CN111499732A - 一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用，所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体中两个Val‑1(α)残基被羧甲基化，两个Lys‑99(α)残基被分子内交联。其中两个Lys‑99(α)残基进行分子内交联，形成的富马酰亚胺桥能改变成人血红蛋白(HbA)分子的静电相互作用，稳定HbA的紧张态(T态)，降低其氧亲和性；Val‑1(α)位于HbA中心空穴αα‑末端，能参与形成有助于稳定松弛态(R态)结构的盐桥，羧基化修饰会破坏这些盐桥，降低了HbA的R态稳定性，使得HbA的四级结构从R态向T态转移，降低HbA对氧的亲和力。本发明将两种修饰手段有机结合，提高HbA四聚体稳定性，增强静电相互作用，改善氧结合区域与氧的结合状态，具有很强的携/放氧活性。

Description

一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种血红蛋白氧载体及其制备方法和应用，尤其涉及一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着我国临床用血需求的快速增长和无偿献血制度的实施，血液供需矛盾日趋突出。传统的输血方式在医疗救护中具有重要作用，同时也存在各种缺点，主要体现在：(1)由于窗口期的存在，输血存在病原体传播的风险，如血液中可能存在HIV、乙肝病毒等病原体；(2)我国血源短缺，临床血库储备不足，尤其是稀有血型患者可能因缺乏同型血而失去生命；(3)天然红细胞储存时间短，在4℃条件的血库中仅能保存5-6周，而且运输条件苛刻；(4)在输入人体前需进行交叉配血，不利于紧急情况下的抢救。这使得本就短缺的血源无法满足临床治疗及应急救援的需求，也限制了天然血液在大失血急救中的应用。

血红蛋白(Hemoglobin,Hb)是由四个亚基(ααββ)组成的四聚体蛋白，具有载氧功能。游离血红蛋白分子的四聚体因稳定性较差，解聚形成的二聚体易被肾小球过滤而引起肾毒性；因失去2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的调节而无法有效地向组织供氧；因其容易被机体内的水解酶降解而缩短其在机体内的循环半衰期；因失去了氧化还原酶系统，容易自氧化生成无活性的高铁血红蛋白和氧自由基等问题。血红蛋白氧载体以人或动物源性血红蛋白为基础，通过化学改构去除其抗原性和毒性，延长其循环半衰期，从而能够安全、有效地替代红细胞发挥携/放氧活性。血红蛋白氧载体是一种理想的血液代用品，能够长期保存，无需交叉配型，可避免经血传播疾病，目前已成为国内外研究的热点之一。

血红蛋白氧载体主要通过血红蛋白的分子内交联、分子间聚合和高聚物修饰等方法制备。例如戊二醛聚合牛血红蛋白(HBOC-201)用于急性失血患者的治疗；右旋糖酐是血浆扩容剂的主要成分，其成本低廉，安全性高，扩充血容量的能力强，右旋糖酐化Hb具有扩充血容量与供氧的双重功能，适用于急性大失血患者的救治。

P₅₀指血红蛋白氧饱和度达到50％时的氧分压，是反映Hb与氧气结合难易程度的一种参数,采用小分子化学修饰的方法对血红蛋白进行定点修饰，可以提高血红蛋白的P₅₀，降低其氧亲和性，提高血红蛋白的携/放氧活性。

目前开发的血红蛋白氧载体普遍具有较高的氧亲和性，即较低的P₅₀值，不能向缺氧组织有效地释放结合的氧气。例如，PEG化Hb的P₅₀仅为4-6mmHg，远远低于血液的P₅₀(～28mmHg)，这是由于每个HbA分子平均结合了约6个分子量为5kDa的PEG。这些PEG分子所形成的水化层屏蔽了HbA的部分携/放氧活性位点。戊二醛聚合牛血红蛋白的P₅₀值也较低，一般小于10mmHg，由于牛血红蛋白的聚合是以低分子量的戊二醛为连接桥，多个牛血红蛋白分子之间比较靠近，进而产生了较大的空间屏蔽效应，使得部分携/放氧活性位点被屏蔽。此外，由于戊二醛介导的分子间交联减少了HbA的胶体颗粒数量，使得其胶体渗透压也低于血液，进而不能有效地扩充血容量。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种血红蛋白氧载体及其制备方法和应用，尤其提供一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用，包括一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法、一种基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法，以上两种产品在制备血液代用品中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体，所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体中两个Val-1(α)残基被羧甲基化，两个Lys-99(α)残基被分子内交联。

