CN103084148A - 混合模式的配体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开包含固体载体、配体和连接体的基质，所述连接体包含至少一个将固体载体共价连接至配体的C，O，N或S原子；以及使用和制备这些基质的方法，和包含该基质的器件。

Description

混合模式的配体
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2011年7月27日提交的美国临时专利申请No.61/512,097的权益，其通过引用并入本文。
本发明的背景技术
本发明通常涉及混合模式或多模式相互作用的色谱制料。对于大量的生物相关分子(即生物分子)例如蛋白的增加的需求已经产生用于将这样的生物分子与生理分离物进行分离的各种技术。一种特别令人感兴趣的分离方法是液相色谱法。
在现有技术中对以下的混合模式的色谱材料存在需求：其显示出高结合载量、特异性、和回收，以及其能在色谱操作中无降解地广泛得到再生。
本发明的简述
根据本发明的基质(即substrate)和使用基质的方法的实施方式，生物物质，例如免疫球蛋白(优选单克隆抗体)优选被结合，而不结合聚集体。在一些实施方式中，免疫球蛋白IgA和/或IgM被选择性地结合。有利的是，生物物质可以被纯化，而同时除去聚集体，允许一步纯化和聚集体除去。
在一个实施方式中，本发明提供包含固体载体、配体和连接体(即linker)的基质。在一些实施方式中，该连接体包含至少一个将固体载体共价连接至配体的C、O、N或S原子。
在一个实施方式中，该配体具有式
Figure BSA00000799740200011
其中
Figure BSA00000799740200012
表示芳香或杂芳香基，其可以任选被取代。在一些实施方式中，该芳香或杂芳香基可以为单环或双环，在环体系中具有5-12个原子，且包含0-3个选自O、N和S的杂原子。
在一些实施方式中，该配体具有选自由以下所组成的组的式：
Figure BSA00000799740200013
Figure BSA00000799740200021
Figure BSA00000799740200031
Figure BSA00000799740200041
Figure BSA00000799740200042
上式中的波浪线表示配体上与连接体连接的位置。
在其它实施方式中，配体具有式
Figure BSA00000799740200043
其中
Figure BSA00000799740200044
表示选自由苯基、吡啶基、嘧啶基和萘基组成的组的芳环或杂芳环，其任选被0-4个选自由以下所组成的组的取代基取代：-H，-(C1-C6)烷基，卤素，-OH，-O(C1-C6)烷基，-COOH，-COO(C1-C6)烷基，-SO3H，-PO3H，-NO2，-NH2，
Figure BSA00000799740200045
Figure BSA00000799740200051
在一些实施方式中，
Figure BSA00000799740200052
表示苯基、吡啶基或萘基，任选被0-1个选自由-H、-COOH和-SO3H组成的组的取代基取代。在其它实施方式中，
Figure BSA00000799740200053
表示苯基，任选被0-1个选自由-H、-COOH和-SO3H组成的组的取代基取代。在另外的实施方式中，
Figure BSA00000799740200054
表示苯基，任选被0-1个选自由以下组成的组的取代基取代：
Figure BSA00000799740200055
在另外其他实施方式中，本发明提供具有选自以下组的式的基质：
Figure BSA00000799740200056
Figure BSA00000799740200061
Figure BSA00000799740200071
Figure BSA00000799740200081
Figure BSA00000799740200091
其中黑色矩形表示固体载体。
本发明也提供用于至少一种物质与样品的分离。在一个实施方式中，用基质处理包含至少一种生物物质的样品的方法包括使基质与样品接触足以使得样品中的所述至少一种生物物质结合至基质的时间段。在一个优选实施方式中，该方法包括(a)将根据本发明的实施方式的基质与包含至少一种物质的液体样品接触，其中该物质吸附至基质；和(b)调节pH、离子强度或调节两者以使该物质从基质上解吸。在一个典型的实施方式中，该方法进一步包括用平衡缓冲液洗涤在(a)中获得的基质。
在另一个实施方式中，提供用于制备基质的方法，包括通过将固体载体与双官能试剂的一个官能基接触而活化该固体载体，所述双官能试剂包含将试剂结合至固体载体的部分或全部的连接体。随后使活化的固体载体与包含配体的试剂反应以在连接体和配体之间形成结合。
附图的简单说明
图1是显示使用根据本发明的一个实施方式的基质的变化的配体密度和动态结合载量(DBC)的图。
图2是显示使用根据本发明的一个实施方式的具有对苯二胺(PDA)配体的基质的使配体密度变化和获得纯IgG的图。
图3是显示使用根据本发明一个的实施方式的基质的在10％突破pH值和电导率数值对纯BSA(牛血清白蛋白)动态结合载量(DBC)的效应的图。
本发明的详细描述
本发明的实施方式提供用于在分开和分离各种(包括感兴趣的生物物质)物质中使用的有效的吸附剂。根据本发明实施方式的基质可以应用于例如制备技术如柱色谱中。
此处所述的基质的实施方式的一个优势是其对生物物质如蛋白的高选择性和特异性。或者，或另外地，另一个优势是本基质的实施方式的高的生物分子结合载量。因此，可以操作较小体积的样品以减少处理时间和/或每单位柱容积处理大量的样品。本发明实施方式的另一个优势是基质在蛋白聚集体存在下对蛋白的选择性。这可以使得从蛋白样品中一步纯化和聚集体的除去。另外地，可以成本有效地制备基质。
基质包含固体载体和配体，该配体经由连接体而共价连结至该固体载体。在一些实施方式中，连接体包含至少一个C、O、N或S原子。
在一个实施方式中，配体具有式其中
Figure BSA00000799740200102
表示芳香或杂芳香基，其可以任选被取代。在一些实施方式中，该芳香或杂芳香基可以是单环或双环，在环系统中具有5-12个原子，且包含0-3个选自O、N和S的杂原子。
在一些实施方式中，该配体具有选自由以下基团组成的组的式
Figure BSA00000799740200103
Figure BSA00000799740200121
Figure BSA00000799740200131
Figure BSA00000799740200132
上式中的波浪线表示配体上与连接体连接的位置。
在其它实施方式中，配体具有式
Figure BSA00000799740200133
其中
Figure BSA00000799740200134
表示选自由苯基、吡啶基、嘧啶基和萘基组成的组的芳环或杂芳环，其任选由0-4个选自由以下组成的组的取代基取代：-H、-(C1-C6)烷基、卤素、-OH、-O(C1-C6)烷基、-COOH、-COO(C1-C6)烷基、-SO3H、-PO3H、-NO2、-NH2、
Figure BSA00000799740200135
Figure BSA00000799740200141
在一些实施方式中，
Figure BSA00000799740200142
表示苯基、吡啶基或萘基，任选被0-1个选自由-H、-COOH和-SO3H组成的组的取代基取代。在其它实施方式中，
Figure BSA00000799740200143
表示苯基，其任选被0-1个选自由-H、-COOH和-SO3H组成的组的取代基取代。在另外的实施方式中，
Figure BSA00000799740200144
表示苯基，任选被0-1个选自由以下组成的组的取代基取代：
Figure BSA00000799740200145
配体共价连接于将配体链接至固体载体的连接体。该连接体可以减少空间位阻和增加配体对所要结合的物质的接近性。在配体和连接体之间的连接可以是例如酰胺键。
