CN1244521C - 位点专一性同位素标记的蛋白质、氨基酸，及其生物化学前体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供位点专一性同位素标记的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，以及这些氨基酸的生物合成前体。用13C或14C在这些氨基酸中离羧基最远的甲基碳原子上进行标记。本发明还公开了这些标记的氨基酸的生物化学前体，2-酮-4-(nC)-丁酸和2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸，其中的n在各种情况下分别为13或14。还公开了含有这些位点专一性同位素标记的氨基酸的蛋白、蛋白片段和多肽，以及制备所述生物化学前体、氨基酸，以及蛋白、蛋白片段和多肽的方法。

Description

位点专一性同位素标记的蛋白质、氨基酸， 及其生物化学前体
                       发明领域
本发明介绍位点专一性同位素标记的有机化合物及其制备方法。更具体而言，本发明涉及位点专一性同位素标记的亮氨酸、异亮氨酸，和缬氨酸的生物化学前体、所述同位素标记的氨基酸本身，及由其制成的蛋白质、蛋白片段或多肽，以及有关的制备方法。
                       发明背景
近来发展起来的探索新药物的技术，将核磁共振(NMR)谱学用来发现与特别的靶分子结合的化合物，这种靶分子例如为蛋白质(参见例如Fesik等的美国专利No.5,698,401和5,804,390)。该技术包括测定蛋白的第一个二维15N/1H NMR相关光谱，该蛋白的氮原子位点富含同位素15N。此蛋白的第一相关光谱是在没有任何可能是配体化合物的情况下测得的。然后，将有可能是配体的化合物，或此类假定为配体化合物的混合物与富含同位素氮的蛋白混合，得到第二个NMR相关光谱。比较这两种光谱，由该两种光谱间的差别可得到以下有关资料：1)任何配体与主体蛋白间的结合是否存在，2)该结合的位点(一个或多个)，以及3)该结合的强度。
上述Fesik等描述的技术中，采用了靶分子，该靶分子富含NMR可检测的同位素15N自旋原子核。这种方法依赖于将适合的微生物进行遗传修饰，以表达所需要的蛋白质、蛋白片段，或多肽，然后将此修饰后的微生物在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基上培养，该氮源包括15N标记的营养物。较便宜的市售15N铵盐可提供此15N源。
但是，这种NMR药物探索技术，在用于富含同位素13C的靶分子时，却受到二个缺点的限制。第一，要生产出有效量的富含13C的靶分子是比较昂贵的。例如，用遗传修饰的微生物，在含有市售均匀标记的葡萄糖(葡萄糖-13C6)营养培养基上生长，来生产蛋白质成本很高。在递交本申请时，葡萄糖-13C6的价格大约为$480/g。另一种生产13C-标记的蛋白质的方法，是营养培养基中包含13C-均匀标记的氨基酸，同样也是昂贵的。第二，用葡萄糖-13C6或市售的均匀富含13C的氨基酸所生产的生物分子，用于NMR相关光谱技术并不理想。微生物在含有均匀富含13C原料的营养培养基上生长时，它所表达的生物分子含有与其邻近的13C-标记碳原子。因为NMR技术是建立在探测空间自旋偶合(亦即核极化效应)的基础上的，邻近的13C原子核的较强自旋-自旋偶合干扰了所要观察的结果。因此，需要开发位点专一性的富含13C的氨基酸、蛋白质和多肽。
                          发明概述
本发明提供位点专一性富含同位素的氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸的生物化学前体，以及位点专一性富合同位素的氨基酸本身。此外，还提供含有位点专一性富含同位素的氨酰基残基的蛋白质、蛋白片段和多肽，以及它们的生产方法，该氨酰基残基来源于上述位点专一富含同位素的氨基酸。该氨基酸及其生物合成前体中，在离其羧基最远的甲基碳原子上，富含同位素13C或14C。在本发明的标记氨基酸中，不存在相邻碳原子被标记的情况。在标记物为13C的情况下，本发明的氨基酸能理想地用于NMR药物探测技术，因为不出现相邻碳原子的13C-13C自旋-自旋相互作用而干扰所需要的信号。而且，因为仅在该氨基酸的甲基碳原子上标记，该甲基上，三个磁性相同的氢原子提供很强NMR信号，用以观察这些氧原子与其相连的13C原子间任何偶合效应。
