CN1150433A - 线粒体缺陷相关疾病的诊断，治疗以及细胞和动物模型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与早老性痴呆症(AD)，糖尿病，帕金森氏症和其它线粒体来源的疾病相关的线粒体细胞色素C氧化酶基因中的遗传突变。本发明提供了或者在临床症状的表征之前或之后检测这些疾病的方法。本发明还进一步提供了对细胞色素C氧化酶功能紊乱的治疗方案。还介绍了可用于研究线粒体缺陷相关疾病的模型系统的胞质杂种细胞系。胞质杂种的构建是通过用一种可以不可逆地破坏线粒体电子传递的物质来处理不死的细胞系。然后用分离自患病组织样品的线粒体转染细胞来构建的。一种这样的胞质杂种是用神经每细胞瘤细胞和来自早老性痴呆病患者的线粒体构建的。还提供了将这类胞质杂种用于治疗这类疾病的用途中的药物和治疗方案的筛选。另外，还提供了胞质杂种动物及其制备方法以及将它们用于药物筛选和治疗方案的选择时的使用方法。

Description

线粒体缺陷相关疾病的诊断，治疗 以及细胞和动物模型

本申请是下述申请的部分继续：1995年3月3日提交的共同未决的《线粒体缺陷相关疾病的细胞和动物模型》申请，申请号081397,808；1995年3月30日提交的共同未决的申请《与迟发型糖尿病相关的线粒体DNA突变》，申请号________；1995年3月30日提交的共同未决的申请《早老性痴呆的诊断和治疗组合物》，申请号________；以及1994年3月30日提交的共同未决的申请《早老性痴呆的诊断和治疗组合物》，申请号08/219,842，所有上述申请都在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及线粒体疾病的诊断和治疗。更具体地说，本发明涉及作为诊断早老性痴呆和糖尿病的一种手段的线粒体细胞色素C氧化酶基因突变的检测，以及在治疗早老性痴呆和糖尿病中抑制这些突变或抑制这些突变的效果。本发明还涉及与线粒体功能缺陷有关的疾病的模型系统，其中线粒体功能缺陷是由线粒体基因的缺陷造成的。本发明还涉及将这些模型系统用于药物筛选以及对这类疾病治疗效果进行评价。本发明还涉及将这些模型系统用于这类疾病的诊断。

发明背景

早老性痴呆(AD)是一种进行性的神经退变疾病，其特征在于大脑中不同区域的神经元的丧失和/或萎缩，伴随着细胞外β-淀粉样蛋白的沉淀和细胞内神经元纤维缠绕的积聚。它是一种独特的人类疾病，影响世界范围的1亿3千万人。许多过着正常而富创造性的生活的个体在变老时慢慢地受到AD的打击，并且疾病逐渐地夺去了他们的记忆和其它精神活动能力。最后，他们甚至不能识别家人和所爱的人，并且他们需要持续照料直到最后死亡。

除非例外，早老性痴呆是不能治愈和不能治疗的。患早老性痴呆的人具有该病的两种形式之一：“家族性”AD或“散发性”AD。

家族性早老性痴呆病仅占所有早老性痴呆病例中的5-10％并且通常发病早，一般在五十岁之前。家族性AD是遗传性的并且遵循传统的孟德尔遗传。这种形式的AD与核染色体异常相关。

相反地，第二种形式的早老性痴呆病，散发性AD，是一种迟发性疾病，它既不是遗传的也不是由核染色体异常引起。这种迟发形式的病症是早老性痴呆病的更普遍类型并且据信可占所有早老性痴呆病例的90-95％。

到现在为止，可能的早老性痴呆症的诊断仅靠临床观察并且是一种排除性诊断。不幸的是，确定的诊断仅能靠尸体解剖时的病理学检验才能实现。曾尝试用鉴别特定生物学标记包括蛋白酶nexinII和阿朴脂蛋白E基因座的不同来诊断早老性痴呆，但没有成功。

AD患者中不完全的外显率或者同正常或其它疾病群体的交叉都使生物学标记的鉴别成为一种不可靠的诊断方法。而且，现在临床评价中的治疗方案是治疗疾病的症状而不是去阻止引起AD的病理学。这类治疗包括用本领域中已知的Cognex，E2020，和其它类似的药剂。但是，由于本领域中对AD的基本病因还不知道，也就不能提出合理的治疗方案。

帕金森病(PD)是一种进行性的神经退变疾病，其特征在于大脑黑质致密部中含多巴胺神经元的丧失和/或萎缩。和AD相似，PD也折磨上了年纪的人。其特征在于运动过慢(慢运动)，强直和静止性震颤。尽管在一般时间内对大多数患者来说，L-Dopa的治疗减轻了震颤，但最终震颤变得越来越不受控制，以致于使患者很难或不能喂养自己或不能满足他们自己基本的卫生需求。

糖尿病是一种常见的退变性疾病，它影响着发达国家人口的5-10％。它是一种有很强的遗传因素在内的杂合性疾病，有迹象表明母性遗传是一个重要因素。单合子双胞胎患病是高度一致的并且在患病个体的第一代亲属中该病的发病率很高。据报道，母性遗传使人有一种患糖尿病的倾向性。Alcolado，J.C.和Alcolado，R.，英国医学杂志，302：1178-1180(1991)；Rengy，S.L，国际皮肤病杂志，23：886-890(1994)。

研究表明特定相关疾症可发生于糖尿病前或同糖尿病伴随产生。例如，据估计在美国有四千万个体患迟发性葡萄糖耐量降低(IGT)。IGT患者在胰岛素分泌增加的情况下对葡萄糖不反应。每年一小部分IGT患者(5-10％)变成胰岛素缺陷非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。这些患者中的一些进一步演变成胰岛素依赖性糖尿病。这种类型的NIDDM或IDDM伴随着胰岛β细胞胰岛素释放的减少和/或末端器官对胰岛素反应的减弱。其它的糖尿病症状和发生于糖尿病之前或与糖尿病有关的疾病包括：血管性病变，外周和感觉神经病，盲症和聋病。

核基因组一直是对引起糖尿病，AD，PD的遗传突变的研究的主要焦点。但是，尽管做了很大努力，分离的糖尿病，AD，PD相关的核基因仍是很少，例如在胰岛素基因，胰岛素受体基因，腺苷脱氨酶基因和糖原激酶基因中的突变。

已经认识到一些退变性病症如勒伯氏遗传性视神经病，肌阵挛，癫痫，乳酸中毒和中风(MELAS)，和癫痫性肌阵挛破碎的纤维综合症(myoclonic epilepsy ragged red fiber syndrome)是通过线粒体DNA突变介导的。线粒体DNA突变也被用于解释退变性神经病如帕金森氏症和早老性痴呆的明显的“偶发性”(非孟德尔的)。实际上，在人群中多数PD是偶发性出现的；甚至在同卵双胞胎，一个可能患病，而另一个却可能不患病。这就提示核染色体的异常不是该病的起因。而且，已经证明神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)在动物和人体中诱导帕金森症。在多巴胺神经元中，MPTP被转化为其活性代谢物，MPP+；该代谢物然后在线粒体中富集。MPP+接着即选择性地抑制NADH：辅酶Q氧化还原酶(“复合体I”)，导致自由基产生增多，腺苷三磷酸产生减小，并最终使所破坏的多巴胺神经元死亡。

另外，糖尿病与母性遗传相关提示线粒体遗传可能起作用。实际上，一种罕见的伴随着神经性耳聋的迟发性NIDDM看来是与线粒体tRNA(tRNA^Leu)的点突变相关连的。带有这种突变的个体常表现为对葡萄糖反应的胰岛素分泌减小并且常诊断为胰岛素依赖的糖尿病(IDDM)，慢性进行性IDDM，或胰岛素缺陷非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。尽管不足1％的NIDDM是由这类突变引起的，但它提示mtDNA中的其它突变可能与NIDDM相关。

线粒体基因组编码的蛋白质是电子传递链的组成成份，并有报道在帕金森病和早老性痴呆中有电子传递链的缺陷。具体地说，有报道表明，细胞色素C氧化酶，一种位于真核细胞线粒体中的重要的电子传递链的末端组份，可能在早老性痴呆中起作用。

一个提示AD和细胞色素C氧化酶之间的关系的报道是Parker等的神经学40：13021303(1990)，其中发现早老性痴呆病患者的细胞色素C氧化酶活性降低。组成线粒体电子传递链(ETC)的细胞色素C氧化酶(COX)在AD患者中的含量是正常的；但在做尸体解剖时发现该酶在AD患者和患者脑内的催化活性是异常地低的。这就提示AD患者中COX的基因是缺陷的，导致催化活性降低以致于在一些情况下引起AD特征或同AD的特征有关。Bennett等，也已证明当把叠氮钠，一种特异的细胞色素C氧化酶(COX)的抑制剂，注射给大鼠时，大鼠的记忆和学习能力下降(一种形式的痴呆)。大鼠模拟了人早老性痴呆的症状。另外，叠氮钠测试的大鼠丧失了长期强化能力，证明神经元的可塑性丧失了。有假设认为，细胞色素C活性降低导致细胞内氧自由基的水平升高，并且自由基介导的脂类氧化的积累效应最终导致AD特征的退变性的神经的变化。Wallace，D.C.，科学，256：628-632(1992)。

尽管有上述发现，但到本发明之前，对引起早老性痴呆，帕金森氏病或几种糖尿病，包括迟发型糖尿病的电子传递机能障碍的确切机制仍不清楚。尚未对这些机能障碍的遗传或结构基础进行鉴定。不知道引起电子传递机能障碍的原因以及特别是不知其遗传或结构基础，就很难诊断这些疾病。

这样就很清楚了，对AD，PD和糖尿病早期阶段的可靠的诊断，是有效和高效的阻断和治疗这些使人虚弱的疾病的关键。这就需要在出现最早的病症时或之前有一种可靠的非侵入性的诊断测试。还需要发展一种治疗病症或疾病本身的治疗方案或药品。

对诊断方法和对线粒体缺陷相关疾病的治疗有用的治疗方案和药品由于缺少可靠的能用于快速和可提供丰富信息的筛选的模型系统而一直受到阻碍。许多线粒体基因缺陷相关疾病的动物模型是不存在的。合适的细胞培养模型系统或者不存在，或者难于建立和维持。而且，即使细胞培养模型可以得到，但又常常不能确定是线粒体或是核基因组对该表型负责，因为线粒体的功能部件通常是由核和线粒体基因二者一起编码的。因此，也不能区别所给的药物或治疗方法是在线粒体基因组水平还是其它水平起作用。

一种有用的确定哪个基因组起作用的方案是破坏培养细胞中已知有正常线粒体功能的线粒体的DNA并且然后给这些细胞转入患病细胞的线粒体。但是，所得到的细胞株，称为ρ°细胞株，是不稳定的并且难以培养。用完全分化的细胞株作为转移的靶细胞，但这些细胞天然的生命期限使它们特别不适于筛选的目的。另外，这些转化没有使用那些这类疾病感染的细胞类型，使从们不清楚是否所观察到的转化体中的线粒体的缺陷与所研究的疾病相关。因此，需要一种能用于快速和有效地筛选AD、PD和糖尿病的可靠的模型系统。

本发明满足了这些对AD、PD和糖尿病进行有用的诊断和有效的治疗的需求并且提供了其它相关的优点。

发明概述

本发明涉及与疾病状态如早老性痴呆或糠尿病相关的线粒体细胞色素C氧化酶基因遗传突变的鉴定。本发明提供了检测这类突变以在临床症状出现之前或之后对早老性痴呆或糠尿病进行诊断的方法。

根据本发明的用于检测早老性痴呆或糖尿病存在的实施方案，获得含有受试者线粒体的生物样品并且检查了与早老性痴呆或糖尿病相关的线粒体细胞色素C氧化酶基因系列中的一个或多个突变。这些被检查的突变优选地位于细胞色素C氧化酶I基因的155-415密码子和/或位于细胞色素C氧化酶II基因的20-150密码子。下述的一个或多个位点的突变更优选地被检查：细胞色素C氧化酶基因I的密码子155、密码子167、密码子178、密码子193、密码子194、和密码子415；细胞色素C氧化酶II基因的密码子20、密码子22、密码子68、密码子71、密码子74、密码子95、密码子110，和密码子146。如果需要，所感兴趣的密码子可在被检查之前进行扩增。

优选的检查上述突变的方法包括：(a)与寡核苷酸探针杂交，(b)基于退火于靶核苷酸上的相邻的寡核苷酸序列的连接的方法，如连接酶链式反应的方法，(c)聚合酶链式反应或依赖于使用成套的引物的变异体，和(d)单核苷酸引物导向的延伸测试。

本发明还包括在上述诊断中有用的核酸序列，即这些与线粒体细胞色素C氧化酶基因相应的或互补的核酸，该线粒体细胞色素C基因包含与早老性痴呆或糖尿病的存在相关的基因突变。根据一个实施方案，核酸序列用可检测的试剂标记。优选的可检测的试剂包括放射性同位素(如³²P)，半抗原(如地高辛)，生物素，酶类(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)，荧光基因(例如荧光素或德克萨斯红)，或化学发光基团(例如吖啶)。

根据另一个检测早老性痴呆或糖尿病存在的实施方案，检测了生物样品中蛋白产物的存在。具休地说，检测了线粒体的带有一个或多个与早老性痴呆或糖尿病相关的细胞色素C氧化酶突变的蛋白产物。优选的检测这类蛋白的试剂包括单克隆抗体。

根据本发明的另一个实施方案，引起早老性痴呆或糖尿病的遗传突变是通过比较野生型的细胞色素C氧化酶基因和知患有早老性痴呆或者糖尿病个体的细胞色素C氧化酶基因的序列而被检测的。本发明的其它实施方案涉及抑制这些不希望的突变的生物活性。这就提供了对早老性痴呆或糖尿病的治疗方案。更具体地说，本发明一种实施方案是关于对突变的细胞色素C氧化酶编码基团的转录和翻译的抑制，该抑制是通过用对突变序列特异并可与突变的靶细胞色素C氧化酶基因或其转录产生的信使RNA能杂交的反义序列来实现的。

本发明的另一个实施方案涉及将结合(conjugate)分子选择性地导入细胞色素C氧化酶基因缺陷的线粒体中。结合物包含与毒素结合的或通过连接物与成象配基配合的靶分子。靶分子可能是，例如，亲脂性阳离子如吖啶衍生物，罗丹明123的衍生物，或一种JC-1的(5，5，6，6-四氯-1，1，3，3-四乙基苯并咪二唑(酯基)-羰花青碘化物)衍生物。连接物可能包含，例如，一种酯，醚、硫酸，磷酸二酯，硫代磷酸二酯，碳酸酯，氨基甲酸酯，腙，肟，氨基或酰胺的官能团。成象配基可以是，例如一种放射性同位素，半抗原，生物素，酶，荧光基团或化学发光基团。并且毒素可能是，例如，磷酸酯，硫代磷酸酯，二硝基苯酯，马来酰亚胺和反义寡核苷酸。

本发明还提供了与线粒体代谢缺陷相关或由其引起的疾病的模型系统。另外，还提供了用这些模型系统对治疗这类疾病的药物和治疗方案进行筛选和评价的方法。而且，还提供了用这些模型系统诊断这类疾病的方法。

本发明还进一步提供了向未分化的胚细胞或胚胎细胞中移植线粒体的方法，因此也就提供了使具有线粒体的测试动物成熟的方法，其中线粒体全部或部分地来自患病机体的细胞。

通过在筛选中使用相同的培养物，就有可能预测几种可能的药物或治疗方案中的哪一种对特定的患者是最有效的。

本发明还包括将线粒体移植入未分化的胚细胞或胚胎细胞，以产生含有线粒体的有机体，其中线粒体是部分或全部来自患病机体细胞的。

本发明的一些实施方案为对与糖尿病相关的缺陷的线粒体基因及其突变的鉴定，探测和特征描述提供了很好的机会，以便确定它们的细胞和代谢表型并评价各种药物和治疗方案的效果。在一种实施方案中，来自糖尿病患者细胞的线粒体被转移入获得不死性的β细胞中。该细胞的表型变化特征是迟发型糖尿病的特征如细胞色素C氧化酶(COX)活性的降低。如果将外源的试剂或治疗用于这类样品上并且能够阻止，延迟或减弱其表型变化，那么这些药剂或治疗将由于它们阻止，延迟或减弱人类迟发病型糖尿病的能力而值得做进一步研究。

因为这类细胞系统被观察到表现出它们相关疾病特征的表型变化，它们也被用做诊断方法。例如，从表现迟发型糖尿病症状的个体获取细胞，并将来自这类细胞的线粒体转入不死的β细胞中。这些培养物的样品接着被化学诱导分化成为胰“β细胞样的”特征的(例如，胰岛素分泌)细胞。如果包含患者线粒体的分化细胞开始表现出迟发病型糖尿病特征的退变表型(例如，胰岛素的分泌减少)，那么即可确定该线粒体携带有一个或多个能引起作用的mtRNA突变。这样即可确诊迟发型糖尿病。

所附的权利要求也在此引入做为对优选实施方案的进一步的举例。

本发明的目的之一是鉴定电子传递功能障碍的结构和遗传基础，已知该功能障碍是伴随着线粒体疾病，例如早老性痴呆或糖尿病的。

本发明的另一个目的是为早老性痴呆或糖尿病的诊断提供可靠和有效的方法。

本发明的另一个目的是为早老性痴呆或糖尿病的医治提供有效的治疗。

本发明还有一个目的是提供一种不死的ρ°细胞系。

本发明的另一个目的是提供了一种未分化的不死的ρ°细胞系，但该细胞又能被诱导分化。

本发明的进一步的目的是提供一种胞质杂种细胞系，该细胞系是包含具有不同生物来源的基因组和线粒体DNA的培养不死细胞。

本发明还有一个目的是提供一种胞质杂种细胞系，包含培养的不死细胞其基因组DNA来自神经每细胞瘤细胞系而线粒体DNA来自人组织样品，其中人组织样品来自已知患有线粒体缺陷相关疾病的个体。

本发明还有一个目的是提供细胞系，其中细胞系的基因组DNA来自维持有正常的胰β细胞表明(例如，但不限于βTC6-F7，HIT，RINM5f，和TC-I细胞)的细胞，并且线粒体DNA来自人组织样品，其中人组织样品源自己知患有线粒体缺陷疾病并与迟发型糖尿病相关的个体。

本发明一个进一步的目的是提供一种未分化但却能被诱导分化的不死的ρ°细胞系，其为包含具有来自不死的β细胞(例如，TC6-F7，HIT-T15，RINm5f，TC-I，和TNS-I细胞)的基因组DNA，以及具有来自人组织样品的线粒体DNA的培养的不死细胞，其中人组织样品来自一个患有已知的与线粒体缺陷相关并导致迟发型糖尿病的个体。

本发明还有一个目的是提供一种研究线粒体缺陷相关疾病的模型系统。

本发明的另一个目的是提供筛选在治疗线粒体缺陷相关并导致迟发型糖尿病中有用的药物模型系统。

本发明的进一步的目的是提供模型系统的以对线粒体缺陷相关并导致迟发型糖尿病的疾病治疗的有效性进行评价。

本发明的另一个目的是提供模型系统，该系统能用来进行治疗线粒体缺陷相关疾病的药物的筛选。

本发明进一步的目的是提供模型系统，其可用来对线粒体缺陷相关疾病的治疗的有效性进行评价。

本发明的另一个目的是提供诊断线粒体缺陷相关疾病的模型系统。

本发明的进一步的目的是提供上述模型系统的构建方法。

一个附加的目的是提供将这些模型系统用于药物筛选，治疗评价，和诊断的方法。

本发明的进一步的目的是提供线粒体缺陷相关疾病的动物模型。这些动物模型在药物筛选，治疗评价和诊断中很有用。

本发明进一步的目的是提供制备这类动物模型的方法。

本发明的一个优点是它对早老性痴呆，具体地说对其常见形式，偶发性AD和糖尿病提供了有效的诊断。

本发明的另一个优点是它提供了一种可在AD或糖尿病症状表现时或表现之前进行的可靠的非侵入性的诊断。

本发明还有一个优点是它提供了涉及AD或糖尿病最基本原因的有效的治疗，它是通过抑制导致早老性痴呆或糖尿病的突变产生的不希望的生物活性或通过选择性地破坏缺陷的线粒体而实现的。

本发明所赋于的另一个优点是它第一次提供了其线粒体是移植自其它细胞的细胞的稳定的培养。已有公开的研究报道将线粒体移植入完全分化的(成熟的)细胞，但这些细胞不能维持，并且最终死亡。相反地，本发明告诉我们如果将线粒体移植入一种不死的，可分化的细胞系，则所被移植细胞也是不死性的。它还说明可在不死性培养物亚群中进行诱导分化，这样即可完成实验，否则的话如果想做相同的实验就必须对分化的细胞进行直接的移植。

本发明还有另外一个优点就是它提供了与所研究的疾病有很大相关性的模型系统。在已发表的文章中用骨肉瘤(骨癌)细胞做为线粒体移植的受体细胞；但是骨细胞并非为这些转化体所产生的神经性病的最初发病位点。本发明期望选择线粒体移植入的不死性的靶细胞为能分化为特定类型的细胞，其中这些类型的细胞在所研究的疾病状态下易被影响。例如，在本文的例子中，来自AD患者的线粒体被移植入神经每细胞瘤细胞中，其亚培养物能被诱导分化为神经元。在该模型系统中线粒体缺陷的表型表达因此可被在最易受该疾病影响的细胞类型中观察到。

本发明的其它目的和优点以及可选择的其它实施方案对通晓本领域技术人员来讲将是显而易见的，尤其是在读了发明的详细说明及其后的实施例之后。

附图简述

图1示5末端非编码区，编码线粒体细胞色素C氧化酶亚基I的完整的核酸序列以及3末端非编码区(序列号I)。

图2示5末端非编码区，编码线粒体细胞色素C氧化酶亚基II的完整的核酸序列以及3末端非编码区(序列号2)。

图3示5末端非编码区，编码线粒细胞色素C氧化酶亚基III的完整的核酸序列以及3末端非编码区(序列号3)。

图4示用于对缺陷线粒体做检测和选择性的破坏的几个吖啶橙衍生物的制备的反应流程图。

图5-8示几个用于缺陷线粒体检测和选择性破坏的JC-1衍生物的制备的反应流程图。

图9是一个随溴化乙锭的处理而使氰化物敏感的氧的消耗减少的图示，提示内源性的线粒体的氧化磷酸化已失去功能了。

图10显示对各种电子传递链的抑制剂敏感的细胞氧的吸收在溴化乙锭处理后其敏感性下降，明确了溴化乙锭破坏了内源性的电子传递链；

图11是本发明的ρ°细胞的生长依赖于丙酮酸但不依赖尿苷的图解。

图12示用浓度不断增加的溴化乙锭处理64天的细胞其线粒体内膜的量增加，提示那些具有大的不规则的线粒体的细胞正是缺少线粒体DNA的细胞。

图13示用溴化乙锭处理64天的细胞接着用阳离子染料JC-1处理，结果荧光增加，提示增大的线粒体即使在缺少线粒体DNA的情况下仍可建立增大的跨膜质子梯度。

发明详述

本发明涉及线粒体细胞色素C氧化酶基因的遗传突变，该突变导致如糖尿病和早老性痴呆等疾病。本发明提供了或者在临床症状表现之前或之后检测这类突变而用于诊断这类疾病的方法。而且，本发明还涉及对突变的所不需要的生物活性的抑制并且因此提供了对这类疾病的治疗。本发明不仅第一次提供了在AD或糖尿病最早表现时或之前可进行的有效诊断，而且对这类疾病第一次提供了有效的治疗。

