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Test de Kleihauer par technique

cytochimique
C. Bassan, A. Charpentier

Le test de Kleihauer est un test cytochimique sur frottis sanguin permettant de détecter et de quantifier
les hématies fœtales dans le sang maternel en cas de suspicion d’hémorragie fœtomaternelle au cours
de la grossesse ou de l’accouchement. Ce test est fondé sur la différence de solubilité en milieu acide
de l’hémoglobine fœtale par rapport à l’hémoglobine adulte. Le test de Kleihauer est indiqué pour diag-
nostiquer, quantifier et suivre l’évolution d’une hémorragie fœtomaternelle (HFM). Le résultat du test
de Kleihauer permet également d’adapter la posologie des immunoglobulines anti-D dans le cadre de
la prophylaxie ciblée et systématique de la femme enceinte RH1 négatif du risque d’allo-immunisation
fœtomaternelle. Le test de Kleihauer est toujours l’examen biologique de référence du diagnostic direct de
l’HFM, car il devient positif dans ce cas avant les autres examens complémentaires. Le test de Kleihauer est
sensible, rapide et a une bonne valeur prédictive négative. Dans un faible pourcentage de cas, le test de
Kleihauer est ininterprétable en raison de la présence d’hématies maternelles possédant un contenu élevé
en hémoglobine fœtale (HbF). Toutefois, le test de Kleihauer est une technique manuelle mal standardisée
et sa reproductibilité et sa justesse sont médiocres. Or, il est cependant nécessaire d’obtenir le résultat
quantitatif le plus précis possible, car ce dernier permet d’évaluer le volume de l’HFM afin, d’une part,
d’estimer la sévérité de l’hémorragie et, d’autre part, d’adapter la posologie d’immunoglobulines anti-D
à administrer dans la prévention de l’allo-immunisation maternelle. Ainsi, pour le biologiste à l’heure de
l’accréditation, la réalisation et la lecture d’un test de Kleihauer nécessiteraient une meilleure standar-
disation interlaboratoires ainsi que des contrôles de qualité renforcés. Pour ces raisons, des techniques
alternatives plus précises de quantification des hématies fœtales par cytométrie en flux sont en cours de
développement.
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Mots-clés : Hémoglobine fœtale ; Test de Kleihauer ; Hémorragie fœtomaternelle ;

Allo-immunisation fœtomaternelle anti-RH1 ; Hémoglobinopathie ; Incompatibilité fœtomaternelle

Plan ■ Intérêt du test de Kleihauer 7

Avantages 7
■ Introduction 1 Inconvénients 7
■ Conclusion 7
■ Indications du test de Kleihauer 2
Hémorragie fœtomaternelle 2
Test de Kleihauer et diagnostic de l’hémorragie fœtomaternelle 2
■ Réalisation du test de Kleihauer par technique cytochimique 2
Principe du test de Kleihauer 2  Introduction
Échantillons 3
Technique de coloration 4 Le test de Kleihauer-Betke, plus communément appelé test de
■
Kleihauer, consiste à mettre en évidence la présence d’hématies
Lecture du test de Kleihauer 5
fœtales dans le sang maternel sur un frottis sanguin maternel
■ Interprétation des résultats 5 afin de détecter et de quantifier une éventuelle hémorragie fœto-
Test de Kleihauer négatif 5 maternelle (HFM) au cours de la grossesse. Les hématies fœtales
Test de Kleihauer positif 5 sont distinguées des hématies maternelles grâce à leur contenu
Cas des hématies ininterprétables 6 en hémoglobine fœtale (HbF) qui, contrairement à l’hémoglobine

EMC - Biologie médicale 1

Volume 9 > n◦ 2 > juin 2014
http://dx.doi.org/10.1016/S2211-9698(14)59085-1
90-15-0124-A  Test de Kleihauer par technique cytochimique