具体而言，本发明提供分子式为I的化合物或其盐，
Figure C0080825100071
其中R1为氧或NH2，R2选自下列基团：
在以上所示的分子式中，R3为氢或nCH3，虚线键代表价键，m为0或1，而n在各种情况下分别为13或14，但要满足以下条件：a)R1为NH2时，连接R1的虚线所代表的第二价键不存在，而与虚线连接的氢存在；b)R1为氧时，与R1连接的虚线所代表的第二价键存在，而与虚线键连接的氢原子不存在；c)R1为氧时，R2为B式，m为0；以及d)R1为NH2时，R3为氢或nCH3。
本发明提供位点专一性富含13C和14C的氨基酸，异亮氨酸(上述的分子式I，其中R1为氨基，R2为A)；亮氨酸(上述的分子式I，其中R1为氨基，R2为B，R3为nCH3，以及m为1)，以及缬氨酸(上述的分子式I，其中R1为氨基，R2为B，R3为nCH3，以及m为0)，以及位点专一性富含13C和14C的这些氨基酸的生物化学前体，2-酮-4-(nC)-丁酸(上述的分子式I，其中R1为氧，R2为B，m为0，以及R3为氢)，和2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸(上述的分子式I，其中R1为氧，R2为B，m为0，以及R3为nCH3)。上述的n代表13(亦即富含13C的化合物)或14(亦即富含14C的化合物)。
本发明还提供含有氨酰基残基的蛋白质、蛋白片段，和多肽，该氨酰基残基来源于选自以下的一种或多种氨基酸：L-2-氨基-3-甲基-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-3-甲基-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-4-(13C-甲基)-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-4-(14C-甲基)-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-3-(13C-甲基)-4-(13C)-丁酸；以及L-2-氨基-3-(14C-甲基)-4-(14C)-丁酸。
本发明还提供位点专一性13C和14C标记的生物化学前体酸，即2-酮-4-(nC)-丁酸和3-(nC-甲基)-4-(nC)丁酸，或其盐类的化学制备方法，该方法包括将分子式为IV的化合物与同位素标记的碘代甲烷(H3 nCI)反应，
Figure C0080825100081
产生分子式为V的化合物
Figure C0080825100091
除去分子式V化合物中叔丁基酯保护基和二甲基肼基保护基，生成2-酮-4-(nC)-丁酸；或进一步将分子式为V的化合物与同位素标记的碘代甲烷(H3 nCI)反应，其中n为13或14，生成分子式为VI的化合物
除去叔丁基酯保护基二甲基肼基保护基，生成2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸；并视需要可将此产物成盐。
本发明另外还提供位点专一性13C和14C标记的氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的制备方法。该方法包括将微生物进行遗传修饰，使其能表达含某种氨基酸的多肽，该氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，以及它们的混合物；将修饰后的微生物在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基上培养，所述碳源和氮源包括2-酮-4(nC)-丁酸、2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸，以及它们的盐类和混合物；分离所产生的表达多肽；将此多肽裂解，并分离出个体氨基酸。可用本领域所知的常用方法裂解表达的多肽，这些方法包括水解或酶促裂解。
