CN100553639C - 用于治疗血栓形成的硼酸多价金属盐 - Google Patents

Abstract

本发明提供了药物可接受的二价金属和有机硼酸药物盐。这种金属例如是钙，镁和锌。有机硼酸药物可以是硼酸肽蛋白酶抑制剂。所述盐可以配制在口服剂量形式中。所述盐用于制备治疗血栓形成的口服药物。

Description

用于治疗血栓形成的硼酸多价金属盐

技术领域

本发明涉及得自有机硼酸的药物学有用的产物。本发明还涉及前述一类产物中的各成员的应用，涉及其配制、其制备、其合成中间体及涉及其它主题。

本发明进一步涉及含有所述产物的口服药物制剂。

背景技术

硼酸化合物

这些年来已经知道硼酸(boronic acid)化合物及其衍生物例如酯具有生物学活性，特别是作为蛋白酶抑制剂或底物。例如，Koehler等，Biochemistry 10：2477，1971报道了2-苯乙烷硼酸在毫摩尔水平抑制丝氨酸蛋白酶胰凝乳蛋白酶。Phillip等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 68：478-480，1971报道了芳基硼酸(苯基硼酸、间硝基-苯基硼酸、间氨基苯基硼酸、间溴苯基硼酸)对胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的抑制。Seufer-Wasserthal等，Biorg.Med.Chem.2(1)：35-48，1994描述了多种硼酸，尤其由Cl、Br、CH₃、H₂N、MeO等取代的苯基硼酸对枯草杆菌蛋白酶Carisberg抑制的研究。

在描述蛋白酶的抑制剂或底物中，P1、P2、P3等是指易断裂的肽键的氨基末端的底物或抑制剂残基，S1、S2、S3等是指根据Schechter，I.andBerger，A.On the Size of the Active Site in Proteases，Biochem.Biophys.Res.Comm.，27：157-162，1967所述关连蛋白酶的相应亚位点。在凝血酶中，S1结合位点或“特异性口袋”是指所述酶中的裂缝，同时S2和S3结合亚位点(也分别称为近端和远端疏水性口袋)是疏水性的，而且例如分别与Pro和(R)-Phe强有力地反应。

对丝氨酸蛋白酶抑制剂的药物学研究已经从简单的芳基硼酸转移至硼酸肽(boropeptide)，即含有α-氨基羧酸的硼酸类似物的肽。所述硼酸可以是衍生的，通常形成一种酯。Shenvi(EP-A-145441和US 4499082)揭示了含有具有中性侧链的一种α-氨基硼酸的肽是弹性蛋白酶的有效抑制剂，随后有许多关于丝氨酸蛋白酶的硼酸肽抑制剂的专利出版物。特别地，已经报道了如下酶的紧密结合的硼酸抑制剂：弹性蛋白酶(Ki，0.25nM)、胰凝乳蛋白酶(Ki，0.25nM)、组织蛋白酶G(Ki，21nM)、α-裂解蛋白酶(Ki，0.25nM)、IV型二肽基(dipeptidyl)氨基肽酶(Ki，16pM)及更最近的凝血酶(Ac-D-Phe-Pro-boroArg-OH(DuP 714，初始Ki 1.2nM)。

Claeson等(US 5574014等)及Kakkar等(WO 92/07869及同族专利包括US 5648338)揭示了具有中性C末端侧链例如烷基或烷氧基烷基侧链的凝血酶抑制剂。

WO 96/25427揭示了对Kakkar等所述化合物的修饰，针对肽基丝氨酸蛋白酶抑制剂进行，其中P2-P1天然肽键由另一个键置换。非天然肽键例如可以是-CO₂-、-CH₂O-、-NHCO-、-CHYCH₂-、-CH＝CH-、-CO(CH₂)pCO-，其中p是1、2或3、-COCHY-、-CO₂-CH₂NH-、-CHY-NX-、-N(X)CH₂-N(X)CO-、-CH＝C(CN)CO-、-CH(OH)-NH-、-CH(CN)-NH-、-CH(OH)-CH₂-或-NH-CHOH-，其中X是H或氨基保护基，Y是H或卤素，尤其是F。特殊的非天然肽键是-CO₂-或-CH₂O-。

Metternich(EP 471651及US 5288707，后一专利被转让给TrigenLimited)揭示了Phe-Pro-BoroArg硼酸肽的变体，其中P3Phe由一个非天然的疏水性氨基酸如三甲基甲硅烷丙氨酸、对-叔丁基-联苯基-甲硅氧基甲基-苯丙氨酸或者对-羟甲基苯丙氨酸置换，P1侧链可以是中性的(烷氧基烷基、烷基硫代烷基或三甲基甲硅烷基烷基)。

Fevig J M et al Bioorg.Med.Chem.8：301-306及Rupin A et al Thromb.Haemost.78(4)：1221-1227，1997描述了N-取代的甘氨酸对硼酸三肽凝血酶抑制剂的P2Pro残基的置换，也见于US 5,585,360所述(de Nanteuil etal)。

Amparo(WO 96/20698及同族专利包括US 5698538)揭示了结构为芳基-接头-Boro(Aa)的肽模拟物，其中Boro(Aa)可以是具有非碱性侧链的一个氨基硼酸残基，例如BoroMpg。所述接头是化学式为-(CH₂)mCONR-(其中m是0-8，R是H或某些有机基团)的化合物或其类似物，其中肽键-CONR-由-CSNR-、-SO₂NR-、-CO₂-、-C(S)O-或-SO₂O-置换。芳基是由1、2或3个选自一个特定基团的基团取代的苯基、萘基或联苯基。最典型地，这些化合物是结构为芳基-(CH₂)n-CONH-CHR²-BY¹Y²的化合物，其中R²例如是上述中性侧链，n是0或1。

非肽硼酸酯已经被提议在去污剂组合物中作为蛋白酶抑制剂。WO92/19707和WO 95/12655报道了芳基硼酸酯可以在去污剂组合物中用作蛋白酶抑制剂。WO 92/19707揭示了由氢键结合基团尤其乙酰氨基(-NHCOCH₃)、磺酰氨基(sufonamido)(-NHSO₂CH₃)和烷基氨基取代硼酸根基团的化合物。WO 95/12655教导正位取代的化合物是优异的。

硼酸酯酶抑制剂具有广泛应用，从去污剂至细菌孢子形成抑制剂再至医药品中。在制药学领域，有描述丝氨酸蛋白酶例如凝血酶、因子Xa、激肽释放酶、弹性蛋白酶、纤溶酶以及其它丝氨酸蛋白酶如脯氨酰肽链内切酶和Ig AI蛋白酶的硼酸酯抑制剂的专利文献。凝血酶是凝血途径中最后的蛋白酶，作用是从纤维蛋白原的每个分子中水解四种小肽，因此使其聚合位点去保护。线性纤维蛋白聚合物一旦形成就可以通过由凝血酶激活的因子XIIIa而交联。另外，凝血酶是血小板的强力激活剂，凝血酶作用于血小板上的特定受体。凝血酶还通过激活因子V和VIII而加强其自身产生。

丝氨酸蛋白酶的其它氨基硼酸酯或硼酸肽抑制剂或底物如以下文献所述：

●US 4935493

●EP 341661

●WO 94/25049

●WO 95/09859

●WO 96/12499

●WO 96/20689

●Lee S-L et al，Biochemistry 36：13180-13186，1997

●Dominguez C et al，Bioorg.Med.Chem.Lett.7：79-84，1997

●EP 471651

●WO 94/20526

●WO 95/20603

●WO97/05161

●US 4450105

●US 5106948

●US 5169841.

丙型肝炎病毒蛋白酶的肽硼酸抑制剂在WO 01/02424中描述。

Matteson D S Chem.Rev.89：1535-1551，1989回顾了α-卤素硼酸酯(halo boronic esters)作为中间体与其它物质在合成氨基硼酸及其衍生物中的应用。Matteson描述了频哪醇硼酸酯在非手性合成中的应用，及蒎二醇(pinanediol)硼酸酯在手性控制中的应用，包括在氨基和酰氨基硼酸酯的合成中。

Contreras et al J.Organomet.Chem.246：213-217，1983描述了通过对环状硼酸酯进行光谱学研究论证了分子内N→B配位作用，所述环状硼酸酯是通过Me₂CHCMe₂-BH₂与二乙醇胺的反应而制备的。

已经显示了硼酸及酯化合物可以作为蛋白酶体的抑制剂，蛋白酶体是负责多数胞内蛋白质周转的多重催化性蛋白酶。Ciechanover，Cell，79：13-21，1994教导蛋白酶体是遍在蛋白-蛋白酶体途径的一个蛋白酶解成分，其中蛋白质通过缀合于遍在蛋白的多个分子而定向降解。Ciechanover还教导遍在蛋白-蛋白酶体途径在多种重要的生理学过程中起重要作用。

Adams等，美国专利No 5780454(1998)、美国专利No 6066730(2000)、美国专利No 6083903(2000)及等同的WO 96/13266，及美国专利No 6297217(2001)描述了用作蛋白酶体抑制剂的肽硼酸酯和酸化合物。这些文献还描述了硼酸酯和酸化合物在降低肌蛋白质降解速度、降低细胞中NF-κB活性、降低细胞中p53蛋白的降解速度、抑制细胞中细胞周期蛋白降解、抑制癌细胞生长、抑制细胞中抗原呈递、抑制NF-κB依赖性细胞附着及抑制HIV复制中的应用。Brand等的WO 98/35691教导蛋白酶体抑制剂包括硼酸化合物用于治疗梗塞如在中风或心肌梗塞期间发生的梗塞。Elliott等的WO 99/15183教导蛋白酶体抑制剂用于治疗炎症和自身免疫疾病。

不幸地，有机硼酸相对地难以获得分析醇形式。因此，烷基硼酸及其环硼氧烷通常是空气敏感的。Korcek et al，J.Chem.Soc.Perkin Trans.2：242，1972，教导丁基硼酸易于在空气中氧化而产生1-丁醇和硼酸。

已知硼酸的衍生物作为环酯提供氧化抗性。例如Martichonok V et al J.Am.Chem.Soc.118：950-958，1996，阐述了二乙醇胺衍生化提供了针对可能的硼酸氧化的保护作用。美国专利No 5,681,978(Matteson DS et al)教导1，2-二醇及1，3-二醇，例如频哪醇，形成不易于氧化的稳定的环状硼酸酯。

Wu et al，J.Pharm.Sci.，89：758-765，2000，论述了一种抗癌剂即化合物N-(2-吡嗪)羰基-苯丙氨酸-亮氨酸硼酸(LDP-341，也称作bortezomib)的稳定性。描述了“在配制非肠道给药的[LDP-341]期间，所述化合物示出“无规律的稳定性行为”。研究了降解途径并推断所述降解是氧化性的，初始的氧化归因于过氧化物或氧分子及其自由基。

WO 02/059131揭示了稳定的硼酸产物。特别地，这些产物是某些硼酸肽和/或硼酸肽模拟物，其中硼酸基团已经用糖衍生化。所揭示的糖衍生物具有疏水性氨基酸侧链，其化学式如下：

其中：

P是氢或一个氨基基团保护基团；

R氢或烷基；

A是0、1或2；

R¹、R²和R³是独立的氢、烷基、环烷基、芳基或-CH₂-R⁵；

R⁵在每种情况中均是芳基，芳烷基、烷芳基、环烷基、杂环基、杂芳基或-W-R⁶之一，其中W是一个硫族元素及R⁶是烷基；

R¹、R²、R³或R⁵中所述任何芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、杂环基或杂芳基的环状基团可以被任意取代；及

Z¹和Z²一起形成一个衍生自糖的基团，其中在每种情况中均附着于硼的原子是氧原子。

一些揭示的化合物是LDP-341的糖衍生物(见上述)。

许多药物包含为羧酸的一种活性基团。在羧酸与硼酸之间有许多不同，其对(例如)药物输送、稳定性和转运的作用还未加以研究。三价硼化合物的一个特点是硼原子是sp²杂化，其在硼原子上留下了一个空2p_z轨道。BX₃类型的分子因此可作为电子对接受体(acceptor)或者路易斯酸。可以使用空2p_z轨道从路易斯酸中获得一对非键合的电子以形成共价键。BF₃因此与路易斯碱基如NH₃反应，形成酸-碱复合物，其中所有原子均具有价电子充填壳层。

因此，硼酸可作为路易斯酸，接受OH^-：

B(OH)₃+H₂O→B(OH)₄ ^-+H⁺

另外，RB(OH)₂类型的硼酸是二碱价的，并具有两个pKa。区别硼化合物的另一点是硼的键长非常短，可能是因为三个因素：

1.pπ-pπ键的形成；

2.离子共价共振；

3.在非键合电子之间的相斥降低。

KOH水溶液中硼酸和羧酸的预定平衡如下所示(排除RBO₂ ^2-的形成)：

氨基硼酸酯合成

现有技术已知通过如下程序合成TRI 50c酯：

上述步骤的产物然后通过已知方法被转变成例如TRI 50b。见例如Deadman J et al，J.Medicinal Chemistry 1995，38，1511-1522所述。

血栓形成

止血是血液的正常生理学情形，其中其成分存在动态平衡。当所述平衡被破坏时，例如在血管损伤后，在这个实例中某些生物化学途径被触发，导致由于血凝块的形成(凝固)而止血。凝固是一种动态的和复杂的过程，其中蛋白酶如凝血酶起关键作用。血液凝固可以通过两个级联酶原激活的任一个而发生，即外源性和内源性凝血级联途径。外源性途径中的因子VIIa和内源性途径中的因子IXa是因子X被激活为Xa的重要决定因素，Xa自身催化凝血酶原激活为凝血酶，同时凝血酶依次催化纤维蛋白原单体聚合为纤维蛋白聚合物。在每个途径中最后的蛋白酶因此是凝血酶，其作用是水解来自每个纤维蛋白原分子的4种小肽(两种FpA及两种FpB)，由此使其聚合位点去保护。一旦线性纤维蛋白聚合物形成，则其可以通过自身被凝血酶激活的因子XIIIa而交联。另外，凝血酶是一种有效的血小板激活剂，在此之上其对特定受体起作用。血小板的凝血酶激活导致细胞聚集及额外的因子分泌，进一步促进止血栓子的产生。凝血酶通过激活因子V和VIII还加强其自身产生(见Hemker和Beguin：Jolles，et.al.，“Biology andPathology of Platelet Vessel Wall Interactions，”pp.219-26(1986)，Crawford和Scrutton：Bloom和Thomas，“Haemostasis and Thrombosis，”pp.47-77，(1987)，Bevers，et.al.，Eur.J.Biochem.122：429-36，1982，Mann，Trends Biochem.Sci.12：229-33，1987)。

蛋白酶是在特异的肽键裂解蛋白质的酶。Cuypers et al.，J.Biol.Chem.257：7086，1982及其引用的参考文献，将蛋白酶根据机械论原理分为5类：丝氨酸、半胱氨酰基或硫醇、酸或天冬氨酰基、苏氨酸和金属蛋白酶。每个类别的成员均通过相似机制催化肽键的水解，具有相似活性位点氨基酸残基，及对类别特异性抑制剂敏感。例如，已经鉴定的所有丝氨酸蛋白酶均具有一个活性位点丝氨酸残基。

凝固蛋白酶凝血酶、因子Xa、因子VIIa和因子IXa是对序列特异性Arg-Xxx肽键的裂解具有胰蛋白酶样特异性的丝氨酸蛋白酶。正如其它丝氨酸蛋白酶一样，裂解事件首先是攻击底物的易断裂的键上活性位点丝氨酸，导致四面体中间体形成。随后该四面体中间体折拢形成酰基酶并释放裂解的序列的氨基末端。然后酰基酶的水解释放羧基末端。

如上所述，血小板在正常止血中起两种重要作用。首先，通过血小板的聚集组成了最初的止血栓子，其立即减少从破坏的血管中流出的血液。其次，血小板表面可以成为活性的并加强血液凝固，这是称作血小板促凝血活性的一种性质。这可以作为在存在因子Va和Ca²⁺的情况下，因子Xa激活凝血酶原的速度提高而观测到，称为凝血酶原酶反应。通常地，未刺激的血小板表面上几乎没有(即便有也是很少)凝固因子，但是当血小板被激活时，通常在膜的胞质侧的负电荷的磷脂(磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇)变为可利用的，并提供在其上发生两步凝固的一个表面。激活的血小板表面上的磷脂极度促进导致凝血酶形成的反应，以便凝血酶能与其被抗凝血酶III的中和相比更快速产生。在有或无肝素情况中，在血小板表面上发生的反应不易于被血液中天然的抗凝血物质如抗凝血酶III抑制(See Kelton和Hirsch：Bloom and Thomas，“Haemostasis and Thrombosis，”pp.737-760，(1981)；Mustard et al：Bloom and Thomas，“Haemostasis and Thrombosis，”pp.503526，(1981)；Goodwin et al；Biochem.J.308：15-21，1995)。

可以认为血栓是正常机制的一种异常产物，并可以解释为在心血管系统例如心或血管的表面上从血液组分中形成的一种块状物或沉积物。血栓形成被认为是病理状况，其中不正确的止血机制活性导致血管内血栓形成。现在识别了三种基本类型的血栓：

●白色血栓，其通常见于动脉，主要由血小板组成；

●红血栓，其见于静脉，主要由纤维蛋白和红细胞组成；

●混合血栓，其由白色血栓和红血栓的成分组成。

血栓的成分受在其形成部位的血流速度的影响。通常白色血小板富集的血栓在血流速度快的系统形成，而红色凝固血栓在淤滞的区域形成。动脉的高切变率防止血液凝固的中间体聚集在循环的动脉侧壁上：只有血小板具有通过Willebrand因子形成与损伤部位结合的血栓的能力。仅由血小板组成的这种血栓是不稳定及分散的。如果刺激强则血栓将再次形成，然后持续分散直至刺激降低。为使血栓稳定，必须形成纤维蛋白。在这个方面，少量的凝血酶可以聚集在血小板血栓内并使因子Va激活及刺激血小板促凝血活性。这两个事件导致因子Xa对凝血酶原的激活速度整体提高300,000倍。纤维蛋白沉积物使血小板血栓稳定。间接的凝血酶抑制剂如肝素在抑制刺激血小板促凝血活性方面无临床效力。因此，抑制血小板促凝血活性的治疗剂将有用于治疗或预防动脉血栓病变。

在循环的静脉侧，血栓包括纤维蛋白：由于静脉侧血流缓慢因此凝血酶可聚集，血小板仅起次要作用。

因此不认为血栓形成是一个单一指征，而是包含适合不同治疗剂和/或方案的不同亚类的一类指征。因此，管理机构将治疗疾病例如深部静脉血栓形成、脑血管动脉血栓形成及肺栓塞作为批准药物的指标。两种主要的血栓形成亚类是动脉血栓形成和静脉血栓形成。动脉血栓形成包括特异的病变如急性冠状动脉综合征((例如急性心肌梗塞(由冠状动脉血栓形成引起的心脏病发作))、脑血管动脉血栓形成(由脑血管动脉系统中血栓形成引起的中风)及周围动脉血栓形成。由静脉血栓形成引起的病变例如是深部静脉血栓形成和肺栓塞。

血栓形成的处理一般包括使用抗血小板药物(血小板聚集的抑制剂)以控制进一步的血栓形成，及使用血栓溶解剂溶解新形成的血块，这两种制剂的一种或两种可以与抗凝血剂联合或组合应用。在治疗认为易患血栓形成的患者中也可以预防性使用抗凝血剂。

目前，临床用作抗凝血剂的最有效的两类药物是肝素和维生素K拮抗剂。肝素是与抗凝血酶III结合并因此加强其作用的硫酸多糖的不明混合物。抗凝血酶III是激活的凝血因子IXa、Xa、XIa、凝血酶及可能的XIIa的一种天然发生的抑制剂(见Jaques，Pharmacol.Rev.31：99-166，1980)。维生素K拮抗剂，例如熟知的杀鼠灵，通过抑制维生素K依赖性凝血因子II、VII、IX和X的核糖体后羧化作用而间接起作用(见Hirsch，Semin.Thromb.Hemostasis 12：1-11，1986)。尽管肝素和维生素K拮抗剂是治疗血栓形成的有效方法，但其具有出血、肝素诱导的血小板减少(在肝素的情况中)等不利的副作用，及明显的患者间可变性，导致治疗安全性小及不可预知。

应用直接起作用的凝血系统的凝血酶及其它丝氨酸蛋白酶的抑制剂期望可以减轻这些问题。为此，已经测试了大量的丝氨酸蛋白酶抑制剂，包括硼酸肽，即含有α-氨基酸的硼酸类似物的肽。在这个说明书的前文已经论述了直接起作用的硼酸凝血酶抑制剂，在一下章节进一步描述。

中性的P1残基硼酸肽凝血酶抑制剂

Claeson等(US 5574014等)及Kakkar等(WO 92/07869及同族专利，包括US 5648338)揭示了具有一个中性(无电荷的)C末端(P1)侧链例如一个烷氧基烷基侧链的亲脂性凝血酶抑制剂。

Claeson等及Kakkar等同族专利揭示了含有氨基酸序列D-Phe-Pro-BoroMpg[(R)-Phe-Pro-BoroMpg]的硼酸酯，其是凝血酶的高度特异性抑制剂。这些化合物中可以提及的特别是Cbz-(R)-Phe-Pro-BoroMpg-O频哪醇(也称作TRI 50b)。相应的游离硼酸称作TRI 50c。关于TRI 50b及相关化合物的进一步的信息，读者可查阅如下文献：

●Elgendy S et al.，in The Design of Synthetic inhibitors of Thrombin，Claeson G et al Eds，Advances in Experimental Medicine，340：173-178，1993.

●Claeson G et al，Biochem J.290：309-312，1993

●Tapparelli C et al，J Biol Chem，268：4734-4741，1993

●Claeson G，in The Design of Synthetic inhibitors of Thrombin，ClaesonG et al Eds，Advances in Experimental Medicine，340：83-91，1993

●Phillip et al，in The Design of Synthetic inhibitors of Thrombin，ClaesonG et al Eds，Advances in Experimental Medicine，340：67-77，1993

●Tapparelli C et al，Trends Pharmacol.Sci.14：366-376，1993

●Claeson G，Blood Coagulation and Fibrinolysis 5：411-436，1994

●Elgendy et al，Tetrahedron 50：3803-3812，1994

●Deadman J et al，J.Enzyme Inhibition 9：29-41，1995

●Deadman J et al，J.Medicinal Chemistry 38：1511-1522，1995.

TRI 50b的三肽序列有3个手性中心。认为至少在具有商业有益的抑制剂活性的化合物中，Phe残基是(R)-构型及Pro残基是天然(S)-构型；在具有商业有益的抑制剂活性的异构体中确信Mpg残基是(R)-构型。因此，认为活性或最大活性的TRI 50b立体异构体是R，S，R构型，可以如下化学式所示：

(RSR)-TRI 50b：Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg Pinacol

虽然已经发现间接起作用的凝血酶抑制剂用于治疗易患或患有静脉血栓形成的患者，但动脉血栓却不是这样的，因为需要将用于治疗静脉血栓的剂量增加许多倍以治疗(预防)动脉血栓。这种增加的剂量典型地引起出血，这使得间接起作用的凝血酶抑制剂不适于或者不优选用于治疗动脉血栓。肝素及其低分子量的衍生物是间接的凝血酶抑制剂，因此不适于治疗动脉血栓。口服直接的凝血酶抑制剂是治疗动脉血栓的一个进展，但治疗指数低于所希望的治疗指数(therapeutic indices)，即在治疗剂量下具有高于希望水平的出血情况。

口服吸收

可以通过主动或被动途径在胃肠道中吸收。通过转运机制的主动吸收在个体之间趋于可变及与肠道内容物相关(Gustafsson et al，ThrombosisResearch，2001，101，171-181)。已经确定上部的肠道是口服药物吸收的主要部位。特别地，十二指肠由于其表面积大而是吸收口服药物的惯例靶定部位。肠粘膜作为一个屏障控制跨细胞的被动吸收：离子的吸收被阻断而有利于亲脂类分子的跨细胞吸收(Palm K et al.，J.Pharmacol and Exp.Therapeutics，1999，291，435-443)。

口服药物需要持续及充分吸收。讨厌的是个体之间及同一个体的不同时机之间的不同而吸收不同。相似地，一般不可接受生物利用度水平低的药物(仅少部分给予的活性剂被吸收)。

被动吸收有利于非离子化合物的吸收，这是与不变性相关的一种途径，因此被优选为进行持续吸收。被动吸收机制特别有利于亲脂类物质，因此表明最利于非离子的亲脂类药物的持续和高度口服吸收。

可以将许多有机硼酸化合物分为亲脂类或疏水类。典型地，这种化合物包括如下化合物：

●全部或大部分氨基酸是疏水性的硼酸肽，

●至少一半氨基酸是疏水性的而且具有一个疏水性N末端取代物(氨基保护基)的硼酸肽，

●基于疏水性基团的非肽。

药物与其生理学靶位的相互作用所需要的典型功能性是功能型基团如羧酸和磺酸。这些基团在胃中(在pH2-3)以质子化形式存在，但在较高pH的肠液中有一定程度的离子化。用于避免羧酸盐或磺酸盐离子化的一个策略是将其以酯形式存在，一旦吸收入血管腔中则被裂解。

例如，未达到最佳胃肠道吸收的直接作用的凝血酶抑制剂melagatran，具有末端羧基和脒基基团，而且当所述羧酸和脒基基团均是带电荷的时在pH 8-10是纯两性离子。因此开发了一种前体药物H376/95，其具有羧酸和脒的保护基，而且是比melagatran更亲脂的分子。所述前体药物经过培养的Caco-2上皮细胞的透性系数高于melagatran的80倍，口服生物利用度高于melagatran的2.7-5.5倍，以及在药物血浆浓度vs时间曲线下的范围内可变性较小(Gustafsson et al，Thrombosis Research，2001，101，171-181)。

硼酸是二价的功能基团，具有更典型的单键特点的硼-氧键长度

与羧酸和磺酸中的C-O和S-O的键不同。因此，硼酸基团具有两种离子化潜力。硼酸基团在十二指肠液的pH下部分离子化，与希望的被动十二指肠吸收不相称。因此，一种带电荷的硼酸酯抑制剂H-D-PheProBoroArg是通过主要的主动转运机制被吸收的(Saitoh，H.andAungst，B.J.，Pharm.Res.，1999，16，1786-1789)。

硼酸肽、硼酸肽模拟物及其它有机硼酸酯的口服吸收

TRI 50b的硼酸酯基团在血浆的条件下迅速裂解，形成相应的硼酸基团，该基团被认为是抑制凝血酶的催化位点的活性基团。

通过TRI 50b的这种裂解形成的肽硼酸(该酸被称为TRI 50c)在水中相对不能溶解，特别是在酸性或中性pH下，并趋于在胃和十二指肠中难以吸收。该酸的结构为Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH。

而肽硼酸Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH在十二指肠条件下部分离子化，达到那样的程度不利于被动转运，该酸的酯被设计为高速被动转运(因此一致)。三肽序列Phe-Pro-Mpg有一个非碱性P1侧链(特别是甲氧基丙基)，由此所述三肽由三个非极性氨基酸组成。所述肽硼酸的酯是不可离子化的，而且酯形成种类进一步授予亲脂性性质，由此促进高速被动转运。

