2.11: Hidrólisis peptídica
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A pH neutro la hidrólisis no catalizada de amidas o péptidos
\[R-CO-NH-R' + H_{2}O \rightleftharpoons R-COO^{-}+R'-NH_{3}^{+} \tag{2.18}\]
es un proceso lento, con constantes de velocidad tan bajas como 10 -11 s -1. La hidrólisis peptídica catalizada por carboxipeptidasa o termolisina puede alcanzar valores de k cat de 10 4 s -1. La química orgánica nos enseña que la hidrólisis de amida es catalizada de manera relativamente eficiente por ácidos y bases. Los mecanismos generales implican la protonación del oxígeno carbonílico (o nitrógeno amida), y la adición de OH - (o de un nucleófilo general) al átomo de carbono del carbonilo. Se ha encontrado que varias bases orgánicas e inorgánicas son catalizadores razonablemente eficientes. Por otro lado, los acua-iones de metales de transición o los complejos de iones metálicos pequeños también muestran eficiencia catalítica (Cuadro 2.8). 107-114 Un ion metálico es un ácido de Lewis, capaz de polarizar eficazmente el enlace carbonilo por coordinación metal-oxígeno. Además, el ion metálico puede coordinar un grupo hidróxido de tal manera que existe una alta concentración de OH a pH neutro o ligeramente alcalino. Por lo tanto, es concebible que una metaloenzima pueda combinar algunas o todas estas características y proporcionar un catalizador muy eficiente.
| Compuesto | Catalizador y condiciones | Constante de velocidad | Referencia |
|---|---|---|---|
| Glicina amida |
pH 9.35 Cu 2+, pH 9.35 |
1.9 x 10 -5 s -1 2.6 x 10 -3 M -1 s -1 |
107 107 |
| [Co (en) 2 (amida de glicina)] 3+ | pH 9.0 a | 2.6 x 10 -4 s -1 | 108 |
| D, L-fenilalanina etiléster |
pH 7.3 Cu 2+, pH 7.3 |
5.8 x 10 -9 s -1 3.4 x 10 -2 M -1 s -1 |
109 109 |
| (tn) 2 O 3 PO—C 6 H 4 NO 2 | OH - | 5.1 M -1 s -1 | 110 |
| Co III — (tn) 2 O 3 PO—C 6 H 4 NO 2 | — a | 7 x 10 -5 s -1 | 110 |
| \(\beta\)Etil-fenilpropionato |
H + OH - |
5 x 10 -3 M -1 s —1 1.3 x 10 - 6 M -1 s -1 |
111 111 |
| Trifosfato de adenosina |
pH 5.3 Cu 2+, pH 5.3 |
5.6 x 10 -6 s -1 1.1 x 10 -2 M -1 s -1 |
112 112 |
| Metiléster de glicina |
Co 2+ (1:1), pH 7.9 Cu 2+ (1:1), pH 7.3 |
1.6 x 10 -2 s -1 4.2 x 10 - 2 s -1 |
113 113 |
| Propiléster de glicina |
Co 3+ (1:1), pH 0 Co 3+ (1:1), pH 8.5 |
1.1 x 10 -3 s -1 >1 x 10 -2 s -1 |
114 114 |
Se ha realizado mucho trabajo experimental en la simulación de la hidrólisis de ésteres y especialmente péptidos con compuestos de coordinación de modelos. La mayor parte del trabajo realizado ha involucrado 108,110,115,116 cobalto (III), aunque tal ión puede no ser el mejor modelo concebible para reacciones hidrolíticas promovidas por zinc (ver Sección IV.G), tiene la gran ventaja de ser sustitucionalmente inerte, eliminando así las ambigüedades mecanicistas debidas a equilibrio entre estructuras isoméricas en el transcurso de la reacción, También se han descrito interesantes reacciones de hidrólisis de amida utilizando complejos con otros iones metálicos, como el cobre (Il) 117 y el propio zinc (Il) 118. En los últimos años los esfuerzos se han centrado en la construcción de catalizadores bifuncionales para imitar o probar mejor la función enzimática. Por ejemplo, los grupos fenólicos y carboxílicos pueden colocarse al alcance de amidas quelatadas con Co (III) en modelos de peptidasa. 116 La presencia del grupo fenólico acelera claramente la hidrólisis amida, pero los grupos carboxilo son ineficaces. Esta química modelo es demasiado simple para proporcionar información sobre el mecanismo enzimático real, que debe comenzar por reconocer el sustrato a través de varios pasos, orientarlo, activarlo, realizar la reacción y finalmente liberar los productos. Consulta las revisiones más especializadas que tratan sobre la reactividad no enzimática. 119-121