连接体典型地包含至少一个C、O、N或S原子。在一个实施方式中，连接体包含-(CH2)m×(CH2)n-或-(CH2)m×1(CH2)n×2(CH2)p-，其中X、X1和X2是各自独立地选自O、S、NH和共价键；和m、n和p是各自独立的0、1、2、3、4、5或6。在另一个实施方式中，上述式中的1、2或3个H原子可以被同等数量的OH基团和/或甲基基团替代。
在一个实施方式中，连接体包含选自以下组的结构：
其中X1和X2的每一个独立地选自O、S和NH；和Ra、Rb、Rc和Rd的每一个独立地选自H、OH和甲基。
在另一个实施方式中，连接体包含选自以下组的结构：
Figure BSA00000799740200151
连接体将配体连接至固体载体。该固体载体可以是典型地用于色谱介质的形式，例如，例如直径约0.1μm至约1000μm的多孔或无孔珠粒或不规则颗粒。这些珠粒或颗粒可以用组合连接体和配体衍生。例如，珠粒或颗粒可以提供能用来填充柱的色谱介质。或者，在一些实施方式中，固体载体包含纤维、膜或渗透有例如以微米至几毫米(multimillimeter)的尺寸的开口或孔的海绵状材料。
合适的固体是本领域已知的。在一个实施方式中，该固体载体可以包含有机材料。示例的有机材料是多糖，如纤维素、淀粉、琼脂、琼脂糖和葡聚糖。合成的聚合物是预期的，包括取代的或未取代的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基聚合物如聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚砜和苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物、和它们的混合物。在另一个实施方式中，可以使用无机材料作为固体载体材料。这样的无机材料包括但不限于多孔矿物材料，如二氧化硅；含水溶胶的二氧化硅、氧化锆、氧化钛、氧化铝；和其它陶瓷材料。也可以使用这些材料的混合物、或两种材料的通过共聚或通过相互穿透的网络而形成的复合材料，例如在美国专利5,268,097、5,234,991和5,075,371中公开的那些。
在一个实施方式中，本发明的基质显示出至少约20μmol/ml基质、至少约30μmol/ml、或至少约40μmol/ml、或至少约50μmol/ml基质的配体密度(每单位体积基质的配体数)。在一些实施方式中，配体密度低于约180μmol/ml，例如，低于约150μmol/ml、或低于约100μmol/ml、或低于约80μmol/ml、或低于约60μmol/ml、或低于约50μmol/ml。配体密度可以在从约20μmol/ml至约180μmol/ml、从约30μmol/ml至约150μmol/ml、或从约40μmol/ml至约100μmol/ml、或从约50μmol/ml至约80μmol/ml、或从约30μmol/ml至约60μmol/ml、或从约50μmol/ml至约60μmol/ml的范围内。
本发明的其它实施方式示于以下。此处和整个全文，式中的黑色矩形表示固体载体。
在其它另外的实施方式中，本发明提供具有选自以下组的式的基质：
Figure BSA00000799740200161
Figure BSA00000799740200171
Figure BSA00000799740200181
Figure BSA00000799740200191
在另一个实施方式中，本发明包含色谱柱，其包含具有入口端和出口端和装填有本文描述的基质的实施方式的管状的部件。该管状的部件可以由任何合适的材料例如玻璃、塑料或金属制造。该装填的基质可以通过配置在管状的部件中的多孔部件而在一端或每一端邻接，所述多孔部件保持基质固定于管状的部件中。
在一些实施方式中，通过柱的液体的重力流是充分的，例如，用于将基质与液体样品、洗涤流体和/或洗脱液接触。在其它实施方式中，柱可以包含一个或多个流体移动装置以实现流体通过柱向上或向下流动。这样的装置包括泵类、注射器类和本领域已知的典型地与色谱法装备联合使用的任何其它装置。
色谱柱可以是任意合适的容积。例如，实验室规模的分离可以确保柱容积小至例如约1毫升或甚至约1微升。生物物质的大规模的纯化和分离可以在大至例如约5000升的柱上进行。更典型的容积是例如在1升和100升之间。柱通常的形状是管状的，但是在长度或直径上没有另外特别的限定。取决于柱所使用的环境，柱直径可以在例如约0.5mm至约1000mm之间变化。此外，柱长度可以在例如约50mm至约1000mm之间变化。因此，本发明预期各种尺寸和相应容积的柱。
在一个另外的实施方式中，本发明包括用于制备基质的工艺。该方法通常包括通过将固体载体与双官能试剂的一个官能基接触而活化该固体载体，所述双官能试剂包含将试剂结合至固体载体的连接体的部分或全部。活化的固体载体随后与试剂发生反应，所述试剂包含在连接体和配体之间形成结合的配体。双官能试剂可以包含至少两个官能基团，所述官能基团包括但不限于氯、溴、碘、环氧化物、羧基、酯、醛、酮、酰氨基、烯基、氰基和亚氨基。
本发明的另一个实施方式是用于至少一种物质与样品的分离的方法。在一个实施方式中，用基质处理包含至少一种生物物质的样品的方法包括将根据本发明实施方式的基质与样品接触足以使得样品中的所述至少一种生物物质结合至基质的时间段。在一个优选实施方式中，该方法包括(a)将基质与包含至少一种物质的液体样品接触，其中物质吸附于基质；和(b)调节pH、离子强度或两者以使该物质从基质上解吸。在一个典型的实施方式中，该方法进一步包含用平衡缓冲液洗涤在(a)中获得的基质。
本发明的另一个实施方式包括用于制备基质的工艺。上述的配体通过在固体载体和连接体之间、和在连接体和配体之间形成共价结合而化学固定在固体载体上。典型地，首先用双官能试剂处理固体载体，所述双官能试剂充当将形成连接体的一部分或全部的反应性基团引入到固体载体上。对于一些固体载体，例如纤维素、含水凝胶的复合物或呈现羟基的其它材料，将氢氧化物来源的羟基基团进行去质子化可能是有利的，例如，在与双官能试剂的反应之前。双官能试剂能够与固体载体和含配体的试剂这两者反应。例示的双官能试剂，其含有相同或不同的官能基团，包括但不限于环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、二溴和二氯丙醇、二溴丁烷、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜、烯丙基缩水甘油醚和烯丙基溴化物。烯丙基杂官能化含物，如烯丙基溴化物，是优选的双官能试剂。
一旦被官能化，固体载体典型地随后用一种或多种溶剂充分洗涤以除去未反应的双官能试剂、反应副产物或两者。此处所用的典型的溶剂是水。
经由与如上所述的官能化的固体载体所呈现的官能基团进行反应的试剂，可以引入配体。配体试剂可以通过本领域技术人员已知的合成工艺来制备。
通过公知的化学知识指导双官能试剂与配体试剂的特定配对。例如，用环氧化物官能化的固体载体经受与巯基、羟基或含氨基的试剂的反应以供给具有含乙烯链接基团的基质。例如用烯丙基溴化物修饰的其它固体载体，呈现可以直接与含巯基的试剂反应的烯基，由此提供含硫原子的连接体。或者，该烯基可以进一步被溴化以供给合适反应性的溴代衍生物。在另一个例示的方法中，可以使得固体载体与含硫的双官能试剂例如二乙烯基砜(DVS)反应。在该情况下，包含配体的试剂仅仅需要与由DVS活化的固体载体所呈现的乙烯基反应。
在一个可选的途径中，如上所述被活化的固体载体，可以用中间双官能试剂来处理。该反应的产物可以随后用包含配体的试剂处理。在该方面例示的例子是在上述的烯丙基活化的固体载体与巯基己酸之间的反应。生成的侧羧基可以与带有例如伯胺的方便的配体试剂反应。在使用该方法的实施方式中，可能必须使用偶联剂例如N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)的或常规已知的碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)或4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓(DM-TMM)。