为了有助于对本发明有一个全面及彻底的理解，很重要的是必须指出，除非有相反的定义，本文所用的所有术语与分子遗传学技术人员常说的术语有相同的含义。本文所用的技术也是本领域普通技术人员所已知的，除非特别指出。本文所引用的参考文献全文引入做为参考。

在使用术语“核酸”，RNA、DNA等时，我们并不意味着限定其可在特定步骤中使用的化学结构。例如，本领域技术人员所熟知的是，一般RNA可用于替换DNA，并且因此，对于本领域技术人员来说，术语“DNA”应该包含这种替换。另外，已知可制做各种核酸类似物和衍生物并且相应之间以及与DNA和RNA可以杂交，并且这类类似物和衍生物的使用也在本发明的范围内。

术语“基因”包括cDNA或者其它编码基因产物的多核苷酸。术语“组织”包括由固体体物质分离或悬浮而来的血和/或细胞，以及各种器官的固体体物质。另外，基因或核酸的“表达”不仅包括细胞基因的表达，而且包括在克隆系统以及其它系统中核酸的转录和翻译。“不死性”细胞系指普通技术人员所说的细胞系或优选能进行不限定次数的传代的细胞，但传代数不能少于10次，并且没有表型改变。“ρ°”细胞是通过用对该目的有用的方法，基本上去除了功能性线粒体和/或线粒体DNA的细胞。

所提到的特定的缓冲液，介质，试剂，细胞，培养条件等，或相同物质的亚类都不是为了限制，而是应该理解为包括在讨论中所提及的特定的情况下对本领域普通技术人员来说认为有益处或有价值的所有相关物质。举例来说，经常可能用一种缓冲体系或培养液去替换另一种，以便用不同的但也是已知的方法达到相同的目标，对他们来说所建议的方法，物质或组合物仅是指导性的。

尽管在本文的一个实施方案中所用的细胞是神经每细胞瘤细胞，本发明并不局限于使用这类细胞。来自不同物种(人，小鼠，等)或不同组织(乳腺上皮，结肠，神经组织，淋巴细胞，等)的细胞在本发明中也是有用的。

线粒体疾病相关的细胞色素C氧化酶突变的分离

细胞色素C氧化酶(COX)是位于真核细胞线粒体中的重要的电子传递链的末端组份。细胞色素C氧化酶，也称为电子传递链复合物IV是由至少十三个亚基组成的。在这些亚基中至少十个是由核基因编码的；剩下的三个亚基(I，II和III)由线粒体基因编码。线粒体DNA(mtDNA)是一个小的环状DNA分子，在人当中大约有17KB长。mtDNA编码2个核糖体RNA(rRNA)，一整套转运RNA(tRNA)，和十三种蛋白；蛋白中包含3个细胞色素C氧化酶亚基COX I，COXII，和COX III。

个体中的多数mtDNA来自在个体形成时包含在卵细胞中mtDNA。在个体中mtDNA序列的突变影响所有mtDNA拷贝的叫同种突变。只影响一部分mtDNA的突变被称为异种突变并且在同一个体的不同线粒体中也是不同的。还应该指出大多数线粒体编码的蛋白质和所有的线粒体编码的COX蛋白物转录自mtDNA的重链。另一条链称为“轻链”，因为mtDNA可根据密度不同被分离为重链和轻链。

在本发明中，来自正常个体的已知的早老性痴呆病患者的，和已知的糖尿病患者的mtDNA被分离，克隆和测序。正如所预期的，在每个基因包括一些正常基因中发现了一些无害的和明显的随机突变。但是，在AD和糖尿病患者中在一些共同的位点发现了一些少数的同种或异种突变。对三个线粒体COX亚基来说，对每个个体来说突变发生在一个或多个亚基的克隆上。尤其是在mtDNA COX亚基I和II的表达区观察到了这类突变。

根据本发明，这类COX基因中的突变是与早老性痴呆和糖尿病相关的，并且明显地可足以引起上述疾病。占所有AD患者90％的偶发性AD和糖尿病与mtDNA编码的COX亚基中的异种突变相关。因此，检测这类突变可以预测和诊断早老性痴呆和糖尿病。

收集血和/或脑样品并且从几个临床分类的或尸体解剖确定的AD患者，从几个已证明的年龄相当的“正常个体”(年纪大的没有AD历史或任何AD临床症状的个体)以及从年龄相当的神经退变病对照(亨延顿氏病患者，伴核麻痹(para subranucoear palsy)等)分离DNA。也从几个糖尿病患者获取血样。在对细胞色素C氧化酶(COX)基因片段进行克隆后，也就获得了来自每个患者的多个克隆。对这些序列收集，排列并与已公开的Cambridge Gerbank(Aaderson等、Nature 290：457-465(1981))中的已知正常人的COX基因序列比较。公开的Cambridge序列编码序号如下：COX I是5964-7505核苷酸；COX II是核苷酸7646-8329，以及COX III是核苷酸9267-10052。根据Anderson的图解，相应的序列号如下：COX I是核苷酸5904-7445，COX II是核苷酸7586-8289，以及COX III是核苷酸9207-9992。同上，以下所有的参考文献只根据公开的Cambridge序列，本领域的技术人员都清楚只要使用，尽管用不同的编码图，包括用Anderson的序列编码方式，也可用于本发明。

与公开序列相异的任意变化(突变，插入、或缺失)都通过复制和互补链测序进行证实。对已知AD患者的变化的分析发现了几个突变。所观察到的突变中的一些是“静止”突变，它在所表达的蛋白中并不导致氨基酸的改变。但是，有几个突变导致相应蛋白中氨基酸的改变。在很多例子中相应的氨基酸的改变还导致COX酶构型的变化。

例如，在细胞色素C氧化酶亚基II中，AD患者中的序列与正常序列相比是每个基因至少有一个碱基的差别。数据总结于下文表2中。几个经常发生的突变据信可以导致COX酶的构型变化。例如，22密码子由正常的ACC突变为ATC导致由正常的亲水的苏氨酸(Thr)改变或疏水的异亮氨酯(Ile)。这种类型的核酸结构的改变，特别是当发生在高度保守的区域时，已知将会破坏或改变酶的活性。

正如下文更全面介绍的，每个所测序的COX基因在几个特定的位点或“突变热点”上与正常的序列比有明显的变化。而且，这些热点通常位于COX基因的特定区域。在AD序列中，在COXI首段1,530个碱基(510个密码子)中，并且特别是在155和415密码子之间，密码子155，167，178，193，194和415有高度的突变相似性(见表I)。在COX II中，热点特别位于子20和密码子150之间的区域并且更具体地是在密码子20，22，68，71，74，90，95，110，和146上(参见表2)。在COX III中，密码子64，76，92，121，131，148，241和247看来是高度可变的热点。

在早老性痴呆患者COXI基因观察到的突变。

下面的表I是几个突变的一个例子并且所给出的突变是44个早老性痴呆患者中的每一个的10个细胞色素C氧化酶亚基I(COXI)基因的克隆中观察到的。所列的AD患者的突变是相对于公开的正常人COX ICambridge序列的。所给的密码子编号是用传统方式从该基因5末端的开放阅读框开始确定的。

                                 表1

如表I所示，AD患者中COXI的突变热点是密码子155，167，178，193，194和415。

在早老性痴呆患者中所见到的COX II基因的突变

下面的表2是几个突变的一个实施例并且对于44个早老性痴呆患者中的每一个，观察了在线粒体细胞色素C氧化酶亚基II(COX II)基因的10个克隆中，所给定的突变的次数。所列的AD患者的突变是相对应于公开的正常人COX II的Cambridge序列的。所给的密码子编号，是用传统方法从该基因5末端开放阅读框开始确定的。

                                 表2

如表2所示，AD患者中COX II的突变热点是密码子20，22，68，71，74，90，95，110和146。

在每一个突变热点，在AD患者中所指出的特异变化很普遍地出现。例如，在COX I中密码子415，正常密码子是苏氨酸；在所见到的9个AD中密码子415编码丙氨酸。在COX I密码子194，芳香的苯丙氨酸取代了正常的疏水的亮氨酸。这些特定的突变不是随机发生的并且在正常个体及不患早老性痴呆的神经病患者中观察不到。

下面的表3证实了上述的突变热点在早老性痴呆诊断中的应用。对表3中的每个患者，在COX I密码子155，167，178，193，194和415存在的每一个突变；以及COX II密码子20，22，68，71，74，95，110和146存在的每个突变均用带阴影的块表示。

获取血样并且从几个活的或者是临床分类的AD患者(“血/AD”)或已知的年龄相当的‘正常个体’(年纪大的没有AD家族病史或任何临床AD症状的)个体分离DNA。在临床分类的AD患者中(“血/AD”)；61％(22对36)含有一个或多个上述的在热点的突变。36％(13对36)没有突变。但是如上述所指出的，现在对可能的早老性痴呆的论断仅限于临床观察，确切的分析只有在尸体解剖时进行病理诊断才能完成。而且，目前通过临床观察论断为AD的活的患者中只有约70-80％在尸体解剖时被确定为AD。Tierney，M.C.等，神经学38：359-364(1988)。剩下的20-30％被不正确地诊断为AD，而实际上他们可能患有具有Lewy身体变化的老年性痴呆，皮克病，伴核麻痹，等。因此，可以预期来自活的临床分类为AD的患者的血样中有很大百分比的部分将不会被测试为AD阳性。实际上，值得注意的是会得到相反的结果。

在活的已知为年龄相当的正常个体中(血/对照)14例中的1例(7％)含有单个热点突变。而且，需指出的是该个体已经65岁并且可能会发展至出现AD症状。

收集脑样品并且从几个已死亡的在尸体解剖时被确证患有AD的患者的脑中(“脑/AD”)或死亡的已知年龄相当的正常个体(年龄大的无AD家族史的，在一生中无AD临床症状的，并且在尸体解剖时无AD现象)的脑中(“脑/对照”)分离DNA。还从几个已死亡的在尸体解剖时发现患有其它退变性神经病的患者中收集脑样品并分离DNA，其它神经病选自亨顿氏病(“脑/AD”)，非特异性退变病(“脑/NSD”)，伴核麻痹(“脑/PSP”)，皮克病(“脑/picks”)，Holleruorden Spatr(“脑/HSP”)，扩散性Lewy身体病(“脑/DLBD”)非典型缠绕(“脑/AT”)，嗜银颗粒(“脑/AG”)，Lewy躯体变化的老年性痴呆(“脑/LBV”)。

从脑样品分离的DNA的检测结果清楚地显示了本发明诊断技术的特异性。在从病理确定为AD的个体获取的脑样品中，83％(10或12)含有一个或多个热点突变。在剩下的两个个体中(BA和DE)，BA证实有COX I密码子170和276COX II密码子26的突变，而DE则被证实在COX I密码子221和COX II密码子90有突变。因此，这些位点可能应加入到上面所列出的“热点”中。相反地，没有发现任何一个年龄相当的正常个体含有这类突变。

另外，在有其它神经病的个体中，18个个体中仅2个(11％)含有单个突变。这就说明本发明对AD的诊断是特异的。而且，病理学家在对两个个体之一(SC)尸体解剖时不能确切清楚地确认是属于带有嗜银颗粒的老年性痴呆还是属于AD。最后，也不能排除这种可能，即另一个个体(KI)如果不是死于伴核麻痹的话，也会表现出AD症状。

                                       表3

                                       表3(续)

密码子野生型氨基酸野生型DNA观察到的氨基酸观察到的DNA30SO31KA32SH33GA34GK35GT36GL37GM38FA39BK40JV41DR42AI45AA46NU47CN48BC49DN50GR51HW52HB54ZI55GU

血/对照血/对照血/对照血/对照血/对照血/对照血/对照血/对照血/对照血/对照血/对照血/对照血/AD血/AD血/AD血/AD血/AD血/AD血/AD血/AD血/AD血/AD血/AD

155ValGTTIleATC

167ThrACAAlaGCA

178GlnCAALeuCTA

193ValGTCAlaGCC

194LeuCTAPheTTA

415ThrACTAlaGCT

415ThrACTIleATT

20LeuCTTProCCT

22ThrACCIleATC

68LeuCTGProCCG

71IleATCThrACC

74ValGTCIleATC

95LeuCTTPheTTT

110TyrTACCysTGC

110TyrTACHisCAC

146IleATTThrACT

146IleATTValGTT

                                 表3(续)

                                表3(续)

本发明还包括分离的与线粒体细胞色素C氧化酶化基因部分对应的或互补的核苷酸序列，其中在该基因中包含与早老性痴呆或糖尿病的存在相对应的基因突变。分离的含有基因突变的核苷酸序列包括COX I核苷酸5964-7505，COX II核苷酸7646-8329和COX III核苷酸4267-10052。

线粒体来源的疾病的诊断性检测

根据本发明，线粒体COX基因的碱基变化可被检测并被用做线粒体来源的疾病，如早老性痴呆和糖尿病的诊断。有多种技术可用于对DNA和RNA分离以及对分离的线粒体COX基因的突变的检测。

有多种样品制备方法可用于从患者血样中分离DNA和RNA。例如，从血样中分离DNA可通过细胞裂解，接着用碱处理而获得。常常是，每个DNA有多个RNA拷贝。因此，从检测的灵敏度的角度出发，那种能够分离两种形式的核酸的样品制备方法是有用的。可通过异硫氰酸胍/苯酚-氯仿抽提，或者通过蛋白酶K/苯酚-氯仿处理来分离总核酸。也可使用商业上供应的例如来自Qiagen Inc.(Chatsworth，CA)的样品制备方法。

正如下文将要全面讨论的，可通过与一个或多个含有突变的互补部分的标记探针杂交来检测突变。因为线粒体疾病可以是杂种的(同时含有突变的和正常的序列)，所以可以通过比较来自突变探针的信号的量与来自正常的或野生型探针的信号的量来获得这种杂种性的定量的或半定量的测量。

如下文将要更全面讨论的，有各种技术可用于线粒体COX基因特异突变的检测。例如，检测方法包括克隆和测序，寡核苷酸的连接，聚合酶链式反应及其衍生方式的应用，单核苷酸引物导向的延伸测试的应用，应用特异的寡核苷酸的杂交技术和夹心式杂交方法。

COX基因的克隆和测序可用于患者样品中突变的检测。测序可通过使用商业供应的使用荧光标记探针的自动测序仪完成。另一种测序战略是使用位于硅片上的高密度的寡核苷酸序列的“杂交测序”方法。(Fodor等，Nature 364：555-556(1993)；Peare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：5022-5026(1994)。例如，荧光标记的靶核酸与含一套其探针区与靶序列互补的短寡核苷酸的小片段杂交，其中标记的靶核酸例如可以是使用荧光标记的引物通过PCR扩增靶基因而获得。所得到的杂交模式对于最初的靶DNA序列的排出是有用的。

突变分析也可通过以寡核苷酸序列连接为基础的方法实现；这些寡核苷酸可以马上且是相邻地退火结合于靶DNA或RNA上。(Wu和Wallance，Genomics 4：560-569(1989)；Landren等，241：1077-1080(1988)；Nickerson等，美国国家科学院院刊87：8923-8927(1990)；Barany，F.，美国国家科学院院刊88：189-193(1991))。连接酶介导的共价联结只有当寡核苷酸的碱基正确地配对之后才发生。使用热稳定的Taq连接酶用于定向扩增的连接酶链式反应(LCR)，在研究突变位置时特别有用。升高的反应温度允许连接反应高度严谨的进行。(Barany，F.，PCR方法和应用1∶5-16(1991)。

DNA中突变位点的分析也可通过应用聚合酶链式反应(PCR)及其衍生方法来实现。错配可通过杂交条件下竞争性的寡核苷酸的引导而被检测到，其中精确相配的引物是优先结合的(Gibbs等，17：2437-2448(1989))。在扩增困难的突变系统技术(ARMS)中，引物被设计成同靶序列精确匹配或要么在靶序列内要么在引端与靶序列错配(Newton等，核酸研究，17：2503-2516(1989))。在合适的条件下，只有那些可精确退火的寡核苷酸可做为PCR反应的引物，也就提供了一种区别正常和突变序列的方法。

COX基因的基因型分析也可通过单核苷酸引物导向的延伸方法来实现，其中正确碱基的特异掺入是通过DNA聚合酶的高保真性完成的(Syranen等，Genomics 8：684-692(1990)；Kuppuswamy等，美国国家科学院院刊88：1143-1147(1991))。另一种通过同时测定野生型和突变型核苷酸而可做异种性定量的引物延伸方法由共同未决的，1995，3，24提交的题为“多种引物延伸方法”的美国专利申请No._________，发明人署名为Eoin Fary和Soumitra Ghosh，公开内容本文做为参考。

靶核酸中单个碱基突变的检测可通过应用靶特异的寡核苷酸的差示杂交技术而实现。(Suggs等，美国国家科学院院刊，78：6613-6617(1981)；Conner等，美国国家科学院院刊，80：278-282(1983)；Saiki等，美国国家科学院院刊86：6230-6234(1989))。例如，突变的诊断是以精确相配的探针比错配的探针有更高的热稳定性为基础。杂交反应可以以滤膜为固定介质的型式实现，其中靶核酸被固定在硝酸纤维素或尼龙膜上与探针杂交。可以使用各种已知的杂交方式，包括Sourthern印迹，狭缝印迹，“反相斑点印迹，溶液杂交，固相支持为基础的夹心式杂交，珠粒为基础的，硅片为基础的，和微滴定孔为基础的杂交方式等。

另一种战略包括用夹心式的杂交方法检测COX基因。在这种战略中，突变的和野生型(正常的)靶核酸是用普遍的固定在固体支撑物上的捕获寡核苷酸从非同源的DNA/RNA分离而来，捕获寡核苷酸可被带有报告标记的寡核苷酸探针所检测。捕获用的寡核苷酸可以固定在微滴定板的孔上或颗粒上(Gingera)等，J.Infect Dis 164：1066-1074(1991)；Richman等，美国国家科学院院刊，88：11241-11245(1991))。

尽管放射性同位素标记的检测寡核苷酸探针是高度灵敏的，但由于考虑到放射活性物质的运输和处理，故优选非同位素标记探针。有几种用非同位素标记检测靶核酸的方法(Matthews等，Anal.Biochem.169：1-25(1988))。非同位素的检测方法可以是直接的或间接的。

间接的检测方法通常是其中寡核苷酸探针被一种例如地高辛(DIG)或生物素半抗原或配基价标记。接下来在杂交步骤后，用一种抗体或链霉亲和素-酶复合体检测靶物-探针二聚体。在DNA检测中常用的酶是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。一个具体的间接方法，Genus^TM检测系统(Boehringer Mannheim)在线粒体COX基因的突变分析中特别有用。该间接方法用地高辛做为寡核苷酸探针的标签并用一种抗地辛抗体碱性磷酸酶结合物来检测。

直接检测方法包括运用荧光基团标记的寡核苷酸，镧系螯合物标记的寡核苷酸或寡核苷酸酶结合物。荧光基团标记的例子有荧光素，罗丹明和酞菁染料。镧系螯合物的例子包含EU³⁺和Tb³⁺复合物。当使用靶特异的寡核苷酸时，优选用直接标记的寡核苷酸酶结合物来检测点突变，因为它们可提供高度灵敏的检测。

寡核苷酸酶结合物可由几种方法制备(Jablonski等，Nucl.Acids.Res.，14：6115-6128(1986)；Li等，Nucl.Acids.Res.，15：5275-5287(1987)；Ghosh等，Bioconjugate Chem.1：71-76(1990)，并且为获得检测的高灵敏性应选择碱性磷酸酶。用这些结合物可通过滤膜杂交或以颗粒为基础的夹心式杂交实现检测(Ishlo等，Bioconjugate  Chemistry 4：34-41(1993))。

探针标记的检测可用下列方法完成。对放射性同位素，可用放射自显影，闪烁计数或磷光体成像检测。对半抗原或生物素标记，可用抗体或与报告酶例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶相结合的链霉亲和素，然后再通过酶法检测。对荧光基团或镧系螯合物标记，荧光可用带有或不带有时间分辨模式的荧光分光计或自动微滴定板读数器测定。用酶标记的，通过颜色或染料沉淀检测(P-硝苯基磷酸酯或5-溴-4-氯-3-吲哆基磷酸酯/氮蓝四唑用于碱性磷酸酶以及3，3-二氨基联苯胺NiCl₂用于辣根过氧化物酶)，荧光(例如磷酸4-甲基散形基(umbelliferyl)酯用于碱性磷酸酶)或化学发光基团(来自LumigenInc.，Detroit MI的碱性磷酸酶底物dioxetaneLumiphos 530或来自Tropix，Inc.的AMPPD和CSPA)。化学发光检测可用X-线或显胶片或用单元子计数光度计来实现。这对碱性磷酸酶标记的探针是优选的检测方式。

检测用的寡核苷酸探针优选10-100碱基大小，更优选15-30个碱基的长度。这类核苷酸探针的例子见下面表4和5。表4和5提供了检测COX基团中AD突变的代表性的探针序列以及代表性的反义序列。为了用检测寡核苷酸探针检测出所期待的靶物的区别，杂交反应优选在20℃-60℃间进行，并且更优选30℃-55℃。本领域技术人员都知道，对完全匹配的和错配的双链体的最佳的区分可如下获得：调节严谨洗涤温度和/或盐浓度或所含的甲醛的量。

                   表4  有义探针--反义链的DNA的检测

基因	AANO.	长度(WT)	％GC	野生型	SEQ.ID.NO.	突变体	SEQ.ID.NO.
								COX I	155	23	52.2	5’-ACCTAGCAGGTGTCTCCTCTATC-3’	4	5’-ACCTAGCAGGTATCTCCTCTATCT-3’	18
COX I	167	27	22.2	5’-CAATTTCATCACAACAATTATCAATAT-3’	5	5’-CAATTTCATCACAGCAATTATCAATAT-3’	19
								COX I	178	21	47.6	5’-GCCATAACCCAATACCAAACG-3’	6	5’-GCCATAACCCIATACCAAACG-3’	20
COX I	193	23	47.8	5’-AATCACAGCAGTCCTACTTCTCC-3’	7	5’-AATCACAGCAGCCTACTTCTCC-3’	21
														5’-AATCACAGCAATCCTACTTCTCC-3’	22
COX I	194	25	50.0	5’-TCACAGCAGTCCTACTTCTCCTATC-3’	8	5’-TCACAGCAGTCTTACTTCTCCTATC-3’	23
								COX I	415	26	26.9	5’-CAAAATCCATTTCACTATCATATTCA-3’	9	5’-AAAATCCATTTCGCTATCATATTCA-3’	24
COX I	20	25	37.5	5’-TCATAGAAGAGCTTATCACCTTTCA-3’	10	5’-TCATAGAAGAG CCTATCACCTTTCA-3’	25

                                         表4(续)

