Introducción

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular Golden Retriever (GRMD) son enfermedades musculares degenerativas genéticamente homólogas y fenotípicamente análogas causadas por mutaciones en el gen DMD, que codifica la proteína distrofina (1, 2). La pérdida de distrofina en el sarcolema conduce a la fragilidad de la membrana y a lesiones tanto esqueléticas (3) como musculares cardíacas (4, 5). Las complicaciones cardíacas son la principal causa de muerte en hombres jóvenes con DMD (6).

Aunque el corazón y el músculo esquelético carecen de distrofina, las diferencias en el Ca²⁺ La homeostasis (7-9), el metabolismo (10) y la localización del complejo distrofina-glicoproteína (11-13) contribuyen a cambios patológicos variables en los dos tejidos. Mientras que algunos estudios han demostrado que los déficits funcionales del músculo esquelético y cardíaco van de la mano, otros han demostrado una progresión variable (5, 6, 14-16). Este potencial de discordancia tiene importancia clínica. Las características típicas de la enfermedad cardíaca pueden no estar presentes en los niños con DMD en silla de ruedas (17, 18), lo que impide la evaluación de los efectos del tratamiento en el corazón. Más importante aún, la mejora en la función del músculo esquelético por sí sola podría aumentar la tensión en el corazón y acelerar la progresión de la enfermedad cardíaca (6, 17-21).

El perro GRMD es un importante modelo animal grande de DMD (1, 2). Las características de la enfermedad cardíaca en los perros afectados que son muy similares a las de los niños incluyen anomalías en el ECG (22-24), el inicio inicial de la lesión alrededor de la adolescencia (4, 5, 25), cambios predominantemente en el ventrículo izquierdo (VI) basolateral (4, 5, 25, 26) y la eventual progresión a miocardiopatía dilatada clínicamente evidente con fracción de eyección reducida e insuficiencia cardíaca (1, 2, 4 y 5). Estudios descriptivos patológicos previos, incluido el primer artículo de Valentine et al. (25), establecieron las características básicas de la miocardiopatía GRMD (1, 25-29). Sin embargo, estos estudios a menudo se centraron en perros jóvenes, y algunos evaluaron un número limitado de sitios anatómicos cardíacos. El estudio de Valentine fue exhaustivo en el sentido de que se evaluaron 13 perros y se tomaron muestras de 17 a 19 secciones cardíacas en cada uno de ellos, pero 24 de los 12 perros tenían <6 semanas de edad y no tenían anomalías detectables. En consecuencia, el estudio se centró en solo cinco perros con edades comprendidas entre los 5,6 meses (m) y los 6 años (y). Los cinco perros presentaban lesiones, estableciéndose 5,26 m como edad de inicio de los cambios patológicos. Basándose en un estudio de ocho beagles cruzados (CXMDJ) con la mutación GRMD, Yugeta et al. (12) sugirieron que el inicio patológico podría retrasarse hasta los 12 meses. Su evaluación patológica incluyó solo cuatro perros >21 m de edad, siendo el mayor de 12 m. No se observaron lesiones histopatológicas en perros <3 m, y solo 4 de los 29 perros mayores presentaron cambios. Si bien el estudio descriptivo más reciente realizado en Brasil (18) incluyó a <> perros con GRMD y también hizo el esfuerzo más concertado para diferenciar las lesiones entre los grupos de edad, solo se examinaron sitios individuales del VI y el ventrículo derecho (VD) para cada perro. Dado que todos los perros en el estudio de Brasil supuestamente murieron de insuficiencia cardíaca, los hallazgos patológicos en todos los grupos de edad podrían ser más típicos de la enfermedad en etapa terminal que de la enfermedad en etapa terminal. el espectro completo del desarrollo de la lesión.

Las mujeres portadoras heterocigóticas de mutaciones en el gen DMD también tienen un mayor riesgo de enfermedad cardíaca clínica (30-33) debido a la expresión de distrofina cardíaca en mosaico (30). Los portadores caninos de GRMD tienen un patrón de expresión de distrofina cardíaca en mosaico análogo (34) y lesiones similares a las de los perros afectados, incluyendo grados variables de fibrosis miocárdica, necrosis, mineralización e infiltración grasa concentrada en la pared libre del VI (35).

Dadas las similitudes entre las miocardiopatías DMD y GRMD, los estudios preclínicos en perros afectados deben informar el manejo de los pacientes con DMD. Los estudios patológicos suelen servir como el estándar de oro para establecer la progresión de la enfermedad y ayudan a seleccionar los marcadores diagnósticos y pronósticos adecuados. Reportamos una historia natural semi-cuantitativa de los cambios histopatológicos en la miocardiopatía en una gran cohorte de perros con GRMD en un amplio rango de edad.

Materiales y métodos

Animales

El cuidado de los perros en este estudio se rigió por los principios descritos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación y los protocolos aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Texas A&M. Típicamente, en nuestra colonia, las hembras portadoras se cruzan con semen de machos afectados, produciendo un 25% de machos normales, hembras portadoras, machos hemicigotos distróficos y hembras homocigóticas distróficas.

Se recolectaron corazones de treinta y ocho perros, incluidos 7 sabuesos normales (controles; 2-10 años; 5 hembras y 2 machos), 5 portadores de GRMD (3 m-4,5 años) y 26 perros afectados por GRMD [divididos en cuatro grupos de edad: <6 m (cinco perros), 6-12 m (siete perros), 12-24 m (cinco perros) y >24 m hasta 76 m (nueve perros)]. Los perros GRMD se dividieron en partes iguales entre machos hemicigotos y hembras homocigóticas.

Corazones

Se recolectaron corazones de perros afectados por GRMD que murieron o fueron sacrificados debido a la disminución de la calidad de vida (definida como una incapacidad para mantener la decúbito esternal o la progresión a insuficiencia cardíaca terminal) o en puntos finales para estudios no relacionados con la miocardiopatía. De los perros GRMD, solo uno fue sacrificado por razones relacionadas con la insuficiencia cardíaca intratable; Cuatro murieron o fueron sacrificados por otras razones. Se recolectaron corazones de perros portadores en los puntos finales terminales para estudios no relacionados con la miocardiopatía y de un perro (3 m) que murió bajo anestesia sin síntomas clínicos previos de enfermedad cardíaca. Se recolectaron corazones no afectados de una colonia no relacionada de perros sabuesos de trabajo sacrificados por eventos no cardíacos.

En todos los corazones, las muestras de las paredes libres del VI y del VD se congelaron en la necropsia y se almacenaron para posibles estudios de expresión génica e inmunohistoquímica. El resto del corazón entero se colocó en formol.

Patología macroscópica y seccionamiento

Los corazones fijos se pesaron y fotografiaron en seis vistas (craneal, caudal, lateral desde los lados izquierdo y derecho, base y ápice). Cada corazón se seccionó transversalmente a través del eje corto ventricular a intervalos de 1 cm hasta el nivel de las válvulas auriculoventriculares y se fotografió (Figura 1). Se pesaron los corazones y se midieron los espesores del VI fijo, del VD y del tabique interventricular (Tabla 1 y Tabla Suplementaria 1). Los corazones fueron evaluados macroscópicamente y en las imágenes para determinar la dilatación subjetiva, la palidez y la mineralización.