adulte, est acido-résistante. Le test de Kleihauer est le test cytochi- Kleihauer, le terme de la grossesse, la présence de signes cliniques
mique de référence en cas de suspicion d’HFM pour permettre, même si ceux-ci sont souvent d’apparition plus tardive [5] . Selon
d’une part, le diagnostic et la quantification de l’HFM et, d’autre cet ensemble de paramètres, la décision thérapeutique porte sur
part, d’adapter la posologie des immunoglobulines (Ig) anti- la poursuite ou l’interruption de la grossesse, le type et le rythme
D chez la femme RH1 négatif enceinte ou accouchée. Ce test de surveillance, la possibilité d’un accouchement par voie basse,
rapide et peu coûteux devient positif en cas d’HFM avant la l’indication d’une transfusion in utero.
plupart des autres examens complémentaires, mais il souffre
d’un manque de standardisation et son interprétation est parfois Place du test de Kleihauer dans la prévention
délicate.
de l’allo-immunisation fœtomaternelle
Une autre conséquence d’une HFM est le risque d’allo-
 Indications du test de Kleihauer immunisation fœtomaternelle. Cette allo-immunisation survient
lorsque les hématies fœtales qui passent dans la circulation mater-
Hémorragie fœtomaternelle nelle expriment des antigènes érythrocytaires hérités du père mais
absents chez la mère. L’allo-immunisation fœtomaternelle la plus
L’HFM, ou transfusion fœtomaternelle, correspond au passage grave survient dans le système rhésus avec l’antigène RH1 (égale-
anormal de sang fœtal dans la circulation sanguine maternelle. ment nommé D), et concerne les femmes RH1 négatif au cours
Le risque des HFM augmente avec le terme de la grossesse : 4 % d’une grossesse d’un fœtus RH1 positif. Le passage des héma-
au premier trimestre, puis 12 et 45 % aux deuxième et troisième ties fœtales dans la circulation maternelle conduit à la synthèse
trimestres et, enfin, 60 % à l’accouchement [1] . Ces HFM, parfois par la mère d’Ig anti-RH1 de type IgM puis IgG. Lors d’un nou-
spontanées, surviennent fréquemment au cours de la grossesse, veau contact avec l’antigène RH1 au cours de la même grossesse
mais la plupart sont si minimes qu’elles ne sont pas détectées ou lors d’une grossesse suivante d’un fœtus RH1 positif, les IgG
par les techniques usuelles de diagnostic [2, 3] . Le volume sanguin anti-RH1 maternelles traversent la barrière placentaire vers la
de l’hémorragie permet une classification partielle des HFM : elles circulation fœtale et se fixent sur les hématies fœtales, ce qui
sont dites « minimes » quand le volume de sang perdu par le fœtus provoque une hémolyse des hématies fœtales, par activation du
n’excède pas 1 ml (96 % des cas) et « majeures » quand il dépasse système du complément (anémie hémolytique du nouveau-né) [9] .
30 ml (0,3 % des cas) [4] . La physiopathologie de l’HFM est mal Ce phénomène renforce l’anémie fœtale due à l’HFM initiale
connue et l’hypothèse la plus probable est un shunt vasculaire et s’accompagne d’une augmentation de la bilirubine chez le
fœtomaternel au niveau de la chambre intervilleuse. Parmi les nouveau-né avec risque de survenue d’un ictère nucléaire pou-
autres étiologies, on peut citer les traumatismes abdominaux, les vant entraîner des séquelles psychomotrices importantes, voire
versions par manœuvre externe, les contextes obstétricaux par- le décès [9] . La prévention de l’allo-immunisation fœtomaternelle
ticuliers (grossesse molaire, grossesse extra-utérine, interruption consiste à injecter aux femmes RH1 négatif non immunisées
de grossesse, fausse couche, mort fœtale in utero, prélèvements contre l’antigène RH1, au cours ou à la fin d’une grossesse d’un
fœtaux, etc.), ou encore l’accouchement [5, 6] . Les conséquences fœtus RH1 positif, des immunoglobulines anti-RH1 (Rhophylac® )
d’une HFM sont l’apparition d’une anémie fœtale de sévérité (également et souvent encore appelées immunoglobulines anti-
variable ainsi qu’un risque d’allo-immunisation fœtomaternelle D). Le Collège national des gynécologues et obstétriciens français
