Recolección e identificación de polen de colonias de abejas melíferas

Describimos métodos para recolectar polen corbicular de abejas melíferas, así como protocolos para la clasificación de colores, acetólisis y preparación de portaobjetos de polígono para la identificación taxonómica. Además, presentamos el color de los pellets y la diversidad taxonómica del polen corbicular recolectado de cinco sistemas de cultivo utilizando trampas de polen.

Los investigadores a menudo recolectan y analizan el polen corbicular de las abejas melíferas para identificar las fuentes vegetales en las que buscan polen o para estimar la exposición a pesticidas de las abejas a través del polen. Aquí se describe un método eficaz de captura de polen para recolectar polen corbicular de las abejas melíferas que regresan a sus colmenas. Este método de recolección da como resultado grandes cantidades de polen corbicular que se pueden utilizar con fines de investigación. Las abejas recolectan polen de muchas especies de plantas, pero generalmente visitan una especie durante cada viaje de recolección. Por lo tanto, cada pellet de polen corbicular representa predominantemente una especie de planta, y cada pellet de polen se puede describir por color. Esto permite la clasificación de muestras de polen corbicular por color para segregar las fuentes vegetales. Los investigadores pueden clasificar aún más el polen corbicular analizando la morfología de los granos de polen acetolizados para la identificación taxonómica. Estos métodos se usan comúnmente en estudios relacionados con los polinizadores, como la eficiencia de la polinización, la dinámica de forrajeo de los polinizadores, la calidad de la dieta y la diversidad. Se presentan metodologías detalladas para recolectar polen corbicular utilizando trampas de polen, clasificar el polen por color y acetolizar granos de polen. También se presentan resultados relacionados con la frecuencia de colores de pellets y taxones de polen corbicular recolectado de abejas melíferas en cinco sistemas de cultivo diferentes.

La abeja melífera occidental (Apis mellifera L.) es un polinizador importante de muchos cultivos agrícolas que dependen de la polinización de las abejas¹. Durante más de una década, se han reportado pérdidas significativas de colonias de abejas melíferas 2,3,4,5,6,7,8,9. Varios factores, incluidos parásitos y enfermedades, mala nutrición y pesticidas, han sido implicados en estas disminuciones de colonias¹⁰. La mala nutrición puede atribuirse a la intensificación agrícola y a la pérdida del hábitat de forrajeo¹¹. Es imperativo comprender los recursos florales utilizados por las abejas en diferentes paisajes para mejorar la nutrición de las abejas y ayudar en los esfuerzos de conservación de las abejas. El polen es la principal fuente de proteínas, lípidos, vitaminas y minerales para las abejas y se ha utilizado en muchos estudios agrícolas y ecológicos para comprender las preferencias de alimentación a nivel de colonia de las abejas melíferas, evaluar el impacto de la captura de polen en las colonias de abejas melíferas y determinar la exposición a pesticidas para las abejas^12,13,14.

Las abejas recolectan polen de las flores, empacan el polen en pellets en su corbicula, una canasta de polen tibial en su pata trasera, y regresan a la colonia para su almacenamiento. El polen corbicular se puede eliminar de los recolectores capturándolos en la entrada de la colmena o en las flores, enfriándolos brevemente para inmovilizarlos y luego retirando los gránulos de polen de sus patas traseras con fórceps. El laborioso proceso de recolección manual de polen corbicular de recolectores capturados individualmente es lento e ineficiente si se requiere una cantidad considerable de polen. Un método más simple y eficiente para recolectar grandes volúmenes de polen es atrapar gránulos de polen corbicular de las abejas melíferas en las entradas de las colmenas. Las trampas de polen están diseñadas para desalojar el polen corbicular de las patas de los recolectores de polen que regresan cuando entran en la colmena¹⁵. Los recolectores deben pasar a través de agujeros de malla que están dimensionados para permitir el paso estrecho de un cuerpo de obrera de abejas melíferas.

A medida que la abeja melífera pasa a través de uno de estos agujeros, los gránulos de polen más grandes se raspan de sus patas y caen en una bandeja de recolección¹⁶. Los estudios han demostrado que la captura de polen estimula a los recolectores a recolectar más polen, aumentando así la eficiencia de polinización de los cultivos y la vegetación circundantes^17,18,19,20. Las metodologías de recolección de polen también se pueden utilizar para comprender el forraje utilizado por las abejas melíferas en el paisaje como el primer paso para determinar la cantidad, calidad y taxones de especies de plantas con flores. Las metodologías eficaces de captura de polen facilitan tanto la polinización como la investigación nutricional de las abejas melíferas. Una comparación de estos métodos de recolección de polen se ilustra en la Tabla 1. El comportamiento de búsqueda de polen cambiará en función de la necesidad de la colonia de polen almacenado en relación con sus niveles de población de huevos y larvas^21,22. Como estos cambios incluyen una intensidad de recolección variable, a menudo se espera una alta variación en la cantidad de polen entre colonias en el mismo lugar y entre diferentes lugares del mismo sistema de cultivo o tipo de paisaje^23,24. Aumentar el número de colonias y lugares para atrapar el polen ayudará a acomodar esta variación.

Las trampas de polen varían en eficiencia^25,26. El tamaño de los pellets de polen recolectados por las abejas melíferas varía entre las especies de plantas y puede cambiar según los niveles de polen almacenados en la colonia^27,28. Esto plantea la posibilidad de que los gránulos de polen más pequeños estén subrepresentados y los gránulos más grandes estén sobrerrepresentados en muestras recolectadas a través de trampas de polen. Las abejas adultas varían en tamaño corporal, lo que también puede afectar la representación del polen recolectado en las trampas. También hay especies de plantas que producen predominantemente néctar que no se detectará si solo se evalúa el polen recolectado en algunos paisajes. La eficiencia de la captura también se ve afectada por la deriva y la desorientación del forrajero, que está influenciada por el tipo de trampa de polen y la condición del equipo de la colmena. Este problema puede mitigarse empleando las técnicas especificadas en este documento. Los investigadores pueden considerar técnicas de investigación adicionales, como contar las visitas de flores por parte de los recolectores, para complementar los resultados de las preferencias de forrajeo a nivel de colonia. Un método útil para evaluar la diversidad de polen es clasificar el polen corbicular por color. Aunque las abejas melíferas son recolectoras generalistas, también exhiben fidelidad floral, donde recolectan polen de la misma especie de planta en el mismo lugar durante cualquier viaje de recolección. Con base en este comportamiento de forrajeo, se supone que cualquier pellet de polen corbicular dado está representado predominantemente por una sola especie de planta 27,29,30,31. Por lo tanto, los científicos pueden describir la diversidad de polen clasificando el polen corbicular por color de pellet e informando el número total de colores detectados o la proporción del total representado por cada grupo de color ^12,32,33,34. Esto se puede lograr midiendo la masa o el recuento de pellets de cada grupo de color. Se sugiere medir el recuento de pellets de cada grupo de color si existen diferencias sistemáticas conocidas o sospechadas en el peso de los pellets de diferentes taxones. Las diferencias sistemáticas podrían ser causadas por el tamaño del pellet o la cantidad de néctar que los recolectores agregan al polen al formar un pellet.

