Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
et de la Prévention Médicale
République
du
Sénégal
Réseau National de
Laboratoires du Sénégal
1ère Edition
Rédaction : Janvier 2004
Révision : Novembre 2008
1ère Edition
Rédaction : Janvier 2004
Révision : Novembre 2008
Coordonnateur :
Professeur Ahmad Iyane Sow,
Coordonnateur du Réseau National de Laboratoires
Equipe de Rédaction :
Pr. Moussa Fafa Cissé : Médecin-Chef des Laboratoires, CHNU Albert Royer
Pr. Jean Marie Dangou : Laboratoire d’Anatomie Pathologique, FMPOS
Dr. Abdoulaye Séga Diallo : Laboratoire de Cyto-Génétique, FMPOS
Pr. Aïssatou Gaye Diallo : Laboratoire de Bactériologie, CHNU Le Dantec
Dr. Ousmane Diop : Laboratoire de Virologie, Institut Pasteur de Dakar
Pr. Saliou Diop : Centre National de Transfusion, Service d’Hématologie
Pr. Yémou Dieng : Laboratoire de Parasitologie, CHNU de Fann
Dr. Roughyatou Ka : laboratoire de Bactériologie, CHNU de Fann
Dr. Abibatou Sall : Laboratoire de Biologie, CHNU A. Le Dantec
Pr. Niama Diop Sall : Laboratoire de Biochimie CHNU A. Le Dantec
1.1.2. En Hématologie
Hémogramme
Vitesse de sédimentation
Test d’Emmel
Taux des réticulocytes
Temps de saignement
Temps de Quick (Taux de prothrombine et INR)
Temps de céphaline activée (TCA)
Dosage du fibrinogène
Groupage sanguin dans les systèmes ABO et Rhésus
1.1.3. En Parasitologie
Dans le sang :
Recherche directe d’hématozoaires : goutte épaisse et frottis sanguin
Recherche indirecte d’hématozoaires : Test d’immunochromatographie ICT, Optimal, Paracheck
etc …
Recherche directe de Trypanosomes et de microfilaires
Dans les urines
Recherche directe de Schistosoma haematobium, de Trichomonas vaginalis,
de microfilaires, de levures.
Dans les selles :
Recherche des kystes, amibes, œufs et parasites par un examen direct
Identification macroscopique de vers intestinaux
Dans le LCR :
Recherche de cryptocoque à l’encre de chine.
1.1.5. En Biochimie
Dans le sang :
- Glycémie
- Azotémie
- Cholestérol total
- Créatininémie
- Ionogramme (Na, K, Cl)
- Protidémie
- Albuminémie
- Bilirubinémie
- Transaminases (ASAT, ALAT)
Dans les urines :
- Albumine
- Sucre
- Corps cétoniques
1.2.2. En Hématologie
Hémogramme
Vitesse de sédimentation
Test d’Emmel
Taux des réticulocytes
Temps de saignement
Temps de Quick (Taux de prothrombine et INR)
Temps de céphaline activée (TCA)
Dosage du fibrinogène
Dosage des PDF
Dosage du D-Dimère
Groupage sanguin dans les systèmes ABO et Rhésus
Recherche de l’antigène D faible
Test de Coombs direct
Test de Coombs indirect
Test de compatibilité au laboratoire entre poche de sang et receveur
Dépistage et identification des agglutinines irrégulières
1.2.4. En Bactériologie
Urines :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Dénombrement des germes urinaires
Identification
Antibiogramme
Pus :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
Sécrétions broncho-pulmonaires :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
Sécrétions ORL :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
1.2.5. En Biochimie
Dans le sang :
- Glycémie
- Azotémie
- Cholestérol total
- Cholestérol HDL
- Triglycérides
- Créatininémie
- Ionogramme (Na, K, Cl)
- Protidémie
- Bilirubinémie
- Transaminases (ASAT, ALAT)
- Amylasémie
- Calcémie
- Magnésémie
- Phosphorémie
- Phosphatases alcalines
- Fer sérique
- Electrophorèse des protéines
- Electrophorèse de l’hémoglobine
Dans les urines :
- Albumine
- Sucre
- Corps cétoniques
1.3.4. En Bactériologie
Urines :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Dénombrement des germes urinaires
Identification
Antibiogramme
Pus :
Examen macroscopique
Examen microscopique
Isolement, identification
Antibiogramme
1.3.5. En Biochimie
Dans le sang :
- Glycémie
- Azotémie
- Créatininémie
- Cholestérol total
- Cholestérol HDL
- Triglycérides
- Ionogramme (Na, K, Cl)
- Gaz du sang (pH, PaCO2, PaO2, HCO3)
- Protidémie
- Bilirubinémie
- Transaminases (ASAT, ALAT)
- Phosphatases alcalines
- Gamma GT
- Amylasémie
- Calcémie
- Magnésémie
- Phosphorémie
- Fer sérique
- Ferritine
- Transferrine
Pot de coproculture
Transport
Le prélèvement est immédiatement acheminé au laboratoire ; si le transport est différé, les selles doivent
être ensemencées dans un milieu Cary Blair.
a) Examen macroscopique :
L’examen macroscopique apprécie à l’œil nu l’aspect des selles qui, dans les cas typiques, sont liquidiennes,
ressemblant à de l’eau de riz.
D’autres aspects sont cependant possibles.
b) Examen microscopique :
Il s’agit surtout d’un examen à l’état frais (une goutte de selles entre lame et lamelle observée à l’objectif x
40) pour rechercher essentiellement une mobilité suspecte des bactéries, à savoir des bacilles très mobiles
grâce à une ciliature polaire, comparés à des étoiles filantes.
Une coloration de Gram peut être effectuée : les vibrions se présentent alors sous forme de bacilles à
Gram négatif incurvés (en virgule).
c) Isolement :
La culture des selles à la recherche de Vibrio cholerae est effectuée sur deux sortes de milieux :
/ Le milieu d’enrichissement qui est un bouillon permettant une culture abondante et rapide des vibrions :
l’Eau Peptonée Hypersalée Alcaline (EPHA) est utilisée en général. Après ensemencement, ce milieu est
incubé à 37°C pendant 4 h puis repiqué sur milieu d’isolement.
/ Les milieux d’isolement, qui peuvent être sélectifs ou non, permettent d’obtenir des colonies caractéristiques :
- Sur gélose nutritive alcaline (GNA), les colonies de vibrions sont de taille moyenne, à surface
lisse, transparentes, avec des contours réguliers.
- Sur gélose TCBS (Thiosulfate, Citrate, Bile, Saccharose), les colonies sont moyennes à grosses,
lisses, à contours réguliers, de couleur jaune du fait de la fermentation du saccharose.
Aspect des colonies de V. cholerae sur GNA (à droite) et sur TCBS (à gauche)
d) Identification
L’identification est réalisée en deux étapes sur les colonies suspectes après vérification de leur morphologie
et de leur mobilité à l’examen microscopique (bacilles très mobiles par ciliature polaire, à Gram négatif
incurvés) :
NB : En cas d’épidémie, une démarche plus rapide (ci-dessous décrite) est adoptée et lorsque
l’épidémie est confirmée les analyses de selles sont réalisées chez 1 malade sur 10.
- Après les examens macroscopique et microscopique, un milieu d’enrichissement est ensemencé
et incubé pendant 3 heures.
- Le 1er tube est repiqué sur un 2e contenant de l’EPHA et réisolé parallèlement sur milieux d’isolement
(GNA, TCBS).
- Au bout de trois autres heures, la même opération est répétée à partir du 2e tube d’EPHA.
- Après 16 à 18 heures, les tests suivants sont réalisés sur colonies suspectes isolées sur GNA : examen
microscopique, test à l’oxydase et tests d’agglutinations.
NB : à défaut de GNA, on peut utiliser la gélose Mueller Hinton
le test d’agglutination ne doit pas être effectué sur les colonies de TCBS
d) Antibiogramme :
Il est réalisé sur gélose Mueller Hinton (MH) selon la technique décrite plus loin.
Les antibiotiques suivants doivent être testés pour les besoins de la surveillance comme du traitement :
amoxicilline, tétracycline, doxycycline, chloramphénicol, cotrimoxazole, furazolidone, érythromycine,
norfloxacine.
b) Transport
Le LCR doit être acheminé rapidement au laboratoire car les bactéries responsables généralement de
méningites sont fragiles.
Au laboratoire, le tube peut être conservé à 37°C en attendant d’être traité
c) Examen macroscopique :
L’aspect du liquide céphalorachidien (LCR) est noté dès l’arrivée de l’échantillon.