FIGURA 1. Imágenes macroscópicas representativas de un corazón con distrofia muscular Golden Retriever que muestran todo el corazón (A), la sección transversal basal con el ventrículo izquierdo y la dilatación del ventrículo derecho (B), y todas las secciones transversales ventriculares (C).

TABLA 1. Promedios de las mediciones cardíacas brutas para la distrofia muscular Golden Retriever (GRMD), perros portadores y normales.

Cada corazón fue seccionado sistemáticamente para su histología. Se tomaron diecisiete secciones del VI (incluido el tabique) para corresponder con la segmentación estándar para imágenes avanzadas (36). Además, se recolectaron cuatro secciones del VD (anterior e inferior según se dispone a nivel basal y medio) y las aurículas izquierda y derecha. El nódulo auriculoventricular se aisló mediante la sección de la unión septal de la aurícula derecha por debajo del agujero oval y la cúspide no coronaria de la válvula aórtica. El nódulo sinoauricular se seccionó en la unión de la vena cava y la aurícula derecha (37). Los casetes de papel tisú que contenían las secciones se fotografiaron como referencia, se incluyeron en parafina y se procesaron de forma rutinaria. Los portaobjetos se cortaron con un espesor de 5-10 m y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómico de Masson. Todas las diapositivas fueron escaneadas digitalmente a los 20 × en un generador de imágenes de diapositivas completas Hamamatsu NanoZoomer 2.0-HT (Hamamatsu Corporation; Bridgewater, Nueva Jersey, Estados Unidos).

Patología microscópica

Las imágenes digitales fueron evaluadas por un solo patólogo (SS) utilizando dos métodos para evaluar la gravedad de la enfermedad. A cada sección se le asignó un grado semicuantitativo para el porcentaje aproximado del área transversal afectada por lesiones histopatológicas, siguiendo generalmente el sistema descrito por Kane et al. (35) (0 = ninguno, 1 = 1-10%, 2 = 11-20%, 3 = 21-30% y 4 >30%) (Figura suplementaria 1). Estas puntuaciones se promediaron entre secciones y grupos para realizar comparaciones estadísticas (Tabla complementaria 2). En un segundo método, los cambios histopatológicos específicos se calificaron como ausentes/presentes, y se hicieron anotaciones para la naturaleza de algunos cambios. Las seis lesiones evaluadas fueron las siguientes: infiltración grasa (ausente/presente), necrosis aguda (ausente/presente), infiltrados inflamatorios (ninguno, principalmente histiocítico o principalmente linfoplasmocítico), mineralización (ausente/presente), vacuolización de la fibra de Purkinje (positiva si el 50% o más del citoplasma total de la fibra se vio afectado por la vacuolización) y la naturaleza de los cambios vasculares (ninguno, fibrosis, hipertrofia de la pared e hipertrofia intimal).

El porcentaje aproximado de secciones examinadas de todo el corazón con las seis lesiones individuales mencionadas anteriormente se puntuó semicuantitativamente utilizando un enfoque «+» modificado, en el que (−) = 0, (−/+) <0,5%, (+) = 0,5-20%, (++) = 20-30%, (+++) = 30-40% y (++++) >40% (Tablas 2, 3). Además, la localización de la lesión primaria dentro de cada segmento se clasificó como subepicárdica (1/3 externa), miocárdica media (1/3 media), subendocárdica (1/3 interna) o panmiocárdica (distribuida uniformemente a lo largo de la pared) (Figura 2).

TABLA 2. Promedios de los cambios histológicos de los grupos.

TABLA 3. Frecuencia de las lesiones en el corazón de cada perro.

FIGURA 2. Representación de las distribuciones de las lesiones fibróticas dentro de la pared ventricular de perros Golden Retriever con distrofia muscular (DMGR) mediante una tinción tricrómica que tiñe el colágeno de azul y las fibras musculares de rojo. (A) El miocardio subepicárdico (machos, 3 años de edad) se ve afectado preferentemente en perros con GRMD (en la imagen) y en niños con distrofia muscular de Duchenne (no en la imagen). (B) Sin embargo, puede predominar el miocardio medio (varón, 4 años). (C) Los cambios subendocárdicos fueron raros y solo se observaron en el ventrículo derecho (mujer, 1 año de edad).

Los portaobjetos tricrómicos se analizaron cuantitativamente para determinar el porcentaje de fibrosis. Los archivos NDPI de cada diapositiva se exportaron como JPEG con un aumento de × 5 utilizando el NDPI to OME-TIFF Converter v1.5 (https://matthias-baldauf.at/software/ndpi-converter/). Estos archivos JPEG se recortaron en Graphic Converter (http://www.graphic-converter.net/) para eliminar secciones de tejido duplicadas y coágulos de sangre grandes. Los JPEG finales se analizaron en ImageJ utilizando macros por lotes (Datos Suplementarios S1) para distinguir el porcentaje de tinción azul del área total con tinción.

Resonancia magnética cardíaca

Algunos perros afectados por GRMD en este estudio formaron parte de un estudio de imágenes de historia natural separado (38) y se evaluó su función cardíaca antes de la recolección patológica. La resonancia magnética cardíaca (RMC) se realizó como se describió anteriormente (38), utilizando una máquina de resonancia magnética 3-T (Siemens 3T Magnetom Verio, Siemens Medical Solutions) mientras los perros estaban bajo anestesia general. Para identificar las lesiones fibróticas, se aplicó realce tardío de gadolinio (LGE) y un método de puntuación semicuantitativo (de 0 a 2; ninguno a realce marcado) para indicar la gravedad de la fibrosis en cada segmento miocárdico como se describió anteriormente (38). El método de segmentación del VI en la RMC fue similar a la segmentación histológica, ambos basados en el mismo estándar de 17 segmentos del VI (36) y modificados para el corazón canino. La distribución de la lesión del VI se comparó entre la RMC y las evaluaciones anatomopatológicas.