A partir del conocimiento básico de la química de las reacciones hidrolíticas, las estructuras de rayos X de la carboxipeptidasa A y una variedad de sus derivados con inhibidores como análogos de sustrato, análogos de productos y análogos de estado de transición han revelado varias características del sitio activo que son potencialmente relevantes para el mecanismo catalítico (Figuras 2.26-2.28 Ver sección de placa de color, páginas C4, C5.). 122 El ión metálico se coordina a dos residuos de histidina (His-69 e His-196), a un residuo de glutamato que actúa como ligando bidentado (Glu-72), y a una molécula de agua. El metal es así accesible al disolvente y, como tal, puede activar la desprotonación de una molécula de agua para formar un ion hidróxido, o polarizar el oxígeno carbonilo del sustrato coordinándolo en el lugar de la molécula de disolvente, o ambos, si se permite cierta flexibilidad de la esfera de coordinación. Otro residuo de ácido glutámico (Glu-270) está muy cerca del centro metálico. Si el papel del metal fuera principalmente polarizar el carbono carbonílico, Glu-270 en su forma desprotonada podría posicionarse para realizar un ataque nucleofílico sobre el carbono carbonilo, produciendo un intermedio anhídrido. Alternativamente, el metal podría servir principalmente para proporcionar un ion hidróxido coordinado que, a su vez, podría atacar el carbono carbonilo; aquí Glu-270 ayudaría a formar ZnOH transfiriendo el protón al grupo carboxilato:
En el lado opuesto de la cavidad se encuentra un residuo de tirosina que ha demostrado ser bastante móvil y por lo tanto capaz de acercarse al sitio donde ocurren los eventos catalíticos. La cavidad tiene un bolsillo hidrófobo que puede acomodar el residuo, R, de aminoácidos C-terminales no polares del péptido sometido a hidrólisis (Figuras 2.26 y 2.28), lo que explica la mayor eficiencia con la que se escinden los péptidos C-terminales hidrófobos. Finalmente, un Asn y tres restos Arg se distribuyen en el dominio de unión al péptido; Asn-144 y Arg-145 pueden interactuar a través de enlaces de hidrógeno con el grupo carboxilo terminal. Arg-127 puede unir hidrógeno al oxígeno carbonílico del sustrato.
Todas estas características han permitido una interpretación detallada de muchos datos químicos y fisicoquímicos a nivel molecular. Los datos esenciales son los siguientes:
- Sustitución de metales. En el Cuadro 2.9 se enumeran los metales divalentes que han sido sustituidos por zinc (II) en CPA, junto con sus actividades relativas de peptidasa (y esterasa). 22 Para algunos de ellos, los datos de rayos X disponibles muestran 123 que la estructura del sitio activo se mantiene esencialmente. Incluso el derivado de cobre es ligeramente activo. Sin embargo, la apoenzima es completamente inactiva.
| Péptidasa | Esterasa | |
|---|---|---|
| Apo | 0 | 0 |
| Cobalto | 200 | 110 |
| Níquel | 50 | 40 |
| Manganeso | 30 | 160 |
| Cadmio | 5 | 140 |
| Mercurio | 0 | 90 |
| Rhodium | 0 | 70 |
| Plomo | 0 | 60 |
| Cobre | — b | — b |
- Modificaciones en sitios activos. Los experimentos de modificación química y mutagénesis dirigida sugieren que Glu-270 es esencial para la catálisis. 124,125 Tyr-248, 126 Tyr-198, 127 y una o más de las argininas 124 están involucradas pero no esenciales.
- Cinética. Los perfiles de pH k cat /K m tienen forma de campana, caracterizados por un ácido pK a, miembro alrededor de 6 y un pK alcalino una extremidad alrededor de 9: k cat aumenta con el pK a de 6 y luego se nivela, y K m aumenta con a pK a de 9. Varias líneas de evidencia sugieren que el pK a\(\approx\) 6 corresponde a la ionización del resto H 2 O coordinado con Glu-270:
\(\tag{2.19}\)
La mutagénesis dirigida ha descartado Tyr-248 como el grupo con el pK a de 9 en la enzima de rata. 125,126 Desafortunadamente, en esta enzima el pK a de 9 se observa en k cat en lugar de K m; por lo que la situación para la enzima bovina más estudiada aún no está clara. Tyr-248 favorece la unión del sustrato de tres a cinco veces más que el derivado de Phe-248 mutagenizado. 126 Los tres posibles candidatos para este pK a, son el agua coordinada, Tyr-248, y el His-196 coordinado con metal, cuyo anillo NH no está unido a hidrógeno a ningún residuo proteico. 128 Los datos de rayos X a diferentes valores de pH muestran un acortamiento del enlace Zn-O al aumentar el pH. 129 Esto favorece la hipótesis de ZnOH.