Il peut être clair louche, trouble, purulent, hématique, xanthochromique. Un LCR clair n’exclut pas une
méningite : c’est les cas des méningites purulentes au début ou décapitées par une antibiothérapie préalable,
c’est aussi le cas des méningites tuberculeuses, virales, parasitaires …
d) Examen microscopique :
Il permet une étude cytologique et bactériologique :
/ La cytologie quantitative est effectuée sur le LCR total par dénombrement sur cellule de Malassez ou de
Nageotte qui permet de déterminer le nombre de cellule par millimètre cube de LCR. Ce nombre est égal
à 1 à 3 / mm3 dans un LCR normal.
/ La cytologie qualitative, réalisée sur le culot de centrifugation, précise la nature des cellules présentes
(polynucléaires, lymphocytes …)
/ Un frottis est réalisé à partir du culot de centrifugation pour une coloration de Gram. L’examen au
microscope peut mettre en évidence des bactéries
Exemples : . diplocoques à Gram négatif en ‘grain de café’
. diplocoques à Gram positif lancéolés, encapsulés
. bacilles à Gram négatif polymorphes, …
NB : Pour les laboratoires ne disposant pas de plateau technique pour faire plus, les résultats obtenus sont
rendus (examens macroscopique, cytologie quantitative et qualitative, test d’agglutination) et le reste de
l’échantillon de LCR est mis dans un milieu de transport comme le Trans-Isolate qui sera acheminé au
Laboratoire régional ou national le plus proche.
f) Culture
Dès l’arrivée du LCR, il est ensemencé sur milieux enrichis qui seront incubés sous atmosphère enrichie en
CO2.
g) Antibiogramme : La sensibilité des souches aux antibiotiques suivants sera particulièrement surveillée :
chloramphénicol, cotrimoxazole, aminopénicilline, céphalosporines de 3e génération.
3.1.3. Shigellose :
a) Prélèvement :
Les selles sont recueillies dans des pots propres.
b) Transport :
Le prélèvement est immédiatement acheminé au laboratoire ; si le transport est différé, les selles doivent
être ensemencées dans un milieu Cary Blair.
c) Examen macroscopique :
Il vérifie la consistance des selles, la présence de glaire, de sang de mucus.
d) Examen microscopique :
En cas de shigellose, on note la présence de nombreux polynucléaires et un déséquilibre de la flore avec
prédominance de bacilles immobiles.
En outre, cet examen permet d’écarter la présence d’amibe.
NB : Les laboratoires périphériques qui ne peuvent pas procéder à la culture rendent les résultats obtenus
aux deux premières étapes, puis ensemencent un milieu de transport (Cary Blair) qui sera envoyé au
laboratoire régional ou national le plus proche.
e) Isolement et Identification :
L’ensemencement est réalisé sur milieux sélectifs (exemples :gélose Hektoen, gélose SS (Salmonella -
Shigella) qui sont incubés à 37°C. Au bout de 24 heures, les colonies suspectes (Lactose -, SH2 -) sont
ensemencées sur milieu Urée – Indole.
Après 18 à 24 heures d’incubation, les souches uréase (-) sont mises en culture sur une galerie d’identification
en tubes (kligler hajna, mannitol mobilité).
Les principaux caractères des shigelles sont : bacilles à Gram négatif, immobiles, AAF, catalase (+) sauf
S. dysenteriae-1, uréase (-), fermentent le glucose sans production de gaz, H2S (-), Citrate de Simmons
(-). Les caractères différentiels des espèces sont résumés dans le tableau ci-dessous.
Shigella dysenteriae est la seule espèce renfermant un sérotype épidémiogène, Shigella dysenteriae-1.
♦ L’étude morphologique des cellules sur frottis sanguin qui permet en outre d’établir la formule
leucocytaire.
- Tirer la lamelle d’un mouvement régulier et rapide. Il faut conserver l’inclinaison et ne pas trop
appuyer sur la lamelle. Tout le sang doit être étalé avant d’atteindre le bout de la lame.
- Sécher à l’air.
§ Fixation
- Placer la lame du frottis sur un support horizontal au dessus d’un bac de coloration.
- Verser sur la lame 5 gouttes de colorant May-Grünwald pur de façon à recouvrir complètement le
frottis. Laisser agir 3 minutes. Laver à l’eau tamponnée (à défaut utiliser l’eau de robinet)
§ Coloration au Giemsa
- Préparer une dilution du Giemsa au dixième avec de l’eau tamponnée (eau neutre)
- Recouvrir le frottis de la solution diluée
- Laisser agir 20 mn
- Laver à l’eau
§ Séchage
- Laisser sécher la lame à l’air, en position inclinée, après avoir essuyé la face inférieure de la lame
avec du papier filtre.
- Attendre au moins 5 minutes avant l’examen microscopique du frottis.
Polynucléaire neutrophile
o Taille: 12 à 14µm, arrondi
o Noyau : 3 à 5 lobes
o Cytoplasme : acidophile,
petites granulations marron clair
(granulations neutrophiles)
Polynucléaire éosinophile
Polynucléaire basophile
o Taille:11 à 13µ arrondi
o Noyau:2 à 4 lobes denses
o Cytoplasme:acidophile clair
o Granulations:bleu violet foncé,
nombreuses pouvant recouvrir le noyau
Lymphocyte (Petit):
o Taille: 9-11µ arrondi
o Noyau: rond et dense
o Cytoplasme: basophile clair
o Granulations: néant
Lymphocyte (Grand):
o Taille: 10-15µ arrondi,
déformable
o Noyau: rond, ovale ou en
drapeau
o Cytoplasme: bleu très clair
Monocyte
o Taille: 18-20µ arrondi,
o Noyau: rond ou irrégulier
o Cytoplasme: bleu clair, peut
contenir des vacuoles
o Granulations: très fines, très
nombreuses, azurophiles
Monocyte:
Noyau irrégulier, cytoplasme gris
dans lequel on devine de fines
granulations
H : 4,5 à 5,8
Hématies 10.6/µL
5,0 à 6,0 3,8 à 4,8 3,6 à 5,2 4,1 à 5,3 4,0 à 5,4
(Tera/L)
F : 3,8 à 5,4
Leucocytes 10³/µL
10,0 à 30,0 6,0 à 18,0 6,0 à 15,0 5,0 à 13,0 5,0 à 11,0 4,0 à 10,0
(Giga/L)
Plaquettes 10³/µL
150 à 400 150 à 400 150 à 400 150 à 400 150 à 400 150 à 400
(Giga/L)
H : 13,5 à
17,5
10,5 à 11,5 à
Hémoglobine g/dL 14,5 à 22,5 10 à 16 10,5 à 13,5
13,5 14,5
F : 12,5 à
15,5
H : 40 à 50
Hématocrite % 44 à 58 38 à 44 36 à 44 36 à 44 37 à 45
F : 37 à 47
CCMH g/dL 32 à 36 32 à 36 32 à 36 32 à 36 32 à 36 32 à 36
en 10³/µL 1ère semaine 8 jours à 3 mois 3 mois à 3 ans 3 à 6 ans 6 à 15 ans Adulte
1,8 à
Polynucléaires neutrophiles 6,0 à 26,0 1,5 à 8,5 1,5 à 8,5 1,5 à 8,5 1,8 à 8,0
7,5
0,04 à
Polynucléaires éosinophiles 0,2 à 0,85 0,2 à 1,2 0,05 à 0,7 0,02 à 0,65 0 à 0,6
0,8
1,0 à
Lymphocytes 2,0 à 11,0 2,0 à 11,0 4,0 à 10,5 2,0 à 8,0 1,5 à 6,5
4,5
0,2 à
Monocytes 0,4 à 3,1 0,05 à 1,1 0 à 0,8 0 à 0,8 0 à 0,8
1,0
b) Vitesse de sédimentation
§ Conditions de prélèvement
- Prélèvement de sang veineux (en général au pli du coude) ; le tube de prélèvement contient un anticoagulant :
EDTA ou citrate trisodique à 3,8% dans une proportion de 20% (1 volume d’anticoagulant pour 4 volume
de sang)
- Le prélèvement est réalisé de préférence à jeun
§ Principe
C’est la vitesse à laquelle les hématies contenues dans le plasma sédimentent au fond d’un tube calibré et
gradué, appelé tube de Westergreen. Elle correspond à la hauteur de chute des particules sanguines dans
le tube.
§ Matériel et réactifs
- le tube de Westergreen : c’est une pipette de dimensions standardisées : longueur totale 300 mm, diamètre
inférieur à 2,5 mm. Cette pipette est graduée de 0 à 200 mm de haut en bas. Elle est en matière plastique
et à usage unique.
- le support : généralement adapté aux pipettes, il permet de les maintenir strictement verticales.
