CN103561752A - 用于移植结肠微生物群的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供包括一种人类粪便提取物的组合物，以及使用此类组合物的方法，包括用于替换或补充或调节一个受试者的结肠微生物群的方法，以及治疗结肠的一种疾病、病理性病状和/或医原性病状的方法。

Description

用于移植结肠微生物群的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求了2011年3月9日提交的美国临时申请序列号61/450,838的权益，该美国临时申请通过引用结合在此。

政府资助

本发明是在政府支持下根据美国国家卫生研究院（NIH）授予的拨款号R21AI091907进行的。政府拥有本发明的某些权利。

背景

1978年，艰难梭菌首先被确认为与使用抗微生物剂有关的腹泻和伪膜性结肠炎的主要病因。从这时起，北美和欧洲的艰难梭菌感染的发生率、发病率以及死亡率不断增长（弗里曼（Freeman）等人，临床微生物学评论（Clin Microbiol Rev）2010;23:529-49；凯莉（Kelly）和拉蒙特（LaMont），新英格兰医学杂志（N Engl J Med）2008;359:1932-40）。1996年到2003年间美国国家出院调查（U.S.National HospitalDischarge Survey）统计的分析揭示在住院患者中诊断为艰难梭菌感染（CDI）的患病率加倍到0.61/1,000（麦克唐纳（McDonald）等人，新发感染性疾病（Emerg Infect Dis）2006;12:409-15）。一项2008年关于所有美国急性病护理设施的12.5%的调查表明CDI患病率为13.1/1,000，这比以前发现的高至少一个数量级（贾维斯（Jarvis）等人，美国感染控制杂志（Am J Infect Control）2009;37:263-70）。虽然老年患者与年轻个体相比具有不成比例地更大比率的CDI，但并无年龄组被省去，并且甚至在儿科群体中CDI相关住院的发生率也已正在上升（茨尔柏柏格（Zilberberg）等人，新发感染性疾病2010;16:604-9）。发生率增加已因这种疾病的最重度形式的频率升高而进一步复杂化，如通过上升的CDI相关发病率和病死率所证明（里恰尔迪（Ricciardi）等人，外科学文献（Arch Surg）2007;142:624-31；讨论631；茨尔柏柏格等人，新发感染性疾病2008;14:929-31）。这在某种程度上与毒性更强的艰难梭菌菌株的出现有关，如PCR核糖核酸型027/北美脉冲场型1（NAP1），其特征为与其他临床上相关情况相比更大的产毒素潜能和抗生素抗性（鲁尼克（Rupnik）等人，自然评论：微生物学（Nat Rev Microbiol）2009;7:526-36；库伊普尔（Kuijper）等人，欧洲监测（Euro Surveill）2008;13）。

复发性CDI是最困难并且越来越常见的与CDI有关的挑战之一（苏拉威茨（Surawicz），胃肠病学（Gastroenterology）2009;136:1152-4）。在约20%-30%的病例中，初始发生的CDI随后可能在30天内复发（凯莉和拉蒙特，新英格兰医学杂志2008;359:1932-40；路易（Louie）等人，新英格兰医学杂志2011;364:422-31；佩平（Pepin）等人，临床感染性疾病（Clin Infect Dis）2006;42:758-64），并且在发生两次或更多次之后复发的风险加倍（麦克唐纳等人，新发感染性疾病2006;12:409-15）。更老的年龄、针对非艰难梭菌适应症的介入性抗生素使用、肾功能不全、免疫缺乏以及抗酸药物是关于复发性CDI的一些已知风险因素（苏拉威茨，胃肠病学2009;136:1152-4；加里（Garey）等人，医院感染杂志（J Hosp Infect）2008;70:298-304）。仅三种临床标准：年龄>65岁、重度疾病以及治疗初始CDI事件之后继续使用抗生素的存在预示了几乎90%的复发率（胡（Hu）等人，胃肠病学2009;136:1206-14）。CDI通常还使发炎性肠道疾病（IBD）的处理变复杂，这近来已被确认为CDI感染的一种额外的独立风险因素（伊萨（Issa）等人，临床肠胃病学与肝脏病学（Clin Gastroenterol Hepatol）2007;5:345-51；罗德曼（Rodemann）等人，临床肠胃病学与肝脏病学2007;5:339-4415）。潜在IBD患者中的CDI与增加的结肠炎严重性和更高的复发率以及结肠切除术有关（伊萨等人，发炎性肠道疾病（InflammBowel Dis）2008;14:1432-42）。

现已认识到正常健康的肠道微生物群（正常消化道微生物）的存在提供了针对CDI的保护。相反地，因用于治疗CDI的抗生素（包括甲硝哒唑和万古霉素）的使用而造成的正常肠道微生物群的严重破坏可能是CDI复发的主要原因之一。常（Chang）和同事使用16S rDNA测序分析七个初始和复发性CDI患者的粪便微生物群（常等人，感染性疾病杂志（J Infect Dis）2008;197:435-8）。他们报导了与正常对照受试者相比所有患者中的细菌物种多样性均降低。然而，在三个复发性CDI患者中发现最大程度的物种多样性降低，并且在门水平上他们的消化道微生物群的破坏很明显，其中拟杆菌门（在正常情况下是结肠中的两种优势门之一）显著减少。相反，这些患者中的消化道微生物群由变形菌门和疣微菌门的成员占优势，这些成员在正常情况下仅是结肠微生物群的次要组分。

复发性CDI的抗生素治疗的一般目标是不仅抑制艰难梭菌，而且保护剩余的结肠微生物群并且优化它们的复原。已使用不同的抗生素方案（包括长期渐减式或脉冲式投以万古霉素（麦克法兰（McFarland）等人，美国胃肠病学杂志（Am J Gastroenterol）2002;97:1769-75）和利福昔明“追加剂”方案（约翰逊（Johnson）等人，临床感染性疾病2007;44:846-8；约翰逊等人，厌氧生物（Anaerobe）2009;15:290-1））来实现这个目标，并且取得了部分成功。近来，显示非达霉素（一种新的大环抗生素，该抗生素的抗菌谱窄并且绕过了拟杆菌属物种）与万古霉素治疗相比使CDI的初始复发率降低50%（路易等人，新英格兰医学杂志2011;364:422-31）。然而，用非达霉素治疗并不改变由毒性更强的PCR027/NAP1菌株所引起的CDI复发率。因此，尽管取得了这些进展，但在可预见的将来，治疗复发性CDI的挑战似乎可能仍然存在。

粪便微生物群移植（FMT）（通常也称为‘粪便细菌疗法’）代表一种治疗性方案，该方案允许结肠微生物群落的正常组成的最快重建。几十年来，FMT已由世界上的选择中心提供，典型地作为复发性CDI患者的一种不得已的选择。最常最早被引用的关于FMT的报导是由爱森曼（Eiseman）和同事进行的，他们在1958年描述了将粪便灌肠剂用于可能患有重度或突发形式的伪膜性结肠炎的患者（爱森曼等人，手术（Surgery）1958;44:854-9）。从这时起，以单独的病例报导或小型病例系列形式报导了远远超过200个病例，其中清除复发性CDI的累积成功率为约90%，而未提到任何不良事件。用于FMT的历史和一般方法已描述于数个近期评论（巴肯（Bakken），厌氧生物2009;15:285-9；范努德（van Nood）等人，欧洲监测2009;14；寇拉斯（Khoruts）和萨多斯基（Sadowsky），粘膜免疫学（Mucosal Immunol）2011;4:4-7）中。然而，尽管存在长期并且成功的追踪记录连同巨大的临床需要，但用于许多患者的程序的可获得性仍非常有限。

更广泛的FMT实践的缺乏在很大程度上归因于多个非微不足道的实际障碍而不是归因于缺乏功效。这些障碍包括缺乏关于供体筛选的补偿、在适当的时间缺乏充足供体、材料制备和给药的困难连同关于在内窥镜检查或医疗办公室中进行该程序的美观性考虑。这些障碍还包括患者对该程序的感知、工作人员进行该程序的意愿、与处理粪便物质有关的卫生问题。这些因素一起使得它成为一种令人讨厌的选择，该选择经常被视为一种不得已的治疗，并且对于可能受益于它的绝大多数患者来说该选择在很大程度上是不可使用的。此外，制药行业对基于FMT的治疗剂的技术进展已显示出一点兴趣，这在很大程度上归因于供体材料的广泛可获得性和它的复杂组成。相反，已主要由面对患者的极渴望的需要的单独的临床医师推动发展。

发明概述

本发明提供了包含人类粪便的一种提取物或一种制备物的组合物。在一个实施例中，一种组合物包含不大于0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的非生命材料重量/生物材料重量。任选地该生物材料包含人类消化道、结肠或肠道粪便微生物，并且任选地该生物材料包含人类消化道、结肠或肠道细菌。任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体。任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

在一个实施例中，一种组合物由非生命材料粒子和/或生物材料粒子组成，或基本上由这些粒子组成，这些粒子将穿过具有以下筛网尺寸的一个筛网：2.0mm、1.0mm、0.5mm、0.25mm、0.212mm、0.180mm、0.150mm、0.125mm、0.106mm、0.090mm、0.075mm、0.063mm、0.053mm、0.045mm、0.038mm、0.032mm、0.025mm、0.020mm、0.01mm或0.2mm。任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品

在一个实施例中，一种组合物包含从消化道、结肠或肠道提取或制备的至少4种不同门的消化道、结肠或肠道细菌，其中这些门包括拟杆菌门的一个成员、厚壁菌门的成员、变形菌门的成员、软壁菌门的成员或其组合。任选地这些门选自拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门以及软壁菌门。该组合物包含不大于0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的非生命材料重量/生物材料重量。任选地该生物材料包含人类消化道、结肠或肠道菌群。任选地该生物材料包含人类消化道、结肠或肠道细菌。任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

在一个实施例中，一种组合物包含一种人类粪便提取物，其中该组合物基本上是无气味的，任选地包含生物材料，并且任选地其中该生物材料包含细菌。任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