通过将宿主微生物修饰，使其表达氨基酸的均聚物，并在营养培养基中采用适合的富含同位素的生物合成前体，可将特定的氨基酸产量提高到最高，而使其成本降到最低。
本发明还进一步提供含氨酰基的蛋白质、蛋白片段，或多肽的制备方法，该氨酰基所来自的氨基酸选自：L-2-氨基-3-甲基-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-3-甲基-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-4-(13C-甲基)-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-4-(14C-甲基)-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-3-(13C-甲基)-5-(13C)-丁酸；以及L-2-氨基-3-(14C-甲基)-5-(14C)丁酸，该制备方法包括将微生物进行遗传修饰，使其表达预定的蛋白质、蛋白片段或多肽；在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基上培养该修饰后的微生物，所述碳源和氮源包括2-酮-4-(nC)-丁酸、2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸，以及它们的盐类和混合物；然后分离所产生的表达多肽。
                       发明详述
自然界中，同位素13C的丰度为1.11％，而14C的丰度低至可忽略的程度。因此，有机分子内，任何指定的碳原子为13C的概率通常约为0.011，而任何指定的碳原子为14C的概率非常低。如前面Fesik等所述，当制备的靶蛋白是为了适合NMR“筛选”用或药物探索过程中用时候，希望通过增加所研究的靶分子中天然13C含量，来增强13C NMR信号。通过均匀地或选择性地使靶分子富含13C，可以达到此要求。本说明书及附加的权利要求中自始至终所用的术语“均匀富含”、“均匀富含的”、“均匀富集的”、“均匀标记的”，以及“均匀标记过的”是指用合成方法，随机地从整个靶分子中选出某一碳原子，使该碳原子为13C的概率增加至大于0.0111的某一值。术语“专一性富含”、“位点专一性富含”、“专一性富含的”、“专一性富集的”、“专一性标记的”、“经专一性标记的”是指通过合成的方法，在靶分子内的一个或多个预选择的专一位点上，使其碳原子为13C的概率增加至大于0.0111的某一值。
例如，经遗传修饰的微生物，在含有均匀富含13C葡萄糖的营养培养基上生长后，其表达的生物分子也将是均匀富含13C的。经遗传修饰的微生物，在含有甲基侧链上富含13C的氨基酸的营养培养基上生长后，13C将会专一地富集在其表达的蛋白所含的丙氨酰残基上。同样，在用本发明的方法所表达的蛋白中，13C或14C将会专一地富集在亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸侧链末端的甲基上。
本发明的方法也可用来制备位点专一性标记的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、由这些标记的氨基酸，以及用14C和13C标记的该氨基酸生物合成前体所制成的蛋白、蛋白片段或多肽。这样的化合物，例如可用在蛋白代谢研究中，即希望用放射性测定法来追踪蛋白降解的历程和结果时，这些化合物甚为有用。
本说明书及附加的权利要求书中，自始至终所用的更多术语的含义与其一般公认的含义一致。以下特定的术语表示其代表的化合物：
“DTT”是指二硫苏糖醇。
“HEPES”表示N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸。
“IPTG”是指异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷。
“PMSF”指的是α-甲苯磺酰氟。
“SCD”指的是溶基质素的催化域(81-256残基)。