计算技术已经证实可推测TRI 50b及Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH的其它二醇酯具有良好的生物可利用度。因此，极性表面区域(PSAd)是推测生物利用度的一个参数，高于

的PSAd值与被动跨细胞转运及已知药物的生物利用度密切相关联(Kelder，J.Pharm.Res.，1999，16，1514-1519)。对上述肽硼酸的二醇酯包括频哪醇酯TRI 50b的测定，示出该二醇酯具有高于

的PSAd值，推测被动转运和良好的生物利用度，如表1所示：

表1：选择的Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH二醇酯的PSAd值

二醇	PSAd值
		频哪醇	98.74
蒎二醇	90.64

相应的单羟基醇(例如烷醇)酯被认为太不稳定，在体外自然裂解释放酸。二醇如蒎二醇和频哪醇的酯具有与单羟基醇的酯相比增强的动力学稳定性，在部分水解为单酯衍生物之后，它们趋于通过便利的分子内反应而重新组合。

本说明书指南

本说明书如在下文更详细的描述涉及关于新的化合物和组合物的各个主题。方便起见，描述中所用术语“新化合物”有时(但并不总是)是指包含这些新化合物和组合物的产物，例如该术语用于标题中。

本发明的主题包括在关于新产物的研究和发展程序的早期部分中设计的合成方法，该方法产生一或多种杂质，而且不便于工业化规模应用。描述中所用术语“合成方法I”有时(但不总是)是指这种早期方法，例如该术语用于标题中。关于新产物的主题也包括随后设计合成技术的多个方面以生产新化合物(或其中间体)及使用这些技术可获得的相对高纯度的产物；描述中所用术语“合成方法II”有时(但不总是)是指这种随后的方法；例如该术语用于标题中。至少在某些方面，合成方法II代表合成方法I的一个亚型。合成方法II的特异性产物有时是指“高纯度产物”。高纯度产物是新产物的一个亚型。

短语新产物、合成方法I、合成方法II和高纯度产物只是便于描述而应用，不应理解为限制本发明的范围，其包括本发明的全部主题，包括所有材料、种类、程序及其应用。

发明内容

1.新产物

为平衡TRI 50b的高度需要的特征，已经揭示了TRI 50b趋于水解。因此在例如HPLC分析的酸性条件下，TRI 50b被转变为半衰期较短的酸形式，这意味着在十二指肠及在胃肠道中其它部位潜在的水解为离子形式，离子形式将抵抗被动转运，并且如果有什么的话，则由主动转运吸收，最多表现出不定的生物利用度。

TRI 50b对水解的不稳定性在化合物的制备及其配制，以及含有其的药物制剂的贮存中还具有潜在的不利之处。

由TRI 50b引起的另一种具有挑战性的困难是数据示出对象之间的生物利用度中的显著变化。这种可变性可产生一种无法接受的药物候选物，因此需要降低这种观测到的可变性。

解决TRI 50b不稳定性的一种理想方法是开发对水解更稳定的二醇酯，因为这种二醇酯与TRI 50b相似，可以预测与TRI 50c相比其具有氧化抗性。在此方面，已知环的大小可影响硼酸酯的稳定性，而且已经示出glycolato boron与频哪醇相比具有增强的水性稳定性(D.S.Matteson，Stereodirected Synthesis with Organoboranes，Springer-Verlag，1995，ch.1)。相似地，蒎二醇酯与频哪醇相比更稳定；确信这是由于蒎二醇基团是高度位阻的并且不利于对硼的亲核攻击。事实上，已经报道了从频哪醇到蒎二醇的酯交换(Brosz，CS，Tet.Assym，8：1435-1440，1997)，而反向过程不顺利。然而认为蒎二醇酯在血浆中太不活跃以至于不能裂解，因此需要提供一种改良的二醇酯。

解决TRI 50b的不稳定性的另一种方法是在其原位给予TRI 50c。然而，TRI 50c数据提示TRI 50c的生物利用度中可变性太高。

TRI 50c也具有不稳定性，因为存在硼酸肽基团通过去硼化(碳-硼键裂解)而自身降解的趋向，通过先前文献教导的氧化途径进行(例如Wu et al，如上述)。降解水平可非常高。

TRI 50b和TRI 50c的上述性质非限于这种化合物，而是由其它硼酸肽酯和酸共有，即使这种其它硼酸肽的性质在数量上不同。

本发明是以某些有机硼酸产物表现出增强的稳定性等发现为基础。本发明的另一个基础是具有意外有利的生物利用度的有机硼酸产物。本发明的益处包括解决了二醇硼酸酯尤其TRI 50b不稳定性的问题，也就是说本发明揭示的产物尤其提供了药物活性化合物，其与TRI50b及其它可对比的酯在对水解的稳定性方面相比更稳定。本发明进一步包括了解决有机硼酸不稳定性的问题，也就是说本发明揭示的产物尤其提供了药物活性化合物，其与TRI 50c相比对去硼化更稳定。在本发明的构架中提供的稳定性不是绝对的，但与对比的化合物相比是改良的。本发明的提供的益处进一步包括提供了与预期相反的在口服生物利用度方面具有非常低的可变性的未曾预料的产物。

一方面，本发明揭示了一种药物可接受的多价(至少二价)的金属盐及一种有机硼酸药物。作为一个类别，这种盐不仅与现有技术的指导相反，而且还具有基于已知化学理论不能解释或预知的改良的稳定性水平。本发明的盐具有基于已知机制无法解释的极高的和一致的口服生物利用度。

本发明包括例如一类盐，其药物(游离酸)除了其硼酸根(硼酸)基团和氨基基团之外在生理pH无带电荷基团。本发明包括一类盐，其药物(游离酸)是一种肽硼酸盐，其所有氨基酸残基均具有无电荷的侧链。

在某些实施方案中，所述有机硼酸是疏水性的。特别的有机硼酸在生理pH及在25℃条件下在1-正辛醇和水之间的分配系数以log P表示高于1.0。一些有用的疏水性有机硼酸的分配系数为至少1.5。一类有用的疏水性有机硼酸的分配系数为不超过5。

一类特殊的盐包括其中有机硼酸包含硼酸肽或硼酸肽模拟物的那些盐。作为盐制备可获益的硼酸肽药物包括但非限于式X-(aa)n-B(OH)₂所示那些硼酸肽，X是H或氨基保护基，n是2，3或4，(尤其是2或3)，及每个aa均独立地是疏水性氨基酸，无论是天然的还是非天然的。

本发明某些实施例揭示的是凝血酶的疏水性硼酸抑制剂的多价金属盐。这种抑制剂可含有疏水性氨基酸，这类氨基酸包括侧链是烃基、含有一个链内氧和/或通过链内氧或杂芳基与分子的其余部分连接的烃基、或者被羟基、卤素或三氟甲基取代的任何前述基团的氨基酸。代表性疏水侧链包括烷基、烷氧基烷基、由至少一种芳基或杂芳基取代的前述基团、芳基、杂芳基，由至少一种烷基取代的芳基以及由至少一种烷基取代的杂芳基。脯氨酸以及环没有被取代的或者由前一句所列的一种基团进行环取代的亚氨基酸也是疏水性的。

一些疏水性侧链含有1-20个碳原子，例如具有1、2、3或4个碳原子的非环状基团。包含一个环状基团的侧链典型地但非必须含有5-13个环成员，在许多情况中是苯基或由一或两个苯基取代的烷基。

本发明包括抑制剂，其含有疏水性非肽基团，其典型地是基于上述可以形成疏水性氨基酸侧链的基团。

疏水性化合物可含有例如一个氨基基团和/或一个酸基团(例如-COOH、-B(OH)₂)。通常地，它们不含有任一类型的多极性基团。

一类疏水性有机硼酸在生理pH及在25℃条件下，在1-正辛醇和水之间的分配系数以log P表示高于1。例如，TRI 50c的分配系数为大约2。

疏水性有机硼酸的一些亚类是在下文标题为“一些实施例详述”中由式(I)和(III)所示的那些化合物。

本发明包括肽硼酸的碱加成盐，其在生理pH及在25℃条件下，在1-正辛醇和水之间的分配系数以log P表示高于1.0。一些有用的肽硼酸的分配系数为至少1.5。一类有用的疏水性肽硼酸的分配系数为不超过5。

在硼酸肽/硼酸肽模拟物的盐的一个亚类中，所述有机硼酸如式(I)所示：

其中

R¹是H或一个中性侧链基团；

R²是H或任选含有链内氧或硫及任选由选自卤素、羟基和三氟甲基的取代物取代的C₁-C₁₃烃基；

或者R¹和R²一起形成一个C₁-C₁₃基团，其与N-CH组合形成了一个4-6个成员的环，并且其选自亚烃基(无论是支链还是线性的)和含有链内硫或者通过硫与N-CH连接的亚烃基；

R³与R¹相同或不同，只要R¹和R²只有一个是H，且是H或一个中性侧链基团；

R⁴是H或任选含有链内氧或硫及任选由选自卤素、羟基和三氟甲基的取代物取代的C₁-C₁₃烃基；

或者R³和R⁴一起形成一个C₁-C₁₃基团，其与N-CH组合形成了一个4-6个成员的环，并且其选自亚烃基(无论是支链还是线性的)和含有链内硫或者通过硫与N-CH连接的亚烃基；

R⁵是X-E-，其中E什么都不是，或者是选自如下一组的疏水性基团，所述组由氨基酸(天然或非天然的)和其中超过一半的氨基酸是疏水性的两或多个氨基酸(天然或非天然的)的肽组成，X是H或氨基保护基。

本发明还揭示了药物可接受的下式(II)，(III)或(IV)所示的肽硼酸的多价金属盐。

式(III)和(IV)的硼酸抑制凝血酶。它们在静脉和动脉中均呈现抗血栓形成活性，并且被认为抑制血小板促凝血活性。式(III)和(IV)所示的硼酸例如是TRI 50c。

本发明的实施例中的数据示出TRI 50c的钙盐与钾盐相比其溶解度明显较低，但口服生物利用度较高及口服生物利用度的一致性较高。关于这两种盐的溶解度与生物利用度之间的反比关系的发现尤其不可预知。关于这个发现没有已知的有机硼酸药物的性质可以解释。本发明因此包括例如一种TRI 50c衍生物，其与TRI 50b相比稳定性增强，并且用TRI 50b和TRI50c已经观测到吸收中的可变性降低及有利地使得获得充分一致的及高度的生物利用度。

本发明的实施例的数据还表明TRI 50c的钙盐与TRI 50c相比稳定性显著提高。再一次，对这个发现没有已知的性质可以解释。

式(III)和(IV)表示的化合物家族代表TRI 50c的近邻，可预知其具有与TRI 50c特殊的相似性质。

钙是一类药物可接受的多价金属。其还是一类药物可接受的二价金属的代表；这类金属的其它成员可以提及的是镁和锌。

TRI 50c与大多数其它有机酸药物的区别在于TRI 50c的酸基团是硼酸而不是羧酸。本发明的数据表明有机硼酸药物的多价金属盐提供一种与溶解度无关的技术方面的作用，其增强生物利用度的量和一致性。因为这种作用与溶解度无关，因此在每个个体情况中就酸而言溶解度和生物利用度之间的数量关系与就TRI 50c而言观测的结果类似。

文献中有一争论之处是水溶液中硼酸根是否形成“三角形”B(OH)₂或者“四面体形”B(OH)₃-硼类，但NMR迹象似乎表明在pH低于硼酸的第一个pKa之处，主要的硼类是中性B(OH)₂。在十二指肠中，pH很可能在6和7之间，因此三角形的种类在那里很可能占优势。在任何情况中，符号-B(OH)₂包括四面体以及三角形硼类，并且在本说明书中表示三角形硼类的符号也包含四面体形的类别。该符号进一步可包含酐形式的硼酸基团(boronic group)。

所述盐可以是溶剂合物形式，特别是水合物形式。

所述盐可包含或者基本由酸式盐组成，其中硼酸是单独去质子化的。因此本发明包括具有与主要(50mol％以上)携带单一负电荷的产物中硼酸根基团一致的金属/硼酸根化学计量的产物。

所述盐可以是分离的形式。如通过实施例13的方法确定，所述盐可具有例如至少大约90％的纯度，例如高于或等于大约95％。在药物制剂的情况中，这种盐的形式可以与药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体组合。

本发明还提供了所述盐的口服制剂。特别地，本发明提供了包含固相所述盐的口服制剂，例如将微粒的盐配制成压缩的片剂或配制成胶囊。根据本发明的另一方面，提供了一种治疗其中需要抗血栓形成活性的病症的方法，所述方法包括给予患有或处于这种病症危险之中的患者口服治疗有效量的式(III)所示硼酸的多价金属盐。

本发明包括与合成方法I相关的主题，包括从相应的硼酸作为中间体制备盐的方法，以及式(I)的中间体硼酸和制备其的方法。

2.合成方法II

TRI 50c多价金属盐是通过TRI 50c酯获得的。然而，公布的合成TRI50c酯因而合成TRI 50c的途径产生一或多种杂质。生产盐的合成方法I(在申请本申请时未公布)产生一或多种杂质，并且不能获得非常高纯度的盐。另外，已经证实所述盐很难获得高纯度。因此，应用的纯化技术不能生产非常高纯度的盐。HPLC不便于工业规模应用以纯化通过公布的TRI50c酯合成和合成方法I的盐制备技术生产的盐。换句话说，为了将TRI 50c盐提供给需要其的患者以达到治疗效力，所述盐必须是可工业化获得的非常纯的形式，并且这个纯形式必须可以不用使用过分昂贵的纯化技术而获得。

本发明提供了纯化有机硼酸化合物的技术及有助于维持有机硼酸化合物纯度的技术以及这种技术的产物。本发明进一步提供了一种生产这种高纯度盐的方法及高纯度盐自身。特别地，本发明的一个实施方案揭示了一种包含手性选择性沉淀步骤的方法，这样产生高纯度的沉淀的硼酸衍生物。本发明还提供了一种水解有机硼酸盐的方法，其可用于帮助获得高纯度的盐。在另一个实施方案中，本发明揭示了一种制备在前述段落中所述高纯度的盐的方法，其中所选择的溶剂用于帮助达到高纯度水平。

在另一方面，本发明提供了一种新的合成方法，用于制备TRI 50c硼酸肽及其它化合物；本发明还提供了通过这种合成可间接获得的氨基硼酸盐和硼酸肽。

本发明进一步提供了特定纯度的硼酸盐及含有其的药物制剂。

一方面，本发明提供了二乙醇胺通过沉淀来拆分硼酸化合物(无论以酸还是例如酯提供)的应用，其中所述酸如式X-(R)-aa¹-(S)-aa²-NH-C^*(R¹)H-B(OH)₂所示，其中aa¹，aa²和R¹如下述，C^*是最初存在于两种手性中的手性中心。本发明还提供了一种拆分手性异构体的方法，其中二乙醇胺以每当量具有(R)-构型手性中心C^*的硼酸化合物1.25±0.1当量的量应用。

本发明的另一方面涉及保护有机硼酸化合物免于通过C-B键裂解而降解，使用一种不是设计为保护性对抗先前已知的C-B键裂解的氧化机制的技术。所述方法包括将硼酸化合物例如硼酸酯很短时间水解，基本避免C-B键的裂解。例如，在室温水解时间不超过大约30分钟。

本发明还包括乙腈在制备有机硼酸盐中作为溶剂的应用。特别地，将有机硼酸溶解于乙腈中并与一种碱接触以形成相应的有机硼酸盐。含有水的固体有机硼酸盐可以通过使用乙腈共沸干燥(azeodrying)而干燥。

本发明还提供了分离式(XX)的硼酸的非对映异构体的方法：

其中：

X是H(以形成NH₂)或氨基保护基；

aa¹是(R)构型的氨基酸残基，选自Phe，Dpa及其全部或部分氢化的类似物；

aa²是(S)构型的亚氨基酸残基，具有4-6个环成员；

R¹是式-(CH₂)_s-Z所示基团，其中s是2，3或4，Z是-OH，-OMe，-OEt或卤素(F，Cl，Br或I)；

其中C^*是一个手性中心；

所述方法包括：

组合(A)一种于选自硼酸(I)及其与醇的酯的硼酸种类的二乙醚中的起始溶液，所述醇选自其中唯一可能的电子供体杂原子是氧的醇，该氧在硼酸酯中相应于酯官能团的氧，所述起始溶液含有具有(R)构型手性中心C^*的硼酸种类及具有(S)构型手性中心C^*的硼酸种类；及(B)二乙醇胺，该二乙醇胺的量基于其中手性中心C^*是(R)构型的硼酸种类是1.25±0.1当量，混和形成一种混合物；

使得硼酸种类与二乙醇胺反应直至形成一种沉淀；

回收该沉淀。

沉淀步骤是针对具有(R)构型的手性中心C^*的种类选择的，其被高纯度回收。

所述方法可包括将回收的沉淀物转变为式(I)的酸，即将沉淀溶解于选自卤代烃及其组合的有机溶剂中，搅拌与一种水性介质(例如pH低于3的一种水性酸)获得的溶液，从而溶解的沉淀被转变为式(I)的酸，并通过蒸发回收式(I)的酸。

本发明的一种方法包括用一种水性介质短时间水解式(I)的酸的二乙醇胺酯，使得产物酸基本上没有得自碳-硼键裂解的杂质。

一类方法进一步包括将回收的式(I)的酸转变为药物可接受的其碱加成盐，即将所述酸溶解与乙腈中，将所得溶液与药物可接受的碱的水溶液或悬浮液组合，使得碱与酸反应，然后蒸发至干以获得一种蒸发残余物。

所述碱加成盐随后可掺入一种药物制剂中。

本发明进一步提供了一种产生式(I)的硼酸或产生这种酸合成中间体的方法，式(I)中R¹是式-(CH₂)_s-O-R³，其中R³是甲基或乙基，s独立地是2，3或4，所述方法包括：

将1-金属烷氧基烷与硼酸酯反应以形成式(VI)的化合物，其中烷氧基烷如式-(CH₂)_s-O-R³所示：

(HO)₂B-(CH₂)_s-O-R³      (VI)，

所述方法任选进一步包括将式(VI)的化合物转变为式(I)的酸，例如通过已知方法进行。

在一类方法中，将式(VI)的化合物转变为式(I)酸的酯，将该酯与二乙醇胺转酯化以形成沉淀。然后回收该沉淀以进一步处理。适当地，如本发明所述二乙醇胺转酯化用于溶解手性异构体。然后如本发明所述将溶解的活性R，S，R异构体从二乙醇胺酯转变为游离酸，如果需要则将游离酸转变为盐。

本发明包括前述方法的产物。进一步的产物在如下的说明书中描述和请求保护。

合成方法II及其产物可以根据大规模或工业规模的具体情况而定。

3.概要

本发明所述的盐包括可通过硼酸与多价金属碱反应可获得的产物(具有通过该反应获得的产物的特性)，由此理解本发明的术语“盐”。因此针对所揭示的产物的术语“盐”非必须意味着产物含有分立的阳离子和阴离子，而且应理解为包含使用硼酸与碱的反应可获得的产物。本发明在更大或更小程度上包含配位化合物形式的产物。本发明因此还提供了通过有机硼酸药物与多价金属碱反应可获得的产物(具有通过这种反应可获得的产物的特性)，以及这种产物的治疗，包括预防应用。

本发明不受盐的制备方法的限制，只要它们含有衍生自硼酸(I)的硼酸根类和一个平衡离子即可。这种硼酸根类可以是其任何平衡形式的硼酸根阴离子。术语“平衡形式”是指相同化合物的不同形式，其可以在平衡等式中表示(例如与硼酸酐平衡及与不同硼酸根离子的平衡中的硼酸)。固相的硼酸盐可以形成酐，并且当所揭示的硼酸盐是固相时可包含硼酸酐，作为硼酸平衡种类。非必须通过含有平衡离子的碱与硼酸(I)反应制备所述盐。另外，本发明包括这样的盐产物，其被认为是通过这种酸/碱反应而间接制备的盐，以及通过这种间接制备可获得的盐(具有通过这种反应获得的产物的特性)。可能的间接制备方法例如可以是这样的方法，其中在初始盐的回收之后，将其纯化和/或处理以修饰其物理化学性质，例如修饰其固体形式或水合物形式或这两者。

在一些实施方案中，所述盐包含酐类，在其它实施方案中，它们基本是无酐类。

本发明的其它方面和实施方案在如下描述和权利要求中阐述。

在本说明书的描述和权利要求中，术语“包含”和“含有”是指“包含但非限于”，并且不除外其它基团、添加剂、成分、整数或步骤。

本专利申请包含的数据表明有机硼酸的稳定性(去硼化抗性)可以通过将其以多价金属盐的形式提供而增加。所述盐可以是一种酸式盐。这种稳定化技术形成了本发明的一部分，并且可适用于“背景”标题下描述的有机硼酸及在该标题下提及的出版物中描述的有机硼酸。

附图说明

图1是实施例13的HPLC图，示出在25℃和60％相对湿度在起泡(blister)包装中保持1.5月后，胶囊化的TRI 50c钙盐的杂质分布图。

图2是实施例13的HPLC图，示出在40℃和75％相对湿度在起泡包装中保持1.5月后，胶囊化的TRI 50c钙盐的杂质分布图。

图3是实施例13的HPLC图，示出在40℃和75％相对湿度在无起泡包装中保持1.5月后，胶囊化的TRI 50c钙盐的杂质分布图。

图4是实施例14的图，示出TRI 1405(TRI 50c镁盐)和TRI 50b的凝血酶酰胺分解分析的结果，其中Vmax是通过酰胺分解分析测定的最大反应速度。

图5是实施例25的图，示出在p.o.给予TRI 50b或TRI 50c后的口期(oral phase)清除率和动力学。

图6是实施例25的另一个图，示出在十二指肠内给予TRI 50b或TRI50c后的口期清除率和动力学。

具体实施方式

术语表

在本说明书中使用以下术语和缩写：

针对硼酸的盐所用术语“酸式盐”是指其三角形的酸基团-B(OH)₂的一个-OH基团被去质子化的一种盐。因此其中硼酸根基团携带一个负电荷并可以表示为-B(OH)(O^-)或[-B(OH)₃]^-的盐是酸式盐。该术语涵盖了具有化

合价n的阳离子盐，其中硼酸与阳离子的摩尔比率为大约n∶1。在实际中，观察的化学计量不可能真正是n∶1，但与理论的n∶1化学计量一致。例如，观察的阳离子质量可以在针对n∶1化学计量计算的质量之上变化不超过大约10％，例如不超过大约7.5％；在一些情况中，观察的金属质量与计算的质量之间的变化不超过大约1％。计算的质量是基于三角形形式的硼酸根。(在原子水平，与酸式盐的化学计量一致的盐可以含有质子化状态的硼酸盐混合物，其平均值与单一去质子化相近，这种“混和的”盐包含在术语“酸式盐”内)。酸式盐例如是半镁盐和半钙盐。

α-氨基硼酸或Boro(aa)是指其中CO₂基团已经由BO₂置换的氨基酸。

术语“氨基基团保护基团”是指用于衍生一个氨基基团尤其是肽或氨基酸的N末端氨基基团的任何基团。这种基团包括但非限于烷基、酰基、烷氧基羰基、氨基羰基和磺酰基基团。然而，术语“氨基基团保护基团”非限于在有机合成中常用的那些特殊的保护基，也非限于易于裂解的那些基团。

本发明所用短语“药物可接受的”是指那些化合物、物质、成分和/或剂型，它们在合理的医学判断范围内，适合用于与人体或动物的组织接触而无过多的毒性、刺激性、变态反应、或其它问题或并发症，与合理的益处/危险率相应。

术语“凝血酶抑制剂”是指一种产物，其在可靠的药物学判断范围内，在药物学方面潜在或真正用作凝血酶的抑制剂，包括包含药物学活性物的物质并且被描述为推荐或审定作为凝血酶抑制剂。这种凝血酶抑制剂可以是选择性的，即其在可靠的药物学判断范围内与其它蛋白酶相比被认为对凝血酶是选择性的；术语“选择性凝血酶抑制剂”包括包含药物学活性物的物质并且被描述为推荐或审定作为选择性凝血酶抑制剂。术语“蛋白酶抑制剂”和“选择性蛋白酶抑制剂”具有相似的意义。

术语“杂芳基”是指一个环系统，其具有至少1个(例如1、2或3个)环内杂原子，并且具有一个缀合的环内双键系统。术语“杂原子”包括氧、硫和氮，其中有时不太优选硫。

“天然氨基酸”是指选自如下中性(疏水性或极性)的带正电荷及负电荷的氨基酸的一种L-氨基酸(或其残基)：

疏水性氨基酸

A＝Ala＝丙氨酸

V＝Val＝缬氨酸

I＝Ile＝异亮氨酸

L＝Leu＝亮氨酸

M＝Met＝甲硫氨酸

F＝Phe＝苯丙氨酸

P＝Pro＝脯氨酸

W＝Trp＝色氨酸

极性(中性或无电荷的)氨基酸

N＝Asn＝天冬酰胺

C＝Cys＝半胱氨酸

Q＝Gln＝谷胺酰胺

G＝Gly＝甘氨酸

S＝Ser＝丝氨酸

T＝Thr＝苏氨酸

Y＝Tyr＝酪氨酸

带正电荷的(碱性)氨基酸

R＝Arg＝精氨酸

H＝His＝组氨酸

K＝Lys＝赖氨酸

带负电荷的氨基酸

D＝Asp＝天冬氨酸

E＝Glu＝谷氨酸

ACN＝乙腈

氨基酸＝α-氨基酸

Cbz＝苄氧基羰基

Cha＝环己基丙氨酸(一种疏水性非天然氨基酸)

带电荷的(如用于药物或药物分子的片段，例如氨基酸残基)＝在生理pH携带电荷，如在氨基、脒基或羧基基团的情况中

Dcha＝二环己基丙氨酸(一种疏水性非天然氨基酸)

Dpa＝二苯丙氨酸(一种疏水性非天然氨基酸)

药物＝一种药物学有益物质，无论是在体内有活性的还是一种前体药物

i.v.＝静脉内

Mpg＝3-甲氧基丙基甘氨酸(一种疏水性非天然氨基酸)

多价＝至少两价的化合价，例如二或三价

中性的(如用于药物或药物分子的片段，例如氨基酸残基)＝无电荷的＝在生理pH不带电荷

Pinac＝频哪醇＝2，3-二甲基-2，3-丁二醇

蒎二醇＝2，3-蒎二醇＝2，6，6-三甲基二环[3.1.1]庚烷-2，3-二醇

Pip＝2-哌啶酸

p.o.＝per os＝通过口腔给予(因此口服制剂是通过p.o.给予的)

室温＝25±2℃

s.c.＝皮下

THF＝四氢呋喃

Thr＝凝血酶

新产物一化合物

本发明的产物包括一种药物可接受的多价(至少二价)金属的盐和一种有机硼酸药物(术语“药物”包含前体药物)。如前所述，术语“盐”是指一种含有多价金属和有机硼酸盐类的产物，例如具有有机硼酸与包含多价金属(例如+2离子)的碱的反应产物的特性；特别地，这种特性包括多价金属与药物种类的性质。

一类产物包含是酸式盐的那些盐。第二类产物包含无论酸与否是式III的硼酸的盐的那些盐。第三类产物包含与其口服给予相关的所有盐，例如当在口服配方中存在时。

所述酸可以例如是在“背景”标题下或在该标题下提及的任何文献中所述的任何硼酸药物，例如其可以是TRI 50c或LDP-341。其可以是WO01/02424中描述的一种硼酸。在这个段落中，提及了现有技术所述的硼酸，包括现有技术所述的硼酸酯的游离酸。其可以是任何其它硼酸药物。

