Métodos inmunológicos: Técnicas de precipitación en gel
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Métodos inmunológicos: Técnicas de precipitación en gel
- 1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Curso teórico de Inmunología Métodos inmunológicos Junio / 2016
- 2. Índice Métodosinmunológicos A. Técnicasde precipitaciónengel Inmunodifusiónsimple (Mancini)………………………………………………………………………………….1 Inmunodifusióndoble (Oüchterlony)…………………………………………………………………………….2 Inmunoelectroforesis……………………………………………………………………………………………………3 Inmunoelectroforesissimple…………………………………………………………………………………………4 Inmunoelectroforesisdoble…………………………………………………………………………………………..5 Contrainmunoelectroforesis………………………………………………………………………………………….6 B. Aglutinación Aglutinacióndirecta………………………………………………………………………………………………………7 Aglutinaciónindirectaopasiva……………………………………………………………………………………..8 C. Complemento Fijacióndel complemento……………………………………………………………………………………………9 D. Neutralización Nutralizaciónde virus ytoxinas……………………………………………………………………………………10 E. Inmunofluorescencia Por microscopía………………………………………………………………………………………………………….11 Por citometríade flujo…………………………………………………………………………………………………12 F. Radioinmunoensayo………………………………………………………………………………………..14 G. Técnicasinmunoenzimáticas ELISA ………….……………………………………………………………………………………………………………….15 Inmunoelectrotransferencia……………………………………………………………………………………….16
- 3. Inmunohistoquímica…………………………………………………………………………………………………..17 H. Intradermorreacciones…………………………………………………………………………………..18 I. Transformaciónblastoide……………………………………………………………………………….19 J. Mediciónde citocinas…………………………………………………………………………………….20 K. Técnicasde mediciónde citotoxicidad……………………………………………………………21
- 4. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunodifusión simple (Mancini) FUNDAMENTO La inmunodifusiónradial (IDR)esunatécnicaque puede determinar cuantitativamente la concentración de un antígeno. Es una técnica sensible que es usada clínicamente para detectar niveles de proteínas plasmáticas. Un anticuerpo es incorporado en agarosa fundida, la cual es vertida en una superficie inerte y se deja solidificar. Una vez solidificada, se elaboran pequeños pozos en la agarosa, y estos son llenados con concentraciones conocidas de antígeno correspondientes al anticuerpo, con el objeto de construir una curva de calibración. Las muestras desconocidastambiénse colocandentrode lospozosal final de las muestras para la curva de calibración. Los antígenosensolucióndifundiránhaciafueradelpozoen un patrón circular rodeando al pozo. El anticuerpo está presente enexcesoyladifusióndel antígenocontinuará hasta que se forme un precipitadoantígeno-anticuerpo en forma de anillo estable. Habrá complejo Ag-Ac en toda la zona circundante al pozo dentro de la línea de precipitación. En esta línea es donde está presente el mayor número de complejos, ya que en ese punto el antígenoy el anticuerpoestánen proporcionesiguales. Esta es conocida como la zona de equivalencia. USOS La Inmunodifusión Radial Cuantitativa fue el primer procedimiento analítico que permitió cuantificar en forma sencilla, precisa y exacta la concentración de proteínas especificas en fluidos biológicos. Por su simplicidad, rapidez y escaso requerimiento técnico, continúa hoy siendo el métodode referencia y la alternativa de elección en pequeños y medianos laboratorios. VENTAJAS Es un método sencillo de realizar en laboratorio, los materiales y reactivos que se utilizan son económicos DESVENTAJAS El desarrollode lareacciónesmuylentoylasensibilidad del método es muy baja.