La clasificación de colores es un proceso simple y eficiente en el tiempo, pero puede no tener una precisión aceptable para algunos estudios de investigación de polinización porque diferentes taxones de plantas pueden tener colores similares de pellets de polen^35,36. Además, existe un límite logístico para el número de grupos de colores distintos en los que se pueden separar los gránulos de polen. Por lo tanto, la separación del polen de cada taxón de planta individual en su propio grupo de color de pellets puede no ser siempre posible en los estudios de polinización. La caracterización morfológica de los granos de polen mediante microscopía óptica a menudo complementa la separación del color de los gránulos al distinguir el polen de dos o más taxones en gránulos del mismo grupo de color. Aunque es común encontrar granos de polen de múltiples taxones en un grupo de color de pellets de polen dado, los pellets de polen individuales recolectados por una abeja melífera generalmente comprenden un taxón predominante, posiblemente con otros taxones en cantidades menores. Por lo tanto, es común asumir la fidelidad taxonómica en pellets de polen corbicular de abejas melíferas. Los gránulos de polen de otros polinizadores que no exhiben un comportamiento de fidelidad floral, como los abejorros, a menudo contienen muchas especies de plantas y pueden no poseer un taxón predominante. En los casos en que se desean estimaciones cuantitativas de las proporciones de taxones en pellets de polen polifloral, se requieren métodos microscópicos que incluyen acetólisis para un análisis adecuado.

La evaluación de las características morfológicas de los granos de polen acetolizados es el método más común para la identificación taxonómica¹⁶. El procedimiento de acetólisis elimina el protoplasma del grano de polen para exponer características diagnósticas que pueden ser observadas bajo microscopía óptica^37,38. Usando este método, los investigadores pueden reportar diferentes taxones, frecuencia de taxones encontrados en sistemas de cultivo específicos y taxones predominantes de colores de pellets^33,36. La acetólisis es la mejor técnica analítica para revelar la morfología del polen²⁸. Sin embargo, algunos granos de polen acetolizados, como muchos tipos de Rosaceae, no se pueden identificar a nivel de género o especie a través de la acetólisis y la microscopía óptica solamente. Los investigadores consideran la microscopía electrónica de barrido o el metabarcoding como métodos alternativos para lograr la identificación a nivel de género o especie. Estos métodos alternativos, sin embargo, sólo proporcionan identificación cualitativa de taxones y no logran estimar las proporciones de diferentes taxones de granos de polen en pellets de polen polifloral^36,39. Además, el gasto y la experiencia necesaria son considerablemente mayores para estos métodos. Una comparación de estos métodos de identificación se ilustra en la Tabla 1.

Tabla 1: Comparación de diferentes métodos de recolección e identificación de polen basados en tiempo, gasto, resolución y experiencia. Los métodos visuales (solo clasificación por colores) informan el número total de colores detectados o la proporción del total representado por cada grupo de colores como una métrica para determinar las fuentes de polen, pero no proporcionan identificación de taxones.

La información disponible sobre la captura y clasificación del polen y la acetolización de los granos de polen es diversa y a menudo se distribuye a través de múltiples fuentes, que varían para los investigadores en diferentes campos. Este documento ofrece información detallada sobre los diferentes tipos de trampas de polen que pueden ser utilizadas tanto por investigadores como por apicultores para recolectar de manera efectiva grandes volúmenes de polen corbicular. También se proporcionan protocolos para preparar muestras de polen, por acetólisis, tinción y montaje de portaobjetos, para la identificación de taxones de plantas. Las metodologías detalladas aquí son exhaustivas y sirven como un recurso único para identificar especies de plantas predominantes en las que las abejas melíferas se alimentan en un paisaje determinado, particularmente en los sistemas de cultivo. Se han presentado hallazgos basados en estos métodos de un estudio previo que documentan la diversidad de colores de pellets de polen y taxones de plantas a partir del polen corbicular recolectado por las abejas melíferas en cinco sistemas de cultivo¹⁴.