在某些实施方案中，所述有机硼酸是疏水性的。

本发明揭示的实施方案中，有机硼酸包含通过一个肽键与有机基团连接的一种氨基硼酸，该有机基团可以是疏水性的。有机基团可包含一个氨基酸，其C末端羧基形成了所述肽键的一部分。因此本发明包括式(XIII)的化合物和多价例如二价的金属的盐：

在式(XII)中，G是一个有机基团，例如包含-CO-，加上任选N末端取代的氨基酸或肽(例如二肽)的一个残基，一个合适的N末端取代例如是如下所述的X基团。R是氨基酸(无论天然还是非天然的)的侧链。G和R可以是疏水性的。R可以是如下述的一个R¹基团。

一类特殊的盐包含其中有机硼酸包含一种硼酸肽或硼酸肽模拟物的那些盐。例如在这些盐的亚类中，所述有机硼酸是式(I)所示的硼酸：

其中：

R¹是H或一个无电荷侧链基团；

R²是H或任选含有链内氧或硫及任选由选自卤素、羟基和三氟甲基的取代物取代的C₁-C₁₃烃基；

或者R¹和R²一起形成一个C₁-C₁₃基团，其与N-CH组合形成了一个4-6个成员的环，并且其选自亚烃基(无论是支链还是线性的)和含有链内硫或者通过硫与N-CH连接的亚烃基；

R³与R¹相同或不同，只要R¹和R²只有一个是H；

R⁴是H或任选含有链内氧或硫及任选由选自卤素、羟基和三氟甲基的取代物取代的C₁-C₁₃烃基；

或者R³和R⁴一起形成一个C₁-C₁₃基团，其与N-CH组合形成了一个4-6个成员的环，并且其选自亚烃基(无论是支链还是线性的)和含有链内硫或者通过硫与N-CH连接的亚烃基；

R⁵是X-E-，其中E什么都不是，或者是选自如下一组的疏水性基团，所述组由氨基酸(天然或非天然的)和其中超过一半的氨基酸是疏水性的两或多个氨基酸(天然或非天然的)的肽组成，在这种肽中，肽键的氮可以是由任选含有链内氧或硫及任选由选自卤素、羟基和三氟甲基的取代物取代的C₁-C₁₃烃基取代(这种N末端取代例如是1C-6C烷基)，X是H或氨基保护基。

所述任选含有链内氧或硫的C₁-C₁₃烃基可以选自烷基、由环烷基、芳基或杂环基取代的烷基、环烷基、芳基、和/或杂环基。杂环基可以是杂芳基。

R¹可以是非极性的。在一些实施方案中，R¹含有最多20个碳原子。R¹对蛋白酶的S1亚位点可以有亲和性。

在一类化合物中，R¹是选自式A或B的除了氢以外的一个基团：

-(CO)_a-(CH₂)_b-D_c-(CH₂)_d-E            (A)

-(CO)_a-(CH₂)_b-D_c-C_e(E¹)(E²)(E³)      (B)

其中

a是0或1；

e是1；

b和d独立地是0或者一个整数，由此(b+d)为0-4，或者

(b+e)是1-4；

c是0或1；

D是O或S；

E是H，C₁-C₆烷基，或者一个饱和或不饱和的环基团，其通常含有最多14个成员特别是5-6个成员的环(例如苯基)或者8-14个成员的稠环系统(例如萘基)，烷基或环基团任选由独立地选自如下的最多三个基团(例如一个基团)取代，所述基团为C₁-C₆三烷基硅烷基，-CN，-R¹³，-R¹²OR¹³，-R¹²COR¹³，-R¹²CO₂R¹³和-R¹²O₂CR¹³，其中R¹²是-(CH₂)_f-，R¹³是-(CH₂)_gH，或者烷基或环基团任选由一种基团取代，该基团的非氢原子由碳原子和环内杂原子组成，数目为5-14个，其含有一个环系统(例如芳基)及任选一个烷基和/或亚烷基基团，其中f和g均独立地是0-10，g特别是至少1(尽管-OH也可以是一个取代物)，条件是(f+g)不超过10，更特别地不超过6，最特别是1，2，3或4，及条件是如果取代物是含有一个环系统的所述基团则只有一个取代，或者E是C₁-C₆三烷基硅烷基；E¹，E²和E³均独立地选自-R¹⁵和-J-R¹⁵，其中J是一个5-6个成员的环，R¹⁵选自C₁-C₆三烷基硅烷基，-CN，-R¹³，-R¹²OR¹³，-R¹²COR¹³，-R¹²CO₂R¹³，-R¹²O₂CR¹³及一或两种卤素(例如在后一情况中为形成-J-R¹⁵基团其是二氯苯基)，其中R¹²和R¹³分别是如上述R¹²基团和R¹³基团(在E¹，E²和E³含有R¹³基团的一些酸中，g是0或1)；

在式(A)或(B)所示的基团中，任何环均是碳环或芳族环，或者是这两者；与碳原子键合的任一或多个氢原子均任选由卤素尤其是F取代。

在某些实施例中，a是0。如果a是1，c可以是0。在特殊的实施例中，(a+b+c+d)和(a+b+c+e)不超过4，尤其是1、2或3。(a+b+c+d)可以是0。

E，E¹，E²和E³的基团例如包括芳环如苯基、萘基、吡啶基、喹啉基(quinolinyl)和呋喃基；非芳族不饱和环，例如环己烯基；饱和的环如环己基。E可以是含有芳环和非芳环二者的一个稠环系统，例如芴基。一类E、E¹、E²和E³基团是芳环(包括杂芳环)，尤其是6个成员的芳环。在一些化合物中，E¹是H，同时E²和E³不是H；在那些化合物中，E²和E³基团例如是苯基(取代或未取代的)，C₁-C₄烷基，例如甲基。

在一类实施方案中，E含有一个取代是C₁-C₆烷基，(C₁-C₅烷基)羰基，羧基C₁-C₅烷基，芳基(包括杂芳基)，尤其是5个成员或优选6个成员的芳基(例如苯基或吡啶基)，或芳烷基(例如芳基甲基或芳基乙基，其中芳基可以是杂环的，优选是6个成员的)。

在另一类实施方案中，E含有一个取代是OR¹³，其中R¹³可以是6个成员的环，其可以是芳环(例如苯基)，或者含有的一个取代是由这种6个成员的环取代的烷基(例如甲基或乙基)。

一类式A或B所示的基团是那些其中E是6个成员的芳环，任选特别是在第2或第4位由-R¹³或-OR¹³取代。

本发明还包括这样的盐，其中R¹包含一个环基团，其中1或2个氢已经由卤素例如F或Cl取代。

本发明还包括一类盐，其中式(A)或(B)的R¹基团如下式(C)，(D)或(E)所示：

其中q是0-5，例如是0，1或2，每个T均独立地是氢、一或两个卤素(例如F或Cl)、-SiMe₃、CN、-R¹³、-OR¹³、-COR¹³、-CO₂R¹³或-O₂CR¹³。在结构(D)和(E)的一些实施方案中，T是在苯基的第4位，并且是-R¹³、-OR¹³、-COR¹³、-CO₂R¹³或-O₂CR¹³，及R¹³是C₁-C₁₀烷基，更特别的是C₁-C₆烷基。在一个亚类中，T是-R¹³或-OR¹³，例如其中f和g均独立地是0，1，2或3；在这个亚类的一些R¹基团中，T是-R¹²OR¹³及R¹³是H。

在一类(基团)中，R¹如式(C)所示，每个T均独立地是R¹³或OR¹³，及R¹³是C₁-C₄烷基。在一些这种化合物中，R¹³是分支的烷基，在其它化合物中其是直链的。在一些基团中，碳原子数是1-4。在另一类基团中，R¹如式(E)所示，T是-CN或者一或两种卤素；在这些化合物中，q可以是例如0或1。

在一类化合物中，R²是H而R³不是H。在R³不是H的情况中，其优选与R⁴结合以形成所述基团。在R³是H的情况中，R⁴优选是所述烃基基团，例如包含C₅-C₆烃基环的C₄-C₆烃基；所述烃基可以是饱和的，例如这些化合物的R⁴基团是环戊基。

在特殊的实施例中，R⁴是H或者R³和R⁴一起形成所述C₁-C₁₃基团。

在R³不与R⁴结合形成所述C₁-C₁₃基团的情况中，在一些实施方案中其含有至多20个碳原子。

R³可以是如上述式(A)或(B)的基团，例如式(C)，(D)或(E)的基团。在一类化合物中，R³如式(C)所示。

在一类盐中，E什么也不是。

在另一类盐中，E包含一或多个疏水性氨基酸的序列，例如这种疏水性氨基酸可以有至多20个碳原子的一个侧链。在一些化合物中，E包含一或多个疏水性氨基酸(例如1个氨基酸)的序列，每个氨基酸均具有上述式(A)或(B)的一个侧链，例如式(C)，(D)或(E)的基团，或者是当式(I)的R¹和R²结合在一起时形成的一个亚氨基酸。在一类盐中，E由具有式(D)的侧链的氨基酸组成；在另一类盐中，E由具有式(E)的侧链的氨基酸组成。

一类特异的盐，其包含其中有机硼酸如式(II)所示的那些盐：

其中

R⁷是X-E′-，其中X是氢或氨基保护基，E′不存在或者是疏水性氨基酸；

R⁸是含有1-5个碳原子的一个任选取代的基团，选自烷基，烷氧基和烷氧基烷基，任选取代物是羟基或者优选卤素(F，Cl，Br，I)，烷基基团是支链或直链的；

aa^h是疏水性氨基酸，或者是在N末端由C₁-C₁₃烃基取代的甘氨酸，所述C₁-C₁₃烃基任选含有链内氧或硫，并任选由选自卤素、羟基和三氟甲基的一个取代物取代。

R⁷可以是X-或X-Phe或X-Dpa。

R⁸优选是未取代的。R⁸优选是C₄基团，例如烷基或烷氧基烷基，如2-甲基丙基或3-甲氧丙基。在式(II)的一个变化体中，R⁸是苯基或苄基，在任一情况中任选由-CN或由一或两种卤素(例如Cl)取代。

当aa^h是N取代的甘氨酸时，N取代例如是包含C₃-C₆烃基环的C₃-C₆烃基；所述烃基可以是饱和的，例如这些化合物的R⁴基团是环烷基，例如环戊基。

疏水性氨基酸可以是相同或不同的，例如选自具有上述式(A)或(B)的侧链的氨基酸，例如式(C)，(D)或(E)所示，及选自先前所述的亚氨基酸。本发明包括一类盐，其中有机硼酸如式(II)所示，相同或不同的疏水性氨基酸具有含有至多20个碳原子并通常含有至多13个碳原子的一个侧链，或者是亚氨基酸。疏水性氨基酸可具有如前述疏水性氨基酸的式(I)的X-E片段中包含的侧链。在含有式(II)酸的盐的一个亚类中，疏水性氨基酸是烃基或杂芳基，或者其包括烃基和杂芳基残基。烃基残基任选含有链内氧，它们可以被例如卤素(例如1，2或3个卤素原子)或羟基(但通常不超过一个羟基)取代。或者，疏水性氨基酸可以是脯氨酸或另一种亚氨基酸。

在某些变体中，R⁷含有一个疏水性氨基酸，其不是Pro或另一种亚氨基酸。在这种实施方案中，R⁷的疏水性氨基酸有一个前述式(A)或(B)所示的侧链[例如式(D)或(E)所示]。

aa^h可例如是一个天然疏水性氨基酸，例如Pro或Phe。

在某些实例中，X是R⁶-(CH₂)_p-C(O)-，R⁶-(CH₂)_p-S(O)₂-，R⁶-(CH₂)_p-NH-C(O)-或R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)-，其中p是0，1，2，3，4，5或6(优选0和1)，R⁶是H或者是5-13个成员的环基团，该基团任选由选自卤素，氨基，硝基，羟基，C₅-C₆环状基团，C₁-C₄烷基及含有链内氧和/或与5-13个成员的环基团通过链内氧连接的C₁-C₄烷基的1、2或3个取代物取代，前述烷基基团任选由选自卤素，氨基，硝基，羟基和C₅-C₆环状基团的一个取代物取代。更特别地，X是R⁶-(CH₂)_p-C(O)-或R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)-，p是0或1。所述5-13个成员的环状基团通常是芳环或杂芳环，例如是6个成员的芳环或杂芳环基团。在许多情况中，该基团不被取代。

X基团例如是(2-吡嗪)羰基，(2-吡嗪)磺酰基，及苄氧基羰基。

有机硼酸可以是一种蛋白酶抑制剂，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂。因此本发明包括多价金属的盐及凝固丝氨酸蛋白酶的有机硼酸抑制剂，例如凝血酶或因子Xa。这种有机硼酸例如是所述肽硼酸盐，特别是二肽和三肽，在任一情况，其在N末端氨基基团上可具有一个保护基(非氢X基团)。

在一类优选的硼酸中，其是抗血栓形成的并包括TRI 50c，所述酸具有一能结合凝血酶S1亚位点的中性基团以及一与该中性基团相连接的能结合凝血酶S2和S3亚位点的疏水性基团。所述酸例如式(III)所示：

其中：

Y包含一个基团，其与片段-CH(R⁹)-B(OH)₂一起对凝血酶的底物结合位点具有亲和性；

R⁹是由一或多个(例如1或2个)醚键中断的一个直链烷基基团，其中氧和碳原子的总数是3，4，5或6(例如5)，或者R⁹是-(CH₂)_m-W，其中m是2，3，4或5(例如4)，W是-OH或卤素(F，Cl，Br或I)。由一或多个醚键(-O-)中断的直链烷基例如可以是烷氧基烷基(一处中断)和烷氧基烷氧基烷基(两处中断)。R⁹在一个亚类化合物中是烷氧基烷基，例如含有4个碳原子的烷氧基烷基。

在一类硼酸中，Y通过一个肽键与-CH(R⁹)-B(OH)₂连接。这种酸可以如式(XII)所示：

其中

Y¹包含一个疏水性基团，其与氨基硼酸残基-NHCH(R⁹)-B(OH)₂一起对凝血酶的底物结合位点具有亲和性，R⁹如上述。

因此典型地，式(III)中符号Y表示的基团包含一个氨基酸残基(无论天然还是非天然的)，其结合凝血酶的S2亚位点，并且通过肽键与片段-CH(R⁹)-B(OH)₂连接，氨基酸残基是在N末端与结合凝血酶的S3亚位点的一个基团连接。

在一类式(III)的酸中，Y是任选N末端保护的二肽残基，其与凝血酶的S3和S2结合位点结合并且通过肽键与-CH(R⁹)-B(OH)₂连接，酸中的肽键任选及独立地是在N末端由C₁-C₁₃烃基取代的，C₁-C₁₃烃基任选含有链内氧或硫及任选由选自卤素、羟基和三氟甲基的一个取代物取代。当N末端保护基存在时，其可以是如上述的X基团(除了氢之外)。通常地，酸含有N末端未取代的肽键；在有N末端取代的肽键的情况中，取代物通常是1C-6C烷基。一类酸具有N末端保护基(例如X基团)和未取代的肽键。

在Y是二肽残基的情况中，S3结合氨基酸残基可以是(R)-构型和/或S2结合残基可以是(S)-构型。片段-NHCH(R⁹)-B(OH)可以是(R)-构型。然而本发明非限于这些构象的手性中心。

本发明因此包括这样的药物，其包含是凝血酶抑制剂，特别是选择性凝血酶抑制剂的具有中性P1(S1结合)基团的有机硼酸的盐例如金属盐。关于结合凝血酶的S3，S2和S1位点的基团的更多的信息，见例如TapparelliC et al，Trends Pharmacol.Sci.14：366-376，1993；Sanderson P et al，CurrentMedicinal Chemistry，5：289-304，1998；Rewinkel J et al，CurrentPharmaceutical Design，5：1043-1075，1999；及Coburn C Exp.Opin.Ther.Patents 11(5)：721-738，2001所述。本发明的凝血酶抑制性盐非限于在前一句中列出的出版物中描述的具有S3，S2和S1亲和性基团的那些。

是凝血酶抑制剂的有机硼酸，例如式(III)的酸，对凝血酶的Ki为大约100nM或更低，例如大约20nM或更低。

式(III)酸的一个亚类包含式(IV)的酸：

X是与N末端氨基基团键合的一个基团，可以是H以形成NH₂。X的性质不是关键的，但可以是上述特定的X基团。在一个实施例中，可以是提及的苄氧基羰基。

aa¹是具有一个烃基侧链的氨基酸残基，该侧链含有不超过20个碳原子(例如最多15个及任选最多13个碳原子)并包含具有最多13个碳原子的至少一个环状基团。在某些实施例中，aa¹的环状基团有5或6个环成员。例如aa¹的环状基团可以是芳基，特别是苯基。典型地，在aa¹侧链中有一或两个环状基团。某些侧链包含或由被一或两个5或6个成员的环取代的甲基组成。

更特别地，aa¹是Phe，Dpa或其完全或部分氢化的类似物。完全氢化的类似物是Cha和Dcha。

aa²是一个有4-6个环成员的亚氨基酸残基。或者，aa²是N末端由C₃-C₁₃烃基取代的Gly，例如由包含C₃-C₆烃基环的C₃-C₈烃基取代；烃基可以是饱和的，例如N末端取代物是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。含有一或多个不饱和键的烃基可以是苯基和由苯基取代的甲基或乙基，例如2-苯乙基，以及β，β-二烷基苯乙基。

一类产物例如包括其中aa²是式(V)的亚氨基酸残基的那些产物：

其中R¹¹是-CH₂-，CH₂-CH₂-，-S-CH₂-或-CH₂-CH₂-CH₂-，当环是5或6个成员时，该基团任选在一或多个-CH₂-基团由1-3个C₁-C₃烷基取代，例如以形成R¹¹基团-S-C(CH₃)₂-。例如这些亚氨基酸是铃兰氨酸，特别是(s)铃兰氨酸，更特别是脯氨酸。

从上所可知，一类非常优选的产物由其中aa¹-aa²是Phe-Pro的那些组成。在另一优选的类别中，aa¹-aa²是Dpa-Pro。在其它产物中，aa¹-aa²是Cha-Pro或Dcha-Pro。当然，也包括其中Pro由(s)-铃兰氨酸置换的相应的产物类别。

R⁹如式(III)所述。在一类化合物中(无论式(III)还是式(IV))，R⁹是式-(CH₂)_s-Z的一个基团。整数s是2，3或4，Z是-OH，-OMe，-OEt或卤素(F，Cl，I或者优选Br)。特别说明的是Z基团是-OMe和-OEt，尤其是-OMe。在一些实施例中，对所有Z基团而言s是3，事实上对所有式(III)或(IV)化合物而言均如此。特别地，R⁹基团是2-溴乙基，2-氯乙基，2-甲氧基乙基，4-溴丁基，4-氯丁基，4-甲氧基丁基，特别是3-溴丙基，3-氯丙基和3-甲氧基丙基。更优选地，R⁹是3-甲氧基丙基。在另一个实例中，2-乙氧基乙基是优选的R⁹基团。

因此，一类特异的盐由式X-Phe-Pro-Mpg-B(OH)₂尤其是式Cbz-Phe-Pro-Mpg-B(OH)₂所示酸的那些盐组成；也包括其中Mpg由具有另一个R⁹基团的一个残基置换和/或Phe由Dpa或另一个aa¹残基置换的这些化合物的类似物。

所述盐的aa¹基团优选是(R)构型。aa²基团优选是(S)-构型。特别优选的盐具有(R)-构型的aa¹及(S)-构型的aa²。手性中心-NH-CH(R¹)-B-优选是(R)-构型。商业制剂具有(R，S，R)排列中的手性中心，例如在Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH的盐的情况中：

Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg-OH

本发明包括Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg-OH(及式X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-boroMpg-OH所示其它化合物)的多价金属盐，其是至少90％纯的，例如至少95％纯。

在主要的术语中，本发明的盐可被认为是相应于上述有机硼酸与一种多价金属的碱，即具有二价或更高化合价的金属的碱的反应产物；然而所述盐非限于得自这种反应的产物，而且可以是通过另外途径获得的产物。所述金属尤其是：

1.第II族的金属(碱土金属)；

2.另一种药物可接受的二价金属，例如锌；或

3.第III族的金属。

一类盐例如包括二价金属盐。一类特别的盐包括钙盐。另一类特别的盐包括镁盐。再一类盐包括锌盐。

特别的盐是酸性硼酸盐，尽管实践中酸盐中可含有非常少比例的双去质子化的硼酸盐。术语“酸性硼酸盐”是指三角形的-B(OH)₂基团，其中B-OH基团之一是去质子化的，该术语也是指平衡中的相应的四面体形基团。酸性硼酸盐具有与单一去质子化一致的化学计量。

本发明进一步包括这样的产物(组合物)，其包含式(VI)所示的盐：

其中Mⁿ⁺是一个二价或三价金属阳离子，aa²’是式V所示亚氨基酸的残基，n根据具体情况是2或3，aa¹，X和R⁹如上述。如前所述，硼酸根可以包含一种四面体形种类。因此，所述产物具有与上式一致的化学计量。

本发明另外包括硼酸药物的钙盐和镁盐，其具有与式“(硼酸根^-)₂Ca²⁺”或“(硼酸根^-)₂Mg²⁺”所示的盐一致的化学计量。在这个类型的其它盐中，所述金属是锌。一类具有这种化学计量的盐包含式(IV)的硼酸的盐，例如下式的盐：

[Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)(O-)]₂Ca²⁺，

这种盐被称为TGN 167。本发明包括上式的盐，其中Ca²⁺由Mg²⁺代替。本发明还包括相应的锌盐。应理解上述表示产物的一种理论表示，其观测的化学计量未必完全精确是2∶1。在上式中，三角形表示的硼酸根代表三角形、四面体形或混和的三角形/四面体形的硼酸根。

特别例如是包含如下种类的产物：

(i)选自(a)式(IX)：X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的酸的种类，其中X是H或氨基保护基，特别是Cbz，(b)其硼酸根阴离子，及(c)前述的任何平衡形式(例如酐)；及

(ii)与所述种类组合的二价金属离子，特别是钙离子，所述种类和金属离子具有与理论上2∶1的种类∶金属化学计量一致的观测的化学计量。^-

然后考虑金属：

1.二价例如碱土金属(第II族金属)盐

二价金属的一个实例是钙。另一种合适的二价金属是镁。本发明还涵盖了锌。二价金属通常以硼酸∶金属基本上为2∶1的比率使用，以达到优选的一价硼酸根基团。本发明还涵盖了含有二价金属的混合物例如碱土金属混合物的盐。

本发明还涉及包含可由(VII)表示的盐的产物：

其中M²⁺是一种二价金属阳离子，例如碱土金属或锌阳离子，aa¹，aa²’，X和R⁹如上述，本发明还涉及包含其中硼酸根基团的两个羟基基团均是去质子化的盐及这种盐的混合物的产物。如前所述，硼酸根可以包含一种四面体形种类。

2.第III族金属

合适的第III族金属包括铝和镓。本发明还涵盖了含有第III族金属的混合物的盐。

本发明包括包含式(VIII)的盐的产物：

其中M³⁺是第III族的金属离子，aa¹，aa²’，X和R⁹如上述，本发明还包括包含其中硼酸根基团的两个羟基均是盐形式的盐及这种盐的混合物的产物。如前所述，硼酸根包含一种四面体形种类。

固体形式的盐可包含一种溶剂，例如水。本发明还包括一类产物，其中盐基本是无水的。本发明还包括是水合物的一类盐。

合成方法I

1.肽/肽模拟物的合成

硼酸肽包括例如Cbz-D-Phe-Pro-BoroMpg-O频哪醇的合成是本领域技术人员熟知的，并在现有技术领域已经加以描述，包括Claeson et al(US5574014及其它)和Kakkar et al(WO 92/07869及同族专利，包括US5648338)。Elgendy et al Adv.Exp.Med.Biol.(USA)340：173-178，1993；Claeson，G.et al Biochem.J.290：309-312，1993；Deadman et al J.EnzymeInhibition 9：29-41，1995及Deadman et al J.Med.Chem.38：1511-1522，1995对此也加以了描述。

在手性B末端碳S或R构型的立体选择性合成可以使用确定的方法学进行(Elgendy et al Tetrahedron.Lett.33：4209-4212，1992；WO 92/07869及同族专利，包括US 5648338)，使用(+)或(-)-蒎二醇作为手性定向物(chiraldirector)(Matteson et al J.Am.Chem.Soc.108：810-819，1986；Matteson et alOrganometallics.3：1284-1288，1984)。另一种方法是溶解必备的氨基硼酸酯中间体(例如Mpg-BO频哪醇)以选择性获得希望的(R)-异构体并将其与二肽基团(例如Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro，与Cbz-D-Phe-L-Pro相同)偶联，这将形成所述分子的剩余物。

读者还可以参考本说明书中先前提及的其它现有文献，例如Adams等的美国专利。

所述硼酸肽最初可以硼酸酯形式合成，特别是具有二醇的酯。如下文所述，这种二醇酯可以转变为肽硼酸。

2.酯至酸的转化

可以将一种肽硼酸酯如Cbz-(R)-Phe-Pro-BoroMpg-O频哪醇水解以形成相应的酸。

将式(I)所示肽硼酸的二醇酯转变为酸的一种新技术包括将该二醇酯溶解于醚尤其二烷基醚中，由此溶解的二醇与一种二醇胺例如二烷醇胺反应形成沉淀产物，回收该沉淀，将其溶解于极性有机溶剂中并将由此溶解的产物与一种水性介质例如水性酸反应，形成肽硼酸。所述硼酸可以从得自反应的混合物的有机层中回收，例如通过除去溶剂进行，如通过在真空下蒸发或蒸馏除去溶剂。二醇酯与二醇胺之间的反应可以在例如回流下进行。

二醇的性质不是关键的。可以提及的合适的二醇是脂肪族和芳族化合物，其具有在相邻碳原子或在被另一个碳取代的碳原子上被取代的羟基基团。也就是说合适的二醇包括具有链内或环内由至少两个相连碳原子分开的至少两个羟基基团的化合物。一类二醇包含由两个羟基基团精确取代的烃。这种二醇是一种是频哪醇，另一种是蒎二醇；还可以提及的是新戊二醇，1，2-乙二醇，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，2，3-丁二醇，1，2-二异丙基乙二醇，5，6-癸二醇和1，2-二环己基乙二醇。

二烷基醚的烷基基团优选地具有1，2，3或4个碳原子，并且所述这些烷基基团可以相同或不同。一种举例性的醚是二乙醚。

二烷醇胺的烷基基团优选地具有1，2，3或4个碳原子，并且所述这些烷基基团可以相同或不同。一种举例性的二烷醇胺是二乙醇胺。二乙醇胺/硼酸反应产物在室温于水中水解，水解速率可通过加入酸或碱而加速。