本发明所涉及的血红蛋白均指血红蛋白A(HbA)，其占成人血红蛋白的98％，是由四个亚基(ααββ)组成的四聚体蛋白，具有载氧功能；其中，两个Val-1(α)残基(α亚基第1位缬氨酸)位于HbA中心空穴的αα-末端，能参与形成有助于稳定松弛态(R态)结构的盐桥，Lys-99(α)残基为α亚基第99位赖氨酸。

本发明所涉及的血红蛋白氧载体中的两个Lys-99(α)残基进行分子内交联，形成的富马酰亚胺桥能够改变HbA分子的静电相互作用，稳定HbA的T态，降低其氧亲和性；其中的Val-1(α)位于HbA中心空穴的αα-末端，能参与形成有助于稳定松弛态(R态)结构的盐桥，羧基化修饰会破坏这些盐桥，降低了HbA的R态稳定性，使得HbA的四级结构从R态向紧张态(T态)转移，降低HbA对氧的亲和力，增强HbA的P₅₀。本发明将两种修饰手段有机结合，可以提高HbA的四聚体稳定性，并增强静电相互作用，改善氧结合区域与氧的结合状态，这种双重修饰的HbA(以下用Glx-αα-Hb表示)具有很强的携/放氧活性。

第二方面，本发明提供一种如上所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，所述制备方法包括：用乙醛酸对血红蛋白进行羧甲基化处理，再用双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯对血红蛋白进行分子内交联处理，得到所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体；

或者，所述制备方法包括：用双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯对血红蛋白进行分子内交联处理，再用乙醛酸对血红蛋白进行羧甲基化处理，得到所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体。

本发明通过用双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯(DBBF)对成人血红蛋白(HbA)的两个Lys-99(α)残基进行分子内交联，乙醛酸定点修饰成HbA的Val-1(α)残基来制备得到如上所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体，以上两种修饰操作可以任选地选择先后顺序。该方法简单易操作。

优选地，其特征在于，所述用乙醛酸对血红蛋白进行羧甲基化处理具体包括如下步骤：

(1)将血红蛋白进行脱氧处理，得到脱氧血红蛋白；

(2)将步骤(1)得到的脱氧血红蛋白与乙醛酸和氰基硼氢化钠混合，在保护性气体保护下进行反应，终止反应。

优选地，步骤(2)所述脱氧血红蛋白、乙醛酸与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:(1-5):(5-100)，其中“1-5”可任意地选择1、2、3、4或5，“5-100”可任意地选择5、10、20、40、50、60、70、80、90或100等，优选1:2:20。

优选地，步骤(2)所述反应的温度为0-8℃，例如0℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或8℃等，时间为2-5h，例如2h、3h、4h或5h等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(2)所述终止反应使用甘氨酸。

优选地，步骤(2)所述终止反应后对产物进行透析除杂。

优选地，步骤(2)所述终止反应后对产物用阴离子交换层析介质进行分离纯化，所述介质为Q Sepharose High Performance阴离子交换层析介质。

优选地，所述用双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯对血红蛋白进行分子内交联处理具体包括如下步骤：

(1)将血红蛋白进行脱氧处理，得到脱氧血红蛋白；

(2)将步骤(1)得到的脱氧血红蛋白与六磷酸肌醇混合，在保护性气体保护下进行反应；

(3)将步骤(2)产物与双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯混合，在保护性气体保护下进行反应，终止反应。

优选地，步骤(2)所述脱氧羧甲基化血红蛋白与六磷酸肌醇的摩尔比为1:(5-10)，例如1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10等，优选1:8.