1. Recolección de polen corbicular de colonias de abejas melíferas usando trampas de polen

1. Determine cuándo atrapar el polen de la ubicación deseada del apiario.
   NOTA: Las condiciones climáticas ideales incluyen exposición total al sol, bajas velocidades del viento, baja humedad y sin precipitaciones pronosticadas durante el período deseado para la recolección de polen.
2. Seleccione las colonias óptimas de abejas melíferas para atrapar el polen dentro de la ubicación del colmenar.
   1. Evalúe la fuerza de la colonia contando a los recolectores que regresan a la entrada de la colonia durante 2 minutos. Seleccione las colonias con el mayor número total de recolectores que regresan.
   2. Seleccione colmenas con artículos de madera que estén en buenas condiciones, preferiblemente sin entradas adicionales y tapas deformadas. Use colonias con menos entradas alternativas, ya que tienen una mayor probabilidad de que los recolectores regresen reorientándose a la entrada de la trampa.
   3. Seleccione entradas de colmenas orientadas al sur siempre que sea posible. Si las colmenas están paletizadas, instale trampas de polen en cada colonia que mire en la misma dirección en una plataforma dada para evitar la deriva de los recolectores hacia las entradas de la colmena vecina.
   4. Si lo desea, evalúe el nido de cría de la colonia inspeccionando los marcos para detectar la presencia de larvas. Seleccione colonias con cantidades relativamente grandes de larvas.
3. Instale trampas de polen en las colonias de abejas melíferas seleccionadas.
   NOTA: La instalación variará según el tipo de trampa de polen. Los tipos incluyen a) montaje frontal, b) montaje inferior, c) montaje superior o d) montaje de entrada con barrena. Consulte la sección de discusión para obtener más detalles.
   1. Para trampas de montaje frontal, fije la trampa frente a la entrada con grapas, tornillos y cinta adhesiva, o conecte la trampa a cuerdas elásticas envueltas alrededor de la colmena. Para trampas de montaje inferior, coloque la trampa debajo de la caja de colmena más baja y fije la entrada de la trampa cerca de la entrada original. Para las trampas de montaje con barrena, fije la trampa directamente delante de un orificio de barrena de una caja de colmena con grapas, tornillos y cinta adhesiva. Para las trampas de montaje superior, coloque la trampa encima de la caja de la colmena superior y debajo de la tapa.
4. Selle todas las demás entradas posibles a la colonia utilizando material no adhesivo y moldeable, como espuma de látex o poliuretano, o tela de hardware # 8 (apertura de 2,7 mm) para agujeros de barrena. Use cinta adhesiva para pequeñas grietas.
5. Si usa trampas de montaje frontal, coloque una barrera, como una estera de goma, entre la canasta de recolección y el césped para evitar daños por humedad causados por el rocío.
6. Activar el mecanismo de captura de la trampa de polen 24 h después de la instalación y antes de que comience el vuelo de forrajeo del día (tarde en la tarde / temprano en la mañana).
   NOTA: Este paso es ideal, pero no necesario. Coloque trampas de polen cada dos semanas si atrapa polen en las mismas colonias durante un período determinado.
7. Recoja el polen corbicular de la bandeja de recolección, colóquelo en bolsas de plástico o tubos de centrífuga y guárdelo en una hielera con hielo.
   1. Para evaluar la diversidad y abundancia de especies de polen, por ejemplo, estudios de nutrición a nivel de paisaje, recolectar polen en dos o tres intervalos de 72 h⁴⁰.
   2. Para el análisis de residuos de plaguicidas, recolectar polen en intervalos de 24 h a 96 h con un mínimo de 3 g para procesar⁴¹.
8. Limpie el polen eliminando las partes de las abejas y otros restos de la colmena.
   NOTA: Use guantes desechables cuando manipule muestras de polen y cambie los guantes desechables entre muestras. Use herramientas separadas para eliminar los desechos del polen recolectado en cada trampa. Enjuague y seque antes de usar las herramientas para otro lote de polen atrapado.
9. Almacenar el polen a -20 °C o menos para mantener su integridad composicional si el polen está destinado a la identificación de fuentes de polen, evaluación de cantidades o análisis de residuos de plaguicidas^41,42.
10. Después de quitar las trampas de las colmenas, esterilice todo el equipo en una solución de lejía al 5%, enjuague y seque el equipo antes del próximo uso.

2. Clasificación del color de los gránulos de polen para la identificación de la fuente de polen aguas abajo y la evaluación de la cantidad

1. Asegúrese de que haya al menos 20 g de muestra de polen para trabajar. Mezclar bien la muestra de polen en su bolsa u otro recipiente del tamaño adecuado para obtener una mezcla homogénea de todos los gránulos contenidos en ella. Para evitar sesgos involuntarios en el siguiente paso, oculte la composición de color de la muestra antes de retirar una submuestra de la bolsa de muestra.
2. Con una cuchara o cuchara grande, saque 10 g de polen como submuestra representativa del conjunto. Vierta lentamente los gránulos de la cuchara en la balanza hasta que la pantalla lea 10 g. Si la primera cucharada no era lo suficientemente grande, recupere otra cucharada de la muestra de la misma manera.
   NOTA: Estos requisitos de peso especificados (20 g y 10 g) sirven solo como ejemplos. Los investigadores deben ajustar la cantidad de polen utilizada en cada paso según corresponda a necesidades específicas.
3. Retire todas las partes de abejas y otros residuos de la submuestra de 10 g. Luego, si es necesario, agregue un poco más de polen de la muestra original para lograr un peso total de 10 g de la submuestra.
4. Clasifique cada pellet de polen de la submuestra de 10 g en un grupo de colores. Utilice tanto el color como la textura del polen para diferenciar entre grupos de colores.
   NOTA: Se espera alguna variación dentro de un grupo, pero el uso de la guía de color Pantone durante la clasificación puede aumentar la coherencia.
5. Para garantizar al menos 0,25 g de cada grupo de color para los pasos posteriores, coloque los gránulos que no sean lo suficientemente abundantes como para formar un grupo de colores de al menos 0,25 g en un grupo misceláneo. Asigne un nombre a cada grupo de colores individual mediante la guía de colores Pantone. Etiquete el grupo misceláneo misceláneo.
6. Pese cada grupo de colores en un papel de pesaje separado y/o cuente el número de pellets en cada grupo de colores. Registre los nombres y pesos del grupo de colores o recuentos en una hoja de datos.
   NOTA: La elección de si pesar o contar el número de pellets en cada grupo de color depende de la métrica de interés del investigador y los objetivos del proyecto.
7. Cree una etiqueta de tubo de microcentrífuga para cada grupo de colores utilizando un bolígrafo resistente a solventes y etiquetas de tubo de papel adhesivas. Incluya la fecha actual, el identificador de muestra, la fecha de recolección de la muestra y el número de grupo de colores en la etiqueta. Aplique las etiquetas a tubos de microcentrífuga limpios y secos de 2 ml.
8. Pese 0,25 g (± 0,05 g) de gránulos de polen de cada grupo de color y coloque esta cantidad en el tubo de microcentrífuga debidamente etiquetado.
   NOTA: Si hay una ligera variación en el color o la textura en el polen de un grupo de colores dado, asegúrese de que haya una muestra representativa de pellets dentro de cada tubo. Los volúmenes de reactivo y los tiempos de incubación y centrifugación que siguen son apropiados para 0,25 g de polen. Por lo tanto, utilice esta cantidad de polen en los tubos de microcentrífuga que se utilizarán en la acetólisis. Este protocolo debe proporcionar abundante polen teñido para la identificación de fuentes de plantas aguas abajo por microscopía óptica. Si se utiliza una cantidad diferente de polen en la acetólisis, los detalles del volumen del reactivo y los tiempos de procesamiento deben ajustarse en consecuencia.
9. Coloque el polen restante de cada grupo de colores en bolsas de plástico individuales (una bolsa por color) etiquetadas con el nombre del grupo de colores. Conservar estas bolsas con las demás partes de la muestra original adecuada en un almacenamiento a -20 °C.
10. Mezcle bien el polen en el tubo con un palillo de madera limpio durante 10 a 15 s.

3. Preparación para la acetólisis

1. Antes de comenzar cualquier parte de la acetólisis por primera vez, comuníquese con el departamento de salud y seguridad ambiental (EHS) de la institución designada para obtener instrucciones sobre cómo se deben manejar los reactivos y desechos relacionados con la acetólisis.
2. Obtenga soluciones madre de los siguientes reactivos y colóquelos en la campana extractora de humos de acuerdo con las directrices de EHS para el almacenamiento químico: etanol al 95%; agua destilada; ácido acético glacial, anhidro; ácido sulfúrico concentrado; Glicerina; y esmalte de uñas transparente.
3. Prepare soluciones madre de los siguientes reactivos y colóquelas en la campana extractora de acuerdo con las directrices de EHS para el almacenamiento químico: bicarbonato de sodio saturado (solución p/v al 8% en agua destilada); y safranina O (solución p/v al 1% en etanol al 50%).