本发明的一种组合物可以包含不大于0.1%的非生命材料重量/生物材料重量。在一个实施例中，一种组合物可以由将穿过一个0.25mm筛网或等效物的粒子组成，或主要由这些粒子组成。在一个实施例中，一种组合物可以包含不大于0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的非生命材料重量/生物材料重量。本发明的一种组合物可以另外包含一种低温保护剂，如甘油。在一个实施例中，一种组合物可以在小于0℃的温度下。在一个实施例中，一种组合物是一种固体，如一种粉末。本发明的一种组合物可以包含至少1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰或5×10¹⁰个细菌。在一个实施例中，一种组合物的生物材料可以包含多种原核细胞、真核细胞或病毒；或一群原核细胞、真核细胞以及病毒，这群原核细胞、真核细胞以及病毒基本上等同于或代表或等效于一个正常健康人类的粪便中所存在的一群原核细胞、真核细胞以及病毒。在一个实施例中，一种组合物的生物材料可以包含一群原核细胞和病毒，这群原核细胞和病毒基本上等同于或代表或等效于一个正常健康人类的粪便中所存在的一群原核细胞和病毒。在一个实施例中，一种组合物的生物材料包含一群原核细胞、真核细胞或病毒，这群原核细胞、真核细胞或病毒基本上等同于或代表或等效于一个正常健康人类的粪便中所存在的一群原核细胞、真核细胞以及病毒。

本发明还提供了通过一种方法制备的组合物。在一个实施例中，一种方法包括使一个粪便样品经受一种条件或多种条件，这种条件或这些条件去除至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的粪便样品中所存在的非生命材料。在一个实施例中，一种方法包括用一种过滤介质过滤一个粪便样品，其中该过滤介质包含不大于2.0mm、1.0mm、0.5mm、0.25mm、0.212mm、0.180mm、0.150mm、0.125mm、0.106mm、0.090mm、0.075mm、0.063mm、0.053mm、0.045mm、0.038mm、0.032mm、0.025mm、0.020mm、0.01mm或0.2mm的筛网尺寸，以形成或产生一种滤液。任选地一种组合物包含一种生物材料，并且任选地该生物材料包含细菌。任选地一种组合物包含一种药学上可接受的载体。任选地一种组合物是一种用于口服给药的配制品。任选地该方法可以在不大于26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃或34℃的温度下进行。

该组合物可以包含至少4种不同门的细菌，其中这些门包括拟杆菌门的一个成员、厚壁菌门的成员、变形菌门的成员、软壁菌门的成员或其组合。任选地这些门选自拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门以及软壁菌门。在一个实施例中，该组合物另外包含至少5、6、7、8、9或10种不同纲的细菌，这些细菌选自放线菌纲、拟杆菌纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲、丹毒丝菌纲、α变形菌纲、β变形菌纲、γ变形菌纲、柔膜菌纲以及疣微菌纲。

该方法可以另外包括添加一种低温保护剂（例如甘油）到该组合物中。该方法可以另外包括冷冻该组合物。该组合物可以用作一种治疗剂，并且它可以用于治疗结肠的一种疾病或一种病理性或医原性病状。该疾病可以是一种特征为结肠微生物群的功能异常或病理性组成的疾病或病状，例如一种艰难梭菌结肠炎。

本发明还提供了一种替换或补充或调节一个受试者的结肠微生物群的方法。该方法可以包括向该受试者给药一种在此所描述的组合物。本发明还提供了一种用于治疗一个受试者的方法。该方法可以包括向一个有需要的受试者给药有效量的一种在此所描述的组合物。这些方法可以另外包括在该给药之前去除一些、大部分或基本上所有的受试者的结肠、消化道或肠道微生物群。受试者可以具有患一种结肠炎的风险或处于该风险中。在一个实施例中，结肠炎是一种自体免疫结肠炎，如一种发炎性肠道疾病、一种溃疡性结肠炎、一种克罗恩氏病或一种肠道易激综合症。在一个实施例中，结肠炎是一种感染性结肠炎，如一种艰难梭菌结肠炎或一种肠出血性结肠炎。艰难梭菌结肠炎可以是一种急性艰难梭菌结肠炎、一种复发性艰难梭菌结肠炎以及一种重度艰难梭菌结肠炎。肠出血性结肠炎可以由志贺氏菌属或大肠杆菌引起。受试者可以具有慢性腹泻或慢性便秘的风险或处于该风险中。

本发明还提供了一种在此所描述的组合物用于制造一种药物，或用于制造供治疗或减轻或预防结肠的一种疾病或一种病理性或医原性病状的一种药物的用途。任选地该疾病是一种特征为结肠微生物群的功能异常或病理性组成的疾病或病状，或该疾病是一种艰难梭菌结肠炎，或该疾病或病状是一种结肠炎、一种自体免疫结肠炎、一种感染性结肠炎或一种肠出血性结肠炎。

术语“和/或”意味着所列要素中的一者或全部或所列要素中的任何两者或更多者的组合。

词语“优选的”和“优选地”是指本发明的实施例在某些情况下可以提供某些益处。然而，其他实施例在相同或其他情况下也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的叙述并不暗示其他实施例是不适用的，而且并不打算从本发明的范围中排除其他实施例。

术语“包含”和其变化形式当这些术语在说明书和权利要求书中出现时并不具有限制性含义。

除非另外说明，否则“一个”、“一种”、“该”以及“至少一个”可互换使用并且意味着一个或大于一个。

另外，在此，通过端点对数值范围进行的叙述包括该范围内所包含的所有数值（例如1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。

对于在此所披露的包括不连续步骤的任何方法来说，这些步骤可以按任何可行的顺序进行。并且，适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。

本发明的以上概述并不打算描述每一个所披露的实施例或本发明的每一个实施例。随后的说明更具体地例示了说明性实施例。在贯穿本申请的数个位置，通过实例的列表提供指导，这些实例可以通过不同的组合形式使用。在每一种情况下，所叙述的列表仅充当一个代表性的组而不应解释为一个排他性的列表。

说明性实施实施方案的详细说明

在本发明标准实践之前，建议为粪便细菌疗法的每一个接受者配一个独立的供体（通常是一个紧密的家庭成员），或使用该接受者自已为随后使用而储备的粪便。这些实践的基本原理是以下想法：紧密的家庭成员已共用他们的病原体，并且这些种类的消化道微生物群因为先前的暴露将在某种程度上更好地被接受者的免疫系统耐受。然而，这导致了双重筛选、使已经虚弱的患者负担寻找一个适合的供体的任务、供体提供材料的压力和可能隐瞒重要医学信息、降低成本的压力（因为成本通常由患者承担）、与筛选有关的时间延迟以及在供体选择期间接受具有次优健康状况的供体的压力。在此所呈现的组合物由一种更标准化的制造方法产生，该方法具有严格的供体筛选、浓缩微生物群并且去除大量非生命材料的多个过滤步骤以及任选地以一种保持微生物群的存活性的方式将它冷冻/解冻。在此所呈现的组合物通过制备容易可获得以被一个医师用来治疗一个患者的结肠微生物群的适用组合物提供一个显著优点。此外，在美观性上它是更加可接受的，因为这些组合物几乎是无气味的，呈浓缩形式，并且使用标准实验室实践是容易操作的。

本发明提供了包含粪便微生物的组合物。如在此所使用，术语“粪便微生物”是指一个正常健康成人的消化道、肠道或结肠（优选地是结肠）中所存在的微生物。这种组合物可以通过加工粪便材料来制备。如在此所使用，术语“粪便材料”是指人类大便。未加工的粪便材料包含非生命材料和生物材料。“非生命材料”可以包括但不限于死细菌、脱落的宿主细胞、蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、粘液、胆汁、未消化的纤维和其他食物以及由食物和代谢废产物以及食物材料的部分或完全消化产生的其他化合物。“生物材料”是指粪便材料中的生命材料，并且包括微生物，这些微生物包括原核细胞，如细菌和古细菌（例如活的原核细胞和可以形成孢子以变成活的原核细胞的芽孢）；真核细胞，如原生动物和真菌；以及病毒。在一个实施例中，“生物材料”是指生命材料，例如一个正常健康人类的结肠中所存在的微生物、真核细胞以及病毒。

可存在于本发明的一种组合物中的原核细胞的实例包括以下细胞：放线菌纲的成员，如放线菌亚纲或红蝽菌亚纲，如双歧杆菌目或红蝽菌目，和/或如双歧杆菌科或红蝽菌科；拟杆菌门的成员，如拟杆菌纲，如拟杆菌目，和/或如拟杆菌科或理研菌科；厚壁菌门的成员，如杆菌纲、梭菌纲或丹毒丝菌纲，如杆菌目或乳杆菌目或梭菌目或丹毒丝菌目，和/或如类芽孢杆菌科或气球菌科或乳杆菌科或链球菌科或卡他杆菌科或消化球菌科或消化链球菌科或瘤胃菌科或梭菌科或优杆菌科或毛螺菌科或丹毒丝菌科；变形菌门的成员，如α变形菌纲或β变形菌纲或γ变形菌纲，如根瘤菌目或伯克氏菌目或交替单胞菌目或肠杆菌目，和/或如红菌科或伯克氏菌科或希瓦氏菌科或肠杆菌科；软壁菌门的成员，如柔膜菌纲，如虫原体目，和/或如螺原体科；和/或疣微菌纲的成员，如疣微菌目，和/或如疣微菌科。

在一个实施例中，本发明的一种组合物可以包含作为至少1个门、至少2个门、至少3个门、至少4个门、至少5个门、至少6个门、至少7个门、至少8个门、至少9个门或至少10个门的成员的原核细菌。在一个实施例中，本发明的一种组合物可以包含作为至少1个纲、至少2个纲、至少3个纲、至少4个纲、至少5个纲、至少6个纲或至少7个纲的成员的原核细菌。在一个实施例中，本发明的一种组合物可以包含作为至少1个目、至少2个目、至少3个目、至少4个目、至少5个目、至少6个目或至少7个目的成员的原核细菌。在一个实施例中，本发明的一种组合物可以包含作为至少1个科、至少2个科、至少3个科、至少4个科、至少5个科、至少6个科、至少7个科的成员的原核细菌。在一个实施例中，本发明的一种组合物可以包含至少5、至少10、至少20或至少30个不同属的原核细菌。在一个实施例中，本发明的一种组合物可以包含至少10、至少50、至少100、至少200、至少300或至少400个不同种的原核细菌。

