Diverzita anaerobních nálevníků

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra zoologie Diverzita anaerobních nálevníků Diversity of anaerobic ciliates Bc. Ludmila Nováková Diplomová práce Školitel: RNDr. Ivan Čepička, Ph.D. Praha, 2011

2 Prohlášení: Prohlašuji, ţe jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a ţe jsem uvedla všechny pouţité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předloţena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, Ludmila Nováková 2

3 Na tomto místě bych chtěla poděkovat svému školiteli RNDr. Ivanu Čepičkovi, Ph. D. za pomoc a uţitečné rady při psaní mé diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Mgr. Elišce Ptáčkové a Mgr. Pavle Smejkalové za pomoc a připomínky k této práci, lidem z laboratoře za vytvoření příjemné atmosféry na pracovním prostředí a všem sběračům materiálu, protoţe bez nich by tato práce nemohla vzniknout. V neposlední řadě chci poděkovat svým rodičům za to, ţe mě celou dobu podporovali. 3

4 Obsah Abstrakt... 6 Abstract Úvod a cíle Literární přehled Obecná charakterizace nálevníků Systém a fylogeneze nálevníků Anaerobní nálevníci Třída Armophorea Třída Litostomatea Třída Plagiopylea Třída Oligohymenophorea Třída Prostomatea Ekologie anaerobních nálevníků Volně žijící anaerobní nálevníci Nálevníci gastrointestinálního traktu Balantidium coli jako patogen Hydrogenosom Hydrogenosom nálevníka druhu Nyctotherus ovalis Metanogenní endosymbionti Materiál a metody Kultivace anaerobních nálevníků a získávání nových izolátů Složení a příprava používaných médií Příprava umělého anaerobního prostředí Získávání nových izolátů Kultivace anaerobních nálevníků Izolace DNA Amplifikace a elektroforéza DNA Amplifikace DNA Elektroforéza amplifikované DNA Purifikace PCR produktů Klonování Příprava ligační směsi

5 Příprava bakteriálních kolonií Příprava směsi na potírání Petriho misek Colony PCR Izolace plasmidů Sekvenace DNA Vyhodnocování sekvencí a fylogenetická analýza Tvorba a úprava alignmentu Tvorba fylogenetických stromů Morfologie Výsledky Izoláty Fylogenetická analýza Třída Armophorea Třída Plagiopylea Rod Cyclidium LIVADIAN Ostatní nálevníci Morfologie Diskuse Kultivace Diverzita anaerobních nálevníků Třída Armophorea Třída Plagiopylea Rod Cyclidium LIVADIAN Morfologie Závěrečné shrnutí Seznam literatury

6 Abstrakt Nálevníci (Ciliata) jsou jednobuněčné eukaryotické organismy patřící do skupiny Alveolata. Dělí se na jedenáct tříd. Z toho se anaerobní/mikroaerofilní zástupci nacházejí ve třídách Armophorea, Litostomatea, Plagiopylea, Oligohymenophorea a Prostomatea. Anaerobní nálevníci mají mitochondrii redukovánu na hydrogenosom. V jejich cytoplasmě je okolo hydrogenosomů přítomno veliké mnoţství metanogenních symbiontů. Anaerobní nálevníci jsou významní producenti metanu a jsou jak volně ţijící, tak endobiotičtí (komenzálové, mutualisti či paraziti v zaţívacím traktu mnohých ţivočichů včetně člověka). Podle dosud publikovaných studií se dá usuzovat, ţe diverzita anaerobních nálevníků je malá. Je to dáno tím, ţe se do fylogenetických studií zařazují pouze sekvence určených nálevníků a vynechávají se environmentální sekvence. Cílem této práce bylo získat sekvenční data co nejvíce volně ţijících anaerobních nálevníků. Dohromady byly získány sekvence SSU rdna 32 izolátů sladkovodních i mořských anaerobních nálevníků. Fylogenetická analýza ukázala, ţe většina jich patří do tříd Armophorea, Plagiopylea a Oligohymenophorea, kde tvoří několik samostatných fylogenetických linií. Kmen LIVADIAN společně s rody Paraspathidium, Askenasia, Urotricha, Cryptocaryon a nekultivovanými nálevníky náleţí do třídy Prostomatea a nachází se v blízkosti třídy Plagiopylea. Třída Plagiopylea bude nejspíš také patřit do třídy Prostomatea a nebude tak dále tvořit samostatnou třídu nálevníků. Klíčová slova: anaerobióza; Armophorea; hydrogenosom; metanogenní symbionti; nálevníci; Oligohymenophorea; Plagiopylea; Prostomatea; SSU rdna 6

7 Abstract Ciliates (Ciliata) are single-celled eukaryotic organisms belonging to the large group Alveolata. Ciliates are classified to eleven classes. Anaerobic/microaerophilic representatives belong to classes Armophorea, Litostomatea, Plagiopylea, Oligohymenophorea, and Prostomatea. The mitochondrion of the anaerobic ciliates has been tranformed to hydrogenosome. The anaerobic ciliates are characteristic for the presence of methanogenic symbionts in the cytoplasm near hydrogenosomes. Anaerobic flagellates are free-living or they live as commensals, mutualists or parasites in the digestive tract of animals including humans. The true diversity of anaerobic ciliates is still not fully understood. The reason is that only sequences of described ciliate species are usually included into phylogenetic analyses. However, many environmental sequences representing considerable part of known molecular diversity of ciliates have been published as well. The aim of this work was to obtain and analyze sequence data of anaerobic free-living ciliates. We have determined SSU rdna sequences of 32 different freshwater and marine strains of ciliates. Phylogenetic analyses showed that the strains belonged mostly to the classes Armophorea, Plagiopylea and Oligohymenophorea. The strain LIVADIAN belonged, together with genera Paraspathidium, Askenasia, Urotricha, Cryptocaryon, and several environmental sequences, to the class Prostomatea. Our data also suggested that the Plagiopylea likely belongs to the class Prostomatea as well, instead of representing an independent ciliate class. Key words: anaerobiosis; Armophorea; ciliates; hydrogenosome; methanogenic symbionts; Oligohymenophorea, Plagiopylea, Prostomatea, SSU rdna 7

8 1. Úvod a cíle Nálevníci (Ciliophora) jsou jednou z nejznámějších skupin prvoků. Do dnešní doby jich bylo popsáno něco okolo 3500 druhů, ale očekává se, ţe jich ve skutečnosti existuje aţ druhů. Většina nálevníků ţije volně ve vodě nebo ve vlhkém prostředí, kde se ţiví bakteriemi. Díky tomu přispívají k regulaci početního stavu bakterií v přírodě a jsou důleţitými indikátory organického znečištění vody. Podle přítomnosti určitých druhů nálevníků můţeme odhadnout stupeň znečištění. Dále byly popsány druhy nálevníků, které ţijí v zaţívacím traktu mnohých skupin ţivočichů. Většina těchto endosymbiotických druhů jsou mutualisté nebo komenzálové a svým hostitelům nezpůsobují ţádné zdravotní obtíţe. Na rozdíl od těchto neškodných nálevníků známe i některé druhy, které mohou výrazně poškozovat své hostitele. Mezi nejznámější patogeny patří Ichthyophthirius multifiliis a Balantidium coli. Anaerobní nálevníci mohou ţít pouze v prostředí, kde se nevyskytuje kyslík nebo je ho tam velmi málo. Byl u nich objeven hydrogenosom, anaerobní derivát mitochondrie, jehoţ metabolickým produktem je mimo jiné vodík. Předpokládá se, ţe společný předek všech nálevníků byl původně aerobní a k přechodu na anaerobní způsob ţivota došlo během evoluce nejméně čtyřikrát. Anaerobní nálevníky nalezneme v třídách Armophorea, Litostomatea, Plagiopylea, Prostomatea a Oligohymenophorea. Do dnešní doby stále převládá názor, ţe diverzita těchto organismů je nízká. My si myslíme pravý opak, proto jsme se zaměřili na studium diverzity anaerobních nálevníků. Cíle diplomové práce: 1. Kultivace izolátů anaerobních nálevníků získaných ze sbírek na PřF UK. 2. Získat vlastní kultury různých skupin anaerobních nálevníků. 3. Určit sekvence genu pro SSU rrna co nejvíce izolátů anaerobních nálevníků a provést fylogenetické analýzy. 4. Prozkoumat molekulární a morfologickou diverzitu jednotlivých izolátů. 8

9 2. Literární přehled 2.1. Obecná charakterizace nálevníků Nálevníci (Ciliophora) společně s výtrusovci (Apicomplexa), obrněnkami (Dinoflagellata) a malými skupinami Perkinsea, Chromerida a Colpodellidae náleţí do jedné velké skupiny Alveolata (Fast et al. 2002; Leander a Keeling 2003; Mylnikov 2009; Weatherby et al. 2011). Její název vychází z toho, ţe výše zmíněné kmeny mají pod plazmalemou systém kortikálních alveolů. Alveoly dodávají buňce pevnost a pruţnost a také zajišťují stabilitu jejího povrchu (Fast et al. 2002). U nálevníků zde dále probíhá regulace obsahu vápníku v buňce (Plattner a Klauke 2001). Někdy mohou býtv alveolech bílkovinné (např. u rodu Euplotes) nebo zvápenatělé polysacharidové pláty (např. u rodu Coleps), které kortikální vrstvu zpevňují (Lynn a Small 2002). Skupina nálevníků je charakterizována především třemi hlavními rysy. Jsou to specifická stavba kortexu, přítomnost dvou typů jader a konjugace (typ pohlavního rozmnoţování). Kortex (viz obr. 1) je 1 4 μm silná podpovrchová vrstva, která pomáhá udrţovat relativně stálý tvar těla. Skládá se ze dvou částí: z pelikuly a z infraciliatury tvořené cytoskeletem asociovaným s bazálními tělísky bičíků (kinetidovými kořeny). Základní sloţkou infraciliatury jsou kinetidy, které se skládají z bazálních tělísek bičíků (kinetosomů) a z několika přidruţených kořenových struktur. Kinetosomy většinou nesou bičík a jsou navzájem propojeny bazálními mikrotubulárními pásy. Kinetida můţe mít buď jedno bazální tělísko (monokinetida), dvě bazální tělíska (dikinetida) či více bazálních tělísek (polykinetida). Přidruţené kořenové struktury tvoří kinetodesmální fibrily a dva mikrotubulární pásy (transverzální a postciliární). Podle umístění na buňce nálevníka a funkce můţeme rozlišit ciliaturu dvojího typu: somatickou (pohybová a senzorická funkce) a orální (získávání a zpracování potravy). Somatická ciliatura bývá sloţena z monokinetid, dikinetid nebo polykinetid. Obvykle se vyskytuje na celém povrchu těla kromě ústního otvoru. Tyto kinetidy jsou uspořádány do podélných pásů, kinet. Ty vedou od předního konce k zadnímu. Kinety se mohou na pravé a levé straně sbíhat a vytvářet suturu, která je buď perorální, nebo postorální. Jedná se o dlouhou mezeru v celistvém uspořádání kortexu a probíhá zde příjem a výdej látek. V některých případech mohou být polykinetidy umístěny těsně u sebe a jejich bičíky mohou vytvářet ciry, struktury slouţící ke kráčivému pohybu. Orální ciliatura je také tvořena monokinetidami, dikinetidami nebo polykinetidami. Orální kinetidy jsou navzájem spojeny mikrotubuly a mikrofilamenty a společně s cytostomem a cytofaryngem vytváří 9

10 orální aparát. Pomocí cytostomu, který je umístěn apikálně nebo ventrálně, přijímají nálevníci potravu. Ta poté putuje přes cytofarynx do potravní vakuoly, v níţ dojde k jejímu zpracování. Zbytky nestrávené potravy pak putují ven cytoproktem (Lynn a Small 2002; obr. 2). V některých případech mohou cilie vytvářet jednotky rozprostřené do plochy, tzv. membranely. Ty nálevníkovy slouţí k zajištění víření částeček potravy (Lynn a Small 2002). Obr. 1. Schéma ultrastruktury kortexu typického nálevníka (podle Lynn a Small 2002). 10