4. Acetólisis

1. Realice el procedimiento de pre-acetólisis del lavado con ácido acético glacial. Realice los siguientes pasos dentro de la campana extractora con bata de laboratorio, protección para los ojos y guantes de nitrilo.
   1. Encienda un bloque de calor a 80 °C.
      NOTA: Asegúrese de que una botella exprimida de bicarbonato de sodio saturado sea fácilmente accesible. Esto se puede utilizar para neutralizar derrames de ácido en la campana extractora de humos si ocurren.
   2. Etiquete un vaso de precipitados de vidrio para residuos ácidos, uno para residuos de etanol y uno para la mezcla de acetólisis.
   3. Usando soluciones madre previamente preparadas, cree alícuotas de trabajo de los siguientes reactivos en vasos de vidrio etiquetados y de tamaño apropiado: ~ 23.0 ml de ácido acético glacial; ~33.0 mL de agua destilada; ~23.0 mL de etanol al 95%; ~25.0 mL de bicarbonato de sodio (para residuos sólidos contaminados con ácido).
      NOTA: Estos son los volúmenes necesarios para completar los siguientes procedimientos de acetólisis en un total de 10 muestras de grupos de color (10 tubos de microcentrífuga).
   4. Añadir lentamente 500 μL de ácido acético glacial a cada tubo de microcentrífuga que contenga 0,25 g de polen de grupos de color. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva el polen con un palillo limpio durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado. Coloque el palillo usado en el vaso de precipitados de desecho de bicarbonato de sodio después de su uso; Repita este proceso para cada tubo.
      NOTA: Use un palillo de dientes nuevo y limpio para cada tubo. Asegúrese de que la tapa de cada tubo esté bien cerrada.
   5. Centrifugar las muestras durante 3 min a 1.100 × g. Decantar el sobrenadante de los tubos al vaso de precipitados de residuos ácidos. Luego, toque suave y brevemente la boca abierta del tubo con una toalla de papel limpia para eliminar el ácido acético glacial residual alrededor del borde del tubo.
      NOTA: Tenga cuidado de no perder el pellet de polen al decantar sobrenadantes.
2. Realice el procedimiento de acetólisis.
   NOTA: Realice los siguientes pasos dentro de la campana extractora con bata de laboratorio, protección para los ojos y guantes de vinilo de butilo.
   1. Prepare la mezcla de acetólisis (ácido acético glacial 9:1: ácido sulfúrico) agregando primero 10.8 ml de ácido acético glacial (de la alícuota de trabajo) a la mezcla de acetólisis etiquetada con vaso de precipitados. A continuación, utilizando una pipeta de 1000 μL equipada con puntas de pipeta filtradas de 1250 μL, añadir lentamente 1200 μL (1,2 ml) de ácido sulfúrico concentrado de la solución madre al vaso de precipitados de la mezcla de acetólisis que contiene ácido acético glacial. Deseche la punta de la pipeta usada en el vaso de precipitados de bicarbonato de sodio.
      NOTA: El vaso de precipitados de la mezcla de acetólisis puede calentarse al tacto y la mezcla puede volverse amarilla. Hay dos posibilidades que hacen que la mezcla se vuelva de color oscuro: (a) los reactivos pueden haber pasado sus fechas de vencimiento, o (b) se puede haber agregado demasiado ácido sulfúrico. En cualquier caso, si la mezcla se oscurece, deséchela en el vaso de precipitados de residuos ácidos y prepare una mezcla de acetólisis fresca.
   2. Revuelva suavemente la mezcla de acetólisis con una varilla de vidrio o un palo de agitación de madera para asegurarse de que esté homogeneizada. Coloque la varilla/palo usado en el vaso de precipitados de bicarbonato de sodio.
   3. Con una pipeta de 1000 μL con puntas de pipeta filtradas de 1250 μL, agregue lentamente 1000 μL de mezcla de acetólisis del vaso de precipitados a cada tubo. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva con un palillo de dientes limpio durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado. Coloque el palillo usado en el vaso de precipitados de desecho de bicarbonato de sodio después de su uso.
      NOTA: Use un palillo de dientes nuevo y limpio para cada muestra.
   4. Colocar las muestras en el bloque térmico precalentado (80 °C). Incubar los tubos durante 5 minutos, agitando bien cada tubo con un palillo limpio a mitad de la incubación. Coloque cada palillo usado en el vaso de precipitados de bicarbonato de sodio después de usarlo.
      NOTA: No deje palillos de dientes en las muestras; El ácido los disolverá.
3. Realice el procedimiento de lavado con ácido acético glacial posterior a la acetólisis.
   NOTA: Realice los siguientes pasos en la campana extractora con bata de laboratorio, protección para los ojos y guantes de vinilo de butilo.
   1. Agregue lentamente 500 μL de ácido acético glacial a cada tubo. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva con un palillo de dientes limpio durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado. Coloque el palillo usado en el vaso de precipitados de bicarbonato de sodio después de su uso.
      NOTA: Use un palillo de dientes nuevo y limpio para cada muestra. Asegúrese de que la tapa de cada tubo esté bien cerrada.
   2. Centrifugar las muestras durante 3 min a 1.100 × g. Decantar el sobrenadante de cada tubo en el vaso de precipitados de residuos ácidos. Luego, toque suave y brevemente la boca abierta del tubo con una toalla de papel limpia para eliminar el ácido residual alrededor del borde del tubo.
   3. Enjuague bien los guantes de vinilo de butilo con agua corriente durante al menos 30 s, quíteselos y colóquelos a secar.
      NOTA: Siga las directrices del fabricante sobre la reutilización de guantes de vinilo butílico.
4. Realice tres enjuagues con agua para cada muestra. Realice los siguientes pasos dentro de la campana extractora con bata de laboratorio, protección para los ojos y guantes de nitrilo.
   1. Agregue 1000 μL de agua destilada del vaso de precipitados de agua destilada a cada tubo. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva con un palillo de dientes limpio durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado. Coloque el palillo en el vaso de precipitados de desecho de bicarbonato de sodio después de su uso.
      NOTA: Use un palillo de dientes nuevo y limpio para cada muestra. Asegúrese de que la tapa de cada tubo esté bien cerrada.
   2. Centrifugar las muestras durante 3 min a 1.100 × g. Decantar el sobrenadante de los tubos en el vaso de precipitados de bicarbonato de sodio. Luego, toque suavemente la boca abierta del tubo con una toalla de papel limpia para eliminar el agua residual alrededor del borde del tubo.
   3. Repita los pasos 4.4.1-4.4.2 dos veces adicionales para un total de tres enjuagues con agua.
5. Realice el enjuague con etanol para cada muestra.
   NOTA: Lleve a cabo los siguientes pasos dentro de la campana extractora con bata de laboratorio, protección ocular y guantes de nitrilo.
   1. Con una pipeta de 1000 μL con puntas de pipeta filtradas de 1250 μL, agregue 1000 μL de etanol al 95% del vaso de precipitados de etanol a cada tubo. Deseche la punta de la pipeta en residuos no peligrosos. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva con un palillo de dientes limpio durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado.
      NOTA: Coloque el palillo en el vaso de precipitados de desecho de bicarbonato de sodio después de usarlo. Use un palillo de dientes nuevo y limpio para cada muestra. Asegúrese de que la tapa de cada tubo esté bien cerrada.
   2. Centrifugar las muestras durante 3 min a 1.100 × g. Decantar el sobrenadante de los tubos en el vaso de precipitados de desecho de etanol, y tocar suavemente la boca abierta del tubo con una toalla de papel limpia para eliminar el etanol residual del tubo.
6. Use bata de laboratorio, protección para los ojos y guantes de nitrilo para teñir las muestras. Mezclar la solución madre de tinción de Safranin O con una inversión suave.
   1. Con una pipeta de transferencia de plástico desechable, agregue 5-10 gotas de tinción de Safranin O a cada tubo. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva con un palillo de dientes limpio durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado. Deje el palillo en el tubo.
   2. Con una pipeta de 1000 μL con puntas de pipeta filtradas de 1250 μL, agregue 1000 μL de etanol al 95% del vaso de precipitados de etanol a cada tubo. Deseche la punta de la pipeta en residuos no peligrosos. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva con el palillo de dientes durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado. Coloque el palillo usado en los residuos no peligrosos después de su uso.
   3. Asegúrese de que la tapa de cada tubo esté bien cerrada. Centrifugar durante 3 min a 1.100 × g. Decantar el sobrenadante en el vaso de precipitados de residuos de etanol.
      NOTA: Esta vez no toque la boca del tubo con una toalla de papel.
   4. Agregue 10-15 gotas de glicerina a cada tubo con una pipeta de transferencia desechable de plástico. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva el contenido del tubo con un palillo limpio durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado.
      NOTA: Coloque el palillo usado en los residuos no peligrosos después de su uso. Use un palillo de dientes nuevo y limpio para cada muestra. Asegúrese de que todas las etiquetas de los tubos sean legibles.
7. Deje los tubos abiertos en la campana extractora para evaporar el etanol durante al menos 2 h a temperatura ambiente. Verifique el olor a etanol en las muestras: si es detectable, las muestras no están listas y deben dejarse secar hasta que el olor a etanol se disipe.
8. Limpie todos los materiales y elimine los desechos. Apague tanto la centrífuga como el bloque térmico. Elimine todos los desechos sólidos y líquidos de acuerdo con las pautas de salud y seguridad ambiental de la institución designada.
9. Preparar portaobjetos de microscopio para la identificación del polen; etiquételos de manera legible. Etiquete un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio apropiadamente para cada grupo de color/muestra que se montará. Mientras inspecciona visualmente el tubo, revuelva la muestra con un palillo limpio durante 10-15 s y asegúrese de que el contenido del tubo esté bien mezclado.
   NOTA: La preparación de la diapositiva se puede hacer en el banco de laboratorio. Deseche el palillo en residuos no peligrosos. Use un palillo de dientes nuevo y limpio para cada muestra.
   1. Con una pipeta de transferencia de plástico desechable limpia, retire 1 gota de residuos de polen de un tubo y colóquela en el centro de su portaobjetos de microscopio etiquetado. Permita que la gota se extienda ligeramente. Coloque un cubreobjetos limpio sobre la gota en la diapositiva.
   2. Después de que el portaobjetos se haya secado, selle el cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas transparente. Coloque una pequeña gota de esmalte en cada esquina del cubreobjetos, y pinte un borde de esmalte alrededor del perímetro del cubreobjetos donde se encuentra con el portaobjetos. Deje que el esmalte de uñas se seque completamente y pinte una segunda capa de esmalte alrededor del perímetro del cubreobjetos.