在一个实施例中，本发明的一种组合物包含不大于5%的非生命材料重量/生物材料重量（wt/wt）、不大于2.5%（wt/wt）、不大于1%（wt/wt）、不大于0.1%（wt/wt）、不大于0.01%（wt/wt）或不大于0.001%（wt/wt）的非生命材料。在一个实施例中，使用目前可获得的技术是无法检测出本发明的一种组合物中非生命材料的量的。举例来说，可以将生命材料染色以便获得特定基因的生物活性、电子传递、DNA以及RNA。

在一个实施例中，本发明的一种组合物中所存在的粪便材料并不包含具有以下尺寸的粒子（例如非生命材料粒子和/或生物材料粒子）：大于2.0毫米（mm）、大于1.0mm、大于0.5mm、大于0.25mm、大于0.212mm、大于0.180mm、大于0.150mm、大于0.125mm、大于0.106mm、大于0.090mm、大于0.075mm、大于0.063mm、大于0.053mm、大于0.045mm、大于0.038mm、大于0.032mm、大于0.025mm、大于0.020mm、大于0.01mm或大于0.2mm。一种组合物中所存在的非粪便材料可以包含具有以下尺寸的粒子：大于2.0mm、大于1.0mm、大于0.5mm、大于0.25mm、大于0.212mm、大于0.180mm、大于0.150mm、大于0.125mm、大于0.106mm、大于0.090mm、大于0.075mm、大于0.063mm、大于0.053mm、大于0.045mm、大于0.038mm、大于0.032mm、大于0.025mm、大于0.020mm、大于0.01mm或大于0.2mm。在一个实施例中，本发明的一种组合物中所存在的粪便材料由非生命材料和/或生物材料的粒子组成，或基本上由这些粒子组成，这些粒子的尺寸将穿过具有以下筛网尺寸的一个筛网：2.0mm、1.0mm、0.5mm、0.25mm、0.212mm、0.180mm、0.150mm、0.125mm、0.106mm、0.090mm、0.075mm、0.063mm、0.053mm、0.045mm、0.038mm、0.032mm、0.025mm、0.020mm、0.01mm或0.2mm。因此，在这种实施例中，一种组合物中所存在的粪便材料的尺寸小于或等于2.0mm、小于或等于1.0mm、小于或等于0.5mm、小于或等于0.25mm、小于或等于0.212mm、小于或等于0.180mm、小于或等于0.150mm、小于或等于0.125mm、小于或等于0.106mm、小于或等于0.090mm、小于或等于0.075mm、小于或等于0.063mm、小于或等于0.053mm、小于或等于0.045mm、小于或等于0.038mm、小于或等于0.032mm、小于或等于0.025mm、小于或等于0.020mm、小于或等于0.01mm或小于或等于0.2mm。筛网尺寸可以是基于美国标准筛网尺寸，例如10、18、35、60、70、80、100、120、140、170、200、230、270、325或400。

本发明的一种组合物可以任选地包含一种低温保护剂。一种低温保护剂是当冷冻时维持粪便微生物的存活性的一种化合物。低温保护剂是本领域中已知的且常规地用于当暴露于冷冻条件时保护微生物。实例包括但不限于氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸；简单糖，如蔗糖、葡萄糖、乳糖、核糖以及海藻糖；以及其他化合物，如二甲亚砜（DMSO）和甘油。在一种此所描述的组合物中所存在的低温保护剂的量可以视所使用的低温保护剂和有待用于冷冻的温度（例如-20℃、-80℃或不同的温度）而不同。可使用的低温保护剂的量是熟练人员已知的或可以使用常规实验容易地确定。在一个实施例中，本发明的一种组合物可以包含浓度为10%的甘油。

在一个实施例中，本发明的一种组合物并不包含病原性生物材料。在一个实施例中，粪便材料是来自一个已经历医学病史、身体检查以及实验室测试的人。医学病史的评估可以包括但不限于感染性媒介物的风险、胃肠并存病的存在、可能或确实影响肠道微生物群的组成的因素以及全身性医学病状。关于感染性媒介物的风险的排除标准可以包括但不限于已知乙型、丙型肝炎或HIV病毒感染；已知在任何时间暴露于HIV或病毒性肝炎；高风险行为，包括因毒品或金钱产生的性行为、男性与男性发生性行为、在前12个月内有一个以上的性伴侣、过去对静脉内毒品或鼻内可卡因的任何使用、嵌顿病史；在12个月内进行了纹身或身体穿洞；到世界上旅行者腹泻的风险高于美国的地区旅行；以及当前传染性疾病，例如上呼吸道病毒感染。

关于胃肠并存病的排除标准包括但不限于肠道易激综合症病史，其中特定症状可以包括频繁腹部绞痛、胀气、鼓胀、腹胀、便急、腹泻、便秘；发炎性肠道疾病病史，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜结肠炎；慢性腹泻；慢性便秘或使用泻药；胃肠恶性病病史或已知结肠息肉病；任何腹部手术史，例如胃绕道手术、肠道切除术、阑尾切除术、胆囊切除术等；使用益生菌或由潜在供体出于调节消化的目的所使用的任何其他非处方助剂，但如果仅作为食物而不是营养补充物来摄取，那么酸奶和酸乳酒产品是可以允许的。

关于可能或确实影响肠道微生物群的组成的因素的排除标准包括但不限于在前6个月内针对任何适应症的抗生素；任何处方免疫抑制或抗肿瘤药物。

关于全身性医学病状的排除标准包括但不限于已确定的或新出现的代谢综合症，其中用于此处的定义的标准比已制定的标准更严格，包括血压升高病史、糖尿病或葡萄糖不耐病史；已知全身性自体免疫性，例如结缔组织疾病、多发性硬化症；已知特应性疾病，包括哮喘或湿疹；慢性疼痛综合症，包括纤维肌痛、慢性疲劳综合症；持续（即使断断续续）使用任何处方药物，包括吸入剂或局部乳膏和软膏；神经性、神经发育性以及神经退化性病症，包括自闭症、帕金森氏病。

关于身体检查的排除标准可以包括但不限于一般指标，如身体质量指数>26kg/m²、由腰臀比>0.85（男性）和>0.80（女性）定义的中心型肥胖；血压收缩压>135mmHg并且舒张压>85mmHg；皮肤-存在皮疹、一年内所作的纹身或身体穿洞、黄疸；淋巴结肿大；听诊时有喘息声；肝肿大或肝病的皮肤红斑；关节肿胀或触痛；肌无力；神经检查异常。

关于实验室测试的排除标准可以包括但不限于通过PCR测得大便艰难梭菌毒素B呈阳性；关于包括沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌、大肠杆菌O157:H7的常规病原体中的任一者的大便培养物呈阳性；卵和寄生虫检查异常；梨形鞭毛虫、隐孢子虫或幽门螺旋杆菌抗原呈阳性；针对任何病毒性疾病的筛查（包括HIV1和2、甲型病毒性肝炎IgM、肝炎表面抗原和核心Ab）呈阳性；RPR（梅毒筛查）异常；肝功能测试（包括碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶）的任何异常；血清甘油三酯升高>150mg/dL；HDL胆固醇<40mg/dL（男性）和<50mg/dL（女性）；高敏感性CRP>2.4mg/L；空腹血浆葡萄糖升高（>100mg/dL）。

本发明的组合物可以包含于多种多样的药学上可接受的配制品中。在一个实施例中，一种配制品可以是一种流体组合物。流体组合物包括但不限于溶液、悬浮液、分散液等。在一个实施例中，一种配制品可以是一种固体组合物。固体组合物包括但不限于粉末、颗粒、压缩片、丸剂、胶囊、口嚼片、糯米纸囊剂等。那些配制品可以包含一种药学上可接受的载体，以使得组合物适合于给药一个受试者。如在此所使用，“药学上可接受的载体”包括与药学给药相容的药理学上的非活性化合物。本发明的组合物可以被配制成与它的预期给药途径相容。本发明的一种组合物可以通过适合于在一个受试者的胃肠道（优选地是结肠）中沉积的任何方法来给药。给药途径的实例包括直肠给药（例如通过栓剂、灌肠剂、上部内窥镜检查、上部推进式肠镜检查或结肠镜检查）、通过鼻或口插管（例如通过鼻胃管、鼻肠管或鼻空肠管）或口服（例如通过一种固体，如一种丸剂、片剂或胶囊；或通过液体）。

对于本发明方法中的治疗性用途来说，一种组合物可以通过包含一种或多种药学上可接受的载体的一种形式方便地给药。适合的载体在本领域中是众所周知的并且因所希望的组合物给药形式和模式而不同。举例来说，他们可以包括稀释剂或赋形剂，如填料、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、助流剂、润滑剂等。典型地，载体可以是一种固体（包括粉末）、液体或其组合。每一种载体优选地从与组合物中的其他成分相容的意义上来说是“可接受的”并且对受试者无害。载体优选地是生物学上可接受的并且是惰性的，即它允许组合物维持生物材料的直到递送到适当部位。

口服组合物可以包含一种惰性稀释剂或一种可食用载体。出于经口治疗性给药的目的，活性化合物可以结合有赋形剂并且以片剂、糖衣片或胶囊（例如明胶胶囊）的形式使用。口服组合物还可以通过将本发明的一种组合物与一种食物组合来制备。在一个实施例中，用于给药的一种食物是冷冻的，例如冰淇淋。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、糖衣片等可以包含以下成分或具有类似性质的化合物中的任一者：一种粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；一种赋形剂，如淀粉或乳糖；一种崩解剂，如海藻酸、普利莫吉尔或玉米淀粉；一种润滑剂，如硬脂酸镁或斯特罗特斯；一种助流剂，如胶状二氧化硅；一种甜味剂，如蔗糖或糖精；或一种调味剂，如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。

活性化合物还可以制备成用于直肠递送的栓剂（例如使用常规的栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯）或保留灌肠剂的形式。

活性化合物可以使用将保护化合物不被身体快速消除的载体来制备，如一种控制释放配制品，包括植入物。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯以及聚乳酸。可以使用标准技术来制备此类配制品。这些材料还可以在商业上从例如西安杨森制药有限公司（Alza Corporation）和诺瓦制药公司（Nova Pharmaceuticals,Inc.）获得。还可以使用脂质体悬浮液作为药学上可接受的载体。这些悬浮液可以根据本领域的普通技术人员已知的方法来制备。