固定的连接体和配体的浓度可以如在本领域中已知地变动，例如每毫升固体载体的微摩尔至几百微摩尔的分数之间，取决于用于制备固体载体的双官能试剂的浓度。固定的基团的低浓度典型地导致色谱材料的低分离载量，而高浓度通常导致增加的载量。
在某些实施方式中，本发明的基质可被用于分离和，如果需要，纯化各种物质，包括生物相关的分子和生物物质例如抗体、蛋白、糖蛋白、融合蛋白、重组蛋白、标记蛋白、酶和生物催化剂、肽类、细胞、细菌、病毒、病毒样颗粒(VLPs)、疫苗、核酸、碳水化合物和脂质类。适合于分离(和，如果需要的话，纯化)的其它物质包括低聚糖和多糖、脂多糖、多肽和合成的可溶的聚合物。生物物质典型地衍生自来源、或被包含在来源中，所述来源包括但不限于液体样品如唾液、生物流体、尿、淋巴液、前列腺液、精液、乳汁、乳汁乳清、器官提取物、植物提取物、细胞提取物、细胞培养物(包括细胞系)、发酵液、血清、腹水和转基因植物和动物提取物。如本文所使用的，生物流体包括任何与活的有机体相关的处理了或未处理的流体，特别是血液，包括全血、温血或冷血、脐带血和储存的或新鲜的血液；处理了的血液，如用至少一种生理溶液稀释的血液，所述生理溶液包括但不限于盐水、营养品和/或抗凝剂溶液；血液组分如血小板浓缩液(PC)、血小板富集血浆(PRP)、血小板贫乏血浆(PPP)、无血小板血浆、血浆、新鲜冷冻血浆(FFP)、从血浆中获得的组分、压积红细胞(PRC)、过渡区材料或血块黄层(BC)；从血液或血组分中衍生的或从骨髓中衍生的血液产物；白细胞、干细胞；从血浆中分离的和在生理溶液中或冷冻保护液中再悬浮的红细胞；和从血浆中分离的和在生理溶液中或冷冻防护液体中再悬浮的血小板。生物流体也包括包含骨髓穿刺物的生物溶液。根据本发明，生物流体在使用之前可以已经被处理以除去一些白细胞。血液产物或生物流体是指上述的组分，以及通过其它方式获得的和具有类似性能的类似血液产物或生物流体。
在上下文中，生物物质的特定优选的类别是免疫球蛋白。该“免疫球蛋白”种类覆盖全部的免疫球蛋白，包括单克隆和多克隆抗体、以及Fab、F(ab′)2、Fc和Fv片段、和其它工程抗体种类。在一个实施方式中，免疫球蛋白可以是免疫球蛋白G(IgG)。或者，或另外地，可以结合以下的任意的一种或多种：IgA、IgM、IgD和IgE。在一些实施方式中，选择性地结合IgA和/或IgM。
根据本发明实施方式的色谱分离可以包括，例如包含色谱离子交换树脂的基质，和疏水作用色谱(HIC)树脂，在一些实施方式中，包括可以在生理pH和/或离子强度下起作用的那些。本发明的基质可以根据各种方法用来分离物质，包括例如国际公开No.WO2005/073711中公开的那些。将含有一种或多种生物物质的液体样品与本发明实施方式中的基质接触足以使得至少一种生物物质结合至基质的时间段。典型地，接触时间在约30秒至约12小时之间。
处理包含至少一种生物物质的样品的方法的实施方式包括实施方式的基质与样品接触足以使得样品中的至少一种生物物质结合至甚质的时间段。
在另一个实施方式中，将至少一种物质与液体样品分离的方法包括将实施方式的基质与包含至少一种物质的液体样品接触，其中该物质吸附于基质；和调节pH、离子强度或两者，以使该物质从基质上解吸。
在该方法的一个实施方式中，至少一种物质包含抗体，例如，IgG、IgA或其抗体片段。
在该方法的一些实施方式中，样品包含生物流体，例如但不限于血浆。
在该方法的一个优选实施方式中，将基质置于柱中，且该方法包括使样品通过该柱。
如果合适，在将样品与基质接触之前可以调节液体样品的pH、离子强度或两者。另外，或任选地，可以将样品浓缩、稀释或与添加剂例如盐混合。对于一定范围的蛋白典型的捕获pH值从约4至约10，虽然该捕获pH可以更高或更低。典型地，在约4至约8的范围的pH促进蛋白被吸附到包括阳离子交换部分的那些基质，而在使用阴离子交换部分时在约6至约10的范围的pH将实现相同的作用。在一些实施方式中，在pH为约5.5时；在pH为约7.2时；在pH为约8.0时；基质可以结合蛋白。然而，基质可以在更高或更低的pH下结合蛋白。
本发明的基质不受样品的离子强度限制，以及可以与具有低和高离子强度的样品使用。许多生物物质在生理离子强度下将容易地吸附至基质。生理离子强度典型地从约15至约20mS/cm变化，尽管离子强度可以高于或低于这些数值。对应于该范围的典型的盐浓度落入约0.1至约0.2M之间、优选0.14至约0.17M中。
液体样品与基质接触的温度在样品和本领域已知的给定色谱材料之间变化。优选地，温度是环境温度，但其可高于或低于环境温度。
样品与基质接触后，优选如本领域中已知地用平衡缓冲液洗涤基质。平衡缓冲液是液体样品与基质接触时的优选pH的缓冲液。而且，该平衡缓冲液从基质洗涤没有吸附至基质的物质。合适的平衡缓冲液在本领域是已知的，和包括例如醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲的盐。该洗涤可以通过将具有结合的生物物质的基质沐浴、浸泡或浸渍入平衡缓冲液中而实现。或者，或另外地，该平衡缓冲液可以在基质上冲洗、喷洒或洗涤
期望的生物物质通常是吸附至基质的物质。在其它实施方式中，可以在例如平衡缓冲液的洗涤中除去感兴趣的生物物质。在该情况下，物质可以通过本领域中已知的方法与缓冲液分离。在另一个实施方式中，期望的生物物质不吸附至基质，但而是要除去的杂质吸附至基质。在该情况下，期望的生物物质可以通过本领域中已知的方法从上样缓冲液或洗涤缓冲液中回收。
在一个实施方式中吸附至基质的生物物质随后通过将pH调节至该物质解吸的值而被解吸。解吸发生的pH取决于物质和给定的基质。例如，对于包含阴离子交换部分的基质，解吸典型地在约从pH8开始和下降到约pH3的pH梯度发生。对于包含阳离子交换部分的基质，应用的pH梯度典型地在约pH4开始和下降到约pH11。对于特性主更为疏水基团的基质，用于解吸的pH梯度典型地在约pH7开始和下降到约pH3。对于特性主要为疏水基团的基质，优选地是也如下所述应用离子强度梯度。该pH可以通过任意常规可获得的试剂、例如Tris-HCl的水溶液或醋酸盐缓冲液来调节。
在一些情况中，如上所提及地，洗脱液离子强度的调节可以增加基质的有效性。因此，对于主要包含疏水基团的基质，离子强度可以伴随着pH而被降低。这对于另外包含可以引起轻微的离子电荷的-NH-部分的材料来说尤其如此，所述离子电荷在当离子强度降低时变得更有效。盐梯度的应用在本领域中是已知的。典型地，用于本基质的盐浓度需要不超过约1.0M或约0.5M。
典型地，被解吸的生物物质随后被收集，以及如果需要可以被进一步处理。根据本发明的实施方式的被纯化的生物物质如抗体的典型纯度为约70％或更高，在一些实施方式中约85％或更高，和更优选约90％至约99％。
在一些实施方式中，本发明的基质可以用于纯化生物物质并同时除去聚集体，使得一步纯化和聚集体除去。在一些实施方式中，基质优选结合生物物质如免疫球蛋白(优选单克隆抗体)，而不结合聚集体。因此，如上所述，包含要被纯化的生物物质的样品可以与基质接触；生物物质将被吸附至基质；以及杂质和聚集体将通过。如上所述，被纯化的生物物质可以随后被解吸和收集。在一些实施方式中，被纯化的生物物质中聚集体的量小于例如约10％，如小于约5％，或小于约2％，或小于约1％。
上面提及的实施方式的许多包括将含有生物物质的溶液与基质接触，并由基质而选择性吸附溶液中的至少一种生物物质。在期望的生物物质被结合到基质的情况下，后者的洗脱使得它或它们以纯化的和浓缩的形式被分离和收集。如果期望的生物物质保留在处理的溶液中(其它的生物物质被结合到基质上)，然后通过收集洗脱液可以直接获得期望的分离。