Un estudio previo informó la evaluación de la diversidad de polen recolectado por las abejas melíferas en los siguientes cultivos agrícolas: almendra, cereza, arándano highbush, zanahoria híbrida y espuma de pradera¹⁴. Utilizando los métodos descritos, se recolectó polen corbicular, se clasificó por color y se identificaron las fuentes vegetales de cada grupo de color de pellets para evaluar la diversidad de polen. Se instalaron trampas de polen de montaje inferior en colonias en múltiples sitios para cada cultivo (Figura 1A). La cantidad de polen recolectado de cada sitio fue suficiente para cumplir con los requisitos de peso de la muestra de los métodos de clasificación de color y análisis de acetólisis. Cada muestra de recolección de polen tenía múltiples grupos de colores distinguibles (Figura 2 y Figura 3). En algunas muestras, los grupos de color del polen contenían tan solo 4-5 pellets; sin embargo, la mayoría de los grupos tenían significativamente más que eso y, por lo tanto, sirvieron como su propio grupo de color etiquetado para la acetólisis (Figura 4 y Figura 5). Después de la acetólisis (Figura 6), se utilizó microscopía óptica de campo claro para identificar eficazmente cada grupo de colores en su rango taxonómico más bajo posible al confirmar las características morfológicas con las de los especímenes de vales recolectados en el área que rodea cada sitio de estudio (Figura 7).

