Université Lille 2 Ecole Doctorale Biologie Santé. Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Laboratoire de pharmacognosie

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1 Université Lille 2 Ecole Doctorale Biologie anté Faculté des ciences Pharmaceutiques et Biologiques Laboratoire de pharmacognosie Institut Charles Violette LPAM Université de Carthage Institut National des ciences Appliquées et de Technologie Laboratoire des Plantes Aromatiques et Médicinales Centre de Biotechnologie de Borj Cédria THEE DE DOCTORAT En "ciences du médicament et des autres produits de santé" et En "Génie Biologique" ETUDE PHYTOCHIMIQUE DE QUELQUE PLANTE EXTREMOPHILE TUNIIENNNE ET EXPLORATION DE LEUR ACTIVITE BIOLOGIQUE Présentée par : Ramla AHLI Encadrée par : Pr. evser ahpaz Pr. Riadh Ksouri Co-encadrée par : Dr. Céline Rivière outenue le 13 juillet 2017, devant le Jury composé comme suit : Pr. Dominique Laurain-Mattar Université de Lorraine Président Pr. Ameur Cherif Université de la Manouba Examinateur Pr. Jean-Michel Mérillon Université de Bordeaux Rapporteur Pr. Imene Ouzari Université de Tunis El Manar Rapporteur Pr. evser ahpaz Université de Lille 2 Directrice de thèse Pr. Riadh Ksouri Université de Carthage Directeur de thèse ANNEE UNIVERITAIRE : 2016/2017

2 À mes soeurs, À mes parents

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4 Merci! Ce travail est le fruit de collaborations forgées sur la sincère volonté d offrir une contribution, quelle qu elle soit, à la recherche. Je tiens à remercier les Professeurs evser ahpaz et Riadh Ksouri, mes directeurs de thèse, pour avoir généreusement accueilli mon projet de thèse ; étant prompts à répondre à mes sollicitations, et ayant apporté le recul nécessaire sur certains problèmes qui me semblaient insolvables au premier abord. Un remerciement tout particulier à mon encadrante, le Dr Céline Rivière, qui a directement adopté mon projet de thèse ; et qui m a toujours accordé patience, soutien et confiance, me guidant constamment vers de nouvelles connaissances et formations enrichissantes. es compétences, notamment en identification structurale des molécules d origine naturelle, m ont été très précieuses. Par ailleurs, je n oublierai jamais ces moments plus informels, qui ont été l occasion pour moi de ne jamais se sentir dépaysée. Les Professeurs Jean-Michel Mérillon, Hadda-Imene Ouzari, Ameur Cherif et Dominique Laurain-Mattar, qui ont accepté de siéger dans le jury de cette thèse, doivent aussi trouver ici l expression de ma profonde reconnaissance. Je suis très reconnaissante aux Drs Karin éron et Yves Rouillé, ainsi qu à Marie- Emmanuelle ahuc, du Centre d'infection et d'immunité de Lille (CIIL, Institut Pasteur de Lille), pour avoir apporté la plus grande contribution scientifique à ce travail et pour avoir conduit la recherche jusqu au bout afin de caractériser le mode d action du dehydrojuncusol, nouvel inhibiteur du virus de l hépatite C. Je les remercie également pour s être rendus disponibles afin de nous communiquer le détail d avancement de leurs expériences lors de multiples réunions. Je remercie très sincèrement le Dr Ali iah pour avoir soutenu vivement ce travail en y apportant une approche plutôt originale qui s est avérée très prometteuse ; et pour m avoir offert des compétences précieuses, avec toute attention et patience. Je remercie également toute l équipe du laboratoire de Biotechnologie et Gestion des Agents Pathogènes en Agriculture (IA, Institut Charles Violette), en particulier le directeur, le Professeur Patrice Halama, et les doctorantes amara et Myriam, pour leur accueil chaleureux et pour leur soutien technique. Je remercie très chaleureusement, le Dr Christel Neut, pour avoir porté un grand intérêt à ce travail en accueillant vivement mes manipulations dans le laboratoire de bactériologie (INERM U995, Université de Lille 2), mais également en acceptant de faire partie de mon comité de suivi de thèse. L éclairage en bactériologie qu elle a su apporter dans le

5 cadre de ce travail a été un atout indéniable. Je remercie aussi toute l équipe du laboratoire de bactériologie, y compris Oumaïra, Isabelle, éverine, Carole et Charlotte pour leur soutien, aussi bien sur le plan technique, que par l ambiance fort conviviale qu elles offrent. Je remercie le Professeur Joëlle Quetin-Leclercq pour avoir suivi de près mon travail en mettant à disponibilité les compétences du laboratoire de pharmacognosie (Université Catholique de Louvain) au service de ce travail, et en acceptant d être membre de mon comité de suivi de thèse, m apportant ainsi de précieux conseils. Je remercie également le Dr Joanne Bero et Claire Beaufay pour avoir participé vivement à ce travail en effectuant les analyses de cytotoxicité et en offrant les mesures nécessaires pour que nous puissions suivre et comprendre les expériences effectuées. Je suis très redevable au Professeur Nathalie Azaroual qui a généreusement assisté mes multiples expériences RMN et qui s est montrée particulièrement attentive à l égard de ce travail en nous offrant ses compétences dans l élucidation structurale d une de nos molécules, et ceci malgré son emploi du temps très chargé. Je remercie aussi toute l équipe du Laboratoire d'application de Résonance Magnétique Nucléaire (LARMN, Université de Lille 2), en particulier Vincent et Alexandre pour leur assistance et leur bienveillance, mais également Pierre de m avoir formée pour réaliser les expériences RMN. Je remercie vivement toute l équipe du Centre Universitaire de Mesures et d'analyses (CUMA-Université de Lille 2), le Professeur Jean-François Goossens, et l ensemble de ses collègues ( Nathalie Duhal, Céline Lenglart, Mike Howsam, Mostafa Kouach, Brigitte Callens), qui ont su se rendre disponibles pour effectuer les analyses en spectrométrie de masse nécessaires à ce travail, et ceci malgré les multiples charges qui leurs sont attribuées. Un grand merci à toute l équipe du laboratoire des Plantes Aromatique et Médicinales (CBBC) en Tunisie, en particulier au Dr Abderrazak maoui qui m a fortement soutenue lors du long travail d identification des plantes, en mettant à ma disposition ses compétences en botanique. Je remercie également Khaoula, Ahmed et Emna, pour toute l aide qu ils m ont apporté. Je remercie aussi Jennifer, Vincent, Thierry, imon, Malika, Cécile et Ayano qui ont veillé, avec compassion, au bon déroulement de ce travail, en offrant toute l assistance technique, des conseils pratiques, la maintenance des équipements et encore un soutien lors des moments difficiles. Je n oublierai pas non plus toutes nos discussions enrichissantes et parfois mêmes hilarantes! A mes collègues et amis, Ameni, Lætitia, Rym, Hishda, Moussa (Diop), Cédric, Charlie, Maryam et particulièrement Moussa, merci infiniment pour avoir rendu mon aventure de recherche agréable et passionnante, tous mes encouragements pour la suite! A mes sœurs Insaf et Emna, les mots me manquent pour vous remercier, le support que vous m avez apporté est tout simplement inestimable. A mes parents, un merci ne serait répondre à votre soutien, sans vous, je n aurais pas pu mener à bien ce travail.

6 OMMAIRE INTRODUCTION... 1 YNTHEE BIBLIOGRAPHIQUE... 4 I. Les plantes extrêmophiles réservoirs de biomolécules...5 I.1. Les plantes xérophytes...5 I.2. Les plantes halophytes...5 I.3. Le système antioxydant des halophytes et des xérophytes, une forme d adaptation performante...6 I.4. Les halophytes et les xérophytes, sources riches en composés phénoliques...6 II. Les composés phénoliques...8 II.1. Les acides phénoliques...9 II.1.1. Les dérivés de l acide hydroxybenzoïque...9 II.1.2. Les dérivés de l acide hydroxycinnamique...10 II.2. Les flavonoïdes...10 II.2.1. Les flavonoïdes au sens strict...11 II.2.2. Les autres flavonoïdes...13 II.3. Les stilbénoïdes...13 II.3.1. Les stilbènes et les bis(bibenzyls)...14 II.3.2. Les phénanthrènes...14

7 II.4. Les tanins...15 II.4.1. Les tanins galliques ou hydrolysables...15 II.4.2. Les tanins condensés...15 III. La richesse des plantes halophytes et xérophytes en polyphénols leur procurent diverses vertus antimicrobiennes...16 III.1. Applications dans la lutte biologique contre les pathogènes des plantes cultivées...17 III.1.1. Les polyphénols offrent aux halophytes et aux xérophytes un pouvoir antifongique prometteur sur les pathogènes des cultures...17 III.1.2. Zymoseptoria tritici, un des pathogènes menaçants des cultures de blé...18 III.2. Applications dans la santé humaine...22 III.2.1. Les halophytes et les xérophytes, des sources prometteuses en polyphénols anti-infectieux...22 III.2.2. Le problème de résistance aux antibiotiques...24 III.2.3. L hépatite C, une maladie persistante dans le secteur de la santé publique...28 IV. Cas des plantes étudiées...34 IV.1. Exploration des plantes halophytes et xérophytes dans leurs biotopes...34 IV.2. Présentation des plantes étudiées, utilisations traditionelles et données phytochimiques et pharmacologiques...36 IV.2.1. ilene succulenta Forsk IV.2.2. Atriplex tatarica L IV.2.3. Aeluropus littoralis Parl...39 IV.2.4. Limonium virgatum Willd IV.2.5. Juncus maritimus Lamk...43 IV.2.6.Atractylis serratuloides (Cass.) ieber ex Cass IV.2.7.cabiosa atropurpurea L. subsp. maritima (L.) Fiori & Paoli...50 IV.2.8.Cirsium scarbrum (Poir.) Bonnet & Barratte...51 REULTAT...57 I. Criblage biologique des plantes halophytes et xérophytes et initiation du fractionnement bioguidé pour les plantes les plus actives...59 II. Cirsium scabrum : isolement et caractérisation des composés responsables de son activité cytotoxique et révélation de son potentiel antibactérien...99 III. Juncus maritimus : activités antivirale (virus de l hépatite C) et antibactérienne...127

8 III.1. Identification du composé responsable de l activité de J. maritimus sur le virus de l hépatite C et caractérisation de son activité III.2.Purification de composés minoritaires et analyse de leurs activités sur le virus de l hépatite C III.2.1. Processus de purification des composés III.2.2. Identification de certains des composés isolés III.2.3. Analyse de l activité de certains des composés purifiés sur le virus de l hépatite C (VHC) III.3. Fractionnement bioguidé du sous-extrait responsable de l activité antibactérienne de J. maritimus et détermination des composés les plus actifs III.3.1. Analyse de l activité antibactérienne sur une nouvelle collection de bactéries à Gram positif III.3.2. Détermination de la CMB du sous-extrait le plus actif sur les souches treptococcus dysgalactiae T46C14 et treptococcus pyogenes III.3.3. Détermination de la CMB du sous-extrait le plus actif sur d autres souches de. pyogenes III.3.4. Localisation des composés potentiellement actifs sur. pyogenes III.3.5. Analyse de l activité antibactérienne des composés purifiés sur. pyogenes IV. Exploration des effets des plantes halophytes et xérophytes sur la santé du végétal, l exemple de la septoriose du blé CONCLUION GENERALE...195

9 LITE DE FIGURE Figure 1. Voiesde biosynthèse simplifiée des flavonoïdes...9 Figure 2. tructure de base des flavonoïdes...10 Figure 3. tructure de base des différentes classes des flavonoïdes...11 Figure 4. tructures de base de stilbénoïdes...14 Figure 5. Exemples de dérivés phénanthréniques chez des halophytes (Juncus)...14 Figure 6. Exemples d ellagitanins chez une espèce halophyte ( Terminalia catappa, Combretacées)...15 Figure 7. Cycle biologique simplifié de Mycosphaerella graminicola...19 Figure 8. Lésions sporulantes à la surface d une feuille de blé...20 Figure 9. Mode d action des antibiotiques...25 Figure 10. Virus de l hépatite C : schéma de la structure et organisation du génome...29 Figure 11. Principales étapes du cycle de réplication du VHC...31 Figure 12. chéma récapitulatif des modes d action d inhibiteurs du VHC d origine naturelle...32 Figure 13. Localisation des zones investiguées sur la carte de la Tunisie...34 Figure 14. ilene succulenta : sur terrain et collectée...36 Figure 15. Atriplex tatarica : sur terrain et collectée...37

10 Figure 16. Aeluropus littoralis : sur terrain et collectée...39 Figure 17. Limonium virgatum : sur terrain et collectée...40 Figure 18. Juncus maritimus : sur terrain et collectée...43 Figure 19. tructure de base des phénanthrènes et des dérivés 9,10- dihydrophénanthrènes...46 Figure 20. tructure de base des phénanthraquinones...46 Figure 21. tructure de base des phénanthrènes dimériques (liaison en C-1-1 )...46 Figure 22. Exemples de phénanthrènes monomériques dans le genre Juncus Figure 23. Atractylis serratuloides : sur terrain et collectée...48 Figure 24. cabiosa maritima : sur terrain et collectée...50 Figure 25. Cirsium scabrum: sur terrain et collectée...51 Figure 26. chéma de biosynthèse de certaines familles de triterpènes...54 Figure 27. Exemples de triterpènes retrouvés dans plusieurs espèces de Cirsium...55 Figure 28. tructure chimique du feruloyl tyramine...62 Figure 29. tructure chimique de la lutéoline...62 Figure 30. Molécules identifiées dans le sous-extrait éther de pétrole des feuilles de Cirsium scabrum Figure 31. tructures chimiques du juncusol et du dehydrojuncusol Figure 32. Chromatogramme de JMR-MC Figure 33. tratégie de purification des composés à partir de JMR-MC Figure 34. tructures chimiques des composés identifiées (JMR-MC) Figure 35. Localisation des composés purifiés sur le chromatogramme de JMR-MC.160 Figure 36. Effets des composés (juncunol, C10 et C12) sur l inhibition des 3 étapes principales du cycle du VHC, en comparaison avec le dehydrojuncusol Figure 37. chéma de la plaque utilisé pour les essais contre. dysgalactiae et. pyogenes...164

11 Figure 38. tructure chimique de la lutéoline Figure 39. tructure chimique du dehydrojuncusol Figure 40. tructure chimique du juncunol Figure 41. tructure chimique de la lutéoline...204

12 LITE DE TABLEAUX Tableau 1. Exemples de dérivés de l acide benzoïque identifiés chez des plantes halophytes...9 Tableau 2. Exemples de dérivés de l acide hydroxycinnamique rencontrés chez des plantes halophytes...10 Tableau 3. Exemples de flavones et de flavonols identifiés chez certaines plantes halophytes...12 Tableau 4. Exemples de flavanones identifiées chez des halophytes...12 Tableau 5. Molécules purifiées à partir d espèces du genre Limonium...42 Tableau 6. CMI (µg/ml) des sous extraits de JMR-CE, qui sont actifs sur les souches bactériennes (Gram +) Tableau 7. CMI et CMB (µg/ml) observées pour JMR -MC contre 8 souches de. pyogenes Tableau 8. CMI et CMB (en µg/ml) enregistrées pour les composés tes tés sur. pyogenes Tableau 9. Conditions de collectes des échantillons de rhizomes de Juncus maritimus (JMR2 à JMR7)...169

13 LITE DE ABREVIATION AG : Acide Gallique CCM : Chromatographie sur Couche Mince CI50 : La concentration inhibitrice à 50% CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance CMI : Concentration Minimale Inhibitrice CMB : Concentration Minimale Bactéricide CPC : Chromatographie de Partage Centrifuge CRW : extrait méthanolique des feuilles de Cirsium scabrum CPE : sous-extrait éther de pétrole des feuilles de Cirsium scabrum CMC : sous-extrait dichlorométhane des feuilles de Cirsium scabrum CEA : sous-extrait acétate d éthyle des feuilles de Cirsium scabrum CBt : sous-extrait butanol des feuilles de Cirsium scabrum CW : sous-extrait aqueux des feuilles de Cirsium scabrum DAA : Direct Acting Antivirals JFH1 : Japanese fulminant hepatitis-1 JMR-CE : extrait méthanolique des rhizomes de Juncus maritimus JMR-MC : sous-extrait dichlorométhane des rhizomes de Juncus maritimus JMR-EA : sous-extrait acétate d éthyle des rhizomes de Juncus maritimus JMR-H2O : sous-extrait aqueux des rhizomes de Juncus maritimus

14 HR-M : spectrométrie de masse haute résolution LV-CE : extrait méthanolique des tiges de Limonium virgatum LV-MC : sous-extrait dichlorométhane des tiges de Limonium virgatum LV-EA : sous-extrait acétate d éthyle des tiges de Limonium virgatum LV-But : sous-extrait butanol des tiges de Limonium virgatum LV-H2O : sous-extrait aqueux des tiges de Limonium virgatum LVL-CE : extrait méthanolique des feuilles de Limonium virgatum LVL-MC : sous-extrait dichlorométhane des feuilles de Limonium virgatum LVL-EA : sous-extrait acétate d éthyle des feuilles de Limonium virgatum LVL-But : sous-extrait butanol des feuilles de Limonium virgatum LVL-H2O : sous-extrait aqueux des feuilles de Limonium virgatum PHH : hépatocytes humains primaires RMN : Résonance magnétique nucléaire VHC : Virus de l Hépatite C

15 INTRODUCTION : quelques éléments de contexte Les produits d origine naturelle prennent de plus en plus une place importante dans l industrie pharmaceutique et agronomique. En effet, un certain nombre de produits chimiques issus de la synthèse organique nécessite une pharmacovigilance en raison de leurs effets indésirables. Les stratégies de recherche de substances naturelles actives à partir de plantes sont souvent basées sur des approches ethnobotaniques, mettant en avant l utilisation de ces plantes en médecine traditionnelle par les populations locales. Mais les plantes médicinales ne représentent pas l unique réservoir en molécules potentiellement actives. De nouvelles approches ont fait leur preuve, notamment, la prise en compte de l écosystème dans lequel se développent les espèces végétales. En effet, l exposition aux contraintes environnementales stimule, chez certains types de plantes, des réponses d adaptation parmi lesquelles l accumulation de molécules issues du métabolisme secondaire, qui se sont avérés actives contre différentes pathologies végétales et humaines. Cette caractéristique est bien illustrée chez les plantes halophytes et xérophytes. Ce sont des végétaux qui se développent de manière optimale dans des conditions abiotiques extrêmes. Dans bien des cas, leurs vertus sont corrélées à leur capacité à tolérer le stress oxydatif liée à une accumulation excessive d oxydants qui vient altérer le développement de la plante. Ces plantes développent ainsi un système antioxydant performant, souvent corrélé à une 1

16 grande biodisponibilité en polyphénols (Ksouri et al., 2009 ; Ksouri et al., 2012). Ces composés sont largement connus pour leur potentiel antioxydant, mais également pour leur pouvoir antimicrobien qui couvre un large éventail de pathogènes qui touchent la santé humaine et celle du végétal. Les molécules aux propriétés antimicrobiennes peuvent être soit accumulées de manière constitutive, on parle alors de phytoanticipines, ou être synthétisées de novo lors de l interaction avec l agent pathogène, et sont alors nommées, phytoalexines (Macheix et al., 2005). Certaines halophytes se trouvent alors dotées d un pouvoir antifongique qui peut être exploité pour protéger des cultures contre les attaques de pathogènes. Ceci est illustré chez une halophyte, Cakile maritima (Brassicacées) qui a montré des activités antifongiques contre des pathogènes de cultures (ellam et al., 2007). L étendue des vertus antimicrobiennes des halophytes et des xérophytes inclut un large panel de pathogènes qui touchent la santé humaine. A titre d exemple, l extrait d une xérophyte, Cirsium tenoreanum (Asteracées) possède une activité antibactérienne sur différentes souches bactériennes humaines, qui se trouve liée à la présence majoritaire de polyphénols (Loizzo et al., 2009). Egalement, l extrait d une halophyte, Plantago major (Plantaginaceae), riche en polyphénols, s est montré actif contre une série de virus (virus de l herpès simplex et adenovirus) (Chiang et al., 2002). Face à l émergence du phénomène de résistance aux traitements actuels, que ce soit en santé humaine, ou dans le secteur agricole, des stratégies sont désormais mises en place vers un renouvellement des biomolécules d origine synthétique. A l instar de certains microorganismes tels que Penicillium ou treptomyces qui ont servi de source d antimicrobiens, les plantes halophytes et xérophytes sont à intégrer dans les nouvelles stratégies de recherche. Dans le cadre de la valorisation des ressources végétales natives des biotopes salins et arides de la Tunisie dans les domaines pharmaceutique et agricole, un travail de criblage a donc été réalisé pour explorer la composition chimique et les activités biologiques de plantes halophytes et xérophytes tunisiennes. Il s agit de 3 xérophytes : Atractylis serratuloides (Cass.) DC. (Asteracées), Cirsium scabrum (Poir.) Bonnet & Barratte (Asteracées), cabiosa maritima L. (Caprifoliacées) ; et de 5 halophytes : Limonium virgatum (Willd.) Fourr. (Plumbaginacées), Juncus maritimus Lam. (Juncacées), ilene succulenta Forssk. (Caryophyllacées), Atriplex tatarica L. (Amaranthacées) et Aeluropus littoralis (Gouan) Parl. (Poacées). Ce criblage a été élaboré de manière à analyser, dans un premier temps, les effets biologiques de ces plantes sur la santé santé humaine. Le contenu des plantes sélectionnées en 2

17 polyphénols a d abord été analysé, puis des tests d activités biologiques ont été mis en place pour évaluer leurs activités antiradicalaire, antibactérienne (sur 35 souches Gram + et -, et une levure) et antivirale (virus de l hépatite C). La cytotoxicité de ces plantes a également été évaluée sur une lignée cancéreuse de macrophages dérivés d un réticulosarcome de souris, J774, ainsi que sur une lignée non-cancéreuse, WI-38. Dans un second temps, le criblage a concerné les effets biologiques des plantes étudiées en santé du végétal, en particulier sur l agent causal le plus fréquent de la septoriose du blé (Zymoseptoria tritici). Pour cette étude, une exploration de l effet des conditions édaphiques et physiologiques sur les propriétés antifongiques de J. maritimus a été initiée. Ce criblage vise à révéler de nouvelles ressources en molécules bioactives. Nous avons donc, suite au criblage, ciblé les plantes les plus actives de manière à déterminer les composés à l origine des activités biologiques. Pour cela, différentes stratégies de fractionnement bioguidé ont été mises en œuvre. Certaines molécules ont été purifiées et isolées par différentes techniques chromatographiques, puis identifiées par différentes techniques spectroscopiques. L activité biologique de ces molécules a ensuite été évaluée et pour certaines d entre elles, des études ont été mises en place pour comprendre leur mécanisme d action. 3

18 YNTHEE BIBLIOGRAPHIQUE 4

19 I. Les plantes extrêmophiles réservoirs de biomolécules Il s agit de végétaux qui se développent de manière optimale dans des conditions abiotiques extrêmes, au sein desquelles d autres végétaux ne peuvent subsister. Ce sont des plantes qui, de par la nature spécialement sévère de leur milieu, ont subi une forte pression de sélection qui s est traduite par leur capacité d adaptation. On distingue les halophytes, plantes tolérantes à la salinité, des xérophytes qui sont plutôt tolérantes aux conditions de sécheresse. Bien que tolérantes à des conditions abiotiques différentes, leur mécanisme de réponses à ces contraintes se rejoignent dans la mesure où la contrainte saline se traduit chez la plante par une situation de déficit en eau sur le plan physiologique. I.1. Les plantes xérophytes Les xérophytes peuplent les biotopes secs ou arides correspondant à un manque d eau ou à sa faible disponibilité, notamment les zones à pluviosité réduite et les zones arides et sahariennes. Leurs capacités à subsister à de telles conditions est régie par deux stratégies adaptatives, la limitation des pertes d eau ou le stockage de l eau. Les xérophytes qui sont capables de limiter les pertes d eau sont dites sclérophytes (laurier-rose ; olivier ; ect.). Ce sont des plantes coriaces caractérisées par un épiderme à cuticule épaisse qui permet de limiter la transpiration (Vartanian et al., 1984). Une autre forme de limitation des pertes d eau se traduit par différents dispositifs de protection des stomates (stomates dans des cryptes pilifères, tissu bulliforme permettant l enroulement de la feuille, poils gardant une atmosphère humide...). Les malacophytes sont des plantes succulentes caractérisées par un parenchyme aquifère à cellules hypertrophiées et à mucilages qui leur confère la capacité de rétention de l eau (Aloès, Liliacées ; Mesembryanthemum, Aizoacées ; ect.) (Vartanian et al., 1984). I.2. Les halophytes Les halophytes couvrent les sols salins, y compris les régions côtières, les marais et les sebkhas (bassin occupant le fond d'une dépression à forte salinité). La contrainte saline induit des changements au niveau du statut hydrique de la plante, réduit le contenu relatif en eau des feuilles, diminue la transpiration et l absorption hydrique par les racines, d où une convergence des mécanismes d adaptation avec ceux des xérophytes. On retrouve donc des réponses au stress salin par la réduction des surfaces foliaires permettant la diminution des pertes d eau, mais aussi des mécanismes de stockage de l eau grâce à la succulence caulinaire 5

20 et foliaire (parenchyme aquifère). Il existe aussi d autres types de mécanisme, notamment par des glandes excrétrices de sel au niveau des feuilles (Tamaris, Tamaricacées) ou encore par un développement important du parenchyme palissadique (Atriplex, Chénopodiacées ; Cristemarine, Apiacées) (Vartanian et al., 1984). I.3. Le système antioxydant des halophytes et des xérophytes, une forme d adaptation performante La capacité d adaptation des xérophytes et des halophytes ne se restreint pas aux formes anatomiques ; elle implique une large gamme de mécanismes physiologiques et biochimiques. ur le plan biochimique, les réponses aux stress hydriques et salins, incluent l induction de processus de détoxification des espèces oxygénées réactives. En effet, les conditions contraignantes de l environnement des végétaux renforcent le pool des plantes en espèces oxygénées réactives (EOR) induisant une situation de stress oxydatif. Cette situation se traduit par une rupture d un équilibre existant entre les «antioxydants» et les «oxydants» entraînant de multiples dégâts comme l oxydation des bases de l ADN ou la modification de la fluidité membranaire, dont les conséquences sont néfastes pour l intégrité de la cellule (Demidchik, 2015). Ainsi, ces conditions imposent un grand défi pour les végétaux qui ne sont pas natives des biotopes arides et salins. Chez ces végétaux, l'adaptation se traduit, en réponse au stress oxydatif, par des réorientations métaboliques vers la constitution d une certaine capacité antioxydante déterminant une résistance inachevée pouvant aboutir à la sénescence de l individu. En contre partie, les halophytes et les xérophytes ont acquis au cours de l'évolution et sous la pression de sélection de l'environnement des mécanismes adaptées au stress oxydatif. Ils se trouvent équipés par un arsenal antioxydant performant leur procurant une maîtrise de l équilibre oxydatif, et donc la possibilité de se développer, d une manière optimale, dans les biotopes salins et arides. I.4. Les halophytes et les xérophytes, sources riches en composés phénoliques Le système antioxydant des halophytes et des xérophytes met en œuvre différentes lignes de défense antioxydantes. Celles-ci comprennent des antioxydants enzymatiques et non enzymatiques qui contrôlent les niveaux des oxydants et réparent les dommages oxydatifs cellulaires. La composante non enzymatique est représentée par les antioxydants de faible 6

21 poids moléculaire qui sont connus par leur rôle de piégeurs de radicaux libres tels que les vitamines C et E, les terpènes et les phénols (Matkowski, 2008). Différentes études qui ont exploré le pouvoir antioxydant des halophytes et des xérophytes se sont focalisées sur des composés largement connus pour leur pouvoir antioxydant, les polyphénols, révélant qu ils occupent une position déterminante dans la composante non enzymatique du système antioxydant des halophytes et des xérophytes (Falleh et al., 2008 ; Falleh et al., 2009 ; Ksouri et al., 2009 ; Ksouri et al., 2012). En effet, les stress hydriques et salins affectent négativement les contenus en polyphénols dans les tissus des végétaux non tolérants à la salinité et à la sécheresse, qui se trouve également comme étant l une des causes de la vulnérabilité de leur système antioxydant. La diminution des composés phénoliques prend origine de la perturbation des principaux processus de l'activité vitale de la plante suite à un choc hydrique ou salin (tocker, 1961). La capacité photosynthétique des plantes se voit toujours diminuée dans ces conditions (Maximov, 1931), de ce fait, les produits initiaux de la biosynthèse des polyphénols pourraient faire défaut. La baisse de la transpiration et la fermeture des stomates sont aussi observées. Ils sont suivis d'une augmentation de la température au niveau des feuilles (Zeltich, 1967) qui pourrait être une cause de la diminution des taux de polyphénols. Les contraintes de salinité et de sécheresse peuvent également engendrer un choc osmotique (Kursanov, 1952). Dans ce cas, le principal système énergétique des plantes cesse de fonctionner pendant une période prolongée. Ce qui, à son tour, entraîne inévitablement un ralentissement des processus synthétisants, et parmi eux, très vraisemblablement, ceux impliqués dans la formation des noyaux aromatiques. D autre part, les situations de stress entraînent des modifications physiques des membranes chloroplastiques ou bien leur destruction, provoquant la libération dans le cytoplasme de certaines enzymes telles que les hydrolases et les oxydases contenues initialement dans les organites cellulaires (tocker, 1961). La disparition de la compartimentation faciliterait, soit la dégradation des molécules phénoliques, par la mise en contact avec des enzymes, soit leur migration vers d autres organes. L ensemble de ces phénomènes sont observées à une très faible échelle chez les halophytes et les xérophytes. A titre d exemple, une xérophyte, Gossypium anomalum (Malvacées) soumise à un choc hydrique, n a montré qu une très faible diminution de son contenu en polyphénols ; alors que d autres espèces de Gossypium qui ne sont pas résistantes à la sécheresse ont montré une baisse importante en polyphénols (Brzozowska et Hanower, 1976). Pour certaines halophytes, l accumulation en composés phénoliques est stimulée dans des conditions de 7

22 salinité accentuées. L exemple de Anethum graveolens cultivée dans un milieu à forte salinité, s est montré capable de quadripler le contenu phénolique dans les racines et de le tripler au niveau des pousses (Mehr et al.,2012). Cet enrichissement en polyphénols totaux est un mécanisme d adaptation des plantes à la salinité car les composés phénoliques améliorent les effets ioniques de NaCl dans les tissus (Parida et al., 2004). II. Les composés phénoliques Les composés phénoliques sont des métabolites secondaires qui constituent un des groupes le plus représenté et largement distribué dans le monde végétal avec plus de 8000 structures phénoliques. L'élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d'au moins un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groupement hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction: éther, ester, hétéroside (Bruneton, 2015 ; Šaponjac et al., 2016). Les composés phénoliques des végétaux sont issus de deux grandes voies de biosynthèse: - La voie des phénylpropanoïdes (C6-C3) ou de l acide shikimique qui conduit à la synthèse de certains acides aminés aromatiques comme la L-phénylalanine et/ou la L-tyrosine, puis par désamination de ces derniers, aux acides cinnamiques et à leurs dérivés comme les coumarines. - La voie des flavonoïdes, combinant la voie des phénylpropanoïdes et celle de l acide acétique conduisant aux polyacétates. Les acides benzoïques, composés en C6-C1, sont issus de la dégradation oxydante des acides cinnamiques ou p-hydroxy-cinnamiques ce qui conduit à la formation d acides hydroxybenzoïques. L élaboration du squelette flavonoïde en C6-C3C6 est effectuée par la chalcone synthase. Pour que cette enzyme soit fonctionnelle, il faut que l acide p-coumarique soit activé sous la forme d acide p-coumarique-coenzyme A par une CoA-ligase non spécifique. Le précurseur ainsi activé pourra réagir avec trois molécules de malonyl-coa. Par la suite, la cyclisation du triacétate s effectue selon la réaction de Claisen et conduit à la formation d une chalcone, la 4,2ʹ,4ʹ,6ʹ-tetrahydroxychalcone (Bruneton, 2015). Une cyclisation conduira à l obtention du noyau flavone, intermédiaire de la synthèse des flavonoïdes, des tanins condensés et des anthocyanes (figure 1). 8

23 Figure 1. Voie de biosynthèse simplifiée des flavonoïdes Il existe donc différentes classes de polyphénols, on y trouve les acides phénoliques, les flavonoïdes, les stilbénoïdes et les tanins. II.1. Les acides phénoliques Un acide-phénol (ou acide phénolique) est un composé organique possédant au moins une fonction carboxylique et un hydroxyle phénolique (Ignat et al., 2011). Ils sont représentés par deux sous-classes, les acides hydroxybenzoïques et les acides hydroxycinnamiques. II.1.1. Les dérivés de l acide hydroxybenzoïque Ils dérivent de l acide benzoïque et ont une structure de base de type C6-C1 (Ignat et al., 2011). Ces acides hydroxybenzoïques sont très communs, aussi bien sous forme libre que sous forme d esters ou d hétérosides (Bruneton, 2015). (Tableau 1). Tableau 1. Exemples de dérivés de l acide benzoïque identifiés chez des plantes halophytes (Ksouri et al., 2012) quelette Composé R1 R2 R3 R4 Acide vanillique H OCH3 OH H Acide gallique H OH OH OH 9

24 II.1.2. Les dérivés de l acide hydroxycinnamique Ils ont une structure de base de type C6-C3 (Ignat et al., 2011). Les fonctions phénols (OH) de ces dérivés peuvent aussi être méthylés (-O-CH3) (Tableau 2). Tableau 2. Exemples de dérivés de l acide hydroxycinnamique rencontrés chez des plantes halophytes (Ksouri et al., 2012). quelette de base Composé Acide p-coumarique R1 H R2 OH R3 H Acide férulique OCH3 OH H Acide caféique OH OH H II.2. Les flavonoïdes Les flavonoïdes sont les composés les plus abondants parmi tous les composés phénoliques. Ce sont des pigments quasiment universels des végétaux. Ils interviennent aussi dans les processus de défense contre le rayonnement UV, les herbivores et les attaques microbiennes (Bruneton, 2015). Le terme flavonoïde regroupe une très large gamme de composés naturels polyphénoliques. On dénombre près de 6500 flavonoïdes répartis en 12 classes (töckigt et al., 2002) et leur nombre ne cesse d accroitre. Par définition, les flavonoïdes sont des composés qui ont en commun la structure en C6-C3-C6 du diphénylpropane (Figure 2), les trois carbones servant de jonction entre les deux noyaux benzéniques notés A et B forment généralement un hétérocycle oxygéné C (De Rijke et al., 2006). Figure 2. tructure de base des flavonoïdes 10

25 On peut distinguer dans les flavonoïdes lato sensus, les flavonoïdes (stricto sensu) qui regroupent les flavones, les flavonols, les flavanones, les dihydroflavonols, les aurones et chalcones ; des dérivés flavaniques, isoflavonoïdes et anthocyanosides (figure 3). Figure 3. tructure de base des différentes classes des flavonoïdes II.2.1. Les flavonoïdes au sens strict Flavones, flavonols Il s agit des composés les plus nombreux de ce groupe. Dans ces molécules, le cycle A est dans 90% des cas substitué à deux hydroxyles phénoliques en C5 et en C7. Ces hydroxyles peuvent être libres ou estérifiés, l un d entre eux peut être engagé dans une liaison hétérosidique (Bruneton, 2015). Le cycle B est substitué dans 80% des cas en C4, les substituants sont des groupes OH ou OCH3 (Bruneton, 2015). Les flavones et les flavonols, ainsi que leurs hétérosides est universelle, mais certains schémas de substitution sont spécifiques à certaines familles. Le tableau 3 présente des exemples de flavones et de flavonols identifiés chez des plantes halophytes. 11

26 Tableau 3. Exemples de flavones et de flavonols identifiés chez certaines plantes halophytes (Ksouri et al., 2012) quelette Composé R1 R2 Apigénine H H Lutéoline H OH Kaempférol OH H Quercétine OH OH Flavanones et dihydroflavonols Ces molécules sont caractérisées par l absence de double liaison en 2,3 et par la présence de centres d asymétrie (Bruneton, 2015). Chez les flavanones naturelles, le C2 est de configuration 2, alors que les dihydroflavonols sont de configuration 2R, 3R, le phényle et l hydroxyle étant en position trans. Le tableau 4 présente des exemples de flavanones identifiés chez des plantes halophytes. Tableau 4. Exemples de flavanones identifiées chez des halophytes (Benaissa et al., 2013) quelette Composé R1 R2 Naringénine H H Eriodictyol H OH Chalcones, aurones Les chalcones dépourvues de l hétérocycle central, sont caractérisés par la présence d un chaînon tricarboné, cétonique, α,β -insaturé (Ferrazzano et al., 2011). i les substitutions sur le noyau A sont souvent identiques à celles des autres flavonoïdes, le noyau B est fréquemment monosubstitué ou non substitué (Bruneton, 2015). Les aurones sont caractérisées par une structure de 2-benzylidènecoumaranone. 12

27 II.2.2. Les autres flavonoïdes Anthocyanosides Ce sont les pigments les plus répandus chez les plantes vasculaires (Castañeda-Ovando et al., 2009). Ils sont responsables de la coloration rouge, rose, mauve, pourpre, bleue ou violette de la plupart des fleurs et des fruits (Wu et al., 2006). Leur structure de base est caractérisée par un noyau «flavylium» généralement glucosylé en position C3 ; les génines sont alors dits anthocyanidols et les hétérosides appelés anthocyanosides (ouquet et al., 2000). Les anthocyanes se différencient par leur degré d hydroxylation et de méthylation, et par la nature, le nombre et la position des oses liés à la molécule (Castañeda-Ovando et al., 2009). Dérivés flavaniques Les flavan-3-ols peuvent avoir deux origines selon l épimère en 3. Les (2,3)-flavan-3-ols (comme la (+)-catéchine) proviennent de la réduction d un précurseur flavan-3,4-diol par une leucoanthocyanidol réductase, alors que les (2R,3R)-flavan-3-ols proviennent de la réduction d anthocyanidols par une anthocyanidol réductase. Ces flavan-3-ols représentent l élément structural de base des tanins condensés (Bruneton, 2015). Isoflavonoïdes Ces composés sont moins répandus taxonomiquement que les précédants et se retrouvent principalement chez les Fabacées où ils sont très actifs en tant que phytoalexines synthétisés par exemple en réponse à une attaque par un pathogène (Ferrazzano et al., 2011). Cette spécificité est probablement due à la présence dans cette famille de l enzyme responsable du réarrangement du 2-phénylchromone (flavone) au 3-phénylchromone (isoflavone) (Bruneton, 2015). Parmi tous les isoflavonoïdes répertoriés dans le règne végétal, la catégorie la plus largement représentée est celle des isoflavones non glycosylées. Les isoflavones glycosylées quant à elles, existent mais sont plus rares (O-glycosylées et exceptionnellement C-glycosylées). II.3. Les stilbénoïdes Cette nomination souligne la parenté biogénétique avec les flavonoïdes. Les stilbénoïdes regroupent les composés qui possèdent deux noyaux benzéniques séparés par un pont éthane ou éthène (bibenzyls et stilbènes), ainsi que les produits qui leur sont biosynthétiquement rattachés (phénanthrènes, 9,10-dihydrophénanthrènes ) (figure 4) (Bruneton 2008). 13

28 Figure 4. tructures de base de stilbénoïdes II.3.1. Les stilbènes et les bis(bibenzyls) Les stilbènes ont une structure en C6-C2-C6 : deux cycles benzéniques sont reliés par deux carbones, eux-mêmes unis par une double liaison. Ils existent généralement sous la forme (trans-1,2-diphényléthylène (E-tilbène). Ils peuvent être libres ou hétérosidiques, parfois polymériques. Ils sont présents dans de nombreuses familles de végétaux supérieurs (la vigne, l arachide ). Les bis(bibenzyls), rares chez les végétaux, sont caractéristiques des Hépatiques (Bruneton, 2008). II.3.2. Les phénanthrènes Les phénanthrènes sont formés par trois cycles benzéniques. Ils existent sous forme, monomérique, dimérique et trimérique ; plus de 200 structures sont caractérisées. Ils sont surtout présents dans une cinquantaine d espèces d Orchidacées (Bruneton, 2008). La figure 5 présente des exemples de dérivés phénanthréniques identifiés chez des plantes halophytes. 12 CH OH 7 4 4a H2C 5a 8 8a HO a 10 CH3 11 Juncusol Dehydrojuncusol Figure 5. Exemples de dérivés phénanthréniques chez des halophytes (Juncus) (El-hamy et al., 2015) 14

29 II.4. Les tanins Les tanins représentent une classe très importante de polyphénols localisés dans les vacuoles (Aguilera-Carbo et al., 2008). Ce sont des composés phénoliques ayant une masse moléculaire comprise entre 500 et 3000 Da et qui présentent, à côté des réactions classiques des phénols, la propriété de précipiter les alcaloïdes, la gélatine et d autres protéines (Fogliani, 2002). ur le plan structural, on distingue les tanins hydrolysables, esters d'acide phénolique, des tanins condensés plutôt des polymères de polyhydroxyflavan-3-ols (Fogliani, 2002). II.4.1. Les tanins galliques ou hydrolysables Ce sont des esters de l acide gallique ou de ses dérivés, en particulier l acide ellagique, associés à un polyol (habituellement le glycose) (Clifford, 2000). Ils sont divisés en ellagitanins et en gallotanins. Ces tanins subissent facilement une hydrolyse acide et basique, ils s hydrolysent aussi sous l action enzymatique (Conrad et al., 1998). La figure 6 présente des exemples d ellagitanins chez les halophytes. Punicalagine Punicaline Figure 6. Exemples d ellagitanins chez une espèce halophyte (Terminalia catappa (Combretacées)) (Ksouri et al., 2012). II.4.2. Les tanins condensés Appelés aussi proanthocyanidines, les tanins condensés sont des polyphénols de masse molaire élevée. Ils résultent de la polymérisation autooxydative ou enzymatique des unités de flavan-3,4-diols liées majoritairement par les liaisons C4-C8 (parfois C4-C6) des unités adjacentes, et se nomment ainsi proanthocyanidines de type B. Lorsque la condensation se produit entre les unités adjacentes par la liaison C4-C8 et par une liaison d éther additionnelle entre C2 et C7, les proanthocyanidines sont dits de type A (Wollgast et al., 2000). 15

30 III. La richesse des plantes halophytes et xérophytes en polyphénols leur procurent diverses vertus antimicrobiennes Les plantes halophytes et xérophytes présentent une grande biodisponibilité en polyphénols, qui peut être considérée, en soit, comme une forme d adaptation au stress oxydatif. Ceci dans la mesure où ce stress se trouve être responsable de la diminution des polyphénols chez les végétaux non tolérants à la salinité et à la sécheresse comme conséquence de la vulnérabilité de leur système antioxydant. Les composés phénoliques sont largement connus pour leur pouvoir antioxydant. Celui-ci réside dans l'élément structural fondamental qui les caractérise, soit la présence d'au moins un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groupement hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction: éther, ester, hétéroside (Bruneton, 2008; Šaponjac et al., 2016). Cette particularité structurale donne à la fonction phénol un caractère plus acide que les autres groupements alcools : elle perd facilement un proton pour former l'ion phénoxy. La perte d'un hydrogène engendre la formation d'un radical fortement stabilisé par mésomérie. C'est cette réactivité chimique qui confère aux composés phénoliques leur caractère antioxydant (Naczka et hahidi, 2004). Les sites et le nombre des groupements hydroxyles sur les groupes phénoliques sont également supposés être reliés à leur toxicité envers les microorganismes. En effet, le taux d hydroxylation est directement proportionnel à la toxicité (Cowan, 1999). Il a été aussi rapporté que plus les composés phénoliques sont oxydés et plus ils sont inhibiteurs des microorganismes (calbert, 2005). Les polyphénols sont en effet dotés d'activités antimicrobiennes. La diversité structurale existante au sein des polyphénols s accompagne par des différences en terme d activités antimicrobiennes qui couvre un large panel de pathogènes. La capacité que procurent les composés phénoliques aux plantes halophytes et xérophytes pour résister aux agressions de l environnement se trouvent donc impliquée dans d autres applications, notamment contre des pathogènes de plantes cultivées, et même des pathogènes qui touchent la santé humaine. 16

