License SV – Biochimie Biologie Moléculaire

Structure des Macromolécules

 
Méthodes spectroscopiques
Absorption, fluorescence
Dichroïsme circulaire

Nathalie Demont-Caulet
Université Paris 7 – Denis Diderot
UMR Ecosys- INRA Versailles

Nathalie.Demont-Caulet@versailles.inra.fr

Pourquoi étudier la structure des protéines?

Meilleure compréhension:
–  Propriétés fonctionnelles
–  Impact des mutations
–  Rôle des AA dans les interactions

Structure de la protéine KTI11P complexée avec le Zn

1
 Comment obtenir des données
structurales

Différentes méthodes selon le niveau de

résolution:
Interaction Rayonnement-Matière:
Spectroscopie

Absorbance, fluorescence,
dichroïsme circulaire

Spectrophotométrie / Spectrofluorométrie

Spectrophotométrie : Mesure de la lumière absorbée par des composés

(généralement en solution aqueuse).

Ä Quantité de lumière absorbée et longueur d’onde d’absorption

Spectrofluorométrie: Mesure de la lumière émise par des composés

après illumination.

Ä Quantité de lumière émise et longueur d’onde d’émission

Applications
Ä Analyse quantitative (identification et concentration)
Ä Modifications structurales (changement de conformation,
liaison de ligands…)

2
Propriétés de la matière et états électroniques (exemple H2)
Energie
e- liaison Nuage
Etat excité électronique

a b
Fondamental
Niveaux
vibrationnels Rotationnels dab
dab

Orbitale
E Orbitale antiliante
antiliante
σ*1S
1SA 1SB 1SA 1SB

Atome HA Atome HB Atome HA

σ1S σ1S Atome HB
Orbitale Orbitale
liante Transition liante
σ→σ*
Etat fondamental Etat excité

Interaction rayonnement

- matière
Rayonnement λ E (kJ)
Rayons X, γ
< 100 nm >1190

UV lointain (far) 100-250 nm 1190-595

Transitions
UV proche (near) 250-400 nm 595-340 Électroniques
Visible (Violet-Rouge) 400-800 nm 340-150 (couche externe)

InfraRouge Proche 800-2000nm 150-60 Transitions

rotationnelles
Moyen 2µm-16µm 60-7.5
vibrationnelles
Lointain > 16µm 7.5-0.4
Micro onde 1cm 0.4 Rotation des
molécules d’H20

λ du
domaine
visible

3
 I0 intensité incidente,
I intensité transmise
I0, λ0 I
N et n nombre de photon
N
n Si la solution « absorbe », n < N
Log (I0/I) = DO (Densité Optique)

Loi Beer-Lambert: DO = ελCl

DO sans unité

C en M ε
λ en M -1.cm-1 Coefficient
d’extinction molaire
l en cm

DO

Détermination expérimentale de εM
⇒ DO ∝ C tant que C < Clim
ε

Clim C

ε λ en M-1.cm-1 dépend de la λ

ε



ε = f(λ) ⇒ spectre d’absorption
de l’espèce chimique étudiée.

Seules certaines longueurs d’onde

vont permettre l’excitation des
λ
électrons

4
 Transitions électroniques possibles

σ*

n→σ*
π* Niveaux libres
n→π*
n
π→π*
π
Niveaux occupés
σ→σ*
σ

σ et π orbitales moléculaires liantes

σ* et π* orbitales moléculaires anti liantes
n orbitales moléculaires non liantes

Vibrationnels
Rotationnels
S1 S1
Energie

S0 Rotationnels
S0

λ
λ

Ligne d’absorption Spectre d’absorption

5
 Absorption des protéines: la liaison peptidique
La liaison peptidique

δ-
O

C N
δ+
H

Transition π→π*
ε190 ~ 7 000 M-1cm-1
Transition n→π*
ε210-220 ~ 100 M-1cm-1
Aromatiques

Absorption des protéines: les acides aminés

aromatiques

Absorption de F+Y+W
Absorption de Y+W
Absorption de W

Acides aminés aromatiques

(Transition π→π* )

Trp (W) ε280 ~ 5 500 M-1cm-1

Tyr (Y) ε274 ~ 1 600 M-1cm-1

ε280 ~ 1 490 M-1cm-1

Phe (F) ε250 ~ 400 M-1cm-1

Wetlaufer D.B. 1962

6
 Exemple d’application:
(1) Détermination de la concentration d’une protéine pure

Calcul théorique du coefficient d’extinction molaire connaissant la séquence

primaire d’une protéine.