优选地，步骤(2)所述反应的温度为20-30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或30℃等，时间为1-5h，例如1h、2h、3h、4h或5h等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(3)所述脱氧羧甲基化血红蛋白与双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯的摩尔比为1:(0.5-5)，例如1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5等，优选1:1，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(3)所述反应的温度为20-30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或30℃等，时间为2-6h，例如2h、3h、4h、5h或6h等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(3)所述终止反应使用甘氨酸。

优选地，步骤(3)所述终止反应后对产物进行透析除杂。

优选地，步骤(3)所述终止反应后对产物用阴离子交换层析介质进行分离纯化，所述介质为Q Sepharose High Performance阴离子交换层析介质。

第三方面，本发明提供一种基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体，所述基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体由如上所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体经过聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯修饰得到。

第四方面，本发明提供一种如上所述的基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，所述制备方法包括：将基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体与聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯混合反应，终止反应，得到所述基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体。

优选地，所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯为带有8个琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇，即八臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯。

优选地，所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的数均分子量为2kDa-40kDa，例如2kDa、8kDa、10kDa、12kDa、15kDa、20kDa、30kDa或40kDa等，优选8-12kDa，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体与聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:(2-4)，例如1:2、1:3或1:4等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述终止反应使用甘氨酸。

优选地，所述终止反应后对产物用凝胶过滤层析介质进行分离纯化，所述层析介质为Superdex 200凝胶过滤层析介质。

本发明使用聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯对上述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体(Glx-αα-Hb)进行分子间聚合反应。2kDa-40kDa的PEG能够更加有效地拉长HbA分子之间的距离，降低分子间的空间屏蔽效应，由于多个HbA结合了1个PEG，使得PEG对HbA的空间屏蔽效应下降。这种修饰方式可以在很大程度上保持Glx-αα-Hb的高携/放氧活性。此外，由于PEG能结合多个水分子，能在一定程度上增强聚合血红蛋白的胶体渗透压。

第五方面，本发明提供一种如上所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体或如上所述的基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体在制备血液代用品中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明所涉及的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体通过乙醛酸修饰HbA的Val-1(α)而引入羧甲基，破坏这些参与形成有助于稳定R态结构的盐桥，使得HbA的四级结构从R态向紧张态(T态)转移，降低HbA对氧的亲和力，进而提高HbA的携/放氧活性；利用DBBF对HbA的两个Lys-99(α)进行分子内交联，可以提高其四聚体稳定性，同时改变HbA分子的静电相互作用，增强HbA的携/放氧活性；利用两种修饰方法的协同效应，将两种修饰方法有机结合，可以提高HbA的四聚体稳定性，并增强静电相互作用，改善HbA的氧结合区域与氧气的结合状态，从而增强HbA本身的携/放氧活性。这种双重修饰HbA(Glx-αα-Hb)的P₅₀值达到了34.6mmHg。

(2)本发明使用八臂PEG对Glx-αα-Hb进行分子间聚合反应。该聚合反应对Glx-αα-Hb的P₅₀值影响很小，聚合产物PEG-Glx-αα-Hb的P₅₀值达到27.8mmHg，能大体上保持Glx-αα-Hb的携/放氧活性。PEG-Glx-αα-Hb的P₅₀值要远高于戊二醛交联血红蛋白和PEG化血红蛋白。

(3)八臂PEG对Glx-αα-Hb进行分子间聚合反应，能在一定程度上提高血红蛋白的胶体渗透压，在输血时不仅可以起到氧载体的携/放氧作用，还能起到扩充血容量的作用；相比之下，戊二醛交联血红蛋白的胶体渗透压较低，不能起到扩充血容量的作用。

附图说明

图1是Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb的纯化洗脱峰示意图；

图2是PEG-Hb、PEG-Glx-Hb、PEG-αα-Hb和PEG-Glx-αα-Hb的纯化洗脱峰示意图；

图3是SDS-PAGE电泳分析结果图；

图4是凝胶过滤分析结果图；

图5是各样品的酶解肽段洗脱峰示意图；

图6是HbA、Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb中活性巯基数量和巯基反应活性结果图；

图7是PEG-Hb、PEG-Glx-Hb、PEG-αα-Hb和PEG-Glx-αα-Hb中活性巯基数量和巯基反应活性结果图；

图8是HbA、Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb的圆二色光谱分析结果图；

图9是PEG-Hb、PEG-Glx-Hb、PEG-αα-Hb和PEG-Glx-αα-Hb的圆二色光谱分析结果图；

图10是HbA、Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb的氧平衡曲线；

图11是PEG-Hb、PEG-Glx-Hb、PEG-αα-Hb和PEG-Glx-αα-Hb的氧平衡曲线；

图12是实施例2中乙醛酸化血红蛋白的制备示意图；

图13是实施例3中DBBF分子内交联血红蛋白的制备示意图；

图14是实施例4中DBBF分子内交联的Glx-Hb的制备示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