Estadística

Se calculó estadística descriptiva para cada variable, incluyendo sexo y edad. Se promediaron las mediciones brutas para los grupos y se compararon las medias con las pruebas t. Se realizó una prueba F de varianza con dos muestras para comparar la variabilidad en las relaciones entre el peso cardíaco (HW) y el peso corporal (PC) entre los grupos. Las secciones del corazón se clasificaron en 25 regiones para realizar comparaciones (como se describió anteriormente, 17 segmentos del ventrículo izquierdo, 4 segmentos del ventrículo izquierdo, aurículas izquierda y derecha, y los ganglios auriculoventricular y sinoauricular). Se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) comparando la media y la desviación estándar del porcentaje de fibrosis y las puntuaciones semicuantitativas de las lesiones en todas las regiones del corazón y comparando el porcentaje de fibrosis entre las muestras de GRMD, portadoras y normales. Se utilizó la regresión logística ordinal para determinar si la variable independiente ordenada, la edad, se asociaba con un aumento en la puntuación semicuantitativa de la lesión de corte transversal. Se calculó el número promedio de secciones con cada una de las seis lesiones individuales detalladas anteriormente, y se utilizó un ANOVA para comparar la frecuencia de cambio entre GRMD, portador y normal, así como entre grupos de edad de GRMD para cada característica. Se calculó una prueba t de muestra independiente que comparó el porcentaje de fibrosis, estratificada por el sexo del perro del que se obtuvo la muestra. Se realizó una regresión logística ordenada, comparando un aumento en las puntuaciones semicuantitativas de la lesión y vasculares. Finalmente, se realizó el análisis de orden de rango de Spearman para evaluar la correlación entre el LGE y las puntuaciones patológicas, y se realizó un ANOVA para comparar el valor medio del porcentaje de fibrosis y las puntuaciones de LGE dentro de las secciones del VI en los corazones de siete perros. Las estadísticas se calcularon utilizando STATA 15 (College Station, TX, EE.UU.) y Microsoft Excel (Redmond, WA, EE.UU.).

Resultados

Hallazgos brutos

No se observaron lesiones macroscópicas en ninguno de los cinco perros afectados menores de 6 m de edad. Los perros mayores tenían múltiples lesiones que variaban en gravedad y distribución. De los perros de 10 a 12 meses de edad, 5/7 tenían cambios macroscópicos, incluyendo palidez y estrías en el VI (3/7) o en el VD (1/7), y 3/7 tenían focos fibróticos o mineralizados en el músculo papilar. Solo 1/7 tenía dilatación concomitante clara del VI y del VD en el examen macroscópico. En los cuatro perros de 12 a 24 m de edad, uno tenía dilatación del VD (1/4) o del VI (1/4). Los diez perros >24 m presentaron cambios macroscópicos, incluyendo dilatación del VI (7/10); dilatación del VD (4/10); dilatación auricular (2/10); paredes ventriculares delgadas (2/10); y palidez y estrías en el VI (6/10), VD (3/10) y tabique (3/10) o palidez con mineralización en el músculo papilar (3/10). En los perros portadores, 4/5 (todos >12 m) presentaron cambios macroscópicos, incluyendo engrosamiento del VI y del tabique (3/5), agrandamiento de la aurícula derecha (1/5) y palidez y estrías del VI y del tabique septal (1/5).

Además, se utilizaron pruebas t para comparar las mediciones brutas medias entre los grupos (Tabla 1). Para las comparaciones de las mediciones de la PC, la pros y la pared ventricular, se excluyeron los perros inmaduros (<6 m), a menos que se indique lo contrario, ya que las relaciones entre la fuerza natural y la propulsión y las relaciones ventriculares difieren incluso entre perros inmaduros normales y adultos (39). Con base en el peso corporal, los sabuesos normales eran significativamente más pesados (25,09 ± 0,09 kg) que los perros portadores (15,32 ± 3,22 kg) o adultos (17,4 ± 6,98 kg; p < 0,001 para ambos); el peso corporal de los perros portadores y adultos de GRMD no fue significativamente diferente. Del mismo modo, el promedio de HW difirió entre los grupos, con GRMD adulto (135,14 ± 41,05 g) < portador (175,6 ± 68,9 g) < normal (210,83 ± 0,05 g) (Tabla 1), pero la disparidad de HW solo fue significativa (p < 0,001) entre normal y GRMD. Para tener en cuenta mejor el efecto del tamaño corporal sobre el peso del corazón, se calcularon las relaciones HW/PC. La relación HW/PV no difirió entre los perros GRMD (8,74 ± 5,33), portadores (12,32 ± 6,44) y normales (8,48 ± 0,10) cuando se compararon todas las edades o cuando se compararon solo perros >6 m (9,27 ± 5,80) (Tabla 1), lo que sugiere que la menor HW en los perros GRMD se debió a su menor estatura. Los resultados para perros individuales se incluyen en la (Tabla suplementaria 1).

Se realizó una prueba F de varianza con dos muestras para comparar la variabilidad en las relaciones HW/BW en los perros. Curiosamente, los perros GRMD >24 m y los portadores >12 m tuvieron una varianza significativamente mayor en la relación HW/BW que los perros normales o los perros GRMD <24 m, lo que refleja la amplia variación fenotípica y la progresión de la enfermedad en perros mayores. En los perros GRMD >24 m, la relación HW/PN osciló entre 5,85 y 31,4 g/kg (Tabla Suplementaria 1), y cuatro perros cayeron muy por encima del rango previamente informado de 4,53 a 10,04 g/kg en perros adultos grandes (39, 40). De manera similar, los 3 perros portadores >24 m (28-76 m) tuvieron relaciones HW/BW más altas de 13,5 a 23,1 g/kg. El peso corporal no difirió entre los perros GRMD >24 m vs. los <24 m de edad, pero el HW fue significativamente mayor en el grupo de mayor edad (169 ± 32,6 vs. 104,4 ± 16,2 g; p < 0,001). Esto sugiere que el aumento de la relación HW/BW es impulsado por un aumento relativo de HW en los perros más viejos.

Al comparar las mediciones entre los grupos, el espesor promedio del VI varió significativamente: DMGR (1,09 ± 0,27 cm) < portador (1,38 ± 0,16 cm) < normal (1,86 ± 0,05 cm) (p < 0,05) (Tabla 1), pero la relación entre el espesor del VD y el espesor del VI no difirieron. De los cinco portadores, cuatro tenían engrosamiento subjetivo de la pared y del músculo papilar en relación con el tamaño del corazón en el examen macroscópico. Sin embargo, al corregir el grosor del VI para el HH general, los grupos no fueron significativamente diferentes (Tabla 1), lo que sugiere que los corazones con paredes más gruesas fueron proporcionalmente más pesados.

Puntuación semicuantitativa de lesiones en perros GRMD

Utilizando imágenes teñidas con H&E y tricrómico, las secciones se puntuaron semicuantitativamente en función del porcentaje total del área de la sección transversal, como lo describen generalmente Kane et al. (35) (0 = ninguno, 1 = 1-10%, 2 = 11-20%, 3 = 21-30% y 4 >30%). Las secciones del corazón se clasificaron en 25 regiones para realizar comparaciones, como se describió anteriormente. Entre los perros con GRMD, las puntuaciones de las secciones individuales variaron de 0,7 (varios sitios) a 1,4 (anterolateral basal). Las puntuaciones para los portadores fueron más bajas, variando de 0,3 a 1,2, y los sitios con mayor/menor afectación no correspondieron al grupo GRMD. Los perros normales tuvieron puntuaciones más bajas, que oscilaron entre 0,1 y 0,7. El área media general de la lesión transversal fue mayor en la GRMD vs. perros normales (1,02 vs. 0,3; p < 0,001). Si bien la puntuación media de los portadores (0,6) fue intermedia, no fue significativamente diferente de la de los perros GRMD o normales. En la evaluación del ANOVA de un factor que comparó la puntuación media del área transversal entre las secciones, ninguna sección tuvo una puntuación significativa mayor o menor en el área transversal. Los valores de los perros individuales y los promedios de las secciones se muestran en la (Tabla complementaria 2).