11 Obr. 2. Schéma buňky nálevníka. (podle Lynn a Small 1990). V kaţdé buňce nálevníka nalezneme dva typy jader: jeden nebo několik malých mikronukleů a jeden nebo více velkých makronukleů. Mikronukleus, generativní jádro, je diploidní a transkripčně téměř neaktivní. Jeho hlavní role spočívá v předávání genetické informace do dalších generací. Dále se uplatňuje při konjugaci a vzniká z něho makronukleus. Mikronukleus obsahuje normální eukaryotické chromozomy a během dělení se vytváří intranukleární dělicí vřeténko. Mikronukleus se dělí uzavřenou mitózou nebo meiózou. Na rozdíl od mikronukleu je makronukleus, somatické jádro, vysoce polyploidní pro část genomu, ale určité úseky genomu vůbec neobsahuje. Probíhá zde masivní syntéza mrna. Tvarově mohou být makronukley velmi proměnlivé (zaokrouhlené, větvené, růţencovité atd.) (Lynn a Small 2002). U makronukleu při dělení nenalezneme typické dělící vřeténko a kondenzované chromozomy. Makronukleus se vyvíjí z mikronukleu a dělí se tzv. amitózou. I kdyţ se při amitóze nevytváří dělicí vřeténko, byly v makronukleu objeveny vnitro- 11

12 (Intramacronucleata) nebo mimojaderné (Heterotrichea) mikrotubuly a γ-tubulin, který se vykytuje v mikrotubulárních organizačních centrech (Kushida et al. 2011). Průběh amitózy je znázorněn na obr. 3. Makronukleus třídy Karyorelictea se nedělí. Obr. 3. Průběh amitózy u nálevníka rodu Tetrahymena. (podle Kushida et al. 2011). Kromě nepohlavního rozmnoţování (příčné dělení) se mohou nálevníci rozmnoţovat i pohlavním procesem zvaným konjugace. Při konjugaci dochází ke spojení dvou buněk stejného druhu a ke vzájemné výměně haploidních jader (pronukleů), které vznikly z mikronukleů. Po skončení této migrace se nálevníci od sebe odpojí. Díky konjugaci vznikají nové, vegetativně se mnoţící klony (Lynn a Small 2002) Systém a fylogeneze nálevníků Systém nálevníků se během let několikrát zásadně změnil. Do nedávné doby pouţívaný systém vznikl v osmdesátých letech dvacátého století a byl zaloţený na sloţitosti orální 12

13 ciliatury. Podle toho se nálevníci dělili do tří tříd: Kinetofragminophorea, Oligohymenophorea a Polyhymenophorea (Corliss et al. 1980). Do třídy Kinetofragminophorea patřili nálevníci, jejichţ orální ciliatura se jen nepatrně lišila od somatické ciliatury a byla odvozena z apikálních částí somatických kinet. Cytostom byl většinou apikální nebo ventrální a cytofaryngeální aparát obvykle nápadný. Třída Kinetofragminophorea se dělila na čtyři podtřídy (Gymnostomatia, Vestibuliferia, Hypostomatia a Suctoria). Třída Oligohymenophorea zahrnovala převáţně nálevníky, kteří měli orální aparát umístěný alespoň částečně uvnitř ústní dutiny a dobře vyvinutý. Do této třídy byli ale také řazeni astomátní nálevníci, u nichţ není orální aparát vůbec vyvinut. Orální ciliatura u zástupců třídy Oligohymenophorea se lišila od somatické. Skládala se z periorální membrány na pravé straně a z malého počtu (obvykle tří) membranel na levé straně. Cytostom byl obvykle ventrální nebo subapikální. Do této třídy patřily pouze dvě podtřídy, Hymenostomatia a Peritrichia (Corliss et al. 1980). Zástupci třídy Polyhymenophorea se vyznačovali orálním aparátem s mnoha sloţitými membranelami. Somatická ciliatura mohla být normálně vyvinuta, redukována nebo přeměněna na ciry. Cytostom se nacházel ve spodní části ústní dutiny a cytoprokt většinou chyběl. Třída Polyhymenophorea zahrnovala pouze jednu podtřídu, Spirotrichia (Corliss et al. 1980). Hned po svém vzniku byl ovšem tento systém kritizován. Ukázalo se, ţe orální ciliatura podléhá silným selekčním tlakům a častým konvergencím (viz např. Lynn 1979, 1981). Byly vytvořeny nové třídy nálevníků (Lynn a Corliss 1991, citováno v Baroin-Tourancheau et al. 1992). Při pouţití prvních molekulárně-fylogenetických metod se skutečně ukázalo, ţe třídy Polyhymenophorea a Kinetofragminophorea jsou polyfyletické (např. Baroin-Tourancheau et al. 1992; Bernhard et al. 1995; Hirt et al. 1995; Stechmann et al. 1998). Došlo tedy k opuštění Corlissova systému tří tříd a k jeho postupnému nahrazení novým systémem se dvěma podkmeny s jedenácti třídami (Lynn 2003; obr. 4). Tento systém, který se pouţívá dodnes, je zaloţen na makronukleárním cyklu a na struktuře somatických kinetid (obr. 5). O těchto znacích se předpokládá, ţe podléhají konvergencím mnohem méně neţ orální infraciliatura. Přirozenost těchto jedenácti tříd je podloţena několika molekulárněfylogenetickými studiemi (např. Wright et al. 1997; van Hoek et al. 1998; Affa a et al. 2004; Strüder-Kypke et al. 2006; Stoeck et al. 2007; Cho et al. 2008). V současném systému se nálevníci dělí na dva podkmeny Postciliodesmatophora a Intramacronucleata. Nejdůleţitějším znakem podkmene Postciliodesmatophora jsou postciliodesmy (Km fibrily). Jsou to vlastně spojené mikrotubulární svazky vznikající tak, ţe postciliární mikrotubuly míří dozadu a překrývají ty, které přicházejí zepředu. Do tohoto 13

14 podkmene patří dvě třídy. Třída Heterotrichea má makronukleus, který se dělí pomocí mimojaderných tubulů, a u třídy Karyorelictea se makronukleus nedělí vůbec. U podkmene Intramacronucleata, který obsahuje valnou většinu nálevníků, se makronukleus dělí pomocí vnitrojaderných mikrotubulů. Jejich role ale nebyla doposud zcela objasněna a nebylo pozorováno dělicí vřeténko. U jednoho zástupce řazeného do tohoto podkmene (rod Protocruzia) byly objeveny i postciliodesmy (Lynn 2003). Do skupiny Intramacronucleata spadá zbývajících devět tříd, které se od sebe navzájem liší strukturou somatické infraciliatury. Přehled tříd nálevníků. Podle Lynn Podkmen 1. Postciliodesmatophora Třída 1. Karyorelictea Třída 2. Heterotrichea Podkmen 2. Intramacronucleata 1 Třída 3. Spirotrichea (podtřídy Protocruziidia, Phacodiniida, Hypotrichia, Oligotrichia, Choreotrichia, Stichotrichia, Licnophoria) Třída 4. Armophorea Třída 5. Litostomatea (podtřídy Haptoria, Trichostomatia, Rhynchostomatia) Třída 6. Phyllopharyngea (podtřídy Phyllopharyngia, Rhynchodia, Chonotrichia, Suctoria) Třída 7. Nassophorea Třída 8. Colpodea Třída 9. Prostomatea Třída 10. Plagiopylea Třída 11. Oligohymenophorea (podtřídy Peniculia, Scuticociliatia, Hymenostomatia, Apostomatia, Peritrichia, Astomatia) 1 Před odevzdáním této diplomové práce byla objevena nová, v pořadí dvanáctá třída nálevníků, třída Cariacotrichea (Orsi et al. 2011). 14

15 Obr. 4. Ukázky zástupců jednotlivých tříd nálevníků. Podle Lynn (2003). A: Loxodes (Karyorelictea); B: Stentor (Heterotrichea); C: Protocruzia (Spirotrichea); D: Euplotes (Spirotrichea); E: Metopus (Armophorea); F: Didinium (Litostomatea); G: Chilodonella (Phyllopharyngea); H: Obertrumia (Nassophorea); I: Colpoda (Colpodea); J: Plagiopyla (Plagiopylea); K: Holophrya (Prostomatea); L: Tetrahymena (Oligohymenophorea). 15

16 Obr. 5. Somatické kinetidy reprezentující 11 tříd skupiny nálevníků. Podle Lynn (2003). A. Loxodes (Karyorelictea); B. Blepharisma (Heterotrichea); C. Protocruzia (Spirotrichea); D. Euplotes (Spirotrichea); E. Metopus (Armophorea); F. Balantidium (Litostomatea); G. Chilodonella (Phyllopharyngea); H. Obertrumia (Nassophorea); I. Colpoda (Colpodea); J. Plagiopyla (Plagiopylea); K. Holophrya (Prostomatea); L. Tetrahymena (Oligohymenophorea); M. Plagiotoma (Spirotrichea). Pc = postciliární mikrotubulární pásy; Kd = kinetodesmální fibrily; T = transverzální mikrotubulární pásy. V roce 2004 Cavalier-Smith rozdělil podkmen Intramacronucleata podle lokalizace cytostomu na tři skupiny (Cavalier-Smith 2004; citováno ve Vďačný et al. 2010). Skupina Spirotrichia zahrnovala třídy Armophorea a Spirotrichea, skupinu Rhabdophora tvořila pouze třída Litostomatea a skupina Ventrata obsahovala zbylých šest tříd (Phyllopharyngea, Nassophorea, Colpodea, Plagiopylea, Oligohymenophorea a Prostomatea). Tento systém nálevníků ale Vďačný et al. (2010b) opět přepracovali. Ze závěrů jejich stude vyplývá, ţe třída Armophorea nepatří do skupiny Spirotrichia, ale ţe se jedná o sesterskou skupinu třídy 16

17 Litostomatea. Společně je tedy zařadili do skupiny, kterou pojmenovali Lamellicorticata (Vďačný et al. 2010b). Dosud se ale stále více pouţívá systém nálevníků o jedenácti třídách z roku 2003 (Lynn 2003). Lynnův systém z roku 2003 vznikl na základě fylogenetických analýz genu pro SSU rrna, ale od konce devadesátých let dvacátého století se zájem vědců zaměřil i na ověřování fylogenetických vztahů pomocí dalších genů, jako je například EF-1α (Moreira et al. 1999). Podle jejich fylogenetické analýzy pro gen EF-1α je třída Oligohymenophorea a podtřída Hypotrichea polyfyletická a nikoli monofyletická, jako při dřívější analýze genu pro SSU rrna (Moreira et al. 1999). Kromě tohoto genu se provádí fylogenetické analýzy i pro geny erf1, erf3 a EF-2 (Moreira et al. 2002) Anaerobní nálevníci Většina nálevníků ţije v prostředí s přístupem kyslíku. Známe ale i některé rody (např. Metopus, Trimyema, Plagiopyla, atd.), které mohou snášet velmi malou koncentraci kyslíku nebo pro ně můţe být kyslík dokonce toxický. U těchto organismů nalezneme hydrogenosom. Jedná se o redukovanou mitochondrii, která za anaerobních podmínek produkuje vodík a ATP. Dále se ukázalo, ţe anaerobní nálevníci rostou pomaleji neţ ti aerobní. Tento fakt vysvětlují dvě hypotézy. První hypotéza tvrdí, ţe anaerobní metabolická cesta způsobuje niţší rychlost růstu neţ ta aerobní, a druhá říká, ţe anaerobní nálevníci mají niţší příjem potravy neţ ti aerobní (Massana et al. 1994). Předpokládá se, ţe předek nálevníků byl aerobní a během evoluce došlo nejméně čtyřikrát k přechodu na anaerobní způsob ţivota. Anaerobní nálevníci náleţí do skupin Armophorea, Litostomatea, Plagiopylea a několik anaerobních zástupců nalezneme i ve skupinách Oligohymenophorea a Prostomatea Třída Armophorea Fylogenetická pozice třídy Armophorea byla dlouho záhadná. Dříve byla tato třída řazena do skupiny Heterotrichea ke třídě Spirotrichea nebo byla označována jako Ciliophora incertae sedis (McGrath et al. 2007). Navíc její dva řády (Armophorida a Clevelandellida) byly často řazeny na různá místa v systému nálevníků. Aţ v roce 2003 na základě struktury somatických kinetid byly tyto dvě skupiny přiřazeny k sobě a vytvořily spolu samostatnou třídu Armophorea (Lynn 2003). To bylo později potvrzeno i na základě molekulárně fylogenetických studií (Affa a et al. 2004; Šlapeta et al. 2005). V roce 2004 vznikl nový 17