- 5. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunodifusión doble (Oüchterlony) FUNDAMENTO En este método se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se depositan antisueros específicos en los pozos centrales y los estándares de proteínas y los problemas en los pozos circundantes.Al difundirlasmuestrasenel gel,dondeel anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia, se formanbandas de precipitadosinsolubles.Laposicióny formade labandase determinansegúnlaconcentración del antígeno y del anticuerpo, y sus tamaños. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente. USOS Identificación de sistemas Ag-Ac múltiples, establecimiento de la relación inmunológica entre dos antígenos, realizar estimaciones de la pureza de un antígeno o anticuerpo. Análisis semicuantitativo de la concentración de antígeno. Conocimiento del Título precipitante de un antisuero. VENTAJAS Método relativamente rápido, pueden determinarse varios aspectos inmunológicos a través del método. Es un método sencillo. DESVENTAJAS 1. Es necesarioque lasconcentracionesde Agy Ac sean similaresode locontrario no se alcanza la equivalencia ynose formael precipitado.El precipitadosolose forma en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag. 2. Las moléculasmáspequeñasmigranconmás rapidez que las de gran tamaño y conforme la migración continúa el precipitado puede redisolverse y volverse a formarde acuerdocon loscambiosde concentraciónde Ag o Ac en el gel. 3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antígeno no se difunde muylejosantesde alcanzar la equivalenciayel anillo es más grueso o espeso. 4. La sensibilidad de este método es muy baja
- 6. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunoelectroforesis FUNDAMENTO La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes componentes proteicosa travésde arcos de precipitación,que tienen movilidad electroforética semejante, pero poseen diferente peso molecular y/o diferentes determinantes antigénicos. La inmunoelectroforesis se realiza preferentemente en geles agarosa y se distinguen dos etapas: 1) la muestra de proteínas se somete a separación electroforética. 2) terminada la electroforesis, las proteínas son precipitadas con antisueros poli o monoespecíficos, aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de migración. Luego de un período de difusión en cámara húmeda,se observanarcosde precipitacióncuyaforma y posición dependen de las características inmunoquímicasyde laconcentraciónde cadaproteína. USOS Diagnóstico de gamopatías monoclonales, mieloma y macroglobulinemia de Waldeström. Evaluación de gamopatías monoclonales encontradas en electroforesis de proteínas séricas, enfermedades linfoproliferativas (linfomas malignos y otras) y enfermedades del tejido conectivo en general. Diagnóstico y caracterización de estados inmunodeficientes y disgamaglobulinemias. VENTAJAS Permite identificar substancias en mezclas muy complejas y en concentraciones muy bajas DESVENTAJAS Requiere que dichas substancias sean inmunogénicas y depende de los anticuerpos utilizados, por lo que es difícil de estandarizar.
- 7. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunoelectroforesis simple FUNDAMENTO Consiste en el transporte electroforético de proteínas antigénicasatravésde unaláminaconagarosa,que a su vez contiene incorporado un anticuerpo específico resuspendido, se realiza una serie de posos y en cada uno se coloca una muestra a un pH que le proporcione una carga negativa y se hace pasar una corriente electrica. Una vez finalizado el corrimiento, en la placa se observan dicersas manchas que terminan en forma de estelade cohete;el áreaque se encuentapordebajo del área del cohete será la concentración de antígeno. USOS Estudiode elementosde concentracióndesconocida, haciendounacurva de calibraciónyen lamismaplaca aplicandolasmuestrasproblemasparapoderobtener estaconcentración. Por mencionar un ejemplo se puede determinar la concentración de albúmina en orina de pacientes con enfermedades renales. VENTAJAS Es una técnicacuantitativaenla que se puede construir una curva estándar representando altura frente a concentraciónde Ag,esunmétodocuantitativosencillo y económico. DESVENTAJAS El antígeno debe migrar hacia el polo positivo en la electroforesis,portanto,esconvenienteparaalbúmina, transferrinayceruloplasmina,peroparaotras proteínas como las inmunoglobulinas es más conveniente la inmunodifusión radial, entonces es un método poco sensible y funcional.
- 8. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunoelectroforesis cruzada FUNDAMENTO También llamada Inmunoelectroforesis cuantitativa de dos dimensiones, difiere del método de análisis inmunoelectroforetico enel hechode que lasproteínas, tras su electroforesis inicial, no se incuba con anticuerpos. En su lugar, se vuelven a someter a una segunda electroforesis, esta vez en un gel que además de buffer y agarosa, contiene los propios anticuerpos contra la proteína de interés, de forma que es durante esta segunda operación cuando se forman los inmunoprecipitadoscadaprecipitadotendrásuspropias características migratorias, con lo cual, cada banda que veamos corresponderá a un antígeno diferente, y además podremos, según la posición del precipitado, conocerla cantidadde proteína así como la cantidadde anticuerpo específico en el gel. Se puede realizar una relativa cuantificación de los componentes. La sensibilidad de este ensayo es similar al análisisinmunoelectroforéticoconvencional,perohay múltiplesvariacionesde latécnicaque lahacenmasútil según el propósito concreto. USOS Este tipode inmunoelectroforesishasidoespecialmente usado en estudios de proteínas sericas y extractos biológicos, en estudios generales. VENTAJAS Cada banda corresponde a un Ag diferente además de conocer la cantidad de proteínas y Ac especifico empleado en el gel DESVENTAJAS El método aunque tiene alta sensibilidad es superado por otros con mayorsensibilidad,especificidadymenor costo.
