CN110117570B - 一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶并进行吹打；培养消化后打散成单个细胞；过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。采用本发明的培养方法30天可获得1010个左右的RASFs，细胞产率大大提高极高，可以满足多种实验需要，因此是一种快速有效的原代RASFS分离培养方法。同时原代培养获得RASFs和体外建系的滑膜细胞系相比，具有更高的研究价值，具有良好的实际应用之前景。

Description

一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
类风湿关节炎(Rheμmatoid arthritis，RA)是一种涉及全身的自身免疫性疾病。RA的主要病理特征是关节炎滑膜慢性炎症反应，炎性细胞浸润，血管翳形成，骨和软骨进行性破坏。滑膜的过度增生和反复发作的剧烈炎症反应导致关节关节骨和软骨的破坏，造成关节磨损，关节功能障碍。虽然近年来人们对RA的治疗已经取得了一定的进展，但其具体的病因仍然不清楚。RASFs直接来源于病人病灶部位，其在RA患者骨和软骨破坏中起到重要的作用。在病患部位中大量的炎性细胞浸润使得RASFs大量增殖导致骨和软骨进行性破坏。近年来大量研究证实调控RASFs中的相关致病基因表达在RA诊断和治疗中有着较高的应用价值。
因此，目前在RA病理进程中的作用研究中，RASFs成为了滑膜功能研究的重要细胞模型之一。目前RASFs的原代培养方法主要包括组织块培养法和混合酶消化法。组织块培养法由于组织块与细胞培养器皿的贴附不牢靠，易脱落，而且培养周期长，消化时间不易控制，极易污染，成功率不高。而混合酶消化法将胰酶和胶原酶混合，进行组织消化，由于胰酶对细胞膜损伤较大，而滑膜细胞脱离组织的束缚、从组织块中爬出，需要较长的消化时间，对细胞膜的损伤极大，获得的细胞状态往往不好。以往研究虽然通过机械剪切对滑膜进行一定的破碎，然后使用混合酶消化法进行消化，一定程度上提高了原代RASFs的获取效率，但是发明人在实验过程中发现两个主要问题：1、RA组织以纤维性组织为主，而胶原酶能够非常有效的消化纤维性组织，并且胰酶对细胞的损害非常大，长时间的消化会导致大量细胞死亡。2、原有的提取方案没有对滑膜组织块的体积进行定量，极易使酶的过量或者不足，导致细胞死亡或者消化不充分，最终原代RASFs提取效率低。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，本发明通过对常规原代滑膜细胞提取方法进行优化，从而大大提高滑膜细胞提取效率，能够在短期内获得大量实验样本，不仅为后续类风湿性关节炎发病机制研究奠定了基础，而且能够大大缩短实验周期。且原代培养获得RASFs和体外建系的滑膜细胞系相比，具有更高的研究价值，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明的一个方面，提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：
将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶并进行吹打；
培养消化后打散成单个细胞；
过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；
采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。
本发明的第二个方面，提供上述培养方法获得的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。
本发明的有益技术效果：
本发明提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，采用本发明的培养方法30天可获得1010个左右的RASFs，是常规消化法的7-10倍，细胞产率大大提高，且细胞形态上更加饱满，活性更强，可以满足多种实验需要，因此是一种快速有效的原代RASFS分离培养方法。同时原代培养获得RASFs和体外建系的滑膜细胞系相比，具有更高的研究价值，具有良好的实际应用之前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例1中倒置显微镜观察原有方法与本发明优化方法在细胞形态和数量上的差异图。
图2是本发明实施例1中原始提取方法和本发明优化方法细胞提取数量差异图。
图3是流式细胞术鉴定本发明实施例1制备的第三代RAFLs细胞纯度图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，常规原代滑膜细胞提取方法存在提取效率较低，获得的原代滑膜细胞数量较少等缺陷。
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：
S1、将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶；
S2、培养消化后打散成单个细胞；