18 systém nálevníků na základě lokalizace cytostomu. Cavalier-Smith rozdělil podkmen Intramacronucleata na tři taxony: Spirotrichia, Rhabdophora a Ventrata. Třída Armophorea společně s třídou Spirotrichea spadaly do taxonu Spirotrichia (Cavalier-Smith 2004; citováno ve Vďačný et al. 2010). Podle nejnovější studie ale Armophorea nepatří do Spirotrichia. Na základě analýzy genu pro 18S rrna vyplývá, ţe Armophorea jsou sesterská skupina třídy Litostomatea (Vďačný et al. 2010b). Autoři této studie proto třídu Armophorea přiřadili ke třídě Litostomatea do taxonu Rhabdophora, jehoţ název zaměnili za Lamellicorticata. Tato třída zahrnuje anaerobní organismy, jak volně ţijící, tak i endosymbiotické druhy. Místo mitochondrie mají hydrogenosom a okolo něho v cytoplasmě velmi často nalezneme metanogenní archebakterie (např. Gijzen et al. 1991; Embley et al. 1992). Do řádu Armophorida patří ty druhy, které mají tělo většinou stočené doleva, podél ústního okraje mají 3 5 periorálních somatických kinetid (Adl et al. 2005). Jejich somatická ciliatura je holotrichní, tzn. tělo je rovnoměrně pokryto bičíky. Z tohoto důvodu byli tito nálevníci často zařazováni ke třídě Heterotrichea, se kterou však nejsou blíţe příbuzní (viz Lynn 2008). Zástupci řádu Clevelandellida mají tělo hustě pokryté bičíky, na bocích zploštělé s mnoha orálními polykinetidami po levé straně (Lynn 2008). Ve většině případů se jedná o komenzály ţijící v širokém spektru hostitelů. Řád Clevelandellida byl ve starších systémech často součástí třídy Polyhymenophorea (např. Corliss et al. 1980) a byl do něj zařazován i rod Metopus, který dnes patří do řádu Armophorida Třída Litostomatea Jako samostatná třída byla skupina Litostomatea vytvořena v roce 1991 (Lynn a Corliss 1991, citováno v Baroin-Tourancheau et al. 1992). Jedná se o skupinu, jejíţ monofylie je dobře podpořena molekulárně-fylogenetickými studiemi (Lynn 2003; Strüder-Kypke et al. 2006; Gao et al. 2008; Vďačný et al. 2010a). Třída Litostomatea je značně diverzifikovaná skupina, nalezneme zde jak aerobní volně ţijící druhy, tak anaerobní endosymbiotické druhy. Jejich somatická ciliatura je tvořena monokinetidami se dvěma příčnými pásy mikrotubulů (Lynn 2003). V dnešní době je tato skupina součástí podkmene Intramacronucleata a jedná se o sesterskou skupinu třídy Armophorea (viz kap ). Třída Litostomatea se podle systému z roku 2003 dělí na dvě podtřídy: Trichostomatia a Haptoria. Podle nejnovější studie z roku 2010 se tato skupina jiţ dělí na tři podtřídy: Trichostomatia, Haptoria a Rhynchostomatia (Vďačný et al. 2010a). 18

19 Podtřída Trichostomatia je monofyletická skupina. Jednotliví zástupci této podtřídy ţijí jako endobionti v zaţívacím traktu mnohých herbivorních ţivočichů (Wright et al. 1997). Je pro ně charakteristický vnořený cytostom a absence toxicyst (Strüder-Kypke et al. 2006). Jejich orální ciliatura je hustá a bazální tělíska se mohou organizovat do polykinetid (Adl et al. 2005). V osmdesátých letech dvacátého století byla tato skupina taxonomicky řazena jako řád Trichostomatida do podtřídy Vestibulifera, která spadala do třídy Kinetofragminophorea (Corliss et al. 1980). Podtřída Haptoria je polyfyletický taxon. Dříve se myslelo, ţe je tato skupina celá aerobní, ale ukazuje se, ţe by to tak nemuselo být. Bylo popsáno několik druhů (např. Lacrymaria elegans nebo L. sapropelica), které byly objeveny v bezkyslíkatém prostředí (Esteban et al. 1993). Zatím ale nebyl u nich popsán hydrogenosom. Na rozdíl od podtřídy Trichostomatia však u této skupiny nalezneme okolo orálního aparátu toxicysty. Ty jim slouţí k obraně proti predátorům a také se podílejí na chytání kořisti (Gao et al. 2008). Organismy z této třídy bývají také často predátoři jiných nálevníků. Haptoria mají redukovanou a málo rozlišenou ciliaturu. V minulosti tato skupina spadala do podtřídy Gymnostomatia třídy Kinetofragminophorea, tedy jinam neţ Trichostomatia (Corliss et al. 1980). Na začátku devadesátých let dvacátého století byly společně s podtřídou Trichostomatia zařazeny do třídy Litostomatea (Lynn a Corliss 1991, citováno v Baroin-Tourancheau), kde jsou dodnes. Skupina Rhynchostomatia, by mohla být na základě fylogenetické analýzy genu pro 18S rrna novou podtřídou třídy Litostomatea. Zahrnuje dva řády: Tracheliida a Dileptida. Pro obě skupiny je charakteristický ústní otvor leţící ventrálně na bázi chobotku (proboscis), který nese komplex orální ciliatury (Vďačný et al. 2010a) Třída Plagiopylea Jedná se o mofyletickou skupinu, která je blízce příbuzná třídám Prostomatea a Oligohymenophorea (Lynn a Strüder-Kypke 2002; Cho et al. 2008). Monofylie této třídy je silně podporována analýzami genu pro SSU rrna (např. Lynn a Strüder-Kypke. 2002). Somatická ciliatura zástupců třídy Plagiopylea je tvořena monokinetidami a orální ciliatura je velmi jednoduchá. Skládá se v podstatě ze somatických kinet, které se dále rozšiřují do ústní dutiny, jeţ má nálevkovitý tvar, nebo do vestibulu (Adl et al. 2005). Všichni zástupci této třídy jsou anaerobní a mohou být jak volně ţijící, tak endobiotičtí (např. Lynn a Strüder- Kypke 2002). I pro tuto třídu je charakteristická přítomnost hydrogenosomů a endosymbiotických metanogenních bakterií (např. Shinzato et al. 2007). 19

20 Do této třídy patří rod Trimyema, ale ne vţdy tomu tak bylo. Pozice tohoto rodu v systému nálevníků byla dlouho nejasná. Vzhledem k tomu, ţe u něho nacházíme apikální orální aparát, který je typický pro prostomátní nálevníky, byla Trimyema řazena mezi Prostomatea (Serrano et al. 1988). Poté byla přemístěna do třídy Oligohymenophorea (Nerad et al. 1995; citováno v Baumgartner et al. 2002) a aţ v roce 2002 na základě fylogenetických analýz genu pro SSU rrna byla umístěna do třídy Plagiopylea (Baumgartner et al. 2002). Zástupce toho rodu můţeme nalézt ve všech typech vod, dokonce i v teplých (Trimyema minutum) (Baumgartner et al. 2002) nebo v hypersalinních vodách (Trimyema koreanum) (Cho et al. 2008). V roce 2007 byla do této třídy zařazena nová skupina nálevníků, řád Odontostomatida. Stalo se to na základě analýzy pro gen SSU rrna (Stoeck et al. 2007). Nejdříve se jednalo o monofyletickou skupinu, která byla součástí řádu Heterotrichida a později, neţ ji zařadili do třídy Plagiopylea, byla spolu s dalšími nálevníky incertae sedis umístěna do třídy Armophorea. Všichni nálevníci z tohoto řádu jsou anaerobní a vyskytují se v sedimentech sladkovodních nádrţí. I u nich se vyskytují metanogenní endosymbionti (Stoeck et al. 2007). V nedávné době vyšla studie, jejíţ autoři se zabývali systematickou pozicí zvláštního nálevníka rodu Paraspathidium. První zmínka o tomto druhu pochází z roku 1937 (Noland 1937) a od toho roku byl pomocí morfologických znaků řazen do podtřídy Haptorida (Litostomatea) (Noland 1937; Long et al. 2009). V roce 2010 provedli autoři studie fylogenetickou analýzu genu SSU rrna a zjistili, ţe tento rod nepatří do třídy Litostomatea. Spíše se přiklánějí k tomu, ţe by se mohlo jednat buď o novou samostanou skupinu, blízce příbuznou třídám Prostomatea a Plagiopylea nebo by mohlo jít o novou skupinu, jeţ by byla součástí třídy Plagiopylea (Zhang et al. 2010b) Třída Oligohymenophorea Třída Oligohymenophorea je největší a nejznámější skupina nálevníků. Patří sem např. rody Tetrahymena, Paramecium, Cyclidium nebo Vorticella, které mají orální aparát částečně v ústní dutině. Orální ciliatura je dobře rozlišená od somatické. Skládá se z perorální membrány na pravé straně a malého počtu organel (membranely, peniculi, polykinety) na levé straně. Cytostom mají umístěný ventrálně nebo blízko anteriorního konce. Nalezneme zde jak volně ţijící druhy, mikrofágní druhy, tak i endoparazity. Některé druhy mohou tvořit cysty nebo vytvářet kolonie (Corliss et al. 1980). V minulosti se tato třída dělila na dvě podtřídy (Hymenostomatia a Peritrichia) se 4 řády (Corliss et al. 1980). Dnes se skládá ze šesti podtříd 20

21 s neurčitým počtem řádů (Lynn a Small 2002; Lynn 2003). Prvním popsaným anaerobním nálevníkem náleţící do této třídy byl volně ţijící druh Cyclidium porcatum, který spadá do podtřídy Scuticociliatia (Clarke a Finlay 1993). Podtřída Scuticociliatia se dříve řadila jako řád Scuticociliatida do podtřídy Hymenostomatia, která doposud spadá do třídy Oligohymenophorea. Jednotliví zástupci této podtřídy obývají různé typy prostředí. Většina z nich jsou fakultativní parazité mořských ţivočichů, hlavně ryb, korýšů, měkkýšů. Napadají jejich ţábry, pokoţku, svaly, srdce nebo bránici a dochází tak k jejich úhynu (např. Jung et al. 2005; Bourne et al. 2008). Kromě druhu Cyclidium porcatum bylo popsáno několik dalších druhů nálevníků (např. Cyclidium dilectissimum, Isocyclidium globosum a Cristigera sp.; Esteban et al. 1993), o kterých se předpokládá, ţe budou také anaerobní. Zatím u nich nebyl objeven hydrogenosom, a proto nelze vyloučit, ţe by se mohlo nakonec jednat o aerobní organismy Třída Prostomatea Třída Prostomatea stejně jako předchozí třída zahrnuje zejména aerobní druhy. Monofylie této skupiny je podpořena několika fylogenetickými analýzami, i kdyţ statistická podpora obvykle nebývá vysoká (např. Stechmann et al. 1998; Zhang et al. 2010b). Tato třída je blízce příbuzná třídám Plagiopylea a Oligohymenophorea (Stechmann et al. 1998; Lynn 2003) a nově i skupině, která byla popsána teprve nedávno a je tvořena rodem Paraspathidium (viz kap 2.3.3). Ale ne vţdy se jednalo o samostatnou třídu. V systému z osmdesátých let dvacátého století byla tato skupina označována pouze jako řád Prostomatida, který patřil do třídy Kinetofragminophorea (Corliss et al. 1980) a teprve aţ v roce 1992 se tento řád stal třídou (Baroin-Tourancheau et al. 1992). Dnes můţeme tuto třídu rozdělit do dvou řádů (Prostomatida a Prorodontida). Název této třídy vychází z umístění jejich cytostomu, který je apikální. Cytofarynx je obklopen postciliárními mikrotubulárními pásy, které vznikají z orálních polykinetid. Mají typický polyploidní makronukleus (Corliss et al. 1980; Lynn a Small 2002). Stejně jako u třídy Oligohymenophorea i zde bylo objeveno několik druhů (Holophrya bicoronata a Prorodon corpulentissimum), které by mohly být anaerobní (Esteban et al. 1993). Ani u nich však nebyl popsán hydrogenosom. 21

