CRISPR en la naturaleza

La palabra fago es la abreviatura de bacteriófago, el tipo de virus que infecta bacterias.

En lo profundo del océano, en nuestro propio intestino y en todas partes, los fagos están infectando todo tipo de bacterias. ¡Aunque son invisibles a simple vista, los fagos son en realidad la "forma de vida" más abundante en la Tierra! Decimos "forma de vida" porque los virus no cumplen con los criterios para ser considerados organismos vivos.

Tal como las células utilizan el ADN como instrucciones para su función, los fagos transportan ADN (o moléculas de ARN) de sus genomas como planos para su montaje y difusión. Sin embargo, los fagos no pueden reproducirse por sí mismos. Deben tomar recursos de las bacterias durante el proceso de infección y utilizar estos recursos para producir más fagos. Es por eso que sólo son "formas de vida".

Con la ayuda de un microscopio, los científicos pueden observar el proceso de infección por fagos en acción. Los fagos parecen pequeños viajeros lunares (¡pero pueden tener otras formas interesantes también!). Sus curiosas estructuras suelen incluir piezas que se asemejan a una cabeza, cuello y piernas. Cuando un fago se posa sobre una bacteria, se “fija” a la superficie bacteriana usando sus patas o fibras de la cola. Luego, el ADN del fago viaja desde el espacio de almacenamiento en su cabeza, por un tubo largo llamado cola, y entra la célula bacteriana.

Después de que un fago inyecta su ADN en una bacteria, la propia maquinaria de proteína de la bacteria replica el genoma del fago. Luego, la bacteria sigue las instrucciones del ADN del fago y genera más cabezas, colas, fibras de la cola y otras piezas del fago. Estas “partes del cuerpo” se ensamblan para formar nuevos fagos.

Una vez que los fagos alcanzan una masa crítica, explotan hacia el exterior o lisan la bacteria y escapan al medio ambiente. Esto es similar al estallido de un globo.

Cada vez que se infecta una nueva célula bacteriana, se produce un nuevo enjambre de fagos. Por lo tanto, la infección puede propagarse exponencialmente y apoderarse rápidamente de las comunidades de bacterias. Esto se conoce como el ciclo lítico Cycle. Por el contrario, los llamados fagos lisogénico esconden su ADN dentro del genoma de una bacteria infectada. Están al acecho y solo producen más fagos en un momento posterior cuando las condiciones son las adecuadas.

En la naturaleza, los fagos superan en número a las bacterias diez a uno. Si los fagos son tan buenos para matar bacterias, ¿cómo quedan bacterias en la Tierra? Las bacterias han desarrollado toda una gama de trucos para defenderse de los fagos. Cada uno de sus sistemas de defensa funciona un poco diferente, y aquí solo mostramos algunos de los tipos generales. ¡Hay muchos, y todavía estamos aprendiendo cómo funcionan todos!

Quizás la defensa más obvia es evitar que los fagos lleguen a las células bacterianas en primer lugar. La membrana de la célula bacteriana está recubierta de diferentes receptores, proteínas o grupos de proteínas que reconocen moléculas del entorno exterior y transmiten señales a la bacteria. Los fagos se han aprovechado de los receptores bacterianos para sus propios fines. Se adhieren a sus anfitriones bacterianos adhiriéndose a los receptores en un proceso llamado adsorción. Algunas bacterias evitan que los fagos se unan a sus superficies alterando la estructura de sus receptores o introduciendo barreras físicas para evitar la unión.

Alternativamente, algunas bacterias bloquean el ADN del fago para que no entre en el citoplasma (el interior de la célula). Para inyectar su ADN en una célula bacteriana, los fagos deben penetrar la membrana celular. Al agregar nuevas proteínas en esta membrana, las bacterias pueden obstruir la entrada del fago y bloquear la inyección de ADN.

Cuando el ADN del fago llega al citoplasma, algunas bacterias pueden evitar que el genoma se replique, mientras que otras evitan que los genomas del fago replicado se carguen en cápsides y salgan de la célula.

Muchas bacterias despliegan sistemas de modificación de restricción (RM) para destruir el ADN del fago que se inyecta en la célula. Estos sistemas de defensa están compuestos por proteínas en forma de tijera llamadas enzimas de restricción enzimas CRISPR-Cas. Estas enzimas cortan el ADN del fago, destruyendo así las instrucciones para producir más fagos. 

Para evitar que las enzimas de restricción dañen su propio ADN, las bacterias agregan sustancias químicas protectoras llamadas grupos metilo a sus genomas. Las enzimas de restricción han evolucionado para ignorar el ADN metilado y no cortarlo. Por lo tanto, la metilación mantiene seguro el genoma bacteriano.

