非编码RNA与癌症关系如此密切，要如何进行功能研究？

非编码RNA与癌症关系如此密切，要如何进行功能研究？

人类基因组的测序结果显示，负责编码蛋白的基因大约有2万多个，占全基因长度的不到2%。而许多低等原生生物也拥有2万多个编码蛋白的基因，但与人类不同的是，这些低等生物体内编码基因占全基因长度的比例高得多。于是，我们不禁发问：是否那98%的非编码基因（non-coding RNA, ncRNA）造就了人体的复杂性？ncRNA是如何参与生命活动的呢？

图1. 不同物种的ncRNA占比

起初，人们对ncRNA的认知有限，认为ncRNA是junk gene，可能只是避免外界不利环境，比如射线、病毒等破坏人类基因的“掩体”。随着研究的深入，科学家们逐渐发现了ncRNA的重要性。ncRNA只是不编码蛋白，但并非不被转录，事实上这些ncRNA也是不断地被转录出来参与蛋白质的合成过程。其中人们最熟悉的有转运氨基酸的tRNA，参与核糖体合成的rRNA和snoRNA。目前与肿瘤高度相关的主要有lncRNA, microRNA, circRNA这三类，它们在癌症的增殖、迁移、细胞死亡抵抗等方面均参与着重要作用。在临床的癌症检查上，ncRNAs也已成为了一个重要的hallmark，为癌症的提前筛查提供了很大的帮助。^[1]-[4]

图2. 已经成为癌症hallmark的ncRNAs

microRNA简称miRNA，通过碱基配对原则与mRNA互补结合，导致mRNA被靶向切割，稳定性下降，最终被降解。miRNA的作用原理虽然单一，但它依然能在癌症发展的各个方面起到调节作用：若miRNA能与抑癌基因的mRNA结合，miRNA便能够促进肿瘤的存活和复制。相反，若结合到原癌基因的mRNA上，miRNA便能抑制肿瘤细胞的扩增。

lncRNA的功能则较为多样：①直接与mRNA结合抑制其翻译，又或与蛋白结合形成转录调节复合物，作为转录调控因子调节下游基因的转录水平；②充当miRNA海绵，特异性的结合到某种miRNA上，持续性的干扰miRNA的正常功能；③作为细胞内复合体的骨架，使得蛋白和RNA稳定地结合到一起。

circRNA本质上也是lncRNA，这种长链的非编码RNA会在转录出来后会形成单链闭合环。其作用机制与IncRNA相似，能调节原癌基因和抑癌基因的转录，也能作为分子海绵竞争性抑制miRNA发挥作用。且有文献提示其可充当分子支架，为复合体提供结合场所。

ncRNA功能研究的方法及敲除策略

研究ncRNA的功能少不了要对其进行基因编辑，RNAi技术在科研探索上是较为便捷常用的一种手段。但由于其效率低且有一定的脱靶概率，科研工作者开始寻求新的编辑手段。相比于RNAi技术，CRISPR/Cas9系统有着脱靶概率低、敲除更彻底、可干预RNAi难以干预的核内RNA等优势，更适用于ncRNA的靶向干预及基因敲除。^[5],[6] 以下是miRNA、lncRNA、circRNA的CRISPR/Cas9敲除策略：

miRNA片段较小，敲除相对而言较为简单。其靶序列可以设计在miRNA成熟体上、茎环处、或者设计一对gRNA直接将整个miRNA序列敲掉，但需要注意的是敲除区域不能与其他编码基因重叠。

LncRNA比较长，只敲除部分碱基难以对功能产生较大影响，故须尽可能地将全部序列敲除。一般采用大片段基因敲除策略，从上至下设计2-4条gRNA。

而circRNA经常与编码基因的外显子重叠，故其敲除更为困难且复杂——敲除circRNA的同时要避免破坏外显子。一般是敲除位于内含子中的circRNA成环元件，这样做即能破坏circRNA功能，又不会对编码基因造成影响（图3）。

图3. circHIPK3敲除策略-Alu成环元件敲除^[8]