22 Systematický přehled anaerobních nálevníků. Podle Lynn (2002). Doplněno o změny ve třídách Plagiopylea (Stoeck et al. 2007), Litostomatea (Esteban et al. 1993; Ito et al. 2006; Vďačný et al. 2010a), Ologohymenophorea a Prostomatea (Esteban et al. 1993). 2 TŘÍDA ARMOPHOREA Řád Armophorida Čeleď Caenomorphidae (rody Caenomorpha, Cirranter, Ludio) Čeleď Metopidae (rody Bothrostoma, Brachonella, Eometopus, Metopus, Palmarela, Parametopus, Spirorhynchus, Tesnospira, Tropidoatractus) Řád Clevelandellida Čeleď Clevelandellidae (rody Clevelandella, Metaclevelandella, Paraclevelandia) Čeleď Inferostomatidae (rod Inferostoma) Čeleď Neonyctotheridae (rod Neonyctotherus) Čeleď Nyctotheridae (rody Cichlidotherus, Metanyctotherus, Nyctositum, Nyctotheroides, Nyctotherus, Paracichlidotherus, Pronyctotherus, Pygmotheroides) Čeleď Sicuophoridae (rody Geimania, Metasicuophora, Parasicuophora, Prosicuophora, Sicuophora) Třída Litostomatea Podtřída Haptoria Řád Cyclotrichida Řád Haptorida Čeleď Lacrymariidae (druhy Lacrymaria elegans, Lacrymaria sapropelica) Řád Pleurostomatida Podtřída Trichostomatia Řád Vestibuliferida Čeleď Balantidiidae (rod Balantidium) Čeleď Isotrichidae (rody Bitricha, Dasytricha, Isotricha, Protoisotricha) Čeleď Paraisotrichidae (rody Enterophrya, Paraisotrycha, Rhizotricha) Čeleď Pycnotrichidae (rody Collinina, Infundibulorium, Nicollella, Pycnothrix, Vestibulongum) Čeleď Protocaviellidae (rody Hydrochoerella, Protocaviella) Řád Entodiniomorphida Podřád Archistomatina Čeleď Buetschliidae (rody Alloiozona, Ampullacula, Amylophorus, Blepharocodon, Blepharoconus, Blepharomonas, Blepharoplanum, Blepharoposthium, Blepharosphaera, Blepharozoum, Buetschlia, 2 Třídy Prostomatea a Oligohymenophorea a podtřídy Haptoria a Rhynchostomatia zahrnují hlavně aerobní nálevníky 22

23 Buissonella, Bundleia, Cucurbella, Didesmis, Hemiprorodon, Holophryoides, Holophryozoon, Kopperia, Levanderella, Meiostoma, Paraisotrichochopsis, Pingius, Polymorphella, Prorodonopsis, Protolutzia, Pseudobuetschlia, Sciurula, Sulcoarcus, Wolskana) Podřád Blepharocorythina Čeleď Blepharocorythidae (rody Blepharocorys, Charonina, Charonnautes, Circodinium, Ochoterenaia, Pararaabena, Raabena, Spirocorys) Podřád Entodiniomorphina Čeleď Cycloposthiidae (rody Bertolinella, Bozasella, Cycloposthium, Diplolophus, Lavierella, Toxodinium, Tricaudalia, Trifascicularia, Tripalmaria, Triplumaria) Čeleď Prototapirellidae (rod Prototapirella) Čeleď Ditoxidae (rody Ditoxum, Tetratoxum, Triadinium) Čeleď Macropodiniidae (rod Macropodinium) Čeleď Ophryoscolecidae (rody Caloscolex, Campylodinium, Cunhaia, Diplodinium, Diploplastron, Elytroplastron, Enoploplastron, Entodinium, Eodinium, Epidinium, Epiplastron, Eremoplastron, Eudiplodinium, Metadinium, Ophryoscolex, Opisthotrichium, Ostracodinium, Polyplastron) Čeleď Polydiniellidae (rody Elephantophilus, Polydiniella, Pterodinium, Thoracodinium) Čeleď Rhinozetidae (rod Rhinozeta) Čeleď Spirodiniidae (rody Cochliatoxum, Spirodinium) Čeleď Telamodiniidae (rody Megadinium, Telamodinium, Teratodinium) Čeleď Troglodytellidae (rody Gorillophilus, Troglodytella) Čeleď Gilchristidae (rody Gilchristia, Digilchristia) Podtřída Rhynchostomatia Řád Tracheliida Řád Dileptida Třída Plagiopylea Řád Plagiopylida Čeleď Plagiopylidae (rody Lechriopyla, Paraplagiopyla, Plagiopyla, Pseudoplagiopyla) Čeleď Sonderiidae (rody Parasonderia, Sonderia, Sonderiella) Čeleď Trimyemidae (rod Trimyema) Řád Odontostomatida Čeleď Discomorphellidae (rod Discomorphella) Čeleď Epalxellidae (rody Atopodinium, Epalxella, Pelodinium, Saprodinium) Čeleď Mylestomatidae (rod Mylestoma) Třída Oligohymenophorea Podtřída Peniculia 23

24 Podtřída Scuticociliatia Čeleď Cyclidiidae (druhy Cyclidium porcatum, Cyclidium dilectissimum, Isocyclidium globosum, Cristigera sp) Podtřída Hymenostomatia Podtřída Apostomatia Podtřída Peritrichia Podtřída Astomatia Třída Prostomatea Řád Prostomatida Čeleď Prorodontidae (druh Prorodon corpulentissimum) Čeleď Holophryidae (druh Holophrya bicoronata) Řád Prorodontida 2.4. Ekologie anaerobních nálevníků Volně žijící anaerobní nálevníci Volně ţijící anaerobní nálevníky nalezneme téměř všude. Ţijí buď v různých typech vod (mokřady, čističky odpadních vod, atd.), nebo ve vlhké půdě, kde se ţiví bakteriemi a řasami (Corliss 2002). Existují i takové druhy anaerobních nálevníků (např. Metopus es nebo Plagiopyla nasuta, obr. 6), které se mohou vyskytovat v prostředí bohatém na sulfidy (Massana et al. 1994) 24

25 Obr. 6. Volně ţijící anaerobní nálevníci: A: Plagiopyla (eol. org/pages/ ); B: Metopus (eol. org/pages/488667) Nálevníci gastrointestinálního traktu Mimo druhy, které ţijí volně v přírodě, nalezneme i některé zástupce v gastrointestinálním traktu býloţravých ţivočichů. Toto anoxické prostředí podporuje rozvoj specifických mikrobiálních společenstev, která se skládají z bakterií, anaerobních hub a anaerobních prvoků, a je charakterizováno dostupností bohatého zdroje rostlinných polymerů (Breznak 1982; Hungate 1966, citováno v Gijzen et al. 1991). U přeţvýkavců nalezneme tyto mikroorganismy hlavně v bachoru, u ţivočichů, kteří nemají bachor, se vyskytují především ve střevě (Ricard et al. 2006). Bachor je vysoce specializovaná část ţaludku charakteristická pouze pro přeţvýkavce (skupina Ruminantia). V této části probíhá veškeré trávení rostlinné potravy (Ricard et al. 2006) a právě tady se bachoroví nálevníci starají o zpracování rostlinných sacharidů. Nálevníci produkují aminokyseliny, díky nimţ dochází ke zpracování nestravitelných strukturních polysacharidů na lipidy. Ty pak můţe hostitel snadno absorbovat (Cameron 2003). Bachoroví nálevníci systematicky spadají do podtřídy Trichostomatia a můţeme je rozdělit do dvou skupin (Ricard et al. 2006): řád Entodiniomorphida (Entodinium simplex, Entodinium caudatum, Eudiplodinium maggii, Metadinium medium, Diploplastron affine, Polyplastron multivesiculatum a Epidinium eucaudatum) a řád Vestibuliferida, který byl 25

26 dříve pojmenován jako Holotricha (Isotricha prostoma, Isotricha intestinalis a Dasytricha ruminantium). Do dnešní doby vyšlo několik studií, ve kterých byli popsáni jednotliví zástupci střevních nálevníků. Například u zebu (domácí skot ţijící v Asii a Africe) se v bachoru vyskytují hlavně rody Entodinium, Eudiplodinium, Diplodinium a Ostracodinium (Mishima et al. 2009). U koní byly identifikovány ve slepém a tlustém střevě rody Cycloposthium, Tripalmaria, Cochliatoxum a Paraisotricha (Strüder-Kypke et al. 2007), u vačnatců se jednalo o různé zástupce čeledí Amylovoracidae, Macropodinidae, Polycostidae a Cycloposthiidae (Trichostomatia, Litostomatea) (Cameron 2003) a u velbloudů byly objeveny rody Entodinium, Diplodinium, Eudiplodinium a Epidinium (Del Valle et al. 2008). Kromě těchto ţivočichů se střevní nálevníci vyskytují i u ryb (např. Balantidium ctenopharyngodoni nebo B. polyvacuolum) (Li et al. 2007, 2009) nebo u šimpanzů a goril. U nich byly popsány tři rody nálevníků, Gorillophilus, Prototapirella a Troglodytella (Pomajbíková et al. 2010). O významu nálevníka Troglodytella abrassarti u šimpanzů se toho zatím moc neví (Modrý et al. 2009). Zajímavé je, ţe u lidí nebyl tento druh zatím objeven, i kdyţ se předpokládá, ţe u našich předků se vyskytoval, ale nejspíš během evoluce došlo u lidí k jeho ztrátě. Mohlo by to být způsobené potravou, kterou lidé konzumují. Ukazuje se, ţe šimpanzi, kteří ţijí v lidských obydlích jako domácí mazlíčci a ţiví se jídlem od lidí, troglodytelu nemají (Irbis et al. 2008). V těchto starších studií se předpokládalo, ţe Troglodytella u primátů ţijících v zajetí mizí, ale nemuselo by to tak být. V roce 2010 vyšel článek, ve kterém se píše pravý opak. Podle autorů je infekce tímto nálevníkem u volně ţijících primátů niţší neţ u těch v zajetí (Pomajbíková et al. 2010). Vysvětlují to také změnou potravy. Primáti ţijící v zajetí totiţ konzumují potravu, ve které je málo vlákniny, ale je bohatá na škroby. Dále byla v roce 2006 popsána nová skupina endobiotických nálevníků ţijících v zaţívacím traktu u nosoroţců (skupina Gilchristidae), která patří do řádu Entodiniomorphida (Ito et al. 2006). Endobiotičtí nálevníci se kromě obratlovců mohou vyskytovat i u bezobratlých, například u švába ve střevě ţije druh Nyctotherus ovalis (Gijzen a Barugahare 1992) nebo u krouţkovců se vyskytují rody Plagiotoma a Anoplophrya (Affa a et al. 2004) Balantidium coli jako patogen Balantidium coli (Litostomatea; viz obr. 7) je anaerobní nálevník s cystami, který parazituje u různých skupin ţivočichů včetně člověka. Za normálních podmínek ţije v lumen tlustého 26

27 střeva prasat, koní, primátů a psů (Nakauchi 1999; Headley et al. 2008). Další druhy rodu Balantidium nalezneme téměř u všech ţivočichů, například v plazech, obojţivelnících (Li et al. 2008) nebo rybách (Li et al. 2007, 2009). Za normálních podmínek se B. coli ţiví střevním obsahem a nezpůsobuje svému hostiteli závaţná poškození. Někdy se ale za nejasných podmínek stává vysoce patogenním. Dochází k proniknutí nálevníků do střevní sliznice nebo do lymfoidní tkáně a ke vzniku vředů. Nálevníci mohou být dále krví rozneseni po celém těle, kde také vznikají vředy, a mohou perforovat i jiné orgány. Toto onemocnění většinou nebývá u zvířat doprovázeno nějakými viditelnými příznaky, ale často končí smrtí (Headley et al. 2008). Balantidium coli je zatím jediný známý patogenní druh, který můţe napadnout i člověka. Toto málo časté onemocnění se nazývá balantidióza (Zaman 1993). Balantidióza je nemoc, která se vyskytuje téměř po celém světě, ale hlavně v tropických oblastech. K její nákaze dochází po napití vody, která je kontaminovaná výkaly nakaţených zvířat (a tedy i cystami druhu B. coli) a po těle se dále roznáší pomocí krve. Projevuje se krvavě hlenovými průjmy, vysokými horečkami, nechutenstvím, hubnutím, bez léčby bývají silně poškozena játra a onemocnění v tomto stádiu ve většině případů končí smrtí. Diagnostika je zaloţena na mikroskopickém nálezu cyst nebo trofozoitů v preparátu z čerstvé stolice. K léčbě se pouţívá tetracyklin nebo metronidazol (Biagi 1970). Často se můţe také stát, ţe dojde k záměně s jinou nemocí, a to s amébovou dyzentérií, kterou způsobuje druh Entamoeba histolytica. Obě onemocnění mají totiţ velmi podobné příznaky. Obr. 7. Balantidium coli. A: trofozoit (www. nationmaster. com/encyclopedia/balantidium-coli); B: cysta (www. phsource. us/ph/para/chapter_2. htm). 27