- 9. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Contrainmunoelectroforesis FUNDAMENTO Es una inmunodifusión doble acelerada por el paso de corriente eléctricaa travésde un gel ensoluciónbuffer comomediode difusión,esmuyimportante quelacarga neta del Ag sea (-) y Ac sea (+) y que seancolocadosen el lugaradecuadoen el campoeléctrico(que viajenuno al encuentro del otro). El Ag y el Ac se colocanen orificiosrealizadosenel agar y se les aplica una corriente eléctrica El antígeno migra de manera progresiva a la zona del anticuerpo donde sucesivamente se une más y más a las moléculas del anticuerpo, en esencia con un aumento artificial de la concentración efectiva de anticuerpo y, en consecuencia, forma una línea de precipitado. USOS Se utiliza para comparar antígenos y evaluar su pureza, era utilizada para diagnósticos rápidos de algunas infecciones bacterianas y virales. VENTAJAS Es un métodorápido y sensible;lasensibilidadesde 10-20 vecesmasque enel métodode Mancini. DESVENTAJAS Es únicamente unmétodocualitativo,nosirve para determinarconcentracionesde antígenos.
- 10. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Aglutinación directa FUNDAMENTO Losprincipiosfisicoquímicosque gobiernanlaformación de estos aglutinados son los mismos que gobiernan la formación de un precipitado, la zona de exceso de antígeno,lazona de equivalenciaylazona de excesode anticuerpo, son válidas y aplicables a las reacciones de aglutinación. La gran diferencia entre las reaccionesde precipitación y las reacciones de aglutinación son las características del antígeno: mientras que en las reacciones de precipitación se emplean antígenos solubles, en las reacciones de aglutinación el Ag es particulado. Las reacciones de aglutinación directa se basan en que los Ag que intervienen en la reacción son componentesnaturalesde laparticulayson empleados en bacterias, levaduras, linfocitos y eritrocitos, por lo que resultan útiles para la detección y titulación de Ac en distintos fluidos biológicos. USOS Principalmente la identificación de grupos sanguíneos, pero también es muy utilizada en la identificación clasificación de microoorganismos aislados de diversas fuentes como puden ser exudadosm sangre, alimentos aguas negras etc. El ejemplo principal en la identificación de grupos sanguíneos es la hemoaglutinación. VENTAJAS Son pruebas que no requieren de mucho tiempo y además son sencillas de realizar, no requieren equipo para llevar acabo su lectura por lo que son de fácil interpretaciónademástienenmayorsensibilidadquelas reacciones de precipitación. DESVENTAJAS Presentanunamenorsensibilidadque las reaccionesde interacción primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia indirecta. Esto hace que en determinados casos se prefiera el empleo de una de estas 2 técnicas para la detección de Acs contra un determinado agente patógeno.
- 11. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Aglutinación indirecta FUNDAMENTO Cuando se tiene un Ag soluble, es posible diseñar una reacciónde aglutinacióngraciasaque es posible utilizar distintaspartículas(partículasinertesoglóbulosrojos)y realizar un acoplamiento artificial ya sea químico o fisicoquímico del Ag soluble a dichas partículas, generando de esa manera un Ag particulado útil para fines diagnósticos. Se refiere a la aglutinación de las célulasrecubiertasde antígenooalas partículasinertes que son portadoras pasivas de antígenos solubles, es decir se puede sensibilizar una partícula inerte, que generalmente es látex o células como eritrocitoscon el antígeno cuya presencia se quiera demostrar y posteriormente se pone encontacto la muestracon las partículas sensibilizadas para observar o no una aglutinación, en caso de aglutinación positiva los anticuerpos contra el antígeno están presentes en la muestra. USOS Uno de los ejemplos mas comunes de aglutinación indirectaesladeterminaciónde laproteínaCreactivao factor reumatoide, los cuales se utilizan para identificaciónde diversasenfermedadesenunpaciente, aunque no es un diagnóstico único. VENTAJAS Son rápidas y sencillas de realizar, no requieren equipo para llevar acabo su lectura por lo que son de fácil interpretaciónademástienenmayorsensibilidadquelas reacciones de precipitación. En adición es una técnica muy flexible donde podemos usar cualquier Ag de interés y acoplarlo a un soporte. DESVENTAJAS Presentanunamenorsensibilidadque lasreaccionesde interacción primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia indirecta. Esto hace que en determinados casos se prefiera el empleo de una de estas 2 técnicas para la detección de Acs contra un determinado agente patógeno.