selon le phénotype RH maternel. On considère que des HFM infé- (CNGOF) a rédigé, en 2006, des recommandations pour la pra-
rieures à 0,5 ml n’ont en général ni risque d’allo-immunisation tique clinique (RPC) sur la prévention de l’allo-immunisation
ni risque fœtal, les HFM de volume compris entre 0,5 et 5 ml fœtomaternelle [6] (Tableau 1). Ces recommandations préconisent
n’exposent qu’au risque d’allo-immunisation maternelle sans une prophylaxie ciblée complétée d’une prophylaxie anténatale
risque fœtal, tandis que le fœtus risque une anémie de sévé- systématique. La prophylaxie ciblée a pour but de prévenir les
rité variable au-delà [5] . Les formes sévères d’HFM peuvent aller immunisations anti-RH1 résultant d’HFM en cas de situation à
jusqu’à mettre en jeu le pronostic vital du fœtus par une anémie et risque hémorragique quel que soit le stade de la grossesse, tan-
un choc hypovolémique [5] . L’évaluation du retentissement fœtal dis que la prophylaxie systématique a lieu au début du troisième
dépend du volume de sang fœtal perdu mais aussi d’autres cri- trimestre de la grossesse (28 semaines d’aménorrhée [SA]) afin de
tères comme le débit du shunt, le stade de la grossesse, le poids prévenir les immunisations résultant d’HFM silencieuses du troi-
du fœtus [5] . sième trimestre de la grossesse (Tableau 1) [6, 10] . À l’accouchement,
Les circonstances de diagnostic de l’HFM sont très variées. En le phénotype RH du nouveau-né doit être déterminé et la prophy-
dehors d’un contexte traumatique évident, le signe clinique le laxie ne concerne que les femmes RH1 négatif qui accouchent
plus fréquent est la diminution de la perception des mouve- d’un enfant RH1 positif [6, 10] .
ments fœtaux. Une HFM doit être également suspectée en cas Au même titre que les recherches d’agglutinines irrégulières
d’anomalies du rythme cardiaque, d’anasarque fœtoplacentaire, (RAI), le test de Kleihauer fait partie intégrante de la stratégie des
voire de mort fœtale in utero (dans les HFM massives) [7, 8] . À la examens complémentaires recommandés en 2005 par le CNGOF
naissance, les manifestations cliniques chez le nouveau-né varient dans le cadre de la prévention de l’allo-immunisation fœtoma-
également selon l’importance de l’HFM : pâleur, cordon ombilical ternelle [6] (Tableau 1). Le test de Kleihauer permet en effet de
fin et exsangue, choc hypovolémique, détresse respiratoire pou- diagnostiquer et de quantifier l’HFM afin d’adapter la posolo-
vant se compliquer d’une hypoxie ischémique cérébrale et mettre gie d’Ig anti-D à injecter dans le cadre de la prophylaxie ciblée
en jeu le pronostic neurologique. (Tableau 2) [6] . Le test de Kleihauer n’est cependant pas utile avant
15 SA, car le volume sanguin fœtal est inférieur à celui couvert par
une dose de 200 ␮g de Rhophylac® [10] .
Test de Kleihauer et diagnostic
de l’hémorragie fœtomaternelle
C’est dans le contexte de suspicion d’HFM que le test de  Réalisation du test de Kleihauer
Kleihauer prend toute sa place afin de mettre en évidence une par technique cytochimique
HFM, puis pour estimer le volume de sang perdu par le fœtus.
Le test de Kleihauer est toujours l’examen biologique de réfé- Principe du test de Kleihauer
rence de première intention du diagnostic direct de l’HFM, car
il devient positif en cas de suspicion d’HFM avant les autres exa- Le test de Kleihauer est un test cytochimique consistant à mettre
mens complémentaires. En effet, les autres examens, comme la en évidence et à quantifier la présence d’hématies fœtales au sein
mesure du pic systolique de vélocité de l’artère cérébrale moyenne des hématies adultes maternelles sur un frottis sanguin mater-
fœtale par échodoppler, sont le reflet de l’anémie consécutive à nel. Ce test a été décrit dès 1957 par E. Kleihauer et K. Betke et
l’HFM et sont plus tardivement perturbés. Devant une HFM, la reste actuellement le test de référence pour mettre en évidence
conduite à tenir est définie et adaptée selon le résultat du test de une HFM de façon directe [11] . Le principe du test de Kleihauer