31 III.1. Applications dans la lutte biologique contre les pathogènes des plantes cultivées III.1.1. Les polyphénols offrent aux halophytes et aux xérophytes un pouvoir antifongique prometteur sur les pathogènes des cultures Les polyphénols, constituants naturels des défenses du végétal Les polyphénols sont des constituants des défenses naturelles des végétaux contre l attaque des pathogènes. Ils sont impliqués dans différentes lignes de défense. Ils interviennent comme des phytoanticipines suivant des barrières physiques, mais aussi par leur présence dans les tissus végétaux avant l infection. Les phytoanticipines peuvent inclure des acides phénoliques, des flavonols, des isoflavones) (Lattanzio et al., 2001). Les polyphénols interviennent également par leur rôle de phytoalexines, qui sont synthétisés de novo lors de l infection. Ceux-ci comprennent les isoflavonoïdes, les flavans, les stilbènes et les phénanthrènes (Lattanzio et al., 2001). Différents exemples de phytoanticipines et de phytoalexines ont été trouvés chez les plantes cultivées. Pour les phytoanticipines, des acides féruliques, p-coumariques et syringique sont généralement trouvés dans les cultivars de blé (Vidhyasekaran, 2008). Pour les phytoalexines, peu sont en relation avec la résistance variétale (Corbaz, 1990). L exemple le plus connu est celui du resvératrol, un stilbène produit par la vigne en réponse à une attaque par un pathogène (Botrytis cinerea). Les polyphénols, dans la lutte biologique des pathogènes de cultures La performance du système de défense des cultures qui est perpétuellement confronté aux attaques des pathogènes, peut devenir insuffisante face à certaines invasions, notamment le cas des variétés sensibles d une même culture, ou lorsque l individu végétal se trouve fragilisé par les contraintes de l environnement. Des solutions chimiques sont souvent déployées à grande échelle, offrant satisfaction à court terme, mais qui ont cumulé des dégâts au niveau du cultivar. La fortification du système de défense des cultures par des composés phénoliques s est introduite dans la recherche de substances actives dans le domaine de la lutte biologique. Certains acides phénoliques (l'acide chlorogénique, l'acide quinique, l'acide férulique, ect.) sont des inhibiteurs in vitro de différents agents pathogènes fongiques des cultures (Lattanzio et al., 2001). Alors que d autres (acide 2,5-dihydroxybenzoïque et l'acide 2,5dimetoxybenzoïque) sont efficaces in vivo contre la germination des spores et la croissance mycélienne de champignons pathogènes de différentes cultures (Botrytis cinerea, clerotinia sclerotiorum, Penicillium digitatum, ect.) (Lattanzio et al., 1996). 17

32 Les composés phénoliques semblent inhiber le développement de pathologies végétales par différents mécanismes impliquant l'inhibition des enzymes fongiques extracellulaires (cellulases, pectinases, laccase, xylanase, ect.), l'inhibition de la phosphorylation oxydante des champignons, la limitation des substrats utilisés par le pathogène, et l'activité antioxydante dans les tissus végétaux (Jersh et al., 1989 ; MacRae et al., 1984 ; calbert, 1991). Pour cette dernière, les plantes halophytes et de xérophytes se sont introduites comme des ressources en composés antimicrobiens. Potentialités des halophytes et des xérophytes contre les pathogènes des cultures Différents exemples de ces plantes ont montré une activité antifongique sur des pathogènes de plantes cultivées, notamment Thellungiella salsuginea (Brassicacées) (Pedras et al., 2009) et Cakile maritima (Brassicacées) (ellam et al., 2007) qui ont montré des activités antifongiques sur divers pathogènes des Brassicacées (Alternaria brassicicola, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani et clerotinia sclerotiorum). Les phénanthrènes, connus pour leur rôle de phytoalexines antifongiques chez les Orchidées (Bruneton, 2015), sont retrouvés chez certaines halophytes, notamment chez les Juncacées. Il a été suggéré qu un phénanthrène (le juncusol) de Juncus roemerianus régulerait les populations de Bacillus dans les marais (Chapatwala et al., 1981). L emploi des halophytes et des xérophytes dans la lutte contre des pathogènes qui touchent les plantes cultivées se voit d être exploité, particulièrement dans le secteur du blé qui est placé en avant dans les stratégies d amélioration de la production. III.1.2. Zymoseptoria tritici, un des pathogènes menaçants des cultures de blé Le blé est la culture la plus répandue au monde. Au sein de l'union européenne, le blé est passé de la deuxième culture alimentaire la plus importante (après le riz) au statut de la céréale la plus importante (Fones et Gurr, 2015). Les parasites et les agents pathogènes constituent un défi sérieux et persistant pour l'industrie du blé. Parmi les agents pathogènes du blé, on trouve Zymoseptoria tritici (anamorphe : Mycosphaerella graminicola). Il s agit de l agent pathogène le plus fréquent de la septoriose du blé, induisant des pertes de rendement allant jusqu'à 50% (Ponomarenko et al., 2011). Présentation et cycle biologique de Zymoseptoria tritici Z. tritici est un champignon parasite Ascomycète. Il est de type hémibiotrophe impliquant une sénescence des tissus hôtes qui commence avant la phase reproductive de l agent pathogène. 18

33 La reproduction de Z. tritici est de nature sexuée ou asexuée selon les conditions environnementales. La reproduction sexuée implique la production d ascospores qui constituent la source principale d inoculum primaire pour initier la maladie de la septoriose. Les ascospores sont disséminés par le vent sur de longues distances permettant la survie du champignon en l absence de plante hôte (anderson et Hampton, 1978 ; haw et Royle, 1989 ; uffert et al., 2011). La reproduction asexuée implique la production de pycnidiospores, qui se déroule majoritairement durant la phase épidémique de la maladie (Fitt et al., 1989 ; aint-jean et al., 2004) (figure 7). Au contact de la feuille, une spore va germer dans les conditions environnementales favorables (températures et humidité) (Magboul et al., 1992). Le tube germinatif pénètre dans les tissus hôtes via les ostioles des stomates (Duncan et Howard, 2000). Après l infection initiale, une période de latence apparait, durant laquelle il y a une progression peu destructrice des hyphes mycéliens dans les espaces intercellulaires. Le développement du champignon s intensifie ensuite lors de la mise en place des appareils reproducteurs (pycnides), et conduit à la destruction des parois cellulaires (phase nécrotrophe) (Lovell et al., 2004). Dans une troisième étape, la sporulation, les spores sont produites dans les pycnides (pycnidiospores). Elles sont couvertes d une gelée protectrice (le cirrhe) constituée de sucres et de protéines hydrophiles (Fournet, 1969). En conditions de forte humidité, ce mucilage sporifère est exsudé et se dissout dans le film d eau tapissant la feuille, permettant ainsi la dissémination des spores sur la surface foliaire (Fitt et al., 1989). Au final, les pycnidiospores se dispersent via l éclaboussement de gouttes de pluie. Figure 7. Cycle biologique simplifié de Mycosphaerella graminicola (Agrios, 2005) 19

34 Effets sur les cultures de blé Au niveau des symptômes macroscopiques, la septoriose engendrée par Z. tritici se manifeste, après la période de latence, par l apparition de taches (ou lésions) sur les feuilles. Lorsque les lésions sont arrivées à maturité, les fructifications du champignon (pycnides et/ou pseudothécies) deviennent visibles sous la forme de petits points noirs à la surface des feuilles (Gigot, 2014) (figure 8). Figure 8. Lésions sporulantes à la surface d une feuille de blé (Gigot, 2014) Le développement de la maladie se traduit par la coalescence des lésions et l accélération de la sénescence des tissus infectés (Robert, 2003). L affection des dernières feuilles sous l épi, impliquées dans le remplissage des grains se traduit par une grande baisse de rendement (Thomas et al., 1989). Dans les cas de fortes incidences, les pertes de rendement peuvent aller jusqu'à 50% (Ponomarenko et al., 2011). Les moyens de contrôle actuels et le problème de résistance de Z. tritici Les moyens de contrôle de Zymoseptoria tritici sont essentiellement chimiques. Le traitement repose sur l emploi de fongicides synthétiques classiques, tels que les inhibiteurs de la 14αdéméthylase (IDM) et les inhibiteurs de la succinate déhydrogénase (DHI). Les IDM appartiennent à la classe des inhibiteurs des stérols membranaires (IB). Certaines familles chimiques des IDM ont été retirées du marché. La famille chimique comprenant le plus grand nombre de molécules actives est celle des triazoles ; on ne compte pas moins de 18 substances. Les fongicides triazolés inhibent la biosynthèse des stérols, constituants essentiels des champignons, en bloquant la C14 déméthylase (Rocher., 2004). Les inhibiteurs de la succinate déhydrogénase (DHI) sont des molécules inhibitrices de la respiration 20

35 mitochondriale. Ils ont déclenché des phénomènes de résistance chez certains champignons (Rocher., 2004). Pour le traitement de la septoriose, ils sont souvent associés à des triazoles. L émergence des formes résistantes de Z. tritici est une réponse à une utilisation massive des fongicides. En effet, il y a mobilisation jusqu à 70% de l usage annuel des fongicides en Europe. La famille des triazoles se voit aussi touchée par ce phénomène. La sensibilité de la septoriose aux triazoles, bien que plus progressive en comparaison avec l émergence de la résistance aux DHI, se trouve en évolution continue (Han., 2014). Un besoin croissant en la réintroduction des moyens de lutte biologique ous la pression conjuguée d une réglementation plus restreinte et des actions en faveur de l environnement, une stratégie raisonnée moins dépendante des fongicides synthétiques est en train de se développer. Au cours de la dernière décennie, de nombreux pesticides ont été retirés du marché. Les changements dans les processus de réglementation au sein de l'union Européenne devraient également réduire la disponibilité de différents fongicides sur le marché (Jess et al., 2014). L investissement dans des variétés de blé résistantes se présente comme étant l alternative la plus simple. Cependant, cette résistance n est que partielle, et des pertes de rendement, bien que moindres, subsistent. La réintroduction des fongicides d origine naturelle se voit de plus en plus comme étant une alternative prometteuse. Les agents de contrôle biologique incluent des extraits et des composés provenant de plantes (Ravensberg, 2015). Certains fongicides commercialisés sont formulés avec des huiles essentielles, mais leurs modes d'action restent pour la majorité, inconnus (Dayan et al., 2009). L'extrait de Reynoutria sachalinensis constitue l'ingrédient principal d'un fongicide commercialisé (Milsana ) qui est efficace contre un large éventail de maladies végétales. (Dayan et al., 2009). Baysal-Gurel et Miller (2015) ont confirmé l'effet protecteur d'une nouvelle formulation de l'extrait de R. sachalinensis commercialisé sous le nom de Regalia par Marrone Bio Innovations (Davis, CA, UA) sur la tomate produite sous serre contre l'oïdium. Dans la lutte biologique contre la septoriose, seule la laminarine (Vaccipant, Goëmar, France), un polysaccharide de faible poids moléculaire dérivé d une algue Laminaria digitata, est enregistré en France comme inducteur de la résistance du blé à Z. tritici. À l'heure actuelle, les biofongicides ne détiennent que 5% du marché mondial de la protection des cultures, mais ce segment de l'industrie devrait augmenter de 8,84% par an, atteignant plus de 7% de la protection totale des cultures d'ici 2025 (Olson, 2015). D où l intérêt de 21

36 rechercher des sources naturelles d agents antifongiques efficaces, notamment chez les halophytes et les xérophytes. III.2. Applications dans la santé humaine III.2.1. Les halophytes et les xérophytes, des sources prometteuses en polyphénols anti-infectieux L organisme humain, constamment exposé à une multitude de microbes (bactéries, virus, ect.), possède un système complexe de défense qui lui permet de s opposer à leurs invasions, et protéger ainsi l intégrité des tissus. Lorsque l infection est grave, le système de défense n arrive plus à la maîtriser et il y a recours aux thérapies (antibiotiques, vaccin, ). Les microbes exposés aux thérapies sur une longue période ne peuvent que s adapter et générer des résistants. Dès lors, et sous la pression des effets secondaires de certaines thérapies qui sont devenus non négligeables, des stratégies vers un renouvellement de l arsenal des molécules anti-infectieux sont désormais envisagées pour faire face à ce problème de santé publique émergent. A l instar de certains micro-organismes tel que le Penicillium ou treptomyces qui ont servi de source d antimicrobiens, les plantes halophytes et xérophytes de part leur richesse en polyphénols, sont à intégrer dans les nouvelles stratégies de recherche d anti-infectieux. Le pouvoir antimicrobien des polyphénols couvre une large gamme de pathogènes humains Les composés phénoliques sont largement réputés pour leur pouvoir antimicrobien qui couvre un large éventail de pathogènes. A titre d exemple, l acide gallique et l épigallocatéchine gallate sont capables d inhiber plusieurs souches bactériennes et fongiques (Bacillus subtilis, taphylococcus aureus, Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, almonella typhi, Vibrio Cholerae Microsporum gypseum, et Helicobacter pylori) (Chanwitheesuk et al., 2007; Hatano et al., 2008). L acide gallique, possède également des activités contre le virus de l herpès HV-1 et le virus de la grippe PI (type3). D autres polyphénols, notamment la génistéine, ainsi que d autres flavonoïdes (quercétine, kaempférol, 3-méthylkaempférol et épigallocatechine gallate) sont actifs in vitro sur plusieurs souches virales, notamment sur le rétrovirus HIV responsable du syndrome d immunodéficience acquise (IDA) (Andres et al., 2009 ; Christina et al., 2009). 22

37 Les mécanismes responsables de la toxicité des polyphénoles envers les microorganismes sont très complexes, probablement dues à la grande diversité structurale existante au sein des polyphénols. A titre d exemple, les flavane-3-ols, les flavonols et les tannins ont reçu une grande attention pour leur large spectre et forte activité antimicrobienne, mais aussi pour leur capacité à intervenir sur un grand nombre de facteurs de virulence microbienne, y compris l inhibition de la formation de biofilms, la réduction de l adhésion aux ligands de l hôte et la neutralisation des toxines bactériennes, ainsi qu à leur capacité d établir une synergie avec certains antibiotiques (Daglia, 2011). Les flavonoïdes interviennent également à différents niveaux de l infection virale. L exemple de la génistéine qui peut intervenir en inhibant la PTK (Protéine kinase de l entrée du virus), la phosphorylation de la glycoprotéine E et d autres polypeptides viraux (inhibition de l assemblage du virus), ou en inhibant l expression de certains gènes viraux (Andres et al., 2009). Les potentialités antimicrobiennes des halophytes et des xérophytes au service de la santé humaine Différentes études, qui ont exploré les potentialités antimicrobiennes des halophytes et des xérophytes sur des pathogènes de l organisme humain, ont montré qu elles sont liées à la présence majoritaire de composés phénoliques. Par exemple, différentes espèces d halophytes (Eryngium maritimum (Apiacées), Crithmum maritimum (Apiacées) et Cakile maritima (Brassicacées)) au potentiel antimicrobien marqué sur différents types de pathogènes, possèdent une richesse en composés phénoliques (Meot-Duros et al., 2008). Activités antibactériennes. L activité des halophytes et des xérophytes sur des bactéries pathogènes est illustrée par différents exemples. L extrait de Tamarix gallica (Tamaricées) dont les composés majoritaires sont des flavonoïdes (isoquercétine, catéchine, ect.) a montré une activité sur différentes souches bactériennes et fongiques (Ksouri et al., 2009). D autres flavonoïdes majoritairement présents dans Cynara cardunculus (Compositées) (épicatéchine, quercétrine, ect.) se trouvent liés à l activité antibactérienne des feuilles de la plante contre plusieurs bactéries pathogènes (Falleh et al., 2008). L ensemble de ces travaux, ainsi que d autres, ont introduit les halophytes et les xérophytes comme des sources prometteuses face au développement de la résistance bactérienne aux antibiotiques. Activités antivirales. Les halophytes et les xérophytes sont dotés d activités antivirales sur différents types de virus. A titre d exemple, Plantago major (Plantaginacées) riche en 23

38 flavonoïdes et en acides phénoliques, s est montré actif contre une série de virus, à savoir le virus de l herpès simplex (HV-1, HV-2) et les adenovirus (ADV-3, ADV-8, ADV-11). Deux acides phénols (acide ferulique et acide caféique) se trouvent principalement responsables de ces activités (Chiang et al., 2002). Les halophytes ont également montré des effets sur les hépatites. Plusieurs halophytes de la famille des Rhizophoracées ont montré des activités prometteuses contre le virus de l hépatite B (Premanathan et al., 1999). A notre connaissance, il n y a pas d études qui ont exploré le potentiel antiviral de plantes halophytes et xérophytes contre le virus de l hépatite C. D une manière générale, certains flavonoïdes peuvent atténuer le pouvoir infectieux et/ou affecter la réplication intracellulaire de différents virus (Ghedira, 2005). Des inhibiteurs du virus de l hépatite C peuvent donc être recherchés dans les halophytes et les xérophytes. III.2.2. Le problème de résistance aux antibiotiques Les antibiotiques Les antibiotiques sont par définition, des produits microbiens, ou leurs dérivés, capables de neutraliser les micro-organismes sensibles ou d inhiber leur croissance (Prescott et al., 1995). Leur action étant spécifique et dirigée contre les micro-organismes, ils ne sont pas toxiques pour les cellules eucaryotes Les antibiotiques sont en majorité d origine naturelle. Le premier antibiotique identifié est la pénicilline (isolée à partir de Penicillium notatum), antibiotique à large spectre d activité, qui appartient à la classe des β -lactames. a découverte a ouvert la voie à l identification de nombreuses autres classes d antibiotiques d origine naturelle, incluant les phénylpropanoïdes, les tétracyclines, les aminoglycosides, les macrolides, les glycopeptides, les streptogramines et les β-lactames de deuxième génération. Par la suite, une troisième génération de β -lactames a été commercialisée (les carbapénèmes) (Toure, 2015). Les antibiotiques peuvent aussi être d origine synthétique ou semi-synthétique. Il existe seulement trois classes d antibiotiques synthétiques. Les sulfamides, premiers antibiotiques utilisés cliniquement, les quinolones (ou fluoroquinolones) découverts lors de la synthèse de la chloroquine (ingh et Barett, 2006), et les oxazolidinones (conduit au développement du linézolide) qui constituent, avec les lipopeptides cycliques (daptomycine), l une des rares classes d antibiotiques mise sur le marché au cours de ces dix dernières années. 24

39 Activité des antibiotiques L étendue de l activité antibactérienne d un antibiotique définit son spectre d action. Un antibiotique caractérisé par un spectre d activité large agit sur des espèces bactériennes différentes. L action des antibiotiques peut s exercer sur des structures ou des mécanismes essentiels à la croissance ou à la survie des bactéries. Ainsi, ceux qui inhibent la croissance bactérienne sont qualifiés de «bactériostatiques» alors que ceux qui neutralisent les bactéries sont dits «bactéricides». Les principales cibles des antibiotiques sont la paroi cellulaire et les ribosomes bactériens. D autres cibles sont impliquées dans les fonctions physiologiques ou métabolites, à savoir l inhibition de la biosynthèse des acides nucléiques (ADN et ARN) et l interférence avec les voies métaboliques de synthèse de l ADN (Figure 9). Des interactions spécifiques avec les cibles bactériennes des antibiotiques sont également régies par la complexité des motifs structuraux et la grande variabilité des groupements fonctionnels. Cette spécificité se trouve engagée dans les processus de la sélection de bactéries résistantes aux antibiotiques (Toure, 2015). Figure 9 : Mode d action des antibiotiques (ingh et Barrett, 2006). 25

40 La résistance aux antibiotiques La sélection de bactéries résistantes aux antibiotiques est due à l usage généralisé des antibiotiques et à la forte adaptabilité des souches bactériennes. En effet, la confrontation à un antibiotique représente du point de vue des bactéries, un formidable stimulus d évolution (Hamilton-Miller, 2004). La résistance aux antibiotiques peut être «naturelle», et dans ce cas l expression d un caractère inné (particularités structurales de la paroi cellulaire ou l absence de cible), partagé par toutes les souches d une même espèce bactérienne (Toure, 2015), rend inappropriée l utilisation de certains antibiotiques. A titre d exemple, les bactéries du genre Mycoplasma, dépourvues de peptidoglycane (composant principal de la paroi des bactéries), présentent une résistance intrinsèque aux β-lactames, dont le mode d action consiste en une inhibition de la synthèse du peptidoglycane (Normak et Normak, 2002). La résistance à un antibiotique est aussi «acquise», observée lorsque certaines souches d une même espèce bactérienne, normalement sensibles à un antibiotique, deviennent résistantes. Cette résistance peut être acquise par mutation ou par transfert de gènes (Toure, 2015). Le phénomène de mutation est conditionné par une utilisation répétée des antibiotiques qui contribue, au sein d une population bactérienne, à l élimination des bactéries sensibles, induisant à la sélection de mutants résistants. La transmission d éléments génétiques mobiles, comme les plasmides et les transposons, favorise également l acquisition des résistances par les bactéries. Elle peut s effectuer par transduction, conjugaison ou transformation. La dissémination des gènes de résistance peut s effectuer au sein d une même espèce mais aussi d une espèce bactérienne à l autre. Ainsi, les souches de taphylococcus aureus résistantes à la vancomycine (ARV) auraient acquis ce caractère suite au transfert plasmidique de l opéron vana, réalisé par conjugaison avec Enterococcus faecalis (Noble et al., 1992 ; Alekshun et Levy, 2007). Mécanismes biochimiques de résistance Confrontées aux antibiotiques, les bactéries ont élaboré plusieurs stratégies. Les bactéries s opposent à l action des antibiotiques par des barrières qui limitent leurs accès. Toutes les bactéries Gram négatif ont une membrane externe qui doit être franchie avant d atteindre la membrane cytoplasmique. Les barrières d entrée peuvent aussi exister dans la membrane cytoplasmique. A titre d exemple, des aminoglycosides (oxygénodépendants) sont inactifs dans l environnement anaérobie de la membrane cytoplasmique (Rice et al., 2003). Certaines bactéries agissent par la modification de l antibiotique en synthétisant des enzymes 26

41 (pour la plupart des cas acquises) qui confèrent un niveau élevé de résistance aux antibiotiques contre lesquels ils sont actifs. De par la spécificité de certaines interactions entre l antibiotique et la molécule cible, certaines bactéries résistent en modifiant la cible de l antibiotique ; de faibles altérations de la cible peuvent avoir des effets importants sur la liaison de l antibiotique. Le degré de résistance conférée par les modifications de cible est variable et dépend de la capacité de la cible mutée à accomplir ses fonctions. La modification des cibles concernent par exemple, l altération des précurseurs de la paroi cellulaire conférant la résistance aux glycopeptides, les mécanismes de protection ribosomale conférant la résistance aux tétracyclines ou encore les mutations de l ARN polymérase conférant la résistance à la rifampicine (Rice et al., 2003 ; Murray et al., 2009). Les systèmes d efflux bactériens constituent une autre forme de résistance aux antibiotiques, par exportation active des drogues dans le milieu extracellulaire. Chez les bactéries à Gram positif, les systèmes d efflux sont constitués par des pompes d efflux (transporteurs membranaires), alors que chez les bactéries à Gram négatif, les systèmes d efflux sont des complexes protéiques tripartites (pompe d efflux, protéine périplasmique de jonction et porine). Les pompes d efflux peuvent concerner une seule classe d antibiotiques «droguespécifiques» (Markham et Neyfakh, 2001). Cependant, la plupart de ces transporteurs peuvent prendre en charge des composés de structures très différentes et contribuer ainsi, de manière significative, à la multi-résistance des bactéries vis-à-vis des antibiotiques (Poole, 2004). Les polyphénols des halophytes dans les stratégies de lutte contre la résistance bactérienne L émergence du phénomène de résistance contre les principales classes d antibiotiques, a conduit à l avènement de l ère post-antibiotique. La mise en place de stratégies de recherche de nouvelles molécules est devenue une nécessité. Etant donné la grande diversité des mécanismes de résistance adoptés par les bactéries, les champs d investigation sont, sans doute larges. Toutefois, les stratégies peuvent se baser sur l identification d agents antibactériens, capables d agir par de nouveaux mécanismes d action (Tan et Darren, 2000; chmidt, 2004; Falconner et Brown, 2009), ou encore sur l identification de nouvelles cibles bactériennes, notamment en vue de développer des agents susceptibles d inhiber les mécanismes de résistance, par exemple au niveau des systèmes d efflux bactériens (Tan et Darren, 2000; chmidt, 2004; Falconner et Brown, 2009). Les halophytes et xérophytes peuvent êtres introduits à ces programmes grâce à leur richesse en polyphénols. En effet, certains de ces composés peuvent agir suivant plusieurs mécanismes comme antibactériens, 27

42 mais aussi comme des inhibiteurs des mécanismes de résistances aux antibiotiques. Les flavonoïdes interviennent aussi comme inhibiteurs des pompes à efflux. La baicaléine, une trihydroxy flavone isolée des feuilles d une halophyte Thymus vulgaris (Lamiacées), présente un intérêt particulier du fait de son aptitude à restaurer l activité de plusieurs antibiotiques, dont la tétracycline, l oxacilline, le cefmétazole et l ampicilline, sur des souches de taphylococcus aureus résistantes à la méthicilline (ARMs) (Fujita et al., 2005). III.2.3. L hépatite C, une maladie persistante dans le secteur de la santé publique La maladie L'hépatite C est une affection hépatique causée par le virus de l hépatite C (VHC). Elle touche 2 à 3% de la population mondiale, soit 130 à 170 millions de personnes ; la prévalence étant différente selon les continents et les pays (Lavanchy, 2011). L'infection par le VHC va déclencher une maladie inflammatoire du foie, l'hépatite virale. Après infection par le virus, l'incubation dure 4 à 12 semaines. La première phase est dite aiguë, presque asymptomatique, qui évolue dans 80% des cas vers une hépatite C chronique. Dans ce cas, se développe une cirrhose (en 20 à 30 ans), voire, un carcinome hépatocellulaire (incidence de 3 à 5 % par an) (Calland, 2012a). Le virus de l'hépatite C L'agent responsable, le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié en Les seuls hôtes du VHC sont l'homme et le chimpanzé. C est un virus sphérique de 60 nm de diamètre qui possède une nucléocapside et une enveloppe lipidique. Le VHC est un membre de la famille des Flaviviridés qui comprend 3 genres : les Hepacivirus, incluant les différents génotypes du VHC ; les Flavivirus, regroupant plusieurs virus responsables d arboviroses, virus transmis à l'homme par un arthropode (virus de la fièvre jaune) ; et les Pestivirus, responsables de pathologies animales. Les virus de cette famille ont des caractéristiques communes comme l organisation génomique et la stratégie de réplication (Payan, 2012). tructure du génome, expression et fonction des protéines virales Le génome du virus de l hépatite C (VHC) est un ARN monocaténaire linéaire de polarité positive d environ 9600 nucléotides, riche en cytosine et guanine. Il possède un seul cadre ouvert de lecture et code pour dix protéines virales : la protéine Core forme la nucléocapside virale, les glycoprotéines E1 et E2 forment l'enveloppe, la protéine N1, N2, 28

43 N3, N4A, N4B, N5A, N5B sont des protéines non-structurales nécessaires pour la réplication et l'assemblage (Payan, 2012). Il est schématiquement divisé en trois régions distinctes de 5 en 3 (Trépo et al, 2006) (figure 10): La région 5 non codante placée en amont du cadre ouvert. Elle porte les séquences les plus conservées qui interviennent dans la réplication du génome viral et la synthèse des protéines virales (Pineiro et al., 2012). Le cadre ouvert de lecture est situé en aval de la région 5 non codante. La traduction de cette partie, dans les cellules infectées, est à l origine de la synthèse d une polyprotéine, précurseur unique des protéines virales structurales et non structurales (Pineiro et al., 2012). La région 3 non codante est la dernière région du génome du VHC. Elle intervient dans la réplication virale, en particulier lors de la transcription virale, en fixant le complexe de polymérisation comprenant l ARN polymérase (Pineiro et al., 2012). Figure 10. Virus de l hépatite C : schéma de la structure et organisation du génome (Hui et al., 2003) 29

44 La polyprotéine, une fois clivée par des protéases virales (N2 et N3) et cellulaires, devient précurseur des protéines virales structurales et non structurales (Pineiro et al., 2012). Les protéines structurales, y compris la protéine de capside et les deux glycoprotéines d enveloppe gp E1 et gp E2, sont codées par un tiers du génome du VHC. Les autres protéines, dites non structurales sont codées par les deux tiers restants du génome du VHC. La protéine N2 et la partie correspondante au tiers N-terminal de la protéine N3 sont des protéases. La protéine N5A est une phosphoprotéine dont la fonction n a pas encore été totalement élucidée. Elle jouerait un rôle dans la régulation de la réponse virale aux interférons, substance de l'organisme dotée de propriétés antivirales. La protéine N5B est une réplicase ARN polymérase dépendante (Pineiro et al., 2012). Cycle viral Le cycle viral du VHC peut être divisé en 3 étapes principales : l entrée du virus dans la cellule hôte, la réplication du génome viral et la dispersion des particules virales. L infection par le VHC touche les hépatocytes, les lymphocytes B et les monocytes. Le virus s attache à la surface de la cellule hôte grâce à la glycoprotéine d enveloppe E2 qui interagit avec les glycosaminoglycanes situés à la surface des cellules cibles. A ce niveau, les virions se lient au récepteurs cellulaire du VHC (tétraspanine CD81) ; ceux-ci migrent et transfèrent ces virions aux protéines de jonction claudine-1 et occuline permettant ainsi l entrée du virus par invagination (Huraux et al., 2003). D autres mécanismes d entrée existent qui mettent en jeu les récepteurs des lipoprotéines de faible et de très faible densité (LDL et VLDL), ainsi que le récepteur scavenger humain de classe B type I. Après fusion des membranes, les génomes viraux sont libérés dans les endosomes acides puis largués dans le cytoplasme (Pawlotsky et al., 2004). Au niveau du réticulum endoplasmique, la traduction est initiée permettant la synthèse de la polyprotéine virale qui est ensuite découpée en protéines virales structurales et non structurales. Par la suite, la synthèse de l ARN négatif à partir de l extrémité 3 du brin positif permet la formation d un ARN double brin et la réplication. Enfin, le virus mature est libéré après encapsidation des ARN formés et des protéines (Payan, 2012). La figure 11 illustre les principales étapes du cycle de réplication du VHC (T.HCV). 30

45 Figure 11. Principales étapes du cycle de réplication du VHC tratégie thérapeutique La prise en charge de l hépatite C ne bénéficie pas d un traitement par vaccin car l'arn du virus mute fréquemment (il existe 7 génotypes différents). Le traitement antiviral était basé sur l utilisation de l interféron (IFN) standard (successivement pendant 6 mois et ensuite 12 mois) ; puis sur la bithérapie (interféron + ribavirine), ensuite sur une combinaison d interféron pégylé avec la ribavirine (Truchot, 2014). La ribavarine est un analogue nucléosidique de la guanosine, à large spectre antiviral, qui inhiberait la synthèse des acides nucléiques viraux. Ce traitement était à l'origine de nombreux effets secondaires et son efficacité était limitée. Depuis fin 2011, le traitement repose sur la bithérapie précédente associée à des inhibiteurs de protéase (N3/4A) de première génération appelés les «Direct Acting Antivirals» (DAA). Ces molécules, le télaprévir et le bocéprévir, ont modifié la prise en charge thérapeutique de l infection par le VHC grâce à leur meilleure efficacité. Cependant, le traitement est limité aux patients atteints par le génotype 1 du VHC. De plus, il y a apparition d effets secondaires qui leur sont inhérents (l anémie et les lésions cutanées) (Truchot, 2014). En début 2014, d autres DAA qui ciblent d autres protéines virales, notamment N5B et N5A, ont été mis sur le marché. Ces molécules sont actives contre plusieurs génotypes viraux. Cependant ces traitements sont extrêmement coûteux, et leurs effets secondaires ne sont pas encore vraiment étudiés à grande échelle. De plus, ce traitement a conduit à l'apparition de substitutions associées à la 31

46 résistance (RAs). Certains des RAs sont spécifiques à un DAA, c'est le cas pour les RA spécifique à N5B. D autres apparaissent indépendamment du DAA utilisé, en particulier pour les N3/4A et N5A (arrazin, 2016). Les patients atteints d'une variante du virus qui est résistante à l N5A sont très difficiles à traiter. En outre, ces virus mutés persistent dans le sang pendant des années (Pawlotsky, 2016). D où l intérêt de développer de nouveaux traitements, particulièrement efficaces contre les varions résistants du VHC. Le virus de l hépatite C et les polyphénols Différent types de composés phénoliques s introduisent comme étant des alternatives très prometteuses aux traitements actuels avec divers mécanismes d action. Les plus connus sont la silymarine et l'épigallocatéchine gallate (EGCG). D autres flavonoïdes ont été reportés comme actifs ou potentiellement actifs, notamment la lutéoline, l apigénine, la quercétine, la narangénine et la ladanéine, ainsi que des lignines (honokiol, 3-hydroxy caruilignan C) (Calland, 2012b) (figure 12). Figure 12. chéma récapitulatif des modes d action d inhibiteurs du VHC d origine naturelle (Calland, 2012b) 32

47 La silymarine est dérivée de l extrait des graines de ilybum marianum. L extrait contient au moins sept flavonolignanes (silybines A et B, isosilybines A et B, silychristine, isosilychristine, silydianine) et un flavonoïde (taxifoline) (Calland, 2012b). La silymarine a de multiples effets sur le VHC à différents stades du cycle viral, elle inhibe la réplication du VHC dans la culture cellulaire (Polyak et al., 2007) et elle présente également des actions anti-inflammatoires et immunomodulatrices pouvant contribuer à ses effets hépatoprotecteurs (Morishima et al., 2010). Bien que la formulation de la silibinine (mélange à peu près équimoléculaire de silybines A et B ; constituant majoritaire de la silymarine) par voie intraveineuse se voit comme une option thérapeutique potentielle au VHC, l administration par voie orale n a pas vu de succès car la silibinine est rapidement métabolisée après administration orale (Hawke et al., 2010 ; Gordon et al., 2012 ; Fried et al., 2012 ; Wen et al., 2008). De plus, les composants de la silymarine présentent une faible biodisponibilité (Hawke et al., 2010). L'EGCG est la catéchine la plus abondante dans l'extrait de thé vert. Il a été démontré qu elle possède différents modes d action anti-vhc. Elle agit comme inhibiteur de l entrée du virus en inactivant directement les particules virales, n'est pas spécifique au génotype (contrairement aux inhibiteurs de protéases actuellement utilisés) et empêche également la transmission de cellules à cellules (Calland, 2012b). Ces propriétés en font une molécule particulièrement intéressante pour prévenir la récurrence et la propagation du VHC chez des patients transplantés du foie chroniquement infectés. 33

48 IV. Cas des plantes étudiées IV.1. Exploration des plantes halophytes et xérophytes dans leurs biotopes Le territoire tunisien est constitué en majorité par un climat semi-aride et aride, mais aussi par des surfaces particulièrement salines en vue de l étendue des bandes littorales dans le pays et la distribution d écosystèmes particulièrement salins comme les sebkhas. Il existe donc une très grande diversité de plantes halophytes et xérophytes qui sont largement distribuées dans le pays. Dans une perspective de contribution efficace à la valorisation des ressources de ces biotopes salins et arides, l étude de plantes qui n ont pas été explorées sur le plan phytochimique et pharmacologique est à privilégier. Pour ce faire, il est nécessaire de réaliser des recherches directement sur terrain, et pour cela, de sélectionner des zones présentant une grande diversité en ce type de plantes, mais également une grande disponibilité en biomasse. Différents écosystèmes de plantes halophytes existent dans le nord du pays. ebkhet oliman (Z-1) (figure 13) est un écosystème qui est bien caractérisé, aussi bien sur le plan climatique, géomorphologique et hydrologique, qu au niveau de la faune et la flore. Elle se situe au sudouest de la péninsule du Cap Bon (Gouvernorat de Nabeul) à la «frontière» du Gouvernorat de Ben Arous. C est une zone humide inondée présentant un plan d eau d une superficie globale Z-2 d environ 225 hectares, caractérisée par des sols en majorité halomorphes. Un inventaire des plantes halophytes qui peuplent cette zone a été le critère Z-4 Z-1 Z-3 principal pour la sélection de celle-ci. Une grande diversité d espèces halophytes a été signalée, y compris des Chénopodiacées indicatrices d une salinité élevée (Arthrocnemum indicum et uaeda fructicosa) ou encore des Aizoacées (Mesembryanthemum edule), des Anacardiacées (Pistacia lentiscus) et des (alicornia arabica) (Annexe 1). Amaranthacées Figure 13 : Localisation des zones investiguées sur la carte de la Tunisie 34

49 ur les limites de Z-1, les plantes halophytes de la sebkha cèdent la place à un couvert représentatif des sols sableux ou limoneux argileux à structure grossière et fine. On retrouve donc un autre écosystème qui s étend le long de l extension balnéaire de la ville de oliman (oliman Plage). Le long de cette extension balnéaire, la Zone Z-2 (figure 13) se distingue par la présence d halophytes qui n ont pas été trouvées dans la Z-1, tels que ilene succulenta (Caryophyllacées) et Atriplex tatarica (Chénopodiacée) (Annexes 1). En s éloignant vers les zones continentales, le paysage est de plus en plus peuplé par des plantes xérophytes. A environ 80 km de Z-1, dans la région de Ghrifette proche de bkhet El Kourzia (Z-3) (figure 13), l environnement est particulièrement sec comparé à Z-1 et présente donc une assez grande diversité en xérophytes, dont Thymus capitatus (Lamiacées), Thapsia garganica, (Apiacées) et Verbascum sinuatum (crophulariacées) (Annexe 1). Les peuplements xérophytes s étendent encore plus loin. A environ une cinquantaine de kilomètres à l'est du gouvernorat de Béja, une zone (Z-4) (figure 13) se distingue par un écosystème un peu différent de (Z-3). Z-4 se situe à la région de Goubellat caractérisée par un climat de steppes avec peu de précipitations. Une autre diversité de xérophytes peuple donc Z4 ; on y trouve notamment Cistus monspeliensis (Cistaceae), Cirsium scabrum (Asteracées), cabiosa maritima (Caprifoliacées) (Annexe 1). ur l ensemble des trente plantes halophytes et xérophytes identifiées dans les quatre zones (Z-1, Z-2, Z-3 et Z-4), huit plantes ont été sélectionnées pour cette étude, qui sont peu ou pas étudiées sur le plan phytochimique et pharmacologique. On distingue 5 halophytes (Z-2) : ilene succulenta Forssk. (Caryophyllacées) ; Atriplex tatarica L. (Amaranthacées) ; Aeluropus littoralis (Gouan) Parl. (Poacées) ; Limonium virgatum (Willd.) Fourr. (Plumbaginacées) ; Juncus maritimus Lam. (Juncacées) ; de 3 xérophytes (Z-3) : Atractylis serratuloides (Cass.) DC. (Asteracées), cabiosa maritima L. (Caprifoliacées) et Cirsium scabrum (Poir.) Bonnet & Barratte (Asteracées). 35

50 IV.2. Présentation des plantes étudiées, utilisations traditionelles et données phytochimiques et pharmacologiques IV.2.1. ilene succulenta Forssk. (yn. ilene corsica DC) HALOPHYTE (Caryophyllacées) Figure 14 : ilene succulenta : sur terrain et collectée Principales caractéristiques botaniques, distribution et écologie. succulenta appartient à la famille des Caryophyllaceae. C est une plante robuste à grosse souche rameuse et à tiges étalées et ascendantes de cm (Pottier-Alapetite, 1981). (figure 14). Le genre ilene comprend plus de 700 espèces largement distribuées dans l'hémisphère Nord, mais aussi en Afrique, Asie et Amérique du ud (Mamadalieva et al., 2012). En Tunisie,. succulenta est distribuée au nord-est, au Cap Bon, au centre et au ud : Hammamet, Mraissa, Hergla, ousse, Lac Kelbia, Mehdia, Gabès, Houmt-ouk et Zarzis (Pottier-Alapetite, 1981). C est une halophyte qui pousse dans les dunes littorales caractérisées par un environnement salin et ensoleillé. Utilisations traditionnelles. succulenta ne présente pas d utilisations en médecine traditionnelle ni d activités biologiques. Par contre, le genre ilene est bien connu en médecine traditionnelle. On retrouve diverses utilisations en médecine traditionnelle tibétaine, chinoise et zulu, 36

51 notamment pour traiter la fièvre, contre les morsures de serpents et comme anti-inflammatoire (Mamadalieva et al., 2012). En outre, les silènes sont très connues pour leur utilisation comme substituts de savon. Ces plantes sont aussi connues dans certaines gastronomies traditionnelles. Données bibliographiques pharmacologiques et phytochimiques Le genre ilene présente différentes activités biologiques, notamment antimicrobienne et antitumorale (Mamadalieva et al., 2012). Des études phytochimiques réalisées sur des espèces de ilene ont révélé la présence de nombreux composés bioactifs. Plus de 400 composés ont été isolés, dont les phytoecdystéroïdes qui sont majoritaires dans le genre. Par contre, il y a peu de données phytochimiques concernant l espèce. succulenta. Des études ont montré la présence d acides gras, de stérols et de saponosides dans la plante (Hanna et al., 1992 ; Karawya et al., 1991), mais ont aussi déterminé la composition chimique de son parfum floral (benzaldéhyde et benzoate de méthyle majoritairement) (Jurgens IV.2.2. Atriplex tatarica L. (yn. Atriplex laciniata L.) et al., 2002). HALOPHYTE (Amaranthacées) Figure 15 : Atriplex tatarica: sur terrain et collectée 37

52 Principales caractéristiques botaniques, distribution et écologie Atriplex tatarica appartient à la famille des Amaranthacées. C est une plante annuelle, entièrement argentée, de 30 cm à 1 m de hauteur, dressée ou ascendante, à rameaux étalés (Pottier-Alapetite, 1981) (figure 15). Le genre Atriplex comprend environ 255 espèces (Abd El Raheim et al., 2013). En Tunisie, A. tatarica est bien distribuée au Kairouan (Pottier-Alapetite, 1981). Cette halophyte pousse sur les dunes littorales sablées caractérisées par un environnement salin. Utilisations traditionnelles A. tatarica n est pas bien connue en médecine traditionnelle. Par contre, différentes utilisations thérapeutiques ont été mentionnées pour le genre Atriplex, notamment le traitement de la bronchite et le contrôle de la glycémie chez les patients diabétiques (Abd El Raheim et al., 2013). Dans la médecine traditionnelle arabe, on trouve différentes utilisations : soins des maux d'estomac et en tant que laxatif. Les tribus bédouines utilisent encore à l heure actuelle ces plantes pour traiter les douleurs musculaires (Chikhi et al., 2014). Données bibliographiques pharmacologiques et phytochimiques Aucune étude concernant les activités biologiques potentielles d A. tatarica n a été trouvée dans la littérature. Néanmoins, le genre Atriplex présente différentes activités biologiques, notamment antifongique, antivirale (contre le virus de l herpès), anti-oxydante et antidiabétique (Abd El Raheim et al., 2013). Des études phytochimiques réalisées sur des espèces d Atriplex ont révélé que le genre présente une diversité de composés. Une étude phytochimique réalisée sur l espèce A. tatarica a montré la présence de flavonoïdes (tricine, tricine-7-o-β-d-glucopyranoside, isorhamnétine et isorhamnétine-3-o-rutinoside) et des phytostérols (stigmastérol et β-sitostérol) dans les parties aériennes (Jenis et al., 2009). Les composés volatiles de la plante ont aussi été déterminés. On retrouve majoritairement des dérivés du phénylpropène, des hydrocarbures et des acides gras (Jenis et al., 2010). 38

53 IV Aeluropus littoralis (Gouan) Parl. (yn. Dactylis littoralis Willd. ; Poa littoralis Gouan) HALOPHYTE (Poacées) Figure 16. Aeluropus littoralis : sur terrain et collectée Principales caractéristiques botaniques, distribution et écologie Aeluropus littoralis appartient à la famille des Poacées. C est une plante vivace de cm. Les tiges sont couchées et souvent radicantes, émettant des rameaux ascendants et courts (Pottier-Alapetite, 1981) (figure 16). Cette espèce est bien répandue sur le bassin méditerranéen. En Tunisie, A. littoralis est l unique représentante du genre Aeluropus (Pottier-Alapetite, 1981). Cette espèce est, par contre, bien distribuée dans le pays, surtout dans les zones côtières. Il s agit d une halophyte par excellence. Elle est très résistante à la salinité et peuple les sables et prés humides. 39

54 Utilisations traditionnelles A. littoralis n est pas très réputée pour des utilisations thérapeutiques. On trouve seulement quelques utilisations en médecine traditionnelle chinoise, pour faire baisser la fièvre, contre les troubles de la diurèse et dans le traitement de la cirrhose hépatique et de l ascite du foie (Ma et al., 2011). Données pharmacologiques et phytochimiques bibliographiques Aucune étude n a été trouvée dans la littérature concernant des analyses phytochimiques ou d activités biologiques pour A. littoralis. D autre part, la majorité des travaux réalisés dans le genre Aeluropus se sont intéressés à l étude de la résistance à la salinité de A. littoralis et de A. lagopoides (Barhoumi et al., 2007 ; Haghighi et al., 2014 ; Jannesar et al., 2014). IV.2.4. Limonium virgatum Willd HALOPHYTE (yn. tatice virgata Willd.) (Plumbaginacées) Figure 17 : Limonium virgatum : sur terrain et collectée Présentation Limonium virgatum appartient au genre Limonium de la famille des Plumbaginacées. Limonium, connu sous le nom de statice, est un grand genre de 180 espèces. Le genre 40