- 12. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Fijación del complemento FUNDAMENTO Se basa en la capacidad hemolítica sobre eritrocitos sensibilizados con anticuerpos específicos (hemolisina). La reacción entre la cantidad de complemento adicionada y la hemólisis producida se comporta en formade curva sigmoide yporlotanto soloel centrode la curva es lineal y es ahí donde los cambios pequeños en la cantidad de complemento adicionado se reflejan en un grado proporcional de hemólisis. La concentracióndel complementose determinaporla dilución límite del suero que lisa los eritrocitos sensibilizados. En general este metodose basaen la lisisde eritrocitos sensibilizados que puede ser cuantificada para establecer un valor de fijación de complemento en un individuo. USOS La evaluación del C' en el laboratorio clínico tiene importancia en diversas situaciones. En el estudio por inmunodeficiencias,se buscanposiblesdefectoseneste sistema, los cuales por lo general consisten en la ausenciaolaafuncionalidadde algunodelosfactoresde la cascada, por causas genéticas. y la actividad de la enfermedad. En las enfermedadesautoinmunes,el C' juegaun papel importante enla lesióna lostejidosysu determinación puede orientareldiagnóstico,asícomoayudaraevaluar el curso y la actividad de la enfermedad. VENTAJAS Esta técnicaproporcionaunavisiónglobal de la funcionalidaddel sistemade complementosinla necesidadinmediatade determinarcadauno de los componentes DESVENTAJAS Para realizar esta determinación se deben tener controlados, ya que la magnitud del complemento depende en gran medida del número de eritrocitos utilizados,su fragilidad,cantidad y clase de hemolisina, fuerza iónica del medio de reacción, concentración de calcio y magnesio, pH, temperatura, tiempo de incubación, etc. Posee limitaciones, tales como su baja sensibilidadparadetectardisminucionesenel C' sérico
- 13. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Neutralización de virus y toxinas FUNDAMENTO En el caso de los virus y toxinas, se puede medir la capacidad que un determinado suero tiene para neutralizar la efectividad del virus o de la toxina sobre una línea celular sensible. Se añade una mezcla de virus/toxina a una concentración constante que previamente ha estado en contacto con diferentes diluciones del suero problema sobre las células. Se van observandolascélulassobre la que se han añadidoslas distintas diluciones para ver si el antígeno las ha infectado o no mediante la tinción con un conjugado o por el efecto citopático. De esta forma se puede medir la capacidad de neutralización de un suero problema. USOS En cuanto a los virus, este método se usa como referencia para cualquier estudio serológico y se empleanfrecuentemente paralaidentificaciónde virus desconocidos y medir el título de Ac específicos en sueros(Seroneutralizaciónvírica) mediante diluciones. En cuanto a toxinas este métodose puede utilizar para envenenamientos por picaduras de animales ponzoñosos, inyectando un antisuero para neutralizar las toxinas introducidas en la mordedura o picadura. VENTAJAS Son altamente específicas y sensibles,y se consideran las pruebas de referencia para cualquier valoración serológica. Enlaneutralizaciónde toxinasesunmétodo rápido. DESVENTAJAS En cuanto a neutralización de virus las pruebas son laboriosas, requieren de cultivos celulares, esterilidad, además de ser generalmente más lentas que otras técnicas. En cuanto a neutralización de toxinasse corre el riesgo de presentar la enfermedad del suero, aún cuando se eliminó la porción inmunogénica de los anticuerpos.
- 14. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunofluorescencia por microscopía FUNDAMENTO La microscopia de inmunofluorescencia es una técnica que consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos o antígenos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Existen dos tipos de inmunofluorescencia por microscopía: DIRECTA : Es una técnica que consiste en demostrar la presenciade unantígenomediante reaccióndirectacon un anticuerpo específico marcado con colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a través de la inoculacióndel microorganismoproductordel antígeno en un modelo animal. INDIRECTA : Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo. USOS Esta técnica tiene múltiples aplicaciones endiagnóstico e investigación. Se ha utilizado en estudios bacteriológicos, virales, parasitológicos. Se ha utilizado en el estudio de la distribución intracelular de las moléculas. VENTAJAS Método Directo: Rápido y sencillo. Metodo indirecto: Mas sensible. Un mismo Ac secundario puede reconocer distintos Ac primarios (generados en la misma especie).