成人血红蛋白(HbA)的分离纯化：

将成人全血离心，弃去上清液。用PBS缓冲液(pH＝7.4)悬浮，离心弃去上清。重复清洗两遍。用3倍体积的水裂解红细胞。将红细胞裂解液离心，取上清，用0.22μm的滤膜过滤。滤液由Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析介质进行分离纯化，收集成人血红蛋白(HbA)对应的洗脱峰，浓缩后透析至PBS缓冲液(pH＝7.4)中，于-80℃冷冻保存备用。

实施例2

乙醛酸化血红蛋白的制备：

乙醛酸共价修饰HbA的N末端Val-1(α)，从而引入羧甲基，会破坏参与形成有助于稳定R态结构的盐桥，降低了HbA的松弛态(R态)稳定性，使得HbA四级结构从R态向紧张态(T态)转移，降低HbA对氧的亲和力。

向0.5mM HbA溶液持续通入氮气，制备脱氧HbA。随后加入1.0mM乙醛酸和10mM氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)溶液，使得HbA、乙醛酸与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:2:20。继续通入氮气，反应在无氧条件下4℃下进行3.5h，得到乙醛酸修饰的HbA(用Glx-Hb表示)。最后，加入20mM甘氨酸溶液终止反应，透析除去未反应的乙醛酸和甘氨酸。其制备示意图如图12所示。

实施例3

DBBF分子内交联血红蛋白的制备：

双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯(DBBF)对脱氧HbA修饰时，在两个Lys-99(α)之间发生分子内交联反应。

向0.5mM HbA溶液持续通入氮气，制备脱氧HbA。随后，加入等体积的4mM六磷酸肌醇(IHP)溶液，继续通入氮气，反应在无氧条件下25℃下进行3h。随后，加入0.5mM DBBF溶液，使得HbA与DBBF的摩尔比为1:1，于25℃下反应4h，得到DBBF分子内交联的HbA(用αα-Hb表示)。最后，加入20mM甘氨酸溶液终止交联反应，透析除去未反应的DBBF和甘氨酸。其制备示意图如图13所示。

实施例4

DBBF分子内交联的Glx-Hb的制备：

向0.5mM Glx-Hb溶液持续通入氮气，制备脱氧Glx-Hb。随后，加入等体积的4mMIHP溶液，于25℃下处理3h。随后，加入0.5mM DBBF溶液，使得Glx-Hb与DBBF的摩尔比为1:1。继续通入氮气，反应在无氧条件下25℃下进行4h，得到DBBF分子内交联的Glx-Hb(用Glx-αα-Hb表示)。最后，加入20mM甘氨酸溶液终止交联反应，透析除去未反应的DBBF和甘氨酸。其制备示意图如图14所示。

实施例5

Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb的分离纯化：

由Q Sepharose High Performance阴离子交换层析柱(0.5cm×5cm)纯化Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb。由20mM Tris-醋酸缓冲液(pH 7.5，Buffer A)充分平衡Q SepharoseHigh Performance阴离子层析柱。将含有Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb的反应混合液分别装载到层析柱上，用Buffer A充分平衡层析柱后，采用0-50％含0.5M氯化钠的20mM Tris-醋酸缓冲液(pH 7.5，Buffer B)梯度洗脱的方式进行洗脱。流速为2.5mL/min。如图1所示：含有αα-Hb反应混合液经洗脱后出现了3个分开的洗脱峰，其中，峰1、峰2和峰3分别对应于结合多个DBBF分子的HbA、αα-Hb和未反应的HbA；含有Glx-Hb反应混合液经洗脱后出现了2个分开的主洗脱峰，其中，峰4对应于Glx-Hb；含有Glx-αα-Hb反应混合液经洗脱后出现了2个分开的主洗脱峰，其中，峰6对应于Glx-αα-Hb。分别收集峰2、峰4和峰6对应的洗脱峰，浓缩后备用。

实施例6

PEG修饰血红蛋白的制备：

将HbA、αα-Hb、Glx-Hb和Glx-αα-Hb的蛋白浓度均调整到0.5mM，置于PBS缓冲液(pH7.4)中。将分子量为10kDa的八臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯溶于PBS缓冲液(pH 7.4)中，使其终浓度为1.5mM。向HbA、αα-Hb、Glx-Hb和Glx-αα-Hb溶液中分别加入等体积的八臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯，于4℃反应24h，得到的聚合产物分别为PEG-Hb、PEG-Glx-Hb、PEG-αα-Hb和PEG-Glx-αα-Hb。最后，加入20mM甘氨酸溶液终止反应。