ε280 = nw ε280w + ny ε280y + ns-s ε280s-s Avec ε280w ~ 5 500 M-1cm-1

ε280 Y ~ 1 490 M-1cm-1
ε280S-S ~ 125 M-1cm-1

D’après Pace C.N., et al. (1995), sur 80 protéines à l’état natif en solution.

Avec la loi de Beer-Lambert

et connaissant εM

DO
DO=εMCl ð C=
εMl

Exemple d’application:
(2) Détermination de la concentration en protéine
(mélange complexe)-Méthode de Bradford

Colorant Coomassie Brilliant Blue G250

Forme libre λmax = 465nm
Forme Liée λmax = 595nm

Se lie aux protéines via interactions non

covalentes (liaison H, VdW,
électrostatiques)
Spectre d’absorption du
CBB libre et lié Nécessite une courbe étalon.

7
Chromophore λmax εmax
(nm) (l.mol-1.cm-1)

Acides nucléiques
Adénine 260 15 000
Guanosine 255 14 000
Thymidine 265 10 000
Cytidine 270 9 000
Protéines
Tryptophane 280 5 600
Tyrosine 275 1 400
Phénylalanine 257 200
Pont disulfure 250 300
Liaison peptidique 190 4-8 000

Coenzyme
Flavine (FAD…) 450 12 700
NADH, NADPH 338 6 400

Appareillage: spectrophotomètre

Simple faisceau

Double faisceau

8
 Spectrophotométrie / Spectrofluorométrie

Spectrophotométrie : Mesure de la lumière absorbée par des composés

(généralement en solution aqueuse).

Ä Quantité de lumière absorbée et longueur d’onde d’absorption

Spectrofluorométrie: Mesure de la lumière émise par des composés

après illumination.

Ä Quantité de lumière émise et longueur d’onde d’émission

Applications
Ä Analyse quantitative (identification et concentration)
Ä Modifications structurales (changement de conformation,
liaison de ligands…)

Fluorescence

L’énergie absorbée est réémise sous forme de rayonnement

A* A*
Absorption Rayonnement
UV/visible Chaleur (hν)
10-15 sec 10-10 à 10-12 sec 10-9 à 10-3sec
A
A

nbre photons émis

Rdt de fluorescence Φ =
nbre photons absorbés

9
 Absorption Emission
(excitation)
Dissipation
S1 non radiative
Energie

Eexc Eem hc
E=
λ

S0
Diagramme de Jablonski
Eexc > Eem

λexc < λem (déplacement de Stokes)

Le spectre d’absorption caractérise les états vibrationnels du niveau excité

Le spectre d’émission caractérise les états vibrationnels du niveau de base

Spectres d’absorption et de fluorescence du NADH

Excitation

Emission

340 nm absorption
spécifique du NADH

10
 Fluorophore λmax (nm) φ

excitation émission (Rdt quantique)

Intrinsèques
Tryptophane 295 350 0.2
Tyrosine 275 300 0.15
NADH, NADPH 340 470 0.02

Extrinsèques
ANS 375 455 1
DANSYL 330 510 0.5

Spectre de d’émission de
fluorescence du tryptophane
et de la tyrosine

Effets de l’environnement du fluorophore sur λem

En fonction de sa polarité, le solvant stabilise (solvant polaire) ou
déstabilise (solvant apolaire) l’état excité.