28 2.5. Hydrogenosom Hydrogenosom je specializovaná organela typická pro eukaryotní organismy ţijící v anaerobním prostředí. Jedná se vlastně o redukovanou mitochondrii, jejíţ metabolismus probíhá za anaerobních podmínek bez oxidativní fosforylace a konečným produktem není voda, ale vodík (Bui et al. 1996; Martin 2005). Předpokládá se, ţe hydrogenosom a mitochondrie mají společného jednoho předka (Hackstein et al. 2006). Kromě nálevníků nalezneme tuto organelu například ještě u anaerobních chytridiomycet (např. Akhmanova et al. 1999; James et al. 2006), u druhu Psalteriomonas lanterna (Heterolobosea) (např. de Graaf et al. 2009) nebo u trichomonád (Parabasalia) (např. Hrdy et al. 2004; Pütz et al. 2006; Smutná et al. 2009). Jednotlivé hydrogenosomy se ale od sebe navzájem strukturně a metabolicky liší (Boxma et al. 2005). To potvrzuje teorii, ţe hydrogenosom vznikl u různých skupin prvoků několikrát nezávisle na sobě (Dyall a Johnson 2000). Hydrogenosom, stejně jako mitochondrie, má dvojitou membránu, vnitřní membrána můţe v některých případech vytvářet kristy a při energetickém metabolismu vzniká ATP, i kdyţ méně neţ při aerobním metabolismu (Bui et al. 1996; Martin 2005). Kromě tří výjimek nebyl u hydrogenosomu popsán genom. Těmi výjimkami jsou nálevník Nyctotherus ovalis (Akhmanova et al. 1998; van Hoek et al. 2000a; Boxma et al. 2005; de Graaf et al. 2011) a prvoci ze skupiny Stramenopiles, rod Blastocystis (Stechman et al. 2008) a druh Ptoteromonas lacertae (Pérez-Brocal et al. 2010). Navíc je zde přítomna hydrogenáza a pyruvát-ferredoxin oxireduktáza. Jedná se o enzym, který katalizuje oxidativní dekarboxylaci pyruvátu na acetyl-coa, nebo v opačném směru tvoří pyruvát z acetyl-coa a oxidu uhličitého (Müller 1993; Dyall et al. 2000). Při energetickém metabolismu glukózy dochází k rozkladu pyruvátu na acetát, laktát, sukcinát, popřípadě butyrát, dále vzniká oxid uhličitý a molekulární vodík (Yarlett et al. 1985; Ellis et al. 1991; Dyall et al. 2000; Tielens et al. 2002) Hydrogenosom nálevníka druhu Nyctotherus ovalis Nyctotherus ovalis je anaerobní nálevník ze třídy Armophorea, který ţije ve střevě termitů a švábů (van Hoek et al. 1998). Hydrogenosom tohoto druhu představuje unikátní přechod mezi pravou mitochondrií a hydrogenosomem, jak ho známe například u trichomonád (Dyall et al. 2000). Tato unikátní organela nese znaky typické jak pro hydrogenosom, tak i několik znaků charakteristických pro mitochondrii (např. genom, kristy, kardiolipin) (Akhmanova et al. 1998; van Hoek et al. 2000a; Boxma et al. 2005). Co se týče jeho genomu, 28

29 ukázalo se, ţe kóduje ribosomální proteiny a dokonce dva komponenty dýchacího řetězce, téměř všechny geny kódující komplex Ι (pumpuje protony ven z organely) a komplex ΙΙ (redukce fumarátu), a navíc je tato organela schopna vytvářet membránový potenciál. Geny, jeţ kódují komplexy III, IV a V, zatím nebyly v hydrogenosomu objeveny. Byly zde identifikovány i některé geny, které zřejmě kódují enzymy Krebsova cyklu, jako jsou malát dehydrogenáza, sukcinát dehydrogenáza, sukcinyl-coa syntetáza či α-ketoglutarát dehydrogenáza (Boxma et al. 2005; Hackstein et al. 2006). Hlavním konečným metabolickým produktem je v tomto případě sukcinát, který je typický i pro anaerobní mitochondrii (Boxma et al. 2005). Kromě sukcinátu můţe v hydrogenosomu druhu N. ovalis vznikat z pyruvátu i malé mnoţství acetátu (Tielens et al. 2002). Předpokládané schéma energetického metabolismu u druhu N. ovalis je znázorněno na obrázku 8. Obr. 8. Předpokládané schéma metabolismu u druhu Nyctotherus ovalis. (podle Hackstein et al. 2006). Zkratky: AcCoA = acetyl CoA; CITR = citrát; FRD = fumarát reduktáza; FUM = fumarát; Hyd = hydrogenáza; α KG = α ketoglutarát; MAL = malát; OXAC = oxaloacetát; PDH = pyruvát dehydrogenáza; PEP = fosfoenolpyruvát; PYR = pyruvát; RQ = rhodochinon; SUCC = sukcinát; SUCC CoA = sukcinil CoA. 29

30 Pro hydrogenosom druhu N. ovalis je typická přítomnost neobvyklé hydrogenázy. Jedná se o polyprotein, který se skládá z dlouhého řetězce [FeFe] hydrogenázy a dvou modulů, které se podobají dvěma (24kDa a 51kDa) podjednotkám mitochondriálního komplexu Ι a eubakteriálnímu respiračnímu řetězci (Boxma et al. 2007). Pomocí této hydrogenázy nejspíš dochází ke spojení fermentativního glukózového metabolismu se základními komponenty mitochondriálního přenosu elektronů (Akhmanova et al. 1998). Tato hydrogenáza můţe přímo reoxidovat redukované NAD(P) v komplexu Ι (díky přítomnosti 24kDa a 51kDa modulu, ostatní hydrogenázy potřebují k výrobě vodíku feredoxin). Dochází tak k ukládání zásobní energie, která se později pouţívá k vypuzení protonů. Ty pak dávají vzniknout molekulárnímu vodíku (Hackstein et al. 1999). U hydrogenosomu jiného prvoka, jenţ také ţije v prostředí bez kyslíku, rodu Blastocystis (Stramenopiles, Chromista), došlo ke konvergentní evoluci. Stejně jako u hydrogenosomu druhu N. ovalis, tak i tady má hydrogenosom vlastní genom, dva komplexy dýchacího řetězce, Fe-Fe hydrogenázu a vnitřní obalová membrána je i v tomto případě je schopna vytvářet kristy (Stechmann et al. 2008) Metanogenní endosymbionti U téměř všech anaerobních nálevníků byly v cytoplazmě nalezeny prokaryotické organismy. Pomocí fluorescenční mikroskopie byly tyto organismy identifikovány jako metanogenní archebakterie. Stalo se to na základě přítomnosti specifických buněčných komponentů uvnitř archebakterií, koenzymu F 420 (deazaflavin) a sloučeniny F 342 (sloučenina pterinu) (van Bruggen et al. 1983). Jak se ukázalo, tyto archebakterie ţijí s nálevníky v symbiotickém vztahu (Vogel et al. 1980) a obývají hlavně prostor okolo hydrogenosomů (Görtz 2001, obr. 9). První zmínka o této symbióze pochází z roku 1982, ve kterém došlo k popsání simbiózy u nálevníků vyskytujících se v bachoru přeţvýkavců (Stumm et al. 1982). Předpokládá se, ţe tato vzájemná symbióza funguje jiţ od počátku evoluce anaerobních nálevníků (van Hoek et al. 2000b). Archebakterie jsou prokaryotické organismy, které často ţijí v prostředí s extrémními podmínkami, jako jsou například vysoká teplota, nízké ph nebo vysoký obsah různých solí. Nalezneme je v mokřadech, oceánech, bahně, zaţívacím traktu ţivočichů, půdách nebo v odpadních vodách (van Hoek et al. 2000b). Spektrum metabolických pochodů u archebakterií je pestré. Chemotrofní archebakterie vyuţívají k získávání energie buď anorganické (litotrofové), nebo organické sloučenin (organotrofové). Oproti tomu fototrofové vyuţívají energie slunečného záření. U nálevníků se jedná o litotrofní archebakterie, které 30

31 vyuţívají elektrony získané z vodíku nebo kyseliny mravenčí k redukci oxidu uhličitého na metan a vodu. Metan se pak uvolňuje do ovzduší jako jeden ze skleníkových plynů (Hungate et al. 1970). I kdyţ závislost mezi výdejem metanu a počtem nálevníků zatím nebyla prokázána (van Hoek et al. 2006), můţeme s jistotou očekávat výrazné rozdíly ve tvorbě metanu v přímé závislosti na počtu metanogenních endosymbiontů u jednotlivých druhů nálevníků. Symbióza mezi bachorovými nálevníky a metanogenními archebakteriemi je velmi důleţitá a je jedním z hlavních zdrojů metanu v ovzduší. Je to dáno tím, ţe v bachoru přeţvýkavců je mnohem více nálevníků neţ volně ve vodě (Görtz 2001). Navíc se podle nejnovější studie předpokládá, ţe i druhové sloţení nálevníků v bachoru by mohlo hrát významnou roli ve tvorbě metanu. Ukázalo se, ţe nálevníci rodu Epidinium a Eudiplodinium, popsaní u jelenů a ovcí, vyráběli více metanu neţ rody Polyplastron a Ostacodinium ze skotu (Kittelmann a Janssen 2011). Metanogeneze je dále významná pro metabolické působení mikroflóry v bachoru. Metanogenní archebakterie totiţ přispívají k eliminaci redukčních ekvivalentů, které vznikají během fermentace (Šurín et al. 2006). Uţ na začátku devadesátých let se zjistilo, ţe šváb vyuţívá vzniklý metan jako shromaţďovací feromon (Gijzen et al. 1991). Kromě toho se v dnešní době zkoumá vyuţití metanu pro výrobu bioplynu. Abychom zjistili přítomnost metanogenů v buňce nálevníka, musíme pouţít fluorescenční mikroskopii (viz výše) nebo se můţeme zaměřit na přítomnost specifického enzymu, který se vyskytuje pouze v metanogenních archebakteriích. Jedná se o metylkoenzym M reduktázu (mcra), která je velmi důleţitá pro konečnou fázi metanogeneze. Během této fáze se podílí na sníţení počtu metylových skupin vázajících se na koenzym M (Thauer 1998). Protoţe víme s jistotou, ţe nálevníci vlastní metabolismus metanu nemají, nemohou tedy tento enzym produkovat. Pokud tedy v buňce nálevníka objevíme mcra, můţeme s jistotou tvrdit, ţe tento nálevník má v sobě i metanogenní archebakterie (Denman et al. 2007). První popsanou metanogenní archebakterií u volně ţijícího nálevníka byl druh Methanobacterium formicicum, a to u druhu Metopus striatus (Bruggen et al. 1984). Tato archebakterie byla poté pozorována ještě i u jiných nálevníků, jako Plagiopylea frontata (Fenchel a Finlay 1991) nebo Metopus palaeformis (Embley et al. 1992). Kromě tohoto rodu Methanobacterium byli popsáni i jiní zástupci metanogenních archebakterií. Například u nálevníka druhu Metopus contortus byl popsán endosymbiont druhu Methanoplanus endosymbiosus (Görtz 2001) a u druhu Metopus es se jednalo o rod Methanosaeta (Narayanan et al. 2009). Stejně jako u rodu Metopus, i u rodu Trimyema bylo pozorováno několik různých 31

32 druhů archebakterií. U druhu Trimyema sp. se jednalo o druh Methanocorpusculum parvum (Finlay et al. 1993) a u druhu T. compressum šlo o druh Methanobrevibacter arboriphilicus (Shinzato et al. 2007). U nálevníka druhu Nyctotherus ovalis, jenţ ţije jako endosymbiont ve střevě termitů nebo švábů, byl popsán rod Methanobrevibacter (Gijzen et al. 1991; Gijzen a Barugahare 1992). Společně můţeme všechny tyto rody zařadit do dvou hlavních řádů, a to Methanobacteriales (rody Methanobacterium, Methanoplanus a Methanobrevibacter) a Methanomicrobiales (rody Methanosaeta a Methanocorpusculum). Předpokládá se, ţe k této symbióze mezi nálevníky a metanogenními archebakteriemi došlo opakovaně a nezávisle na sobě. Dále můţeme očekávat, ţe některé tyto vztahy mohly vzniknout relativně nedávno (Embley a Finlay 1993). Obr. 9. Endosymbiotické bakterie (B) okolo hydrogenosomu (M) druhu Nyctotherus ovalis. Podle Gijzen et al. (1991). 32