在一个实施例中，一种组合物可以经过封装。举例来说，当有待于口服组合物时，配制剂型以使得组合物不暴露于结肠前的胃肠道中普遍的条件，例如高酸性和胃和/或肠道中所存在的消化酶。用于治疗性用途的组合物的封装在本领域中是常规的。封装可以包括硬壳胶囊，这种封装可以用于干粉末状成分软壳胶囊。胶囊可以由胶凝剂（如动物蛋白（例如明胶）、植物多糖或衍生物（如角叉菜胶）以及改性形式的淀粉和纤维素）的水溶液制成。可以添加其他成分到一种胶凝剂溶液中，如塑化剂（例如甘油和或山梨醇）、着色剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂以及表面处理。

一种组合物可以通过从一个适当供体获得一个粪便样品并且与一种稀释剂共混来制备。适用的稀释剂包括常规地用于处理微生物、真核细胞和/或病毒的水溶液。适用的稀释剂可以包括用于维持生理缓冲液、摩尔渗透压等的组分。稀释剂优选地是无菌和/或非过敏性的。一种稀释剂的一个实例包括但不限于pH7的磷酸盐缓冲生理盐水。在一个实施例中，1份供体粪便可以与5份稀释剂组合（例如50克供体粪便可以与250ml稀释剂组合）并且共混。在一个实施例中，共混室中的氧气可以通过在共混之前用一种惰性气体（如氮气或氩气）吹扫来减少或去除。此类厌氧条件可以适用于维持结肠中所存在的最厌氧细菌的。样品可以共混多次和/或可以添加更多稀释剂直到实现将允许以下步骤进行的稠度。在一个实施例中，在共混后的步骤中不使用厌氧条件。发现厌氧条件在共混后的步骤中不是必需的，并且这是出乎意料和令人惊讶的，因为粪便材料中相当大百分比的原核细胞是严格的厌氧菌，并且暴露于氧气会杀死它们。共混后，用于洗涤和再悬浮的溶液并不需要吹扫氧气，并且不需要在一个无氧箱或手套箱中处理微生物群。

并非可以培养一个个体的结肠中所存在的所有微生物和真核细胞，因此，在一个实施例中，用于制备一种组合物的条件包括使用使微生物和真核细胞的复制减少的温度。在一个实施例中，用于制备的条件是维持在37℃以下。举例来说，用于制备的条件是维持在不大于30℃、不大于20℃、不大于10℃或不大于5℃的温度下。在一个实施例中，使用使得微生物和真核细胞的复制不会发生的条件。当用于制备本发明的一种组合物的条件包括更低的温度以使复制和细胞死亡减到最少时，一种组合物中所存在的生物材料包含一群微生物、真核细胞以及病毒，这群微生物、真核细胞以及病毒基本上等同于一个正常健康人类（例如供体，从该供体获得粪便样品）的结肠或粪便中所存在的一群微生物、真核细胞以及病毒。

非生命材料的去除可以通过使被共混的样品穿过具有以下筛网尺寸的一个筛网来实现：不大于2.0mm、不大于1.0mm、不大于0.5mm、不大于0.25mm、不大于0.212mm、不大于0.180mm、不大于0.150mm、不大于0.125mm、不大于0.106mm、不大于0.090mm、不大于0.075mm、不大于0.063mm、不大于0.053mm、不大于0.045mm、不大于0.038mm、不大于0.032mm、不大于0.025mm、不大于0.020mm、不大于0.01mm或不大于0.2mm。在一个实施例中，被共混的样品是通过使它穿过筛网尺寸为0.25mm的一个筛网并且收集滤液来制备。在一个实施例中，使被共混的样品穿过具有逐渐更小的筛网尺寸的筛网直到最终穿过0.25mm的筛网尺寸。举例来说，如果使用总共四个筛网，那么第一个筛网的筛网尺寸可以是2mm，随后是1mm、随后是0.5mm并且接着随后是0.25mm。最终滤液可以被收集在一个离心管中，并且在4℃下在足以使生物材料形成球粒的速度（例如10,000×g）下离心10分钟。去除上清液，使细胞再悬浮于稀释剂中，任选地例如在4℃下在10,000×g下再次离心10分钟。丢弃最终上清液并且使细胞再悬浮于一种水性溶液（例如稀释剂、低温保护剂等或其组合）中。在一个实施例中，通过筛分和洗涤步骤使被共混的混合物的体积减小。举例来说，在一个实施例中，体积减小到共混时所使用的体积的14%（例如从250ml到35ml）。在一个实施例中，通过筛分和洗涤步骤使被共混的混合物的体积减小，从而使得在随后给药一个受试者的体积中的细胞在1×10¹⁰与5×10¹⁰个之间。这个过程使得所有结肠微生物群高度富集的一种粪便提取物能够穿过如上文所描述的一个筛网，并且可以在10,000×g下离心10分钟。如在此所使用，“富集”是指使生物材料的丰度相对于非生命材料增加，使得与富集前的粪便材料相比生物材料构成显著更高的比例。术语“富集”是指一个人已进行介入来提高生物材料比例的那些情形。

水性溶液的添加量可以是使得单一剂量具有适当数目的细胞的量。在一个实施例中，单一剂量可以包含1×10¹⁰与5×10¹⁰个之间的细胞，例如3×10¹⁰个细胞。因为大多数生物材料难以培养或不可能培养，所以可以使用一种血细胞计来测定细胞数目。

在一个实施例中，可以将所得球粒悬浮于一半原始体积的包含10%甘油的稀释剂中。样品可以立即使用，或可以例如在-80℃下冷冻以供随后使用。当冷冻时，样品可以留在一个离心管中，或可以留在一个不同的容器中。在一个实施例中，该容器是一个使样品的表面积增加的容器。举例来说，样品可以被放在一个IV袋中。当有待于使用冷冻样品时，它可以在冰上被解冻并且接着移植到接受者中。发现在此所描述的冷冻组合物并不使得它的治愈性潜力被破坏。在一个实施例中，由离心产生的样品可以被加工用于1年或更久的长期储存。储存这种样品的能力提供了其他方法所不可能实现的一定程度的灵活性。举例来说，必需快速鉴别一个供体，快速加工来自该供体的一个粪便样品，并且立即使用这个样品。适用的加工方法的实例包括但不限于冷冻、冷冻干燥、喷雾干燥、冻干、真空干燥、空气干燥或其他形式的蒸发干燥。加工本发明的一种组合物可以包括在任何干燥程序后产生一种粉末。

使用筛网来从粪便材料中提取生物材料出乎意料地产生几乎无气味的一种组合物。这是未预期到的，因为粪便正常具有一种独特的气味并且通过所使用的最低程度的处理而出人意料地去除了这种气味。这是一个显著的优点，因为它采用一种不美观并且如此令人讨厌以致一些患者和工作人员拒绝参与的方法，并且将它变成一种在正常临床配置中或在家容易实践的方法。如在此所使用，“无气味”意味着所存在的挥发性有机分子的量减少，并且所存在的挥发性有机分子的量减少可以通过一个人将加工前的材料与加工后的材料相比较而容易地检测。

本发明另外是针对使用在此所描述的组合物的方法。本发明的一种方法包括向一个有需要的受试者给药有效量的一种在此所描述的组合物。给药是在适合于组合物在大肠或小肠的一个区域中沉积以使得组合物中的生物材料移生于结肠的条件下进行。举例来说，给药可以到达上胃肠道连同下胃肠道中，例如末端回肠、盲肠、包含憩室病的结肠区域以及直肠。在一个实施例中，可以进行口服，如通过片剂。在一个实施例中，可以通过插管来给药，如通过鼻胃管。在一个实施例中，可以直肠给药，例如通过一种结肠镜、灌肠剂或栓剂。“适合”于发生一个事件的条件或“适合”的条件是并不阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于该事件。如在此所使用，“有效量”涉及一种在此所描述的组合物足以提供所希望的作用的量。举例来说，在一个实施例中，“有效量”是对减轻如本文所描述的疾病的一种或多种症状和/或迹象有效的量。在一些实施例中，有效量是足以实现与一种疾病有关的一种症状和/或迹象（如腹泻或艰难梭菌）的减少的量。一种症状和/或一种迹象的减少是，与一个对照、一个未治疗受试者或给药组合物前的受试者相比，所测量的迹象减少例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。在一个实施例中，有效量是足以使得至少1×10¹⁰、至少3×10¹⁰或至少5×10¹⁰个细胞递送到结肠中的量。然而，应了解，如在此所披露的组合物的总剂量将由主治医师在合理的医学判断范围内进行决定。所需要的准确量将视如所治疗的疾病的类型和程度的因素而不同。

在一个实施例中，本发明的一种方法包括治疗一个需要治疗的受试者的某些疾病。该受试者可以是一个哺乳动物，如一个人类。在一些实施例中，可以使用动物模型，如一个哺乳动物，包括一个大鼠、一个小鼠、一个仓鼠、一个沙鼠或一个灵长类动物。如在此所使用，术语“疾病”是指一个受试者的一个部分、器官或系统或其组合的正常结构或功能的任何偏离或中断，该偏离或中断是通过一个特征性症状或临床迹象来显示的。疾病包括特征为结肠微生物群的功能异常组成的疾病。此类疾病包括但不限于结肠炎，包括自体免疫结肠炎（例如发炎性肠道疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏疾病、肠道易激综合症）和感染性结肠炎。感染性结肠炎的实例包括但不限于艰难梭菌结肠炎（例如急性艰难梭菌结肠炎、复发性艰难梭菌结肠炎或重度艰难梭菌结肠炎）和肠出血性结肠炎（例如由志贺氏菌属或大肠杆菌引起的一种结肠炎）。疾病的其他实例包括但不限于慢性腹泻；慢性便秘、代谢综合症以及肥胖症；特应性疾病，包括哮喘、湿疹；胃肠道的嗜酸性粒细胞病症；全身性自体免疫性，包括类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化症等；慢性疼痛病症，如纤维肌痛、慢性疲劳综合症；神经退化性病症、进食障碍以及营养不良。

