的调节剂
在一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防种类繁多的疾病与病症的新颖沉默调节蛋白的调节性化合物，上述疾病与病症包括，例如与老化或应激反应有关的疾病或病症、糖尿病、肥胖症、神经变性疾病、眼疾病与病症、心血管疾病、血液凝固病症、炎症、癌症和/或潮红等。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于治疗患者中因增加线粒体活性而受益的疾病或病症，用于增进肌肉机能，用于增加肌肉ATP水平，或用于治疗或预防与缺氧或缺血相关的肌肉组织损伤。本文中所公开的其它化合物可适用于本文中所公开的药物组合物，和/或一种或多种方法。
在一些实施方式中，本发明的沉默调节蛋白-调节性化合物表示为结构式(XL)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)，包括结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)和(XXI)中任一个化合物。
下面描述的实施方式应用于以下任一结构式的化合物：(XL)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)，包括结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)和(XXI)中任一个化合物。
本发明化合物，包括本发明新化合物，也可以用于本文描述的方法中。
本文所述的化合物及其盐还包括它们相应的水合物(例如，半水合物、单水合物、二水合物、三水合物、四水合物)和溶剂化物。用于制备溶剂化物和水合物的合适溶剂可以由本领域技术人员常规选择。
所述化合物及其盐可以存在为无定形或晶体(包括共晶体和多晶型体)形式。
本发明的沉默调节蛋白调节性化合物有利地调节沉默调节蛋白的水平和/或活性，特别是沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性。
独立地或除了前述性质以外，本发明的一些沉默调节蛋白的调节性化合物在该化合物有效调节沉默调节蛋白(例如，SIRT1和/或SIRT3蛋白)的脱乙酰基活性的浓度下，基本上不具有下列一种或多种活性：抑制PI3-激酶、抑制醛糖还原酶(aldoreductase)、抑制酪氨酸激酶、反式激活EGFR酪氨酸激酶、冠状动脉扩张或解痉挛活性。
烷基是完全饱和的直链的或支链的烃基。典型地，直链的或支链的烷基具有1至大约20个碳原子，优选具有1至大约10个碳原子。直链的和支链的烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基和辛基。C1-C4直链的或支链的烷基也称为"低级烷基"。
环烷基为完全饱和的环状烃基。
碳环包括5-7元单环和8-12元双环，其中所述单环或双环选自饱和、不饱和和芳香环。在一些实施方式中，当碳环为双环体系时，各环可以特征在于不同的饱和度。例如芳香环(例如苯基)可以稠和至饱和或不饱和环(例如环己烷、环戊烷或环己烯)上。只要价键允许，饱和、不饱和和芳香双环的任一组合包括在碳环的定义内。示例性碳环包括环戊基、环己基、环己烯基、金刚烷基、苯基和萘基。
杂环包括含有一个或多个选自例如N、O和S原子的杂原子的4-8元单环和8-12元双环。在一些实施方式中，所述杂环选自饱和，不饱和或芳香环。在一些实施方式中，在双环体系中，各环可以特征在于不同的饱和度。例如，芳香环(例如苯基或吡啶)可以稠和至饱和环(例如吗啉基或四氢呋喃)上。只要价键允许，饱和、不饱和和芳香双环的任一组合包括在杂环的定义内。在饱和的杂环中，杂环的原子通过单键相互键结。
单环包括5-7元芳基或4-8元杂芳基、5-7元环烷基和4-8元非-芳香杂环基。示例性单环基团包括取代的或未经取代的杂环，例如噻唑基、
Figure BDA00002598264500251
唑基、
Figure BDA00002598264500252
嗪基、噻嗪基、二噻烷基、二烷基、异
Figure BDA00002598264500254
唑基、异噻唑基、三唑基、呋喃基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、吡喃基、四唑基、吡唑基、吡嗪基、哒嗪基、咪唑基、吡啶基、吡咯基、二氢吡咯基、吡咯烷基、噻嗪基、
Figure BDA00002598264500255
嗪基、哌啶基、哌嗪基、嘧啶基、吗啉基、四氢噻吩基、噻吩基、环己基、环戊基、环丙基、环丁基、环庚基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、氮杂环丙烷基和硫吗啉基。
芳香基团(芳基)包括碳环芳基，如苯基、萘基和蒽基。杂芳香基团(杂芳基)包括咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、
Figure BDA00002598264500256
唑基和四唑基。
芳基还包括稠合多环芳香环体系，其中碳环芳香环或杂芳基环稠合至一个或多个其它芳香环或杂芳基环上。实例包括苯并噻吩基、萘基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并吗啉基、苯并
Figure BDA00002598264500257
唑基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。
氟-取代的包括从一个氟取代基至最多全氟取代。示例性的氟-取代的C 1-C2烷基包括-CFH2、CF2H、-CF3、-CH2CH2F、-CH2CHF2、-CHFCH3和-CF2CHF2。全氟-取代的C1-C2烷基，例如，包括-CF3和-CF2CF3。
在指定为取代的或未取代的部分上的合适取代基为基本上不干扰所公开化合物具有一种或多种本文所公开性质的能力的那些取代基。与不具有取代基的化合物相比，当具有取代基的化合物的所述性质的大小降低超过大约50%时，认为取代基基本上干扰化合物的性质。
本发明预计的取代基与变体的组合仅是形成稳定化合物的那些。本文所使用的术语“稳定的”是指化合物具有其制备的足够稳定性，且可使该化合物的完整性维持足够时间以用于本文中所详述的目的。
本文中所公开的化合物也包括经部分及完全氘化的变体。在一些实施方式中，存在一个或多个氘原子用于动力学研究。本领域普通技术人员可选择所述氘原子存在的部位。
本发明也包括本文所述沉默调节蛋白的调节性化合物的盐类，特别是药学上可接受的盐类。具有足够酸性、足够碱性或该二性的官能团的本发明化合物，可以和许多的无机碱类、及无机与有机酸类中的任一种反应形成盐类。或者，固有带电荷的化合物(例如具有季氮的化合物)可和适当抗衡离子(例如，卤离子如溴离子、氯离子或氟离子，特别是溴离子)形成盐。
一般用于形成酸加成盐的酸类为无机酸类，例如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，及有机酸类，例如对-甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对-溴苯基-磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、醋酸等。此类盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、酸式硫酸盐、亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸单氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、反丁烯二酸盐、顺丁烯二酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、酞酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。
碱加成盐包括衍生自无机碱类，例如铵或碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等的那些盐。因此此类可用于制备本发明盐类的碱类包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。
根据另一实施方式，本发明提供制备前述定义的沉默调节蛋白的调节性化合物的方法。这些化合物可使用通用技术合成。有利地，这些化合物可由容易获得的起始物料方便地合成。
用于合成本文所述沉默调节蛋白的调节性化合物的合成化学转化作用与方法在本领域中是已知的，且包括，例如描述于R.Larock，ComprehensiveOrganic Transformations(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第二版，(1991)；L.Fieser与M.Fieser，Fieser andFieser’s Reagents for Organic Synthesis(1994)；及L.Paquette编著，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis(1995)中的那些化学转化作用与方法。
在一个示例性的实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物可能通过细胞的胞质膜。例如，化合物可具有至少约20%、50%、75%、80%、90%或95%的细胞-通透性。
本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物也可具有一个或多个下列特性：该化合物可基本上对细胞或个体无毒性；该化合物可为有机分子或具有2000amu或小于2000amu，1000amu或小于1000amu的小分子；该化合物可于正常大气条件下具有至少约30天、60天、120天、6个月或1年的半衰期；该化合物于溶液中可具有至少约30天、60天、120天、6个月或1年的半衰期；沉默调节蛋白的调节性化合物可于溶液中，较白藜芦醇稳定至少约50%、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍或100倍；沉默调节蛋白的调节性化合物可促进DNA修复因子Ku70的脱乙酰基化作用；沉默调节蛋白的调节性化合物可促进RelA/p65的脱乙酰基化作用；该化合物可增加一般转换率，及增强细胞对TNFα-所诱发细胞凋亡的敏感性。
在一些实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物在(例如体内)有效调节沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有抑制第I类组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)、第II类HDAC或HDACsI与II的任何实质能力。例如，在优选的实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物为沉默调节蛋白-活化化合物，且选择那些具有对活化沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的EC50值，较对于抑制HDAC I和/或HDAC II的EC50值少至少5倍，且甚至优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的沉默调节蛋白-调节性化合物。用于测定HDAC I和/或HDAC II活性的方法为本领域所熟知，且进行此类测定的试剂盒可市场上购得。参见例如，BioVision，Inc.(Mountain View，CA；网址biovision.com)及Thomas Scientific(Swedesboro，NJ；网址thomassci.com)。
在一些实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物不具有调节沉默调节蛋白同系物的任何实质能力。在一个实施方式中，人沉默调节蛋白的活化剂，在(例如活体内)有效活化人沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，可能不具有活化得自低等真核生物，特别是酵母或人病原体的沉默调节蛋白的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白-活化化合物可选择具有对于活化人沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3)脱乙酰基酶活性的EC50值，较对于活化酵母沉默调节蛋白(例如Sir2(如念珠菌属、酿酒酵母等))的EC50值少至少5倍，且甚至更优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在另一实施方式中，得自低等真核生物(特别是酵母或人病原体)的沉默调节蛋白的抑制剂，在(例如活体内)有效抑制得自低等真核生物的沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有抑制得自人的沉默调节蛋白的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白的抑制性化合物可选择具有对于抑制人沉默调节蛋白(例如SIRT1、SIRT2和/或SIRT3)的脱乙酰基酶活性的IC50值，较对于抑制酵母沉默调节蛋白(例如Sir2(如念珠菌属、酿酒酵母等))的IC50值少至少5倍，且甚至更优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。
在一些实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物可具有调节一种或多种沉默调节蛋白同系物，诸如一种或多种人SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的能力。在一个实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物具有调节SIRT1及SIRT3蛋白的能力。在另一实施方式中，沉默调节蛋白-调节化合物具有调节SIRT1和SIRT2蛋白的能力。在具体实施方式中，沉默调节蛋白调节化合物具有激活SIRT1同时抑制SIRT2蛋白的能力。
在其它实施方式中，SIRT1调节剂在(例如活体内)有效调节人SIRT1的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有调节其它沉默调节蛋白同系物，诸如一种或多种人SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白的调节性化合物可选择具有对于调节人SIRT1脱乙酰基酶活性的ED50值，较对于调节一种或多种人SIRT2、SIRT3、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的ED50值少至少5倍，且甚至更优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在一个实施方式中，SIRT1调节剂不具有调节SIRT3蛋白的任何实质能力。
在其它实施方式中，SIRT2调节剂在有效调节人SIRT2的脱乙酰基酶活性的浓度(例如，在体内)不具有任何调节其它沉默调节蛋白蛋白同源物(例如人SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7中的一个或多个)的实质能力。例如，可以选择沉默调节蛋白-调节化合物，使得调节一个或多个人SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的ED50为具有调节人SIRT2脱乙酰基酶活性的ED50的至少5倍，甚至更优选至少10倍、100倍或甚至1000倍。在一个实施方式中，SIRT2调节剂不具有调节SIRT1蛋白的实质能力。在一些具体实施方式中，所述SIRT2调节剂抑制SIRT2蛋白。
在其它实施方式中，SIRT3调节剂在(例如活体内)有效调节人SIRT3的脱乙酰基酶活性的浓度下，不具有调节其它沉默调节蛋白同系物，诸如一种或多种人SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的任何实质能力。例如，沉默调节蛋白的调节性化合物可选择具有对于调节人SIRT3脱乙酰基酶活性的ED50值，较对于调节一种或多种人SIRT1、SIRT2、SIRT4、SIRT5、SIRT6或SIRT7的ED50值少至少5倍，且甚至更优选少至少10倍、100倍或甚至1000倍的那些化合物。在一个实施方式中，SIRT3调节剂不具有调节SIRT1蛋白的任何实质能力。
在一些实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物可具有对于沉默调节蛋白的结合亲和力约10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或以下。沉默调节蛋白的调节性化合物可减少(活化剂)或增加(抑制剂)沉默调节蛋白对于其底物或NAD+(或其它辅因子)的表观Km值达至少约2、3、4、5、10、20、30、50或100倍。在一些实施方式中，Km值使用本文所述的质谱分析测定。优选的活化化合物减少沉默调节蛋白对于其底物或辅因子的Km值，至较由白藜芦醇在相似浓度下所引起的更大的程度，或减少沉默调节蛋白对于其底物或辅因子的Km值，相似于由白藜芦醇在较低浓度下所引起的Km值。沉默调节蛋白的调节性化合物可增加沉默调节蛋白的Vmax值至少约2、3、4、5、10、20、30、50或100倍。沉默调节蛋白的调节性化合物可具有对于调节SIRT1和/或SIRT3蛋白的脱乙酰基酶活性的ED50值少于约1nM，少于约10nM，少于约100nM，少于约1μM，少于约10μM，少于约100μM，或从约1-10nM，从约10-100nM，从约0.1-1μM，从约1-10μM或从约10-100μM。沉默调节蛋白的调节性化合物可调节SIRT1和/或SIRT3蛋白的脱乙酰基酶活性达至少约5、10、20、30、50或100倍，通过细胞分析或以细胞为基础的分析(cell based assay)测定。沉默调节蛋白-活化化合物可诱导沉默调节蛋白的脱乙酰基酶活性，相对于相同浓度的白藜芦醇大至少约10%、30%、50%、80%、2倍、5倍、10倍、50倍或100倍。沉默调节蛋白的调节性化合物可具有对于调节SIRT5的ED50值，较对于调节SIRT1和/或SIRT3的ED50值大至少约10倍、20倍、30倍、50倍。
3.例举性用途
在一些方面，本发明提供用于调节沉默调节蛋白的水平和/或活性的方法，及其使用方法。
在一些实施方式中，本发明提供增加细胞中沉默调节蛋白-1活性的方法，包括将所述细胞与以下结构式中任一个代表的化合物接触的步骤：(XL)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)，包括结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)和(XXI)中任一个的化合物。
在一些实施方式中，本发明提供使用沉默调节蛋白的调节性化合物的方法，其中沉默调节蛋白的调节性化合物活化沉默调节蛋白，例如增加沉默调节蛋白的水平和/或活性。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于各种治疗应用，包括例如增加细胞寿命，及治疗和/或预防许多种疾病与病症，包括例如与老化或应激有关的疾病或病症、糖尿病、肥胖、神经变性疾病、心血管疾病、血液凝结病症、炎症、癌症和/或潮红等。该方法包含将药学上有效量的沉默调节蛋白的调节性化合物，例如沉默调节蛋白的活化化合物给药于对其有需要的患者。
虽然申请人不希望受限于理论，但相信本发明的活化剂可在沉默调节蛋白内的相同部位(例如，活性位置或影响该活性位置的Km或Vmax的位置)与沉默调节蛋白相互作用。认为此即一些类沉默调节蛋白的活化剂与抑制剂为何能具有实质结构相似性的原因。
在一些实施方式中，本文中所述的沉默调节蛋白的调节性化合物可单独使用或与其它化合物组合使用。在一个实施方式中，可将两种或更多种沉默调节蛋白的调节性化合物的混合物给药于对其有需要的受治疗者。在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可与一种或多种下列化合物一起给药：白藜芦醇、紫铆花素、非瑟素、白皮杉醇(piceatannol)或槲皮素。在一个例举性的实施方式中，将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物与烟酸组合给药。在另一个实施方式中，减少(decrease)沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可与一种或多种下列化合物一起给药：烟酰胺(NAM)、舒拉宁(suranim)；NF023(一种G-蛋白拮抗剂)；NF279(一种嘌呤能受体拮抗剂)；托洛索(Trolox)(6-羟基-2,5,7,8,四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸)；(-)-表没食子儿茶精(羟基位于位置3,5,7,3',4',5')；(-)-表没食子儿茶精没食子酸酯(羟基位置5,7,3',4',5'，且没食子酸酯位于位置3)；氯化花青素(3,5,7,3',4'-五羟基氯化黄
Figure BDA00002598264500311
盐)；氯化翠雀色素(3,5,7,3',4',5'-六羟基氯化黄