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 在了解了ncRNA在肿瘤中的作用机制以及ncRNA敲除策略后，一起来欣赏几个CRISPR/Cas9介导的ncRNA研究案例吧~

1、利用CRISPR/Cas9敲除miR-137分析肿瘤细胞的耐药性机制

中山大学生命科学学院生物防治国家重点实验室Jiang团队在British Journal of Cancer 发表的microRNA-137 promotes apoptosis in ovarian cancer cells via the regulation of XIAP^[7]一文中阐明了miR-137在顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡中起重要作用。^[7]

目前可以确定的是顺铂能够通过促使肿瘤细胞发生细胞凋亡来达到治疗的效果，但是其机制尚不清楚。为回答这一问题，Jiang团队通过双荧光素酶报告基因，筛选出了8个miRNA能够调控凋亡调节因子XIAP（哺乳动物细胞中最有效的凋亡调节因子），其中miR-137具有较高的显著性，同时该miR-137的高表达在其他的肿瘤中也起重要的抑制作用，因此团队选择miR-137进行进一步的实验。通过过表达miR-137, 卵巢癌细胞A2780下调了凋亡调节因子XIAP，使得卵巢癌细胞面对顺铂的诱导，更容易发生细胞凋亡。

图4. miR-137促进卵巢癌细胞发生细胞凋亡

       为了进一步证实miR-137在卵巢癌细胞凋亡中的起着抑癌基因的作用，Jiang团队设计了三种sgRNA分别靶向成熟 miR-137 的上游、下游和精确区域，利用CRISPR/Cas9系统特异性敲除了A2780细胞系中的miR-137，发现miR-137敲除后，XIAP随之上调，并且细胞凋亡率降低。

图5. miR-137敲除后，XIAP随之上调

2、利用CRISPR/Cas9敲除SNHG1分析肿瘤细胞增殖和集落形成能力的机制

国立台湾大学生物医学电子与生物信息学研究所的Juan团队发现，SNHG1的高表达与神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）的不良预后高度相关。于是Juan团队设计了两条gRNA，使用 CRISPR/Cas9 技术敲低了SK-N-BE(2)C细胞系（一种NB的细胞系）内源性SNHG1。Juan团队在LncRNA SNHG1 regulates neuroblastoma cell fate via interactions with HDAC1/2^[8]一文中提示，SNHG1的敲低抑制了NB细胞系的增殖。并且，通过对细胞系转录组的分析，提示SNHG1与多种生物过程息息相关，比如细胞的迁移，生长和细胞凋亡抵抗。并且SNHG1能够影响 核心调节环路（core regulatory circuitry， CRC）成员基因的表达，CRC包括PHOX2B、HAND2、GATA3、ISL1、TBX1和MYCN。

图6. SNHG1能够影响核心调节环路

Juan团队进一步利用ChIP-seq与ATAC-seq发现SNHG1和 HDAC1/2 之间可能存在相互作用，然后，通过pull-down和RIP进一步证实了两者的互作关系。

图7. pull-down和RIP的结果图

以上Juan团队解析了SNHG1在NB中的作用机制，并且提示，阻断SNHG1与HDAC1/2 相互作用将会是抑制NB细胞增殖和形成集落的一个关键点，为治疗NB的提供了潜在治疗策略。

3、利用CRISPR/Cas9技术研究肝细胞癌发展的信号通路

与正常肝组织相比，HCC 患者肿瘤组织中circSOD2处于高表达状态。抑制circSOD2能够显著地抑制肝癌细胞的增殖，减缓体内成瘤的速度。温州医科大学Tu团队在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research发表的CircSOD2 induced epigenetic alteration drives hepatocellular carcinoma progression through activating JAK2/STAT3 signaling pathway^[9]提出了一条新的信号通路轴，为肝癌的预防和药物干预提供了新的思路。

Tu团队通过RNA 相互作用组数据库分析，并利用Ago2 pull-down和biotin pull-down技术，以及观察沉默和过表达CircSOD2后miR-502-5p的表达水平，发现CircSOD2在肝脏肿瘤细胞中充当“miRNA海绵的作用“，特异性地结合到miR-502-5p上，有效地抑制了miR-502-5p的表达。