Figura 1: Trampas de polen instaladas en una colonia de abejas melíferas para recolectar polen corbicular . (A) Trampas de montaje inferior colocadas sobre el tablero inferior de la colmena y directamente encima de la caja de la colmena más baja. Otros estilos de trampas de polen incluyen (B) trampas de montaje frontal y (C) trampas de montaje de entrada de barreno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Mecanismo de captura y bandeja de recogida de trampa de polen. Los recolectores de polen que regresan deben pasar por el mecanismo de captura de malla antes de llegar a su colmena. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Bandeja de recogida de trampa de polen. El polen corbicular es raspado de las patas de los recolectores de polen que regresan por la trampa de polen y cae en la bandeja de recolección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Clasificación de una muestra de polen corbicular en grupos de color. El polen corbicular se puede secar y pesar después de clasificarlo en grupos de color para informar proporciones de pellets de diferentes colores recolectados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Cuatro grupos de gránulos de polen ordenados por color utilizando la guía de colores Pantone. Los grupos de color están etiquetados como (A) gris, Pantone 5855C, (B) marrón, Pantone 7557C, (C) amarillo, Pantone 458C y (D) marrón claro, Pantone 3547C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Configuración del equipo de acetólisis dentro de la campana extractora. El bloque de calor, los reactivos, los residuos de disolventes y los contenedores de residuos ácidos, los vasos de precipitados etiquetados, la pipeta, las puntas de pipeta, las varillas de agitación y los tubos de microcentrífuga situados dentro de la campana extractora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Micrografía de granos de polen teñidos y acetolizados. Muchas facetas de granos de polen de mostaza acetolizada (Brassicaceae) con un aumento de 40x. Barra de escala = 50.398 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El polen recolectado de los cultivos de almendros tuvo una diversidad de polen relativamente menor que el polen recolectado de otros cultivos, con un promedio de 3,0 ± 0,5 colores de pellets y 3,2 ± 1,2 taxones de plantas por sitio (Tabla 2)¹⁴. Los cuatro sistemas de cultivo restantes tuvieron niveles más altos de diversidad de polen con un promedio de 6.0 ± 2.0 colores de pellets y 8.0 ± 1.5 taxones de plantas por sitio en cerezo, 8.8 ± 1.4 colores de pellets y 13.5 ± 2.0 taxones de plantas por sitio en arándanos de arbusto alto, 7.0 ± 1.0 colores de pellets y 11.0 ± 0.0 taxones de plantas por sitio en zanahoria híbrida, y 10.0 ± 0.0 colores de pellets y 13.0 ± 1.5 taxones de plantas por sitio en meadowfoam¹⁴.

Tabla 2: Diversidad de polen corbicular recolectado de abejas melíferas en cinco sistemas de cultivo. Las métricas de diversidad incluyen el número medio de colores de pellets (± SE), el número medio de taxones de plantas (± SE) y el total de taxones identificados. Esta tabla ha sido modificada de¹⁴. Abreviatura: SE = error estándar.

Los diferentes estilos de trampas de polen tienen sus propias ventajas y consecuencias. Los beneficios y limitaciones de cuatro estilos de trampa de uso común, (1) montaje frontal, (2) montaje inferior, (3) barrena y (4) trampas de polen de montaje superior se discuten a continuación. Las trampas de montaje frontal son el estilo más versátil (Figura 1B). La instalación es rápida y fácil; se puede hacer sin levantar cajas de colmenas, y estas trampas pueden caber en cualquier estilo Langstroth de equipo de colmena. Como la bandeja de recolección se encuentra frente a la colonia, recoge un mínimo de escombros de la colonia. Sin embargo, la bandeja de recolección también está más expuesta a elementos externos: la humedad del riego del campo, el clima lluvioso o húmedo, o el rocío puede entrar en contacto con el polen a través de la bandeja de recolección, lo que puede hacer que el polen sea inutilizable si los gránulos se saturan demasiado para separarse. El riesgo de saturación de polen puede reducirse evitando la captura durante los eventos pronosticados de lluvia o alta humedad. Colocar una estera de goma debajo de la trampa y material de cobertura adicional (por ejemplo, fieltro para techos) encima de la trampa de polen también puede proteger la bandeja de recolección del clima.

Se utilizaron trampas de montaje inferior para recolectar polen para los datos de este documento (Figura 1A). No son tan convenientes de instalar porque deben colocarse debajo del nido de cría de la colonia. La instalación requiere mucho tiempo y da como resultado un gran volumen de escombros que caen en la trampa de la colonia, como partes de abejas y pequeños trozos de cera. El piso de la bandeja de recolección para la mayoría de las trampas de montaje inferior fabricadas está hecho de malla fina, lo que permite una ventilación adecuada para proteger el polen recolectado de la humedad. Las trampas de polen de barrena ayudan a minimizar la desorientación de los recolectores si utilizan principalmente agujeros de barrena como entradas de colmena en lugar de la entrada hecha por el tablero inferior de la colmena (Figura 1C). Como la bandeja de recolección para trampas de polen con barrena es muy pequeña, debe vaciarse con frecuencia para evitar el desbordamiento de la bandeja de recolección. Dada su ubicación superior en una colmena, la trampa de polen de montaje superior es el estilo de trampa más fácil de instalar y quitar, y la muestra de polen recolectada está libre de restos de colmena. Sin embargo, este estilo de trampa es muy sensible al equipo de colmena dañado, ya que la bandeja de recolección estaría expuesta a la humedad si la tapa, la cubierta interior y la caja superior de la colmena no están selladas correctamente.

Los protocolos descritos en este documento requieren la selección de colonias con grandes poblaciones adultas y larvales (paso 1.2). Este método de selección está destinado a producir cantidades muy grandes de polen atrapado de estas colonias. Las colonias con poblaciones de forrajeo sustanciales pueden experimentar una gran congestión en la entrada tras la instalación de la trampa. Seleccionar una gran entrada de colmena aliviará la congestión. Las grandes poblaciones de forrajeo también pueden recolectar cantidades muy grandes de polen que pueden exceder los límites de la bandeja de recolección. Use bandejas de recolección voluminosas, como se ve con la mayoría de los estilos de trampas de montaje inferior o superior, y bandejas vacías con frecuencia para acomodar grandes cantidades de polen atrapado. Si el objetivo de investigación deseado es evaluar las cantidades de polen recolectadas por las colonias en un colmenar, seleccione colonias representativas en lugar de optimizar las poblaciones adultas y larvales para la selección. Todos los estilos de trampas de polen bloquean la entrada de la colmena y crean una nueva entrada que difiere espacialmente de la entrada original¹⁶. Las trampas de polen comúnmente no recolectan polen cuando los recolectores no pueden reorientarse a la nueva entrada de la trampa de polen después de la instalación. Estos recolectores se desplazan fácilmente a las colmenas vecinas, lo que podría contaminar otras muestras de recolección de polen si ingresan a otra colmena con una trampa de polen. Por lo tanto, a los recolectores se les debe dar al menos 24 h para aclimatarse a la nueva entrada, manteniendo el mecanismo de captura desconectado después de la instalación. La selección de colonias con pocas o ninguna entrada adicional de colmenas también reduce la confusión al orientarse hacia la nueva entrada de la trampa de polen.