A l’état excité, le fluorophore est en général plus polarisé qu’à l’état

natif.

réorganisation du solvant
autour du fluorophore

chaleur
hν

! Modulation du temps de vie de l’état excité

! Plus ou moins d’énergie dissipée sous forme non radiative,
! Rayonnement de fluorescence +/- energétique

11
 Effets de l’environnement du fluorophore sur λem

Red shift
Solvant polaire (solution aqueuse)
Stabilisation
de l’état excité

Retour à état fondamental: CHALEUR + rayonnement hν

Solvant apolaire (cœur hydrophobe de protéine)

Blue shift
Déstabilisation
de l’état excité

Retour à état fondamental: chaleur + RAYONNEMENT hν

Effets de l’environnement sur λem

Blue shift Red Shift

Fluorophore dans un Fluorophore dans un

environnement plus environnement plus
apolaire (hydrophobe) polaire (hydrophile)

lem (nm)

Blue et red shift par analogie avec le domaine visible

l du domaine
visible

12
 Effets de l’environnement du fluorophore sur IF

S1
Energie Pas d’effet (ou très peu)
Eexc Eem du solvant sur l’absorption

S0
Diagramme de Jabolnski

Polarité du solvant
Blue shift Red shift

λem
Rdt quantique

Exemple de l’effet de
Blue shift
l’environnement
sur le spectre de fluorescence,

Augmentation Fluorescence du NADH libre

du Rdt quantique ou associé à la lactate
déshydrogénase

Lactate déhydrogénase
Lactobacillus helveticus

13
 Inhibition de fluorescence

Si la protéine P contient un fluorophore

(tryptophane) et fluoresce à l’état
P+ L PL
quencher
libre. La fixation du ligand L peut
éteindre cette fluorescence.

Equation de Stern-Volmer
F0
= 1 + KSV [Q]
F
F0 fluorescence en absence de ligand (quencher)
F fluorescence en présence de ligand
KSV Constante de Stern-Volmer (KSV = kqt0 avec kq constante de
vitesse de quenching et t0 temps de vie de la fluorescence)
[Q] concentration de quencher.

On distingue le quenching dynamique:

extinction de fluorescence due à une collision entre le

fluorophore à l’état excité et le quencher
(I-, acrylamide, O2, H2O2…)

le quenching statique:

le quencheur s’associe avec le fluorophore dans l’état

fondamental (DNA, Protéine, cofacteur)

Donne des indications sur:

* Modification de conformation,
* Localisation du fluorophore.

14
Stern-Volmer plots of P-glycoprotein Trp quenching by
acrylamide in the absence and presence of nucleotides.

l, no ligand added

, 3 mM MgATP  
p, 3 mM MgATP γ S

[  Exposition du trp au

solvant avec fixation des
ligands.

Equation de Stern-Volmer
F0
= 1 + KSV [Q]
F

F0 1 1
Autre formulation: Loi de Lehrer: = +
ΔF faK[Q] fa

Avec : ΔF = F0 – F et K = 1
KSV
fa fraction de fluorophore qui émet

F0
ΔF Si plusieurs Trp fluorescent,
cette analyse permet de
1
déterminer la fraction
faK d’entre eux qui interagit
1 avec Q
fa
1
[Q]

15
 Exemple de quenching statique du tryptophane
Homéodomaine de la protéine bicoïde de D.
melanogaster (BCD-HD)

Entre N-H de l’indole du Trp48

et les électrons π du noyau
aromatique de la Phe8
Spectres de fluorescence
de BCD native et dénaturée
(λexc = 295nm) D’après Subramaniam et al. (2001)

Quenching et transfert d’énergie

- Transfert de l’énergie de l’état excité d’un donneur D

à un accepteur A

-  Le spectre d’émission de D
recouvre au moins partiellement
le spectre d’excitation de A.

-  L’efficacité de transfert suit la relation:

E = R06 / (R06 + r6)
R0 distance de Forster (efficacité de transfert de ½)
r distance entre donneur et accepteur.

- Distances classiques entre 2 et 5 nm

- Application à la mesure des distances au sein des protéines

16
 Schéma d’un fluorimètre
Cellule d’échantillon

λexc
Lampe Absorption

Fluorescence
Monochromateurs
(sélection des λ)

1- Déterminer le spectre d’absorption,

2- λmax = λexc λem
3- Déterminer le spectre d’ émission,
4- λmax = λem
Détecteur

Dichroïsme circulaire
* Le dichroïsme circulaire CD est un type de
spectroscopie d’absorption qui permet d’obtenir
des informations structurales sur les
macromolécules biologiques (protéines, acides
nucléiques).

* Il mesure la différence d’absorption entre les

composantes gauche et droite d’une lumière
polarisée circulairement.