- 15. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunofluorescencia por citometría de flujo FUNDAMENTO La técnicade inmunofluorescenciase suele utilizarenel estudio de poblaciones de células de sangre periférica. Actualmente el análisis de una suspensión de células vivasmarcadas con un fluorocromose realizamediante un citómetro de flujo. La suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas. Las células pasan por un campo de detección atravesado por un potente rayo láserque produce la dispersiónde la luz y la activación de la fluorescencia. Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblacionesen estudio en función de sus propiedades fisicoquímicas y del marcaje efectuado. Para la separación celular este aparato lleva acoplado un sistema que carga eléctricamente las células y con placas deflectoras se realiza su separación. Además de basarse en la detección de la fluorescencia emitida por las células marcadas, también lo hace en otras propiedades diferenciales de las células en estudio como tamaño (FSC), complejidad (SSC), etc. La señal producida como consecuenciade la excitacióndel fluorocromo,permite conocer el porcentaje de células reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imágenes en dos dimensiones (Dot-Plot) o enuna dimensión(Histograma)enlasque se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas. USOS La técnicade inmunofluorescenciase suele utilizarenel estudio de poblaciones de células de sangre periférica. Actualmente el análisis de una suspensión de células vivasmarcadas con un fluorocromose realizamediante un citómetro de flujo. VENTAJAS Brindainformaciónacercadel tamaño,lagranularidado complejidadcelular,comoasí tambiénde la emisiónde fluorescencia en el caso de que la célula haya unido un anticuerpo marcado con un fluorocromo. DESVENTAJAS Debidoa lasespecialescaracterísticasde loscitómetros de flujo, la muestra a analizar debe encontrarse en formade suspensiónmonodispersa.Haymuestrascomo la sangre periférica, médula ósea, u otros fluidos biológicos, que precisan de un mínimo procesamiento; en cambio los tumores sólidos o las muestras parafinadasnecesitande unadisgregaciónmásomenos intensa (mecánica, enzimática, etc.).
- 16. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Radioinmunoensayo FUNDAMENTO La técnica de radioimnunoanálisis (RIA) permite cuantificar la presencia de pequeñas cantidades de un determinado Ag o Ac en una muestra biológica. Si bien es una técnica sumante sensible, enla actualidadno es tan utilizada como lo era antes y ha sido reemplazada por otras técnicas que no utilizan radioisótopos. La técnica se basa en la inhibicióncompetitiva de la unión de unAg marcadoradiactivamente consuAcespecifico, por parte de Ags idénticosnomarcadospresentesenla muestraaanalizar.Pararealizarlatécnicadebecontarse de antemanocon: 1) Acs específicoscontrala molécula a cuantificar (esa molécula puede ser un Ag o una inmunoglobulina), 2) la molécula a cuantificar marcada radioactivamente y 3) la muestra a analizar (donde se encuentra la molécula a cuantificar). Tal como puede verse en el esquema, los complejos inmunes formados por la molécula marcada (Ag caliente) y el anticuerpo específico se enfrentan a la muestra que posee la molécula sin marcar (Ag frío). Si la concentración de Ag frío es mayor, se producirá el desplazamiento del Ag caliente yporlotanto,laradioactividadde loscomplejos Ag-Ac irá disminuyendo, mientras que la radioactividad de la fracción de Ag libre aumentará. Realizando una curva patrón con concentracionesconocidasde Aglibre puede calcularse, luego, la concentración de Ag en la muestra biológica. USOS Usos: Se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeñas y mezcladas con muchas otras. VENTAJAS Es una técnicamuysensible ymuyespecífica.Utilizando anticuerpos de gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de antígeno. DESVENTAJAS Manejo especial, debido al uso de compuestos radioactivos. Peligro a la salud.