Si un fago logra eludir todas estas salvaguardas, la última línea de defensa de la bacteria es el suicidio celular. Este acto "altruista" mata a la bacteria individual, pero evita la producción de más copias de fagos que podrían infectar las células vecinas. Una versión común de este proceso se conoce como infección abortiva.

Todos los sistemas de defensa descritos anteriormente se consideran defensas innatas . Esto significa que, por lo general, evolucionan lentamente, actúan rápidamente durante la infección y se defienden de todos los fagos en general más que de un fago específico. Casi todas las bacterias tienen alguna forma de defensa innata.

Aproximadamente la mitad de las bacterias también tienen un mecanismo inmunitario adaptado llamado sistema CRISPR-Proteínas Cas te, que defiende contra tipos específicos de fagos. Este sistema puede adaptarse, generando rápidamente inmunidad contra nuevos fagos. También hay otros tipos de sistemas inmunitarios adaptativos. Nos estamos centrando en la inmunidad CRISPR-Cas, que describiremos con más detalle en la siguiente sección.

Las bacterias utilizan una variedad de defensas para bloquear los ataques de los fagos, incluida una forma única de inmunidad adaptativa conocida como sistema CRISPR-Cas (o sistema CRISPR, para abreviar). Estos sistemas se encuentran en aproximadamente la mitad de todas las especies bacterianas y casi todas las arqueas, aunque pueden ser menos comunes en microbios que no podemos cultivar de forma aislada. En pocas palabras, los sistemas CRISPR funcionan capturando pequeños fragmentos de ADN de fago invasor, escondiéndolos en el genoma de la célula huésped y utilizando estos recuerdos moleculares para encontrar y destruir fagos coincidentes.

Entonces, ¿de dónde obtiene CRISPR su nombre inusual? El acrónimo CRISPR (en inglés: clustered regularly interspaced short palindromic repeats) (en español: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas) proviene de una sección de ADN dentro del genoma bacteriano. Este ADN se denomina matriz CRISPR o matriz de espaciadores repetidos y tiene dos componentes: repeticiones y espaciadores. 

• repeticiones — Estos son segmentos de ADN que tienen todos la misma secuencia. Generalmente son de alrededor de 30 pares de bases en longitud. Las repeticiones se denominan "palindrómicas" en las siglas CRISPR porque suelen contener un tramo de bases seguido por las bases complementario de la misma secuencia, en orden inverso. Puede ser difícil de imaginar, así que observar ilustraciones y visualizaciones puede ayudar. La terminología proviene de palíndromos en el lenguaje: palabras o frases que se pueden leer de la misma manera hacia adelante y hacia atrás, como por ejemplo "luz azul".

  Esta complementariedad interna es importante porque significa que la mayoría de las repeticiones de CRISPR se pliegan en una estructura llamada tallo-bucle u horquilla una vez que están transcritas en ARN.

  NOTA: El sistema Cas9 el sistema lo hace no tiene repeticiones palindrómicas. En lugar de un solo ARNcr que parea sus bases internamente, el crRNA de Cas9 se parea con una segunda pieza de ARN, llamada ARNtracr (que se muestra en la primera ilustración del siguiente capítulo). 

• espaciadores — Estos se sientan entre las repeticiones. Son pequeños segmentos de ADN de fago, cada uno diferente del otro. Estas son las "memorias moleculares" descritas anteriormente. Los espaciadores son restos de previas infecciones previas y se transmiten a través de generaciones de bacterias. Esto significa que una célula individual no tiene que haber sido infectada para ser inmune a un fago.

En la mayoría de los casos, se encontrará un conjunto de genes asociados a CRISPR, o cas, los genes justo al lado de la matriz de espaciadores repetidos. Estos genes codifican proteínas cas, que realizan todas las actividades necesarias para la inmunidad. Además de defenderse de los fagos, los sistemas CRISPR también pueden bloquear otros ácidos nucleicosdel ADN, tales como los plásmidos. 

Hay una variedad de sistemas CRISPR diferentes, pero todos defienden a las bacterias siguiendo tres pasos básicos: adquisición de espaciadores, biogénesis de ARN CRISPR e interferencia. Repasemos cada paso con un poco más de detalle.

Los sistemas CRISPR funcionan recordando las infecciones por fagos, por lo que el primer paso de la inmunidad CRISPR es crear una memoria. Cuando un fago infecta una bacteria equipada con un sistema CRISPR-Cas, se puede agregar una nueva secuencia espaciadora a la matriz CRISPR. Esto procede a través de un proceso llamado adquisición or adaptaciónes.