2 EMC - Biologie médicale

 Test de Kleihauer par technique cytochimique  90-15-0124-A

Tableau 1.
Recommandations pour la prévention de l’allo-immunisation anti-RH1 chez les femmes RH1 négatif (d’après [6] ).
Terme de la grossesse Moins de 15 SA De 15 à 27 SA De 27 à 29 SA De 29 SA jusqu’à Accouchement
l’accouchement
Mesures générales Double détermination RAI RAI au 8e mois si Groupe sanguin du bébé
groupe sanguin + RAI absence de prévention sur sang de cordon
Génotypage fœtal sur sang systématique
maternel
Attitude Prévention ciblée si : Prévention ciblée si : Prévention Prévention ciblée : Prévention
– FCS, IVG ou IMG – risque important systématique inutile si prévention systématique si
– grossesse molaire d’HFM : IMG, FCS, systématique réalisée nouveau-né RH1 positif
– GEU MFIU, VME, pour risque d’HFM
– métrorragies traumatisme ou important (IMG, FCS, Abstention possible si :
– choriocentèse, chirurgie abdominale etc.) moins de trois semaines
amniocentèse ou pelvienne après Rhophylac® et
– réduction embryonnaire – risque modéré d’HFM : Kleihauer négatif et Ac
– traumatisme abdominal métrorragies, cerclage anti-RH1 > 6 ng/ml
– cerclage cervical cervical, MAP
Test de Kleihauer Non Oui si risque important Non Oui si risque important Oui (à prélever au
moins 30 minutes après
la délivrance)
Rhophylac® 200 ␮g i.v. (ou i.m.) 200 ␮g i.v. dans les 300 ␮g i.m. 200 ␮g i.v. dans les 200 ␮g i.v. dans les
dans les 72 heures 72 heures (ou plus si 72 heures (ou plus si 72 heures, rattrapage
nécessaire) nécessaire) jusqu’à 30 jours

SA : semaines d’aménorrhée ; RAI : recherche d’agglutinines irrégulières ; FCS : fausse couche spontanée ; IVG : interruption volontaire de grossesse ; IMG : interruption
médicale de grossesse ; GEU : grossesse extra-utérine ; HFM : hémorragie fœtomaternelle ; MFIU : mort fœtale in utero ; VME : versions par manœuvres externes ; MAP :
menace d’accouchement prématuré ; Ac : anticorps ; i.v. : intraveineux, i.m. : intramusculaire.

Tableau 2.
Adaptation des doses de Rhophylac® en fonction du résultat du test de Kleihauer [6] .
Test de Kleihauer Dose de 200 ␮g Dose de 300 ␮g Voie d’administration
(pour 10 000 hématies)
Nombre de doses ␮g Nombre de doses ␮g
0–4 1 200 1 300 Intraveineuse directe
5–24 1 200 1 300
25–44 2 400 1 300
45–64 2 400 2 600 Perfusion sur 4 heures dans 250 ml de NaCl 9 ‰
65–84 3 600 2 600
85–104 3 600 2 600
105–124 4 800 3 900
125–144 4 800 3 900
145–164 5 1000 3 900
165–184 5 1000 4 1200
185–204 6 1200 4 1200
205–224 6 1200 4 1200
225–244 7 1400 5 1500
245–264 7 1400 5 1500
265–284 8 1600 5 1500
285–304 8 1600 6 1800

NaCl : chlorure de sodium.

repose sur la différence de solubilité en milieu acide de l’HbF par Il faut signaler le développement encore récent de techniques
rapport à l’hémoglobine adulte. En effet, l’HbF, majoritairement de cytométrie en flux, qui détectent les hématies contenant de
contenue dans les hématies fœtales, est résistante à l’hémolyse en l’HbF à l’aide d’un anticorps dirigé contre l’HbF [15] .
milieu acide, tandis que l’hémoglobine A (HbA), principalement
située dans les hématies maternelles adultes, est hémolysée [11–13] .
Après cette étape de contact avec le réactif acide hémolysant, les Échantillons
hématies sont colorées à l’éosine : les hématies maternelles adultes Le test de Kleihauer s’effectue sur un frottis sanguin fin préparé
apparaissent comme des membranes cellulaires vides et transpa- à partir d’un prélèvement de sang veineux prélevé sur anticoagu-
rentes (Fig. 1) tandis que les hématies fœtales sont colorées en rose lant (éthylène-diamine-tétra-acétique [EDTA], citrate de sodium).
foncé (Fig. 2). Les hématies fœtales en rose foncé présentes sur le Pour une bonne interprétation du test, la prescription accompa-
frottis sanguin maternel sont alors comptées au microscope par gnant les tubes doit mentionner, outre les informations usuelles,
rapport aux hématies maternelles [13] . Pour valider la bonne réali- le contexte de la demande, la date de début de la grossesse, le
sation des différentes étapes, on effectue en parallèle deux lames groupe et la RAI de la mère ainsi que la date et la posologie d’une
témoins (négatif et positif). éventuelle précédente injection de Rhophylac® .
Le test de Kleihauer est coté B70 dans le chapitre « Hématologie Deux frottis témoins, un négatif et un positif, doivent égale-
de la Nomenclature des Actes de Biologie Médicale » (sous- ment être effectués en parallèle afin de valider la bonne exécution
chapitre 5-01, code 2109) [14] . de la technique de coloration. Par exemple, le frottis témoin