Figure BDA00002598264500312
盐)；杨梅黄酮(大麻双酮；3,5,7,3',4',5'-六羟基黄酮)；3,7,3',4',5'-五羟基黄酮；棉黄素(3,5,7,8,3',4'-六羟基黄酮)、瑟汀诺(sirtinol)；及斯托米辛(splitomicin)。在另一实施方式中，一种或多种沉默调节蛋白的调节性化合物可与一种或多种用于治疗或预防各种疾病包括例如癌症、糖尿病、神经变性疾病、心血管疾病、血液凝结、炎症、潮红、肥胖、老化、应激等的治疗剂一起进行给药。在多种实施方式中，包含沉默调节蛋白的调节性化合物的组合疗法可涉及(1)包含一种或多种沉默调节蛋白的调节性化合物与一种或多种治疗剂(例如，一种或多种于本文中所描述的治疗剂)的药物组合物；及(2)一种或多种沉默调节蛋白的调节性化合物与一种或多种治疗剂的共同给药，其中所述沉默调节蛋白的调节性化合物与治疗剂尚未配制在同一组合物中(但是可存在于相同试剂盒或包装，例如泡罩包装或其它多隔室包装内；存在于可由使用者自行分开的相连结的、分别密封的容器(例如锡箔小袋)内；或存在于其中沉默调节蛋白的调节性化合物与其它治疗剂处于分开的容器中的试剂盒内)。当使用分开的制剂时，沉默调节蛋白的调节性化合物可与另一治疗剂的给药同时、间歇、交错、在其之前、在其之后，或这些方式的组合进行给药。
在一些实施方式中，使用沉默调节蛋白的调节性化合物以减轻、预防或治疗疾病或病症的方法，也可包括增加沉默调节蛋白(例如人SIRT1、SIRT2和/或SIRT3，或其同系物)的蛋白水平。增加蛋白水平可通过将编码沉默调节蛋白的一个或多个核酸拷贝引入细胞中而完成。例如，可通过将编码沉默调节蛋白的核酸引入哺乳动物细胞中，而增加哺乳动物细胞中沉默调节蛋白的水平，例如通过将编码列示于GenBank登录编号NP_036370中的氨基酸序列的核酸引入，而增加SIRT1的水平，和/或通过将编码列示于GenBank登录编号AAH01042中的氨基酸序列的核酸引入，而增加SIRT3的水平。
经引入细胞中以增加沉默调节蛋白水平的核酸，可编码与沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3蛋白)的序列至少约80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的蛋白。例如，编码该蛋白的核酸可与编码SIRT1(例如GenBank登录编号NM_012238)和/或SIRT3(例如GenBank登录编号BC001042)蛋白的核酸至少约80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。核酸也可为优选于严格杂交条件下与编码野生型沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3蛋白)的核酸杂交的核酸。严格杂交条件可包括在0.2×SSC中于65℃下杂交并且清洗。当使用编码与野生型沉默调节蛋白不同的蛋白(例如其为野生型沉默调节蛋白的片段的蛋白)的核酸时，该蛋白优选是生物学活性的，例如能够进行脱乙酰基化作用。仅需要在细胞中表达沉默调节蛋白具有生物学活性的部分。例如，与具有GenBank登录编号NP_036370的野生型SIRT1不同的蛋白，优选含有其核心结构。该核心结构有时指GenBank登录编号NP_036370的氨基酸62-293，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸237至932编码，其包含NAD结合以及底物结合结构域。SIRT1的核心结构域也可指GenBank登录编号NP_036370的大约氨基酸261至447，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸834至1394所编码；指GenBank登录编号NP_036370的大约氨基酸242至493，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸777至1532所编码；或指GenBank登录编号NP_036370的大约氨基酸254至495，其由GenBank登录编号NM_012238的核苷酸813至1538所编码。可根据本领域已知的方法测定蛋白是否保留生物功能，例如脱乙酰基化能力。
在一些实施方式中，使用沉默调节蛋白的调节性化合物以减轻、预防或治疗疾病或病症的方法，也可包括降低沉默调节蛋白(例如人SIRT1、SIRT2和/或SIRT3，或其同系物)的蛋白水平。降低沉默调节蛋白水平可根据本领域已知的方法实现。例如，可于细胞中表达靶向沉默调节蛋白的siRNA、反义核酸或核酶。也可使用显性阴性(dominant negative)的沉默调节蛋白的突变体，例如不能进行脱乙酰基化的突变体。例如，可使用经描述于例如Luo等人(2001)Cell 107：137中的SIRT1突变体H363Y。或者，可使用抑制转录作用的试剂。
用于调节沉默调节蛋白水平的方法也包括调节编码沉默调节蛋白的基因转录作用的方法，稳定化/去稳定化相对应mRNA的方法，及本领域已知的其它方法。
老化/应激
在一个实施方式中，本发明提供通过将细胞与本发明的增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物接触，而延长细胞寿命、增加细胞增生能力、减缓细胞老化、促进细胞存活、延迟细胞衰老、模拟摄热量限制功效、增加细胞对应激的抗性或防止细胞凋亡的方法。在一个例举性的实施方式中，该方法包含将细胞与沉默调节蛋白-活化化合物接触。
本文所述的方法可用于增加细胞、特别是初生细胞(即得自生物体，例如人的细胞)在细胞培养物中可保持存活的时间量。胚胎干细胞(ES)与多潜能细胞(pluripotent cell)及由其分化的细胞，也可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物来处理，以使细胞或其子代在培养物中保持较长的时间。此类细胞也可用于例如在进行离体修饰(ex vivomodification)后移植入受治疗者中。
在一个实施方式中，可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物处理要长时间保存的细胞。细胞可存在于悬浮液(例如血细胞、血清、生物学生长培养基等)中，或存在于组织或器官中。例如，可用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物处理收集自个体的供输血的血液，使血细胞保存较长的时间。此外，用于法医目的的血液也可使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物进行保存。其它可经处理以延长其寿命或保护其对抗凋亡的细胞，包括供消耗的细胞例如得自非人哺乳动物的细胞(例如肉类)，或植物细胞(例如蔬菜)。
也可在哺乳动物、植物、昆虫或微生物的发育及生长期施用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以例如改变、减缓或加速发育和/或生长过程。
在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于处理用于供移植或细胞疗法的细胞，包括例如固体组织移植物、器官移植物、细胞悬浮液、干细胞、骨髓细胞等。细胞或组织可为自体移植物、同种异基因移植物(allograft)、同种同基因移植物(syngraft)或异种移植物。可将细胞或组织于给药/植入之前、于给药/植入的同时、和/或于给药/植入受治疗者之后，以沉默调节蛋白的调节性化合物进行处理。可将细胞或组织于从供给者个体取出之前、于从供给者个体取出后离体地(exvivo)、或于植入接受体之后进行处理。例如，可用沉默调节蛋白的调节性化合物对供给者或接受体个体进行全身性处理，或用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物对细胞/组织的亚型(subset)进行局部性处理。在一些实施方式中，可另外地用另一种用于延长移植物存活的治疗剂，例如免疫抑制剂、细胞因子、血管生成因子等处理细胞或组织或供给者/接受者个体。
在其它的实施方式中，可在体内用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物处理细胞，以增加其寿命或防止细胞凋亡。例如，可通过用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物来处理皮肤或表皮细胞，而保护皮肤以防老化(例如，形成皱纹、丧失弹性等)。在一个例举性的实施方式中，将皮肤与包含增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物的药物组合物或化妆品组合物接触。可根据本文所述方法处理的例举性皮肤疾病或皮肤病症，包括与炎症、晒伤或自然老化相关或由其引起的病症或疾病。例如，组合物可用于预防或治疗接触性皮炎(包括刺激性接触性皮炎与过敏性接触性皮炎)、特应性皮炎(也称作变应性湿疹)、光化性角化病、角质化病症(包括湿疹)、大疱性表皮松解病(包括天疱疮(penfigus))、剥脱性皮炎、脂溢性皮炎、红斑(包括多形红斑与结节性红斑)、由日晒或其它光源引起的损伤、盘状红斑性狼疮、皮肌炎、牛皮癣、皮肤癌及自然老化作用。在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗创伤和/或烧伤以促进愈合，包括例如第一度、第二度或第三度烧伤和/或热烧伤、化学烧伤或电烧伤。可将制剂局部地给药至皮肤或粘膜组织。
包含一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物的局部制剂，也可用作为预防性(例如化学预防性)组合物。当使用于化学预防性方法中时，在特定个体中出现可见病症之前处理易感染的皮肤。
可将沉默调节蛋白的调节性化合物局部或全身性地递送至受治疗者。在一个实施方式中，通过注射、局部制剂等，将沉默调节蛋白的调节性化合物局部地给药至受治疗者的组织或器官。
在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防因受治疗者中细胞衰老所诱发或加重的疾病或病症；用于减低受治疗者衰老速度(例如在开始衰老之后)的方法；用于延长受治疗者寿命的方法；用于治疗或预防与寿命有关的疾病或病症的方法；用于治疗或预防与细胞增殖能力有关的疾病或病症的方法；及用于治疗或预防由细胞损伤或死亡所导致的疾病或病症的方法。在一些实施方式中，该方法并非通过减低那些缩短受治疗者寿命的疾病的发生率而起作用。在一些实施方式中，该方法并非通过减低由疾病(例如癌症)所引起的致死率而起作用。
在又一个实施方式中，为了一般性地增加受治疗者的细胞寿命以及为了保护其细胞对抗应激和/或对抗凋亡的目的，可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于受治疗者。可以相信以本文所述的化合物治疗受治疗者，类似于使受治疗者经历毒物刺激作用(hormesis)即，对生物体有益且可延长其寿命的温和应激。
可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于受治疗者，以预防老化及与老化有关的后果或疾病，例如中风、心脏病、心脏衰竭、关节炎、高血压及阿尔茨海默病。其它可被治疗的病症包括眼疾病，例如与眼睛老化有关的眼病症，例如白内障、青光眼及黄斑变性。也可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于受治疗者，用来治疗与细胞死亡有关的疾病，例如慢性疾病，以保护细胞不死亡的目的。例举性疾病包括那些与神经细胞死亡、神经元功能障碍、或肌肉细胞死亡或功能障碍有关的疾病，例如帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化(amniotropic lateral sclerosis)与肌肉营养不良；AIDS；暴发性肝炎；与脑退化相关的疾病，例如克-雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、色素性视网膜炎与小脑变性；脊髓发育不良例如再生障碍性贫血；缺血性疾病例如心肌梗塞与中风；肝病例如酒精性肝炎、乙型肝炎与丙型肝炎；关节疾病例如骨关节炎；动脉粥样硬化；脱发；由UV光引起的皮肤损伤；扁平苔藓；皮肤萎缩；白内障；以及移植物排斥。细胞死亡也可由手术、药物治疗、化学品接触或放射接触所引起。
也可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于患有急性疾病，例如器官或组织伤害的受治疗者，例如患有中风或心肌梗塞的受治疗者，或罹患脊髓损伤的受治疗者。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于修复酒精性肝(alcoholic’liver)。
心血管疾病
在另一个实施方式中，本发明提供一种治疗和/或预防心血管疾病的方法，其系通过将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于有需要的受治疗者。
可使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物治疗或预防的心血管疾病，包括心肌病或心肌炎，例如特发性心肌病、代谢性心肌病、酒精中毒性心肌病、药物引发的心肌病、缺血性心肌病及高血压性心肌病。也可使用本文所述化合物与方法治疗或预防的疾病，例如主动脉、冠状动脉、颈动脉、脑血管动脉、肾动脉、髂动脉、股动脉及腘动脉(popliteal arter ies)等主要血管的粥样硬化病症(大血管疾病)。其它可被治疗或预防的血管疾病，包括那些与血小板聚集、视网膜小动脉、肾小球小动脉(glomerular arteriole)、神经滋养血管(vasa nervorum)、心小动脉，及眼、肾脏、心脏与中枢及周围神经系统相关的毛细血管床相关的血管疾病。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于增加个体血浆内的HDL水平。
可以用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物治疗的其它病症，包括再狭窄(例如在冠状动脉介入治疗后)，及与异常高密度及低密度胆固醇水平有关的病症。
在一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以作为组合疗法的一部分与另一种心血管药剂一起给药。在一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以作为组合疗法的一部分与抗-心率失常药剂一起给药。在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可以作为组合疗法的一部分与其它心血管药剂一起给药。
细胞死亡/癌症
沉默调节蛋白的调节性化合物给药于最近已接受或可能将接受一定剂量辐射或毒素的受治疗者。在一个实施方式中，接受辐射或毒素的剂量作为工作相关程序或医药程序的一部分，例如作为预防措施(prophylactic measure)给药。在另一个实施方式中，非故意地接受辐射或毒素的暴露。在这种情况下，优选在暴露后尽快给药所述化合物，以抑制细胞凋亡及后续发展成急性辐射综合征。
沉默调节蛋白-调节化合物还可以用于治疗和/或预防癌症。术语“癌症”、“肿瘤”和“瘤”在本文中可互换使用。本文所用的癌症(肿瘤或瘤)特征在于一种或多种以下性质：细胞生长不受环境中的正常生化和物理影响调节；间变(例如，缺乏正常协同的细胞分化)；并且在一些情况下，转移。可以通过本发明的沉默调节蛋白-调节化合物治疗和/或预防的癌疾病包括，例如肛癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、子宫内膜癌、毛细胞白血病、头颈癌、肺(小细胞)癌、多发性骨髓瘤、非-霍奇金淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、卵巢癌、脑瘤、结肠直肠癌、肝细胞癌，卡波西肉瘤、肺(非-小细胞)癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌和软组织肉瘤。其它癌症可见于例如，Isselbacher等，(1994)Harrison's Principles of InternalMedicine 1814-1877，本文引入作为参考。
在一些实施方式中，增加沉默调节蛋白(例如SIRT1)的水平和/或活性，或降低沉默调节蛋白(例如SIRT2)的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗和/或预防癌症。摄热量限制已经与年龄相关的病症(包括癌症)的发生率的减少相关联。于是，增加或降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的所述化合物可用于治疗和/或预防年龄相关病症(例如癌症)的发生率。在与实体肿瘤有关的癌症中，可将调节性化合物直接给药于该肿瘤。血液细胞的癌症(例如白血病)可通过将调节性化合物给药至血流中或骨髓中而进行治疗。也可治疗良性细胞生长例如疣。可被治疗的其它疾病包括自体免疫疾病，例如全身性红斑狼疮、硬皮病及关节炎，其中应将自体免疫细胞去除。也可通过给药沉默调节蛋白的调节性化合物，治疗与病毒感染(例如疱疹、HIV、腺病毒及HTLV-1)有关的恶性与良性病症。或者，可自受治疗者获取细胞，经体外处理以去除一些不希望的细胞(例如癌细胞)，并再给药于相同或不同的受治疗者。
也可将化学治疗剂与本文所述具有抗癌活性的调节性化合物，例如诱发细胞凋亡的化合物、减短寿命的化合物或使细胞对应激敏感的化合物共同给药。化学治疗剂本身可与本文所述可诱发细胞死亡或减短寿命或增加对应激敏感的沉默调节蛋白-调节性化合物，和/或与其它化学治疗剂组合使用。除了常规化学治疗剂之外，本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物也可与反义RNA、RNAi，或其它抑制会引起不希望细胞增殖的细胞组分表达的多核苷酸一起使用。
包含沉默调节蛋白的调节性化合物与常规化学治疗剂的组合疗法，可能优于本领域已知的组合疗法，因为该组合可使常规化学治疗剂在较低剂量下起更大功效。在优选的实施方式中，对于化学治疗剂或常规化学治疗剂的组合的有效剂量(ED50)而言，当与沉默调节蛋白的调节性化合物组合使用时，相较于单独的该化学治疗剂的ED50低至少2倍，且甚至更优选低5倍、10倍或甚至25倍。反之，对于此类化学治疗剂或此类化学治疗剂的组合的治疗指数(TI)而言，当与本文所述沉默调节蛋白的调节性化合物组合使用时，相较于单独的常规化学治疗方案的TI高至少2倍，且甚至更优选地高5倍、10倍或甚至25倍。
神经元疾病/病症
在一些方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗患有神经变性疾病，及中枢神经系统(CNS)、脊髓或周围神经系统(PNS)的创伤或机械性损伤的患者。神经变性疾病通常涉及人脑部质量与体积的减少，其可能由于脑细胞萎缩和/或死亡所致，这比健康人因老化所引起的人脑部质量与体积的减少影响更大。神经变性疾病可在执行长期正常脑功能后，由于特定脑区域的渐进性退化(例如神经细胞功能不足及死亡)而逐渐进展。另一方面，神经变性疾病可快速发作(onset)，例如那些与创伤或毒素相有关的神经变性疾病。脑退化的实际发作可能较临床表达早许多年。神经变性疾病的实例包括(但不限定于)阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS；罗杰里格氏病(Lou Gehrig’sdisease))、弥散性路易体病(diffuse Lewy body disease)、舞蹈病-棘红细胞增多症、原发性侧索硬化、眼疾病(眼神经炎)、化学疗法诱发的神经病变(例如来自长春新碱、紫杉醇、硼替佐米(bortezomib))、糖尿病诱发的神经病变及佛里德赖希共济失调。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗这些病症及如下文所描述的其它病症。
AD为导致记忆丧失、异常行为、个性改变及思考能力衰退的CNS病症。这些丧失与特定类型的脑细胞死亡、及脑细胞间的连结与其支撑网络(例如神经胶质细胞)损坏有关。最早期症状包括丧失最近的记忆、错误判断及个性改变。PD为导致身体运动不受控制、僵硬、颤抖及运动障碍的CNS病症，与脑部制备多巴胺的区域中的脑细胞死亡关联。ALS(运动神经元疾病)为攻击运动神经元(CNS中将脑与骨骼肌连结的组分)的CNS病症。
HD为另一种引起运动不受控制、智力丧失及情绪失调的神经变性疾病。泰-萨病(Tay-Sachs disease)与桑德霍夫病，是其中GM2神经节苷脂与β-氨基己糖苷酶(hexosaminidase)的相关糖脂类底物累积于神经系统中并引发急性神经变性的糖脂储存疾病(glycolipid storage diseases)。
已熟知，细胞凋亡在免疫系统的AIDS病变方面起作用。然而，HIV-1也诱发可以用本发明的沉默调节蛋白的调节性化合物治疗的神经学疾病。
神经元丧失(neuronal loss)也为朊病毒病(prion diseases)(例如人克-雅病、牛BSE(疯牛病)、绵羊与山羊的瘙痒病及猫的猫类海绵状脑病(FSE))的突出特征。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防由这上述朊病毒病引起的神经元丧失。