- Vinculación aniónica. El metal se une a ligandos aniónicos solo por debajo de pH 6, es decir, cuando Glu-270 está protonado, cuando Glu-270 es químicamente 130 o genéticamente 125 modificado, o cuando aminoácidos aromáticos o moléculas relacionadas se unen en el dominio de unión C-terminal (Arg-145 + bolsillo hidrófobo). 131-134
- Intermedios. Se pudo haber identificado un intermedio anhídrido que involucra Glu-270 para un sustrato hidrolizado lentamente. 135 Algunos otros intermedios se han observado espectroscópicamente a temperaturas bajo cero con el derivado de cobalto (II). 22,136 Los péptidos se unen en un paso rápido sin alterar las propiedades espectroscópicas del cobalto (II), después de lo cual se forma y se acumula un aducto metálico. 22 Así, si se forma un intermedio de anhídrido, se encuentra más a lo largo de la trayectoria catalítica.
A partir de estos datos, y de muchos experimentos relacionados, se puede formular un mecanismo detallado (Figura 2.29). El péptido entrante interactúa con los residuos de arginina a través de su grupo carboxilato terminal. La interacción podría implicar inicialmente Arg-71 (no mostrado); entonces el péptido se deslizaría suavemente a su posición final de acoplamiento en Arg-145, mientras que el residuo R, si es hidrofóbico, se mueve hacia el bolsillo hidrófobo (Figura 2.29B). El oxígeno carbonílico forma un fuerte enlace de hidrógeno con Arg-127. La estabilización adicional podría provenir de los enlaces de hidrógeno de Tyr-248 al penúltimo péptido NH. Este aducto podría ser el primer intermedio sugerido por la crioespectroscopía 22,136 (Figura 2.24).
En este punto el hidróxido unido a metal, cuya formación es asistida por Glu-270, podría realizar un ataque nucleofílico sobre el carbón carbonílico activado por Arg-127 y posiblemente, pero no necesariamente, por una interacción electrostática adicional del oxígeno carbonilo con el ion metálico. La estructura del análogo de sustrato\(\alpha\)\(\beta\) -R-fenilpropionato muestra que el carbonilo se une de manera bidentada:
El sistema luego evoluciona hacia la ruptura del enlace C-N, causado por la adición de un protón al nitrógeno amino. Este protón podría provenir de Glu-270, que con ello regresa al estado ionizado. La ruptura del enlace peptídico podría ser la etapa limitante de la velocidad. 22 El segundo protón requerido para transformar el nitrógeno amino en un grupo NH 3 + podría provenir del grupo carboxílico coordinado del sustrato, que ahora porta un protón en exceso, nuevamente a través de Glu-270 (Figura 2.29D). El sistema mostrado en la Figura 2.29D puede, de hecho, verse como un complejo ternario con un ligando carboxilato y un zwitterión de aminoácido, unidos sinérgicamente. 131-134 Finalmente, el metal retrocede para recuperar un ligando Glu-72 bidentado, y el péptido escindido sale, mientras que otra molécula de agua se agrega al ion metálico y comparte su protón con el grupo carboxilato libre de Glu-270.
Una vez realizada la hidrólisis, el aminoácido escindido aún interactúa con Arg-145 y con el bolsillo hidrófobo, mientras que el grupo amino interactúa con Glu-270. El grupo carboxilato del nuevo aminoácido terminal interactúa con el zinc. Esta imagen, que es un paso posterior razonable en el mecanismo catalítico, encuentra apoyo de la interacción de L- y D-fenilalanina con carboxipeptidasa. 131-134,138
Este mecanismo, basado esencialmente en la reciente propuesta de Christianson y Lipscomb, 137 subraya el papel del resto Zn—OH en la realización del ataque nucleofílico tanto como lo hace la anhidrasa carbónica. Este mecanismo puede aplicarse con ligeros cambios en la termolisina 139 y otras proteasas. La termolisina escinde enlaces peptídicos en algún lugar de la cadena peptídica. El mecanismo podría ser muy similar, involucrando zinc unido a dos histidinas y Glu-166 (Figura 2.31). 139 Glu-166 es monodentado. El papel de Glu-270 en el CPA es interpretado por Glu-143 y el papel de Arg-127 lo juega His-231.