- 17. Fundamento Usos Ventajas Desventajas ELISA FUNDAMENTO Esta técnica, también se conoce como ensayo de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificaciónde loscomplejosAg-Ac,se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antígeno, o bien unidas al anticuerpo. Se conocen diferentes tipos de ELISA, los mas importantes son: El métododirectopermite ladeteccióndel antígenocon un anticuerpo específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. En el método indirecto el antígeno reacciona con el anticuerpo específico. El complejo antígeno-anticuerpo es entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es el que está marcado enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar diferentes antígenos. En ambos métodos, la reacción enzimática puede serdetectadaya que la enzimaque enpresencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este productoes cuantificadoespectrofotográficamente con un lector ELISA. Aunque también existe el ELISA en sándwich, ELISA de inhibición y ELISA competitiva. USOS La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático ampliamente empleado en el área médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentancambiosendiferentesestadoscomo pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitosofasesactivasde enfermedadesautoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos,inmunoglobulinascontraantígenosde patógenos,toxinas,antígenos.Lastécnicasde ELISA son también muy usadas en los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés en cada caso. Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo. VENTAJAS Especifico y de alta sensibilidad y no requiere de radioistopos como en el caso de RIA. DESVENTAJAS Costosodebidoa la necesidadde un lectorde este tipo de reacción.
- 18. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunoelectrotransferencia FUNDAMENTO Es una técnica muy sensible que permite identificar antígenos y anticuerpos. La técnica de Western Blot se basa en la separación electroforética de proteínas en geles de poliacrilamida, la transferencia (blotting) de dichas proteínas a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa o nylon) y la posterior detección de una o más bandas identificadas por Acs específicos. La migración de las proteínas se realiza en presencia de detergentes(Dodecil Sulfatode Sodio,SDS) afinde que su migración dependa fundamentalmente de peso molecular(PM) de lospéptidos.Asídescripta,latécnica permite investigar la presencia de un antígeno dado en una mezclade proteínaspresentesenunadeterminada muestra y para ello se debe disponer del Ac específico para marcar la membrana. Sin embargo, la técnica de Western Blot es también muy útil para la detección de Acs específicos en sueros. Si se desea detectar Acs específicos,debe contarseconel Agde interésseparado por electroforesisytransferidoaunamembrana,lacual se incubará con el suero a analizar. Posteriormente esa membranadeberáincubarse conel segundoanticuerpo marcado con la enzima para poder detectar las bandas específicas. USOS La técnica de Western Blot para determinar la especificidadde los Acs contra Ag del virus de HIV esla pruebaconfirmatoriade elecciónparalos casos en que los sueros de los pacientes dieron un ELISA positivo. VENTAJAS Uno de losprincipalesargumentosafavorde laWestern Blot es su sensibilidad. Debido a su capacidad para detectar un mínimo de 0,1 nanogramos de proteína en una muestra, la técnica puede servir teóricamente herramientade diagnósticotempranocomoeficaz.Otra ventaja importante es la especificidad, por lo que los diagnósticos son certeros. DESVENTAJAS A pesar de su sensibilidad y especificidad, un Western blot puede aún producir resultados incorrectos. falsos positivos cuando un anticuerpo reacciona con una proteína que no se espera. Falsos negativos cuando el procedimientonoesel correctoy la transferencianoes completa.Ademásestatécnicaconllevaaltoscostos de anticuerpos marcados, analistas y equipos de laboratorio.
- 19. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Inmunohistoquímica FUNDAMENTO La inmunohistoquimica es un procedimiento que combina técnicas inmunológicas con técnicas histoquímicaaenlaobservaciónde lostejidos,paraeso debe hacerse primero una inmunomarcación de la muestra (o antígenos). Las técnicas de inmunomarcación utilizando Ac conjugados permiten detectar la presencia de Ags en tejidos (inmunohistoquímica). La imunomarcacion de tejidos se realiza sobre cortes de tejidofijado montado sobre un portaobjetos. A través de estas técnicas es posible detectar tanto Ags celulares (de membrana, citoplasmáticos o nucleares) como extracelulares (matriz extracelular, membrana basal, etc.)Una vez realizada la inmunomarcación (directa o indirecta) la presencia del Ac conjugado con la enzima se evidencia por el agregadode un sustratoincoloro.La acción de la enzimasobre el sustratogeneraun producto coloreado que precipita en el lugar donde ocurrió la reacción y es visualizado al microscopio óptico. Los sustratos incoloros que viran a un producto coloreado se los conoce con el nombre de cromógenos.El hechode que existan distintos cromógenos capaces de generar productos de distinto color, permite que puedan detectarse Agdiferentesenunmismocorte de tejidoo célula USOS La inmunohistoquímica tiene utilidad diagnóstica en identificación de diferenciación y de marcadores pronósticos de neoplasias (marcadores tumorales). VENTAJAS Las técnicas inmunohistoquímicas enzimáticas permite una localizaciónmásprecisade lasreacciones,yaque la tinción es permanente, estable, puede contrastarse y puede ser evaluada con microscopiode luz. El material así estudiado puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción. Los anticuerpos monoclonalesha permitido aumentar la especificidad, sensibilidad y gama de esta técnica. DESVENTAJAS Presencia de reacción inespecífica, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales, algunos reactivos son potencialmente carcinógenos y su manipulación debe ser cuidadosa, requieren estandarización precisa y estricto control de calidad.