在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防任何涉及轴突病(axonopathy)的疾病或病症。远端轴突病为一类由周围神经系统(PNS)神经元的某种代谢或毒性错乱所产生的周围神经病。其为神经对代谢或毒性紊乱的最通常响应，而因此可能由代谢性疾病例如糖尿病、肾衰竭、缺乏综合征例如营养不良及酒精中毒，或由毒素或药物的作用所引起。那些患有远端轴突病的患者通常呈现对称性手套-袜样感觉-运动紊乱。在受影响区域也发生深层腱反射及自主神经系统(ANS)功能丧失或缩减。
糖尿病性神经病变为与糖尿病有关的神经病症。可能与糖尿病性神经病变有关的较常见病症包括第三神经麻痹；单一神经病变；多发性单神经炎；糖尿病性肌肉萎缩；疼痛性多神经病；自主神经病；及胸腹神经病。
周围神经病变为用于对周围神经系统的神经损伤的医学术语，其可能是由神经疾病，或由全身性疾病的副作用所引起。周围神经病变的主要原因包括癫痫发作、营养缺乏及HIV，虽然糖尿病是最可能的原因。
在一个例举性的实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防多发性硬化(MS)，包括复发性MS与单症状MS，及其它脱髓鞘病症(demyelinating condition)，例如慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)或与其有关的病症。
在又另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于治疗神经创伤，包括由于疾病、损伤(包括手术介入)或环境创伤(例如神经毒素、酒精中毒等)所引起的创伤。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于预防、治疗及缓解各种PNS病症的症状。术语“周围神经病变”涵括广范围的位于脑与脊髓外部的神经(即周围神经)已经受损的病症。周围神经病变也可指周围神经炎，或者如果涉及许多神经时，可使用术语多神经病或多神经炎。
可以用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物治疗的PNS疾病包括：糖尿病、麻疯、进行性神经病性肌萎缩、格林-巴利综合征和壁神经丛神经病(Brachial Plexus Neuropathy)(颈与第一胸根、神经干、索(cord)及臂神经丛的周围神经组分的疾病)。
在另一个实施方式中，沉默调节蛋白的活化化合物可用于治疗或预防多谷氨酰胺疾病。例举性多谷胺酰胺疾病包括脊髓延髓肌肉萎缩(肯尼迪病)、亨廷顿病(HD)、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(dentatorubral-pallidoluysian atrophy)(郝乌河综合征(Haw River syndrome))、1型脊髓小脑性共济失调、2型脊髓小脑性共济失调、3型脊髓小脑性共济失调(马-约病)、6型脊髓小脑性共济失调、7型脊髓小脑性共济失调及17型脊髓小脑性共济失调。
在一些实施方式中，本发明提供治疗中枢神经系统细胞以防止因响应于血液流向细胞减低所引起的伤害的方法。通常可被预防的伤害严重度，将大部分取决于血液流向细胞的减低程度及减少的持续时间。在一个实施方式中，可预防凋亡性或坏死细胞死亡。在再一个实施方式中，可预防缺血所介导的伤害，例如细胞毒性水肿或中枢神经系统组织缺氧血症。在各实施方式中，中枢神经系统细胞可为脊髓细胞或脑细胞。
另一方面包括将沉默调节蛋白的活化化合物给药于受治疗者，以治疗中枢神经系统缺血性病症。有许多中枢神经系统缺血性病症可由本文所述的沉默调节蛋白的活化化合物治疗。在一个实施方式中，缺血性病症为导致任何类型缺血性中枢神经系统损伤，例如凋亡性或坏死性细胞死亡、细胞毒性水肿或中枢神经系统组织缺氧的中风。中风可能冲击脑部任何区域，或由任何一般已知会导致中风发生的病因所引起。在该实施方式的另一选择中，中风为脑干中风。在本实施方式的另一选择中，中风为小脑中风。在本实施方式的另一选择中，中风为栓塞性中风(embolic stroke)。在本实施方式的另一选择中，中风为出血性中风。在其它实施方式中，中风为血栓性中风。
在另一方面，可给药沉默调节蛋白的活化化合物，以在中枢神经系统缺血性病症后减少缺血核心的梗塞大小。而且，也可有益地给药沉默调节蛋白的活化化合物，以在中枢神经系统缺血性病症后，减少缺血性半影或过渡区域的大小。
在一个实施方式中，组合药物疗法可包括用于治疗或预防神经变性性病症、或与这些病症有关的继发病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种沉默调节蛋白的活化剂与一种或多种抗-神经变性药物。
血液凝结病症
在其它方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防血液凝结病症(或止血病症)。如可交换地用于本文，术语“止血”、“血液凝结”及“血液凝结(clotting)”是指控制流血，包括血管收缩与凝结的生理特性。血液凝结协助维持哺乳动物在受伤、炎症、疾病、先天缺陷、功能障碍或其它破坏(disruption)后的循环完整性。而且，血块的形成在受伤的情况中不仅限制出血(止血作用)，也可能在动脉粥样硬化疾病方面，因阻塞重要动脉或静脉而导致严重器官损伤及死亡。因此血栓是在错误时间及地点形成的血液凝块。
于是，本发明提供目的在于抑制血液凝块形成，以预防或治疗血液凝结病症，例如心肌梗塞、中风、因周围动脉疾病的肢体损失或肺栓塞的抗凝结与抗血栓治疗。
本文可交换地使用的术语“调制止血”及“调节止血”包括诱导(例如刺激或增加)止血，也包括抑制(例如减低或减少)止血。
在一方面，本发明提供通过给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以减低或抑制受治疗者中止血的方法。本文所公开的组合物或方法可用于治疗或预防血栓形成疾病。本文使用的术语“血栓形成病症”包括以过量或不希望的凝血或止血活性，或凝固性过高的状态为特征的任何病症或疾病。血栓形成疾病包括涉及血小板粘附与血栓形成的疾病或病症，且可能显示为形成血栓的可能性增加，例如形成血栓数量增加、在低年龄期(early age)出现血栓形成、血栓形成的家族性倾向(familialtendency towards thrombosis)及在罕见部位(unusual site)出现血栓形成。
在另一个实施方式中，组合药物疗法可包括用于治疗或预防血液凝结病症，或与这些病症有关的继发病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，与一种或多种抗凝结或抗血栓形成药物。
体重控制
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防受治疗者的体重增加或肥胖。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于例如治疗或预防遗传性肥胖症、饮食性肥胖症、激素相关的肥胖症、与给药药物有关的肥胖症，用于减轻受治疗者体重或防止受治疗者体重增加。需要此类治疗的受治疗者可为其已经肥胖、有可能变成肥胖、过重或有可能变成过重的受治疗者。可能变成肥胖或过重的受治疗者，可例如基于家族历史、遗传学、饮食、活动程度、药物摄取或其各种不同组合来确定。
在其它的实施方式中，可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物给药于患有各种可通过促进受治疗者的体重减轻而治疗或预防的其它疾病与病症。此类疾病包括例如高血压、血压过高、高血胆固醇、血脂异常、II型糖尿病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高胰岛素血症、冠心病、心绞痛、充血性心力衰竭、中风、胆结石、胆囊炎与胆石病、痛风、骨关节炎、阻碍性睡眠呼吸暂停与呼吸问题、一些类型癌症(例如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌与结肠癌)、妊娠并发症、雌性生殖健康变差(例如月经不规则、不孕、不规则排卵)、膀胱控制问题(例如压迫性尿失禁)；尿酸肾石病；精神性病症(例如忧郁、进食障碍病(eating disorders)、体象障碍与自尊降低)。最后，患有AIDS的患者会对于AIDS的组合疗法响应，而发展成脂肪营养障碍或胰岛素抵抗。
在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于在体外或体内抑制脂肪形成或脂肪细胞分化。此类方法可用于治疗或预防肥胖症。
在其它实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减低食欲和/或增加饱食感，藉此引起体重减轻或避免体重增加。需要此类治疗的受治疗者可为已经过重、肥胖的受治疗者，或有可能变成过重或肥胖的受治疗者。该方法包含将一定剂量(例如呈丸剂(pill)的形式)每日或每二日或一周一次给药于受治疗者。该剂量可为“食欲减低剂量”。
在一个例举性的实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以以治疗或预防体重增加或肥胖症的组合疗法进行给药。例如，可将一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物与一种或多种抗肥胖剂组合给药。
在另一个实施方式中，可给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以减低由药物引发的体重增加。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，能够与可以刺激食欲或引起体重增加(尤其是由于除了保留水分以外的因素引起的体重增加)的药物通过组合疗法进行给药。
代谢病症/糖尿病
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防代谢病症，例如胰岛素抵抗、前期糖尿病、II型糖尿病、和/或其并发症。增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物的给药可增加受治疗者的胰岛素敏感性和/或减低胰岛素水平。需要此类治疗的受治疗者可为具有胰岛素抵抗或II型糖尿病的其它前驱症状(precursor symptom)、具有II型糖尿病或有可能发展任何这些病症的受治疗者。例如，该受治疗者可为具有胰岛素抵抗，例如具有高胰岛素循环水平和/或相关联病症，例如高血脂症、脂肪生成障碍、高胆固醇血症、葡萄糖耐受不良、高血糖水平、综合征X的其它表征、高血压、动脉粥样硬化及脂肪代谢障碍的受治疗者。
在一个例举性的实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以以治疗或预防代谢病症的组合疗法进行给药。例如，可将一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物与一种或多种抗-糖尿病剂组合给药。
炎性疾病
在另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防与炎症有关的疾病或病症。可于引发炎症发作前、发作时或发作之后给药增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物。当预防性使用时，该化合物优选在任何炎症反应或症状之前给药。该化合物的给药可预防或减弱炎症反应或症状。
在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防变态反应及呼吸病症，包括哮喘、支气管炎、肺纤维化、过敏性鼻炎、氧气毒性、肺气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合征及任何慢性闭塞性肺病(COPD)。该化合物可用于治疗肝炎感染，包括乙型肝炎及丙型肝炎。
此外，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗自体免疫疾病，和/或与自体免疫疾病有关的炎症，例如器官-组织自身免疫疾病(例如雷诺得氏综合征)、硬皮病、重症肌无力、移植排斥、内毒素休克、脓毒病、牛皮癣、湿疹、皮炎、多发性硬化、自身免疫甲状腺炎、葡萄膜炎、全身性红斑狼疮、阿狄森病、自身免疫多腺疾病(也称为自身免疫多腺综合征)及格雷夫斯病。
在一些具体实施方式中，一种或多种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白-调节性化合物可单独使用，或与用于治疗或预防炎症的其它化合物组合使用。
潮红
另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减低其为病症的症状的潮红和/或热潮红(hot flash)的发生率或严重性。例如，主题方法(subject method)包括使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白-调节性化合物，单独或与其它药剂组合使用，以减低癌症患者的潮红和/或热潮红的发生率或严重性。在其它实施方式中，该方法提供使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物以减低绝经及绝经后妇女的潮红和/或热潮红的发生率或严重性。
另一方面，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用作减低作为另一种药物疗法的副作用的潮红和/或热潮红(例如，药物-诱发的潮红)的发生率或严重度的疗法。在一些实施方式中，用于治疗和/或预防药物-诱发的潮红的方法包括将含有至少一种诱发潮红的化合物与至少一种增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物的制剂给药于有需要的患者。在其它实施方式中，用于治疗药物所诱发的潮红的方法包括，分别给药一种或多种诱发潮红的化合物与一种或多种沉默调节蛋白的调节性化合物，例如其中沉默调节蛋白的调节性化合物与潮红诱发药物未经配制于同一组合物中。当使用分开的制剂时，可将沉默调节蛋白的调节性化合物(1)在与潮红诱发药物的给药的同时给药，(2)与潮红诱发药物一起周期性地给药，(3)与潮红诱发药物错开给药，(4)在潮红诱发药物给药之前给药，(5)于潮红诱发剂给药之后给药，及(6)以其各种不同组合进行给药。例举性潮红诱发药物包括例如烟酸、雷洛昔芬(faloxifene)、抗忧郁剂、抗-精神病药、化学治疗剂、钙通道阻断剂及抗生素。
在一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少血管扩张剂或抗血脂药(包括抗胆固醇血药物与抗脂肪肝药)的潮红副作用。在一个例举性的实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少与给药烟酸有关的潮红。
在另一个实施方式中，本发明提供治疗和/或预防高血脂症并减低潮红副作用的方法。在另一代表性的实施方式中，该方法包括使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以减少雷洛昔芬的潮红副作用。在另一代表性的实施方式中，该方法包括使用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，以减少抗忧郁药或抗精神病药的潮红副作用。举例而言，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可与5-羟色胺再吸收抑制剂，或5HT2受体拮抗剂共同使用(分开或一起给药)。
在一些实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用作5-羟色胺再吸收抑制剂(SRI)的治疗的一部分以减少潮红。在另一代表性的实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少化学治疗剂如环磷酰胺及他莫昔芬的潮红副作用。
在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少钙通道阻断剂如氨氯地平的潮红副作用。
在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于减少抗生素的潮红副作用。例如，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可与左氧氟沙星组合使用。
眼病症
本发明的一方面为用于抑制、减低或治疗视力损伤的方法，该方法通过将治疗剂量的选自本文所公开化合物的沉默调节蛋白的调节剂或其药学上可接受的盐、前药或代谢衍生物给药于患者。
在本发明的一些方面，视力损伤是由于对视神经或中枢神经系统的伤害所引起。在具体的实施方式中，视神经伤害由高眼内压(例如由青光眼引起的高眼内压)所引起。在其它特别的实施方式中，视神经伤害由神经肿胀(swelling)(其往往与感染或免疫(例如自身免疫)反应(如在视神经炎中)所引起。
在本发明的一些方面，视力损伤由视网膜的伤害所引起。在具体的实施方式中，视网膜的伤害由流向眼睛的血流中的障碍(例如，动脉粥样硬化、血管炎)所引起。在具体的实施方式中，视网膜的伤害是由黄斑破坏(disruptionof macula)(例如，渗出性或非渗出性黄斑变性)所引起。
例举性视网膜的疾病包括渗出性年龄相关的黄斑变性、非渗出性年龄相关的黄斑变性、视网膜电子假体和RPE移植年龄相关的黄斑变性、急性多病灶板状色素上皮病、急性视网膜坏死、先天性黄斑变性、视网膜分支动脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、癌症关联和相关的自身免疫视网膜病、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、中心性浆液性脉络膜视网膜病变(central serous chorioretinopathy)、伊尔斯病、黄斑前膜(epimacular membrane)、点阵变性、巨动脉瘤、糖尿病性黄斑水肿、艾尔温-盖斯黄斑水肿、黄斑裂孔(macular hole)、视网膜下新血管膜、弥散性单侧亚急性视神经视网膜炎、非假晶状体囊样黄斑水肿(nonpseudophakic cystoid macular edema)、眼假组织胞浆菌病综合征(presumed ocular histoplasmosis syndrome)、渗出性视网膜脱离、手术后视网膜脱离、增生性视网膜脱离、孔源性视网膜脱离、牵引性(tractional)视网膜脱离、色素性视网膜炎、CMV视网膜炎、成视网膜细胞瘤、早熟性视网膜病、散弹状视网膜病(birdshot retinopathy)、背景性糖尿病性视网膜病、增生性糖尿病性视网膜病、血红蛋白病性视网膜病、普尔沙视网膜病、瓦尔萨尔瓦视网膜病、青年性视网膜劈裂症(juvenile retinoschisis)、老年性视网膜劈裂症、泰尔松综合征及白点综合征(white dot syndromes)。
其它例举性疾病包括眼细菌感染(例如，结膜炎、角膜炎、结核病、梅毒、淋病)、病毒感染(例如眼单纯疱疹病毒(ocular herpes simplex Virus)、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒视网膜炎、人免疫缺陷病毒(HIV))以及继发于HIV或其它HIV-关联及其它免疫缺陷-关联性眼疾病的进行性外部视网膜坏死。此外，眼疾病包括真菌感染(例如念珠菌性脉络膜炎(Candida choroiditis)、组织胞浆菌病)、原生动物感染(例如弓形体病)及其它例如眼弓蛔虫病与肉样瘤病(sarcoidosis)。
本发明的一方面为用于抑制、减低或治疗以化学治疗药物(例如，神经毒性药物、升高眼内压力的药物例如类固醇)治疗的受治疗者视力损伤的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的受治疗者。
本发明的另一方面为用于抑制、减低或治疗在进行手术包括眼或其它于俯卧位(prone position)的手术，例如脊髓手术时的受治疗者视力损伤的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的受治疗者。眼手术包括白内障、虹膜切开术和晶状体置换。
本发明的另一方面为治疗(包括抑制与预防性治疗)年龄相关的眼疾病，包括白内障、干眼症、年龄-相关的黄斑变性(AMD)、视网膜损害等的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的受治疗者。
本发明的另一方面为预防或治疗由应激、化学伤害或照射所引起的眼睛损伤的方法，其通过将治疗剂量的本文所公开的沉默调节蛋白的调节剂给药于有此类治疗需要的受治疗者。对眼睛的照射或电磁性损伤可包括由CRT或暴露于阳光或UV所引起的那些损伤。
在一个实施方式中，组合药物疗法可包括用于治疗或预防眼病症，或与这些病症有关的继发病症的药物或化合物。因此，组合药物疗法可包括一种或多种沉默调节蛋白的活化剂与一种或多种用于治疗眼病症的治疗剂。
在一个实施方式中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于减低眼内压力的疗法结合进行给药。在另一个实施方式中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防青光眼的疗法结合进行给药。在另一实施方式中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防视神经炎的疗法结合进行给药。在一个实施方式中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防CMV视网膜病的疗法结合进行给药。在另一个实施方式中，可将沉默调节蛋白的调节剂与用于治疗和/或预防多发性硬化的疗法结合进行给药。