实施例7

PEG修饰血红蛋白的分离纯化：

PEG-Hb、PEG-Glx-Hb、PEG-αα-Hb和PEG-Glx-αα-Hb均由Superdex 200凝胶过滤柱(1.6cm×60cm)进行分离纯化。层析柱由PBS缓冲液(pH 7.4)平衡与洗脱，流速为2.0mL/min，洗脱液由280nm的可见光进行检测。如图2所示：将含有PEG-Hb的反应混合物上柱洗脱，得到3个洗脱峰，峰1、峰2和峰3分别对应PEG-Hb、HbA和未反应的八臂PEG，峰1出峰时间要明显早于峰2，表明八臂PEG介导的聚合反应能够显著增强HbA的分子尺寸；与此相似，将含有PEG-Glx-Hb、PEG-αα-Hb和PEG-Glx-αα-Hb的反应混合物分别上柱洗脱，均得到了3个洗脱峰。其中，峰4、峰6和峰8分别对应PEG-αα-Hb、PEG-Glx-Hb和PEG-Glx-αα-Hb。收集这些峰对应的洗脱液，浓缩后备用。

实施例8

SDS-PAGE电泳分析：

将浓缩的洗脱峰溶液加入等体积的电泳缓冲液，在煮沸的水浴中放置5min，使用15％电泳胶，考马斯亮蓝染色，由SDS-PAGE电泳分析样品的纯度。

如图3所示，HbA(第2泳道)展示出1条单一的电泳条带，对应的分子量约为16kDa，这是由于HbA(64.0kDa)由α₁α₂β₁β₂四个亚基组成，在煮沸的水浴中HbA四聚体蛋白完全解聚为分子量为16.0kDa的单个亚基，单一的电泳条带表明HbA的纯度高，达到单点电泳纯；Glx-Hb(第6泳道)展现出与HbA相似的电泳条带；αα-Hb(第4泳道)和Glx-αα-Hb(第8泳道)展现出两条电泳带，对应的分子量为16kDa和32kDa，这是由于αα-Hb和Glx-αα-Hb是由自由的β亚基(16kDa)和αα-二聚体(32kDa)组成；与HbA的条带相比，PEG-Hb(第3泳道)展现出4条较大分子量的电泳条带，而原有的电泳条带变弱，这表明整个HbA分子被八臂PEG聚合，但仍有少数HbA的亚基为参与八臂PEG的聚合反应；PEG-Glx-Hb(第7泳道)展现出与PEG-Hb相似的电泳条带；与αα-Hb的条带相比，PEG-αα-Hb(第5泳道)展现出1条呈现弥散型的电泳条带，而原有的两条电泳条带变弱；PEG-Glx-αα-Hb(第9泳道)展现出与PEG-αα-Hb相似的电泳条带。第1泳道为maker。

实施例9

凝胶过滤分析：

样品由分析型Superose 6凝胶过滤柱(1cm×30cm)进行分析。如图4所示，HbA、Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb经洗脱后呈现出单一且对称的洗脱峰，而且洗脱峰的位置分别为18.1min、18.1min、17.8min和17.8min。αα-Hb和Glx-αα-Hb的出峰体积要小于HbA和Glx-Hb，表明αα-分子内交联能够增加HbA的四聚体稳定性。相比之下，PEG-Hb、PEG-αα-Hb、PEG-Glx-Hb和PEG-Glx-αα-Hb的洗脱峰位置在7.8min，为凝胶过滤柱的外水体积。这说明八臂PEG介导的聚合反应能显著增强HbA及其衍生物的分子量，导致4种样品的表观分子量超过了凝胶过滤柱的检测上限。

实施例10

修饰位点的鉴定：

利用酸丙酮法除去血红蛋白的血红素，得到珠蛋白。胰蛋白酶可以水解赖氨酸和精氨酸的羧基侧。按照胰蛋白酶与珠蛋白1:100的质量比加入胰蛋白酶，混合均匀后，在37℃条件下孵育4h，置于冷冻干燥机内冷冻干燥。随后，利用反相HPLC分离酶解肽段，并通过电喷雾离子阱质谱确定肽段的分子量。对解析的每个肽段参照血红蛋白的一级氨基酸序列进行鉴定。反相HPLC层析柱选用Proteonavi C4柱(4.6mm×250mm)。将酶解肽段装载到层析柱后，进行梯度洗脱。将αα-Hb或Glx-Hb的酶解肽图与HbA进行比较，确定αα-分子内交联和羧甲基化的位点。