Se utilizó la regresión logística ordinal para determinar si la variable independiente ordenada, la edad, se asociaba con un aumento en la puntuación semicuantitativa de la lesión. Las puntuaciones de cada sección mostraron una correlación estadísticamente significativa (p < 0,001) con la edad, consistente con la progresión de la enfermedad a lo largo del tiempo.

Infiltración grasa

La infiltración grasa (Figuras 3A, B) se observó con frecuencia en los corazones de los perros portadores y GRMD de mayor edad (Tabla 2). Mientras que el porcentaje de secciones afectadas en cada corazón normal osciló entre 0 y 30%, los perros portadores y GRMD >24 m tenían >50% de secciones que mostraban infiltración grasa y degeneración. En los perros GRMD >24 m, 195/232 (84%) de las secciones examinadas presentaron cambios grasos. Un porcentaje similar de secciones (56/76, 74%) en portadoras también mostraron degeneración grasa, mientras que solo 18/149 (12%) de las secciones normales presentaron esta lesión. Sin embargo, solo las diferencias entre GRMD y perros normales fueron significativas (p < 0,01), probablemente debido al número relativamente bajo de portadores.

FIGURA 3. La infiltración grasa fue una característica prominente en los perros mayores con distrofia muscular Golden Retriever (GRMD). (A) Una sección de la pared libre del ventrículo izquierdo de una perra de 3 años de edad muestra grandes bandas de grasa (tejido vacuolado que no mancha) que reemplaza el músculo miocárdico normal (rojo) y predomina sobre la fibrosis (azul). (B) En algunos casos, la infiltración grasa fue más difusa con grupos individuales o pequeños de células grasas dispersas por todo el miocardio (varón, 1 año de edad). (C) En varios perros, el VD mostró un sorprendente reemplazo miocárdico medio por bandas de grasa con tejido fibrótico mínimo (macho, 3,5 años de edad). En estas secciones teñidas con tricrómicos, las fibras musculares = rojo, el colágeno = azul y las células grasas = tejido vacuolado sin tinción; × 10 aumentos originales.

La infiltración y degeneración grasa aumentó con la edad. No se vio ninguno en ningún perro <6 m. Los perros GRMD >24 m tuvieron una proporción significativamente mayor de secciones con infiltración grasa (84,05%) que cualquiera de los grupos más jóvenes de GRMD (0%, 6 m; 14,75%, 6-12 m; 16,95%, >12-24 m; p < 0,001) (Tabla 2). Lo mismo fue probablemente cierto para los portadores, en los que solo dos secciones en un perro <12 m tenían infiltración grasa, aunque los números eran demasiado pequeños para determinar la importancia. Ningún perro normal medía <22 m; los tres perros de mayor edad presentaron el mayor número de secciones afectadas en este grupo (Tabla 3).

El reemplazo graso del miocardio medio fue una característica prominente en el VD de algunos perros con GRMD (Figura 3C), con solo pequeñas bandas de músculo que quedaban a cada lado de una banda central de tejido adiposo. Este patrón no se observó en el ventrículo izquierdo, donde las áreas irregulares de grasa tendían a rodear los vasos y mezclarse con fibrosis (Figura 3A).

Necrosis aguda

De los 26 perros GRMD, 0/5 <6 m (0%), 5/7 6-12 m (71%), 2/4 12-24 m (50%) y 4/10 >24 m (40%) tenían al menos una sección con necrosis coagulativa aguda (Figura 4). Casi la mitad del número de perros con GRMD con este cambio (5/11) tuvieron tres o más secciones con necrosis aguda. Más de la mitad del número de perros con necrosis aguda (7/11) midió entre 6 y 24 m, lo que apunta a la aparición relativamente temprana de esta lesión. Se encontró necrosis aguda al menos una vez en las 17 secciones del VI y 4 del VD que se examinaron en cada perro, y ninguna sección del corazón tuvo una mayor probabilidad de lesiones. No se encontró necrosis aguda en las aurículas. Por cierto, 3/7 perros normales y 2/5 perros portadores, cada uno >24 m, también tenían al menos una, pero no más de tres, secciones con necrosis miocárdica aguda (Tabla 3).

FIGURA 4. La necrosis miocárdica coagulativa fue una característica en algunos corazones con distrofia muscular Golden Retriever. (A) Las áreas de necrosis coagulativa tipo infarto caracterizadas por la pérdida de detalle citoplasmático y el mantenimiento de la arquitectura tisular (estrellas) están rodeadas por macrófagos y pericitos proliferantes (flechas); H&E, × 5 aumentos. (B) Necrosis coagulativa aguda con pérdida de núcleos y citoplasma hipereosinofílico (células representativas con estrellas); Las células en los márgenes de las lesiones tienen mineralización basófila granular (flechas). Hembra de 1 año, H&E, × 20 aumentos.

Una perra hembra de 12 m de edad tenía secciones marcadamente más afectadas (14/27 segmentos cardíacos) con necrosis miocárdica aguda. Este perro tuvo un incidente de respiración abdominal marcada y orina oscura de causa indeterminada después de la anestesia para el tratamiento de heridas a ~ 6 m de edad. No se documentó hipertermia y la oxigenación de la sangre se mantuvo en el rango normal. Como parte de un estudio no cardíaco, fue sacrificada bajo anestesia a los 12 m de edad.

Inflamación

Las células inflamatorias se observaron en todos los grupos de enfermedad y no difirieron entre las edades, incluso si se excluyeron los perros más jóvenes (Tabla 2). Si bien las puntuaciones generales de inflamación entre los perros normales, GRMD y portadores no difirieron, hubo diferencias en los tipos de células. Los perros normales tenían infiltrados linfoplasmocíticos, con un perro de 46 m de edad con infiltrados en casi todas las secciones examinadas. A pesar de que los perros normales fueron sacrificados por lesiones no cardíacas, dos perros examinados inicialmente para el estudio fueron excluidos debido a la enfermedad de Chagas crónica (Trypanosoma cruzi) detectada histológicamente y por PCR. No se detectó T. cruzi en el resto de los perros, pero la exposición con lesiones asociadas puede explicar la inflamación inesperada en algunos perros de este grupo. Por el contrario, los perros portadores y con GRMD tuvieron pocas secciones con infiltración linfoplasmocítica (cuatro en todos los perros examinados), con inflamación predominantemente histiocítica. La inflamación histiocítica es típica secundaria a la degeneración y a la necrosis aguda, que se produce inicialmente en 48 h y alcanza su punto máximo en torno a los 6 a 10 días, con una resolución lenta a medida que el tejido se remodela (41, 42).