线粒体-有关的疾病与病症
在一些实施方式中，本发明提供用于治疗因增加线粒体活性而获益的疾病或病症的方法。该方法包含将治疗上有效量的沉默调节蛋白的活化化合物给药于需要的受治疗者。增加线粒体活性是指在维持线粒体的总量(例如线粒体的质量)的同时增加线粒体的活性、增加线粒体的数量并因此增加线粒体的活性(例如，通过刺激线粒体的生物生成(biogenesis))，或其组合。在一些实施方式中，因增加线粒体活性而获益的疾病或病症，包括与线粒体功能障碍有关的疾病或病症。
在一些实施方式中，用于治疗因增加线粒体活性而获益的疾病或病症的方法可包括确定患有线粒体功能障碍的受治疗者。用于诊断线粒体功能障碍的方法可包括分子遗传学、病理学和/或生物化学分析。与线粒体功能障碍有关的疾病或病症包括这样的疾病和病症，其中线粒体的呼吸链活性不足导致哺乳动物中此类疾病或病症的病理生理学的发展。因增加线粒体活性而获益的疾病或病症一般包括例如，由自由基介导的氧化损伤导致的组织变性的疾病、细胞不适当地进行凋亡的疾病，及细胞无法进行凋亡的疾病。
在一些实施方式中，本发明提供用于治疗因增加线粒体活性而获益的疾病或病症的方法，该方法包括将一种或多种沉默调节蛋白的活化化合物与另一种治疗剂(例如可用于治疗线粒体功能障碍的药剂，或可用于减少与涉及线粒体功能障碍的疾病或病症有关的症状的药剂)组合给药于有需要的受治疗者。
在例举性的实施方式中，本发明提供用于治疗因增加线粒体活性而获益的疾病或病症的方法，通过将治疗上有效量的沉默调节蛋白的活化化合物给药于受治疗者。例举性疾病或病症包括例如神经肌肉病症(例如佛里德赖希共济失调、肌肉营养不良、多发性硬化等)、神经元不稳定性病症(例如癫痫发作、偏头痛(migrane)等)、发育迟缓、神经变性病症(例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化等)、缺血、肾小管性酸中毒、年龄相关的神经变性与认知衰退、化学疗法疲劳、年龄相关或化学疗法诱发的绝经或月经周期或排卵不规则、线粒体性肌病、线粒体损害(例如钙累积、兴奋性中毒、接触一氧化氮、缺氧等)及线粒体失调。
肌肉营养不良指一类涉及肌肉神经组织构造与功能恶化的疾病，其往往导致骨骼肌萎缩及心肌功能障碍，例如杜兴氏肌肉营养不良。在一些实施方式中，沉默调节蛋白的活化化合物可用于减低肌肉功能能力的衰退速率，及用于增强患有肌肉营养不良患者肌肉的功能状态。
在一些实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗线粒体性肌病。线粒体性肌病范围从外眼部肌肉的轻微缓慢进行性衰弱，到严重致命的婴儿期肌病与多系统脑脊髓病(encephalomyopathy)。一些综合征已经确定，它们之间有些重迭。影响肌肉的已确立的综合征包括进行性外眼肌麻痹、卡-塞综合征(具有眼肌麻痹、色素性视网膜病、心脏传导缺陷、小脑共济失调与感觉神经性耳聋)、MELAS综合征(线粒体性脑脊髓病、乳酸性酸中毒与类中风事件(stroke-like episodes))、MERFF综合征(肌阵挛型癫痫、不整齐的红纤维(ragged red fibers))、肢带分配衰弱(limb-girdle distribution weakness)及婴儿肌病(良性、重度与致死)。
在一些实施方式中，沉默调节蛋白的活化化合物可用于治疗患有对线粒体的毒性损害，例如由于钙累积、兴奋性中毒、一氧化氮接触、药物诱导的毒性损害或缺氧引起的毒性损害的患者。
在一些实施方式中，沉默调节蛋白的活化化合物可用于治疗与线粒体失调(mitochondrial deregulation)有关的疾病或病症。
肌肉性能
在其它实施方式中，本发明提供用于增强肌肉性能的方法，其通过给药治疗上有效量的沉默调节蛋白的活化化合物。例如，沉默调节蛋白的活化化合物可用于改善身体耐久力(例如，进行身体工作例如运动、体力劳动、运动活动等)、抑制或延迟身体疲劳、增加血液氧水平、增进健康个体的能量、加强工作能力与持久性、减少肌肉疲劳、减低压力、增强心脏与心血管功能、改善性能力、增加肌肉ATP水平和/或减少血液中的乳酸。在一些实施方式中，该方法包括给药一定量的增加线粒体活性、增进线粒体的生物生成和/或增加线粒体质量的沉默调节蛋白的活化化合物。
运动性能是指运动员的肌肉在参与运动活动时所完成的能力。所增强的运动效能、强度、速度及持久力，是通过肌肉收缩强度的增加、肌肉收缩幅度的增加、在刺激与收缩之间的肌肉反应时间的缩短而进行测量。运动员指以任何程度参与运动，以及寻求能在其机能上达到增进强度、速度与耐久力水平的个人，例如健身者(body builder)、自行车运动员、长跑运动员、短跑运动员等。所增强的运动效能由能克服肌肉疲劳的能力、保持较长时间活力的能力及具有更有效锻炼的能力显示。
在运动员肌肉性能的部位(arena)，期望产生允许在长期的更高耐性程度下进行比赛或训练的状况。
预期本发明的方法也有效于治疗肌肉相关的病理病症，包括急性肌肉减少症(acute sarcopenia)，例如肌肉萎缩和/或与烧伤、卧床、肢体固定术或大部分胸部、腹部和/或整形外科手术有关的恶病质。
在一些实施方式中，本发明提供包含沉默调节蛋白的调节剂的新型饮食组合物，其制备方法及使用该组合物以改善运动效能(performance)的方法。于是，本发明向涉及广泛定义的运动，包括需要耐力的运动与需要重复性肌肉运动的劳动的人们提供具有改善身体耐力和/或抑制身体疲劳的作用的治疗组合物、食品与饮料。此类饮食组合物可另外包含电解质、咖啡因、维生素、碳水化合物等。
其它用途
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于治疗或预防病毒感染(例如流行性感冒病毒、疱疹病毒或乳头状瘤病毒感染)或作为抗真菌剂。在一些实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可以作为组合药物疗法的一部分与另一种用于治疗病毒性疾病的治疗剂一起给药。在另一个实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，可作为组合药物疗法的一部分与另一种抗真菌剂一起给药。
可如本文所述进行治疗的受治疗者包括真核生物，例如哺乳动物例如人、羊类、牛类、马类、猪类、犬类、猫类、非人灵长类、小鼠及大鼠。可处理的细胞包括真核细胞，例如得自前述受治疗者的细胞，或植物细胞、酵母细胞及原核细胞例如细菌细胞。例如，可将调节性化合物给药于农场动物，以改善其能更长期承受农场条件的能力。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于增加植物寿命、应激抗性及对于细胞凋亡的抗性。在一个实施方式中，将化合物施予植物(例如以周期性为基础)，或施予真菌。在另一个实施方式中，植物经基因修饰以产生化合物。在另一个实施方式中，将植物与果实在采收与运送前先以化合物处理，以增加在运送期间对于损伤的抗性。也可将植物种子与本文所述的化合物接触，以例如使其防腐(preserve)。
在其它实施方式中，增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物可用于调节酵母细胞的寿命。其中希望延长酵母细胞寿命的情况包括其中使用有酵母的任何工艺过程，例如啤酒、酸奶与烘焙物品(例如面包)的制备。使用具有延长寿命的酵母，可以使用更少酵母，或使酵母具有活性的时间更长。也可将用于重组制备蛋白的酵母或其它哺乳动物细胞进行如本文所述的处理。
增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物也可用于增加昆虫寿命、应激抗性及对于细胞凋亡的抗性。在此实施方式中，化合物将被施用至有用的昆虫，例如蜜蜂及其它涉及植物授粉的昆虫。在一个具体的实施方式中，化合物将被施用至涉及生产蜂蜜的蜜蜂。一般而言，本文所述的化合物可应用至任何生物体，例如具有商业重要性的真核生物。例如，可将本文所述的化合物应用至鱼类(水产养殖)及鸟类(例如鸡与家禽)。
也可使用较高剂量的增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物作为杀虫剂，这是通过干扰发育期间沉默基因的调节以及细胞凋亡的调节进行的。在该实施方式中，可通过本领域已知的方法将该化合物施用至植物，并确保该化合物对昆虫幼虫(且不是对于植物)为生物可利用的。
至少就生殖与寿命间的联系的观点而言，可施用增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物，来影响诸如昆虫、动物及微生物等生物体的生殖。
4.测定
在本文中所构思的其它方法包括用于鉴定调节沉默调节蛋白的化合物或试剂的筛选方法。所述试剂可为核酸，例如适体(aptamer)。测定可以基于细胞或不含细胞的形式进行。例如，测定可包含，在沉默调节蛋白可被已知调节沉默调节蛋白的试剂所调节的条件下，用试验试剂培养(或接触)沉默调节蛋白，并在该试验试剂存在下监控或测定沉默调节蛋白相对于无该试验试剂存在下的调节程度。沉默调节蛋白的调节程度可通过测定其将底物脱乙酰基化的能力而确定。例举性底物为可购自BIOMOL(Plymouth Meeting，PA)的乙酰化肽类。优选底物包括p53的肽类，例如那些包含乙酰化K382的肽类。尤其优选的底物为Fluor de Lys-SIRT1(BIOMOL)，即乙酰化肽Arg-His-Lys-Lys(SEQ ID NO:2)。其它底物为得自人组蛋白H3与H4的肽类或乙酰化氨基酸。底物可为荧光的(fluorogenic)。所述沉默调节蛋白可为SIRT1、Sir2、SIRT3或其部分。例如，重组型SIRT1可得自BIOMOL。反应可进行约30分钟，并例如以烟酰胺终止。可使用HDAC荧光活性试验/药物发现试剂盒(drug discovery kit)(AK-500，BIOMOL Research Laboratories)测定乙酰化程度。类似的测定经描述于Bitterman等人(2002)J.Biol.Chem.277：45099中。可将测定中的沉默调节蛋白的调节程度，与在一种或多种本文所述化合物(其可作为阳性或阴性对照组)(分开或同时)存在下的沉默调节蛋白的调节程度进行比较。用于测定的沉默调节蛋白可为全长沉默调节蛋白或其部分。因为在本文中已显示活化化合物似乎会与SIRT1的N-端作用，故用于测定的蛋白包括沉默调节蛋白的N-端部分，例如SIRT1的大致为氨基酸1-176或1-255；Sir2的大致为氨基酸1-174或1-252部分。
在一个实施方式中，筛选试验包括(i)在无试验试剂存在下且在适合沉默调节蛋白将底物脱乙酰化的条件下，使沉默调节蛋白与试验试剂及乙酰化底物接触；及(ii)测定底物的乙酰化程度，其中在该试验试剂存在下底物的乙酰化程度相对于无该试验试剂存在下较低则表示：该试验试剂刺激由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用，而在该试验试剂存在下底物的乙酰化程度，相对于无该试验试剂存在下较高则表示：该试验试剂抑制由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用。
用于鉴定于体内调节例如刺激沉默调节蛋白的试剂的方法可包含(i)在第I类与第II类HDAC的抑制剂存在下，在无试验试剂存在下且在适合沉默调节蛋白将底物脱乙酰化的条件下，使细胞与试验试剂及能够进入细胞的底物接触；及(ii)测定底物的乙酰化程度，其中在该试验试剂存在下底物的乙酰化程度相对于无该试验试剂存在下较低则表示：该试验试剂刺激由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用，而在该试验试剂存在下底物的乙酰化程度相对于无该试验试剂存在下较高则表示：该试验试剂抑制由沉默调节蛋白进行的脱乙酰化作用。优选底物为乙酰化肽，其也优选为荧光的，如本文中进一步描述的。该方法可进一步包含将细胞裂解(lysing)，以测定底物的乙酰化程度。可将底物以范围介于约1μM至约10mM，优选地约10μM至1mM，甚至更优选约100μM至1mM，例如约200μM的浓度加至细胞中。优选底物为乙酰化赖氨酸，例如ε-乙酰基赖氨酸(Fluor de Lys，FdL)或Fluor de Lys-SIRT1。第I类与第II类HDAC的优选抑制剂为曲古抑菌素A(trichostatinA)(TSA)，其可以范围介于约0.01μM至100μM，优选约0.1μM至10μM，例如1μM的浓度使用。细胞与测试化合物及底物的培养可进行约10分钟至5小时，优选约1-3小时。因为TSA抑制所有第I类与第II类HDAC，且一些底物例如Fluor de Lys对于SIRT2为较差的底物，对于SIRT3-7为甚至更差的底物，故此类测定可用于鉴定体内SIRT1的调节剂。
5.药物组合物
本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物可以通过常规方法，使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂配制。例如，沉默调节蛋白的调节性化合物及其药学上可接受的盐与溶剂合物可经配制成用于通过例如注射(例如SubQ、IM、IP)、吸入或吹入(通过口或鼻)或口服、口腔、舌下、经皮、鼻、肠胃外或直肠给药的制剂。在一个实施方式中，沉默调节蛋白的调节性化合物可局部地，在标靶细胞存在的部位，即在特定组织、器官或体液(例如血液、脑脊髓液等)中进行给药。
沉默调节蛋白的调节性化合物可配制成用于各种给药方式，包括全身及局部或区域性给药的制剂。技术与制剂一般可见于Remington’sPharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，PA。对于肠胃外给药，以注射为优选，包括肌肉内、静脉内、腹膜内及皮下。对于注射，可将所述化合物配制成液态溶液，优选用生理学上相容的缓冲液，例如汉克氏溶液或林格氏溶液。此外可将所述化合物配制成固体形式，并于使用前立即再溶解或悬浮。也可包括冷冻干燥形式。
对于口服给药，药物组合物可采用例如通过常规方法，用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或湿润剂(例如月桂基硫酸钠)制备的片剂、锭剂或胶囊的形式。片剂可通过本领域已熟知的方法包衣。用于口服给药的液体制剂可采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可制成干燥产物，在使用前以水或其它适宜载体配制。此类液体制剂可通过常规方法，用药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂类)；乳化剂(例如卵磷脂或金合欢胶)；非水载体(例如扁桃油、酯油类、乙醇或分馏植物油)；及防腐剂(例如对-羟基苯甲酸甲基酯或对-羟基苯甲酸酯丙基酯或山梨酸)制备。如果适当，该制剂也可含有缓冲盐、调味剂、着色剂与甜味剂。用于口服给药的制剂可适宜地配制，以使活性化合物受控的释放。
对于通过吸入(例如肺递送)给药，可方便地将沉默调节蛋白的调节性化合物以从经加压包装或喷雾器中使用适宜的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合气体的气溶胶喷雾制剂形式来递送。在经加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供用于递送已计量的量的阀来确定。可配制用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊或药筒(cartridge)，其含所述有化合物与适宜粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
沉默调节蛋白的调节性化合物可经配制成用于通过注射，例如通过单次快速静脉注射或持续输注的肠胃外给药的制剂。用于注射的制试剂可以单位剂量形式提供，例如，以安瓿或多剂量容器(添加防腐剂)提供。组合物可采用诸如在油性或含水载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前可以用适宜载体，例如灭菌无热源水配制。
沉默调节蛋白的调节性化合物也可配制成直肠给药组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质如可可脂或其它甘油酯类。
除了先前所述的制剂外，沉默调节蛋白的调节性化合物也可配制成长效制剂(depot preparation)。此类长效型制剂可通过植入(例如以皮下或肌肉内)，或经由肌肉内注射给药。因此，例如，可将沉默调节蛋白的调节性化合物用适宜的聚合物或疏水性材料(例如在可接受油类中的乳液)或离子交换树脂配制，或呈微溶性衍生物，例如呈微溶性盐。受控释放剂型也包括贴剂。
在一些实施方式中，本文所述的化合物可配制成用于递送至中枢神经系统(CNS)的制剂(见综述，Begley，Pharmacology & Therapeutics 104：29-45(2004))。用于药物递送至CNS的常规方法包括：神经外科策略(例如脑内注射或脑室内输注)；试剂的分子操作(例如制备包含具有对于内皮细胞表面分子的亲合性的转运肽与其本身能够穿越BBB的试剂组合的嵌合型融合蛋白)目的在于开发一种BBB的内源性运送途径；设计用于增加试剂的脂溶度的药学策略(例如，将水溶性试剂结合(conjugation)至脂质或胆固醇载体上)；及通过高渗透力瓦解短暂破坏BBB完整性(由将甘露糖醇溶液灌流入颈动脉，或使用生物活性剂例如血管紧张肽所导致)。
脂质体为另一种可容易注射的药物递送系统。于是，在本发明方法中也可将活性化合物以脂质体递送系统的形式给药。脂质体为本领域熟练技术人员已熟知的。脂质体可由各种磷脂例如胆固醇、磷酯酰胆碱类的硬脂胺形成。可用于本发明方法的脂质体包含所有类型脂质体，包括但不限定于小单层囊泡、大单层囊泡及多层囊泡。
另一种制备沉默调节蛋白的调节剂例如白藜芦醇或其衍生物的制剂(尤其是溶液)的方法是通过使用环糊精。环糊精是指α-、β-或γ-环糊精。环糊精详细描述于Pitha等人，U.S专利4,727,064中，其以参考文献引入本文。环糊精为葡萄糖的环状寡聚物；这些化合物与其分子能配合至环糊精分子的亲脂-搜寻空腔(lipophile-seeking cavity)中的任何药物形成包合复合物。
快速崩解或溶解剂型可用于医药活性剂的快速吸收，尤其是口腔与舌下吸收。快速溶解(fast melt)剂型对具有吞咽常见的固体剂型例如囊片(caplet)与片剂困难的患者(例如老年人及幼儿患者)有益。此外，快速溶解剂型克服了与例如咀嚼剂型有关的缺点，其中活性剂保持在患者口中的时间，在确定味觉掩盖量及患者可能感受到活性剂的喉咙粗砂质感的程度方面起重要作用。
药物组合物(包括化妆品制剂)可包含约0.00001%至100%，例如0.001至10%或0.1%至5%重量的一种或多种本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物。
在一个实施方式中，将本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物混入含有一般适用于局部药物给药的局部给药载体，且包含本领域已知的任何此类物质的局部制剂中。可选择局部给药载体以使组合物呈所希望的形式，例如呈软膏、洗剂、乳膏、微乳剂、凝胶、油、溶液等，且其可由天然存在或合成来源的材料组成。优选所选择的载体不会有害地影响活性剂或局部制剂的其它组分。用于本文的适宜局部给药载体实例包括水、醇类及其它无毒性有机溶剂、甘油、矿物油、硅酮、凡士林、羊毛脂、脂肪酸、植物油、对羟基苯甲酸酯类、蜡类等。
制剂可为无色无味的软膏、洗剂、乳膏、微乳剂及凝胶。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入一般为半固体制剂的软膏中，其通常以凡士林或其它石油衍生物为基质。所使用的本领域技术人员所了解的具体软膏基质是能够提供最佳药物递送，且优选可提供其它所希望特征以及例如软化性或类似特性的基质。如果与其它载体或赋形剂共用，则软膏基质应为惰性、稳定、无刺激性且非致敏性的。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入洗剂中，其一般为要施用于皮肤表面而无摩阻(friction)的制剂，且通常为其中固体颗粒(包括活性剂)存在于水或醇类基质中的液态或半液态制剂。洗剂通常为固体的悬浮液，且可包括水包油型的液体油性乳液。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入乳膏中，其一般为粘稠性液体或半固态乳液，为水包油或油包水型。乳剂基质为可水洗，且含有油相、乳化剂与水相。油相一般由凡士林与脂肪醇，例如鲸蜡醇或硬脂醇所组成；水相通常(虽然并非必要地)在体积上较油相过量，且一般含有湿润剂。乳膏制剂中的乳化剂如于前述Reminton的文献中所说明的，一般为非离子型、阴离子型、阳离子型或两性表面活性剂。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入微乳剂中，其一般为两种不相混溶的液体(例如油与水)经由表面活性剂分子的界面膜稳定化的热动力学上稳定、各向同性的澄清的分散体(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(New York：Marcel Dekker，1992)，第9卷)。