Las entradas adicionales de la colmena (por ejemplo, agujeros y tapas deformadas) deben sellarse, pero el riesgo de que los recolectores se desvíen hacia colmenas vecinas aumentará con estas entradas presentes al comienzo de la instalación de la trampa. Los recolectores también se desplazarán fácilmente hacia otras entradas de colmenas si se instala una trampa de polen solo en una colmena en un grupo de colmenas paletizadas. Es menos probable que los recolectores se desvíen si todas las colmenas que miran hacia la misma dirección en la plataforma tienen trampas instaladas. Las trampas de polen de montaje superior pueden representar un mayor riesgo de deriva de abejas debido a la distancia sustancial entre la entrada de la trampa de polen y la entrada original de la colmena. Para este estudio, se instalaron trampas de polen en múltiples colonias de abejas melíferas en cada ubicación experimental para tener en cuenta la variación en la cantidad de polen y la composición de taxones entre cada colonia de abejas melíferas. Por lo tanto, las trampas de polen deben instalarse en múltiples colonias para lograr colecciones de polen robustas del paisaje porque la recolección de polen puede variar ampliamente entre colonias según el tipo de especie de planta y la cantidad total recolectada^12,13. Cada muestra de polen tuvo un período de recolección de 7 días. En estudios futuros, la recolección de polen en dos o tres intervalos consecutivos de 72 h aumentará la precisión de la estimación del polen forrajero⁴⁰.

Como existe un alto grado de fluctuación temporal en la recolección de polen, la precisión de la estimación del polen podría aumentarse repitiendo el proceso de recolección de polen en los períodos de floración temprana, máxima y tardía de los sistemas de cultivo objetivo^24,27,39. El polen debe recolectarse de múltiples ubicaciones, aunque sean del mismo sistema de cultivo o tipo de paisaje, debido a la variación anticipada en cantidad y tipo de especie de planta entre las ubicaciones de los colmenares 14,27,33,43. La captura de polen a largo plazo puede ser perjudicial para las colonias de abejas melíferas. Los impactos potenciales incluyen la reducción de la cría de crías, el acortamiento del período de crecimiento larvario y el canibalismo de huevos y larvas jóvenes en las colmenas 19,44,45,46. Los períodos más largos de captura de polen, como toda la temporada de crecimiento, pueden empeorar los efectos nocivos sobre la cría de crías en colonias. La captura de polen también puede causar una reducción en la producción de miel y un aumento en el nivel de humedad de la miel almacenada¹³. La rotación de trampas de polen entre colonias en un colmenar cuando se monitorea continuamente un paisaje o sistema de cultivo podría mitigar el daño a las colonias utilizadas para la captura de polen. Utilizar trampas de polen cada dos semanas reducirá los impactos perjudiciales, particularmente la pérdida en la producción de miel, si atrapa polen en las mismas colonias durante un período de tiempo¹³.

Además, las trampas de polen se colocan preferiblemente en colonias fuertes. Ocasionalmente, las trampas de polen pueden activarse involuntariamente. Esto podría evitarse bloqueando el mecanismo de la trampa de polen cuando no se desea la recolección de trampas de polen. Las trampas de polen no eliminan todo el polen corbicular de las abejas recolectoras de abejas. La eficiencia de captura depende del tipo de trampa, el tamaño del pellet de polen, el tamaño del cuerpo de la abeja, la hora del día y las condiciones climáticas. Por lo tanto, la recolección de polen corbicular no es consistente cuando se utilizan trampas de polen para diferentes especies de plantas y períodos de recolección^25,26. Los pellets de polen más pequeños de plantas como Eucalyptus spp. y Tamarix spp. tienen menos probabilidades de ser capturados por trampas de polen²⁷. En particular, no se encontró polen de arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum L.) en los sitios de recolección de arándanos de arbusto alto en este estudio, lo que respalda la evidencia previa de que los gránulos de polen de arándanos de arbusto alto son demasiado pequeños para la recolección de trampas de polen⁴⁷. En contraste, el polen obtenido del diente de león (Taraxacum officinale F.H. Wigg) se encontró en todos los sistemas de cultivo en este estudio. Los pellets de polen de algunas especies de plantas también pueden ser mucho más grandes que otros, como Taraxacum spp., y posiblemente podrían estar sobrerrepresentados en el análisis de las colecciones de polen de trampas de polen²⁷. La captura de recolectores de polen individuales y la eliminación manual de su polen corbicular aumentará la precisión de una evaluación de la fuente de polen, pero requiere mucho tiempo y recursos en comparación con el uso de trampas de polen (Tabla 1). La clasificación de los gránulos de polen en grupos de color es relativamente sencilla, aunque lleva mucho tiempo. A menos que haya una meta u objetivo de investigación específico, la cantidad de pellets de polen debe limitarse a 10 g o menos (para cualquier muestra dada) para clasificar en grupos de color. La clasificación de muestras enteras que contienen cantidades mayores que esta cantidad aumentará drásticamente el tiempo requerido para completar el análisis. Sin embargo, es crucial que una muestra de polen esté muy bien mezclada antes de tomar una submuestra para la clasificación de colores. No mezclar la muestra original puede resultar en una submuestra que no es representativa del todo, lo que debe evitarse.

Si el recipiente original de la muestra no contiene suficiente espacio libre para permitir una mezcla completa de pellets de polen, colocar toda la muestra en una bolsa de plástico grande o una bolsa de papel pequeña debería ser suficiente, incluso para muestras grandes. Los recipientes de plástico duro con tapa también funcionarán. La mezcla de la muestra debe hacerse suavemente, de modo que los gránulos de polen no se aplasten ni se destruyan de otra manera. El sesgo involuntario podría persuadir inconscientemente a uno a sacar "los bonitos gránulos púrpuras", por ejemplo, al eliminar una submuestra del conjunto. Por lo tanto, la composición de color de la muestra debe ocultarse de la vista mientras se extrae una submuestra. De esta manera, es más probable obtener una submuestra que sea verdaderamente representativa del todo. Sin embargo, este método de submuestreo podría no seleccionar pellets de polen que están en baja abundancia en la muestra. Por lo tanto, si la identificación de cada taxón de plantas individual representado en la muestra es un objetivo de investigación, la recolección de una submuestra no será apropiada; Se debe analizar toda la muestra. Por lo tanto, los pellets deben clasificarse en una placa de Petri de vidrio. Una vez que se completa la clasificación, se pueden colocar las páginas apropiadas de la guía de color Pantone debajo del plato para facilitar la coincidencia de colores entre la guía y el polen clasificado. Un ejemplo de esto se ilustra en la Figura 5.