极性有机溶剂优选地是CHCl₃。其它例子通常为多卤化烷和乙酸乙酯。原则上除了醇以外的任何极性有机溶剂均是可接受的。

酸水溶液合适地为pH为1的强无机酸，如盐酸。

与酸反应后，反应混合物合适地用例如NH₄Cl或另一种弱碱洗涤。

具体程序的例如以下所述：

1.将所选择的肽硼酸的频哪醇或蒎二醇酯溶解在二乙醚中。

2.加入二乙醇胺并将混合物在40℃回流。

3.除去(过滤)沉淀产物，用二乙醚或除了醇以外的另一种极性有机溶剂洗涤(通常几次)，并干燥(例如通过真空蒸发)。

4.将干燥产物溶于除了醇之外的一种有机溶剂例如CHCl₃中，加入酸或碱水溶液，例如盐酸(pH 1)，在室温搅拌混合物例如1小时。

5.取出有机层并用NH₄Cl溶液洗涤。

6.蒸发掉有机溶剂并干燥残余的固体产物。

上述方法导致形成可被方便地称作式(I)的肽硼酸的“二醇胺加成物”，特别是具有二乙醇胺的这种加成物，本发明包括这种加成物。这种加成物的分子结构还未知，它们可能包含一种化合物，该化合物中二醇胺的两个氧和氮均与硼配位；它们可包含离子。然而所述加成物被认为是酯。本发明包含的一种特定的新产物是可通过式(IX)所示化合物、特别是(R，S，R)-TRI 50c的频哪醇或蒎二醇酯与二乙醇胺的反应获得的产物，即新产物是(R，S，R)-TRI 50c/二乙醇胺“加成物”，其中所述酸是(R，S，R)-TRI50c。

本发明的二醇胺可以是包含如下物质的一种组合物：

(i)式(X)所示化合物

其中X是H或一个氨基保护基，硼原子任选额外与氮原子配位，末端氧的化合价状况是开放的(它们可以附于另一个共价键上，离子化为-O^-，或者有一些其它的例如中间体状态)；及处于键合中。

(ii)式(XI)所示化合物

其中氮原子和两个氧原子的化合价状态是开放的。应意识到式(X)所示种类的末端氧原子和式(XI)所示种类的氧原子可以是相同的氧原子，在这种情况中式(XI)的种类与式(X)的种类形成一种二醇酯。

应理解的是前述技术包括一种回收有机硼酸产物的方法，所述方法包括提供一种溶解于溶剂中的混合物，该混合物包含可溶形式的有机硼酸和具有两个羟基基团和一个氨基基团的化合物(即二醇胺)，使得所述有机硼酸与二醇胺反应形成沉淀，回收所述沉淀。可溶形式的有机硼酸可以是如上所述的一种二醇酯。所述溶剂可以是如上所述的一种醚。所述有机硼酸可以是本说明书中提及的有机硼酸之一，例如其可以是式III所示的有机硼酸。本段中所述的方法是新的并且形成了本发明的一个方面。回收方法是过滤。

二醇胺与可溶形式的有机硼酸之间的反应是在升高的温度下适当进行的，例如在回流下进行。

本发明的另一方面是回收有机硼化合物的方法，所述方法包括：

提供于醚中可溶形式的一种有机硼酸，例如一种药物如式(III)或(IV)所示的化合物；

形成于醚中的可溶形式的一种溶液；

将所述溶液与一种二烷醇胺组合，使得二烷醇胺与可溶形式的有机硼酸反应形成一种不溶的沉淀；及

回收所述沉淀。

前一段落中的术语“可溶”是指在反应介质比沉淀产物中基本上更可溶的化合物。在该方法的变化方法中，所述醚由甲苯或另一种芳族溶剂代替。

上述二乙醇胺沉淀技术例如是另一种新方法，这是从醚溶液中回收肽硼酸的频哪醇或蒎二醇酯的一种方法，包括将二乙醇胺溶解于溶液中，使得沉淀形成并回收该沉淀。本发明涵盖了这种方法的变化方法，其中使用除了频哪醇或蒎二醇之外的另一种二醇。

所述沉淀物，即“加成物”，可以被转变为游离有机硼酸，例如通过将其与酸接触而进行。所述酸可以是一种水性酸，例如上述一种水性无机酸。所述沉淀可例如溶解于有机溶剂中，之后再与所述酸接触。

本发明因此提供了一种生产有机硼酸的方法，包括将其二醇胺反应产物转变为酸。

得自前两段所述方法的酸可以被转变为该酸与一种多价金属的盐，该盐随后被配制成一种口服剂型的药物组合物。

3.盐合成

通常地，所述盐可以通过将相应的硼酸与一种相应的碱接触来制备，例如金属的氢氧化物(或者例如可以使用金属的碳酸盐)。有时更便利地是将所述酸与一种相应的金属醇盐(例如甲醇盐)接触，为此相应的烷醇是一种合适的溶剂。所述盐例如是酸式盐(一个-BOH质子被置换)，为产生这些盐，所述酸和碱以基本适当的化学计量反应。因此惯例的酸∶碱摩尔比率基本为n∶1，其中n是碱的阳离子的化合价。

在一个程序中，将肽硼酸于可与水混溶的有机溶剂例如乙腈或醇(例如乙醇、甲醇、丙醇例如异丙醇，或另一种烷醇)中的溶液，与碱的水溶液组合。使酸和碱反应并回收盐。该反应典型地在环境温度(例如15-30℃，例如15-25℃)进行，但可以使用升高的温度，例如直至反应混合物的沸点，但更常见的是较低的温度，例如至多40℃或50℃。静置反应混合物或者搅动(通常是搅拌)。

酸和碱的反应时间不是关键的，但已发现希望的是保持反应混合物至少一小时。一至两个小时的反应时间通常是合适的，当然也可以采用更长的反应时间。

盐可以从反应混合物中经任何合适的方法如蒸发或沉淀而回收。沉淀可以通过加入过量的可混溶剂而进行，所述盐在该可混溶剂中溶解度有限。在一个优选的技术中，盐是通过将反应混合物抽真空干燥而回收。之后优选将盐纯化，例如通过将盐重新溶解之后过滤所得溶液并将其干燥，例如抽真空至干燥而纯化。重新溶解可以使用水例如蒸馏水进行。然后将盐进一步纯化，例如以除去剩余的水，这可以通过在合适的溶剂，优选乙酸乙酯或THF中进一步重新溶解，随后蒸发至干燥而进行。纯化程序可以在环境温度进行(即15-30℃，例如15-25℃)，或者在适当升高的温度例如不超过40℃或50℃进行；例如盐可以通过搅动溶解于水和/或溶剂中，加温或不加温至例如37℃。

本发明还包括一种干燥本发明的盐及其它肽硼酸盐的方法，所述方法包括将它们溶解于有机溶剂例如乙酸乙酯或THF中，然后例如通过抽真空而蒸发至干燥。

通常用于纯化盐的优选的溶剂是乙酸乙酯或THF，或者也许是另一种有机溶剂。

合成Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH的多价金属盐的一般程序如下：

将Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH(20.00g，38.1mM)在室温经搅拌溶解于乙腈(200ml)中。向此溶液中加入必要的于蒸馏水(190ml)中的碱溶液[对二价金属是0.1M溶液；对三价金属是0.67M溶液]。使所得澄清的溶液例如通过静置或搅拌反应一段时间，在任一情况中均为1-2小时。典型地在室温进行反应(例如15-30℃，例如15-25℃)，但或者可以升高温度(例如至多为30℃，40℃或50℃)。然后将反应混合物在真空下抽真空至干燥，温度不超过37℃，典型地产生一种白色易碎的固体或一种油状/粘液。将该油状/粘液重新溶解于最少量的蒸馏水(200ml-4L)中，典型地加温(例如至30-40℃)，通常至多2小时。通过滤纸过滤溶液并抽真空至干燥，溶液温度也不超过37℃，或者冻干。所得产物在真空下干燥过夜以正常产生一种白色的易碎固体。如果产物是以油状或粘液状态存在的，则然后将其溶解于乙酸乙酯中并抽真空至干燥，产生白色固体。该白色固体典型是一种粗糙的非晶质粉末。

在前述一般程序的变体中，乙腈由另一种与水可混溶的有机溶剂代替，所述溶剂特别是如上述醇，特别是乙醇、甲醇、异丙醇或另一种丙醇。

上述合成程序也可用于制备本发明所述TRI 50c及其它硼酸的碱金属盐，例如式(III)所示的那些。这些碱金属盐用作起始物进行多价金属盐的另一种合成，其中不便于从酸中直接合成，因为在多价金属氢氧化物的情况中，其在选择的进行盐形成的反应介质中的可溶性较低(例如氢氧化锌)。当碱金属盐作为起始物时，用于生产碱金属盐的反应的化学计量通常调节为1∶1，以制备一种酸式盐。在这种从碱金属盐尤其是钠盐或另一种钾盐“间接”合成中，溶液中硼酸碱金属盐与相关的金属的盐(通常为具有药物可接受的阴离子例如氯的盐)接触。“靶”金属(例如锌)的盐典型以n∶1的化学计量(硼酸∶靶金属)应用，其中n是金属的化合价。然后回收硼酸的多价金属盐，例如通常将其沉淀出(当多价金属盐在反应介质中的可溶性低于碱金属盐时)。然后将所得沉淀例如通过过滤从液体中分离出并纯化。

从相应的碱金属盐中制备多价金属盐是一种新技术。本发明还包括碱金属盐及其水溶液。碱金属盐与相应的酸相比更有利，其对降解更具有抗性(其硼酸肽基团与相应的游离酸相比降解趋向更低)。

本发明还提供了肽硼酸药物例如凝血酶抑制剂或式(I)的酸在生产本发明所述盐中的应用。本发明还包括一种制备产物的方法，所述方法包括将式(I)，(II)，(III)，(IV)或(IX)的肽硼酸药物与能生产这种盐的碱接触而进行。

用于制备药物制品的肽硼酸典型具有GLP或GMP性质，或者符合GLP(《药品非临床研究质量管理规范》)或GMP(《药品生产质量管理规范》)；本发明包括这种酸。

相似地，所述酸通常是无菌和/或适于药物学应用的，本发明的一方面涉及一种组合物，其是无菌或适于药物学应用的或者包括这二者，并且包含式(IV)所示的肽硼酸。这种组合物可以是微粒形式或者是液体溶液或分散液形式。

中间体酸可以是分离形式的，本发明包括这种分离的酸，特别是如式(IX)所示肽硼酸的分离的酸：

X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂(IX)

其中X是H(以形成NH₂)或一个氨基保护基。

提供中间体酸的一种典型方式是作为微粒组合物，该组合物主要由这种肽硼酸组成，本发明包括这些组合物。肽硼酸通常占该组合物重量的至少75％，典型为占该组合物重量的至少85％，例如占组合物重量的至少95％。

提供中间体酸的另一种典型方式是作为一种液体组合物，该组合物由式(II)所示肽硼酸和肽硼酸溶解或悬浮于其中的一种液体载体组成或基本由式(II)所示肽硼酸和肽硼酸溶解或悬浮于其中的一种液体载体组成。所述液体载体可以是水性介质，例如水，或醇如甲醇、乙醇、异丙醇或另一种丙醇，另一种烷醇或前述介质的混合物。

中间体酸的组合物通常是无菌的。该组合物可含有细碎粒形式的肽硼酸以便于进一步加工。

4.立体异构体的分离

肽硼酸酯或合成的中间体氨基硼酸酯的立体异构体可以通过例如任何已知方式拆分。特别地，硼酸酯的立体异构体可以通过HPLC拆分。

合成方法II-化合物的稳定性和纯度

现有的出版物教导有机硼酸由于C-B键的氧化而被降解，例如参见Wu等人(如上所述)。对TRI 50c盐的早期工作证实这些盐和/或其制备过程中的中间体是略微不稳定的，其不稳定程度为盐中发现含有不含硼的杂质，称为杂质I，其显然由于C-B键裂解所产生。作为一类物质的盐比游离酸对这种降解而言要明显更稳定。

这些早期的TRI 50c盐是通过本说明书实施例4和5描述的通用方法制备的。杂质I具有如下结构：

例如用更特别地在实施例13中描述的反相方法获得的HPLC色谱产生如下关于根据本文实施例4和5的程序制备的TRI 50c单钠盐的数据：

	名称	RT(min)	面积	高度	量	单位	％面积
								1	苯甲醛	6.145	2487	224			0.39
2	杂质I	11.022	6379	539			1.00
								3	TRI50c	11.679	628872	51108	946,063	ug/mL	98.61

纯化具有杂质I的盐的尝试没有成功，并且看起来，例如杂质I是在HPLC柱中从盐产生的。

通过如下方法实现了根据实施例5和9的通用程序制备的盐的相对手性纯度，所述方法为经HPLC拆分称为TRI 50b的TRI 50c的频哪醇酯，并将如此拆分的TRI 50b转化成盐。这种HPLC程序对于正常的市售药物生产是不可接受的。

进一步发现在“氨基硼酸程序”题目下总结的现有技术的合成当用于合成TRI 50c或其酯时导致形成称为杂质IV的杂质：

把TRI 50c和杂质IV分离的尝试没有成功。同样的尝试即分离TRI 50c盐及酯和杂质IV的相应盐和酯同样没有成功。如果使用所述的现有技术的合成，已经尝试的纯化技术没有一个能防止杂质IV的存在。

合成方法II-方法

本发明解决了有机硼酸化合物中控制C-B键裂解等问题，并以商业规模提供了TRI 50c以及其它有机硼酸的手性纯化的盐。在此方面，发现C-B键似乎通过一种非氧化机制裂解，这一过程在许多溶剂、包括水例如含水酸和碱等的存在下发生。

还发现可以使用手性选择性沉淀以高纯度回收有机硼酸。

因此C-B键裂解(及因此特别是杂质I的产生)可以如下控制：

●当加工时需要溶剂时且乙腈具备所需的溶解力时，选择乙腈作为溶剂，特别是当希望或者需要极性溶剂时选择乙腈。

●避免与水的过度接触。

因此，在TRI 50c盐生产方面，本发明包括包含如下一、二或三个特征的方法：

(i)通过使用二乙醇胺的手性选择性沉淀拆分TRI 50c的(R，S，S)和(R，S，R)差向异构体，并且方便地但不是必需地使用酯形式的TRI50c例如频哪醇酯作为起始材料；

(ii)控制例如通过如此沉淀获得的TRI 50c二乙醇胺酯的水解时间和/或条件，以控制C-B键断裂；

(iii)使用乙腈作为例如由这种水解获得的TRI 50c的溶剂，以将TRI50c与碱反应形成盐。另一种有利的溶剂可以是四氢呋喃。

作为一种任选的、或甚至是独立的第四个特征，TRI 50c盐可以通过使用乙腈经共沸干燥而干燥。

认为C-B键裂解可经一亲核机制发生，因此本发明包括这样的方法，其中亲核攻击的机会被降至最低。

上述四个特征，或者其任何一个、二个或三个，可以适于生产和加工其它硼酸化合物，特别是式(I)的酸及其衍生物(例如酯和盐)。

因此，在一个方面，本发明提供了二乙醇胺经选择性沉淀来拆分式(I)的硼酸的非对映异构体的用途。起始材料可以是酸(I)或其能够形成硼酸的二乙醇胺酯的衍生物。所述沉淀选自具有(R)构型的手性中心C^*的酸作为沉淀物。沉淀物可以被回收并转化成相应的硼酸或其盐。盐可以制备成药物制剂。

为了优化手性纯度和收率，二乙醇胺的用量可以是基于具有(R)构型的手性中心C^*的硼酸的起始当量为约1.25±0.1当量。

起始硼酸或酸衍生物可以例如包含50％-60％的具有(R)构型的手性中心C^*的分子以及40％-50％的具有(S)构型的手性中心C^*的分子。

该方法为硼酸(I)及其衍生物、特别是盐作为药物的商业化提供了途径。因此本发明提供了使用硼酸(I)及其衍生物的商业规模产物及活性。

在一个实施方案中，本发明提供了分离式(I)的硼酸的非对映异构体的方法，包括：

在二乙醚溶液中组合(A)选自硼酸(I)及其酯的硼酸类物质，所述硼酸类物质包括具有(R)构型手性中心C^*的分子和具有(S)构型手性中心C^*的分子，和(B)二乙醇胺，所述二乙醇胺的量基于具有(R)构型手性中心C^*的硼酸类物质约为1.25±0.1当量，并混合以形成混合物；

促使或使得所述硼酸类物质与二乙醇胺反应直至形成沉淀；以及

回收沉淀。

当起始材料为酯时，其可以是硼酸与选自如下一组的醇的酯，所述的组由这样的醇组成：所述的醇的单电势(sole potential)电子供体杂原子是氧，其在硼酸酯中相应于酯官能团的氧。

在一些方法中，二乙醇胺的量基于手性中心C^*为(R)构型的硼酸物质为1.2-1.3当量。

本发明包括如下方法，其中硼酸酯为硼酸和二醇特别是没有空间位阻的二醇的酯。这样的二醇的例子为频哪醇、新戊二醇、1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、2，3-丁二醇、1，2-二异丙基乙二醇或5，6-癸二醇。特别的二醇是频哪醇。

通过加热混合物至一升高的温度可以促使硼酸物质与二乙醇胺反应，例如混合物可以被加热回流，例如至少10小时。

沉淀可以通过过滤回收。回收的沉淀可以用二乙醚洗涤。回收的沉淀，当需要洗涤时在洗涤后，溶解于选自CH₂Cl₂和CHCl₃的溶剂中，并且通过将所得溶液与二乙醚组合而再沉淀。一特别的溶剂是CH₂Cl₂。

回收的沉淀可以转化为式(I)的酸，适当地通过水解进行，例如通过将沉淀溶解在选自卤代烃及其组合的有机溶剂种，并用一种含水液体搅拌溶液，例如pH低于3的含水酸，因而将溶解的沉淀转化为式(I)的酸，并通过蒸发回收式(I)酸。有机溶剂可以是CH₂Cl₂或CHCl₃。特别的溶剂是CH₂Cl₂。在一些方法中，有机溶剂进一步从回收的式(I)酸中蒸发。

本发明包括这样的方法，其中硼酸(I)的酯，特别是二乙醇胺酯，以控制C-B键断裂的方式水解。特别地，这涉及在选择的温度下限制水解时间。在二乙醇胺酯水解的情况中，水解在室温或更低的温度下适当地进行不超过大约30分钟短，例如不超过20分钟，并且最佳为大约20分钟。

因此上一段中所称的回收的沉淀可以使用一种含水的酸水解，特别是2％的盐酸或另一种相似pH的无机酸，在大约室温下进行不超过30分钟或更短。适当地，沉淀溶解在非亲核性有机溶剂中(例如卤代烃或卤代烃混合物，例如CH₂Cl₂)并将所得溶液与所述含水酸接触如前述的时间。沉淀因而被水解形成式(I)的游离酸，其保留在有机溶剂中。可以从含水介质中分离有机溶剂然后蒸发以获得式I的固体酸。

有多种方法干燥例如前段所述获得的式(I)酸。在一类方法中，式(I)酸当其在有机溶剂中时通过将溶剂与吸湿固体接触而被干燥。

本发明包括这样的方法，其中式(I)酸当在有机溶剂中时用一种含水铵盐洗涤。

手性纯化的硼酸可以被转化为其药物可接受的碱加成盐，特别是通过将所述酸溶解在乙腈中，将所得溶液与一种药物可接受的碱的含水溶液或悬浮液接触，并使碱和酸反应，然后蒸发干燥获得蒸发残留物而获得。使酸和碱反应的步骤可以包括在不超过35℃，并通常不超过30℃，例如不超过25℃下搅拌酸的乙腈溶液和碱的含水溶液或悬浮液的组合；最佳的温度是室温，其中反应时间2小时可能是合适的。所述方法可以进一步包括：

(i)将蒸发残留物再溶解于乙腈中并蒸发干燥所得溶液；及

(ii)按需要重复步骤(i)以获得干燥的蒸发残留物。

在一些方法中，干燥的蒸发残留物溶解于乙腈或四氢呋喃中形成溶液，将该溶液与二乙醚和脂肪族或脂环族溶剂的3∶1-1∶3v/v的混合物组合(例如以足够慢的速度慢慢地加入以避免形成块)形成沉淀，将所述溶液以1∶5-1∶15v/v的比率(溶液∶混合物)加入二乙醚/(环)脂肪族溶剂混合物中。回收沉淀并从回收的沉淀中除去一些或基本上所有残留的溶剂，同时保持温度不超过35℃，例如在减压下除去。本发明包括这样的方法，其中开始干燥过程的温度是大约10℃，在过程中提高到35℃。脂肪族或脂环族溶剂可以具有6、7或8个碳原子；溶剂可以是烷，例如正烷，例如正庚烷。一些反应可以在环境温度下进行，其可以例如是15-30℃，例如20-30℃；有时环境温度可以是室温。

本发明制备的盐可含有痕量的脂族或脂环族溶剂，例如低于0.1％，特别是低于0.01％，例如低于约0.005％的量。

在制备盐的方法中，碱可以包含n价的阳离子，且可以以约n∶1的化学计量(硼酸∶碱)使用。在特定的方法中，碱是碱金属或碱土金属碱，例如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物。可提及的是氢氧化钠。另一种可提及的碱是氢氧化钙。本发明包括这样的方法，其中碱是氢氧化钠，干燥蒸发残留物溶解于乙腈中。本发明包括这样的方法，其中碱是氢氧化钙，干燥蒸发残留物溶解于四氢呋喃中。

本发明不限于获得式(I)的硼酸(例如作为其酯)的方法。然而，在本发明主题的一类中，式(I)酸具有式-(CH₂)_s-O-R³的R¹基团，其中R³是甲基或乙基，s独立地是2、3或4，式(I)酸经式(XXV)中间体而制备：

(HO)₂B-(CH₂)_s-O-R³    (XXV)，

该中间体通过硼酸酯与合适的1-金属烷氧基烷烃反应而制备。

本发明的一个新方面包含式(XXV)中间体。

式(XXV)中间体可以通过将1-金属烷氧基烷烃与硼酸酯反应而形成式(XXV)的化合物，其中烷氧基烷烃如式-(CH₂)_s-O-R³。

应理解的是上述方法提供了制备可用式R^Z-O-R^Y-B(OH)₂表示的烷氧基烷基硼酸的通用程序。这种烷氧基烷基硼酸可以转化成氨基硼酸酯，氨基硼酸酯可以在其氨基基团被衍生以形成与另一基团连接的酰胺键。换句话说，氨基硼酸酯可以被转化成硼酸肽。以下非限制性地参照式(XXV)的化合物进一步描述所述方法。

反应的起始材料可以是金属烷氧基烷烃，例如Grignard试剂，得自式Hal-(CH₂)_s-O-R³的1-卤代烷氧基烷烃(其中Hal是卤素)和硼酸酯。金属特别是镁。另一种金属是锂，在此情况下金属试剂可以通过将1-卤代烷氧基烷烃与丁基锂反应而制备。当方法包括从卤代烷氧基烷烃制备金属试剂时，所述卤代烷氧基烷烃可以是氯烷氧基烷烃；相应的溴化合物也可以使用。为制备Grignard试剂，可以将镁与卤代烷氧基烷烃反应。

合适的硼酸酯是单官能和二官能醇的酯(例如EtOH，MeOH，BuOH，频哪醇，乙二醇，蒎二醇等)。例如，酯可以是式B(OR^a)(OR^b)(OR^c)，其中R^a、R^b和R^c是C₁-C₄烷基且可以彼此相同。

以甲氧基丙烷作为烷氧基烷烃为例说明制备式(XXV)中间体的例子：

反应合适地在有机溶剂例如THF中进行。

当终产物不是TRI 50c或其衍生物(盐、酯等)时，上述制备烷氧基烷基硼酸的程序避免了产生杂质IV(如上所述)或其类似物。因此，所述程序提供了独特的制备未被杂质IV污染的TRI 50c、其酯和盐的途径，以及制备未被类似于杂质IV的杂质污染的硼被烷氧基烷基α-取代的其它氨基硼酸的途径。

烷氧基烷基硼酸，即可以由式R^Z-O-R^Y-B(OH)₂表示的化合物可以通过任何合适的程序例如现有技术中已知的程序转化成氨基硼化合物，例如硼酸肽。将烷氧基烷基硼酸制备成氨基硼酸酯并将氨基硼酸酯转化成肽硼酸酯的反应方案以本说明书实例开始部分的TRI 50c的合成为例说明。如果希望，该反应方案可以进行修改，例如二乙醇胺沉淀和后续的步骤可以被省略和/或可以更换试剂。例如频哪醇可以用另一种二醇替换。LDA是一种非亲核性强碱，其可以用另一种这样的碱替换。其它的例子包括但不限于二异丙基酰胺锂、2，2，6，6-四甲基哌啶锂、1-锂-4-甲基哌嗪，1，4-哌嗪二锂、双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂、双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠、双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾、异丙基氯化镁、苯基氯化镁、二乙酰胺锂和叔丁氧基钾。反应可以在任何合适的溶剂中进行，其中实例中使用了正庚烷，其可以被另一种惰性非极性溶剂替换，例如另一种脂族或脂环族溶剂，例如烷烃如正烷烃。

因此，本发明包括制备式(XXI)的氨基硼酸酯的方法：

其中

R^X是H或不妨碍合成的一个取代基；

R^Y是链烯基；和

R^Z是烷基，

所述方法包括将1-金属烷氧基烷烃与硼酸酯反应以形成式R^Z-O-R^Y-B(OH)₂的硼酸，酯化该酸，将酯化的酸在强碱存在下与CH₂Cl₂和ZnCl₂接触，将所得产物与LiHMDS接触，随后将所得产物与氯化氢接触。

所述产物不含式(XXII)的污染物：

H₂N-C(R^X)(R^Y)-B(OH)₂    (XXII)

氨基硼酸酯(XXI)可以与氨基酸或肽(在每种情况下它们可以是合适地被保护的)反应以形成肽硼酸酯。因此，本发明广义上包含式(XXIII)的肽硼酸：

Q-CO包含至少一个氨基酸残基；

R^X是H或不妨碍合成的一个取代基；

R^Y是链烯基；

R^Z是烷基，

该有机硼酸不含式(XXIV)的杂质：

本发明还包括式(XXIII)酸的衍生物(例如酸或碱加成盐、酯)，其不含式(XXIV)杂质或其衍生物。

R^Y和R^Z的准确性质取决于终产物的性质，并且不是本方法或其益处的一部分。

从上述内容应理解的是上述方法可用于生产所述的有机硼酸盐。不需要在一个操作中或在同一位点进行依次的步骤：它们可以如此进行或者不同的方法(整个合成的不同部分)可以做时间和/或空间的分配。特别的终产物盐是例如TRI 50c的单钠盐、单锂盐、半钙盐和半镁盐。

通常，反应可以合适地用非亲核性溶剂进行。当存在亲核性溶剂时，例如当水解二乙醇胺酯时，优选进行最少的接触。

高纯度产物

本发明的“高纯度产物”特别包括例如通过本发明方法获得的(具有根据本发明方法获得的产物的特性的)硼酸、二乙醇胺酯及盐。本发明还包括通过本发明方法直接或间接获得的产物。

本发明的特别产物是式(I)的硼酸的碱加成盐，其具有根据本文方法制备时这种盐的手性纯度。其它产物是式(I)的硼酸的碱加成盐，其具有根据本文方法制备时这种盐的纯度。

产物性质通过前述描述和下述实施例会变得明显。另外，本发明的产物在权利要求书中描述。特别应注意的是实施例28的数据，其表明本发明的方法可以显著地获得不含HPLC可检出的杂质的终产物盐。在其它情况下，盐基本上不含杂质，例如根据反相(RP)HPLC峰面积百分比，至少98％纯，更通常至少99％纯，例如至少99.5％纯。根据反相HPLC峰面积百分比，盐可以至少99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％或99.9％纯。合适的RP HPLC程序符合实施例28的参考文件1和/或参考文件2和/或参考文件3。本发明还包括基本上不含杂质I及类似物的产物，不含杂质IV及类似物的产物，及含有痕量非极性溶剂例如正庚烷的产物。根据GC-headspace色谱确定痕量非极性溶剂可以是低于0.2％，0.1％，0.05％，0.01％或0.005％。

