Les milieux de culture en Bactériologie

BIO303 Rédigé par Chringel
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Les Milieux de Culture en
Bactériologie
Les Milieux de Culture
Gélose au Cétrimide - milieu sélectif
Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone
 Glucide et dérivés : /
 Autres molécules carbonées : /
 Indicateurs S2-
: /
 Inhibiteurs : cétrimide (antiseptique), acide nalidixique
 Divers : /
 Indicateurs de pH : /
 Ions minéraux : chlorure de magnésium MgCl2, sulfate de potassium K2PO4,
hydrogénophosphate de potassium
 Agar : oui
 Eau : oui
Caractéristiques
 Milieu proche du King A, favorise la production de pyocyanide.
 Milieu relativement pauvre.
 Acide nalixidique : inhibiteur des Gram –
 Cétrimide : inhibiteur des Grams + donc des Gram – par extension.
 Ensemencement en cadran.
Usage
 Recherche des Pseudomonas, notamment Pseudomonas earuginosa.
Lecture
 Incubation 24h à 37°C :
Développement Pseudomonas aeruginosa et éventuellement Pseudomonas putida,
Pseudomonas stutzeri et Pseudomonas maltophilia.
 Incubation 24h à 42°C :
Développement presque exclusif de Pseudomonas aeruginosa.
 Pyocyanine : milieu bleu
 Pyoverdine : milieu jaune-vert  indicateur de la présence de Pseudomonas

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Gélose de Chapman – milieu sélectif
Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extrait de viande
 Glucides et dérivés : /
 Autres molécules carbonées : mannitol
 Indicateur S2-
: /
 Inhibiteurs : NaCl à 75g/L
 Divers : /
 Indicateurs de pH : rouge de phénol
 Ions minéraux : NaCl
 Agar : oui
 Eau : oui
Caractéristiques
 Permet la croissance des bactéries halophiles.
 Très forte concentration en NaCl permettant l’inhibition des Gram-
 Permet l’étude de l’attaque du mannitol (si baisse du pH, alors teinte jaune)
 Ensemencer richement en stries ou cadran.
 Incubation : 24-48h
Usage
 Isolement de Staphylococcus aureus.
 Numération des staphylocoques.
Lecture
 Si Staphylococcus aureus : colonie jaunes avec halo clair. Mannitol +
Les autres colonies sont Mannitol -.
Contamination possible par Enterococcus et certains Bacillus.

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Drigalski – milieu sélectif
Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extraits de viande et levure
 Glucide et dérivés : Lactose
 Indicateurs S2-
: /
 Inhibiteurs : Cristal violet, Désoxycholate de sodium
 Divers : /
 Indicateurs de pH : Bleu de Bromothymol
 Ions minéraux : Thiosulfate de sodium
 Agar : oui
 Eau : oui
Caractéristiques
 Cristal violet : inhibe les bactéries Gram +
 Désoxycholate de sodium : inhibe les bactéries Gram +
 Sélectionne les bactéries Gram –
 Inoculation en cadran.
Usage
 Isolement des entérobactéries.
Lecture
 Bactéries lactose + : colonies jaunes (utilisation du lactose)
 Bactéries lactose - : colonies bleu-vert
Lexique
Mannitol : utilisé pour étudier sa voie d’attaque par les bactéries (fermentation…).
Bleu de Bromothymol : vert (basique) et jaune (acide)
Entérobactéries : bactéries se trouvant dans les cavités internes des êtres vivants comme
l’appareil digestif.
Rouge de phénol : rouge (basique) à jaune (acide)

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Hektoen – milieu sélectif
Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extraits de levure
 Glucide et dérivés : salicine, lactose, saccharose
 Indicateurs S2-
: citrate de fer
 Inhibiteurs : sels biliaires
 Divers : /
 Indicateurs de pH : Bleu de bromothymol, fuschine acide
 Ions minéraux : Thiosulfate de sodium, NaCl
 Agar : oui
 Eau : oui
Caractéristiques
 Sels biliaires : limitent le développement des Gram +
 Fuschine : vire au rose s’il y a production d’aldéhyde.
 Favorise Salmonelle et Shigella du fait des peptones.
 Mise en évidence de la production d’H2S
Usage
 Isolement des entérobactéries pathogènes : principalement pour vérifier la présence de
Shigella et Salmonella.
Lecture
 Aspect des colonies :
H2S
Attaque
glucide
Production
aldéhyde
Saumon - + +
Saumon et
centre noir
+ + +
Bleu-vert - - -
Bleu-vert
et centre
noir
+ - -
 Interprétation :
o Saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia,
Yersinia.
o Saumon et centre noir : Proteus vulgaris.
o Bleu-vert : suspicion de Shigella ou Salmonella.
o Bleu-vert et centre noir : suspicion de Salmonella.