§ Technique
- Aspirer le sang, bien homogénéisé, dans la pipette de Westergreen jusqu’au trait 0 en tirant sur la
languette présente dans la pipette.
- Placer aussitôt la pipette sur le support.
§ Résultats
Les valeurs normales sont : - enfant : 6 à 25 mm
- femme adulte : 4 à 20 mm
- homme adulte : 3 à 10 mm
§ Causes d’erreurs
La sédimentation des hématies peut être ralentie artificiellement si :
- l’échantillon sanguin est partiellement coagulé
- la mesure est faite à partir d’échantillon sanguin prélevé depuis plus de 2 heures
- la température du laboratoire est basse
La sédimentation des hématies peut être augmentée artificiellement si :
- la pipette de Westergreen est inclinée
- l’échantillon sanguin est hémolysé ou prélevé avec un excès d’anticoagulant
- la température du laboratoire est élevée.
§ Conditions de prélèvement
- le prélèvement est effectué sur sang veineux dans un tube avec ou sans anticoagulant
- il n’est pas nécessaire d’être à jeun
§ Principe
En présence d’un réducteur (métabisulfite de sodium à 2%), les hématies du drépanocytaire prennent une
forme en « faucille » ou en « feuille de houx ».
§ Matériel et réactifs
- Spatule
- Méta bisulfite de sodium en poudre
- Balance de précision
- Eau distillée
- Flacon de 125 ml
- Papier buvard
- Lame
- Lamelles
- Vernis à ongles
§ Technique
o Préparation du métabisulfite
- déposer le papier buvard sur le plateau de la balance
- calibrer l’appareil
- à l’aide de la spatule, prélever la poudre de méta bisulfite et la déposer sur le papier buvard
- peser exactement 2 grammes de cette poudre
- recueillir les 2 grammes dans un flacon de 125 ml
- ajouter 100 ml d’eau distillée
- mélanger et attendre 15 mn environ pour que la solution soit stable
- tester la solution de méta bisulfite à 2% avec les échantillons positifs de la veille
NB : Le contrôle de qualité interne exige de préparer le métabisulfite tous les jours et de le vérifier sur des
échantillons considérés connus positifs et négatifs.
o Préparation du test
- déposer sur une lame propre une goutte de sang et une goutte de la solution de métabisulfite
- mélanger doucement
- déposer sur le mélange une lamelle en évitant les bulles d’air
- essuyer délicatement l’excès du mélange avec du papier buvard (à défaut utiliser une compresse)
- sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles ou de la paraffine, le but étant d’empêcher
le contact des hématies avec l’oxygène de l’air ambiant.
§ Résultats
- test négatif : les hématies gardent leur forme régulièrement arrondie ;
- test positif : présence de nombreuses hématies en forme de « faucille ».
§ Causes d’erreurs
- Etalement mal fait avec hématies « traumatisées »
- Présence de bulles d’air
§ Conditions de prélèvement
- sang veineux sur tube EDTA ou sang capillaire
- il n’est pas nécessaire d’être à jeun
§ Matériel et réactifs
- tube à hémolyse
- bain marie
- pipette Pasteur
- lame
§ Technique
- dans un tube à hémolyse, déposer 1goutte de sang et 1goutte de bleu de crésyl (si le taux d’Hb est
inférieur à 11g/dL, mettre 2 gouttes de sang et 1 goutte de bleu de crésyl)
- puis confectionner un frottis et lire au microscope au grossissement 100 avec de l’huile à immersion
(idéalement lire sur dix champs ; compter le nombre de réticulocytes et de globules rouges et
exprimer le pourcentage de réticulocytes sur le nombre globules rouges).
§ Résultats
Le résultat est exprimé en pourcentage et surtout en valeur absolue de réticulocytes par mm3 de sang. Le
taux normal est de :
Le taux des réticulocytes traduit l’activité de l’érythropoïèse médullaire. Il est un indicateur du type d’anémie.
§ Causes d’erreurs
- corps de Jolly
- corps de Heinz
§ Conditions de prélèvement
- sang veineux
- utiliser un tube avec de l’héparine (EDTA contient des sels)
§ Principe
Les hématies, qui in vivo sont dans un milieu isotonique, se comportent in vitro dans des solutions
hypotoniques comme des osmomètres. Par osmose, l’eau diffuse du milieu le moins concentré en osmoles
vers le compartiment le plus concentré en osmoles.
Dans les solutions hypotoniques, l’eau pénètre dans les hématies qui gonflent grâce aux propriétés d’élasticité
de la membrane plasmique. Au-delà d’un volume maximal, les hématies éclatent en libérant l’hémoglobine
dans le milieu extérieur : il y a hémolyse.
Dans certaines pathologies et notamment lors d’anémies hémolytiques, la résistance globulaire osmotique
(ou RGO) des hématies peut être :
- augmentée : l’hémolyse apparaît pour des solutions de concentration en NaCl inférieure à celle
provoquant normalement l’hémolyse, donc pour des solutions d’hypotonie supérieure. C’est le
cas lors de ß thalassémies
- diminuée : l’hémolyse apparaît pour des solutions de concentration en NaCl supérieure à celle
provoquant normalement l’hémolyse, donc pour des solutions d’hypotonie inférieure. C’est le cas
lors de la microsphérocytose.
§ Matériel
- tubes à hémolyse
- portoir
- eau distillée
- NaCl
- Pipette
- Etuve
- Centrifugeuse
§ Technique
La détermination de la RGO se réalise sur sang total ou sur sang déplasmatisé, à 37°C pendant une heure.
On réalise une gamme de solutions de NaCl hypotoniques par rapport au plasma. Les concentrations en
NaCl de ces solutions varient de 2,6 à 6g/L et sont croissantes de 0,2 en 0,2g/L.
- disposer les 18 tubes à hémolyse sur un portoir et les numéroter
- préparer les 18 solutions de NaCl à partir d’une solution mère à 7g/L et d’eau distillée selon le
protocole présenté dans le tableau suivant :
N° des tubes 1 2 3 4 5 …. 14 15 16 17 18
Nombre de gouttes d’eau 5 6 7 8 9 18 19 20 21 22
distillée
Nombres de gouttes de solution 30 29 28 27 26 17 16 15 14 13
mère de NaCl à 7g/L
Concentration finale en NaCl en 6 5,8 5,6 5,4 5,2 3,4 3,2 3 2,8 2,6
g/L
§ Lecture
o Lecture directe
Faire la lecture de la gamme de gauche à droite en partant des solutions les moins hypotoniques. Observer :
- dans les premiers tubes, le surnageant est incolore, les hématies sont intactes et forment un culot
rouge au fond du tube : il n’y a pas d’hémolyse
- à partir d’un certain tube, le surnageant devient jaune, quelques hématies ont été lysées et ont
libéré leur hémoglobine : il y a hémolyse partielle ; dans les tubes suivants, le culot globulaire
diminue de plus en plus et la couleur du surnageant s’accentue
- à partir d’un certain tube, le culot globulaire a disparu, toutes les hématies sont détruites, l’hémolyse
est totale : il reste un petit culot blanchâtre composé de restes membranaires.
Noter les concentrations en NaCl des solutions des 2 tubes :
- Hi ou hémolyse initiale : premier tube où le surnageant est jaune
- Ht ou hémolyse totale : premier tube où le culot globulaire a disparu.
o Lecture ou spectrophotomètre
Compléter la lecture en mesurant l’absorbance de chaque surnageant à 540 nm afin de doser la quantité
d’hémoglobine libérée. L’absorbance du surnageant du premier tube de la gamme correspondra à 0%
d’hémolyse et l’absorbance du surnageant du dernier tube correspondra à 100% d’hémolyse.
Tracer la courbe % d’hémolyse = f (concentration en NaCl)
Déterminer la valeur de la concentration en NaCl correspondant à 50% d’hémolyse (H50%)
§ Résultats
o Lecture directe
Les valeurs normales sont les suivantes :
o Lecture au spectrophotomètre
b) Adénogramme
§ Principe
C’est l’étude cytologique du suc ganglionnaire après ponction à l’aiguille fine. L’adénogramme permet un
diagnostic d’orientation des proliférations lymphoïdes, qu’elles soient bénignes ou malignes.
§ Matériel
- aiguille fine (23 G de préférence) et seringue
- lames
- coton
- alcool
§ Technique
c) Myélogramme
§ Principe
C’est l’étude cytologique de la moelle osseuse.
§ Sites de la ponction
La moelle osseuse rouge est essentiellement située dans les épiphyses des os longs et dans les os plats. Le
site de ponction préférentiel chez l’adulte est le sternum et l’épine iliaque chez l’enfant. Chez le nourrisson,
il faut préférer l’épine iliaque ou la tubérosité tibiale antérieure.