本发明也包括含有少于410ppm乙腈的盐。

一些盐含有少于10,000ppm、5000ppm、1000ppm或500ppm的杂质。

本发明产物的应用

本发明的盐可用于制剂中，特别是用于口服制剂，以给予盐的药物部分。典型地，它们用作蛋白酶抑制剂。

凝血酶抑制剂的盐

如上所述，本发明揭示的是硼酸的盐，其是凝血酶抑制剂。例如式(IV)的硼酸的盐是强力的凝血酶抑制剂。它们因此用于抑制凝血酶。因此本发明提供了具有控制淤血及尤其抑制凝集的潜力的凝血酶抑制性化合物，例如在治疗或预防心肌梗塞后的继发事件。所述化合物的医学应用可以是预防性的(包括治疗血栓形成以及预防血栓形成的发生)以及治疗性的(包括预防血栓形成再次发生或继发血栓形成事件)。

当需要抗凝血酶原制剂时可以应用所述凝血酶抑制性盐。另外，已经发现所述盐可通过治疗或预防用于治疗动脉血栓形成。所揭示的凝血酶抑制性盐因此示出可治疗或预防动物包括人的血液和组织中血栓形成及血凝过快。术语“血栓形成”包括例如衰弱性血栓形成、动脉血栓形成、心内血栓形成、冠状动脉血栓形成、匐行性血栓形成、传染性血栓形成、肠系膜血栓形成、胎盘血栓形成、蔓延性血栓形成、外伤性血栓形成及静脉血栓形成。

已知血凝过快可导致血栓栓塞性疾病。

可以用本发明的化合物治疗或预防的静脉血栓栓塞例如包括静脉阻塞、肺动脉阻塞(肺栓塞)、深部静脉血栓形成、与癌症和癌症化疗相关的血栓形成、继发于具有血栓形成倾向的疾病如蛋白C缺乏、蛋白S缺乏、抗凝血酶III缺乏及因子V Leiden的血栓形成、及得自获得性血栓形成倾向的疾病如系统性红斑狼疮(炎症性结缔组织疾病)的血栓形成。对于静脉血栓栓塞而言，本发明的化合物用于保持留置导管的开放性。

可以用本发明的化合物治疗或预防的心源性血栓栓塞例如包括血栓栓塞性中风(导致与脑供血不足相关的神经学病变的分离血栓)、与心房纤颤(快速的、不规律的上部心房肌纤维颤搐)相关的心源性血栓栓塞、与修复的心脏瓣膜如人工心脏瓣膜相关的心源性血栓栓塞、及与心脏疾病相关的心源性血栓栓塞。

包含动脉血栓形成的病症例如包括不稳定性绞痛(胸部源于冠状动脉的严重的压榨性疼痛)、心肌梗塞(由于血供不足引起的心肌细胞死亡)，缺血性心脏病(由于血供阻塞(如动脉狭窄)所致局部缺血)、在经皮穿刺冠状动脉成形术期间或之后的再闭塞、在经皮穿刺冠状动脉成形术后再狭窄、冠状动脉旁路搭桥术的闭塞、及阻塞性脑血管疾病。就动静脉(混和的)血栓形成而言，本发明的抗血栓形成化合物也用于保持动静脉支路的开放性。

可以提及的与血凝过快及血栓栓塞性疾病血管的其它病症继发于或获得自肝素辅助因子II的缺乏、循环抗磷脂抗体(狼疮抗凝血剂)的缺乏、高半胱氨酸血症、肝素诱导的血小板减少症及纤维蛋白溶解缺陷。

可以提及的特殊用途包括治疗性和/或预防性处理静脉血栓形成及肺栓塞。本发明抗血栓形成产物(特别是式IV的硼酸的盐，例如TRI 50c的盐)的优选用途包括：

●预防静脉血栓栓塞(例如深部静脉血栓形成和/或肺栓塞)。例如包括经历整形外科手术如全部髋关节置换、全部膝关节置换、主要髋或膝关节手术的患者；处于血栓形成高危险状态中经历普通外科手术的患者，如癌症的腹部或骨盆手术；及卧床3天以上及具有急性心力衰竭、急性呼吸衰竭、感染的患者。

●预防患者血液透析通路、晚期肾病患者中血栓形成。

●预防晚期肾病患者中心血管病变(死亡、心肌梗塞等)，无论是否需要血液透析。

●预防通过留置导管接受化疗的患者中静脉血栓栓塞事件。

●预防经历下肢动脉重建手术(旁路、终动脉切除术、穿刺血管成形术等)的患者中血栓栓塞事件。

●治疗静脉血栓栓塞事件。

●与另一种心血管治疗剂组合预防急性冠状动脉综合征中的心血管事件(例如不稳定心绞痛、无Q波心肌缺血/梗塞)，所述另一种心血管治疗剂例如是阿司匹林(乙酰水杨酸；阿司匹林是在德国已经注册的商标)、溶血栓剂(见下文实例)、抗血小板制剂(见下文实例)。

●与乙酰水杨酸、溶血栓剂(见下文实例)组合治疗患有急性心肌梗塞的患者。

本发明的凝血酶抑制剂因此可用于治疗和/或预防性处理前述所有病症。

在一个方法中，本发明的凝血酶抑制剂用于治疗血液透析的患者，通过在透析溶液中提供本发明的产物，如在WO 00/41715中关于其它凝血酶抑制剂所述。本发明因此包含透析溶液及包含本发明的抗血栓形成产物的透析浓缩物，本发明还包含治疗需要这种治疗的透析患者的方法，所述方法包括使用一种包含低分子量凝血酶抑制剂的透析溶液。本发明还包括本发明的抗血栓形成的产物在生产治疗透析患者的药物中的应用，其中本发明的抗血栓形成产物在透析溶液中提供。

在另一个方法中，本发明的凝血酶抑制剂用于抗击不利的细胞增殖，如在WO 01/41796中关于其它凝血酶抑制剂所述。所述不利的细胞增殖是典型不利的增生性细胞增殖，例如平滑肌细胞、尤其血管平滑肌细胞的增殖。发现凝血酶抑制剂在治疗内膜超常增生中特别有用，血管内膜增生的一部分是平滑肌细胞增生。再狭窄可被认为是由于新生内膜超常增生所致；因此本发明说明书中内膜超常增生包括再狭窄。

本发明的凝血酶抑制剂也预期可治疗缺血性疾病。更特别地，它们可用于治疗(无论治疗性或是预防性)患有或处于非瓣膜心房纤颤(NVAF)危险中的患者的缺血性疾病，如WO 02/36157中关于其它凝血酶抑制剂所述。缺血性疾病是其结果包括机体一部分血流限制的病症。该术语应理解为包括血液、组织和/或器官中的血栓形成和血凝过快。可以提及的特殊用途包括预防和/或治疗缺血性心脏病、心肌梗塞、系统性栓塞例如在肾或脾中，及更特别是脑缺血，包括脑血栓形成、脑栓塞和/或与非脑血栓形成或栓塞相关的脑缺血(换句话说，即治疗(无论治疗性还是预防性)血栓形成性或缺血性中风及治疗短暂脑缺血发作)，特别是治疗患有或处于NVAF危险中的患者。

本发明的凝血酶抑制剂还预期可治疗风湿性/关节炎疾病，如在WO03/007984中关于其它凝血酶抑制剂所述。因此，本发明的凝血酶抑制性盐可用于治疗慢性关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎或强直性脊椎炎。

另外，期望本发明的凝血酶抑制剂用于预防溶栓、经皮穿刺血管成形术(PTA)及冠状动脉旁路术后再闭塞(即血栓形成)；预防一般性显微外科和血管手术后再次血栓形成。本发明的产物的用途进一步包括治疗和/或预防性治疗由细菌、多处外伤、中毒或任何其它机制导致的弥散性血管内凝血；当血液与机体内外源表面如血管移植物、血管支架、血管导管、机械性和生物性修复的瓣膜或任何其它医学装置接触时进行抗凝血处理；及当血液与机体外医学装置接触如在使用心-肺机进行心血管手术期间或在血液透析时进行抗凝血处理。

本发明的凝血酶抑制剂进一步用于包括治疗其中存在不利的过量凝血酶而无血凝过快迹象的病症，例如神经变性疾病如阿尔茨海默病。除了凝血酶对凝集过程的作用之外，已知其可激活大量细胞(如嗜中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞)。因此，本发明的化合物也可用于治疗和/或预防性治疗特发性及成人呼吸窘迫综合征、在放疗或化疗处理后的肺纤维化、败血症休克、败血病、炎症反应，包括但非限于水肿，急性或慢性动脉硬化如冠状动脉疾病、脑动脉疾病、周围动脉疾病、再灌注损伤及在经皮穿刺成形术(PTA)后再狭窄。

凝血酶抑制剂还可以用于治疗胰腺炎。

式(III)的硼酸的盐进一步可用于抑制血小板促凝血活性。本发明提供了一种抑制血小板促凝血活性的方法，通过给予患有或处于动脉血栓形成危险中的哺乳动物、特别是人一种式(III)或(IV)所示硼酸的盐。本发明还提供了这种盐在生产抑制血小板促凝血活性的药物中的应用。

式(III)或(IV)产物作为血小板促凝血活性抑制剂的应用基于这样观察，即式(III)或(IV)的酸有效抑制动脉血栓形成以及静脉血栓形成。

包含动脉血栓形成的病症包括急性冠状动脉综合征(尤其是心肌梗塞和不稳定心绞痛)，脑血管血栓形成和周围动脉闭塞及由于心房纤颤、瓣膜性心脏病，动静脉旁路，留置导管或冠状动脉支架发生的动脉血栓形成。因此，本发明另一方面提供了一种治疗选自这些疾病或病症的方法，包括给予哺乳动物尤其是人类患者一种本发明的凝血酶抑制性盐。本发明包括用于动脉环境例如冠状动脉支架或其它动脉植入体中的产物，其具有包含本发明的抗凝血酶盐的一个包被。

式(III)或(IV)硼酸的盐可预防性用于治疗确信处于患有动脉血栓形成或者包含动脉血栓形成的疾病或病症的危险中的个体，或者治疗性应用(包括预防血栓形成的再次发生或继发的血栓形成)。

因此本发明包括所述选择性凝血酶抑制剂(有机硼酸盐)在预防性或治疗性处理上述疾病中的应用，以及其在药物制剂及药物制剂的生产中的应用。

在上述天然是抗凝血剂的那些应用中，可以用本发明的另一种抗凝血剂盐代替本发明的凝血酶抑制剂。

给药及药物制剂

所述盐可以给予宿主，例如在所述药物有抗凝血酶原活性的情况中，以获得抗凝血酶原作用。在较大动物如人的情况中，所述化合物可单独给予或与药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体组合给予。术语“药物可接受的”包括人和兽医目的均可接受性，其中优选人用药物应用可接受性。在口服给药的情况中，所述化合物，特别是氨基或肽硼酸的盐优选以防止本发明的盐与酸性胃液接触的形式给予，如是肠衣制剂形式，这样防止盐释放直至达到十二指肠。

肠衣例如是由碳水化合物聚合物或聚乙烯聚合物适当地制成。肠衣原料例如包括但非限于乙酸纤维素邻苯二甲酸酯，乙酸纤维素琥珀酸酯，纤维素氢邻苯二甲酸酯，乙酸纤维素偏苯三酸酯，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基乙酸纤维素琥珀酸酯，羧甲基乙基纤维素，淀粉乙酸邻苯二甲酸酯，直链淀粉乙酸邻苯二甲酸酯，聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯，聚丁酸乙烯酯邻苯二甲酸酯，苯乙烯顺丁烯二酸共聚物，甲基丙烯酸-甲基丙烯酸共聚物(MPM-05)，甲基丙烯酸-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(MPM-06)，及甲基甲基丙烯酸-甲基丙烯酸共聚物(

L&S).。任选所述肠衣含有一种增塑剂。增塑剂例如包括但非限于柠檬酸三乙酯，三醋精和二乙基邻苯二甲酸酯。

本发明的抗血栓形成盐可以组合和/或与任何心血管治疗剂共同给予。在商业应用、临床评价和临床前研发中有大量可利用的心血管治疗剂，可以加以选择与本发明的产物一起通过组合药物治疗以预防心血管疾病。这种制剂可以是选自但非限于几个主要类别的一或多种制剂，即降脂药物，包括IBAT(回肠Na⁺/胆酸协同转运蛋白)抑制剂，贝特类药(fibrate)，烟酸，抑制素，CETP(胆固醇酯转移蛋白)抑制剂，及胆酸螯合剂，抗氧化剂，包括维生素E和普罗布可(probucol)，IIb/IIIa拮抗剂(例如abciximab，eptifibatide，tirofiban)，醛甾酮抑制剂(例如螺内酯(spirolactone)和epoxymexrenone)，腺苷A2受体拮抗剂(例如losartan)，腺苷A3受体激动剂，β-阻滞剂，乙酰水杨酸，袢利尿剂及ACE(血管紧张素转换酶)抑制剂。

抗血栓形成盐可以组合和/或与具有不同作用机制的任何抗血栓形成剂共同给予，如抗血小板制剂乙酰水杨酸，ticlopidine，clopidogrel，血栓烷受体和/或合成酶抑制剂，前列环素模拟物和磷酸二酯酶抑制剂及ADP-受体(P₂T)拮抗剂。

凝血酶抑制性盐在治疗血栓形成疾病、特别在心肌梗塞中可进一步组合和/或与溶栓剂共同给予，所述溶栓剂如组织纤溶酶原激活物(天然的、重组的或修饰的)，链激酶，尿激酶，尿激酶原，茴香酰纤溶酶原-链激酶激活物复合物(APSAC)，动物唾液腺纤溶酶原激活物等等。

抗血栓形成盐可以组合和/或与一种保心剂例如腺苷A1或A3受体激动剂共同给予。

本发明还提供了治疗患者炎症疾病的一种方法，包括用抗血栓形成产物与NSAID例如COX-2抑制剂一起治疗该患者。这种疾病包括但非限于肾炎，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，肾小球肾炎，脉管炎和肉样瘤病。因此，本发明的抗血栓形成盐可以组合和/或与NSAID共同给予。

因此典型地，式(III)或(IV)酸的盐可以给予宿主以获得一种凝血酶抑制作用，或者本发明中提及的任何其它凝血酶抑制性或抗血栓形成作用。

药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得针对特定患者、组合物及给药模式有效达到所需治疗应答的活性化合物的量(本发明称之为“治疗有效量”)。所选择的剂量水平依赖于特定化合物的活性，所治疗的病症的严重性及所治疗的患者的状态和现病史。然而，本领域技术人员已知所述化合物的起始剂量低于达到希望的治疗作用所需要的水平，然后逐步增加剂量直至达到希望的作用。

例如，目前预期在口服给予TRI 50c的盐的情况中，所述盐例如可以每日两次给予0.5-2.5mg/Kg的量，计作TRI 50c的量。其它盐可以等摩尔量给予。本发明所述方法非限于以这种数量或方案给予，包括在前句所述之外的剂量和方案。

根据本发明的另一方面，提供了一种口服药物制剂，其包含本发明的产物并混和一种药物可接受的佐剂、稀释剂或载体。

口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂(也称为药丸)、粉末和颗粒。在这种固体剂型中，所述活性化合物典型地混合至少一种惰性的药物可接受的赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或一或多种以下原料：a)充填剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和阿拉伯树胶(acacia)；c)湿润剂如甘油；d)崩解剂如琼脂-琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收促进剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸收剂如高岭土和皂土及i)润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。在胶囊和片剂的情况中，所述剂型还可以包含缓冲剂。在软和硬填充的明胶胶囊中也可以使用相似类型的固体组合物用作充填剂，例如使用乳糖以及高分子量的聚乙二醇作为赋形剂。

适当地，口服制剂可含有一种溶解辅助物。所述溶解辅助物非限于是其性质，只要其是药物可接受的即可。例如包括非离子表面活性剂，如蔗糖脂肪酸酯，甘油脂肪酸酯，失水山梨糖醇脂肪酸酯(例如失水山梨醇三油酸酯)，聚乙二醇，聚氧乙烯氢化蓖麻油，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，聚氧乙烯烷基醚，甲氧基聚乙氧烯烷基醚，聚氧乙烯烷基苯基醚，聚乙二醇脂肪酸酯，聚氧乙烯烷基胺，聚氧乙烯烷基硫醚，聚氧化烯聚氧丙烯共聚物，聚氧乙烯甘油脂肪酸酯，季戊四醇脂肪酸酯，丙二醇单脂肪酸酯，聚氧乙烯丙二醇单脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，脂肪酸烷基醇酰胺，及烷基胺氧化物；胆汁酸及其盐(例如鹅脱氧胆酸，胆酸，脱氧胆酸，脱氢胆酸及其盐，及甘氨酸或其牛磺酸缀合物)；离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠，脂肪酸皂，烷基磺酸盐，烷基磷酸盐，磷酸乙醚，碱性氨基酸的脂肪酸盐；三乙醇胺皂，及烷基季铵盐；及兼性表面活性剂如甜菜碱和氨基羧酸盐。

所述活性化合物也可以是微囊化形式，如果适当则具有一或多种上述赋形剂。

口服制剂的液体剂型包括药物可接受的乳状液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，该液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油(特别是棉油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢糠醇，聚乙二醇及脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂如湿润剂，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，调味剂和香料。悬浮液除了所述活性化合物之外，还可含有悬浮剂如乙氧基化异硬脂醇，聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯，微晶纤维素，间氢氧化铝，皂土，琼脂-琼脂，及黄蓍胶及其混合物。

本发明的产物可以是细碎粒状的固体形式，例如可以是微粉化的。粉末或细碎粒可以装入胶囊。

所述活性混合物可以单一剂量、多重剂量或作为缓释制剂给予。

从前述内容应理解本发明提供了适于口服给药的干细颗粒形式的药物产物，其包含式(III)或(IV)所示硼酸的碱土金属盐，特别是钙盐。所述碱土金属盐优选是一种酸盐。

实施例

实施例说明

所有实施例均涉及本发明的新产物。具体地，实施例涉及如下“说明书介绍”中提及的不同类别：

●实施例1-3和27-29涉及合成方法II，因此涉及高纯度产物(一类新产物)

●实施例4-21涉及合成方法I，以及涉及用合成方法I的技术制备的新产物的鉴定和测试

●实施例22-26含有未公开的材料，用于证实TRI 50c以及因此的新产物(因此包括高纯度产物)的动脉和静脉应用是有效的

实施例1至3-绪言

仪器：

在如下实施例1-3的程序中，使用标准实验室玻璃器具类，及操作和转移空气敏感性试剂的专业器具。

所有玻璃器具在使用前均在140-160℃加热至少4小时，然后在干燥器中或通过集中热量并用干氮气流吹风冷却。

溶剂：

实施例1-3中使用的有机溶剂均是无水的。适当地，将它们在使用之前经过钠线干燥。

干燥：

在实施例1-3的干燥程序中，通过观测在干燥过程中重量的减少而测试产物的干燥程度(包括有机溶剂的干燥)。根据如下程序测定干燥过程中重量的减少：将样品置于真空干燥器中并在40℃在100mbar干燥2小时。当在干燥时重量的减少低于起始物总重的0.5％时，认为产物是干燥的。

实施例1-3描述了如下反应方案的执行及所得TRI 50c转变其钙盐的过程：

LDA＝二异丙基酰胺锂

LiHMDS＝六甲基二硅氮烷锂，也称为双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂

实施例1-TRI 50D的合成

步骤1：Z-DIPIN B

程序A

加入17.8g(732.5mmole)镁镟屑，0.1g(0.4mmole)碘和127ml无水四氢呋喃并加热至回流。随后加入15ml的66g(608mmole)1-氯-3-甲氧基丙烷于185ml无水四氢呋喃中的溶液并在回流下搅拌直至发生强烈反应。最初放热停止后，缓慢加入1-氯-3-甲氧基丙烷溶液以保持温和回流直至全部镁被消耗。在反应完成后，将反应混合物冷却至环境温度，并缓慢加入64.4g(620mmole)三甲基硼酸盐于95ml无水四氢呋喃中的溶液；将后一溶液冷却至0℃以下，如果在反应过程期间其升温，则反应混合物必须非常缓慢地加入以保持这个溶液的温度低于65℃。在加入完成后，使反应混合物升温至大约0℃并再搅拌60分钟。然后缓慢加入22.4ml硫酸于400ml水中的溶液，以保持温度低于20℃。使该层沉下并分离各相。将水性层用200ml叔丁基甲醚再洗涤3次。使组合的有机层沉下并除去从这个溶液中分离出的额外的水。将有机层经过硫酸镁干燥并蒸发至干。蒸发残渣从沉淀的固体中过滤并将滤物溶解于175ml甲苯中。将34.8g(292mmole)频哪醇加入该溶液中，随后在环境温度搅拌不少于10小时。将该溶液蒸发至干，溶解于475ml正庚烷中并用290ml饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤3次。将正庚烷溶液蒸发至干并将蒸发残渣蒸馏及在Bp 40-50℃在0.1-0.5mbar回收级分。

沸点：40-50℃/0.1-0.5mbar

收率：40.9g(70％)Z-DIPIN B(油)

程序B

加入17.8g(732.5mmole)镁镟屑，0.1g(0.4mmole)碘和127ml无水四氢呋喃并加热至回流。随后加入15ml的66g(608mmole)1-氯-3-甲氧基丙烷于185ml无水四氢呋喃中的溶液并在回流下搅拌直至发生强烈反应。最初放热停止后，缓慢加入1-氯-3-甲氧基丙烷溶液以保持温和回流。在反应完成后，将反应混合物冷却至环境温度，并缓慢加入64.4g(620mmole)三甲基硼酸盐于95ml无水四氢呋喃中的溶液，将这个溶液的温度低于-65℃。在加入完成后，使反应混合物升温至大约0℃并再搅拌60分钟。然后缓慢加入22.4ml硫酸于400ml水中的溶液，以保持温度低于20℃。有机溶剂通过在真空下蒸馏而除去。将300ml正庚烷加入蒸发残渣的水溶液中，随后加入34.8g(292mmole)频哪醇。将两相混合物在环境温度搅拌不少于2小时。在使该层沉下后，分离水性相。将300ml正庚烷加入水性相并在环境温度搅拌两相混合物不少于2小时。在使该层沉下后，分离水性相。组合有机层并用200ml水洗涤一次，随后用200ml饱和的碳酸氢钠溶液洗涤一次，再用200ml水洗涤两次。将正庚烷溶液蒸发至干并将蒸发残渣蒸馏及在Bp 40-50℃在0.1-0.5mbar回收级分。

沸点：40-50℃/0.1-0.5mbar

收率：40.9g(70-85％)Z-DIPIN B(油)

步骤2：Z-DIPIN C

加入16.6g(164mmole)二异丙胺和220ml四氢呋喃并冷却至-30至-40℃。向此溶液中加入41.8g(163mmole)正丁基锂于正庚烷中25％的溶液，随后在0至-5℃搅拌1小时。将这个新鲜制备的二异丙酰胺锂溶液冷却至-30℃，然后在-60和-75℃之间加入27.9g(139mmole)Z-DIPIN B于120ml四氢呋喃中的溶液及35.5g(418mmole)二氯甲烷。在该温度搅拌溶液半小时，随后加入于四氢呋喃中的480ml(240mmole)0.5N无水氯化锌(II)或者32.5g(240mmole)无水固体氯化锌(II)。在-65℃搅拌1小时后，使反应混合物升温至环境温度，再搅拌16-18小时。将反应混合物蒸发至干(即直至除去溶剂)，随后加入385ml正庚烷。反应混合物用150ml 5％硫酸、190ml饱和碳酸氢钠溶液和180ml饱和氯化钠溶液洗涤。有机层经过硫酸镁干燥，过滤并蒸发至干(即直至除去溶剂)。油性残余物无需进一步纯化而进行下一个步骤。

收率：19g(55％)Z-DIPIN C

步骤3：Z-DIPIN D

向23.8g(148mmole)六甲基二硅氮烷于400ml四氢呋喃的溶液中在-15℃加入34.7g(136mmole)正丁基锂于正庚烷中的25％溶液，并搅拌1小时。将该溶液冷却至-55℃，随后加入溶解于290ml四氢呋喃中的30.6g(123mmole)Z-DIPIN C，并向这个新鲜制备的LiHMDS溶液中加入35ml四氢呋喃。使溶液升温至环境温度并搅拌12小时。将反应混合物蒸发至干，蒸发残渣溶解于174ml正庚烷中，用170ml水和75ml饱和的氯化钠溶液洗涤。有机相经过硫酸镁干燥，过滤并蒸发至完全干(即直至除去溶剂)。将油性残余物溶解于100g正庚烷中。这一溶液无需进一步纯化而进行下一步骤.

