Laboratorio 2

DETERMINACIÓN DE
AZÚCARES REDUCTORES

QUÍMICA PATRICIA MILLAN CRUZ

MSc, PhD
 Azúcares reductores
Los Azúcares Se clasifican en reductores y no reductores con base en como se forma el
enlace glicosídico:

Característica para que El grupo hidroxilo en el carbono anomérico (carbono 1)

sea Azúcar reductor debe estar libre para poder reaccionar con otro
compuesto

Grupo hidroxilo en el carbono

anomérico (carbono 2) debe estar libre.
Los monosacáridos son azúcares En la fructuosa el carbono anomérico
reductores esta ubicado en el carbono 2
 Disacáridos reductores
Disacáridos reductores. El carbono anomérico de un monosacárido reacciona con un
grupo hidroxilo (OH) del otro, quedando libre el carbono anomérico del segundo
monosacárido y por lo tanto conservará sus propiedades reductoras y el fenómeno de
mutarrotación. (ejemplo: maltosa, celobiosa y lactosa)

.
 Disacáridos no reductores
Cuando la unión de los monosacáridos se efectúa entre los carbonos anoméricos
de cada uno, la molécula pierde su característica reductora al carecer de carbono
anomérico libre.

Este enlace glucosídico es muy particular porque se produce entre el carbono

anomérico del anómero α de glucosa con el carbono anomérico del anómero ß-
furanósido de fructosa, es decir, entre el carbono 1 de glucosa y el carbono 2 de
fructosa. Por tanto se pierde la característica reductora de los azúcares
Monosacáridos y disacáridos reductores
 Hidrólisis de Azúcares no reductores
Los azúcares que no son reductores como la sacarosa y los polisacáridos (almidón,
pectina, celulosa etc.; cuando se hidrolizan (reacción con ácido o enzimática), se rompe
uno o varios enlaces glicosídicos y se generan azúcares reductores

Azúcar no reductor Azúcares reductores

H+

Maltosa azúcar reductor

Almidón Polisacárido, no es azúcar no reductor
 Reacción de azúcares reductores
Azúcar reductor

Los monosacáridos se oxidan rápidamente y reducen otras sustancias como:

Soluciones alcalinas de cobre, plata, mercurio y bismuto, soluciones ácidas de
molibdato amónico y de acido selenoso.

Azúcar reductor

Azúcar reductor: debe tener un hidroxilo libre en el carbono hemiacetalico (C-1 o 2).
Carbono anomérico libre.
Esta reacción se puede utilizar para cuantificar azúcares.
Poder reductor de los monosacáridos
 Determinación de azúcares reductores
La mayoría de los métodos analíticos usados para determinar azúcares reductores
involucran detección colorimétrica basada en la reacción de oxidación del grupo
carbonilo del extremo reductor para producir una molécula que absorbe luz visible
y ultravioleta. Lo cual en último fin permite la cuantificación de la cantidad de
azúcar presente en una muestra por medio de espectroscopia.

Uno de los métodos más conocidos es la reacción de Fehling, el cual se basa en la

oxidación simultánea de grupos funcionales del azúcar y la reducción del cobre
(mediante la aplicación de calor), el cual absorbe luz a 520nm .

Existen también procedimientos de carácter cualitativo que permiten detectar la

presencia de carbohidratos en una muestra por medio de distintas reacciones,
además también hacen posible su identificación y diferenciación en base a
características propias de cada azúcar.
 Fenómeno de absorción de radiación
Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0 pasa a través de una
solución, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menor
que I0

Absortividad (a) absortividad molar”

(una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a
cada longitud de onda l y en unas condiciones experimentales determinadas; también se
denomina “coeficiente de extinción molar” si, como es frecuente, la concentración se
expresa en moles por litro.
Ley de Lambert:
cuando un rayo de luz monocromática
(I0) pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la Ley de Beer:
longitud del medio absorbente
Cuando un rayo de luz
aumenta
monocromática pasa a través de un
I = I0e-a medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente a
medida que la concentración del
medio absorbente aumenta
I = I0e-ac
Ley de Beer-Lambert
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Beer-Lambert donde la
fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la
concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relación entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de
radiación que ha sido absorbida por la muestra.

Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un
determinado espesor, l , la absorbancia A, medible directamente, es
proporcional a la concentración molar de la muestra, c, lo que constituye
el fundamento del análisis espectrofotométrico cuantitativo.
La Transmitancia (T) es la relación entre la intensidad de luz transmitida
por una muestra problema (I) con la intensidad de luz incidente sobre la
muestra (Io):

T = I / I0 Se expresa como % T

La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del recorrido b

a través de la solución y la concentración c del color absorbente. Estas
relaciones se dan como:

A = a·b·c

A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por litro.

Entonces la absortividad tiene unidades de l·g–1·cm–1.

 ¿Qué relación guardan la transmitancia y la
absorbancia?

De acuerdo a las características de la sustancia

analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solución

LUZ
A
B
S Luz transmitida
O
I0 R I
B
I
D T = I/I0
A
 Por lo tanto la absorbancia es reciproca de la transmitancia

Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

Absorbancia

Concentración
% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo negativo y
comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentración
La representación gráfica correspondiente a absorbancia y
transmitancia en un gradiente de concentraciones es la siguiente:

Concen
tración
 Espectrofotometría
Se le llama espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía
radiante que absorbe un conjunto de elementos o un elemento en su
estado puro, en función de la longitud de onda de la radiación lumínica y
a las mediciones a una determinada longitud de onda.

¿Cómo se puede medir la radiación que emiten o absorben los cuerpos?

Un aparato capaz de obtener el espectro de una radiación, es decir, de

separar la radiación en sus componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrógrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrómetro.
Cuando es capaz de medir también la intensidad de la radiación, se
llama espectrofotómetro.
 Colorimetría y Espectrofotometría como
procedimientos analíticos
Las técnicas colorimétricas se fundamentan con la medición de la absorción de
radiación visible por sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a determinar no posee coloración, es

necesario llevar a cabo un tratamiento de color empleando substancias que que
reaccionen de forma proporcional con el compuesto de interés
Las diferentes sustancias se analizan
mediante reacciones coloreadas. Cuanto
mayor es la concentración de la sustancia a
analizar mayor es el color de la reacción. También es posible que la
muestra pueda ser “leída”
cuando su espectro de
absorción se encuentra en las
regiones no visibles del
espectro, como las referentes
a las regiones de UV o
visión de las abejas infrarroja
 Espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un instrumento que descompone un haz de luz (haz
de radiación electromagnético), separándolo en bandas de longitudes de onda
específicas, formando un espectro atravesado por numerosas líneas oscuras y
claras, semejante a un código de barras del objeto, con el propósito de
identificar, calificar y cuantificar su energía
 Espectro de absorción
Cada compuesto (de complejo a
simple) presenta un espectro de
absorción característico.

Las longitudes de onda con mayor

absorción (picos) corresponderán
de forma general a aquellas con
las que se leerá la muestra para
determinar su concentración.

Espectro de absorción de pigmentos

La relación entre la absorbancia por

una sustancia a una longitud de onda
determinada y su concentración es
directamente proporcional es decir: a
mayor concentración mayor
proporción de luz absorbida.
 Curva patrón
El proceso de determinación de una concentración desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su absorbancia (curva
patrón), es posible interpolar (intercalar) la concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)

Con base en que la Absorbancia guarda una

relación lineal con la concentración, se
comprende la existencia de una relación de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la
concentración:

A1 / A2 = C1 / C2

Donde:

A1 = Absorbancia del problema.

