CITOMETRÍA DE FLUJO.

Cyto-metría: células - medición

● Conteo de células en un sistema de flujo.
● Alto rendimiento, se cuentan miles de células en un pequeño lapso de tiempo
v/s
● Análisis citológico tradicional (microscopio)
● Conteo o análisis de un pequeño número de células
poder contar y analizar células en forma individual.

¿QUÉ ES EL SISTEMA INMUNE?

es una compleja red de células y proteínas
● funcion:
- proteger contra infección y cáncer
- generar memoria inmunológica

● características:
- altamente sofisticado
- ha evolucionado en millones de años
- altos niveles de redundancia.

LAS CÉLULAS

leucocitos: están las

plaquetas, linfocitos,
polimorfonucleares,
monocitos, y después están
los linfoides y aquí tenemos
a los linfocitos B, linfocitos T,
y células asesinas por
naturaleza.

Frotis sanguíneo es otra forma de mirar células, y uno las miras para ver si es qué hay
cuerpos de inclusión si hay hemólisis, parásitos, como por ejemplo anaplasma, y además
permite ver si es qué los neutrófilos son tóxicos, si los eritrocitos son muy pequeños o son
muy grandes, en conclusión es super util.
ANALYSING IMMUNE CELL POPULATIONS
Clinical setting?
● Hemograma
● Eritrocitos +
● Leucocitos
● Linfocitos
● Monocitos
● Neutrofilos
● Basofilos
● Eosinofilos
● Plaquetas
● Frotis sanguíneo
En citometría de flujo es agarrar la sangre y directamente ponerla en el sistema para ver
conteo de celulas pero también se puede separar las células, agarrando la sangre y
separando los leucocitos del resto y se pueden obtener linfocitos de la
sangre, del bazo y de la linfa.

OBTENCIÓN DE LINFOCITOS
fuentes de linfocitos
● Sangre (Células mononucleares de la sangre periférica)
● Bazo (esplenocitos)
● Linfa (aferente y eferente)
- Canulación
se puede hacer una canulación dependiendo del linfonodo qué se
trate, y puedo saber qué linfocito se está moviendo desde los tejidos hacia el linfonodo, o
tambien saber qué linfocito esta saliendo del linfonodo
Hay qué eliminar los eritrocitos porque nos va afectar todo el sistema, y hay unos líquidos
comerciales qué nos ayudan a separar las poblaciones de células dentro de la sangre.
¿Cómo eliminar eritrocitos?
● Separación por gradiente de densidad
- 1077 – CMSPs
- 1119 – granulocitos
● Eritrolisis

se coloca el líquido dentro de un tuvo, ese líquido especial de densidad específica (1077 o
1119) y se coloca la sangre encima, y después de centrifugar los eritrocitos se van al fondo
y va haber una interfase, con cierto tipo de células qué después nosotros lo podemos
conectar y hacer un análisis de esas células.

En el fondo sirve más la línea blanca porque tiene más importancia inmunológica, pero sirve
para todo. La idea de esto es tener una suspensión de células no un tejido.

Es para hacer análisis inmunológicos para ver qué poblaciones de células están presenten
en algún proceso infeccioso.
Se agarra la interfase, qué es donde están las células
mononucleares de sangre periférica, qué eso incluye a
los monocitos y a los linfocitos, en esta foto se puede
ver a los eritrocitos al fondo, lo de arriba el plasma y
entremedio la base donde están todas las células qué
yo quiero analizar.
La otra manera de eliminar a los eritrocitos es
rompiéndolos.
Una vez qué tenemos la suspensión de células qué
aún están vivas, las puedo cultivar o analizar, y ahi las puedo fijar con formalina, acetona,
ahi se mueren y las puedo teñir o las puedo teñir mientras están vivas, y la tinción en este
caso vuelve hacer con anticuerpos marcados qué es lo mismo qué vimos para la
inmunofluorescencia indirecta o directa.

Entonces si tenemos un linfocito CD4 de pollo yo puedo tener un marcador que es CD3 este
es el marcador de todos los linfocitos T y además un anticuerpo que se pegue al CD4 y por
lo tanto puedo tener un análisis que me diga “en una muestra X” cuántos de estos linfocitos
tiene la tinción verde que es del CD3 y cuantos la tinción café que es la del CD4.