优选地，根据本发明实施方式的基质可以无降解重复地得到再生。再生可以通过本领域技术人员已知的工序进行。例如，在使用后，基质可以与再生溶液例如氢氧化钠水溶液接触。在一个实施方式中，基质与5个柱容积的1M NaOH接触，最小接触时间为30分钟。或者或另外地，基质可以与酸溶液例如盐酸水溶液或醋酸水溶液接触。在一个实施方式中，基质与5个柱容积的0.1M HCl或0.1M醋酸接触，最小接触时间为30分钟。或者或另外地，基质可以与盐溶液例如氯化钠水溶液接触。在一个实施方式中，基质与5个柱容积的1M NaCl接触，最小接触时间为30分钟。在再使用之前，优选用平衡缓冲液洗涤基质。再生溶液的接触时间和组成和浓度，可以由本领域的技术人员基于配体的特性和进料的组成来选择以确保再生是有效的。
上述的例示的分离方法可以被用于各种技术，包括，例如，应用固定床、流化床、批色谱的制备方法中。或者，这些方法可以在例如利用例如较小的装置如离心柱或多孔板的高通量分离技术的背景中实施，所述较小的装置中装置容积可以小至几微升。
当使用分批吸附/分离时，基质可以直接添加到生物物质的溶液中，并且将基质/生物物质混合物典型地轻微搅拌足以使得生物物质结合至基质的时间。具有被吸附的生物物质的基质，可以随后通过例如离心或过滤而除去，以及生物物质随后在分离步骤中从基质上被洗脱。
在另一个实施方式中，可以使用柱色谱。在固定床柱色谱中，基质被装填入柱中，含有待分离的生物物质的溶液通过将其以使得生物物质结合到基质的速率灌注通过基质而被施用到基质。
在流化床柱色谱中，使用上升的过滤流和大的/密集的颗粒以保持抗上升力的平衡。使用典型地由相互重叠的1-5个段构成的基本上垂直的柱，以及溶液依次通过各个段并通过在上面的段的上部上的溢出而排出。优选地，柱有三段。每段，除了最高的那段，被两分配系统所分离，一个在所述段的底部分配溶液，另一个朝向位于正上方的段分配溶液。
在一个实施方式中，与包含其它基质的柱串联地使用包含本基质的柱，在将杂质从样品中除去的方面是有效的。因此，本柱的一个或多个优势可以视为对其它或常规柱的补充。在该情况下，这样的柱的串联排列将保存洗脱液和平衡缓冲液，因此减少(如果不清除)对于另外的样品操作和制备的需求。
下面的实施例进一步例示本发明，但当然，将不被认为是以任何方式限制其范围。
实施例1
本实施例示例说明用于合成配体试剂2-(3-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(异丙氧基羰基氨基)苯甲酰胺基)乙酸甲酯的工艺。
将甘氨酸甲酯盐酸化物(675mg，5mmol)溶解于DMF(15ml)和羟基苯并三唑(HOBt)(675mg，5mmol)中，加入3-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(异丙氧基羰基氨基)苯甲酸(1.76g，5mmol)。冷却反应混合物至0℃并缓慢加入N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)(1.54mL，10mmol)。在0℃下进一步将反应混合物搅拌5分钟并在室温下过夜。加入水(100ml)和持续搅拌另外20分钟，随后加入乙酸乙酯(100ml)。将粗产物搅拌另外5分钟，并分离有机层。用2×70ml乙酸乙酯进一步提取水相，并用水洗涤合并的有机相，用Na2SO4干燥并在真空下浓缩。
具有在乙酸乙酯/己烷1：1中的硅胶柱的色谱给予1.65g、3.9mmol白色固体，78％收率。1H NMR(CDC13)δ：7.72(s，1H，芳族的)，7.50(s，2H，芳族的)，6.50(s，1H，酰胺)，6.60(s，2H，酰胺)，4.22(dd，2H，)，3.80(s，3H)，1.55(s，18H)。LCMS(离子模式：ESI)m/z[M-H+]计算422.20，实测422.00，[M+Na]+466.07。
实施例2
本实施例示例说明制备纤维素的对苯二胺(PDA)衍生物的工艺。
用1M氢氧化钠溶液然后用水充分洗涤纤维素珠粒的50％浆料100ml直到获得中性pH。向排干的(drained)50ml珠粒加入50ml pH11-12的氢氧化钠溶液和5ml氯乙酸。然后将产生的混合物在60℃下搅拌24小时。使得反应混合物冷却至室温，洗涤以除去未反应的氯乙酸，然后中和。
珠粒的COOH的密度为60μmol/ml以及对于各种官能基的连结通过酸碱滴定来确定。
在pH4.7的0.1MMES缓冲液中在EDC(2.1mmol)存在下将10ml在60μmol/ml的COOH的羧甲基纤维素的珠粒与N-Boc-对苯二胺(0.374g，1.8mmol，3当量)偶联。洗涤该反应混合物以除去过量的Boc-对苯二胺和副产物。用3M HCl除去该BOC保护基团以获得以下所示的材料：
Figure BSA00000799740200252
产物是白色的，且配体密度为40μmol/ml珠粒，其通过氮元素分析而确定。将产物在4-8℃下以50％浆料的形式在pH7的磷酸盐缓冲液(PBS)中储存。
实施例3
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的对苯二胺(PDA)衍生物的工艺。
将抽湿成湿润饼的交联纤维素珠粒100g与水(75g)、32％NaOH(19.5g)和烯丙基溴化物(18.75g)混合。在室温下搅动该混合物24小时。
将珠粒充分洗涤以除去未反应的烯丙基溴化物和副产物，产生烯丙基-纤维素作为用于各种官能的连结的基质。
将抽吸干燥成湿润饼的烯丙基-纤维素珠粒100g与水(99g)和pH11-12的2-巯基乙酸(1.0g)混合，混合物在室温下搅动48小时。将产生的羧基衍生物洗涤以除去副产物，产生酸活化的纤维素作为用于各种官能基的连结的基质。使用元素分析而确定酸密度为90μmol/ml的珠粒。
然后，在EDC(3当量)的存在下将获得的酸活化的珠粒的50％浆料的10.0ml用在pH4.7的0.1M MES缓冲液中的Boc-对苯二胺的(0.562g，2.7mmol，3当量)浓缩。在室温下振荡反应混合物12小时。将混合物充分洗涤以除去未反应的Boc-对苯二胺和反应的副产物。用3M HCl除去该BOC保护基团以获得以下所示的材料：
Figure BSA00000799740200261
产物是白色的，且通过氮元素分析确定，对苯二胺配体密度为78μmol/ml珠粒。产物在4-8℃下以50％浆料在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例4
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的间苯二胺纤维素衍生物的工艺。
在EDC(3当量)的存在下将根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml用在pH4.7的0.1M MES缓冲液中的N-Boc-间-苯二胺的(0.562g，2.7mmol，3当量)浓缩。用3M HCl除去该BOC保护基团以产生以下所示的材料：
Figure BSA00000799740200262
产物是白色的。通过氮元素分析确定，配体密度为62μmol/ml珠粒。产物在4-8℃下以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
通过偶联间-苯二胺替代N-Boc-间-苯二胺而制备相同的产物，且配体密度为64μmol/ml珠粒。
实施例5
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的邻苯二胺的纤维素衍生物的工艺。
在EDC(3当量)的存在下将根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml用在pH4.7的0.1M MES缓冲液中的Boc-邻苯二胺的(0.562g，2.7mmol，3当量)浓缩。将反应混合物在室温下振荡24小时。充分洗涤混合物以除去未反应的Boc-邻苯二胺和反应的副产物。用3M HCl除去该BOC保护基团以获得以下所示的材料：
Figure BSA00000799740200271