* Nécessite un chromophore chiral ou placé dans un

environnement asymétrique.

17
 Lumière polarisée circulairement

* Lumière polarisée linéairement:

Vecteur électrique direction constante et amplitude variable.

* Lumière polarisée circulairement:

vecteur électrique de direction variable et d’amplitude constante.

La résultante des deux ondes est une autre onde

sinusoïdale située entre les deux premières

La résultante est une spirale

18
Deux ondes lumineuses polarisées linéaires peuvent se combiner.
La résultante est une onde lumineuse polarisée circulaire.

Deux ondes lumineuses polarisées circulaires peuvent se

combiner. La résultante est une onde polarisée linéaire.

Composantes circulaires d’une onde polarisée

Les molécules chirales et structures secondaires n'absorbent

pas de façon égale la lumière polarisée circulairement vers la
droite et la lumière polarisée circulairement vers la gauche.

19
 Composantes circulaires d’une onde polarisée

L’absorption préférentielle de l’une de ces deux polarisations résultera en une

déviation de la résultante: au lieu d’un cercle, le tracé de la résultante entre la
spirale tournant à droite et la spirale tournant à gauche sera une ellipse.

Cette déviation est

appelée dichroïsme
θ
circulaire
Elle permet d'établir un spectre de forme caractéristique pour trois
structures secondaires retrouvées dans les protéines: l'hélice, le
feuillet et la forme aléatoire (ou random coil), qui chacune présentent
des asymétries structurales.

Définitions et unités a
θ
b
Ellipticité = tang. de l’angle d’ouverture de l’ellipse


a
tan θ =
b
Les données de CD peuvent être exprimées :
1- ΔA = AG – AD
AG-AD
Δε = εG-εD = Δε coefficient d’extinction différentiel (en
c.l M-1.cm-1)

2- Ellipticité θ:

θ x 100 x Mr
[θ] Ellipticité molaire (degré.cm². dmol-1)
[θ] = Avec: θ (degré), mesurée expérimentalement
cxl
c, la concentration molaire
l, la longueur de la cellule (cm)
Mr, le poids moléculaire

20
 Structure des protéines et spectre de CD

* Les spectres de CD entre 180 et 240 nm (UV lointain ou far UV nous

renseignent sur les structures secondaires des protéines étudiées.

Transitions n "π* et π "π* de la liaison peptidique

structures secondaires = structures asymétriques

* Les spectres de CD entre 260 et 320 nm (UV proche ou near UV) nous
renseignent sur leur structure tertiaire (mobilité de la chaîne
latérale du W par ex).

Transitions vibrationnelles des noyaux aromatiques (F, Y, W)

* Technique de choix pour l’analyse des structures de protéines

Spectre de CD des différentes structures secondaires

80000
-1

60000
Mean residue ellipticity in deg.cm2.dmol-1

α-helix
dmol
2

β-sheet
40000 random coil

20000

-20000

-40000
Mean residue ellipicity in deg cm

190 200 210 220 230 240 250

wavelength in nm

polylysine à différents pH
pH7 random coil, pH10.8 hélice α; pH 11.1 brin β

21
 Le spectre de CD est sensible aux variations de
structure secondaire

CD signals for GCN4-p1

O'Shea et al. Science (1989) 243:538 GCN4-p1 is a coiled–coil:
figure 3: 34µM GCN4-p1 in 0.15M NaCl,
10mM phosphate pH 7.0
80

70

60
0 OC
50 50 OC
[θ] in1000 deg.cm2.dmol-1
-1

40 75 OC
dmol
2

30

20

10

0
in θ]

-10
1000
[

-20
deg cm

-30

-40
190 200 210 220 230 240 250 260

wavelength in nm
100% hélice α à 0oC
2 minima aux environs de à 220nm random coil à 75°C
spectre caractéristique d’hélice

Le signal de CD peut varier avec l’environnement

* Effet du trifluoroethanol (TFE) sur la structure de

GCN4-p1
* TFE induit l’hélicité du peptide
Effect of 50% TFE on a monomeric peptide