§ Prélèvement
Au site de la ponction :
- la peau est soigneusement désinfectée
- le trocart tenu fermement par l’opérateur, est enfoncé perpendiculairement à la peau et à la surface
osseuse avec un mouvement de rotation jusqu’à ce que l’on franchisse la corticale osseuse
- après pénétration, le mandrin est retiré et remplacé par une seringue qui aspire de la substance
médullaire (volume prélevé est inférieur à 0,5cc)
- enlever la seringue et replacer le mandrin
- le contenu de la seringue est déposé directement sur la lame pour un frottis médullaire réalisé de la
même façon qu’un frottis sanguin
NB : si la première aspiration a ramené du matériel, l’aiguille peut être retirée et un pansement légèrement
compressif est appliqué au point de ponction.
§ Coloration
Les frottis confectionnés sont séchés à l’air et colorés au May Grunwald Giemsa mais éventuellement avec
des colorants cytochimiques.
§ Lecture
Elle se fera d’abord au faible grossissement pour apprécier la richesse cellulaire puis au fort grossissement
pour l’étude des différentes lignées.
3.2.2. Hémostase
L’exploration de la coagulation doit se faire sur des prélèvements avec comme anticoagulant le citrate
trisodique à raison d’un volume d’anticoagulant pour 9 volumes de sang.
Les tests doivent être réalisés dans les 4 heures qui suivent le prélèvement.
Les outils du contrôle de qualité reposent sur deux types d’échantillons biologiques :
- des pools de plasmas normaux ou anormaux préparés localement et aliquotés
- des plasmas lyophilisés préparés industriellement par différentes firmes pharmaceutiques qui
sont soit des plasmas étalons ou standards de calibration ou alors des plasmas de « contrôle »
ayant une valeur moyenne et un intervalle de confiance déterminée selon la technique utilisée.
Ces différents échantillons sont utilisés pour le contrôle de qualité journalier qui permet la validation
quotidienne des résultats. Il est préférable de passer ces contrôles en début et en cours de série et de
mentionner les résultats sur un graphe. L’ensemble des procédures de contrôle de qualité interne doit être
clairement décrit dans un cahier technique qui doit être régulièrement mis à jour. Le contrôle de qualité
RNL Sénégal : Manuel de Procédures techniques (Page 44)
interne doit aussi vérifier les étapes pré analytiques (prélèvements) et post analytiques (validation, rendu et
archivage des résultats).
a) Temps de saignement
§ Principe
C’est un test global qui explore l’hémostase primaire dans son ensemble (l’adhésion, l’agrégation et le
facteur Willebrand)
.Il est réalisé in vivo et mesure la durée de l’hémorragie provoquée par une incision de la couche superficielle
de la peau des les conditions normalisées.
§ Matériel
- tensiomètre
- vaccinostyle stérile
- papier buvard
- éther
- chronomètre
§ Technique
- Placer le brassard à tension au bras gonflé à 40 mm Hg, pression qui sera maintenue constante toute
la durée du test,
- désinfecter la peau de l’avant bras avec l’éther (l’alcool entraîne une vasodilatation), laisser sécher,
- réaliser 3 piqûres distantes de 2 cm chacune au niveau de l’avant bras à l’aide du vaccinostyle
- déclencher immédiatement le chronomètre,
- l’excès de sang est épongé délicatement toutes les 30 secondes à l’aide du papier buvard (éviter de
toucher et de frotter les berges des points de piqûre) ;
- noter le temps au bout duquel le saignement s’arrête au niveau de chaque point de piqûre et faire la
moyenne
§ Résultats
La valeur normale chez l’adulte doit être inférieure à 5 mn.
§ Principe
C’est le temps de coagulation d’un plasma citraté, pauvre en plaquettes recalcifié en présence de
thromboplastine tissulaire. Le TQ explore la voie extrinsèque de la coagulation.
§ Technique
- déposer les barrettes dans la zone d’incubation
- distribuer une bille dans chaque cupule
- mettre 50µL de plasma citraté dans chaque cupule
- incuber pendant 1mn
- transférer dans la zone de lecture
- déclencher la coagulation en distribuant 100µL de thromboplastine calcique (préincubée à 37°C)
dans chaque cupule
§ Résultats
o Expression en pourcentage d’activité prothrombinique
En pratique courante, le temps de Quick (TQ) est converti en taux de prothrombine (TP) exprimé en
pourcentage. La conversion du TQ en TP se fait à l’aide d’une droite d’étalonnage ou droite de « Thivolle »,
établie à partir de plasmas normaux testés en dilution.
§ Principe
C’est le temps de coagulation d’un plasma citraté, pauvre en plaquettes, recalcifié à 37°C en présence de
substitut plaquettaire (céphaline) et d’un activateur (kaolin, silice ou acide ellagique) standardisant l’activation
des facteurs contacts et en présence de calcium.
Le TCA explore la voie endogène de la coagulation ainsi que la voie commune. Seul le facteur VII n’interfère
pas sur ce test.
§ Réactifs
- réactif céphaline activateur
- solution de CaCl2
§ Technique
- placer les barrettes dans la zone d’incubation
- mettre une bille dans chaque cupule
- ajouter 50µL de plasma citraté et 50µL de céphaline activateur
- incuber pendant 3mn
- transférer la barrette en zone de lecture
- déclencher la coagulation en ajoutant 50µL de solution de CaCl2
§ Résultats
Ils sont exprimés en secondes et varient entre 20 et 40 secondes selon le réactif utilisé.
Est considéré comme pathologique un écart supérieur à 8 secondes par rapport au contrôle.
Chez les enfants de moins de 5 ans, le TCA est souvent à la limite supérieure des valeurs normales voire
légèrement allongé, sans anomalies associées.
NB : Si le TCA d’un patient est allongé, on réalise un TCA sur le mélange à volume égal du plasma du
malade et du plasma du témoin :
- une correction du TCA indique un déficit en un ou plusieurs facteurs de la voie intrinsèque
- une non correction du TCA indique la présence d’anticoagulants circulants.
d) Temps de thrombine
§ Principe
C’est le temps de coagulation d’un plasma citraté pauvre en plaquettes, recalcifié à 37°C en présence
d’une quantité déterminée de thrombine, quantité choisie de façon à entraîner la coagulation en 20 secondes
d’un plasma témoin.
Le temps de thrombine explore la fibrinoformation.
§ Matériel
Solution de thrombine calcique.
§ Résultats
Un temps de thrombine est généralement inférieur à 22 s. Tout écart supérieur ou égal à 5s entre le temps
de thrombine du plasma à tester et le temps de trombine du plasma témoin est considéré comme significatif.
§ Principe
Le temps de coagulation d’un plasma citraté pauvre en plaquettes, dilué dans des proportions adéquates,
mis en présence d’un excès de thrombine à 37°C et en optimum calcique, est directement fonction du taux
de fibrinogène fonctionnel plasmatique.
§ Réactifs
- solution de thrombine contenant un inhibiteur spécifique de l’héparine permettant le dosage du
fibrinogène sur le plasma des patients traités par cet anticoagulant.
- Tampon pH 7,35 permettant la dilution du plasma (tampon Owren-Koller)
§ Technique
- réaliser une dilution du plasma au 1/20 avec le tampon
- mettre 100µL de la dilution dans les cupules placées en zone d’incubation et contenant des billes
- incuber 1mn
- Transférer la barrette en zone de mesure et déclencher la coagulation en ajoutant 50µL de solution
de thrombine calcique.
§ Résultats
Le taux de fibrinogène normal est compris entre 2 et 4 g/L (le temps de coagulation mesuré est compris
entre 8 et 20 secondes.
§ Principe
Les D-Dimères sont des structures spécifiques des produits de dégradation de la fibrine. Ils sont mis en
évidence directement dans le plasma citraté par une réaction d’agglutination passive utilisant des particules
de latex sensibilisées avec un anticorps monoclonal anti D-Dimères ne réagissant pas avec le fibrinogène.
Les particules de latex sont sensibilisées de telle sorte que l’on observe une agglutination à partir d’une
concentration plasmatique des D-Dimères égale ou supérieure à 500ng/mL.
§ Réactifs
- suspension de latex sensibilisée avec des anticorps anti D-Dimères
- plasma contrôle positif
- plasma contrôle négatif
- solution tampon pH 8,2
o Protocole qualitatif
- sur une carte, déposer
§ Résultats
La réaction est positive lorsqu’on observe une agglutination
Le seuil de sensibilité de la technique étant de 500µL, une agglutination indique une concentration de D-
Dimères égale ou supérieure à 500ng/Ml dans la dilution correspondante : la concentration plasmatique en
D-Dimères est donc estimée en multipliant cette valeur par l’inverse de la dernière dilution donnant une
agglutination.