Curiosamente, al comparar los grupos de edad, los perros <6 m tenían significativamente menos secciones con inflamación (sin inflamación) que los perros de 10-12 y >24 m de edad (p < 0,05 y p < 0,01), pero no fueron significativamente diferentes del pequeño grupo de perros de 12 a 24 m de edad. Los perros de 10 a 12 m tendieron a tener secciones más inflamadas que los perros de 12 a 24 m de edad (p = 0,054), mientras que los perros >24 m tuvieron secciones significativamente más afectadas que los perros de 12 a 24 m de edad (p < 0,05). Sin embargo, los perros de 10-12 m y >24 m de edad no difirieron.

Mineralización

No se observó ningún mineral en los corazones de los perros normales. Todos los perros GRMD >10 m tenían mineral en al menos 1 sección, con la excepción de un macho de 17 m de edad que presentaba pocas lesiones de cualquier tipo (Tabla 3). El número promedio de secciones que contienen mineral difirió significativamente (p < 0.05) entre los grupos de edad de GRMD (<6 m: 0 secciones, sin mineral detectable; 6-12 m: 8.4 secciones; 12-24 m: 2 secciones; >24 m: 8.8 secciones). Los números bajos en el grupo de 12 a 24 m probablemente reflejan las lesiones relativamente leves en este grupo de edad en nuestro estudio, ya que se ha demostrado previamente que el grado de mineralización disminuye con la edad (25). Dos de los cinco portadores también tenían mineral en al menos una sección.

Fibras Purkinje

Estudios previos describieron pero no puntuaron la vacuolización de la fibra de Purkinje a partir de menos de 6 m en el corazón GRMD (CXMDJ) (27). También se han descrito cambios degenerativos en las fibras de Purkinje de niños con DMD (43). Puntuamos la vacuolización de la fibra de Purkinje como presente si las vacuolas afectaban al 50% o más del citoplasma total de la fibra (Figura 5). De los 26 perros GRMD, 4/5 (80%) <6 m, 6/7 (86%) 6-12 m, 4/4 (100%) 12-24 m y 7/10 (70%) >24 m tenían al menos un segmento con vacuolización. Los perros GRMD tuvieron un aumento significativo de la vacuolización de la fibra (promedio, 6,9 secciones afectadas; rango, 0-19) en comparación con ambos portadores (1,4 secciones; p < 0,01) y perros normales (1,6 secciones; p < 0,01) (Tablas 2 y 3). La vacuolización de la fibra de Purkinje no difirió entre los perros portadores y normales ni entre los grupos de edad de la cohorte GRMD. A diferencia del estudio anterior de CXMDJ, a algunos perros GRMD no se les detectó vacuolización de la fibra de Purkinje. Además, la vacuolación no se correlacionó con la edad ni con las puntuaciones semicuantitativas o cuantitativas de las lesiones. De hecho, la vacuolización fue marcada en algunos de los perros más jóvenes que, por lo demás, no tenían lesiones. El examen de los portaobjetos H&E no mostró una diferencia visual apreciable en las vacuolas entre los grupos. Los ganglios sinoauricular y auriculoventricular no presentaron anomalías observables con la tinción de H&E o tricrómica.

FIGURA 5. Vacuolización de la fibra de Purkinje (área encerrada en un círculo) (espacios despejados indicados por puntas de flecha) en el corazón de un perro macho Golden Retriever con distrofia muscular Golden Retriever de 18 meses de edad. H&E, × 20 aumentos.

Cambios vasculares

Se evaluaron los cambios vasculares de fibrosis e hipertrofia medial (Figura 6). Los corazones de los perros GRMD <6 m solo tuvieron cambios raros. Los de perros adultos (>6 m) con GRMD tuvieron una frecuencia significativamente mayor de hipertrofia de la pared vascular que los perros normales (5,2 vs. 1,7 secciones; p < 0,01). Aunque los números bajos impidieron la detección de una diferencia entre los perros normales y los portadores, dos de los portadores tenían hipertrofia en el doble de secciones que los perros normales más altos.

FIGURA 6. (A) Aumento del tejido fibroso (azul) en una arteriola de una niña normal de 3 años de edad. Tricrómico, × 5 aumentos. (B) Marcada hipertrofia medial e íntima y proliferación vascular en arteriolas en el corazón de un perro macho Golden Retriever con distrofia muscular Golden Retriever de 6 años de edad. H&E, × 5 aumentos.

La regresión logística ordenada que comparó un aumento en la puntuación transversal semicuantitativa (que no incluyó cambios vasculares) y las puntuaciones vasculares en perros GRMD mostró una asociación altamente significativa entre la hipertrofia arteriolar y un aumento en la puntuación de gravedad semicuantitativa. Por cada aumento de 1 punto en la puntuación vascular, hubo un aumento de 0,32 en la puntuación de gravedad semicuantitativa (puntuación z = 3,91, p < 0,001). Aunque están correlacionados, no está claro si existe una asociación causal o si ambos representan un aumento acumulado de los cambios degenerativos con la edad.

Además, la mineralización aórtica fue una característica prominente en los perros GRMD, con 11/26 con mineralización prominente en la aorta: 0/5 <6 m, 4/7 6-12 m, 1/4 12-24 m y 6/10 >24 m de edad. No se observó mineralización aórtica en los portadores, mientras que 2/7 de los sabuesos normales más viejos tenían depósitos minerales mucho más pequeños en la pared aórtica.

Aunque la hipertrofia endotelial fue descrita por Valentine et al. en un perro, no se detectó en este estudio.

Fibrosis cuantitativa

Se realizó un análisis de varianza para evaluar la relación entre el estado de la enfermedad y el porcentaje de fibrosis del área transversal medido mediante tinción tricrómica. Se incluyeron datos de todos los grupos de edad, incluidos los perros más levemente afectados <6 m. Los tres grupos fueron muy diferentes (p < 0,001), siendo los portadores los que presentaron mayor fibrosis (media: 9,82 ± 1,01% de tinción azul) en comparación con la GRMD (7,84 ± 0,25%), mientras que los perros normales (4,35 ± 0,26%) tuvieron el porcentaje más bajo. Una prueba t independiente no indicó diferencias entre los sexos en la fibrosis.

Además, el grado de tinción de fibrosis difirió significativamente entre los grupos de edad de GRMD según lo determinado por ANOVA de un factor (puntuación f = 15,01, p < 0,001). La prueba post-hoc de Tukey reveló que el valor medio a los 6-12 m (5,38 ± 3,54%) fue significativamente menor que el de todos los demás grupos (p < 0,05) y que el grupo de 12-24 m tuvo el mayor grado de fibrosis (9,80 ± 8,31%), siendo superior incluso al grupo >24 m (8,28 ± 5,23%; p < 0,05). Los valores más bajos en los perros más viejos podrían reflejar mayores depósitos de grasa, que no se detectan por este método, con una fibrosis proporcionalmente menor.