图8. CircSOD2抑制miR-502-5p的表达

随后，Tu团队有利用了上述类似的实验原理，发现加入miR-502-5p的类似物之后，一个在各种肝癌细胞系中均高表达的蛋白——DNMT3a发生了明显表达下调。

图9. miR-502-5p下调DNMT3a

团队为进一步研究DNMT3a在 HCC 中作用的分子机制，利用CRISPR/Cas9技术成功构建出DNMT3a-KO的HEPG2 和 HUH7 细胞系。从WB的结果看以看出，DNMT3a可能是通过SOCS3/JAK2/STAT3信号通路调控HCC细胞增殖的。团队进一步根据DNMT3a是DNA甲基转移酶这一线索，利用双荧光素酶报告基因实验和CHIP-qPCR实验，验证了信号通路的可靠性。最终得出结论，即DNMT3a 上调促进 SOCS3 启动子甲基化并抑制 SOCS3 表达，从而进一步激活 JAK2/STAT3 信号通路。

图10. DNMT3a抑制SOCS3 表达，从而进一步激活 JAK2/STAT3 信号通路

总结

许多ncRNA已经被证实在细胞中，发挥促进肿瘤生长，迁移和逃避细胞死亡的作用。同时，另外一些ncRNA能够发挥肿瘤抑制因子的作用，阻止细胞进入分裂周期、激活程序性死亡、维持基因组稳定性，直接或间接地抑制肿瘤的发生。

上述案例借助CRISPR/Cas9基因编辑技术进行ncRNA的功能研究都获得理想效果，源井生物拥有200+常用细胞系基因编辑实验参数，效率高10倍的CRISPR-U^TM专利技术，可提供lncRNA、miRNA、circRNA敲除细胞定制服务，优质纯合交付快至4周！更有超3000种敲除细胞现货低至￥8000元，1周达。

参考文献：

1 Winkle, M., El-Daly, S. M., Fabbri, M. & Calin, G. A. Noncoding RNA therapeutics - challenges and potential solutions. Nat Rev Drug Discov 20, 629-651, doi:10.1038/s41573-021-00219-z (2021).

2 Renganathan, A. & Felley-Bosco, E. Long Noncoding RNAs in Cancer and Therapeutic Potential. Adv Exp Med Biol 1008, 199-222, doi:10.1007/978-981-10-5203-3_7 (2017).

3 Pichler, M. & Calin, G. A. MicroRNAs in cancer: from developmental genes in worms to their clinical application in patients. British Journal of Cancer 113, 569-573, doi:10.1038/bjc.2015.253 (2015).

4 Kristensen, L. S., Hansen, T. B., Venø, M. T. & Kjems, J. Circular RNAs in cancer: opportunities and challenges in the field. Oncogene 37, 555-565, doi:10.1038/onc.2017.361 (2018).

5 Yang, J. et al. CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers. RNA Biol 15, 35-43, doi:10.1080/15476286.2017.1391443 (2018).

6 Dimitri, A., Herbst, F. & Fraietta, J. A. Engineering the next-generation of CAR T-cells with CRISPR-Cas9 gene editing. Molecular Cancer 21, 78, doi:10.1186/s12943-022-01559-z (2022).

7 Li, X. et al. microRNA-137 promotes apoptosis in ovarian cancer cells via the regulation of XIAP. Br J Cancer 116, 66-76, doi:10.1038/bjc.2016.379 (2017).

8 Hsu, C. L. et al. LncRNA SNHG1 regulates neuroblastoma cell fate via interactions with HDAC1/2. Cell Death Dis 13, 809, doi:10.1038/s41419-022-05256-z (2022).

9 Zhao, Z. et al. CircSOD2 induced epigenetic alteration drives hepatocellular carcinoma progression through activating JAK2/STAT3 signaling pathway. J Exp Clin Cancer Res 39, 259, doi:10.1186/s13046-020-01769-7 (2020).