55 englobe principalement des plantes herbacées vivaces mais parfois annuelles ou arbustes (Bailey., 1977). Il existe entre 15 à 20 espèces cultivées en horticulture, parmi elles on peut citer L. sinuatum, L. bonduelli, L. dregeanum, L. latifolium, L. sinense, L. psylliostachys, L. bellidifolium, L. gmelinii et L. perezii (ato., 1989). Description botanique Limonium virgatum est une plante vivace de cm, glabre, grêle, très rameuse à la base et dont l inflorescence est en épi (figure 17). La plante est à souche ligneuse à divisions épigées couvertes de feuilles rapprochées, étroitement spatulées, obtuses ou rétuses, uninervées, non ridées. Les hampes sont flexueuses, non fragiles, très rameuses, à rameaux stériles très nombreux, rigides, à articles longs, grêles, non étranglés aux 2 bouts. Les épillets sont arqués (à 1-4 fleurs), écartés, en longs épis lâches, unilatéraux, peu nombreux. La bractée extérieure est 3 à 4 fois plus courte que l'interne, carénée sur le dos et très appliquée. Le calice est à tube courbé, à limbe 1 fois plus court que le tube, à dents ovales-obtuses. La corolle violacée est assez grande (7-9 mm de large) (Pottier-Alapetite, 1981). Distribution et écologie Le genre Limonium est largement distribué dans le monde. Il est très présent en Tunisie. Certaines espèces du genre sont considérées comme endémiques du pays. L. virgatum est bien distribué au nord et au centre de la Tunisie : Bizerte, La Marsa, Radès, Hammam-lif, Zembra, Bou Ficha et ousse (Pottier-Alapetite, 1981). C est une plante très tolérante à la salinité, qui pousse sur les sables maritimes. Utilisations traditionnelles Bien que l espèce L. virgatum ne soit pas mentionnée en médecine traditionnelle ni dans la littérature, le genre Limonium est bien connu en médecine traditionnelle chinoise. Plusieurs espèces sont utilisées pour traiter la diarrhée, les bronchites et les hépatites. On cite l exemple de Limonium wrightii qui est employée pour le traitement des arthrites et de la fièvre (Aniya et al., 2002). Données bibliographiques pharmacologiques et phytochimiques A notre connaissance, Limonium virgatum n a pas été étudié auparavant d un point de vue phytochimique et pharmacologique. En revanche, plusieurs espèces du genre Limonium présentent diverses activités biologiques, Des propriétés antioxydantes, antivirales et antiprolifératives, cardioprotectrice, anti-inflammatoire et antibactérienne ont été reportées pour le genre Limonium (Aniya et al., 2002 ; Yuh-Chi et al., 2002 ; Kandil et al., 2000 ; 41

56 Murray et al., 2004). Plusieurs espèces de Limonium sont connues pour leurs activités antimicrobiennes sur différents types de bactéries et de champignon pathogènes. Les extraits des racines de L. effusum, L. globuliferum, L. lilacinum ont montré des activités sur 9 bactéries et 12 champignons avec un maximum enregistré pour L. lilacinum (Listeria monocytogenes) et L. globuliferum contre (Alternaria alternata) (Avaz et al., 2012). Une autre étude a montré que l extrait des tiges de Limonium stocksii est capable d inhiber la croissance de souches d Aspergillusflavus et de Microsporumcanis (Rahat et al., 2013). akagami et al. (2001) suggèrent que l administration des extraits de Limonium caliniforlicum empêche la production de la vérotoxine par la bactérie Escherichia coli entérohémorragique dans les intestins humains. Par ailleurs, une grande diversité de composés a été décrite dans le genre Limonium. Toutes les espèces du genre sont connues par leur grande richesse en naphtoquinones, et surtout en flavonoïdes tels que le kaempferol, la quercétine et des flavonols triglycosylés (Tableau 5). De plus, certains auteurs ont signalé la présence de tanins dans les plantes du genre Limonium (Medini et al., 2011, Medini et al., 2014). Tableau 5. Molécules purifiées à partir d espèces du genre Limonium (Harborne, 1999) Molécules Plante beta-alanine betaïne Limonium vulgare N-Carbamoyl putrescine Limonium vulgare Choline sulfate Limonium vulgare Laricitrine Limonium sinuatum Herbacetine 8-glucoside 3-O-Methylquercetine-7-O-beta-D-glucopyranoside Limonium sinuatum Limonium gmelinii Isorhamnetine 7-O-beta-D-glucopyranoside Limonium sinuatum Myricetine 3-O-galactoside Limonium latifolium Myricetine 3-O-galactoside Limonium serbicum Myricitrine Limonium spp, Myricetine-3-O-rutinoside Limonium gmelinii Laricitrine 7-O-glucoside Limonium sinuatum Myrtilline Limonium spp. Delphinidine Limonium spp. Petunidine 3-rhamnoside-5-glucoside Limonium spp. 3,4,2',4',6'-Pentahydroxychalcone Limonium spp. 4,6,4'-Trihydroxyaurone Limonium spp. Aureusidin Limonium spp. Cernuoside Limonium bonduellili Aureusine Limonium spp. Myricetine 3-(2''-p-hydroxybenzoylrhamnoside) Limonium sinense 42

57 IV.2.5. Juncus maritimus Lamk (syn. Juncus maritimus var. arabicus Asch. & Buchenau) HALOPHYTE ( Juncaceae) Figure 18 : Juncus maritimus : sur terrain et collectée Présentation J. maritimus appartient à la famille des Juncaceae. Cette famille se compose de huit genres, dont Juncus L. qui est de loin le plus important. Les espèces de Juncus les plus connues: Juncus acutus L., Juncus bufonus L., Juncus effusus L., Juncus inflexus L., Juncus fontanessi Gay in Lah., Juncus littoralis C.A.May., Juncus punctoritus L.f., Juncus rigidus C. A. May., Juncus subulatus Forssk, Juncus roemerianus L., Juncus inflexus L. et Juncus alpinus V. (Tackholm, 1974). Description botanique J. maritimus une plante herbacée vivace, vigoureuse, glabre, atteignant 1 mètre de hauteur (figure 18). Les rhizomes sont traçants. Les tiges sont raides, nues, pleines, les stériles sont piquantes. Les feuilles sont toutes radicales, peu nombreuses, égalant presque les tiges, dressées, cylindriques, piquantes. Les fleurs sont de couleur vert pâle, en panicules, fournies, 43

58 lâche-décomposées, un peu latérales, souvent dépassées par une bractée piquante. Le périanthe est à divisions toutes lancéolées aiguës. Les étamines sont au nombre de 6. Le fruit est une capsule petite, elliptique-oblongue, mucronée, fauve, juste un peu plus longue que les tépales. Les graines sont appendiculées et plus obtuses (Pottier-Alapetite, 1981). Distribution et écologie Les espèces du genre Juncus sont présentes dans les terres humides du monde entier, mais sont plus rares sous les tropiques que dans les régions tempérées (Brink et al., 2012). Juncus maritimus est bien distribué dans le monde. Il se rencontre en zone méditerranéenne et s étend en Afrique et en Europe. Il se trouve aussi en Asie et en Amérique. En Tunisie, la plante est nommée mar. Elle se trouve en abondance dans les zones côtières et dans les sebkhas (bassin occupant le fond d'une dépression à forte salinité). Utilisations traditionnelles Depuis le néolithique, les espèces de Juncus sont très connues pour leur utilisation comme matière première pour tresser des articles tels que des nattes et des paniers, ainsi que pour leurs utilisations dans la couverture des toits. Dans l Egypte ancienne, les plumes de jonc étaient utilisées comme outil d écriture dès le III e siècle avant J.-C. Dans le delta du Nil en Egypte, on cultivait à petite échelle des espèces de Juncus pour la production de nattes au début du XXe siècle. Au Tibesti (Niger), les tiges de J. rigidus sont utilisées pour fabriquer des brosses et des tamis (Brink et al., 2012). Les jeunes pousses sont consommées par les Touareg du Niger. Par ailleurs, les espèces du genre Juncus possèdent diverses vertus thérapeutiques. En médecine traditionnelle asiatique, les graines de différentes espèces de Juncus sont employées comme diurétique et comme remède contre la diarrhée (Brink et al., 2012). L'infusion des fruits de J. acutus mélangée à des grains d'orge est utilisée pour soulager un rhume (Bellakhdar, 1978). Les rhizomes de J. maritimus sont recommandés en cas d'insomnies (El-hamy et al., 2012). La partie médullaire de J. effusus L. est utilisée dans la médecine traditionnelle japonaise et chinoise comme antipyrétique et comme agent sédatif (Miles et al., 1977). Juncus maritimus est aussi connu en médecine traditionnelle, notamment pour traiter le rhume (Ouarghidi et al., 2013). Les graines, en décoction, sont employées contre les maux l estomac et du foie (Lahsissene et al., 2009). Au Maroc (utilisation propre au Zaër), les graines, associées aux stigmates de Maïs, aux fleurs de Figuier de Barbarie et aux rhizomes de Chiendent, sont utilisées en décoction contre les calculs rénaux et comme diurétique. 44

59 Données bibliographiques pharmacologiques et phytochimiques Il existe une grande diversité dans le genre Juncus, aussi bien en terme de composition chimique que d activités biologiques. Différentes activités biologiques ont été rapportées pour plusieurs espèces du genre Juncus : antioxydante, hépatoprotectrice, antitumorale, antivirale, antimicrobienne, anti-algale et anti-inflammatoire (El-hamy et al., 2012). De plus, une panoplie de composés ont été caractérisés dans le genre Juncus, notamment des flavonoïdes, coumarines, terpènes, stilbènes, acides phénoliques, caroténoïdes et d une manière plus fréquente, des phénanthrènes (monomériques et dimériques). Ces derniers sont les plus étudiés dans le genre Juncus. (El-hamy et al., 2012). Concernant J. maritimus, il n y a qu une seule étude phytochimique et biologique à notre connaissance, où il a été démontré qu elle possède une activité antibactérienne probablement due à des composés phénanthréniques (Tóth et al., 2016). - Les phénanthrènes Les phénanthrènes forment une classe de composés aromatiques qui est assez rare dans la nature. Ils sont rencontrés principalement dans environ 49 espèces de la famille des Orchidacées (Dendrobium, Bulbophyllum, Maxillaria...). Ils existent aussi chez les familles des Dioscoreacées, Bétulacées et Combretacées. Une grande majorité des phénanthrènes ont été décrits chez les espèces de Juncus. Les phénanthrènes sont le plus souvent dérivés des stilbènes par couplage oxydatif des noyaux aromatiques, mais il existe aussi des phénanthrènes ayant comme précurseurs des diterpènes. Il existe une assez grande diversité structurale au sein des phénanthrènes. Ces composés peuvent être classés en trois groupes principaux : monophénanthrènes, diphénanthrènes et triphénanthrènes. Phénanthrènes monomériques C est la forme naturelle la plus fréquente dans la nature avec plus de 200 composés connus. Une centaine d entre eux sont des dérivés phénanthréniques (dont les 9,10- dihydrophénanthrènes) qui sont substitués par des groupes hydroxyle et/ou méthoxyle (figure 19). Leur diversité repose essentiellement sur le nombre et la position des fonctions oxygène. Les groupes hydroxyle et méthoxyle sont souvent au nombre de 3 et 6 et leur position en C-2, C-3, C-5, C-6 et C-7. Il existe des substitutions en C-9 et C-10 mais beaucoup moins fréquentes. Les phénanthrènes substitués par un seul substituant sont rares, on en trouve chez les orchidées (Kovacs et al., 2008). D autres types de substitution sont rencontrés chez les phénanthrènes monomériques, notamment par des groupes méthyle, carboxyle, formyle et 45

60 vinyle. Des hétérosides existent aussi mais sont relativement rares. Un autre type caractérise les phénanthrènes monomériques, les phénanthraquinones (figure 20) qui regroupe 19 composés, souvent substitués par des groupes hydroxyle, méthoxyle ou méthyle (Kovács et al., 2008). Figure 19. tructure de base des phénanthrènes (gauche) et des dérivés 9,10-dihydrophénanthrènes (droite) Figure 20. tructure de base des phénanthraquinones Phénanthrènes dimériques et trimériques Ils sont nettement moins fréquents, avec une quarantaine de composés identifiés actuellement. Il s agit d une association de deux monomères de phénanthrènes et de leurs dérivés 9,10dihydrophénanthrènes, généralement reliés entre les positions C-1-1ʹ (figure 21). Des liaisons C1-3ʹ, C1-8ʹ et C3-3ʹ existent également dans la nature. Ces composés sont souvent substitués par des groupes hydroxyle et méthoxyle. Figure 21. tructure de base des phénanthrènes dimériques (liaison en C-1-1 ) 46

61 Finalement, il existe un seul triphénanthrène qui a été isolé à partir d une orchidée, C. appendiculata (Xue et al., 2006). - Les phénanthrènes dans le genre Juncus Il existe une grande diversité de phénanthrènes monomériques dans le genre Juncus dont la plupart comporte un groupe vinyle en C5. Un grand nombre de phénanthrènes ou dihydrophénanthrènes sont substitués par des groupes hydroxyle, alkyle, formyle, carboxyle, mais aussi reliés à un composé hétérocyclique tel que les pyranes et les furanes. Les formes glycosylées sont relativement rares dans le genre Juncus. Quelques hétérosides comme les effusides (I-V), ont toutefois eté isolés à partir de Juncus effesus (Dellagreca et al., 1995) (figure 22). Les phénanthrènes dimériques sont aussi rares dans le genre Juncus. Cinq 9,10-dihydrophénanthrènes dimériques ont été identifiés chez Juncus acutus (Dellagreca et al., 2002). Juncusol Déhydrojuncusol Effuside I Figure 22. Exemples de phénanthrènes monomériques dans le genre Juncus. Un phénanthrène (juncusol - gauche) ; un dihydrophénanthrène (dehydrojuncusol - centre) ; un dérivé glycosylé (effuside I - droite) Ces phénanthrènes sont doués de diverses activités biologiques révélées chez différentes espèces de Juncus. Le déhydroeffusol isolé de Juncus effusus, possède des propriétés anxiolytiques et sédatives caractéristiques et n'affecte pas la coordination générale du mouvement chez la souris (Liao et al., 2011). Des dihydrophénanthrènes dimériques isolés d une autre espèce, Juncus acutus, sont aussi dotés de propriétés anti-algales (Dellagreca et al., 2002, 2005). Chez la même espèce, d autres phénanthrènes ont révélé un effet anti47

62 inflammatoire, notamment le juncutol (Behery et al., 2007). Des activités cytotoxiques ont aussi été rapportés, notamment pour le juncunol qui a montré une cytotoxicité sélective in vitro vis-à-vis de divers lignées cancereuses humaines (Rodrigues et al., 2014). On trouve aussi des phénanthrènes à potentiel antimicrobien. Chez Juncus inflexus, quatre phénanthrènes : juncusol, jinflexin B, juncuenine D et ldehydrojuncuenine B ont montré des effets sur la croissance de souches de taphylococcus aureus résistantes à la méthicilline. Plus loin, il a été suggéré que le juncusol isolé à partir de J. roemerianus régulerait les populations de Bacillus dans le marais (Chapatwala et al., 1981). IV.2.6. Atractylis serratuloides (Cass.) ieber ex Cass yn. Atractylis microcephala Coss. & Durieu) XEROPHYTE (Asteracées) Figure 23. Atractylis serratuloides : sur terrain et collectée Principales caractéristiques botaniques, distribution et écologie Atractylis serratuloides appartient à la famille des Asteracées. C est une plante vivace à tiges épaisses dressées de 20 à 30 cm de haut, très ramifiées et à rameaux très feuillus (Chehma et al., 2006) (figure 23). Le genre Atractylis se compose de 30 espèces bien réparties dans le monde : la méditerranée, la macaronésie et le sud-ouest de l Asie (Bohm et al., 2001). En Tunisie, la plante est 48

63 nommée irr. Elle est bien distribuée au sud du pays (Chehma et al., 2006). La plante pousse dans un climat semi-aride, dans les Regs (déserts de pierre) et les hamadas (plateaux rocailleux rencontrés dans les régions désertiques). Utilisations traditionnelles En médecine traditionnelle, le genre Atractylis est bien connu pour traiter les troubles circulatoires, les parasites intestinaux, les ulcères et l'empoisonnement par des morsures de serpent (Chabani et al., 2013). Les racines d A. serratuloides sont utilisées pour traiter l'estomac fragile et le manque d'appétit. Par ailleurs, les racines de la plante produisent un latex qui est consommé comme gomme à mâcher Loubene. La plante est aussi pâturée par les dromadaires (Chehma et al., 2006). Données bibliographiques pharmacologiques et phytochimiques Une étude réalisée sur les parties aériennes de la plante a montré qu elle possède des activités antioxydante et antibactérienne (Bouaziz et al., 2009). Aucune étude phytochimique n a été effectuée sur A. serratuloides. De plus, le genre Atractylis est chimiquement peu étudié. eule la présence de flavonoïdes et de triterpènes a été mise en évidence (Chabani et al., 2013). Les études phytochimiques réalisées sur d autres espèces du genre ont porté principalement sur une espèce toxique, Atractylis gummifera. a toxicité a été attribuée à l atractyloside et au carboxyatractyloside, deux diterpènes gycosylés capables d'inhiber la phosphorylation oxydative mitochondriale (Chabani et al., 2013). 49

64 IV.2.7. cabiosa atropurpurea L. subsp. maritima (L.) Fiori & Paoli (yn. cabiosa maritima L.) XEROPHYTE (Dipsacacées) Figure 24. cabiosa maritima : sur terrain et collectée Principales caractéristiques botaniques, distribution et écologie Le genre cabiosa, qui appartient à la famille des Dipsacacées, est représenté par 10 espèces en Tunisie (Pottier-Alapetite, 1981). cabiosa atropurpurea, regroupe deux sous-espèces : atropurpurea et maritima (Tela botanica). La scabieuse maritime est une plante annuelle ou pérenne de 30 cm à 1 m de hauteur, glabre ou poilue, à rameaux étalés et des fleurs roses ou lilas, rayonnantes, à 5 lobes inégaux (figure 24). cabiosa maritima est bien répandue dans le bassin méditerranéen. En Tunisie, elle est localisée à Korbos, Dj. Abder Rahman, le Kef, Zaghouan, Kessera, akiet idi Youssef, ousse, Gabès, Moularès (Pottier-Alapetite, 1981). C est une plante xérophyte qui pousse dans un environnement sec. Utilisations traditionnelles cabiosa atropurpurea, regroupant les deux sous-espèces atropurpurea et maritima, est connue sous le nom de Ambarina au nord du Pérou et de Escabiosa au nord-est de la Catalogne. Elle est très utilisée en médecine traditionnelle (comme régulateur de la menstruation et même en médecine vétérinaire comme diurétique), particulièrement pour son activité antibactérienne contre la bronchite (Elhawary et al., 2011). 50

65 Données bibliographiques pharmacologiques et phytochimiques Il a été démontré que. atropurpurea possède plusieurs activités biologiques, notamment, anti-inflammatoire, antibactérienne, anti-oxydante et hépatoprotectrice (Elhawary et al., 2011). La première étude phytochimique sur cabiosa atropurpurea a été conduite en 1977 révélant la présence d un hétéroside de flavone : la rhoifoline (Zemtsova, 1977). Un deuxième travail a été réalisé en 2010 sur la sous-espèce maritima, permettant l'isolement d iridoïdes (Polat et al., 2010). L'étude la plus récente a investigué la composition chimique et l'activité biologique de l'extrait éthanolique des parties aériennes de cabiosa atropurpurea. Ce travail a permis d'identifier la lutéoline et ses dérivés glycosylés (lutéoline-7-o-glucoside e t lutéoline-7-o-βd-rutinoside) ainsi qu un autre composé phénolique (acide 3-O-cafféoylquinique methylester) (Elhawary et al., 2011). IV.2.8. Cirsium scarbrum (Poir.) Bonnet &Barratte (yn. Cirsium giganteum preng.) XEROPHYTE (Asteracées) Figure 25 : Cirsium scabrum Cirsium scabrum: sur terrain et collectée 51

66 Description botanique Cirsium scarbrum est une plante annuelle de la famille des Asteracées. C est une plante épineuse, puissante, pouvant dépasser 3 m de hauteur (figure 25). La tige est dressée, raide, striée, laineuse, rameuse-divariquée dans le haut. Les feuilles sont oblongues, pennatilobées, à lobes larges et épineux, les caulinaires amplexicaules mais non décurrentes sur la tige, les inférieures en rosette, pouvant atteindre 40 à 80 cm ; face inférieure tomenteuse, blanchâtre et face supérieure verte et scabre. Les capitules sont globuleux, relativement petits, de 3 cm de diamètre. Les bractées de l'involucre ovo-lancéolées sont petites, aranéeuses, appliquées et terminées en courte épine récurvée. Les pétales sont blancs aux extrémités purpurines (Pottier-Alapetite, 1981). Distribution et écologie Les espèces du genre Cirsium sont bien distribuées dans le monde. Environ 200 espèces de Cirsium sont distribuées en Europe, en Afrique du Nord, en Asie, ainsi qu'en Amérique du Nord et centrale (Mabberley et al., 2008). La présence de Cirsium scarbrum a été signalée dans le bassin méditerranéen, mais aussi sur le continent américain. En Tunisie, le genre Cirsium n est représenté que par trois espèces. C. scabrum se trouve à Zaghouan, Kessera, Dj. Bargou, Thibar, Korbous, Zembra (Pottier-Alapetite, 1981). C est une plante xérophyte qui pousse dans un environnement particulièrement sec. Utilisations C. scabrum n est pas bien connue en médicine traditionnelle, ni pour d autres utilisations. En général, les espèces de Cirsium sont considérées comme étant des mauvaises herbes nuisibles aux cultures et sont donc souvent la cible de moyens de contrôle massifs. En revanche, chaque organe de ces plantes peut être consommé. Les racines de toutes les espèces de Cirsium peuvent être consommées crues, bouillies ou rôties. Certaines ont des racines qui deviennent douces lorsqu'elles sont cuites. Les boutons floraux immatures peuvent être mangés crus ou cuits. Les jeunes feuilles peuvent être consommées crues une fois débarrassées de leurs épines. De plus, les feuilles, qu il s agit de jeunes feuilles ou des feuilles basales, peuvent servir à la préparation de thé. Les jeunes tiges pelées et cuites prennent un goût qui rappelle celui du céleri. Les graines peuvent être bouillies et consommées de la même manière que les graines de tournesol ; elles peuvent aussi être broyées en farine panifiable (Vizgirdas et al., 2009). L utilisation du Cirsium comme source nutritionnelle est connue par plusieurs cultures. Dans les zones rurales en Turquie, les tiges et les racines de 52

67 certaines espèces de Cirsium ont été utilisées comme source de nourriture et additifs alimentaires depuis des années (Demirtas et al., 2017). Plus loin, certaines espèces de Cirsium sont cultivées par les mongols pour subvenir aux besoins manquants en fruits et légumes, qui sont moins faciles à faire pousser dans les steppes à climat sec (Khramova et al., 2011). Le genre Cirsium est aussi connu en thérapeutique. On trouve des utilisations en médecine traditionnelle chinoise, coréenne et japonaise pour traiter l hépatite, mais aussi les tumeurs, notamment le cancer du foie, cancer de l utérus et la leucémie (Liu et al., 2006). D autres utilisations ont aussi été rapportées en médecine traditionnelle polonaise, notamment comme anti-inflammatoire et antimicrobien (Tarle et al., 1990 ; Nazaruk et al., 2005) mais aussi en Louisiane pour le traitement du rhume (Hand, 1980). À Mizoram, en Inde, le jus de racine de Cirsium chinensis est utilisé comme antiseptique pour traiter les blessures au fil de barbelé, les ulcérations et les abcès. Une décoction de la racine est consommée pour soulager la flatulence. En Italie centrale, les feuilles et le jus de feuilles de Cirsium arvense sont utilisés comme hémostatique d'urgence à appliquer directement sur les plaies ; en décoction, les feuilles sont utilisées sur les bléssures (Guarrera et al., 2005). Les plantes du genre Cirsium s introduisent aussi dans divers types d utilisations. En effet, les tiges des espèces de Cirsium sont connues pour leur texture très fibreuse. Les fibres extraites des tiges peuvent être utilisées pour la fabrication de cordes résistantes. En outre, les tiges bien séchées et débarrassées de leurs épines peuvent servir à faire du feu. La partie duveteuse des graines constitue un bon matériau isolant (Vizgirdas et al., 2009). Données bibliographiques pharmacologiques et phytochimiques A notre connaissance, il n existe pas d études concernant la composition chimique, ni les potentielles activités biologiques de C. scabrum. Par contre, différentes propriétés biologiques d autres espèces de Cirsium ont été démontrées dans la littérature. Plusieurs travaux se sont intéressés aux activités cytotoxiques et antiprolifératives contre différentes lignées cellulaires cancéreuses (Lee et al., 2002 ; Liu et al., 2006 ; Waksmundzka-Hajnos et al., 2008), suggérant que le genre Cirsium est une source prometteuse en molécules antitumorales actives. On trouve aussi des études qui mettent en évidence les propriétés antimicrobiennes, antioxydantes, et anti-inflammatoires de différentes espèces de Cirsium (Nazaruk, 2008). D autre part, le genre Cirsium a bien été exploré du point de vue phytochimique. Des données sur la composition chimique d environ une centaine d espèces de Cirsium sont disponibles dans la littérature, soulignant l existence d une grande diversité chimique au sein du genre Cirsium. Parmi les composés les plus étudiées chez les Cirsium, on trouve les 53

68 flavonoïdes. La plus rencontrée est la linarine (Jordon-Thaden et al., 2003), une flavone qui possède des propriétés analgésiques, anti-inflammatoires, antipyrétiques et neuroprotectrices (Feng et al., 2015). L apigénine et la lutéoline (et leurs dérivées) sont également synthétisées par une grande majorité des espèces de Cirsium (Jordon-Thaden et al., 2003). Elles sont connues pour leurs propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, antibactériennes et chimiopréventives (Jordon-Thaden et al., 2003 ; hukla et Gupta, 2010 ; López-Lázaro, 2009). Les triterpènes et stérols représentent la deuxième famille de métabolites secondaires en termes de diversité chez le genre Cirsium (López-Lázaro et al., 2003). Les triterpènes sont une classe de métabolites secondaires composés de 30 carbones. Ils sont très répandus, notamment dans les résines, à l'état libre, estérifié, ou sous forme hétérosidique. Ces molécules sont des constituants membranaires de certains organes spécialisés comme les trichomes (Peirs, 2005). Ce sont également des composés sécrétés par les plantes pour se défendre contre les insectes (Jordon-Thaden et al., 2003). La majorité des triterpènes sont des molécules cycliques et sont, à ce jour, représentés par plus de 4000 structures formées sur plus d une centaine de squelettes. Au niveau biosynthétique, ils dérivent soit de la cyclisation du squalène, soit de celle de l époxysqualène. Les formes les plus représentées chez les végétaux sont en général pentacycliques (de type lupane, oléanane, tarastane, ursane ), mais aussi tétracycliques (figure 26). Figure 26. chéma de biosynthèse de certaines familles de triterpènes 54

69 Les phytostérols (molécules tétracycliques) ont un rôle structural important dans les membranes plasmiques où ils interviennent dans la régulation de la fluidité et de la perméabilité de celles-ci. Enfin, les phytostérols ont un rôle à jouer dans la transduction des signaux entre la cellule et son environnement (Luo et al., 2015). Les phytostérols et triterpènes pentacycliques se rencontrent à l état libre ou sous forme d hétérosides (on parle alors de saponosides). elon la nature de la génine, on distinguera les saponosides à génine stéroïdique et les saponosides à génine triterpénique, de loin plus nombreux que les précédents (Peirs, 2005). Par ailleurs, il existe des triterpènes représentées par des squelettes mono-, bi-, tri- et hexacycliques ainsi que par des structures acycliques ; la formation de ces dernières structures étant régie par un mécanisme différent. Parmi les triterpènes et stérols du genre Cirsium, certains sont retrouvés chez plusieurs espèces de Cirsium, notamment des triterpènes pentacycliques : lupéol (lupane), taraxastérol (tarastane), β-amyrine (oléanane) et des stérols (β-sitostérol et stigmastérol) (Jordon-Thaden et al., 2003) (figure 27). Ces molécules possèdent un large panel d activités biologiques. Lupéol β-sitostérol Taraxastérol tigmastérol β-amyrine Figure 27. Exemples de triterpènes retrouvés dans plusieurs espèces de Cirsium. 55

70 Enfin, on trouve aussi dans le genre Cirsium des acides phénoliques et des alcaloïdes. Il a été également rapporté la présence de polyacétylènes et d hydrocarbures dans les racines. En revanche, les lactones sesquiterpéniques qui sont en général bien distribuées chez les Asteraceae, ne sont pas très connues dans le genre Cirsium (Jordon-Thaden et al., 2003). 56

71 REULTAT 57

72 Délimitation du sujet et démarche générale. La stratégie de recherche de nouvelles substances actives au sein du règne végétal met souvent en jeu des enquêtes ethnobotaniques. Cependant, d autres modes de sélection des plantes existent : les plantes extrêmophiles, soumises à des contraintes principalement abiotiques, en sont un bon exemple. Les plantes halophytes et xérophytes connues notamment pour leur système antioxydant puissant apparaissent comme des ressources prometteuses en molécules bioactives, notamment en polyphénols. En raison de leurs activités antioxydantes, ces métabolites secondaires peuvent avoir des effets pharmacologiques chez l Homme, notamment dans la prévention des maladies liées au stress oxydant telles que les cancers. Toutefois, les potentialités thérapeutiques des plantes halophytes et xérophytes ne se limitent pas à leur pouvoir antioxydant ; ce sont également des antimicrobiens prometteurs, capables d agir sur différents agents pathogènes en santé humaine, animale et végétale. Nous avons donc exploré les potentialités biologiques de 8 plantes halophytes et xérophytes prélevées en Tunisie, On distingue 5 halophytes : ilene succulenta Forssk. (Caryophyllacées) ; Atriplex tatarica L. (Amaranthacées) ; Aeluropus littoralis (Gouan) Parl. (Poacées) ; Limonium virgatum (Willd.) Fourr. (Plumbaginacées) ; Juncus maritimus Lam. (Juncacées) ; de 3 xérophytes: Atractylis serratuloides (Cass.) DC. (Asteracées), cabiosa maritima L. (Caprifoliacées) et Cirsium scabrum (Poir.) Bonnet & Barratte (Asteracées). Un premier travail de criblage (chapitre I) porte sur les effets biologiques de ces plantes en santé humaine, en analysant les activités antiradicalaire, cytotoxique (sur une lignée cancéreuse de macrophages dérivés d un réticulosarcome de souris, J774, et sur une lignée non-cancéreuse, WI-38), antibactérienne (sur 35 souches Gram + et -, et une levure), antivirale (virus de l hépatite C), mais aussi en évaluant leurs richesse en polyphénols. Au terme de ce criblage, les plantes les plus actives ont été ciblées ; il s agit principalement d une xérophyte, Cirsium scabrum (activité cytotoxique), et de deux halophytes Limonium virgatum (activité antiradicalaire et antibactérienne) et Juncus maritimus (activité antiradicalaire, antibactérienne et antivirale). Pour ces trois plantes, un fractionnement bioguidé a été réalisé. Certains sous-extraits et certains composés responsables des activités biologiques de Limonium virgatum ont été caractérisés (chapitre I). Un fractionnement bioguidé a aussi été réalisé sur Cirsium scabrum au terme duquel, les composés responsables de son activité cytotoxique ont été déterminés (chapitre II). 58

73 Par la suite, le fractionnement de Juncus maritimus a été bioguidé à la fois par l activité antiradicalaire et par l activité antimicrobienne. Le composé responsable de son activité antiradicalaire a été mis en évidence dans le chapitre I. L analyse des activités antivirale et antibactérienne de J. maritimus est par contre développée dans le chapitre III. Les composés les plus actifs ont été identifiés ; le mécanisme d action du composé responsable de l activité antivirale a été caractérisé. Dans une dernière partie, un criblage de ces 8 plantes halophytes et xérophytes a porté sur leurs effets biologiques en santé végétale. Nous avons notamment évalué leurs effets sur l agent causal le plus fréquent de la septoriose du blé (Zymoseptoria tritici). De plus, une exploration de l effet des conditions édaphiques et physiologiques sur les propriétés antifongiques de J. maritimus a été initiée. Les résultats sont détaillés dans le chapitre IV. 59

74 I. Criblage biologique des plantes halophytes et xérophytes et initiation du fractionnement bioguidé pour les plantes les plus actives Résumé détaillé Cette étude met en avant le caractère antioxydant et antimicrobien des plantes extrêmophiles pour appuyer les approches écologiques dans le domaine de la recherche de substances biologiquement actives qui, généralement favorise les démarches ethnobotaniques. Pour ce faire, un criblage a été élaboré sur une sélection de 8 plantes extrêmophiles, dont 3 xérophytes (Atractylis serratuloides, Cirsium scabrum et cabiosa maritima) et 5 halophytes (Limonium virgatum, Juncus maritimus, ilene succulenta, Atriplex tatarica et Aeluropus littoralis), pour évaluer leur pouvoir antiradicalaire et leur richesse en polyphénols, ainsi que leurs potentielles activités antibactérienne, antivirale et cytotoxique. Les différents organes de ces plantes (sauf pour A. serratuloides, A. tatarica et A. littoralis) ont été broyés séparément. Les extraits bruts méthanoliques ont ensuite été préparés par macération. La détermination du contenu en polyphénols totaux et l évaluation de l activité antioxydante ont été effectués respectivement par des tests colorimétriques employant le réactif de Folin-Ciocalteu et le radical stable DPPH. L évaluation des activités antibactériennes de l ensemble des extraits a été réalisée sur une collection de 36 souches microbiennes (36 bactéries Gram + et - ; et 1 levure) par la méthode de diffusion en milieu solide et en utilisant un inoculateur à tête multiples. Pour l évaluation de l activité antivirale, nous nous sommes intéressés au virus de l hépatite C (VHC), responsable d une affection hépatique qui touche environ 170 millions de personnes dans le monde. L effet des extraits sur l infection virale d une lignée de cellules de foie humain immortalisées (Huh-7), a été estimé par immunofluorescence. Le test de cytotoxicité porte sur une lignée cellulaire cancéreuse (J774) en comparaison avec une lignée cellulaire saine (WI-38) ; la mesure de la prolifération cellulaire repose sur le test MTT. Ce criblage a permis de cibler en particulier trois plantes, Juncus maritimus, Limonium virgatum et Cirsium scabrum. L extrait des feuilles de C. scabrum (CL-CE) a montré l activité cytotoxique le plus marquée, avec une action antiproliférative sélective contre la lignée cellulaire J774 (CI50 = 1,53 µg/ml ; index de sélectivité = 2,6). Juncus maritimus et Limonium virgatum ont montré d autres activités intéressantes (antiradicalaire, 60

75 antibactérienne et antivirale). Ces espèces ont, par conséquent, été sélectionnées pour initier un fractionnement bioguidé permettant de mieux comprendre leurs potentialités. Pour L. virgatum, les extraits bruts méthanoliques des tiges (LV-CE) et des feuilles (LVLCE) ont montré les activités antiradicalaires les plus élevées (CI50 = 7,56 pour LV-CE et CI50 = 7,59 µg/ml pour LVL-CE) et se sont montrés comme étant les plus riches en polyphénols totaux (LV-CE = 37,0 mg eq AG/g extrait et LVL-CE = 31,6 mg eq AG/g extrait). De plus, LV-CE et LVL-CE ont montré un potentiel antibactérien, bien qu assez faible (500 µg/ml < CMI < 1000 µg/ml), à spectre d activité antibactérienne assez large (bactéries Gram- et +). Un fractionnement bioguidé a été réalisé à partir des extraits LV-CE et LVL-CE par extraction liquide-liquide permettant d obtenir quatre sous-extraits pour chacun des deux extraits : dichlorométhane (LV-MC et LVL-MC), acétate d éthyle (LV-EA et LVL-EA), butanoliques (LV-But et LVL-But) et aqueux (LV-H2O et LVL-H2O). Ces sous-extraits ont été testés pour déterminer ceux responsables des activités antiradicalaire et antibactérienne. L activité antiradicalaire la plus élevée a été enregistrée pour LVL-EA (CI50 = 6,62 µg/ml), sous-extrait le plus riche en polyphénols (32,39 mg eq AG/g d extrait). Les sous-extraits, LV-But et LVL-But, ont aussi montré des activités antiradicalaires intéressantes (CI50 = 7,01 µg/ml et 9,95 µg/ml respectivement). La teneur en tanins a été aussi analysée pour l ensemble des sous-extraits montrant que les deux sous-extraits butanoliques (LV-But et LVL-But) sont riches en tanins. Le genre Limonium se caractérise par une grande richesse et diversité en polyphénols, et particulièrement en flavonoïdes ; la présence de tanins a aussi été mis en évidence (Medini et al., 2011 ; 2014). Ces composés sont largement connus pour leurs propriétés antioxydantes suggérant que l activité antiradicalaire des extraits des feuilles et des tiges de Limonium virgatum est liée à la présence de ces molécules (LV-But = 11,37 mg eq GA/g d extrait sec et LVL-But = 10,8 mg eq GA/g extrait sec). Dans un second temps, l activité antibactérienne des sous-extraits obtenus à partir de LV et LVL a été évaluée. Des activités élevées (CMI < 100 µg/ml) ont été observées pour LV-MC et LVL-MC, avec une action sélective vis-à-vis des bactéries Gram +. L activité la plus élevée (CMI = 39 μg/ml) a été enregistrée pour LVL-MC contre des souches de streptocoques et un staphylocoque. L analyse des chromatogrammes à 320 nm de LV-MC et LVL-MC a permis de distinguer trois pics majoritaires correspondants à 3 composés (C1, C2 et C3). Ces trois molécules ont été isolées directement par chromatographie liquide haute performance (CLHP) 61

76 préparative, puis leur structure a été élucidée par spectroscopie de masse (HR-M) et par RMN. Le composé C1 a ainsi été identifié comme étant le N-trans-feruloyl tyramine (figure 28). C est un phénylpropanoïde qui possède différentes activités, notamment antimicrobiennes. Les données spectroscopiques de C2 montrent que sa structure est proche de celle de C1, mais les quantités disponibles n ont pas permis l élucidation complète de sa structure. Ces deux phénylpropanoïdes interviendraient dans le potentiel antibactérien de L. virgatum. C3 est par contre une contamination par un phtalate. Figure 28. tructure chimique du N-transferuloyl tyramine L extrait brut méthanolique des rhizomes de J. maritimus (JMR-CE), a montré une activité anti-radicalaire modérée (CI50 = 45,23 µg/ml) et une teneur en polyphénols relativement intéressante (5,63 mg eq AG/g d extrait sec). Il s est distingué par son potentiel antimicrobien ciblant un certain groupe de bactéries Gram-positif, et particulièrement treptococcus dysgalactiae T46C14 (CMI = 78 µg/ml), mais surtout par son activité antivirale puissante contre le virus de l hépatite C (plus de 85% d inhibition de l infection). A partir de cet extrait, une extraction liquide-liquide suivie de l'évaluation des activités biologiques des différents sous-extraits obtenus (sous-extrait dichlorométhane JMR-MC ; sous-extrait acétate d éthyle JMR-EA ; sous-extrait aqueux JMR-H2O) ont été effectuées. Le sous-extrait JMR-EA a montré le contenu en polyphénols et l activité antiradicalaire les plus élevés (CPT = 16,53 mg eq GA/g extrait sec; CI50 = 5,47 µg/ml), Le composé responsable de l activité antiradicalaire a été directement isolé à partir de JMR-EA par chromatographie de partage centrifuge (CPC). L analyse par RMN et par HR-M a permis d identifier ce composé comme étant la lutéoline (figure 29), une flavone largement connue pour son activité antioxydante. F Figure 29. tructure chimique de la lutéoline 62

77 Le sous-extrait JMR-MC s est montré quant à lui, plutôt responsable des activités antibactérienne (particulièrement active contre treptococcus dysgalactiae T46C14 avec une CMI à 39 µg/ml) et antivirale (plus de 98% d inhibition de l infection du virus de l hépatite C). Les activités antivirale et antibactérienne de J. maritimus, s appuyant sur un fractionnement bioguidé, seront développées dans le chapitre III. Contribution personnelle. Cette étude est le fruit d un long travail de recherche et de sélection des plantes. En effet, j ai recherché et investigué plusieurs terrains favorables au développement de plantes halophytes et xérophytes. J ai effectué l échantillonnage et la mise en herbier. J ai réalisé le travail de recherche bibliographique qui a abouti à la sélection des 8 plantes étudiées dans ce travail. J ai aussi collecté les échantillons en quantité et réalisé le travail d extraction, y compris la mise au point du protocole d extraction, la préparation des échantillons des plantes (broyage, séchage) et la préparation des extraits. Les autres contributions que j ai apportées concernent la réalisation des tests d activités biologiques, précisément les tests d activité antiradicalaire et antibactérienne, mais aussi le travail complet de fractionnement et de purification des molécules. J ai notamment effectué les extractions liquide-liquide, la recherche des gradients en CLHP analytique (pour l analyse qualitative des extraits) et préparative (pour séparer C1, C2 et C3 en une seule étape). J ai également déterminé le système de solvants adéquat pour la purification de la lutéoline en une seule étape par CPC. 63

78 An ecological approach to discover new bioactive extracts and products: The case of extremophile plants Ramla ahlia,b, Céline Rivièrea*, Christel Neutc, Joanne Berod, Marie-Emmanuelle ahuce, maoui Abderrazakb, Claire Beaufayd, Vincent Roumya, Thierry Hennebellea, Yves Rouillée, Joelle Quetin-Leclercqd, Karin érone, Riadh Ksourib, evser ahpaza a Univ. Lille, INRA, IA, Univ. Artois, Univ. Littoral Côte d Opale, EA 7394 ICV, Institut Charles Viollette, F Lille, France, bthe Laboratory of Aromatic and Medicinal Plants, Biotechnology Centre of Borj-Cédria (CBBC), Hammam-lif, Tunisia, cudl, INERM U995, UFR Pharmacie, F Lille, France, dpharmacognosy Research Group, Louvain Drug Research Institute, Université Catholique de Louvain, Avenue E. Mounier, 72, B-1200 Brussels, Belgium, and euniv. Lille, CNR, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, U UMR 8204 CIIL, Centre d'infection et d'immunité de Lille, F Lille, France Correspondence: Céline Rivière, EA ICV, Institut Charles Viollette, Laboratory of pharmacognosy, Faculty of pharmacy University of Lille 2 3 rue du Pr. Laguesse, B.P. 83, Lille Cedex, France celine.riviere-3@univ-lille2.fr 64

79 Abstract Objectives Eight extremophile plants from Tunisia were screened in order to find natural products with benefits in human health. Methods These plants were collected in different areas in Tunisia. Their methanolic extracts were evaluated for their total phenolic content, and for their antiradical (DPPH), antimicrobial (on 35 bacteria and 1 yeast), antiviral (hepatitis C virus, HCV), and cytotoxic activities (against WI38 and J774 cell lines). The most active species were subjected to a bioguided fractionation. Key findings The screening revealed promising activities for four plants, but two species have both antiradical and antimicrobial activities: Juncus maritimus and Limonium virgatum. The rhizomes extract of J. maritimus showed the highest activity against HCV, a selective antibacterial activity against treptococcus dysgalactiae, and a moderate antiradical activity which is due to luteolin isolated in one step by centrifugal partition chromatography. The stems and leaves extracts of L. virgatum were rich in polyphenols responsible for the antiradical activity. Also, Limonium extracts showed an antibacterial activity with a broad spectrum. Conclusions Extremophile plants have proven to be a promising source for bioactive metabolites. They have a powerful antioxidant system highly influenced by biotic and abiotic factors and the ability to produce secondary metabolites with antimicrobial activities. Keywords: extremophile plants; antiradical activity; antibacterial activity; antiviral activity; cytotoxic activity. 65

80 Introduction Natural products from plant species maintain a strong position in the drug discovery. Even if natural products are not always used directly as medicines, they often remain a source of inspiration for medicinal chemistry (natural products with semisynthetic modifications, pharmacophore with natural origin). [1] Plant species are selected by random screening programs or by more focused selection programs, such as chemotaxonomy or ethnopharmacology. According to an ethnopharmacology approach, medicinal plants constitute a source of bioactive products because their use is validated by therapeutic experiences, passed down from generation to generation, leading to a drug discovery process much easier and safe. [2,3] But, drug discoveries were not systematically based on traditional plant uses. In fact, many plants, not recognized for a medicinal use, may also be a rich source of medicines, referred to as an ecological approach in this case, because they produce many bioactive molecules implicated in chemical defences of the plant against biotic and abiotic constraints. Extremophile plants are a good example of this kind of plants. Unlike other vascular plants, they are able to grow under some severe environmental constraints capable of triggering an oxidative stress. tress conditions increase production and accumulation of reactive oxygen species (RO) in plants, leading to cellular damage, metabolic disorders, and senescence processes. [4] Extremophile plants are known for their ability to withstand and quench these toxic RO, since they are equipped with a powerful antioxidant system. [5,6] Interestingly, many of these natural antioxidants have proved to be very useful in human health field. [7] The oxidative damage created by free radical generation is a critical aetiological factor implicated in several chronic human diseases such as cancer and infectious diseases. [8] everal extremophile plants were reported to contain some key-compounds in prevention of these diseases. [7] Furthermore, these plants constitute a well-known source of natural antimicrobial agents. Indeed, their capacities to produce phytoalexins and to resist to 66