§ Interprétation
Les valeurs physiologiques en D-Dimères sont inférieures à 500ng/mL
Des valeurs supérieures traduisent une activation de la fibrinolyse consécutive à une activation anormale de
la coagulation.
NB : Il existe une méthode immuno-enzymatique plus sensible mais plus longue dans sa réalisation.
Le dosage consiste à mesurer le temps de coagulation d’un plasma contenant tous les facteurs de coagulation
à l’exception du facteur à doser, celui ci étant apporté par le plasma à étudier, convenablement dilué.
Le système test utilisé doit être sensible au facteur à mesurer : temps de Quick pour les facteurs II + X, V
et VII, temps de céphaline activée pour les facteurs VIII, IX, XI, XII et contacts.
• Mesure du Facteur Willebrand Antigène (vWAg) : ce facteur peut être dosé par des méthodes
immunologiques à l’aide d’antisérum hétérologue par électro-immuno-diffusion (Laurell), immuno-
enzymologie (ELISA), ou radio-immunologie.
Les protéines S, C et l’antithrombine sont les inhibiteurs physiologiques de la coagulation. Leur mesure
repose sur des techniques chronométriques ou immunologiques (en centre spécialisé uniquement).
Les prélèvements peuvent être réalisés soit sur tube sec soit sur tube avec anticoagulant.
Le contrôle de qualité interne repose sur l’analyse quotidienne d’échantillons de contrôle effectuée dans
les mêmes conditions que celles appliquées aux échantillons biologiques.
§ Réactifs
o Sérums tests
- sérum-test anti-A
- sérum-test anti-B
- sérum-test anti-AB
o Hématies tests
Ce sont des hématies humaines prélevées sur une solution anticoagulante et conservatrice, lavées 3 fois en
sérum physiologique, puis remises en suspension dans cette solution.
NB : il est important qu’il n’y ait pas trop d’hématies risquant d’empêcher l’observation correcte des
agglutinations.
- ajouter à côté de chaque goutte deux gouttes de culot du sérum à tester (une petite goutte ou des
hématies diluées)
- mélanger soigneusement les deux gouttes puis animer la plaque d’un mouvement rotatoire lent
- observer au bout d’une minute et rechercher s’il y a ou non agglutination
o Erreurs sérologiques :
- agglutination faible ou incomplète
- double population d’hématies (après une transfusion hétérogroupe ou incompatible)
- altérations des érythrocytes : on observe une positivité dans tous les tests sériques.
a) le Phénotypage Rhésus
§ Principe
C’est la recherche à la surface des hématies testées des allo Ag courants du système Rhésus, l’Ag D, l’Ag
C, l’Ag E, l’Ag c et l’Ag e, en mettant en contact ces hématies avec des Ac spécifiques connus :
- anti-D
- anti-C
- anti-c
- anti-E
- anti-e
§ Réactifs nécessaires
- sérum-test anti-D d’origine humaine ou monoclonale
- sérum-test anti-E d’origine humaine ou monoclonale
- sérum-test anti-e d’origine humaine ou monoclonale
- sérum-test anti-C d’origine humaine ou monoclonale
- sérum-test anti-c d’origine humaine ou monoclonale
RNL Sénégal : Manuel de Procédures techniques (Page 53)
§ Technique sur plaque chauffée à 40°C
o Mode opératoire
- prélever dans un mélange constitué du même volume de culot globulaire et de plasma
- délimiter sur la plaque chauffante d’un microscope, huit espaces séparés les uns des autres de 2
à 3 cm
- au niveau de chaque espace, réaliser rapidement les dépôts comme indiqués ci-dessous
1 2 3 4 5 6 7 8
1goutte de 1goutte 1goutte 1goutte 1goutte 1goutte 1goutte 1goutte
sang à hématies hématies de sang à de sang à de sang à de sang à de sang à
tester O O rhésus tester tester tester tester tester
Rhésus+ –
+ + + + + + + +
1goutte de 1goutte 1goutte 1 goutte 1 goutte 1 goutte 1 goutte 1 goutte
sérum de sérum de sérum de sérum de sérum de sérum de sérum de sérum
témoin test test test test test test test
albumineux anti-D anti-D anti-D anti-C anti-c anti-E anti-e
§ Principe
Il consiste à vérifier si les hématies possèdent l’Ag D faible (lorsqu’elles se sont avérées sans Ag D avec le
test précédent), en utilisant des Ac anti-D lors d’une réaction d’agglutination active indirecte (artificielle)
utilisant comme artifice des antiglobulines.
L’antigène D faible se recherche d’abord par 1 préchauffage des hématies à l’aide d’un rhésuscope afin de
mieux mettre à nu les épitopes de l’antigène.
§ Réactifs nécessaires
- sérum test anti-D
- hématies O Rhésus standard +
- hématies O Rhésus standard –
- sérum antiglobuline humaine
- sérum albumineux sans Ac anti-D
§ Technique
* dans un tube à hémolyse, mettre 1ml de sang à tester
* laver les érythrocytes à tester en sérum physiologique et préparer, à partir de ces érythrocytes, une
suspension à 5% dans du sérum physiologique
* prendre 4 tubes à hémolyse et introduire dans les tubes 2, 3, et 4 : 100 µL de sérum anti D et dans
le tube 1 : 100 µL de sérum albumineux témoin sans anti-D
* ajouter : - en 1 : 50 µL d’érythrocytes à examiner
- en 2 : 50 µL d’érythrocytes O Rh standard +
- en 3 : 50 µL d’érythrocytes O Rh standard -
- en 4 : 50 µL d’érythrocytes à examiner
* incuber les 4 tubes au bain marie pendant 45mn
* laver 3 fois la pastille globulaire en eau physiologique de la façon suivante :
- remettre les hématies en suspension dans l’eau physiologique, centrifuger 1 mn à 750 g
- la même opération est répétée 3 fois
- après le dernier lavage, la totalité du surnageant doit être bien éliminée
* ajouter 100 µL de sérum antiglobuline
* agiter doucement pour remettre les érythrocytes en suspension
* centrifuger 1 mn à 400 g
* faire la lecture après agitation douce
o Premier cas
L’agglutination n’est observée que dans le tube 2 : cela signifie que les érythrocytes testés ne possèdent
pas d’Ag D faible. Le sujet est donc Rh standard –
o Deuxième cas
L’agglutination n’est observée que dans les tubes 2 et 4 : cela signifie que les érythrocytes testés possèdent
l’Ag D faible. Le sujet est donc D faible.
o Troisième cas
Les tubes 1, 2 et 4 présentent une agglutination :
- l’agglutination du tube 2 est normale
- l’agglutination dans le tube 1 témoigne de la présence d’auto-Ac sur les érythrocytes ou de formation
de rouleaux en présence de BSA. Le résultat positif dans le tube 4 ne peut être validé.
o Quatrième cas
Aucune agglutination n’est observée dans le tube 2 (ni dans aucun des 3 autres tubes), il s’agit d’une erreur
ou de mauvais réactifs notamment le sérum anti D. il faut donc recommencer.
b) Phénotypage étendu
Il consiste à rechercher un ou plusieurs antigènes érythrocytaires autres que ceux qui sont définis par le
groupage ABO-D et le phénotypage Rhésus.
Pour un système donné, la recherche de chaque antigène est basée sur l’utilisation de l’anticorps monoclonal
spécifique et du témoin adéquat.
Le contrôle de qualité interne doit utiliser deux échantillons de contrôle de phénotypes garantis, l’un étant
négatif, et l’autre d’expression « hétérozygote ».
§ Principe
Le test direct à l’antiglobuline ou test de Coombs direct permet la mise en évidence de la sensibilisation in
vivo des hématies humaines par des anticorps de nature Ig G et/ou des fractions du complément. Ce test
doit être réalisé sur un échantillon de préférence anti coagulé.
Il repose sur l’utilisation d’antiglobuline humaine polyspécifique ou monospécifique.
Le contrôle de qualité utilise des hématies préalablement sensibilisées par une antiglobuline in vitro par des
Ig G et éventuellement du complément.
§ Technique
§ Principe
Ce test met en présence le sérum à tester dans lequel on recherche des anticorps libres, avec des hématies
comportant des sites antigéniques spécifiques de ces anticorps. Le test est positif lorsqu’il existe une
agglutination des hématies en présence d’une antiglobuline.