33 3. Materiál a metody 3.1. Kultivace anaerobních nálevníků a získávání nových izolátů Složení a příprava používaných médií Sonnebornovo parameciové médium (ATCC # 802): Tab. 1. Sonnebornovo parameciové médium (ATCC # 802) Cereal Grass Media (Scholar Chemistry) Na 2 HPO 4 destilovaná voda 1,25 g 0,25 g doplnit do 500 ml Přípravek Cereal Grass Media byl nasypán do destilované vody a nechal se 5 minut vařit. Po zchladnutí bylo médium přefiltrováno pomocí filtračního papíru, doplněno do 500 ml a nalito do 0,5 l láhve. Nakonec byl k médiu přidán Na 2 HPO 4. Hotové médium bylo autoklávováno. Mořské 802 médium (ATCC # 1525): Nejdříve bylo připraveno dvakrát koncentrované ATCC # 802 médium (viz výše), ale nebyl do něho přidán Na 2 HPO 4. Poté byla připravena 2x koncentrovaná umělá mořská voda, která byla pomocí sterilizačního filtru přefiltrována do vychladlého dvakrát koncentrovaného ATCC # 802 média. Tab. 2. 2x koncentrovaná umělá mořská voda NaCl KCl CaCl 2 2H 2 O MgCl 2 6H 2 O MgSO 4 7H 2 O NaHCO 3 destilovaná voda 24,71 g 0,68 g 1,36 g 4,66 g 6,3 g 0,18 g doplnit do 500 ml 33

34 Tekuté LB Broth médium Tab. 3. LB Broth médium LB Broth (Sigma) destilovaná voda 5 g Doplnit do500 ml Prášek LB Broth byl rozpuštěn v destilované vodě a poté vyklávován v autoklávu. Takto připravené médium se později pouţilo při klonování (viz kap. 3.5.) jako ţivné médium pro bakterie. Pevné LB Broth médium Tab. 4. Směs agaru a LB Broth na Petriho misky LB Broth (Sigma) Bakteriologický agar (Oxoid Limited, UK) destilovaná voda 10 g 6 g Doplnit do 500 ml Nejprve byl prášek LB Broth rozpuštěn v destilované vodě, poté byl do roztoku přidán bakteriologický agar. Médium bylo autoklávováno a rozplněno do Petriho misek. Ty se pak pouţily při klonování (viz kap.3.5.) Příprava umělého anaerobního prostředí Pro přípravu umělého anaerobního prostředí byly pouţity sáčky AnaeroGen (Oxoid), které byly společně s vybranými izoláty vkládány do anaerostatu. Pomocí sáčku AnaeroGen 2.5 l (Oxoid) v něm byla vytvořena umělá anaerobní atmosféra Získávání nových izolátů Vzorky kultur byly odebírány z mikrooxických nebo anoxických sladkovodních sedimentů. Poté byl 1 ml získaného materiálu přeočkován do 9 ml ATCC # 802 média. Po čtrnácti dnech byla kultura přeočkována a dále pak kaţdý týden znovu očkována. 34

35 Kultivace anaerobních nálevníků Sladkovodní izoláty byly kultivovány v ATCC # 802 médiu a mořské kultury v ATCC # 1525 médiu. Kultivace probíhala při pokojové teplotě (asi 23 C). Jednotlivé kultury byly přeočkovány jednou za týden. Některé izoláty byly drţeny v uměle vytvořené anaerobní atmosféře, kde byly očkovány jednou týdně. Inokulum bylo 1 ml Izolace DNA Před vlastní izolací DNA bylo ze zkumavky odebráno 2 ml vzorku a stočeno na 7 minut/1000g. Bylo odebráno 1900 μl supernatantu a zbylých 100 μl bylo resuspendováno a pouţito pro vlastní izolaci DNA. K izolaci DNA byl pouţit kit DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) dle protokolu Purification of total DNA from animal blood or cells (spin column protocol) nebo kit ZR Genomic DNA II Kit TM (Zymo Research) podle protokolu Cell suspension and proteinase K digested samples. DNA byla uchovávána v -20 C Amplifikace a elektroforéza DNA Amplifikace DNA Amplifikace DNA byla prováděna pomocí LA polymerázy (5 U/μl; Top-Bio). Při amplifikaci byly pouţity univerzální eukaryotické primery (Medlin et al. 1988). V následujících tabulkách je shrnuto sloţení reakčních směsí při pouţití LA polymerázy a nastavení teplotního cyklu v termocykléru pro LA polymerázu. Tab. 5. Použité primery Medlin A Medlin B AYCTGGTTGAYYTGCCAG TGATCCATCTGCAGGTTCACCT 35

36 Tab. 6. Složení reakční směsy s LA polymerázou (Top-Bio) LA pufr (10x konc., + MgCl2) dntp (10 mm kaţdý) DMSO Medlin A Medlin B La polymeráza DNA H2O 5 μl 1,5 μl 1 μl 12,5 pmol 12,5 pmol 0,5 μl aţ 5 ng doplnit do 50 μl PCR reakce probíhala v termocykléru při nastavení teplotního cyklu: Tab. 7. Nastavení teplotního cyklu při použití LA polymerázy počet cyklů teplota čas část cyklu 1x 94 C 1 min počáteční denaturace 94 C 20 sec denaturace 31x 55 C 30 sec nasednutí primerů 68 C 2 min 30 sec polymerace 1x 68 C 10 min závěrečná polymerace Elektroforéza amplifikované DNA Elektroforéza byla provedena na 1% horizontálním gelu. Pro zvýraznění jednotlivých fragmentů byl přidán ethidiumbromid (finální koncentrace 0,5 μg/ml). Obraz elektroforetického gelu byl vyfocen digitálním fotoaparátem a pomocí programu Alpha DigiDoc RT (Innovantion) byl převeden do počítače a zpracován Purifikace PCR produktů Pokud byl na elektroforetickém záznamu zviditelněný pouze jeden naamplifikovaný fragment, byl PCR produkt přečištěn pomocí kitu QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) dle protokolu QIAquick PCR Purification Kit Protocol, Using a Microcentrifuge. DNA byla eluována do 25 μl EB pufru a skladována při -20 C. Výsledná koncentrace DNA ve vzorku byla změřena na nanodropu, tj. na spektrofotometru pro měření koncentrace DNA v mikroobjemu (NanoDrop ND-1000) a poslána na sekvenaci. 36

37 V případě, ţe bylo naamplifikováno více fragmentů, byla část gelu s fragmentem poţadované délky vyříznuta a přečištěna kitem Zymoclean TM Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research) a DNA byla eluována do 6 8 μl sterilní miliq H 2 O Klonování Pokud došlo k naamplifikování několika fragmentů nebo v případě, ţe v kultuře bylo přítomno více druhů nálevníků, bylo nutné přečištěný vzorek zaklonovat. K tomu byl pouţit klonovací kit pgem-t Easy Vector System (Promega) a kompetenční buňky Escherichia coli JM109 High Efficiency Competent Cells (Promega) Příprava ligační směsi Tab. 8. Složení ligační směsi 2x ligační pufr vektor pgem T-easy ligáza DNA 5 μl 1 μl 1 μl asi 50 ng Vzorek se po namíchání krátce ztočil a nechal se přes noc v lednici při 4 C Příprava bakteriálních kolonií 1. Všechna ligační směs byla opatrně přidána do rozmrzlých kompetečních buněk a nechala se 20 minut na ledu. 2. Mikrozkumavka s buňkami byla vloţena na 45 sekund do 42 C. Po uplynutí času byla zkumavka znovu vrácena na led na 2 minuty. 3. Po 2 minutách bylo do zkumavky opatrně přidáno 800 μl LB média a buňky se nechaly na třepačce (37 C, 220 rpm) 1,5 hodiny inkubovat. 4. Mezitím byla připravena směs na potírání Petriho misek, která se na ně poté na ně natřela. 5. Po skončení inkubace bylo na připravené Petriho misky natřeno 150 μl buněk. 6. Plotny byly dány přes noc do termostatu o teplotě 37 C. 37

38 Příprava směsi na potírání Petriho misek Tab. 9. Směs na potírání Petriho misek IPTG (23,83 μg/ml) ampicilin (100 μg/ml) X-gal (50 μg/ml) 100 μl 25 μl 20 μl Colony PCR Pomocí sterilní špičky automatické pipety bylo od kaţdého izolátu odebráno kolem 10 bílých kolonií. Bakerie byly resuspendovány v 9 μl vody, která byla předem napipetována do mikrozkumavek. Takto připravené vzorky byly vloţeny do termocykléru. Tab. 10. Nastavení degradačního teplotního cyklu 1x 96 C 5 min 1x 50 C 1 min 50 sec 1x 96 C 1 min 50 sec 1x 45 C 1 min 1x 96 C 1 min 1x 40 C 1 min Rozpuštěná DNA ve vodě byla pouţita pro PCR reakci. Při amplifikaci byly pouţity primery T7 a SP6 komplementární k vektoru. Tab. 11. Použité primery Primer SP6 Primer T7 GATTTAGGTGACACTATAG TAATACGACTCACTATAGGG 38

39 Tab. 12. Složení reakční směsy při použití Combi PPP Master Mix (Top-Bio) Combi PPP Master Mix primer SP6 primer T7 bakteriální lyzát 10 μl 10 pmol 10 pmol 9 μl Tab. 13. Nastavení teplotního cyklu při použití Combi PPP Master Mix (Top-Bio) počet cyklů teplota čas část cyklu 1x 94 C 4 min počáteční denaturace 94 C 30 sec denaturace 31x 50 C 30 sec nasednutí primerů 72 C 2 min 30 sec polymerace 1x 72 C 10 min závěrečná polymerace Přítomnost naamplifikovaného fragmentu byla ověřen na horizontální elektroforéze. Pokud vyšel pozitivní výsledek, byl vzorek přečištěn pomocí kitu (viz kap. 3.4.). Výsledná koncentrace DNA byla změřena na nanodropu a poslána na sekvenaci. Jakmile nám vyšla nízká koncentrace DNA nebo jsme věděli, ţe nám DNA nebude stačit na všechny sekvenační reakce, dali jsme bakteriální kolonie napěstovat a následující den jsme z nich vyizolovali plasmidy Izolace plasmidů 1. Vybrané kolonie byly pomocí špičky automatické pipety přeneseny do zkumavky se 4 ml LB média a 4 μl ampicilinu (100 μl/ml) a pěstovány přes noc v třepačce (37 C/220 rpm). 2. Izolace plasmidů byla provedena kitem Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega). 3. Mnoţství DNA bylo změřeno na nanodropu a plasmid byl poslán na sekvenaci. 4. Zbylá plasmidová DNA byla skladována v -20 C. 39

40 3.6. Sekvenace DNA Sekvenace DNA byla provedena v Laboratoři sekvenace DNA na PřF UK. Vzorky pro sekvenační reakci byly připravovány do mikrozkumavek smícháním templátové DNA, primeru a vody (viz tab. 14). Tab. 14. Složení sekvenační směsy DNA primer H 2 O 100 ng/1 kbp 3,2 pmol doplnit do 14 μl Tab. 15. Použité primery Medlin A Medlin B SP6 T7 577F 577R 1262F AYCTGGTTGAYYTGCCAG TGATCCATCTGCAGGTTCACCT GATTTAGGTGACACTATAG TAATACGACTCACTATAGGG GCCAGCMGCCGCGGT ACCGCGGCKGCTGGC GGTGGTGCATGGCCG 3.7. Vyhodnocování sekvencí a fylogenetická analýza Jednotlivé osekvenované části sekvencí byly sloţeny v programu SeqMan (součást programového balíku DNASTAR). Z konečných sekvencí byly odstraněny sekvence primerů Tvorba a úprava alignmentu Alignment byl vytvořen metodou MAFFT (Katoh et al. 2002) pomocí internetového serveru Byl vybrán algoritmus G-INS-i, ostatní parametry zůstaly nezměněny. Výsledný alignment byl ručně upraven v programu BioEdit (Hall 1999). Z alignmentu byly odstraněny variabilní oblasti, u kterých jsme si nemohli být jisti, ţe byly správně zalignovány. Začátek a konec byl ořezán tak, aby všechny sekvence začínaly a končily stejně. U neúplných sekvencí byl začátek a konec nahrazen neurčitými bázemi (n). 40