81 infections are often the consequences of their biosynthetic machinery. [7] Thus, extremophile plants can be a source of new bioactive compounds to fight the resistant pathogenic bacteria to a range of formerly efficient antibiotics and to combat the current emergence of new infectious diseases. Extremophile plants, especially halophytes and xerophytes, constitute a major part of the country flora in Tunisia. In fact, arid (average annual temperature above 30 C and average annual rainfall under 100 mm) and semi-arid (moderate winters and average annual rainfall rarely above 300 mm) regions cover about two-third of the total area of the country. Also, 1.5 million ha (10% of the whole territory) are affected by salt. [7] In this context, our study was undertaken to screen Tunisian extremophile plants for their antiradical, antibacterial, antiviral and cytotoxic activities. Eight plants were selected for this work, including 3 xerophytes: Atractylis serratuloides (Cass.) DC. (Asteraceae), Cirsium scabrum (Poir.) Bonnet & Barratte (Asteraceae), cabiosa maritima L. (Caprifoliaceae); and 5 halophytes: Limonium virgatum (Willd.) Fourr. (Plumbaginaceae), Juncus maritimus Lam. (Juncaceae), ilene succulenta Forssk. (Caryophyllaceae), Atriplex tatarica L. (Amaranthaceae), Aeluropus littoralis (Gouan) Parl. (Poaceae). To our knowledge, no reports on the chemical composition and on the biological activities of these species have been provided in the literature so far. The few studies available are focused on other aspects. [9-11] Materials & Methods Plant materials All plants were identified by Dr Abderrazak (Biotechnology Centre of Borj-Cédria). Voucher numbers are indicated in brackets: Atractylis serratuloides (167), Cirsium scabrum (181), 67

82 cabiosa maritima (182), ilene succulenta (183), Juncus maritimus (184), Limonium virgatum (185), Atriplex tatarica (186) and Aeluropus littoralis (187). Plant n 1 was collected in February 2013 in the outh of Tunisia, whereas plants n 2 and n 3 were collected in August 2013 in the North of Tunisia (Goubella). These plants are xerophytes, while all other plants (4-8) are halophytes and were collected in October 2013 in the North-East of Tunisia (oliman). Preparation of the plant extracts Collected plant materials were dried at 25 C for a week. Different parts of these plants were powderized separately (Table 1) and extracted by maceration at room temperature (methanol; 15 ml/g; 3 x 48 h). Extracts were dried in vacuum at 35 C, then suspended in water and lyophilized. Percentage yields are listed in Table 1. Determination of total polyphenol content (TPC) TPC was measured by the Folin-Ciocalteu method described by Lixiang et al. [12] Briefly, an aliquot of 0.25 ml of an appropriate diluted extract (5% acetone in water) was mixed with 1.25 ml of Folin-Ciocalteu reagent (1/10th). After 2 min, 1 ml of a Na2CO3 solution (145 g/l) was added and the mixture was left at 50 C for 5 min. The absorbance was measured at 760 nm against a blank. A calibration curve of gallic acid (0 to 100 µg/ml) was prepared. Total polyphenol content was expressed as mg gallic acid equivalent per gram of sample on a dry weight basis (mg eq GA/g extract DW). Green tea leaves methanolic extract was employed as positive control. 68

83 Determination of tannin content (TC) TC determination was achieved according to the hide powder method. [13,14] The extracts (10 mg/ml) were mixed with 8 mg of hide powder. The suspensions were stirred for 40 min and were filtered. The remaining phenolic sample (TPwT) solution was analysed by the FolinCiocalteau method. TC is calculated as a difference of absorbance at 760 nm between TPC and TPwT. Juncus maritimus and Limonium virgatum extracts analysis General NMR spectra were recorded on a Bruker DPX-500 spectrometer (1H and 13 C NMR at 500 MHz) in methanol-d4 and chloroform-d6. HRM analyses were carried out in positive and negative modes with a range of m/z , using a Thermo Fisher cientific Exactive Orbitrap mass spectrometer equipped with an electrospray ion source. The vaporizer temperature of the source was set at 100 C, the nitrogen sheath gas at 10-20, and the auxiliary gas at 2-6 (arbitrary units). Analytical HPLC was carried out using a himadzu binary LC-10A pump, a CL-10A UV-visible detector and a Vision HT Basic C18 (5 µm, 250 x 4 mm) column (Grace, Epernon, France). Preparative HPLC was performed using himadzu HPLC system equipped with a LC-20AP binary high-pressure pump, a PD-M20A photodiode array detector and a VisionHT Basic C18 (5 µm, mm) column. For HPLC analyses, the mobile phase was composed of 0.01% formic acid in water (solvent A) and acetonitrile (ACN) (solvent B). Centrifugal partition chromatography (CPC) was performed using a 250 ml rotor (CPC-250-L) provided by Armen instrument (aint-avé, France). The solvents were pumped by a himadzu Prominence LC-20AP binary pump. 69

84 Liquid-liquid extraction Rhizomes crude extract of Juncus maritimus (100 g) was suspended in water (60 ml) and partitioned with methylene chloride (10 60 ml) and then with ethyl acetate (10 60 ml). The combined partitions were concentrated at 35 C under reduced pressure to give a methylene chloride partition (JMR-MC = 7%) and an ethyl acetate partition (JMR-EA = 23.3%). The remaining aqueous partition was freeze-dried and lyophilized (JMR-H2O = 11%). tems and leaves crude extracts of Limonium virgatum (100 g) were also suspended in water (60 ml) and extracted sequentially ten times with increasing polarity solvents (60 ml) giving methylene chloride (LV-MC = 6.2%; LVL-MC = 8%), ethyl acetate (LV-EA = 10.6%; LVL-EA = 12,3%) and n-butanol (LV-But = 22.1%; LVL-But = 23.8%) partitions after removal solvents. The remaining aqueous partition was lyophilized (LV-H2O = 18.8%; LVL-H2O = 20.8%). HPLC-UV analysis 20 µl of samples (10 mg/ml, MeOH) were injected through the HPLC system (1 ml/min) using two gradient elution programs: gradient 1 (L. virgatum): % B (0-44 min), % B (44-45 min), % B (45-60 min); gradient 2 (J. maritimus): 10-38% B (0-30 min), 38% B (30-40 min), 38-45% B (40-45 min), 45-51% B (45-47 min), 51-95% B (47-48 min), % B (48-62 min), % B (62-63 min). Preparative HPLC experiment Preparative HPLC was performed on the methylene chloride partition of L. virgatum (LVMC) obtained after liquid/liquid extraction (LLE). 200 mg of LV-MC solubilized in MeOH were injected (14 ml/min) using the following gradient elution program: 16% B (0-26 min), 28% B (26-32 min), % B (32-42 min), % B (42-60 min). CPC experiment 70

85 CPC was performed for the purification of luteolin from the ethyl acetate partition of J. maritimus (JMR-EA) obtained after LLE. Ten quaternary biphasic solvent system Arizona were tested in order to choose the optimal system. [15] Arizona K (n-hept/etoac/meoh/h2o; 1:2:1:2; v/v/v/v) was used on JMR-EA (180 mg) in ascending mode (50 min). Fractions of 8 ml were collected every min. 12 sub-fractions were then pooled according to TLC. Evaluation of antiradical activity The antiradical activity was determined according to Aquino et al. [16] using the stable 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH, igma, France). 50 µl of extract (40 µg/ml) were added to 2.5 ml of freshly prepared DPPH solution (25 µg/ml). MeOH (50 µl) was added to the same DPPH solution and was used as control (DPPH 0). After 20 min, absorbances were measured at 515 nm against a blank on a Biowave II WPA spectrophotomer (erlabo Technologies). A calibration curve was obtained after linear regression of DPPH (1 to 50 µg/ml). The percentage of remaining DPPH was calculated as follows: % DPPH REM = [DPPH 20min]/[DPPH 0] x 100 IC50 was determined for the most active plants and for rutin (positive control), by testing several concentrations (10 to 100 µg/ml for extracts; 1.25 to 40 µg/ml for partitions and rutin). Antimicrobial activity The antimicrobial activity was evaluated against 36 pathogenic microorganisms according to Mahamodo et al. [17]. The 36 microorganisms were grown overnight at 37 C on sloping Mueller-Hinton (MH) agar medium. The bacteria were diluted with Ringer's Cysteine (RC) solution to obtain 106 bacteria/ml. In Petri dishes, 19 ml MH II agar was supplemented with 1 ml of stock solution of extracts (12.5 mg/ml to 0.39 mg/ml) or antibiotics (gentamicin, vancomycin, amoxicillin) and amphotericin B (28 mg/ml to mg/ml), giving final 71

86 concentrations from 625 to 19.5 µg/ml for the extracts and 64 to 0.03 µg/ml for controls. Inocula of 104 colony forming units (CFU) were spotted ultimately with a multipoint inoculator (teers Replicator). Antimicrobial activity was tested on the following reference strains from the collection of the laboratory of bacteriology (INERM U995), obtained recently by clinical isolation and that reflect the pathologies encountered today in hospitals: Gram bacteria: Citrobacter freundii 11041, C. freundii 11042, Escherichia coli 8138, E. coli 8157, E. coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes 9004, Enterobacter cloacae 11050, E. cloacae 11051, E. cloacae 11053, Klebsiella pneumoniae 11016, K. pneumoniae 11017, erratia marcescens 11056,. marcescens 11057, P. mirabilis 11060, Providencia stuartii 11038, almonella sp , Acinetobacter baumanii 9010, A. baumanii 9011, Pseudomonas aeruginosa 8131, P. aeruginosa ATCC 27583, tenotrophomonas maltophilia, Yersinia pseudotuberculosis 2777; Gram + bacteria: Enterococcus faecalis C159-6, Enterococcus sp 8153, taphylococcus epidermidis 10282, taphylococcus epidermidis 5001, taphylococcus aureus 8146, taphylococcus aureus 8147, taphylococcus lugdunensis T26A3, taphylococcus warneri T12A12, Corynebacterium T25-17, Mycobacterium smegmatis 5003, treptococcus agalactiae T 25-7, treptococcus dysgalactiae T46C14, treptococcus agalactiae T 53C2; Yeast: Candida albicans Antiviral activity against hepatitis C virus (HCV) Plant extracts were assessed against HCV infection according to Galani et al. modified JFH1 (Japanese Fulminant Hepatitis-1) virus. [19,20] [18] using a The viral stock (5.10 focus forming unit/ml) was produced in Huh-7 hepatoma cells. [21] The day before infection, Huh-7 cells were plated in 96-well plates at 6000 cells/well. Plant extracts were added at 25 μg/ml (DMO) during both the 2 h inoculation step and the 28 h post-inoculation step. DMO 72

87 (0.01%) was employed as control. Infected cells were fixed and submitted to immunofluorescence labeling with an anti-e1 envelope glycoprotein antibody with Cy3conjugated goat anti-mouse IgG [22]. The total number of cells at the end of the experiment was determined by staining of nuclei with 1 µg/ml DAPI. Cytotoxicity assays The cytotoxicity was evaluated on WI38 (normal human fibroblast) and on J774 (macrophage-like cells derived from BALB/c murine reticulum cell sarcoma) cell lines as described by Bero et al. [23], using the tetrazolium salt MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5 diphenyltetrazolium bromide (igma)) colorimetric method. Briefly, WI-38 or J774 were seeded in 96-well plates (5000 cells/well) containing 100 µl of medium (DMEM containing 4mM L-glutamine and 1mM sodium pyruvate (Gibco) or RPMI 1640 containing 2mM Lglutamine (igma)) supplemented with 10% heat-inactivated foetal bovine serum (Gibco) and penicillin-streptomycin (100 UI/ml). After 24 h, the medium was removed and cells were treated with 200 µl of plant extracts solutions at a fixed concentration of 50 µg/ml to calculate cell viability percentage. Cell viability % = [AT/ANT] x 100, with A: absorbance, NT: control cells, T: treated cells. When this percentage is inferior to 50%, an IC50 is calculated with a concentration range of µg/ml obtained from a 20 mg/ml DMO stock solution diluted in fresh medium. The medium was replaced after 72 h of incubation by 100 µl of 10% MTT solution (3 mg/ml in PB) in medium. After 45 min, the medium was removed again and 100 µl of DMO were added to solubilize formed formazan crystals. Absorbance was recorded at 570 nm and 620 nm. Camptothecin (igma) was used as positive control (concentration range: µg/ml). Each sample was tested in eight serials three fold dilutions in 96-well microtiter plates, with three wells per concentration. All experiments were made at least in duplicate. 73

88 The highest concentration of solvent to which the cells were exposed was 0.25%, which was shown to be non-toxic. tatistical analysis tatistical calculations were carried out with Prism statistical software (Graph Pad Inc.). Results are expressed as the mean ± EM (tandard Error of the Mean) (antiviral and cytotoxicity assays) or as the mean ± D (tandard Deviation) (total polyphenol content and antiradical activity) of at least three independent experiments with individual values. Nonparametric Kruskal-Wallis test was used for statistical comparison of groups of data. Then, individual differences between treatments were identified using Dunn s test as a post hoc test.; P values < 0.05 were considered as significantly different from the control. Results creening results Eight extremophile plants were collected in different areas in Tunisia, including 3 xerophytic plants and 5 halophytic plants. 16 crude methanolic extracts were prepared from different parts of these plants. These extracts were evaluated for their antiradical, antimicrobial (on 35 bacteria and 1 yeast), antiviral (hepatitis C virus, HCV), and cytotoxic activities (against WI38 and J774 cell lines). Total polyphenol content and antiradical activity of plant extracts 16 crude methanolic extracts were evaluated for their total polyphenol content and for their antiradical activity. Results are summarized in Figures 1 and 2. Among the 16 crude methanolic extracts, only Limonium virgatum (stems and leaves) and Juncus maritimus 74

89 (rhizomes) extracts have an antiradical activity. All other samples did not significantly reduce the free radical DPPH. tems and leaves methanolic extracts of L. virgatum (LV-CE and LVL-CE) showed the highest DPPH free radical scavenging activities with IC 50 values of 7.56 and 7.59 µg/ml, respectively. The similar antiradical activity of these two extracts is correlated with their similar total polyphenol content (TPC: LV-CE = 37.0 mg eq GA/g extract DW and LVL-CE = 31.6 mg eq GA/g extract DW). The methanolic extract of J. maritimus rhizomes (JMR-CE) showed a moderate antiradical activity (IC50 = µg/ml). This extract had also a moderate TPC (5.63 mg EAG/g extract DW). Antimicrobial activity of plant extracts The antimicrobial activity of all crude methanolic extracts was evaluated against a panel of 36 pathogenic microorganisms (22 Gram-positive bacteria, 13 Gram-negative bacteria and 1 yeast) by means of a multiple inoculator. The data in Table 2 give Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) values of only active crude extracts (MIC < 1000 µg/ml). Limonium and Juncus extracts showed the highest activities. LV-CE and LVL-CE showed a low antimicrobial activity (500 µg/ml < MIC < 1000 µg/ml), but a broad spectrum activity (MIC = 625 µg/ml against several strains of Gram + and Gram - bacteria). The most interesting antibacterial activities of these extracts were against a multi-resistant strain of Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ATCC 27583: MIC = 625 µg/ml) and against a strain of Escherichia coli (E. coli 8157: MIC = 312 µg/ml). JMR-CE showed a selective action against Gram-positive bacteria, in particular against the three multi-resistant strains of treptococcus and one strain of taphylococcus 75

90 (taphylococcus lugdunensis T26A3). Most interestingly, this crude extract showed a high activity against treptococcus dysgalactiae T46C14 (MIC = 78 µg/ml). Antiviral activity of plant extracts The HCVcc inhibition assay enabled us to analyse the antiviral effect of the extracts during a complete viral life cycle. The results are presented in Figure 3. By comparison with the control, only few plant extracts showed a slight toxicity against Huh-7 hepatoma cells at 25 µg/ml, in particular ilene succulenta extracts (-CE and L-CE). However, these ilene extracts showed a significant decrease in the number of HCVcc infected cells. Most interestingly, JMR-CE showed the highest effect, with more than 85% of inhibition in HCV infection, demonstrating a strong anti-hcv activity without toxicity. All other plant extracts displayed infection rates higher than 50%, indicating an absence of inhibition of HCV infection. Cytotoxic activity of plant extracts Plant extracts were analysed for their antiproliferative activity using the MTT assay on a cancerous cell line J774 compared to the one on a non-cancerous cell line WI38. Results were summarized in Figure 4. Three plant extracts showed cytotoxicity on the J774 cancerous cell line at lower concentrations than 50 µg/ml: ilene extracts (-CE and L-CE) as well as leaves extract of Cirsium scabrum (CL-CE) with respectively IC50 values of 47.59, 23.11, and µg/ml. The cytotoxic activity of CL-CE is particularly interesting because this extract showed the highest activity on J774 cell line that is also selective (IC 50 = µg/ml on WI38, selectivity index = 2.6), unlike for ilene extracts. 76

91 Bioassay-guided fractionation Four plant species showed the most interesting activities at the end of the screening process. The crude extract of Cirsium scabrum leaves (CL-CE) showed a selective cytotoxic activity on J774 cell line, whereas ilene succulenta crude extracts (-CE and L-CE) showed a moderate and non-selective cytotoxicity on J774 cell line, as well as a moderate anti-hcv activity. Juncus maritimus and Limonium virgatum stood out for their high antimicrobial and antiradical activities. The crude extract of J. maritimus rhizomes (JMR-CE) had the highest activity against HCV and showed a selective antibacterial activity against treptococcus dysgalactiae T46C14. It also had a moderate antiradical activity. Crude extracts of L. virgatum stems and leaves (LV-CE and LVL-CE) showed the highest antiradical activities and a broad antibacterial spectrum against several strains of Gram + and Gram - bacteria. Bioguided fractionation was then initiated on JMR-CE, LV-CE and LVL-CE to deepen the understanding of their bioactivities. Juncus maritimus JMR-CE showed a moderate antiradical activity, a selective antibacterial activity against treptococcus dysgalactiae T46C14 and the highest activity against HCV. Bioguided fractionation was performed using a liquid-liquid fractionation. Three partitions were obtained: methylene chloride partition (JMR-MC), ethyl acetate partition (JMR-EA) and aqueous partition (JMR-H2O). These three extracts were evaluated using the same antiradical, antibacterial and anti-hcv assays as for the screening process. With respect to antiradical assays (Table 3), results showed that the ethyl acetate partition (JMR-EA) exhibited the highest antiradical activity with an IC50 value equal to 5.47 µg/ml. The major compound of this partition was isolated in one step by CPC using the Arizona 77

92 system K (Figures 6 and 7). HR-M and NMR data analysis allowed its identification as luteolin. A high antiradical activity was then obtained for this compound (IC50 = 4.82 µg/ml). Regarding antibacterial assays (Table 4), results showed that the activity of the JMR-CE against the Gram-positive bacteria (taphylococcus aureus 8147, treptococcus agalactiae T 25-7 and T 53C2) was due to the methylene chloride partition (JMR-MC). This partition was also active against other strains (taphylococcus aureus 8146 and Corynebacterium T25-17) and is particularly active against treptococcus dysgalactiae T46C14 with a MIC equal to 39 µg/ml. Bioautography performed on JMR-MC against. dysgalactiae showed that the partition contains a large panel of compounds that seems to be active against the bacteria strain (data not shown). Finally, the same partition (JMR-MC) was most likely responsible for the antiviral activity against hepatitis C virus with more than 98% of inhibition in HCV infection (Figure 8). Limonium virgatum Crude extracts of L. virgatum stems and leaves (LV-CE and LVL-CE) showed the highest antiradical activities, correlated with their high total polyphenol content (TPC), exceeding those of the methanolic extract of green tea. They were also active against several Gramnegative and Gram-positive bacteria. Liquid-liquid partitioning yielded four partitions for both LV-CE and LVL-CE: methylene chloride partitions (LV-MC and LVL-MC), ethyl acetate partitions (LV-EA and LVL-EA), butanol partitions (LV-But and LVL-But), and aqueous partitions (LV-H2O and LVL-H2O). Results of antiradical assays (Table 5) showed that the butanol and ethyl acetate partitions of stems (LV-But and LV-EA) and leaves (LVL-But and LVL-EA) of this species had the highest antiradical activities. The best IC50 values were recorded for LV-But and LVL-EA (7.01 µg/ml and 6.62 µg/ml respectively). These two partitions also showed the highest TPC 78

93 (30.87 mg eq GA/g extract DW and mg eq GA/g extract DW respectively). By contrast, aqueous and methylene chloride partitions of the two organs had relative lower antiradical activities and lower total polyphenol content (Figures 9 and 10). The quantitative determination of total tannins showed that the butanol partitions of both L. virgatum organs were very rich in tannins (LV-But = mg eq GA/g extract DW and LVL-Bt = 10.8 mg eq GA/g extract DW), while the methylene chloride and ethyl acetate partitions had the lowest tannin contents (Figure 10). Results of the antibacterial assays highlighted that LV-EA and LVL-EA have a broad spectrum of action similar to those of the crude extract, but a low to moderate antibacterial activity (Table 6). By contrast, the methylene chloride partitions of the stems and of the leaves showed a high antibacterial activity, with a selective action against Gram-positive bacteria. LV-MC was active against taphylococcus epidermidis 5001 and treptococcus agalactiae T25-7 (MIC = 78 µg/ml), whereas LVL-MC showed an antibacterial activity against a strain of Corynebacterium (MIC = 78 µg/ml) and against four other Gram-positive bacteria with a MIC value equal to 39 µg/ml: taphylococcus lugdunensis T26A3, treptococcus dysgalactiae T46C14, treptococcus agalactiae T25-7 and treptococcus agalactiae T53C2. The comparison of the chromatograms at 320 nm of LV-EA and LV-MC allowed the detection of three major compounds: C1, C2 and C3 (Figure 11). These compounds were also detected in LVL-MC, but are identified in traces in LVL-EA. These compounds might be responsible for the antibacterial activity of LV-MC and of LVL-MC. Thus, they were isolated by preparative HPLC. The compound C2 was isolated in sufficient quantity to determine its structure on the basis of HR-M and NMR data. The HR-M spectrum of C2 contained a monocharged ion peak [M+H]- at m/z corresponding to the molecular formula C18H19O4N ( = ppm). The comparison of the 1D- and 2D-NMR data of C2 with those reported in literature allowed to identify this compound as N-trans-feruloyl 79

94 tyramine. [24] This phenolic amide was previously isolated from the roots of another Limonium species, L. sinense. [25] The 1H spectrum of C1 was close to those of C2. This compound could also be a phenolic amide. The HR-M spectrum gave a monocharged ion peak [M+H]- at m/z , but the low quantity obtained for this product did not allow us to determine totally its structure. The HR-M spectrum of C3 gave a monocharged ion peak [M+H]+ at m/z corresponding to the molecular formula C28H46O4 ( = ppm). According to the NMR data, the compound C3 is of chemical nature completely different from C1 and C2, but it could be a contamination by the diisodecyl phthalate. Discussion Our study showed the great potential of extremophile plants to find bioactive extracts, in particular with antiradical and antimicrobial activities. It had been reported that extremophile plants are equipped with a powerful antioxidant system, including polyphenols to overcome severe environmental conditions. [5] Limonium virgatum is a good example of extremophile plants with a high DPPHº free radical scavenging activity, correlated with a high total polyphenol content. This halophyte plant from the Plumbaginaceae family is not very encountered in Tunisia. To our knowledge, no reports on its chemical composition and on its biological activities have been provided in the literature so far. In our study, we showed that the antiradical activity of the stems and leaves extracts of L. virgatum is due to their high phenolic content (ethyl acetate and butanol partitions), but also to the rich content of tannins (mainly butanol partitions). Our findings are in agreement with the literature. In fact, several Limonium species are known to be rich in tannins iddhuraju et al. [29] [26-28] reported that a high concentration of tannins increased the free-radical DPPH scavenging capacity. In addition, Plumbaginaceae family is chemically characterized 80

95 by the capacity to produce polyphenols, widely known for their antiradical potential. [30-32] Among the other extremophile plants tested, only Juncus maritimus showed a moderate antiradical activity. J. maritimus, a halophyte from the Juncaceae family, is well distributed in the coastal regions of Tunisia. To our knowledge, the majority of studies relating to J. maritimus do not deal with pharmacological and chemical aspects. In our work, we showed that the flowers and stems of this species had no activity while the rhizomes exhibited several antiradical and antimicrobial activities. From the most antiradical partition (ethyl acetate), we isolated luteolin in one step by CPC and we showed that this compound was mostly responsible for the antiradical activity of the rhizomes. Our results are in agreement with the literature. In fact, luteolin is a very common flavone, previously identified in other Juncus species, [33] known to have multiple biological effects including antioxidant activity. [34,35] The antiradical activities of the other extremophile plants are not described in the literature, except for Atractylis serratuloides. Our results are not in concordance with the literature for this plant. Bouaziz et al. [36] reported that a methanolic extract of A. serratuloides had a very high antiradical potential (IC50 = 4.11 mg/ml), while our sample did not show an antiradical activity (% remaining DPPHº = 86.7% at 40 µg/ml). Both samples were collected in outh of Tunisia but at a different vegetative stage. This difference of conditions of collect could explain this difference of activity. In fact, the succession of seasons is coupled to an adjustment of the production of phenolic compounds to cover plant needs to each season. The antiradical activity is by consequence affected. [37] Moreover, the antioxidant system of extremophile plants is highly modulated by biotic and abiotic factors. [5] J. maritimus and L. virgatum also showed an antimicrobial activity. First, J. maritimus rhizomes extract was found to have a selective activity against treptococcus dysgalactiae, as well as an antiviral activity against HCV. treptococcus dysgalactiae used in our study is a strain isolated from an osteomyelitis located in a diabetic foot. This Gram-positive bacterium 81

96 is a member of group C streptococci (GC) that causes mastitis and polyarthritis in animals, and in rare cases, meningitis in humans. The clinical spectrum of diseases caused by this species is similar to that caused by treptococcus pyogenes. [38] We also tested our plants against HCV because this virus is a major cause of chronic liver diseases. A new generation of effective anti-hcv drugs (viral protein inhibitors) is currently available, but they are very expensive and not accessible in developing countries. Also, the emergence of resistant HCV variants continues to be a public health issue. [39] In our study, we showed that the antimicrobial activity of J. maritimus was related to some compounds present in the methylene chloride partition. To our knowledge, no reports on antimicrobial activities of this species and on its chemical composition have been produced in the literature so far. However, some studies showed that a dihydrophenanthrene isolated from J. roemerianus had an antimicrobial activity, but not directed specifically against. dysgalactiae. [40] From a chemotaxonomic point of view, Juncus species biosynthesise phenanthrenes and dihydrophenanthrenes. [41] ome studies demonstrated that several phenanthrenes were phytoalexins, accumulated in plants as a response to infection caused by pathogenic fungi [42]. The same studies also showed that these phenanthrenes possess an antimicrobial potential. Another study reported that dihydrophenanthrenes isolated from the ethyl acetate partition of J. effusus had an antiviral activity [43]. Taken together, these findings suggest that the methylene chloride partition of J. maritimus rhizomes is probably rich in phenanthrene derivatives with an antibacterial and antiviral potential. The methylene partition of L. virgatum stems and leaves also showed a high antibacterial activity, with a selective action against some Gram-positive bacteria, in particular against some taphylococcus and treptococcus strains. This activity could be due to the presence of phenolic amides. These compounds could also explain the moderate antiradical activity of LV-MC and LVL-MC. [24] 82

97 Aside from J. maritimus and L. virgatum, the screening process revealed a cytotoxic activity against a murine macrophage-like tumor cell line (J774) for two plants. These species were a xerophyte belonging to Asteraceae family, Cirsium scabrum, and a halophyte belonging to Caryophyllaceae family, ilene succulenta. This latter species also showed a toxicity against a human lung fibroblast cell line (WI38). More than 400 compounds, including phytoecdysteroids, sterols and saponins, have been isolated from ilene succulenta and other ilene species. [44-46] Biological investigations on phytoecdysteroids indicated their multiple activities, including antitumor potential. [44] Moreover, several saponins are well known for their toxicity, because they are powerful haemolytics in vitro. [47] The quantitative analysis of the saponins in our plant sample should deepen the understanding of its toxicity. Unlike. succulenta, C. scabrum showed a selective cytotoxicity against J774 compared to WI38. To our knowledge, no reports on chemical composition and on biological activities of C. scabrum have been provided in the literature so far. But, some studies showed that several compounds isolated from other hydroperoxycycloart-25-by-313-ol) tocopheroide, α-tocospiro C) [50] [48] Cirsium species, including, C. japonicum (flavones) [49] C. setidens (24- and C. setosum (α-, had cytotoxic activities against several cancer cell lines. Bioassay-guided fractionation is required to determine the compounds responsible for the cytotoxic activity of the crude methanolic extract of C. scabrum. Conclusion Eight extremophile plants from Tunisia were screened for their phenolic content and for some biological activities. This is the first report of the antiradical, antimicrobial, antiviral and cytotoxic activities of these eight species. We found that Cirsium scabrum and ilene succulenta had high cytotoxic activities. Most interestingly, Juncus maritimus and Limonium 83

98 virgatum showed multiple biological activities. J. maritimus rhizomes extract showed a moderate antiradical activity, a selective antibacterial activity against treptococcus dysgalactiae and the highest activity against hepatitis C virus. We showed that luteolin was mostly responsible for the antiradical activity, while the presence of phenanthrene derivatives could explain the antimicrobial activities. The extracts of L. virgatum stems and leaves showed the highest DPPH radical scavenging activity related to the high content in polyphenols and tannins. Their methylene chloride partitions showed an antibacterial activity probably due to the presence of phenolic amides. Acknowledgements The authors are grateful to Jennifer amaillie (Institut Charles Viollette), everine Mahieux (INERM U995), Maude Bourlet (Pharmacognosy Research Group, UCL) and Mike Howsam (CUMA) for their skillfull technical assistance. The authors wish to thank platforms of CUMA (University of Lille 2, Pr. J.F. Goossens) and LARMN (University of Lille 2, Pr. N. Azaroual) for access to equipment. 84

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103 Tables Table 1. Percentage yield (PY) on a dry weight basis (% w/w) of each crude methanolic extract Xerophytic plants Plant species Organs Atractylis serratuloides whole plant (A) 7.6% Cirsium scabrum stems (C) 9.3% flowers (CF) 6.1% leaves (CL) 12.1% leaves (ML) 7.6% flowers (MF) 3.3% stems (M) 2.3% stems () 10.8% leaves (L) 23.7% flowers (JMF) 7.3% rhizomes (JMR) 12.5% stems (JM) 13.1% stems (LV) 17.9% leaves (LVL) 19.4% cabiosa maritima Halophytic plants ilene succulenta Juncus maritimus Limonium virgatum PY (% w/w) Atriplex tatarica whole plant (AT) 14.2% Aeluropus littoralis whole plant (AL) 9.3% Table 2. Antimicrobial activities of active crude methanolic extracts (MIC in µg/ml) L. virgatum J. maritimus Rhizomes Gent Vanc Amox tems Leaves Escherichia coli R R Klebsiella pneumoniae R R Providencia stuartii R Acinetobacter baumanii R R Pseudomonas aeruginosa ATCC R R R tenotrophomonas maltophilia R R taphylococcus aureus taphylococcus lugdunensis T26A taphylococcus warneri T12A R Mycobacterium smegmatis treptococcus agalactiae T treptococcus dysgalactiae T46C14 78 treptococcus agalactiae T53C2 625 Gram - bacteria Gram + bacteria MIC (µg/ml) of positive controls: Gent (gentamicin), : 4, R: > 8; Vanc (vancomycin), : 4, R: > 16; Amox (amoxicillin), : 4, R: > 16; : sensitive, I: intermediate, R: resistant.. MIC (µg/ml) of crude methanolic extracts: MIC < 100 µg/ml: high activity; 100 µg/ml < MIC < 500 µg/ml: moderate activity; 500 µg/ml < MIC <

104 µg/ml: low activity; MIC > 1000 µg/ml: no activity. : inactive (MIC > 1000 µg/ml) on Gram bacteria: Citrobacter freundii 11041, C. freundii 11042, Escherichia coli 8138, E. coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes 9004, Enterobacter cloacae 11050, E. cloacae 11051, E. cloacae 11053, Klebsiella pneumoniae 11016, erratia marcescens 11056,. marcescens 11057, P. mirabilis 11060, almonella sp , Acinetobacter baumanii 9011, Pseudomonas aeruginosa 8131, Yersinia pseudotuberculosis 2777; Gram + bacteria: Enterococcus faecalis C159-6, Enterococcus sp. 8153, taphylococcus epidermidis 10282, taphylococcus epidermidis 5001, taphylococcus aureus 8146, Corynebacterium T25-17; Yeast: Candida albicans Table 3. Antiradical activities (IC50 in µg/ml) of Juncus maritimus rhizomes partitions Extract, partitions, compounds JMR-CE JMR-MC JMR-H20 JMR-Luteolin IC50 (µg/ml) 45.23± ± ± ±0.31 Each value represents the mean ± D of 3 determinations. JMR, Juncus maritimus rhizomes; JMR-Luteolin, luteolin isolated from J. maritimus (positive control); JMR-CE, methanolic crude extract; JMR-MC, methylene chloride partition; JMR-EA, ethyl acetate partition; JMRH2O not represented: IC50 = ± µg/ml. Table 4. Antimicrobial activities of rhizomes partitions of Juncus maritimus (MIC in µg/ml) J. maritimus Rhizomes JMR-MC JMR-EA JMR-H20 Gent Vanc Amox Gram + bacteria taphylococcus aureus taphylococcus aureus Corynebacterium T treptococcus agalactiae T treptococcus dysgalactiae T46C treptococcus agalactiae T53C MIC (µg/ml) of positive controls: Gent (gentamicin), : 4, R: > 8; Vanc (vancomycin), : 4, R: > 16; Amox (amoxicillin), : 4, R: > 16; : sensitive, I: intermediate, R: resistant. MIC (µg/ml) of partitions (JMR-MC: methylene chloride partition; JMR-EA: ethyl acetate partition; JMR-H2O: aqueous partition): MIC < 100 µg/ml: high activity; 100 µg/ml < MIC < 500 µg/ml: moderate activity; 500 µg/ml < MIC < 1000 µg/ml: low activity; MIC > 1000 µg/ml: no activity : inactive (MIC > 1000 µg/ml) on Gram bacteria: Citrobacter freundii 11041, C. freundii 11042, Escherichia coli 8138, E. coli 8157, E. coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes 9004, Enterobacter cloacae 11050, E. cloacae 11051, E. cloacae 11053, Klebsiella pneumoniae 11016, K. pneumoniae 11017, erratia marcescens 11056,. marcescens 11057, P. mirabilis 11060, Providencia stuartii 11038, almonella sp , Acinetobacter baumanii 9010, A. baumanii 9011, Pseudomonas aeruginosa 8131, P. aeruginosa ATCC 27583, tenotrophomonas maltophilia; Yersinia pseudotuberculosis 2777; Gram + bacteria: Enterococcus faecalis C159-6, Enterococcus sp 8153, taphylococcus epidermidis 10282,. epidermidis 5001, taphylococcus lugdunensis T26A3, taphylococcus warneri T12A12, Mycobacterium smegmatis 5003; Yeast: Candida albicans

105 Table 5. Antiradical activities (IC50 in µg/ml) of Limonium virgatum stems and leaves partitions. Extract, partitions, compound LV-CE LV-MC LV-EA LV-But LV-H20 LVL-CE LVL-MC LVL-EA LVL-But LVL-H20 Luteolin IC50 (µg/ml) 8.19± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.31 Each value represents the mean ± D of 3 determinations. LV, Limonium virgatum stems; LV-CE, methanolic crude extract; LV-MC, methylene chloride partition; LV-EA, ethyl acetate partition; LV-But, butanol partition; LV-H2O, aqueous partition; LVL, Limonium virgatum leaves; LVL-CE, methanolic crude extract; LVL-MC, methylene chloride partition; LVL-EA, ethyl acetate partition; LVL-But, butanol partition; LVL-H2O, aqueous partition. Positive control: luteolin. Table 6. Antimicrobial activities of stems and leaves partitions of Limonium virgatum (MIC in µg/ml) L. virgatum LV -MC tems LV LV -EA -But LV -H2O LVL -MC Leaves LVL LVL -EA -But LVL -H2O Gent Vanc Amox R R R R Gram bacteria Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Providencia stuartii R R R Acinetobacter baumanii Acinetobacter baumanii R R R R R Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa ATCC R R R R R tenotrophomonas maltophilia Yersinia pseudotuberculosis R R Gram + bacteria taphylococcus epidermidis10282 taphylococcus epidermidis taphylococcus aureus taphylococcus aureus taphylococcus lugdunensis T26A R taphylococcus warneri T12A Corynebacterium T Mycobacterium smegmatis treptococcus agalactiae T treptococcus dysgalactiae T46C treptococcus agalactiae T53C MIC (µg/ml) of positive controls: Gent (gentamicin), : 4, R: > 8; Vanc (vancomycin), : 4, R: > 16; Amox (amoxicillin), : 4, R: > 16; : sensitive, I: intermediate, R: resistant. 91

106 MIC (µg/ml) of partitions (LV: Limonium virgatum tems; LVL: Limonium virgatum Leaves; LV-MC, LVL-MC: methylene chloride partitions; LV-EA, LVL-EA: ethyl acetate partitions; LV-But, LVL-But: butanol partitions; LV-H2O, LVL-H2O: aqueous partitions): MIC < 100 µg/ml: high activity; 100 µg/ml < MIC < 500 µg/ml: moderate activity; 500 µg/ml < MIC < 1000 µg/ml: low activity; MIC > 1000 µg/ml: no activity : inactive (MIC > 1000 µg/ml) on Gram bacteria: Citrobacter freundii 11041, C. freundii 11042, Escherichia coli 8138, E. coli 8157, E. coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes 9004, Enterobacter cloacae 11050, E. cloacae 11051, E. cloacae 11053, Klebsiella pneumoniae 11016, erratia marcescens 11056,. marcescens 11057, almonella sp ; Gram + bacteria: Enterococcus faecalis C159-6; Enterococcus sp 8153; Yeast: Candida albicans Figures Total polyphenol content (mg eq GA/g extract DW) ** ** * C. scabrum J. maritimus. maritima L. virgatum stems leaves stems leaves flowers stems leaves stems rhizomes flowers stems leaves flowers A. tatarica A. serratuloides For A. littoralis Green tea Control *. succulenta Figure 1. Total polyphenol content of crude methanolic extracts (mg eq GA/g extract DW). Each value represents the mean ± D of 3 determinations; Negative control: water (TCP = mg eq GA/g extract DW). Positive control: green tea (leaves extract). ignificantly different from the background control (water): *p < 0.05, ** p < Percentage of remaining DPPH (40 µg/ml) * ** ** ** C. scabrum J. maritimus L. virgatum. maritima stems leaves stems leaves flowers stems leaves stems rhizomes flowers stems For leaves flowers A. tatarica A. serratuloides A. littoralis Rutin MeOH 0. succulenta 92

107 Figure 2 Antiradical activities of crude methanolic extracts (at 40 µg/ml). Each value represents the mean ± D of 3 determinations. Negative control: MeOH. Positive control: rutin. ignificantly different from the background control (MeOH): *p < 0.05, ** p < For Review Only Figure 3 Anti-hepatitis C virus activity of crude methanolic extracts (relative infection rate and relative Huh-7 cell number percentages at 25 µg/ml). Each value represents the mean ± EM of 3 independent determinations. Huh-7 cells were inoculated with HCV in cell culture (HCVcc) in the presence of plant extracts at 25 µg/ml or 50 µm dephinidin or 1 µm boceprevir for 2h. Inoculum was removed and cells were further incubated in medium containing plant extracts or molecules for 28 h and cells were fixed. Negative control: DMO. Positive controls: delphinidin, an inhibitor with natural origin of HCV entry; boceprevir, an inhibitor of HCV replication. ignificantly different from the background control (DMO): *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p <

108 Figure 4 Cytotoxic activities of crude methanolic extracts (cell viability percentage at 50 µg/ml). Each value represents the mean ± EM of 12 determinations (6 repetitions in duplicate). WI-38, human normal fibroblast cell line; J774, murine macrophage-like tumor cell line. Negative controls: DMO and EtOH/H2O (vehicle solvents). Positive control: camptothecin, IC50 = 0.17 ± 0.04 µg/ml (WI-38), IC50 = ± µg/ml (J774). ignificantly different from the background control (DMO): *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p <

109 40 Total polyphenol content (mg eq GA/g extract DW) ** 20 * Control Green tea JMR-CE JMR-MC JMR-EA JMR-H2O Figure 5 Total polyphenol content TPC (mg eq GA/g extract DW) of Juncus maritimus rhizomes partitions. Each value represents the mean ± D of 3 determinations. JMR, Juncus maritimus rhizomes; JMR-CE, methanolic crude extract; JMR-MC, methylene chloride partition; JMR-EA, ethyl acetate partition; JMR-H2O, aqueous partition. Negative control: water (TCP = mg eq GA/g extract DW). Positive control: green tea (leaves extract). * ignificantly different from the positive control (water): *p < 0.05, ** p < Figure 6 Chromatograms at 254 nm of rhizomes crude extract of Juncus maritimus (JMR-CE) and its ethyl acetate partition (JMR-EA). The retention time of luteolin is indicated on the chromatogram (TR luteolin = 30 min). 95

110 or Review Figure 7 Anti-hepatitis C virus activity of crude methanolic extract and partitions of Juncus maritimus rhizomes (relative infection rate and relative Huh-7 cell number percentages at 25 µg/ml) Each value represents the mean ± EM of 3 independent determinations. Huh-7 cells were inoculated with HCVcc in the presence of plant extracts at 25 µg/ml or 50 µm delphinidin or 1 µm boceprevir for 2h. Inoculum was removed and cells were further incubated in medium containing plant extracts or molecules for 28 h and cells were fixed. Negative control: DMO. Positive controls: delphinidin, an inhibitor with natural origin of HCV entry; boceprevir, an inhibitor of HCV replication. Juncus maritimus rhizomes; JMR-CE, methanolic crude extract; JMR-MC, methylene chloride partition; JMR-EA, ethyl acetate partition; JMR-H2O, aqueous partition. ignificantly different from the background control (DMO): *** p<

111 TPC (mg eq GA/g extract DW) * ** 30 * LVL-H2O LVL-But LVL-EA LVL-MC LVL-CE LV-H2O LV-But LV-EA LV-MC LV-CE Control 0 TC (mg eq GA/g extract DW) * 10 5 LVL-H2O LVL-But LVL-EA LVL-MC LVL-CE LV-H2O LV-But LV-EA LV-MC LV-CE Control 0 Figure 8 Total polyphenol content (TPC) and total tannins content (TC) (mg eq GA/g extract DW) of Limonium virgatum stems and leaves partitions. Each value represents the mean ± D of 3 determinations. LV, Limonium virgatum stems; LV-CE, methanolic crude extract; LVMC, methylene chloride partition; LV-EA, ethyl acetate partition; LV-But, butanol partition; LV-H2O, aqueous partition; LVL, Limonium virgatum leaves; LVL-CE, methanolic crude extract; LVL-MC, methylene chloride partition; LVL-EA, ethyl acetate partition; LVL-But, butanol partition; LVL-H2O, aqueous partition. Control (TPC and TC): Water. Positive control (for TPC): green tea. ignificantly different from the background control (DMO): * p <0.05; ** p <

112 Figure 9 Chromatograms at 320 nm of methylene chloride (LV-MC and LVL-MC) and ethyl acetate partitions (LV-EA and LVL-EA) of Limonium virgatum stems and leaves. The retention times of compounds C1, C2 and C3 mainly identified in methylene chloride partitions are indicated on the chromatogram (TR C1 = 31.5 min; TR C2 = 32.5 min; TR C3 = 56.5 min). 98