产物是白色的，通过元素分析确定，配体密度为40μmol/ml珠粒。产物以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例6
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的4，6-二氨基嘧啶衍生物的工艺。
在EDC(3当量)的存在下将根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml用在pH4.7的0.1MMES缓冲液中的4，6-二氨基嘧啶盐酸盐的(0.395g，2.7mmol，3当量)在室温下浓缩12小时。洗涤产物以除去未反应的4，6-二氨基嘧啶和副产物。
Figure BSA00000799740200272
用4，6-二氨基嘧啶衍生的珠粒是白色的。确定配体密度为30μmol/ml珠粒。珠粒可以在4-8℃下以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例7
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的2，4，6-三氨基嘧啶衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml以除去储存溶液，然后用在pH4.7的0.1M MES缓冲液洗涤。之后，将珠粒与溶解于0.1M MES(3ml)和2M HCl(1.75ml)的3.5mmo12，4，6-三氨基嘧定混含，随后添加EDC(1.5mmol)。将反应混合物在室温下搅动3小时，洗涤充分的洗涤以除去未反应的试剂和副产物。
产物是白色的，通过元素分析而确定配体密度为30μmol/ml珠粒。产物以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例8
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的1，5-二氨基萘衍生物的工艺。
在EDC(3当量)的存在下将根据上面实施例3所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml用在甲醇和在pH4.7的0.1MMES缓冲液的混合物中的1，5-二氨基萘的(0.427g，2.7mmol，3当量)在室温下浓缩12小时。然后将产物充分洗涤以除去未反应的二胺和副产物。
Figure BSA00000799740200281
由1，5-二氨基萘衍生的珠粒是灰粉红色的。通过元素分析来确定配体密度为41μmol/ml珠粒。产物是稳定的且可以在4-8℃下以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例9
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的2，5-二氨基吡啶衍生物的工艺。
在EDC(5当量)的存在下将根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml用在pH4.7的0.1M MES缓冲液中的(0.491g，3mmol，3当量)2，5-二氨基吡啶盐酸盐浓缩。充分洗涤产物以除去未反应的试剂和副产物。
Figure BSA00000799740200282
用2，5-二氨基吡啶衍生的珠粒是白色的。通过元素分析确定配体密度为58μmol/ml珠粒。产物可以在4-8℃下以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例10
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的2，4，6-三甲基-1，3-苯二胺衍生物的工艺。
在EDC(3当量)的存在下将根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml用在甲醇和在pH4.7的0.1MMES缓冲液的混合物中的2，4，6-三甲基-1，3-苯二胺的(0.405g，2.7mmol，3当量)浓缩。洗涤产物以除去副产物和未反应的试剂。
Figure BSA00000799740200283
用2，4，6-三甲基-1，3-苯二胺衍生的珠粒是白色的。通过元素分析确定配体密度为72μmol/ml珠粒。
实施例11
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的四甲基-对苯二胺衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml以除去储存液，然后用pH4.7的0.1MMES缓冲液洗涤。添加溶解于甲醇(4ml)的2，3，5，6-四甲基-1，4-苯二胺(4.0mmol)，接着添加溶解于0.1MMES缓冲液的EDC(4.0mmol)至珠粒中。搅动珠粒过夜并充分洗涤以除去过量的二胺和副产物。
Figure BSA00000799740200291
产物是白色的，其配体密度为65μmol/ml珠粒，通过元素分析确定。产物以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例12
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的3，5-二氨基苯甲酸衍生物的工艺。
在EDC(3当量)的存在下将根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml用在甲醇和在pH4.7的0.1M MES缓冲液的1∶1混合物中的3，5-二氨基苯甲酸的乙基酯的(0.486g，2.7mmol，3当量)浓缩。然后在室温下使用1M NaOH进行皂化反应12小时以产生以下所示的产物：
Figure BSA00000799740200292
用该二氨基苯甲酸衍生的珠粒是灰白色的。通过元素分析确定配体密度为40μmol/ml珠粒。
实施例13
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的2-甲氧基-5-叔-丁基-1，3-苯二胺衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml以除去储存液，然后用pH4.7的0.1MMES缓冲液洗涤。添加溶解于甲醇(4ml)的4-叔-丁基-2，6-二氨基苯甲醚(4.0mmol)，接着添加溶解于0.1M MES的EDC(4.0mmol)。将珠粒搅动过夜并充分洗涤以除去过量的二胺和副产物。
Figure BSA00000799740200293
产物是白色的，可以以为50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例14
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的2，6-二氨基吡啶衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的5.0ml以除去储存液，然后用pH4.7的0.1M MES缓冲液洗涤。珠粒与溶解于0.1M MES(2ml)和2M HCl(1.75ml)的2，6-二氨基吡啶(382mg，3.5mmol)混合。加入溶解于0.1M MES(1.5ml)的EDC(306mg，1.6mmol)。将珠粒在室温下搅动过夜和充分洗涤以除去未反应的试剂和副产物。
Figure BSA00000799740200301
偶联的配体的密度通过元素分析而确定为26μmol/ml珠粒。产物是白色的并且可以以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例15