41 Tvorba fylogenetických stromů Fylogenetické stromy byly konstruovány metodou maximum likelihood a Bayesovskou metodou. Analýza maximum likelihood byla provedena v programu RaxML (Stamatakis 2006) s modelem GTRGAMMAI. V tomto programu byla provedena i bootstrapová analýza s 1000 replikáty. Konsensuální strom byl konstruován v programu Consense programového balíku Phylip 3.69 (Felsenstein 1989), v jeho uzlech byla čísla bootstrapové hodnoty. Bayesovská analýza byla provedena v programu MrBayes (Huelsenbeck a Ronquist 2001) s modelem GTR + Γ + I + covarion. Ostatní parametry zůstaly nezměněny. Počet generací byl nastaven tak, aby odchylka dvou samostatně běţících analýz (původní nastavení programu) za posledních 75 % generací byla menší neţ 0,01. Perioda burn-in byla stanovena jako prvních 25 % generací. Program MrBayes dále spočítal Bayesovské posteriorní pravděpodobnosti jednotlivých větví Morfologie Nativní preparáty byly pozorovány mikroskopem Olympus BX 51 s pouţitím Nomarského diferenciálního interferenčního kontrastu. Pozorované objekty byly snímány kamerou Olympus DP70/DP71 a zpracovány v programu Quick PHOTO CAMERA 2.3. Kromě těchto nativních preparátů byly pozorovány i preparáty obarvené protargolem. Preparáty byly zapůjčené ze sbírky PřF UK. Během barvení protargolem se postupovalo dle protokolu podle Nie (1950), který byl modifikován (viz Ptáčková 2010). Preparáty barvené protargolem byly pozorovány pod normálním světlem s pouţitím modrého filtru. 41

42 4. Výsledky 4.1. Izoláty Vzorky sladkovodních izolátů byly nejčastěji nasbírány v České republice, ale máme k dispozici i vzorky z ciziny (viz tab. 16). Do dnešní doby úspěšně kultivuji 29 různých izolátů s různými druhy nálevníků. Izolát GRUBER zanikl, ostatní kultury jsou k dispozici na Katedře zoologie PřF UK. Vzorky nejčastěji nasbírali kolegové z PřF UK a čtyři izoláty z České republiky jsem získala já, z toho jsme pro naše účely pouţili pouze jeden (KLEPAC). V ostatních izolátech nenarostli nálevníci. Většinu izolátů mi poskytli RNDr. Ivan Čepička, Ph.D. a Mgr. Eliška Ptáčková, izolát VLH1 jsme obdrţeli od Mgr. Vladimíra Hampla, Ph.D. Ve většině izolátů se kromě nálevníků vyskytovaly i jiné organismy. Nejčastěji se jednalo o zástupce ze skupin Heterolobosea, Euglenozoa a Archamoebae. Přítomnost těchto organismů v kulturách neovlivnila naši práci na nálevnících. Všechny sladkovodní izoláty (VT2, HRAD1, HRAD2, BOTANKA, 3ML, SADSKA, SWAN4, KLEPAC, VLADECH, GRUBER, OLSRYB, CSS, IND5, QUEENSLAND, FRIOJESKYNE, RADUN, VIT9, SUSBARB, EVROS4B, MORETES, VLH1 a PANT3) byly kultivovány na ATCC #802 médiu, mořské izoláty (COORUNG2B, LARNAKA2N, LUC3, EVROS2, BALIKMARAN, VIT1AN a LAGOS) na ATCC #1525 médiu. Izolát LIVADIAN byl kultivován ve dvoufázovém Dobell-Leidlaw médiu. Toto médium se v naší laboratoři rutinně pouţívá pro pěstování trichomonád, retortamonád a dalších prvoků izolovaných z trávicího traktu ţivočichů. V kultuře LIVADIAN jsou kromě našeho nálevníka přítomny i volně ţijící trichomonády (Yubuki et al. 2010). Izoláty LARNAKA2N, LUC3, IND5 a LIVADIAN byly na několik týdnů dány do anaerostatu, abychom zjistili, zda budou schopné přeţít anaerobní podmínky. Ukázalo se, ţe jsou schopné přeţít. 42

43 Tab. 16. Získané izoláty Izolát Lokalita Souřadnice Habitat 3ML Třetí Mlýn, Chomutov, ČR 50 o 29 S, 13 o 20 V strouha BALIKMARAN Balikpapan, Borneo, 1 20 S, V Indonésie mořský sediment BOTANKA Botanická zahrada PřF UK, 50 o 04 S, 14 o 25 V Praha, ČR jezírko COORUNG2B Národní park Coorong, Salt 36 o 07 S, 139 o 38 V Creek, Severní Amerika mořský sediment CSS Jetřichovice, Českosaské S, V Švýcarsko, ČR kaluţ EVROS2 delta řeky Evros, Řecko 40 o 48 S, 26 o 00 V sladkovodní sediment EVROS4B delta řeky Evros, Řecko 40 o 50 S, 26 o 03 V sladkovodní sediment FRIOJESKYNE Ribeiro Frio, Madeira S, V sladkovodní sediment GRUBER Gruberova studánka, ČR 48 o 48 S, 15 o 38 V sladkovodní sediment HRAD1 vrch Hradiště u Chomutova, 50 o 27 S, 13 o 20 V ČR sladkovodní sediment HRAD2 vrch Hradiště u Chomutova, 50 o 27 S, 13 o 20 V ČR sladkovodní sediment IND5 Bhangarh, Indie 27 o 05 S, 76 o 17 V sladkovodní sediment KLEPAC hora Klepáč, Králický 50 o 09 S, 16 o 47 V Sněţník, ČR sladkovodní sediment LAGOS Lagos, Řecko 41 o 00 S, 25 o 06 V Mořský sediment LARNAKA2N Larnaka, Kypr 34 o 51 S, 33 o 37 V mořský sediment LIVADIAN Jezero u Středozemního 34 o 58 S, 33 o 39 V moře, Kypr sediment o neznámé salinitě LUC3 Ostrov Brač, Chorvatsko 43 o 23 S, 16 o 34 V mořský sediment MORETES Morretes, Brazilíe 25 o 26 J, 48 o 47 Z sladkovodní sediment OLSRYB Olšanský Rybník, Praha, ČR 50 o 0 S, 14 o 29 V sladkovodní sediment PANT3 Národní park Pantanal, 16 o 47 J, 56 o 51 Z Brazílie sladkovodní sediment QUEENSLAND Cooktown, QLD 15 o 27 J, 145 o 58 V sladkovodní sediment RADUN Raduň, ČR S, V rybníček SADSKA Sadská, ČR 50 9 S, V sladkovodní sediment SUSBARB Národní park Bako, Borneo, 1 43 S, V Malajsie sladkovodní sediment SWAN4A Perth, Swan river, WA 31 o 56 J, 115 o 53 V sladkovodní sediment SWAN4B Perth, Swan river, WA 31 o 56 J, 115 o 53 V sladkovodní sediment VIT1AN Kamenice, ČR 49 o 54 S, 14 o 35 V sladkovodní sediment VIT9 Kamenice, ČR 49 o 54 S, 14 o 35 V sladkovodní sediment VLADECH Česká republika nespecifikováno sladkovodní sediment VT2 rybník Velký Tisý, ČR 49 o 4 S, 14 o 42 V sladkovodní sediment 43

44 4.2. Fylogenetická analýza Celkem bylo získáno 36 sekvencí SSU rdna, z toho 16 jich bylo ze třídy Armophorea, 10 ze třídy Plagiopylea, 5 sekvencí rodu Cyclidium, 1 sekvence izolátu LIVADIAN a zbývající 4 sekvence od různých nálevníků, jiţ patřili mezi aerobní druhy. Celkem bylo provedeno 11 fylogenetických analýz SSU rdna. Fylogenetické stromy ze sekvencí genu pro SSU rrna (obr ) byly konstruovány metodou maximum likelihood a Bayesovskou metodou Třída Armophorea Kromě našich nově získaných sekvencí SSU rdna bylo pouţito 25 sekvencí různých zástupců třídy Armophorea získané z databáze GenBank. Jako outgroup byly pouţity 4 sekvence nálevníků ze třídy Litostomatea a 5 sekvencí nálevníků ze třídy Spirotrichea. Třídy Litostomatea a Spirotrichea jsou nejpříbuznější skupiny ke třídě Armophorea (Vďačný et al. 2010b). Třída Armophorea nám vyšla jako monofyletická skupina, která je ale statisticky slabě podpořena (bootstrap 61; posterior probability (PP) 0,55). Podle naší analýzy se třída Armophorea dělí na 12 odlišných linií (A L), viz obr. 10. Jednotlivé vztahy mezi nimi nebyly rozřešeny, navíc se výsledky podle obou pouţitých metod v některých případech lišily. Naše izoláty se vyskytují v liniích C, D, F, G, I, J a K. Linie A I patří do řádu Armophorida, linie L je tvořena řádem Clevelandellida. Linie J a K, které zastupují naši dva nálevníci GRUBER a VLADECH klon 4, nemůţeme zařadit ani do jednoho řádu. Na základě našich výsledků se jedná o skupiny příbuzné řádu Clevelandellida. Jako první se oddělila linie A, jeţ zahrnuje rod Caenomorpha a enviromentální sekvenci DQ Další odvětvující se skupinou byla linie B s nekultivovaným nálevníkem AB Následující skupiny C a D jsou tvořeny dvěma environmentálními sekvencemi a našimi organismy SWAN4B, PANT3, VLH1, MORETES, VLADECH klon 1 a RADUN. Linie E je zastoupena jedním nekultivovaným nálevníkem, dále rodem Brachonella a jemu příbuznými izoláty VIT9, SUSBARB a EVROS4B. Izolát FRIOJESKYNE tvoří samostatnou skupinu F. Následující skupina G zahrnuje environmentální sekvence a jeden popsaný druh Metopus contortus. Tomuto druhu je příbuzný náš izolát QUEENSLAND (bootstrap 96; PP 1). Poté se odděluje linie H, ve které se nachází jeden nekultivovaný nálevník. Linie I je zastoupena popsaným druhem Metopus palaeformis, k němuţ jsou příbuzné naše izoláty HRAD2, OLSRYB, CSS a IND5. Celá tato skupina je středně podpořena (bootstrap 69; 44

45 PP 0,82). Poslední dvě naše sekvence, GRUBER a VLADECH klon 4, vytvářejí jiţ zmiňované skupiny J a K. Izolát GRUBER nám při předběţných analýzách pokaţdé přeskakoval na jiná místa. Zřejmě to bylo dáno tím, ţe jsme měli k dispozici pouze částečnou sekvenci SSU rdna, jeţ je dlouhá 575 bp. Proto jsme provedli i molekulárně fylogenetickou analýzu bez tohoto izolátu. Výsledná topologie fylogenetického stromu se nezměnila, sekvence VLADECH klon 4 byla stále příbuzná řádu Clevelandellida (data nejsou zařazena do výsledků). Poslední oddělující se skupinou je jiţ zmiňovaný řád Clevelandellida. 45

46 Obr. 10. Fylogenetická analýza SSU rdna třídy Armophorea. Strom byl konstruován metodou maximum likelihood v programu RaxML. Čísla v uzlech představují hodnotu bootstrapu z maximum likelihood analýzy a posterior probability z Bayesovské analýzy, hodnoty < 50/0,5 jsou označeny hvězdičkou (*). Mořské organismy jsou označeny plusem (+). Strom je zakořeněn sekvencemi ze třídy Spirotrichea. 46