A2 = Absorbancia de un estándar de
concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
A1 (problema) * Conc estándar C2 = Concentración del estándar.
Conc. (problema) =
A2 (estándar)

Si despejamos C1 = Concentración del problema

 Curva patrón
Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina; donde se
solubiliza este colorante únicamente en agua siendo por tanto el agua misma
el tubo blanco o de referencia para la calibración del equipo (colorímetro o
espectrofotómetro)

TUBO Stock de Safranina Agua Destilada ml

(3 x10 -4 g/ml) ml
1 0 10
2 0.05 9.95
3 0.10 9.9
4 0.20 9.8
5 0.40 9.6
6 0.80 9.2
 Resultado de una curva patrón
Absorbancia en el
Espectrofotómetro a 490 nm
Tubos Absorbancia
1 0
2 0.135
3 0.253
4 0.417
5 0.658
6 0.574

7 0.768

Curva que no cumple la ley de

Beer- Lambert Curva de calibración
0.8
Existen, sin embargo, distintos factores 0.7
que afectan al cumplimiento de la ley de 0.6
Absorbancia

Lambert-Beer, especialmente a 0.5

concentraciones elevadas. Por ello antes 0.4

de proceder al análisis de una muestra 0.3

0.2 y = 0.1015x - 0.0409
es preciso comprobar experimentalmente R² = 0.8133
0.1
el rango de concentraciones en que
0
dicha ley se cumple, obteniendo la curva 0 1 2 3 4 5 6 7 8
de calibración que relaciona las Tubos
absorbancias con las concentraciones.
 Determinación de azúcares reductores por
espectroscopia visible
Para el proceso de determinación de una concentración desconocida en una
muestra se hace a partir de concentraciones conocidas de las cuales también se
sabe su absorbancia (curva patrón), es posible interpolar (intercalar) la
concentración del problema sabiendo su absorbancia (línea roja en figura )
 Como se construye una curva patrón
1. A partir de concentraciones conocidas de un compuesto en este caso que es para
determinar azúcares reductores el compuesto conocido que se utiliza es la glucosa
que es un azúcar reductor.
2. Para esto se pesa una cantidad exacta de glucosa y se disuelve hasta un volumen
conocido. Esta solución se llama PATRÓN.
3. A Partir de la muestra patrón se preparan una serie de soluciones (entre 5-7),
tomando un volumen conocido y diluyendo a otro volumen conocido.
 Como se construye una curva patrón (cont)
4. A cada una de estas soluciones (que
corresponden a la curva patrón), se les

Absorbancia (no tiene unidades)

agrega el reactivo de Fehling y se calienta
por un tiempo determinado (exacto) para
que ocurra la reacción .
5. Al finalizar la reacción cada una de estas
soluciones se leen en el Y = mX + b
espectrofotómetro para determinar la
absorbancia de cada una de ellas. Cada
muestra absorberá luz de acuerdo a la
concentración, entre mayor es la
concentración mayor será la luz Concentración (mg/ml) o (μg/ml)
absorbida por tanto la absorbancia va a
ser mas alta. 8. Con la ecuación de la recta se puede
6. Se construye una gráfica en Excel de encontrar la concentración de una
absorbancia versus concentración; esta muestra desconocida
dará una línea recta de la cual se obtiene
Y = mX + b donde:
la ecuación de la recta :
Y = absorbancia (no tiene unidades)
m = pendiente (concentración)
Y = mX + b
b = intercepto
X= concentración
Calculo de la concentración en una muestra desconocida

Ecuación de la recta
Absorbancia (no tiene unidades)

Con la ecuación de la
recta se despeja X y se
obtiene la concentración
de la muestra
desconocida
Y = mX + b
Y = mX + b donde:
Y = absorbancia (no tiene
unidades)
m = pendiente
Concentración (mg/ml) o (μg/ml) b = intercepto
X= concentración
La absorbancia de la muestra desconocida es 0,2. al pasar Entonces X = (Y –b)/m
una línea desde la cocnetracción hasta la línea recta de la
gráfica y bajando se obtiene la concentración de la
muestra desconocida leída
 Cálculo concentración de azúcar en una muestra
desconocida
Se necesita conocer el contenido de azúcar en una muestra.
Para la preparación de la muestra se hizo lo siguiente:

Se tomó 2 gramos de muestra y se diluyó a 100 ml. Del balón se sacó una alícuota (0,5ml)de
la muestra y se llevó a un tubo de ensayo. A este tubo se le adicionó el reactivo de Fehling y
se llevó a cabo la reacción en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. El tubo de
ensayo con la muestra se enfrío, se le adicionó 10 ml de agua y se leyó la absorbancia en el
espectrofotómetro.
 Concentración de una muestra desconocida

Y = 0,0056X + 0,04

Cuando se leyó en el espectrofotómetro, la absorbancia leída fue de 0,265.