如图5所示：HbA、Glx-Hb、αα-Hb和Glx-αα-Hb经酶解后均展现出一些肽谱。与HbA相比，Glx-Hb的肽谱中对应于α-T₁肽(α亚基第1个肽段)和α-T₁₊₂肽(α亚基第1和第2个肽段)几乎完全消失。其它肽段，尤其是α-T₃肽(α亚基第3个肽段)几乎没有发生变化。由于Val-1(α)(α亚基第1位缬氨酸)是α-T₁肽和α-T₁₊₂肽唯一的可修饰位点，α-T₁肽和α-T₁₊₂肽的消失表明Val-1(α)是甘油醛的特异性修饰位点。与HbA相比，αα-Hb的肽谱中对应于α-T₁₁肽(α亚基第11个肽段)和α-T₁₀₊₁₁肽(α亚基第10和第11个肽段)几乎完全消失，而其它肽段几乎没有发生变化。由于Lys-99(α)(α亚基第11位赖氨酸)是α-T₁₁肽和α-T₁₀₊₁₁肽唯一的可修饰位点，α-T₁₁肽和α-T₁₀₊₁₁肽的消失表明Lys-99(α)是DBBF的特异性修饰位点。与HbA相比，Glx-αα-Hb的肽谱中对应于α-T₁肽、α-T₁₊₂肽、α-T₁₁肽和α-T₁₀₊₁₁肽几乎完全消失，而其它肽段几乎没有发生变化。因此，Glx-αα-Hb的Val-1(α)和Lys-99(α)被特异性修饰。

实施例11

样品的巯基反应活性：

氧合血红蛋白第93位半胱氨酸[Cys-93(β)]的巯基反应活性可用于评估血红蛋白α1β2界面的变化。由于4,4’-二硫代二吡啶(4-PDS)可以与-SH发生反应生成4-硫代吡啶酮，该物质在324nm波长条件下具有最大吸光度值。利用该吸光度值作时间的函数，即可计算出Hb样品中活性巯基数量和巯基反应活性。如图6和图7所示：所有Hb样品中的活性巯基数量均为2，与血红蛋白的理论活性巯基数相同。然而，图6显示HbA的巯基反应活性要略微高于αα-Hb，但略微低于Glx-Hb，这表明αα-分子内交联会稳定α1β2界面，而Val-1(α)的羧甲基化会轻微破坏α1β2界面。与此相似，图7中显示PEG-Hb的巯基反应活性要略微高于PEG-αα-Hb，但略微低于PEG-Glx-Hb，然而，对比图6和图7显示PEG-Hb、PEG-αα-Hb和PEG-Glx-Hb的反应活性均略微高于对应的HbA、αα-Hb和Glx-Hb，这表明八臂PEG介导的聚合反应仅轻微破坏了HbA的α1β2界面。

实施例12

样品的圆二色光谱分析：

圆二色光谱的L峰(260nm附近)对血红素与周围球蛋白的相互作用非常敏感，而且受到配基(如氧分子)相互作用的影响。如图8所示：αα-Hb和Glx-Hb的L峰吸收值要略微低于HbA，但略微高于Glx-αα-Hb，这表明αα-分子内交联和Val-1(α)的羧甲基化均会改变氧与血红素的相互作用。如图9所示：相比之下，PEG-Hb、PEG-αα-Hb、PEG-Glx-Hb和PEG-Glx-αα-Hb的L峰吸收值相当。

圆二色光谱在285nm附近的光吸收值可反映血红蛋白的松弛态(R态)向紧张态(T态)的过渡。如图8所示：αα-Hb和Glx-Hb在285nm的吸收值要略微低于HbA，但略微高于Glx-αα-Hb。此外，Glx-αα-Hb在285nm处展现出1个较深的负波谷，表明Glx-αα-Hb在α1β2界面处于一种类似于T态的四级结构。如图9所示：与此相似，PEG-αα-Hb和PEG-Glx-Hb在285nm的吸收值要略微低于PEG-Hb，但略微高于PEG-Glx-αα-Hb，这表明PEG-Glx-αα-Hb更倾向于由R态向T态过渡，从而使得Hb向缺氧组织更多地释放氧气。