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的4-硝基-1，2-苯二胺衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的6.0ml50％浆料以除去储存液，然后用pH4.7的0.1M MES缓冲液洗涤。添加溶解于甲醇(4ml)的4-硝基-1，2-苯二胺(2.4mmol)，接着加入溶解于0.1MMES(2ml)的EDC(2.4mmol，458mg)。将珠粒在室温下搅动过夜和充分洗涤以除去未反应的试剂和副产物。
Figure BSA00000799740200302
最终的产物是橙色的和可以以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例16
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的4，5，6-三氨基嘧啶衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的5.0ml50％浆料以除去储存液，然后用pH4.7的0.1M MES缓冲液洗涤。添加悬浮于0.1M MES(4ml)的4，5，6-三氨基嘧啶硫酸盐(3.2mmol，702mg)，接着加入溶解于0.1MMES(1ml)的EDC(1.5mmol，280mg)。将反应混合物搅动3小时和充分洗涤以除去未反应的试剂和副产物。
Figure BSA00000799740200303
最终的产物是白色的且可以以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例17
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的4-氯-2，6-二氨基吡啶衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的5.0ml50％浆料以除去储存液，然后用pH4.7的0.1M MES缓冲液洗涤。珠粒与溶解于0.1MMES(3ml)和2M HCl(1.75ml)的4-氯-2，6-二氨基吡啶(3.5mmol)混合，接着加入EDC(1.5mmol)。将反应混合物在室温下搅动3小时，并充分洗涤以除去未反应的试剂和副产物。
Figure BSA00000799740200311
最终的产物是白色的且可以以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例18
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的2，4-二氨基嘧啶衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的10.0ml50％浆料以除去储存液，然后用pH4.7的0.1M MES缓冲液洗涤。随后珠粒与溶解于0.1M MES(6ml)和2M HCl(3.5ml)的2，4-二氨基嘧啶(7.0mmol)混合，接着加入EDC(3.0mol)。将反应混合物在室温下搅动3小时，且充分洗涤以除去过量的试剂和副产物。
Figure BSA00000799740200312
最终的产物是白色的且可以以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例19
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的2，5-二氨基苯磺酸衍生物的工艺。
用水充分洗涤根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的5.0ml50％浆料以除去储存液，然后用pH4.7的0.1M MES缓冲液洗涤。随后珠粒与溶解于0.1MMES(3ml)和1M NaOH(1.5ml)的2，5-二氨基苯磺酸(300mg，1.6mmol)混合，接着加入溶解于0.1M MES(2ml)的EDC(306mg，1.6mmol)。珠粒在室温下搅动24小时，且充分洗涤以除去过量的试剂和副产物。
配体的密度通过元素分析而确定为28μmol/ml珠粒。最终的产物可以以50％浆料的形式在pH7的PBS缓冲液中储存。
实施例20
本实施例示例说明制备具有含硫连接体的纤维素的3，4-二氨基苯甲酸衍生物的工艺。
在EDC(3当量)的存在下将根据上述实施例3中所述的方案获得的酸活化的纤维素珠粒的50％浆料的10ml用在甲醇和pH4.7的0.1M MES缓冲液的1∶1混合物中的3，4-二氨基苯甲酸的乙基酯的(0.486g，2.7mmol，3当量)浓缩。然后在室温下使用1M NaOH进行皂化12小时以产生以下所示的产物：
Figure BSA00000799740200321
用该二氨基苯甲酸衍生的珠粒是灰白色的。通过元素分析确定配体密度为70μmol/ml树脂。
实施例21-45
根据实施例8中所述的方案制备在下列表1中所示的具有含硫连接体和配体的纤维素衍生物，替代实施例19中的2，5-二氨基苯磺酸的合适的配体试剂。
表1
Figure BSA00000799740200331
Figure BSA00000799740200341
实施例46
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的固体基质从粗人血浆中分离和纯化IgG的方法。
用根据实施例3制备的固体基质装填1-ml柱。用pH7.2的20mM的磷酸盐缓冲液平衡该固体基质。
接着，在平衡缓冲液中将10ml粗人血浆样品稀释1∶1，过滤通过0.2μm膜，以及将12ml直接上并于柱上。然后用pH7.2的20mM磷酸盐缓冲的0.5M NaCl洗涤柱，以确保没有被吸附的蛋白的清除。通过用pH7.2的20mM磷酸盐缓冲液洗涤柱来除去结合的杂质。
用pH4.0的20mM醋酸盐缓冲液洗脱期望的IgG。收集25mg IgG且估计其纯度为＞99％。
实施例47
本实施例示例说明使用根据本发明的另一实施方式的固体基质从粗人血浆中分离和纯化IgG的方法。
用根据实施例9制备的固体基质装填1-ml柱。用pH7.4的20mM磷酸盐缓冲液平衡该固体基质。
接着，在平衡缓冲液中将10ml人血浆样品稀释1∶1，过滤通过0.2μm膜，以及将20ml直接上样于柱上。然后用pH7.2的20mM磷酸盐缓冲的0.15M NaCl洗涤柱，以确保没有被吸附的蛋白的清除。通过用pH7.2的20mM磷酸盐缓冲液洗涤柱以除去结合的杂质。
用pH5.0的20mM醋酸钠缓冲液洗脱期望的IgG。收集35mg期望的IgG且估计其纯度为＞99％。
实施例48
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质、用变化的配体密度可以实现良好的动态结合载量。
根据实施例3制备固体基质，除了改变对苯二胺与酸活化的珠粒偶联条件(改变苯二胺和EDC相对于酸密度的化学计量学)以产生具有变化的配体密度的样品。
对于各基质样品的IgG动态蛋白结合载量(DBC)在根据UNICORN软件设备的Explorer 100LC工作站(GE Healthcare Biosciences，Pittsburgh，PA)上确定。平衡和洗涤流速是1ml/min，和上样流速是0.33ml/min(3min停留时间)。将人IgG上样至50％突破(BT)。来自于Amersham 18-0383-01的HR5/5柱(直径5mm和长度5cm，容积＝lml)用于树脂填充，和使用UltraSpec1000来确定A280读数。使用2.0mg/ml浓度的商业的IgG(SeraCare LifeSciences，批号G111RM-25B0802)。IgG的上样缓冲液是pH7.2的20mM NaH2PO4以及平衡和洗涤缓冲液也是pH7.2的20mM NaH2PO4。洗脱缓冲液是0.1M醋酸，pH3.1。洗脱的动态结合载量通过测量所有的洗脱组分中蛋白的量来计算。回收通过洗脱中的蛋白的量除以实际结合到柱的蛋白的量(结合到柱的蛋白的量＝上样到柱的蛋白的量-在突破和洗涤中的蛋白)来计算。使用等式：(上样中的蛋白浓度)*(V10％BT-V空隙)来计算在10％突破的结合载量。通过1％丙酮的注射来测量系统和柱的空隙容积。