§ Technique
- Faire un panel O+
- Diluer le pannel à 5%
- Mettre dans un tube à hémolyse 1goutte de la dilution
- Ajouter 3 gouttes de sérum à tester
- Incuber 45 mn au bain marie préchauffé à 37°C
- Après incubation lire une première fois
- S’il n’y a pas d’agglutination faire 3 lavages à l’eau physiologique
- Bien égoutter l’eau du troisième lavage
- Ajouter une goutte d’antiglobuline
- Centrifuger une minute à 1000 tr/mn
- Remettre doucement les hématies en suspension,
- Agiter et incliner pour déceler la présence d’agglutination ou observer au microscope x 40 (entre
lame et lamelle)
§ Lecture
On recherche dans un sérum des Ac irréguliers en incubant le sérum en présence d’hématies porteuses des
Ag spécifiques. Les anticorps, s’ils sont présents, s’unissent aux Ag : on obtient des hématies sensibilisées,
mais souvent sans provoquer une agglutination, en raison :
- des forces de répulsion électrostatiques importantes entre hématies voisines
- du caractère masqué, peu accessible de certains antigènes
Provoquer l’agglutination en réalisant un pontage spécifique entre Ac unis à des hématies voisines grâce à
des antiglobulines spécifiques des épitopes des Ig humaines.
Il s’agit donc d’une réaction d’agglutination active indirecte.
Le sang examiné doit être, de préférence, prélevé sur tube sec, les agglutinines sont alors recherchées sur
le sérum.
- réaliser un pannel O+
- laver les hématies 3 fois à l’eau physiologique (le surnageant du dernier lavage doit être complètement
éliminé)
- remettre les hématies en suspension dans l’eau physiologique (dilution à 3%)
- Prendre 3 tubes à hémolyse, déposer dans chaque tube, 1goutte de la dilution et 3 gouttes de
sérum à tester
- Incuber le tube 1 à 37°, le tube 2 à 25° (température ambiante) et le tube 3 à 4° pendant 45 mn
- Faire une première lecture en agitant le tube tout doucement
- Si le test est négatif, faire trois lavages à l’eau physiologique (le surnageant du dernier lavage doit
être complètement éliminé)
- Dans chaque tube mettre une goutte d’antiglobuline
- Centrifuger 1 mn à 1000 tours/mn
§ Lecture
- S’il y a présence d’agglutination dans l’un des 3 tubes la RAI est positive et il faut spécifier la
température
- S’il n’y a pas d’agglutination, la RAI est négative
NB : les échantillons positifs doivent faire l’objet d’une seconde étape d’identification qui utilise au
moins 10 hématies tests de groupe O qui doivent porter séparément différents antigènes (les différents
Ag du système rhésus, Ag Kell, Kidd, Duffy, MNS, Lewis, Lutheran…)
Le contrôle de qualité interne utilise des échantillons de contrôle comportant des anticorps de spécificité et
de titre connus et sur des hématies comportant l’antigène correspondant d’expression « hétérozygote ».
b) Examen macroscopique :
Il renseigne sur l’état de la selle (diarrhée / constipation), sur la présence d’anneaux de taenia, d’adultes
d’helminthes.
b) Confection :
/ Frottis :
Placer à une extrémité d’une lame une petite goutte de sang. Sans attendre que le sang sèche, appliquer sur
la lame à côté de la goutte, entre elle et le centre de la lame, l’arête d’une lame rodée. Former environ
45°du côté de la goutte. Reculer la lame jusqu’à ce qu’elle touche la goutte. Par capillarité, celle-ci s’étale
le long du dièdre. Par un mouvement uniforme, sans excessive rapidité, faire parcourir au dièdre la surface
de la lame. Ne pas quitter le contact de la lame avant la fin de l’étalement. Agiter la lame pour obtenir un
séchage rapide. Colorer.
/ Goutte épaisse :
Placer au centre de la lame une goutte de sang. Défibriner le sang en tournant à l’aide du coin d’une autre
lame ou d’un vaccinostyle et étendre la surface de la goutte en raclant la surface de la lame (1-2 mn).
Laisser sécher 2 h au minimum (étuve à 37°) à l’abri de la poussière et des mouches. Déshémoglobiniser
avec quelques gouttes d’eau jusqu’à lyse totale des hématies. Egoutter, sécher, colorer.
c) Coloration :
/ Frottis :
- Fixer le frottis avec du méthanol pendant quelques secondes en le trempant dans une cuve qui en contient.
- Préparer une solution de Giemsa à 10% (1ml de solution mère dans 9 ml d’eau de robinet).
- Recouvrir toute la lame de cette solution et laisser colorer pendant 15minutes.
- Chasser délicatement le colorant de la lame en ajoutant de l’eau propre goutte à goutte. Faire sécher à
l’air libre et examiner au microscope
/ Goutte épaisse :
La coloration se fait comme pour le frottis, exception faite de l’étape de la fixation.
d) Lecture :
Elle se fait à l’objectif à immersion (x 100). La numération des Plasmodiums (parasitémie) est faite sur la
goutte épaisse. Le nombre de parasites par microlitre de sang est établi par rapport au nombre de leucocytes,
fixé à 8000 par microlitre.
b) Examen :
Il est fait sur le culot de centrifugation des urines.
Parcourir toute la préparation à l’objectif x 10
a) Prélèvement
Prélever 5 ml de sang par ponction veineuse. Le sang est recueilli sur anticoagulant, de préférence le
citrate de sodium à 3,8% à raison de 0,4 ml pour 1,6ml de sang ou à défaut l’EDTA.
Remarques :
- Les autres anticoagulants sont déconseillés car l’héparine provoque une agglutination des microfilaires ;
le fluorure de sodium et l’oxalate de sodium tuent les microfilaires.
- Pour la recherche des microfilaires diurnes (Loa loa) le prélèvement doit être effectué de préférence
entre 12 et 14 heures ; pour celles des microfilaires nocturnes (Wuchereria bancrofti), l’heure propice
est entre 22 heures et minuit .Cependant, l’utilisation d’une technique de concentration permet d’effectuer
tous les prélèvements pendant la journée.
Même procédure que pour la recherche des plasmodies mais le temps de coloration doit être de 25
minutes.
c) Gouttes épaisses colorées au Giemsa
Déshémoglobiniser avec quelques gouttes d’eau jusqu’à lyse totale des hématies. Egoutter, sécher, fixer
au méthanol puis colorer avec une solution à 10%de Giemsa pendant 25 minutes. Rejeter le colorant.
Laver sous un fin filet d’eau de robinet ; sécher à l’air libre.
e) Examen microscopique
Les frottis , gouttes épaisses et culot de leucoconcentration colorés au Giemsa doivent d’abord être
observés à l’objectif x 10 ou x 40 pour la recherche des microfilaires . L’identification des
espèces de microfilaires se fait à l’objectif 100 sous huile à immersion.
Larves d’Anguillules :
Œufs d’Ascaris :
Anneaux Œufs
Schistosoma mansoni :
Plasmodium :
Trypanosomes :
Schistosoma haematobium :
Technique
. Chez l’adulte et grand enfant :
Au cours d’une miction physiologique, il faut nettoyer le méat urinaire, rejeter les premières gouttes d’urines
et recueillir les urines en milieu de jet dans un pot stérile.
. Chez le Nourrisson et le petit enfant :
Appliquer une poche adhésive stérile autour des organes génitaux externes et la changer toutes les 30
minutes en l’absence de miction.
. En cas de rétention aigue d’urines, le recueil des urines se fait par sondage vésical ou par ponction
sus pubienne
Transport
Procéder à un envoi immédiat de l’échantillon au laboratoire avec une fiche de renseignements bien remplie.
Les urines peuvent aussi être conservées à +4°C pendant 2 heures.
b) Examen macroscopique :
Il permet d’apprécier à l’œil nu l’aspect des urines : claires, troubles, purulentes, hématiques.
c) Examen microscopique :
♦ L’examen à l’état frais est effectué sur les urines totales et permet une appréciation quantitative ou
semi quantitative des leucocytes, des hématies, des cellules épithéliales (en nombre / champ ou en croix).
Cet examen permet également de vérifier la présence de cristaux, de levures, de parasites (Trichomonas
vaginalis, œufs de bilharzies), et de préciser la morphologie et la mobilité des bactéries.