EMC - Biologie médicale 3

90-15-0124-A  Test de Kleihauer par technique cytochimique

Figure 1.
A, B. Test de Kleihauer négatif. Les hématies apparaissent vides et translucides.
C. Test de Kleihauer négatif avec modification des temps de rinçage, donnant un
aspect un peu moins transparent aux hématies.

négatif peut être confectionné à partir du sang d’un homme adulte Technique de coloration
sain et le frottis témoin positif après mélange d’une goutte de sang
de nouveau-né de moins de trois jours dans neuf gouttes de sang Il existe des kits de coloration commerciaux prêts à l’emploi
d’homme adulte sain. Il est important que les frottis soient fins (LMR® Hémoglobine F, Labo-Moderne, ou Sure-Tech® , test de Klei-
afin de bien étaler les cellules pour faciliter la reconnaissance des hauer Oxytele) ou des protocoles de coloration propres à chaque
hématies négatives et éviter des colorations douteuses en raison laboratoire. Il est nécessaire de colorer dans la même série le(s)
de la présence d’hématies trop « épaisses » sur la lame. Pour réali- frottis de(s) patiente(s) ainsi que le frottis témoins négatif et posi-
ser des frottis fins, il est conseillé d’effectuer l’étalement régulier tif.
d’une petite goutte de sang avec un angle d’étalement inférieur La technique exposée ci-dessous est adaptée de la technique
à 45◦ . princeps et est décrite à titre indicatif [12, 13] .
Après confection, les frottis de la patiente et des témoins
doivent sécher pendant au moins 30 minutes pour éviter le risque
de décollement du frottis puis être fixés à l’alcool. L’étape de
Réactifs nécessaires
confection et fixation des frottis peut ainsi se résumer selon le Avant de réaliser le test, il est nécessaire de préparer à l’avance
protocole suivant : les solutions suivantes [13] :
• faire un frottis fin sur une lame identifiée ; • solution 1 : solution mère d’hématoxyline à 0,75 % : 0,75 g
• laisser sécher à l’air pendant au moins 30 minutes ; d’hématoxyline, 100 ml d’éthanol absolu ;
• fixer par de l’éthanol à 80 % pendant cinq minutes ; • solution 2 : solution de chlorure ferrique (FeCl3 : 2,4 g), chlo-
• ôter l’alcool et laisser sécher dix minutes au minimum ; rure d’hydrogène (HCl) à 25 % (2,5 ml de HCl pour 10 ml d’eau
Après fixation, les frottis peuvent être conservés plusieurs jours distillée) : 2 ml, eau distillée (quantité suffisante pour 100 ml) ;
à 4 ◦ C en attendant la réalisation de la technique du test de Klei- • solution 3 : solution d’éosine à 0,5 % dans l’eau distillée : éosine
hauer (cela permet en particulier de confectionner plusieurs lames poudre (0,5 g), eau distillée (100 ml) ;
de témoin à l’avance). • éthanol à 80 % (100 ml d’éthanol absolu pour 28,6 ml d’eau
Il existe dans le commerce des kits de contrôle qualité interne distillée).
(CQI) permettant un CQI externalisé, contenant trois niveaux
de positivité de sang stabilisé, à utiliser comme s’il s’agissait
d’un échantillon sanguin (Fetal RBC ControlTM , R&D systems, Mode opératoire [13]
FETALtrolTM , Trillium Diagnostics® ). • Préparer extemporanément la solution finale d’hématoxyline
Selon le contexte clinique, il est également possible de réaliser composée de :
si besoin le test de Kleihauer sur un frottis sanguin de métror- ◦ deux volumes de solution 1 ;
ragies, de sang de nouveau-né, de fœtus transfusé, ou de liquide ◦ un volume de solution 2 ;
amniotique (frottis ou cytocentrifugation). ◦ un volume d’éthanol à 80 % ;

4 EMC - Biologie médicale

 Test de Kleihauer par technique cytochimique  90-15-0124-A

Figure 2.
A, C. Test de Kleihauer positif (patiente).
B. Test de Kleihauer positif (témoin positif au 1/10e ).