以下叙述的是代表性位点专一性富含nC的蛋白片段靶分子的制备。所示的具体例子对所谓人溶基质素“催化域”(“SCD”)的制备作了说明，该“催化域”是用位点专一性富含13C的亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸标记的。尽管是用13C-标记的氨基酸前体来说明，该方法同样可用于从14C-标记的氨基酸前体着手的情况。制备有足量含专一性富含nC多肽的靶分子的优选方法包括：用表达载体转化宿主细胞，该表达载体含有编码所需多肽的多核苷酸。将转化的细胞系在含有可同化的碳源和氮源培养基上培养，使其表达蛋白或多肽蛋白片段，所述碳源和氮源为本领域所熟知，并包括本发明的富含nC的生物化学物前体。按照本发明，为了对蛋白或蛋白片段进行位点专一性标记，用来对靶多肽进行nC标记的可同化来源物包括nC-标记的氨基酸生物合成前体。
例如，已知α-酮-丁酸是异亮氨酸的生物合成前体，α-酮异戊酸是缬氨酸和亮氨酸的生物合成前体。以下的图式1表示如何合成专一性富含nC的亮氨酸、异亮氨酸，和缬氨酸的生物合成前体。该方法中，采用比较便宜的富含nC的碘代甲烷，H3 nCI，作为同位素富含物的来源，来生产末端标记nC的α-酮-丁酸和α-酮-异戊酸。采用均匀富含13C的营养物，如葡萄糖-13C6，作为一种将13C富含物引入靶化合物中的适宜的典型方法，然而该方法成本很高。而且，在13C均匀标记的靶分子中，对大多数的该碳位点来说，与其共价连接的相邻碳原子也会被13C标记，引入的13C-13C偶合对靶生物分子中13C-标记位点的信号-噪声比，以及弛豫性能会有负面影响。另一种方法是，营养培养基中可包括市售的13C均匀标记的氨基酸。但是，这种技术降低了标记的“稀释作用”，此外在成本方面也成问题，而且也存在相邻碳原子13C-13C自旋-自旋相互作用的缺点。
但是，本发明nC标记多肽靶分子的方法包括将遗传修饰后的细胞系在营养培养基上生长，该培养基含有nC标记的特定氨基酸生物合成前体。在所产生的蛋白、蛋白片段或多肽中的某些氨基酸不仅富含同位素，而且是位点专一性标记的。
在本发明的一个实施方案的方法中，优选氨基酸前体为标记的α-酮-丁酸和α-酮-异戊酸。这些前体的生物合成产物是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，其中其特定的侧链甲基是富含nC的。由于每个这样的甲基有三个与nC标记的碳原子相连的氢原子，当n为13时，相应的NMR信号特别强，而且有可区别性。
标记的α-酮-丁酸和α-酮-异戊酸的合成，包括用富含nC的碘代甲烷使丙酮酸中的末端碳原子C-甲基化。通常，α-酮酸，例如丙酮酸的烷基化本来就困难，而且伴随着烯醇酯中间产物的分解，兼有大量副产物的生成。然而，Spencer等在《四面体通讯》1975，3889中，和William等在(同上，1990，5881)中表明，虽然用伯型亲电子试剂(例如，碘代甲烷)进行烷基化是成问题的，但相应的肟烯醇化物的烷基化却可以进行。D.Enders等在Angew，Chem.Int.Eng.Ed.，1992，618中，和D.Enders等在Synlett，1992，901中证明了丙酮酸的N，N-二甲基腙烷基化是可能的，但特别指出，为防止自身酰化作用，大体积的2，6-二烷基苯酯是必不可少的。本发明代表性的化合物包括：
2-酮-4-(13C)-丁酸或其盐；
2-酮-4-(14C)-丁酸或其盐；
2-酮-3-(13C-甲基)-4-(13C)-丁酸或其盐；
2-酮-3-(14C-甲基)-4-(14C)-丁酸或其盐；
L-2-氨基-3-甲基-5-(13C)-戊酸或其盐；
L-2-氨基-3-甲基-5-(14C)-戊酸或其盐；
L-2-氨基-4-(13C-甲基)-5-(13C)戊酸或其盐；
L-2-氨基-4-(14C-甲基)-5-(14C)戊酸或其盐；
L-2-氨基-3-(13C-甲基)-4-(13C)丁酸或其盐；
L-2-氨基-3-(14C-甲基)-4-(14C)-丁酸或其盐。