♦ La coloration de Gram est effectuée sur un frottis réalisé à partir du culot de centrifugation. Elle
apporte des informations supplémentaires sur les caractères morphologiques des bactéries. Elle permet de
mieux apprécier la flore bactérienne.
f) Antibiogramme
Les antibiotiques sont choisis en fonction de l’espèce identifiée. Les antibiotiques éliminés sous forme
active par voie urinaire sont toujours inclus dans la liste.
b) Prélèvements
* Indications :
- on ne prélève que les collections fermées
- ne pas prélever les pus de plaies ouvertes car inexploitables
* Techniques
- nettoyer la peau avec de l’alcool iodé
- soit on prélève le pus avec une seringue
- soit on incise la collection avec un bistouri et on prélève le pus avec une pipette Pasteur ou un
écouvillon
* Transport – conservation
- transporter immédiatement le pus au laboratoire,
- utiliser des milieux de transport / conservation si nécessaire (grande distance)
- transporter le pus à l’abri de l’oxygène (si germes anaérobies à rechercher)
c) Technologie au Laboratoire
/ Examen macroscopique
- noter la consistance du pus
. purulent
. séreux ou citrin : exsudat, transsudat
- noter la couleur du pus
. bleue : faisant penser au bacille pyocyanique
. chocolat : faisant penser au pneumocoque
- noter l’odeur : très fétide (évoquant les anaérobies)
/ Culture :
- milieux
. géloses au sang frais ou sang cuit
. bouillon thioglycolate, ou bouillon cœur-cervelle
- technique : méthode des quadrants
- recherches particulières
. anaérobies : milieu de Rosenow, milieu de Schaedler
. gélose de Löwenstein-Jensen pour la culture des BK
/ Résultats et interprétation
- flore monomicrobienne : c’est l’idéal
- flore polymicrobienne
. peut se voir en cas de pleurésie ou de péritonite
. il s’agit d’une association de germes anaérobies et de germes aérobies
Examen macroscopique
- séreux, purulent
- crémeux, fluide
- épais, «grains»
- fétides
- fluidifier
- homogénéiser
Ne pas cultiver
Culture
- milieux classiques
- milieux spéciaux Examen microscopique
Cytologie
- ç pharyngées
- ç bronchiques
- ç alvéolaires
- leucocytes Coloration de Gram Coloration de Ziehl-Neelsen
a) Introduction
Le but de l’étude est de «rechercher l’agent étiologique d’une infection à germes banals des voies
respiratoires inférieures»
c) Indications
Infections respiratoires inférieures
d) Prélèvements
* Techniques
/ Expectorations
. matin au réveil, après toilette bucco-dentaire
. prélèvement physiologique : après une toux
* Transport - conservation
/ Transport immédiat au laboratoire (< 30mn)
/ Ne pas conserver
* Prélèvements complémentaires
/ Hémoculture
/ Sérum sanguin : recherche d’antigènes solubles
e) Technologie au Laboratoire
- Examen macroscopique :
/ expectorations muqueuses, muco-purulentes, purulentes, hémoptoïques etc.
/ aspects des liquides d’aspiration
/ fluidifier, homogénéiser
- Examen microscopique :
/ fluidifier, homogénéiser
/ cytologie : coloration de May Grunwald Giemsa
. cellules pharyngées < 25/champ (si > 25/champ : rejeter l’échantillon)
. leucocytes : > 25/champ : échantillon bon
: < 25 + flore monomorphe : échantillon bon
: < 25 + flore polymorphe : rejeter l’échantillon
. autres cellules : bronchiques, alvéolaires
/ Bactériologie : coloration de Gram
. flore monomorphe + PN > 25/ champ : cultiver
. prédominance d’un germe + PN > 25/champ : cultiver
. autres situations : ne pas cultiver
- Résultats :
/ Devant des bactéries pathogènes spécifiques
- bronchopathies
. S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus
. B. catarrhalis, N. mucosa,
. Bacille pyocyanique, entérobactéries
- pneumopathies
. pneumonie : S. pneumoniae
. abcès : K. pneumoniae, S. aureus, anaérobies
. pneumopathies atypiques : M. pneumoniae,
Chlamydia, Legionella pneumophila …
/ Interprétation nécessaire
- expectorations et aspirations non protégées
. seuil : 107 bactéries / ml de prélèvement
. bactérie commensale : 105 bactéries/ml
. signification douteuse : 106 bactéries/ml
/ Transport – conservation
- transport immédiat, sans délai (risque de dessèchement)
- milieux de transport-conservation disponibles
- humidifier les prélèvements si culture retardée
* Technologie au Laboratoire
/ Examen microscopique
- coloration de Gram
. apprécier qualité/quantité de la flore
. chercher à isoler le germe prédominant
- coloration au bleu de méthylène
. pour apprécier la présence de levures, la cytologie etc.
/ Culture
- milieux
. géloses au sang frais + acide nalidixique
. gélose au sang cuit + complexe vitaminique
. bouillon d’enrichissement : streptosel, BGT
. spéciaux : au sérum de bœuf coagulé ; Hoyle
- technique : méthode des quadrants
/ Recherches particulières
- Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum
- Candida albicans
- virus : Herpes simplex virus
/ Résultats
- angines rouges ou érythémato-pultacées
. S. pyogenes, S. pneumoniae , Streptocoque du groupe C , Streptocoque du
groupe G
. Staphylococcus aureus, H. influenzae
. Candida albicans
. virus = 50%
- angines pseudomembraneuses
. Corynebacterium diphteriae
. Staphylococcus aureus
. virus : EBV (mononucléose infectieuse)
- angines ulcéro-nécrotiques
. angine de Vincent : association de 2 germes
. chancre syphilitique : Treponema pallidum
- angines vésiculeuses : elles sont virales
- qualité flore
- quantité flore
Culture
- Isolement
- Identification
- Antibiogramme
* Technologie au Laboratoire
/ Examen macroscopique
- Sécrétions fluides, purulentes
- Odeur : fétides (anaérobies)
/ Examen microscopique
- coloration de Gram : flore monomicrobienne
- bleu de méthylène : levures, cytologie etc.
/ Culture
- milieux : GSO, GSC + complexe vitaminique
- technique : méthode des quadrants
/ Résultats
- otite moyenne aiguë
. S. pneumoniae, Streptococcus spp.
. S. aureus, H. influenzae, Entérobactéries, bacille pyocyanique
- otite externe (furoncle) : S. aureus
* Prélèvement oculaire
- Indications : conjonctivites
- Technique : écouvillonnage au niveau de l’angle interne, du cul de sac lacrymal, de la conjonctive
palpébrale
- Examen macroscopique
- Examen microscopique après coloration de Gram
- Milieux de culture : fonction du germe recherché
- Germes : Chlamydia trachomatis, Moraxella, pneumocoque, gonocoque, Haemophilus,
Staphylococcus aureus …
3.4.5. Hémoculture
a) Introduction
Il s’agit de «rechercher un agent étiologique dans le sang lors d’une infection»
Le sang est normalement stérile, et la présence de bactéries dans le sang peut signifier :
. une bactériémie : décharges transitoires de bactéries dans le sang pouvant être physiologique
(après les repas) ou pathologique (à partir d’un foyer infectieux),
. une septicémie : décharges répétées de bactéries dans le sang avec fièvre très élevée. Les
causes fréquentes sont : l’endocardite, la thrombophlébite, la fièvre typhoïde.
Les indications de l’Hémoculture sont :
- toute fièvre inexpliquée chez un cardiaque, une femme enceinte, un immunodéprimé
- tableau de septicémie
- hypothermie
b) Prélèvement :
* Techniques :
- moment du prélèvement : quand prélever ?
. quand ? : avant toute antibiothérapie, au moment des pics fébriles, loin des repas
. rythme : faire une hémoculture toutes les 6H
- techniques : comment et où prélever ?