如图8所示：αα-Hb和Glx-Hb在Soret区域的吸光值要高于HbA，而且最大吸光值从417nm漂移到415nm，这表明αα-分子内交联和Val-1(α)的羧甲基化扰乱了血红素的微环境。相比之下，Glx-αα-Hb的吸光值略高于HbA，且最大吸光值仍在417nm处。如图9所示：PEG-Glx-αα-Hb在Soret区域的吸光值要高于Glx-αα-Hb，这表明八臂PEG介导的聚合反应改变了血红素分子与周围微环境的相互作用，血红素分子更多地暴露在周围微环境中。

实施例13

携/放氧活性的测定：

由Hemox血氧分析仪测定样品，获得氧平衡曲线。从氧平衡曲线可直接得到P₅₀值，用于评价样品的氧亲和性；计算样品的氧运送效率，即动脉氧分压(40mmHg)和静脉氧分压(110mmHg)之间的差异。氧运送效率可用于评价样品的携/放氧的活性；计算Hill系数，用于评价样品四个亚基的协同性。将含有6mg HbA的样品加到4mL HEMOX缓冲液中，再加入20μL牛血清白蛋白和10μL消泡剂，于37℃水浴5min，将样品放入样品池中，等待温度回升至37℃，设定参数，开始测定。

如图10所示：HbA的携氧曲线在生理的氧分压条件下(90-100mmHg)处于饱和状态。相比之下，Glx-Hb和αα-Hb的携氧曲线向右漂移，而且生理氧分压条件下接近饱和状态。Glx-αα-Hb的携氧曲线进一步向右漂移，生理氧分压条件下呈现不饱和状态。这表明这些血红蛋白样品均具有较好的携氧能力。HbA、αα-Hb、Glx-Hb和Glx-αα-Hb的P₅₀值分别为14.8、24.0、25.6和34.6mmHg。这表明αα-分子内交联和Val-1(α)的羧甲基化能够通过协同作用的方式提高HbA的P₅₀值。如图11所示：PEG-Hb、PEG-αα-bHb、PEG-Glx-bHb和PEG-Glx-αα-Hb的P₅₀值分别为10.8、18.1、20.1和27.8mmHg，因此，八臂PEG介导的聚合反应轻微降低了HbA及其衍生物的P₅₀值。

氧转运效率受P₅₀值的影响较大。HbA、αα-Hb、Glx-Hb和Glx-αα-Hb的OTE值分别为9.1％、25.5％、25.7％和33.1％。这表明αα-分子内交联和Val-1(α)的羧甲基化能够通过协同作用的方式改变HbA的T态至R态的四级结构转换，显著提高HbA释放氧的能力。PEG-Hb、PEG-αα-Hb、PEG-Glx-Hb和PEG-Glx-αα-Hb的氧转运效率值分别为8.3％、23.2％、21.9％和30.5％。这说明PEG-Glx-αα-Hb具有很强的氧释放能力，而八臂PEG介导的聚合反应能在很大程度上保持其携/放氧功能。

HbA的Hill系数为2.7，表明其四个亚基具有较好的协同效应。αα-Hb，Glx-Hb和Glx-αα-Hb的Hill系数分别为2.0、2.1和2.0，表明αα-分子内交联和Val-1(α)的羧甲基化能够在一定程度上影响HbA的亚基协同效应。PEG-Hb、PEG-αα-bHb、PEG-Glx-bHb和PEG-Glx-αα-Hb的Hill系数分别为1.8、1.6、1.7和1.4，这表明八臂PEG介导的聚合反应进一步降低了HbA的亚基协同效应。

实施例14

胶体渗透压的测定：

样品的胶体渗透压由Wescor 4420胶体渗透压仪(美国Wescor公司)测定，测定温度为25℃。HbA和PEG-Glx-αα-Hb的蛋白浓度均为40mg/mL，溶于PBS缓冲液(pH 7.4)。经测定，HbA的胶体渗透压为15.3mmHg，而PEG-Glx-αα-Hb的胶体渗透压为19.6mmHg。