如在此所使用，术语“症状”是指患者所经历的并且由疾病引起的疾病或病状的主观证据。如在此所使用，术语“临床迹象”或简单地“迹象”是指一个受试者中所存在的一种疾病的客观证据。与在此所提及的疾病有关的症状和/或迹象以及对此类迹象的评估在本领域中是常规并且已知的。典型地，可以通过评估与一种疾病有关的迹象来确定一个受试者是否患有该疾病以及一个受试者是否对治疗作出反应。

一种疾病的治疗可以是预防性的或可替代地可以在发展一种疾病之后开始。预防性治疗（例如在一个受试者显示一种疾病的迹象之前开始）在此称为对“处于发展一种疾病的风险中”的一个受试者的治疗。处于发展一种疾病的风险中的一个受试者的一个实例是具有一种风险因素的一个人。艰难梭菌结肠炎的一种风险因素的一个实例是胃肠道的抗生素疗法。可以在在此所描述的疾病发生之前、期间或之后进行治疗。在发展一种疾病之后开始的治疗可以使得该疾病的迹象的严重性降低，或完全去除这些迹象。

在一个实施例中，本发明的一种方法包括将一个微生物群从一个供体移植到一个接受者中。

在一个实施例中，本发明的一种方法包括使一个接受者的结肠中厚壁菌门的成员（如梭菌纲的一个非病原性成员）和/或拟杆菌门的成员的相对丰度增加。短语“相对丰度”是指在一个接受者的结肠中与所有其他分类群的成员的数目相比一个门或纲的成员的数目。这种比较可以用百分比表示。在一个实施例中，与在给药之前一个接受者的结肠相比，在给药之后在该接受者的结肠中梭菌纲的非病原性成员的相对丰度可以增加至少5%、至少10%、至少20%或至少50%。在一个实施例中，与在给药之前一个接受者的结肠相比，在给药之后在该接受者的结肠中厚壁菌门的成员的相对丰度可以增加至少5%、至少10%、至少20%或至少50%。可以在例如给药粪便微生物群之后3天、10天、15天或25天时测定丰度变化。

在一个实施例中，本发明的一种方法包括使一个接受者的结肠中变形菌门的成员的相对丰度降低。在一个实施例中，与在给药之前一个接受者的结肠相比，在给药之后在该接受者的结肠中变形菌门的成员的相对丰度可以降低至少10%、至少20%、至少30%或至少40%。可以在例如给药之后3天、10天、15天或25天时测定变形菌门的成员的丰度变化。

在一个实施例中，在给药本发明的一种组合物之前并不需要清除现有微生物群。在其他实施例中，微生物群的清除可能是必需的。清除现有微生物群的方法是已知并且常规的。在一个实例中，可以通过给药一种抗生素混合液持续一周直到移植前一天为止来实现清除。一种适用的混合液的一个实例是甲硝哒唑（1000mg，每天两次）、利福昔明（550mg，每天两次）、万古霉素（500mg，每天两次）以及新霉素（1000mg，每天两次）。

通过以下实例来说明本发明。应了解，将根据如在此所阐述的本发明的范围和精神概括地解释具体实例、材料、量以及程序。

实例1

艰难梭菌相关疾病是抗生素疗法的一种主要已知并发症。病原体正常被天然结肠微生物群抑制，但这种程度的保护当这些微生物群落被抗生素抑制时可能会丢失。用于治疗艰难梭菌感染的抗生素还可以通过继续抑制正常微生物群来维持它的复发。因此，相当一部分患者遭受顽抗性艰难梭菌感染，并且顽抗性艰难梭菌感染与显著发病率有关。粪便细菌疗法是一种越来越多地被使用的方法，该方法用于大概通过正常肠道微生物群落的复原来打断艰难梭菌感染复发周期。我们先前在一个临床病例中报导了，结肠微生物群的细菌疗法使得一个宿主的微生物群替换为供体的微生物群（寇拉斯等人，2010，临床胃肠病学杂志（J.Clin.Gastroenterol.），44(5):354）。为了获得对细菌疗法前后微生物群落的组成和稳定性的更好的理解，我们已通过使用一种焦磷酸测序技术（伊路米那（Illumina）HiSeq2000或其他伊路米那平台）分析了粪便DNA中经过扩增的16S rRNA区域（V5和V6）。目前，正对额外的个体进行加工和分析。

介绍

●艰难梭菌是一种新出现的病原体并且是院内腹泻的最常见病因。

●感染经常与抗生素疗法有关，其中由正常肠道菌群提供的保护作用被破坏。

●艰难梭菌感染经常通过额外的抗微生物剂疗法来控制，但约20%的患者发展成难治性疾病，从而引起复发性腹泻。

●已显示呈粪便移植形式的细菌疗法成功地治疗了难治性艰难梭菌感染。

●新一代测序技术已允许对肠道微生物群进行更深的询问并且在我们的研究中用于检验移植之后微生物群落结构的变化。

从患者的儿子获得供体粪便材料，对患者的儿子进行感染性疾病测试，包括艰难梭菌；甲型、乙型或丙型肝炎病毒；HIV病毒；沙门氏菌；弯曲杆菌；耶尔森氏菌；志贺氏菌；大肠杆菌O157:H7；幽门螺旋杆菌；梅毒螺旋体；梨形鞭毛虫；以及隐孢子虫。

通过结肠镜检查为患者灌注供体粪便材料，该结肠镜检查揭示了乙状结肠中的重度广泛憩室病。供体的粪便材料沉积到盲肠中。符合艰难梭菌感染的症状在细菌疗法的数天内消退。

方法

●在粪便移植细菌疗法之前第-31天和移植后第5天、第21天、第46天、第95天、第132天、第159天、第188天以及第227天收集患者粪便样品。在程序当天收集一个供体粪便样品并且沉积到接受者的盲肠中。

●使用一个MOBIO超洁净粪便DNA试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜欧实验室公司（MOBIO Laboratories,Inc.,Carlsbad,CA））如由制造商所指导从粪便材料中提取DNA。提取并且汇集一式三份样品。

●使用50ng所提取的DNA作为模板来扩增细菌16S rRNA基因的V6高变区。使用带条码的引物来进行多重测序（基塞拉（Kysela）等人，2005，环境微生物学（Environmental Microbiology）7:356-64，以及克雷森（Claesson）等人，核酸研究（Nucleic Acids Research），2010，第38卷，第22期e200doi:10.1093/nar/gkq873）。制备并且汇集一式三份样品。

●将扩增的样品以等摩尔比混合并且在国家基因组研究中心（NCGR）使用伊路米那测序平台进行测序。

●使用MOTHUR和SILVA参考数据库分析序列资料（斯科尔斯（Scholss），2009，应用与环境微生物学（Appl.Environ.Microbiol.），75(23):7537-7541。操作分类单位（OTU）的分类是使用GreenGenes参考文件按97%相似性进行分配。

●使用越（Yue）和克莱顿（Clayton）的θ计算（越和克莱顿，2005，统计理论和方法通讯（Commun.Stat.Theor.Methods），34:2123-2131）进行主要组分分析。基于97%OTU相似性计算累积曲线。

结果和讨论

●从接受者的移植前样品（第-31天）获得的序列中大于40%属于未分类的柔膜菌纲菌株或γ变形菌纲。

●相比之下，供体和接受者的移植后样品均由厚壁菌门占优势。未分类的梭菌目和瘤胃菌科成员很丰富。

●使用越和克莱顿的θ指数进行群落分析，显示与接受者的移植前样品相比，移植后样品彼此并且与供体样品更紧密地群集。

●序列分析表明接受者的移植前后粪便样品中所存在的分类群显著不同，表明粪便细菌疗法成功地改变了患者的肠道微生物群。

●在接受者的肠道中被移植的微生物群落在移植后7.5个月之后保持相当稳定。

令人惊讶的是，在所分析的所有样品中代表拟杆菌目的序列的丰度相当低。

实例2

用于粪便微生物群材料制备的供体筛选

供体经历一个完整的医学病史和身体检查。此外，如由FDA关于血液供体所建议，完成一份全长供体病史问卷，并且排除对任何问题均答是的潜在供体（http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProduct s/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/BloodDonorScreening/UCM213 552.pdf）。然而，因为消化道微生物群已与多种医学病状相关或假定涉及多种医学病状，所以选择过程比血液供体的选择过程更严格并且包括实际上任何全身性疾病。

纳入标准

1.年龄>18

2.提供知情同意的能力。

排除标准

I.医学病史

A.感染性媒介物的风险。

1.已知乙型、丙型肝炎或HIV病毒感染

2.已知在任何时间暴露于HIV或病毒性肝炎

3.高风险行为，包括因毒品或金钱产生的性行为、男性与男性发生性行为、在前12个月内有一个以上的性伴侣、过去对静脉内毒品或鼻内可卡因的任何使用、嵌顿病史。

4.在12个月内进行了纹身或身体穿洞。

5.到世界上旅行者腹泻的风险高于美国的地区旅行。

6.当前传染性疾病，例如上呼吸道病毒感染。

B.胃肠并存病。

1.肠道易激综合症病史。特定症状可以包括频繁腹部绞痛、胀气、鼓胀、腹胀、便急、腹泻、便秘。

2.发炎性肠道疾病病史，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、显微镜结肠炎。

3.慢性腹泻。

4.慢性便秘或使用泻药。

5.胃肠恶性病病史或已知结肠息肉病。

6.任何腹部手术史，例如胃绕道手术、肠道切除术、阑尾切除术、胆囊切除术等。

7.使用益生菌或由潜在供体出于调节消化的目的所使用的任何其他非处方助剂。如果仅作为食物而不是营养补充物来摄取，那么酸奶和酸乳酒产品是允许的。

C.可能或确实影响肠道微生物群的组成的因素。

1.在前6个月内针对任何适应症的抗生素。

2.任何处方免疫抑制或抗肿瘤药物。

D.全身性医学病状。

1.已确定或新出现的代谢综合症。用于此处的定义的标准比任何已制定的标准更严格。这些标准包括血压升高病史、糖尿病或葡萄糖不耐病史。

2.已知全身性自体免疫性，例如结缔组织疾病、多发性硬化症。

3.已知特应性疾病，包括哮喘或湿疹。

4.慢性疼痛综合症，包括纤维肌痛、慢性疲劳综合症。

5.持续（即使断断续续）使用任何处方药物，包括吸入剂或局部乳膏和软膏。

6.神经性、神经发育性以及神经退化性病症，包括自闭症、帕金森氏病。

II.关于身体检查的排除标准。

1.一般指标。身体质量指数>26kg/m²、由腰臀比>0.85（男性）和>0.80（女性）定义的中心型肥胖。

2.血压收缩压>135mmHg并且舒张压>85mmHg。

3.皮肤-存在皮疹、一年内所作的纹身或身体穿洞、黄疸。

4.淋巴结肿大。

5.听诊时有喘息声。

6.肝肿大或肝病的皮肤红斑。

7.关节肿胀或触痛。肌无力。

8.神经检查异常。

III.关于实验室测试的排除标准。

1.通过PCR测得大便艰难梭菌毒素B呈阳性。

2.关于包括沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌、大肠杆菌O157:H7的常规病原体中的任一者的大便培养物呈阳性。