沉默调节蛋白的调节性化合物可混入凝胶制剂中，其一般为由小的无机粒子组成的悬浮液(二相系统)，或基本上均匀分布于整个载体液体(单相凝胶)中的大的有机分子所组成的半固体系统。虽然凝胶一般使用含水载体液体，也可使用醇类与油类作为载体液体。
在制剂中也可包括其它活性剂，例如其它消炎剂、镇痛剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抗生素、维生素、抗氧化剂及一般存在于防晒制剂中的阳光阻断剂，包括但不限定于邻氨基苯甲酸酯、二苯甲酮(尤其是二苯甲酮-3)、樟脑衍生物、肉桂酸酯(例如甲氧基肉桂酸辛酯)、二苯甲酰基甲烷(例如丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷)、对-氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物，及水杨酸酯(例如水杨酸辛酯)。
在一些局部制剂中，活性剂以该制剂的大约0.25重量%至75重量%，优选地为该制剂的大约0.25重量%至30重量%，更优选地为该制剂的大约0.5重量%至15重量%，且最优选地为该制剂的大约1.0重量%至10重量%的范围存在。
眼疾病可通过例如全身性、局部眼内注射沉默调节蛋白的调节性化合物，或通过安插可释放沉默调节蛋白的调节性化合物的持续释放装置而治疗或预防。可将增加沉默调节蛋白的水平和/或活性的沉默调节蛋白的调节性化合物在药学上可接受的眼载体中进行递送，以使该化合物能保持与眼表面接触足够的时间以让该化合物穿透角膜与眼睛的内部区域，例如前室、后室、玻璃体、房水、玻璃体液、角膜、虹膜/睫状体(ciliary)、晶状体、脉络膜/视网膜及巩膜。药学上可接受的眼载体可例如为软膏、植物油或包封材料。另一方面，可将本发明化合物直接注射入玻璃体液与房水中。在另一选择中，该化合物可全身性给药(例如通过静脉内输注或注射)用于眼的治疗。
本文所述的沉默调节蛋白的调节性化合物可储存于无氧环境中。例如，可将白藜芦醇或其同系物配制于供口服给药的不透气胶囊中，例如购自Pfizer，Inc.的Capsugel中。
可将例如经沉默调节蛋白的调节性化合物体外处理的细胞，根据用于将移植物给药于患者的方法进行给药，其可伴随例如给药免疫抑制药物例如环孢菌素A。关于药物配制的一般原理，读者可参考Cell Therapy：Stem CellTransplantation，Gene Therapyand Cellular Immunotherapy，G.Morstyn和W.Sheridan编，剑桥大学出版社，1996；及Hematopoietic Stem Cell Therapy，E.D.Ball，J.Lister和P.Law，Churchill Livingstone，2000。
沉默调节蛋白的调节性化合物的毒性与治疗功效可通过用细胞培养物或实验动物的标准药学方法测定。LD50为对于50%群体致死的剂量。ED50为对于50%群体治疗上有效的剂量。毒性与治疗功效间的剂量比值(LD50/ED50)为治疗指数。优选具有高治疗指数的沉默调节蛋白的调节性化合物。虽然可使用具有毒副作用的沉默调节蛋白的调节性化合物，但应小心设计将此类化合物靶向至受感染组织位置的递送系统，以使得可以将对于未受感染细胞可能的伤害减至最低，并由此减少副作用。
得自细胞培养试验及动物研究的数据，可用于配制在人中使用的剂量范围。此类化合物的剂量可在其包括具有较小或无毒性的ED50值的循环浓度范围内。该剂量可在此范围内根据所使用的剂型及所利用的给药途径而有所变化。对于任何化合物，可最初由细胞培养试验评估治疗上有效的剂量。可用动物模型调配剂量，以达到包括如在细胞培养中所测定的IC50值(即，达到对症状的一半最大抑制作用的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地测定人的有效剂量。可例如通过高效液相色谱法测量血浆中的浓度。
6.试剂盒
本发明也提供试剂盒，例如用于治疗目的的试剂盒，或用于调节细胞寿命或调节细胞凋亡的试剂盒。试剂盒可包括一种或多种例如以预先测量的剂量的沉默调节蛋白的调节性化合物。试剂盒可任选地包括用于将细胞与所述化合物接触的装置及使用说明书。该装置包括注射器、支架及其它用于将沉默调节蛋白的调节性化合物导入患者(例如患者的血管)中，或将其涂覆于患者皮肤的装置。
在另一个实施方式中，本发明提供一种物质组合物，其包含本发明的沉默调节蛋白的调节剂与另一种治疗剂(与用于组合疗法及组合药物组合物(combination composition)中的那些相同的治疗剂)，存在于独立的剂型中，但彼此互相关联。本文使用的术语“互相关联”是指，将独立的剂型包装在一起，或者相互依附，从而使得可以容易地明白这些独立的剂型欲被销售，且欲以相同方案的一部分给药。优选将该药剂与沉默调节蛋白的调节剂一起包装于泡罩包装或其它多室包装中，或作为可由使用者自行分开(例如，通过在两个容器间的刻划线处撕开)的连结的、分开密封的容器(例如锡箔小袋等)中。
在又一个实施方式中，本发明提供试剂盒，其包含存在于独立的容器中的a)本发明沉默调节蛋白的调节性剂；及b)另一种治疗剂，例如那些描述于说明书其它部分的治疗剂。
除非另有说明，本发明方法的实施将利用本领域普通技术人员所知的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA及免疫学的常规技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：Molecular Cloning A Laboratorymanual，第2版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编著(Cold Sp Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，第I与II卷(D.N.Glover编著，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编著，1984)；Mullis等人U.S.专利No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames &S.J.Higgins编著1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins编著，1984)；Culture ofAnimal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；专题论文，Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Millerh和M.P.Calos编著，1987，Cold Spring HarborLaboratory)；Methods In Enzymology，卷154和155(Wu等人编著)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编著，Academic Press，London，伦敦，1987)；Handbook of ExperimentalImmunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著，1986)；Manipulatingthe Mouse Embryo(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
实施例
通过参照下列实施例更容易理解对本发明进行的一般描述，这些实施例仅为说明本发明一些方面及实施方式，而不是用来以任何方式限制本发明。
实施例1.原料和方法
由BioPeptide(San Diego，CA)制备所有的肽，并且通过分析型HPLC分析显示纯度至少95%。牛谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮基戊二酸、NADH和NAD+购自Sigma Chemical Company。全长人SIRT1和用于生物物理研究的截短的形式SIRT1(183-664)根据之前所述制备，并且显示出具有相当的动力学性质(Milne等(2007)Nature 450，712-716)。烟酰胺酶PNC1根据Denu及合作者(Smith等，(2009)Anal Biochem 394，101-109)所述制备。
实施例2.STAC的结构和合成
化合物1–20的结构(其与图5结合使用)呈现在化合物表中，而化合物21–26的结构呈现在表1和图9和11中。化合物10、11和12的实验方法和表征数据示于其中。根据文献方法(Milne等，(2007)Nature 450，712-716)制备SRT1460、SRT1720和SRT2183，文献中为3、23和24(Vu等，(2009)J Med Chem)。根据结构相似的化合物(Vu等，(2009)J Med Chem)所述方法制备化合物25。根据相关专利所述方法制备化合物3(Nunes等，(2007),国际专利申请号WO 2007/019346),4(Bemis等，(2008),国际专利申请号WO2008/156866)、26、13和14(Vu等，(2010),国际专利申请号WO 2010/003048)。本文公开了7的合成。
实施例3.等温滴定量热法实验
使用VP-ITC系统或iTC200系统(MicroCal)在26°C在缓冲液中进行ITC实验，所述缓冲液由137mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl2、2mM TCEP、5%(V/V)甘油和50mM HEPES-NaOH，PH 7.3组成。实验前纯化SIRT1(183-664)并用缓冲液透析，离心并脱气。将所述肽和化合物溶于最终透析缓冲液中，调节它们的PH值以匹配蛋白溶液的PH值。在VP-ITC系统上进行的表征STAC/TAMRA-肽相互作用的典型结合实验中，将1mM TAMRA-肽以35个等份的8μL(除了第一次注射为2μL)注射至1.47ml含有100μMSTAC的样品细胞中。为了使用iTC200系统表征该相互作用，将1mMTAMRA-肽以20个等份的2μL(除了第一次注射为0.5μL)注射至0.202mL含有100μM STAC的样品细胞中。对于溶解度差的STAC，相应地调节浓度。为了表征SRT1460与TAMRA-肽的相互作用，使用5mM TAMRA-肽和0.5μM SRT1460以获得更优的数据。
为了在VP-ITC系统上表征STAC与SIRT1(183-664)的相互作用，将100μM酶以35个等份的8μL(除了第一次注射为2μL)注射至1.47mL含有10μM STAC的样品细胞中。在iTC200系统上的典型结合实验中，将100μM酶以20个等份的2μL(除了第一次注射为0.5μL)注射至0.202mL含有100μMSTAC的样品细胞中。
在所有情况下，校正稀释热的数据，并使用非线性最小二乘法使用单位点结合模型使用ITC v7.0383的Origin软件(Microcal)进行拟合，其计算化学计量(n)、反应的焓(ΔH)以及结合常数(Ka)。
结果
在SIRT1活化研究的过程中，发现几种STAC结合至TAMRA-肽，形成活化剂:底物复合物。为了研究该复合物的机理意义，使用ITC对20个有效性为EC1.5=0.05至≥100μM的活化剂(这些化合物的结构见表6)测定了STAC结合至TAMRA-肽的Kd值。图4包括了代表性ITC滴定。图4A表示4的滴定，其显示没有可检测的与TAMRA-肽的结合。在这些实验条件下，如果该化合物结合至TAMRA-肽，则其确实具有保守估计大于100μM的Kd值。图4B为7的滴定，并且表示结合至TAMRA-肽的Kd为36μM。该Kd值比0.5μM的Kx值高72倍(7的活化滴定曲线见图4B的插图)。Kd和Kx之间的差异表明通过7活化不依赖于其与底物的结合。
图2A的机理预测了EC1.5值应当与Kd值相关，如图3的模拟所示。为了研究该结论，绘制了EC1.5与Kd的函数图(图5)。由该图可看出，活化有效性与STAC对TAMRA-肽的亲和力之间没有相关性。用灰色标出的是一系列化合物，其Kd值范围为2.5至超过100μM，但具有约0.3μM的相同EC1.5值。这清楚地表明STAC激活TAMRA-肽的SIRT1-催化的脱乙酰基化的能力与STAC对该底物的亲和力不相关。
可以推测可能对于某种结构类型的STAC，EC1.5和Kd之间可能存在相关性。该相关性将限定图5中连接10和20的线。在该线上检查具体化合物的结构揭示，它们代表了所有三种结构类型，包括图5的化合物。因此，即使根据STAC结构类型试图剖析可能的相关性，EC1.5与Kd之间也不存在相关性。
活化剂结合至SIRT1与底物增强不一致，但是与酶变构相一致。在测试的大约20个化合物(见表6)中，可以使用ITC检测SIRT1(183-664)与三种STAC的相互作用。发现化合物4、13和14的结合Kx值分别等于3.0、0.32和0.43μM(概述和结构见表1)。作为代表，在图8A中显示14的实验数据。对于该化合物，还可能进行荧光结合实验。观察到该化合物在450nM发射的荧光随着SIRT1浓度的增加而下降(图8B)。这些数据的量化使计算Kx值为0.27μM(图8C)，与ITC测量一致。
表1.SRT:SIRT1复合物的解离常数a
(a)反应条件的描述和实验方案的描述见本文。
应注意，图2A的机理排除了在SIRT1和活化剂之间形成复合物的可能性。相反，图2B的变构机理包括，但不要求，形成该复合物。20个测试的STAC中仅有3个可以结合至SIRT1，因此与该机理一致。
表2概括了STAC结合至Ac-Arg-His-Lys-LysAc-X的Kd值。应注意，除了SRT1460，化合物的溶解度要求这些ITC实验在含有10%DMSO的溶液中进行。由于这些STAC与Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Phe-NH2和Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp-NH2的相互作用发生在C-末端氨基酸的苯基和吲哚部分而且可能受疏水作用驱使，因此这些Kd值可以大于1%DMSO溶液(即活化测试运行的DMSO浓度)中的Kd值。
表2.STAC结合至Ac-Arg-His-Lys-LysAc-X的Kd值a
Figure BDA00002598264500622
(a)在含有10%DMSO的缓冲液中进行SRT1720、SRT2183和10的Kd测量。对于SRT1460，不需要共溶剂。
对于酰胺和AMC衍生物，并不存在可检测的与四种STAC中任一种的相互作用。显著地，10激活AMC衍生物的脱乙酰基化。联系10与该底物不存在结合，可以排除通过底物增强活化。
对于X=PheNH2，不存在结合至SRT1460，然而存在底物的脱乙酰基化的活化。相反，虽然10的确结合至该底物，但其不激活其脱乙酰基化。最后，对于X=TrpNH2，SRT1720结合但不激活，而10同时结合和激活。
对于TAMRA-肽的脱乙酰基化的活化，STAC的激活能力与其底物亲和力之间不存在相关性。
实施例4.14与SIRT1相互作用的荧光结合试验
使用由137mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl2、2mM TCEP、5%(V/V)甘油和50mM HEPES-NaOH，PH 7.3组成的缓冲液透析SIRT1(183-664)。将14溶于最终透析缓冲液，并调节其pH值以匹配蛋白溶液的pH值。在存在或不存在不同浓度的酶时，在具有在315nm激发的SpectraMax M5上监测了14的荧光发射光谱。相对SIRT1(183-664)的浓度绘制了在450nm的荧光强度变化，并使用标准结合等式拟合。
实施例5.使用desTAMRA-肽筛选SIRTRIS化合物库
使用BioTrove质谱系统筛选了大约5,000个SIRT1活化剂的库，如前所述(Milne等，(2007)Nature 450，712-716)。在该筛选中，[SIRT1]o=5nM，[desTAMRA-肽]o=1μM=Km/10以及[NAD+]o=30μM=Km/10。化合物以10μM存在，并且该测试在含有150mM Tris、5mM DTT、1%DMSO和0.025%BSA的PH 7.4缓冲液中进行。
结果
在高通量筛选试验（campaign）中鉴定了Sirtris的最初活化剂先导结构，其用于荧光偏振试验，以TAMRA-肽为底物(Milne等，(2007)Nature 450，712-716)。该20mer(SIRT1的天然底物)位于p53的Lys382周围。特别进行TAMRA-肽相对于p53的序列修饰，以用于该测试(Milne等，(2007)Nature450，712-716；Marcotte等，(2004)Anal Biochem 332，90-99)。已经使用TAMRA-肽和基于质谱的测试进行了最初筛选苗头化合物的表征，以及所有的后续研究(Milne等，(2007)Nature 450，712-716)。
由于关于这些最初活化剂先导化合物的构效关系的进展，观察是否这些化合物能够激活缺乏TAMRA部分的的TAMRA-肽类似物的脱乙酰基化是有意思的。在最初测试的几种STAC(包括Milne等((2007)Nature 450，712-716)报道的那些)中，无一能够激活desTAMRA-肽的脱乙酰基化。这些结构与Pacholec等((2010)J.Biol.Chem.285，8340-8351)最近报道的结果一致，并且表明STAC对SIRT1的活化高度依赖于底物的结构特征。然而，虽然Pacholec等((2010)J.Biol.Chem.285，8340-8351)和其他人(Kaeberlein等(2005)J.Biol.Chem.280，17038-17045；Beher等(2009)Chem Biol Drug Des)已经解释了活化对底物结构的依赖性反映了底物-相关的模拟，以及SIRT1活化的‘间接’机理，但是我们相信这些结果揭示了SIRT1变构调节的重要特征。
在测试的几种STAC中，无一激活了desTAMRA-肽的脱乙酰基化。为了测试该发现的普遍性，筛选了我们库里超过5,000个STAC激活该肽的脱乙酰基化的能力。该筛选结果鉴定了三个结构相关的STAC：10、11和12。这三个化合物的活化滴定曲线示于图6中，其中可以看出所有三个化合物激活desTAMRA-肽的SIRT1-催化的脱乙酰基化，它们的EC50和RVmax值分别约为2μM和2.3。这些结果证明没有TAMRA部分的肽仍可支持通过STAC活化。
虽然desTAMRA-肽仍支持活化，但是在LysAc的N-末端侧保留了生物素部分。这产生以下问题：是否生物素自身可以支持活化。为了回答该问题，我们检查了10、11和12对des(生物素，TAMRA)-肽的作用，并且发现并未激活该底物的脱乙酰基化，这表明需要在肽底物上存在具有一定立体大小的化学部分，用于通过STAC激活它们的脱乙酰基化。
实施例6.STAC与SIRT1相互作用的动力学研究
为了测定STAC与SIRT1的相互作用，应用了两种动力学方法。其中一种(其用于TAMRA-肽、desTAMRA-肽、des(生物素,TAMRA)-肽和p53-20mer)使用之前所述的质谱方法检测肽反应产物(Milne等，(2007)Nature 450，712-716)。另一种(其用于基本结构Ac-Arg-His-Lys-LysAc-X的肽)使用之前报道的连续的酶-偶联方法(Smith等，(2009)Anal Biochem 394，101-109)，其中SRT1产物烟酰胺首先在PNC1的作用下转化为烟酸和氨，然后氨被GDH用于将α-酮基戊二酸转化为谷氨酸。该反应伴随氧化NADH至NAD+，其伴随在340nM的吸光度改变(Δε340=-6,200M-1cm-1)。
用于表征活化剂的动力学实验在Perkin Elmer Lambda 25分光光度计上运行，所述分光光度计配备维持在25℃的水-夹套、8室转换器。在典型的动力学实验中，将除了SIRT1的所有反应溶液成分加入至1mL比色皿中，并允许达到热平衡。该偶合系统成分的最终浓度为：1μM PNC1、0.23mMNADH、3.4mM α-酮基戊二酸和20U/mL牛GDH。该溶液还含有肽底物NAD.0.，和文中所示浓度的活化剂。最终DMSO浓度保持恒定在1％，且用于这些实验的缓冲液为50mM HEPES、150mM NaCl，PH 7.5。虽然该系统达到热平衡，但是仍监测吸光度，以提供背景速率的准确估计，其在加入SIRT1后从反应速率中减去。
结果
表3概括了该研究中使用的底物的稳态动力学参数。使用PNC1-GDH-偶合试验测定了该表中报道的参数。还使用Milne等((2007)Nature 450，712-716)首次公开的基于质谱的试验评估了四种20mer的动力学参数，而且与表3中报道的参数一致。
表3.SIRT1底物的稳态动力学参数的概况a，b，c
Figure BDA00002598264500651
Figure BDA00002598264500661
(a)KB为生物素化的赖氨酸，KT为标记有TAMRA基团的赖氨酸，并且J为正亮氨酸。所有肽在C-末端用乙酰基和在N-末端用酰胺封端。
(b)在25OC，在PH 7.5的含有50mM HEPES和150mM NaCl的缓冲液中进行实验。[NAD+]o=2mM且[SIRT1]o为50–1,000nM，取决于底物的反应性。
(c)各参数估计基于2或3次独立的实验。在所有情况下，标准偏差(n=3)或离均差(n=2)低于15%。
受上述研究(其记录了底物结构对STAC如何与SIRT1相互作用的强力影响)激励，研究了STAC如何影响Ac-Arg-His-Lys-LysAc-X的脱乙酰基化，其中X为NH2、AMC、PheNH2和TrpNH2。Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC(a.k.a.Biomol)为用于鉴定和表征白藜芦醇的试验中的底物(Howitz等，(2003)Nature 425，191-196)，而且广泛用于筛选SIRT1的活化剂和抑制剂。