本发明另外还包括含有位点专一性富含同位素的氨基到的蛋白、蛋白片段和多肽，这些氨基酸是L-2-氨基-3-甲基-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-3-甲基-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-4-(13C-甲基)-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-4-(14C-甲基)-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-3-(13C-甲基)-4-(13C)-丁酸；以及L-2-氨基-3-(14C-甲基)-4-(14C)-丁酸。
虽然以上列举的特定化合物是设计成其特定位点上含有13C-或14C-同位素，但本领域的普通技术人员应该理解，该化合物的这些位点上的碳原子并不是完全13C或14C标记的。在每个分子位点上，同位素的取代程度或“富集”程度取决于合成中所用原料的相应富集程度。
                  图式I
             标记前体的化学合成
Figure C0080825100141
在图式I中，叔丁基丙酮酸1，与N，N-二甲基肼在二乙基醚中，室温下反应，转化为相应的N，N-二甲基腙2。所生成的腙2，在四氢呋喃溶液中冷却至-78℃，并用溴化锂处理，随后用二异丙酰胺锂处理，生成中间产物氮杂-烯丙基烯醇化物。用nC标记的碘代甲烷将此烯醇化物烷基化，生成腙3。腙3经过第二次烷基化过程产生标记的二甲基化腙4。首先用含水的1N HCl在四氢呋喃或乙醚中处理3和4(以除去腙)，随后用氯化氢气体在二氯甲烷中处理(除去叔丁基酯)，得到相应的nC-末端标记的α-酮酸5和6。图式II，III，和IV分别说明这些α-酮酸如何通过生物合成转变为nC-亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。在所用的这些图式中，富含同位素的位点都用星号表明。
                         图式II
             标记的异亮氨酸的生物化学合成：
Figure C0080825100151
              图式III
      标记的亮氨酸生物化学合成：
                 图式IV
           缬氨酸的生物化学合成：
Figure C0080825100171
制备含有编码特定多肽的多核苷酸序列的表达载体，以及用这些载体转化宿主细胞的方法，在本领域是众所周知的。(例如参阅R.W.Old，等，《基因操作技术》，Blackwell Science出版社，London，1994，以及本领域类似的论文。)同样，培养该转化的细胞，以表达其编码的多肽，以及分离、纯化和回折迭此多肽的方法，在本领域也是众所周知的。下面提出的实施例中，描述了用修饰后的E.Coli生产富13C的人溶基质素81-256氨基酸催化区(SCD)样品的过程。
                     实施例
                   实施例1
均匀富含13C的人溶基质素催化域(SCD)的制备
溶基质素的81-256片段(SCD)(SEQ ID NO：1)的制备方法如下：将质粒插入大肠杆菌菌株中，该质粒可编码上述的蛋白片段，并可用于生产该蛋白片段，然后将此遗传修饰后的细菌菌株在适合的培养基上生长。从培养基中分离出此蛋白片段，经纯化后，按照本发明的方法，用于测试其与被测化合物亲和性的二维NMR分析中。该制备方法的步骤如下所述。
人皮肤成纤维细胞按Clark等所述的步骤，Archiv，Biochem andBiophys.，241：36(1985)使其生长和诱导。用RNAgent总RNA分离系统试剂盒(Prmaga公司，2800Woods Hollow Road，Madison，WI 53711，美国)，按照生产商的说明，从1g细胞中分离出总RNA。一份1μg的RNA在80℃下加热5分钟，使其变性，然后用GenAmpRNA PCR试剂盒(Applied Biosystem/Perkin-Elmer)，按生产商的说明，进行反转录酶聚合酶链反应。