Por lo tanto si tengo anticuerpos contra distintos marcadores de la superficie celular,

linfocitos B o T (CD3, CD4, CD8) por ejemplo, puedo hacer análisis de las combinaciones
de antígenos que estas células tienen en la superficie para saber de qué célula estamos
hablando y que está participando en un proceso infeccioso.

ANÁLISIS DE POBLACIONES DE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

Agarramos la sangre, los linfonodulos del bazo, hacemos una suspensión de esas células,
obtenemos esos linfocitos y después los podemos teñir con algún anticuerpos, y estos
anticuerpos vienen marcados directamente, y basta con un anticuerpo para tener el color
fluorescente en las células una vez qué yo las analizo y yo las puedo ver en el microscopio,
y si me lo permite puede ver fluorescencia verde o café, pero con ese análisis solo puedo
ver unas pocas células, y si las pongo en la máquina de citometría de flujo voy a poder
hacer un analisis de mucho más números de células

Marcadores de superficie celular

● CD4, CD8, CD3, TCR, MHC, IgM (BCR), etc
● Combinaciones de antígenos en sub-poblaciones celulares
- TH: CD3+, CD4+, αβTCR+

Son detectables usando

● Anticuerpos monoclonales obtenidos en ratones
● Muchos disponibles comercialmente (ratones)
● No marcados y marcados con fluoróforos
- FITC, PE, SPRD, AF647…
En general los anticuerpos son de ratones entonces agarro el CD4 lo purificó, y se lo inyectó
a ratones, y estos van a generar anticuerpos contra este CD4, después agarro los
anticuerpos de los ratones contra CD4 y los marcó con estos colores específicos.
Los marcadores son llamados Fluoróforos y hay de muchos colores distintos para poder
tener distintas marcas.

Técnicas
● Inmunofluorescencia
● Inmunohistoquímica
● Citofluorometría

Análisis de poblaciones de células del sistema inmune

Tinción normal Hematoxilina-eosina:

Bazo de pollo embebido en parafina fue teñido con anticuerpo de
ratón contra CD4 de pollo sin marcar, seguido por un anticuerpo
secundario anti-ratón marcado con HRP, DAB, y hematoxilina.
Todo lo que es café es lo que está teñido para el marcador CD4
en los linfocitos T.

Inmunohistoquímica:
Inmunofluorescencia de un centro germinal en el linfonódulo de un ratón 7
días después de una inmunización secundaria. Rojo: células dendríticas
(CD35); verde: células B del centro germinal (10% expresa GFP); azul:
células B ingenuas (IgD)

Citómetro de flujo

En el tubo pequeño se pone un tubo de ensayo con la suspensión de células y la máquina

comenzará a succionar esas células y las va a empezar a analizar, todo esto va a un
computador.

Análisis de poblaciones de células del sistema inmune basados en su fenotipo

Tenemos una suspensión de células que van pasando por un tubito y van pasando una a
una a través de un láser y tenemos lasers de distintos colores y de distintas características
pero en el fondo la luz del láser al chocar contra la célula, va a hacer que la luz del láser se
desvie un poco entonces la máquina tiene unos detectores que captan la luz que se desvió
hacia adelante y la que se desvió hacia el lado, la luz que se desvía hacia adelante sería el
Forward Scatter Detector y nos permite saber el tamaño de las células y la luz que se
desvía hacia los lados “Side Scatter Detector” nos permite saber la complejidad de la célula
o que tan granulares son, que tipo de organelos tienen adentro, ademas tenemos
detectores de fluorescencia entonces si yo tengo algo que es fluorescente verde el
fluorescencia verde lo va a detectar, si tengo algo amarillo, el detector amarillo lo detecta y
si tengo algo rojo lo detecta el rojo y así.

Entonces cada vez que pasa una célula individual tendremos un indicador de que tan
grande es, que tan granular es por ejemplo si fuera un granulocito, un polimorfonuclear va a
tener harta granularidad comparado con un linfocito que son mucho menos granulares, y
además de eso voy a tener información si es que tienen inmunofluorescencia de algún tipo,
y como se les coloca anticuerpos que si fluorescen, si son fluorescentes lo va a detectar y
los va a contar.

Toda esta información se va al computador.