En este proceso, dos proteínas Cas, Cas1 y Cas2, trabajan juntas para capturar fragmentos de ADN del fago inyectado. El complejo Cas1-Cas2 actúa como una regla y trabaja con proteínas accesorias para medir y cortar una pieza de ADN del tamaño preciso. El complejo retiene el ADN del fago y lo inserta en un extremo de la matriz CRISPR como un nuevo espaciador. El sistema incorpora una nueva repetición en el proceso, por lo que todos los espaciadores siempre están flanqueados por repeticiones en cada lado. La bacteria almacena así un recuerdo del fago.

Este paso es similar a una vacunación — puedes imaginar que la matriz de espaciadores repetidos es como una tarjeta de vacunación que muestra todos los fagos contra los cuales la bacteria es inmune.

Los sistemas CRISPR almacenan estas memorias de la infección por fagos en su ADN, pero no utilizan el ADN para reconocer directamente las infecciones posteriores por fagos. En su lugar, convierten las memorias de ADN en una molécula similar llamada moléculas de ARN. El ARN es químicamente diferente del ADN y a menudo existe como una hebra sencilla.. Las bacterias hacen muchas copias de ARN de las memorias del fago y las usan para encontrar nuevos fagos invasores. Es útil hacer estas "copias funcionales" de ARN porque se pueden descomponer y reciclar sin destruir la memoria permanente original.

El término biológico para este proceso es biogénesis del ARNCRISPR. Implica transcribir toda la matriz de repeticiones y espaciadores CRISPR en una pieza larga de ARN llamada ARN precursor CRISPR (pre-ARNcr). Por lo general, las proteínas Cas luego cortan o 'rompen' el ARN largo en segmentos cortos e individuales. Estos contienen un espaciador y partes de las repeticiones. Las copias finales de ARN completamente recortadas de las memorias del fago se denominan ARN CRISPR (ARNcr). Luego, las proteínas Cas utilizarán cada ARNcr para buscar e identificar positivamente el ADN del fago coincidente.

El paso final en la inmunidad CRISPR conduce a la destrucción del ADN del fago invasor. Este proceso se llama interferencia, porque implica que el sistema CRISPR "interfiere" o detiene el ciclo de vida del fago. La interferencia comienza con una sola proteína Cas o un grupo de proteínas Cas agarrando o uniéndose a un ARNcr. Juntos, la(s) proteína(s) Cas más el ARNcr forman lo que se conoce como complejo de búsqueda, complejo efector, o como lo llamaremos aquí: el complejo de vigilancia. (Cuando múltiples moléculas de proteína, ARN u otros componentes se adhieren entre sí y trabajan juntas, se denominan integraciones.)

Cuando un fago inyecta su ADN en una célula bacteriana, el complejo de vigilancia explora el genoma del fago en busca de una secuencia que coincida con el espaciador en su ARNcr. Esta secuencia objetivo se denomina protoespaciador. Debido a que el ARNcr es una copia del ADN del fago original, es complementario y puede formar pares de bases con una hebra del ADN inyectada por otro fago de la misma especie. Los pares de bases entre el ARN y el ADN se parecen mucho a los que hay entre cada hebra de ADN en una doble hélice normal.

El complejo de vigilancia desabrocha el ADN del fago y comprueba si el ARNcr puede formar pares de bases con una hebra. Si todo el espaciador puede formar pares de bases, significa que el complejo de vigilancia ha encontrado el objetivo que ha estado buscando, por lo que corta el ADN del fago para destruirlo. Si el complejo de vigilancia busca en todo el ADN de la célula pero no encuentra ninguna coincidencia, no hace ningún corte.

Los complejos de vigilancia CRISPR destruyen el ADN cortándolo. Realizan diferentes tipos de cortes según el sistema CRISPR-Cas. Algunos sistemas hacen una sola rotura en cada hebra. Algunos cortan tanto el objetivo como cualquier ARN o ADN cercano. Aún otros mastican el objetivo poco a poco, como una cortadora de césped. Después de que el ADN del fago se corta al menos una vez, otras proteínas dentro de la célula ayudan a descomponer el resto.

Dado que se destruyen las instrucciones de replicación del fago, la infección ha terminado. Gracias a su sistema de defensa CRISPR, la bacteria sobrevive. En resumen, el sistema CRISPR protegió a la célula recordando una antigua infección por fagos y usando esa memoria para reconocer y detener el mismo tipo de fago cuando atacaba de nuevo.