嵌套式聚合酶链反应进行的方法是：采用第一引物(a)GAAATGAAGAGTCTTCAA(SEQ ID NO：2)和(b)GCGTCCCAGGTTCTGGAG(SEQID No.3)进行35个循环的扩增，扩增条件为94℃，2分钟；45℃，2分钟；以及72℃，3分钟。随后用内部引物(c)TACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC(SEQ ID NO：4)和(d)ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG(SEQ ID NO：5)，在上述相同的条件下，进行30个循环的再扩增，产生编码人溶基质素1-256氨基酸残基的DNA序列。
然后按生产商的说明将该PCA扩增的片段克隆到克隆载体pT7BIue(Novagen公司)中。再按生产商的说明将所产生的质粒用NcoI和BamHI酶切，并将切出的溶基质素片段亚克隆至表达载体pET3d(Novagen公司)中。
1-256表达结构通过PCR扩增，产生编码氨基酸残基81-265，加上起始蛋氨酸氨酰基残基成熟的溶基质素表达结构。按生产商的说明，用上述方式将PCR扩增所得的片段先克隆到pT7IBue载体中(Novagen公司)，然后再亚克隆到pET3d载体中(Novagen公司)，产生质粒pETST-83-256。该最终所得的质粒与Qi-Zhuang等在《生物化学》，31：11231(1992)中所述的质粒相同，只是编码多肽序列的本发明质粒起始于更前面二个氨基酸，具体在人溶基质素序列的81位。按照生产商的说明，将质粒pETST-83-256转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pLysS(Novange公司)，产生表达菌株BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-1。
预培养基的制备方法是将1.698g NaH2PO4·7H2O、0.45g KH2PO4、0.075g NaCl、0.150g NH4Cl、0.3g U-13C-葡萄糖、300μl 1M的MgSO4水溶液，以及15ml CaCl2水溶液溶于150ml去离子水中。所得的预培养基溶液经灭菌后转移至无菌的500ml挡板摇瓶中。在预培养基接种细菌之前先将150ml含34mg/ml氯霉素溶于100％乙醇的溶液，以及1.5ml含20mg/ml青霉素的溶液加入该摇瓶的内含物中，然后接种1ml经遗传修饰的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-1的甘油贮存液。该摇瓶内含物然后在37℃下震摇(225rpm)至光密度为0.65。
发酵营养培养基的制备方法是将113.28g Na2HPO4·7H2O、30gKH2PO4、5g NaCl和10ml％的DF-60防沫剂溶于9604ml去离子水中。该溶液置于New Brunswick Scientific Micro发酵罐(Edison，NJ)中，并在121℃灭菌40分钟。在发酵培养基接种之前，将以下预灭菌的化合物加入发酵容器的内含物中：100ml 10％的NH4Cl水溶液、15g均匀富含13C的葡萄糖、20ml 1M的MgSO4水溶液、1ml 1M的CaCl2水溶液、5ml硫氨素盐酸水溶液(10mg/ml)、10ml含34mg/ml氯霉素溶于100％乙醇的溶液，以及1.9g溶于该氯霉素溶液的青霉素。加入4N的H2SO4水溶液将所得溶液的pH调至7.00。
将上述摇瓶中的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-1预培养物加入发酵罐的内含物中，使细胞生长至光密度达到0.48为止。在此过程中，需要时，加入4N H2SO4或4N KOH，使发酵罐内的内含物pH自动保持在7.0。借助阶式的环使发酵罐内含物的溶解氧含量保持在空气饱和度的55％以上，在溶解氧含量降至55％以下时，该阶式的环会增加其搅动速度。发酵罐内含物的空气供给量为每分种7标准升(SLPM)，全过程的培养温度维持在37℃。
在17,000×g，4℃下离心10分钟，收获细胞，收集所得的细胞沉淀粒，并在-85℃下贮存。湿细胞产量为3.5g/L。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析细胞裂解物的可溶和不溶部分，其结果表明，在可溶相中含有约50％的溶基质素。