. où : tout territoire veineux disponible
. comment (technique) : badigeonner la peau à l’alcool
poser un garrot
ponctionner la veine avec une seringue stérile
recueillir 10 ml de sang chez l’adulte, 5 ml chez l’enfant et
1 ml chez le nouveau-né.
b) Technologie au Laboratoire
* Incubation et surveillance
- incubation en atmosphère aérobie à + 37°C
- examiner les ballons tous les jours
* Traitement d’une hémoculture positive
- le ballon devient trouble en 2-3 jours
- faire un examen à l’état frais et après une coloration de Gram
- repiquer systématiquement sur gélose au sang et gélose MH
- ensemencer une galerie d’identification
- réaliser un antibiogramme
* Traitement d’une hémoculture négative
- garder les ballons non suspects pendant 7 à 10 jours
- repiquer systématiquement sur gélose au sang
- si culture négative, rendre les résultats
* Recherches particulières
- médulloculture
. fièvre typhoïde, brucellose
. tuberculose miliaire
- borréliose, leptospirose : milieux spéciaux
Ballon d’hémoculture
Incubation-observation
(atmosphère aéro/anaérobie)
Hémoculture positive
- délai : 2-3 jours
Hémoculture négative
Cas particuliers - délai : 7 jours
Examen
microscopique
Identification
- Etat frais - galerie
- Gram - recherche d’Ag
- ABG
v Indications
Diagnostic des fièvres typhoïde et paratyphoïdes
v Prélèvement
sang veineux chez un patient à jeûn
sérum recueilli après centrifugation
v Réactifs
sérums agglutinants de trois types :
- sérums contenant des Antigènes O = Ag somatiques, dénaturés à l’alcool
TO – AO – BO – CO
- sérums contenant des Antigènes H = Ag flagellaires, dénaturés au formol
TH – AH – BH – CH – ENH -TMH
- sérums contenant des Antigènes Vi = Ag capsulaires, dénaturés à l’alcool de
S. Typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin
v Principe
Réaction d’agglutination entre Ag et Ac (Sérum à étudier et suspensions antigéniques)
v Technique
Se fait en deux temps :
- Détecter la présence des Anticorps anti O, H, et Vi aux dilutions 1/100e et 1/200e
- Procéder au titrage de ces Anticorps
2- TITRAGE
Dilutions du sérum positif
Dilutions croissantes de raison 2 : 1/400, 1/800, 1/1600e
Centrifugation – Chiquenaude – Lecture
Titre final = inverse de la dernière dilution positive
Exemple : si dilution à 1/400e positive Titre : 400 UI/ml
v Principe
C’est un test basé sur une réaction d’agglutination sur carte.
Le réactif est constitué par un antigène fait de particules de latex polystyrène recouvertes de streptolysines
O.
En présence d’anticorps antistreptolysines O dans le sérum à tester, il se forme une agglutination visible à
l’œil nu.
v Matériel nécessaire
- Kit réactif qui comprend : réactif, contrôle positif, contrôle négatif, tigettes, carte d’agglutination ( le kit
est conservé à +4°C)
- Agitateur mécanique (non indispensable)
v Mode opératoire
• Sortir les réactifs et les laisser à température ambiante
• Prélever le sang du patient, centrifuger et recueillir le sérum
• A l’aide d’une carte sur laquelle sont individualisés des cercles, déposer 50ul de sérum
à tester dans un cercle et une goutte de chaque contrôle positif et négatif dans d’autres cercles
• Agiter le réactif ASLO et ajouter une goutte à coté de chaque échantillon.
• Mélanger, à l’aide d’une tigette à usage unique, de façon à recouvrir toute la surface
du cercle (changer de tigette pour chaque cercle)
• Agiter la carte à 100 tours/mn ou imprimer un mouvement de rotation avec les mains
pendant 2 minutes
• Lire la réaction obtenue.
v Lecture et Interprétation
- Absence d’agglutination : réaction négative = absence d’anticorps antistreptolysine O
- Présence d’agglutination : réaction positive = présence d’anticorps antistreptolysine O
Une réaction positive traduit un taux >200UI/ml (seuil de positivité du réactif utilisé, Bio Mérieux)
Tout sérum positif doit être titré.
Pour titrer, on procède à des dilutions sériées de 2 à 2 (1/2,1/4,1/8 etc…)
Le taux final sera défini comme étant la plus grande dilution qui donne une réaction positive (sérum positif
à la dilution 1/A : titre = A x seuil
exemple : un sérum positif à la dilution 1/8 correspond à un titre de 8 x 200 soit 1600 UI/ml.
Un taux d’ASLO < ou = 200UI/ml est considéré comme normal chez le sujet africain.
Un taux > 200UI/ml signe une infection récente.
- Antibiotiques à étudier
v Enterobacteriaceae
v Pseudomonas aeruginosa
v Staphylococcus spp.
v Enterococcus spp.
Ampicilline Chloramphénicol
Oxacilline Tétracycline
Kanamycine Erythromycine
Gentamicine Lincomycine ou clindamycine
Nitrofuranes Pristinamycine
Vancomycine Cotrimoxazole
Fluoroquinolones
v Streptococcus pneumoniae
Pénicilline G Chloramphénicol
Ampicilline ou amoxicilline Cotrimoxazole
Oxacilline Fosfomycine
Céfotaxime ou ceftriaxone Lincomycine
Gentamicine Pristinamycine
Kanamycine Norfloxacine
Tétracycline Vancomycine
Erythromycine
Pénicilline G Lincomycine
Ampicilline ou amoxicilline Pristinamycine
Oxacilline Chloramphénicol
Gentamicine Cotrimoxazole
Kanamycine Fluoroquinolones
Tétracycline Vancomycine
Erythromycine
- Milieu
Gélose chocolat PolyViteX® ou Milieu HTM (Mueller-Hinton + NAD 15 mg/l + hémine 15 mg/l +
extrait de levure 5 g/l).
- Ensemencement
Diluer au 1/10 la suspension inoculum (~106 UFC/ml) et ensemencer par écouvillonnage ou par
inondation en respectant les mesures de sécurité nécessaires.
- Lecture
Après 18-24 h d’incubation à 35-37° C.
- Antibiotiques à étudier
Ampicilline Chloramphénicol
Amoxicilline/ac. clavulanique Kanamycine
Céfalotine Gentamicine
Céftriaxone Fluoroquinolones
Tétracycline Cotrimoxazole
- Milieu
Gélose Mueller-Hinton additionnée de 5% de sang de mouton.
- Ensemencement
Ensemencer la suspension inoculum par écouvillonnage ou par inondation en respectant les mesures de
sécurité nécessaires. Disposer les disques à une distance de 60 mm, centre à centre, afin d’éviter le
chevauchement des zones d’inhibition.
- Lecture
Après 18 à 20 h d’incubation à 35-37° C en atmosphère contenant 5 % de CO2.
- Antibiotiques à étudier
Pénicilline G Chloramphénicol
Oxacilline Spiramycine
Amoxicilline Ciprofloxacine
Céfotaxime ou ceftriaxone Cotrimoxazole
Gentamicine Erythromycine
- Milieu
Gélose chocolat PolyViteX®
- Ensemencement
Ensemencer la suspension inoculum diluée au 1/100 ou ajustée au standard McFarland 0.5 (~106 UFC/
ml) par écouvillonnage ou par inondation en respectant les mesures de sécurité nécessaires. Disposer les
disques à une distance de 60 mm, centre à centre, afin d’éviter le chevauchement des zones d’inhibition.
- Lecture
Après 18-24 h d’incubation à 35-37° C en atmosphère contenant 5 % de CO2, et, si la croissance est
insuffisante, après 36-40 h.
- Antibiotiques à étudier
v Liquides biologiques :
Urines, expectorations, lavages broncho-alvéolaires, brossages des muqueuses, épanchements des séreuses
(plèvre, péricarde, péritoine), de la synoviale articulaire et du liquide céphalo-rachidien (LCR), écoulements
mamelonnaires spontanés ou provoqués. Le volume de prélèvement souhaité est de 5 à 10 ml.
v Biopsies et pièces opératoires (si le Centre de santé est doté d’un bloc opératoire)
Les échantillons de petite taille (biopsies endoscopiques, biopsies à la pince, biopsie partielle cutanée ou
biopsie exérèse, etc.) peuvent être fixés dans du liquide de Bouin (éviter alors les contenants en plastique),
ou dans du formol à 10%.
Les échantillons de grande taille en l’occurrence les pièces opératoires peuvent être adressés au laboratoire
après fixation dans du formol à 10% dans un récipient de grande taille pouvant contenir 5 à 10 fois le
volume de la pièce en fixateur et à ouverture large. Il est recommandé de ne pas sectionner la pièce pour
permettre au Pathologiste d’en faire un examen macroscopique correct et des prélèvements de bonne
qualité.
v Liquides biologiques
Flacons propres, alcool 50°, EDTA, lames porte-objet propres, lamelles, milieu de montage, colorants et
solvants
v Liquides biologiques
Le seul impératif est que le prélèvement soit fait dans des conditions d’asepsie et que l’échantillon soit mis
dans un récipient propre.
Tous ces échantillons seront accompagnés d’une fiche d’examen anatomo-pathologique sur laquelle
seront mentionnés les données personnelles du patient, un résumé clinique et paraclinique et des
hypothèses diagnostiques.
v Liquides biologiques
Mélange à volume égal du liquide prélevé avec de l’alcool à 50° dans un récipient propre.
Si le liquide est hémorragique, il faut le mettre dans un tube à EDTA.
v Liquides biologiques
Chaque flacon devra porter le nom et le prénom du patient, son âge, son sexe et le service de provenance.
Eviter d’écrire sur les couvercles des récipients et utiliser des récipients qui ferment hermétiquement.
_________________________________________________
_______________________________________
______________________________