表4概括了单一浓度的22和Milne等((2007)Nature 450，712-716)公开的三种STAC对五种底物的脱乙酰基化的影响。与四种20mer观察到的结果相似，具体STAC对脱乙酰基化的影响取决于底物的结构。例如，虽然SRT1460激活Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Phe-NH2和Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp-NH2的脱乙酰基化，但是其抑制Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC的脱乙酰基化，而且虽然22激活Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC和Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp-NH2的脱乙酰基化，但其抑制Ac-Arg-His-Lys-LysAc-NH2的脱乙酰基化。
表4.STAC对Ac-Arg-His-Lys-LysAc-X的SIRT1-催化的脱乙酰基化的影响的概况a
Figure BDA00002598264500663
(a)[SRT]o=5μM，[肽]o≤Km，[NAD+]=70μM。每项代表2-3次独立实验的平均值；标准偏差≤15%。
用全滴定曲线继续研究了这些观察的几种结果。在图10A中，观察到22以剂量依赖方式激活Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC和Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp-NH2的脱乙酰基化。同样，在图10B中，SRT1460依赖剂量地激活Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Phe-NH2和Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp-NH2的脱乙酰基化。这些结果非常显著，证明了STAC可以加速肽底物(仅包括天然氨基酸)的脱乙酰基化。
实施例7.活化数据一般处理
以相对速度(即，在活化剂X的存在下的速率vx与不存在活化剂时的vo的比值)对最初的活化剂浓度[X]o绘制活化剂滴定曲线，并通过非线性最小二乘法拟合至等式(1)的酶活化机理-独立的表达式：
v x v o = 1 + RV max - 1 1 + EC 50 [ X ] o - - - ( 1 )
其中RVmax为最大相对速度(即，在无穷[X]o时的vx/vo)且EC50为在vx/vo=(RVmax-1)/2时的活化剂浓度。EC50为催化和活化二者的动力学机理，以及底物浓度的函数。
对于不溶性和效力阻止了取得用于准确估计RVmax和EC50的高浓度的活化剂，活化剂效力可以表示为EC1.5，其为取得1.5倍活化所需的活化剂浓度。EC1.5可以表示为等式：
EC 1.5 = EC 50 2 RV max - 3 - - - ( 2 )
因此反映了活化剂有效性，而且依赖于RVmax和EC50二者。对于其中RVmax基本相同的一系列活化剂，EC1.5/EC50比值将在该系列的所有成员中相似，因此EC1.5或EC50均可用于测量活化剂效力。
EC1.5的倒数为活化剂有效性的直接量度，且为等式：
( EC 1.5 ) - 1 = 2 ( RV max - 1.5 EC 50 ) - - - ( 3 )
可以看出，(EC1.5)-1类似于标准稳态酶动力学的Vmax/Km。
实施例8.通过形成活化剂:底物复合物酶活化的动力学模型
图2A的机理的速率规律可以来自等式(4)的表达式，其使用快速平衡假设推导。
v x [ E ] o = k c [ S ] K m ( 1 + [ XS ] K m , x ) + [ S ] + &gamma; k c [ XS ] K m , x ( 1 + [ S ] K m ) + [ XS ] - - - ( 4 )
应注意，术语底物浓度对应于游离底物，而非总底物。这是因为在该机理中，X:S可以占据显著比例的总底物，取决于[S]o、[X]o和Kd。
为了以总底物和游离底物表达速率规律，等式(4)可以重新推导为等式(5)。
v x [ E ] o = k c [ S ] K m ( 1 + [ S ] o - [ S ] K m , x ) + [ S ] + &gamma; k c ( [ S ] o - [ S ] ) K m , x ( 1 + [ S ] K m ) + [ S ] o - [ S ] - - - ( 5 )
如果可以用[S]o、[X]o和Kd表示[S]，则该推导将完整。这起始于Kd的定义，如等式(6)中给出：
K d = [ X ] [ S ] [ XS ] = { [ X ] o - [ S ] o + [ S ] } [ S ] [ S ] o - [ S ] - - - ( 6 )
等式(6)当然可以表示为二次方程式：
[S]2+(Kd+[X]o-[S]o)[S]+Kd[S]o=0            (7)
其具有以下解：
[ S ] = - ( K d + [ X ] o - [ S ] o ) + ( K d + [ X ] o - [ S ] o ) 2 + 4 K d [ S ] o 2 - - - ( 8 )
结果
SIRT1活化的‘间接’机理的主要特征为X:S，即活化剂和底物的复合物(见图2A)。检验该机理指出，活化由形成X:S驱使，意味着具有较低Kd值的X:S复合物应当产生更有效的活化。因此，我们预期，对于图2A的机理，EC50和Kd之间为正相关。为了检验该结论，我们使用用于等式(8)的游离底物和修改形式的等式(5)的表达式模拟了活化剂滴定曲线，其中等式两边均除以对照速率，vo/[E]o=kc[S]o/(Km+[S]o)，得到相对速度的表达式vx/vo。
这些曲线示于图3，并且用以下参数设定产生：Km设定为5μM(TAMRA-肽的Km)；γ设定为单位值(value of unity)，因为观察到通过STAC的活化主要为Km降低的结果，而kc改变很小或者不改变；且Km,x设定为0.25μM(比Km低20倍的值)，再次给予重视(weight)通过STAC的SIRT1-活化主要来自Km降低的实验观察结果。[S]o=Km/10=0.5μM，在Milne等((2007)Nature450，712-716)和Pacholec等(2010)J.Biol.Chem.285，8340-8351)二人的研究工作中使用了该浓度。最后，Kd的范围为3至300μM，其包括了STAC与TAMRA-肽相互作用测得的范围值。如对该机理所推测的，该模拟指出EC50与Kd正相关。
实施例9.经过变构机理酶活化的动力学模型
图2B的机理的速率规律可以使用快速平衡假设推导，并表示为等式(9)。
v x v o = 1 1 + [ X ] o &beta;K x , obs + &gamma; obs 1 + &beta;K x , obs [ X ] o - - - ( 9 )
其中
K x , obs = K x ( 1 + K s [ S ] o 1 + &beta;K s [ S ] o ) - - - ( 10 )
&gamma; obs = &gamma; ( 1 + K s [ S ] o 1 + &beta;K s [ S ] o ) - - - ( 11 )
结果
为了确定底物增强是否可以解释通过10或SRT1460的TAMRA肽的SIRT1催化的脱乙酰基化的活化，评估了图2A的间接机理的真实性。选择化合物10和SRT1460是因为它们代表了该研究中STAC的底物亲和力的两种极端情况，分别具有2.5和140μM的Kd值。
图6表示通过10活化SIRT1的滴定曲线。当将数据集拟合至等式(5)时，其中[S]o设定为0.5μM的实验值且Km限制为5μM，剩余参数的最佳拟合估计计算如下：Kd=53±8μM，Km,x=0.035±0.011μM且γ=0.69±0.08。最显而易见的是，Kd的最佳拟合值比2.5μM的实验测得Kd值高20倍。当Kd限制为2.5μM时，非线性最小二乘法拟合并未收敛，表明不存在Km,x和γ的值可以解释具有Kd=2.5μM的STAC的数据。
该研究中STAC的Kd的其它极端情况发生在SRT1460中，其具有140μM的Kd值。为了确定图2A的机理是否可以适应该活化剂，我们拟合了Milne等((2007)Nature 450，712-716)报道的活化滴定曲线为等式(5)的表达式。该曲线呈现于图7A中。与10的滴定曲线不同，这些数据可以适合于图2A的机理的速率规律。在该拟合中，使用了以下限制：Kd=140μM(实验测得值)；[S]o=0.5μM(实验中使用的浓度)；且Km=14.5μM(实验测得值)(即，图7B的对照)。对于这些限制，我们发现Km,x=90nM且γ=0.20。
为了判断图2A的机理是否对SRT1460实际有效，如上述分析所建议，我们在SRT1460的几个固定浓度检验了来自另一类型的活化实验(其中初速率确定为底物浓度的函数)的数据。如果图2A的机理可用于SRT1460，则来自两种类型的实验的参数估计必须相同。我们检验的数据集也来自Milne等((2007)Nature 450，712-716)，并示于图7B中。将该数据全拟合为等式(5)，得到：Km,x=1.0±0.1μM且γ=1.53±0.07。在该拟合中，Kd设定为140μM的实验测得值，且Km和Vmax设定为曲线中[SRT1460]＝0时的值(见表5)。
表5.TAMRA-肽的SRT1460-激活的脱乙酰基化的稳态动力学参数的概况a
Figure BDA00002598264500701
(a)图7B的各数据集拟合至Michaelis-Menten方程。
应注意对于两种类型的活化实验，活化参数Km,x和γ之间存在非常大的不一致。由活化剂滴定曲线的分析，Km,x=0.090μM且γ=0.20，且由在固定浓度的活化剂的Michaelis-Menten曲线的分析，Km,x=1.0和γ=1.53。因此，图2A的机理不能以得到内部一致的结果的方式解释通过SRT1460活化。
酶变构可以解释通过SRT1460的TAMRA-肽的SIRT1-催化的脱乙酰基化的活化。当活化的变构机理的速率规律用于拟合图7B的数据时，获得了以下的最佳拟合参数：Kx=8.7±0.8μM，Β=0.26±0.02且γ=1.48±0.04。使用等式(9)和这些参数绘制的曲线显示出对数据的极佳拟合。这些曲线与由表5的个别拟合和参数估计绘制的曲线重叠。
为了检验通过STAC活化可以依赖于肽序列，并且仅可发生在具有对应于天然底物的肽序列的可能性，我们测试了10、11和12激活p53-20mer的SIRT1-催化的脱乙酰基化的能力。显著地，这三种化合物抑制了该反应(见图9)。这些结果与图2B的变构机理相一致，其中γ/β比确定是否外部配体起活化剂或抑制剂的作用；即当γ/β>1时观察到活化，而当γ/β<1时观察到抑制。应注意，图2A的机理不能解释抑制，因为在该机理中，酶与调节剂不能形成复合物。应当注意，虽然通过底物耗尽的抑制(即，X:S不是底物，但简单充当底物‘沉淀’)是形式可能性，但是其被排除，因为没有TAMRA(如Pacholec等((2010)J.Biol.Chem.285，8340-8351)所指出的)或一些其它‘大’基团时，STAC不与肽结合。
实施例10.SIRT1的结构模型
使用ACS2肽-结合的SIRT3结构(PDB id.3GLR)(Jin等，(2009)J.Biol.Chem.284，24394-24405)创建SIRT1同源模型，模板使用Swiss-Pdb Viewer4.0.1(Guex and Peitsch(1997)Electrophoresis 18，2714-2723)。基于结合在A.Fulgidus的SIR2结构的p53肽(PDB id.1MA3)(Avalos等，(2002)Mol Cell 10，523-535)和结合在SIRT3结构的ACS2肽(PDB id.3GLR)(Jin等，(2009)J.Biol.Chem.284，24394-24405)建立Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Trp-NH2肽模型。
实施例11.2-丁基-6-(哌啶-4-基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺(X)的制备：
步骤1)2-丁基-6-羟基嘧啶-4-甲酸的合成：
Figure BDA00002598264500721
向21.0g(100mmol)草酰乙酸二乙酯钠盐中加入80mL水。经1分钟在环境温度向搅拌的悬浮液中加入16mL(100mmol)的6.25M NaOH(水溶液)。将混合物搅拌10分钟，直至仅剩余痕量未溶解的草酰乙酸酯，得到橙色溶液。向其中加入13.9g(100mmol)的正戊脒盐酸盐在20mL水中的溶液。用pH计监测反应，并在必要时加入另外的6.25M NaOH以保持pH在10和11之间。在环境温度搅拌22小时后，将混合物用冰浴冷却，然后加入12M HCl直至pH=2，得到白色沉淀。将其过滤、用50mL水洗涤，然后在滤器（filter）上干燥1小时。将白色固体悬浮于50mL庚烷中，并用Dean-Stark榻分水器在1巴蒸馏，直至榻分水器中不再收集到水。将悬浮液冷却、过滤，并在滤器上干燥，得到8.13g(41%)的2-丁基-6-羟基嘧啶-4-甲酸。MS(ESI)，计算值：C9H12N2O3:196；实测值：197[M+H]。
步骤2)2-丁基-6-氯嘧啶-4-甲酰氯的合成：
Figure BDA00002598264500722
向5.0g(25.48mmol)的2-丁基-6-羟基嘧啶-4-甲酸中加入35mL三氯氧磷。将反应在105°C搅拌1小时，然后在真空中进行浓缩。将深色残余物悬浮于50mL庚烷中，然后在真空中进行浓缩，以除去大多数剩余的三氯氧磷。接着，将残余物悬浮于100mL庚烷中，并用水(3x25mL)，然后用盐水(1x25mL)萃取。将有机层用MgSO4干燥，过滤，并在真空中进行浓缩，得到5.1g(86%)的2-丁基-6-氯嘧啶-4-甲酰氯。MS(ESI)，计算值：C9H10Cl2N2O:233；实测值：234[M+H]。
步骤3)6-(溴甲基)-2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶的合成：
Figure BDA00002598264500731
根据之前WO2007/019346公开的方法制备。
步骤4)4-((2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成：
Figure BDA00002598264500732
向2.73g(13.56g)的4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯、4.75g(13.56mmol)的6-溴甲基-2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶、230mg(0.68mmol)的四丁基硫酸氢铵和5.42g(135.6mmol)氢氧化钠的混合物中加入15mL甲苯和5.4mL水。将反应在环境温度搅拌，搅拌速度足以将两层混合充分。15小时后，将反应用100mL的1M HCl(水溶液)稀释，然后用乙酸乙酯(3x25mL)萃取。将合并的乙酸乙酯层用水(1x25mL)和盐水(1x25mL)反萃取，用MgSO4干燥、过滤，并浓缩得到橙色油状物。将其经中压硅胶色谱(240g预装填柱)纯化，用50%乙酸乙酯:庚烷的等梯度混合物洗脱。4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯和产物共同洗脱。混合并浓缩含有产物的级分，然后将粗产物溶于20mL热乙酸乙酯，并用等量庚烷稀释。结晶4-((2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯，得到黄色固体，3.64g。第二批509mg与第一批一样纯。总计4.15g(65%)。MS(ESI)，计算值：C23H26N4O5S:470；实测值：471[M+H]。
该通用方法可以用于合成一系列2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶衍生物，通过选择合适的羟基成分。
步骤5)4-((2-(2-氨基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成：
Figure BDA00002598264500741
向3.64g(7.74mmol)的4-((2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯中加入2.13g(38.7mmol)铁粉、497mg(9.23mmol)氯化铵，然后加入20mL异丙醇和4mL水。将反应在回流下加热1.75小时，然后加入4mL的4M NaOH(水溶液)。将混合物在回流下加热5分钟，然后过滤。将固体与50mL的CH2Cl2一起搅拌10分钟，然后将混合物过滤。将含水异丙醇混合物在真空中进行浓缩，以除去大多数醇，然后将剩余溶液用15mL水稀释。将含水悬浮液与CH2Cl2滤液一起震摇，然后经滤纸过滤。然后将CH2Cl2层用水(1x15mL)、2M NaOH(水溶液)(1x15mL)和盐水(1x15mL)萃取，然后在真空中进行浓缩，得到泡沫状物。将其溶于30mL乙酸乙酯和30mL戊烷的混合物中，然后用2M NaOH(3x15mL)和盐水(1x15mL)萃取，用MgSO4干燥、过滤，并浓缩得到黄色固体。将粗产物悬浮于15mL的CH2Cl2中，然后装载于120g硅胶MPLC柱上，并用40-50%戊烷:乙酸乙酯梯度洗脱。浓缩含有产物的级分后，从65mL乙酸乙酯中重结晶，得到795mg(23%)的4-((2-(2-氨基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI)，计算值：C23H28N4O3S:440；实测值：441[M+H]。
步骤6)4-((2-(2-(2-丁基-6-氯嘧啶-4-甲酰胺基)苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成：
Figure BDA00002598264500742
向795mg(1.80mmol)的4-((2-(2-氨基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯在8mL的CH2Cl2中的溶液中加入0.45mL(3.2mmol)三乙胺，然后加入505mg(2.17mmol)的2-丁基-6-氯嘧啶-4-甲酰氯在2mL的CH2Cl2中的溶液。1.25小时后，将反应用30mL甲醇稀释，得到结晶沉淀。将沉淀过滤，用15mL甲醇洗涤，然后在滤器上干燥，得到4-((2-(2-(2-丁基-6-氯嘧啶-4-甲酰胺基)苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯1.04g(91%)。MS(ESI)，计算值：C23H28N4O3S:440；实测值：441[M+H]。
该通用方法用于制备3-(2-(甲基氨基)乙基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶2-基)苯基)苯甲酰胺和3,4-二甲氧基-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶2-基)苯基)苯甲酰胺，通过与合适的酰氯偶合。经过该路线通过在步骤4中与二甲基胺偶合类似地制备N-(2-(6-((二甲基氨基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)喹喔啉-2-甲酰胺。
步骤7)4-((2-(2-(6-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基氨基)-2-丁基嘧啶-4-甲酰胺基)苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成：
Figure BDA00002598264500751
向709mg(1.11mmol)的4-((2-(2-(2-丁基-6-氯嘧啶-4-甲酰胺基)苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯和267mg(1.33mmol)的4-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯的混合物中加入7mL的DMSO和0.40mL (2.24mmol)的N，N-二异丙基-N-乙基胺。将混合物在100°C在N2下加热4小时。通过1H NMR监测反应，取出等量反应液并溶于CDCl3中，然后在6ppm的低场区域观察共振。起始物料消耗后，将反应用35mL水稀释，得到颗粒状沉淀。将其过滤，并用25mL水洗涤，得到淡褐色固体。将粗固体在30mL异丙醇中重结晶，然后将产物用60mL冷异丙醇洗涤，得到674mg(76%)的4-((2-(2-(6-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基氨基)-2-丁基嘧啶-4-甲酰胺基)苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI)，计算值：C42H56N8O6S:801；实测值：802[M+H]。