- 20. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Intradermorreacciones FUNDAMENTO Las células que participan en este mecanismo son los linfocitos T y son los responsables patogénicos de la dermatitis por contacto y del rechazo a trasplantes. De cuatro a ocho horas después de ingresar la sustancia extraña induce vasodilatación y edema; asimismo se forma un infiltrado perivascular mixto en la dermis profunda, constituido por linfocitos e histiocitos, con algunosbasófilosyneutrófilos.El antígenoesprocesado por las células de Langerhans o los macrófagos (células presentadoras de antígenos, CPA) y presentado al linfocito T, que sufre numerosas mitosis del que se obtienen células de memoria,proceso conocido como transformación. La segunda vez que el mismo antígeno penetre la dermis será presentado a los linfocitos T de memoria previamente sensibilizados, que se multiplicarán y producirán linfocinas que actúan sobre losneutrófilos,macrófagosyotroslinfocitosresultando en hipersensibilidad retardada; asimismo, se induce un aumento de la permeabilidad vascular y se activa el sistemade coagulación.Lafibrinaobtenidaatrapaotras proteínas y constituye un gel, responsable de la induración observada en estas reacciones juntocon los histiocitosylinfocitos.Lareacción alcanza su máximoa las 24 horas de la inyección y, en ocasiones, se observarán vesículas o necrosis, además de induración en el sitio de la aplicación. USOS Las pruebas intradérmicas o intradermorreacciones se hanutilizadodurantemuchosañosparavalorardiversas funciones cutáneas, para el diagnóstico de algunas enfermedadesen las que la piel se encuentra afectada, para tratamientode procesosalérgicosy principalmente para determinar la hipersensibilidad inmediata o retardada. La hipersensibilidad retardada (HSR) se refiere a la respuesta inmunitaria de tipo celular. Ésta depende de linfocitos T CD4+ funcionales, por lo que estaspruebasse usan para evaluarlainmunidadcelular en pacientes en quienes se sospecha cursan con una infección, en inmunodeficiencias o en valoraciones pretrasplante opretratamientoconagentesbiológicos. VENTAJAS Pruebasde bajocosto,detectafácilmente algún contacto con unorganismopatógeno.Sonpruebas fácilesde aplicar DESVENTAJAS Su principal limitación es que una reacción positiva no necesariamente significaque lossíntomas sondebidosa una reacción mediada por Lc T, debido a que sujetos libres de síntomas también puedentener IgE alergeno- específica. Incluso familiares directos asintomáticos de individuos alérgicos tienen mayor número de pruebas positivas que la población general. Ello obliga a una cuidadosa interpretación de las mismas y siempre correlacionarlasconlaclínica.Puedenexistirreacciones cruzadas.
- 21. Fundamento Usos Ventajas Desventajas ç Transformación blastoide FUNDAMENTO Los linfocitos experimentan importantes transformacionesespecíficastantoinvitrocomoinvivo. El estudiode las transformacionesinvitroha permitido estudiar los conceptos de la transformación in vivo. En ciertas condiciones, los linfocitos cultivados in vitro experimentan una transformación a células inmaduras grandes.El aspectode estascélulasesparecidoal de los blastos. Este método se fundamenta en la capacidad de un linfocito de responder a un estímulo (antígeno) y presentar una respuesta, como es la transformación. Para estose marcanlinfocitosconunisótoporadiactivo, el cual se expone a un antígeno; si se libera linfocina (factor de la blastogénesis) aumenta el número de linfocitos,locual se puededeterminarmediante conteo. En caso de que no aumente el número de linfocitos aunque estén frente al antígeno, no hay linfocitos sensibilizados y no hay factor blastogénico, por lo que no hay transformación blastoide. USOS Se haempleadolatransformaciónblásticainducidapara estudiar la competencia de los linfocitos y la respuesta inmune en una serie de enfermedades metabólicas hereditarias mediante cultivos y proliferación de linfocitos. Asi Como en la capacidad de respuesta inmunológicayproporciónenel individuode linfocitos. VENTAJAS Puede hacerse un estudio in vitro para demostrar el funcionamientode loslinfocitosante diversosestímulos y correlacionandoloobtenidoinvitroconloque sucede in vivo conocer el estado funcional de los linfocitos. DESVENTAJAS Aunque es un método que puede representar el funcionamiento de los linfocitos in vivo hay muchos factores que no pueden controlarse que afectan el funcionamientode lascélulasinvitrocomoel efectode reguladoras celulares, citocinas y otras células que participan en la activación natural.