采用经改进的Ye等在《生物化学》，31：11231(1992)中所描述的技术，纯化按上述方法制备的溶基质素片段。将收获的细胞悬浮于20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的叠氮钠溶液中，该溶液含有1mMMgCl2、0.5mM ZnCl2、25U/ml的Benzonase酶(Benzon Pharma A/SRoskilde公司，丹麦)，以及由4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(“AEBSF”)、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽和抑胃酶肽组成的抑制剂混合物(浓度均为1mg/ml，AEBSF、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽和抑胃酶肽均购自美国国际化学品公司)。将所得的混合物温和搅拌1小时，然后冷却至4℃。采用50％工作循环将细胞超声破碎。所得的裂解物在14,000rpm下离心30分钟，不溶部分的沉淀在-80℃下冷冻，用于下一步工序中。
上清液中加入固体硫酸铵至20％饱和度，所得的溶液加到700ml苯基琼脂糖凝胶快速流动(“Q-Sepharose FF)柱(PharmaciaBiotech)上。在加样前，琼脂糖凝胶柱用含5mM CaCl2，以及1M(NH4)2SO4的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6，4℃)平衡。加好样的柱用浓度渐减的线性梯度(NH4)2SO4水溶液(由1M降至0M)，和浓度渐增的，溶于pH7.6 Tris-HCl缓冲液中的CaCl2线性梯度水溶液(由5mM增至20mM)洗脱。收集洗脱液中有活性的馏分，并在Amicon搅拌室(Amicon公司产品)内浓缩。浓缩的样品在Q-琼脂糖凝胶FF柱所用的起始缓冲液中透析过夜，该起始缓冲液为含10mM CaCl2的50mMTris-HCl(pH8.2，4℃)缓冲液。
经透析后的样品加到Q-琼脂糖凝胶FF柱上，并用由起始缓冲液和200nM NaCl所组成的线性梯度液洗脱。将纯化的溶基质素片段的可溶馏分浓缩并在4℃下储存。上述的沉淀部分溶解在8M的盐酸胍中。该溶液在20,000rpm下离心20分钟，将上清液滴加入折迭缓冲液中，该缓冲液含有50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM CaCl2、0.5mMZnCl2以及AEBSF、亮抑蛋白酶肽(R)、抑蛋白酶肽(R)和抑胃酶肽(R)的抑制剂混合物(浓度均为1μg/ml)。折迭缓冲液的体积为该上清液的10倍。上清液和折迭缓冲液的混合物在20,000rpm下离心30分钟。将离心后得到的上清液在4℃下储存，而沉淀再经过二次上述的步骤，即溶于盐酸胍、在缓冲液中重折迭，以及离心处理。将三次离心每次最后所得的上清液合并，加入固体硫酸铵至20％饱和度。由此所得的不溶馏分的溶液，和以上所述的可溶部分一样，在苯基琼脂糖凝胶和Q-琼脂糖凝胶上进行纯化。合并纯化的可溶和不溶馏分，每克细胞浆状物原料得到约1.8mg均匀富含13C纯化溶基质素81-256片段(SCD)。
                     实施例2
专一性富含13C的人溶基质素催化域(SCD)的制备
在含有2-酮-4-(13C)-丁酸或其盐，以及2-酮-3-(13C-甲基)-4-(13C)-丁酸或其盐的培养基上，培养经修饰的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-1，使其表达SCD。除了采用U-12C-葡萄糖，而不是U-13C-葡萄糖以外，制备大肠杆菌的遗传工程菌株，以及表达、分离和纯化蛋白片段的方法如以上所描述。
对于本领域的普通技术人员来说，很显然，可以对阐述的实施方案作不同的改进而不会超出本发明的范围。
                        序列表
<110>Abbott实验室
     Augeri，David J.
     Fesik，Stephen F.