113 II. Cirsium scabrum : isolement et caractérisation des composés responsables de son activité cytotoxique et révélation de son potentiel antibactérien La précédente étude a montré que l extrait brut méthanolique des feuilles de C. scabrum (CRW) possède à la fois une activité cytotoxique élevée contre une lignée de macrophages dérivés d un réticulosarcome de souris J774 (BALB/cmurine) (CI50 = 11,56 µg/ml), et à l inverse une très faible toxicité vis-à-vis de la lignée de cellules humaines non cancéreuses WI-38 (CI50 = 77,80 µg/ml). Dans ce travail, un fractionnement bioguidé a donc été initié sur CRW par une extraction liquide-liquide. Les 5 sous-extraits obtenus, éther de pétrole (CPE), dichlorométhane (CMC), acétate d éthyle (CEA), butanolique (CBt) et aqueux (CW) ont été testés contre les lignées cellulaires J774 et WI-38. La mesure de la prolifération cellulaire repose sur le test colorimétrique utilisant le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les cellules cultivées sont ensemencées dans des plaques à 96 puits, puis mélangées aux sous-extraits à différentes concentrations. La mesure des densités optiques permet de déterminer le pourcentage de viabilité cellulaire qui sert à estimer le pouvoir cytotoxique des extraits. Les résultats indiquent que le sous-extrait éther de pétrole (CPE) présente l activité cytotoxique la plus élevée parmi l ensemble des sous-extraits testés (CI50 =11,53 µg/ml), et est sélectif de la lignée cellulaire J774 (indice de sélectivité = 2,7). Cette activité est proche de celle de l extrait brut. Ces tests d activité antiproliférative ont été réalisés dans le cadre d une collaboration avec l équipe de pharmacognosie du Prof. Joëlle Quetin-Leclercq (UCL, Belgique) et notamment avec le Dr Joanne Bero et Claire Beaufay, doctorante au sein de leur équipe. Le sous-extrait éther de pétrole a fait l objet d un fractionnement bioguidé. La première étape du fractionnement est effectuée par une chromatographie sur colonne en phase normale (heptane/acétate d éthyle, 100:0 à 70:30) donnant lieu à 7 fractions (CPE1CPE7). Au cours de ce processus, un composé pur a été isolé (composé 1 = 21,9 mg). ur la base des profils CCM des fractions obtenues, des tentatives de purification de composés ont été initiées. Un deuxième composé (composé 2 = 1,5 mg) pur a été isolé à partir des deux fractions CPE1 et CPE2 par chromatographie sur colonne en phase normale (éther de pétrole/dichlorométhane, 25:5). L activité cytotoxique des fractions (CPE1-CPE7) a été évaluée contre les lignées cellulaires J774 et WI-38. Les résultats ont montré que les fractions CPE4 et CPE5 99

114 possèdent les activités les plus élevées contre J774 (CI50 = 13,77 et 8,96 g/ml respectivement). De plus, ces deux fractions n ont pas montré de toxicité significative sur la lignée de cellules saines WI-38. Les fractions CPE4 et CPE5 ont donc été fractionnées par chromatographie de partage centrifuge en utilisant le système Arizona X en mode ascendant (25 minutes) puis descendant (27 minutes). Ceci a permis d isoler un mélange indissociable de deux composés (composé 3 et composé 4 = 9,6 mg). Des tentatives pour séparer les 2 composés n ont pas abouti car les produits une fois séparés se dégradaient. Le mélange des deux composés 3 et 4 a donc été testé sur J774 et WI-38. Nous avons aussi évalué l activité du composé 1 directement purifié depuis le sous-extrait CPE. Les résultats obtenus montrent que le composé 1 a une activité similaire à celle du sous extrait éther de pétrole, aussi bien en terme d action antiproliférative, que de sélectivité à l égard de la lignée cellulaire J774 (CI50 = 12,60 µg/ml et I =1,5). L activité la plus élevée a été enregistrée pour le mélange des deux composés 3 et 4 (CI50 = 1,79 µg/ml) avec une très haute sélectivité (I = 9,2). Les composés 1 à 4 ont été identifiés. Un criblage phytochimique a permis de déterminer la nature chimique des composés qui constituent le sous-extrait CPE ; il s agit de triterpènes et de phytostérols. Par la suite, l analyse des données spectroscopiques (RMN et M) et la comparaison des résultats avec les données de la littérature ont permis d identifier ces composés : les composés 1 et 2 sont des triterpènes, le lupéol (composé 1) et l acétate du taraxastérol (composé 2), alors que les composés 3 et 4 sont un mélange de triterpènes de type cycloartane, le 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol et le 24hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol. L ensemble de ces composés (figure 30) ont déjà été identifiés chez d autres espèces de Cirsium. L'activité cytotoxique décrite dans la littérature pour certaines espèces de Cirsium a été attribuée aux deux cycloartanes, montrant qu ils possèdent une activité cytotoxique significative contre plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines in-vitro (Lee et al., 2002). Par ailleurs, nous nous sommes intéressés à l activité antibactérienne du genre Cirsium. En effet, plusieurs espèces de Cirsium ont montré un potentiel antimicrobien prometteur, notamment sur des souches de taphylococcus aureus. Même si initialement l extrait brut méthanolique des feuilles de C. scabrum n a pas montré d activité sur la collection de 36 souches testées (chapitre I), nous avons réalisé une nouvelle analyse, en utilisant une autre collection de bactéries composée majoritairement de souches de. aureus. L extrait brut (CRW), ainsi que l ensemble des sous-extraits CPE, CMC, CEA, CBt et CW ont été 100

115 testés par la méthode de diffusion en milieu solide avec un inoculateur à tête multiples. Les résultats ont montré que seuls CEA et CBt sont actifs, et notamment sur 6 souches de. aureus et 2 souches d une autre bactérie, Dermabacter hominis. Les CMI les plus élevées ont été enregistrées pour le sous-extrait CBt (312 μg/ml). Nous avons donc cherché à déterminer les composés responsables des activités de ce sous-extrait. Tout d abord, un criblage phytochimique a permis de déterminer que CBt était riche en flavonoïdes et en tanins. Par la suite, l'analyse par CLHP analytique de CBt a révélé la présence de deux composés majoritaires, qui ont donc été isolé directement par CLHP préparative. La structure de ces composés a été déterminée par l analyse de leurs données spectroscopiques (RMN et HR-M) et par comparaison avec les données de la littérature. Il s agit de deux flavones glycosylées : le composé 5 a été identifié comme un mélange (3:1) de la lutéoline 7-O-β-Dglucuronide et de la lutéoline 7-O-β-D-glucoside ; le composé 6 est l apigenine 7-O-β-Dglucuronide (figure 30). L activité biologique des flavonoïdes est en général bien caractérisée, notamment celle des génines (lutéoline et apigénine). Ce n est pas le cas pour ces hétérosides, car leur mécanisme d action n a pas été étudié. D autre part, on ne trouve pas de données dans la littérature concernant l'activité des flavonoïdes sur D. hominis. Il serait donc intéressant d analyser davantage les activités antibactériennes de ces 3 composés. Contribution personnelle. Pour réaliser ce travail, j ai effectué la collecte des feuilles de C. scabrum, le séchage et la préparation des échantillons. J ai aussi mis au point la première étape du fractionnement bioguidé, soit la préparation des sous-extraits par extraction liquideliquide à partir de l extrait brut. Je suis intervenue dans une autre étape du fractionnement bioguidé, en aidant Cédric Dufloer, étudiant en Master 2 Recherche, notamment dans la purification du mélange des 2 composés actifs par chromatographie de partage centrifuge. Finalement, j ai mené l ensemble du travail concernant la réalisation des tests d activité antibactérienne, la détermination du gradient en CLHP analytique (analyse qualitative des sous-extraits) et préparative, ainsi que le travail de purification des composés 5 et

116 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol 24-hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol Acétate du taraxastérol Lutéoline 7-O-β-D-glucuronide Lupéol Lutéoline 7-O-β-D-glucoside Apigénine 7-O-β-D-glucuronide Figure 30. Molécules identifiées dans le sous-extrait éther de pétrole des feuilles de Cirsium scabrum 102

117 Antiproliferative and antibacterial activities of Cirsium scabrum from Tunisia Ramla ahlia,b, Céline Rivièrea*, Cédric Dufloera, Claire Beaufayc, Christel Neutd, Joanne Beroc, Thierry Hennebellea, Vincent Roumya, Riadh Ksourib, Joelle Quetin-Leclercqc, evser ahpaza a Univ. Lille, INRA, IA, Univ. Artois, Univ. Littoral Côte d Opale, EA 7394 ICV, Institut Charles Viollette, F Lille, France, b The Laboratory of Aromatic and Medicinal Plants, Biotechnology Centre of Borj-Cédria (CBBC), Hammamlif, Tunisia, c Pharmacognosy Research Group, Louvain Drug Research Institute, Université Catholique de Louvain, Avenue E. Mounier, 72, B B Brussels, Belgium and d UDL, INERM U995, UFR Pharmacie, F Lille, France Correspondence: Céline Rivière, EA ICV, Institut Charles Viollette, Laboratory of pharmacognosy, Faculty of pharmacy, University of Lille 2-3 rue du Pr. Laguesse, B.P. 83, Lille Cedex, France celine.riviere-3@univ-lille2.fr 103

118 Abstract everal Cirsium species are known for their uses in traditional medicine and consequently are studied for their phytochemical content and their biological activities. In the framework of a previous study conducted on eight extremophile plants from Tunisia, we highlighted that the crude methanolic extract of C. scabrum, a not investigated thistle, showed a moderate but a quite selective cytotoxic activity against the cancerous cell line J774 compared to the noncancerous cell line WI38 (IC50 = μg/ml on J774, IC50 = µg/ml on WI38, selectivity index = 2.6). In the current study, the partitions of the leaves of C. scabrum were analysed for their antiproliferative activity on the same cell lines. From the most active petroleum ether partition, we isolated four triterpenoids including lupeol, taxasterol acetate and a (1:1) mixture of 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol and 24-hydroperoxycycloart-25en-3β-ol. These two cycloartane-type triterpenoids are mostly responsible for this cytotoxic activity. On the other hand, the antimicrobial potential of this plant was also evaluated against 36 microorganisms. The moderate antibacterial activity against 6 taphylococcus aureus and 2 Dermabacter hominis strains is mainly attributed to the butanol partition whose major compounds are glycosides of flavones. 104

119 1. Introduction The genus Cirsium (thistle), belonging to the Asteraceae family, is well distributed around the world. About 200 Cirsium species are distributed in Europe, North Africa, Asia, as well as North and Central America [1]. In agriculture, Cirsium species are often considered as invasive weeds against which massive means of control are deployed. By contrast, some species are easily cultivated by communities in dry steppes of Mongolia where fruits and vegetables are not easily afforded [2]. In some countries, such as in Turkey, some Cirsium species are considered as edible plants [3]. Different parts can be consumed, such as stems, roots and dethroned young leaves [4]. ome species of the genus Cirsium are also used as medicinal plants in the traditional medicine of several countries. In some European countries, the tea prepared from the leaves of some Cirsium species possesses therapeutic virtues. It is the case in Central Italy where the decoction of the leaves of Cirsium arvense is used to treat abdominal pains and intestinal disturbances. The species is also frequently used as an emergency haemostatic for wounds [5]. The roots or the entire plants of more than ten species are used in China for the treatment of various ailments including hemorrhaging, jaundice and gastrointestinal disorders [6]. According to literature, these traditional uses led to the consideration of the phytochemistry and the biological activities of some species. Cirsium species contain a variety of natural products including flavonoids, phenolic acids, lignans, sesquiterpenoids, triterpenoids, sterols, alkaloids, acetylenes, polyacetylenes, hydrocarbons, and a few other compounds [7]. Flavonoids and their glycosides are the main secondary metabolites of Cirsium species [6]. The compounds isolated from Cirsium species and extracts show many different biological activities including antimicrobial, antioxidant, antidiabetic, anti-inflammatory, vasorelaxant, astringent, hepatoprotective, and anticancer [8]. 105

120 Cirsium scabrum (Poir.) Bonnet & Barratte is a tall thistle native of the Mediterranean region [4]. To our knowledge, no reports on the uses of this plant in the traditional medicine, on its chemical composition and on its biological activities have been provided in the literature so far. In a previous study conducted on eight extremophile plants from Tunisia, we highlighted that the crude methanolic extract of C. scabrum showed a moderate but a quite selective cytotoxic activity against J774 compared to WI38 (IC50 = μg/ml on J774, IC50 = µg/ml on WI38, selectivity index = 2.6) [9]. In addition, the therapeutic uses attributed to several Cirsium species prompt us to explore in more depth the cytotoxic effect of the leaves of C. scabrum and to identify the compounds responsible of this activity using a bioguided fractionation approach. As several Cirsium species demonstrate an antimicrobial potential [7], we used the same approach to evaluate the antimicrobial activity of this species against a panel of 36 microorganisms and to identify the bioactive natural products. 2. Material and Method 2.1 General Experimental Procedures For the extraction and fractionation, synthesis grade methanol (MeOH), petroleum ether (PE), methylene chloride (CH2Cl2) and cyclohexane were furnished by VWR chemicals (Fontenaysous-Bois, France), whereas ethyl acetate (EtOAc) and n-heptane were obtained from Carlo Erba (Val-de-Reuil, France). Toluene was purchased from Fisher cientific (Illkirch, France). Water (W) was bi-distilled. All organic solvents for Centrifugal Partition Chromatography (CPC) purification were High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) grade except for the n-heptane which was synthesis grade (Carlo Erba, Val-de-Reuil, France). Ethyl acetate (EtOAc) and methanol (MeOH) were purchased from Fisher cientific (Illkirch, France). 106

121 Water was purified using Millipore Integral 5 (France) water purification system with a resistivity of not less than 18 MΩ.cm 1. The chloroform-d6 and MeOD for Nuclear Magnetic Resonance (NMR) experiments was obtained from Euriso-Top (Gif-sur-Yvette, France). Analytical Thin Layer Chromatography (TLC) were performed on pre-coated silica gel 60 F (0.25 mm, Merck, Germany) and the spots were visualized under UV (254 and 365 nm) before being sprayed with a solution of sulfuric anisaldehyde and heating at 100 C for 10 min. ilica gel 60 ( µm, Macherey Nagel, Germany) and silica gel 60H (< 63 µm, Macherey Nagel, Germany) were used for column chromatography. Analytical HPLC was carried out using a himadzu binary LC-10A pump, a CL-10A UVvisible detector and a Vision HT Basic C18 (5 μm, 4 mm i.d. 250 mm) column (Grace, Epernon, France). Preparative HPLC was performed using a himadzu HPLC system equipped with a LC-20AP binary high-pressure pump, a PD-M20A photodiode array detector and a VisionHT Basic C18 (5 μm, 22 mm i.d. 250 mm) column. The mobile phase was composed of 0.01% formic acid in water (solvent A) and acetonitrile (ACN) (solvent B). For analytical HPLC analysis, 20 µl of extract (10 mg/ml in MeOH) was injected at 1 ml/ml, whereas for preparative HPLC analysis, 200 mg of extract solubilised in MeOH was injected at 14 ml/min. The wavelength used was 254 nm. For both analysis, the following gradient elution program was used: 10-25% B (0-15 min), % B (15-20 min), % B (20-25 min); 34.75% B (25-28 min), % B (28-29 min), 35.12% B (29-32 min), % B (32-35 min). CPC was performed using an Armen instrument 250 ml rotor (CPC-250-L) provided by Armen instrument (aint-avé, France). CPC analyses were monitored using himadzu pump and detector. NMR spectra were recorded on a Bruker DPX-500 spectrometer (1H and 13 C NMR at 500 MHz), except for compound 2 identified on a 600 MHz spectrometer. For triterpenoids, M 107

122 analyses were carried out using a Trace DQ mass spectrometer (Thermo Finnigan) operating in the electron-impact mode. amples were analyzed in a full-scan mode ( amu) and was injected directly with a DEP probe. The data obtained were compared with those of the database NIT. Data acquisition and processing were performed with Xcalibur software. For flavonoids, HRM analyses were carried out in negative mode with a range of m/z , using a Thermo Fisher cientific Exactive Orbitrap mass spectrometer equipped with an electrospray ion source. The vaporizer temperature of the source was set at 100 C, the nitrogen sheath gas at 10-20, and the auxiliary gas at 2-6 (arbitrary units) Plant material Cirsium scabrum was collected in August 2013 in the North of Tunisia (Goubellat) and was identified at the Biotechnology Centre of Borj-Cédria by Dr Abderrazak maoui. A voucher specimen (181) was deposited at the Herbarium of the Laboratory of Extremophile Plants at the Biotechnology Centre of Borj-Cédria Preparation of the methanolic crude extract of C. scabrum leaves g of C. scabrum leaves were dried at 25 C for a week, and then powdered. Extraction was carried out by maceration at room temperature (MeOH, 15 ml per g of powder, 3 x 48 h). After filtration, extract was dried in vacuum at 35 C and lyophilized to afford g of crude methanolic extract (yield = 8.5%) Fractionation of the methanolic crude extract of C. scabrum leaves The crude methanolic extract of C. scabrum leaves (C = 12 g) was suspended in water (20 ml) and partitioned with PE, CH2Cl2, EtOAc and butanol (10 60 ml). Partitions were concentrated at 35 C under reduced pressure to give PE partition (CPE = 0.84 g), CH 2Cl2 108

123 partition (CMC = 1.46 g), EtOAc partition (CEA = 1.03 g) and butanol partition (CBt = 2.72 g). The remaining aqueous partition was freeze-dried and lyophilized (CW = 5.16 g) Isolation of compounds from the CPE partition 2 g of the CPE partition (obtained after two successive extractions and fractionations) was subjected to Column Chromatography (CC) on silica gel 60 ( µm) using a gradient of heptane/etoac (100:0 to 70:30) to give seven fractions (CPE1 CPE7) based on their TLC behaviour (heptane/etoac, 7:3). Compound 1 (21.9 mg) was isolated by this process (heptane/etoac, 95:5). Compound 2 (1.5 mg) was isolated from the combined fractions CPE1 and CPE2 (346.3 mg) by a silica gel 60H CC, eluted with PE/CH2Cl2 (25:5). Preparative Centrifugal Partition Chromatography (CPC) was carried out to isolate compounds from the most active combined fractions CPE4 and CPE5. CPC separation was conducted using a quaternary biphasic solvent system: Arizona X (n- Hept/EtOAc/MeOH/H2O, 9:1:9:1). Ten quaternary biphasic solvent systems Arizona were tested in order to choose the optimal system [10]. The two phases (aqueous and organic) of Arizona X system were prepared. The rotor was entirely filled at 30 ml/min and 500 rpm with the aqueous stationary phase (400 ml) in the ascending mode. The rotation speed was increased to 1600 rpm and the organic mobile phase was pumped into the column in ascending mode at a flow-rate of 8 ml/min. eparation was performed using 400 mg of combined partitions CPE4/CPE5, in ascending mode for 25 min then switched to descendant mode for 27 min. Fractions of 8 ml were collected every min by a Gilson FC 204 fraction collector (52 sub-fractions: X1 X52). Fractions were checked by TLC developed with heptane/etoac (7:3). CPC analysis allowed the direct purification of a (1:1) mixture of compounds 3a and 3b (X30-X33: 9.6 mg). 109

124 2.6. Isolation of compounds from the CBt partition Major compounds of the CBt partition (compounds 4a/4b and 5) were isolated by preparative HPLC using the following gradient elution program: 10-25% B (0-15 min), % B (15-20 min), % B (20-25 min); 34.75% B (25-28 min), % B (28-29 min), 35.12% B (29-32 min), % B (32-35 min). From 200 mg of the CBt partition, 8.04 mg of compound 4a/4b and 5.96 mg of compound 5 were obtained Cytotoxicity assays Cell culture The cytotoxicity was evaluated on two cell lines : J774 (macrophage-like cell line, derived from BALB/c murine reticulum cell sarcoma) and on WI38 (human normal fibroblast-like lung cell line), using the tetrazolium salt MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (igma)] colorimetric method, as described by Bero et al. [11]. J774 cells were cultivated in a humidified atmosphere with 5% CO2 at 37 C in RPMI 1640 medium (Life Technologies, Paisley, UK) containing 2 mm L-glutamine supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Life Technologies) and penicillin streptomycin (100 UI/ml). WI38 cells were cultivated in a humidified atmosphere with 5% CO2 at 37 C in DMEM medium (Life Technologies) containing 4 mm L-glutamine, 1 mm sodium pyruvate supplemented with 10% heat inactivated fetal bovine serum (Life Technologies) and penicillin streptomycin (100 UI/ml). 110

125 Cytotoxicity assay Briefly, WI38 or J774 were seeded in 96-well plates (5000 cells/well/180 µl medium or 2.8x104 cells/ml). After 24 h, cells were treated with 20 μl of crude extract and partitions solutions in a fixed concentration of 50 µg/ml to calculate cell viability percentage. When an extract or a partition presents a percentage inferior to 50%, an IC50 is calculated with a range of concentration between µg/ml obtained from a 20 mg/ml DMO stock solution diluted in fresh medium. In the same way, fractions (CPE1 to CPE7) obtained from the most active partition (CPE) and purified compounds were tested at two fixed concentrations of 5 and 20 µg/ml. This time, an IC50 is calculated for cell viability percentages inferior to 50% at 20 µg/ml with a range of concentration between µg/ml obtained as cited above. After 72 h, the medium was replaced by 100 μl of a 10% MTT solution (3 mg/ml in PB) in medium. After 45 min, the medium was removed again and 100 μl of DMO were added to solubilize formed formazan crystals. Absorbance was recorded at 570 nm and 620 nm. Each sample was tested in eight serial three-fold dilutions in 96-well microtiter plates, at least three wells per concentration in duplicate. Camptothecin (igma) was used as positive control (concentration range: µg/ml). The highest concentration of solvent to which the cells were exposed was 0.25%, which was shown to be non-toxic. Cell viability % = [AT/ANT] x 100, with A: absorbance, NT: control cells, T: treated cells Antimicrobial assay The antimicrobial activity of crude extract and partitions was evaluated against 36 pathogenic microorganisms (22 Gram-positive bacteria, 13 Gram-negative bacteria and 1 yeast) according to Mahamodo et al. [12]. The 36 microorganisms were grown overnight at 37 C on sloping Mueller-Hinton (MH) agar medium. Briefly, the bacteria were diluted with Ringer's Cysteine (RC) solution to obtain 106 bacteria/ml. In Petri dishes, 19 ml MH 2 agar was 111

126 supplemented with 1 ml of stock solution of crude extract or partitions (12.5 mg/ml to 0.39 mg/ml) or antibiotics (gentamicin, vancomycin, amoxicillin) (28 mg/ml to mg/ml); giving final concentrations from 625 to 19.5 µg/ml for the extracts and 64 to 0.03 µg/ml for antibiotics. Inocula of 104 colony forming units (CFU) were spotted ultimately with a multipoint inoculator (teers Replicator) tatistical analysis Data were analyzed by Graphpad Prism 7 statistical software and presented as the mean ± standard error of the mean. Activity differences between both cell lines were analyzed by the non-parametric Mann-Whitney test in two-tailed to highlight significant toxicity. However, the Wilcoxon signed-rank test in two tailed was used to compare activity (for CMC, CEA, CPE 4 and 5) on J774 to the maximum tested value on WI38, 50 or 20 µg/ml respectively. tatistical significance for all statistical tests was set at p < Results 3.1. Cytotoxic activity of crude methanolic extract and partitions of Cirsium scabrum leaves In a previous study [9], we showed that the cytotoxicity of the crude methanolic extract of C. scabrum leaves (CRW) was particularly interesting. It showed, among other plant extracts tested, the highest activity on J774 cell line (IC50 = µg/ml) and was also quite selective (IC50 = µg/ml on WI38, selectivity index = 2.6). In this study, our objective is to identify the compounds responsible of this activity. For this purpose, the partitions of C. scabrum leaves obtained from the crude methanolic extract by liquid-liquid partitioning (CPE, CMC, CEA, CBt and CW) were also analysed for their antiproliferative activity on the same cell lines (Table 1). Among all tested partitions, the petroleum ether partition 112

127 (CPE) showed the highest activity on J774 with an IC50 value (IC50 = µg/ml) almost similar to that of the crude methanolic extract (CRW). As CRW, CPE was also interesting because it showed some selectivity (IC50 = µg/ml on WI38, selectivity index = 2.7). A I value inferior to 2 may indicate a general toxicity of an extract or a pure compound [13]. In our case, we obtained I superior to 2 for both the crude extract CRW and the partition CPE with significant differences (p < 0.05) between both cell lines Cytotoxic activity of CPE fractions In view of these results, we followed our bioguided fractionation on the most active partition CPE. The fractionation of CPE by silica gel column chromatography produced seven fractions (CPE1-CPE7), based on their TLC behaviour, which were analysed for their antiproliferative activity on both cell lines (Table 2). The highest activity was recorded for the fractions CPE 4 and CPE 5 with IC50 values equal to and 8.96 g/ml respectively. Besides, these fractions did not show any toxicity at 20 µg/ml, the maximum concentration tested on the non-cancerous WI38 cell line, and their activity on J774 was significantly different with selectivity indices higher than 1.4 and 2.2 respectively. All other fractions were considered as non-active (IC50 20 g/ml) Purification of compounds from CPE partition A rapid phytochemical screening revealed that CPE partition is rich in terpenoids and phytosterols, while the presence of alkaloids, flavonoids, saponins and tannins was not detected. Four compounds were purified from some CPE fractions by silica gel column chromatography (CC) or by centrifugal partition chromatography (CPC). All compounds were identified and characterized by their spectroscopic data (1H and 13 C NMR, 2D NMR experiments), spectra mass data and by comparisons with the literature. Compounds 1 and 2 113

128 were identified as two common triterpenoids, respectively lupeol and taraxasterol acetate [1415]. Compounds 3a and 3b were identified as an indissociable (1:1) mixture of two hydroperoxide cycloartane-type triterpenoids: 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol (3a) and 24-hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol (3b) [16-17] (Figure 1) Cytotoxic activity of purified compounds The mixture of two cycloartane-type triterpenoids obtained from the most active fractions (combined fractions CPE4 and CPE5) were analysed for their antiproliferative activity on J774 and WI38 cell lines (Table 3). Even if lupeol was isolated directly by CC on silica gel 60 from CPE and not from CPE4-5, we tested its activity due to data of the literature [18]. Lupeol exhibited a cytotoxic activity against the J774 cell line with an IC 50 value similar to that of the CPE partition (IC50 = µg/ml), but did not show selectivity against the WI38 cell line (selectivity index = 1.5). On the other side, the mixture of 25-hydroperoxycycloart23-en-3β-ol and 24-hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol showed the highest activity on J774 cell line (IC50 = 1.79 µg/ml) and showed a very interesting selectivity index (IC 50 = µg/ml on WI38, selectivity index = 9.2) Antimicrobial activity of partitions of Cirsium scabrum leaves In our previous screening conducted on 8 extremophile plants, the crude methanolic extract of C. scabrum did not show relevant antimicrobial activity [9]. However, due to the known antimicrobial activity of some Cirsium species [7], we decided to analyse again the crude methanolic extract as well as partitions of C. scabrum for their antimicrobial activity against a new panel of 36 pathogenic microorganisms including new taphylococcus strains and Dermabacter hominis strains. Table 4 give MIC (Minimum Inhibitory Concentration) values of the two active partitions: CEA and CBt. CRW, CPE, CMC and CW were not 114

129 considered active because they showed MIC values > 1000 µg/ml. CEA and CBt showed a moderate antibacterial activity against 6 taphylococcus aureus and 2 Dermabacter hominis strains with higher MIC values for the CBt partition (312 µg/ml) Identification of the major compounds of the CBt partition. A rapid phytochemical screening revealed that CBt partition is rich in flavonoids and tannins. HPLC analysis of CBt partition revealed the presence of two major compounds isolated by preparative HPLC. tructural elucidation was achieved based on their spectroscopic data (1H and 13C NMR, 2D NMR experiments and HRM) and by comparison with the literature. Compounds 4a and 4b was identified as a (1:1) mixture of luteolin 7-O-βD-glucuronide (4a) [19] and luteolin 7-O-β-D-glucoside (4b) [20] and compound 5 was identified as apigenin 7-O-β-D-glucuronide [21] (Figure 1). 4. Discussion In a previous study conducted on extremophile plants, we analysed the antiproliferative activity of eight species using the MTT assay on J774 cancerous cell line compared to the one on WI38 non-cancerous cell line. We highlighted that the crude methanolic extract of C. scabrum leaves (CRW), a non investigated thistle, showed the highest activity on J774 cell line among other plant extracts tested and a good selectivity index [9]. In this current study, we aimed to investigate the cytotoxic activity of partitions obtained from the extract of C. scabrum leaves (CRW) on the same cell lines. We showed that the petroleum ether partition (CPE) was the most cytotoxic against the J774 cell line and may contain the compounds mostly responsible for the cytotoxic activity of this species. A bioguided fractionation of 115

130 CPE partition allowed us to identify these compounds, a (1:1) mixture of two hydroperoxide cycloartane-type triterpenoids: 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol (3a) and 24-hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol (3b). Lee et al. [16] have previously isolated these compounds from the methylene chloride extract of Cirsium setidens aerial parts in three steps by successive column chromatography. They demonstrated that both compounds have significant cytotoxic activity against several cultured human cancer cell lines, in particular the 24-hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol. In our study, both compounds were isolated as a (1:1) mixture in one step from the most active combined fractions (CPE4 and CPE5) using CPC. The attempts to separate these compounds from each other by column chromatography were not fruitful because they rapidly degrade. Consequently, we tested the antiproliferative activity of the mixture. The cytotoxic activity described in the literature for some Cirsium species is not only attributed to cycloartane-type triterpenoids. Other studies highlighted the cytotoxic potential of other types of compounds, for example caryolane-type sesquiterpenes from Cirsium souliei [6] or a nor-α-tocopheroid (α-tocospiro C) from Cirsium setosum [22]. We also isolated from the CPE partition of Cirsium scabrum leaves two common triterpenoids lupeol and taraxasterol acetate. Lupeol and taraxasterol acetate were identified in other Cirsium species (C. canum, C. hypoleucum and C. oleraceum) [7]. Lupeol is a triterpenoid widely distributed in various botanical families. everal in vitro and preclinical animal studies suggest that lupeol has a wide range of biological activities, including antiinflammatory, antimicrobial, antiprotozoal, cholesterol lowering, antiproliferative, antiinvasive and antiangiogenic ones [18]. This natural product is able to modulate different molecular mechanisms contributing to the melanoma development [23-24]. Taraxasterol acetate is occurring in various Cirsium species [7]. For instance, this triterpenoid was isolated from a cytotoxic petroleum ether fraction of Cirsium setosum [25] or from Cirsium species growing in Turkey [26]. In general, it is quite common in the Asteraceae family [27-28]. 116

131 On the other hand, we evaluated the antibacterial activity of the crude methanolic extract and partitions of Cirsium scabrum against a panel of 36 gram positive and negative bacteria. The crude extract showed no activity, while the butanol partition CBt had a moderate action against 6 taphylococcus aureus strains and 2 Dermabacter hominis strains. We isolated the major compounds of the CBt partition, a (1:1) mixture of luteolin 7-O-β-D-glucuronide and luteolin 7-O-β-D-glucoside (compounds 4a and 4b) and apigenin 7-O-β-D-glucuronide (compound 5), as a primary approach to understand the antibacterial potential of C. scabrum. To our knowledge, literature does not describe or little the antibacterial activity of luteolin 7O-β-D-glucuronide and apigenin 7-O-β-D-glucuronide. However, it is worthy to mention that some plant species containing these two flavones showed antibacterial activity against some Gram-positive and Gram-negative bacteria, including taphylococcus aureus strains [29, 30]. On the other hand, luteolin 7-O-β-D-glucoside (cynaroside) demonstrated antibacterial activity especially against Gram-negative bacteria [31]. This flavone was already identified in Cirsium japonicum [32]. In general, flavonoids are well known to be effective antibacterial substances against a wide array of bacteria, with MIC in the range of 0.06 to 31.3 µg/ml against some gram-positive bacteria and 0.3 to 39.1 µg/ml against some gram-negative bacteria, for the ten most potently antibacterial natural flavonoids tested in recent years [33]. As a matter of fact, they are synthesized by plants in response to microbial infection [34]. The mechanism of antimicrobial action of flavonoids seems to be complex as it does not target one specific site of action. In addition to direct and synergistic antibacterial effects, flavonoids interfere with bacterial virulence factors, including quorum-sensing signal receptors, some enzymes and toxins [33]. The antibacterial activity of apigenin and luteolin against taphylococcus aureus was thoroughly investigated. Apigenin can remarkably decrease at low concentrations the production of α-hemolysin, a toxin released by. aureus. Also, apigenin has a therapeutic effect on. aureus-related pneumonia by alleviating injury of the lung tissue 117

132 and decreasing cytokine levels [35]. Concerning luteolin, Wang et al. [36] suggested that this flavone could inhibit the activity of D topoisomerase I and II, which results in some decrease in the nucleic acid and protein synthesis. A recent study has investigated the mechanism of action of luteolin against methicillin-resistant taphylococcus aureus (MRA) [37]. The authors showed that luteolin acts in synergy by increasing cytoplasmic membrane permeability and inhibiting ATPase. The study also suggests a direct binding of luteolin with the major constituent of the. aureus cell wall. The antibacterial activity of flavonoids against D. hominis was not reported in the literature so far. Besides, few or no information exists on the activity of natural products from plants against this bacteria strain. D. hominis is a common colonizer from human skin. It is usually susceptible to vancomycin, teicoplanin and linezolid [38]. Further phytochemical investigation of the butanol partition of C. scabrum would deepen the understanding of its activity against D. hominis strains. On the other hand, the antibacterial activity of CBt partition could be also attributed to the presence of tannins. The antimicrobial activity of tannins is widely investigated. The different mechanisms proposed to explain their mechanism of action include direct action on microbial metabolism, but also inhibition of extracellular microbial enzymes or deprivation of the substrates required for microbial growth [39]. Nazaruk et al. [40] reported the presence of tannins in aqueous extracts from leaves of several Cirsium species. They showed that most of these extracts had antibacterial potential. Although they suggested that the content of small-molecular phenolic compounds had greater influence on the activity of extracts than tannins, consideration will be given to investigate more the antibacterial effect of the CBt partition from C. scabrum. 5. Conclusion A phytochemical and biological study was carried out for the first time on Cirsium scabrum. The study revealed that the crude methanolic extract of the leaves, and more precisely the petroleum ether partition (CPE) showed an interesting and quite selective cytotoxic potential 118

133 against the J774 cell line. A mixture of two hydroperoxide cycloartane-type triterpenoids were isolated and identified as the secondary metabolites responsible for this activity. Two other triterpenoids, lupeol and taraxasterol acetate were also isolated from the CPE partition, strengthening our knowledge about the chemical composition of Cirsium scabrum. We also focused our study on the antibacterial potential of this species. The butanol partition of C. scabrum leaves (CBt) showed a moderate activity against 6 taphylococcus aureus strains and 2 Dermabacter hominis strains. The two major compounds of CBt partition were identified as glycosides of flavones, suggesting that they might be responsible for this activity, as well as the presence of tannins. Acknowledgments This study was supported by an internal financial support from the Charles Viollette Institute. The authors wish to thank platforms of CUMA (University of Lille 2, Pr. J.F. Goossens) and LARMN (University of Lille 2, Pr. N. Azaroual) for access to equipment. The authors are also grateful to Laurence Marcourt for her technical assistance concerning the identification of compound 2. The chool of Pharmaceutical ciences of the University of Geneva (Prof. J-L. Wolfender) is thankful in this context to the wiss National cience Foundation for the support in the acquisition of the NMR 600 MHz (NF R Equip grant _164095). The authors also wish to thank Dr. Abderrazak maoui (Biotechnology Centre of Borj-Cédria), Maude Bourlet (UCL), Laetitia Bocquet, Moussa Diop, Jennifer amaillie, éverine Mahieux and Dr Mostafa Kouach (University of Lille 2) for their skillful technical assistance. 119

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137 Tables Table 1: In vitro cytotoxicity of the crude extract and partitions of C. scabrum leaves Crude extract and WI38 J774 I partitions IC50 (µg/ml) IC50 (µg/ml) (IC50 WI38/IC50 J774) CRW ± ± *** CPE ± ± *** CMC > ± 1.87 >1 CEA > ± 2.91 >1.2 * CBt >50 >50 >1 CW >50 >50 >1 Camptothecin ± ± *** CRW: C. scabrum leaves crude extract; CPE: C. scabrum leaves petroleum ether partition; CMC: C. scabrum leaves methylene chloride partition; CEA: C. scabrum leaves ethyl acetate partition; CBt: C. scabrum leaves butanol partition; CW: C. scabrum leaves water partition; Camptothecin: positive control. Results are expressed as mean ± standard error of the mean (EM) from six determinations and activity differences between cell lines are statistically defined for each partition with the Mann-Whitney or Wilcoxon signed rank tests for comparison to the highest tested concentration (p< 0.05 *, p< ***). Table 2: In vitro cytotoxicity of CPE fractions CPE fractions WI38 J774 I IC50 (µg/ml) IC50 (µg/ml) (IC50 WI38/IC50 J774) CPE1 >20 >20 >1 CPE2 >20 >20 >1 CPE3 >20 >20 >1 CPE4 > ± 1.26 >1.4 * CPE5 > ± 1.09 >2.2 * CPE6 >20 >20 >1 CPE7 >20 >20 >1 Camptothecin ± ± *** CPE1-CPE7: fractions of CPE; Camptothecin: positive control. Results are expressed as mean ± standard error of the mean (EM) from six determinations and activity differences between cell lines are statistically defined for each fraction with the Mann-Whitney or Wilcoxon signed rank tests for comparison to the highest tested concentration (p< 0.05 *, p< ***) 123

138 Table 3: In vitro cytotoxicity of isolated compounds from the combined fractions CPE4/CPE5 WI38 J774 I IC50 (µg/ml) IC50 (µg/ml) (IC50 WI38/IC50 J774) ± ± *** (4.51 µm) (2.96 µm) Mixture of ± ± 0.03 compounds 3a/3b (3.6 µm) (0.39 µm) Camptothecin ± ± (0.05 µm) ( µm) Compound *** 15 *** Compound 1: lupeol; Mixture of compounds 3a/3b: 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol and 24-hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol; Camptothecin: positive control. Results are expressed as mean ± standard error of the mean (EM) of six determinations and activity differences between cell lines are statistically defined for each compound with the Mann-Whitney or Wilcoxon signed rank tests for comparison to the highest tested concentration (p< 0.05 *, p< ***). 124

139 Table 4: Antimicrobial activity of active partitions of C. scabrum leaves Active partitions MIC values (µg/ml) Reference antibiotics MIC values (µg/ml) CBt CEA Amox Gent Vanc Escherichia coli T20A2 R R Pseudomonas aeruginosa T41 R R Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 R R Dermabacter hominis T47A R Dermabacter hominis T49B Corynebacterium striatum T40A3 R R Corynebacterium striatum T46C1 Enterococcus faecalis T37B1 Enterococcus faecalis T47A16 R treptococcus agalactiae T53A4 R R R taphylococcus aureus T R taphylococcus aureus T281 R taphylococcus aureus taphylococcus aureus R taphylococcus aureus 8142 R taphylococcus aureus T61 R taphylococcus aureus T R taphylococcus aureus T11 R taphylococcus aureus T taphylococcus aureus T26A R taphylococcus epidermidis T151 R R taphylococcus epidermidis T19A1 R taphylococcus capitis T21A3 taphylococcus capitis T29A2 taphylococcus pottenkoferi T282 taphylococcus pottenkoferi T33 R taphylococcus saprophyticus 8237 taphylococcus lugdunensis T36A1 taphylococcus lugdunensis T47B2 Gram bacteria Gram + bacteria MIC (µg/ml) of positive controls: Amox (amoxicillin), : 4, R: > 16, Gent (gentamicin), : 4, R: > 8; Vanc (vancomycin), : 4, R: >16; MIC (µg/ml) of partitions (CBt: C. scabrum leaves butanol partition; CEA: C. scabrum leaves ethyl acetate partition): MIC < 100 µg/ml: high activity; 100 µg/ml < MIC < 500 µg/ml: moderate activity; 500 µg/ml < MIC < 1000 µg/ml: low activity; MIC > 1000 µg/ml: = inactive. 125

140 Figure 1: Compounds isolated from Cirsium scabrum H H H H H HO O H H O H 1 2 OOH OOH H HO H HO H H 3a 3b OH OH O OH OH HO HO O O O OH OH O O OH OH O OH OH OH OH O O 4b 4a OH O OH HO O OH OH O O OH O 5 126

141 III. Juncus maritimus : activités antivirale (virus de l hépatite C) et antibactérienne III.1. Identification du composé responsable de l activité de J. maritimus sur le virus de l hépatite C et caractérisation de son activité Résumé détaillé uite au screening initial mené sur les 8 plantes extrêmophiles (chapitre I), nous avons sélectionné l extrait des rhizomes de J. maritimus (JMR-CE) en raison de son activité antivirale marquée contre le virus de l hépatite C (plus de 85% d inhibition de l infection virale). Un fractionnement bioguidé a été réalisé. Trois sous-extraits ont été obtenus par extraction liquide-liquide : dichlorométhane (JMR-MC), acétate d éthyle (JMR-EA) et aqueux (JMR-H2O). Les résultats ont montré que JMR-MC est principalement responsable de cette activité, avec plus de 98% d inhibition de l infection. Dans cette présente étude, nous avons poursuivi le fractionnement bioguidé du sous-extrait dichlorométhane pour rechercher le ou les composés responsables de l activité. Nous avons également cherché à comprendre son mode d action contre le VHC grâce à une collaboration avec les Drs Karin eron et Yves Rouillé (CIIL - Center for Infection and Immunity of Lille, Institut Pasteur de Lille), et de Marie-Emmanuelle ahuc, doctorante au sein de leur équipe. Nous avons purifié les deux composés majoritaires de JMR-MC. Pour cela, un fractionnement a été réalisé par chromatographie de partage centrifuge (CPC) en utilisant un système de solvants approprié, Arizona X. L analyse par CPC a donné 15 fractions (MCX1 MCX15). A partir de la fraction MCX15, les deux composés majoritaires 1 (22,2 mg) et 2 (25,9 mg) ont été isolés par CLHP préparative. Ensuite, l effet des deux composés isolés sur l infection virale a été analysé de manière à déterminer l étape du cycle viral du VHC sur laquelle les composés agissaient. Les produits sont alors ajoutés aux cellules Huh-7 infectées, à différents temps correspondants aux principales étapes du cycle viral du VHC : pendant l entrée du virus (uniquement lors de l'inoculation : co-addition), après inoculation (post-inoculation), ou encore de façon continue (co-addition et post-inoculation). Les deux composés (1) et (2) se sont montrés actifs sur le VHC, avec une activité élevée pour le composé (2). Ce dernier présente une activité sur l ensemble des étapes testées du cycle viral, et particulièrement pendant l étape post-inoculation avec plus de 95% d'inhibition de l'infection. De plus, il n a pas montré de cytotoxicité sur les cellules Huh-7, contrairement au 127

142 composé (1). Nous avons donc cherché à élucider la structure des composés (1) et (2). Ils ont été identifiés sur la base de leurs données spectroscopiques (RMN et HR-M). La structure de ces composés déjà connus a été confirmée par comparaison avec les données de la littérature. Le composé (1) est le juncusol (Della Greca et al., 1992), et le composé (2) est son dérivé, le dehydrojuncusol (arkar et al., 1988). Il s agit de deux dérivés phénanthrèniques déjà identifiés chez d autres espèces de Juncus (El-hamy et al., 2015) CH CH3 CH OH 5 4a 8 3 HO 8a a 10 CH3 11 Juncusol 4a 3 OH 7 4 5a 6 5 H2C a 8 8a HO a 10 CH3 11 Dehydrojuncusol Figure 31. tructures chimiques du juncusol et du dehydrojuncusol En raison de l effet remarquable du dehydrojuncusol sur le VHC, nous avons cherché à analyser davantage son activité. Une première analyse confirme son efficacité en montrant qu il est capable de diminuer les titres infectieux du VHC à partir de doses relativement faibles (2,2 μm). D autres expériences ont montré que ce composé est particulièrement actif au cours de l étape de post-inoculation, avec une CE50 de 1,53 μm, tout en étant sélectif sur les cellules Huh-7 (indice de sélectivité = 56). Pour confirmer ces résultats, nous avons vérifié que le dehydrojuncusol n intervient pas au niveau de l'entrée du VHC dans la cellule hôte, en utilisant les particules rétrovirales pseudotypées avec les glycoprotéines d enveloppe E1 et E2 du VHC (VHCpp). L analyse a montré que le dehydrojuncusol n'était pas un inhibiteur de l'entrée du VHC ; aucun effet sur l'entrée de VHCpp n'a été observé même à des concentrations élevées. Nous avons donc évalué l activité de ce composé sur la réplication du VHC indépendamment de l'entrée. En raison de quantités limitées en dehydrojuncusol (temps de purification en quantités importantes assez long à partir de la plante), les essais ont été poursuivis en utilisant le sous-extrait dichlorométhane des rhizomes de J. maritimus à partir duquel le dehydrojuncusol a été purifié. Pour cela, des cellules Huh-7 exprimant de manière stable un réplicon de HCV qui exprime la N5A (protéine non structurale impliquée dans la 128