3.卵和寄生虫检查异常。

4.梨形鞭毛虫、隐孢子虫或幽门螺旋杆菌抗原呈阳性。

5.针对任何病毒性疾病的筛查（包括HIV1和2、甲型病毒性肝炎IgM、肝炎表面抗原和核心Ab）呈阳性。

6.RPR（梅毒筛查）异常。

7.肝功能测试（包括碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶）的任何异常。

8.血清甘油三酯升高>150mg/dL

9.HDL胆固醇<40mg/dL（男性）和<50mg/dL（女性）

10.高敏感性CRP>2.4mg/L

11.空腹血浆葡萄糖升高（>100mg/dL）

实例3

粪便样品加工

立即将供体粪便材料在冰上冷冻以便运输到实验室。在收集后一个小时内加工样品。

通过在一个瓦林（Waring）共混器中将50g供体粪便与250ml无菌磷酸盐缓冲生理盐水（pH7）（PBS）混合来将粪便样品均质化。在均质化之前用氮气吹扫共混室数分钟以去除氧气。将样品在最低设置上共混三次持续20秒。可以视粪便悬浮液的稠度来添加额外的PBS或共混循环。使被共混的样品穿过孔径为2.0mm、1.0mm、0.5mm以及0.25mm的一系列四个筛网（俄亥俄州蒙特尔泰勒工业集团（W.S.TylerIndustrial Group,Mentor,OH））。这些筛网关于2.0mm、1.0mm、0.5mm以及0.25mm分别是基于美国标准筛网尺寸10、18、35以及60。将穿过这些筛网（小于0.25mm部分）的最终滤液收集在50ml圆锥形离心管中，并且在4℃下在4,000rpm（约4,000×g）下离心10分钟。丢弃上清液，并且将球粒悬浮于一半原始体积的包含10%甘油的PBS（例如125ml）中。样品立即使用，或在-80℃下冷冻储存并且在移植之前在冰上解冻。

实例4

这个实例报导了治疗复发性CDI艰难梭菌感染（CDI）的43个连续患者的临床经历。在这一时间内，通过从患者鉴别的单独的供体移到标准志愿者供体来简化供体鉴别和筛选。材料制备从一组内窥镜检查程序转到实验室中的一种标准化方法，并且最终转到储备冷冻加工的粪便材料，这种粪便材料准备好在需要时使用。材料制备的标准化显著简化了治疗的实践方面而不会损失在清除复发性CDI方面的显而易见的功效。约30%的患者具有潜在发炎性肠道疾病，并且治疗在这一组中同等地有效。供体材料制备的标准化中的数个关键步骤显著简化了抗生素疗法失败的患者的复发性CDI的治疗的临床实践。这也报导于汉密尔顿（Hamilton）等人，美国胃肠病学杂志（Am.J.Gastroenterol.），2012，doi:10.1038/ajg.2011.482中。

方法

患者

这一报导包括首先的43个患者，他们因复发性CDI而接受粪便微生物群移植（FMT）。通过在明尼阿波利斯（Minneapolis）和圣保罗（St.Paul）都市区中在感染性疾病和胃肠病学实践时由临床医师直接安排来鉴别所有患者。FMT的纳入标准包括有症状的、毒素呈阳性的艰难梭菌感染以及尽管使用标准抗生素疗法但仍有至少两次被记载的后续复发的病史。至少一个失败的抗生素方案必须包括最少一个6周的渐减式或脉冲式万古霉素投药过程，或至少一个月的万古霉素过程，随后最少两周利福昔明“追加剂”。该方案中的唯一排除标准是年龄<18和来自非艰难梭菌问题的医疗脆弱性使得预期寿命<1年。在后一种情况下，我们建议患者最好的治疗性选择是一个无限期的万古霉素过程。所有患者均提供关于通过结肠镜检查进行FMT的知情同意，从而认识到这种治疗方法的相对有限的经历以及与它的使用有关的固有未知情况。明尼苏达大学（University of Minnesota）的机构审查委员会（InstitutionalReview Board）批准了临床结果资料的前瞻性收集，同时认识到这种经历并不构成一种临床试验，并且因此不被设计成测试FMT与任何其他治疗性选择相比的功效。

供体鉴别和筛选

在计划开始时，让患者自我鉴别潜在供体。这些供体包括母亲（n=2）、女儿（n=1）、儿子（n=3）、妻子（n=1）、丈夫（n=1）以及朋友（n=2）。招募之前，供体需要提交可获得的医学记录并且与接受者患者分开进行一次独立的医学病史面谈。该病史包括：感染性风险的评估，包括鉴别关于HIV和肝炎、当前传染性疾病以及近期到世界上腹泻病患病率更高的地区旅行的已知风险因素。额外的绝对供体排除标准包括胃肠并存病和在前三个月内使用抗生素。因为消化道微生物群可能参与能量代谢和免疫系统功能的不同的方面，所以将代谢综合症、自体免疫性或过敏性疾病的特征的存在视为相对排除标准。供体对参与包括与实验室筛选有关的风险的方案提供独立的知情同意。供体经历针对HIV以及乙型和丙型肝炎的血清测试以及大便测试，该大便测试包括筛查常规肠病原体、艰难梭菌毒素B以及检查卵和寄生虫以及梨形鞭毛虫和隐孢子虫抗原。

鉴于在招募单独的患者鉴别的供体时不同的逻辑困难，在需要时供体材料的可获得性缺乏，并且没有证据表明使用一个相关相较于不相关供体（例如儿子或女儿相较于朋友或家庭伴侣）的一个清楚的治疗性优点，将志愿者供体招募到FMT计划中。这种变化的优点包括将供体鉴别的负担从患者身上去除、改善与供体筛选有关的效率和成本、一个更一致供应的供体粪便微生物群以及对供体选择施加广泛和严格的排除标准的能力（表1）。在这一时期内招募两个无薪志愿者供体，并且他们中的一个提供大部分的捐赠粪便材料。在每次捐赠之前回顾供体医学病史并且每6个月进行如上文所描述的完整实验室筛选。

表1.供体排除标准。

供体材料制备

用于该计划的早期阶段中的单独的患者鉴别的供体在预定程序之前1-2h进入门诊患者内窥镜检查中心。将粪便材料收集在一个厕所用帽子状物中并且在与程序室分开的一个专用盥洗室中进行加工。将约50克粪便材料放置到一个标准商业共混器（纽约州拉伊的奥斯特苏必姆公司（Oster,Subeam Corp,Rye,NY））中并且在250mL无菌非抑菌性生理盐水中进行均质化。接着，使浆料穿过不锈钢滤茶器以去除可以干扰加载注射器的更大粒子。

将从志愿者“通用”供体获得的材料在冰上运输到实验室中，其中在收集两小时内加工该材料。将材料称重并且在一个专用生物箱中在一个商业共混器中进行均质化。接着使浆料穿过2.0mm、1.0mm、0.5mm以及0.25mm不锈钢实验室筛网（俄亥俄州蒙特尔泰勒工业集团）以去除未消化的食物和更小粒子材料。将穿过0.25mm筛网的所得材料在一个索福（Sorvall）SS-34转子中在6,000×g下离心15min并且再悬浮于一半原始体积的非抑菌性生理盐水中。立即将所得浓粪便细菌悬浮液给药患者或用无菌药学级甘油（密苏里州圣路易斯的西格马公司（Sigma,St.Louis,MO））修正到最终浓度为10%，并且在-80℃下冷冻储存一到八周直到使用。在FMT程序之前在一个冰浴中历经2-4小时进行解冻。用非抑菌性生理盐水将冷冻制备物稀释到250ml，然后灌注到供体中。这种粪便材料提取物（无论是新鲜还是冷冻的）几乎是无气味的并且相对于在内窥镜检查中心所制备的早期材料具有降低的粘度、颜色以及质地。供体材料的过滤允许不费力地加载大尖端60mL注射器而无堵塞风险。用于材料制备的所有容器、瓶子以及筛网均在使用之前进行灭菌。以与从患者鉴别的供体获得的粪便材料相同的方式处理来自通用供体的粪便材料。

移植程序

使患者维持完全剂量的万古霉素（125mg，每天4次，经口）直到FMT程序前两天。程序前一天，在结肠镜检查之前使用分离剂量的聚乙二醇冲洗（GoLYTELY或MoviPrep）（这是我们内窥镜检查单元的标准）以洗去残余抗生素和粪便材料来使患者作好准备。患者在清醒性镇静下经历完整结肠镜检查。采取粘膜活组织检查以在不存在显而易见的发炎性肠道疾病的情况下排除淋巴细胞性结肠炎。通过导入患者的末端回肠和盲肠中的结肠镜活组织检查来给药大部分所制备的供体材料（220-240mL）。然而，在一些情况下，也将一小部分（50mL）滴入包含最大程度憩室病的结肠区域中。回收程序与常规地用于标准结肠镜检查患者的程序相同。指示所有患者在症状复发的情况下接触内窥镜，在该程序之后正式临床追踪1-2个月。CDI的清除是通过腹泻的消退和FMT之后2个月针对艰难梭菌的大便测试呈阴性来定义。这一方案中的所有患者还参与一项检查粪便细菌群落结构的研究，该研究涉及在该程序之后第3天、第7天、第14天以及1个月、3个月、6个月和12个月收集粪便试样。研究工作人员从患者的居住地收集这些试样，从而提供额外的追踪症状的机会。