Citometría de flujo – Poblaciones celulares

Esto es lo que nos da la maquina, entonces por un lado tenemos la desviación hacia
delante y por el otro lado la desviación hacia el lado y por lo tanto todas las células que
están aquí son células chiquitas y las celulas que estan aca son células grandes y a su vez
las celulas que estan aca abajo son en el eje Y celulas muy poco granulares y las celulas
que estan arriba son muy grandes por la desviación de la luz, en el eje X es el tamaño de la
célula.

El color indica el número de células, entonces cada uno de los puntos indican un grupo de
células.
Ahora cuando yo hago mi suspencion las células por
algún motivo se pueden juntar y se aglutinan, forman
estas unidades que son como estas llamadas
DOBLETES, que son dos células juntas entonces la
máquina va a decir “esta es una célula super grande”,
entonces después dentro del análisis tenemos que
eliminar las celulas que estan pegadas porque no
sirven ya que están alterando los datos.

FACSverse – DOS lasers

Las máquinas de dos láser pueden ver 6 colores, pero algunas tienen 5 láser y pueden ver
30 colores, Por lo tanto si yo tengo marcadores que puede usar con estos anticuerpos con
distintos colores puede analizar hasta 6 cosas distintas, entonces cada vez que la célula
pasa, va a ver si es grande, si es granular y además va a medir 6 fluorescencias distintas.

Tipos de tinciones y láseres que usó el profe,

podemos tener muchos marcadores para
distintas cosas que están en la superficie de la
célula y esto me permite saber que células
específicas están en la muestra que yo estoy
analizando, entonces si uso suficientes colores al
final voy a saber exactamente qué células estoy
mirando.
Inmunofluorescencia (directa o indirecta)

El sistema para analizar estas células es con inmunofluorescencia directa en general,

entonces en vez de tener las células en un vidrio las tenemos en suspensión, le agregamos
el anticuerpo primario lo lavamos, las colocamos en la máquina y esta hace el análisis.

Análisis de poblaciones de células del sistema inmune

EJEMPLO: CD4-Alexa fluor

Se están contando 50 y tantos mil células y esto
es lo que me está dando en tamaño y
granularidad y hago un analisis y me permite
sacar los que son células individuales de las que
están pegadas

Se observan células individuales y doblones las

cuales no quiero analizar porque la maquina me
va a dar datos equívocos, y una vez que tengo
eso le digo al computador que muestre todas las
que tienen fluorescencia CD4, se hace el análisis
marco las células que yo se que son los
linfocitos, se muestran tanto los fluorescentes como los que no, entonces yo se que todos
los que están aquí son fluorescentes para CD4 y por tanto se que son linfocitos T
ayudadores con certeza porque tienen el marcador CD4 o expresar como gráfico y entonces
tengo todas estas células y hacer un análisis para contar todas las que son positivas pero
que no cuente las que son negativas.

Se tienen 56.000 sacamos los dobletes los que se transformaron en 51202, después le digo
que agarre estos linfocitos y ya no son esa cantidad 18000 y de los otros que son el 20% de
esas celulas tienen CD4, cada cosa la va contando

MARCADORES DE SUBPOBLACIONES DE LEUCOCITOS

Ejemplo de que tan complejas pueden ser
las células inmunes que se analizan, por
ejemplo tenemos linfocitos T como interés y
entonces los podemos marcar según su
receptor de célula T, los cuales son de dos
tipos alfa beta o gamma beta y dentro de ala
beta están los CD4 Y CD8, pero además
tenemos los gamma delta raro que sean
CD4 pero si CD8, pero existe la posibilidad
de los gamma delta no tenga CD8 y esos
son linfocitos inactivos , por otro lado
tenemos CD8+ algunos brillan poco o
mucho donde tienen canada alfa y beta con
sus respectivos marcadores
Se pueden analizar la población específica que se está actuando en el sistema

CITOFLUOROMETRÍA DE FLUJO

Tenemos cuadros donde están las células (19000), por

ejemplo tenemos una combinación de células, y le digo
que me cuente los linfocitos y después que de esos
cuales son CD4, cuales tiene fluorescencia CD4 y CD8 ,
donde se pueden dividir en 4 cuadrantes, los de baja
fluorescencia CD4-CD8 donde no tienen ninguno de los
dos marcadores, CD8+, CD4+ y CD4+CD8+ muy común
en bovinos y pollos

En este lado tenemos receptor gamma delta y por el otro

lado CD8, tenemos a todos los gamma delta + y CD8-,
gamma delta - y CD8+ …. y asi todas las combinaciones
de células, si tengo 6 colores son combinaciones de 6
cosas
ESTRATEGIA DE SELECCIÓN Y ANÁLISIS?