143 réplication du VHC) marquée par la GFP, ont été utilisées. En présence du sous-extrait dichlorométhane, l'expression de la N5A-GFP est significativement diminuée, et ceci pendant les différentes périodes de traitement, montrant que le sous-extrait dichlorométhane, et fort probablement le déhydrojuncusol, sont des inhibiteurs de la réplication du VHC. L effet sur la réplication a donc été analysé de manière encore plus approfondie. Dans une première analyse, nous avons trouvé que le sous-extrait dichlorométhane (et potentiellement le dehydrojuncusol), agirait spécifiquement sur des protéines du VHC. Ceci a été vérifié en testant le sous-extrait dichlorométhane sur deux autres virus de la même famille du VHC (YFV et BVDV), où aucune diminution significative de l'infection par ces deux virus n'a été observée même à des concentrations qui inhibaient l infection par le VHC. Face aux potentialités thérapeutiques que montre le dehydrojuncusol, des essais pré-cliniques ont été effectués en utilisant l unique modèle pré-clinique humain disponible, les hépatocytes humains primaires (PHH). En présence du dehydrojuncusol, une diminution du titre du VHC a été observée, avec une CE50 similaire à celle calculée dans les cellules Huh-7 (1,14 μm et 1,35 μm, respectivement). De plus, le dehydrojuncusol n'a pas montré de toxicité sur les PHH à des concentrations actives. L ensemble des résultats obtenus jusqu'à présent plaident en faveur de l efficacité du dehydrojuncusol comme inhibiteur de la réplication, aussi bien in vitro, qu en pré-clinique. Dans le but d introduire le dehydrojuncusol comme une alternative prometteuse aux traitements actuels, il est important d évaluer son activité sur les mutants résistants aux DAA «Direct Acting Antivirals» actuellement utilisés. En effet, certains patients traités par des DAA nouvellement approuvés ciblant N5A ou N5B deviennent résistants à la thérapie, en raison de l apparition de mutants résistants après le traitement par des DAA anti-n5a (daclatasvir, ledipasvir, ombitasvir). Un réplicon a donc été généré portant les mutations L31M ou Y93H qui confèrent une résistance à N5A, notamment au daclatasvir. Les résultats ont montré que le mutant résistant L31M est très sensible au dehydrojuncusol, avec une EC50 de 0,22 μm. Par contre, l inhibition du mutant résistant Y93H est partielle, avec une EC50 de 3,62 μm. Dans une dernière étape, nous avons cherché à mieux comprendre le mécanisme d'action du dehydrojuncusol. Pour cela, des mutants partiellement résistants au sous-extrait dichlorométhane des rhizomes de J. maritimus ont été sélectionnés. Il s agit d un double mutant dans N5A, T24-L31M. Les trois mutants obtenus (T24, L31M et T24-L31M) après insertion de ces mutations dans JFH1 ont été testés avec le sous-extrait dichlorométhane, montant que les mutations doubles T24-L31M semblent conférer une 129

144 résistance modérée au dehydrojuncusol, semblable à celle observée avec la mutation Y93H. Les mutants L31M sont toujours aussi sensibles, de même que les mutants T24. Pour conclure, N5A semble bien être la cible du dehydrojuncusol, avec trois mutations qui confèrent une résistance partielle à cette molécule (T24-L31M et Y93H). D autre part, l ensemble des mutations étudiées sont résistantes au daclatasvir, suggérant que le déhydrojuncusol peut s introduire comme une potentielle alternative au daclatasvir. Contribution personnelle. Pour réaliser cette étude, j ai dû purifier le composé responsable de l activité antivirale du sous-extrait dichlorométhane des rhizomes de J. maritimus. Le sous-extrait étant très riche en composés ayant des polarités très proches, la mise en place d une stratégie rapide pour purifier les produits a nécessité différents essais, notamment pour déterminer le système de solvants adéquat en CPC (Arizona Z), ainsi que les gradients de solvants à utiliser en CLHP préparative. De plus, ce travail a nécessité des quantités élevées en dehydrojuncusol et en sous-extrait dichlorométhane, nécessitant donc de renouveler les opérations de collecte, de préparation des échantillons, d extraction, de purification, et finalement de vérification de la pureté des composés par CLHP-UV et RMN. 130

145 Dehydrojuncusol, a natural phenanthrene compound extracted from Juncus maritimus is a new inhibitor of hepatitis C virus replication Marie-Emmanuelle ahuc1*, Ramla ahli2,3*, Céline Rivière2, Véronique Pène4, Muriel Lavie1, Abderrazak maoui3, Arielle Rosenberg4, Jean Dubuisson1, Riadh Ksouri3, Yves Rouillé1, evser ahpaz2, Karin éron1 1 CIIL - Center for Infection and Immunity of Lille, Univ. Lille, CNR, INERM, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, U1019 UMR 8204 F Lille, France, 2 ICV - Institut Charles Viollette, Univ. Lille, INRA, IA, Univ. Artois, Univ. Littoral Côte d Opale, EA 7394, F Lille, France, 3 Laboratory of Aromatic and Medicinal Plants, Biotechnology Centre of Borj-Cédria (CBBC), Hammam-lif, Tunisia, 4Univ. Paris Descartes, EA4474 Hepatitis C Virology, F Paris, France. * Equal contribution Corresponding author: Karin éron, Molecular & Cellular Virology, CIIL, INERM (U1019) & CNR (UMR8204), Institut Pasteur de Lille, Bâtiment IBL, 1 rue Calmette, C50447, Lille cedex, France. Tel: (+33) ; Fax: (+33) ; karin.seron@ibl.cnrs.fr Keywords Hepatitis C, antiviral agent, natural compound, phenanthrene, dehydrojuncusol 131

146 Abstract Hepatitis C virus (HCV), causing hepatitis C, is present in approximately 170 million people worldwide. Recent emergence of direct acting antivirals (DAAs) targeting HCV proteins, has considerably enhanced the success of antiviral therapy. However, the apparition of DAA resistantassociated variants is a cause of treatment failure. The cost of the therapy is extremely high and not accessible in countries with inadequate medical infrastructures. Therefore, search for new inhibitors and with lower cost of production, like natural compounds, should be pursued. In this context, sixteen crude methanolic extracts of extremophile plants from Tunisia were screened against HCV in cell culture. Infection rates in Huh-7 hepatoma cells were investigated by indirect immunofluorescence assay. The rhizome crude extract of Juncus maritimus Lam., exhibited the highest antiviral activity. Bio-guided fractionation showed that the methylene chloride partition was most likely responsible for this activity. Among the compounds isolated and identified from this partition, dehydrojuncusol, was the most active. A time-addition assay showed that dehydrojuncusol significantly inhibited HCV infection when added during the post-inoculation step (EC50 = 1.31 µm). Inhibition of HCV replication was confirmed using a cell line stably expressing a HCV subgenomic replicon. No in vitro toxicity on Huh-7 cells at active concentrations was observed and no effect on HCV pseudoparticule entry. Antiviral activity of dehydrojuncusol was also demonstrated in primary human hepatocytes, the most relevant human pre-clinical model for HCV infection. Interestingly, dehydrojuncusol was able to inhibit replication of two frequent daclatasvir resistant mutants (carrying the mutations L31M or Y93H in N5A). Finally, two linked mutations in N5A (T24-L31M) were identified in dehydrojuncusol resistant mutants and were shown to confer partial resistance to the drug. In conclusion, dehydrojuncusol, a natural compound, extracted from J. maritimus, inhibits HCV replication and is active against HCV resistant variants frequently found in patients with treatment failure, and may target the viral protein N5. 132

147 Introduction Hepatitis C is a major cause of chronic hepatitis often associated with complications, such as liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (Levrero, 2006; Messina et al., 2015). Approximately 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV) worldwide (Lavanchy, 2011). To date no vaccine is available against HCV, mainly due to the diversity of viral isolates (Tarr et al., 2015). In recent decades, various treatments have been established. Before 2011, a standard therapy combining pegylated interferon alpha and ribavirin (a guanosine analogue) was administered to patients (Liang and Ghany, 2013). The first direct-acting antiviral agents (DAA), targeting the N3/4A protease activity, effective only against genotype 1 HCV-infected patients and inducing side effects, were released in ince then, other viral proteins have been targeted like RdRp N5B and N5A, a protein involved in replication and assembly of the virus but with no enzymatic activity. New inhibitors have been marketed with high rates of sustained virologic response against all genotypes and very few side effects (Pawlotsky, 2014). However, these treatments are very expensive and not accessible to all people infected (Graham and wan, 2015). Moreover, there is a risk of selecting viral variants resistant to DAA leading to failure of the therapy, which will require new treatments (Pawlotsky, 2016). HCV, a member of the Flaviviridae family, is an enveloped, single stranded R virus (Lindenbach et al., 2007) encoding for a single polyprotein which is cleaved co- and post-translationally in ten proteins. tructural proteins are components of infectious viral particles, whereas non-structural proteins are involved in the replication of the viral genome and the production of new infectious particles in infected cells. The HCV life cycle can be divided into three major steps: entry, replication, and assembly/release. At each step, different sets of viral proteins and host factors are involved. HCV entry (Bartosch and Dubuisson, 2010) is a complex mechanism initiated first by the binding of particles to non-specific and specific entry factors, then endocytosis and fusion of viral envelope and the endosomal membrane leading to release of viral R genome into the cytoplasm. Viral envelope proteins E1 and E2 are involved in the entry process. The replication of the R genome takes place in the membranous web which are endoplasmic reticulum rearranged membranes (Egger et al., 2002). The replication complex is composed of viral proteins N3/4A, N4B, N5A and N5B. Finally, new virions assemble in association with lipid droplets (Miyanari et al., 2007), bud into the endoplasmic reticulum and infectious viral particles are secreted out of the cells via the secretory pathway. The present hepatitis C therapy is very efficient but lead to the apparition of resistant associated substitutions (RAs). ome of the RAs are specific to a DAA, this is the case for N5B RAs but 133

148 some of them appear independently of the DAA used, especially for N3/4A and N5A RAs (arrazin, 2016). Patients with N5A resistant variant are very difficult to treat and re-treatment with a combination of anti-n5b and anti-n5a antiviral does not always lead to a high sustained antiviral response. Moreover, these mutated viruses are persistent for years in blood serum (Pawlotsky, 2016). Lack of alternative therapy might be a problem for these patients in the future. Natural products from plant species maintain a strong position in the drug discovery (Newman and Cragg, 2012). Between 1981 and 2010 marketed molecules with plant origin had antimicrobial activities. A number of metabolites found in plants, among which are the phenolic compounds, are being cited as antimicrobials and resistance-modifying agents (Abreu et al., 2012; Gibbons, 2004). If the artemisinin derivatives are well known for their antimalarial activity, researchers continue to study plant-derived natural products as source of new antimalarial drugs to fight emerging multidrug resistant strains of malaria parasites, including synthetic analogues of natural compounds (Wright, 2010). In fact, even if natural products are not always used directly as medicines, they often remain a source of inspiration for medicinal chemistry, with semisynthetic modifications, or pharmacophore with natural origin (Newman and Cragg, 2012). Extremophile plants either xerophytes (growing in arid climate), or halophytes (growing in saline soils) are natural reservoirs of rare bioactive compounds. To live in this environment, the plants should be able to develop several physiological, biochemical and molecular mechanisms, including biosynthesis of osmolytes and bioactive molecules enzymatic or not enzymatic. By these molecular mechanisms, extremophile plants can resist to abiotic stresses and to infections by producing phytoalexins (Ksouri, 2012). Rare compounds with unique or common chemical structure present in extremophile plants might help to identify new DAA against HCV with unexpected mechanism of action. Numerous DAA from natural origin are now described and are able to target different steps of HCV infectious cycle (Calland et al., 2012). Crude extracts from plants used in traditional medicine are also promising source of antiviral molecules. However, only silymarin, a standardized extract of Milk thistle (ilybum marianum (L.) Gaertn., Asteraceae) and some of its metabolites, silibinin A and B, a mixture of two diastereoisomers of flavonolignans, are developed in clinical trials to be used in hepatitis C infected patients (Polyak et al., 2013). It is estimated that the new DAA therapy against hepatitis C will benefit to a very small part of the patients (Hajarizadeh et al., 2013). The use of plant extracts or compounds isolated from these extracts should render the therapy more accessible to many patients in developing countries. Therefore search for such compounds and extracts is still needed to treat the vast majority of the patients in the coming decades. In this context, we have screened halophyte and xerophyte plant extracts from Tunisia for their anti-hcv activity. This led us to identify Juncus maritimus rhizome extract for its capacity to inhibit HCV infection (ahli et al., in press). Thanks to a bio-guided fractionation approach, dehydrojuncusol, the active compound inhibiting HCV infection was identified and its mechanism of action against HCV replication characterized. 134

149 Materials and methods Chemicals Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM), Opti-MEM, phosphate buffered saline (PB), glutamax-i, fetal bovine serum were purchased from Eurobio. 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) was from Molecular Probes (Thermo Fischer cientific, Waltham, UA). EGCG was from Calbiochem (MerckChemicals, Darmstadt, Germany) and was >95% pure. Delphinidin chloride was from Extrasynthèse (Lyon, France) and was >96% pure. Daclatasvir (BM ) was from elleckchem (France). tocks of EGCG and delphinidin were resuspended in dimethylsulfoxide (DMO) at 0.5 M. Plant extracts were resuspended in DMO at 25 mg/ml. Boceprevir was kindly provided by Philippe Halfon (Hôpital Européen, Laboratoire Alphabio, Marseille, France). Other chemicals were from igma (t. Louis, MO). Antibodies The anti-e1 monoclonal antibody (A4) (Dubuisson et al., 1994), anti-yellow fever virus (YFV) envelope protein 2D12 antibody and anti-bovine viral diarrhea virus (BVDV) N3 protein OC-23 antibody were produced in vitro by using MiniPerm apparatus (Heraeus, Hanau, Germany). The antin5a (2F6/G11) was from Austral Biologicals (an Ramon, UA). Mouse anti-β tubulin Mab (TUB 2.1) was from igma. Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG and peroxidase-conjugated goat antimouse IgG antibodies were from Jackson Immunoresearch (West Grove, PA, UA). Cells and culture conditions Huh-7 (Nakabayashi et al., 1982) and HEK 293T (ATCC number CRL-11268) were grown in DMEM supplemented with glutamax-i and 10% fetal bovine serum (complete culture medium), and MadinDarby Bovine Kidney (MDBK; ATCC number CCL-22) in DMEM supplemented with glutamax-i and 10% horse serum in an incubator at 37 C with 5% CO2. The primary human hepatocytes were from (Biopredic International, aint-grégoire, France) and maintained in primary culture as described previously (Calland et al., 2015) (Podevin et al., 2010). 135

150 Collection of plant, extraction and purification of natural products Juncus maritimus rhizomes were collected in October 2013 from a coastal region in the North-East of Tunisia (oliman) and a voucher specimen (184) was deposited at the Herbarium of the Laboratory of Extremophile Plants at the Biotechnology Centre (Technopark of Borj-Cédria). Dried and powdered rhizomes were soaked in methanol (15 ml/g; 1 x 24 h; 2 x 48 h) to afford g of a crude methanolic extract. A part of the extract (215.0 g) was dissolved in water and then partitioned with methylene chloride (CH2Cl2) to afford a CH2Cl2 partition (15.0 g). Preparative Centrifugal Partition Chromatography (CPC) (Armen Instrument) was carried out on CH2Cl2 partition (1.45 g) using a quaternary biphasic solvent system Arizona X (n-hept/etoac/meoh/h2o; 9:1:9:1; v/v/v/v) in ascending mode for 30 min. Fifteen fractions (MCX1 to MCX15) were pooled according to TLC and UV analysis. Compounds 1 (22.2 mg) and 2 (25.9 mg) were isolated from MCX15 (200 mg) by preparative High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (himadzu instrument) using the following elution program (EP1): 10-38% B (0-2 min), 38-45% B (2-8 min), 45-51% B (8-25 min), 51-96% B (25-26 min), 96%-96.1% B (26-29 min), 100% B (29-35 min). HCVcc We used a modified JFH1 strain (Japanese Fulminant Hepatitis-1, genotype 2a) containing cell culture adaptive mutations (Delgrange et al., 2007; Goueslain et al., 2010). The viral stock was produced in Huh-7 cells. Huh-7 cells were infected with a pre-stock of HCVcc in flasks. After 24h, 48h and 72h the supernatants of flasks were collected. The titer of the stock was focus forming unit (ffu)/ml. For infection assay, Huh-7 cells, 6000/well, seeded in 96-well plate were inoculated with HCVcc at a multiplicity of infection (MOI) of 0.8 during 2h at 37 C then the inoculum was removed and cells were incubated in complete culture medium for 28h at 37 C. Compounds were added to cells at 25 µg/ml either for 2h at 37 C before infection (preincubation condition), for 2h at 37 C in the presence of the virus (inoculation condition), for 28h at 37 C after virus removal (post-inoculation condition) or both during the 2h infection and 28h post-infection periods (inoculation and post-inoculation condition). Cells were fixed with ice-cold methanol and subjected to immunofluorescent detection of viral E1 envelope protein. HCV grown in primary culture (HCVpc) For HCV infection, PHH were inoculated 3 days post-seeding at a MOI of 5 with a non-modified JFH1 virus (HCVcc), as previously described (Podevin et al., 2010). After 6h incubation at 37 C, the inoculum was removed, and monolayers were washed 3 times with PB. upernatants containing 136

151 infectious HCVpc were harvested 2 days later, and infectious titers were evaluated by a focus-forming assay on Huh-7 cells as previously described (Pène et al., 2009). BVDV and YFV Bovine viral diarrhea virus (BVDV, strain DL) was produced in MDCK cells as previously described (Lecot et al., 2005). Yellow fever virus (YFV, strain 17D) was produced in W13 cells. Infection assays were performed with MDBK cells (BVDV) or Huh-7 cells (YFV) seeded 96-well plates, at a multiplicity of infection (MOI) of 1.5 or 1, respectively. Cells were infected for 1 hour at 37 C. The viral inoculum was removed and the cells were further cultured for either 15 hours (BVDV) or 23 hours (YFV). Cells were fixed with paraformaldehyde 3% in PB and subjected to immunofluorescent detection of N3 (BVDV) or E (YFV). HCV particle pseudotyped (HCVpp) Retroviral pseudoparticles expressing HCV envelope glycoproteins E1E2 of genotype 2a (HCVpp) were produced in HEK-293T cells as described (Bartosch et al., 2003). Huh-7 cells were seeded in 48well plates and inoculated with HCVpp in the presence of compounds for 2h. Inoculum was removed and replaced with fresh medium without compound. Cells were lysed 48 hpi in 50 µl of 1x Luciferase Lysis Buffer (Promega, Madison, UA) and luciferase activity was quantified in a Tristar LB 941 luminometer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) using luciferase Assay ystem (Promega) as recommended by the manufacturer. Immunofluorescent detection assay HCVcc, YFV and BVDV infected cells grown in 96-well plates were processed for immunofluorescence detection of viral proteins, as previously described (Rouillé et al., 2006). Nuclei were stained with 1 µg/ml of DAPI, and infected cells were detected by immunofluorescent labeling of E1 envelope glycoprotein (HCV), E envelope protein (YFV) and N3 protein (BVDV) followed by Cy3-conjugated anti-mouse secondary antibody. For BVDV and YFV infection assays, the plates were observed with an Axiophot microscope equipped with a 10X-magnification objective (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany). Fluorescent signals were collected with a Coolsnap E camera (Photometrix, Kew, Australia). Images of infected cells (Cy3 channel) and of nuclei (DAPI channel) present in 20 randomly picked areas from each well were recorded. The number of total cells and of infected cells were quantified using ImageJ software. For quantification of HCVcc infection, confocal images were 137

152 recorded with an automated confocal microscope IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare Life ciences) using a 20x objective with exposure parameters 405/450 nm and 561/610 nm. ix fields per well were recorded. Each image was then processed using the Colombus image analysis software (Perkin Elmer). Nuclei were first segmented and the cytoplasm region was extrapolated based on the DAPI staining. Objects with a specific and predefined size were defined as cells. The ratio of infected cells over total cells represents the infection rate. For each virus, the number of cells per well and MOI were determined in order to have 30 to 40% of infected cells in control experiments with no inhibitor. Infection rates in DMO controls were expressed as 100%. Determination of the half maximal effective concentration (EC50) of dehydrojuncusol Huh-7 cells were inoculated for 2h at 37 C with HCVcc and the inoculum was removed and replaced with culture medium for 28h at 37 C in the presence of increasing concentrations of dehydrojuncusol. Cells were fixed in iced-cold methanol and processed for immunofluorescent detection assay. EC50 values were calculated with Graph Pad Prism software (Version 5.0b). Viability Assay Huh-7 cells were plated in 96-well plates at a density of cells/well and then were incubated the next day in 100 μl of culture medium containing increasing concentrations of dehydrojuncusol for either 24, 48, or 72h. An MT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium]-based viability assay (Cell Titer 96 Aqueous non-radioactive cell proliferation assay, Promega) was realized as recommended by the manufacturer. The absorbance of formazan at 490 nm is detected using an ELIA plate reader (ELX 808 Bio-Tek Instruments Inc). Each measure was performed in triplicate. HCV replicons The plasmid pgr-jfh1 encoding a sub-genomic replicon of JFH-1 strain was obtained from Dr T Wakita (Kato et al., 2003). A BglII and an NsiI restriction sites were inserted between codons Pro419 and Leu420 of N5A, and the coding sequence of EGFP was then inserted between these two sites. This position was previously shown to accept a GFP insertion in a sub-genomic replicon of the CON-1 strain (Moradpour et al., 2004). To insert mutations in the replicon, the N5A coding sequence was amplified from pgr-jfh1-n5agfp plasmid by PCR with two primers: (1) 5 - GCCACATGCATGCAAGCTGA-3 and (2) 5 -TCGCCCCTTGCTCACAGATCT-3 and the 138

153 amplified D was purified. Then mutations Met31Leu (M31L) and Tyr93His (Y93H) were inserted independently by PCR using two primers, 5 -GCCCGGGCATCTTGGGGAAC-3 and 5 TTCCCCAAGATGCCCGGGCTCCCCTT-CATC-3 for M31L, and 5 - CCCTCCGTGTGGCAATTAATAGGAAAGGT-3 and 5 -TATTAATTGCCACACGGAGGG-3 for Y93H. Plasmid pgr-jfh1-n5agfp and PCR amplified D containing mutated sequences were digested with NsiI and BglII restriction enzymes, and PCR fragment inserted by ligation into the plasmid. All constructs were verified by sequencing. These plasmids were in vitro transcribed before electroporation into Huh-7 cells. Cells that express wild type and mutated replicons were selected for using 500 µg/ml of geneticin during 15 days and cultured in a medium containing 250 µg/ml of geneticin. Replication assay Huh-7 cells stably expressing wild type or mutated replicons were seeded in 24-well plates and incubated with the different compounds for 24h, 48h and 72h. They were lysed in ice cold lysis buffer (Tris HCl 50mM, NaCl 100 mm EDTA 2 mm Triton-100 1% D 0.1%) on ice for 20 min. Lysates were collected and 20 µg of proteins were analyzed by Western blotting using anti-n5a and anti-β tubulin antibodies. Peroxidase-conjugated goat anti-mouse secondary antibody (Jackson Immunoresearch) was used for the revelation using ECL western blotting substrate (Thermo Fischer cientific). Wild-type, L31M and Y93H replicon cell lines were seeded in 96-well plates and incubated with boceprevir, daclatasvir or methylene chloride partition at given concentration for 72h. Cells were fixed with PFA 3% for 30 min. The cells were counted by labeling of nuclei with DAPI (0.5 µg/ml). Number of GFP-positive cells was quantified with a Zeiss Axiophot 2 microscope equipped with a 40 /1.3 numerical aperture lens. Fluorescence signals were analyzed as described previously. election of dehydrojuncusol-resistant replicon and virus, and identification of resistance mutation To obtain JFH1 dehydrojuncusol-resistant mutants, supernatants of HCV-infected cells were serially passaged with increasing concentrations (10-50 µg/ml) of methylene chloride partition of J. maritimus rhizome extract. Total R was extracted, non-structural protein coding region (N2N5B) was amplified by reverse transcription-pcr and sequenced with specific primers. Mutations were identified by analysis of the D sequence compared to the initial and control passages in the 139

154 absence of compound. The identified mutations were reintroduced into replicon or JFH1 plasmids by PCR mutagenesis, and the plasmids were sequenced. tatistical Analysis The results were presented as means ± EM of three independent experiments performed in triplicate. The statistical test used is a Mann-Whitney non-parametric test (Test t) with a confidence interval of 95%. The data were analyzed using Graph Pad Prism (Version 5.0b) by comparisons between each treated group and untreated group (DMO control). Results Dehydrojuncusol present in the methylene chloride partition of J. maritimus rhizome extract is an inhibitor of a late step of HCV infection We have previously screened sixteen plant extracts from eight different Tunisian extremophile plants for the presence of antiviral compounds (ahli et al., in press). Our results demonstrated that stem, rhizome and flower extracts from Juncus maritimus, and stem and leaf extracts from ilene succulenta significantly decrease HCV infection. The strongest antiviral activity was observed for J. maritimus rhizome extract, a halophyte plant belonging to Juncaceae family. The methylene chloride partition of J. maritimus rhizome extract was the most active against HCV (ahli et al., in press). To go further in the characterization of antiviral activity and identify active compound(s) a bio-guided fractionation was performed. This partition was further fractionated in order to isolate two major phenanthrene derivatives (1 and 2). Their antiviral activity was determined. A time-addition assay was performed with the purified compounds added either only during virus inoculation or only post-inoculation or continuously during both steps. As shown in Figure 1A, compounds (1) and (2) were both active against HCV, compound (2) being the most active in the different conditions tested, co-addition, postinoculation and continuously during infection. Only compound (1) significantly decreased the number of cells (Figure 1B) showing limited cytotoxicity. Compounds (1) significantly inhibited HCV infection at the post-inoculation step, whereas compounds (2), was active both at inoculation and postinoculation steps. The compound (2) was the most active at the post-inoculation step with more than 95% inhibition of HCV infection. The chemical structures of the two major compounds were determined by comparison of their spectroscopic data (NMR and M) with literature values. Compounds 1 and 2 were identified as two known phenanthrene derivatives, respectively juncusol 140

155 (Della Greca et al., 1992) and dehydrojuncusol (arkar et al., 1988). (Figure 2A). The purity of these compounds was checked by UV-DAD (juncusol: 99.5%; dehydrojuncusol: 98.8%). As compound (2), dehydrojuncusol, was the most active, we decided to further analyze its antiviral activity. The antiviral effect of dehydrojuncusol was further examined by measuring HCV infectious titers. A dose-dependent decrease of the infectious titer was observed, with a 1-log10 decrease at 2.2 µm confirming its high anti-hcv capacity (Figure 2B). Time-addition assay of dehydrojuncusol was performed and confirmed that this compound was significantly more active during a post-inoculation step (Figure 2C). No effect of dehydrojuncusol was observed when cells were preincubated with the compound 2h before inoculation and when it was co-added with the virus. To measure the EC50, a dose-response inhibition experiment was then performed with Huh-7 cells incubated with increasing concentrations of dehydrojuncusol at different steps of the infection, either during inoculation, or postinoculation or continuously (Figure 2D). The results show that the EC50 of dehydrojuncusol was 1.35 µm when added continuously, 8.21 µm when added during inoculation, and 1.53 µm when added post-inoculation, confirming the major effect of the molecule at the post-inoculation step. The toxicity of the compound on Huh-7 cells was also tested in parallel at different time points, 24h, 48h, and 72h. The results showed that the cytotoxic concentration (CC50) of dehydrojuncusol was approximately 75.6 µm (Figure 2E), much higher than the active dose, yielding a selective index of 56. Taken together, these results showed that dehydrojuncusol inhibited predominantly a late step of HCV infectious cycle, most likely the replication, and, to a lesser extent, an early step of infection, potentially the entry step. Dehydrojuncusol inhibits replication of HCV and not entry As shown above, dehydrojuncusol seems to inhibit both early and late steps of HCV infection. To determine if the molecule is able to inhibit HCV entry, HCVpp expressing E1E2 envelope glycoprotein at their surface were produced and used to infect Huh-7 cells in the presence of dehydrojuncusol at different concentrations. Delphinidin at 50 µm, an inhibitor of HCV entry, was added as a control. A strong inhibition of HCVpp infection was observed with delphinidin. In contrast no effect of dehydrojuncusol on HCVpp entry was observed even at concentration up to 94.7 µm (Figure 3A). This result showed that dehydrojuncusol was not an inhibitor of HCV entry. To test the activity of dehydrojuncusol on replication independently of entry, Huh-7 cells stably expressing a HCV-replicon were used. This replicon, GR-JFH1-N5AGFP, expresses a GFP-tagged N5A. Due to some difficulties to purify enough dehydrojuncusol in sufficient quantity from J. maritimus extract to perform all the tests, the methylene chloride partition was used. The replicon cells were incubated with methylene chloride partition and lysed at different time points. Boceprevir, an 141

156 inhibitor of N3/4A protease and daclatasvir, an inhibitor of N5A protein, were used as controls. The activity of the molecules against HCV replication was determined by quantifying the expression of N5A-GFP protein by Western blots. As shown in Figure 3B, the expression of N5A-GFP was decreased in replicon cells incubated with boceprevir, daclatasvir and methylene chloride partition of J. maritimus, showing an inhibitory effect of dehydrojuncusol on HCV replication. Inhibition was observed at all time points, 24h, 48h and 72h of treatment, showing a rapid antiviral activity of methylene chloride partition. Taken together, these results showed that methylene chloride partition of J. maritimus and most likely dehydrojuncusol were inhibitors of HCV replication. Dehydrojuncusol has no effect on BVDV and YFV We tested the antiviral effect of the methylene chloride partition of J. maritimus, containing dehydrojuncusol, against two other members of the Flaviviridae family, YFV and BVDV, and, as shown in Figure 3C, after treatment with 10 µg/ml of J. maritimus methylene chloride partition, a concentration that significantly inhibit HCV infection, no significant decrease in infectivity was observed neither for YFV nor for BVDV. This result shows that dehydrojuncusol is not active against all the members of the Flaviviridae family. This suggested that it could target HCV protein(s) directly or a cellular factor specifically involved in HCV replication. Dehydrojuncusol inhibits HCV infection in PHH Primary human hepatocytes (PHH) are the unique human pre-clinical model available to test the activity of an inhibitor on HCV infection. A dose-response experiment was performed in PHH inoculated with JFH-1. PHH were infected during 72h and supernatants containing HCVpc were used to infect Huh-7 cells to measure infectious titers. As shown in Figure 4A, a dose-dependent decrease of HCV titer was observed with dehydrojuncusol showing that the molecule is able to inhibit HCV infection in PHH. Very interestingly, the EC50 of dehydrojuncusol in PHH is 1.14 µm, similar to the EC50 calculated in Huh-7 cells, 1.35 µm. The toxicity of the molecule in PHH was measured and the results presented in Figure 4B showed that dehydrojuncusol was not toxic in PHH at active concentrations. Dehydrojuncusol inhibits replication of HCV mutants resistant to N5A inhibitors ome patients treated with the newly approved DAA molecules targeting N5A or N5B become resistant to the therapy due to the apparition of HCV resistant mutants. Once present in patients, these 142

157 resistant mutants are very difficult to eliminate, particularly for the resistant mutants appearing after treatment with anti-n5a molecules, like daclatasvir, ledipasvir or ombitasvir. To determine if dehydrojuncusol could be active against HCV resistant mutants, we generated mutated replicon harboring point mutation L31M or Y93H. These two mutations conferred resistance to N5A targeting drugs, including daclatasvir, ledipasvir and ombitasvir, in patients infected with HCV of different genotypes, and are often associated with treatment failure (Pawlotsky, 2016; arrazin, 2016). Huh-7 cells harboring mutant replicons were incubated with methylene chloride partition of J. maritimus, containing dehydrojuncusol, and lysed after 72h of treatment. Daclatasvir and boceprevir, were used as controls. As shown in Figure 5A, in the L31M and Y93H replicon cell lysates, the N5A-GFP protein is detected after 72h of treatment with daclatasvir showing that the replicon are resistant to daclatasvir at 0.5 nm. When treated with boceprevir, N5A-GFP is not detected showing that the mutants are still sensitive to boceprevir, as expected. In cells expressing mutated replicon treated with methylene chloride partition at 10 µg/ml, N5A-GFP was not detected in the L31M mutant showing that dehydrojuncusol is able to inhibit resistant mutant replication. However, it was still detectable at lower level in the Y93H daclatasvir resistant mutant, showing that this mutant is partially resistant to dehydrojuncusol. To quantify this activity, a dose-response experiment was performed on replicon cells treated with either daclatasvir or dehydrojuncusol and the number of cells expressing N5A-GFP after 72h of treatment was quantified. As shown in Figure 5C, the L31M mutant was very sensitive to the dehydrojuncusol with an EC50 of 0.22 µm similar to wild-type 0.40 µm. As expected, the Y93H daclatasvir-resistant was less sensitive to dehydrojuncusol than the wild-type replicon, with an EC50 of 3.62 µm. However, the EC50 fold change was only of 9, much lower than the one observed with daclastasvir as observed in Figure 5B and which was calculated to be over 100 (Fridell et al., 2011). Mutants resistant to dehydrojuncusol In order to further investigate the mechanism of action of dehydrojuncusol, we selected partially resistant mutants to the methylene chloride partition of J. maritimus rhizome extract after 8 passages of JFH1 virus in Huh-7 cells in increasing concentration of compounds. We searched for mutations in HCV non-structural genes (N2 to N5B) and identified a double mutant in N5A, T24-L31M. These mutations were inserted in JFH1 by reverse genetic and the resistance of the viruses to dehydrojuncusol investigated in a dose-response study. Interestingly, this double mutation was already identified in ombistasvir resistant replicon of genotype 2a T24A(L31), as well as the single mutation T24A (Krishnan et al., 2015). Three mutants were obtained, JFH1 T24, L31M and T24-L31M. We also tested the daclatasvir resistant mutant Y93H as a control. As shown in Figure 6A, as expected, all the mutants were resistant to daclatasvir. However, double mutations T24-L31M seemed to confer a moderate resistance to dehydrojuncusol, similar to the one observed with JFH1 Y93H. The mutants 143

158 L31M is as sensitive as WT JFH1 to dehydrojuncusol, confirming the results obtained with the replicon (Figure 5C), as well as the T24 single mutant (data not shown). Taken together, these results seemed to demonstrate that (i) N5A is the target of dehydrojuncusol with three mutations in N5A that conferred partial resistance to this molecule (T24-L31M and Y93H), and (ii) all the HCV mutants resistant to daclatasvir could be inhibited by dehydrojuncusol. Discussion Plants are known to be an important source of numerous bioactive compounds (Newman and Cragg, 2012). Here, we highlighted the strong inhibition HCV replication in HCVcc system of a bioactive molecule, dehydrojuncusol, isolated from a J. maritimus rhizomes extract. More interestingly, we also showed that this natural product strongly inhibited the virus in PHH, which are the only human preclinical model for hepatitis C. Many different drugs are now available to cure hepatitis C, but in some patients, apparition of viral variants resistant to the treatment makes them difficult to cure, especially for N5A resistant mutants. Unfortunately, the sets of marketed molecules available are not efficient to cure such resistant viruses (Pawlotsky, 2016). In this work, we demonstrate that dehydrojuncusol has the capacity to inhibit N5A resistant mutants appearing in patients treated with anti-n5a inhibitors, L31M and Y93H, which are two major resistant variants appearing after treatment with N5A inhibitors daclatasvir, ledipasvir and ombitasvir (Pawlotsky, 2016; arrazin, 2016). These mutants are often associated with treatment failure. We tried to identified the viral target of dehydrojuncusol, and, quite surprisingly, it seemed to be N5A as 3 mutations (T24-L31M, Y93H) that conferred partial resistance to this compound were identified in this protein. The mutations T24-L31M should be linked because they did not confer resistance to dehydrojuncusol when present individually in JFH1. Unfortunately, in a mechanistic point of view, the resistance was partial and the target of dehydrojuncusol was not clearly identify even if all the mutations were located in the domain I of N5A. It could have been not easy to obtain mutants with high resistance to dehydrojuncusol because we used the methylene chloride partition of J. maritimus rhizome extracts to obtain the mutants, due to the difficulties to purify high amount of dehydrojuncusol needed for this experiment. This partition contained different compounds that may also have been active against HCV. As shown in Figure 1A, juncusol (compound 1) was also active but with an uncharacterized mechanism of action, and other minor compounds may also possessed an anti-hcv activity (data not shown). The complexity of the composition of the partition may have rendered the identification of dehydrojuncusol resistant mutants more difficult. However, the lack of complete resistance of the different mutants was also encouraging in a therapeutic point of view, 144

159 because it meant that dehydrojuncusol could be a molecule used for patients with treatment failure. Therefore, dehydrojuncusol or molecules derived from dehydrojuncusol might be of great interest in the future to cure patients with resistant variants and treatment failure. Furthermore, the present therapy is suboptimal for patients infected with HCV genotype 3a. It will be interesting to test the efficacy of dehydrojuncusol against HCVcc of genotype 3a. Unexpectedly for a replication inhibitor, dehydrojuncusol also inhibits HCV infection when it is added to the cells during virus contact and removed later on (Figure 2C and 2D). This ability to inhibit an early step of HCVcc infection is probably not due an inhibition of HCV entry as this molecule is not active on HCVpp (Figure 3A). It is likely that this effect results from dehydrojuncusol molecules that enter cells during viral inoculation, remain trapped inside the cells and are able to inhibit HCV replication afterwards. The EC50 of dehydrojuncusol is near 1 µm, both in HCVcc system and in PHH, a concentration relatively low for a natural product. This molecule might serve of a starting point for a study of structure activity relationships and drug design to increase its antiviral capacity and reduce its EC50. It is rare that a compound is as active in Huh-7 as in PHH. Its toxicity in Huh-7 cells is relatively low with a CC50 of approximately 75 µm, leading to a selective index of 56. imilarly, no toxicity was observed in PHH even at high concentration. Unfortunately, little is known about the bioavailability of this compound in animal models or in humans. More generally, few/no pharmacokinetics studies in-vivo or in humans of phenanthrene derivatives were reported. Natural phenanthrenes are an uncommon class of aromatic metabolites which in a biosynthetic point of view can originate from stilbene precursors and more rarely from diterpenoid precursors. These compounds are biosynthesized by a limited number of botanical families. Orchidaceae and Juncaceae are the main botanical families known to produce this kind of natural products (El-hamy et al., 2015; Kovács et al., 2008). 9,10-dihydrophenanthrenes and phenanthrenes showed a large panel of biological activities, including among others cytotoxicity, antimicrobial, spasmolytic and anti-inflammatory activities. However, this potential is not investigated sufficiently and not really exploited (Kovács et al., 2008). Concerning the antiviral activities of phenanthrene derivatives, a limited number of studies exist in the literature. ome phenanthrene derivatives isolated from Tamus communis (Dioscoreaceae) showed antiviral activity against two R enveloped virus: vesicular stomatitis virus (VV) and human rhinovirus serotype 1B (HRV 1B) (Aquino et al., 1991). o far, no antiviral activity was highlighted for dehydrojuncusol. Only a moderate anti-inflammatory activity has been shown for this natural product (Behery et al., 2007). J. maritimus is a perennial plant which thrives in particular on saline soils. In the framework of our study, this halophyte plant was collected in Tunisia, but J. maritimus is present worldwide in the coast line of many different areas, including several European countries such as France. Few traditional uses 145

160 are mentioned for this plant in Tunisia, with the exception of its use in making baskets and curtains. Its usage as an antiviral agent is a newopportunity for economic valorization of this plant. One of the disadvantages of our study is that the part of plant used is not renewable (rhizomes), so the chemical synthesis of dehydrojuncusol or a more active derivative could be an issue. It would be also interesting to search for dehydrojuncusol in other Juncus species and especially in parts of plant renewable, such as aerial parts. Interestingly, this phenanthrene derivative has been previously isolated from the aerial parts of Juncus species, such as J. acutus (Della Greca et al., 2002) and J. effusus (Wang et al., 2012), increasing its potential for its use in low income countries. In conclusion, we showed that dehydrojuncusol, an active compound present in J. maritimus rhizomes, was able to inhibit HCV replication in a dose dependent manner. Although it probably targeted N5A, it inhibited the replication of resistant viruses appearing in patients treated with anti-n5a inhibitors and responsible for treatment failure. This molecule should be further investigated for being able to be used in patients of developing countries or in patients resistant to therapy for whom re-treatments are envisaged. 146

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164 Legend to figures Figure 1. creening of compounds isolated from J. maritimus rhizome extract for anti-hcv activity. Huh-7 cells were inoculated with HCVcc for 2h either in the presence (+) or not (-) of isolated compounds at 10 µg/ml, or 50 µm EGCG, or 1 µm boceprevir. DMO was used as a control. Cells were further incubated in medium containing (+) or not (-) the compounds for 28h and cells were fixed. (A) Infectivity was measured by the use of immunofluorescence labeling of HCV E1 envelope protein, and by calculating the number of infected cells. Data are expressed as a percentage of values measured with DMO. Data are means of values obtained in 3 independent experiments performed in triplicate. Error bars represent standard error of the means (EM). (B) Nuclei were stained with DAPI to quantify the number of cells. 150

165 Figure 2. Dehydrojuncusol inhibits HCV infection in a dose dependent manner. (A) Chemical structure of juncusol (1) and dehydrojuncusol (2). (B) Huh-7 cells were infected with HCVcc in the presence of dehydrojuncusol at different concentrations. 48h post-infection, supernatants were collected and infectious titers measured serial dilutions of the supernatants and reinfection of naive Huh-7 cells. Ffu/ml were quantified after 48h (C) Time-addition assay. Dehydrojuncusol at 3.8 µm, delphinidin at 50 µm or boceprevir at 1 µm were added at different time points as indicated (+). Cells were either pre-incubated with the compounds for 2h, or compounds added during HCVcc inoculation (2h) or post inoculation (28h). Infectivity was measured by the use of immunofluorescence labeling of HCV E1 envelope protein, and by calculating the number of infected cells. (D) Huh-7 cells were 151

166 inoculated with HCVcc in the presence of increasing concentration of dehydrojuncusol either for 2h inoculation, 28h post-inoculation or continuously. Infectivity was measured by the use of immunofluorescence labeling of HCV E1 envelope protein, and by calculating the number of infected cells. (E) Huh-7 cells were cultured in the presence of given concentrations of dehydrojuncusol. The viability was monitored using an MT-based viability assay after 24h, 48h and 72h. Data are expressed as a ratio to control i.e. the condition without extracts. Data are means of values obtained in 3 independent experiments performed in triplicate. Error bars represent EM. Figure 3. Dehydrojuncusol inhibits HCV replication. (A) HCVpp were used to inoculate Huh-7 cells in the presence of dehydrojuncusol at indicated concentrations. Delphinidin at 50 µm was used as a control. 48h post-infection, cells were lysed and luciferase activity quantified. Data are expressed as a ratio to the DMO control (100%). (B) Established replicon GR-JFH1-N5AGFP Huh-7 cells were incubated for the indicated time with either 0.5 nm daclatasvir, 1 µm boceprevir, or 10 µg/ml of methylene chloride partition of J. maritimus. DMO was used as a control. Cells were lysed and 152

167 lysates subjected to D-PAGE followed by Western blot revelation of GFP and tubulin. (C) Huh-7 cells were inoculated with HCVcc, or YFV and MDBK cells with BVDV in the presence (+) or absence (-) of 10 µg/ml of methylene chloride partition of J. maritimus. Inoculum was removed and replaced with medium with (+) or without (-) 10 µg/ml of methylene chloride partition of J. maritimus. Cells were fixed and infection detected by immunofluorescence labeling of viral proteins. Data are means of values obtained in 3 independent experiments performed in triplicate. Error bars represent EM. Figure 4. Dehydrojuncusol inhibits HCV infection in PHH. PHH were inoculated with HCVcc in the presence of the indicated concentrations of dehydrojuncusol. (A) Infectious titers in culture supernatants were expressed as ratio to carrier control. (B) Cytotoxicity was expressed as a ratio to carrier control. Data are means (± EM) of 3 independent experiments performed in triplicate. 153

168 Figure 5. Dehydrojuncusol inhibits daclatasvir N5A resistant mutants. (A) Huh-7 cells stably expressing subgenomic replicon GR-JFH1-N5A wild-type or harboring L31M or Y93H mutation in N5A conferring resistance to daclatasvir were incubated for 72h either with 0.5 nm daclatasvir, 1 µm boceprevir, or 10 µg/ml of methylene chloride partition of J. maritimus. DMO was used as a control. 154

169 Cells were lysed and lysates subjected to D-PAGE followed by Western blot revelation of GFP and tubulin. (B)(C) Huh-7 cells stably expressing subgenomic replicon GR-JFH1-N5A wild-type or harboring L31M or Y93H mutation in N5A conferring resistance to daclatasvir were incubated for 72h with increasing concentrations of daclatasvir (B) or dehydrojuncusol (C). Cells were fixed and GFP positive cells, representing replication, quantified. Replication of subgenomic replicon was expressed as a ratio to carrier control DMO. Data are means of values obtained in 3 independent experiments performed in triplicate. Error bars represent EM. Figure 6. Double mutations T24-L31M and single mutation Y93H confer partial resistance to dehydrojuncusol. Huh-7 cells were inoculated with wild-type (WT) HCVcc or harboring different mutations, T24-L31M, L31M or Y93H in the presence of (A) daclatasvir or (B) dehydrojuncusol at different concentrations for 2h. Inoculum was removed and replaced with medium containing the different drugs at the same concentration for 28h. Cells were fixed and infection detected by immunofluorescence labeling of E1 envelope protein. Data are means of values obtained in 3 independent experiments performed in triplicate. Error bars represent EM. 155