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Hugh et Leifson – milieu différentiel
Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones, extrait de levures
 Glucide et dérivés : glucose
 Indicateurs S2-
: /
 Inhibiteurs : /
 Divers : /
 Indicateurs de pH : bleu de bromothymol
 Ions minéraux : NaCl, K2HPO4
 Agar : oui
 Eau : oui
Usage
 Détermination de la voie d’attaque des Glucides, utilisés comme principale source
d’énergie par les bactéries.
L’utilisation du glucose acidifie le milieu, le BBT va alors virer au jaune.
Technique
 Régénérer les 2 tubes : création gradient d’oxygène.
 Les ramener à 45°C.
 Ajouter aseptiquement quelques gouttes d’une solution de glucose stérile.
Concentration finale dans le tube environ 10g/L.
 Agiter le tout pour répartir le glucose dans tout le tube.
 Solidifier les deux tubes en les plongeant dans l’eau froide.
 Ensemencer chaque tube par piqûre centrale avec la pipette Pasteur.
 Recouvrir l’un des deux tubes de paraffine ou vaseline stérile.
 Incubation 24h à 37°C.
Tube recouvert = tube fermé
Tube non recouvert = tube ouvert
NE PAS REVISSER A FOND LES BOUCHONS.
Lecture
Il peut y avoir formation de gaz par les bactéries.
Résultats après
cultures 24h à 37°C
Interprétation
Le glucose est
dégradé en
aérobiose et en
anaérobiose :
bactérie
fermentative du
glucose.

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Le glucose est
dégradé en
anaérobiose
uniquement :
bactérie
fermentative du
glucose.
Utilisation du
glucose
uniquement en
aérobiose :
bactérie
oxydative.
La bactérie
n’utilise pas le
glucose : elle est
inerte vis-à-vis du
glucose.

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King A et King B – milieu différentiel
Composition King A
 Glucide et dérivés : glycérol
 Indicateurs S2-
: /
 Inhibiteurs : /
 Divers : /
 Ions minéraux : MgCl2 (chlorure de magnésium), K2SO4 (sulfate de potasssium)
 Agar : oui
 Eau : oui
Composition King B
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : polypeptone
 Glucide et dérivés : glycérol
 Indicateurs S2-
: /
 Inhibiteurs : /
 Divers : /
 Ions minéraux : MgSO4 (sulfate de magnésium), K2HPO4 (hydrogénophosphate de
potassium)
 Agar : oui
 Eau : oui
Caractéristiques
 La gélose est inclinée dans un tube.
 Ensemencement en stries.
 Le chlorure de magnésium et le sulfate de potassium favorisent la production de
pyocyanine.
 Le sulfate de magnésium et le phosphate bipotassique favorisent la production de
pyoverdine.
 King A : recherche de production de pyocyanine.
 King B : recherche de production de pyoverdine.
Usage
 Identification des Pseudomonas par la présence de pyocyanine ou de pyoverdine.
Technique
 Inoculer un tube de milieu A et un tube de milieu B en faisant une strie médiane à la
surface de la gélose avec une anse de culture prise dans un bouillon ou sur une gélose.
 Replacer la capsule sur chaque tube sans la reviser.
Lecture
 Aspect après 24h minimum à 30°C :
o King A : culture colorée en bleu-vert (pyocyanine +) et parfois en brun-rose
(pyoverdine +).