- 22. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Medición de citocinas FUNDAMENTO Las citocinas, son un grupo de glucoproteínas solubles de bajo peso molecular, responsables de la comunicaciónintercelularyque atravésde laactivación de receptores específicos de membrana, activan mensajeros intracelulares regulando la transcripción génica e induciendo de esa manera el crecimiento celular, inflamación, inmunidad, diferenciación y reparación, entre otros eventos biológicos. Las mediciones de la expresión de citoquinas pueden hacerse desde el nivel nuclear con la detección de los niveles de expresión de los genes que se están transcribiendo. Esta técnica consiste básicamente en la extracción de fragmentos de (ácido ribonucléico (ARN) de una mezcla compleja, la cual se somete a una electroforesis en gel separando de esta manera los fragmentos en base a su tamaño. Cuandolas cantidadesde citoquinassonmuypequeñas o el número de células disponibles para estudiar se expresión, se recurre a técnicas mucho más sensibles como la transcripciónreversaseguidade la reacciónen cadena de la polimerasa (RT-PCR). En cuanto al nivel proteico, las citoquinascomúnmente son medibles con la técnicade ELISA, Ensayopor inmunoabsorciónligado a enzimas). Esta técnica de inmunoensayo permite fijar a un soporte sólido un anticuerpo monoclonal frente a la citoquina en estudio, luego se añade un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente que cataliza esta reaccióny generaun producto cuya intensidadde color es fácilmente medible por espectrofotometría. Existen variantes de esta técnica como el ELISPOT que permite conocer la frecuencia de células sintetizadoras de una determinada citocina. Se han diseñado los Array Multiplex o inmunoensayos múltiples los cuales están disponibles en diferentes formatos basados en la utilización de la citometría de flujo, la quimioluminiscencia, o la tecnología electroquimioluminiscencia.Estatécnicapermite medir hasta 25 citocinas simultáneamente. USOS Debido a su importancia como mediadoras de la respuesta inmune, su determinación es esencial para realizar el correcto diagnóstico de diversas enfermedades y infecciones como por ejemplo patologías renales donde se determinan las Interleucinas 6 y 8 que están presentes durante una infección urinaria o bien para detección temprana de riesgo de rechazo en un trasplante por tan solo citar algunos ejemplos. VENTAJAS Existe una gran variedad de metodologías para determinar las sustancias en estudio DESVENTAJAS En cuanto a las técnicas genéticas sunque son buenas técnicas para detectar pequeños cambios en la expresiónde genes,esmuysensiblealadegradaciónde la muestra por parte de RNAsas generadas por contaminación ambiental.
- 23. Fundamento Usos Ventajas Desventajas Medición de citotoxicidad FUNDAMENTO La actividad citotóxica de loslinfocitos T CD8+ y células NKfrente a unacélulablanco(diana) se puede estudiar, midiendo la capacidad citocida, que las células mencionadas tienen para destruir un determinado númerode célulasdiana,al estarambas poblacionesen contacto. Se puede medir mediante el marcaje de las células diana con Cr51 , posteriormente se ponen en contacto con un número conocido de linfocitos T citotóxicos o células NK y después de un tiempo de incubación se mide el cromo libre, el cual es liberado después de la muerte de la célula diana marcada por causa de las células citotóxicas. USOS Para determinar en un paciente la funcionalidad de las célulascitotóxicascomosonloslinfocitosTy las células NK frente a diversas infecciones a las que pueda enfrentarse. Determinar también la capacidad de la toxicidad para eliminar agentes antigénicos en el organismo. VENTAJAS Es un método sensible y exacto por el marcaje de células, además es un método cuantitativo muy específico. DESVENTAJAS Utilización de elementos radiactivos para el marcaje de lascélulas,loque puede resultarndañosala saludpara el personal que realizalatécnica,auncuandoseaa argo plazo.