170 III.2. Purification de composés minoritaires et analyse de leurs activités sur le virus de l hépatite C Dans l étude précédente, nous avons réussi à déterminer le composé responsable de l activité anti-hcv du sous-extrait dichlorométhane des rhizomes de J. maritimus (JMR-MC), le dehydrojuncusol, mais aussi de caractériser son activité. Nous avons également testé un autre dérivé phénanthrénique, le juncusol, qui était moins actif. En examinant le chromatogramme de JMR-MC à 256 nm, on distingue, en plus des pics du juncusol et du dehydrojuncusol, un 3ème pic majoritaire (III), qui englobe plusieurs composés très apolaires qui ont des polarités très proches. En raison de l activité remarquable du dehydrojuncusol et de la richesse de JMR-MC en métabolites secondaires, nous avons cherché à purifier et à tester ces molécules plus apolaires (pic III) (figure 32). Figure 32. Chromatogramme de JMR-MC (256 nm) La phase mobile : solvant A (eau à 0,01% d acide formique) ; solvant B (acétonitrile); Gradient utilisé : 10-38% B (0-30 min), 38% B (30-40 min), 38-45% B (40-45 min), 45-51% B (45-47 min), 51-95% B (47-48 min), 9598,8% B (48-62 min), 98,8-100% B (62-63 min). 156

171 III.2.1. Processus de purification des composés Dans le but de purifier les composés du pic (III), différentes techniques chromatographiques ont été combinées, la chromatographie de partage centrifuge (CPC) et la CLHP semipréparative et préparative. Pour les analyses par CPC, des systèmes de solvants biphasiques Arizona ont été utilisés. Le système Arizona X utilisé précédemment pour isoler le juncusol et le dehydrojuncusol, a été à nouveau utilisé pour purifier certains composés du pic III, ainsi que des composés minoritaires ayant des polarités proches de celle du juncusol. Un deuxième système de solvants a été déterminé, Arizona R, nécessaire pour la purification d autres composés du pic III. Pour toutes les analyses, les 2 phases (stationnaire et mobile) du système de solvants biphasique (Arizona X ou Arizona R), sont séparées et la colonne de CPC est remplie à un débit de 30 ml/min (500 rpm) avec 400 ml de la phase stationnaire. L'équilibration avec la phase mobile est faite à 1600 rpm avec un débit de 8 ml/min. L'échantillon est dissous dans un mélange des phases inférieure et supérieure (50:50) puis injecté à travers la boucle d injection dans le système. Des fractions de 8 ml sont collectées toutes les minutes puis l ensemble des fractions sont regroupées après analyse par CCM. L analyse par CPC utilisant le système Arizona R est réalisée en mode ascendant pendant 40 minutes, puis en mode descendant pour encore 20 minutes ; au terme de laquelle 12 fractions ont été obtenues (MCR1-MCR12). Pour la purification par le système Arizona X, l analyse par CPC est réalisée seulement en mode ascendant (30 minutes) où 15 fractions (MCX1 MCX15) ont été obtenues. Des purifications par CLHP semi-préparative et préparative ont ensuite été réalisées sur un certain nombre des fractions obtenues, en utilisant différents gradients. Pour toutes les analyses, la phase mobile utilisée est constituée de deux solvants (solvant A : eau à 0,01% d acide formique et solvant B : acétonitrile). Au final, 11 composés ont été isolés en plus du juncusol et du dehydrojuncusol. La figure 33 résume les stratégies mises en place pour purifier ces composés. 157

172 JMR-MC (1,45 g) CPC/ARIZO X Mode ascendant MCX (97,6 mg) MCX1 MCX 14 (71,7 mg) CLHP préparative (Gradient n 4) CLHP préparative (Gradient n 4) C8 C9 (20 mg) (18 mg) C7 C6 (3 mg) (2,5 mg) MCX 15 (150 mg) CLHP préparative C5 (2 mg) C4 C3 (4,8 mg) (5 mg) Juncusol (22,2 mg) Dehydrojuncusol (25,9 mg) JMR-MC (1,45 g) CPC/ARIZO R Mode descendant Mode ascendant MCR 6 (14,5 mg) MCR 4 (44,2 mg) MCR1 CLHP préparative (Gradient n 4) CLHP préparative sf8 (5,7 mg) sf6 (3 mg) MCR 8 sf1 C12 (2 mg) MCR 10 (19,4 mg) MCR 12 CLHP préparative (Gradient n 4) C13 (1,8 mg) CLHP semi-préparative C11 (2,4 mg) C10 (2,3 mg) Figure 33 : tratégie de purification des composés à partir de JMR-MC A partir de la CPC utilisant le système Arizona X, trois composés minoritaires, C3 (5 mg), C4 (4,8 mg) et C5 (2 mg), ayant des polarités proches de celle du juncusol, ont été isolés par CLHP préparative à partir de la fraction MCX15 (150 mg). Le gradient utilisé (G1) est : 1038% B (0-2 min), 38-45% B (2-8 min), 45-51% B (8-25 min), 51-96% B (25-29 min), 96100% B (29-30 min). D autre part, à partir de cette même CPC, nous avons réussi à purifier 4 composés (C6 à C9) parmi les composés très apolaires présents sous le pic III. C6 (2,5 mg) et C7 (3 mg) ont été isolés par CLHP préparative depuis les fractions MCX14 (71,7 mg), alors que les composés C8 (18 mg) et C9 (20 mg) ont été isolés à partir des fractions MCX12 et MCX13 rassemblées 158

173 (97,6 mg). Le gradient utilisé (G2) est : 10-40% B (0-2 min), 40-96% B (2-8 min), 96-96,1% B (8-29 min), 96,1-100% B (29-30 min). Quatre autres composés très apolaires présents sous le pic III (C10 à C13) ont été purifiés via la deuxième analyse par CPC (Arizona R). L analyse en mode ascendant a donné 7 fractions, dont MCR4 (44,2 mg) et MCRC10 (14,5 mg). C12 (2 mg) a été isolé par CLHP préparative depuis MCR10, alors que des séries d analyses par CLHP semi-préparative et préparative à partir MCR4 ont été nécessaires pour obtenir les composés C10 (2,3 mg) et C11 (2,4 mg). Le composé C13 (1,8 mg) a été isolé à partir de la fraction MCR10 (19,4 mg) obtenue suite au passage au mode descendant au cours de l analyse par CPC. Le gradient (G2) a été utilisé pour toutes les purifications par CLHP semi-préparative et préparative. III.2.2. Identification de certains des composés isolés Les composés purifiés ont ensuite été analysés pas spectroscopie de masse (HR-M) et par spectroscopie RMN. L analyse des données obtenues a permis de déterminer que certains sont des dérivés phénanthréniques (C3, C4, C6, C8 et C12), alors que d autres sont des triterpènes (C9, C10 et C11). Les structures de 3 phénanthrènes ont été complètement déterminées (C3, C4 et C8). L élucidation complète des structures des autres composés est en cours. L identification des composés C3, C4 et C8 a été réalisée par l analyse des données de la masse et de la RMN (Annexe 2) et la comparaison des resultants obtenus avec les données de la littérature (hima et al., 1991 ; Dellagreca et al., 1992). Il s agit de composés déjà identifiés chez différentes espèces de Juncus. Les composés C4 et C3 sont respectivement l effusol et son dérivé le dehydroeffusol. Le dehydroeffusol a déjà été identifié dans les parties aériennes de J. effusus (hima et al., 1991). On retrouve aussi l effusol dans cette plante, ainsi que dans d autres espèces de Juncus, notamment dans les parties aériennes de J. acutus et dans les rhizomes de J. subulatus (hima et al., 1991 ; Dellagreca et al., 1993 ; Dellagreca et al., 2004 ; Abdel-Mogib, 2001 ; Abdel-Razik et al., 2009). Le composé C8 est le juncunol. a présence a été signalée dans les parties aériennes de J. acutus et de J. effusus, ainsi que dans les rhizomes et les parties aériennes de J. roemerianus (arkar et al., 1988 ; Dellagreca et al., 2002 ; 2004 ; Abdel-Mogib, 2001 ; Abdel-Razik et al., 2009). Les structures chimiques de ces 3 dérivés phénanthréniques sont présentées dans la figure

174 CH2 CH2 CH2 6 OH a 5a HO 4a 8a 2 1 HO CH a 4a a OH 5 CH a HO 10 CH3 11 8a a 10 CH Effusol 8 3 8a 2 5a Dehydroeffusol Juncunol Figure 34. tructures chimiques des composés identifiées (JMR-MC) Le juncunol, ainsi que deux autres composés dont la détermination structurale est presque achevée (C12 et C10) ont été testé sur le virus de l hépatite C. Des analyses sont en cours pour déterminer des effets de l effusol et du dehydroeffusol sur le VHC. L ensemble de ces composés testés sont localisés dans le chromatogramme de JMR-MC (figure 35). Figure 35 : Localisation des composés purifiés sur le chromatogramme de JMR-MC (254 nm) La phase mobile : solvant A (eau à 0,01% d acide formique) ; solvant B (acétonitrile) ; Gradient utilisé : 10-38% B (0-30 min), 38% B (30-40 min), 38-45% B (40-45 min), 45-51% B (45-47 min), 51-95% B (47-48 min), 9598,8% B (48-62 min), 98,8-100% B (62-63 min). 160

175 III.2.3. Analyse de l activité de certains des composés purifiés sur le virus de l hépatite C (VHC) L effet des composés (juncunol, C10 et C12) sur l infection virale a été analysé de la même manière que pour le juncusol et le déhydrojuncusol (sous-chapitre III.1), et ceci en ajoutant les molécules aux cellules Huh-7 infectées par le VHC, à différents temps correspondants aux principales étapes du cycle viral du VHC : pendant l entrée du virus (uniquement lors de l'inoculation : co-addition), après inoculation (réplication), ou encore de façon continue (post- Dehydrojuncusol Juncunol C10 Continu Réplication Entrée Continu Réplication Entrée Continu Réplication Entrée Continu Réplication Entrée BOC EGCG DMO Infection relative (%) inoculation). Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 36. C12 Figure 36. Effets des composés (juncunol, C10 et C12) sur l inhibition des 3 étapes principales du cycle du VHC, en comparaison avec le dehydrojuncusol Les résultats montrent que le dehydrojuncusol détient toujours la place de l inhibiteur le plus efficace sur la réplication du VHC. En revanche, C12, a montré une activité fort intéressante sur l entrée du VHC, qui est supérieure à celle de l 'épigallocatéchine gallate (EGCG), un inhibiteur de l entrée du VHC (respectivement 16,60% et 25,82%). Le juncunol, ainsi que le triterpène C10 n étaient pas actifs sur les trois étapes du cycle viral du VHC (infection relative >50 %). 161

176 Des essais ont été initiés pour évaluer les activités de l effusol et du dehydroeffusol sur le VHC. Les résultats préliminaires sur les activités de ces 2 composés pendent l étape de postinnoculation (continu) ont montré des résultats intéressants, et en particulier pour l effusol. Le sous-extrait dichlorométhane des rhizomes de J. maritimus semble être un réservoir de molécules actives sur l inhibition du VHC, et qui mérite donc d être analyser d avantage, notamment d achever l identification des composés dont la structure n est pas entièrement déterminée, en particulier pour C12, et de caractériser leurs activités ou potentiels effets sur l inhibition du VHC. III.3. Fractionnement bioguidé du sous-extrait responsable de l activité antibactérienne de J. maritimus et détermination des composés les plus actifs L extrait des rhizomes de J. maritimus (JMR-CE) s est aussi distingué par son potentiel antibactérien sélectif envers certaines souches bactériennes à Gram-positif (particulièrement treptococcus dysgalactiae T46C14 : CMI = 78 µg/ml). Les sous-extraits obtenus par extraction liquide-liquide de JMR-CE (JMR-MC, JMR-EA et JMR-H2O) ont également été analysés sur la collection de 36 souches de bactéries à Gram + et -, montrant que JMR-MC est principalement responsable de cette activité (particulièrement actif contre treptococcus dysgalactiae T46C14, CMI = 39 µg/ml) (cf chapitre I). III.3.1. Analyse de l activité antibactérienne sur une nouvelle collection de bactéries à Gram positif Dans cette étude menée au sein du Laboratoire de bactériologie (INERM U995, collaboration avec le Dr C. Neut), j ai réalisé un deuxième criblage de l activité antibactérienne des 3 sous-extraits JMR-MC, JMR-EA et JMR-H2O, ainsi que de l extrait brut (JMR-CE), en utilisant une nouvelle collection de bactéries composée uniquement de bactéries à Gram + (majoritairement des souches de staphylocoques et de streptocoques) et comprenant les souches sur lesquelles JMR-MC était initialement actif (Annexe 3). L extrait brut et les sous-extraits ont été testés aux concentrations suivantes : 1250 ; 625 ; 312 ; 156 ; 78 et 39 µg/ml. Le tableau 6 précise les concentrations minimales inhibitrices (CMI) mesurées pour les extraits actifs et ne présente que les souches qui ont montré une certaine sensibilité. 162

177 Tableau 6 : CMI (µg/ml) des sous extraits de JMR-CE, qui sont actifs sur les souches bactériennes (Gram +) JMR-CE Corynebacterium T27.17 taphylococcus aureus CIP224 taphylococcus aureus 8147 taphylococcus aureus 8146 taphylococcus aureus T28.1 taphylococcus aureus T47.A12 taphylococcus epidermidis T30.1 treptococcus agalactiae T25-7 treptococcus agalactiae T53C2 treptococcus agalactiae T38-2 treptococcus agalactiae T40A2 treptococcus agalactiae treptococcus agalactiae treptococcus dysgalactiae T46C14 treptococcus pyogenes N.A N.A N.A N.A N.A N.A JMR-MC JMR-EA N.A N.A N.A N.A N.A N.A N.A JMR-CE : Juncus maritimus rhizome-extrait brut ; JMR-MC : J. maritimus-sous-extrait dichlorométhane ; JMR-EA : J. maritimus-sousextrait acetate d éthyle. (JMR-H2O : sous-extrait aqueux, non actif car a montré des CMI > 1000 µg/ml pour toutes les souches testées). CMI (µg/ml) de l extrait brut et des sous-extraits : CMI < 100 µg/ml : activité élevée ; 100 µg/ml < CMI < 500 µg/ml : activité modérée ; 500 µg/ml < CMI < 1000 µg/ml : activité faible ; MIC 1000 µg/ml : n est plus considéré actif (). JMR-CE montre toujours une activité élevée contre treptococcus dysgalactiae T46C14, mais aussi sur une nouvelle souche, treptococcus pyogenes JMR-MC et JMR-EA ont montré des activités contre différentes souches de staphylocoques et de streptocoques alors que le sous-extrait aqueux n a montré aucune activité sur l ensemble des bactéries testées (CMI > 1000 µg/ml). JMR-EA a montré un spectre d activité plus large que celui de JMRMC mais une activité globalement plus faible (CMI = 625 µg/ml pour la majorité des souches testées). Les activités les plus élevées ont été enregistrées pour JMR-MC. Ce sousextrait se trouve le plus actif sur. dysgalactiae T46C14 et. pyogenes (CMI égales à 39 µg/ml), souches sur lesquelles l extrait brut a montré les activités les plus élevées. III.3.2. Détermination de la CMB du sous-extrait le plus actif sur les souches treptococcus dysgalactiae T46C14 et treptococcus pyogenes Nous avons voulu déterminer la concentration minimale bactéricide (CMB) de JMR-MC sur. dysgalactiae T46C14 et. pyogenes par la méthode de dilution en milieu liquide, en utilisant des plaques 96 puits. 163

178 Un échantillon de JMR-MC a été préparé à 10 concentrations (625-1 µg/ml) dans des tubes eppendorfs. Les puits utilisés sont d abord chargés par 100 µl de milieu liquide, puis, 10 µl de chaque dilution de JMR-MC sont déposés dans les puits (1-10). Enfin, la suspension bactérienne déjà incubée pendant 24h dans du milieu liquide est directement chargée dans tous les puits utilisés à raison de 10 µl (figure 37). Après un temps d incubation de 24h à 37 C, la détermination de la CMI se fait visuellement. Pour déterminer la CMB, 100 µl sont prélevés du puits contenant le mélange à la CMI, ainsi que de deux autres puits contenant le mélange à des concentrations inférieures. Ces prélèvements sont ensemencés sur des milieux de culture solide. La concentration à laquelle il n y a aucune croissance bactérienne correspond donc à la CMB. C1 : 625 µg.ml C12 : 1 µg.ml ouche bactérienne Témoin solvant Témoin stérilité Témoin culture Figure 37 : chéma de la plaque utilisé pour les essais contre. dysgalactiae et. pyogenes Les multiples essais réalisés sur. dysgalactiae T46C14 n ont pas été concluants. Les CMI obtenues sont très différentes de celles obtenues lors du test de criblage sur les 36 souches avec une très grande variabilité des CMI et des CMB selon les expériences. Ceci est probablement dû à une certaine sensibilité de la souche au méthanol en milieu liquide, solvant utilisé pour solubiliser le sous-extrait JMR-MC qui n est pas bien soluble dans l eau ou dans le DMO. Ces essais ont ainsi été abandonnés. Par contre, les essais sur. pyogenes se sont montrés beaucoup plus reproductibles, avec les mêmes CMI que celles obtenues lors du 164

179 test de criblage sur les 36 souches (CMI = 39 µg/ml et CMB = 156 µg/ml). Nous nous sommes donc concentrés sur l étude de l activité antibactérienne de JMR-MC contre. pyogenes III.3.3. Détermination de la CMB du sous-extrait le plus actif sur d autres souches de. pyogenes Plusieurs souches de. pyogenes étant disponibles au Laboratoire de bactériologie, nous avons testé l activité antibactérienne de JMR-MC sur ces souches par la même méthode de dilution en milieu liquide, comme détaillée précédemment, pour déterminer les CMI et CMB. L amoxicilline a été utilisée comme témoin positif (64-0,5 µg/ml). Les résultats sont détaillés dans le tableau 7. Tableau 7 : CMI et CMB (µg/ml) observées pour JMR-MC contre 8 souches de. pyogenes treptococcus pyogenessouches CMI JMR-MC CMB CMB/CMI Amox. R R R R R R R R CMI (µg/ml) de l extrait brut et des sous-extraits : CMI < 100 µg/ml : activité élevée ; 100 µg/ml < CMI < 500 µg/ml : activité modérée ; 500 µg/ml < CMI < 1000 µg/ml : activité faible ; CMI 1000 µg/ml : n est pas considéré actif (). CMB/CMI 4 : bactéricide ; CMB/CMI > 4 : bactériostatique. Amox. Amoxicilline, : 4, R : > 16 ; R : résistante ; : sensible. JMR-MC est bactéricide et montre des activités élevées sur toutes les souches de. pyogenes testées, avec l activité la plus élevée notée contre. pyogenes (CMI = 19 µg/ml et CMB = 39 µg/ml). Nous avons donc cherché à localiser les composés responsables des activités de JMR-MC. 165

180 III.3.4. Localisation des composés potentiellement actifs sur. pyogenes Pour localiser les composés responsables de l activité antibactérienne, nous avons effectué des analyses par bioautographie. Cependant, les différentes tentatives réalisées n ont pas été fructueuses dans la mesure où la visualisation des zones d inhibition n était pas facile. En effet, les souches testées ne semblent pas avoir bien poussées sur la gélose en contact avec la plaque CCM et n ont donc pas pu bien réagir avec les composés ayant migré sur la plaque. Les tentatives d optimisation du protocole (ajout du sang dans le milieu) n ont pas fonctionné. Nous avons été notamment confronté à un manque de reproductibilité des expériences ; le rapport frontal des composés localisés comme étant actifs changeant d une expérience à une autre (Annexes 4). Nous avons donc testé directement les composés purifiés de JMR-MC et identifiés au cours de l étude précédente. III.3.5. Analyse de l activité antibactérienne des composés purifiés sur. pyogenes Nous avons testé l activité antibactérienne sur. pyogenes des dérivés phénanthréniques précédemment identifiés : juncusol, dehydrojuncusol, dehydroeffusol, effusol et juncunol, et ceci par la même méthode de dilution en milieu liquide détaillée précédemment (concentrations : 312-0,14 µg/ml). Nous n avons pas pu tester les composés C12 et C10 analysés dans l étude précédente (VHC), car ils ont été isolés en trop faibles quantités. De plus, l élucidation structurale de ces composés n est pas encore achevée. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 8. Tableau 8 : CMI et CMB (en µg/ml) enregistrées pour les composés testés sur. pyogenes16135 Composés Juncusol Dehydrojuncusol Dehydroeffusol Effusol Juncunol CMI 156 >312 >312 > CMB 312 >312 >312 > CMB/CMI 2 NC NC NC 2 CMI (µg/ml) de l extrait brut et des sous-extraits : CMI < 100 µg/ml : activité élevée ; 100 µg/ml < CMI < 500 µg/ml : activité modérée ; 500 µg/ml < CMI < 1000 µg/ml : activité faible ; MIC 1000 µg/ml : n est pas considéré actif. NC, non calculé. CMB/CMI 4 : bactéricide ; CMB/CMI > 4 : bactériostatique. 166

181 Parmi les composés testés, seuls deux produits ont montré des activités intéressantes, le juncusol, avec une activité modérée (100 µg/ml < CMI < 500 µg/ml), mais surtout le juncunol, qui a montré l activité la plus élevée, similaire à celle de JMR-MC (CMI = 19 µg/ml). Le juncunol serait donc en partie responsable de l activité antibactérienne observée pour JMR-MC. Aucune étude n a été trouvée dans la littérature concernant l analyse de son activité antibactérienne. Il serait donc intéressant d étudier davantage l activité du juncunol contre les souches de. pyogenes. Par ailleurs, d autres composés isolés de JMR-MC pourraient avoir des activités plus élevées. L identification et l évaluation de l activité antibactérienne des autres composés purifiés pourraient aider à mieux comprendre l activité antibactérienne de JMR-MC. 167

182 IV. Exploration des effets des plantes halophytes et xérophytes sur la santé du végétal, l exemple de la septoriose du blé Dans un premier travail de criblage, nous nous sommes intéressés aux bénéfices que peuvent apporter les plantes halophytes et xérophytes en santé humaine. En raison de leurs activités antimicrobiennes intéressantes et d une collaboration avec l IA au sein de l Institut Charles Viollette (Prof. Patrice Halama et Dr Ali iah), nous nous sommes intéressés aux propriétés antifongiques que peuvent avoir les 8 plantes extrêmophiles étudiées (Atractylis serratuloides, Cirsium scabrum, cabiosa maritima, Limonium virgatum, Juncus maritimus, ilene succulenta, Atriplex tatarica et Aeluropus littoralis), en particulier contre Zymoseptoria tritici, un pathogène fongique qui attaque les cultures de blé provoquant la maladie de la septoriose. A l égard du potentiel antimicrobien remarquable de l extrait des rhizomes de J. maritimus (cf chapitre III), et en prenant en compte la variabilité des écosystèmes salins que peut occuper cette halophyte (marais, sebkhas, ), une exploration des effets édaphiques, mais également des effets physiologiques, sur les potentielles activités antifongiques de cette plante contre Zymoseptoria tritici a été initiée. Les extraits méthanoliques préparés à partir d organes des 8 plantes extrêmophiles étudiées ont donc été testés sur Zymoseptoria tritici. A ce criblage, un deuxième extrait des rhizomes de J. maritimus a été intégré, nommé JMR1, pour faire la distinction avec l extrait des rhizomes de la même plante utilisé initialement dans ce travail de thèse (ici nommé JMR0). L échantillon des rhizomes de JMR1 a été collecté sur un substrat à tendance marneux et durant la période de floraison, contrairement à JMR0 étant collecté sur un substrat plutôt sableux/marneux et durant la période de maturation des graines. Les essais antifongiques ont été réalisés en utilisant des boites de pétri coulées par de la gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA) mélangée aux extraits (1250 µg/ml) et ensemencée par une souche de Z. tritici (5x105 spores/ml). Curieusement, l activité la plus élevée sur Z. tritici a été enregistrée pour JMR1, parmi l ensemble des extraits testés, y compris JMR0 qui a montré un effet significativement moins important de celui de JMR1. Cette différence d'activité entre JMR0 et JMR1 rend compte de l influence du stade physiologique ou de l endroit dans le quel se développent les rhizomes de la plante. En vue de vérifier ces hypothèses, six nouveaux échantillons de rhizomes de J. 168

183 maritimus (JMR2 à JMR7), ont été collectés en faisant varier différents paramètres, soient l endroit, le stade physiologique, mais également l année de collecte (tableau 9). Tableau 9. Conditions de collectes des échantillons de rhizomes de Juncus maritimus (JMR2 à JMR7) Année tade physiologique Endroit JMR Maturation des graines ite (1) de collecte de JMR0 (sableux / marneux) JMR Maturation des graines ite 3 (sableux) JMR Maturation des graines ite 4 (sebkha) JMR Maturation des graines ite (2) de collecte de JMR1 (marneux) JMR Floraison ite (2) de collecte de JMR1 (marneux) JMR Maturation des graines ite (1) de collecte de JMR0 (sableux / marneux) Des extraits méthanoliques ont alors été préparés à partir de ces échantillons puis testés sur Z. tritici. Les résultats indiquent initialement que l activité antifongique des rhizomes de J. maritimus sur Z. tritici ne semble pas varier le long des années. En effet, JMR2 et JMR7, collectés sur 2 années, à partir du même endroit et durant le même stade physiologique, ont montré des activités similaires, ayant un faible effet sur la croissance de Z. tritici. Le stade physiologique, également, semble avoir peu d influence sur le potentiel antifongique des rhizomes de J. maritimus. Ceci a été déterminé en comparant les activités de JMR6 et JMR7 sur Z. tritici. Ces échantillons collectés au même endroit et à la même année, mais à différents stades physiologiques, ont en effet, des activités antifongiques similaires, avec peu d effets sur la croissance de Z. tritici. En contre partie, les extraits des autres échantillons (JMR2 - JMR5), collectés durant la même année et au même stade physiologique, mais à des endroits différents, ont montré des activités significativement différentes sur Z. tritici. On peut suggérer donc que l activité des rhizomes de J. maritimus serait plutôt influencée par le milieu. JMR3 et JMR4 se sont distingués des autres extraits par les activités les plus élevées, avec un maximum enregistré pour JMR4 (la croissance est complètement inhibée à la concentration testée, 1250 µg/ml). Cet extrait a été élaboré à partir de rhizomes poussant dans un bassin occupant le fond d'une dépression à forte salinité (ebkhat Ariana). Afin de comprendre ces différences d activités antifongiques, une analyse des extraits (JMR2-JMR7) par CLHP-DAD a d abord été réalisée. 169

184 La comparaison des profils chromatographiques de l ensemble des extraits a montré que les chromatogrammes des extraits les plus actifs, JMR3 et JMR4, sont différents des autres. Une série de composés moyennement polaires (tr = 10 à 35 minutes) est détectée dans le chromatogramme de JMR3 avec des intensités plus élevées que dans les autres chromatogrammes. Le chromatogramme de JMR4 quant à lui, se distingue par la présence d un pic (tr = 38 minutes) qui est très faiblement détecté dans les autres extraits. Un fractionnement bioguidé a donc été initié pour ces deux extraits par extraction liquide-liquide. Les sous-extraits obtenus, dichlorométhane (JMR3-MC et JMR4-MC), acétate d éthyle (JMR3-EA et JMR4-EA) et aqueux (JMR3-W et JMR4-W) ont été analysés au moyen du même test d activité antifongique, mais en utilisant une gamme de concentrations pour déterminer les CMI et les CI50. Les résultats obtenus ont montré que JMR3-EA, qui renferme majoritairement la série des composés (tr = 10 à 35 minutes) susceptibles d être responsables de l activité de JMR3, n est pas le plus actif (CI50 = 479,64 µg/ml) parmi les sous-extraits de JMR3. Les sous-extraits de JMR4 ont montré les activités les plus élevées avec un maximum enregistré pour JMR4-MC (CI50 = 26,55 µg/ml). La comparaison des chromatogrammes des sous-extraits de JMR4 (JMR4-MC, JMR4-EA et JMR4-W) a révélé que le composé à tr = 38 min, nommé JMR4-MC-1, est principalement présent dans JMR4-MC. Nous avons donc isolé ce composé directement par CLHP préparative (JMR4-MC-1 = 9 mg). L analyse des données RMN 1D et 2D de JMR4-MC-1 puis la comparaison de ces données avec celles rapportées dans la littérature a permis de déterminer qu il s agit de l effusol (hima et al., 1991), un des phénanthrènes isolés à partir de JMR0 (CPC et CLHP préparative) au courant des études précédentes (chapitre III.2). Par la suite, nous avons voulu vérifier si l effusol est responsable de l activité de JMR4. L évaluation de l activité antifongique de l effusol sur Z. tritici a montré qu il est très actif (CMI =19 µg/ml et CI50 = 9,98 µg/ml). Pour le confirmer, une fraction de JMR4-MC sans l effusol a également été testée. Celle-ci n a montré aucune activité sur Z. tritici (CMI > 312 μg.ml). L effusol semble donc être le composé principalement responsable de l activité antifongique de JMR4. Il n y a pas d études sur l'activité antifongique de l'effusol dans la littérature, d où l intérêt de poursuivre cette étude pour caractériser le mécanisme d action de l effusol sur Z. tritici, mais aussi de contribuer à la compréhension de l effet de la salinité sur le changement du profil chimique chez les halophytes. 170

185 Contribution personnelle. Cette étude a abouti suite à un grand travail de recherche et d investigation de plusieurs terrains en Tunisie où j ai sélectionné différents spécimens de J. maritimus représentatifs de différentes conditions édaphiques et physiologiues. J ai aussi collecté les échantillons en quantités et réalisé le travail d extraction, y compris la préparation des échantillons (broyage, séchage) ainsi que la préparation des extraits. Les autres contributions que j ai apportées concernent la réalisation des tests d activités antifongiques, mais aussi le travail de fractionnement et de purification des molécules, notamment la réalisation des extractions liquide-liquide, et la purification de l effusol directement par CLHP préparative. 171

186 Biocontrol activity of effusol from the extremophile plant, Juncus maritimus, against the wheat pathogen Zymoseptoria tritici Ramla ahli1,2, Céline Rivière1*, Ali iah3, Abderrazak maoui2, Jennifer amaillie1, Thierry Hennebelle1, Vincent Roumy1, Riadh Ksouri2, Patrice Halama3, evser ahpaz1 1 Univ. Lille, INRA, IA, Univ. Artois, Univ. Littoral Côte d Opale, EA 7394 ICV, Institut Charles Viollette, F Lille, France 2 The Laboratory of Aromatic and Medicinal Plants, Biotechnology Centre of Borj-Cédria (CBBC), Hammam-lif, Tunisia; 3 IA, INRA, Univ. Artois, Univ. Lille, Univ. Littoral Côte d Opale, EA 7394 ICV, Institut Charles Viollette, F Lille, France Corresponding author: Céline Rivière celine.riviere-3@univ-lille2.fr Phone number:

187 Abstract Zymoseptoria tritici, responsible for eptoria tritici blotch, is the most important pathogen of wheat. The control of this parasite relies mainly on synthetic fungicides, but their use is increasingly controversial and searching for alternative management strategies is encouraged. In this context, the biocontrol potential of crude methanolic extracts of eight extremophile plant species from Tunisia, including three xerophytes and five halophytes, against Z. tritici was assessed. Only the extract of Juncus maritimus rhizomes showed significant in vitro antifungal activity. In extremophile plants, the production of secondary metabolites is often influenced by abiotic conditions. Thus, we collected several samples of J. maritimus rhizomes at different vegetative stages, at different periods and from different substrates to compare their antifungal activities. Our results suggest that the plant environment, especially the substrate of the soil, should be taken into account to identify great sources of natural antifungal products. From the most active sample, a 9,10-dehydrophenanthrene derivative, effusol, absent from other J. maritimus rhizomes extracts, was purified. This product showed a strong antifungal activity against the pathogen, with a MIC of 19 µg/ml and an IC 50 of 9.98 µg/ml. This phenanthrene derivative could be a promising biocontrol molecule against Z. tritici. Keywords: Zymoseptoria tritici, Wheat, Biofungicides, Extremophile plants, Juncus maritimus, effusol 173

188 Introduction Wheat is the most widely grown crop in the world. Within the European Union, wheat advanced from its world position of second most important food crop (after rice) to the status of the most important cereal (Fones and Gurr 2015). Pests and pathogens constitute a serious and persistent challenge to the wheat industry. Among pathogens of wheat, Zymoseptoria tritici (anamorph: Mycosphaerella graminicola), causing eptoria tritici blotch (TB), is the most frequently occurring one, inducing up to 50% yield losses (Ponomarenko et al. 2011). Pathogen control relies mainly on the use of conventional synthetic fungicides such as demethylation inhibitors (DMIs) and succinate dehydrogenase inhibitors (DHIs), and at lesser extent the deployment of partially-resistant wheat cultivars. However, the wide use of some products because of their strong protection efficacy led to (i) an emergence and widespread of resistant strains towards several fungicide families including quinone outside inhibitors (QoI) and to (ii) a frequent overcoming of plant host resistance (Cowger et al. 2000; Cheval et al. 2017). Besides, there is a growing public concern about the potential negative impact of chemical fungicides on both the environment and human health. Over the last decade, many pesticides were removed from the market. Changes in the regulatory processes within the European Union are also expected to curtail the availability of effective fungicides (Jess et al. 2014). Hence, looking for alternative control strategies is strongly encouraged, especially in Europe, where several national action plans were set up to reduce the use of conventional pesticides (Ravensberg et al. 2015). Biocontrol products are considered as one of the most promising save and eco-friendly plant protection tools. Currently, biofungicides hold just 5% of the worldwide crop protection market (approx. $3 billion/year), but this segment of the industry is growing and it is projected to increase by 8.84% annually, reaching more than 7% of the total crop protection market by 2025 (more than $4.5 billion/year) (Olson 2015). Biological control agents include 174

189 living microorganisms or their metabolites, but also extracts and compounds from plants that have the ability to alter the pathogen development (Ravensberg et al. 2015). Extremophile plants are a good example of this kind of plants. Unlike other vascular plants, they are able to thrive under severe environmental constraints (salinity, drought, light stress, extreme temperatures, etc.). uch potential was associated to their ability to resist to pathogens infections, as many extremophile plants were proven to possess antimicrobial activity (Ksouri et al. 2012). Today, there is a growing demand for new sources of biocontrol agents, since only few active substances of such products are available in the market. For instance, in France, only laminarin (Vacciplant, Goëmar, France), a low-molecular-weight polysaccharide, is registered as plant resistance inducer on wheat against Z. tritici, despite the strong significance of this pathogen. However, a range of microbial-derived products belonging to a wide range of genera, including for example Bacillus species, are available for management of plant diseases in organic agriculture (Dayan et al. 2009). Natural compounds discovered from plants are less encountered. ome marketed biofungicides are formulated with essential oils, but their mode of action against individual plant pathogens are largely unknown (Dayan et al. 2009). The most studied plant extract for induced resistance is probably an extract of the giant knotweed Reynoutria sachalinensis (F. chmidt) Nakai (Polygonaceae), which is the main ingredient of a marketed fungicide (MilsanaTM) effective against a wide spectrum of plant diseases (Dayan et al. 2009). Baysal-Gurel and Muiller (2015) confirmed the protective effect of a new formulation of R. sachalinensis extract marketed as Regalia by Marrone Bio Innovations (Davis, CA, UA) on greenhouse produced tomato against powdery mildew (iah et al. in press). The objective of the present study was to assess the biofungicide potential of extracts from eight extremophile plants, including three xerophytes and five halophytes, against Z. tritici. 175

190 Different parts of these plants were collected and crude methanolic extracts were prepared and assessed for in vitro activity against the pathogen. The rhizomes of the most active plant, Juncus maritimus, were thereafter collected at different vegetative stages, at different periods and from different substrates to compare their antifungal activity. From the most active J. maritimus sample, HPLC-UV analyses highlighted the presence of a peak not detected in other samples, corresponding to effusol. Further investigations revealed that this biomolecule was responsible for the observed activity against Z. tritici. Materials and methods Plant collection and identification Xerophyte plants (Cirsium scabrum Bonnet & Baratte, Asteraceae, and cabiosa maritima L., Caprifoliaceae) were collected in August 2013, in North Tunisia, and in February 2013, in outh Tunisia (Atractylis serratuloides ieber ex Cass. (Asteraceae). Halophyte plants (Aeluropus littoralis (Gouan) Parl., Poaceae; Atriplex tatarica Aellen, Amaranthaceae; Juncus maritimus Lam., Juncaceae (JMR0); Limonium virgatum Fourr., Plumbaginaceae; ilene succulenta Forssk., Caryophyllaceae) were collected in eptember-october 2013 from a coastal region of north-eastern part of Tunisia (oliman beach, marly-sandy soil). In addition, rhizomes of the halophyte plant J. maritimus (JMR1) were collected at a different period (flowering stage, March 2014) and from a different substrate (oliman beach, marly soil). All plants were identified at the Biotechnology Centre of Borj -Cédria by Dr Abderrazak maoui. Voucher numbers are indicated in brackets: Atractylis serratuloides (167), Cirsium scabrum (181), cabiosa maritima (182), ilene succulenta (183), Juncus maritimus JMR0 (184), Limonium virgatum (185), Atriplex tatarica (186), Aeluropus littoralis (187), Juncus maritimus JMR1 (192). Furthermore, new rhizomes of J. maritimus (JMR2 to JMR7) were 176

191 collected in October 2014 and March or October 2015 take into consideration three different abiotic parameters (year of collection, vegetative stage and substrate) (Table 1). Plant extract preparation Collected plant materials were dried at 25 C for one week. Different parts of some of these plants were powdered separately as detailed as follows: Limonium virgatum (leaves (137g) and stems (167.2g)); Juncus maritimus (flowers (92.4g), stems (217.1g) and rhizomes (40.5g)); cabiosa maritima (flowers (156.8g), leaves (46.7g) and stems (273.9g)); Cirsium scabrum (flowers (243.9g), leaves (310.8g) and stems (141.1g)); ilene succulenta (leaves (107.5g) and stems (81g)). In case of other species, the entire plant was powdered (Aeluropus littoralis (111.3g), Atractylis serratuloides (99g) and Atriplex tartarica (97.3g)). The dried and powdered parts were then extracted three times (3 x 48 h) by maceration with methanol at room temperature (15 ml g-1). After filtration and removal of methanol in vacuo at 35 C, the extracts were suspended in water and lyophilized: A. littoralis (AL = 9.34%); A. serratuloides (A = 7.63%); Atriplex tartarica (AT = 14.23%); Cirsium scabrum flowers (CF = 6.13%), leaves (CL = 12.12%) and stems (C = 9.33%); J. maritimus (JMR0) flowers (JMF = 7.33%), stems (JM = 12.65%) and rhizomes (JMR = 12.53%); J. maritimus (JMR1) rhizomes (JMR1 = 14.84% ); L. virgatum leaves (LVL = 19.39%) and stems (LV = 17.85%);. maritima flowers (MF = 3.28%), leaves (ML = 7.65%) and stems (M = 2.32%);. succulenta leaves (L = 23.73%) and stems ( = 10.76%). Juncus maritimus rhizomes (JMR2-JMR7) were dried at 25 C for one week. Dried rhizomes were powdered and extracted by maceration with methanol (24 h) at room temperature (15 ml g-1) using a double-arm agitator pattern. Extracts were then filtered and dried in vacuo at 35 C. 177

192 Phytochemical analyses HPLC analysis of crude J. maritimus extracts HPLC-UV analysis of the plant extracts were carried out using a himadzu binary LC-10A pump, acl-10a UV-visible detector and a VisionHT Basic C18 (5 µm, 250 x 4 mm) column (Grace, Epernon, France). Twenty microliters of samples (10 mg.ml-1 of plant extract solution in MeOH) were injected and the flow rate was set at 1 ml/min at room temperature. The mobile phase was composed of solvent A (0.01% formic acid in water) and solvent B (acetonitrile). The gradient elution program used was 10-38% B (0 30 min), 38% B (30 40 min), 38-45% B (40 45 min), 45-51% B (45 47 min), 51-95% B (47 48 min), % B (48 62 min) and % B (62 63 min). olvent-solvent partition of JMR3 and JMR4 A portion of the crude extracts of J. maritimus JMR3 and JMR4 (150 mg) was suspended in water (20 ml) and solvent-solvent partition was performed with methylene chloride (10 20 ml) and then with ethyl acetate (10 20 ml). Each fractions were concentrated at 35 C under reduced pressure to yield methylene chloride fraction (JMR3-MC = 152 mg; JMR4-MC = 230 mg) and ethyl acetate fraction (JMR3-EA = 138 mg; JMR4-EA = 89 mg). The remaining aqueous fractions were lyophilized (JMR2-W = 818 mg; JMR4-W = 633 mg). Purification of JMR4-MC-1 by preparative HPLC The active compound of JMR4 (JMR4-MC-1) was isolated by preparative HPLC. It was performed using a himadzu HPLC system equipped with a LC-20AP binary high-pressure pump, a PD-M20A photodiode array detector and a VisionHT Basic C18 (5 µm, mm) column. A portion of JMR4-MC (50 mg.ml-1) was injected three times through a preparative HPLC system at a flow rate of 15 ml.min-1 to give 9 mg of a pure compound 178

193 (JMR4-MC-1). The mobile phase was composed of solvent A (0.01% formic acid in water) and solvent B (acetonitrile). The gradient elution program used was 10-38% B (0 2 min), 3845% B (2 8 min), 45-51% B (8 25 min), % B (25 26 min) and 100% B (26 45 min). tructural elucidation of JMR4-MC-1 by NMR Nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were recorded on a Bruker DPX-500 spectrometer (1H and 13 C NMR at 500 MHz) in CDCl3. HRM analysis was carried out in negative mode with a range of m/z , using a Thermo Fisher cientific Exactive Orbitrap mass spectrometer equipped with an atmospheric pressure chemical ionization (APCI) ion source. The vaporizer temperature of the source was set at 100 C, the nitrogen sheath gas at 10-20, and the auxiliary gas at 2-6 (arbitrary units). pectroscopic data of effusol (JMR4-MC-1); white powder (9 mg): EI-M m/z [M-H]- (theorical mass ; C17H16O2 requires 252); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.34 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-4), 6.97 (1H, dd, J = 17.5, 11.8 Hz, H-13), 6.92 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), 6.72 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 6.71 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-3), 5.71 (1H, dd, J = 17.5, 0.9 Hz, H2-14a), 5.28 (1H, dd, J = 10.8, 0.9 Hz, H2-14b), 2.77 (2H, m, H2-10), 2.71 (2H, m, H29), 2.29 (3H, s, H3-11) and 13C NMR (500 MHz, CDCl3): (C-7), (C-2), (C1a), (C-13), (C-8a), (C-5), (C-4), (C-5a), (C-4a), (C-1), (C-14), (C-8), (C-6), (C-3), 29.2 (C-9), 24.7 (C-10), 10.7 (C11). Antifungal bioassay Antifungal activity of plant extracts against Z. tritici was assessed in vitro using potato dextrose agar (PDA) medium (Fluka) amended with different plant extracts, using the spotting method described by iah et al. (2010). Plant extracts were added to the medium at 30 C 179

194 after autoclaving and after solubilizing in 0.5 ml of methanol. Final concentration of methanol in the medium, including controls without plant extracts, did not exceed 2%. Crude extracts from different plant species and from J. maritimus rhizomes were tested using only one concentration (1.25 g L-1), while purified extracts (JMR3 and JMR4) were tested using several concentrations (625, 312, 156, 78, 39, 19.5 and 9.75 mg.ml-1). Effusol obtained from JMR4-MC, as well as Bixafen (igma-aldrich), used as a reference synthetic fungicide molecule, were tested using eight concentrations (312, 156, 78, 39, 19.5, 9.75, 4.87, 2.43 mg.ml-1). After preparation, each PDA plate was spotted with 5 µl of 5 x 105 spores.ml-1 suspension, obtained by washing a 7 day-old fungal culture grown on PDA at 20 C, using sterile distilled water. The screening of crude extracts from different plant species was performed using the Z. tritici strain T01193, while further assays were carried out using the Z. tritici strain T Both isolates we used in our experiments were collected, respectively in 2009 and 2014, in North France (Lorgies locality) from a wheat plants infected with eptoria tritici blotch (Zymoseptoria tritici). The two isolates were obtained in our lab using a fungal isolation procedure. Three different plates were used as replicates for each condition, including controls. After spotting, the plates were incubated for 10 days in dark at 18 C and then the fungal growth was scored by measuring colony perpendicular diameters of each fungal spot. tatistical analyses Comparisons of fungal growth (means of colony perpendicular diameters) for crude plant extracts were performed with the Tukey test at a significance level of P < 0.05, using the XLTAT software (Addinsoft, France). For purified extracts, half-maximal inhibitory concentration (IC50) and minimal inhibitory concentration (MIC) values were calculated from 180