La ecuación de la recta obtenida de la curva patrón fue: Y = 0,0056 X + 0,04, cual es la
concentración de la muestra?
Se reemplaza en la ecuación de la recta la absorbancia leída de la muestra desconocida

O,265 = 0,0056 X + 0,04 al despejar;

X = (0,265 – 0,04)/ 0,0056 por tanto;
X = 40,18 mg/ml (esta es la concentración que hay en la cantidad de muestra
desconocida que se leyó en el espectrofotómetro que es la que estaba en el tubo de
ensayo)
 Cálculo del contenido de azúcar en la muestra
desconocida
En la muestra desconocida del ejercicio anterior se obtuvo la concentración de la
muestra que se leyó en el espectrofotómetro (un volumen conocido de esta muestra que
estaba diluida).

Para realizar el cálculo del contenido de azúcar en la muestra total, se deben utilizar los
factores de dilución .

Como se calcula el factor de dilución?

Se tomó 2 gramos de muestra y se diluyó a 100 ml en este caso el factor de dilución es:

100 /2 = 50
Calculo concentración que había en el tubo Factor de dilución
Como se calcula el porcentaje de azúcar en la muestra total? Este valor no debe
tener unidades estas
(40,18 mg/ml ) * (100ml/2 g) * (1g/1000mg) *100 = 2, 009 % se deben cancelar al
sacar los cálculos.
La muestra total tiene un contenido de azúcar reductor del 2 % % viene de multiplicar
por 100
 Cálculo del factor de dilución cuando se tienen
varias diluciones
Por ejemplo se necesita calcular el contenido de azúcar de una muestra. Para esto se
prepara la muestra siguiente:

Se toma 1 gramo de muestra y se diluye a 100 ml. Del balón se sacó una alícuota de 50
ml y se diluyó a 100 ml, de esta muestra se sacó una alícuota de 10 ml y se enrasó a 50
ml. Cual es el factor de dilución?

Muestra

Dilución 1
Dilución 2 Dilución 3
 Cálculo del factor de dilución cuando se tienen
varias diluciones (cont)

Como se calcula el factor de dilución?

Se tomó 1 gramo de muestra y se diluyó a 100 ml, de esta solución se tomó una
alícuota de 50 ml y se diluyó a 100 ml, y de esta última dilución se sacó una
alícuota de 10 ml y se enrasó a 50 ml en este caso el factor de dilución es:

(100/ 1) * (100/50) * (50/10) = 1000

Primera Segunda tercera

dilución dilución dilución
 Colores que puede tomar la soluciones con el
reactivo de Fehling

La muestra tiene alta La muestra tiene una concentración de azúcar aceptable para leer en el
concentración de azúcar espectrofotómetro
hay que diluir
 Porque hay que utilizar diluciones para determinar el
contenido de azúcar de una muestra?

Cuando se hace una curva de calibración

y se lee la absorbancia en el
espectrofotómetro debe cumplir la ley
de Beer -Lambert (figura de la derecha).
Debe obtenerse una línea recta en la
gráfica.

No cumple la ley
Muestra muy
diluida (amarillo)

Cuando se lee una absorbancia de una

muestra , esta debe caer en el rango de la
recta de calibración no puede estar ni por
debajo ni por encima porque no cumpliría
la ley de Lambert y Beer
Rango donde las lecturas de Rango donde las lecturas de una muestra no cumplen la ley son
una muestra cumplen la ley. muestras muy concentradas se salen del rango de la curva de
Coloraciones azules calibración (rojas intenso)
 Videos para ver como se hace en el laboratorio
la determinación de azúcares reductores
Azúcar reductor

https://www.youtube.com/watch?v=Loaa_agy5WU
ttps://www.youtube.com/watch?v=st7A-fyY3rc

Determinación de Azúcares reductores

https://www.youtube.com/watch?v=YHfiHmANbH8