El ANOVA de un factor mostró una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos (puntuación f = 7,64, p < 0,001) para el grado de tinción de fibrosis en las secciones de 17 VI y 4 RV de perros con DMGR. La prueba post-hoc de Tukey reveló que las secciones del VD tenían los niveles más altos de fibrosis en comparación con las otras secciones, pero eran similares entre sí (p < 0,001). La sección anterolateral del VI medio tuvo una fibrosis significativamente menor que las otras secciones.

Localización de lesiones dentro de la pared

Estudios previos de GRMD (25) y DMD (4) describen una miocardiopatía difusa con localización subepicárdica a veces prominente de fibrosis y otras lesiones. La localización predominante en cada sección fue principalmente subepicárdica, miocárdica media, subendocárdica o transmural (distribución uniforme a lo largo de la pared miocárdica) (Figura 2). De acuerdo con las observaciones previas, las lesiones degenerativas se concentraron inicialmente en la mitad externa del miocardio (el subepicardio y el miocardio medio o la porción del VD de la pared del tabique). En los perros de mayor edad, más secciones tenían lesiones transmurales, como podría esperarse en una enfermedad progresiva. En general, los cortes basales del VI tenían un mayor grado de lesiones externas (o subepicárdicas), mientras que el VD y las porciones más apicales tenían una distribución más difusa/transmural en general o, como se describió anteriormente, una distribución miocárdica media prominente, particularmente en el VD más apical.

Correlación con la RTG en la resonancia magnética cardíaca

La correlación de los hallazgos histológicos específicos con las imágenes diagnósticas es el objetivo final para realizar un mejor seguimiento de la progresión de la miocardiopatía. La RMC con realce tardío de gadolinio es una modalidad común para la evaluación clínica de la miocardiopatía en la GRMD y la DMD (44). Ocho perros GRMD en este estudio formaron parte de nuestro estudio de historia natural de imágenes cardíacas (38), y siete de ellos tenían suficientes exploraciones de imágenes de LGE dentro de los 7 días anteriores a las colecciones de corazón, lo que permitió una comparación retrospectiva con los resultados patológicos (los datos preliminares de un perro se informaron previamente, incluida una comparación visual representativa de macroscopios, Resonancia magnética e imágenes histológicas) (38). Con el fin de evaluar la correlación entre el LGE y la evaluación patológica dentro de cada sección del corazón en los siete perros, se realizó el análisis de orden de rango de Spearman. Las observaciones sin un par entre los enfoques se eliminaron del análisis. Esta prueba no paramétrica reveló una relación monótona altamente significativa (p < 0,0001) entre estos dos métodos, con un coeficiente de relación moderadamente positivo de 0,44. Las puntuaciones de LGE y patología semicuantitativa para cada sección aumentaron juntas, mostrando una consistencia entre las evaluaciones de imagen y anatomopatológicas. El porcentaje de fibrosis también se comparó con las tres categorías de LGE en las mismas secciones (N = 107) mediante la realización de un ANOVA de un factor. El ANOVA de un factor no produjo resultados estadísticamente significativos (p = 0,493). Si bien hubo un ligero aumento en el porcentaje de fibrosis en la categoría más alta de LGE, es probable que esto se deba a un aumento en los hallazgos dentro de esta categoría en comparación con otros grupos. Con base en este análisis, no existe una correlación clara entre estas variables.

Discusión

La enfermedad miocárdica en la DMD se define clásicamente como una miocardiopatía dilatada con VI más pronunciada vs. Lesiones y cambios funcionales del VD (4-6). Los estudios previos de la miocardiopatía GRMD han estado limitados por el número de perros estudiados o por las secciones anatómicas evaluadas (25, 26). En este trabajo se describen las lesiones macroscópicas e histológicas a lo largo del corazón en una gran cohorte de perros con GRMD de edades comprendidas entre los 3 y los 76 m. Al igual que en los estudios anteriores más limitados, no se observó un aumento general de la relación HW/PC, típicamente asociada con la miocardiopatía hipertrófica. Sin embargo, las relaciones HW/BW de algunos GRMD y perros portadores fueron de 3 a 4 veces más altas que el rango normal (39, 40). Si bien la disminución del peso corporal debido a la atrofia muscular en los perros con DMGR podría contribuir al aumento de la relación HW/PC, hubo poca diferencia en el peso corporal entre los grupos. Por otro lado, el HW aumentó en los perros más viejos y en los perros portadores. Además, el HW no se correlacionó directamente con la edad en los perros adultos. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que las proporciones elevadas de HW/BW en corazones afectados y portadores ocurrieron debido a la hipertrofia cardíaca excéntrica como se informó previamente en nuestros perros (38) y se observó en miocardiopatía dilatada canina (45), ratones mdx (46) y en algunos estudios de portadores de DMD (47) y niños con DMD (48, 49).

La fibrosis es el principal cambio patológico en la miocardiopatía por DMD, que ocurre inicialmente en la porción posterobasal de la pared libre del ventrículo izquierdo y se extiende al tercio externo y, finalmente, a todo el ventrículo izquierdo y al tabique (4, 22). El ventrículo derecho puede estar dilatado pero, en general, está libre de fibrosis. Los perros GRMD de este estudio también tenían lesiones pronunciadas en el VI, pero a diferencia de la DMD, el VD también estaba muy afectado, aunque a menudo con más cambios grasos que fibróticos. Las lesiones cardíacas en la DMD son consistentemente más pronunciadas en el subepicardio, con preservación de las fibras musculares más cercanas a la cámara ventricular izquierda. Este también fue el caso en los perros GRMD estudiados aquí, pero no detectamos la concentración posterobasal distintiva observada con las lesiones tempranas de DMD, sino que encontramos cambios más difusos. En particular, la afectación de los músculos papilares y el área posterobasal explica la insuficiencia de la válvula mitral en la DMD (50). Los músculos papilares en los perros con GRMD también se vieron muy afectados, aunque no pudimos relacionar esto con la disfunción de la válvula mitral.

Al igual que en otros estudios (25, 26, 29) que evaluaron cambios histopatológicos específicos, la gravedad de la lesión tendió a aumentar con la edad. A pesar de esta tendencia general, algunos perros de edad avanzada presentaban pocas lesiones, si es que las tenían (Tabla 3), en consonancia con la marcada variación fenotípica observada en la miocardiopatía por DMD (51, 52). Los corazones portadores tenían niveles más bajos de afectación, y los perros normales tenían las puntuaciones más bajas. La falta de asociaciones regionales en nuestro estudio puede deberse a que los perros fueron evaluados en un solo momento en lugar de longitudinalmente. El hecho de que muchos de nuestros perros fueran mayores y tuvieran lesiones en todas las secciones examinadas y que hubiera relativamente pocos perros en el grupo de rango de edad potencialmente crítico de 12 a 24 m también puede haber impedido la detección de diferencias regionales en el desarrollo de lesiones. Dicho esto, nuestro estudio tuvo una clara ventaja en el sentido de que se incluyeron corazones de perros de muchas edades y etapas de progresión de la enfermedad, mientras que en la DMD, la biopsia cardíaca de rutina no se realiza comúnmente, y las autopsias también son poco comunes, lo que puede causar que se pasen por alto las lesiones fuera de la fibrosis crónica.