195 the corresponding dose-response curves, using linear regression implemented in the XLTAT software. Results and discussion Antifungal activity of crude plant extracts against Z. tritici The antifungal activity of crude methanolic extracts from eight extremophile plants collected in Tunisia, including three xerophytes and five halophytes, was evaluated at 1.25 g L-1 against Z. tritici. Interestingly, several plant extracts (i.e. extract from stems of. maritima and leaves from C. scabrum), as well as methanol used as solvent to dissolve plant extracts, showed a stimulatory effect on the pathogen growth when compared to the control (Figure 1). Among the tested crude extracts, only the extract JMR1 from J. maritimus rhizomes, collected in March 2014, at flowering stage and growing on marly soil, exhibited a significant reduction of fungal growth (mean of colony diameter = 1.85 ± 0.45 mm) (Figure 1). Juncus maritimus is a halophyte plant from the Juncaceae family. To date, no data was reported on the phytochemical composition of this plant and on its biological activity against Z. tritici. Previous studies on Juncus species focused mainly on antibacterial activity against medical bacteria. For instance, it was recently demonstrated that extracts from sixteen Juncus species, including J. maritimus, displayed strong inhibitory activities against methicillin-resistant taphylococcus aureus strains (Tóth et al. 2016). Only few studies have been reported the antifungal activity of Juncus species, e.g. Awaad et al. (2015) demonstrated that ethanol extract prepared from the aerial parts of J. acutus possessed low inhibitory activity against unicellular and filamentous fungi. 181

196 Impact of plant growing conditions on the activity of J. maritimus rhizome extracts Curiously, the extract JMR0, prepared from also J. maritimus rhizome, but collected in a different period (October 2013, at full seed stage) and growing on a different substrate (marly-sandy soil), did not show any significant activity. This difference of activity between JMR0 and JMR1 could be explained by the vegetative stage (physiological properties) of the plant at the moment of sampling, as well as by the type of substrate since JMR0 and JMR1 were sampled from different types of soil. In order to verify these hypotheses and to evaluate the impact of the variation of environmental parameters on antifungal activity, six new J. maritimus rhizome samples (JMR2 to JMR7) were collected in October 2014, and March and October 2015 according to different abiotic parameters (substrate of the soil, vegetative stage and year of collection). amples JMR2 and JMR7, collected over two years, on the same site and at the same vegetative stage, had overall similar and low antifungal activities against Z. tritici (Figure 2), suggesting that the year of collection do not significantly influence the antifungal activity level of J. maritimus rhizome extracts. In fact, 2014 experienced heavier rainfall (78 mm) than in 2015 (13 mm), but similar temperature levels were recorded over these two years ( On the other hand, it seems that the vegetative stage does not affect the antifungal activity of J. maritimus rhizome extracts. In fact, JMR6 and JMR7, both collected from the same substrate, but at different stages ( full seed and flowering, respectively) showed similar antifungal activities (Figure 2). Taken together, these finding indicate that the year of collection and the vegetative stage would have a low impact on the antifungal activity of J. maritimus rhizomes. However, J. maritimus rhizomes collected on the same year and vegetative stages, but from different types of substrate, displayed significant reductions of fungal growth and the level of 182

197 antifungal effect varies depending on the substrate from which the plants were collected (Figure 2). J. maritimus rhizomes growing in an endorheic salt lake (sabkha) (JMR4) showed the highest activity against Z. tritici (total inhibition of fungal growth), while the other samples (JMR2, JMR3 and JMR5) displayed lower extent of reduction. This result indicates that substrate, especially salty environment, have a strong impact on the antifungal potential of J. maritimus rhizomes. alinity stress is capable of triggering changes in the plant metabolism by affecting the plant growth, the biosynthesis of some metabolites, and therefore the qualitative and quantitative composition of these constituents (Dow et al. 1981). This abiotic stress may lead to an oxidative damage for many vascular plants. However, halophyte plants are able to grow optimally under this environment, as they developed different adaptive mechanisms, through for example the biosynthesis of a cascade of antioxidants (Ksouri et al. 2007). Moreover, it has been proven that harder environmental conditions, such as high salinity, is linked to an increase in the production of antioxidant and antimicrobial components in some of these plants (Maisuthisakul et al. 2007). Our results support these data, suggesting that high salinity environment could stimulate the synthesis of phytoalexins (e.g. in the rhizomes of J. maritimus) resulted in a promising antifungal activity. HPLC characterization of crude J. maritimus rhizome extracts J. maritimus rhizome extracts (JMR2 to JMR7) were analyzed using HPLC-UV as a primary phytochemical investigation approach. JMR3 and JMR4 clearly showed different chromatographic profiles in comparison with the other extracts (Figure 3). Compounds with retention times between 10 and 35 min are presented at higher concentration in JMR3 than in the other extracts. Moreover, the chromatogram of JMR4 showed the presence of a compound (tr = 38 min) almost missing from the other extracts. Chromatographic data confirmed that the substrate, especially salty environment (sabkha), have an effect on the biosynthesis of 183

198 secondary metabolites that are likely involved in J. maritimus defense mechanisms, and that the vegetative stage and the year of collection have lower impact on the biosynthesis of such compounds. Bioguided fractionation of JMR3 and JMR4 and activity assessment of the fractions In order to identify the compounds responsible for antifungal activity against Z. tritici, the crude methanolic extract of J. maritimus rhizomes (JMR4) was subjected to a bioguided fractionation. In addition, JMR3 was also selected for the same phytochemical investigation to deepen the understanding of J. maritimus antifungal potential. A preliminary fractionation was carried out using a solvent-solvent partition. Three fractions were obtained for both JMR3 and JMR4: methylene chloride (JMR3-MC and JMR4-MC), ethyl acetate (JMR3-EA and JMR4-EA) and aqueous (JMR3-W and JMR4-W) ones. All fractions as well as JMR3 and JMR4 crude extracts were tested for their antifungal activity against Z. tritici by determining MIC and IC50 values (Table 2). The ethyl acetate fraction from JMR3 (JMR3-EA) showed a lower activity (IC50 = µg.ml-1) than the methylene chloride fraction from JMR3 (JMR3-MC) (IC50 = µg.ml-1). On the other hand, fractions from the most active crude methanolic extract of J. maritimus rhizome (JMR4), displayed overall higher activities. The methylene chloride fraction (JMR4-MC) had the strongest activity among all the investigated fractions, with an IC50 value of µg.ml-1. Comparison of the HPLC chromatograms of JMR4 fractions (JMR4-MC, JMR4-EA, JMR4W) revealed that compound JMR4-MC-1 (at tr = 38 min) is mostly presented in JMR4-MC (Figure 4), suggesting that this compound is mainly responsible for the remarkable antifungal property of JMR4. Purification, structural elucidation and antifungal activity of JMR4-MC-1 (effusol) 184

199 The major compound (JMR4-MC-1, 9 mg) was purified by preparative HPLC from the most active fraction (JMR4-MC). This component was not detected in other J. maritimus rhizome extracts. The comparison of the 1D- and 2D-NMR data of JMR4-MC-1 with those reported in literature allowed to the identification of effusol (Bhattacharyya 1980), a phenanthrene only encountered in the genus Juncus (El-hamy et al. 2015). Effusol (Figure 5) was already isolated from other Juncus species, such as the aerial parts of J. effusus and J. acutus, and the rhizomes of J. subulatus (El-hamy et al. 2015). To the best of our knowledge, this is the first time that this natural product is isolated from J. maritimus rhizomes. To confirm the antifungal property of JMR4-MC is due to effusol, additional antifungal tests were performed using the same spotting assay undertaken above. Effusol showed a high antifungal activity against Z. tritici (Figure 6). The MIC and IC50 values obtained for this natural product were 19 µg.ml-1 and 9.98 µg.ml-1, respectively (Table 2). In addition, the methylene chloride fraction (JMR4-MC) without effusol was also tested and showed no activity (CMI > 312 µg.ml-1), confirming that the activity of this fraction (JMR4-MC) is mainly due to effusol. No reports on the antifungal activity of effusol have been provided in the literature so far. The few studies on the biological potential of effusol highlighted cytotoxic, anxiolytic and sedative activities (Ishiuchi et al. 2015; Wang et al. 2012). Moreover, no reports exist in the literature on the antifungal activity against Z. tritici for J. maritimus, neither for the Juncus genus. However, some studies highlighted the antimicrobial potential of some Juncus species and the implication of some dihydrophenanthrenes in this activity (El hamy et al. 2015). These natural products are already known to be phytoalexins in some plant families such as Orchidaceae (Fisch et al., 1973; Kovács et al., 2008). 185

200 Conclusions Methanolic extracts from eight Tunisian extremophile plants were tested for their activity against Z. tritici. Only extracts from J. maritimus rhizomes showed significant inhibitory activity against this pathogen. Further investigations showed that the substrate, especially salty environment, would have significant effect on the biosynthesis of compounds responsible for antifungal activity, as it was observed in case of J. maritimus. By contrast, the vegetative stage and the year of plant collection had lower effect on antifungal compound biosynthesis. olvent-solvent partition suggested that the methylene chloride fraction JMR4MC of the most active extract JMR4 was responsible for the antifungal activity. In addition, HPLC-UV analyses showed the presence of a compound (rt = 38 min) which could only be detected in the methylene chloride fraction (JMR4-MC) of the sample JMR4. This component was then isolated by preparative HPLC and identified as effusol, a phenanthrene derivative already described in the Juncus genus, but never in J. maritimus. It would be interesting to carry out further analyses to understand its mechanism of action against Z. tritici. This phenanthrene derivative could be a promising biological control molecule of this pathogen. Acknowledgement This study was supported by an internal financial support from the Charles Viollette Institute. The authors wish to thank platforms of CUMA (University of Lille 2, Pr. J.F. Goossens) and LARMN (University of Lille 2, Pr. N. Azaroual) for access to equipment. 186

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205 Figures Fungal colony diameter (mm) a 14 ab bc 12 cde def 10 cde efg cde cde fgh 8 ghi bcd def efg fgh hij ij j tems Leaves 6 4 k 2 0 Flowers Control MeOH Rhizomes tems J. J.maritimus maritimusi (JMR0) Rhizomes J.J.m. m.ii Leaves L. virgatum Flowers tems. maritima tems Flowers Leaves C. scabrum tems Leaves. succulenta A. litto. A. serra. A. tata. (JMR1) Fig. 1 Effect of crude plant extracts on the in vitro growth of Zymoseptoria tritici. MeOH: control with methanol; J. maritimus (JMR0): Juncus maritimus collected in eptember-october 2013 ( full seed stage) on marlysandy soil; J. m (JMR1): J. maritimus collected in March 2014 ( flowering stage) on marly soil; L. virgatum: Limonium virgatum;. maritima: cabiosa maritima; C. scabrum: Cirsium scabrum;. succulenta: ilene succulenta; A. litto: Aeluropus littoralis; A. serra: Atractylis serratuloides; A. tata: Atriplex tatarica. Means tagged with the same letter are not significantly different using the Tukey test at P = Perpendicular colony diameter (mm) 10 a ab 8 c c JMR5 JMR6 6 d cd e 4 2 f JMR7 JMR4 JMR3 JMR2 MeOH 0 Fig. 2 Effect of Juncus maritimus rhizomes extracts on the in vitro growth of Zymoseptoria tritici. MeOH: control with methanol; Means tagged with the same letter are not significantly different using the Tukey test at P =

206 Fig. 3 JMR2-JMR7 chromatograms at 320 nm (acetonitrile/water with 0.1% acetic acid) Fig. 4 JMR4 partitions chromatograms at 320 nm (acetonitrile/water with 0.1% acetic acid) 192

207 14 CH OH a 5a 8 3 HO 8a a 10 CH3 11 Fig. 5 Effusol chemical structure Fig. 6 Growth inhibition of Zymoseptoria tritici by JMR4, JMR4-MC and JMR4-MC-1 19 (effusol) 193

208 Tables Table 1 Year of collect, vegetative stage and substrate of the soil for the seven Juncus maritimus rhizomes samples ample Collection time Vegetative stage ubstrate JMR2 October 2014 full seed" stage ite 1 : marly sandy soil JMR3 October 2014 full seed" stage ite 3 : sandy soil JMR4 October 2014 full seed" stage ite 4 : endorheic salt lake JMR5 October 2014 full seed" stage ite 2: marly soil JMR6 March 2015 flowering stage ite 2 : marly sandy soil JMR7 October 2015 full seed" stage ite 1 : marly sandy soil Table 2 Effect of JMR3 and JMR4 partitions against Z. tritici strain T02596 growth JMR3 JMR3-MC JMR3-EA JMR3-W JMR4 JMR4-MC JMR4-EA JMR4-W Bixafen MIC (µg/ml) IC50 (µg/ml) > 625 > 625 > > > 625 > > 625 > 625 > 625 > D

209 CONCLUION GENERALE Le regain porté aux substances d origine végétale ces dernières années est lié au fait qu elles peuvent constituer un véritable arsenal thérapeutique dans le domaine de la santé humaine mais aussi du végétal. La recherche de molécules bioactives repose souvent sur la connaissance de l usage traditionnel des plantes. D autres approches sont également considérées, comme les approches écologiques. En effet, les plantes soumises à des stress abiotiques peuvent également être une source riche en molécules bioactives. Ces molécules sont souvent impliquées dans les mécanismes d adaptation et de défense de la plante à ces différents stress. Les plantes extrêmophiles ont, de ce fait, des effets pharmacologiques d intérêt. Dans une perspective de valorisation des ressources naturelles des milieux salins et arides de la Tunisie, nous avons réalisé au cours de ce travail, un criblage biologique [activités antiradicalaire, cytotoxique, antibactérienne, anti-vhc et antifongique (Z. tritici)] de 8 plantes sélectionnées parmi 30 plantes xérophytes et halophytes. Nous avons commencé le criblage en testant les extraits bruts méthanoliques des différents organes de ces plantes. Il s agit de 3 xérophytes : Atractylis serratuloides (Cass.) DC. (Asteracées), Cirsium scabrum (Poir.) Bonnet & Barratte (Asteracées), cabiosa maritima L. (Caprifoliacées) ; et 5 halophytes : Limonium virgatum (Willd.) Fourr. (Plumbaginacées), Juncus maritimus Lam. 195

210 (Juncacées), ilene succulenta Forssk. (Caryophyllacées), Atriplex tatarica L. (Amaranthacées) et Aeluropus littoralis (Gouan) Parl. (Poacées). En se basant sur l hypothèse que les plantes halophytes et xérophytes sont équipées d'un système antioxydant puissant par la présence notamment de polyphénols, nous nous attendions à avoir un résultat global intéressant pour l ensemble des huit plantes testées. Nous n avons pas eu les résultats attendus. eules deux plantes étaient relativement riches en polyphénols avec un potentiel antioxydant intéressant (Limonium virgatum et Juncus maritimus). Des études ont montré que le taux de polyphénols et l activité antioxydante chez les plantes dépendent des conditions édaphiques environnementales (température, salinité, stress hydrique et intensité lumineuse), mais aussi de facteurs biologiques (génotype, organes et ontogenèse). De plus, la solubilité des composés phénoliques est régie par le type de solvant utilisé, le degré de polymérisation des composés phénoliques, et leur interaction (Medini et al., 2014). Parmi les plantes étudiées, seule A. serratuloides a fait l objet de travaux antérieurs par d autres équipes pour son contenu en polyphénols et pour son activité anti-radicalaire. D après les travaux effectués par Bouaziz et al. (2009), l extrait méthanolique d A. serratuloides a montré une activité anti-radicalaire intéressante (CI50 = 4,11 µg/ml). Cette activité est plus élevée que celle obtenue pour notre échantillon (% DPPH restant = 86,7% à la concentration testée de 40 µg/ml), alors que les deux prélèvements ont été effectués au sud de la Tunisie. Cette différence pourrait s expliquer par la méthode d extraction différente de la nôtre (par oxhlet : hexane, acétate d éthyle, méthanol et eau), mais surtout par une différence de période de récolte (notre échantillon a été collecté en hiver alors que leur échantillon a été colleté en été). L évaluation de ces plantes dans d autres périodes de leur cycle de vie et en testant d autres solvants pourrait éventuellement conduire à des teneurs en polyphénols et des activités anti-radicalaires plus intéressantes. Dans le cadre de ce criblage qui met en jeu encore d autres activités biologiques, la standardisation des conditions expérimentales est importante. Les deux plantes qui ont montré les contenus en polyphénols les plus élevés, soit Limonium virgatum et Juncus maritimus, ressortent aussi comme étant les plus actives au cours des analyses d activités antimicrobiennes. Les composés de ces deux plantes, définis ou suggérés comme étant responsables de ces activités, sont des composés phénoliques ou apparentés (phénanthrènes de J. maritimus). Ceci suggère que la présence de composés phénoliques au 196

211 sein des halophytes peut être indicatrice de la présence d un pouvoir antimicrobien chez ces plantes. Plusieurs études ont mis en évidence cette corrélation. Par exemple, différentes espèces d halophytes (Eryngium maritimum (Apiacées), Crithmum maritimum (Apiacées) et Cakile maritima (Brassicacées)) au potentiel antimicrobien démontré sur différents types de pathogènes, sont riches en composés phénoliques (Meot-Duros et al., 2008). Par contre, Cirsium scabrum, qui a montré l activité cytotoxique la plus élevée, ne présente pas de pouvoir antioxydant particulièrement intéressant. Ainsi, C. scabrum rejoint diverses espèces du genre Cirsium connues pour leur pouvoir cytotoxique et antitumoral (Cirsium japonicum var. ussuriense, Cirsium tenoreanum...) (Loizzo et al., 2004). Ce criblage initial nous a permis de mettre en exergue les potentialités biologiques de certaines des plantes halophytes et xérophytes testées en général pour la première fois. Cela nous a conduits ensuite à nous intéresser à leur composition chimique. Il a également mis en évidence des activités biologiques originales de molécules à potentiel très prometteur dans diverses applications en santé humaine et du végétal. Limonium virgatum, une halophyte riche en substances antioxydantes et antibactériennes Limonium virgatum est une halophyte de la famille des Plumbaginacées, qui est bien distribuée au nord et au centre de la Tunisie (Pottier-Alapetite, 1981). À notre connaissance, aucune étude du point de vue phytochimique et biologique n a été réalisée sur cette plante. Nous avons montré que les extraits des tiges et des feuilles de Limonium virgatum présentent des activités anti-radicalaires intéressantes, en relation avec leur contenu en polyphénols, incluant les tanins. Ces résultats concordent avec les données de la littérature dans la mesure où la majorité des espèces du genre Limonium sont connues par leur grande richesse en flavonoïdes. De plus, certains auteurs ont signalé la présence de tanins dans les plantes du genre Limonium (Medini et al., 2011, 2014). L activité antioxydante des polyphénols et des tanins est largement étudiée. Les mécanismes d actions de divers polyphénols sont bien caractérisés. D une manière générale, les composés phénoliques sont thermodynamiquement capables de réduire les radicaux libres oxydants, mais aussi d arrêter l auto-oxydation par transfert d hydrogène. Les polyphénols ont également un pouvoir chélateur des ions métalliques impliqués dans la production du radical hydroxyle selon les réactions de Fenton et Haber Weiss (Wang et al., 197

212 2006). Ils sont aussi capables d inhiber une large gamme d enzymes génératrices de radicaux libres oxygénés. Les extraits des tiges et des feuilles de Limonium virgatum ont montré également une activité antibactérienne à spectre assez large vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et Gram positif. L activité antibactérienne de certaines espèces de Limonium a déjà été soulignée. Des extraits de L. densiflorum et de L. delicatulum ont montré une activité antibactérienne contre des souches de taphylococcus aureus, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa (Medini et al., 2011, 2014). Ceci est en accord avec nos résultats puisque les extraits de L. virgatum ont montré également une activité antibactérienne contre ces souches. Une seule étude a évalué l activité antibactérienne de composés purifiés d une espèce de Limonium (L. caspium), toutefois, ces composés, incluant la myricétine et plusieurs de ses dérivés, n ont montré aucune activité contre les souches de taphylococcus, Escherichia et Pseudomonas (Gadetskaya et al., 2015). Dans notre étude, avons suggéré que deux phénylpropanoïdes, dont l un est le N-transferuloyl tyramine, seraient responsables de l activité antibactérienne de L. virgatum. Les phénylpropanoïdes constituent une classe chimique abondante de métabolites secondaires dans le règne végétal. Ils protègent les plantes contre les stress biotiques et abiotiques. Différentes études ont montré le potentiel antimicrobien de certains phénylpropanoïdes (Kang et al., 1994 ; Laouer et al., 2009). Par ailleurs, la richesse de L. virgatum en tanins peut aussi participer à son activité antibactérienne. En effet, les tanins sont bien connus pour avoir diverses activités antibactériennes. Les mécanismes d'action proposés comprennent, l'inhibition des enzymes microbiennes extracellulaires, la limitation des substrats nécessaires pour la croissance microbienne, mais aussi par une action directe sur le métabolisme microbien par l'inhibition de la phosphorylation oxydante (Fernández-Natal et al., 2013). Il est donc intéressant d explorer davantage l activité antibactérienne de L. virgatum. 198

213 Cirsium scabrum, une xérophyte dotée de potentialités cytotoxique et antibactériennes prometteuses Cirsium scarbrum est une xérophyte de la famille des Asteracées qui a été localisée dans différentes régions du Nord de la Tunisie (Pottier-Alapetite, 1981). Cirsium scabrum n a pas été étudiée précédemment d un point de vue phytochimique ou biologique. Au cours de ce travail, nous avons montré que l extrait des feuilles de C. scabrum possède un pouvoir cytotoxique qui est sélectif envers la lignée de macrophages dérivée d'un réticulosarcome de souris (J774). Nous avons identifié un mélange indissociable (1:1) de deux triterpènes de type cycloartane hydroperoxydés (25-hydroperoxycycloart-23-en-3ß-ol et 24hydroperoxycycloart-25-en-3β- ol) comme étant responsables en partie de cette activité. Des tentatives pour séparer les 2 composés n ont pas abouti car les produits séparés finissent toujours par se dégrader. Lee et al. (2002) ont isolé ces composés à partir d une autre espèce de Cirsium, C. setidens, et ont mis en évidence leur activité antiproliférative sur des lignées cellulaires cancéreuses ovariennes ainsi que sur des mélanomes (DE50 = 4,24 et 2,66 μm, respectivement). L activité cytotoxique de Cirsium scabrum, se trouve aussi associée à la présence d un autre triterpène, le lupeol. Ce composé est largement distribué dans diverses familles botaniques. Plusieurs études suggèrent que le lupéol possède un large éventail d'activités biologiques, y compris anti-inflammatoires, antimicrobiennes, antiprotozoaires, anti-cholestérolémiantes, et notamment antiprolifératives (Wal et al., 2015). Le lupéol est aussi capable de moduler différents mécanismes moléculaires contribuant au développement de certains mélanomes (Gajos-Michniewicz et Czyz, 2016 ; tricklanda et al., 2015). D'autre part, nous avons montré que l extrait des feuilles de Cirsium scabrum possède un pouvoir antibactérien contre 6 souches de taphylococcus aureus et 2 souches de Dermabacter hominis. Cette activité serait liée à une présence de flavones glycosylées : un mélange (3:1) de la lutéoline 7-O-β-D-glucuronide et de la lutéoline 7-O-β-D-glucoside ; et l apigénine 7-O-β-D-glucuronide. Il n y a pas beaucoup de données dans la littérature concernant l activité antibactérienne de la lutéoline 7-O-β-D-glucuronide et de l apigénine 7-O-β-D-glucuronide. Certaines espèces de plantes contenant ces deux flavones ont montré une activité antibactérienne contre certaines bactéries à Gram positive et Gram négative, y compris sur des souches de taphylococcus 199

214 aureus (alawu et al., 2010 ; Moussaoui et al., 2011) Concernant la lutéoline 7-O-β-Dglucoside, il a été démontré qu elle possède une activité antibactérienne spécialement contre les bactéries à Gram négative (Žemlicka et al., 2011). Bien que le mécanisme d action de ces hétérosides n a pas été bien définie, l action des génines est, quant-à-elle, bien caractérisée contre taphylococcus aureus. L'apigénine peut considérablement diminuer la production de l α-hémolysine dans. aureus, et ceci à de faibles concentrations (Dong et al., 2013). L'apigénine est également capable de diminuer les taux de cytokines et d atténuer les lésions du tissu pulmonaire dans le cas de pneumonies liées à. aureus. En ce qui concerne la lutéoline, Wang et al. (2010) ont suggéré que cette flavone pourrait inhiber l'activité de l'adn topoisomérase I et II, ce qui entraîne une diminution de la synthèse des acides nucléiques et des protéines. Une étude récente qui a analysé le mécanisme d'action de la lutéoline contre des souches de taphylococcus aureus résistantes à la méticilline (ARM) (Joung et al., 2016), a montré qu elle agit en synergie en augmentant la perméabilité de la membrane cytoplasmique et en inhibant les ATPases. L'étude suggère également l existence d une interaction directe entre la lutéoline et le constituant principal de la paroi cellulaire de. aureus. Concernant l'activité antibactérienne de C. scabrum sur les 2 souches de Dermabacter hominis, il n existe pas de données dans la littérature concernant ce type d activité des flavones identifiées. De plus, les données sur l'activité de biomolécules végétales contre des souches de D. hominis sont rares. D où l intérêt d analyser davantage l activité des flavones de C. scabrum sur D. hominis. Juncus maritimus, un véritable réservoir en composés bioactifs Juncus maritimus est une halophyte de la famille des Juncacées qui est bien répandue dans les régions côtières de la Tunisie. À notre connaissance, la majorité des études relatives à J. maritimus concernent peu ou pas les aspects phytochimiques et biologiques. Dans notre travail, nous avons montré que l extrait des rhizomes de J. maritimus possède un large éventail d activités biologiques, qui, pour la plupart, se sont montrées originales. - une activité anti-radicalaire modérée, - une activité originale contre la réplication du virus de l hépatite C, 200

215 - une activité antibactérienne spécifique d un certain groupe de bactéries à Gram positif (particulièrement sur une souche de treptococcus dysgalactiae et sur différentes souches de treptococcus pyogenes), - une activité antifongique marquée contre Zymoseptoria tritici (pathogène de la septoriose du blé). La lutéoline, responsable, de l activité anti-radicalaire de J. maritimus Une flavone, la lutéoline (figure 38) a été déterminée comme étant le composé responsable de l activité anti-radicalaire des rhizomes de J. maritimus. La lutéoline est synthétisée par de nombreuses plantes. Elle est largement connue pour diverses activités biologiques, notamment pour son pouvoir antioxydant. Il a été montré que le noyau B est le pharmacophore responsable de son activité Figure 38. tructure chimique de la lutéoline antioxydante (Leopoldini et Russo, 2011). Dans le genre Juncus, la lutéoline a été identifiée chez différentes espèces : dans les parties aériennes de J. acutus et J. rigidus ainsi que dans les rhizomes de J. subulatus (Mansour et al., 1986 ; Abdel-Razik et al., 2009 ; Abdel-Mogib, 2001 ; han et al., 2008). Chez J. subulatus, un fractionnement bioguidé a permis d identifier la lutéoline comme étant la plus active parmi les 7 flavonoïdes isolés, avec une CI50 à 4,98 µg/ml (Abdel-Razik et al., 2009). Le dehydrojuncusol, un nouvel inhibiteur de la réplication du virus de l hépatite C Nous avons montré que le dehydrojuncusol (figure 39), un 12 CH3 dehydrophénanthrène, est capable d inhiber la réplication du VHC, dans le système VHCcc, et dans les PHH. En effet, il est assez rare un modèle pré-clinique humain (PHH), et en même temps dénué de toxicité. OH 7 4 4a H2C d une manière remarquable, avec une CE50 proche de 1 μm, à la fois qu'un composé d origine naturelle soit à la fois actif in vitro, et sur a 8 8a HO a 10 CH3 11 Figure 39. tructure chimique du dehydrojuncusol 201

216 De plus, il agit sur les premières étapes de l'infection par les particules virales. Cette capacité, n'est probablement pas due à une inhibition de l'entrée du VHC, car cette molécule n'est pas active sur VHCpp. Il est donc probable que le dehydrojuncusol qui entre dans les cellules pendant l'inoculation virale, reste piégé à l'intérieur et peut par la suite inhiber la réplication du VHC. L action inhibitrice du dehydrojuncusol sur la réplication du VHC aurait pour cible la protéine N5A, avec une résistance partielle au double mutant T24-L31M, et au mutant N5A Y93H. Cette résistance partielle suggère que le mécanisme d action du dehydrojuncusol sur N5A est probablement différent de celui du daclatasvir (résistant au mutant N5A Y93H). Le dehydrojuncusol inhibe efficacement la réplication du mutant résistant au daclatasvir (N5A L31M) retrouvé chez les patients traités. Les cas d échecs de traitements avec le daclatasvir observés chez les patients, sont de 63% pour la mutation L31M. La double mutation de N5A qui est résistante au dehydrojuncusol (T24-L31M) est rarement retrouvée chez les patients traités. En ce qui concerne le mutant N5A Y93H, il est responsable de l échec de la thérapie pour 14% des patients. Il n existe pas d études de biodisponibilité dans la littérature pour ce composé dans des modèles animaux ou chez l Homme. De plus, des études de pharmacocinétique (in vivo ou chez l Homme) d autres dérivés phénanthrèniques sont peu ou pas disponibles. Ces données sont importantes à prendre en compte dans le cas d essais cliniques. Cette molécule devra donc être étudiée davantage si on souhaite une utilisation thérapeutique chez les patients résistants à la thérapie conventionnelle, mais aussi chez certains patients issus de pays en développement. Pour ces populations, l utilisation d un extrait de la plante standardisé en dehydrojuncusol pourrait aussi avoir un intérêt. Le juncunol, un agent antibactérien prometteur contre des souches de treptococcus pyogenes résistantes à l amoxicilline Le sous-extrait dichlorométhane des rhizomes de J. maritimus s est distingué par des activités antibactériennes élevées sur treptococcus dysgalactiae T46C14 (isolée d'une ostéite), et sur différentes souches de treptococcus pyogenes (isolées soit d une ostéite ou soit d'une hémoculture). Ces dernières se sont montrées résistantes à l amoxicilline, contrairement à. dysgalactiae qui est sensible à divers antibiotiques. La pénicilline ou l'un de ses dérivés (par 202

217 exemple, l'amoxicilline) constituent le traitement antibiotique recommandé pour les patients non-allergiques diagnostiqués avec des infections par. pyogenes et. agalactiae. Ces souches sont en général non résistantes aux pénicillines (Frieden, 2013). treptococcus pyogenes (streptocoque du groupe A) est une bactérie pathogène strictement humaine connue depuis longtemps. La particularité de cette bactérie provient de son pouvoir pathogène aux multiples facettes. En effet,. pyogenes peut causer une large variété d infections allant d infections localisées non-compliquées (pharyngites aiguës, infections cutanées superficielles, ) à des infections invasives pouvant engager le pronostic vital (Billon, 2014). Différents polyphénols sont capables d agir suivant différentes modalités contre. pyogenes. Par exemple, des prodelphinidines possèdent une propriété non-adhésive spécifique à. pyogenes (Janecki et al., 2010 ; Janecki et al., 2011) ; un flavonol (la morine), est capable de réduire la formation de biofilms de. pyogenes (Green et al., 2012). Nous avons ainsi mis en évidence le pouvoir antibactérien marqué du juncunol (figure 40), un autre dehydrophénanthrène, contre. pyogenes 16135, souche sur laquelle le sous-extrait dichlorométhane des rhizomes de J. maritimus était la plus active. A notre connaissance, il n existe pas d études concernant le potentiel antibactérien du juncunol. Figure 40. tructure chimique du juncunol Les quelques études trouvées dans la littérature montrent qu il présente une cytotoxicité sélective in vitro vis-à-vis de diverses lignées cellulaires cancéreuses humaines (Rodrigues et al., 2014), et sur une microalgue (elenastrum capricornutum) (DellaGreca et al., 2004). Il présente aussi une activité antiparasitaire (Trypanosoma cruzi) (Oliveira et al., 2016) et neuroprotectrice (inhibition de la cholinestérase) (Rodrigues et al., in press). De plus, peu ou pas d études existent sur l activité des phénanthrènes sur. pyogenes. Il convient de signaler que le juncusol, qui était moins actif que le juncunol sur treptococcus pyogenes (16135), a montré une activité spécifique à des bactéries à Gram + (Chapatwala et al., 1981). Il est donc très intéressant d explorer davantage l activité du juncunol sur la collection de souches de. pyogenes résistantes à l amoxicilline. Déterminer son mécanisme d action donnera accès à une meilleure compréhension de la pathogénicité de treptococcus pyogenes qui, bien que particulièrement étudiée, demeure encore loin d être complètement élucidée. 203

218 L effusol, au service de la bioprotection des cultures de blé contre la septoriose Nous avons montré que l extrait des rhizomes de Juncus maritimus présente l activité contre Zymoseptoria tritici la plus élevée lorsqu il peuple un écosystème particulièrement salin (sebkha), en comparaison avec d autres écosystèmes moins salins. 14 CH OH De plus, les profils chimiques des extraits de rhizomes sont différents 4a d un écosystème à un autre, révélant une biosynthèse accentuée pour certains composés en cas de salinité élevée. Ceci est particulièrement vrai pour un phénanthrène, l effusol (figure 41). Nous avons mis en évidence son activité antifongique contre Zymoseptoria tritici. 5a 8 3 HO 8a a 10 CH3 11 Figure 41. tructure chimique de l effusol D une manière générale, la distribution et la composition des composés phénoliques au sein des plantes peuvent être affectées par les teneurs en sels du milieu sur lequel ces plantes vivent. Ainsi, plus la salinité est élevée, plus les teneurs en composés phénoliques sont importantes (Lim et al., 2012). Ceci a été confirmé par les travaux de Mehr et al. (2012) portant sur les pousses et les racines d une halophyte Anethum graveolens (Apiacées). Ils ont prouvé que la culture de cette plante dans un milieu contenant 100 mm de NaCl est capable de quadripler le contenu phenolique dans les racines et de le tripler au niveau des pousses. Cet enrichissement en polyphénols totaux est un mécanisme d adaptation des plantes à la salinité car les composés phénoliques améliorent les effets ioniques de NaCl dans les tissus (Parida et al., 2004). Concernant l'activité antifongique de l'effusol, aucune donnée n existe dans la littérature. Les quelques études sur le potentiel biologique de l effusol ont mis en évidence des activités cytotoxiques, anxiolytiques et sédatives (Ishiuchi et al., 2015 ; Wang et al, 2011). En outre, il n y a pas d études dans la littérature sur l'activité contre Z. tritici, pour J. maritimus, ni pour d autres espèces du genre Juncus. En revanche, certaines études ont mis en évidence le potentiel antimicrobien de certaines espèces de Juncus et l'implication de certains dihydrophénanthènes dans cette activité (El-hamy et al., 2015). Les phénanthrènes sont déjà connus pour être des phytoalexines dans certaines familles de plantes telles que les Orchidacées (Kovács, 2008). Les moyens de contrôle usuels de Zymoseptoria tritici sont essentiellement chimiques. ous la pression conjuguée d une réglementation plus restreinte et des actions en faveur de 204

219 l environnement, une stratégie raisonnée moins dépendante des fongicides synthétiques est en train de se développer. Dans la lutte biologique contre la septoriose, seul la laminarine (Vaccipant, Goëmar, France), un polysaccharide de faible poids moléculaire dérivé d une algue Laminaria digitata, est enregistrée en France comme inducteur de la résistance du blé à Z. tritici. Etudier davantage l effet de l effusol sur la septoriose du blé devient donc très intéressant. Ceci permettra, d une part, de contribuer à la compréhension de l effet de la salinité sur le changement du profil chimique chez les halophytes. D autre part, pour une éventuelle introduction sur champ de ce phénanthrène, différentes analyses sont nécessaires, notamment de déterminer à quel niveau du cycle biologique de Z. tritici il est le plus actif, mais aussi de vérifier sa biodisponibilité et son éventuelle toxicité sur le blé. Perspectives. Nous avons montré que les halophytes et les xérophytes sont un véritable réservoir en biomolécules qui devraient bénéficier d une plus grande attention par le monde de la recherche dans le domaine des substances naturelles. L exploitation de ressources végétales identifiées dans ce travail, notamment Juncus maritimus, vers une perspective de conception de médicaments ou de formulation de biofongicides est envisageable, en prenant en compte la large distribution de cette plante, aussi bien sur le territoire tunisien, que dans d autres parties du monde. La présence des molécules bioactives dans J. maritimus et dans les parties aériennes de diverses autres espèces de Juncus plaide en faveur de la valorisation économique de ces molécules. Cependant, les parties de la plante les plus actives de J. maritimus sont les rhizomes, organes par lesquels la plante se propage. Cultiver des espèces de Juncus ne constitue pas une aberration sur le plan cultural ; bien au contraire, cette stratégie est bien établie depuis le XXe siècle dans le delta du Nil en Egypte, où on cultivait à petite échelle des espèces de Juncus pour la production de nattes (Brink et al., 2012). Des stratégies de synthèse chimique peuvent aussi êtres envisagées, notamment pour le juncunol dans la mesure où un protocole de synthèse de cette molécule est déjà prédéfini (Cossey et al., 1980), mais aussi pour le dehydrojuncusol, qui peut être hémi-synthétisé par la conversion du juncusol dont la méthode de synthèse est bien décrite (McDonald et Martin, 1978). Une autre alternative serait d envisager l utilisation des biotechnologies végétales. 205

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242 ANNEXE

243 ANNEXE 1. Les 30 plantes collectées Plantes halophytes collectées de la zone Z-1 alicornia arabica L (Amaranthaceae) uaeda maritima L. Dumort (Amaranthaceae) Pistacia lentiscus L. (Anacardiaceae)

244 Plantes halophytes collectées de la zone Z-2 Limonium virgatum (Willd.) Four (Plumpaginaceae) ilene succulenta Forssk (Caryophyllaceae) Euphorbia paralias L. (Euphorbiaceae) Eryngiym maritimum L. (Apiaceae) Euphorbia granulata Forssk. (Euphorbiaceae) Polygonum maritimum L. (Polygonaceae) Eryngium canadensis L. (Apiaceae) Cyperus conglomeratus Rottb. (Cyperaceae) Myrtus communis L. (Myrtaceae)

245 Juniperus oxycedrus L. (Cupressaceae) Atriplex tatarica L. (Amaranthaceae) Aeluropus littoralis (Gouan) Parl. (Poaceae) Juncus maritimus Lam. (Juncaceae)

246 Plantes xérophytes collectées de la zone Z-3 Cirsium scabrum (Poir.) Bonnet & Barratte (Compositae) Thymelaea hirsuta (L.) Endl. (Thymelaeaceae) Thymus capitatus (L.)Hoffmanns. & Link (Thymelaeaceae) Verbascum sinuatum L. (crophulariaceae) Cistus monspeliensis L. (Cistaceae) Calicotome villosa (Poir.) Link. (Leguminosae) Thapsia garganica L. (Apiaceae)

247 Plantes xérophytes collectées de la zone Z-4 Mentha pulegium L. ( Lamiaceae) Daucus carota L. (Apiaceae) Hypericum triquetrifolium Turra. (Hypericaceae) Galium mollugo L (Rubiaceae) Phagnalon rupestre (L.) DC (Compositae) Lotus creticus L. (Leguminosae) Asparagus acutifolius L. (Asparagaceae)

248 ANNEXE 2. Les données RMN des composés identifiés RMN Composé DCM1 (dans MeOD) Juncusol 14 CH 2 12 CH OH 3 4 4a 5a 8a HO 1 CH a 10 9 C 18 H 18 O 2 (MM= 266 g/mol) N 1 H NMR 13 C NMR d (9.3) d (9.3) s a 139 4a a a s s dd (18.2 ; 11.4) dd (18.2 ; 2.05) 5.45 dd (11.4 ; 2.05) 117.9

249 RMN Composé DCM2 (dans MeOD) dehydrojuncusol H 2 C a 5a 5 CH a OH HO 2 1 1a 10 9 CH 3 11 C 18 H 16 O 2 (MM= 264 g/mol) N 1 H NMR 13 C NMR d (9.3) d (9.3) s d (9.2) d (9.2) a a a a s s dd (18.2 ; 11.4) dd (18.2 ; 2.05) 5.69 dd (11.4 ; 2.05)

250 RMN Composé CPC2-F16-P6 ArizX Ex6-C10 (dans CDCl 3 ) Dehydroeffusol 13 CH OH 3 4 4a 5a 8a 7 8 HO 2 1 1a 10 9 CH 3 11 C 17 H 14 O 2 (MM= 250 g/mol) N 1 H NMR 13 C NMR d (9.3) d (9.3) s s d (9.2) d (9.2) a a a a s dd (18.2 ; 11.4) dd (18.2 ; 2.05) 5.81 dd (11.4 ; 2.05) 114.5

251 RMN Composé CPCR2-F-C9 CPC-F16-13-P4 ArizX Ex6-C9 (dans CDCl3) Effusol 14 CH OH 3 4 4a 5a 8a HO 1 1a 10 9 CH 3 11 C 17 H 16 O 2 (MM= 252 g/mol) N 1 H NMR 13 C NMR d (9.3) d (9.3) s s a a a a s dd (17.5 ; 11.8) dd (17.5 ; 0.9) 5.28 dd (10.8 ; 0.9) 114.1

252 RMN Composé P2021 (dans CDCl3) Juncunol 14 CH CH a 5a 8a HO 1 CH a 10 9 C 18 H 18 O (MM= 250 g/mol) N 1 H NMR 13 C NMR d (9.3) d (9.3) (s) (s) a a a a s s dd (18.2 ; 11.4) dd (18.2 ; 2.05) 5.72 dd (11.4 ; 2.05) 113.7

253 ANNEXE 3. Les collections de souches bactériennes utilisées Liste des souches utilisées dans le Chapitre I Liste des souches utilisées dans le Chapitre I ouches N ouches (Gram positif) N Bactéries Citrobacter freundii Corynebacterium T Gram Citrobacter freundii Enterococcus faecalis C négatif Escherichia coli Enterococcus faecalis T26-B7 3 Escherichia coli Enterococcus faecalis T Escherichia coli ATCC Enterococcus faecalis T39-C11 5 Enterobacter aerogenes Enterococcus faecalis T37A4 6 Enterobacter cloacae Mycobacterium smegmatis Enterobacter cloacae taphylococcus aureus CIP224 8 Enterobacter cloacae taphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae taphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae taphylococcus aureus T erratia marcescens taphylococcus aureus erratia marcescens taphylococcus aureus Proteus mirabilis taphylococcus aureus T Providencia stuartii taphylococcus aureus T almonella sp taphylococcus aureus T25.9" 16 Acinetobacter baumanii taphylococcus aureus T Acinetobacter baumanii taphylococcus aureus T26.A4 18 Pseudomonas aeruginosa taphylococcus aureus T P. aeruginosa ATCC taphylococcus aureus T36.B1 20 tenotrophomonas maltophilia 22 taphylococcus aureus Yersinia pseudotuberculosis taphylococcus aureus T47.A12 22 Bactéries taphylococcus epidermidis taphylococcus epidermidis Gram Enterococcus faecalis C taphylococcus epidermidis T positif Enterococcus sp taphylococcus lugdunensis T26A3 25 taphylococcus aureus taphylococcus warneri T12A12 26 taphylococcus aureus taphylococcus pettenkoferi T taphylococcus epidermidis treptococcus agalactiae T lugdunensis T26A3 28 treptococcus agalactiae T53C2 29 taphylococcus warneri T12A12 29 treptococcus agalactiae T Corynebacterium T treptococcus agalactiae T40A2 31 Mycobacterium smegmatis treptococcus agalactiae treptococcus agalactiae T treptococcus agalactiae treptococcus dysgalactiae T46C14 34 treptococcus dysgalactiae T46C14 34 treptococcus agalactiae T 53C2 35 taphylococcus saprophyticus Levure Candida albicans treptococcus pyogenes

254 ANNEXE 4. Localisation des composés actifs par bioautographie Expérience 1 Expérience 2 Différences des composés actifs localisés entre deux expériences : en rouge, composés actifs contre. pyogenes ; en jaune, composés actifs contre. dysgalactiae ; en blanc, localisation du juncusol et du déhydrojuncusol (toluène/ acétate d'éthyle / acide formique ; 15:10:2,5 à 366 nm) Protocole. Les différents composés d un extrait sont séparés au préalable par la méthode de chromatographie sur couche mince (CCM). Le système de solvants utilisé a été ajusté pour avoir la meilleure séparation pour chaque échantillon testé (toluène/ acétate d'éthyle / acide formique : 15/10/2.5). Après migration, la plaque est séchée, puis laissée sous vide pendent 24 heures pour favoriser les conditions de stérilité. En parallèle à cela, treptococcus dysgalactiae T46C14 et treptococcus pyogenes sont cultivés dans des tubes contenant un milieu BH (Brain Heart cystéiné) puis incubées pendant heures dans une étuve à 37 C. Les souches ayant poussé, un volume de 5 ml est prélevée la culture microbienne pour être mis directement dans environ 30ml de gélose Columbia (CC), auquel 10 µl de solution de para-iodonitrotétrazolium (INT) à 2 mg/ml sont ajoutés. Les CCM développées et stérilisées sont introduites dans des boîtes à pétrie de forme carrée pour être couverte par la suspension gélose-bactérie-int. Les boîtes sont ensuite incubées pendant h à 37 C. Après incubation, l INT est transformée par une deshydrogénase en un composé d une couleur rouge foncé. Les résultats sont observables directement sur les plaques ; la présence de zones claires correspond aux zones d inhibition de la croissance bactérienne.