🎥 | Puedes revisar todo el proceso de inmunidad CRISPR en el vídeo de abajo. Esta animación, creada para IGI por Janet Iwasa, muestra un sistema CRISPR que contiene Cas9 como ejemplo, por lo que es un poco más específico que la descripción general que proporcionamos aquí, pero verás los tres pasos clave: adquisición del espaciador, biogénesis de ARNcr e interferencia.

Finalmente, una nota sobre las variaciones potencialmente confusas de la terminología 'espaciador':

• preespaciador - La maquinaria de adquisición selecciona un segmento de ADN del fago llamado preespaciador y lo integra en la matriz CRISPR bacteriana.
• espaciador - Una vez que el ADN del fago se incorpora a la matriz CRISPR, se denomina espaciador. Después de transcribir un ARNcr de la matriz, la secuencia del ARN derivada del fago también se denomina espaciador.
• protoespaciador - El tramo de ADN en el genoma del fago que es complementario al ARNcr y cortado por el complejo de vigilancia se denomina protoespaciador. El PAM es un motivo adyacente al protoespaciador, lo que significa una secuencia corta justo al lado del objetivo del complejo de vigilancia.

Durante la defensa CRISPR, las bacterias usan proteínas Cas para destruir el ADN del fago invasor. Identifican ese ADN de fago comparándolo con copias de ARN de la misma secuencia almacenada en la matriz CRISPR de su genoma. Por lo tanto, es posible que se pregunte, ¿por qué las proteínas Cas no terminan cortando los espaciadores en la matriz?

Reconocer la diferencia entre el ADN "propio" (el genoma bacteriano) y el ADN "no propio" (ADN extraño como el genoma de un fago) es esencial porque las bacterias generalmente mueren cuando sus genomas se dañan. Los sistemas CRISPR pueden evitar la destrucción dañina del propio genoma de la bacteria al depender de secuencias de ADN cortas llamadas protospacer adjacent motifso PAMspor sus siglas en inglés, lo cual se traduce a motivos adyacentes al protoespaciador. Estos se encuentran junto a los objetivos CRISPR en el ADN del fago, pero nunca en las matrices CRISPR bacterianas. Como resultado, las proteínas Cas cortan el ADN del fago que contiene PAM, pero no el ADN bacteriano sin PAM.

Explicaremos esto con más detalle utilizando el sistema CRISPR-Cas9 como ejemplo.

Cas9 funciona buscando cualquier ADN que sea complementario a su guía ARN CRISPR (ARNcr). Una vez que Cas9 encuentra dicho ADN, lo corta. Dado que la matriz CRISPR bacteriana codifica los ARNcr, estos siempre serán complementarios. El requisito de PAM es lo que evita que Cas9 corte la matriz. ¿Pero cómo?

Antes de probar si su ARNcr puede formar pares de bases con un tramo de ADN, Cas9 primero busca su secuencia PAM específica: GG, dos bases de guanina. Si no hay PAM, Cas9 se aleja flotando. Incluso si el ARNcr contiene una coincidencia perfecta y complementaria con una secuencia de ADN, Cas9 no lo encontrará sin ver primero un PAM. Cuando Cas9 encuentra con éxito un PAM, luego comprueba si el ADN adyacente coincide con su ARNcr guía. Si lo hace, entonces Cas9 sabe que está bien cortar. La matriz de espaciadores repetidos no contiene secuencias PAM, por lo que Cas9 no la corta.

¿Cómo es que siempre hay un PAM al lado del objetivo previsto en el genoma del fago? El sistema CRISPR se asegura de esto durante el primer paso de la adquisición de inmunidad CRISPR. Cuando un fago inyecta su ADN en una bacteria, Cas1, Cas2 y otra proteína llamada Csn2 trabajan junto con Cas9 para elegir las piezas apropiadas del ADN del fago, llamadas preespaciadores, para insertarlas en la matriz CRISPR. De hecho, estas proteínas solo eligen preespaciadores que están al lado de las PAM. Las actividades diligentes de Cas1, Cas2, Csn2 y el requisito de PAM permiten que las bacterias se defiendan de los fagos mientras evitan que su propio ADN se corte.

🎥 | Para una descripción detallada del PAM y su importancia tanto en la inmunidad CRISPR natural como en aplicaciones de edición del genoma basado en CRISPR , vea nuestro video de pizarra a continuación.