S3、过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；
S4、采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。
本发明的又一典型实施方式中，所述预处理方法包括将浸泡于生理盐水中的滑膜组织取出在无菌状态下使用PBS冲洗，去除滑膜组织中的脂肪和软骨；
本发明的又一典型实施方式中，破碎方法为剪碎，进一步优选剪碎至＜0.5mm；
本发明的又一典型实施方式中，Ⅲ型胶原酶的浓度优选为0.2～0.6μg/ml(优选为0.5μg/ml)，Ⅱ型胶原酶的浓度优选为10～30μg/ml(优选为20μg/ml)；通过优化选择胶原酶的配比浓度，有利于胶原酶对纤维性组织的消化，同时避免使用胰酶，从而减少对滑膜细胞的损害；
本发明的又一典型实施方式中，滑膜组织与Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的面积体积比为0.3～0.6cm2：2～3ml：200～400μl(优选为0.5cm2：3ml：300μl)；通过限定滑膜组织与胶原酶之间的用量关系，从而避免酶加过量导致细胞死亡或者酶加量过少导致消化不充分的现象发生；
本发明的又一典型实施方式中，向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶后反复吹打2～3min；通过吹打混匀，使酶和滑膜组织充分接触以提高消化效率；
本发明的又一典型实施方式中，所述培养消化具体方法为：置于37℃，5％CO2细胞培养箱消化培养3～6h；
本发明的又一典型实施方式中，打散成单个细胞具体方法为采用吹打方式，该方法较为柔缓，减少对细胞的损伤；
本发明的又一典型实施方式中，DMEM高糖培养基中还含有有1％双抗和10％FBS；
本发明的又一典型实施方式中，所述类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞为3-6代培养细胞，此时培养细胞活性较高。
本发明的又一典型实施方式中，提供上述培养方法获得的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1主要试剂仪器耗材
1.1试剂
试剂名称 厂家 产地
澳洲胎牛血清 Gibco 美国
Ⅱ型胶原酶 索莱宝 北京
Ⅲ型胶原酶 索莱宝 北京
DMEM细胞培养基 Hyclone 美国
胰酶、青霉素链霉素 索莱宝 北京
FITC标记vimentin抗体 eBiosecience 美国
CD68抗体 eBiosecience 美国
1.2仪器耗材
Figure BDA0002077430920000061
2方法
2.1类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的分离和培养
1)经患者同意并通过本单位伦理审核获得经膝关节置换手术切除的RA患者的滑膜组织；
2)将取下的滑膜组织放置于无菌的生理盐水中，密封于无菌样本代中迅速转移至实验室；
3)在超净工作台中将RA患者膝关节滑膜组织用20ml PBS冲洗3遍，每遍2钟；
4)利用无菌眼科剪小心除去滑膜组织中的脂肪和软骨组织；
5)将滑膜组织以每小培养皿(30mm)0.5cm2滑膜组织平均分到若干小皿中；
6)使用眼科剪对每小皿中的滑膜组织充分剪碎＜0.5mm；
7)每皿剪碎的组织中加入3ml(0.5μg/ml)的Ⅲ型胶原酶以及300μl(20μg/ml)的Ⅱ型胶原酶；
8)使用无菌枪头反复吹打(2分钟)使酶和滑膜组织充分接触以提高消化效率；
9)置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，消化3-6h；
10)消化完毕后使用1ml移液枪反复吹打细胞使其成为单个细胞，如果无法将组织吹散放入培养箱继续消化；
11)使用70μm的细胞滤筛过滤消化完毕并吹散的滑膜组织；
12)将滤液移至无菌的5ml离心管中，于离心机中以1500r/min转速离心5min；
13)离心完毕后收集下层沉淀接种于含有1％双抗和10％FBS的DMEM高糖培养基中；
14)48h后RASFs可以完全贴壁，对细胞进行换液除去未贴壁细胞；
15)根据细胞状态进行换液和传代，利用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞，取3-6代活性高纯度好的细胞进行实验。
2.2滑膜成纤维细胞的鉴定
2.1.1形态观察
使用倒置显微镜观察培养第一代和第二代的原代细胞形态。通常RASFs为滑膜成纤维样细胞。观察RASFs细胞的形态是否为长梭形、是否贴壁生长来初步判断RASFs的纯度和生长状态。
2.1.2细胞计数
使用细胞计数器对原代细胞进行计数。称取相同质量的组织通过常规方法和优化方法提取后，接种到25cm2的细胞培养瓶中,然后通过自然传代方法纯化细胞，最终使用胰酶消化细胞，使用细胞计数器对细胞进行计数。
2.1.3流式细胞术
将第三代RASFs使用胰酶消化后收集2×106细胞，加入200μLPBS重悬细胞后分为两份，分别加入20μL FITC标记抗人vimentin抗体和抗人CD68抗体混匀，4℃避光孵育30min，期间每5min振荡混匀细胞一次。用PBS洗涤细胞两次后，加入500μL固定液重悬细胞避光，尽快进行流式细胞术检测。