• recouvrir les frottis avec cette solution finale d’hématoxyline exemple) et rester inférieur à 72 heures, qui est le délai maxi-
pendant 20 à 25 secondes ; mal d’injection de la prophylaxie anti-D en cas de prévention de
• rincer à l’eau courante pendant une minute ; l’incompatibilité fœtomaternelle.
• contrecolorer avec la solution 3 d’éosine à 0,5 % pendant cinq
à huit minutes ;
• rincer à l’eau courante ;  Interprétation des résultats
• laisser sécher verticalement les lames à température ambiante.
Test de Kleihauer négatif
 Lecture du test de Kleihauer La Figure 1 montre des résultats de test de Kleihauer négatif.
Les hématies maternelles, dépourvues d’HbF, apparaissent trans-
La lecture au microscope s’effectue dans une zone du frottis où lucides et fantomatiques. Comme le montrent les Figures 1B et C,
les hématies sont non chevauchantes, à l’objectif 50 ou 100 [12, 13] . des différences d’aspect des hématies maternelles peuvent
La technique est validée par l’observation des lames témoins s’observer en fonction des conditions de réalisation de la colora-
colorées en parallèle. Sur le frottis du témoin négatif, les héma- tion : variation des temps de rinçage de la coloration par exemple.
ties ne contiennent pas d’HbF et apparaissent vides, translucides On peut observer quelques cas de résultats faussement négatifs
telles des fantômes (Fig. 1A). Sur le frottis témoin positif, les dans les situations de destruction des hématies fœtales présentes
hématies fœtales contenant de l’HbF sont colorées en rose foncé (incompatibilité fœtomaternelle, postinjection d’Ig anti-D avec
laqué (Fig. 2B) et sont dispersées au sein d’une majorité d’hématies un fœtus RH1 positif), ou lors d’une HFM débutante [5] .
négatives. Sur le frottis coloré, il faut effectuer le décompte des
éventuelles hématies positives sur 10 000 hématies, ce qui néces- Test de Kleihauer positif
site de regarder au microscope environ 20 champs de 500 hématies
à l’objectif 50, ou 50 champs de 200 hématies à l’objectif 100. La Figure 2 présente des tests de Kleihauer positifs. Les hématies
En l’absence d’hématies positives, le résultat est négatif, et est fœtales sont en rose foncé et la coloration homogène, d’aspect
rendu comme inférieur à une hématie fœtale pour dix mille héma- laqué au sein des hématies maternelles négatives translucides. La
ties maternelles (< 1/10 000). dilution de sang fœtal utilisée pour confectionner le frottis du
En présence d’hématies positives, le résultat est le nombre témoin positif (Fig. 2B) peut servir d’étalon pour vérifier la justesse
d’hématies positives comptées pour 10 000 hématies adultes du compte d’hématies positives comptabilisées chez la patiente.
maternelles. Un test de Kleihauer positif permet d’affirmer une HFM mais
Le délai de rendu du résultat du test de Kleihauer doit tenir aussi d’évaluer l’importance du saignement. Cela est en effet
compte du contexte clinique qui peut aller de quelques heures nécessaire pour déterminer la posologie d’Ig humaines anti-
(urgence de décision de déclenchement de l’accouchement par RH1 (Rhophylac® ) à administrer chez les femmes RH1 négatif

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A B

C D
Figure 3. A, B, C, D. Test de Kleihauer présentant des hématies de coloration rose pâle intermédiaire et présence d’un halo clair.