Voy a tener a mis leucocitos que

saqué de la sangre, los voy a
identificar para saber que son celulas
individuales y no dobles
(supercelulones) y por ejemplo hacer
análisis de los monocitos, pero
además puedo separar a los linfocitos
(+, -) y hacer todas las
combinaciones posibles que yo
quiera

4 días después de la infección - Medias

Finalmente qué es lo que tengo,

estos eran pollos que habían sido
infectados con un virus y cuatro días
después les habíamos sacado
muestra de sangre y se hizo todo el
análisis, se agarró la sangre , se
separaron los linfocitos por
centrifugación con gradiente de
densidad, separamos las células,
tinción con gammadelta, CD8, CD4 e
se hizo el análisis para distintos tipos
de pollos y algunos no estaban
infectados y otros están infectados
con dos tipos de virus distintos.
permite hacer comparaciones, un
virus produce una respuesta inmune distinta a otro virus , y lo mismo para comparar cepas
virales , especies virales….
PURIFICACIÓN DE CÉLULAS DEL SISTEMA
INMUNE
Usando sus propiedades físicas
● Densidad > gradiente (contínua or paso)
● Tamaño + densidad > elutriación
centrífuga
Depleción
● Anticuerpos + Complemento
● Perlas magnéticas (MACS)
Clasificación (separación) de células
● Selección positiva o negativa

Por un lado podemos hacer análisis de las células,

mirarlas y ver si son fluorescentes o no, contarlas,
%... pero también se puede hacer separar células
(clasificación de células por su magnetismo,
entonces en vez de tener anticuerpos marcados
con fluorescencia, estos están marcados con unas
perlitas que son magnéticas.
entonces tengo las células, anticuerpos con punta magnética, entonces puedo separar las
células por magnetismo, las pasos por un tubito con imanes y por lo tanto todas las células
que tienen ese anticuerpo pegado se van a pegar al iman y los que no pasan de largo y
después sacó los imanes y lo que está pegado se va a soltar y voy a tener una población
única de células con un marcador específico que yo estoy buscando o al revés y decir tengo
esta muestra y quiero eliminar todas las células que tengan este marcador , osea tengo
todos estos linfocitos pero yo no quiero exterminar a los linfocitos B , solo a los D , entonces
marco los linfocitos B los cuales quedan pegados

SEPARACIÓN DE CÉLULAS POR SU FENOTIPO

● Carga positiva o negativa se aplica a las células,
dependiendo de su tamaño, granularidad or
fluorescencia
● Células cargadas son desviadas por un campo
electrostático
● Placas a altos voltajes (+/- 3000 volts)
● Células desviadas se recolectan en tubos
● Pureza > 95 %

Máquina más sofisticada pero en el fondo es lo mismo,

pasa la celula marca la fluorescencia y le digo a la
máquina que a mi me interesa que en este tubito estén
todas las células que son CD8+ y la maquina mira la
fluorescencia y reconoce las fluorencias CD8 y va a poner unas cargas eléctricas y va a
desviar las células (derecha o izquierda) por lo tanto vamos a tener un tubo lleno de células
CD8 y otro con CD4, puedo tener células únicas celulares para hacer experimentos por
ejemplo.
ASPECTOS COMUNES DE TODAS LAS TÉCNICAS:
Dependen de tener los reactivos apropiados: tengo que tener los anticuerpos específicos
para el marcador que ando buscando, si quiero CD4 tengo que tener un marcador anti CD4
y no bastan con solo eso debe ser de la misma especie del animal que estoy buscando y
eso lo hace complicado porque muchas veces no existen marcadores de especies
específicas y se deben hacer o comprar
● Antisuero (primario y/o secundario)
● Controles positivos y/o negativos
● KITS COMERCIALES
Dependen de tener los equipos necesarios:
● Citómetro de flujo
● Clasificador de células
Metodologías
● Lavados entre pasos son MUY importantes para eliminar uniones inespecíficas