COX II	22	24	37.5	5’-AGAGCTTATCACCCTTTCATGATCA-3’	11	5’-AGAGCTTATCATCTTTCATGATCA-3’	26
								COX II	68	18	61.1	5’-TGCCCGCCATCATCCTAG-3’	12	5’-TGAACTATCATGCCCGCC-3’	27
COX II	71	18	61.1	5’-TGCCCGCCAICATCCTAG-3’	13	5’-TGCCCGOCACCATCCTAG-3’	28
								COX II	74	21	52.4	5’-ATCATCCTAGTCCTCATCGCC-3’	14	5’-ATCATCCTAATCCTCATCGCC-3’	29
COX II	95	21	47.6	5’-GATCCCTCCCTTACCATCAAA-3’	15	5’-GATCCCTCCITTACCATCAAAT-3’	30
														5’-GATCCCTCCCCIACCATCAAA-3’	31
COX II	110	23	52.2	5’-AACCLACGAGACACCGACTACG-3’	16	5’-AACCTACGAGCACACCGACTAC-3’	32
														5’-AACCTACGAGTGCACCGACTAC-3’	33
COX II	146	20	55.0	5’-AGTACTCCCGATTGAAGCCC-3’	17	5’-AGTACCCGGTTGAAGCCC-3’	34

                        表5  反义探针--有义序列DNA和PNA的检测

基因	AANO.	长度(WT)	％GC	野生型	SEQ.ID.NO.	突变体	SEQ.ID.NO.
								COX I	155	23	52.2	5’-GATAGAGGAGACACCTGCTAGGT-3’	35	5’-AGATAGAGGAGATACCTGCTAGGT-3’	49
COX I	167	27	22.2	5’-ATATTGATAATTGTTGTAGATGAAATTG-3’	36	5’-ATATTGATAATTGCTGIGATGAAATTG-3’	50
								COX I	178	21	47.6	5’-CGTTTGGTATTGGGTTATGGC-3’	37	5’-CGTTTGGTATAGGGTTATGGC-3’	51
COX I	193	23	47.8	5’-GGAGAAGTAG GETGCTGTATT-3’	38	5’-GGAGAAGTAGGGCTGCTGTGATT-3’	52
														5’-GGAGAAGTAGGATTGCTGTGATT-3’	53
COX I	194	25	50.0	5’-GATAGGAGAAGTAGGACTGCTGTGA-3’	39	5’-GATAGGAGAAGTAAGACTGCTGTGA-3’	54
								COX I	415	26	26.9	5’-TGAATATGATAGIGAAATGGATTTTG-3’	40	5’-TGAATATGATAGCGAAATGGATTTT-3’	55
COX II	20	25	37.5	5’-TGAAAGGTGATAAGCTCTTCTATGA-3’	41	5’-TGAAAGGTGATAGGCTCTTCTATGA-3’	56

                                 表5(续)

COX II	22	24	37.5	5’-TGATCATGAAAGGTGATAAGCTCTT-3’	42	5’-TGATCAXGAAAGATGATAAGCTCT-3’	57
								COX II	68	18	61.1	5’-GGCGGGCAGGATAGTTCA-3’	43	5’-GGCGGGCAAGATAGTTCA-3’	58
COX II	71	18	61.1	5’-CTAGGATGATGGCGGGCA-3’	44	5’-GGCGGGCAAGATAGTTCA-3’	59
								COX II	74	21	52.4	5’-GGCGATGACCACTAGGATGAT-3’	45	5’-GGCGATGAGGATTAGGATGAT-3’	60
COX II	95	21	47.6	5’-TTTGATGGTAAGGGAGGGATC-3’	46	5’-ATTTGATGGTAAAGGAGGGATC-3’	61
														5’-TTTGATGGTAGGGGAGGGATC-3’	62
COX II	110	23	52.2	5’-CGTAGTCGGTGTACTCGTAGGTT-3’	47	5’-GTAGTCGGTCTGCTCGTAGGTT-3’	63
								COX II	110	23	52.2			5’-GTAGTCGGTGCACTCGTAGGTT-3’	64
COX II	146	20	55.0	5’-GGGCTTCAATCGGGAGTACT-3’	48	5’-GGGCTCAACCGGGAGTACT-3’	65

做为与COX基因相关的核酸中突变的检测的另一种选择，也可以分析COX基因的蛋白产品。具体地说，细胞色素C氧化酶亚基1和2中的点突变预期可改变这些基因编码的蛋白的结构。这些改变的蛋白(变异体多肽)可被分离并被用于制备可特异性检测突变基因的蛋白产物但不能同非突变的或野生型基因的蛋白产物作用的抗血清和单克隆抗体。突变基因的产品也可用于免疫动物以生产多克隆抗体。重组产生的肽也可用于产生多克隆抗体。这些肽可能只代表所产生的基因产物的小的片段，其中基因产物是由含点突变的线粒体基因组的表达区域表达产生的。

更具体地，在PCT/US93/10072中，例如，所讨论的，含有细胞色素C氧化酶亚基1和2点突变的变异体多肽可用于免疫动物以产生多克隆抗血清。例如，可将重组产生的变异体多肽片段与佐剂一起注射入小鼠以产生免疫反应。与重组的片段的结合亲和力至少有1×10′M^-1的小鼠免疫球蛋白可做为抗血清从被免疫的小鼠中，并且可用亲和层析或其它方法做进一步纯化。另外，以小鼠中收集细胞并与骨髓瘤细胞融合以产生一个分泌抗体的杂交瘤细胞库。对杂交瘤细胞库进行筛选以获取与重组产生的片段的亲和力至少为1×10⁶M^-1的克隆。更具体地说，选择那些选择性地与变异体多肽结合但结合很差或根本不与野生型多肽结合的多肽，该选择或者通过用野生型蛋白预吸附或者通过对可与变异体但不是野生型多肽结合的独特型的杂交瘤细胞系的筛选而实现的。

能最终表达所需要的变异体多肽的核酸序列可由几种不同的多核苷酸(基因组的或cDNA，RNA，合成的寡核苷酸等)以及几种不同的技术形成。

在该DNA序列可操作地连接到(即定位以确保功能发挥)一个表达控制序列之后，该序列即可在宿主中表达。这些载体可在宿主机体中或者做为附加体或者宿主染色体DNA的整合的部分而进行典型的复制。一般说来，表达载体含有选择标记(例如以四环素抗性或以湿霉素抗性为基础的记号)以允许对转化有所需DNA序列的细胞进行检测和/或选择。进一步的细节可见美国专利4,704,362。

编码变异体多肽的多核苷酸以包含可促进那些编码序列转录(表达序列)和翻译的序列，以便生产所编码的多肽产品。这类多核苷酸的构建是本领域熟知的。例如，这类多核苷酸可包含启动子，一个转录终止位点(在直核表达宿主中是多聚腺苷酸)，一个核糖体结合位点，和，可选择地，一个用于真核表达宿主的增强子，和，可选择地，载体复制所必需的序列。

大肠杆菌是对克隆本发明的DNA序列特别有用的原核宿主。其它的可做此用途的微生物宿主包括杆菌属细菌，如枯草杆菌，以及其它的肠杆菌杆菌如沙门菌属，沙霉菌属，及各种假单菌属菌种。在这些氯核宿主中仍可构建表达载体，其中该载体含有典型的与宿主相容的表达控制序列(例如一个复制起点)。另外，可含有任意个的各种已知的启动子，例如乳糖启动子系统，色氨酸(Trp)启动子系统，β半乳糖苷酶启动子系统，或来自λ菌体的启动子系统。启动子主要控制表达，也可选择性含有有一个操纵基因序列，以及含有核糖体结合位点序列，例如，用于启始和结束转录和翻译的序列。

其它的微生物，例如酵母，也可用于表达。对于带有含表达酿洒酵母可以是一个合适的宿主，控制序列如启动子合适的载体载体还含有磷酸葡糖激酶动或其它的葡萄糖裂解的酶，需要的话还可含有一个复制起点，终止序列等。

除了微生物之外，哺乳动物组织细胞培养也可用于表达和生产本发明的多肽。真核细胞是真正优选的，因为在本领域中已发展了多种能分泌完整的人的蛋白的适宜的宿主细胞系，其中包含CHO细胞系，各种COS细胞系，Hela细胞系，骨髓瘤细胞系，Jurkat细胞系，等。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，例如一个复制的起点，一个启动子，一个增强子，以及必要的信息处理位点，例如核糖体结合位点，RNA剪切位点，多聚腺苷酸化位点，以及转录终止序列。优选的表达控制序列是来自免疫球蛋白基因，SV40，腺病毒，牛乳头状瘤病毒等的启动子。含有所感兴趣的DNA片段的载体(例如编码一种变异体多肽的多肽)可用已知的方法转入宿主细胞，导入法依细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染一般用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它的细胞宿主。

方法本身使其可方便地配制成诊断中使用的测试试剂盒。这样的试剂盒可包含一个被划分含一个或多个容器的相邻近区域的底架，其中第一个容器含有适当标记过的探针。其它的容器可以含有在定位标记的探针中有用的试剂，例如酶的底物。其它的容器还可含有限制性内切酶，缓冲液等，还有使用说明书。

线粒体来源疾病的治疗性处理

通过反义技术抑制突变的效果为线粒体来源的疾病(例如AD和糖尿病提供了有效的治疗。对以RNA(mRNA)或核DNA为目标的反义治疗已经知道很多。Helene等，生物化学与生物物理杂志1049：99-125(1990)。本发明的诊断性测试确定在特定患者中存在特异的AD或糖尿病的突变是哪些突变，这就可以针对所检测到的突变用反义寡核苷酸对患者进行“定做”的治疗。这种患者特异的反义治疗也是全新的，并且可减少患者与各种非必需的反义治疗性处理接触。如本文所用的，一个“反义”寡核苷酸是指一个能通过watson-Crick碱基配对与单链DNA或DNA配对并且通过Hoogsteen氢键可与双键靶DNA结合的寡核苷酸。

没有希望受到任何特定理论的支持，只是假设提出细胞色素C氧化酶基因中突变的破坏性效果是由电子传递链障碍产生的基因所引起的。这类自由基的作用预期是积累性的，特别是当从缺少抑制线粒体中突变的机制这一角度看时。

在细胞色素C氧化酶基因中的AD和糖尿病的突变的破坏性作用优选被反义寡核苷酸试剂减弱或消除。这类反义试剂通过双链DNA三链体的形成，与转录中单链DNA的双链体的形成，或二者都有而作用于线粒体DNA。在一个优选的实施方案中，反义试剂以编码突变的细胞色素C氧化酶基因的信使RNA为靶目标。因为DNA和mRNA二者的序列是相同的，就没有必要准确地确定起到所需作用的精确的靶目标。在细胞培养中以及在体内抑制基因表达的方法可以查到，例如，C.F.Bennett，等脂质体研究杂志3：85(1993)和C.Wahlestedt，等自然，363：260(1993)。

反义寡核苷酸治疗试剂表现出高度的药理特异性。这就允许同时进行两个或更多个反义治疗的合用，而毒性作用却不增加。因此，当一个患者被诊断出在COX基因中有两个或更多个突变时，优选将治疗设计成对多个突变同时进行治疗。结合本发明的诊断性测试，这种“患者特异的治疗”的尝试的结果是仅限于治疗在患者中检测到的特异突变。这种患者特异的治疗避开了需对所有可能的突变均作为反义治疗这种“广谱”的治疗需要。最终的结果是治疗的花费少，发生毒副作用的机会少。

一种抑制蛋白合成的方法是通过使用反义或三链体寡核苷酸，类似物或表达构件。这些方法包括向细胞中导入序列互补的核酸以便特异性与靶基因或mRNA杂交。一旦将某基因做为靶物，由于在每个细胞中只需几个拷贝就可获得完全的抑制效果，这些方法将会特别有效。反义方法学抑制了靶信息的正常处理，翻译或半衰期。这类方法对本领域的技术人员是熟知的。

一般地反义和三链体方法是用相对短的寡核苷酸处理细胞或组织，尽管也可用较长的序列达到抑制效果。该寡核苷酸可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸而且必需有足够的长度以便与靶RNA或DNA在生理温度和生理盐浓度下形成稳定的双链体或三链体。它还必须有足够的互补性或序列特异性以便与靶核酸特异性地杂交。能达到这种特异性的寡核苷酸长度优选是10-60个核苷酸长，更优选的是10-20个核苷酸长。但是，杂交的特异性不仅受到长度和生理条件影响，而且受诸如GC含量和寡核苷酸的一级结构等因素的影响。这些原理是本领域已知的，并且可由本领域的技术人员按常规确定。

作为一个例子来说，许多表4和5中的用于探针联用的寡核苷酸序列也作为反应试剂用于AD，该试剂或者指向线粒体DNA或者指向由转录得到的信使RNA。

对给定的突变可设计出一个很大范围的反义序列。例如，突变的线粒体基因COX I，密码子193。做为其RNA和DNA反义序列的寡核苷酸序列可选自下面的列表。

如所见到的，对所选择的突变体反义基因可通过截短5端、截短3端、延伸5端，或延伸3端而产生多个反义基因变异体轻链或重链都可做为靶目标。其它的变化例如载短5端并截短3端，延伸5端并延伸3端，以及截短5¹端并延伸3¹端，延伸5¹端并截短3¹端等都是可行的。重链mtDNA，野生型序列的反义基因：SEQ ID NO：7    5’-AAT  CAC  AGC  AGT  CCT  ACT  TCT  CC重链mtDNA，突变体序列的反义基因：SEQ ID NO：21   5’-AAT CAC AGC AGC CCT ACT TCT CC

  3’截短SEQ ID NO：66   5′-AAT CAC AGC AGC CCT ACT TCT CSEQ ID NO：67   5′-AAT CAC AGC AGC CCT ACT TCTSEQ ID NO：68   5′-AAT CAC AGC AGC CCT ACT TCSEQ ID NO：69   5′-AAT CAC AGC AGC CCT ACT TSEQ ID NO：70   5′-AAT CAC AGC AGC CCT ACTSEC ID NO：71   5′-AAT CAC AGC AGC CCT ACSEQ ID NO：72   5′-AAT CAC AGC AGC CCT A

 5’截短SEQ ID NO：73   5   AT CAC AGC AGC CCT ACT TCT CCSEQ ID NO：74   5′-T CAC AGC AGC CCT ACT TCT CCSEQ ID NO：75   5′-CAC AGC AGC CCT ACT TCT CCSEQ ID NO：76   5′-AC AGC AGC CCT ACT TCT CCSEQ ID NO：77   5′-C AGC AGC CCT ACT TCT CCSEQ ID NO：78   5′-AGC AGC CCT ACT TCT CC

   3’和5’截短：SEQ ID NO： 79    5′-AT CAC AGC AGC CCT ACT TCT CSEQ ID NO： 80    5′-T CAC AGC AGC CCT ACT TCTSEQ ID NO： 81    5′-CAC AGC AGC CCT ACT TCSEQ ID NO： 82    5′-AC AGC AGC CCT ACT T

    5’和3’延伸SEQ ID NO： 83    5′-C CGT CCT ATC TCTSEQ ID NO： 84    5′-CGT CCT ATC TCTSEQ ID NO： 85    5′-GT CCT

ATC TCTSEQ ID NO： 86    5′-T CCT

ATC TCTSEQ ID NO： 87    5′-CCT

ATC TCTSEQ ID NO： 88    5′-CT ATC TCTSEQ ID NO： 89    5′-T

ATC TCT5’延伸，3’延伸，或二者同时进行，保持长度不变：SEQ ID NO： 90    5′-C CGT CCT

SEQ ID NO： 91    5′-CGT CCT

SEQ ID NO： 92    5′-GT CCT

ASEQ ID NO： 93    5′-T CCT

ATSEQ ID NO： 94    5′-CCT

ATCSEQ ID NO： 95    5′-CT ATC TSEQ ID NO： 96    5′-T ATC TCSEQ ID NO： 97    5′-

ATC TCT轻链mtDNA，野生型序列的反义基因：SEQ ID NO： 98    3′-TTA GTG TCG TCA GGA TGA AGA GG轻链mtDNA，突变体序列的反义基因：SEQ ID NO： 99    3′-TTA GTG TCG TCC GGA TGA AGA GG

   5’截短SEQ ID NO： 100   3′-TTA GTG TCG TCC GGA TGA AGA GSEQ ID NO： 101   3′-TTA GTG TCG TCC GGA TGA AGASEQ ID NO： 102   3′-TTA GTG TCG TCC GGA TGA AGSEQ ID NO： 103   3′-TTA GTG TCG TCC GGA TGA ASEQ ID NO： 104   3′-TTA GTG TCG TCC GGA TGASEQ ID NO： 1OS   3′-TTA GTG TCG TCC GGA TGSEQ ID NO： 106   3′-TTA GTG TCG TCC GGA T

3’截短SEQ ID NO： 107   3′-TA GTC TCG TCC GGA TGA AGA GGSEQ ID NO： 1D8   3′-A GTG TCG TCC GGA TGA AGA GGSEC ID NO： 109   3′-GTG TCG TCC GGA TGA AGA GGSEQ ID NO： 110   3′-TG TCG TCC GGA TGA AGA GGSEQ ID NO： 111   3′-G TCG TCC GGA TGA AGA GGSEQ ID NO： 112   3′-TCG TCC GGA TGA AGA GG

   3’和5’截短SEQ ID NO： 113   3′-TA GTG TCG TCC GGA TGA AGA GSEQ ID NO： 114    3′-A GTG TCG TCC GGA TGA AGASEQ ID NO： 115    3′-GTG TCG TCC GGA TGA AGSEQ ID NO： 116    3′-TG TCG TCC GGA TGA A

3’和5’延伸SEQ ID NO： 117    3′-G GCA GGA TAG AGASEQ ID NO： 118    3′-GCA GGA

TAG AGASEQ ID NO： 119    3′-CA GGA

TAG AGASEQ ID NO： 120    3′-A GGA TTA GTG TCG TCC GGA TGA AGA GGA TAG AGASEQ ID NO： 121    3′-GGA TTA GTG TCG TCC GGA TGA AGA GGA TAG AGASEQ ID NO： 122    3′-GA TTA GTG TCG TCC GGA TGA AGA GGA TAG AGASEQ ID NO： 123    3′-A TTA GTG TCG TCC GGA TGA AGA GGA TAG AGA5’延伸，3’延伸，或二者同时进行，保持长度不变：SEQ ID NO： 124    3′-G GCA GGA

SEQ ID NO： 125    3′-GCA GGA

SEQ ID NO： 126    3′-CA GGA TSEQ ID NO： 127    3′-A GGA TASEQ ID NO： 128    3′-GGA

TAGSEQ ID NO： 129    3′-GA

TAG ASEQ ID NO： 130    3′-A

TAG AGSEQ ID NO： 131    3′- TAG AGA

反义或三链体的寡核苷酸的组成也可影响抑制的效率。例如，优选使用对内源性核酸酶降解有抗性的寡核苷酸。对核酸酶的抗性赋与寡核苷酸在体内更长的半衰期而因此增加了效率并减少了所需要的剂量。还可通过修饰寡核苷酸并使其更易于穿过细胞膜以获得更高的效率。这类修饰是本领域已知的，它包括对带负电荷磷酸骨架碱基的改变，或用例如嵌合剂和交联分子和试剂在5′和3′末端修饰该序列。这类修饰的具体的例子包括含甲基磷酸酯(miller，P.S.，生物技术，2：358-362(1991))，硫代磷酸酯(Stein，科学，261：1004-1011(1993))和二硫代磷酸酯链(Brill，W.K-D.，J.Am.Chem，Soc.III：2322(1989))的寡核苷酸类似物，还存在其它类型的链修饰，例如肽核酸中的多聚酰胺骨架(Nielson等，Science.254：1497(1991))，甲醛缩醇，(formacetal)(Mattou cci，M.，Tetrahedron Lett.31：2385-2388(1990))氨基甲酸酯和吗啉键等这些本领域技术人员已知的修饰。在反义试剂所提供的特异性之外，靶RNA或DNA可被不可逆地修饰，其中修饰是通过诸如烷基化反应等将反义分子上的反应基团共价地同靶分子相连。

还可用本领域中已知的重组方法以达到对一种靶核酸的反义或三链体抑制。例如，含反义核酸的载体可被用于表达蛋白或反义信使以减少靶核酸的表达及其活性。这类载体是已知的或可由本领域技术人员构建并且应该含有所有为达到所期望的反义或三链体转录所必需的表达元件。在载体中也可含有其它有益的特性例如以不同的形式对核酸回收的机制。噬菌体质粒嵌合体是这类有用的载体的具体的例子，因为它们即可用做质粒也可用做噬菌体载体。其它载体的例子包含病毒，例如噬菌体，杆状病毒和反转录病毒，柯斯质粒，质粒，脂质体和其它的重组载体。载体还可含有或者用于真核或者用于原核系统的元件。一位本领域的普遍技术人员都将会知道哪个宿主系统是与特定的载体匹配的。

可用本领域中多种已知的方法中的任一种将载体导入细胞或组织中。这类方法以例子形式在下面有介绍：Sambrook等《分子克隆：实验操作指南》，冷泉港实验室，纽约(1992)，本文将其引入做为参考，以及参见Ausubel等《现代分子生物学原理》，John Wielg和Sons，Baltimore，MD(1989)，本文也将其引入做为参考。方法包括，例如，稳定或短暂的转染，脂转染(lipofection)，电穿孔以及使用重组病毒载体的转染。用转染导入核酸比其它所列的方法有几个优点，其中包括它在体外和体内都可使用。由于其感染的特性也可获得较高的效率。另外，病毒是特异性的，特别是感染特异以及在特定的细胞类型中繁殖。因此，它们本身的这种特性可用于在体内或组织内或混合的培养细胞内将反义载体靶向导入特异的细胞类型。通过对特定受体或烷基的修饰，可改变病毒载体的靶向特异性，这种改变是由受体介导的系列事件引起的。

一个具体的用于导入和表达反义核酸的病毒载体的例子是腺病毒来源的载体Adenop53TX。该载体表达一个或用于正选择或用于负选择的疱疹病毒胸苷激酶(TX)基因和所需的重组序列例如反义序列的表达盒。该载体可被用于感染包括大多数上皮来源的，胶质细胞以及其它细胞类型的癌细胞。该载体和其它表现相似的具所希望功能的其它载体一样可被用于处理混合类群的细胞以选择性地表达所感兴趣的反义序列。混合类群的细胞可以包括，例如，体外或体外培养的细胞，组织或人体的部分。

对载体可增加另外的特征以确保它的安全性和/或增强其治疗效率。这类特征包括，例如，能用于对重组病毒感染的细胞进行负性选择的标记。这类负选择标记的一个例子是上述的TK基因，它可赋于对抗生素甘环核式(ganciclovir)的敏感性。负选择因此是一种可控制感染的方式，因为它通过抗生素的加入而提供了一种可诱导的自杀。这样的保护确保，例如，如果突变型式的病毒载体产生了，则细胞转化就不再发生。而且还可包括限定在特定细胞类型中进行表达的特征。这些特征包括，例如，在特异细胞类型中才能表达的启动子表达元件。