pour prévenir l’allo-immunisation fœtomaternelle anti-RH1 [6] de celle des hématies fœtales. Il devient alors impossible de dis-
(Tableau 2), mais également pour estimer la sévérité de tinguer ces hématies maternelles d’éventuelles hématies fœtales.
l’hémorragie. Il existe une relation entre la valeur du résultat La Figure 4A montre ainsi l’exemple d’un test de Kleihauer effec-
du test de Kleihauer et le volume de sang perdu par le fœtus. tué chez une patiente drépanocytaire non enceinte sur lequel on
Le volume sanguin perdu est déterminé par une équation qui observe des hématies d’un rose vif ressemblant à des hématies
tient compte du pourcentage d’HbF, des hématies fœtales (90 %), fœtales. Ces hématies de coloration intermédiaire nécessitent un
du volume globulaire moyen (120 ␮l) d’une hématie fœtale, lecteur expérimenté, car leur dénombrement est difficile, surtout
du volume globulaire de la mère (1800 ml) et de l’hématocrite si coexistent au sein du même frottis des hématies positives et
(50 %) [16] . On estime ainsi que le volume de l’HFM (en millilitres) intermédiaires. Les hématies de coloration intermédiaire doivent
correspond globalement à la moitié du résultat d’hématies posi- être considérées et rendues comme « ininterprétables » afin de ne
tives dans le test de Kleihauer [16] . Par exemple, un test de Kleihauer pas rendre un résultat faussement positif [18] . En 2006, le Centre
positif à 10 pour 10 000 hématies adultes correspond à une perte national de référence en hémobiologie périnatale (CNRHP) a
de sang fœtal de 5 ml. estimé, sur environ 6500 tests, que la fréquence d’observation des
Le volume de l’hémorragie fœtale doit être interprété par rap- cellules ininterprétables s’élevait à 3 % des tests de Kleihauer [18] .
port au volume sanguin total qui peut être estimé, sachant qu’un Dans ce cas, il est souhaitable de prendre connaissance des
nouveau-né possède 80 à 90 ml de sang par kilogramme [17] , soit données cliniques maternelles à la recherche d’une hémoglobino-
pour un nouveau-né à terme de 3 kg un volume sanguin total pathie et d’accompagner le résultat d’un commentaire suggérant
d’environ 250 ml. de réaliser une électrophorèse de l’hémoglobine si aucune hémo-
globinopathie n’est connue (trait thalassémique par exemple).
Cas des hématies ininterprétables La Figure 4B illustre ainsi l’aspect du test de Kleihauer chez
une patiente atteinte d’un trait thalassémique, où l’on n’observe
Dans certains cas, on observe des hématies de coloration que des hématies intermédiaires et négatives. Dans ces situations,
« intermédiaire » c’est-à-dire présentant une coloration rose pâle où le test de Kleihauer met en évidence de nombreuses cellules
intermédiaire entre le rose foncé des hématies fœtales et la ininterprétables, les tests de cytométrie en flux offrent une alterna-
transparence incolore des hématies adultes, ou un halo clair tive intéressante en permettant de séparer à l’aide d’un anticorps
(Fig. 3). Cette situation s’observe dans les situations au cours des- anti-Hb F les hématies maternelles adultes contenant de l’HbF
quelles les hématies maternelles contiennent une quantité accrue des hématies fœtales [15, 19] . Ces deux populations d’hématies, bien
d’HbF : drépanocytose, ␤-thalassémie, persistance héréditaire de que toutes deux positives pour l’Hb F, peuvent en effet être dis-
l’hémoglobine fœtale, traitement par hydroxyurée. Plus les héma- tinguées en cytométrie de flux par une différence d’intensité de
ties maternelles sont riches en HbF, plus leur coloration est proche fluorescence.

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 Test de Kleihauer par technique cytochimique  90-15-0124-A

utilisent leur propre mode opératoire. Les principales limites du

test de Kleihauer se rencontrent cependant au moment de la lec-
ture au microscope, dans deux situations : lors de la quantification
des hématies positives et en présence d’hématies de coloration
intermédiaire.
Quantification des hématies positives : le dénombrement des
hématies positives se fait sur 10 000 hématies, ce qui nécessite
d’estimer le nombre d’hématies sur des champs du microscope
choisis par le lecteur. Pour cette raison, le compte des héma-
ties positives est très « observateur dépendant » : il en résulte
une médiocre reproductibilité [21, 22] ainsi qu’une médiocre jus-
tesse des résultats positifs [18, 19, 23] . Dans une étude comparative
de la même lame par 20 laboratoires et 72 opérateurs, Simonnet
et Brossard [21] ont montré que le résultat du nombre d’hématies
fœtales variait de 14 à 122 d’un laboratoire à l’autre et de 0 à 140
selon l’opérateur, pour une valeur de référence de 44 hématies
fœtales positives pour 10 000 hématies adultes [18] . Ce manque
de justesse n’est pas sans conséquence puisque la posologie
d’immunoglobulines anti-D à administrer pour la prophylaxie de
l’allo-immunisation fœtomaternelle dépend du résultat du test
de Kleihauer [6] . La standardisation de la lecture du test de Klei-
hauer peut être améliorée par un système de lecture automatisé
réservé à des laboratoires ayant un recrutement très important [24] .
Les techniques de quantification de l’HbF par cytométrie en
flux se développent également afin d’améliorer la précision des
résultats [15, 19] .
Présence d’hématies de coloration intermédiaire : il s’agit de la
situation où la lecture du test est la plus délicate, nécessitant un
opérateur expérimenté puisqu’il faut parfois faire la différence
entre des dégradés de coloration rose. Cela induit un manque
de spécificité en raison de la possibilité de résultats faussement
positifs [25–28] .