一种基质样品的配体密度和动态结合载量示于图1中。测试的基质即使在约50μmol/ml的低配体密度或更高的配体密度下显示良好的动态结合载量。
实施例49
本实施示例说明使用根据本发明的实施方式的基质，配体密度可以变化，但依然获得纯IgG。
根据实施例3制备固体基质，除了改变对苯二胺与酸活化的珠粒的偶联条件(改变苯二胺和EDC相对于酸密度的化学计量学)以产生具有变化的对苯二胺(PDA)配体密度的样品。将各固体基质样品上样于分离柱中并用于从人血浆中纯化IgG，如实施例46中所述。
从各基质样品中获得的IgG纯度示于图2。甚至在如35μmol/ml这样低的配体密度下，获得99％纯度的IgG。对于具有35μmol/ml或更高的配体密度的基质，没有观测到具有配体密度的IgG纯度的显著升高。
实施例50
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质的结合IgG相对于停留时间。
根据实施例3制备固体基质。相据以下工序将各固体基质样品上样于分离柱和用于结合纯IgG：将在pH7.2的磷酸盐缓冲液中并且6mS/cm的电导率的IgG 2mg/ml上样至各柱直到其达到50％BT。然后用0.5M NaCl洗涤柱以除去吸附于珠粒的IgG。然后使用pH3.1的0.1M醋酸缓冲液洗脱IgG。
表2中显示对于测试的各停留时间、在10％突破的结合的和洗脱的IgG的量、在pH3的百分比回收量。基质在6分钟停留时间显示出高的结合载量，且对于各种停留时间IgG的回收量是高的。
表2
停留时间(min) 结合的(mg/ml) 洗脱的(mg/ml) 回收(％)
3 24.4 23.5 96.3
4 31.0 29.6 95.5
6 40.9 37.7 92.3
实施例51
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质，pH对于IgG结合和回收的影响。
根据实施例12制备固体基质。根据以下工序将各固体基质样品上样于分离柱并用于从人血浆纯化IgG：将在各种具有可变的pH(5-8.5)(参见表2)的缓冲液中和6mS/cm的电导率的IgG2mg/ml上样至各柱直至达到10％的BT。然后用0.5M NaCl洗涤柱以除去吸附于珠粒的IgG。然后使用pH3.1的0.1M醋酸缓冲液洗脱IgG。
表3中示出对于各测试的pH值在10％突破结合的和洗脱的IgG的量、以及百分比回收量。在测试的所有pH值中，至少结合的IgG的98.8％被回收。对于该配体pH5.5是最佳的上样pH。
表3
pH 在10％BT结合的IgG 在10％BT洗脱的IgG 回收(％)
5.0 19.2 19.2 100
5.5 25 24.8 99
6.0 24.3 24.0 98.8
7.2 19.1 19.0 ～100
8.5 3 3 100
实施例52
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质用于从粗人血浆中的IgG的纯化的基质的再利用。
根据实施例3制备固体基质并将其上样于柱中，且根据在实施例46中所述的工序用于处理包含IgG的生物物质的样品。洗脱后，使用1M NaOH以1ml/分钟的流速将该固体基质再生，以及再次根据相同的工序用于处理包含IgG的生物物质的样品。第二次重复再生和再利用的循环，用于3个生物样品的总处理。
各循环的IgG结合的量和纯度示于表4。即使在重复使用后，基质产生高纯度的IgG。
表4
试验# 停留时间(min) 来自洗脱的结合(mg/ml) 纯度(％)
1 3 25.1 98.3
2 3 22.0 99.4
3 6 23.0 99.7
实施例53
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质的从粗人血浆的IgG纯化(3分钟停留时间)。
根据实施例3，4，9，10和11制备固体基质。如实施例46中所述将各固体基质样品上样于分离柱和用于从人血浆纯化IgG。
对于各测试的基质的洗脱的IgG的量和纯度示于表5。所有测试的基质产生高纯度的IgG。
表5
Figure BSA00000799740200391
实施例54
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质在10％突破的纯IgG的结合和回收(3分钟停留时间)。
根据实施例3，10，11和13制备固体基质。如实施例50中所述将各固体基质样品伏在于分离柱和用于结合纯IgG。
对于各基质在10％突破和3分钟停留时间所结合的和洗脱的IgG的量、以及百分比回收示于表6。
表6
Figure BSA00000799740200392
Figure BSA00000799740200401
实施例55
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质在10％突破的Fab的结合和回收。
根据实施例3，4，5和8制备固体基质。在以下条件下将各固体基质样品上样于分离柱和用于结合纯Fab：将Fab在100mM Tris-HCl、pH7.4的10mM EDTA缓冲液中的0.5mg/ml溶液上样于各柱中直到达到10％的突破。然后用平衡缓冲液(100mM Tris-HCl和pH7.4的10mMEDTA)洗涤柱，以及用pH3的300mM甘氨酸缓冲液洗脱Fab。
对于各基质在10％突破和3分钟停留时间的Fab的动态结合载量(DBC)、以及百分比回收示于表7。
表7
Figure BSA00000799740200402
实施例56
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质的单克隆抗体结合相对于停留时间。
根据实施例3制备固体基质并将其上样于柱中，且根据以下工序用于结合纯的单克隆抗体：将在pH7.2的磷酸钠缓冲液中6mS/cm电导率的2mg/ml mAb上样至各柱中直到在各种停留时间下其达到10％的突破。用20mM磷酸钠缓冲液和500mM NaCl洗涤柱，以及用pHH4.0的20mM醋酸钠洗脱mAb。
结合至基质的和从基质洗脱的单克隆抗体的量、以及百分比回收示于表8。基质显示出在短的停留时间下的单克隆抗体的高回收。
表8
停留时间(min) 结合的(mg/ml) 洗脱的(mg/ml) 回收(％)
3 41.0 40.3 98.2
4 46.7 46.5 99.6
6 62.0 58.3 94.0
实施例57
本实施例说明使用根据本发明实施方式的基质的单克隆抗体的结合相对于停留时间。
根据实施例20制备固体基质，并将其上样于柱中，且根据以下工序用于结合纯的单克隆抗体：将在pH5.5的磷酸钠与150mM NaCl中15mS/cm的电导率的2mg/ml mAb上样至各柱中直到在各种停留时间下达到10％的突破。用20mM磷酸钠和150mM NaCl(具有15mS/cm的电导率)洗涤柱，和用pH8.0的250mM NaCl(具有25mS/cm的电导率)和50mM磷酸钠洗脱mAb。
结合至基质的单克隆抗体的量、以及百分比回收示于表9。基质显示出在短停留时间下的单克隆抗体的高回收。
表9
停留时间(min) 结合的(mg/ml) 回收(％)
3 37.3 ～98
4 47.0 ～95
6 68.3 ～92
实施例58
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质在10％突破和3分钟停留时间的单克隆抗体结合和回收。
根据实施例3，4，8和9制备固体基质。如实施例56中所述将各固体基质样品上样于分离柱中和用于处理包含单克隆抗体的生物物质样品。
对于各基质在10％突破和3分钟停留时间的mAb的动态结合载量(DBC)、以及与百分比回收示于表10。
表10
Figure BSA00000799740200421
实施例59
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质的聚集体除去。