收率：32.2g(70％)Z-DIPIN D

步骤4：Z-DIPIN(TRI50b，粗制)

26.6g(71mmole)Z-DIPIN D于82.6g正庚烷中的溶液用60ml正庚烷稀释并冷却至-60℃，随后导入10.5g(285mmole)氯化氢。反应混合物随后抽真空并用氮排出，同时以约20℃的升幅将温度升至环境温度。从油状沉淀中除去溶剂并用60ml新鲜正庚烷更换若干次。油状残余物溶于60ml四氢呋喃(溶液A)中。

向另一烧瓶中加入130ml四氢呋喃，24.5g(61.5mmole)Z-D-Phe-Pro-OH和6.22g(61.5mmole)N-甲基吗啉并冷却至-20℃。向此溶液中加入8.4g(61.5mmole)氯甲酸异丁酯于20ml四氢呋喃中的溶液并搅拌30分钟，随后在-25℃加入溶液A。在加入完毕时，加入至多16ml(115mmole)三乙胺以调节pH至9-10，pH值用pH试纸测定。仍在氮气下使反应混合物升温至环境温度并搅拌3小时。蒸干溶剂并将蒸发残余物溶解于340ml叔丁基甲醚(t-BME)中。Z-DIPIN于t-BME中的溶液用175ml 1.5％盐酸洗两次。将合并的酸性洗涤液用175ml t-BME再洗1次。合并的有机层用175ml水、175ml饱和碳酸氢钠溶液、175ml 25％氯化钠溶液洗涤，在硫酸镁上干燥并过滤。这一溶液无需进一步纯化而进行下一步骤。

收率：29.9g(80％)Z-DIPIN

实施例2-TRI 50D(TRI 50C的二乙醇胺加成物)的合成

这个实施例中使用的起始物是在实施例1中获得的TRI 50b溶液(Z-DIPIN)。该溶液无需进一步纯化而直接进行TRI 50d的合成。将于t-BME中的Z-DIPIN溶液(含有7.0g(11.5mmole)(R，S，R)TRI50b，基于Z-DIPIN的HPLC结果计算)蒸发至干，并将蒸发残渣溶解于80ml二乙醚中。加入1.51g(14.4mmole)二乙醇胺并将混合物在回流加热至少10小时，在此期间产物沉淀。将悬浮液冷却至5-10℃，过滤用二乙醚洗涤的滤渣。

为改良手性和化学纯度，将湿的滤渣(7g)溶解于7ml二氯甲烷中，冷却至0-5℃，通过加入42ml二乙醚沉淀产物并过滤。将分离的湿产物在35℃在真空干燥，或者至少4小时直至1天。

收率：5.5g(80％)Tri50d

熔点：140-145℃

实施例3-TRI50C的钙盐的制备

将在实施例2中获得的1.5kg(2.5mole)TRI50d溶解于10.5L二氯甲烷中。加入11L 2％盐酸并将混合物在室温搅拌至多30分钟(任选大约20分钟)。在搅拌后，使层沉下并分离。将水性层用2.2L二氯甲烷再洗涤两次。组合的有机层用625g氯化铵于2.25L水中的溶液洗涤。有机相经过硫酸镁干燥，过滤并将滤物蒸发至干。进行游离硼酸分析，计算将酸转变为盐所需的溶剂和碱的量。如果获得2.5mol的游离酸，则将蒸发残渣溶解于5L乙腈中，随后加入93g(1.25mole)氢氧化钙于1L水中的悬液。将溶液在环境温度(例如15-30℃，优选室温)搅拌2小时，然后在初始温度为大约10℃然后升温至不超过大约35℃的温度在真空(ca.10mmHg)中蒸发。将蒸发残渣再溶解于3.5L新鲜乙腈中并蒸发至干以除去微量的水。如果蒸发残渣是干的，则将其溶解于6L四氢呋喃中，缓慢加入32L正庚烷和32L二乙醚的混合物中。足够缓慢地进行加入以避免产物结成块状或粘滞，加入时间不少于30分钟。过滤出沉淀产物，用正庚烷洗涤并在低于35℃的温度下在真空干燥(ca.10mmHg)干燥直至变干。

收率：0.98kg(70％)Tri50c钙盐。

实施例1-4的程序可以按比例放大，如果谨慎操作可产生高纯的盐。在二乙醇胺沉淀步骤中，重要的是每当量(R，S，R)TRI 50b使用1.25当量的二乙醇胺。在二乙醇胺酯的水解中，重要的是避免过长时间与水性酸接触。同样，TRI 50b应通过Z-DIPIN A的Grignard反应合成。

实施例4-TRI 50B至TRI 50C的另一种转变

在这个及随后的合成实施例中描述的合成程序通常是在商购的氮及使用干溶剂下进行的。

1.将通过外消旋的TRI 50b的HPLC纯化获得的大约300g的TRI 50b溶解于大约2.5L二乙醚中。估计不同批次的TRI 50b的异构体纯度在85％R，S，R至超过95％R，S，R范围内。

2.加入大约54ml二乙醇胺(与总TRI 50b含量1∶1化学计量)，并将混合物在40℃回流。

3.除去沉淀产物，用二乙醚洗涤若干次并干燥。

4.将干产物溶解于CHCl₃中。加入盐酸(pH 1)并将混合物在室温搅拌大约1小时。

5.除去有机层并用NH₄Cl溶液洗涤。

6.蒸馏去有机溶剂并干燥残余的固体产物。

典型收率：大约230g

实施例5-TRI 50C钙盐的第一种替代制备

室温搅拌下将通过实施例4的方法获得的Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH(20.00g，38.1mM)溶解于乙腈(200ml)中。向此溶液中加入于蒸馏水中的0.1M溶液的Ca(OH)₂(190ml)，所得澄清溶液在室温搅拌2小时，然后真空干燥，温度不超过37℃。所得产物是白色易碎固体。

然后将所述盐在真空下于硅石上干燥至恒重(72小时)。

收率：17.69g

实施例6-TRI 50C钙盐的第二种替代制备

室温搅拌下将50.0g TRI 50c(95.2mmol)溶解于250ml乙腈中，然后用冰浴冷却。向此冰冷的溶液中滴加100ml 3.5g(47.6mmol)氢氧化钙的水性悬浮液，室温搅拌2.5小时，过滤并将所得混合物蒸发至干燥，温度不超过35℃。将澄清的微黄色油状残余物重溶于200ml丙酮中并蒸发至干燥。重复一次重溶于丙酮中的程序以获得无色泡沫。

将这一泡沫重溶于100ml丙酮中，过滤并滴加至冰冷的1100ml石油醚40/60和1100ml二乙醚的溶液中。将所得无色沉淀过滤，用石油醚40/60洗二次并高真空干燥，产生49.48g无色固体(92％)，根据HPLC测定纯度为99.4％。

实施例7-TRI50C的钙盐的UV/可见光谱

记录得自实施例5的程序的盐在蒸馏水中在20℃在190nm-400nm的UV/可见光谱。TRI50C和盐给定λ_max在210和258nm。然后测定干的盐的重量以计算消光系数。使用258nm的λ_max。使用下式计算消光系数：

A＝εcl       其中A是吸光度

              C是浓度

              l是UV池的通径长度

              ε是消光系数。

消光系数：955

实施例8-TRI 50C的钙盐的水溶解度

这个实施例中使用的盐是使用实施例6所述的方法加以修改制成的。所修改的方法的不同之处在于100mg的TRI 50c用作起始物，重新溶解于水中的产物通过冻干而干燥，及通过0.2μm滤膜进行过滤。确信盐含有大约85％的R，S，R异构体。

为确定最大的水溶解度，将25mg的干盐在37℃在水中摇动，过滤样品并测定UV光谱。该盐剩余一种未溶解的白色残余物。

当在25mg/ml溶解时溶解度为5mM(5mg/ml)。

实施例9-TRI 50C钙盐的体外活性

通过一酰胺分解分析(J.Deadman et al，J.Med.Chem.38：15111-1522，1995，其报道了TRI 50b的Ki值为7nM)分析了作为人α-凝血酶的抑制剂的TRI 50c钙盐。

因此通过对酶催化的三种不同浓度的生色底物S-2238的水解的抑制来确定对人α-凝血酶的抑制。

将200μl样品或缓冲液和50μl S-2238在37℃温育1分钟，并加入50μl人α-凝血酶(0.25NIHμ/ml)。在4.5nm记录被抑制和未被抑制的反应的最初速率。根据Lineweaver and Burke方法绘制光密度增加图。确定Km和表观Km，并用如下关系式计算Ki。

$V=\frac{V\max }{1+\frac{\mathrm{Km}}{\left[S\right]}\·(1+\frac{\left[I\right]}{\mathrm{Ki}})}$

所用缓冲液含有0.1M磷酸钠、0.2M NaCl，0.5％PEG和0.02％叠氮化钠，用正磷酸调节至pH 7.5。

样品由溶解于DMSO中的化合物组成。

Ki的测定的进一步描述参见Dixon，M and Webb，E.C.，“Enzymes”，thirdedition，1979，Academic Press，该文献并入参考。

观察到TRI 50c钙盐的Ki为10nM。

实施例10-TRI 50C锌盐的制备

镁和锌的氢氧化物的相对溶解度分别是这样的，如果该氢氧化物使用实施例5的程序用于制备相应的TRI 50c盐，它们不能导致同质的盐形成。因此需要揭示新的方法以制备锌和镁盐，如在这个及后文的实施例中所述。

TRI 50c钠盐(2.24g，4.10mM)在室温溶解于蒸馏水(100ml)中，小心加入于THF中的氯化锌(4.27ml，0.5M)并搅拌。滤出立即形成的白色沉淀并用蒸馏水洗涤。将这个固体溶解于乙酸乙酯中并用蒸馏水洗涤(2×50ml)。将有机溶液抽真空干燥并将产生的白色固体在干燥器中经过硅石干燥3天，之后进行微量分析。收率1.20g。

¹H NMR 400MHz，δ_H(CD₃OD)7.23-7.33(20H，m，ArH)，5.14(4H，m，PhCH₂O)，4.52(4H，m，αCH)，3.65(2H，m)，3.31(12H，m)，3.23(6H，s，OCH₃)，2.96(4H，d，J 7.8Hz)，2.78(2H，m)，2.58(2H，m)，1.86(6H，m)，1.40(10H，m)。

¹³C NMR 75MHz 393K δ_C(CD₃OD)178.50，159.00，138.05，137.66，130.54，129.62，129.50，129.07，128.79，128.22，73.90，67.90，58.64，58.18，56.02，38.81，30.06，28.57，28.36，25.29。

FTIR(KBr disc)v_max(cm^-1)3291.1，3062.7，3031.1，2932.9，2875.7，2346.0，1956.2，1711.8，1647.6，1536.0，1498.2，1452.1，1392.4，1343.1，1253.8，1116.8，1084.3，1027.7，916.0，887.6，748.6，699.4，595.5，506.5。

实施例11-TRI 50C镁盐的制备

将TRI 50c(1.00g，1.90mM)溶解于甲醇(10ml)中并在室温搅拌。向此溶液中加入于甲醇中的甲氧化镁(Mg(CH₃O)₂)(1.05ml，7.84wt％)。室温搅拌这一溶液2小时，过滤并抽真空至5ml。然后加入水(25ml)，将这一溶液抽真空至干燥，得到白色固体。将其在硅石上干燥72小时，之后送去进行微量分析。收率760mg。

¹H NMR 300MHz，δ_H(CD₃C(O)CD₃)7.14-7.22(20H，m)，6.90(2H，m)，4.89(4H，m，PhCH₂O)，4.38(2H，m)，3.40(2H，br s)，2.73-3.17(20H，未分辨的多重宽峰)，1.05-2.10(16H，未分辨的多重宽峰)。

¹³C NMR 75MHz 393K δ_C(CD₃C(O)CD₃)206.56，138.30，130.76，129.64，129.31，129.19，129.09，128.20，128.04，74.23，73.55，67.78，58.76，56.37，56.03，48.38，47.87，39.00，25.42，25.29。

FTIR(KBr disc)v_max(cm^-1)3331.3，3031.4，2935.3，2876.9，2341.9，1956.1，1711.6，1639.9，1534.3，1498.1，1453.0，1255.3，1115.3，1084.6，1027.6，917.3，748.9，699.6，594.9，504.5，467.8。

实施例12-(R，S，R)TRI 50C的钙盐、镁盐和锌盐的分析

如下盐使用n∶1的硼酸根∶金属化学计量制备，其中n是金属的化合价，使用比实施例8中用于制备盐更高的手性纯度的(R，S，R)TRI 50c。

A.钙盐(实施例5的产物)

分析数据                            物理性质

HPLC或LC/MS：HPLC betabasic         形状：非晶质固体C18Column，CH₃CN，水

                                    颜色：白色

估计纯度：＞95％，通过UV(λ_215nm)测定                                    熔点：N/A

微量分析：

         计算的.     发现的.        溶解度：在水性介质中

C：      59.27    55.08          可溶ca～4mg/ml

H：      6.48     6.43

N：      7.71     7.08           M_w：1088.89

其它：B：1.99     2.01

      Ca：3.68    3.65

B.镁盐(实施例11的产物)

分析数据                                物理性质

PLC或LC/MS：HPLC betabasic C18          形状：非晶质固体Column，CH₃CN，水

                                        颜色：白色

估计纯度：＞90％，通过UV(λ_215nm)测定                                        熔点：N/A

微量分析：                              溶解度：在水性介质中可

           计算的.  发现的.       溶ca～7mg/ml

C：        60.44    57.25

H：        6.57     6.71           M_w：  1073.12

N：        7.83     7.45

其它：B：  2.01     2.02

      Mg： 2.26     2.12

C.锌盐(实施例10的产物)

分析数据                                物理性质

HPLC或LC/MS：HPLC betabasic        形状：非晶质固体C18 Column，CH₃CN，水

                                   颜色：白色

估计纯度：＞95％，通过UV(λ_215nm)测定                                   熔点：N/A

微量分析：                         溶解度：在水性介质中可

           计算的.  发现的.    溶ca～2mg/ml

C：        58.21    56.20

H：        6.33     6.33       M_w：1114.18

N：        7.54     7.18

其它：B：  1.94     1.84

      Zn： 5.87     7.26

注意：在计算的微量分析中使用三角形化学式的酸性硼酸盐。确信在实施例8中报道的钙盐溶解度较低，因为在实施例8中测试的盐具有较低的手性纯度。

结论：

锌盐、钙盐和镁盐均已经分别用一个金属离子对TRI 50c两个分子的化学计量制备。针对钙盐和镁盐发现的值接近于并因此与计算的1∶2化学计量一致。就锌盐而言，发现过量的锌；但是锌盐包含有效比例的酸性硼酸盐。

实施例13-稳定性

这个实施例对比了当充填入肠衣硬明胶胶囊中时(见实施例20)TRI50c与TRI 50c钙盐的稳定性。

1.表格化结果

化合物	包装	1.5月的气候条件<sup>0)</sup>	纯度(HPLC％面积)T0	纯度(HPLC％面积)<sup>3</sup>T1
					TRI50c	起泡胶囊	25℃/60％r.h.<sup>4</sup>	99	73.9
TRI50c	起泡胶囊	40℃/75％r.h	99	73.9
					TRI50c	胶囊<sup>1</sup>	40℃/75％r.h	99	75.3
TRI50c钙盐	起泡胶囊	25℃/60％r.h.	99.2<sup>2)</sup>	98.0
					TRI50c钙盐	起泡胶囊	40℃/75％r.h	99.2<sup>2</sup>	97.2
TRI50c钙盐	胶囊<sup>1</sup>	40℃/75％r.h	99.2<sup>2</sup>	95.0

注意：

0)在给定条件下贮存1.5月，然后将样品在室温贮存直至进行分析试验。

1)在各自的气候条件下不用起泡贮存胶囊。

2)在贮存之前批次的纯度

3)贮存批次的纯度(将胶囊内容物倒出，然后进行分析)。

4)r.h.＝相对湿度

2.分析程序

2.1样品制备

2.1.1TRI 50c及盐的分析

将TRI 50c-标准物(游离酸)贮存于干燥器中经过五氧化二磷干燥2天。然后称重参考标准物置于量瓶中并溶解于乙腈和水的混合物中(25/75v/v％)。将所得溶液等份(ST 1A)如表4所示稀释方案用水相继稀释。

Tri 50c的原液和标准溶液

	净重	纯度	盐-因子	溶解的	溶剂	Conc.	Calibr.
									mg	％		in ml		[μg/ml]	[μg/ml]
ST 1A	40.8	98.23	1	10	ACN/水25/75(v/v％)	4007.8	C4000
	ml	ST	[μg/ml]	ad ml	溶剂	[μg/ml]
								ST 2A	5	1A	4007,8	10	水	2003.9	C2000
ST 3A	5	2A	2003,9	10	水	1001.9	C1000
								ST 4A	5	3A	1001,9	10	水	501.0	C500
ST 5A	5	4A	500,9	10	水	250.5	C250
								ST 6A	1	3A	1001,9	10	水	100.2	C100
ST 7A	1	6A	100,2	10	水	10.0	C10

2.1.2贮存的胶囊的杂质分布图

取出在相应的气候条件下贮存的每个批次的胶囊，并称重10mg内容物置于10ml量瓶中，溶解于10ml的乙腈/水混合物(25/75v/v％)中。注入这些溶液分别进行杂质分布图分析并量化。

3.数据评价

使用HPLC-PDA方法进行定量评价和杂质分布图分析。处理波长设定为258nm。

4.分析参数

4.1设备和软件

自动取样器            Waters Alliance 2795

泵                        Waters Alliance 2795

柱式加热炉                Waters Alliance 2795

检测                      Waters 996diode array，extracted wavelength 258nm

软件版本                  Waters Millennium Release 4.0

4.2固定相

分析柱ID                    S71

材料                        X-Terra^TM MS C₁₈，5μm

供应商                      Waters，Eschborn，Germany

尺度                        150mm x 2.1mm(长度，内径)

4.3流动相

水相：                A：于水中0.1％HCOOH

有机相：              C：ACN

梯度条件：

时间	流速	％A	％C
				0.00	0.5	90	10
27.0	0.5	10	90
				27.1	0.5	90	10
30.0	0.5	90	10

5.TRI50C Ca盐的杂质分布图

起泡胶囊(Capsules in blister)25℃/60％r.h.

名称	量[μg/ml]	保留时间[min.]	面积	％面积	高度
						Benzaldeh.		6,058	7927	1,29	392
Tri50c	930,903	11,686	601551	98,02	25135
								19,199	839	0,14	89
		19,498	1821	0,30	105

20,168

1581

0,26

158

相应的HPLC踪迹如图2所示。

起泡胶囊40℃/75％r.h.

名称	量[μg/ml]	保留时间[min.]	面积	％面积	高度
						Benzaldeh.		6,060	12270	2,37	586
Tri50c	786,223	11,681	503867	97,19	21324
								19,517	707	0,14	97
		20,185	1614	0,31	169

相应的HPLC时间如图3所示。

胶囊(不起泡)40℃/75％r.h.

名称	量[μg/ml]	保留时间[min.]	面积	％面积	高度
						Benzaldeh.		6,041	19170	3,64	992
Imp.I		10,897	4433	0,84	345
						Tri50c	780,097	11,666	499730	94,96	21526
		19,494	805	0,15	110
								20,156	2100	0,40	176

相应的HPLC踪迹如图4所示。

实施例14-TRI 50C的镁盐作为凝血酶抑制剂的体外分析

凝血酶酰胺分解(Amidolytic)分析

在凝血酶酰胺分解分析中测试TRI 50c镁盐(TRI 1405)。

试剂：

分析缓冲液：

100mM磷酸钠

200mM NaCl(11.688g/l)

0.5％PEG 6000(5g/l)

0.02％叠氮化钠

pH 7.5

将生色底物S2238在水中溶解至4mM(25mg+10ml)。用分析缓冲液稀释至50uM以在分析中以5μM使用。(S2238是H-D-Phe-Pip-Arg-pNA)。

凝血酶经Cambridge Bioscience得自HTI，用分析缓冲液以1mg/ml等分。用分析缓冲液稀释至100ng/ml，然后进一步3倍稀释(1 in 3)用于分析中。

分析：

110μl分析缓冲液

50ul 5μg/ml凝血酶

20μl载体或化合物溶液

于37℃ 5分钟

20μl 50μM S2238

在37℃ 10分钟于405nm读数并记录Vmax

结果：

结果示于图4。

讨论：

在这一分析中，TRI 50c的镁盐显示与作为外部对照(externalcontrol)的TRI 50b相同的活性。

实施例15(对比)-制备TRI 50C的钾盐

将Cbz-Phe-Pro-BoroMpg-OH(20.00g，38.1mM)在室温搅拌下溶解于乙腈(200ml)中。向这个溶液中加入KOH于蒸馏水中的0.2M溶液(190ml)。将所得澄清溶液在室温搅拌2小时，然后在真空下抽真空干燥，温度不超过37℃。将所得油/粘液重新溶解于1L蒸馏水中，加温至37℃大约2小时。用滤纸过滤溶液并蒸发至干，再一次溶液温度不超过37℃。所得产物在真空下干燥过夜以正常收获一种白色易碎固体。

收率：14.45mg.

然后将盐在真空下经过硅石干燥至恒定重量(72小时)。

微量分析：

C％观察值(计算值)	H％观察值(计算值)	N％观察值(计算值)	B％观察值(计算值)	金属％观察值(计算值)
					54.84(57.55)	6.25(6.26)	7.02(7.45)	2.01(1.92)	K4.29(6.94)

实施例16(对比)-TRI 50C钾盐的水溶解度

TRI 50c的UV/可见光谱及其溶解度如上述钙盐的方法获得。当以25mg/ml溶解时的溶解度：29mM(16mg/ml)

实施例17(对比)-TRI 50C的溶解度

TRI 50c的UV/可见光谱及其溶解度如上述钙盐的方法获得。TRI 50c的溶解度当以50mg/ml溶解时为8mM(4mg/ml)。

实施例18-大鼠中的十二指肠内吸收

A.制备TRI 50c及盐的液体制剂

1.制备缓冲溶液pH 4.5

将1.48g醋酸钠(无水)置于1000mL容量瓶，加入16mL 2NCH₃COOH，然后加入水并混合。用0.2N NaOH调节pH至4.5，用水填满。

2.制备缓冲溶液pH 6.8(USP)

将50.0mL一代磷酸钾0.2M置于200mL容量瓶中，加入22.4mL NaOH0.2M，用蒸馏水充满。测定pH并且如果需要进行调节。

3.制备制剂

●将10mg相关化合物放入一Eppendorf杯

●加入0.5mL乙醇并摇动10分钟

●超声处理10分钟

●加入1.5mL缓冲液

●再摇动15分钟

●产生靶浓度：5mg/mL

B.十二指肠内研究

十二指肠内研究使用约8周龄的体重在250-300g的雄性Wistar大鼠进行。

在给药前禁食一夜，并在给药后约2小时重新给予食物，水随意摄取。

用气态氟烷(halothane)麻醉动物。在腹部切一小口，定位十二指肠。通过使用恒定剂量体积4mL/kg直接注射进十二指肠，使每只动物接受单次对照或测试物给药。给药后用手术钉(surgical staples)封闭切口。

个体剂量体积基于给药当天获得的个体体重而定。

本研究采用的处理如下：

给药前约48小时以及给药后0.5，1，2，4和8小时经尾静脉将约0.6mL血液收集进3.8％柠檬酸三钠试管中。

于3000rpm、4℃离心10分钟制备血浆，在用自动凝血时间测定仪(automated coagulometer)分析前将血浆冷冻保存(通常-20℃)。

C.结果

表2：十二指肠内给药的大鼠的平均凝血酶时间

sd＝标准差

实施例19-大鼠中的口服吸收

A.制备TRI 50c及盐的液体制剂

进行实施例18的程序。

B.口服研究

经口研究用约8周龄的体重在250-300g的雄性Wistar大鼠进行。

在给药前禁食一夜，并在给药后约2小时重新给予食物，水随意摄取。

通过使用恒定剂量体积4mL/kg经管饲法使每只动物接受单次对照或测试物给药

个体剂量体积基于给药当天获得的个体体重而定。

本研究采用的处理如下：

给药前约48小时以及给药后0.5，1，2，4和8小时经尾静脉将约0.6mL血液收集进3.8％柠檬酸三钠试管中。

于3000rpm、4℃离心10分钟制备血浆，在用自动凝血时间测定仪分析前将血浆冷冻保存(通常-20℃)。

C.结果

表3：在口服给药后的大鼠中的平均凝血酶时间

sd＝标准差

实施例20-十二指肠内变异

分析实施例18中确定的凝血酶时间以确定凝血酶时间增加的标准差，以平均值的百分比表示(这有时也称作“变异系数”)。计算出Ca盐的变异比TRI 50c的低，见表4所示。

表4：十二指肠内给药的大鼠中的凝血酶时间

              ←时间→

产物       0h        0.5h     增加

TRI 50c    23.70     40.02    16.32

           23.10     40.20    17.10

           16.85     23.60    6.75

           21.67     62.55    40.88       SD       SD％

                 平均     20.26    14.53    71.7％

Ca盐    21.97    35.32    13.35

        18.75    45.98    27.23

        23.57    37.27    13.70

        21.57    49.30    27.73    SD       SD％

                 平均     20.50    8.06     39.3％

结论

实施例18和19示出硼酸的多价金属盐具有高口服生物利用度，其源于未知的技术效果而非溶解度。

实施例20示出硼酸的多价金属盐具有在口服生物利用度方面有低变异，其源于未知的技术效果而非溶解度。

推测这些技术效果可能以某种方式涉及硼酸根基团与金属离子的配位。

实施例21-在狗中的口服给药

在比格尔(beagle)犬中口服给药后研究TRI 50c(游离酸)及其钙盐的药物代谢动力学(PK)和药物动力学(PD)。三只雌性和三只雄性狗用于本研究。狗的体重为8-18kg。

使用自动凝血时间测定仪将凝血酶时间和APTT作为PD。用LCMS/MS方法测定血浆浓度。

将钙盐和TRI 50c充填进明胶胶囊并肠溶包衣(HPMCP 55)。以每只狗个体为基础调节剂量。如前所述在给药前、给药后0.5，1，1.5，2，3，6，8，12，16和24小时取血样加入柠檬酸三钠中。

A.结果

A.1耐受性

狗对TRI 50c和钙盐的耐受性均很好，在整个研究期间未见副作用。

A.2钙盐

在接受钙盐的狗中观察到令人意想不到地高平均凝血酶凝集时间。在给药后3小时观察到C max，平均凝血酶凝集时间为80.5秒(从15秒的基线升高而来)。在给药后8小时仍有平均凝血酶凝集时间的升高(平均20.2秒)。在口服给予钙盐后所有的狗均动力学响应，尽管应答有些差异。给予钙盐的所有狗凝血酶凝集时间峰值高达148秒，但大多数动物(6只中有四只)的峰值凝血酶时间至少升高4倍。

A.3TRI 50c

通过检查动力态响应(TT)而估计的吸收是可变的。在给药后1.5小时观察到峰值凝血酶时间(从基线15.4秒至34.2秒)。通过从动力学响应估计两只动物未显著吸收TRI 50c。

B.活化的部分促凝血酶原激酶时间

在TRI 50c给药后APTT从基线没有显著改变。在给予钙盐后3小时APTT有一非常轻微的平均升高(峰值从14.5秒至18秒)，这一升高不被认为是临床相关的。

C.生物利用度

通过将钙盐给药后凝血酶凝集时间转化为估计血浆浓度而估计生物利用度。

尽管应答中有一些变化，但是在口服吸收后观察到令人意想不到地高的钙盐吸收；包括两个低应答者在内的平均估计生物利用度为25％，在一些动物中高达50％。口服给药时，TRI 50c也是良好耐受的，尽管其动力学应答比钙盐低得多。

实施例22-TRI 50B对血小板促凝血活性的抑制

当加入用凝血酶预处理的血小板时，由单独的凝血酶、单独的胶原或凝血酶与胶原的混合物所引起的，在存在因子Va的情况中，可观测到血小板促凝血活性随因子Xa对凝血酶原的激活速度而增加。这种性质是由于血小板表面上阴离子磷脂的增加及伴随的微泡从表面释放所致。这是一个基本的生理学反应，其血小板产生促凝血活性能力下降的人(Scott综合征)示出出血倾向加重。

方法：

洗涤的血小板用1.15nM凝血酶，23μg/ml胶原或者两种物质的混合物在相同浓度在37℃处理。在加入激活物前1分钟或在与激活物温育后立即加入TRI 50b。如前述确定血小板促凝血活性(Goodwin C A et al，BiochemJ.1995 8，308：15-21)。

TRI 50b被证实是血小板促凝血活性的强力抑制剂，其IC50如下所概括。

表5：TRI 50b对由多种激动剂诱导的血小板促凝血活性的影响

表5

激动剂        无TRI 50b的提   IC50加上预温   IC50不用温育

              高倍数          育(nM)         (nM)

凝血酶        30              8              3000

胶原          45              200            300

凝血酶/胶原   110             3              80

表5示出例如当血小板用凝血酶处理时，其与对照血小板相比导致激活凝血酶原的速度提高30倍。用TRI 50在给定的多种浓度水平进行处理使这种加速度降低一半。通过IC₅₀值在纳摩尔范围内的事实表明了TRI 50的显著效力。

TRI 50b对ADP、胶原或肾上腺素诱导的洗涤的血小板聚集无作用。

实施例23-兔体外分流模型(extracorporeal shunt model)

