CN103184279A - 非标记荧光pcr结合hrma检测副溶血弧菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤：根据副溶血弧菌TLH基因设计引物对；提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用软件对PCR扩增产物进行扩增曲线和HRMA分析。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低的非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种非标记荧光PCR结合高分辨率熔解曲线（HRM）分析检测副溶血弧菌的方法，属于微生物检测领域。
背景技术
副溶血弧菌（Bibrio Parahemolyticus），是一种嗜盐性细菌，系弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌。进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒，主要来自海产品。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。
荧光PCR检测技术大致分为两大类：荧光探针法（标记荧光PCR）和通用型的荧光染料法（非标记荧光PCR）。前者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于扩增序列专一检测，不过检测成本要高很多。而后者主要是利用荧光染料与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，其优点是：无需另外设计荧光探针，简便易行，成本较低。其中，荧光染料又分为非饱和染料（如Sybr Green）和饱和染料（如LC Green等）。
相对Sybr Green等非饱和染料来说，Eva Green、LC Green、SYTO9等饱和染料具有以下优点：①饱和的染料对PCR反应没有任何抑制作用，因此可以在PCR反应之前加入，而其它非饱和荧光染料若较多加入到反应液中会抑制PCR反应，因此只能限量加入，从而对荧光PCR反应的指示收到限制。②DNA高温变性时，非饱和荧光染料加入则会造成DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，而饱和染料则不会出现此类情况。③高温稳定，对于高GC含量的PCR产物，Tm值较高，在DNA双链高温熔解时，饱和荧光染料结合核酸更稳定。
高分辨熔解曲线分析(high-resolution melt analysis，HRMA)技术是近几年来在国外兴起的一种用于物种鉴定的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解曲线分析，即可完成对物种鉴定、基因分型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作。
HRMA利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录熔解曲线，从而对样品进行检测。虽然带HRM模块的荧光PCR仪与普通荧光PCR仪购买价格相差不大，但其温度均一性要高很多。如普通定量PCR仪温度均一性±0.25℃，温度分辨率为0.1℃，而Rotor-Gene 6000温度均一性为±0.01°C，温度分辨率为0.02°C。其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分，加上饱和性染料（LC Green、Eva Green等）的出现，使得HRM这一技术的普及使用成为可能。
目前，副溶血弧菌的检测方法主要有传统的培养后分离鉴定方法和分子检测方法。其中传统的副溶血弧菌分离检测方法，依赖于生化和形态学特点，国际上通常以美国FDA颁布的“细菌学分析手册”作为经典方法。我国也参照制定颁布了副溶血弧菌检验国家标准（GB/T4789.7-2008），规范了副溶血弧菌传统培养检测方法和分子检测方法。但传统的检测方法存在操作繁琐、耗时长、易漏检等缺点。分子检测方法中，包括了常规PCR方法，但是常规PCR需要扩增后进行电泳，操作复杂而且极易引起污染。而探针法PCR则存在检测成本很高，试剂保存期短等缺点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低的非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、根据副溶血弧菌TLH基因设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；
C、应用软件对PCR扩增产物进行扩增曲线和HRMA分析。
进一步地，本发明按以下反应步骤进行：
（1）采用PRIMER等软件，根据GeneBank发布的序列，针对副溶血弧菌TLH基因设计的引物对，设计非标记荧光PCR扩增副溶血弧菌上游引物序列为：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’序列，其下游引物为：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。
（2）标准品模板的制备
以常规PCR方法扩增副溶血弧菌TLH基因。PCR产物经1%凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
（3）非标记荧光PCR扩增和HRM分析
提取副溶血弧菌样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用带HRMA模块的荧光定量PCR仪（包括Corbett Rotor公司的Gene 6000、Roche公司LightCycler 480等）对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物的Tm值和基因型。
在所述荧光定量PCR反应中所采用的反应液，包含下列成分：
所述荧光染料选自DNA饱和性染料。
所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LC
PLUS染料、SYTO 9染料中的一种或者两者以上的混合物。
所述dNTP混合液为10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液。
所述PCR缓冲液为Tris·Cl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2中的一种。
所述非标记荧光PCR结合HRMA技术检测副溶血弧菌反应程序如下：
（4）敏感性和特异性试验
将10倍稀释的阳性模板DNA加入前述反应体系，进行敏感性实
验。同时采用其他常见病原菌进行特异性验证，具体菌株名称和编号如下，同时设置阴阳性对照，验证方法的特异性。
本发明方法中只有副溶血弧菌有光滑扩增曲线，其它非特异性病原菌均无明显扩增曲线，检测灵敏度达到10fg，且具有很好重复性。
本方法倍比稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，其相关系数为0.988，说明该方法具有很好的精确度和良好的稳定性。
本发明的检测方法能在1天之内完成对副溶血弧菌检测，相对于其他传统检测的方法，简化了检测流程，也大大缩短了检测周期。
本发明采用非标记荧光PCR结合HRM分析检测副溶血弧菌方法具有以下优点:
1)一次最多可检测384样本。其检测时间大约是传统培养分析方法的1/3；
2)HRM检测灵敏度是传统SYBR Green荧光定量PCR方法10倍以上；
3)用HRM方法进行分析时，样品经PCR扩增后直接进行HRM，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。而且可同时完成定量分析和基因分型。
4)HRM只需设计PCR引物，进行PCR反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限；
5)相比传统的探针法荧光PCR，HRM大大降低了使用成本；
6)HRM只检测PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR样品，不损伤PCR扩增产物，PCR产物可以进行下游分析，如直接纯化测序。
附图说明
图1为10倍稀释副溶血弧菌非标记荧光PCR扩增曲线图；
图2为10稀释副溶血弧菌非标记荧光PCR Cp值和浓度的线性关系图；
图3为副溶血弧菌非标记荧光PCR特异性实验图扩增曲线图；
图4为不同浓度副溶血弧菌Normalized and shifted meltingcurves分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
本发明非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法包括以下步骤：
A、根据副溶血弧菌TLH基因设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；
C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值和基因型。
其中所述的副溶血弧菌TLH基因为TLH基因，所述引物对的上游引物序列为：5‘-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’，所述引物对的下游引物序列为：5‘-TGTGCCTTGATGAACTCGTTC-3’。
其中步骤B中进行非标记荧光PCR扩增过程中的反应液由以下组分组成：
其中所述的荧光染料为DNA饱和性染料，所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LC
PLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。所述dNTP混合液为由10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP组成的混合液。所述PCR缓冲液为Tris·Cl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2中的一种。
其中本发明所述步骤B中非标记荧光PCR扩增的扩增反应按以下步骤进行：
（1）92℃～96℃预变性30s；
（2）92℃～96℃变性10～30s,55-63℃退火10～30s,72℃10～30s,共进行45～55个循环；
（3）72℃延伸10～30s 。
步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分型分析，按以下步骤进行：
（1）92℃～96℃变性1min；
（2）40℃复性1min；
（3）然后初始熔解温度60～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
实施例1
使用本发明所述非标记荧光PCR结合HRMA检测水产品中副溶血弧菌的方法：
DNA提取
采用无菌操作称取样品25g，加入到225mL3.5%NaCl BPW培养，36±1℃培养18h。取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10%SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h；加入100μL 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心；沉淀用1mL的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇,加入TE溶液溶解沉淀，-20℃保存备用。
非标记荧光PCR反应
反应体系如下
反应条件参照下列程序：
PCR扩增产物循环次数分析和熔解曲线分析
对PCR扩增产物进行循环次数曲线分析，如果样品非标记荧光PCR有明显扩增曲线，且Cp值<38,判为阳性，Cp值>38而<45，重复一次，如果仍有明显上升曲线，则判为阳性，Cp值>45或无上升曲线判为阴性。
采用软件对扩增产物进行HRMA分析，确定扩增产物Tm值。
Claims (8)
1.一种非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、根据副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；
C、应用带HRM模块的荧光PCR仪软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱。
2.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述引物对的上游引物序列为：5‘-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’，所述引物对的下游引物序列为：5‘-TGTGCCTTGATGAACTCGTTC-3’。
3.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤B中所述非标记荧光PCR扩增过程是在反应液中进行的，其中制备20μL的反应液由以下组分组成：
4.根据权利要求3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述的荧光染料为DNA饱和性染料。
5.根据权利要求4所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LC
PLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。
6.根据权利要求3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述dNTP混合液由10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP组成的混合液。
7.根据权利要求1或3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤B中非标记荧光PCR扩增的扩增反应按以下步骤进行：
（1）92℃～96℃预变性30s；
（2）92℃～96℃变性10～30s,55-63℃退火10～30s,72℃10～30s,共进行40～50个循环；
（3）72℃延伸10～30s。
8.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
（1）92℃～96℃变性1min；
（2）40℃复性1min；
（3）然后初始熔解温度60～65℃，开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
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