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En cas de doute, prélever l’eau de condensation à la pipette Paster et verser
0,5mL de chloroforme sur la pente du milieu. Laisser 5 à 10min en position
inclinée. La pyocyanine colore le chloroforme en bleu.
o King B : culture colorée en vert fluorescent (pyoverdine +).
o Pyocyanine + : présence de Pseudomonas aeruginosa.
o Pyoverdine + : présence de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens
et Pseudomonas putida.
Gélose de Mac Conkey – milieu sélectif
Composition
 Glucide et dérivés : lactose
 Indicateurs S2-
: /
 Inhibiteurs : Cristal violet, sels biliaires
 Divers : /
 Indicateurs de pH : Rouge neutre
 Ions minéraux : NaCl
 Agar : oui
 Eau : non
Caractéristiques
 Sels biliaires : inhibiteur des Gram +
 Cristal violet : inhibiteur des Gram +
 Si la bactérie fermente le lactose, le milieu devient rouge du fait de l’acidification du
milieu.
 Ensemencement en cadrans.
 Incubation 18 à 24h à 37°C
Usage
 Détermine si la bactérie fermente le lactose ou pas.
Utilisé pour Shigella et Salmonella.
Lecture
 Lactose + : colonies rouges entourées d’un halo opaque de la même couleur dû à la
précipitation des sels biliaires.
 Lactose - : colonies jaunes ou incolores.

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Mannitol - Mobilité - Nitrate – milieu différentiel
Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones trypsiques de viande
 Glucide et dérivés : /
 Autres molécules carbonées : mannitol
 Indicateurs S2-
: /
 Inhibiteurs : /
 Divers : /
 Ions minéraux : KNO3
 Agar : oui
 Eau : oui
Caractéristiques
 Utilisable uniquement pour les bactéries fermentives.
 Ensemencement par piqûre centrale au fil droit par pipette Pasteur.
 Ne pas oublier de régénérer le milieu et de le laisser refroidir.
Usage
 Recherche de la dégradation du mannitol
 Recherche de la mobilité de la bactérie.
 Recherche de mobilité par présence d’une Nitrate réductase.
Lecture
Aspect après 24h à
37°C
Interprétation
Mannitol -
Mobilité -
Mannitol -
Mobilité +

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Mannitol +
Mobilité -
Mannitol +
Mobilité +
Dégradation des Nitrates :

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Urée Indole – milieu synthétique
Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : /
 Glucide et dérivés :
 Autres molécules carbonées : L-triptophane (noyau indole), éthanol
 Indicateurs S2-
: /
 Inhibiteurs : /
 Divers : /
 Ions minéraux : NaCl, K2HPO4 hydrogénophosphate de potassium, KH2PO4
dihydrogénophosphate de potassium
 Agar : /
 Eau : eau distillée
Caractéristiques
 Il n’y a pas de source de carbone : les bactéries ne se multiplient pas. Il faut donc
l’ensemencer abondamment.
Absence de peptones : alcalinisation du milieu due à l’hydrolyse de l’urée.
 Milieu complexe synthétique.
 Fournit un ensemble de données permettant l’identification des entérobactéries et
autres bactéries.
Usage
 Permet la recherche de 3 activités enzymatiques :
o L’uréase
o La tryptophane désaminase (TDA)
o La production d’indole grâce à une tryptophanase.
Technique
Recherche d’une Uréase
 Ensemencement riche à partir de cultures solides.
 Aspect après 24h à 37°C :
Toutes les bactéries hydrolysent l’urée : O=C(NH2)2 + H2O  H2N-COOH + NH3
Seules les bactéries ayant une uréase très active arrivent à : H2N-COOH  CO2 + NH3
Le CO2 et le NH3 se combinent pour former du carbonate d’ammonium : CO2 + NH3 
2NH4
+
+ CO3
2-
.

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Le carbonate d’ammonium est très alcalin : la recherche de l’uréase constituera à tester
l’alcalinisation du milieu.
o Uréase constitutive : uréase + très rapidement, 10min pour Proteus et Yersinia.
o Uréase induite : uréase + en plusieurs heures, pour Klebsiella.
Recherche d’une Tryptophane Désaminase (TDA)
 Ensemencement :
o Classique : ensemencer richement le milieu urée-indole à partir de culture en
milieu solide et incuber 24h à 37°C.
o Rapide : faire une suspension dense dans 10 gouttes de milieu urée-indole.
Agiter 10min à l’agitateur de Kahn.
En présence de TDA, le tryptophane donne de l’acide β-indole peruvique. Ce dernier, en
présence de perchlorure de fer donne une coloration brune.
o TDA + : coloration brune. Proteus, Providencia, Morganella…
o TDA - : coloration jaune-orangée.
Recherche de la Production d’Indole
 Ensemencement :
Ensemencer richement le milieu urée-indole à partir de culture en milieu solide et
incuber 24h à 37°C.
Grâce à une tryptophanase, les bactéries peuvent dégrader le tryptophane en indole,
acide pyruvique et NH3.
o Indole + : anneau rouge
o Indole - : anneau brûnatre.

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