本发明还提供了选择地破坏缺陷线粒体的方法。由于线粒体基因组成是杂合型的(即它含有突变的和正常的DNA)，这将产生带有正常或野生型DNA的完整的线粒体并且这些正常的线粒体将在靶组织中重新定居，使线粒体的功能正常化。这可由如下方式完成：鉴定带突变DNA的线粒体的特有特征，设计一种针对一种或多种特有特征的小分子，并给该小分子连接一个线粒体毒素。这样“靶向分子”是指任意选择性的在带有细胞色素C氧化酶活性缺陷的线粒体中积累的分子并且包含如下文介绍的吖啶橙衍生物和JC-1衍生物。“线粒体毒素”指破坏或使线粒体功能障碍的分子，包含磷酸酯，硫代磷酸酯，二硝基苯酚，马来酰亚胺，和那些上述的反义寡核苷酸。毒素将通过靶向分子在缺陷线粒体中富集并使缺陷线粒体选择性地失去功能或被破坏。该分子的结合形式可以是一种有活性的线粒体毒素。但更优选的是设计一种其联接形式为无活性的毒素靶分子和毒素之间的化学联接可以是一种线粒体特异酶的底物或者对氧化还原裂解敏感。联接的选择依赖于靶分子和毒素的化学本质以及对裂解方式的需要。一旦结合分子在缺陷线粒体中聚集，毒素便被从靶向分子上切断下来并被激活。

带有细胞色素C氧化酶活性缺陷的线粒体表现为受损害的电子传递，导致腺苷三磷酸合成减小及总的生物能障碍。结果是，带突变体DNA的线粒体将变大并且线粒体内的膜电势增加。

变大的线粒体的心磷酯和其它带负电荷的磷脂的水平增加。吖啶橙的衍生物10N-壬基吖啶橙(NAO)相对特异性地与心磷脂结合并在功能障碍的线粒体中积累。NAO和吖啶橙的其它化学衍生物的积累不依赖于线粒体的跨膜电势，衍生物中包括但不限于这些氮环上带有各种不同长度的脂肪链的吖啶橙(〔3，6-二(二甲基-氨基)吖啶橙〕)，例如10N-戊烷基吖啶橙，10N-辛烷基吖啶橙，以及十二烷基吖啶橙。Maftah等，生物化学和生物理研究通讯16411：185-190(1989)。在大到1μm的浓度，NAO和它的衍生物可被用于将其它分子定位于线粒体基质。如果NAO被一个线粒体毒素如磷酸酯，硫代磷酸酯，二硝基苯酚，马来酰胺以及反义寡核苷酸连接，那么线粒体中NAO-线粒体毒素结合物的积累就可选择性地质线粒体失去功能或使之被破坏。另外，高浓度时(3-10μM)的NAO及其衍生物抑制了电子传递，ATP水解和Pi转运并且破坏了呼吸作用。(Matth等，FEBS Letters的260(2)：236-240(1990))。在这些浓度下，NAO是线粒体毒素。

根据本发明的一个实施方案，任何脂肪族的或其它类型的(例如聚乙二醇)与吖啶橙氮环结合的链的末端，都化学衍生有羧酸，羟基，硫氢基，氨基或相似的基因以接受任意的线粒体毒素。在另外的实施方案中选用了其它的吖啶橙及吖啶橙衍生物的线粒体毒素结合位点。例如，10N-(10-羟基-1-癸基)-3，6-二(二甲基氨基)吖啶橙的溴盐并且进一步衍生为10-N-(10-磷酰基-1-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶橙氯酸盐或10-N-(10-硫代磷酰基-I-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶橙氯酸盐。另外，可制备10-N-(11-十一烷酸)-3，6-二(二甲基氨基)吖啶橙溴酸盐并可进一步衍生为10-N-(11-十一烷-1-油酸2，4-二硝基苯酯)-3，6-二(二甲氨基)吖啶橙溴盐。在切割后，缺陷线粒体内的磷酸酯，硫代磷酸酯或二硝基苯酚的水平选择性地升高并破坏线粒体。如果毒素上的结合位点对毒素在线粒体内的功能是非干扰性的话，毒素的功能及其共价结合不必依赖于将NAO从毒素上切割下来。

在图4中总结了几种吖啶橙衍生物制备的例子并且也在下文的实施例IX(q)-IX(f)中有介绍。如本领域的技术人员所已知的，还允许做其它的修饰。

本发明还有其它的实施方案用于研究由于细胞色素C氧化酶活性缺陷所引起的线粒体内的膜电势的改变。已用离域的亲脂性阳离子调节线粒体的膜电势。对这些阳离子的吸收涉及由质子聚产生的线粒体内部负性池(sink)的存在。随着细胞色素C氧化酶缺陷所引起的线粒体大小的增大，膜电势也将增加并且这些缺陷线粒体将积累亲脂性阳离子。根据本发明的一个实施方案，这些亲脂的阳离子。将被与线粒体毒素结合并被用于破坏含有增大的跨膜电势的缺陷或线粒体。罗丹明-123的水合形式如下所示：

它已被经常用于检测线粒体的膜电势并且能同线粒体毒素结合从而在线粒体内富集毒素。化合物5，5，6，6-四氯-1，1，3，3-四乙基苯并咪二唑-羰花青碘化物(JC-1)在线粒体内积聚也依赖于膜电势。当JC-1超过一个临界浓度时，在线粒体的基质中形成了J-聚合物，并且其大小使这些JC-1J-聚合物慢慢地扩散出线粒体(Reers等，生物化学，30(18)：4480-4486(1991))。JC-1可以与线粒体毒素进行化学结合，给相对于正常线拉表现出增大的跨膜电势的线粒体产生一个长寿命的毒性化合物。

如NAO一样，通过给JC-1结构增加官能性的基因，人们可以将另一个化学基因共价地结合到JC-1亚基上。将其运送到细胞中即可引起此二膜体试剂被优先转送到线粒体中，其中将双链体试剂在共价连接部位(断裂开以在线粒体内释放毒素并在其中表现出理想的效果。另外，如果活性类型上的结合位点不干扰毒素在线粒体内的功能，那么毒素的功能及其共价结合就不必依赖于将毒素从活性试剂上切割下来。

图5，6和7用几种不同方法描述了JC-1的官能作用。下述实施例IX(g)-IX(f)显示了一种氧原子的官能度，但对氮原子，硫原子或羧酸也可达到相同的官能度。

通过应用JC-1的准对称特性，一种新的化学本体可被合成，该本体是“半”JC-1并含有能作用将一个化学本体共价连接到JC-1亚基上的官能团。JC-1亚基的存在方便了整个分子的选择性转运至线粒体，在那儿如果需要，则可从毒素上酶切下JC-1亚基，允许它发挥所期望的作用。另外，如果毒素上的结合位点不干扰活性试剂在线粒体内的功能，那么毒素的官能作用共价结合就不必依赖于从毒素上断裂下JC-1亚基。

图8还用几种不同的方法合成一种官能作用的“半”JC-1亚基。活性化学基团结合是通过将杂原子JC-1或“半”JC-1结构中实现的。这种结合可用多种连接方法实现，例如利用活性分子的官能度(例如用羧酸与改变了的JC-1中的氧原子形成酯)或用连接物在JC-1和毒素之间进行连接。这些方法对于制备带有报告功能的诊断性或标记分子的化学领域的技术人员是已知的，它们是用于生物研究的并且包含酯，酰胺，氨基甲酸乙酯，尿素，氨磺酰，以及硫酸酯(S.T.Smiley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：3671-3675(1991))。

如上文所说，带有突变的细胞色素C氧化酶基因的线粒体其心磷脂和其它的带负电荷的磷脂以及线粒体的膜电势都增加。结果是，线粒体选择性地积累靶向分子，包括吖啶橙衍生物和亲脂性阳离子。例如罗丹明-123和JC-1的衍生物。除了可将毒素选择性地导入线粒体中之外，这类靶向分子还可选择性导入成象配基，这就形成了体内和体外诊断所策略有效性的基础。这类方法包括磁共振成像(MRI)，单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)，以及正电子发射体层摄影术(PET)。优选的用于本发明实践的成像配基包含放射性同位素(例如¹²³I，¹²⁵I，¹⁸F，¹³N，¹⁵O，¹¹C，^99mTc，⁶⁷Ga等)，半抗原(例如地高辛)，生物素，酶(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)，荧光基团(例如荧光素锏系螯合物，或Texas Red)以及MRI用的钆螯合物。Saka等，核医学讨论全，4：324-349(1994)。

作为一个体外诊断的例子，一种靶向分子，例如一种吖啶橙或JC-1的衍生物，被作为成像配基的荧光素标记。标记的靶向分子被导入人的组织细胞培养物例如原代的成纤维细胞培养物。在几个小时之后，带有细胞色素C氧化酶基因缺陷的线粒体的细胞比不含这类线粒体的细胞选择性吸收的标记的靶向分子的量要大。然后洗涤这些细胞并用如Becton-Dickison所卖的荧光激活的细胞分选仪(FACS)进行分选。用带野生型线粒体的细胞为FACS确定阈值限制。类似的，在体内诊断中，一种靶向分子如吖啶橙或JC-1的衍生物被作为成像配基的^qqmTc，¹⁸F或¹²³I标记。标记的靶向分子被导入患者血流中。在几个小时之后，标记的靶向分子在带有细胞色素C氧化酶缺陷基因的线粒体的组织中积累。这类组织可被正电子敏感的成像设备直接成像。

也可用核酶达到对缺陷线粒体的选择性破坏。核酶是一类不依赖于细胞蛋白的能催化RNA分子链剪切的RNA分子。具体地说，核酶可直接杂交并切割线粒体RNA靶分子。被剪切的靶RNA分子不能被翻译，因而阻断了对线粒体的功能必要的必需蛋白的合成。因此应用于治疗时包括设计一个核酶，该酶包含一个发挥切割功能必须的有催化活性的核苷酸，以及将核酶导向编码功能障碍的COX亚基的mRNA。该核酶可以化学合成并被导入细胞中或者它们由永久或暂时转染的表达载体表达。因此可通过在缺陷线粒体中选择性去除突变体RNA而提供活性治疗方法。

线粒体缺陷相关疾病的细胞和动物模型

从细胞中去除线粒体(“mtDNA”)并用来自其它细胞的线粒体转化这些细胞的方法在本领域中已有报道。King和Attardi，Science，246：500-503(1989)，创造缺少mtDNA的人的细胞(ρ°206-143B人骨肉瘤细胞)并且然后使来自其它细胞的线粒体重新在这些细胞中生长。各种线粒体供体转化的转化体表现出与宿主和食体细胞不同的呼吸作用表型，提示线粒体的基因型和核基因组，或它们之间的相互作用的基因型和核基因组，或它们之间的相互作用中起作用。Chomyn等。(Chomyn，A.，等，Mol.Ceu.Biol.，11：2236-2244(1991))用来自患者的成肌细胞的线粒体再生了ρ°206细胞，其中在该患者的线粒体tRNA^Leu基因中带有MELAS引起的突变。转化细胞蛋白合成和呼吸缺陷，类似于来自MELAS患者的肌肉活检细胞。最近，Chomgn等。(Chomgn，A.，等，.Am.J.Hum.Gent.，54：966-974(1994))报道了用血小板作为再生ρ°细胞的线粒体供体的来源。

但是，上述人的细胞的线粒体转化只允许做有限的短期研究。在转化后的生长培养中必须多加注意，未分化的含野生型mtDNA的细胞较这些含突变体mtDNA的健康，因此在培养中有繁殖优势。在几次传代的过程中，带野生型mtDNA的细胞将在细胞种群中占优势(即突变体mtDNA将被选择掉)并且含突变体mtDNA的细胞将会消失。

另外，上述细胞系的价值还受到进一步的限制，因为它们与那些能体现出疾病发病机会的细胞不同。例如，Chomyn(Chomyn，A.，等，.Am.J.Hum.Genet.，54：966-974(1994))用骨肉瘤细胞作为来自MERRT对患者的主要损害是影响脑和肌肉引起脑肌癌和肌癌。在骨细胞中并未发现致病机理。

本发明克服了这两个严重的限制。首先，通过将来自患病细胞的线粒体导入一个未分化的不死的细胞中，就有可能在培养中几乎无限制地维持该转化体。尽管也可以使用和研究未分化细胞自身，但优选是取这样细胞的样品，并且然后诱导它们分化成它们最终所要形成的细胞类型。例如，神经退变性疾病，培养原代神经元或成神经瘤细胞系是优选的，因为这些细胞在转移了mtDNA后可用佛波酯，生化因子以及维甲酸诱导终端分化。将mtDNA转入这些细胞即产生了带突变体mtDNA的细胞并且该等细胞分化成带有神经元的或神经元样表型的分裂后细胞。

带神经元表型的分裂后细胞与其它细胞比有几个优点。很明显，这些细胞与受神经退变性疾病影响的细胞的表型相近。由于这些细胞分裂不活跃，在测试期含野生型mtDNA细胞的繁殖有优势就不是一个严重的问题(即含突变体mtDNA的细胞在组织培养中不被选择掉)。而且，在终端分化后，这些细胞在培养中是稳定的。分裂后细胞在它们的培养生活阶段中积累突变体mtDNA，结果是随培养时间的增加，其生物能障碍增强。这就导致线粒体机能障碍的加重以及与生物能障碍相关的生化事件的变化。

因此，用来自原代神经元或成神经瘤细胞系的培养物的ρ°细胞即可对线粒体基因组的变化进行分析并且逼真地模拟线粒体机能障碍在神经元和细胞中的功能效果。

本发明中的被用来转移以构建模型系统的线粒体基本上可以从任何组织或细胞来源分离。如细胞可来自任意组织一样，各种类型的细胞培养物都是潜在的应用对象。但是，成纤维细胞，脑组织，肌细胞和血小板是优选的供体线粒体的来源。血小板是最优选的，部分是因为它们的量丰富，并且缺少核DNA。这种优选性并不意味着对可用做供体来源的细胞类型的范围构成限制。

本发明中可用来构建模型的受体细胞是任意类型的未分化细胞，但不死性的细胞，特别是癌变的细胞系，由于它们的生长特性是优选的。许多这样的细胞系是商业供应的，并且可用本领域已知的技术分离新的细胞类型并使其变为不死细胞。尽管培养的细胞系是优选的，也可以用来自另一个个体的细胞例如一个未患病的血缘相近的个体；这对排除非线粒体影响具有一定好处。在任何情况下，使用能被诱导分化的受体细胞都是最优选的；分化是通过加入特定的化学(例如激素，生长因子等)或物理的(例如温度，射线照射例如紫外光照射等)诱导信号的。

最优选的受体细胞是那些能成为(或能被诱导成为)患病个体中表型受影响最大的细胞类型的细胞。例如，为了构建线粒体缺陷相关的神经性疾病的模型，神经元或成神经瘤细胞系是优选的。

在下面的例子当中，线粒体是用改编后的由Chomyn(Chomyn，A，等，Am.J.Hum，Genet.，54：966-974(1994))发表的方法分离的。但不必非用这种方法，其它的方法，也很容易地用于替换上述。方法唯一的要求是来自原料细胞的线粒体是基本纯化的并且源细胞应被充分破坏以至源细胞几乎不可能在培养皿中生长物繁殖，该培养皿是用于加入线粒体的转化的。

在实施例中，通过溴化乙锭的处理来去除靶细胞的线粒体DNA(mtDNA)。这样的处理可能是通过干扰其mRNA的翻译起作用的。线粒体因此变得不能复制和/或产生电子传送所需的蛋白，以至线粒体明显是永久性地被破坏了，但是，必须指出用任何特殊的方法去除线粒体或线粒体DNA对于本发明的目的来说都不是必须的。

根据本发明建造和使用的模型系统不管所研究的疾病是否是由线粒体障碍引起的，在线粒体缺陷是疾病的症状时，在与疾病的易感倾向性相关，或者与疾病有一种未知的关系时该等模型系统都是同样有用的。另外，根据本发明使用模型系统确定一种疾病与线粒体缺陷是否相关也在本发明的范围之内。

另外，尽管本发明主要针对代谢缺陷疾病的模型系统，但并限于此。可以想象对于有结构或外形缺陷或畸形的疾病，本发明中的模型系统也是有用的，例如，寻找能确定这些疾病的特定方面的药物。此外，一些特定的个体含有或怀疑含有特别有效的或高效率的线粒体，因此本发明的模型系统可用于研究这类线粒体。另外，可以设想将已知为正常的线粒体放入具有疾病表型的细胞系中，以排除线粒体缺陷是发病原因的可能性。所有这些以及类似的应用都在本发明的范畴之内，并且本文所用的术语“线粒体缺陷”不应该被理解为不包括这类实施方案。

确定将患有由IGT转为NIDDM的分子开关将具有巨大的医疗价值。能够根据先期征兆鉴定出哪些患者将由IGT转为糖尿病患者将是迟发型糖尿病诊断上的一个进步。能够防止由IGT向迟发型糖尿病转换则将是治疗上的巨大进步。

编码电子传递链组份的线粒体基因的遗传缺陷可能参与了由IGT向NIDDM的转变。这些遗传缺陷可能导致该蛋白复合体的紊乱并最终导致，腺苷三磷酸(ATP)，细胞生物化学反应燃烧的主要来源的产生的减少。

当线粒体的细胞内ATP水平下降时，葡萄糖向细胞内的转运受到影响，葡萄糖的代谢减慢并且胰岛素的分泌下降，这些都是由IGT向NIDDM转换的关键事件。受影响的组织是横纹肌(主要的胰岛素敏感组织)和胰β细胞胰岛素分泌细胞)。这些靶组织含不分裂的终端分化细胞，这些细胞易于积累mtDNA突变。在胰腺β细胞中的mtDNA的突变达到一个临界水平可加速胰岛素分泌的下降，提供了疾病表型由IGT向糖尿病转换的分子机制。另外，类似的机制加速了肌内对胰岛素反应性的丧失。

几个在葡萄糖代谢中的关键酶(己糖激酶)和胰岛素的分泌需要ATP才能有正常的功能。己糖激酶更具体地说葡萄糖激酶结合于与物质透过小孔，该孔是一个电压依赖的阴离子通道，它位于线粒体的外膜内。接着，该小孔又是同位于线粒体内膜的腺苷转位因子相并列。这些蛋白复合体一起形成一个运输导管，该导管可将ATP从线粒体的内膜基质运到结合在线粒体外膜上的己糖激酶上并将由这些激酶催化反应产生的ADP返回。线粒体结合的己糖激酶所用的ADP来源于线粒体基质而不是细胞质。己糖激酶需要线粒体ATP激活。

上述的和下面的本发明的说明书以各种实施方案并不是在于限制本发明只是为了说明示意。分子遗传学领域的技术人员可在本发明的范围之内设计进一步的实施方案。

实施例

缩略语的定义：

1×SSC＝150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠，pH6.5-8

SDS＝十二烷基磺酸钠

探针＝一种标记的核酸，一般是一种单链寡核苷酸，该探针与固定在膜上的靶DNA互补。探针可用放射性同位素(如³²P)，半抗原(例如地高辛)，生物素，酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)，荧光基团(如荧光素或Texas Red)，或化学发光基团(如吖啶)标记。

PCR＝聚合酶链式反应，如Erlich，等，自然331：461-46＝(1988)所介绍，在此引入做为参考。

材料和方法

试剂    细胞培养液购自Gibco BRL(Gaitherberg，MD)。碘化5，5，6，6-四氯-1，1，3，3-四乙基苯并咪二唑-羰花青(JC-1)和壬基吖啶橙来自Molecular Bioprobes(Eugene，0R)。除非特别指出，所有其它试剂都来自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri)。细胞培养   SH-SY5Y成神经瘤细胞(Biedler，J.L等，癌症研究，38：3751-3757(1978))生长在Dulbecco’s改良Eagle’s培养液(DMEM)中在37℃5％CO₂中培养，培养液中补有10％的热灭活胎牛血清(FBS)，青霉素(100IU/ml)，链霉素(50μg/ml)，葡萄糖(4500mg/ml)。25mM HEPES，及谷氨酰胺(584mg/ml)。热灭活FBS，先在4℃融化过夜，温热至37℃，然后在56℃加热30分钟。选择DMEM培养液而不用RPMI 1640培养液是因为已知RPMI抑制在缺失细胞系(ρ°)中线粒体DNA(mtDNA)的产生(Van Oen Bogert，C.等，细胞生理学杂志，152：632-638(1992)。氧消耗测定    从一个75cm²的培养皿中将细胞胰酶消化下来，用HBSS(Hanks平衡盐溶液，Gibco BRL)洗一次，在HBSS中以2.0 X107细胞/ml重悬，并维持在37℃。将一个80μl的细胞悬液样品放入一个Haas旋转极谱微室中(Hass，R.H.等，Biochem.Med. 132：138-143(1984)，在HBSS中终体积为330μl。氧消耗的测定是用一个YelloWSprings Clark氧电极No.5531和一个监测器No.5300(YellowSprings，OH)在37℃测定。氧的利用程度如Estabrook(酶学方法，10：41-47(1967)所介绍的计算。酶活测定和蛋白定量柠檬酸合成酶活性的测定是在含2×10⁵细胞的样品中进行的，其中细胞在含有0.04％triton X-100，0.1mM 5，5’-二硫代-双(2-硝基苯甲基)酸，980μl 100mM的Tris pH8.0的比色杯中，在测定前于30℃温育3分钟。为了起始该反应，加入10μl乙酰CoA并分别加入终始度为50nM及500nM的草酰乙酸。用上下倒置来混合比色杯并测定记录2-3分钟在412nM的吸收的增加。反应在这个时间段上是线性的(Shepherod，D.，等，酶学方法、13：11-16(1969))。除了所测定的是细胞(COX活性用6×10⁵细胞并且琥珀酸脱氢酶用2×10⁵细胞)而不是分离的线粒体以及膜被裂解之外，复合物IV(细胞色素C氧化酶)和复合物II(琥珀酸脱氧酶)活性的测定基本上如(Park，w.D.，等，Neurology，40：1302-1303(1990))所介绍的，其中膜的裂解是在测定酶速率之前在30℃同正-十二烷基-β-D-麦芽糖(maltoside)(0.2mg/ml)温育3分钟。测定反应是由向比色杯中加入还原的细胞色素C启始的，其中比色杯上下颠倒2次。不停顿地测定在550nM的吸收变化90秒钟。完全氧化的吸收值得到的。获取不同细胞浓度下的速率以证实该测定是在确定速率常数之前用1mM氰化钾(KCN)预培养这些细胞。对氰化物敏感的复合物IV的活性在去除背景活性之后并计算成为一个一级速率常数。复合物II活性的测定是将细胞加入含测定缓冲的比色杯中，缓冲液含(10mM琥珀酸，35mM磷酸钾，pH7.2，200μg/ml正十二烷基-β-D-麦芽糖(maltoside)，1mM KCN，5mM MgCl₂，1μM鱼藤酮和1μM抗霉素A)。测定体积用测定缓冲液调整为887的体积。在30℃温育10分钟之后，加入100μl 0.16mM的做为最终电子受体的2，6-二氯酚靛酚，维持一分钟以做温度平衡。加入3μl 20mM的合成的辅Q酶的类似物，Q₁(中间电子受体)以启始DCIP的还原。在30℃测定在600nM的吸收的改变1-3分钟。获取不同细胞浓度下的速率以证实测定是在一个线性范围内。背景的测定是10mM丙二酸竞争性抑制剂存在下的重复反应中进行的。特异的复合物II的活性是通过减去丙二酸抑制的背景活性后计算得到的。正如用lowry的方法的测定的那样(J.Bisl.Chem.193：265-275(1951))，所有的酶活性都用总的细胞蛋白标准化。