统计分析

使用不成对的学生t检验比较非分类数据。使用费雪准确测试比较分类数据。使用哥拉夫帕德棱镜（GraphPad Prism）软件计算双尾和双侧p值，这些p值是分别用每一种测试计算。

结果

人口统计状况

这一报导中所描述的复发性CDI患者组如由病状的连续复发的平均次数和持续时间所证明显然患有难治性疾病（表2）。此外，许多患者具有关于高复发机率的多种风险因素，如由住院所证明的重度CDI病史、频繁使用非艰难梭菌介入性抗生素以及高龄（胡等人，胃肠病学2009;136:1206-14）。所有患者的长期渐减式或脉冲式万古霉素方案均失败，并且40%的患者的额外的长期万古霉素过程随后两周利福昔明“追加剂”方案也失败了。这些患者中有一个的4周利福昔明过程也失败了。数个患者（3/43）采取了2-4周的硝唑尼特过程，这些患者对感染的清除也失败了。发炎性肠道疾病患者并不从该方案中排除。我们的患者中百分之三十五（40个中的14个）患有潜在IBD，包括克罗恩氏病（6/14）、溃疡性结肠炎（4/14）以及淋巴细胞性结肠炎（4/14）。IBD患者总体上是年轻人（表3），但CDI的难治性质或表现的严重性与老年患者相比并无区别。然而，未患潜在IBD的患者大部分患有中度到重度憩室病。

表3.未患和患有潜在IBD的患者的比较。IBD的定义包括患者患有克罗恩氏病、溃疡性结肠炎以及偶然发现的淋巴细胞性结肠炎。

对治疗的反应

回应于供体粪便材料的单一灌注，总感染清除率是86%，如由症状消退和追踪两个月之后针对艰难梭菌毒素B的PCR测试呈阴性所证明（表2）。针对艰难梭菌毒素B之测试呈阴性持续两个月被视为潜在IBD患者治疗成功，即使不存在完全症状消退。接受使用来自患者鉴别的单独的供体的材料的FMT的十个患者中有三个（30%）具有CDI复发。对于这一系列中其余的33个病例使用两个标准供体，但大部分（30/33）是使用由单一供体制备的材料来进行。接受来自一个标准供体的FMT（新鲜或冷冻）的33个患者中有三个具有CDI复发。患者鉴别的相较于标准的供体来源的差异并不显著（p=0.1270）。新鲜（11/12）或冷冻（19/21）供体材料在清除感染方面无显著差异。FMT之后经历CDI复发的所有6个患者均提供一个重复程序。这些患者中有两个（两者年龄均>80岁）具有多个其他主动医学问题并且更喜欢保持无限期的万古霉素治疗。四个其他患者用第二灌注治疗，并且全部均清除感染，从而使总成功率达到95%（43个患者中有41个）。使用标准供体衍生的材料进行所有第二灌注。CDI复发之一发生在从第二标准供体接受第一灌注的一个患者中。对他的第二FMT使用相同供体来源。接受一次第二FMT的四个患者中三个具有潜在IBD；两种患者具有克罗恩氏病并且一个具有淋巴细胞性结肠炎。最后，第四个患者因在她的初始CDI事件之后出现的狭窄而进行了部分结肠切除。她进行了结肠造口术，从而排空了她的近端结肠和一长段其余远端结肠。在她的第一FMT之后三周内CDI复发后，我们认为有可能在这种情况下因为由于粪便内容物的高流速和受感染结肠的相对小的尺寸而难以保留供体材料，从而使移植变得复杂。在这种情况下，以两剂冷冻的标准供体材料进行第二灌注：一剂通过结肠造口术进入结肠，而另一剂使用上部推进式肠镜检查进入空肠。在第一个月和此后的每月内每周对她的粪便材料进行艰难梭菌测试。历经三个月的追踪未发现艰难梭菌。

在使用新鲜或冷冻材料的任何患者中，在FMT之后均未注意到严重的不良事件。少数患者（约三分之一）在程序之后的最初几周期间注意到一些不合常规的肠道运动和过度肠胃气胀，但当他们在临床追踪中被观察时这些症状消退。在潜在IBD患者中未观察到增强的结肠炎活性，并且在所有UC患者中总结肠炎活性均得到改善，不过这容易地可归因于清除CDI。有趣的是，首次从在FMT时进行的结肠镜检查期间采取的活组织检查进行了淋巴细胞性结肠炎的所有诊断。在没有针对淋巴细胞性结肠炎的任何额外的医学疗法的情况下，这些患者使他们的肠道功能完全正常化并且在FMT之后没有腹泻。在这些患者中，当他们变得无症状时不进行追踪活组织检查。

讨论

在艰难梭菌诱发的腹泻疾病范围内，复发性感染是最困难的临床挑战之一。在两个或更多个事件之后复发风险增加高达65%（麦克唐纳等人，新发感染性疾病2006；12:409-15），并且这种风险在遭受重度CDI并且遭受由介入性给药抑制非艰难梭菌的抗生素所造成的额外的消化道微生物群破坏的老年患者中几乎是必然的（胡等人，胃肠病学2009；136:1206-14）。在这一病例系列中，患者的纳入标准很简单：至少复发三次和标准抗生素治疗失败。我们的患者在平均一年的过程中平均复发约六次。这个群体突显了关于除所记载的复发以外的CDI复发的已知风险因素。大部分因重度CDI具有至少一次住院史并且几乎一半在发展CDI后因另一种非艰难梭菌适应症采用了抗生素。年轻组中以发炎性肠道疾病患者为主。实际上所有患者在发病时均采用益生菌并且许多人还已尝试了毒素结合树脂。我们并未系统地收集关于我们的患者所采用的所有不同的益生菌制剂的信息，并且许多人在他们复发性感染的过程中已尝试了多种类型。最常见的制剂包含布拉氏酵母菌和乳杆菌菌株。建议所有患者在FMT之后中断采用益生菌。总体来说，通过所有可获得的指标来看，在这一病例系列中，患者患有顽抗性CDI，该顽抗性CDI不会对安慰剂具有显著反应率，并且不太可能对另一种抗生素过程或其他可获得的治疗性选择作出反应。

FMT已经使用了几十年，作为治愈复发性CDI的一种最后采取的方法，并且已有越来越多不受控的证据支持它的功效。在此，我们报导最大的单一病例系列之一。这一系列中的95%总成功率与文献中的累积经历（巴肯，厌氧生物2009；15:285-9，范努德等人，欧洲监测2009；14，寇拉斯和萨多斯基，粘膜免疫学2011；4:4-7）相当，并且增加了发展这种治疗方法以使它更广泛可获得的动力。我们中心所处理的主要问题是实践性问题。在计划的早期阶段中，我们让患者带来有希望的供体，实际上此时这是最常见的方法。我们的经历并不与这种方法的功效相矛盾。然而，供体鉴别和病情检查增加了程序的费用并且引入了一个潜在的延迟期。此外，已因疾病而精疲力竭的一些患者在寻找适合的供体时有困难。虽然理想的供体健康状态对于具有有限预期寿命的老年接受者来说可能不是必需的，但我们认为对于年轻患者来说对任何供体排除标准进行妥协不是一种选择。消化道微生物群构成具有主要的能量代谢功能和免疫系统功能的一个人类微生物器官（寇拉斯和萨多斯基，粘膜免疫学2011；4:4-7）。因此，这种移植程序潜在地暗示了接受者的系统性生理学。虽然供体健康并不保证消化道微生物群的最佳组成，但它是目前唯一可获得的指标。出于所有这些原因，我们决定为我们的患者引入标准供体选择。有趣的是，尽管许多患者与一些已经过鉴别的潜在供体一起来到诊所，但他们在学习了关于一个匿名筛选的供体的标准选择后全部立即更喜欢这种标准选择。

下一挑战变成了提前准备供体材料。关于粪便微生物群的不同组分随时间推移的存活性了解很少，并且我们并不希望测试这个变量。然而，因为一经要求即产生新鲜材料总是不实际的，并且确实形成了延迟以及卫生和美观性问题，所以我们引入冷冻的供体材料作为另一种治疗选择。冷冻制备物的临床功效很快变得明显并且现在它已成为我们计划中的标准方案的一部分。

典型地，FMT被大多数临床医师视为一种最后的选择、孤注一掷的治疗选择，并且在很大程度上这是归因于它的给药方式中所存在的多种美观性和实际障碍。增加的CDI患病率、发病率以及死亡率现已达到流行比例并且这些患者中的相当一部分不能用标准疗法清除感染。这些患者可以受益于FMT，但有可能该程序对他们来说是不可获得的。我们的FMT方案现已进行到已克服大多数显而易见的美观性和实际挑战的程度。这还显著降低了与筛选潜在供体有关的成本。虽然需要作出努力并且组织适合供体的招募和筛选，连同材料制备和储备，但实际FMT的执行已变成一件用解冻的几乎无气味的材料加载注射器和结肠镜检查的简单的事情。

这项研究存在多个局限性。它不是被设计成测试一种具体FMT方法相较于另一种或一些其他形式的疗法的功效的一种严格的临床试验。相反，它是随着程序方案在我们的临床经历过程中演变而使FMT标准化的一种尝试。需要额外的工作来准备将这种程序用于临床试验和更广泛的应用。尽管如此，我们的临床结果仍提供了关于冷冻制备物的功效的极有说服力的证据。然而，单独从这一经历我们无法得出新鲜和冷冻制备物等效的结论。供体材料制备物的复杂性、通过经典实验室技术培养大多数所包含的微生物组分的技术不可能性以及我们对于物种身份（这在治疗学上是最重要的）的无知妨碍了在FMT之前可以预测其功效的对供体材料的简单测试。然而，我们目前正努力通过高产量16SrRNA基因测序来表征供体材料和随时间推移所收集的接受者的粪便样品的微生物组成。这些实验的结果会提供一些手段来比较不同的供体制备物。此外，我们正努力研发将允许使供体制备物的微生物组成的进一步标准化的实际实验室测试。