根据实施例4和5制备固体基质。将各固体基质样品上样于分离柱中和根据实施例56中所述工序用于处理包含75.5％单克隆抗体和24.5％聚集体的生物材料的样品。
用基质处理后在样品中单克隆抗体和聚集体的量示于表11。用实施例3中所述的基质处理后，产生的产物具有91.9％的单克隆抗体和8.1％的聚集体。对于用实施例3中所述的基质处理的样品，观测到与聚集体相比在单克隆抗体的比例上甚至更大的增加，其在处理后具有99.0％的单克隆抗体和1.0％的聚集体。
表11
Figure BSA00000799740200431
实施例60
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质的IgG静态结合载量。
根据实施例3-12，14，15和19-45制备固体基质。通过将27mg约94％纯度的人冻干IgG(SeraCare Life Sciences，批号G111RM-25B0802)溶解于10ml PBS中而制备2.5mg/ml的IgG溶液以进行IgG静态结合分析。一式二份地制备一系列的IgG溶液的稀释液，以及在280nm处确定UV吸光率。吸光率值被用于绘制成相对于标称浓度的图表，该图的斜率用于计算使用1.43作为IgG消光系数的稀释液中的实际的IgG浓度。一式两份地将50μL的珠粒的每份样品在PBS中的1：1浆料移液到分离的1.5ml微型离心机中，并将1ml在PBS中的2.5mg/mlIgG添加到各管中。将管子旋转2小时和在2分钟内停止旋转。然后将每份样品的120μL移液到96-孔板中，和在280nm处读取UV吸光度。
对于各基质的静态结合载量和配体密度示于表12。基质即使在低配体密度下也示出高静态结合载量。
表12
Figure BSA00000799740200432
Figure BSA00000799740200441
Figure BSA00000799740200451
Figure BSA00000799740200471
实施例61
本实施例示例说明使用相据本发明实施方式的基质的BSA(牛血清白蛋白)的静态结合载量。
根据实施例22-26，29-31，34，35，37，38，41，42和44制备固体基质。通过将22mg约96％纯度的BSA粉末(Sigma Aldrich，批号106K0687)溶解于pH4.7的10ml0.1MMES中以获得2mg/ml的BSA溶液而进行BSA静态结合分析。一式两份地制备一系列的BSA溶液的稀释液，以及在280nm处确定UV吸光率。吸光率值用于绘制成相对于标称浓度的图表，该图斜率用于计算使用0.625作为BSA消光系数的稀释液的实际的BSA浓度。一式两份地将50μL的珠粒的每份样品在pH4.7的0.1MMES中的1∶1浆料移液到分离的1.5ml微型离心机中，并将1ml在pH4.7的0.1M MES中的2mg/mlBSA添加到各管中。将管子旋转2小时和在2分钟内停止旋转。然后将每份样品的120μL移液到96-孔板中，和在280nm处读取UV吸光度。
对于各基质的静态结合载量和配体密度示于表13中。这些基质即使在低配体密度下也示出高静态结合载量。
表13
Figure BSA00000799740200491
Figure BSA00000799740200511
实施例62
本实施例示例说明使用根据本发明实施方式的基质在10％突破pH和电导率值对纯牛血清白蛋白(BSA)动态结合的影响。
根据实施例20制备固体基质。将各固体基质样品上样于分离柱，和根据以下工序用于确定BSA的动态结合载量(DBC)：将具有变化的pH(3.4-8.5)和变化的电导率(0-80mS/cm)的各种缓冲液中的BSA2mg/ml上样于各柱中直到达到10％的突破(图3)。然后用上样缓冲液(例如，pH4.7和15mS/cm的电导率)洗涤柱以除去吸附到基质的BSA。然后用50mM的pH8.0的磷酸钠盐缓冲液和250mM NaCl洗脱BSA。
对于各测试的pH和电导率的组合在10％突破结合的BSA的量示于图3中。在pH值高于或等于6.0时，在电导率高于5mS/cm下观测到没有BSA结合。在pH3.4时，BSA的结合载量随着电导率的升高而升高。对于该配体，pH4.7是最佳的上样pH，电导率低于或等于15mS/cm。
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本发明的优选实施方式在本文中被描述，包括发明人用于实施本发明的已知的最佳方式。阅读上面的描述后对于本领域技术人员而言这些优选实施实施方式的变形可以变得明显。本发明人预计熟练的技术人员能适当地的使用这样的变形，并且发明人意欲本发明以与本文具体描述不同的方式实施。因此，本发明包括在下面的权利要求中所述的主题所有改进和等同物，如可适用的法律所允许地。而且，上述要素以其所有可能的变形的任意组合由本发明所覆盖，除非本文另有说明或者明显与上下文相抵触。

Claims (14)

1.一种基质，其包含：
(a)固体载体；
(b)下式的配体：
Figure FSA00000799740100011
和
(c)包含至少一个C、O、N或S原子的连接体，其在由波浪线所示的配体上的位置上将固体载体共价连接至配体；
其中
Figure FSA00000799740100012
表示选自由苯基、吡啶基、嘧啶基和萘基所组成的组的芳环或杂芳环，任选被具有0-4个选自由以下基团所组成的组的取代基取代：-H，-(C1-C6)烷基，卤素，-OH，-O(C1-C6)烷基，-COOH，-COO(C1-C6)烷基，-SO3H，-PO3H，-NO2，-NH2，
Figure FSA00000799740100021
2.权利要求1的基质，其中
表示苯基、吡啶基或萘基，其任选被0-1个选自由-H、-C00H和-SO3H组成的组的取代基取代。
3.权利要求1的基质，其中
Figure FSA00000799740100023
表示苯基，其任选被0-1个选自由-H、-COOH和SO3H组成的组的取代基取代。
4.权利更求1的基质，其中
Figure FSA00000799740100024
表示苯基，其任选被0-1个选自由以下基团组成的组的取代基取代：
5.权利要求1的基质，其中配体具有选自由以下组成的组的式：
Figure FSA00000799740100026
Figure FSA00000799740100031
Figure FSA00000799740100041
Figure FSA00000799740100051
6.权利要求1的基质，其具有选自由以下组成的组的式：
Figure FSA00000799740100052
Figure FSA00000799740100061
Figure FSA00000799740100071
Figure FSA00000799740100081
Figure FSA00000799740100091
Figure FSA00000799740100101
其中黑色矩形表示固体载体。
7.用权利要求1-6中任一项的基质处理包含至少一种生物物质的样品的方法，该方法包括使基质与样品接触足以使得样品中的至少一种生物物质结合到基质的时间段。
8.将至少一种物质与液体样品进行分离的方法，该方法包括使根据权利要求1-6中任一项的基质与包含至少一种物质的液体样品接触，其中所述物质吸附至基质；以及调节pH、离子强度或两者以使得所述物质从基质解吸。
9.权利要求7或8的方法，其中所述至少一种物质包含抗体。
10.权利要求7-9的任一项的方法，包含选择性地结合IgG、IgM和/或IgA。
11.权利要求7或8的方法，其中所述至少一种物质包含抗体片段
12.权利更求7-11的任一项的方法，其中所述样品包含生物流体。
13.权利要求12的方法，其中样品包含血浆。
14.权利要求7-13的任一项的方法，其中将基质置于柱中，以及该方法包括使样品流经柱。
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