Las bacterias han desarrollado una amplia variedad de sistemas CRISPR para defenderse. En su forma más simple, un sistema CRISPR-Cas se compone de un conjunto de genes cas y una matriz CRISPR. Los microbios pueden tener diferentes combinaciones de genes cas , y cada conjunto único se define como un sistema CRISPR diferente. Las proteínas Cas que componen el sistema son como un equipo, cada una con funciones únicas que trabajan juntas para lograr un objetivo. Imagina una liga deportiva: todos juegan el mismo juego, pero no todos los equipos son iguales. 

Todos los sistemas CRISPR contienen el gen cas1 . cas1 codifica la proteína Cas1, que agrega nuevos espaciadores a las matrices CRISPR para que las bacterias puedan defenderse de los nuevos fagos. Una matriz CRISPR puede tener entre un espaciador y cientos de espaciadores.

¿Qué varía entre los sistemas? Para casi todos los aspectos de la inmunidad CRISPR, la naturaleza ha creado algunas variaciones. Consideremos cada paso de la inmunidad CRISPR, uno por uno.

• Acquisition - Este paso tiende a ser bastante similar en todos los sistemas, pero Cas1 y Cas2 reciben ayuda de una variedad de proteínas adicionales que varían según el sistema, incluidas otras proteínas Cas y, a veces, proteínas del huésped que no están codificadas junto a los genes cas y que desempeñan otras funciones en la célula. 
• Biogénesis de ARNcr - Varias proteínas Cas cortan los pre-ARNcr para convertirlos en ARNcr maduros. A veces hay proteínas Cas dedicadas para este trabajo. A veces, la misma proteína que realiza el paso de interferencia también procesa su ARNcr. Otras veces, también participan proteínas bacterianas no relacionadas. La composición de los guías de ARNcr procesados también puede variar entre sistemas. Los ARNcr son típicamente una sola hebra de ARN que se pliega en una estructura en forma de horquilla or tallo-bucle en un extremo. Sin embargo, la presencia, el tamaño, la forma y la ubicación de la horquilla dentro del ARN varían. A veces, los ARNcr también necesitan ARNs adicionales para funcionar completamente. Por ejemplo, el sistema CRISPR-Cas9 común usa tanto un ARNcr como una pieza adicional de RNA llamada ARNtracr.
• Interferencia - Este paso presenta la mayor variación entre sistemas y sirve como base para su clasificación. Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases principales. Los sistemas de clase 1 tienen un gran complejo de vigilancia de múltiples proteínas que encuentra objetivos de ácido nucleico. A veces, ese complejo corta el objetivo directamente y, a veces, activa una proteína de corte separada, llamada nucleasa, o múltiples nucleasas separadas, para su destrucción. Los sistemas de clase 2, por otro lado, usan una sola proteína para encontrar y cortar objetivos. Cada una de estas clases se divide a su vez en tipos y subtipos que varían según el conjunto de genes cas que utilizan.

  Si bien en CRISPRpedia discutimos principalmente el sistema Cas9 dirigido al ADN, algunas enzimas Cas cortan el ARN y algunos sistemas destruyen tanto el ADN como el ARN. Los diferentes sistemas suelen reconocer PAM únicos.

  Quizás la mayor variabilidad proviene de cómo los sistemas CRISPR destruyen los ácidos nucleicos. La enzima Cas3 , que se encuentra en los sistemas de tipo I, se mueve a lo largo del ADN objetivo y lo corta como una cortadora de césped. Algunos complejos de vigilancia cortan el mismo objetivo en varios lugares. Otras enzimas CRISPR, como Cas9, cortan solo una vez. Finalmente, algunos sistemas CRISPR no limitan el corte a su objetivo correspondiente, sino que, una vez que se ha identificado un objetivo, comienzan a cortar también cualquier pieza cercana de ADN o ARN.

A medida que los científicos continúan estudiando la inmunidad CRISPR y descubriendo nuevos sistemas, se revelan más y más variaciones.

La cantidad de sistemas CRISPR puede ser abrumadora y todavía se están descubriendo nuevos. ¿Por qué evolucionaron tantas variaciones?

Los diferentes sistemas CRISPR-Cas permiten que las bacterias respondan a diferentes tipos de fagos. Por ejemplo, mientras que la mayoría de los sistemas tienen como objetivo el ADN, algunos pueden cortar el ARN y otros pueden cortar tanto el ARN como el ADN. Esto es útil ya que algunos fagos tienen genomas de ARN, e incluso aquellos con genomas de ADN necesitan producir ARN durante el curso de la infección. Algunos complejos Cas1-Cas2 pueden incluso integrar ARN como nuevos espaciadores. 

Más allá de responder a diferentes fagos, puede ser útil para las bacterias tener múltiples sistemas CRISPR como "respaldo" en caso de que uno falle.