步骤8)2-丁基-6-(哌啶-4-基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺(X)的合成:
Figure BDA00002598264500761
向600mg(0.75mmol)的4-((2-(2-(6-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基氨基)-2-丁基嘧啶-4-甲酰胺基)苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶-6-基)甲氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯中缓慢地加入5mL三氟乙酸，以控制剧烈冒出的气体。将溶液在环境温度搅拌10分钟，将溶剂在真空中在50°C除去。将残余物用12mL饱和NaHCO3(水溶液)稀释，得到油状悬浮液，其pH=8。将其搅拌并在80°C加热60分钟，然后冷却至环境温度，得到淡黄色沉淀。将该沉淀过滤，然后悬浮于水中，并再次过滤(3x20mL)。通过在滤器上抽吸18小时将湿固体干燥，得到364mg(81%)的2-丁基-6-(哌啶-4-基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺。MS(ESI)，计算值：C32H40N8O2S:600；实测值：601[M+H]。
实施例12.2-异丁基-6-(哌啶-4-基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺(XI)的制备：
Figure BDA00002598264500762
通过与2-丁基嘧啶类似物相似的顺序制备，通过在步骤6中替换为6-氯-2-异丁基嘧啶-4-甲酰氯。使用对2-丁基-6-氯嘧啶-4-甲酰氯所述的相同的两步方法，起始于异戊酰脒盐酸盐制备酰氯。将最终产物经反相HPLC纯化，然后用HCl水溶液处理含有产物的级分，然后浓缩得到2-异丁基-6-(哌啶-4-基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺的2HCl盐。MS(ESI)，计算值：C32H40N8O2S:600；实测值：601[M+H]。
实施例13.2-丁基-6-(2-(甲基氨基)乙基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺(XII)的制备：
Figure BDA00002598264500771
通过与2-丁基-6-(哌啶-4-基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺相似的顺序制备，在步骤7中替换为(N-Boc-N-甲基)乙二胺。将最终产物经反相HPLC纯化，然后用HCl水溶液处理含有产物的级分，然后浓缩得到2-丁基-6-(2-(甲基氨基)乙基氨基)-N-(2-(6-((哌啶-4-基氧基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)嘧啶-4-甲酰胺的2HCl盐。MS(ESI)，计算值：C30H38N8O2S:575；实测值：576[M+H]。
实施例14.N-(2-(6-(((R)-3-氟吡咯烷-1-基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)-3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酰胺(V)的制备：
步骤1)3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酸的合成：
Figure BDA00002598264500772
将(R)-奎宁环-3-醇HCl盐(1g，6.11mmol)溶于5mL的H2O中，并用NaHCO3(0.51g，6.11mmol)中和，并将混合物冷冻干燥。将残余物用EtOH萃取，并将EtOH层浓缩，得到(R)-奎宁环-3-醇游离碱，将其与DIAD(2.4mL，12.22mmol)、PPh3(1.6g，12.22mmol)和3-羟基苯甲酸甲酯(0.93g，7.33mmol)一起基本上溶于30mL的THF中，将反应混合物在室温搅拌24小时。然后将其浓缩，并在CH2Cl2和2N HCl之间分配。水层分离并洗涤(1x CH2Cl2)。将水层用NaHCO3中和，并用CH2Cl2萃取。将有机层用Na2SO4干燥，并浓缩得到3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酸甲酯(0.85g，53.2%)，其为粗品。将该粗品接受在乙醇中用LiOH水溶液的标准碱水解条件，并使之回流。完成后，将反应冷却至室温并用5N HCl中和，得到3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酸。
步骤2)3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酰氯的合成：
Figure BDA00002598264500781
将3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酸(1当量)悬浮于CH2Cl2中，并向该溶液中加入草酰氯(2.35当量)和2滴DMF。在室温1小时后，将溶剂在真空中除去，并将所得残余物放在高真空下30分钟，得到3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酰氯。
步骤3)(R)-6-((3-氟吡咯烷-1-基)甲基)-2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶的合成：
Figure BDA00002598264500782
通过之前公布的WO2007/019346的相似方法制备。将6-(溴甲基)-2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶(1当量)和(R)-3-氟吡咯烷(1当量)溶于含有Et3N(1当量)的乙腈中，并在50°C加热4小时。将反应冷却至室温，并搅拌另外60小时。通过硅胶色谱(石油醚:EtOAc:Et3N)纯化，得到(R)-6-((3-氟吡咯烷-1-基)甲基)-2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶。MS(ESI)，计算值：C17H15FN4O2S:358；实测值：359[M+H]。
步骤4)N-(2-(6-(((R)-3-氟吡咯烷-1-基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)-3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酰胺(V)的合成：
通过之前公布的WO2007/019346的相似方法制备。将(R)-6-((3-氟吡咯烷-1-基)甲基)-2-(2-硝基苯基)噻唑并[5,4-b]吡啶接受上述的标准铁还原条件，得到(R)-2-(6-((3-氟吡咯烷-1-基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯胺。将苯胺(1当量)溶于CH2Cl2中，加入三乙胺(1.8当量)。然后加入3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酰氯(0.8当量)在CH2Cl2中的溶液。1.25小时后，将反应用30mL甲醇稀释，得到结晶沉淀。将沉淀过滤，用甲醇洗涤，并在滤器上干燥，得到N-(2-(6-(((R)-3-氟吡咯烷-1-基)甲基)噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基)苯基)-3-(奎宁环-3-基氧基)苯甲酰胺。MS(ESI)，计算值：C31H32FN5O2S:558；实测值：559[M+H]。
实施例15.N-(2-(3-(哌嗪-1-基甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基)联苯-3-甲酰胺(I)的制备：
Figure BDA00002598264500792
通过Perni等(J.Med.Chem.，2009，52，1275-1283)和WO2007/019346之前报道的相似顺序制备。
该通用方法用于制备N-(2-(3-(哌嗪-1-基甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基)
Figure BDA00002598264500801
唑并[4,5-b]吡啶-2-甲酰胺和N-(2-(3-(2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基)-4-甲基-2-(吡啶-3-基)噻唑-5-甲酰胺，通过选择合适的酰氯和胺成分。
实施例16.N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(XX)的制备：
步骤12-(6-氯吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸的合成：
Figure BDA00002598264500802
通过WO2010/003048之前公开的方法制备。
该通用方法用于制备类似物：2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸。
步骤2)2-(6-氯吡啶-3-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺的合成：
通过一篇之前公布的WO2010/003048的相似路线制备。将2-(6-氯吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(250mg，0.91mol)与4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲腈(170.57mg，0.91mmol)和HATU(695.06mg，1.83mmol)溶于DMF(5mL)。加入DIEA(0.32mL，1.83mmol)，并将反应在室温搅拌过夜。将反应混合物用水稀释，并将所得固体通过真空过滤收集。通过硅胶色谱(戊烷/EtOAc)纯化，得到2-(6-氯吡啶-3-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺。MS(ESI)，计算值：C21H11ClF3N5O:442；实测值：443[M+H]。
该通用的酰胺偶合可以用于制备一系列1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺衍生物，通过选择合适的酸和胺成分。
步骤3)4-(5-(4-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯的合成：
Figure BDA00002598264500811
通过WO2010/003048之前公开的路线制备。将含有2-(6-氯吡啶-3-基)-N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(1当量)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1当量)在DMSO中的混合物在140°C在微波反应器中搅拌25分钟。将反应冷却至室温，并用水稀释。将所得固体通过过滤收集，用水洗涤并在真空下干燥，得到4-(5-(4-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI)，计算值：C30H28F3N7O3:592；实测值：593[M+H]。
步骤4)N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(XX)的合成：
Figure BDA00002598264500812
通过WO2010/003048之前公开的路线制备。将含有4-(5-(4-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.04mmol)在HCl的甲醇溶液(3N，2mL)中的混合物在室温搅拌18小时。将沉淀的固体通过过滤收集，用甲醇洗涤，干燥得到N-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-2-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺。MS(ESI)，计算值：C25H20F3N7O:491；实测值：492[M+H]。
上述通用方法用于制备N-(6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)-2-(6-(哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺和2-(2-吗啉代吡啶-4-基)-N-(3-((哌啶-4-基氧基)甲基)苯基)-1H-苯[d]咪唑-4-甲酰胺。
实施例17.2-(2-吗啉代吡啶-4-基)-N-(3-((哌啶-4-基氧基)甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(XVII)的制备：
步骤1)4-(3-氨基苄基氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成：
Figure BDA00002598264500821
将(3-硝基苯基)甲醇(1g，6.55mmol)和吡啶(19.59mmol)的混合物溶于CH2Cl2并冷却至0°C。在0°C滴加4-甲苯磺酰氯(1.57g，7.18mmol)，并在加入完成后将反应温热至室温。完成后，即将反应浓缩，用CH2Cl2稀释，淬灭并在高真空下干燥，不经任何另外纯化直接进入下一步。
在0°C，向搅拌的1-Boc-4-羟基哌啶(1.5g，6.55mmol)在CH2Cl2中的溶液中分几次加入NaH(0.19g，7.73mmol)，搅拌另外10分钟，期间加入4-甲基苯磺酸3-硝基苄基酯。接着进行标准的铁还原和脱保护，如之前所述和WO2010/003048中之前所公布。MS(ESI)，计算值：C17H26N2O3:306；实测值：307[M+H]。
步骤2)4-(3-(2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺基)苄基氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成：
Figure BDA00002598264500822
通过WO2010/003048之前公开的相似路线制备，见上述通用酰胺方法。MS(ESI)，计算值：C30H32ClN5O4:561；实测值：562[M+H]。
步骤3)2-(2-吗啉代吡啶-4-基)-N-(3-((哌啶-4-基氧基)甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酰胺(XVII)的合成：
Figure BDA00002598264500831
通过之前WO2010/003048公开的相似路线制备，见上述通用方法。MS(ESI)，计算值：C29H32N6O3:512；实测值：513[M+H]。
实施例18.N-(2-(2-(3-(二甲基氨基)丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-4-(哌嗪-1-基甲基)苯甲酰胺三盐酸盐(XIV)的合成：
步骤1)2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸的制备：
Figure BDA00002598264500832
将2,3-二氨基苯甲酸(1.07g，7.06mmol)、2-氯吡啶-4-甲醛(1.0g，7.06mmol)和Na2S2O5(1.75g，9.18mmol)溶于DMF(40mL)中，并在100°C搅拌18小时。将反应混合物冷却至室温，并用H2O(100mL)稀释。将所得混合物在室温搅拌1小时并过滤。将收集的固体用水洗涤，干燥得到2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸，其为固体(1.14g，59%产率)。MS(ESI)，计算值：C13H8ClN3O2:273；实测值：274[M+H]。
步骤2)2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酸苄酯的制备：
Figure BDA00002598264500841
向2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-甲酸(1.14g，4.17mmol)和三乙胺(0.64mL，4.58mmol)在甲苯(15mL)中的溶液中滴加DPPA(0.9mL，4.17mmol)。将混合物在室温搅拌18小时，然后加热至回流保持2小时。加入苄醇(0.65mL，6.25mmol)，并将所得混合物加热至回流保持18小时，浓缩至干，并在硅胶柱色谱上纯化(9至17%乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酸苄酯，其为黄色固体(0.69g，44%产率)。MS(ESI)，计算值：C20H15ClN4O2:378；实测值：379[M+H]。
步骤3)2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺的制备：
Figure BDA00002598264500842
将2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酸苄酯(0.69g，1.82mmol)、HBr(8mL，33wt%的乙酸溶液)和乙酸(5mL)的混合物在室温搅拌0.5小时，并将固体通过过滤收集。将固体与NaHCO3(饱和)水溶液搅拌0.5小时，通过过滤收集，干燥得到2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺，其为黄色固体(0.4g，90%产率)。MS(ESI)，计算值：C12H9ClN4:244；实测值：245[M+H]。
步骤4)4-(4-(2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯的制备：
Figure BDA00002598264500851
向2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(250mg，1.02mmol)、4-((4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)甲基)苯甲酸(360mg，1.12mmol)和HATU(583mg，1.53mmol)在DMF(10mL)中的溶液中加入N,N'-二异丙基乙基胺(0.5mL，3.06mmol)。将混合物在室温搅拌18小时，用水(40mL)稀释，并用CH2Cl2(10mLx 3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化(17%至50%乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到4-(4-(2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯，其为黄色固体(270mg，48%产率)。MS(ESI)，计算值：C29H31ClN6O3:546；实测值：547[M+H]。
步骤5)4-(4-(2-(2-(3-(二甲基氨基)丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯的制备：
Figure BDA00002598264500852
将4-(4-(2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(100mg，0.18mmol)和N,N-二甲基丙烷-1,3-二胺(0.5mL)在吡啶(2mL)中的溶液微波加热(160°C x 2小时)。将溶液浓缩，并通过制备型TLC纯化，得到4-(4-(2-(2-(3-(二甲基氨基)丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯，其为黄色固体(40mg，36%产率)。MS(ESI)，计算值：C34H44N8O3:612；实测值：613[M+H]。
步骤6)N-(2-(2-(3-(二甲基氨基)丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-4-(哌嗪-1-基甲基)苯甲酰胺三盐酸盐(XIV)的制备：
Figure BDA00002598264500861
将4-(4-(2-(2-(3-(二甲基氨基)丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(37mg，0.06mmol)在甲醇(1.0mL)中的溶液中加入4M HCl/MeOH(2mL)。将混合物搅拌1小时，并将沉淀通过过滤收集，得到N-(2-(2-(3-(二甲基氨基)丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-4-(哌嗪-1-基甲基)苯甲酰胺三盐酸盐，其为HCl盐(31mg，83%产率)。MS(ESI)，计算值：MS(ESI)，计算值：C29H36N8O:512；实测值：514[M+H]。