复合物I(NADH：辅酶Q氧化还原酶)活性基本上如Parker，等，Am.J.Neurol，28：719-723(1989)，所介绍的那样测定，除了所测定的是细胞而不是分离的线粒体以外。2×10⁶细胞/ml用含0.005％洋地黄皂苷加上5mM EDTA的Hank’s平衡盐溶液(HBSS/EDTA)在23℃裂解20秒钟使膜裂解。加入50体积的冷HBSS/EDTA而终止溶解作用。裂解的细胞在4℃以140,000g离心10分钟。沉淀用1μM Leupeptin，1μM胃蛋白酶抑制剂和100μM PMSF在HBSS/EDTA中稀释到约1mg/ml。在复合物I测定之前，200μl的蛋白悬液于1.5ml eppendorf管中用一个冰浴的杯形角(Cuphorn)超声破碎仪(Heat System-Ultrasonics modelw225)超声6分钟，以脉冲保持时间与间隔时间比为50％周期。复合物I测试反应的起始是通过10μl 10mM NaOH(在测定缓冲液中)和在1ml比色杯中的总体积已在30℃预温3分钟的1ml测定缓冲液(25mM磷酸钾，pH8.0，0.25mM EDTA，以及1.5mM氰化钾)中的30-100μg蛋白中加入3μl乙醇中的20mM的辅酶Q-1而起始的。测定340nM的吸收变化120秒钟，之后加入5μl 500μM的溶于乙醇中的鱼藤酮再测定吸收变化120秒钟，以测定对鱼藤酮敏感的复合物I的活性。复合物I的活性定义是：总速率(无鱼藤酮)-总速率(有鱼藤酮)。速度是以6.81mM^-1作为结合的NAOH-Q，在340nm的消光系统数从曲线的最大线性部分计算而来。染料吸收    以4-50×10³细胞/孔将细胞种植在96孔微孔板中过夜。倒去培养液后将细胞用HBSS洗一次。细胞同碘化5，5，6，6-四氯-1，1，3，3-  四乙基苯并咪唑-羰花青(JC-1，16μM)或壬基吖啶橙(1μg/ml)在100纳升体积的HBSS中37℃，含CO₂下温育60分钟。倒去培养液，将细胞用200μl HBSS洗3次并留下100μl HBSS。用MillipsreCytotluor No.2350荧光测定系统(Bedford，MA)测定染料吸收。JC-1和壬基吖啶橙用的滤光系统是485nm(激发)和530nm(发射)。485nm和530nm的滤光镜的带宽分别是20nm和25nm。细胞的染料吸收对温育时间，浓度，及细胞个数进行优化选择，并且证明在选定的条件下(原稿在准备当中)与细胞个数呈线性关系。为了确定线粒体膜电势敏感的染料(JC-1)的非特异性吸收，与JC-1一起加入碳酰氰间氯苯腙以解除电子传递以及消除线粒体膜电势(Johnnson，L.V.等，J. of Cell.Biol.88：526-535(1981))。

在一些实验中，染料吸收也可在上述的染料浓度和温育时间下以荧光激活的细胞分选仪(FACS-Scan，Becton-Dickinson)来定量。将生长的细胞从75cm²的培养皿上刮下来，用PBS+1mg/ml葡萄糖洗一次，重悬在同样的缓冲液中，分成不同的管，用染料处理和温育。在温育之后将细胞在200×g离心10分钟，倒掉温育培养液，已被染过的细胞被重悬在2ml PBS+1mg/ml葡萄糖中并在FACS分析前将细胞放在冰上。对1×10⁴细胞，用激发滤片485nm以及发射滤片530nm，宽42nm来进行FACS分析。mtDNA的狭缝印迹分析    总DNA是用Qiagen试剂盒(Chatsuortn，CA)分离自10⁷SH-SCSY母本及ρ°细胞并用在260nm的吸收以及该脂糖凝胶电泳进行定量。各种量的总DNA用0.2N NaOH在100μl 2MNH₄OAC中和。DNA被真空印迹到Zeta探针膜上(Bio-Red，Pichmond，(A)，并用10×SSC(1.89M氯化钠，188mM柠檬酸钠，pH7.0)湿润。该膜然后用紫外线照射(254mM，125m Joule)并在室温下同封闭缓冲液(0.2％ I-Block，0.5×SSC，0.1％ Tween-20)室温温育30分钟。在一个敝口的小体积的塑料培养皿中用杂交缓冲液(5×SSC，1％SDS，0.5％ BSA)洗膜。

碱性磷酸酶寡聚物的制备如Ghosh(Bioconiuiute Chem.，1：71-76(1990))所述。将10ml含2 pmol/ml对应于COX I亚基，尤其是人mtDNA(CGTTGGTATTGGGTTATGGC)的AP寡聚物的杂交缓冲液铺在膜上并在42℃温育60分钟。将膜用缓冲液I(1×SSC，0.1％SDS，室温5分钟)洗3次，用缓冲液2(0.5×SSC，0.1％ SDS，1％Triton X-100，50℃)洗1次，用缓冲液3(1×SSC，1％ TritonX-100，室温下3分钟)洗1次并最后用显影缓冲液(50mM NaHCO₃，1m MgCl₂，pH9.5)简单洗1次。该膜用Lumi-phos(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)按各布骤显影。为了定量mtDNA，一个已知含COX量的I基因的质粒的标准曲线被同时印迹。

                      实施例I

            细胞色素C氧化酶基因的分离和克隆

从AD患者以及非早老性痴呆(正常)个体获取DNA。年龄相当的正常个体以及NINCDS标准划分可能患有AD的患者也被用来提取DNA(Mckann等，Neurology 34：939-944(1984))。

对血样来说，取6ml样品，加到18ml右旋糖溶液中(3％右旋糖，平均分子量＝250,000个顿尔顿(KDa)，0.9％氯化钠，1mM乙二胺四乙酸盐，在室温混合并保持40分钟，不要搅动以使红细胞沉淀。)

将血浆白细胞部分转移到离心管中并在14,000×g离心5分钟收集白细胞。在3.8ml水中重悬白细胞沉淀并旋转振荡10秒钟以裂解残余的红细胞。加入1.2ml 0.6M氯化钠并在14,000×g重新将样品离心5分钟以收集白细胞。将白细胞沉淀重悬在0.4ml含0.9％氯化钠/1mM乙二胺四乙酸盐的溶液中并保存在-80℃。

从0.2ml冻存的白细胞样品中分离总细胞DNA。将冻存的白细胞溶化，并在微型离心机14,000×g离心5分钟。细胞沉淀用0.8ml Dulbecco’s磷酸平衡盐溶液(PBS；Gibeo Laboraiories，Life technologies，Inc.，Grand Islaod，N.Y.；catalog#.310-4040AJ)洗3次并重悬在0.3ml水中。向细胞悬液中加入0.06ml 10％的十二烷基磺酸钠以裂解白细胞，然后将样品在沸水浴中保温10分钟。在样品达到室温之后，在14,000×g离心5分钟沉淀细胞碎片。将上清转移到一个干净的微型离小管中并用0.5ml酚∶氯仿(1∶1)抽提两次。向样品中加入0.03ml 5M的氯化钠及0.7ml 100％的乙醇以沉淀DNA。接着在-80℃保温，14,000×g离心15分钟收集的沉淀的DNA。DNA沉淀用0.8ml 80％乙醇洗涤，基本干燥后，重悬于0.2-0.4ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)中。DNA的浓度用260nm的紫外吸收确定。

做为从血液中分离DNA的另一种方法，取5ml血样并加到Accuspin^TM管中(12ml或50ml容积，Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)，根据制造商的说明书制备并含有Histopaque^TM分离培养液。将该管在1,000×g离心10分钟。将血浆和白细胞部分转移到一个含1ml TE缓冲液的离心管中，并在2,500rpm离心10分钟收集白细胞。将白细胞沉淀重悬于5ml TE缓冲液中并且加入0.2ml 20％SDS以及0.1ml20mg/ml的蛋白酶K。在37℃一边振荡一边温育4小时之后，裂解物用苯酚抽提两次并用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次。加入1/10体积3.0M乙酸钠(pH5.0)以及2体积乙醇沉淀DNA。接着在-20℃保温过夜，离心收集沉淀的DNA，用70％乙醇洗涤，基本干燥后，重悬于0.1-0.2ml TE缓冲液中。用260nm的紫外吸收测定DNA的浓度。

对脑样品来说，细胞总DNA是从0.1-0.2克冻存的脑组织中分离的。将冻存的脑组织存入含3ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7-9，100mM EDTA，0.1M NaCl，0.03M二硫苏糖醇，1％十二烷基磺酸钠，1mg/ml蛋白酶K)的玻璃dounce匀浆器中(Pyrex，VWR目录号7726-S)并用玻璃棒搅动几下匀浆。将脑匀浆液转移到一个温育管中并在40-45℃放置30-60℃分钟。加入5ml无菌水之后，用苯酚/氯仿抽提匀浆液2-3次，然后用氯仿抽提2次加1/20×体积5M NaCl和2.5×体积标准强度为200乙醇并置于-20℃以沉淀DNA。在6,000×g离心15分钟沉淀DNA。DNA沉淀用10ml 80％乙醇洗涤后，简单干燥，并重悬于200-400ml TE缓冲液。通过260nm的紫外吸收而确定DNA的浓度。

目的细胞色素C氧化酶基因序列用聚合酶链式反应(PCR)(Ertich等，Nature 331：461-462(1988))扩增。引物是用公开的Cambfidge序列中正常人COX基因的序列设计的。引物对位于线粒体COX基因编码亚基I，II，III的上游和下游大约100个核苷酸外的COX基因序列。引物含如下的序列：COX I-正向引物I-反向引物-(5′TTAGCCTATAATTTAACTTTGAC-3′)(SEQ.ID.NO.133)′COX II-正向引物(5′-CAAGCCAACCCCATGGCCTCC-3′)(SEQ.ID.NO.134)，COXII-   反向引物    (5′AGTATTTAGTTGGGGCATTTCAC-3′)(SEQ.ID.NO.135)，COX III-      正向引物(5′-ACAATTCTAATTCTACTGACTATCC-3′)(SEQ.ID.NO.136)，COX  III-   反向引物(5′-TTAGTAGTAAGGCTAGGAGGGTG-3′)(SEQ.ID.NO.137).

引物用Cyclone Plus DNA合成仪(Millipore Corporation，Marlbough，MA)或应用β-氰乙基磷酰亚胺化学的基因组装DNA合成仪(Pharmalia)进行化学合成。新合成的引物用羟铵脱保护，冷冻干燥并用NAP-10柱层析(Pharmacia.LKB Biotechnology Inc.，piscataway，NJ；目录号17-0854-01)纯化。DNA浓度用260nm的紫外吸收确定。

另外，引物也能以应用标准的β-氰乙基磷酰亚胺(β-cyanoethyphosphoramidite)化学的ANI 394 DNA/RNA合成仪(Appliod Biosystenm，Inc.，Foster City，CA)化学合成。在不切除三苯游甲基的情况下，引物用羟铵去保护并用寡核苷酸纯化柱(Applimd Biosystems.，Inc.，FosterCity，CA)纯化。DNA浓度用260nm的紫外吸收测定。

扩增反应实施如下：用0.5-1.0μg DNA，该DNA在50-100μl的反应体积中，其中含有10mM Tris-HCl。pH 8.3-9.5。50mM氯化钾，1-4mM氯化镁，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP各200μM(“扩增混合物”)合适的COX正向和反向引物各200ng，及5单位的Amplitaq聚合酶(Perkin-Elmer公司)；目录号N 801-0060)。

扩增反应应用Gene Amp PCR System 9600(Perkin Elmer公司)完成在95℃10秒钟进行一个循环；15℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟，进行26个循环；72℃4分钟进行一个循环；之后将样品冷却至4℃。对每个患者和每个细胞色素C氧化酶亚基进行5个独立的扩增反应。反应完成后，对每个患者和亚基的样品并合起来并且通过加入1/10体积5M氯化钠和2体积100％乙醇然后静止将扩增产物沉淀。

PCR扩增产物经离心沉淀，简单干燥后，重悬于40μl的TE缓冲液中并用该脂糖凝胶电泳进行纯化(Sambrook等，“分子克隆：实验操作指南”冷泉港实验室，1988)。DNA用溴化乙锭染色并在波紫外灯下观察。以凝胶切下期望长度的带(对COX I约1,700bp，对COX II约900bo以及对COX III约1,000op)。含DNA的凝胶被弄碎并放入微量离心管中。向凝胶片段中加入0.3ml 1M氯化钠并将样品在-80℃冷冻，然后接触并在50℃保温15-20分钟。在14,000×g离心5分钟沉淀凝胶，将含DNA的上清转移至新的小管中并用乙醇沉淀收集DNA片段。

将扩增的DNA片段用TA克隆试剂盒(Invitroqen公司，圣地亚哥，加州，目录号K20000-01)克隆进质粒pCRII中(Invitrogen公司，圣地亚哥，加州)。在含1-5μl PCR扩增产物，2μl质粒(50mg)1μl 10×连接缓冲液体及1μl T₄ DNA连接酶(4个单位)的11μl的反应体积中进行连接反应。连接反应在10-12℃保温15-16小时。

载体连接的PCR片段被转化进入感受态的大肠杆菌菌株XL1-BlueMRF，XL2-Blue MRF以及SURE菌株中(Stratagene，SanDiego，CA)。将转化的细胞涂布在含氨苄青霉素(50μg/ml)，卡那霉素(50μg/ml)，IPTG(异丙基-3-D-硫代半乳糖苷，20μg/ml)以为X-Gal(100μg/ml)的LB-琼脂平板上。克隆载体和大肠杆菌细胞结合在一起所提供的蓝/白色选择机制择可很容易的挑选重组克隆，因为它是白色的。

对每个患者和COX亚基都挑选多个白色菌落并引物序列取巢居(nested)引物的PCR筛选正确的插入自公开的Cambridge序列。引物对于编码亚基I，II，III的COX基因上游和下游的约40-60核苷酸特异。引物的序列如下：COXI-正向引物

(5′-AGGCCTAACCCCTGTC-3′)  (SEQ.ID.NO.138)，COX

I-  反向引物      (5′-GGCCATGGGGTTGGC-3′) (SEQ.ID.NO.

139)，COX II-    正向引物     (5′-AGGTATTAGAAAAACCA-3′)

(SEQ.ID.NO.140)，COX II-        反向引物

(5′ATCTTTAACTTAAAAGG)(SEQ.ID.NO.141)，     COX

III-   正向引物     (5′GCCTTAATCCAAGCC-3′) (SEQ.ID.NO.

142)，COX III    反向引物    (5′-GAATGTTGTCAAAACTAG-3′)

(SEQ. ID. NO.143).

来自裂解细胞上清的DNA样品被用做PCR扩增反应的DNA模板。挑选独立的菌落并用含氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养液在37℃下(225rpm)培养过夜。取每个培养物的100-200μl在14,000×g离心2分钟。细胞沉淀悬于5-10μl水中，并在沸水浴中保温5分钟裂解细胞。在14,000×g离心2分钟去除细胞碎片。

克隆的DNA样品在10μl的反应体积中进行扩增，其中含扩增混合物，合适的COX-S正向和反向引物每种各40mg以及0.25单位Ampsitale聚合酶。扩增反应在95℃ 10秒钟一个循环；95℃1分钟，44℃1分钟，72℃1分钟25个循环，并冷至4℃，使用的扩增仪是基因扩增PCR系统9600。用水平琼脂糖凝胶电泳分析PCR产品。

                     实施例II

           细胞色素C氧化酶(COX)基因的测序

含COX基因插入的质粒DNA的获取如实施例I所介绍的用质粒Quik^TM质粒纯化试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)或质粒试剂盒(Qiaqen，Chatsworth，CA，目录号12145，分离。从50ml细菌培养物中纯化质粒DNA。对于Stratagene方法中的“Midi柱方法”，试剂盒程序的10-12步骤用以下步骤代替，即用2倍体积的100％乙醇在-20℃沉淀，6,000×g离心15分钟，用80％乙醇洗涤并在100μl TE缓冲液中重悬DNA样品。用水平琼脂糖凝胶电泳或用260nm的紫外吸收确定DNA的浓度。

双链质粒DNA的测序反应如下试剂盒来进行：测定酶试剂盒(美国生化公司，Cleveland，OH；目录号70770)，Base Station T7试剂盒(Millipore，公司，目录号MBBLSEQ01)，Vent测序试盒(Millipore，公司；目录号MBBLVEN01)，AmpliTaq循环测序试剂盒(perrin Elmer公司)；目录号N808-0110)以及Taq DNA测序试剂盒(BoenrigerMannheim)。使用BaseStation自动DNA测序仪(Millipore公司)以荧光来测定DNA序列。对于基因步行实验，带荧光的寡核苷酸引物的合成是在Cyclone plus DNA合成仪上(Millipore公司)或在基因装配DNA合成仪(pharmacia LKB Biotechnology，Inc.)上通过利用β-氰乙基磷酰亚胺化学来合成的。下述的引物序列是按照公开的COX基因亚基I，II和III的Cambridge序列制备的，并在自动DNA合成的最后一步将荧光素导入(F；FluoreDite荧光素亚酰胺，Millipore公司；或Fluoreprime荧光素亚酰胺，Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.)。COX I  引物   (5′-FAGGCCTAACCCCTGTC-3′)  (SEQ.ID.NO.144)；COX I 引物   2 (5′-FGTCACAGCCCATG-3′) (SEQ.ID.NO.145)；COX I 引物   3 (5′-FCCTGGAGCCTCCGTAG-3′) (SEQ.ID.NO.146)；COX I  引物   4  (5′-CTTCTTCGACCCCG-3′)(SEQ.ID.NO.147)；COX I  引物   5  (5′-FCATATTTCACCTCCG-3′)(SEQ.ID.NO.148)；COX I   引物    6  (5′-FCCTATCAATAGGAGC-3)(SEQ.ID.NO.149)； COX  I     引物   7(5′-FCATCCTATCATCTGTAGG-3′)  (SEQ.  ID. NO. 150)；COX II引物   1 (5′-FAGGTATTAGAAAAACCA-3′)  (SEQ. ID. NO. 151)；COX II   引物  2 (5′-FTAACTAATACTAACATCT-3′) (SEQ. ID. NO.152)；COX II    引物  3 (5′-FTGCGACTCCTTGAC-3′)(SEQ. ID.NO. 153)；COX  III    引物  1 (5′-FGCCTTAATCCAAGCC-3′)(SEQ.ID. No. 154)； COX   III   引物 2 (5′-CAATGATGGCGCGATG-3′)(SEQ. ID. NO.  155)；  COX  III  引物  3 (5′-FCCGTATTACTCGCATCAGG-3′)    (SEQ. ID. NO. 156)； COX III引物  4  (5′-FCCGACGGCATCTACGGC-3′)  (SEQ. ID.  NO.  157).如上所述将引物膜保护并纯化。用260nm的紫外吸收来确定DNA浓度。

除了下面的修改之外，测序反应根据生产商的说明书进行：1)开盖下94℃加热样品5min以终止反应并减少体积，在其之后加入4μl终止染料(3mg/ml右旋糖苷蓝，95％-99％甲醛；如Nillipore公司配制；2)Ampli Taq循环测序试剂盒反应，Vent测序试剂盒反应，以及Taq测序试剂盒的温度循环组成是：95℃10秒钟1个循环；95℃20秒钟，44℃20秒钟以及72℃20秒钟30个循环，接着加入4μl终止染料前要在95℃开盖加热5min以减少体积。

用生产厂商提供的用于BaseStation自动DNA合成仪(Millipore公司)的BioImage和BaseStation软件来进行电泳和凝胶分析。根据生产商的说明书制备测序凝胶。对来自每个个体的平均10个不同的克隆进行了测序。将所得到的COX序列进行排序并与已公开的Cambridge序列进行比较。测得的序列中的突变被找出并通过对变异区进行再测序来确定。

做为COX基因序列测定的另一个方法，含COX基因插入的质粒DNA的获取是按如实施例1所说的用质粒Quik^TM质粒纯化试剂盒以Midi柱法(Qiagen，Chatasworth，(A)来分离的。质粒DNA是从35ml细菌培养物中纯化的。分离的DNA被重悬于100μl TE缓冲液中。用OD(260)的吸收来确定DNA的浓度。