然后制备戊二醛交联HbA，包括以下步骤：(1)将HbA和戊二醛分别置于PBS缓冲液(pH 7.4)中，浓度分别为32mg/mL和0.1％(v/v)；(2)将5mL HbA溶液与5mL戊二醛溶液混合，反应2h；(3)加入50mg/mL甘氨酸水溶液(0.4mL)，终止交联反应；(4)将反应混合液置于截留分子量为10kDa的透析袋中，用PBS缓冲液(pH 7.4)透析除去未反应的戊二醛和甘氨酸。将上述戊二醛交联HbA溶液浓缩，再将其浓度调整至40mg/mL。经测定，其胶体渗透压为11.7mmHg。这表明戊二醛交联成HbA的胶体渗透压低于HbA，这是因为戊二醛交联使得HbA分子间交联，减少了HbA的胶体颗粒数量，从而降低了其胶体渗透压；而PEG-Glx-αα-Hb的胶体渗透压高于HbA，这是因为PEG能够结合大量的水分子，从而增强其胶体渗透压，并在一定程度上弥补了聚合反应所造成的胶体渗透压降低。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体，其特征在于，所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体中两个Val-1(α)残基被羧甲基化，两个Lys-99(α)残基被分子内交联。

2.如权利要求1所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：用乙醛酸对血红蛋白进行羧甲基化处理，再用双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯对血红蛋白进行分子内交联处理，得到所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体；

或者，所述制备方法包括：用双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯对血红蛋白进行分子内交联处理，再用乙醛酸对血红蛋白进行羧甲基化处理，得到所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体。

3.如权利要求2所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，其特征在于，所述用乙醛酸对血红蛋白进行羧甲基化处理具体包括如下步骤：

(1)将血红蛋白进行脱氧处理，得到脱氧血红蛋白；

(2)将步骤(1)得到的脱氧血红蛋白与乙醛酸和氰基硼氢化钠混合，在保护性气体保护下进行反应，终止反应。

4.如权利要求3所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述脱氧血红蛋白、乙醛酸与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:(1-5):(5-100)，优选1:2:20；

优选地，步骤(2)所述反应的温度为0-8℃，时间为2-5h；

优选地，步骤(2)所述终止反应使用甘氨酸；

优选地，步骤(2)所述终止反应后对产物进行透析除杂；

优选地，步骤(2)所述终止反应后对产物用阴离子交换层析介质进行分离纯化，所述介质为Q Sepharose High Performance阴离子交换层析介质。

5.如权利要求2所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，其特征在于，所述用双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯对血红蛋白进行分子内交联处理具体包括如下步骤：

(1)将血红蛋白进行脱氧处理，得到脱氧血红蛋白；

(2)将步骤(1)得到的脱氧血红蛋白与六磷酸肌醇混合，在保护性气体保护下进行反应；

(3)将步骤(2)产物与双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯混合，在保护性气体保护下进行反应，终止反应。

6.如权利要求5所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述脱氧羧甲基化血红蛋白与六磷酸肌醇的摩尔比为1:(5-10)，优选1:8；

优选地，步骤(2)所述反应的温度为20-30℃，时间为1-5h；

优选地，步骤(3)所述脱氧羧甲基化血红蛋白与双(3,5-二溴水杨酸)富马酸酯的摩尔比为1:(0.5-5)，优选1:1；

优选地，步骤(3)所述反应的温度为20-30℃，时间为2-6h；

优选地，步骤(3)所述终止反应使用甘氨酸；

优选地，步骤(3)所述终止反应后对产物进行透析除杂；

优选地，步骤(3)所述终止反应后对产物用阴离子交换层析介质进行分离纯化，所述介质为Q Sepharose High Performance阴离子交换层析介质。

7.一种基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体，其特征在于，所述基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体由如权利要求1所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体经过聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯修饰得到。

8.如权利要求7所述的基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体与聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯混合反应，终止反应，得到所述基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体。

9.如权利要求8所述的基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯为带有8个琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇；

优选地，所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的数均分子量为2kDa-40kDa，优选8-12kDa；

优选地，所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体与聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:(2-4)；

优选地，所述终止反应使用甘氨酸；

优选地，所述终止反应后对产物用凝胶过滤层析介质进行分离纯化，所述层析介质为Superdex 200凝胶过滤层析介质。

10.如权利要求1所述的基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体或如权利要求7所述的基于三重化学修饰的血红蛋白氧载体在制备血液代用品中的应用。

Images