Al cuantificar la fibrosis mediante la tinción tricrómica en perros adultos (>6 m), los que estaban a 6-12 m tenían significativamente menos fibrosis que cualquiera de los dos grupos de mayor edad. Inesperadamente, los perros >24 m tenían menos tinción cuantitativa de colágeno que los de 12 a 24 m, a pesar de que la mitad de estos perros más jóvenes tenían lesiones relativamente leves. El porcentaje proporcionalmente menor de tinción de colágeno puede haber ocurrido porque las lesiones, como la infiltración grasa, la fibrosis no compacta y la mineralización, no se tiñen con los métodos utilizados, y la grasa, en particular, aumentó en los perros más viejos. Es importante destacar que esto demuestra que los métodos dirigidos únicamente a la detección de la fibrosis pueden subestimar la gravedad fenotípica en perros mayores con GRMD. La puntuación semicuantitativa del área total de la lesión transversal y los porcentajes de secciones que mostraban varias lesiones demostraron más claramente una fuerte correlación con la edad y la progresión de la enfermedad. Esta puntuación también puso de manifiesto la gran variación fenotípica de las lesiones cardíacas en los perros con DMGR, similar a la variación de la enfermedad del músculo esquelético (2). En particular, un varón de 17 m de edad no presentaba lesiones cardíacas. En este caso, todas las tareas de puntuación semicuantitativa fueron realizadas por un solo patólogo. Es probable que este método tenga una mayor variabilidad entre operadores, lo que lo hace poco confiable para comparar los resultados entre estudios sin un acuerdo más sólido sobre la puntuación. Tener varios intérpretes para cada diapositiva con una puntuación de consenso probablemente mejoraría la reproducibilidad de los resultados.

Incluso más que la fibrosis, la infiltración grasa fue una característica de la progresión de la miocardiopatía en perros mayores con GRMD. Si bien se puede observar cierta infiltración de grasa con el envejecimiento normal, este cambio fue particularmente pronunciado en los perros GRMD, como se observa con otras miocardiopatías caninas crónicas (45, 53-56). La metaplasia lipomatosa (grasa) también se observa con afecciones degenerativas crónicas en el corazón de perros y humanos, con mayor frecuencia con miocardiopatía isquémica crónica y reemplazo de cicatrices isquémicas (57, 58), con una mayor propensión asociada a taquicardia ventricular y arritmias (53, 59). Aunque no podemos descartar una respuesta específica a la deficiencia de distrofina, la aparición de un cambio graso similar en una variedad de enfermedades sugiere que se trata de una reacción general a la degeneración y remodelación miocárdica crónica.

Curiosamente, se observó necrosis coagulativa en algunos perros con GRMD en ausencia de trombosis vascular. La severidad de estos cambios se correlacionó con el grado de engrosamiento vascular. Dado que el suministro vascular coronario a los ventrículos difiere entre el perro y el hombre (60), es difícil hacer inferencias con respecto a la patogénesis de la enfermedad cardíaca con DMD. Sin embargo, hemos visto previamente un síndrome de infarto agudo de miocardio en perros con DMG (61) que parece análogo a una afección en DMD (62). Esto ha llevado a especular que los cardiomiocitos deficientes en distrofina están operando en un estado de hipoxia funcional (61, 63, 64) y que un músculo deficiente en distrofina tiene una capacidad reducida para compensar el aumento de las demandas metabólicas (65, 66). La necrosis coagulativa se asocia con anoxia/hipoxia, que a menudo ocurre después de la isquemia, el infarto o la toxicosis. Las lesiones se detectan histológicamente a las ~12-24 h después del evento, se infiltran en láminas de macrófagos dentro de las 48-72 h y contienen focos de proliferación vascular y de células intersticiales entre 10 días y 6 semanas (41, 42). Encontramos cada una de estas lesiones en todos los grupos de edad de GRMD mayores de 6 m, de acuerdo con el rango completo de necrosis cardíaca y cicatrización descrito por Malvestio et al. (29). Teniendo en cuenta que la trombosis vascular no es una característica de la DMD/GRMD, es más probable que estos cambios ocurran como consecuencia de la hipoxia no oclusiva. Extendiendo la importancia potencial de la enfermedad vascular/hipóxica en la miocardiopatía GRMD, también encontramos una correlación positiva entre la hipertrofia arteriolar y las puntuaciones semicuantitativas de lesiones transversales más graves. Los ratones mdx deficientes en distrofina también tienen una mayor formación de neointimal, con engrosamiento de la pared y lúmenes estrechos debido a la proliferación del músculo liso vascular (67). En principio, estos cambios podrían ocurrir debido a lesiones degenerativas crónicas en el músculo liso deficiente en distrofina y podrían ser un factor en el síndrome miocárdico agudo que se observa en la DMD/GRMD. Si bien el aumento del grosor de la pared y el tejido conectivo son un cambio de envejecimiento reportado en las arteriolas cardíacas de los perros senescentes (68), los perros normales en este estudio tenían significativamente menos hipertrofia de músculo liso que los perros GRMD, lo que indica que este cambio es parte de la progresión de la enfermedad.

Se ha demostrado que la deficiencia de distrofina en el músculo liso vascular tanto en ratones mdx como en perros GRMD tiene consecuencias funcionales, incluida la alteración de la vasoregulación simpática y la reducción de la atenuación de la vasoconstricción durante la contracción (67, 69-72). Esto se debe en parte a la pérdida de nNOS sarcolemal en el músculo esquelético y cardíaco, lo que conduce a una disminución de la vasodilatación inducida por el óxido nítrico. Sin embargo, la expresión selectiva de distrofina en el músculo liso vascular rectificó parcialmente las respuestas vasorreguladoras (72) en ratones mdx, lo que sugiere que la distrofina del músculo liso puede tener un papel funcional primario en la vasorregulación. En combinación con los tipos de degeneración observados en los corazones de los perros GRMD de nuestro estudio, estos cambios vasculares podrían apoyar la hipótesis de los «dos golpes» para las lesiones en la deficiencia de distrofina (73), con isquemia funcional relacionada con una vasoregulación alterada combinada con una mayor susceptibilidad al estrés metabólico que conduce a una supervivencia alterada de los cardiomiocitos.

Las anomalías estereotipadas del ECG son comunes en los pacientes con DMD y GRMD. Los cambios degenerativos descritos en las fibras de Purkinje de los niños afectados (43) y de los perros (27) se han propuesto como un posible factor contribuyente. Urasawa et al. (27) describieron una marcada vacuolación anormal en las fibras de Purkinje asociada con cambios degenerativos ultraestructurales en beagles jóvenes cruzados con la mutación GRMD (CXMDJ). También detectamos un aumento de la vacuolización de la fibra de Purkinje, comenzando con los perros más jóvenes con GRMD, aunque esta lesión no estaba presente en todos los perros con GRMD, y los perros normales también tenían vacuolización de la fibra de Purkinje. Curiosamente, los perros portadores de este estudio no tenían vacuolización de la fibra de Purkinje, a pesar de que también tienen anomalías en la conducción (35). Además, el grado de vacuolación no se correlacionó con la gravedad de la lesión transversal en nuestros perros. Debido a la naturaleza retrospectiva de este estudio, no se dispuso de ECG para correlacionar la gravedad vacuolar con las diferencias de conducción o arritmia.