<120>位点专一性同位素标记的蛋白、氨基酸，及其生物化学前体
<130>6470.US.O1
<140>US 09/289,517
<141>1999-04-09
<160>5
<170>Windows 3.0版快速序列
<210>1
<211>174
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>人溶基质素81-256催化区
<400>1
Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu Thr
 1               5                  10                  15
Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp Ala Val Asp
            20                  25                  30
Ser Ala Val Glu Lys Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val Thr Pro Leu
        35                  40                  45
Thr Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe
    50                  55                  60
Ala Val Arg Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn
65                  70                  75                  80
Val Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly Ile Asn Gly Asp Ala
                85                  90                  95
His Phe Asp Asp Asp Glu Gln Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr Asn
            100                 105                 110
Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu Phe
        115                 120                 125
His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr Hls Ser Leu
    130                 135                 140
Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp Ile Asn Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr Pro
                165                 170
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>引物
<400>2
gaaatgaaga gtcttcaa                                        18
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>引物
<400>3
gcgtcccagg ttctggag                                        18
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>引物
<400>4
taccatggcc tatccattgg atggagc                              27
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>引物
<400>5
ataggatcct taggtctcag gggagtcagg                           30

Claims (10)

1.式Ia化合物或其盐，
Figure C008082510002C1
其中R3为氢或nCH3，而n在各种情况下分别为13或14。
2.权利要求1所述的化合物，选自：
2-酮-4-(13C)-丁酸；
2-酮-3-(13C-甲基)-4-(13C)-丁酸；
2-酮-4-(14C)-丁酸；以及
2-酮-3-(14C-甲基)-4-(14C)-丁酸；或它们的盐。
3.制备式Ia化合物或其盐的方法，
其中R3选自氢和nCH3，而n在各种情况下分别为13或14，该方法包括：
a)将式IV化合物，
Figure C008082510003C1
与同位素标记的碘代甲烷反应，产生式V化合物
以及当R是氢时，
b)除去叔丁基酯和二甲基肼基基团，生成2-酮-4-(nC)-丁酸，
或当R是nCH3时，
c)将a)步的反应产物与同位素标记的碘代甲烷反应，其中n为13或14，生成式VI的化合物，
d)除去叔丁基酯和二甲基肼基基团，生成2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸，以及
e)任选形成其盐。
4.权利要求3所述的方法，该方法进一步包括将b)步或d)步的反应产物成盐。
5.制备含有至少一种氨酰基残基的蛋白、蛋白片段或多肽的方法，该氨酰基残基选自4-(nC-甲基)-5-(nC)-亮氨酰基，5-(nC)-异亮氨酰基，以及3-(nC-甲基)-4-(nC)-缬氨酰基，该方法包括
a)将适合的微生物经遗传修饰，使其表达所说的蛋白、蛋白片段，或多肽；
b)在含有式Ia化合物或其盐的营养培养基中，培养该遗传修饰后的微生物，
Figure C008082510004C1
其中n在各种情况下分别为13或14，R3为氢或nCH3；以及
c)分离该蛋白、蛋白片段，或多肽。
6.权利要求5所述的方法，其中所说的蛋白、蛋白片段，或多肽含有至少一种选自5-(nC)-异亮氨酰基的氨酰基残基，并且R3为氢。
7.制备选自2-氨基-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸，2-氨基-4-(nC-甲基)-5-(nC)-戊酸和2-氨基-3-甲基-5-(nC)-戊酸的氨基酸的方法，该方法包括：
a)将适合的微生物经遗传修饰，使其能表达所说的氨基酸的均聚物；
b)当所说的氨基酸是2-氨基-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸和2-氨基-4-(nC-甲基)-5-(nC)-戊酸时，在含有式Ia′化合物或其盐的营养培养基中，培养该遗传修饰后的微生物，
Figure C008082510005C1
其中的n在各种情况下分别为13或14；
或者当所说的氨基酸是2-氨基-3-甲基-5-(nC)-戊酸时，在含有式Ia″化合物或其盐的营养培养基中，培养该遗传修饰后的微生物，
Figure C008082510005C2
其中的n在各种情况下分别为13或14；
c)分离该遗传修饰后的微生物所表达的氨基酸的均聚物；以及
d)将所说的均聚物裂解，产生所说的氨基酸。
8.权利要求7所述的方法，其中所说的氨基酸是2-氨基-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸。
9.权利要求7所述的方法，其中所说的氨基酸是2-氨基-4-(nC-甲基)-5-(nC)-戊酸。
10.权利要求7所述的方法，其中所说的氨基酸是2-氨基-3-甲基-5-(nC)-戊酸。
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