3结果
3.1细胞形态
原代细胞经36h贴壁之后,对细胞进行换液以去除杂细胞，使用倒置显微镜观察。常规提取方法和优化方法都能够有效地提取到成纤维状的RASFs，传代后(第二代)RASFs体积增大，更加伸展，已经具有成纤维细胞的典型特征，贴壁性更好。但是与常规提取方法相比本发明方法提取的RASFs轮廓更清晰，生长活性更强(图1)。
3.2细胞计数
对第三代细胞进行消化后，加入相同体积的PBS，使用细胞计数板进行计数，计数过程分三次进行，记录并统计细胞数量(图2)。
3.3流式细胞术鉴定RASFs纯度
原代培养第三代RASFs细胞分别用抗抗vimentin和抗CD68抗体标记后，流式分析显示所得滑膜细胞中vimentin阳性、CD68阴性的细胞比率达95％以上(图3)。
本发明利用机械方式将滑膜组织尽量剪碎，并对每个消化体系中加入的剪碎滑膜组织进行了定量，弃用了以前胰酶和胶原酶混合消化法，直接使用一定体积和浓度的胶原酶混合液进行消化，并用枪吹打混匀以使组织和酶充分接触，提高消化效率。消化结束后使用枪头轻轻吹散组织块，使用滤网过滤。这种柔缓的方法获得的细胞损伤最小。与原有方法相比优化后的方法提取的原代RASFs在细胞形态上更加饱满，活性更强，并且细胞数量更多，提取效率更高。细胞计数也再一次说明优化后的方法比原有方法提取细胞数量更多效率更高。Vimenin是成纤维细胞的蛋白标志物，采用鉴定成纤维细胞标志分子vimentin和CD68的方法来鉴别所获得滑膜细胞的类型。流式细胞术显示，vimentin阳性且CD68阴性的细胞占所有滑膜细胞的95％以上，并且原有方法和优化方法vimentin阳性率差异不大。以上结果表明，优化的方法能够有效地提取RASFs，并且提取效率大大提高。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (11)

1.一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法，所述方法包括：
将经预处理后的滑膜组织充分破碎；向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶；Ⅲ型胶原酶的浓度为0.2~0.6 μg/ml，Ⅱ型胶原酶的浓度为10~30 μg/ml，滑膜组织与Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的面积体积比为0.3~0.6cm2：2~3ml：200~400μl；
培养消化后打散成单个细胞；
过滤后将滤液离心取下层沉淀接种至DMEM高糖培养基中贴壁培养；
采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞即得类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞。
2.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，所述预处理方法包括将浸泡于生理盐水中的滑膜组织取出在无菌状态下使用PBS冲洗，去除滑膜组织中的脂肪和软骨。
3.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，破碎方法为剪碎。
4.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，破碎方法为剪碎至＜0.5mm。
5.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，Ⅲ型胶原酶的浓度为0.5 μg/ml。
6.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，Ⅱ型胶原酶的浓度为20 μg/ml。
7.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，滑膜组织与Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的面积体积比为0.5cm2：3ml：300μl。
8.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，向其中加入Ⅲ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶后反复吹打2~3min。
9.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，所述培养消化具体方法为：置于37℃，5% CO2细胞培养箱消化培养3~6h；
所述打散成单个细胞具体方法为采用吹打方式进行。
10.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，DMEM高糖培养基中还含有1%双抗和10%FBS。
11.如权利要求1所述的一种原代培养方法，其特征在于，所述类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞为3-6代培养细胞。
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