El patrón de cambios en la RMC en los pacientes con DMD tiende a ser paralelo a la distribución de los cambios histopatológicos, comenzando en la pared basal y subepicárdica posterior del VI (44). A pesar de que la calidad de las imágenes de la LGE fue insuficiente para localizar las lesiones en la región subepicárdica, los resultados anatomopatológicos fueron consistentes con los hallazgos de la LGE. Además, las evaluaciones semicuantitativas de la puntuación histopatológica de la lesión y la gravedad de la RTG se correlacionaron fuertemente, lo que valida aún más la asociación entre nuestros hallazgos patológicos y de RMC. Por el contrario, el porcentaje cuantitativo de fibrosis no se correlacionó con la LGE. Al igual que con los cambios en las fibras de Purkinje, no tuvimos la oportunidad de determinar si había una asociación entre los hallazgos del ECG, como la aparición de ondas Q profundas, con la fibrosis septal. Esto requeriría un estudio prospectivo longitudinal detallado.

Si bien los datos reportados aquí ampliaron sustancialmente los estudios patológicos previos de la miocardiopatía GRMD, las limitaciones incluyeron la incapacidad de emparejar perfectamente la edad de los perros en todos los grupos de enfermedades, el bajo número de perros portadores, la variación en la gravedad fenotípica y la necesidad de usar corazones de control normales de perros fuera de la colonia. La disponibilidad cardíaca y la edad en todos los grupos de enfermedades se vieron limitadas por la disponibilidad de perros que murieron por otras razones. Dado que los perros portadores y normales son sacrificados con poca frecuencia a edades tempranas, estos grupos, en particular, carecían de controles exactos de la misma edad. Aquí, evaluamos una cohorte separada de perros sabuesos fuera de nuestra colonia. Aunque se esperarían diferencias mínimas entre los corazones de los perros normales dentro y fuera de la colonia, el alojamiento y el manejo variables podrían haber alterado el fenotipo cardíaco, por ejemplo, se excluyeron dos perros debido a la enfermedad de Chagas confirmada por PCR, lo que sugiere que todos los perros normales pueden haber estado expuestos a infecciones no presentes en nuestra colonia. Eso también puede explicar la inflamación linfoplasmocítica inesperada en algunos corazones de este grupo.

Al igual que en estudios anteriores, la patología cardíaca fue limitada o ausente en nuestros perros con GRMD <6 m, y tampoco se esperarían cambios en perros normales, por lo que la incapacidad de comparar directamente probablemente tuvo un impacto mínimo. Los perros portadores que no se utilizan para la cría son adoptados rutinariamente fuera de la colonia, lo que limita nuestro acceso al tejido de este grupo. Los números más bajos dificultaron nuestra capacidad para detectar la significación entre este grupo de enfermedades y el GRMD y los perros normales; Sin embargo, las tendencias son intrigantes y se justifican más estudios.

Las conclusiones extraídas de los estudios no longitudinales también están siempre limitadas por la variación fenotípica en la expresión de la enfermedad entre los perros. En nuestra cohorte, tuvimos un número bajo de perros y un alto grado de variación fenotípica en el rango de edad aparentemente crítico de 6 a 12 m, mientras que el grupo de 12 a 24 m parecía tener una gravedad general más leve, incluido un perro sin lesiones. Esto probablemente confundió las diferencias entre los grupos de edad. La enfermedad leve o no detectable en perros de esta edad que no habían recibido ningún tratamiento específico para el corazón pone de manifiesto la importancia de no depender de un solo animal para determinar los efectos del tratamiento.

Este estudio proporciona la mayor revisión patológica e histopatológica macroscópica de la miocardiopatía GRMD hasta la fecha. Nuestros hallazgos resaltan las diferencias en la gravedad de la enfermedad y sugieren que la puntuación semicuantitativa es preferible a la cuantificación de la fibrosis para evaluar la gravedad general de la lesión. La enfermedad es universalmente progresiva, pero debido a la dificultad de detectar lesiones pre-mortem tempranas, todavía existe debate sobre la secuencia de progresión de la lesión cardíaca en la DMG y, por extensión, en la DMD. Con base en los hallazgos publicados anteriormente y los resultados reportados aquí, sugerimos que dos factores interactúan entre sí. Las deficiencias metabólicas subyacentes en el músculo cardíaco, como la desregulación del calcio, la fragilidad de la membrana, la mala respuesta a la hipoxia y las anomalías mitocondriales, colocan a las fibras bajo una tensión metabólica constante. Con el tiempo, esto puede conducir a la necrosis de fibras individuales, mineralización y abandono, con transición grasa en algunas fibras, particularmente en áreas de tensión (es decir, pared basoinferior del VI). Además, el estrés episódico ante los cambios vasculares que hemos descrito podría producir infarto no trombótico y pérdida de focos mayores de miocardio compatibles con grandes lesiones agudas/subagudas en algunos perros. Los episodios secuenciales de daño pueden dar lugar a un ciclo escalonado de daño, reparación y estabilización, con aumento de la tensión, metaplasia grasa y disminución de la reserva con el tiempo.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

Declaración de Ética

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas A&M.

Contribuciones de los autores

SS, JK, BW y L-JG contribuyeron a la concepción y diseño del estudio, incluyendo protocolos de recolección de muestras. El SS y el peso corporal contribuyeron a la interpretación de los cambios histológicos. SS desarrolló las categorías de interpretación, recogió los corazones y las muestras, escribió el primer borrador y las principales revisiones del artículo, y escaneó y leyó las diapositivas. SF desarrolló la macro Image J. SF y SS recogieron los datos de la imagen J. L-JG realizó las imágenes de RMC, la recopilación de datos de LGE y la interpretación. GS realizó el análisis estadístico. SS, JK, GS y L-JG escribieron secciones del documento. Todos los autores contribuyeron a la revisión del manuscrito y leyeron y aprobaron la versión enviada.

Financiación

Este trabajo fue parte de la tesis doctoral de SS, apoyada por una beca de la Fundación Zoetis-Morris Animal (subvención número D14CA-903). El escaneo digital de portaobjetos contó con el apoyo del generoso equipo compartido por el GI Lab de la Universidad de Texas A&M. Amanda Bettis y Heather Heath-Barnett se encargaron del cuidado dedicado de los perros y del mantenimiento de la colonia.

Conflicto de intereses

JK reporta honorarios personales de Solid Biosciences como consultor remunerado, fuera del trabajo presentado.

El resto de los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o afirmación que pueda ser hecha por su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

Material complementario

El material complementario para este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.759585/full#supplementary-material

Referencias