47 Třída Plagiopylea Podařilo se nám osekvenovat 9 (3 mořské a 6 sladkovodní) izolátů rodu Trimyema. Kromě našich nově získaných sekvencí jsme v analýze pouţili 51 sekvenci organismů třídy Plagiopylea získaných z databáze GenBank. Většinou patřily nekultivovaným nálevníkům. Rod Trimyema se podle našich výsledků rozpadl na 9 linií (viz obr. 11), fylogenetické vztahy mezi jednotlivými liniemi však nebyly vyřešeny. Rod Trimyema je monofyletická (bootstrap 100; PP 1). Aţ na druhy Trimyema koreanum, T. minutum a T. compressum se jednalo o neurčené nálevníky. Jako první se oddělila linie A, kterou tvořily dva nekultivovaní nálevníci. Poté následovala linie B s rodem T. koreanum a čtyřmi environmentálními sekvencemi. Izolát EVROS2 tvoří samostatnou linii C. Kultury BALIKMARAN a LAGOS vytvořily skupinu D. Dále následovala skupina E s druhem T. minutum. Následující skupinu F představovalo devět nekultivovaných nálevníků. Za ní se oddělila skupina G, ve které byl náš izolát VT2. Předposlední linii H utvořil druh T. compressum a do poslední skupiny I spadaly naše izoláty HRAD1, BOTANKA, 3ML, VIT1AN a SADSKA a T. sp. Z

48 Obr. 11. Fylogenetická analýza SSU rdna třídy Plagiopylea. Strom byl konstruován metodou maximum likelihood v programu RaxML. Čísla v uzlech představují hodnotu bootstrapu z maximum likelihood analýzy a posterior probability z Bayesovské analýzy, hodnoty < 50/0,5 jsou označeny hvězdičkou (*). Mořské organismy jsou označeny plusem (+). Strom je zakořeněn druhem Epalxella antiquorum a jí příbuznými environmentálními sekvencemi. 48

49 Rod Cyclidium Rod Cyclidium náleţí do třídy Oligohymenophorea a podtřídy Scuticociliatia. Podařilo se nám osekvenovat 1 sladkovodní a 4 mořské izoláty rodu Cyclidium. Kromě těchto 5 sekvencí jsme pro molekulárně fylogenetickou analýzu vyuţili 41 sekvenci z podtřídy Scuticociliatia z databáze GenBank. Jako outgroop jsme pouţili zástupce dalších podtříd třídy Oligohymenophorea: podtřída Peniculida (5 sekvencí), podtřída Peritrichia (5 sekvencí), podtřída Apostomatia (3 sekvence), podtřída Hymenostomatia (3 sekvence) a podtřída Astomatia (2 sekvence). Podtřída Scuticociliatia vytvořila polyfyletickou skupinu a rozpadla se na skupiny Loxocephalida 1, Loxocephalida 2, Pleuronematida 1, Pleuronematida 2 a Philasterida (viz obr. 12). Jako první se oddělila Loxocephalida 1. Do této skupiny patří druh Dexitrichides pangi. Tento druh se nám přiřadil ke druhu Urocentrum turbo, který náleţí do podtřídy Peniculia. Tedy mimo podtřídu Scuticociliatia. Poté následovaly skupiny Loxocephalida 2, Pleuronematida 1, Pleuronematida 2 a jako poslední se oddělila skupina Philasterida. Tento výsledek se shoduje s jiţ publikovanými studiemi (např. Zhang et al. 2010). Naše nově osekvenované izoláty LARNAKA2N, COORUNG2B, LUC3 a SWAN4 náleţely do skupiny Pleuronematida 1. O druh Cyclidium porcatum se jedná v případě izolátu SWAN4, o zbylých třech našich nálevnících více nevíme, protoţe se odvětvují ve skupinách jinak obsahujících pouze environmentální sekvence. Izolát EVROS2 je příbuzný druhu Cyclidium glaucoma a patří do skupiny Pleuronematida 2. 49

50 Obr. 12. Fylogenetická analýza SSU rdna rodu Cyclidium. Strom byl konstruován metodou maximum likelihood v programu RaxML. Čísla v uzlech představují hodnotu bootstrapu z maximum likelihood analýzy a posterior probability z Bayesovské analýzy, hodnoty < 50/0,5 jsou označeny hvězdičkou (*). Mořské organismy jsou označeny plusem (+). Strom je zakořeněn podtřídou Peritrichia. 50

51 LIVADIAN Nálevník z kultury LIVADIAN pochází z Kypru. Sekvenci tohoto nálevníka jsme vyhodnotili pomocí metody BLAST, která se nachází na internetovém serveru Na základě výsledků této metody jsme pro fylogenetické analýzy pouţili kromě sekvence LIVADIAN dalších 74 sekvencí nálevníků. Jako outgroop byly pouţity sekvence zástupců třídy Oligohymenophorea (15 sekvencí). Kromě této třídy byly do datasetu zařazeny i sekvence tříd Prostomatea (14 sekvencí) a Plagipoylea (4 sekvence). Podle našich analýz se sekvence rozdělily do 11 linií. Fylogenetické vztahy mezi těmito skupinami nebyly rozřešeny (obr. 13A). Třída Prostomatea v našem případě vyšla jako polyfyletická skupina. Druhy Cryptocaryon irritans a Urotricha sp. EU se přiřadily k nálevníkům mimo třídu Prostomatea. Nálevník LIVADIAN se dvěma enviromentálními sekvencemi vytvořil samostatnou skupinu, ke které byly příbuzné třídy Prostomatea a Plagiopylea. Kromě těchto dvou tříd byly k izolátu LIVADIAN příbuzné i další skupiny. Ty ale obsahovaly environmentální sekvence, proto o nich nemůţeme téměř nic říci. Kromě této analýzy jsme provedli ještě jednu fylogenetickou analýzu, tentokrát bez environmentálních sekvencí (viz obr. 13B). Izolát LIVADIAN se přiřadil ke druhu Urotricha sp. EU024981, ale bez statistické podpory (bootstrap < 50, PP < 0,50). Ten náleţí do třídy Prostomatea. K této skupině byly příbuzné třídy Plagiopylea, dále skupina, jeţ je tvořena rodem Paraspathidium, a nakonec skupina, ve které jsou druhy Cryptocaryon irritans a Askenasia sp. EU

52 Obr. 13. Fylogenetická analýza SSU rdna izolátu LIVADIAN. Strom byl konstruován metodou maximum likelihood v programu RaxML. Čísla v uzlech představují hodnotu bootstrapu z maximum likelihood analýzy a posterior probability z Bayesovské analýzy, hodnoty < 50/0,5 jsou označeny hvězdičkou (*). Mořské organismy jsou označeny plusem (+). A: s environmentálními sekvencemi; B: bez environmentálních sekvencí. Strom není zakořeněn. 52

53 4.3. Ostatní nálevníci Kromě anaerobních nálevníků se nám podařilo osekvenovat i SSU rdna druhů, které byly aerobní. Jednalo se o izoláty KLEPAC, EVROS2, VLADECH a SWAN4A. U těchto druhů jsme neprováděli fylogenetické analýzy. Jednotlivé sekvence jsme vyhodnotili metodou BLAST pomocí internetového serveru Fylogenetické stromy jsme převzali také z tohoto serveru. Izolát KLEPAC se nám přiřadil do třídy Oligohymenophorea a jednalo se o nálevníka příbuzného druhu Opisthonecta minima. Izolát EVROS2 byl příbuzný druhu Paranophrys magna a také náleţel do třídy Oligohymenophorea. V případě zbylých dvou izolátů VLADECH a SWAN4A šlo o zástupce třídy Colpodea a byly příbuzné druhu Cyrtolophosis mucicola (viz obr. 14). Obr. 14. Fylogenetická pozice aerobních izolátů KLEPAC, EVROS2, VLADECH a SWAN4A. ( 53

54 4.4. Morfologie Ţivé buňky byly pozorovány a nafoceny s pouţitím světelného mikroskopu a DIC. Mohli jsme tak sledovat způsob jejich pohybu a některé organely. V jednom případě se nám podařilo nafotit dělící se buňky. Pro zvýraznění některých struktur jsme obarvili několik izolátů nálevníků protargolem. Po obarvení jsme tak mohli na jednotlivých preparátech vidět různé tvary makronukleů, mikronukleus, bičíky, orální aparát a kinetidy. Izoláty: Třída Armophorea Jedná se o organismy velkých rozměrů (okolo 80 µm)s tělem zatočeným jednou (obr. 15 B E, G, H, J) nebo dvakrát (obr. 15 A, F) doleva. Jednotliví zástupci se od sebe navzájem liší tvarem těla. Pozorovali jsme organismy, které měly štíhlé, podlouhlé tělo (obr. 15 C, G, H, J), nebo byl tvar jejich těla kapkovitý (obr. 15 B, D, E) aţ téměř kulatý (obr. 15 A, F). Na ţivých buňkách byla na první pohled vidět pulzující vakuola. Dále byl rozeznatelný orální aparát a makronukleus. Na protargolových preparátech (obr. 18 A, B, C, E) došlo ke zvýraznění orální ciliatury, kinetid a makronuleu. Makronukleus se nacházel buď v přední části, nebo uprostřed těla. Jednotlivé makronukley se lišily tvarem (kulatý, fazolovitý, zakroucený atd.) a v jeho blízkosti se nacházel mikronukleus. Třída Plagiopylea Do této třídy patří nálevníci, kteří jsou mnohem menších rozměrů neţ organismy náleţící do třídy Armophorea. Ţivé buňky jsou velké okolo 30 µm. Jednotliví zástupci se tvarově od sebe navzájem téměř neliší. Tvar těla je oválný aţ téměř kulatý, na konci těla je patrné kaudální cilium (viz obr. 16). Makronukleus jsme na ţivých buňkách téměř nepozorovali. Pulzující vakuola a orální aparát nebyly tak výrazné jako u předchozí třídy. Na protargolových preparátech (obr. 19A - D) byl na první pohled vidět výrazný kulatý makronukleus. Nacházel se uprostřed těla a v jeho blízkosti jsme mohli vidět mikronukleus. V přední části těla se nacházel subapikální orální aparát, který je pro rod Trimyema typický. Na konci těla jsme mohli pozorovat kaudální cilium. LIVADIAN Jedná se o nálevníka podobných rozměrů jako u třídy Armophorea. Tvar těla je oválný, dopředu zúţený, vybíhající v apikální orální aparát. Ţivé buňky jsou asi 70 µm dlouhé. 54

55 Na ţivých buňkách můţeme vidět výraznou pulzující vakuolu a makronukleus (viz obr. 17). Po obarvení protargolem došlo ke zvýraznění oválného makronukleu, jenţ se nachází uprostřed buňky nálevníka, a u kterého opět nalezneme mikronukleus. Kromě jader jsme mohli pozorovat orální aparát a kinety (obr. 18D). Rod Cyclidium Tento rod jsme pozorovali jenom na protargolových preparátech (izolát LARNAKA2N). Pro nedostatek času jsme se nezabývali focením ţivých buněk. Rod Cyclidium je velký přibliţně jako rod Trimyema (okolo 30 µm). Má oválný tvar buňky a na jejím konci nalezneme dlouhé kaudální cilium. V přední části těla je nápadný cytostom, makronukleus a mikronukleus (viz obr. 19E). 55

56 Obr. 15. Fotografie ţivých buněk izolátů náleţících do třídy Armophorea. A: izolát VLADECH; B: izolát IND5; C: izolát HRAD2; D: izolát MORETES; E: izolát RADUN; F: izolát VIT9; G: izolát CSS; H: izolát VLADECH;I: izolát MORETES-konjugace; J:izolát VLADECH. Měřítko 10 μm. 56

57 Obr. 16. Fotografie ţivých buněk izolátů náleţící do rodu Trimyema. A: izolát VIT1AN; B: izolát SADSKA; C: izolát VT2; D: izolát VIT1AN; E: izolát SADSKA; F: izolát VIT1AN; G: izolát 3ML; H: izolát SADSKA. Měřítko 10 μm. 57

58 Obr. 17. Fotografie ţivých buněk izolátu LIVADIAN. A, B, D: nálevník; C: orální aparát; E: pulzující vakuola. Měřítko 10 μm. 58

59 Obr. 18. Fotografie buněk nabarvených protargolem. A: izolát MORETES; B: izolát IND5; C: izolát EVROS4B; D: izolát LIVADIAN; E: izolát CSS. OC-orální ciliatura; Mic-mikronukleus, Macmakronukleus. Měřítko 20 μm. 59

60 Obr. 19. Fotografie buněk nabarvených protargolem. A: izolát VT2; B: izolát BALIKMARAN; C: izolát VIT1AN; D: izolát HRAD1; E: izolát LARNAKA2N. OC-orální ciliatura; Micmikronukleus; Mac-makronukleus; KC-kaudální cilie. Měřítko 20 μm. 60