另一种方法是，双链质粒DNA的测序反应是用Prism^TM Reaction DyeDeoxy^TM Terminator Cycle 测序试剂盒(Applied Biosystems，Inc.，FosterCity，CA)来进行的。DNA序列是用ABI 373A自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)通过对荧光的检测而获得的。对于基因步行实验来说，寡核苷醇引物是在ABI 394 DNA/RNA合成仪(Applied Biosystems，Inc，Foster City，CA)用标准的β-氰乙基磷酰亚胺化学合成的。下面的引物序列是根据公开的COX基因的亚基I，II，和III的Cambridge序列制备的。COX1  引物  11 (5′-TGCTTCACTCAGCC-3′) (SEQ.ID.NO.158)；COX1  引物  1SF (5′-AGGCCTAACCCCTGTA-3′) (SEQ.ID.NO.159)；COX1  引物  11X (5′-AGTCCAATGCTTCACTCA-3′)  (SEQ.ID.NO.160)；COX1  引物  12 (5′-GCTATAGTGGAGGC-3′) (SEQ.ID.NO.161)；COX1  引物  12A (5′-CTCCTACTCCTGCTCGCA-3′) (SEQ.ID.NO.162)；COX1  引物  12X (5′-TCCTGCTCGCATCTGCTA-3′) (SEQ.ID.NO.163)；COX1  引物  12XX  (5′-CTCCTACTCCCTGCTCGCA-3′)  (SEQ.ID.NO.164)；COX1  引物  13 (5′-CCTACCAGGATTCG-3′)  (SEQ.ID.NO.165)；COX1  引物  13A (5′-CCTACCAGGCTCTTCGGAA-3′)(SEQ.ID.NO.166)；COX1  引物  13X (5′-TCCTACCAGGCTCTTCGGAA-3′) (SEQ.ID.NO.167)；COX1  引物  14 (5′-CCTATCAATAGGAGC-3′)  (SEQ.ID.NO.168)；COX1  引物  14XX (5′-GTCCTATCAATAGGAGCTGTA-3′) (SEQ.ID.NO.169)；COX1  引物  11C (5′-GTAGAGTGTGCAACC-3′)(SEQ.ID.NO.170)；COX1  引物  11CN (5′-GTCTACGGAGGCTCC-3′)(SEQ.ID.NO.171)；COX1  引物  11CX (5′-AGGTCTACGGAGGCTCCA-3′)(SEQ.ID.NO.172)；COX1  引物  11CXX (5′-AGGAGACACCTGCTAGGTGTA-3′)(SEQ.ID.NO.173)；COX1  引物  12C (5′-CCATACCTATGTATCC-3′)(SEQ.ID.NO.174)；COX1  引物  12CA (5′-TCACACGATAAACCCTAGGAA-3′)(SEQ.ID.NO.175)；COX1  引物  12CX (5′-GACCATACCTATGTATCCAA-3′)(SEQ.ID.NO.176)；COX1  引物  13C (5′-CCTCCTATGATGGC-3′)(SEQ.ID.NO.177)；COX1  引物  13CN (5′-GTGTAGCCTGAGAATAGG-3′)(SEQ.ID.NO.178)；COX1  引物  13CXX (5′-GTCTAGGGTGTAGCCTGAGAA-3′)(SEQ.ID.NO.179)；COX1  引物  14C (5′-GGGTTCGATTCCCTTCC-3′)(SEQ.ID.NO.180)；COX1  引物  14CN (5′-TGGATTGAAACCAGC-3′) (SEQ.ID.NO.181)；COX1  引物  14CX (5′-GTTGGCTTGAAACCAGCTT-3′) (SEQ.ID.NO.182)；COX2  引物  21 (5′-TCATAACTTT-GTCGTC-3′)(SEQ.ID.NO.183)；COX2  引物  21N (5′-CATTTCATAACTTTGTCGTC-3′)  (SEQ.ID.NO.184)；CCX2  引物  21NA (5′-AGGTATTAGAAAAACCA-3′) (SEQ.ID.NO.185)；COX2  引物  21NB (5′-AAGGTATTAGAAAAACC-3″ (SEQ.ID.NO.186)；COX2  引物  21X (5′-TTCATAACTTTGTCGTCAA-3′) (SEQ.ID.NO.187)；COX2  引物  2FSF (5′-AAGGTATTAGAAAAACC-3′) (SEQ.ID.NO.188)；COX2  引物  2SFA (5′-CCATGGCCTCCATGACTT-3′) (SEQ.ID.NO.189)；COX2  引物  22  (5′-TGGTACTGAACCTACG-3′)(SEQ.ID.NO.190)；COX2  引物  22A  (5′-ACAGACGAGGTCAACGAT-3′) (SEQ.ID.NO.191)；COX2  引物  22X  (5′-CATAACAGACGAGGTCAA-3′) (SEQ.ID.NO.192)；COX2  引物  21C  (5′-AGTTGAAGATTAGTCC-3′) (SEQ.ID.NO.193)；COX2  引物  21CN (5′-TAGGAGTTGAAGATTAGTCC-3′) (SEQ.ID.NO.194)；COX2  引物  21CX (5′-TGAAGATAAGTCCGCCGTA-3′) (SEQ.ID.NO.195)；COX2  引物  22C  (5′-GTTAATGCTAAGTTAGC-3′) (SEQ.ID.NO.196)；COX2  引物  22CXX  (5′-AAGGTTAATGCTAAGTTAGCTT-3′)(SEQ.ID.NO.197)；COX3  引物  31  (5′-AAGCCTCTACCTGC-3′)(SEQ.ID.NO.198)；COX3  引物  31N  (5′-CTTAATCCAAGCCTACG-3′)(SEQ.ID.NO.199)；COX3  引物  32  (5′-AACAGGCATCACCC-3′)(SEQ.ID.NO.200)；COX3  引物  32A  (5′-CATCCGTATTACTCGCATCA-3′)(SEQ.ID.NO.201)；COX3  引物  31C  (5′-GATGCGAGTAATACG-3′)(SEQ.ID.NO.202)；COX3  引物  31CX  (5′-GATGCGAGTAATACGGAT-3′)(SEQ.ID.NO.203)；COX3  引物  32C  (5′-AATTGGAAGTTAACGG-3′)(SEQ.ID.NO.204)；COX3  引物  32CX  (5′-AATTGGAAGTTAACGGTA-3′)(SEQ.ID.NO.205)；COX3  引物  32CXX  (5′-GTCAAAACTAGTTAATTGGAA-3′)(SEQ.ID.NO.206)；

测序反应根据生产商的指导进行。用ABI 37A DataCollection和Analysys Software 以及Sequence Navigator Software(ABI，Foster City，(A)进行电泳和序列分析。根据生产商的说明书制备测序胶。对每个个体的平均10个克隆进行了测序。将得到的COX序列进行排序与公开的Cambridge序列比较。测得的序列中的突变被后出并通过互补DNA链的序列来进行确定。)

编辑每个个体每个COX基因的突变。对正常和AD患者的突变进行比较并总结于表1和2中

                   实施例III

         不经预先扩增用杂交来检测COX突变

本实施例示的测试血样，印迹DNA，并以点杂交形式通过寡核苷酸杂交来检测。本实施例用两个探针来确定在早老性痴呆患者的线粒体DNA中COXII基因密码子74上不正常突变的存在(参见表1)。本实施例用了点杂交方式但其它已知的杂交方式也可使用，如Southern印迹，狭逢印迹，“反向斑点”杂交，溶液杂交，固体支持物为基础的夹小杂交，珠粒为基础的，硅片为基础的以及以微量滴定板孔为基础的杂交方式。

样品制备提取和将DNA印迹到膜上

从患者中取全血。将血与等体积的0.5-1N NaOH混合，并在室温保温十到二十分钟以裂解细胞，降解蛋白并变性DNA。然后将混合物直接印迹到预先洗过的尼龙膜上，多次上样进行。然后用10×SSC(1.5MNaCl，0.15M柠檬酸钠，pH7.0)洗膜5分钟以中和膜，接着再用1×SSC洗一次。如需贮藏，将膜空气干燥，并封存。为了准备杂交，用1×SSC，1％SDS洗膜。

另外，将1-10ml全血用标准方法分级分离，并分离白细胞层(“血沉棕黄层”)。白细胞被裂解，消化，并用传统方法(有机提取的，非有机提取，或固相)提取DNA。用紫外吸收或荧光染料技术定量DNA。将标准量的DNA(0.1-5μg)在碱中变性，并印迹到膜上。然后洗膜。

也可用其它的制备细胞或线粒体DNA的方法，如通过温和的细胞裂解和离心来分离线粒体。

杂交和检测

对于寡核苷酸探针合成，标记，应用及检测的例子请参见“寡核苷酸及其类似物：操作指南”F.Eckstein，编，牛津大学出版社(1992)；和“寡核苷酸和其类似物合成的化学”S.Agrawal，编，Humana press(1993)，本文将其引入做为参考。

在本实例中，应用了两个具有下列序列的COX II密码子74探针：ATC ATC CTA GTC CTC ATC GCC(序列号14)(野生型)和ATC ATCCTA ATC CTC ATC GCC(序列号29)(突变体)。

为了检测和定量非正常的突变，含复制的DNA样品的膜进行平行杂交，一个膜与野生型探针杂交，另一个膜与AD探针杂交。另外，也可用同一个膜与两个探针顺序进行杂交并比较结果。

例如，将带有固定的DNA的膜在1×SSC，1％SDS中简单水化(10-60分钟)，然后在杂交温度下(35-60℃根据所用的探针变化)在5×SSC，1％ SDS，0.5％酪蛋白中预杂交并封闭30-60分钟。将含探针(0.1-10nM，理想地是2-3nM)的新鲜的杂交液加到膜上，接着在合适的温度下杂交15-60分钟。在1×SSC，1％SDS中在45-60℃每次5-10分钟洗膜1-3次(依赖于所用的探针)，接着在1×SSC中在室温下洗1-2次。然后用适当的方法检测已杂交的探针。

可根据在同一患者中AD探针对正常探针的信号的比率确定ADCOX基因对野生型基因的平均的比例。这是在AD患者中对异种百分率的一个半定量的测定并且与疾病的严重程度相关。

上述的和其它的用于野生型和突变性DNA样品的改变和定量的探针列于上文的表4和5中。

                     实施例IV

           用杂交(无需预先扩增)检测COX突变

A.用³²P探针狭缝印迹检测RNA/DNA

本实施例示用³²P探针通过狭缝印迹检测DNA来检测COX突变。试剂配制如下：4×BP：2％(W/V)牛血清白蛋白(BSA)，2％(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量：40,000)被溶解在无菌水中并通过0.22μ的蜡酸纤维素滤膜(corning)并于-20℃贮存于50ml的圆锥形管中。

通过向样品中加入TE至终体积为90μl将DNA变性。然后加入10μl2N的NaOH并旋涡振荡样品，在65℃保温30分钟，然后放在冰上。样品用100μl2M的乙酸铵中和。

根据生产商的指导将一片湿的硝酸纤维素膜或尼龙膜剪成与狭缝印变装置相匹配，并且加上变性的样品。通过在80℃真空烤1h或紫外线(254nm)照射将核酸固定的滤膜上。将膜在杂交温度下于-5ml1×BP，5×SSPE，1％SDS中预杂交10-30分钟。对15-30碱基较短的探针或G-C含量低的探针用较低的温度。每毫升杂交流中至少加入2×10⁶cpm检测寡核苷酸。将滤膜在Scotchpak^TM可热封口的袋子中两次封口并保温90分钟。滤膜在一个平台掘床上用20×SSPE：3m NaCl，0.02M.EDTA，0.2磷酸钠，pH7.4，1％SDS在室温洗3次每次洗5分钟，为了获得较高的严谨性，可将滤膜在杂交温度下于1×SSPE，1％SDS中1次洗。可在-70℃使用柯达XAR胶片加增感屏通过放射自显影显像。为了估计靶的量，而将所检测到的靶的量与已知浓度的杂交标准进行视觉比较。

B.用碱性磷酸酶寡核苷酸结合探针通过狭缝印迹分析检测RNA/DNA

本实施例示用碱性磷酸酶施寡核苷酸探针通过狭缝印迹检测DNA而检测COX突变，其中或者使用带颜色的试剂或者使用化学发光试剂。试剂配制如下：

彩色试剂：为了制备彩色试剂而将下述试剂混合在一起：新鲜的0.16mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)，100mM NaCl溶液中含0.17mg/ml四唑氮蓝(NBT)，100mM Tris-HCl，5mMMgCl₂和0.1mM ZnCl₂，pH9.5。

化学发光试剂：为了配制化学发光试剂而将下述试剂混合在一起：100mM二乙醇胺-盐酸溶液，其中含250μM 3-金刚烷基4-甲氧基4-(2-二氧磷基)苯基·dioxetane(AMPPD)，(Tropix Inc.，Bedford，MA)，1mM MgCl₂ pH9.5，或预先配制的dioxetane底物Lumiphos^TM 530(Lumigen，Inc.，Southfield，MI)。

如上所述将DNA靶物(0.01-50fmol)固定在尼龙膜上。将尼龙膜在封闭缓冲液(0.2％I-Block(Tropix，Inc.)，0.5×SSC，0.1％Tween 20)中温育30分钟，并在室温摇动。接着将滤膜在杂交液(5×SSC，0.5％BSA，1％SDS)预杂交30分钟，该过程是在杂交温度下(37-60℃)在一个可封口的袋子中每cm膜加50-100μl杂交液来完成的。去掉该溶液并用温的杂交缓冲液简单冲洗。然后加入终浓度为2-5nm的含结合探针的新鲜杂交液并且终体积是50-100μl/cm²膜。在杂交温度下振荡温育30分钟后，将膜转移至含预热的1.5ml冲洗-1溶液(1×SSC，0.1％SDS)/cm²膜的盘中，并在洗膜温度(通常是最佳的杂交温度减去10℃)下振荡10分钟。去掉冲洗-1溶液并将该步骤重复一次。然后加入冲洗-2溶液(1×SSC)并在洗膜温度下振荡10分钟。去掉冲洗-2溶液并立即通过颜色反应来检测。

通过颜色反应来做检测是将膜完全浸在颜色试剂中。并在20-37℃保温直到显色充分。当颜色显现充分时，通过在水中冲洗而中止显色。

对化学发光试剂来说，下面的冲洗步骤是在杂交步骤后进行的(见上)。因此，用冲洗-1溶液在室温洗膜10分钟，接着在50-60℃用冲洗-3溶液(0.5×SSC，0.1％SDS)洗膜3-5分钟洗三次，然后用冲洗-4溶液(1×SSC，1％Triton X-100)在室温下洗10分钟，一次，然后用冲洗-5溶液(50mM NaHCO₃/1mM mgCl₂ pH9.5)简单洗膜(～1分钟)。

用化学发光来做检测是通过将膜浸于发光试剂中，用量为25-50μl溶液/cm²膜。将柯达XAR-5胶片(或等效物；最大发射光477nm)在暗盒中曝光1-24小时，并且将胶片显影。

                    实施例V

            通过扩增和杂交来检测COX突变

本实施例出取测试血样，制备DNA，用聚合酶链式反应(PCR)扩增特异的COX基因的一部分，并用斑点印迹形式的寡核苷酸杂交来检测突变。

样品制备及DNA的制备

从患者中取全血。将之裂解，并用实施例I所述的方法制备PCR用的DNA。

用聚合酶链式反应扩增靶COX基因，并且印迹到膜上：

用实施例I所述的方法扩增来自测试样品的处理后的DNA。在扩增之后，将DNA变性并少量多次地直接印迹到预先润湿过的尼龙膜上。将膜在10×SSC中浸洗5分钟。若要贮存，将膜空气干燥并封存。在用于准备杂交时，将膜用1×SSC，1％SDS浸洗。

杂交和检测

扩增基因的杂交和检测按实施例III中所详述的进行。

尽管本发明是以公开的实施例方案作参考来介绍的，本领域的技术人员很容易明白本文所提供的具体的实施例对本发明仅仅是说明性的而不是限制性的。应该清楚在不背离本发明范畴的情况下可以做各种修改。

                  实施例VI

             反义寡核苷酸的合成

用ABIDNA合成仪，基于固相磷酰亚胺合成的DNA或RNA的标准的生产商的方法被用于制备反义寡聚物。使用的磷酰亚胺单聚物(T，C，A，G和U)来自供应商(应用生物系统部/Perkin Elmer，Foster City.CA.)。对于例行的寡聚物合成，1μmol规模的合成的反应是通过利用THF/I₂/二甲基吡啶来氧化磷酰亚胺(phosphoramidite)以及利用Beaucage试剂来制备硫代磷酸盐寡聚物而实现的。从固相支持物断裂和脱保护是通过羟铵在标准条件下实现的。以反相HPLC纯化并用200nm的紫外吸收及质谱进行定量和鉴定。

                     实施例VII

            细胞培养中对突变体线粒体的抑制

将与COX基因密码子193突变的突变体互补的并且因此与野生型COX基因突变体RNA非互补的反义硫代磷酸盐寡聚物以10μg/ml的浓度加入到新鲜的含Lipofectin^Gibco BRL(Gaithersberg，MD)的培养液中。使终浓度达到0.1，0.33，1，3.3和10μM。将这些温育15分钟然后用于细胞培养。如前述实施例将培养物温育24小时收集细胞并分离和测序DNA。定量分析结果证明突变体DNA减少到小于1％总COX的水平。

将与COX基因密码子193突变的突变体互补的和与野生型COX非互补的反义硫代磷酸盐寡聚物以10μg/ml的浓度加到含Lipofectin的新鲜培养液中使养终浓度为0.1，0.33，1，3.3，和10μM。将其温育15分钟然后用于细胞培养。如前述实施例将培养物温育24小时并收集细胞、分离DNA和测序。定量分析结果证明突变体COX DNA没有减少。

                  实施例VIII

             体内对突变体线粒体的抑制

将小鼠分成每组10头动物的6个组。将按标准方法笼养并饲喂。1-4组给药以IVC以实施例VI中所制备的，与突变体COX基因RNA互补的，浓度分别是每5μl 0.1，0.33，1.0和3.3nmol的反义硫代磷酸盐寡核苷酸。对第5组给药以5μl与突变体COX基因DNA及与野生型COX基因DNA非互补的硫代磷酸盐寡核苷酸其中含有1.0nmol的ICV。第6组只给ICV载体。每天给药一次，持续10天。杀死动物并收集脑组织。如上述处理该组织并如上述实施例分离和定量分析DNA。结果表明对于反义处理组突变体COX DNA减少到小于1％总COX的水平而对于对照组则无减小。

                  实施例IX

          检测和选择性破坏缺陷线粒体的试剂a. 10-N-(10-羟基-1-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶氢溴酸盐的制备

将3，6-二(二甲氨基)吖啶(1.0毫摩尔)溶解于含1.1当量的叔胺碱的DMF(100ml)中。向其中加入10-羟基-1-溴癸烷(1.1毫摩尔)，并将混合物加热回流。当用TLC检测没有残留的3，6-二(二甲氨基)吖啶时，将反应冷却并分离10-N-(10-羟基-1-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶(0.75毫摩尔)。b. 10-N-(10-羟基-I-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶盐酸盐的制备

将10-N(10-羟基-1-癸基)-3.6-二(二甲氨基)吖啶(1.0毫摩尔)溶解在吡啶(100ml)中。根据Taguchi(化学、药学、通报：23：1586(1975)的方法，向其中加入2-(N，N-二甲氨基)-4-硝基苯基磷酸酯(1.1毫摩尔)，并将混合物在氮气环境中搅拌。当用TLC检测没有剩余的10-N-(10-羟基-1-癸基)-3，6-二(甲氨基)吖啶时，按Taguchi所述处理该反应并分离10-N-(10-磷酰基-1-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶(0.75毫摩尔)。c. 10-N-(10-硫代磷酰基-1-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶盐酸盐的制备

将10-N-(10-羟基-1-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶(1.0毫摩尔)溶于DMF(100ml)中。根据Eckstein(美国化学联合会杂志，92：4718，(1970))的方法向其中加入三咪唑-1-硫膦(1.1毫摩尔)并将混合物在氮气中搅拌。当用TLC检测表明没有剩余的10-N-(10-羟基-1-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶时，按Eckstein所述处理该反应并分离10-N-(10-硫代磷酰基-1-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶(0.75毫摩尔)。d. 10-N-(11-烷酸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶溴酸盐的制备

将3，6-二(二甲氨基)吖啶(1.0毫摩尔)溶于DMF(100ml)中。向其中加入11-溴十一烷酸(1.1毫摩尔)，并将混合物加热回流。当用TLC检测没有剩余的3，6-二(二甲氨基)吖啶时，冷却反应并且分离10-N-(11-十一烷酸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶(0.75毫摩尔)。e. 10-N-(11-十一烷基-2，4-二硝基苯基氨基甲酸乙酯)-3，6-二(二甲氨基)吖啶氢溴酸盐的制备

将10-N-(11-十一烷酸)-3，6-二(二甲氨基)吖啶溶于THF(100ml)中。向其中加入2，4-二硝基苯酚(1.1毫摩尔)和二苯基磷酰叠氮化物(1.1毫摩尔)，并将混合物搅拌加热至70℃。当用TLC检测无剩余的10-N-(11-十一烷酸)-3，6-二(二甲氨基)-吖啶时，将反应冷却并分离10-N-(11-十一烷基-2，4-二硝基苯基氨基甲酸乙酯)-3，6-二(二甲氨基)吖啶(0.75毫摩尔)。f. 10-N-(11-十一碳-1-油酸2，4-二硝基苯酯)-3，6-二(二甲氨基)吖啶溴酸盐的合成

将10-N-(11-十一烷酸)-3，6-二(二甲氨基)吖啶(1.0毫摩尔)溶于DMF(100ml)中。向其中加入2，4-二硝基苯酚(1.1毫摩尔)，二环己基碳化二亚胺(1.1毫摩尔)以及羟基苯并三唑(1.1毫摩尔)，并搅拌混合物。当用TLC检测无残留的10-N-(11-十一烷酸)-3，6-二(二甲氨基)-吖啶时，将该反应冷却并分离10-N-(11-十一碳-1-油酸2，4-二硝基苯酯)-3，6-二(二甲氨基)吖啶(0.75毫摩尔)。g. N-(2-羟乙基)-JC-1的合成

根据Yamamoto等，日本化学联合会通报，46：1509-11(1973)的方法，将苯胺和正甲酸乙酯同2-甲基-5，6-二氯-N-乙基-N-(2-羟乙基)苯并咪唑在100℃加热。向其中加入酸酐和乙酸钾并在160℃持续加热。如Yamamoto所述处理该反应并分离产物。h.二N-(2-磷酰基-1-乙基)-JC-1的合成

将N-(2-羟乙基)-JC-1(1.0毫摩尔)溶于吡啶中(100ml)。根据Taguchi(化学药学通报，23，1586(1975))的方法，向其中加入2-(N，N-二甲氨基)-4-硝基苯基磷酸酯(1.1毫摩尔)，并在氮气气氛中搅拌该混合物。当用TLC检测无10-N-(10-羟基-癸基)-3，6-二(二甲氨基)吖啶时，如Taguchi所述处理该反应并分离二N-(2-磷酰基-1-乙基)-JC-1(0.75毫摩尔)。

                 实施例X

          不死的ρ°细胞系的制备

为了产生能够传代和能维持非分化状态以及能走向终端分化的表达线粒体DNA突变的细胞系，将成神经瘤细胞去掉线粒体DNA并用分离自AD患者血小板的线粒体导入这些细胞中。

为了将它们转变成ρ°细胞，而将SH-SY5Y神经每细胞瘤细胞(Biedler，J.L.等，癌症研究，38：3751-3757)(1978)培养在不同的浓度(0.01-5μg/ml)。细胞每星期传代一次，并每3天换一次培养液。比这高的溴化乙锭浓度导致细胞在2-3周后死亡。在大约33天，细胞生长率有明显的下降。挑选用做进一步研究的细胞系并用不同浓度的溴化乙锭处理33或64天。用5.0μg/ml溴化乙锭(EtBr)处理33天，45天，或64天的细胞系分别称为ρ°33.5，ρ°45/5和ρ°64/5。

用氰化物可抑制的O₂的利用来检测呼吸缺陷的突变体的产生。可观察到氧的利用度做为时间和溴化乙锭浓度的函数下降并且在用5.0μg/ml浓度的溴化乙锭处理64天后即不能再检测到如图9所示(也可参见表6)。通过对用各种浓度溴化乙锭处理33天(实心圆圈)或64天(空心圆圈)细胞的极谱分析来确定氧的利用度。在1mM KCN存在下确定非特异性的氧耗量并将其从总速率中减去。数据是以标准误方法(S.E.M)给出的，至少为2次独立实验的结果。

用各种浓度的EtBr处理细胞64天，然后在复合物I(鱼藤酮)，复合物III(抗霉素)，和复合物IV(氰化物)特异的抑制剂的存在下测定氧耗量以确证溴化乙锭对切断电子传递的有效性，如图10所示，5μg/ml溴化乙锭处理导致几乎全部氧利用度(Oxygen Utiliration)受到抑制，其中氧利用度对复合物I的抑制敏感或者对复合物III的抑制敏感(图10)。数据示至少2次独立实验的标准误方法的结果。复合物II的酶活性较少受到影响，因为它没有亚基是由线粒体DNA编码的，并且它的蛋白质的转运明显是正常的并以功能状态插入ρ°细胞增大的线粒体中。类似的，线粒体基质酶柠檬酸合成酶的活性在亲本和ρ°SH-SY5Y细胞中是相仿的，但在ρ°6415细胞中却减少约50％。该酶的不受影响不足为奇，因为它是由核基因编码的，并且它的表达不应该受到mtDNA缺失的影响。很明显，该酶也是正常地被转运并以功能状态插入到ρ°细胞增大的线粒体中。这些发现通过对复合物IV，复合物II，和柠檬酸合成酶(表6)活性的直接测定而得到确证；结果指出在ρ°64/5和ρ°33/5细胞中复合物IV的活性都基本检测不到。