 Conclusion
Le test de Kleihauer est toujours l’examen cytochimique le plus
précoce et le plus répandu de diagnostic direct de l’HFM. Dans ce
contexte, le test de Kleihauer est indispensable pour quantifier la
proportion des hématies fœtales présentes dans le sang maternel
afin d’adapter la posologie de la prophylaxie par immunoglobu-
lines anti-D en cas d’allo-immunisation fœtomaternelle. Le test
de Kleihauer est un test peu coûteux, rapide et compatible avec
l’urgence, mais il souffre toutefois d’une mauvaise standardisa-
tion technique, du manque de contrôles de qualité externes ainsi
Figure 4. que d’une médiocre reproductibilité et justesse des résultats. Les
A. Test de Kleihauer effectué chez une femme drépanocytaire non biologistes médicaux se trouvent dans une situation paradoxale
enceinte. On constate une discrète hétérogénéité dans l’intensité de avec un test de plus en plus prescrit par les gynécologues obsté-
la coloration rose avec des hématies de coloration identique à celle triciens, car il fait partie intégrante de la stratégie des examens
d’hématies fœtales. complémentaires recommandés par le CNGOF dans le cadre de
B. Test de Kleihauer effectué chez une femme porteuse d’un trait thalas- la prévention de l’allo-immunisation fœtomaternelle, mais avec
sémique et non enceinte. On n’observe dans ce cas que des hématies de un test qui a du mal à répondre aux critères de l’accréditation des
coloration rose pâle intermédiaire. analyses de biologie médicale.
Pour ces raisons, les voies d’avenir du test de Kleihauer sont
probablement l’amélioration de la standardisation, le développe-
 Intérêt du test de Kleihauer ment des contrôles de qualité, internes et externes, la formation et
l’harmonisation des observateurs à la lecture du test, ainsi que le
Avantages développement de techniques alternatives plus précises et repro-
ductibles comme la détection des hématies fœtales par cytométrie
Le test de Kleihauer est aisé à effectuer au laboratoire : sa réali- en flux.
sation est rapide, réalisable en urgence, simple et nécessite des
réactifs peu coûteux. De plus, le bénéfice attendu est impor-
tant puisque le prélèvement est peu invasif pour un test très Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts en
sensible [19, 20] . Lorsqu’il est négatif, le test de Kleihauer permet relation avec cet article.
d’exclure les HFM avec une très bonne sensibilité (une héma-
tie pour 10 000) et spécificité. Lorsque le frottis ne comporte pas
d’hématies de coloration intermédiaire, les cas de faux négatifs ou
de faux positifs sont très rares.
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C. Bassan, Biologiste.
Laboratoire de l’hôpital Saint-Philibert, Groupement des Hôpitaux de l’Institut catholique de Lille, 115, rue du Grand-But, BP 249, 59462 Lomme cedex,
France.
A. Charpentier, Maître de conférences Universitaire, Praticien hospitalier, Chef de service (charpentier.agnes@ghicl.net).
Faculté libre de médecine de Lille, Laboratoire de l’hôpital Saint-Philibert, Groupement des Hôpitaux de l’Institut catholique de Lille, 115, rue du Grand-But,
BP 249, 59462 Lomme cedex, France.

Toute référence à cet article doit porter la mention : Bassan C, Charpentier A. Test de Kleihauer par technique cytochimique. EMC - Biologie médicale
2014;9(2):1-8 [Article 90-15-0124-A].

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