Al atrapar el polen de las colonias de abejas melíferas colocadas en cultivos para la polinización, no se deben usar más de diez grupos de colores totales: nueve colores individuales y un grupo de colores "misceláneos" compuesto por los colores minoritarios en la muestra. Establecer un límite razonable en el número máximo de grupos de color en los que se puede dividir una muestra evita que el investigador se atasque al separar interminablemente los gránulos en un número cada vez mayor de grupos extremadamente específicos, que, cuando se completa la clasificación, pueden no contener individualmente cantidades suficientes para la acetólisis. Si se captura a partir de colonias que probablemente se alimentan de una variedad muy diversa de especies de plantas, pueden ser necesarios más grupos de colores, y los protocolos deben optimizarse para reflejar ese requisito. El presente estudio se centró en las muestras de polen recolectadas de colonias de abejas melíferas que polinizaban cultivos, y se encontraron comúnmente múltiples taxones en un grupo de color, similar a estudios previos 29,30,31.

La acetólisis disuelve los lípidos, proteínas y desechos orgánicos de la superficie de los granos de polen, revelando los caracteres distintivos de la exina, de modo que los granos se pueden teñir e identificar más fácilmente. Es una metodología antigua y común utilizada en muchos tipos de investigación del polen³⁷. Los pasos generales están estandarizados; Varían poco de un protocolo a otro. Sin embargo, los detalles de las velocidades y tiempos de centrifugación, la temperatura y duración de la incubación, los volúmenes de reactivos impulsados por la cantidad de polen e incluso el método de eliminación del sobrenadante (decantación vs pipeteo) pueden necesitar ser optimizados experimentalmente de acuerdo con los objetivos de la investigación y, en cierta medida, los tipos de polen que probablemente se encontrarán⁴⁸. De hecho, la acetólisis puede eliminar importantes caracteres diagnósticos del polen de algunos taxones como Malvaceae y Orchidaceae³⁸. Por lo tanto, no todo el polen es susceptible a los métodos estándar de acetólisis. Como se indicó anteriormente, estos métodos se optimizaron en este estudio con el fin de identificar las fuentes dominantes de polen de taxones vegetales recolectados por las abejas melíferas polinizadoras de cultivos. Los detalles que deben considerarse si la cuantificación precisa de los granos de polen es parte del estudio, no se han abordado en este documento.

El uso de solventes y ácidos requiere una planificación cuidadosa, equipo de protección personal (EPP) adecuado y eliminación responsable de desechos (Figura 6). Es fundamental que los investigadores determinen la forma correcta de almacenar los reactivos y eliminar los residuos antes de comenzar cualquier parte de la acetólisis. En este laboratorio, los guantes de butilo se utilizan durante cualquier parte del proceso que involucre ácido sulfúrico e incluso ácido acético glacial, ya que tienen calificaciones de degradación y permeación mucho mejores para ambos ácidos que los guantes de nitrilo, sin comprometer la destreza⁴⁹. Sería prudente consultar las directrices de seguridad de la institución respectiva para obtener recomendaciones sobre guantes apropiados y otros EPP⁴⁹. La adición de ácido acético glacial antes de la etapa de acetólisis ayuda a eliminar cualquier humedad residual en la muestra y la prepara para la importante reacción de acetólisis. La mezcla de ácido acético glacial-ácido sulfúrico en la etapa de acetólisis puede reaccionar violentamente con el agua, por lo que es importante que toda la cristalería y los suministros estén completamente secos, y que toda la humedad se elimine de la muestra antes de la acetólisis. La adición post-acetólisis de ácido acético glacial diluye y neutraliza la mezcla de acetólisis.

El etanol y el ácido acético glacial, en particular, pueden disolver la tinta de las etiquetas de los tubos de microcentrífuga, si estos reactivos gotean en el exterior del tubo, incluso con plumas resistentes a los solventes. Revise las etiquetas de los tubos con frecuencia durante todo el proceso para asegurarse de que aún sean legibles. Si es logísticamente factible, considere el uso de etiquetas impresas con LaserJet como protección contra esta posibilidad. La forma en que se decantan los sobrenadantes influirá en si los reactivos gotean por el exterior de los tubos de microcentrífuga. Es importante decantar el sobrenadante con una mano segura y suave, que viene con la práctica. Se debe tener cuidado para evitar la pérdida de muestras de polen del tubo de centrífuga durante la decantación. Decantar demasiado rápido corre el riesgo de perder parte o la totalidad del residuo de polen; La decantación demasiado lenta puede hacer que el sobrenadante corra por el tubo. Aunque comúnmente se recomienda una temperatura de incubación de 100 °C, el polen podría fácilmente "cocerse en exceso" a esa temperatura en las cantidades utilizadas en este estudio (0,25 g), particularmente si se incuba por duraciones ligeramente más largas²⁹. De hecho, incluso a 80 ° C, los granos de polen pueden estallar o dañarse si se dejan en la mezcla de acetólisis demasiado tiempo. La temperatura y la duración de la incubación deben determinarse cuidadosamente para evitar la destrucción de los granos de polen en la muestra.

La tinción del polen aumenta la definición y el contraste de las características de la exina, lo que facilita la fotografía y la identificación (Figura 7). Cinco gotas (de una pipeta de transferencia de plástico) de Safranin O al 1% tiñeron efectivamente 0,25 g de polen. Sin embargo, diferentes pólenes se tiñen de manera diferente. Si los granos de polen se manchan demasiado ligeramente o demasiado, la identificación puede ser difícil. Cuando sea posible, deberá validarse el volumen de la solución de tinción necesaria para teñir adecuadamente las especies de polen que se espera encontrar en el estudio antes de comenzar el procesamiento de las muestras experimentales. Sin embargo, si una de las muestras experimentales no se tiñe adecuadamente, se puede corregir. Para aclarar una muestra de polen que está manchada demasiado, enjuague la muestra con agua y luego etanol. Si el polen no está lo suficientemente bien como para ver características distintivas, se pueden agregar algunas gotas adicionales de mancha. La tinción de estas muestras debe verificarse antes de agregar glicerina. Del mismo modo, puede ser necesario un poco de prueba y error para determinar el volumen ideal de glicerina para los residuos de polen. Quince gotas de glicerina protegieron adecuadamente las muestras en este estudio de la desecación, al tiempo que diluyeron el residuo de polen a una concentración ideal para la identificación posterior a través de microscopía óptica. Otras cantidades de residuos de polen pueden requerir más o menos glicerina para evitar la desecación y facilitar el montaje.

Los autores no tienen nada que revelar.

Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) por ayudar con la clasificación de colores y el análisis de acetólisis. Esta investigación fue apoyada por fondos de investigación proporcionados a R.R.S. por la Asociación de Apicultores del Estado de Oregón.