将ρ°细胞培养在补加有尿核苷(50μg/ml)和丙酮酸(100μg/ml)支持生长的SH-SY5Y培养液中(King，M.P.等，科学，246：500-503(1989))。如图11所示，ρ°64天/5μg/ml溴化乙锭(“ρ°64/5”)在100μg/ml丙酮酸存在下(实心方块)或丙酮酸和尿核苷(空心圆圈)存在下传代旺盛，但种植在含50μg/ml尿核苷(空心方决)或无加入物(空心三角)的培养液中的ρ°细胞则不是如此。亲本SH-SY5Y细胞(实心圆圈)做为阳性对照可在无加入物的条件下生长(实心圆圈)，这不奇怪。每个点代表在24孔板中三个平行孔的每孔的平均细胞数。SH-SY5Y在正常培养中的世代时间是24小时，而ρ°64/5细胞在含丙酮酸的培养液中每代时间是48小时。ρ°64/5细胞如亲本一样达到相同的最终密度。单用尿核苷的细胞，跟无加入物的细胞一样不支持ρ°细胞的生长并且在接种3天后即可看到细胞死亡。

丙酮酸单用即可支持生长表明，对尿核苷从头合成必须的二氢乳清酸脱氢酶可能在本发明的ρ°细胞中仍有活性。已经证明在其它ρ°细胞分离物中mtDNA的缺失导致尿核苷营养缺陷型(King等，科学，246：500-503(1989))。

ρ°表型的回复突变率是通过在一个75cm²的培养皿中接种2×10⁶细胞并培养于尿核苷/丙酮酸缺陷选择培养液中而确定的。当在2-3周内大多的细胞死亡时对尿核苷和丙酮酸的存活依赖性即可表现出来。然后将很少的几个存活细胞亚培养并称为回复突变体。通过测定在这些条件下的存活而测定的回复突变频率在3周时对ρ°33/5克隆是1×10^-5，而对ρ°64/5是1×10^-6。将这几个极少的细胞亚培养在这些亚培养物中，复合物II，复合物IV，柠檬酸合成酶和O₂的利用度恢复到对照水平，表明用在选择培养中的存活来评估回复突变与ETC活性的恢复是一致的(表6)。表6亲本和ρ°细胞中的呼吸和生化活性细胞                 O₂         复合物  _IV   复合物_x   II  柠檬酸合成酶  回复突变率

                     消耗      min-mg^-1     min-mg^-1

                 nmol/min-mg   (S.D.)                        min-mg^-1

                 (S.D.)SH-SY5Y              3.25(0.57)   2.025(0.052)  28.49            174.4ρ°33/5             0.21(o.26)   0.008(0.003)  30.69            158.2         10^-5ρ°33/5回复突变体   3.72(0.77)   5.490(0.281)  29.58            167.4ρ°64/5             0.00(0.28)   0.048(0.038)  7.20             83.2          10^-6注意.所有的活性都按以mg计的总细胞蛋白标准化。

如图12所示，溴化乙锭处理64天结果导致在SH-SY5Y细胞中荧光染料壬基吖啶橙的结合显著增加。测定在96孔微孔板中进行，在加入1μg/ml壬基吖啶橙24小时之前每孔接2×10⁴细胞。如上文所述测定。数据示8次实验的平均值±标准误差。因为壬基吖啶橙选择性地与一种线粒体内膜脂，心磷脂结合，所以它的吸收与线粒体的数目和大小相关(Leprat；P.，等，实验细胞学研究，180：130-137(1990))。图12所示的数据提示线粒体内膜的量在用活化乙锭处理后增加，这一结果正是预期的，因为已观察到缺少线粒体DNA的细胞含大的，不规则的线粒体(Morais，P，等，体外细胞和发育生物学，21：649-658(1988))。

类似地，如图13所示，在溴化乙锭处理的细胞中阳离子染料JC-1的结合也增加。如前所述，用16μmJC-1在96孔微孔板中用荧光板仪进行测定，并且通过同时加入5μm CCCP测定非特异性的吸收。在加入染料前24小时，每孔接种2×10⁴细胞测定方法如前所述。数据示8次实验的平均值SD。因为已知JC-1由于跨膜电势而在线粒体膜上得到平衡(Ehrenberg，B.，等，生物物理杂志，53：785-794(1988))，图13的数据表明在那些缺失mtDNA的细胞中，预期会增大的线粒体可建立增大的跨膜质子梯度，而不管线粒体DNA缺失，也不管所导致的复合物的IV活性的缺失。这与所看到的壬基吖啶橙的吸收增加是一致的。

为了最后进一步确定ρ°细胞缺失mtDNA，而从用5μg/ml浓度溴化乙锭处理64天的SH-SY5Y细胞或未处理的细胞提取DNA，用Southern印迹分析mtDNA。在琼脂释凝胶上分离等量的DNA，将其转移到硝酸纤维素膜上，并用³²P标记的mtDNA特异的探针杂交。当与已知数量的COX I基因(数据未出示)为基础的标准曲线相比较时，SH-SY5Yρ°细胞每个细胞含少于1个的mtDNA。这基本上是检测不到有mtDNA，结论是这些细胞是ρ°状的。

上述的结果提示用于实现ρ°表型的EtBr的浓度看来是细胞类型特异的。亲本成神经病细胞系需要高剂量的EtBr(5μg/ml)长时间处理以诱导ρ°表型；所用剂量分别是用于诱导ρ°成纤维细胞和骨肉瘤细胞剂量的10倍和100倍(Leprat，P.等，Exp-Ceu，ROS，186：130-13)(1990)·(King等，Science，246：500-503(1989))。SH-SYSY细胞可能对EtBr诱导的毒性有效高的抗性。因此，对一个给定的新的类型的细胞来说确定所需的溴化乙锭的量和时间都在本领域的普通技术范围之内。

需要重点指出的是，在神经每细胞瘤细胞中，一旦出现ρ°表型，还需要继续处理以得到可接受的低的回复突变率，回复突变的定义是：当ρ°细胞生长在含添加的丙酮酸的培养液中时野生型表型的再出现。与供体血小板融合的ρ°细胞高的回复突变率将导致在胞质杂种克隆筛选中的假阳性。在用EtBr处理64天后即可达到一个可接受的低于每10⁶细胞1个回复突变的水平。而且，确定需要什么样的持续处理也在本领域的普通技术范围内。

                 实施例XI

         不死性ρ°细胞的分化

用佛波酯(12-O-四癸酰基佛波醇-13-乙酰酯，TPA)或生长用子诱导ρ°细胞分化。在用16μm TPA或1μm维甲酸处理2周之后，ρ°细胞出现分化中的神经每细胞瘤细胞所有的典型的带有分泌颗粒的长的轴突。因此，与来自成肌细胞的ρ°细胞情况相反，当用形态标准判断这些来自神经每细胞瘤细胞的ρ°细胞明显地仍保留着分化的能力(Heraberg，N.H.等，生物化学与生物物理杂志，1181：63-67(1993))。这就是提示同核基因编码的对信号转导和分化必需的蛋白仍是有功能的，没有受到EtBr处理的影响。

                 实施例XII

           AD和PD胞质杂种细胞的制备

ρ°64/5神经每细胞瘤细胞被来自12个早老性痴呆，3个帕金森氏病和两个年龄相当的对照患者的血小板转化以产生所谓的胞质杂种细胞()。

放在含抗凝剂(酸性柠檬酸右旋糖)的Becton-Dickinson(Rutherford，NJ)Vacutainer中，其中AD和PD患者的线粒体在其编码ETC亚基的mtDNA上带有一个或多个突变。将对照的SH-SYSY细胞样品做类似处理。将样品转移到Accuspin管(Sigma)的histopaque(Sigma)层上并在室温1,000×g离心10分钟。分离含血小板和单核淋巴细胞的血沉棕黄层，重悬于5倍体积的PBS中并在1700×g离心10分钟，倒掉上清并重悬沉淀于含5mM EDTA的DMEM中(融合培养液)。

根据改进的Chomyn等的方法完成转化(Chomyn，A，等，美国人类遗传学杂志54：966-974(1994))。用胰蛋白酶将ρ°细胞从培养板上消化下来，洗2次，并重终重悬于融合培养液中。将ρ°细胞(4×10⁵，ρ°64/5.0克隆)与血小板(1×10⁷血小板或1×10⁸血小板)混合并在37℃温育培养10分钟。阴性对照是不加血小板的ρ°细胞和不加ρ°细胞的血小板。将细胞混合物在300×g离心10分钟，重悬于57ml融合培养液中。将含聚乙二醇的融合培养液溶液(70％W/V PEG1000，J.T.Baker，Mc Graw Park，II)加入到细胞中使终体积为200ml(PEG终浓度，50％)。将细胞在室温下培养1.5分钟然后用温热的正常的ρ°细胞培养液稀释到终体积为10ml并在37℃下恢复10分钟。将融合细胞接种75cm²培养皿中。在第二天更换培养液。

细胞被允许在ρ°培养液中恢复一周。通过在缺乏丙酮酸和尿核苷的培养液中进行培养而筛选转化后的带有外源血小板线粒体的细胞(胞质杂种)，其中培养液中含有10％的透析过的经热灭活而去除了残留的尿核苷的FBS。这样的条件使得只有带有外源线粒体的细胞才能成活。当用存活细胞个数进行判断时，转化效率是1-2％。大约1×10³个融合细胞被稀疏地种植在一个15cm的组织培养皿中。

在最初的融合之后4-6周出现独立的克隆。以所观察的ρ°64/5.0克隆所计算的回复突变率为基础(10^-6)，在这些培养物中自发回复突变克隆的出现应该少于一个。通过用在其编码COX的基因上带有特异突变的mtDNA疾病表型或带有这样的mtDNA的线粒体转化可部分挽救需氧的表型。

杂种的存活细胞(大量期)及分离的同种克隆二者都被传代并测定其复合物I和复合物IV的活性并与来自亲本SH-SY5Y细胞的复合物I和复合物IV的活性进行比较(表7)。与早老性痴呆症的脑和血相关的复合物IV的缺陷(Parker.W.D.1等，神经学；40：1302-1303(1990))被成功地转移到了ρ°64/5成神经细胞细胞瘤细胞中。表7对照和早老性痴呆症胞质杂种细胞的复合物IV的活性

                                     复合物    IV

                                     min-mg^-1(S.D.)胞质杂种      患者年龄      Bulk Cells   ％还原            克隆SH-SY5Y                     2.025(0.052)           -ψcon#0064      74          1.963(0.010)           3.1     1.93(0.73)ψcon#0049      69          2.862(0.070)          -41.3    2.49(0.69)ψAD#2330       83   第1周  1.500(0.005)           25.9    1.72(0.99)″                 第2周  1.762(0.181)           25.8″                 第3周  1.432(0.078)           29.3ψAD#2418       66          1.520(0.053)           24.9    1.75(0.47)ψAD#2490       85          1.375(0.072)           32.1    1.28(0.24)

三个患者AD#2330，AD#2418和AD#2490的大量期具有较低的复合物IV特异活性。平均缺陷是27.8％。帕金森症的脑和血相关的复合物I缺陷也被成功地转移到了ρ°64/5成神经细胞细胞瘤细胞中。平均的缺陷是44.5％。年龄相当的对照胞质杂种，Con#0049和Con#0064，具有正常的复合物I和IV活性。分离自大离量期的克隆有类似的结果，但变化程度较大。这可能反映了克隆内不同程度的杂种性。AD#2418大量期的复合物IV活性被检测3周，其中包括进行三次细胞传代，复合物IV的活性很稳定。这样看来缺陷的转移可至少稳定地保持3次细胞传代，并且可能是永久保持的。

因为融合细胞表现出复合物I和IV酶促活性的特异减少而这正是AD和PD神经细胞的特征，故该方法提供了一种细胞模型(AD和PD胞质杂种细胞)以此可进一步研究在AD和PD患者的脑和血中发现的主要的生化和遗传缺陷。

                      实施例XIII

        用AD胞质杂种细胞筛选药物和治疗方案

AD胞质杂种细胞构成了一个新的独一无二的细胞模型系统。

当将该系统用于筛选可能对于治疗AD有用的药物时，AD胞质杂种细胞生长在药物存在的条件下，其中的药物是已知或被怀疑能改善AD患者中的电子传递缺陷或能改善者明显由该缺陷引起的细胞退变。另一种方法是，可完全以经检方式进行筛选，并且筛选用的化合物可随机选自世界上任何地方得到的化合物。另一选择是使胞质杂种在化合物的组合存在的条件下，或将它们用其它类型的营养物质，维生素或处理方式处理。

用给定的化合物处理一段时间之后，用上述所述的那些方法去测定处理过的胞质杂种培养物中的COX活性将之同未处理过的胞质杂种细胞对照样品中的和正常细胞中的COX的活性作对比。除了测定COX活性之外，还可通过显微观察处理过的和未处理的胞质杂种对照，以确定化学药剂的加入是否减少了AD或PD特有的形态变化。如果处理过的细胞相对于未处理过的胞质杂种表现出COX活性的增加和/或形态退变的减少的话，那么用作处理的该化合物或该等化合物就值得做进一步的研究以评价它们做为治疗AD药物的潜在的有效性。另外，这些阳性结果也提示其它类似的化学结构也可被筛选以寻找这种活性。

               实施例XIV

              PD胞质杂种

用所述的构建AD胞质杂种的方法，将来自帕金森氏症和年龄相当对照患者的血小板与上述的ρ°细胞融合，产生ρ°胞质杂种。如上所述接着分离单独的胞质杂种克隆，并用来申请前述的方法测定复合物I的活性。表8对照和帕金森氏症胞质杂种中复合物I和复合物IV活性的比较胞质杂种               复合物I          复合物IV

                 nmol/min/mg         sec/mgSH-SY5Y                 28.2             0.120对照1                   27.7             0.135对照2                   24.1             0.154平均                    26.7             0.136帕金森氏症1             18.3             0.110帕金森氏症2             10.2             0.103帕金森氏症3             15.9             0.188平均                    14.8             0.134

                 实施例XV

           AD胞质杂种动物的制备

在另一个实施方案中，来自AD患者的mtDNA线粒体被导入动物中以产生镶嵌型动物，其中mtDNA在其编码COX基因上带有多个或单个特异的突变。

一个新鲜无菌的小鼠胚胎，大约在3-10个，细胞阶段被从怀孕的小鼠的输卵管中用盐水灌洗洗脱下来。在解剖镜下将单细胞分离开，并用上述的方法用溴化乙锭处理以诱导一个ρ°状态。为了确定溴化乙锭处理的合适的时间和浓度，就需要牺牲几个胚胎做Sourther印迹以确证线粒体的功能已丧失了。

接着，这样处理过的细胞中导入来自AD患者的血小板中分离的外源线粒体其制备方法在上文实施例XII有介绍。然后通过显微注射将一个或多个胞质杂种细胞注射到假怀孕的雌体的输卵管中而将胞质杂种植入到子宫中。在怀孕的最后阶段，来自一个或多个后代的血细胞的COX活性被测定以确证线粒体是与AD患者的线粒体相类似的。也可通过DNA序列分析确定AD COX基因缺陷。

                    实施例XVI

         用AD胞质杂种动物筛选药物和治疗方案

给胞质杂种动物施以已知的和未知的药物，并选择能挽救疾病表型或能抵抗疾病表型相关的有害后果的药物做为可用于治疗早老性痴呆病的潜在药物而做进一步的研究。

另外，也可从这些动物中分离例如神经和成肌细胞并用于筛选可挽救疾病表型或可抵抗疾病表型相关的有害后果的药物。这些药物也可做为治疗早老性痴呆病的潜在药物做进一步的研究。

                      实施例XVII

                       糖尿病

从血样中提取DNA

将来自14个NIDDM患者的血样(7-8ml)收集在EDTAVacutainer集中(科学产品，Waukegan Park，IL)。将血样在4℃2500rpm离心10分钟。回收含白细胞和血小板的血沉棕黄层。向血沉棕黄层中加入5ml TE缓冲液(10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH7.5)。将该混合物在4℃2500rpm离心10分钟。去掉上清并向沉淀中加入5ml TE缓冲液，200μl 20％SDS和100μl蛋白酶K(终浓度400μg/ml)。不断地振动该混合物并在37℃保温4小时。用苯酚抽提2次接着用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次以提取DNA。在每次抽提，都将溶液混合，放置5分钟并在室温7000rpm离心7分钟。加入1/10体积的3M乙酸钠和2体积的100％乙醇沉淀基因组DNA。将DNA在4℃离心20分钟并去掉上清。然后加入乙醇(70％)，并将混合物简单离心并弃掉上清。将干燥沉淀重悬于TE缓冲液中并在4℃贮藏直到使用。用1∶50的稀释液在A260的吸收定量DNA。

DNA 测序

将靶细胞色素C氧化酶基因的序列如实施例I所述进行扩增和克隆。如实施例2所述的含COX基因插入的质粒DNA是通过带Midi柱的质粒Quik^TM质粒纯化试剂盒(Qiaqen，Charrs worth，CA)分离而得。从35ml细菌培养物中纯化质粒DNA。分离的DNA被重悬于TE缓冲液中。用1∶50的稀释液在A280的吸收定量DNA。

用Prism^TM. Ready Reaction DyeDeoxy^TM终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems Division，Perkin Elmer Corp.，Foster City，CA)来进行的链质粒DNA的测序反应。用ABI 373A自动DNA测序仪(AppliedBiosystems DiVision，Perkin Elmer Corp.，Foster City，CA)通过荧光来检测DNA序列。对于基因步行实验，通过ABI 394DNA/RNA合成仪使用标准的β-氰乙基磷酰亚胺(β-Cyanoethyl phosphoramidite)化学来合成寡核苷酸引物。

下面的引物序列是参考公开的COX基因亚基I，II和III的序列而制备的：COX1  引物  11  (5′-TGCTTCACTCAGCC-3′)；COX1  引物  1SF  (5′-AGGCCTAACCCCTGTA-3′)；COX1  引物  11X  (5′-AGTCCAATGCTTCACTCA-3′)；COX1  引物  12  (5′-GCTATAGTGGAGGC-3′)；COX1  引物  12A  (5′-CTCCTACTCCTGCTCGCA-3′)；COX1  引物  12X  (5′-TCCTGCTCGCATCTGCTA-3′)；COX1  引物  12XX  (5′-CTCCTACTCCTGCTCGCA-3′)；COX1  引物  13  (5′-CCTACCAGGATTCG-3′)；COX1  引物  13A  (5′-CCTACCAGGCTTCGGAA-3′)；COX1  引物  13X  (5′-TCCTACCAGGCTTCGGAA-3′)；COX1  引物  14  (5′-CCTATCAATAGGAGC-3′)；COX1  引物  14XX  (5′-GTCCTATCAATAGGAGCTGTA-3′)；COX1  引物  11C  (5′-GTAGAGTGTGCAACC-3′)；COX1  引物    11CN  (5′-GTCTACGGAGGCTCC-3′)；COX1  引物    11CX  (5′-AGGTCTACGGAGGCTCCA-3′)；COX1  引物    11CXX  (5′-AGGAGACACCTGCTAGGTGTA-3′)；COX1  引物    12C  (5′-CCATACCTATGTATC -3′)；COX1  引物    12CA  (5′-TCACACGATAAACCCTAGGAA-3′)；COX1  引物    12CX  (5′-GACCATACCTATGTATCCAA-3′)；COX1  引物    13C  (5′-CCTCCTATGATGGC-3′)；COX1  引物    13CN  (5′-GTGTAGCCTGAGGAATAGG-3′)；COX1  引物    13CXX  (5′-GTCTAGGGTGTAGCCTGAGAA-3′)；COX1  引物    14C  (5′-GGGTTCGATTCCTTCC-3′)；COX1  引物    14CN  (5′-TGGATTGAAACCAGC-3′)；COX1  引物    14CX  (5′-GTTGGCTTGAAACCAGCTT-3′)；COX2  引物    21 (5′-TCATAACTTTGTCGTC-3′)；COX2  引物    21N (5′-CATTTCATAACTTTGTCGTC-3′)；COX2  引物    21NA (5′-AGGTATTAGAAAAACCA-3′)；COX2  引物    21X (5′-TTCATAACrTTGTCGTCAA-3′)；COX2  引物    2FSF  (5′-AAGGTATTAGAAAAACC-3′)；COX2  引物    2SFA  (5′-CCATGGCCTCCATGACTT-3′)；COX2  引物    22  (5′-TGGTACTGAACCTACG-3′)；COX2  引物    22A  (5′-ACAGACGAGGTCAACGAT-3′)；COX2  引物    22X  (5′-CATAACAGACGAGGTCAA-3′)；COX2  引物    21C  (5′-AGTTGAAGATIAGTCC-3′)；COX2  引物    21CN  (5′-TAGGAGTTGAAGATTAGTC-3′)；COX2  引物    21CX  (5′-TGAAGATAAGTCCGCCGTA-3′)；COX2  引物    22C  (5′-GTTAATGCTAAGTIAGC-3′)；COX2  引物    22CXX  (5′-AAGGTTAATGCTAAGTAGCTT-3′)COX3  引物    31  (5′-AAGCCTCTACCTGC-3′)；COX3  引物    31N  (5′-CTTAATCCAAGCCTACG-3′)；COX3  引物    32  (5′-AACAGGCATCACCC-3′)；COX3  引物    32A  (5′-CATCCGTATTACTCGCATCA-3′)；COX3  引物    31C  (5′-GATGCGAGTAATACG-3′)；COC3  引物    31CX  (5′-GATGCGAGTAATACGGAT-3′)；COX3  引物    32C  (5′-AATTGGAAGTTAACGG-3′)；COX3  引物    32CX  (5′-AATTGGAAGTTAACGGTA-3′)；COX3  引物    32CXX  (5′-GTCAAAACTAGTTAATTGGAA-3′)；

测序反应是根据生产商的说明书进行的。用ABI 373A DataCollection和Analysis的软件以及Sequence Navigator软件(AppliedBiosystems DiVision；Perkin Elmer Corp，Foster City，CA)来进行电泳和序列分析。根据生产商的说明制备测序胶。对来自每个个体的平均10个不同的克隆进行了测序。将得到的COX序列进行排序并与已公开的序列进行比较。公开序列中的不同之处被指出并通过互补DNA链的序列得到确证。

5个迟发型糖尿病个体在其编码COX亚基I和的基因中有突变(表9)。这些突变在神经性疾病(早老性痴呆病，帕金森氏症，亨廷顿病，弥散性Lewy小体，Lewy小体型老年性痴呆(Senile Dementia ofthe Lewy Body Type)，Halvordan Spatr，伴核麻痹(para suparnuclear)，为其它的神经性疾病)或老年对照中未被发现。

                       表9

       同迟发型糖尿病相关的线粒体COX基因突变

                                 密码子号

                        COXI              COXII

                  155        194       22      146正常氨基酸            VAL        LEU       Thr     Ile正常DNA               GTC        CTA       ACC     ATT所观察到的氨基酸      ILE        Phe       Ile     Val突变体DNA             ATC        TTA       TCC     GTT患者KE                     2          1         2       2RT                     5          4         3       3DA                     -          -         1       -WO                     -          2         -       -PO                     -          -         1       1