绪言

这个技术描述了一种动物模型，其中产生了血小板富集的血栓。对比了TRI 50b与肝素的活性。

使用麻醉的兔的颈动脉和颈静脉产生含有悬浮的外源表面(丝线)的体外循环。通过高剪切应力湍流的动脉血流的产生、血小板激活、随后在存在血栓形成倾向(thrombogenic)表面的情况下凝聚而引发血栓沉积。组织病理学研究示出该血栓是血小板富集的。

材料和方法

动物：

使用NZW兔(雄性2.5-3.5kg)。允许动物摄取食物和水直至进行麻醉。

麻醉：

通过肌内注射术前给予动物术前用药共0.15ml的fontanel/氟阿尼酮(fluanisone)(Hypnorm)。用甲己酮(10mg/ml)诱导全身麻醉，随后进行气管插管。用氧/一氧化二氮中携带的异氟烷(isoflurane)(1-2.0％)保持麻醉。

手术准备：

将动物屈膝背卧放置，并对颈腹部备皮准备手术。暴露左颈动脉和右颈静脉。将大

导管(黄色规格)插入动脉，切至合适长度。将

导管插入静脉。吻合处包含5cm长的“自动分析仪”线(紫色/白色规格)。用中等大小的

管形材料在动脉侧连接吻合处。该吻合处在暴露于循环之前用盐水充填。在右侧股动脉插管以测定血压。丝线制备及插入：

吻合中央处含有一条长度为3cm的丝线。这条丝线由000规格Gutterman缝合线组成，在末端打一个外科结(打结处在吻合处之外)。

血流

血流速度使用Doppler探针(Crystal Biotech)确定。将硅胶探针在靠近插入动脉导管处置于颈动脉上。使用热敏纸将血流记录在图表记录器上。

结果

表6

处理	剂量	20分钟后血栓重量	抗血栓形成活性
				对照	N/A	22.4±2.2mg(n＝5)
TRI 50b	10mg/kg iv	9.78±1.9mg(n＝5)	活性

	3.0mg/kg iv	15.3±2.2mg(n＝5)	活性
				肝素	100u/kg iv	22.9±1.65mg(n＝4)	无活性
	300u/kg iv	10.5±1.4mg(n＝4)	活性(严重出血)

讨论

表6示出在动脉高剪切应力条件下，静脉内给予3mg/kg-10mg/kg剂量的TRI 50b显著抑制血栓形成而不出血，而肝素在治疗静脉血栓形成的正常临床剂量范围内(静脉内给予100u/kg肝素)无效。较高剂量的肝素尽管可以有作用，但导致严重出血。这些示出TRI 50b有效抑制动脉血栓形成而不出血的结果与TRI 50b抑制血小板促凝血活性一致。相反，凝血酶抑制剂肝素当在大约等效剂量(即抑制动脉血栓形成)给予时，产生严重的出血，而这种出血在使用凝血酶抑制剂治疗动脉血栓形成时是正常的。

实施例24-出血时间对比

这项研究的目的是在合适的模型中对比肝素与TRI 50b处理的出血时间。一般公认肝素是一种不太好的血小板促凝血活性的抑制剂(J.Biol.Chem.1978，253(19)：6908-16；Miletich JP，Jackson CM，Majerus PW1：J.Clin.Invest.1983，71(5)：1383-91)。

出血时间是在经静脉内给予肝素和TRI 50b之后在大鼠尾部出血模型中确定的。基于其在大鼠Wessler和动力学模型中的效力而选择应用剂量，选择的剂量如下：

TRI 50b：5和10mg/kg

肝素：100单位/kg

材料和方法

麻醉

将大鼠用60mg/kg的戊巴比妥钠(ip.注射30mg/ml溶液，2.0ml/kg)麻醉。如果需要ip.给予追加麻醉。

手术准备

颈静脉插管给予测试化合物。另外用合适的插管进行气管插管使动物自然呼吸“室内空气”。

化合物给予

这些化合物以1.0ml/kg剂量在合适的载体中经静脉内给予。肝素在盐水内给予，而TRI 50b溶解于乙醇中，然后将所得溶液加入水进行注射(1份乙醇对5份水)。

技术

在给予化合物后2分钟，用新的解剖刀切下2mm动物尾部末梢并将该尾部浸入标准“通用”容器中的温盐水(37℃)中，以便清晰观测血流。在横切后立即开始记录出血时间直至尾部末端血流停止。在尾部血流停止后再观察30秒，以确保不再发生出血，如果出血再次开始，记录时间持续记载直至最多45分钟。

结果

表7给出了出血结果概要并示出了在基线值之上的增加。

表7

出血结果总结表

处理	出血时间(分钟)(±SEM<sup>+</sup>)
		盐水	5.1±0.6
肝素100u/kg iv	＞40<sup>*</sup>
		TRI 50b 5mg/kg iv	11.3±1.2
TRI 50b 10mg/kg iv	30.4±5.2

^*在所有动物中均严重出血，在40分钟后不停止。

SEM＝平均值的标准误差

讨论

结果示出TRI 50b在所有剂量均优于肝素(产生较少的出血)。应注意当100u/kg肝素与5mg/kg TRI 50b相比时，肝素处理的动物与接受TRI 50b的动物相比更广泛出血；先前确定了(实施例25)肝素在100u/kg的剂量与3.0mg/kg剂量的TRI 50b相比，抑制动脉血栓形成的效力较差。肝素最初是一种凝血酶抑制剂，而对血小板促凝血活性的抑制较差；这个结果因此与TRI 50b除了凝血酶抑制活性之外通过抑制血小板凝血活性而发挥抗凝活性的结果一致。

实施例25-TRI 50C的前体药物TRI 50B：药物代谢动力学和吸收

材料和方法

动物

使用体重为大约250-300g的大鼠。动物只在用于iv.阶段的当天禁食。动物在进行口服和十二指肠内给药的研究的前一夜禁食，水允许给至直至麻醉时。

表8：

口期

处理	剂量mg/kg po	数目
			TRI 50b	20mg/kg	2
TRI 50c	20mg/kg	2

表9：

十二指肠内期(intraduodenal phase)

处理	剂量mg/kg po	数目
			TRI 50b	20mg/kg	3
TRI 50c	20mg/kg	3

剂量

制剂(TRI 50b/TRI 50c)

如下制备制剂：将48mg/ml的TRI 50b溶解于乙醇∶PEG 300(2∶3 vol∶vol)中。就在给药之前，将5体积的这个溶液与3体积的5％科利当(kollidon)17 8F混和。

将两种化合物均以20mg/kg剂量通过口腔管饲或者直接注入十二指肠。

化合物在PEG/乙醇/科利当制剂中给予，该制剂在立即使用之前制备，如在标题为“给药”的段落中所述：原液15.0mg/ml。这种给药剂量是1.33ml/kg(等于30mg/kg)。

方法

经口腔管饲

给予大鼠20mg/kg。在给予大约30分钟后，大鼠被麻醉。

十二指肠内给予

在完成麻醉和手术程序后，将化合物直接滴注入十二指肠中。

取血样

口期

在麻醉和手术后从颈动脉插管取血样(0.81ml)到(0.09ml)的3.8％w/v柠檬酸三钠中。第一次取样是在给药1小时后。然后在给药后1.5、2、4小时取血样。

十二指肠内期

取血样：在给药前、给药后0.25、0.5、0.75、1.0、2、3及4小时。

血浆

通过离心(3000RPM，10分钟)获得并在-20℃贮存直至进行分析。

结果

药物代谢动力学分析

图5：在给予TRI 50b或其游离酸(TRI 50c)后的口期清除率和动力学。

图6：在经十二指肠内给予TRI 50b或其游离酸(TRI 50c)后的口期清除率和动力学。

结论：

当通过十二指肠内途径给予时，TRI 50b达到比游离酸高的生物利用度(血浆峰浓度)。这个数据与在血浆中迅速水解为TRI 50c的TRI 50b及与是有效成分的TRI 50c一致。

与实施例18-21的数据一起，实施例22-25的结果表明以钙盐的形式口服给予TRI 50c提供了一种治疗动脉血栓形成和/或静脉血栓形成的良好方式。

实施例26-人体临床研究

在使用至多2.5mg/kg iv.剂量(显著延长凝血酶凝固时间的剂量)的人体临床志愿者研究中，TRI 50b对Simplate出血时间(即使用

出血时间设备测定的出血时间)无作用。

实施例27-TRI 50C钙盐的残余正庚烷

通过headspace气相色谱法测试根据实施例1和3的方法制备的盐。数据如下所示：

残余溶剂：Headspace气相色谱法
	GC参数：柱：                DB-wax，30m，0.32mm ID，5μ载气：              Helium 5.0，80kPas检测仪：            FID，220℃注射器温度：        150℃操作条件：          35℃/7min；10℃/min直至80℃/2min；40℃直至180℃/2min注射体积：          1mlSplit：             OnHeadspace参数：炉温：              70℃针温度：            90℃转移温度：          100℃其它参数：          回火(temper)时间：15min，GC-循环时间：28min，注射时间：          0.03min，持续：0.4min

实施例28-HPLC层析

通过HPLC色谱分析通过实施例1、2和3的方法制备的TRI 50c半钙盐，以及用同样方法学制备的TRI 50c单钠盐。

1.方法

1.1设备和软件

自动取样器        Waters Alliance 2795

泵                Waters Alliance 2795

柱加热炉          Waters Alliance 2795

检测              Waters 2996diode array，MS-ZQ single quad

软件版本          Waters Millennium 4.0

1.2固定相

分析柱ID                    S-71

材料                        XTerra^TM MS C₁₈，5μm

供应商                      Waters，Eschborn，Germany

尺寸                        150mm x 2.1mm(长度，ID)

前置柱(Pre-colunm)ID        无前置柱

Xterra MS C₁₈，5μm是由Waters Corporation，34Maple Street，Milford，MA 01757，US及本地分支机构在2002/2003年供应的柱填充材料，其包含杂合有机/无机颗粒，由5μm大小、

孔径和15.5％碳荷载的球形颗粒组成。

1.3流动相

水相：          A：H₂O+0.1％HCOOH

有机相：        C：ACN

H₂O＝Ultra Clear水净化系统提供的H₂O

ACN＝梯度级乙腈

梯度条件

时间[min]	A％	C％	流速[mL/min]	梯度形状
					0.0	90.0	10.0	0.5
27.00	10.0	90.0	0.5	线性
					27.10	90.0	10.0	0.5	线性
30.00	90.0	10.0	0.5	线性

1.4仪器参数

流速            0.5mL-min^-1

温度            40±5℃

HPLC控制        Waters Millennium Release 4.0

计算            Waters Millenium 4.0

2.参数

2.1波长/保留时间/响应系数(response factor)

表：保留和检测参数(k’F：0.5ml/min，t0＝0.9mL/min)

物质	RetTime[min]	λ[nm]	m/z	响应系数[面积/μg]	响应系数的倒数
						TRI 50c	11.68	258	508.33	660	1
苄醇	3.862	258	n.d.	1960	0.337
						苯甲醛	6.13	258	n.d.	79939	0.0083
苯甲酸	5.52	258	n.d.	5967	0.111
						杂质I	11.18	258	396.17	886	0.745
杂质II	13.39	258	482.22	552	1.196

2.2线性

线性范围4000-10μg/mL(检测UV 258nm)

表：线性数据UV 258nm

校准溶液	面积[μAU’s]	目标浓度[μg/mL]	发现的浓度<sup>1</sup>[μg/mL]
				Tri 50c	5353	10	20.44
Tri 50c	5301	10	20.37
				Tri 50c	65809	100	113.35
Tri 50c	66365	100	114.17
				Tri 50c	172019	250	270.43
Tri 50c	162587	250	256.48
				Tri 50c	339503	500	518.13
Tri 50c	326912	500	499.51
				Tri 50c	659257	1000	991.02
Tri 50c	647495	1000	973.63
				Tri 50c	1322371	2000	1971.72
Tri 50c	1305196	2000	1946.32
				Tri 50c	2724410	4000	4045.24

¹根据线性方程重新计算

线性方程参数：

Y    ＝    6.75e+002X-8.45e+003

r    ＝    0.99975

r²   ＝    0.99950

线性范围10-0,10μg/mL(检测SIR m/z 508，33)

表：线性数据SIR 508.33

校准溶液	平均面积[μAU’s]	目标浓度[μg/mL]	发现的浓度<sup>1</sup>[μg/mL]
				Tri 50c	2188860	0.01	0.022
Tri 50c	2702839	0.01	0.045
				Tri 50c	3817226	0.1	0.094
Tri 50c	3833799	0.1	0.095
				Tri 50c	23153550	1	0.947
Tri 50c	24646892	1	1.013
				Tri 50c	223007852	10	9.765
Tri 50c	233753043	10	10.239

¹根据线性方程重新计算

方程参数：

Y    ＝    2.27e+007X+1.69e+006

r    ＝    0.99958

r²   ＝    0.99916

2.3定量限度

用信噪比标准S/N＞19确定定量限度

UV 258nm：10μg/mL

M/z 508.3：0.1μg/mL

2.4精度

注射	目标浓度[μg/mL]	面积	量[μg/mL]	保留时间[min]
					1	250	165805	261.24	11.690
2	250	168644	265.44	11.662
					3	250	167858	264.27	11.686
4	250	166947	262.93	11.692
					5	250	166925	262.89	11.679

6	250	166294	261.96	11.696
					平均		167079	263.12	11.684
Std.Dev.		1033	1.528	0.01
					％RSD		0.6	0.6	0.1

2.5稳健性(robustness)

表：稳健性数据；标准250μg/mL水溶液(含有＜1％ACN)

校准溶液	温度/时间[℃/h]	面积[μAU’s]	回收[％]
				250μg/mLTri50c	-	172020	-
250μg/mLTri50c	4℃.16h	166294	96.67
				2.5μg/mLTRI50c	-	88034891	-
2.5μg/mLTRI50c	37℃.4h	88833175	100.9

参考文献

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2.FDA Reviewer Guidance.Validation of chromatographic methods.Center forDrug Evaluation and Research.Nov.1994

3.USP 23.<621>Chromatography

4.L.Huber.Validation of analytical Methods.LC-GC International Feb.1998

5.Handbuch Validierung in der Analytik.Dr.Stavros Kromidas(Ed.)Wiley-VCHVerlag.2000.ISBN 3-527-29811-8

3.结果

3.1样品名称：TRI 50c单钠盐

注射体积：10μL

名称       保留时间    面积      面积         峰高

           (Min)       ％        [μAU’s]    μAU

TRI 50c    12.136      100.0000  604.27228    32.05369

3.2样品名称：TRI 50c半钙盐

注射体积：10μL

名称        保留时间    面积      面积         峰高

            (Min)       ％        [μAU’s]    μAU

TRI 50c     12.126      100.0000  597.11279    32.29640

本文公开的方法用于获得基本上不含C-B键降解产物的盐，特别是不含HPLC可检测的量的这种产物的盐，特别是由实施例28的方法制得的盐。本文公开的方法用于获得基本上不含杂质I的盐，特别是由实施例28的方法获得的不含HPLC可检测的量的杂质I的盐。本文公开的方法用于获得基本上不含杂质IV的盐，特别是由实施例28的方法获得的不含HPLC可检测的量的杂质IV的盐。

实施例29-非对映异构体过量的测定

TRI 50b粗制品含有三个手性中心，其中的两个通过使用对映体纯的氨基酸((R)-Phe和(S)-Pro)而固定，第三个在合成中形成。有利的差向异构体是所需的TRI 50b，异构体I(R，S，R-TRI 50b)。TRI 50b的差向异构体均通过HPLC方法基线分离，由此可以确定TRI 50b的非对映异构体过量(de)。

TRI 50d在进行HPLC纯度测定的条件下不稳定，在样品制备时迅速分解成TRI 50c，因此TRI 50d和TRI 50c显示出相同的HPLC踪迹。

TRI 50c的两个异构体不是在HPLC基线分离的，但是两个异构体均清晰可见。当TRI 50b粗制品(两个异构体的混合物)用苯基硼酸转化成TRI 50c粗制品时，这变得更明显。TRI 50c的两个异构体在HPLC中均可观察到，其几乎与如前在TRI 50b粗制品中有相同的关系。

从TRI 50b粗制品合成TRI 50d时，仅沉淀出一个非对映异构体。在此情况下，HPLC显示TRI 50c一个峰，其中观察到一非常小的前峰(fronting)。从二氯甲烷/二乙醚沉淀有效除去了前峰。异构体II的去除水平不能用此HPLC方法定量，因此在再沉淀之前以及在一和两次再沉淀之后样品用频哪醇酯化，所得的TRI 50b样品用HPLC分析。由此确定粗样品的de为95.4％。再沉淀样品的de为99.0％，再沉淀两次的样品显示de为99.5％。

这些结果清楚表明了异构体I的优选的沉淀，而异构体II保留在溶液中。

从前述内容意识到本发明提供了用作药物的硼酸盐，其特点是如下一或多种性质：(1)改良的口服生物利用度的量；(2)改良的口服生物利用度一致性；(3)改良的稳定性；(4)无论如何现有技术未提及的。

药物组合物的活性成分的选择是一项复杂的工作，不仅需要考虑生物学性质(包括生物利用度)，还要考虑适于加工、配制和贮存的物理化学性质。生物利用度自身依赖于多种因素，通常包括体内稳定性、溶剂化性质及吸收性质，每项因素依次又潜在地依赖于多种物理、化学和/或生物学行为。

本发明包括下列各项主题：

1.一种口服药物制剂，其包含一种药物可接受的多价金属和有机硼酸药物的盐。

2.第1项所述的制剂，其中所述金属是第II族或第III族金属或锌。

3.第1项或第2项所述的制剂，其中所述金属是二价的。

4.第1项所述的制剂，其中所述金属是钙。

5.第1项所述的制剂，其中所述金属是镁。

6.第1-5项任一项所述的制剂，其中所述有机硼酸是疏水性的。

7.第1-6项任一项所述的制剂，其中所述有机硼酸包含硼酸肽或硼酸肽模拟物。

8.第1-6项任一项所述的制剂，其中所述有机硼酸具有式(I)：

其中：

R¹是H或非带电的侧链基团；

R²是H或任选地含有链内氧或硫并任选地由选自卤素、羟基和三氟甲基的一个取代基取代的C₁-C₁₃烃基；

或者R¹和R²一起形成一个C₁-C₁₃基团，其与N-CH组合形成一个4-6元环并且其选自链烯基(支链或直链)和含有链内硫或通过硫与N-CH连接的链烯基；

R³与R¹相同或不同，只要R¹和R²中不超过一个是H，且是H或非带电侧链基团；

R⁴是H或任选地含有链内氧或硫并任选地由选自卤素、羟基和三氟甲基的一个取代基取代的C₁-C₁₃烃基；

或者R³和R⁴一起形成一个C₁-C₁₃基团，其与N-CH组合形成一个4-6元环并且其选自链烯基(支链或直链)和含有链内硫或通过硫与N-CH连接的链烯基；以及

R⁵是X-E-，其中E不存在或者是选自氨基酸(天然或非天然)和两个或多个氨基酸(天然或非天然)的肽(所述肽中超过一半的氨基酸是疏水性的)的疏水性基团，且X是H或一个氨基保护基。

9.第8项的制剂，其中R²和R⁴是H，或者R²是H且R³和R⁴一起形成所述的C₁-C₁₃基团。

10.第8项或第9项的制剂，其中所述任选地含有链内氧或硫的烃基选自烷基；由环烷基、芳基或杂芳基取代的烷基；环烷基；芳基；和杂芳基。

11.第8-10项任一项的制剂，其中E不存在。

12.第8-10项任一项的制剂，其中E是疏水性氨基酸。

13.第1-6项任一项的制剂，其中所述有机硼酸具有式(II)：

其中

R⁷是X-E′-，其中X是氢或一个氨基保护基，且E′不存在或者是一个疏水性氨基酸；

R⁸是含有1-5个碳原子的任选地取代的基团，并且选自烷基、烷氧基和烷氧基烷基，任选的取代基是羟基和卤素(F，Cl，Br，I)；以及

aa^h是疏水性氨基酸，或是由一种C₁-C₁₃烃基进行N-取代的甘氨酸，所述C₁-C₁₃烃基任选地含有链内氧或硫并任选地由选自卤素、羟基和三氟甲基的一个取代基取代。

14.第8-13项任一项的制剂，其中X是R⁶-(CH₂)_p-C(O)-，R⁶-(CH₂)_p-S(O)₂-，R⁶-(CH₂)_p-NH-C(O)-或R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)-，其中p是0，1，2，3，4，5或6，且R⁶是H或一个5-13元环状基团，其任选地由选自卤素、氨基、硝基、羟基、C₅-C₆环状基团、C₁-C₄烷基和含有一个链内O和/或通过一个链内O与所述环状基团连接的C₁-C₄烷基的1、2或3个取代基取代，前述烷基任选地由选自卤素、氨基、硝基、羟基和C₅-C₆环状基团取代。

15.第14项的制剂，其中所述5-13元环状基团是芳环或杂芳环。

16.第15项的制剂，其中所述5-13元环状基团是苯基或6元杂芳基。

17.第14-16项任一项的制剂，其中X是R⁶-(CH₂)_p-C(O)-或R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)-，且p是0或1。

18.第1-6项任一项的制剂，其中有机硼酸是丝氨酸蛋白酶抑制剂。

19.一种口服药物制剂，包含一种药物可接受的多价金属和一种凝固丝氨酸蛋白酶的有机硼酸抑制剂的盐。

20.第19项的制剂，其中有机硼酸是肽硼酸。

21.第19项或第20项的制剂，其中有机硼酸是凝血酶抑制剂。

22.第21项的制剂，其中凝血酶抑制剂具有一中性凝血酶S1结合基团，其与一疏水性凝血酶S2/S3结合基团连接。

23.第21项的制剂，其中有机硼酸具有式(III)：

其中

Y包含一个基团，其与片段-CH(R⁹)-B(OH)₂一起具有对凝血酶底物结合位点的亲和性；以及

R⁹是由一或多个醚键间断的直链烷基，并且其中氧和碳原子的总数是3-6个，或者R⁹是-(CH₂)_m-W，其中m是2-5且W是-OH或卤素(F，Cl，Br或I)。

24.第23项的制剂，其中Y包含一个结合凝血酶的S2亚位点并且经一个肽键与-CH(R⁹)-B(OH)₂连接的氨基酸，所述氨基酸在其N-末端与一个结合凝血酶S3亚位点的基团连接。

25.第23项的制剂，其中Y是任选地N-末端保护的二肽残基，其结合凝血酶的S3和S2结合位点并且经一肽键与-CH(R⁹)-B(OH)₂连接，所述酸中的肽键任选地并独立地由一C₁-C₁₃烃基N-取代，所述C₁-C₁₃烃基任选地含有链内氧或硫并任选地由选自卤素、羟基和三氟甲基的一个取代基取代。

26.第25项的制剂，其中N-末端保护基是如第13-17任一项定义的基团X(除氢之外)。

27.第25或26项的制剂，其中有机硼酸具有一N-末端保护基和未取代的肽键。

28.一种口服药物制剂，其包含一种药物可接受的多价金属和式(IV)的肽硼酸的盐：

其中：

X是H(以形成NH₂)或一个氨基酸保护基；

aa¹是一个氨基酸残基，其具有一个含不超过20个碳原子的烃基侧链并包含至少一个具有至多13个碳原子的环状基团；

aa²是一个具有4-6个环成员的亚氨基酸残基；

R9是由一或多个醚键间断的直链烷基，并且其中氧和碳原子的总数是3-6个，或者R⁹是-(CH₂)_m-W，其中m是2-5且W是-OH或卤素(F，Cl，Br或I)。

29.第28项的制剂，其中aa¹具有一个含至多13个碳原子的烃基侧链。

30.第28项的制剂，其中aa¹的一个或多个环状基团是芳基。

31.第28项的制剂，其中aa¹的一个或多个环状基团是苯基。

32.第28项的制剂，其中aa¹具有一个含一或两个环烃基的烃基侧链。

33.第28项的制剂，其中aa¹是Phe，Dpa或其全部或部分氢化的类似物。

34.第28项的制剂，其中aa¹选自Dpa，Phe，Dcha和Cha。

35.第28-34项任一项的制剂，其中aa¹是R-构型。

36.第35项的制剂，其中aa¹是(R)-Phe(即D-Phe)或(R)-Dpa(即D-Dpa)。

37.第35项的制剂，其中aa¹是(R)-Phe。

38.第28-31项任一项的制剂，其中aa²是式(V)的亚氨基酸残基：

其中R¹¹是-CH₂-，CH₂-CH₂-，-S-CH₂-或-CH₂-CH₂-CH₂-，该基团当所述环是5或6元环时任选地在一或多个-CH₂-基团被1-3个C₁-C₃烷基取代。

39.第38项的制剂，其中aa²是S-构型。

40.第38项的制剂，其中aa²是(S)-Pro。

41.第28项的制剂，其中aa¹-aa²是(R)-Phe-(S)-Pro(即D-Phe-L-Pro)。

42.第28-41项任一项的制剂，其中R⁹是2-溴乙基，2-氯乙基，2-甲氧乙基，3-溴丙基，3-氯丙基或3-甲氧丙基。

43.第28-41项任一项的制剂，其中R⁹是3-甲氧丙基。

44.第28项的制剂，其中肽硼酸是式(IX)的化合物：

X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂(IX)，

其中X如第28或24项的定义。

45.第28-44项任一项的制剂，其中X是R⁶′-(CH₂)_p-C(O)-或R⁶′-(CH₂)_p-O-C(O)-，其中R6′是苯基或一个6元杂芳基且p是0或1。

46.第28-44项任一项的制剂，其中X是苄氧基羰基。

47.第28-46项任一项的制剂，其中所述盐是肽硼酸的二价金属盐。

48.第47项的制剂，其中金属是钙。

49.第47项的制剂，其中金属是镁。

50.第28-46项任一项的制剂，其中金属是肽硼酸的第III族金属盐。

51.第50项的制剂，其中金属是铝。

52.第50项的制剂，其中金属是镓。

53.第1-52项任一项的制剂，其具有与制剂中主要携带一个单天然电荷的硼酸根一致的化学计量。

54.一种口服给药的药物组合物，其包含如下化合物的钙盐：

Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂。

55.第54项的制剂，其中所述盐是酸式盐。

56.第1-55项任一项的制剂，其中所述盐包含来自硼酸的一个硼酸根离子和一个平衡离子，并且其中所述盐基本上由一种具有一单一类型平衡离子的盐组成。

57.第1-56项任一项的制剂，其为片剂或胶囊形式。

58.口服剂型的药物制剂，其包含第1-56项任一项定义的盐和一种药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

59.第1-58项任一项的制剂，其适于在十二指肠释放所述盐或产物。

60.第59项的制剂，其是肠溶的。

61.一种药物学可接受的多价(至少二价)金属和一种有机硼酸药物(其中术语“药物”包含前体药物)的盐，其中观察的化学计量与具有n∶1的理论药物∶金属化学计量的盐的主要部分一致，其中n是金属化合价。

