Técnicas de inmunodiagnóstico: electroforesis, ELISA e inmunoquimioluminiscencia

“Técnicas de difusión en gel y electroforesis.
Inmunoensayo de ligandos”
Inmunología Clínica
UNIVERSIDAD DE SONORA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS
DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
Hermosillo, Sonora a lunes 05 de octubre del 2020

Técnicas de difusión en
gel
y
electroforesis

Introducción.
Contexto histórico
● Siglo XIX: Primeros trabajos basados en
electroquímica
● Arne Tiselius en 1931 desarrolla el “aparato de
Tiselius”
● Ouchterlony desarrolla técnicas inmunológicas.
Örjan Ouchterlony
(1914–2004)

Electroforesis.
Generalidades
¿Qué es?
Técnica de separación de moléculas con
base
en su carga neta en un campo eléctrico.
Fines:
● Analíticos
● Preparativos
● Métodos inmunoquímicos. Electroforesis en agarosa

La electroforesis:
● Utiliza distintos medios de soporte, por ejemplo: poliacetato de celulosa.
● Geles como la agarosa.
● pH 8,2 - 8,6
Las inmunoglobulinas, en promedio, poseen poca carga en este pH por lo que
migran poco desde el punto de aplicación.

Técnicas de difusión en gel.
Inmunodifusión doble por Ö. Ouchterlony
● Análisis cualitativo
de antígenos.
● Reacción antígeno-
anticuerpo por
medio de una
precipitación.

● 2 Antígenos + anticuerpo homólogo = rx de identidad
● 2 Antígenos no relacionados + mezcla anticuerpos específicos = rx no identidad
● 1 Antígeno homólogo + antígeno menos afín = Rx de identidad parcial
Reacción de identidad
parcial
Reacción de no
identidad
Reacción de identidad
Posibles patrones

Reacción de identidad parcial.

Radioinmunoensayo
● El radioinmunoensayo
desarrollada en 1959 por Yalow
y Berson.
● Uso de material radioactivo.
● Precursor de los ensayos
inmunoenzimáticos.
Rosalyn Yalow (1921-2011)

¿Por qué ya no se usa el radioinmunoensayo?
● Algunos radioisótopos poseen vidas medias muy
cortas.
● Riesgos considerables para la salud.
● Entrenamiento y permisos especiales.
● Sistemas de desecho apropiados

ELISA (Ensayo por Inmunoabsorción ligado a enzimas)
Principio básico: aprovechamiento de unión antígeno-
anticuerpo, generando reacciones fácilmente observables
y/o medibles.
Clasificación de ELISA:
● Directos
● Indirectos
● Sandwich
● Competitivo
Generalidades

Términos importantes
● Fase Sólida
● Anticuerpo Primario
● Anticuerpo Secundario
● Cromóforo

Consideraciones
● Es adecuado para detectar antígenos de alto peso molecular.
● Se considera que es el ELISA más simple y rápido.
● Sin embargo, presenta desventajas:
○ Marcaje directo de anticuerpos primarios requiere:
■ Mucho tiempo
■ Dinero
■ Especificidad comprometida.

Detección simultánea del antígeno p24 de HIV-1 y de anticuerpos
anti HIV-1 y anti HIV-2
● ELISA indirecto y Sandwich aplicado en una
sola prueba.
● Fase sólida:
○ Antígenos: gp41 de HIV-1 y gp36 de HIV-
2
○ Anticuerpos monoclonales anti-p24
● Se utiliza mezcla de antígenos y anticuerpos
marcados con biotina
● Uso de conjugado de peroxidasa unido a
estreptavidina
Biotina
Estreptavidina

● Lo que permite un cambio de color visible es añadir tetrametilbencidina (TMB) y H2O2.
● TMB actúa como donador de hidrógeno para la oxidación de H2O2 mediante peroxidasa.
● TMB forma una diimina de color azul y luego vira a amarillo al añadir ácido sulfúrico
(stopper)
H2SO4 Viraje a amarillo,
leible a 450 nm
Prueba positiva a VIH -> Viraje a azul y amarillo
Prueba negativa a VIH -> Sin cambios

ELISA competitivo
● Se utiliza para detectar o cuantificar antígenos presentes
en bajas cantidades.
● Este tipo de ELISA es el más complejo.
● También conocida como ELISA de inhibición.
● Se requiere que el anticuerpo primario tenga una alta
especificidad para el antígeno.
● Método directo
● Método indirecto

Estudio de ELISA competitivo de la Proteína de Cadena Neuronal en
orina en la enfermedad de Alzheimer
● Elisa competitivo directo.
● La proteína de la cadena neuronal (NTP) aumenta
en pacientes con demencia.
● Puede cuantificarse en la primera orina del día del
paciente
● Fase sólida:
■ Antígeno estándar de la proteína NTP

● Anticuerpo IgG marcado con fosfatasa alcalina.
● sustrato p-nitrofenil-fosfato reaccionara con la fosfatasa alcalina ligada al
anticuerpo.
● La reacción se detiene con NaOH mostrando una coloración amarillenta.
Viraje a amarillo,
leible a 405 nm
NaOH
Prueba positiva para NTP: no se mostrará una coloración o
habrá una variación con los valores estándar.
Prueba negativa para NTP: viraje a amarillo

Inmunoquimioluminiscencia
● Basada en la técnica ELISA (sándwich o
competitivo)
● Uso de éster de acridina, luminol o AMPPD.
● Emisión de una señal de luz directa o
inversamente proporcional a la concentración
de la molécula de interés.
● Bajo volumen tanto de muestra como de
reactivos.

Referencias.
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https://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis#Historia
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https://en.wikipedia.org/wiki/Ligand_binding_assay

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