上述的数字显示了观察到的，对每个糖尿病患者的10个克隆进行测序时给定碱基的变化次数。相对于公开的人线粒体COX亚基的序列，在所观察的序列中碱基的变化是不同的。密码子的序号是从该基因的5端的开放阅读框的开始的地方来确定的。

Claims (94)

1.一种用于检测受实验者中早老性痴呆病的存在的方法，其包括如下步骤：

a)获取来自所述受实验者的包含线粒体的生物样品；和

b)研究线粒体细胞色素C氧化酶基因序列中的与早老性痴呆病相关的至少一个突变。

2.权利要求1的方法，其中至少一个突变存在于细胞色素C氧化酶I基因的密码子155和密码子415之间。

3.权利要求2的方法，其中细胞色素C氧化酶I基因中的至少一个突变位于选自密码子155，密码子167，密码子178，密码子193，密码子194，和密码子415的密码子上。

4.权利要求1的方法，其中至少一个突变存在于细胞色素C氧化酶II基因的密码子20和密码子150之间。

5.权利要求4的方法，其中细胞色素C氧化酶II基因中的至少一个突变存在于选自密码子20，密码子22，密码子68，密码子71，密码子74，密码子90，密码子95，密码子110，和密码子146的密码子上。

6.权利要求1的方法，其中线粒体细胞色素C氧化酶基因序列中至少一个突变的存在是通过与寡核苷酸探针的杂交来确定的。

7.权利要求1的方法，其中在线粒体细胞色素C氧化酶基因序列中存在的至少一个突变是用选自如下的方法确定的：

(a)以退火结合于靶核酸之上的相邻的核苷酸序列间的连接为基础的方法；

(b)依赖于使用成套的引物的聚合酶链式反应或其变化；和

(c)单核苷酸引物导向的延伸测定法。

8.权利要求7的方法，其中的连接方法是连接酶链式反应。

9.权利要求7的方法，其中所用的成套的引物中，一个是完全互补的，而另一个是含有一个错配的。

10.权利要求9的方法，其中的错配或者位于中间或者位于所用成套引物的3’端。

11.权利要求1的方法，其中所说的线粒体细胞色素C氧化酶基因用选自PCR，RT-PCR和体外DNA复制的方法扩增。

12.权利要求1的方法，其中对所说的突变以探针为手段进行研究，该探针包含与线粒体细胞色素C氧化酶基因的正义或反义链之一互补的核苷酸序列。

13.权利要求12的方法，其中的探针包含一个与一个或多个选自下述密码子的正义和反义链互补的区域：

(a)细胞色素C氧化酶I基因的密码子155，密码子167，密码子178，密码子193，密码子194以及密码子415；和

(b)细胞色素C氧化酶II基因的密码子20，密码子22，密码子68，密码子71，密码子74，密码子90，密码子95，密码子110，和密码子146。

14.一种检测引起早老性痴呆病的遗传突变的方法，其包括如下步骤：

a)确定患早老性痴呆病的受实验者的线粒体细胞色素C氧化酶基因的序列：

b)将所说序列与已知的野生型线粒体细胞色素C氧化酶基因序列进行比较；和

c)鉴定的所说受实验者中的频发突变。

15.权利要求14的方法，其中所说的已知的野生型线粒体细胞色素C氧化酶基因选自〔序列号1〕〔序列号2〕，和〔序列号3〕

16.分离的与线粒体细胞色素C氧化酶基因的若干部分相对应或互补的核苷酸序列，其中所说的序列包含与早老性痴呆病相关的基因突变。

17.权利要求16中含基因突变的分离的核苷酸序列，它是COXI核苷酸5964-7505，COX II 7646-8329或COX III核苷酸9267-10052。

18.权利要求16的分离的核苷酸序列，其中所说的分离的序列被一种可检测的试剂标记。

19.权利要求16的分离的核苷酸序列，其中所说的可检测的试剂选自放射性同位素，半抗原，生物素，酶，荧光基团或化学发光基团。

20.权利要求16的分离的核苷酸序列，其中所说的可检测的试剂选自³²P，地高辛配体(digoxigenin)，罗丹明，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，荧光素和吖啶。

21.一种抑制突变的细胞色素C氧化酶编码基因的转录或翻译的方法，其包括如下步骤：

a)将所说基因与对所说突变序列特异的反义序列接触；和

b)将所说的靶突变细胞色素C氧化酶基因和所说的反义序列在一定的条件下进行杂交，该条件是所说的反义序列与所说的靶突变细胞色素C氧化酶基因结合并抑制其转录或翻译但不阻止野生型细胞色素C氧化酶基因的转录或翻译。

22.权利要求21的方法，其中早老性痴呆病或糖尿病受到治疗，并且其中所说的细胞色素C氧化酶基因在一个或多个密码子上有突变，其中的密码子选自：

(a)细胞色素C氧化酶I基因的密码子155，密码子167，密码子178，密码子193，密码子194，和密码子415；

(b)细胞色素C氧化酶II基因的密码子20，密码子22，密码子68，密码子71，密码子74，密码子90，密码子95，密码子110，和密码子146。

23.一种用于检测与线粒体细胞色素C氧化酶基因的一个或多个突变相关的疾病状态的探针，其包括一种与所说的线粒体细胞色素C氧化酶基因中的一个或多个突变的正义或者反义链互补的核苷酸序列。

24.权利要求23的探针，其中所说的探针包含一个与选自下列一个或多个密码子的正义和反义链互补的区域：

(a)细胞色素C氧化酶I基因的密码子155，密码子167，密码子178，密码子193，密码子194，和密码子415；以及

(b)细胞色素C氧化酶II基因的密码子20，密码子22，密码子68，密码子71，密码子74，密码子90，密码子95，密码子110，和密码子146。

25.一种包含一种用于检测早老性痴呆病或糖尿病基因型的探针的试剂盒，其中所说的探针包含一个与线粒体细胞色素C氧化酶基因的正义或反义链互补的核苷酸序列。

26.权利要求28的试剂盒，其中所说的探针包含一个与选自下列一个或多个密码子的正义和反义链互补的区域，：

(a)细胞色素C氧化酶I基因的密码子155，密码子167，密码子178，密码子193，密码子194，和密码子415；和

(b)细胞色素C氧化酶II基因的密码子20，密码子22，密码子68，密码子71，密码子74，密码子90，密码子95，密码子110和密码子146。

27.一种包含对突变的细胞色素C氧化酶基因或由其转录的突变信使RNA特异的反义序列的治疗用组合物，其中所说的反义序列适合于与所说的靶突变细胞色素C氧化酶基因结合并抑制其转录或翻译，但并不阻止野生型细胞色素C氧化酶基因的转录或翻译。

28.权利要求27的治疗用组合物，其中选自早老性痴呆和糖尿病的疾病被治疗并且其中所说的细胞色素C氧化酶基因在一个或多个密码子上有突变，这些密码子选自：

(a)细胞色素C氧化酶I基因的密码子155，密码子167，密码子178，密码子193，密码子194，和密码子415；和

(b)细胞色素C氧化酶II基因的密码子20，密码子22，密码子68，密码子71，密码子74，密码子90，密码子95，密码子110，和密码子146。

29.一种在受实验者中检测线粒体疾病的方法，其包括如下步骤：

a)获取来自所说受实验者的包含线粒体的生物样品；和

b)研究至少一个变异体多肽，它由线粒体细胞色素C氧化酶基因的一个或多个亚单位中的一个或多个突变产生，并且该突变与所说疾病的存在相关。

30.权利要求29的方法，其中所说的疾病选自早老性痴呆病和糖尿病并且所说的突变是用单克隆抗体或多克隆抗体研究的。

31.一种适于与编码突变的细胞色素C氧化酶亚基的线粒体mRNA分子杂交并剪切的核酶。

32.一种将一种结合分子选择性地导入带有缺陷的细胞色素C氧化酶基因的线粒体中的方法，其包括：

a)提供一种可被选择性地导入所说线粒体中的结合分子，其中所说的结合分子包含一个通过一种连接物而与一种毒素或一种成像配基(imaging ligand)结合的靶向分子；和

b)将所说的突变线粒体与所说的结合分子相接触。

33.权利要求32的方法，其中所说的靶向分子是一种选自吖啶橙衍生物和JC-1衍生物的亲脂性阳离子。

34.权利要求32的方法，其中所说的连接物包含一种选自酯，醚，硫醚，磷酸二酯，硫代磷酸二酯，碳酸酯，氨基甲酸酯，腙，肟，氨基和酰胺的官能团。

35.权利要求32的方法，其中所说的靶向分子和连接物包含一种10-N-(R₁-X)-3，6-双(二甲氨基)吖啶衍生物，其中R₁是一种含5-20个碳原子的脂族基，并且X被连到链烷烃基的末端碳上且X选自如下基团：酯，醚，硫醚，磷酸二酯，硫代磷酸二酯，碳酸酯，氨基甲酸酯，腙，肟，氨基和酰胺。

36.权利要求32的方法，其中所说的靶向分子选自罗丹明123和JC-1的衍生物。

37.权利要求32的方法，其中所说的靶向分子是一种JC-1衍生物，并且其中所说的连接物包含一种选自酯，醚，硫醚，磷酸二酯，硫代磷酸二酯，碳酸酯，氨基甲酸酯，腙，肟，氨基和酰胺的官能团。

38.权利要求37的方法，其中通过对JC-1衍生物5，5，6和6碳位置上的四个氯原子中的至少一个的取代而将连接物结合到JC-1衍生物上。

39.权利要求37的方法，其中通过对JC-1衍生物1，1，3和3位置上的四个乙基基团中的至少一个的末端碳氢原子的取代而将所说的连接物结合到JC-1衍生物上。

40.权利要求37的方法，其中所说的连接物是通过对JC-1衍生物的一个烯氢原子的取代而被结合到JC-1衍生物上的。

41.权利要求37的方法，其中所说的连接物进一步包含一个2-20个碳原子的烷基。

42.权利要求32的方法，其中所说的成像配基选自放射性同位素，半抗原，生物素，酶，荧光基团或化学发光基团。

43.权利要求40的方法，其中所说的毒素选自磷酸酯，硫代磷酸酯，二硝基苯酚和马未酰亚胺以及反义寡核苷酸。

44.一种不死的ρ°细胞系。

45.权利要求44的不死的ρ°细胞系，其中所说的细胞系是一种不死的神经细胞系的ρ°型。

46.权利要求44的不死的ρ°细胞系，其中所说的细胞系是未分化的。

47.权利要求46的未分化的不死的ρ°细胞系，其中所说的细胞系能被诱导分化。

48.权利要求47的不死的ρ°细胞系，其中所说的细胞系是一种神经每细胞瘤细胞系的ρ°型。

49.权利要求48的ρ°细胞系，其中所说的细胞系是一种神经每细胞瘤细胞细胞系SH-SY5Y的ρ°型。

50.一种胞质杂种细胞系，其包括：具有不同生物来源的基因组和线粒体DNA的培养的不死细胞。

51.权利要求50的胞质杂种细胞系，其中所说的基因组DNA来源于一种不死的ρ°细胞系，并且所说的线粒体DNA来源于一种人组织样品。

52.权利要求50的胞质杂种细胞系，其中所说的基因组DNA来源于一种未分化的但能够被诱导分化的不死的ρ°细胞系，而所说的线粒体DNA来源于一种人组织样品。

53.权利要求52的胞质杂种细胞系，其中所说的未分化的不死的ρ°细胞系是一种神经每细胞瘤细胞系的ρ°型。

54.权利要求53的胞质杂种细胞系，其中所说神经每细胞瘤细胞系来源于神经每细胞瘤细胞系SH-SY5Y。

55.权利要求51的胞质杂种细胞系，其中所说的人组织样品来源于患有线粒体缺陷相关疾病的患者。

56.权利要求52的胞质杂种细胞系，其中所说的人组织样品来源于具有线粒体缺陷相关疾病的患者。

57.权利要求52的胞质杂种细胞系，其中所说的未分化的不死的ρ°细胞系是一种神经每细胞瘤细胞系的ρ°型。并且所说的人组织样品来源于具有线粒体缺陷相关的神经性疾病的患者。

58.权利要求51的胞质杂种细胞系，其中所说的人组织样品来源于具有下列疾病的患者：早老性痴呆，帕金森氏症，亨廷顿病，肌张力障碍，利伯氏遗传性视神经病，精神分裂症，癫痫性肌阵挛乳酸中毒和梗塞(MELAS)，和癫痫性肌阵挛破碎的红纤维综合症(MERRF)。

59.权利要求52的胞质杂种细胞系，其中所说的未分化的不死的ρ°细胞系是一种神经每细胞瘤细胞系SH-SY5Y的ρ°型并且所说的人组织样品来自具有选自下列疾病的患者：早老性痴呆，帕金森氏症，亨廷顿病，肌张力障碍，利伯氏遗传性视神经病，精神分裂症，癫痫性肌阵挛乳酸中毒和梗塞(MELAS)，和癫痫性肌阵挛破碎的红纤维综合症(MERRF)。

60.权利要求52的胞质杂种细胞系，其中所说的未分化的不死的ρ°细胞系是一种神经每细胞瘤细胞系SH-SY5Y的ρ°型并且所说的人组织来自具有早老性痴呆症的患者。

61.一种分化的胞质杂种细胞系，它是由权利要求52的胞质杂种细胞系的细胞诱导分化成的。

62.一种构建胞质杂种细胞系的方法，其包括如下步骤：

a)用一种能不可逆地破坏线粒体电子传递并因此能将所述细胞系转变为不死的ρ°细胞系的化学药剂处理一种不死的细胞系；和

b)用分离的线粒体转染所说的不死的ρ°细胞系以形成所说的胞质杂种细胞系。

63.权利要求62的方法，其中所说的不死的细胞系是未分化的，但能被诱导分化。

64.权利要求62的方法，其中的分离的线粒体纯化来自患线粒体缺陷相关疾病的患者的分离的线粒体被纯化。

65.权利要求62的方法，其中所说的化学药剂是溴化乙锭。

66.一种构建胞质杂种细胞系的方法，其包括如下步骤：

a)用溴化乙锭处理一种不死的神经每细胞瘤细胞系以不可逆地破坏线粒体电子传递而因此将所说的细胞系转变成一种不死的ρ°神经每细胞瘤细胞系；以及

b)用分离自患者组织的线粒体转染所说的不死的ρ°神经每细胞瘤细胞以形成所说的胞质杂种细胞系，其中的患者患有如下的疾病：早老性痴呆，帕金森氏症，亨廷顿病，肌张力障碍，利伯氏遗传性视神经病，精神分裂症，癫痫性肌阵挛乳酸中毒和梗塞(MELAS)，和癫痫性肌阵挛破碎的红纤维综合症(MERRF)。

67.一种用于评价在线粒体缺陷相关疾病的治疗中有潜在应用性的化合物的方法，其包括如下步骤：

a)将预定量的待测化合物与培养的不死的胞质杂种细胞接触，其中胞质杂种细胞的基因组DNA来源于一种不死的ρ°细胞系而线粒体DNA来源于具有线粒体缺陷相关疾病的患者的组织；和

b)在所说的受线粒体缺陷影响的胞质杂种细胞中测定表型特征；和

c)确定所说的药剂是否能以及以何种程度引起所说的特征变得更接近于带有无缺陷线粒体的对照细胞，药剂具备上述能力则表明该化合物在治疗所说的疾病中有潜在的应用性。

68.一种根据权利要求67评价在疾病治疗中有潜在的应用性的化合物的方法，所述疾病与线粒体缺陷相关，该方法包括如下步骤：

a)诱导培养的未分化的不死的胞质杂种细胞分化，其中该细胞的基因组DNA来源于一种不死的ρ°细胞系而线粒体DNA来源于患有线粒体缺陷相关疾病的患者的组织；和

b)将预定量的待测化合物与所说的已分化的胞质杂种细胞接触；和

c)在所说的已分化的受线粒体缺陷影响的胞质杂种细胞中测定表型特征；和

d)确定所说的药剂是否能以及以何种程度引起所说的特征变得更接近于带有无缺陷线粒体的对照细胞，药剂具备上述能力则表明该化合物在治疗所说的疾病中有潜在的应用性。

69.一种线粒体缺陷相关疾病的诊断方法，其包括以下步骤：

a)从患者获取含线粒体的生物样品；和

b)将所说的线粒体转入不死的ρ°细胞中以形成胞质杂种细胞；以及

c)在所说的胞质杂种细胞中测定由所测试的一种或几种疾病相关的线粒体缺陷引起的表型特征；和

d)确定所说的胞质杂种细胞能否表现出该疾病的患者的细胞所表现出的特征，这即表明了在患者中是否存在该疾病。

70.根据权利要求69的用于诊断线粒体缺陷相关疾病的方法，其包括以下步骤：

a)从患者获取含线粒体的生物样品；和

b)将所说的线粒体转入未分化的不死的ρ°细胞以形成胞质杂种细胞；和

c)诱导所说的胞质杂种细胞分化；和

d)在所说的已分化的胞质杂种细胞中测定由所测试的一种或几种疾病相关的线粒体缺陷引起的一种或多种表型特征；和

e)确定所说的胞质杂种细胞是否与患所说疾病的患者细胞表现出一样的特征，而该特征表明在所说患者中该疾病的存在。

71.一种胞质杂种动物，其包括：一种多细胞的非人类的动物，其具有不同生物来源的基因组和线粒体DNA。

72.一种制备胞质杂种动物的方法，其包括以下步骤：

a)从多细胞的，非人类的动物分离胚胎细胞；和

b)用能不可逆地破坏线粒体电子传递并因此可将所述的细胞转变为ρ°状态的化学药剂处理所述胚胎细胞；和

c)用分离自另一细胞源的线粒体转染所说的不死的ρ°细胞系；以产生所说的胞质杂种动物。

73.一种用于评价化合物在治疗疾病中的潜在应用性的方法，其中该疾病是与线粒体缺陷相关的，其包括以下步骤：

a)将待测的预定量的化合物与权利要求71的胞质杂种动物接触；知

b)在所说的受线粒体缺陷影响的胞质杂种动物中测定或观察一种或多种表型特征；和

c)确定所说的药剂是否能以及以何种程度引起所说的一种或几种特征变得更类似于那些带有无缺陷的线粒体的动物，药剂具备上述能力则表明该化合物在所说疾病的治疗中有潜在应用性。

74.一个胞质杂种细胞系，其包括：培养的具有不同生物来源的基因组和线粒体核酸的细胞，其中或者线粒体或者基因组核酸来源于一个个体，该个体表现出迟发型糖尿病综合症或正处于将要发展为迟发型糖尿病综合症的危险期。

75.权利要求74的胞质杂种细胞系，其中所说的胞质杂种按如下方法制成：

a)用能将所说细胞或细胞系转变成ρ°细胞系的化学药剂处理亲本细胞或细胞系；和

b)用分离的线粒体转染所说的ρ°细胞系以形成所说的胞质杂种细胞系。

76.权利要求75的胞质杂种，其中所说的亲本细胞或细胞系是未分化的，但能被诱导分化。

77.权利要求75的胞质杂种，其中的胞质杂种细胞系是不死的。

78.权利要求77的胞质杂种，其中的胞质杂种细胞系是未分化的但能被诱导分化。

79.权利要求75的胞质杂种细胞系，其中的亲本细胞或细胞系选自：合子，能分化并形成组织或个体的胚胎细胞，胚细胞系，胰岛β细胞或细胞系，脂肪细胞或细胞系，肌细胞或细胞系，以及胰岛β细胞系，脂肪细胞或肌细胞之外的其它胰岛素应答细胞。

80.一种评价化合物在诊断和治疗糖尿病中的应用的方法，所说的方法包括：

a)将预定量的所说的化合物与培养的胞质杂种细胞接触，其中该细胞的基因组DNA来源于一种ρ°细胞系而线粒体DNA来源于患有迟发型糖尿病患者的组织；和

b)在受所说的线粒体缺陷影响的胞质杂种细胞中测定表型特征。

81.权利要求80的方法，其中的ρ°细胞系是不死的。

82.一种用于评价一种化合物在糖尿病的诊断和治疗中的应用性的方法，所说方法包括：

a)诱导培养的未分化的胞质杂种细胞分化，其中该细胞的基因组DNA来源于一种ρ°细胞系而线粒体DNA来源于一种带有迟发型糖尿病相关疾病的人的组织；和

b)将预定量的所说的化合物与所述的已分化的胞质杂种细胞接触；和

c)在所说的已分化的受线粒体缺陷影响的胞质杂种细胞中测定表型特征。

83.权利要求82的方法，其中所说的ρ°细胞系是不死的。

84.一种检测人的线粒体疾病的方法，其包括：

a)获取所说人的含线粒体的生物样品；和

b)确定与该疾病相关的至少一种线粒体突变或基因的存在。

85.权利要求84的方法，其中所述的至少一种线粒体突变或基因是指在细胞色素C氧化酶基因中的突变。

86.权利要求85的方法，其中的疾病选自早老性痴呆和糖尿病。

87.权利要求86的方法，其中所说的在细胞色素C氧化酶基因中的突变位于一个或多个密码子上，其中密码子选自：细胞色素C氧化酶I基因的密码子155，密码子167，密码子178，密码子193，密码子194，和密码子415以及细胞色素C氧化酶II基因的密码子20，密码子22，密码子68，密码子71，密码子74，密码子90，密码子95，密码子110，和密码子146。

88.一种分离的与线粒体DNA序列至少部分互补的核苷酸序列，所述线粒体DNA序列含有至少一个与人的线粒体疾病相关的突变。

89.权利要求88中的分离的核苷酸序列，其中所说的线粒体DNA序列含至少一个突变，该突变选自COXI核苷酸5964-7505，和COXII核苷酸7646-8329的突变。

90.权利要求88中的分离的核苷酸序列，其中所说的人的线粒体疾病选自糖尿病和早老性痴呆。

91.权利要求90的分离的核苷酸序列，其中所说的线粒体DNA序列含至少一种突变，该突变选自细胞色素C氧化酶I基因的密码子155和密码子415之间以及细胞色素C氧化酶II基因的密码子20和密码子146之间的突变。

92.权利要求91的分离的核苷酸序列，其中所说的线粒体DNA序列含至少一个突变，该突变位于选自如下的密码子上：细胞色素C氧化酶I基因的密码子155，密码子167，密码子178，密码子193，密码子194，和密码子415以及细胞色素C氧化酶II基因的密码子20，密码子22，密码子68，密码子71，密码子74，密码子90，密码子95，密码子110，和密码子146。

93.一种抑制编码一种或多种突变的细胞色素C氧化酶的核酸的转录或翻译的方法，其包括：

a)将所说的一个或多个基因同对一个或多个突变序列特异的反义序列接触；和

b)将所说的一个或多个靶突变细胞色素C氧化酶基因与所说的一个或多个反义序列进行杂交。

94.权利要求93的方法，其中的杂交是在这样的条件下进行的：其中的一个或多个反义序列与所说的一个或多个靶突变细胞色素C氧化酶基因结合并抑制其转录或翻译但并不抑制野生型细胞色素C氧化酶基因或其它线粒体基因的转录或翻译。

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