0
peptide in water
peptide in 50% TFE
-5

-10

-15

TFE
MRE

-20

-25

-30

-35
200 210 220 230 240

wavelength in nm

22
 Spectre de CD et structure secondaire des protéines

—— chymotrypsine (~ β)
—— lysozyme (α & β)
—— triosephosphate isomérase
(principalement α , qqles β)
—— myoglobine (α)

θ  à 222 nm diminue lorsque la proportion d’hélice α dans les

protéines augmente
from: http://broccoli.mfn.ki.se/pps_course_96/ss_960723_21.html

Spectres de dichroïsme
circulaire de la
Cu/Zn SOD humaine

Structure tertiaire
de la Cu/Zn SOD
humaine

D’après Arnesano et al. (2004)

23
 Détermination de la proportion des différentes
structures secondaires à partir d’un spectre CD

Méthode de Greenfield et Fasman (1969) d’ajustement par

combinaison linéaire selon la méthode des moindres carrées.


80000

Mean residue ellipticity in deg.cm2.dmol-1

θt = xαθα + xβθβ + xcθc

-1
60000 α-helix

xα,, xβ, et xc proportions relatives

dmol
2
β-sheet
40000 random coil

d’hélice α, brin β et rc avec 20000

xα+ xβ + xc = 1.0
0

-20000

-40000
Mean residue ellipicity in deg cm

190 200 210 220 230 240 250

wavelength in nm

Exemple : la myoglobine

θt = xαθα + xβθβ + xcθc
Le meilleur ajustement est obtenu pour

Xα = 80%,

Xβ = 0%
Xc = 20%

80000
En accord avec la structure 3D:
-1
Mean residue ellipticity in deg.cm2.dmol-1

60000

78% d’hélice α et 22% de pelote statistique

α-helix
dmol
2

β-sheet
40000 random coil

20000

-20000 www-structure.llnl.gov/cd/cdtutorial.htm
-40000
Mean residue ellipicity in deg cm

190 200 210 220 230 240 250

wavelength in nm

24
 Caractéristiques des spectres CD des
structures secondaires

Hélice α: pics négatifs à 208 et 222 nm

pic très intense à 190 nm

Feuillet β: moins intense que α et plus variable

pic négatif à 217 nm (Variable)

pic positif à 195 nm

Random coil (non structuré):pic négatif à 200 nm

CD et Structure tertiaire des protéines

"near-UV" (proche UV) = 250-320 nm

Partie du spectre sensibles à la structure tertiaire des protéines.

Chromophores impliqués

* 250-270 nm → phenylalanine
* 270-290 nm → tyrosine
* 280-300 nm → tryptophane.

Les liaisons S-S donnent une bande large sur toute la zone.

Protéine sans structure tertiaire (protéine mal repliée, ou « molten

globule ») signal dans le proche UV ~ 0

Signal important dans la région du proche UV [ protéine contenant une

structure tertiaire bien définie.

25
 Spectres de CD dans
l’UV proche des
αA- et αB- crystallines à
25 et 62°C

CD dans le proche UV
permet de suivre les
changements
conformationnels ayant lieu
à proximité des chromophores
(acides aminés aromatiques)

Etude de la dénaturation thermique de la chaîne A de

la cinnamomine

D’après Xie et al. (2001)

La cinnamomine (Chaînes A et B) : inactivatrice de ribosome

(RIP de type II),

La chaîne A (271 aa) catalyse l’activité N-glycosidase responsable de

l’inhibition du ribosome, la chaîne B (264) est une lectine,

Présente au niveau des graines de Camphrier, active sur les cellules

tumorales.

26
 Spectres CD dans l’UV proche
(A)  et lointain (B)
UV proche à différentes températures
1- 0°C 2- 37°C 3- 45°C
4- 55°C 5- 65°C 6- 75°C

Ä A 45°C perte de la structure UV lointain

tertiaire sans modification
notable de la structure
secondaire
(modèle de dénaturation à
plus de deux états)?
(A noter [θ]222 faible, due contribution
positive des résidus aromatiques)
D’après Wang and Liu (2003)

Fluorescence de l’ANS, 1-
Fluorescence du trp
anilo-8-naphtalène sulfonate

λexc = 380nm

Ä Mise en évidence de l’exposition de

zones hydrophobes lors de la dénaturation

27