实施例19.4-(哌嗪-1-基甲基)-N-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)苯甲酰胺二盐酸盐(XVI)的制备：
步骤1)2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺的制备：
Figure BDA00002598264500862
将2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(70mg，0.29mmol)和丙胺(0.11mL，1.43mmol)在NMP(1mL)中的溶液微波加热(250°C x 20分钟)。将混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤并干燥。将残余物通过制备型TLC纯化，得到2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺，其为黄色固体(48mg，62%产率)。MS(ESI)，计算值：MS(ESI)，计算值：C15H17N5:267；实测值：268[M+H]。
步骤2)4-(4-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯的制备：
向2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(28mg，0.1mmol)、4-((4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)甲基)苯甲酸(20.2mg，0.13mmol)和HATU(60mg，0.16mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入N,N'-二异丙基乙基胺(0.05mL，0.31mmol)。将混合物在室温搅拌18小时，用水稀释，并将所得沉淀通过过滤收集和干燥。将固体通过制备型TLC纯化(6.25%MeOH的CH2Cl2溶液)，得到4-(4-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯，其为黄色固体(30mg，53%产率)。MS(ESI)，计算值：MS(ESI)，计算值：C32H39N7O3:569；实测值：570[M+H]。
步骤3)4-(哌嗪-1-基甲基)-N-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)苯甲酰胺二盐酸盐(XVI)的制备:
Figure BDA00002598264500872
将4-(4-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(30mg，0.05mmol)在HCl/MeOH(2mL)中的溶液搅拌0.5小时。将形成的沉淀通过过滤收集，用丙酮洗涤，干燥得到4-(哌嗪-1-基甲基)-N-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)苯甲酰胺二盐酸盐，其为HCl盐。(20mg，97%产率)。MS(ESI)，计算值：MS(ESI)，计算值：C27H31N7O:469；实测值：471[M+H]。
实施例20.N-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-3-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺盐酸盐(XV)的制备：
步骤1)3-(3-(2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的制备：
Figure BDA00002598264500881
向2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-胺(200mg，0.82mmol)、3-(1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-3-基)苯甲酸(262mg，0.9mmol)和HATU(466mg，1.23mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入N，N′-二异丙基乙基胺(0.4mL，2.45mmol)。将混合物在室温搅拌18小时，用水稀释，并将所得沉淀通过过滤收集。将固体通过硅胶柱色谱纯化(25%至50%乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到3-(3-(2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯，其为黄色固体(345mg，81%产率)。MS(ESI)，计算值：MS(ESI)，计算值：C28H28ClN5O3:517；实测值：518[M+H]。
步骤2)3-(3-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的制备：
Figure BDA00002598264500891
在密封管中，将3-(3-(2-(2-氯吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(100mg，0.19mmol)和丙胺(0.16mL，1.93mmol)在DMSO(2mL)中的溶液在140°C加热24小时。将反应混合物倒入水中，用CH2Cl2萃取，并将有机相用水洗涤，干燥并浓缩至干。将残余物通过制备型tlc纯化，得到3-(3-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯，其为棕色固体(31mg，38%产率)。MS(ESI)，计算值：MS(ESI)，计算值：C31H36N6O3:540；实测值：541[M+H]。
步骤3)N-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-3-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺盐酸盐(XV)的制备：
将3-(3-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基氨基甲酰基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(39mg，0.07mmol)在HCl/MeOH(2mL)中的溶液搅拌0.5小时。将混合物浓缩并将残余物用丙酮研磨，得到N-(2-(2-(丙基氨基)吡啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-4-基)-3-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺盐酸盐，其为HCl盐(30mg，94%产率)。MS(ESI)，计算值：C26H28N6O:440；实测值：442[M+H]。
实施例21.生物学活性
使用基于质谱的测定法来鉴定SIRT1活性的调节剂。该基于质谱的测定法利用如下的具有20个氨基酸残基的肽：Ac-EE-K(生物素)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(5TMR)-EE-NH2(SEQ ID NO：1)，其中K(Ac)为乙酰化的赖氨酸残基，Nle为正亮氨酸。该肽在C端以荧光团(fluorophore)5TMR(激发540nm/发射580nm)标记。该肽底物的序列以具有数处修饰的p53为基础。此外，用正亮氨酸代替天然存在于该序列中的甲硫氨酸残基，因为甲硫氨酸在合成及纯化期间，可能容易被氧化。
质谱测定法如下进行：将0.5μM肽底物和120μM βNAD+与10nMSIRT1在25℃在反应缓冲液(50mM Tris-乙酸盐pH 8，137mM NaCl，2.7mMKCl，1mM MgCl2，5mM DTT，0.05%BSA)中培养25分钟。可以将测试化合物加入上述的反应混合物中。将SirT1基因克隆到含有T7启动子的载体中，并将其转化到BL21(DE3)中。经与SIRT1培养25分钟后，加入10μL的10%甲酸以停止反应。将反应混合物密封并冷冻用于后续的质谱分析。测定底物肽的质量以精确地确定与脱乙酰化的肽(产物)相比的乙酰化程度(即起始物料)。
抑制沉默调节蛋白活性的对照试验通过在反应开始时加入1μL 500mM烟酰胺作为阴性对照进行（例如确定沉默调节蛋白最大抑制）。活化沉默调节蛋白活性的对照试验使用10nM沉默调节蛋白，用1μL DMSO代替化合物进行，以确定在给定的时间点在测定的线性范围内所述底物的脱乙酰基化的量。在线性范围内，该时间点与测试化合物使用的时间点相同。终点表示速度的变化。对于上述测定，SIRT1蛋白按照如下方法进行表达并纯化。将SirT1基因克隆到含T7启动子的载体中，并将其转化到BL21(DE3)中。该蛋白用1mM IPTG于18°C下诱导过夜进行表达，且表达的蛋白为N-端His-tag融合蛋白，并于30,000xg下收获。在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM Tris[2-羧乙基]膦(TCEP)，10μM ZnCl2，200mM NaCl)中用溶菌酶将细胞裂解，并进一步以超声波处理10分钟以完全裂解。将该蛋白通过Ni-NTA柱(Amersham)纯化，并收集含有纯蛋白的各级分，浓缩并通过分级柱(SephadexS200 26/60global)。收集含有可溶性蛋白的峰，并通过离子交换柱(MonoQ)进行纯化。通过梯度溶液洗脱(200mM-500mM NaCl)得到纯蛋白。将此蛋白浓缩，并用透析缓冲液(20mM Tris-HCl，2mM TCEP)透析过夜。将蛋白等分并在-80°C冷冻直到进一步使用。
使用如上所述的测定法鉴定活化SIRT1的沉默调节蛋白的调节性化合物，并且示于下面的表4中。EC1.5值表示导致SIRT1的150%活化的测试化合物的浓度。活化化合物的EC1.5值以A(EC1.5≤1μM)、B(EC1.5>1μM)表示。活化最大百分比倍数(percent maximum fold activation)用A(活化倍数≥200%)或B(活化倍数<200%)表示。
表6
Figure BDA00002598264500911
Figure BDA00002598264500931
Figure BDA00002598264500951
同等物
本发明尤其提供了沉默调节蛋白活化化合物及其使用方法。尽管已经讨论了主题发明的具体实施方式，但上述说明书是说明性的，不是限制性的。依据该说明书的说明，本发明的许多变化对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的全部范围应该参考权利要求书，以及其等同物，说明书以及其变化的全范围来确定。
参考文献的引入
本文提到的所有出版物和专利以它们的整体引入到本文中作为参考，如同每个单一的出版物或专利具体地和单独地注明被引入作为参考那样。在出现矛盾的情况下，以本申请(包括本文任何定义)为准。还以整体引入作为参考的是任何多核苷酸和多肽序列，参考与公共数据库的目录相关的登记号码，例如，由The Institute for Genomic Research(TIGR)(www.tigr.org)和/或the National Center for Biotechnology Information(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)保存的那些登记号码。

Claims (51)

1.一种检测在体外激活沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性的化合物的方法，其包括：
将沉默调节蛋白脱乙酰基酶与候选化合物以及不含荧光基团的活化底物接触，所述活化底物包括沉默调节蛋白的乙酰基化的肽、多肽或蛋白底物；
检测在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平；和
比较在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平与不存在候选化合物时沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平，
其中与不存在候选化合物时沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平相比，在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平增加表明该化合物为沉默调节蛋白活化剂。
2.权利要求1的方法，其中所述沉默调节蛋白脱乙酰基酶为SIRT1。
3.权利要求1的方法，其中所述沉默调节蛋白脱乙酰基酶选自SIRT2、SIRT3、SIRT4和SIRT5。
4.权利要求1的方法，其中所述候选化合物为含有荧光基团的乙酰基化的肽或多肽底物的SIRT1活化剂。
5.权利要求4的方法，其中所述含有荧光基团的肽底物为TAMRA-肽:Ac-EEK(生物素)GQSTSSHSKAcNleSTEGK(5-TMR)EE-NH2。
6.权利要求1的方法，其中在NAD的存在下将所述沉默调节蛋白脱乙酰基酶与不含荧光基团的活化底物和候选化合物接触。
7.权利要求1的方法，其中在可水解的NAD类似物的存在下将所述沉默调节蛋白脱乙酰基酶与不含荧光基团的活化底物和候选化合物接触。
8.权利要求1的方法，其中所述不含荧光基团的活化底物为生物素化的多肽。
9.权利要求1的方法，其中所述不含荧光基团的活化底物为desTAMRA-肽:Ac-EEK(生物素)GQSTSSHSKAcNleSTEGKEE-NH2。
10.权利要求1的方法，其中所述不含荧光基团的活化底物为不含荧光基团TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明)和AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)的乙酰基化的肽或多肽。
11.权利要求1的方法，其中所述不含荧光基团的活化底物为选自Ac-RHKKAcF-NH2和Ac-RHKKAcW-NH2的乙酰基化的肽。
12.权利要求1的方法，其中所述不含荧光基团的活化底物包括沉默调节蛋白的乙酰基化的肽、多肽或蛋白底物和携带活化辅因子的辅助蛋白。
13.权利要求12的方法，其中所述携带活化辅因子的辅助蛋白选自DBC1(乳腺癌缺失基因1)、HIC1(癌症过度甲基化基因1)、AROS(SIRT1的活化调节剂)和CLOCK。
14.权利要求1的方法，其中所述乙酰基化的蛋白选自组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、p53、p300、FOXO 1、FOXO 3a、FOXO 4、p65、HIVTat、PGC-1α、PCAF、MyoD、PPARγ和Ku70。
15.权利要求1的方法，其中通过测量NAD水解的速率检测沉默调节蛋白脱乙酰基酶活性水平。
16.权利要求1的方法，其中通过测量不含荧光基团的活化底物脱乙酰基化的速率检测沉默调节蛋白脱乙酰基酶活性水平。
17.权利要求1的方法，其中所述化合物为不含荧光基团的活化底物的SIRT1脱乙酰基化的活化剂。
18.权利要求17的方法，其中所述化合物具有下式：
Figure FDA00002598264400021
或其盐，其中：
R1选自-(CH2)3-CH3和-(CH2)CH(CH3)2；且
R2选自-哌啶和-(CH2)2-NH-CH3。
19.权利要求18的方法，其中所述化合物或其盐选自：
Figure FDA00002598264400031
20.权利要求1的方法，其还包括：
选择候选化合物，其为SIRT1活化剂，且
将该SIRT1活化剂与测试细胞接触，并检测所述测试细胞中SIRT1活化-特异性改变。
21.权利要求20的方法，其中所述SIRT1活化-特异性改变为FGF21生成增加。
22.权利要求20的方法，其中所述SIRT1活化-特异性改变为LPS-诱导的TNFα生成减少。
23.权利要求1的方法，其还包括：
选择候选化合物，其为SIRT1活化剂，且
给药该SIRT1活化剂至测试受治疗者，并在测试受治疗者中检测SIRT1活化-特异性改变。
24.权利要求23的方法，其中所述测试受治疗者为糖尿病模型小鼠，且SIRT1活化特异性改变为血糖降低。
25.权利要求23的方法，其中所述测试受治疗者为神经变性疾病模型小鼠，且SIRT1活化特异性改变为神经变性疾病过程或标记的降低。
26.权利要求25的方法，其中所述神经变性疾病选自阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、亨廷顿病和多发性硬化(MS)。
27.不含荧光基团的沉默调节蛋白底物，其具有选自Ac-RHKKAcF-NH2和Ac-RHKKAcW-NH2的结构式。
28.式(I)化合物：
Figure FDA00002598264400041
或其盐。
29.式(II)化合物：
Figure FDA00002598264400042
或其盐。
30.式(III)化合物：
Figure FDA00002598264400043
或其盐。
31.式(IV)化合物：
或其盐。
32.式(V)化合物：
Figure FDA00002598264400051
或其盐。
33.式(VI)化合物：
或其盐。
34.式(VII)化合物：
Figure FDA00002598264400053
或其盐。
35.式(VIII)化合物：
或其盐。
36.式(IX)化合物：
Figure FDA00002598264400061
或其盐。
37.式(X)化合物：
Figure FDA00002598264400062
38.药物组合物，其包含权利要求28至37中任一项的化合物，或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。
39.权利要求38的药物组合物，其还包含其它活性剂。
40.治疗罹患或易患胰岛素抵抗、代谢综合症、糖尿病或其并发症的受治疗者，或增加受治疗者胰岛素敏感性的方法，其包括给药需要的受治疗者权利要求38的组合物。
41.式(XXXI)化合物：
Figure FDA00002598264400063
或其盐，其中：
X和Y之一选自-NH-C(=O)-R1或–C(=O)-NH-R1，且X和Y的另一个为H，其中
R1选自苯基或稠合杂环，且R1任选地被1个至2个独立地选自以下的取代基取代：–C≡N、氟-取代的C1-C2烷基和–(C0-C2烷基)-饱和杂环，
且当R1为苯基时，R1任选地被–CH2-O-饱和杂环取代，其中所述饱和杂环选自哌啶、吡咯烷或哌嗪，
且当R1选自稠合杂环时，所述稠合杂环选自苯并[d]噻唑，且R1还任选地被–OCH3取代；且
Z1和Z2之一为N，且另一个为CR2，其中R2选自-NH(C1-C3烷基)、-NH(C1-C3烷基)-N(CH3)2、–(C0-C2烷基)-吗啉、–(C0-C2烷基)-哌嗪或-N(C1-C4烷基)2，其中当R2为–(C0-C2烷基)-饱和杂环时，所述饱和杂环选自吗啉或哌嗪。
42.权利要求41的具有式(XXXI)的化合物，或其盐，该化合物选自：
Figure FDA00002598264400071
Figure FDA00002598264400081
43.式(XXXII)化合物：
Figure FDA00002598264400082
或其盐，其中：
R1为任选地被–(C0-C2烷基)-吡咯烷或–(C0-C2烷基)-哌嗪取代的苯基；且
R2选自–C1-C3烷基或–(C1-C3烷基)-N(CH3)2。
44.权利要求43的具有式(XXXII)的化合物，或其盐，该化合物选自：
Figure FDA00002598264400083
45.式(XXXIII)化合物：
Figure FDA00002598264400084
或其盐，其中：
R1为任选地被–(C0-C2烷基)-哌嗪取代的苯基；且
R2选自–C1-C3烷基和–(C1-C3)-N(CH3)2。
46.权利要求45的具有式(XXXIII)的化合物，或其盐，该化合物选自：
Figure FDA00002598264400091
47.式(XXXIV)化合物：
Figure FDA00002598264400092
或其盐，其中：
Z1和Z2之一为N，且另一个选自CR2，其中
R2选自-(C0-C2烷基)-吗啉、-(C0-C2烷基)-哌嗪和-N(C1-C4)2；且
R1选自苯基和苯并[d]噻唑，其任选地被–OCH3取代，其中R1进一步任选地被1个至2个独立地选自以下的取代基取代：–C≡N、氟-取代的C1-C2烷基，且当R1为苯基时，R1进一步任选地被–CH2-O-哌啶取代。
48.权利要求58的具有式(XXXIV)的化合物，或其盐，该化合物选自：
Figure FDA00002598264400093
Figure FDA00002598264400101
49.药物组合物，其包含权利要求41至48中任一项的化合物，或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。
50.权利要求49的药物组合物，其还包含其它活性剂。
51.治疗罹患或易患胰岛素抵抗、代谢综合症、糖尿病或其并发症的受治疗者，或增加受治疗者胰岛素敏感性的方法，其包括给药需要的受治疗者权利要求50的组合物。
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