Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

El ADN mitocondrial (mt) de mamíferos es una molécula de ADN intramitocondrial pequeña, circular, de doble cadena, que codifica 13 subunidades de la cadena de transporte de electrones. A diferencia del genoma nuclear diploide, la mayoría de las células contienen muchas más copias de ADNmt, que van desde menos de 100 a más de 200.000 copias dependiendo del tipo de célula. El número de copias de ADNmt se utiliza cada vez más como biomarcador para una serie de afecciones y enfermedades degenerativas relacionadas con la edad y, por lo tanto, la medición precisa del número de copias de ADNmt se está convirtiendo en una herramienta clave tanto en entornos de investigación como de diagnóstico. Las mutaciones en el ADNmt, que a menudo ocurren como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o deleciones, pueden existir en todas las copias del ADNmt dentro de la célula (denominada homoplasmia) o como una mezcla de copias mutadas y WT de ADNmt (denominadas heteroplasmia). Las mutaciones heteroplásmicas de ADNmt son una causa importante de patología mitocondrial clínica, ya sea en enfermedades raras o en un número creciente de enfermedades comunes de aparición tardía, como la enfermedad de Parkinson. La determinación del nivel de heteroplasmia presente en las células es un paso crítico en el diagnóstico de enfermedades mitocondriales raras y en la investigación dirigida a comprender los trastornos comunes de aparición tardía donde las mitocondrias pueden desempeñar un papel. El número de copias de ADNmt y la heteroplasmia se han medido tradicionalmente mediante ensayos cuantitativos (q)PCR o secuenciación profunda. Sin embargo, la reciente introducción de la tecnología ddPCR ha proporcionado un método alternativo para medir ambos parámetros. Ofrece varias ventajas sobre los métodos existentes, incluida la capacidad de medir el número absoluto de copias de ADNmt y la sensibilidad suficiente para realizar mediciones precisas de células individuales incluso con números bajos de copias. Aquí se presenta un protocolo detallado que describe la medición del número de copias de ADNmt en células individuales utilizando ddPCR, denominado PCR de generación de gotas en adelante, con la opción de medición simultánea de heteroplasmia en células con deleciones de ADNmt. También se discute la posibilidad de ampliar este método para medir la heteroplasmia en células con SNP de ADNmt.

El ADN mitocondrial (mt) de mamíferos es un pequeño (aprox. 16,5 Kb) genoma circular de ADN que reside en la matriz mitocondrial que codifica 37 genes, que comprende dos ARNr, 22 ARNt y 13 genes codificadores de proteínas¹. A diferencia del genoma nuclear, que contiene una (haploide) o dos copias (diploides) de cada gen por célula, el ADNmt está presente en múltiples copias en las mitocondrias de cada célula, que van desde decenas de copias (por ejemplo, espermatocitos maduros) hasta cientos de miles de copias (por ejemplo, ovocitos)^2,3. Una consecuencia de esta naturaleza de múltiples ....

Todos los experimentos siguieron las pautas de ARRIVE y fueron aprobados por el Organismo de Revisión Ética de Bienestar Animal de la Universidad de Cambridge (AWERB).

NOTA: Todos los pasos de preparación de la muestra antes de la generación de gotitas deben realizarse en un área de trabajo limpia antes de la PCR, idealmente en un gabinete esterilizado por UV siempre que sea posible. El protocolo descrito aquí utiliza equipos específicos de PCR de generación de gotas (ver Tabla.......

Después de la generación de gotas, una capa transparente de gotas opacas es visible flotando sobre la fase petrolera en cada pozo (Figura 1B). La formación de gotitas puede verse afectada negativamente por la presencia de detergentes en el lisado de entrada cuando se realizan experimentos en células individuales. Utilizando el protocolo de lisis descrito en 2.1.2., se alcanzan rutinariamente rendimientos de gotitas por encima del nivel recomendado de 10.000, a pesar de la presencia de un.......

El protocolo descrito aquí es aplicable a una amplia gama de tipos de células y especies, además de los discutidos anteriormente, aunque la optimización cuidadosa de los nuevos diseños de ensayo será clave para garantizar que la precisión y la repetibilidad del método se mantengan cuando se aleje de las combinaciones de cebador / sonda previamente validadas. Cuando se trabaja con células individuales, es vital garantizar que la recolección de muestras se realice con la mayor precisión posible (por ejemplo, uti.......

Gracias al Dr. L Bozhilova por su asesoramiento sobre el análisis estadístico de los datos de PCR de generación de gotas. Gracias al Dr. H Zhang por proporcionar los ovocitos utilizados para generar datos en la Figura 3C y la Figura 4B. Este trabajo fue llevado a cabo por SPB en la Unidad de Biología Mitocondrial del Consejo de Investigación Médica (MC_UU_00015/9), Universidad de Cambridge, y financiado por una beca de investigación principal de Wellcome Trust en poder de PFC (212219 / Z / 18 / Z).