虽然FMT用于复发性CDI已历史悠久，但病例报导表明它还可以在治疗IBD和IBS中有一席之地（贝内特（Bennet）等人，柳叶刀（Lancet）1989；1:164，布洛迪（Borody）等人，临床胃肠病学杂志（JClin Gastroenterol）2003；37:42-7，安德鲁兹（Andrews）和布洛迪,澳大利亚医学杂志（Med J Aust）1993；159:633-4）。鉴于消化道微生物群在代谢综合症的发病机制中的潜在重要作用，已在关于这种病状的一种临床试验中探索FMT（乌瑞兹（Vrieze）等人，糖尿病学（Diabetologia）2010；53:606-13）。基于FMT的治疗剂的简化和标准化对它的将来发展来说是至关重要的。最新的技术进展还已使得有可能获得关于消化道微生物群的组成和它们的活性的深入了解。对FMT情形中的微生物群的研究会加速微生物治疗剂的发展并且得到新的关于微生物宿主相互作用的深入了解。

在此所引用的所有专利、专利申请和公开以及用电子方式可获得的材料（包括例如在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交材料，以及在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交材料，以及在GenBank和RefSeq中的标注编码区域的翻译）的全部披露通过引用以其全文结合在此。公开中所参考的补充材料（如补充的表、补充的图、补充的材料和方法和/或补充的实验数据）同样通过引用以其全文结合在此。在本申请的披露与通过引用结合在此的任何文献的披露之间存在任何不一致的情况下，应以本申请的披露为准。已仅为了清楚理解而提供前述详细说明和实例。不应由其理解为不必要的限制。本发明不限于所显示和描述的确切细节，因为本领域的普通技术人员所显而易见的变化形式将包括在由权利要求书所定义的本发明内。

除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所使用的表示组分的量、分子量等等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非相反地指明，否则本说明书和权利要求书中所阐述的数值参数是可能视试图通过本发明获得的所希望的性质而变化的近似值。最低限度地，并且不试图限制等效物原则应用于权利要求书的范围，至少应根据所报导的有效数字的数目并且通过应用一般四舍五入技术来理解每一数值参数。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但特定实例中所阐述的数值是尽可能精确报导的。然而，所有数值均固有地包含由它们对应的测试测量中所存在的标准偏差必然产生的一个范围。

所有标题均是为了方便读者并且不应用于限制该标题之后的文字的含义，除非如此规定。

Claims (42)

1.一种包含人类粪便提取物或制备物的组合物，其中该组合物包含不大于约0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的非生命材料重量/生物材料重量，其中任选地该生物材料包含人类消化道、结肠或肠道粪便微生物，并且任选地该生物材料包含人类消化道、结肠或肠道细菌，

其中任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

2.一种包含有包含人类粪便材料的人类粪便提取物或制备物的组合物，其中该人类粪便材料由非生命材料粒子和/或生物材料粒子组成，或基本上由这些粒子组成，这些粒子将穿过一个具有以下筛网尺寸的筛网：2.0mm、1.0mm、0.5mm、0.25mm、0.212mm、0.180mm、0.150mm、0.125mm、0.106mm、0.090mm、0.075mm、0.063mm、0.053mm、0.045mm、0.038mm、0.032mm、0.025mm、0.020mm、0.01mm或0.2mm，

其中任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

3.一种包含从消化道、结肠或肠道提取或制备的至少4种不同门的消化道、结肠或肠道细菌的组合物，

其中这些门包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门软壁菌门或其组合，

其中任选地这些门选自拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、软壁菌门或其组合，

并且其中该组合物包含不大于约0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的非生命材料重量/生物材料重量，其中任选地该生物材料包含人类消化道、结肠或肠道菌群，并且任选地该生物材料包含人类消化道、结肠或肠道细菌，

其中任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

4.一种包含人类粪便提取物的组合物，其中该组合物基本上是无气味的，

其中任选地该组合物包含生物材料，并且任选地其中该生物材料包含细菌，

其中任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

5.如权利要求1到4中任一项所述的组合物，其中该组合物包含不大于约0.1%的非生命材料重量/生物材料重量。

6.如权利要求2所述的组合物，其中该粪便材料由将穿过一个0.25mm筛网或等效物的粒子组成，或基本上由这些粒子组成。

7.如权利要求2所述的组合物，其中该组合物包含不大于约0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的非生命材料重量/生物材料重量。

8.如权利要求1、2、3或4所述的组合物，其中该组合物另外包含一种低温保护剂。

9.如权利要求8所述的组合物，其中该低温保护剂包含一种甘油。

10.如权利要求8所述的组合物，其中该组合物是在小于约0℃的温度下。

11.如权利要求1、2、3或4所述的组合物，其中该组合物是一种固体。

12.如权利要求11所述的组合物，其中该固体包含一种粉末。

13.如权利要求1、2、3或4所述的组合物，其中该组合物包含至少约1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰或5×10¹⁰个细菌。

14.如权利要求1到13中任一项所述的组合物，其中该生物材料包含：多种原核细胞、真核细胞或病毒；或一群原核细胞、真核细胞以及病毒，这群原核细胞、真核细胞以及病毒基本上等同于或代表或等效于一个正常健康人类的粪便中所存在的一群原核细胞、真核细胞以及病毒。

15.如权利要求1到13中任一项所述的组合物，其中所存在的该生物材料包含一群原核细胞和病毒，这群原核细胞和病毒基本上等同于或代表或等效于一个正常健康人类的粪便中所存在的一群原核细胞和病毒。

16.如权利要求2或4所述的组合物，其中该组合物包含一种生物材料，并且该生物材料包含一群原核细胞、真核细胞或病毒，这群原核细胞、真核细胞或病毒基本上等同于或代表或等效于一个正常健康人类的粪便中所存在的一群原核细胞、真核细胞和病毒。

17.一种通过方法制备的组合物，该方法包括：

使一个粪便样品经受一种条件或多种条件，这种条件或这些条件去除至少约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的在这一经受之前该粪便样品中所存在的非生命材料，

其中任选地该组合物包含一种生物材料，并且任选地该生物材料包含细菌，

其中任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

18.如权利要求17所述的组合物，其中这一经受是在不大于约26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃或34℃的温度下进行。

19.一种通过方法制备的组合物，该方法包括：

用一种过滤介质过滤一个粪便样品，其中该过滤介质包含不大于约2.0mm、1.0mm、0.5mm、0.25mm、0.212mm、0.180mm、0.150mm、0.125mm、0.106mm、0.090mm、0.075mm、0.063mm、0.053mm、0.045mm、0.038mm、0.032mm、0.025mm、0.020mm、0.01mm或0.2mm的筛网尺寸，以形成或产生一种滤液，其中任选地该组合物包含一种生物材料，并且任选地该生物材料包含细菌，

其中任选地该组合物包含一种药学上可接受的载体，并且任选地该组合物是一种用于口服给药的配制品。

20.如权利要求19所述的组合物，另外包含用一种过滤介质过滤该粪便样品，其中该过滤介质包含不大于0.25mm的筛网尺寸。

21.如权利要求19所述的组合物，其中该过滤是在不大于约26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃或34℃的温度下进行。

22.如权利要求17或19所述的组合物，其中该组合物包含至少4种不同门的细菌，

其中这些门包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、软壁菌门或其组合，

其中任选地这些门选自拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、软壁菌门或其组合。

23.如权利要求22所述的组合物，其中该组合物另外包含至少5、6、7、8、9或10种不同纲的细菌，这些细菌选自放线菌纲、拟杆菌纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲、丹毒丝菌纲、α变形菌纲、β变形菌纲、γ变形菌纲、柔膜菌纲以及疣微菌纲。

24.如权利要求17或19所述的组合物，其中该方法另外包括添加一种低温保护剂到该组合物中。

25.如权利要求24所述的组合物，其中该方法另外包括冷冻该组合物。

26.一种如权利要求1、2、3或4中所述的组合物，用作一种治疗剂。

27.一种如权利要求1、2、3或4中所述的组合物，用于治疗结肠的一种疾病或一种病理性或医原性病状。

28.如权利要求28所述的组合物，其中该疾病是一种特征为结肠微生物群的功能异常或病理性组成的疾病或病状。

29.如权利要求29所述的组合物，其中该疾病是一种艰难梭菌结肠炎。

30.一种替换或补充或调节受试者的结肠微生物群的方法，该方法包括：

向该受试者给药如权利要求1、2、3、4、16、17或19所述的组合物。

31.一种用于治疗受试者的方法，该方法包括：

向一个有需要的受试者给药有效量的如权利要求1、2、3、4、16、17或19所述的组合物。

32.如权利要求30或31所述的方法，另外包括在该给药之前去除一些、大部分或基本上所有的该受试者的结肠、消化道或肠道微生物群。

33.如权利要求31所述的方法，其中该受试者具有患一种结肠炎的风险或处于该风险中。

34.如权利要求33所述的方法，其中该结肠炎是一种自体免疫结肠炎。

35.如权利要求34所述的方法，其中该自体免疫结肠炎选自一种发炎性肠道疾病、一种溃疡性结肠炎、一种克罗恩氏病以及一种肠道易激综合症。

36.如权利要求33所述的方法，其中该结肠炎是一种感染性结肠炎。

37.如权利要求36所述的方法，其中该感染性结肠炎选自一种艰难梭菌结肠炎和一种肠出血性结肠炎。

38.如权利要求37所述的方法，其中该艰难梭菌结肠炎选自一种急性艰难梭菌结肠炎、一种复发性艰难梭菌结肠炎以及一种重度艰难梭菌结肠炎。

39.如权利要求37所述的方法，其中该肠出血性结肠炎是由选自志贺氏菌属和大肠杆菌的一种微生物引起。

40.如权利要求31所述的方法，其中该受试者具有慢性腹泻或慢性便秘的风险或处于该风险中。

41.一种如权利要求1到29中任一项所述的组合物的用途，用于制造一种药物。

42.一种如权利要求1到29中任一项所述的组合物的用途，用于制造一种药物，该药物用于疗或减轻或预防结肠的疾病或病理性或医原性病状，

其中任选地该疾病是一种特征为结肠微生物群的功能异常或病理性组成的疾病或病状，或该疾病是一种艰难梭菌结肠炎，或该疾病或病状是一种结肠炎、一种自体免疫结肠炎、一种感染性结肠炎或一种肠出血性结肠炎。