62.第61项的盐，其中观察的化学计量与基本上由具有V∶1的理论药物∶金属化学计量的盐组成的盐一致。

63.第61或62项的盐，其进一步如第1-53或55项任一项的定义。

64.一种药物学可接受的多价金属和第23-27项任一项所定义的式(III)的有机硼酸的盐。

65.一种药物学可接受的多价金属和式(IV)的肽硼酸的盐：

其中：

X是H(以形成NH₂)或一个氨基保护基；

aa¹是一个氨基酸残基，其具有一个含不超过20个碳原子的烃基侧链并包含至少一个具有至多13个碳原子的环状基团；

aa²是一个具有4-6个环成员的亚氨基酸残基；

R⁹是由一或多个醚键间断的直链烷基，并且其中氧和碳原子的总数是3-6个，或者R⁹是-(CH₂)_m-W，其中m是2-5且W是-OH或卤素(F，Cl，Br或I)。

66.第65项的盐，其由第29-52项任一项的特征或者其可允许的组合所定义。

67.化合物Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的钙盐。

68.第67项的钙盐，其具有基本上为2∶1的观察化学计量(化合物∶钙)。

69.一种用于制备第65-68任一项的盐的物质组合物，其包含第28-46或54项任一项所定义的有机硼酸的碱金属盐。

70.第23-46或54项任一项定义的式(IV)的化合物的钠盐。

71.第23-46或54项任一项定义的式(IV)的化合物的钾盐。

72.在水溶液中的第57-59任一项的盐。

73.一种抑制凝固丝氨酸蛋白酶以治疗疾病的方法，包括口服给予哺乳动物治疗有效量的一种选自由第19-60任一项的制剂和第64-68任一项的盐组成的组中的产物。

74.第73项的方法，其中活性成分处于一种适于在十二指肠释放所述活性成分的制剂中。

75.第64-68任一项的盐在制备用于治疗、例如预防血栓形成的口服药物中的用途。

76.一种通过预防或治疗而治疗静脉和/或动脉血栓形成的方法，包括给予患有或处于患有静脉和/或动脉血栓形成的危险中的哺乳动物治疗有效量的一种选自由第23-60任一项的制剂和第64-68任一项的盐组成的组中的产物。

77.第76项的方法，其中所述疾病是急性冠状动脉综合征。

78.第76项的方法，其中所述疾病是急性心肌梗死。

79.第76项的方法，其中所述疾病是选自深部静脉血栓形成和肺栓塞的静脉血栓栓塞事件。

80.一种在患者血液透析通路中预防血栓形成的方法，包括给予患者治疗有效量的选自由第23-60任一项的制剂和第64-68任一项的盐组成的组中的产物。

81.一种在患有晚期肾病的患者中预防心血管事件的方法，包括给予患者治疗有效量的选自由第23-60任一项的制剂和第64-68任一项的盐组成的组中的产物。

82.一种在接受或即将接受通过留滞导管进行的化疗的患者中预防静脉血栓栓塞事件的方法，包括给予患者治疗有效量的选自由第23-60任一项的制剂和第64-68任一项的盐组成的组中的产物。

83.一种在进行或即将进行下肢动脉重建性手术的患者中预防血栓栓塞事件的方法，包括给予患者治疗有效量的选自由第23-60任一项的制剂和第64-68任一项的盐组成的组中的产物。

84.一种抑制血小板促凝活性的方法，包括给予处于患有或正在患有动脉血栓形成的哺乳动物治疗有效量的选自由第23-60任一项的制剂和第64-68任一项的盐组成的组中的产物。

85.第84项的方法，其中所述疾病是急性冠状动脉综合征。

86.一种通过治疗或预防而治疗动脉疾病的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的选自由第23-60任一项的制剂和第64-68任一项的盐组成的组中的产物，所述动脉疾病选自急性冠状动脉综合征、脑血管血栓形成、周围动脉闭塞、和产生自房颤、瓣膜心脏疾病、动静脉支路、留滞导管或冠脉支架的动脉血栓形成。

87.第86项的方法，其中所述疾病是急性冠状动脉综合征。

88.第64-68任一项的盐在制备用于第73和75-87任一项所述治疗的药物中的用途。

89.一种药物制剂，包含(i)第64-68任一项的盐和(ii)另一种药物活性剂的组合。

90.一种药物制剂，包含(i)第64-68任一项的盐和(ii)另一种心血管治疗剂的组合。

91.第90项的制剂，其中另一种心血管治疗剂包含降脂药、贝特类药、烟酸、抑制素、CETP抑制剂、胆酸螯合剂、抗氧化剂、IIb/IIIa拮抗剂、醛甾酮抑制剂、腺苷A2受体拮抗剂、腺苷A3受体激动剂、β-阻断剂、乙酰水杨酸、袢利尿剂、ace抑制剂、具有不同作用机制的抗血栓形成剂、抗血小板剂、血栓烷受体和/或合成酶抑制剂、纤维蛋白原受体拮抗剂、前列环素模拟物、磷酸二酯酶抑制剂、ADP-受体(P2T)拮抗剂、溶栓剂、保心剂或COX-2抑制剂。

92.第23-60任一项所定义的盐在制备用于与另一种心血管治疗剂共给药而治疗、例如预防心血管疾病的药物中的用途。

93.一种产物，其包含第44项所定义的式(IX)的化合物与二乙醇胺的加成物。

94.一种物质组合物，包含：

(i)式(X)的物质(species)

其中X是H或一个氨基保护基，所述硼原子任选地额外与一氮原子配位，末端氧的价态是开放的(它们可以附着于第二个共价键、被离子化为-O^-或者具有一些其它例如中间体状态)；并且键合以下物质：

(ii)式(XI)的物质(species)

其中氮原子和两个氧原子的价态是开放的。

95.第94项的组合物，其中式(X)的物质的末端氧原子和式(XI)的物质的氧原子是相同氧原子，即式(XI)的物质与式(X)的物质形成二醇酯。

96.一种药物，其包含一种药物学可接受的二价金属和一种有机硼酸的盐，所述有机硼酸是选择性凝血酶抑制剂并具有一中性凝血酶S1亚位点结合基团。

97.第96项的药物，其中所述选择性凝血酶抑制剂是第23-27任一项定义的式(III)的有机硼酸。

98.第96或97项的药物，其中所述选择性凝血酶抑制剂对凝血酶的Ki约为100nM或更少。

99.第98项的药物，其中所述选择性凝血酶抑制剂对凝血酶的Ki约为20nM或更少。

100.一种稳定有机硼酸的方法，包括将其以多价盐的形式提供。

101.一种配制有机硼酸药物以增加药物稳定性的方法，包括将酸配制成与多价金属的酸式盐形式。

102.一种适于口服给药的药物制剂，包含

a)选自式(III)的硼酸、所述硼酸的硼酸根离子和所述硼酸和硼酸根离子的平衡形式的第一种物质(species)：

其中

Y包含一个基团，其与氨基硼酸残基-NHCH(R⁹)-B(OH)₂一起具有对凝血酶底物结合位点的亲和性；以及

R⁹是一个由一或多个醚键间断的直链烷基，其中氧和碳原子的总数是3，4，5或6，或者R⁹是-(CH₂)_m-W，其中m是2，3，4或5，且W是-OH或卤素；以及

(b)选自n价的多价金属离子的第二种物质(species)，

其中所述制剂的第一与第二种物质的观察化学计量与理论化学计量n∶1基本上一致。

(第102-139项不存在)。

140.一种分离式(I)的硼酸的非对映异构体的方法：

其中：

X是H(以形成NH₂)或一个氨基保护基；

aa¹是一个(R)构型的氨基酸，选自Phe，Dpa及其全部或部分氢化的类似物；

aa²是一个具有4-6个环成员的(S)构型的亚氨基酸；

R¹是式-(CH₂)_s-Z的基团，其中s是2，3或4，且Z是-OH，-OMe，-OEt或卤素(F，Cl，Br或I)，

以及其中C^*是一个手性中心，

所述方法包括：

(A)将选自硼酸(I)及其酯的一种硼酸物质在二乙醚中的起始溶液与醇组合，所述的醇中唯一的潜在电子供体杂原子是氧，所述的氧在硼酸酯中相应于酯官能团的氧，所述起始溶液同时含有具有(R)构型手性中心C^*的硼酸物质(species)以及具有(S)构型手性中心C^*的硼酸物质(species)；以及(B)二乙醇胺，所述二乙醇胺的量基于手性中心C^*为(R)构型的硼酸物质为1.25±0.1当量，并混和以形成混合物；

促使或使得硼酸物质与二乙醇胺反应直至形成沉淀；以及

回收沉淀。

141.第140项的方法，其中二乙醇胺的量基于手性中心C^*为(R)构型的硼酸物质(boronic species)为1.2-1.3当量。

142.第141项的方法，其中二乙醇胺的量基于硼酸物质为约1.25当量。

143.第140-142任一项的方法，其中醇为二醇。

144.第143项的方法，其中二醇是没有空间位阻的。

145.第144项的方法，其中二醇是频哪醇，新戊二醇，1，2-乙二醇，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，2，3-丁二醇，1，2-二异丙基乙二醇或5，6-癸二醇。

146.第145项的方法，其中二醇是频哪醇。

147.第140-146任一项的方法，其中通过加热混合物至升高的温度促使硼酸物质和二乙醇胺反应。

148.第147项的方法，其中混合物被回流加热。

149.第148项的方法，其中混合物被回流加热至少10小时。

150.第140-149任一项的方法，其中沉淀通过过滤而回收。

151.第140-150任一项的方法，其中回收的沉淀用二乙醚洗涤。

152.第140-151任一项的方法，其中回收的沉淀，当需要洗涤时在洗涤后，溶解于选自CH₂Cl₂和CHCl₃的溶剂中，并且通过将所得溶液与二乙醚组合而再沉淀。

153.第152项的方法，其中溶剂是CH₂Cl₂。

154.第140-153任一项的方法，其中aa¹选自(R)-Dpa，(R)-Phe，(R)-Dcha和(R)-Cha。

155.第140-154任一项的方法，其中起始溶液中的硼酸物质包含50％-60％的具有(R)-构型手性中心C^*的分子和40％-50％的具有(S)-构型手性中心C^*的分子。

156.第140-155任一项的方法，其进一步包括将回收的沉淀转化为式(I)的酸，其通过如下步骤进行：将回收的沉淀溶解于选自卤代烃及其组合的有机溶剂中，搅拌所得的有机溶液和一种pH低于3的含水酸以此将溶解的沉淀转化为式(I)酸，以及通过蒸发回收式(I)酸。

157.第156项的方法，其中有机溶液与含水酸接触时间是充分受限的，从而基本上避免C-B键断裂。

158.第157项的方法，其中当接触在室温进行时，接触时间不超过30分钟。

159.第156-158任一项的方法，其中含水酸是浓度约为2％w/v的盐酸或者类似pH的另一种含水无机酸。

160.第156-159任一项的方法，其中有机溶剂选自CH₂Cl₂和CHCl₃。

161.第160项的方法，其中有机溶剂是CH₂Cl₂。

162.第156-161任一项的方法，其中式(I)酸被干燥。

163.第162项的方法，其中当式(I)酸在有机溶剂中时，通过将溶剂与一种吸湿固体接触而将所述酸干燥。

164.第156-163任一项的方法，其中当式(I)酸在有机溶剂中时，将其用铵盐水溶液洗涤。

165.第156-164任一项的方法，其中从回收的式(I)酸蒸发有机溶剂。

166.第156-165任一项的方法，其进一步包括将回收的式(I)的酸转化成其药物学可接受的碱加成盐，这是通过如下步骤进行：将酸溶解于乙腈中，将所得溶液与一种药物学可接受的碱的水溶液或悬浮液组合，促使或使得碱与酸反应，然后蒸发至干燥以获得蒸发残渣。

167.第166项的方法，其中促使或使得酸与碱反应的步骤包括在不超过35℃的温度下搅拌酸的乙腈溶液和碱的水溶液或悬浮液的组合。

168.第167项的方法，其中温度不超过25℃。

169.第166-168任一项的方法，其进一步包括：

(i)将蒸发残渣重溶于乙腈中并蒸发所得溶液至干燥；和

(ii)重复步骤(i)至需要次数，以获得干燥的蒸发残渣。

170.第169项的方法，其中当在真空干燥器中于40℃、100mbar下干燥2小时后测定的干燥的蒸发残渣的干燥损失约小于0.5％。

171.第169或170项的方法，其进一步包括：

将干燥蒸发残渣溶解于乙腈或四氢呋喃中以形成一种溶液；

以足够慢而防止絮凝物形成的速度将所述溶液添加到二乙醚和一种脂族或脂环族溶剂的3∶1-1∶3v/v混合物中以形成沉淀，所述溶液以1∶5-1∶15v/v的(溶液∶混合物)比率加入到所述二乙醚/脂族(脂环族)溶剂混合物中；

回收所述沉淀；以及

在减压下同时保持温度不超过35℃从回收的沉淀中除去溶剂。

172.第171项的方法，其中进行除去溶剂的过程直至当通过在真空干燥器中于40℃、100mbar干燥2小时后测定的沉淀的干燥损失低于约0.5％。

173.第171或172项的方法，其中干燥过程开始时的温度约为10℃，且在干燥过程中增加至约35℃。

174.第171-173任一项的方法，其中脂族或脂环族溶剂是正庚烷。

175.第166-174任一项的方法，其中所述碱包括n价阳离子并以约n∶1的化学计量(硼酸∶碱)使用。

176.第166-175任一项的方法，其中所述碱是碱金属或碱土金属碱。

177.第166-176任一项的方法，其中所述碱是氢氧化钠。

178.第171-175任一项的方法，其中所述碱是氢氧化钠，且干燥蒸发残渣溶于乙腈中。

179.第171-175任一项的方法，其中所述碱是氢氧化钙。

180.第171-175任一项的方法，其中所述碱是氢氧化钙，且干燥蒸发残渣溶于四氢呋喃中。

181.一种水解第140或154项定义的硼酸的酯的方法，包括将所述酯与一种水性介质接触足够短的时间，该段时间短至基本避免C-B键裂解。

182.第181项的方法，其中水性介质是pH约小于3的含水酸。

183.第182项的方法，其中含水酸为浓度约2％w/v的盐酸或者具有类似pH的另一种含水无机酸。

184.第181-183任一项的方法，其中接触时间约30分钟或更少。

185.第181-184任一项的方法，其在约为25℃±2℃的温度下进行。

186.第181-185任一项的方法，其中所述酯是二乙醇胺酯。

187.一种制备第140或154项定义的硼酸的药物学可接受的碱加成盐的方法，包括：

将硼酸溶解于乙腈中；

将所得溶液与药物学可接受的碱的水溶液或悬浮液组合，促使或使得碱与硼酸反应；

蒸发至干燥以获得蒸发残渣；

将蒸发残渣重溶于乙腈中，并蒸发所得溶液至干燥；和

重复前述步骤至所需次数以获得基本上干的蒸发残渣。

188.一种制备第140或154项的硼酸或其药物学可接受的碱加成盐的方法，所述硼酸的R¹基团为式-(CH₂)_s-O-R³，其中R³是甲基或乙基，s独立地是2，3或4，所述方法包括：

将1-金属烷氧基烷烃与一种硼酸酯反应以形成式(VI)的化合物，其中所述烷氧基烷烃具有式-(CH₂)_s-O-R³：

(HO)₂B-(CH₂)_s-O-R³    (VI)，

以及从式(VI)的化合物合成硼酸，并且如果需要将酸转化成其盐。

189.第188项的方法，其中硼酸的合成以及所进行的向其盐转化涉及第140-187任一项的方法。

190.选自第140或154项定义的式(I)的硼酸及其碱加成盐的化合物，所述化合物的手性纯度与通过第140-187任一项的方法产生的手性纯度相同。

191.选自第140或154项定义的式(I)的硼酸及其碱加成盐的化合物，所述化合物具有约95％或更高的非对映异构体过量，任选地约99％或更高、例如约99.5％或更高。

192.选自Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的单锂、单钠和单钾盐的盐，其纯度约为通过实施例3的方法制备的这种盐的纯度。

193.第192项的盐，具有约99.5％或更多的非对映异构体过量，其纯度当用实施例43的方法测定的％HPLC峰面积表示时至少为97.5％。

194.第192或193项的盐，其是单钠盐。

195.选自Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的半钙盐和半镁盐，其纯度约为通过实施例4的方法制备的这种盐的纯度。

196.第195项的盐，具有约99.5％或更多的非对映异构体过量，其纯度用实施例43方法测定的％HPLC峰面积表示至少为97.5％。

197.第195或196项的盐，其是半钙盐(hemicalcium salt)。

198.Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的化合物，及其酯和盐(例如选自单碱金属盐和半碱土金属盐)，该化合物以％HPLC峰面积表示的纯度至少为97.5％，例如99％或更高，例如99.5％或更高，％HPLC峰面积根据实施例43的方法测定。

199.第198项的化合物，其是单锂盐、单钠盐、半钙盐(hemicalcium)或半镁盐(hemimagnesium)。

200.选自第140或154项定义的硼酸及其酯和盐的化合物，所述化合物基本上不含用HPLC例如反相HPLC可检测的杂质。

201.第140或154项定义的硼酸的药物学可接受的碱加成盐，其基本上不含衍生自C-B键裂解的降解产物。

202.选自第188项定义的硼酸及这种酸的酯和盐的化合物，除了R¹基团被式-(CH₂)_s-H的基团置换，所述化合物基本上不含相同结构的任何化合物。

203.Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的药物学可接受的碱加成盐，其基本上不含如下化合物：

204.第201-203任一项的盐，其量至少为1kg，例如已经以每天至少100kg的量被生产。

205.第140或154项定义的硼酸例如Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的药物学可接受的碱加成盐，其含有痕量的脂族或脂环族溶剂。

206.第205项的盐，其中溶剂是烷烃。

207.第206项的盐，其中溶剂是正烷烃。

208.第207项的盐，其中溶剂是正庚烷。

209.第204-208任一项的盐，其中所述溶剂以约0.01％或更低的量存在。

210.一种用作药物的产物，其包含第190-209任一项的盐。

211.前述任一项的主题，其中所述盐是第190-209任一项的盐。

212.二乙醇胺通过选择性沉淀拆分第140或第154项定义的式(I)的硼酸的(R，S，R)和(R，S，S)异构体的用途。

213.一种产物，其包含第140或154项定义的式(I)的硼酸的(R，S，R)异构体，其是使用二乙醇胺以通过沉淀拆分(R，S，R)和(R，S，S)异构体的方法所产生的。

214.一种制备抗血栓形成制剂的方法，包括以每年至少1000kg所述盐的速度将第190-209任一项的盐制备成这种制剂。

215.提供一种抗血栓形成制剂的方法，包括向药房提供第211项的制剂。

216.一种包装，其包含一种药物制剂并包含一种市场准入编号和/或指导患者用药的说明页，该药物制剂含有第190-209任一项的盐。

217.Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的药物学可接受的碱添加盐，所述盐含有痕量的脂族或脂环族溶剂但基本上不含如下结构的杂质：

218.制备式(XXI)的氨基硼酸盐的方法

其中

R^X是H或一不妨碍合成的取代基；

R^Y是链烯基；和

R^Z是烷基，

所述方法包括将1-金属烷氧基烷烃与一种硼酸酯反应以形成式R^Z-O-R^Y-B(OH)₂的硼酸，酯化所述酸，将酯化的酸与CH₂Cl₂和ZnCl₂在强碱存在下接触，将所得产物与LiHMDS接触，继而将所得产物与氯化氢接触。

219.第123项的式(XXI)的氨基硼酸盐，其不含式(XXII)的污染物：

H₂N-C(R^X)(R^Y)-B(OH)₂        (XXII)。

220.一种制备式(XXIII)的有机硼酸的方法

其中

Q-CO包含至少一种氨基酸残基；

R^X是H或不妨碍合成的取代基；

R^Y是链烯基；

R^Z是烷基，

所述方法包括：

a)进行第123项的方法以制备式(XXI)的氨基硼酸盐或提供第124项的氨基硼酸盐，和

B)将所述氨基硼酸盐与选自氨基酸和肽的一种化合物反应，所述化合物任选地是N-末端保护的。

221.选自第125项定义的式(XXIII)的有机硼酸、其酯或盐的化合物，其基本上不含选自式(XXIV)的化合物及其酯和盐的杂质：

222.第140和154项定义的式I的硼酸的药物学可接受的碱添加盐，其中具有(R)-构型手性中心C^*的硼酸是非对映异构体大量过量的。

223.第222项的盐，其基本上不含产生自C-B键裂解的任何降解产物。

224.第222或223项的盐，其中R¹如第65项的定义，且所述盐基本上不含其中R¹是-(CH₂)_sH的相应硼酸物质。

225.一种药物制剂，其包含第190-209任一项的盐并基本上不含由于盐合成带来的任何杂质。

226.一种产物，其中该产物是一种工业产物并且包括第190-211，213，216，217和219-225任一项的产物。

Claims (57)

1.一种药物学可接受的二价金属与式(III)所示的凝血酶的有机硼酸抑制剂的盐，

其中

Y是任选地N-末端保护的二肽残基，其结合凝血酶的S3和S2结合位点并经一肽键与-CH(R⁹)-B(OH)₂连接，且其与片段-CH(R⁹)-B(OH)₂一起对凝血酶底物结合位点具有亲和性，所述酸中的肽键任选并独立地被C₁-C₁₃烃基基团N-末端取代，所述烃基基团任选含有链内氧或硫并任选由选自卤素、羟基和三氟甲基的取代基取代；以及

R⁹是由一或多个醚键间断的直链烷基基团，且其中氧原子和碳原子的总数为3-6，或者R⁹是-(CH₂)_m-W，其中m为2-5且W为-OH或卤素。

2.权利要求1的盐，其中R⁹是一种烷氧基烷基基团。

3.权利要求2的盐，其中所述C₁-C₁₃烃基基团是C₁-C₆烷基基团。

4.权利要求1的盐，其中所述二肽残基是N-末端保护的且酸中所有肽键均是未取代的。

5.权利要求2的盐，其中二肽残基包含(R)构型的S3结合氨基酸残基，及(S)构型的S2结合残基，且其中片段-NHCH(R⁹)-B(OH)₂是(R)构型。

6.权利要求1的盐，其中硼酸对凝血酶的Ki为100nM或更低。

7.权利要求2的盐，其中硼酸对凝血酶的Ki为20nM或更低。

8.权利要求1的盐，其中硼酸为式(IV)所示：

其中：

X是H或一个氨基保护基；

aa¹是一个氨基酸残基，其具有一个含不超过20个碳原子的烃基侧链并包含至少一个具有至多13个碳原子的环状基团；

aa²是一个具有4-6个环成员的亚氨基酸残基或者是被C₃-C₁₃烃基基团N-取代的Gly；

R⁹如权利要求1所定义。

9.权利要求8的盐，其中aa¹选自Phe、二苯丙氨酸及其全部或部分氢化的类似物。

10.权利要求8的盐，其中aa¹选自二苯丙氨酸、Phe、二环己基丙氨酸和环己基丙氨酸。

11.权利要求10的盐，其中aa¹是(R)构型。

12.权利要求8的盐，其中aa¹是(R)-Phe或(R)二苯丙氨酸。

13.权利要求8的盐，其中aa¹是(R)-Phe。

14.权利要求9的盐，其中aa²是一种式(V)的亚氨基酸的残基

其中R¹¹是-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-S-CH₂-、-S-C(CH₃)₂-或-CH₂-CH₂-CH₂-，当环为5或6元环时，该亚氨基酸任选地在一或多个-CH₂-基团被1-3个C₁-C₃烷基基团取代。

15.权利要求14的盐，其中aa¹是(R)构型及aa²是(S)-构型。

16.权利要求9的盐，其中aa¹是(R)构型及aa²是(S)-脯氨酸残基。

17.权利要求8的盐，其中aa¹-aa²是(R)-Phe-(S)-Pro。

18.权利要求15的盐，其中片段-NH-CH(R⁹)-B(OH)₂呈(R)-构型。

19.权利要求18的盐，其中R⁹是式-(CH₂)_s-Z的基团，其中s是2、3或4，Z是-OH、-OMe、-OEt或卤素。

20.权利要求18的盐，其中R⁹是2-溴乙基、2-氯乙基、2-甲氧乙基、3-溴丙基、3-氯丙基或3-甲氧丙基。

21.权利要求18的盐，其中R⁹是3-甲氧丙基。

22.权利要求8的盐，其是式(IX)所示的化合物的盐：

X-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂    (IX)

其中Mpg-B(OH)₂为硼甲氧基丙基甘氨酸。

23.权利要求18的盐，其中X是R⁶-(CH₂)_p-C(O)-、R⁶-(CH₂)_p-S(O)₂-、R⁶-(CH₂)_p-NH-C(O)-或R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)-，其中p是0、1、2、3、4、5或6，R⁶是H或者5-13元环状基团，该环状基团任选地由1、2或3个选自卤素、氨基、硝基、羟基、C₅-C₆环状基团、C₁-C₄烷基和含有链内O的C₁-C₄烷基和/或通过链内O与所述环状基团连接的C₁-C₄烷基的取代基取代，前述烷基任选地由选自卤素、氨基、硝基、羟基和C₅-C₆环状基团的取代基取代。

24.权利要求23的盐，其中所述5-13元环状基团是芳环或杂芳环。

25.权利要求24的盐，其中R⁹是甲氧丙基及所述5-13元环状基团是苯基或6元杂芳环基团。

26.权利要求22的盐，其中X是R⁶-(CH₂)_p-O-C(O)-并且p是0或1。

27.权利要求21的盐，其中X是苄氧基羰基。

28.权利要求8的盐，其中硼酸是Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂。

29.权利要求1的盐，其中所述金属是钙或镁。

30.权利要求5的盐，其中所述金属是钙。

31.权利要求5的盐，其中所述金属是镁。

32.权利要求18的盐，其中所述金属是钙或镁。

33.权利要求26的盐，其中所述金属是钙。

34.权利要求26的盐，其中所述金属是镁。

35.权利要求27的盐，其是半镁盐。

36.权利要求27的盐，其是半钙盐。

37.权利要求5的盐，其具有与50mol％以上携带单一负电荷的产物中硼酸根基团一致的金属/硼酸根化学计量。

38.权利要求28的盐，其是镁盐。

39.权利要求28的盐，其是钙盐。

40.权利要求32的盐，其中所述盐包含来自硼酸的硼酸根离子和一个平衡离子，其中所述盐具有单一类型的平衡离子。

41.Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的半钙盐。

42.Cbz-(R)-Phe-(S)-Pro-(R)-Mpg-B(OH)₂的半镁盐。

43.权利要求41的盐，其是固相的。

44.权利要求43的盐，其包含酐形式的硼酸根。

45.权利要求41的盐，其含有痕量的脂族或脂环族溶剂。

46.权利要求45的盐，其中所述溶剂是正庚烷。

47.权利要求28的盐，其不含任何得自C-B键断裂的降解产物。

48.权利要求28的盐，其中硼酸根离子呈95％或更多的非对映异构体过量，所述硼酸根离子中aa¹是(R)构型，aa²是(S)构型，且片段-NH-CH(R⁹)-B(OH)₂呈(R)-构型。

49.权利要求28的盐，其不含如下化合物：

50.权利要求28的盐，其不含如下化合物和其平衡形式：

51.一种药物制剂，其包含权利要求1-50任一项的盐。

52.权利要求51的制剂，其是口服剂型并进一步包含药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

53.权利要求52的制剂，其是固体制剂。

54.权利要求53的制剂，其中所述盐包含酐形式的酸的硼酸根基团。

55.权利要求53的药物制剂，其适于在十二指肠释放所述盐。

56.权利要求1-50任一项的盐在制备预防或治疗血栓形成的药物中的应用。

57.权利要求56的应用，其中所述药物是口服药物。

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