CN101557817A - 清蛋白融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明包括清蛋白融合蛋白。编码本发明的清蛋白融合蛋白的核酸分子、及含有这些核酸的载体、以这些核酸载体转化的宿主细胞以及制备本发明的清蛋白融合蛋白的方法和使用这些核酸、载体和/或宿主细胞的方法也包括在本发明中。此外本发明还包括包含清蛋白融合蛋白的药物组合物和使用本发明的清蛋白融合蛋白治疗、预防或缓解疾病、疾患或病症的方法。

Description

清蛋白融合蛋白

参考光盘上的序列表

本申请参考下列以三张相同光盘(CD-R)上的电子文件提供的“序列表”，光盘分别标为“拷贝1”、“拷贝2”和“CRF”。这些光盘各含有文件“PF619PP5序列表.txt”(198,000字节，创建于2007年9月7日)，其在此以其整体通过引用并入。

发明背景

本发明通常涉及与清蛋白或清蛋白的片段或变体融合的治疗性蛋白(包括，但不限于，至少一种多肽、抗体、肽、或其片段和变体)。本发明包括编码治疗性清蛋白融合蛋白的多核苷酸、治疗性清蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、配制剂和药盒。以编码治疗性清蛋白融合蛋白的多核苷酸转化的宿主细胞以及使用这些多核苷酸和/或宿主细胞制备本发明的清蛋白融合蛋白的方法也包括在本发明中。

人类血清清蛋白(HSA或HA)是一种成熟形式为585个氨基酸的蛋白质(如图1所示(SEQ ID NO：1))，负责血清渗透压的重大部分，还发挥内源和外源配体的运载体的功能。目前，用于临床用途的HA从人类血液中萃取而制备。在微生物中制备重组HA(rHA)已公开于EP 330451和EP 361991。

天然状态或重组制备的治疗性蛋白，诸如干扰素和生长激素，通常是不稳定的分子，表现出短的贮存期限，尤其是配制为水溶液时。当配制用于施用时这些分子的不稳定性要求许多这类分子必须冻干并在贮存的所有时间保持冷冻，从而致使难以运输和/或贮存这类分子。当必须在医院环境外对药物配制剂贮存和配药时，贮存问题尤其严重。

很少有解决不稳定的蛋白分子的贮存问题的实用解决方案被提出。因此，需要蛋白治疗分子的易于配药的稳定的长久配制剂，优选贮存后需要最少操作的简单配制剂。

体内施用后，天然状态或重组制备的治疗性蛋白，诸如干扰素和生长激素，由于从血流快速清除，表现短的血浆稳定性。因此，这些蛋白提供的治疗效果也是短期的。因此为了保持它们期望的体内治疗效果，这些蛋白从血液的快速清除要求必须较频繁地或以较高剂量施用治疗分子。然而增加施用治疗性蛋白的给药计划常导致患者注射部位反应、副作用和毒性的增加。类似地，以较高剂量施用治疗性蛋白也常导致患者毒性和副作用的增加。

已提议来提高治疗分子的血浆稳定性的实用解决方案很少，包括化学接合，对患者提供的益处有限。通常，大多数情况下，仍以频繁的给药计划施用这些化学改性的治疗分子，保持患者的显著注射部位反应、副作用和毒性。因此，对稳定形式的治疗分子存在需求，其在体内保持比仅天然或重组制备的治疗剂更高的血浆稳定性，并可较不频繁地施用，从而降低对患者的潜在副作用。

发明概述

本发明包括清蛋白融合蛋白，其包含与清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体融合的治疗性蛋白(如，多肽、抗体或肽、或其片段或变体)。本发明还包括多核苷酸，其包括或由以下组成：编码与清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体融合的治疗性蛋白(如，多肽、抗体或肽、或其片段或变体)的核酸分子。本发明还包括多核苷酸，其包括或由以下组成：编码包括与清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体融合的治疗性蛋白(如，多肽、抗体或肽、或其片段或变体)的蛋白的核酸分子，该清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体足以延长治疗性蛋白的贮存期限，足以与未融合状态的治疗性蛋白相比增加治疗性蛋白的血浆稳定性，和/或稳定治疗性蛋白和/或其在溶液中(或在药物组合物中)的体外和/或体内活性。由本发明的多核苷酸编码的清蛋白融合蛋白及以本发明的多核苷酸转化的宿主细胞、以及制备本发明的清蛋白融合蛋白的方法和使用本发明的这些多核苷酸和/或宿主细胞的方法也包括在本发明中。

在本发明的一个方面，清蛋白融合蛋白包括但不限于表2中所述的那些和编码这种蛋白的多核苷酸。

本发明还包括包含本发明的清蛋白融合蛋白和药学上可接受的稀释剂或载体的药物配制剂。这种配制剂可在药盒或容器中。这种药盒或容器可与关于所述治疗性蛋白延长的贮存期限的说明书一起包装。这种配制剂可用于治疗、预防、缓解或诊断患者(例如哺乳动物或人类)的疾病或疾病症状的方法，包括向所述患者施用所述药物配制剂的步骤。

在其它实施方式，本发明包括预防、治疗或缓解疾病或疾患的方法。在一些实施方式，本发明包括治疗列在表1的“适应症：Y”列的疾病或疾患的方法，包括向期望这种治疗、预防或缓解的患者以有效治疗、预防或缓解所述疾病或疾患的量施用本发明的清蛋白融合蛋白，本发明的清蛋白融合蛋白包括公开于表1的“治疗性蛋白：X”列(与列在表1的“适应症：Y”列的待治疗的疾病或疾患同一行)的治疗性蛋白或对应于治疗性蛋白的部分(或其片段或变体)。

在一个实施方式，表1或表2中所述的清蛋白融合蛋白具有延长的贮存期限。

在第二种实施方式，表1或表2中所述的清蛋白融合蛋白比表1中所述的相应未融合的治疗分子更稳定。

本发明还包括转基因的生物体，其被修饰以包含本发明的核酸分子(包括但不限于表1和2中所述的多核苷酸)，例如被修饰以表达本发明的清蛋白融合蛋白。

附图简述

图1A-D显示成熟形式人类清蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和编码其的多核苷酸(SEQ ID NO：2)。SEQ ID NO：2的核苷酸1至1755编码成熟形式的人类清蛋白(SEQ ID NO：1)。

图2显示pPPC0005克隆载体ATCC保藏物PTA-3278的限制性图谱。

图3显示pSAC35酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)表达载体的限制性图谱(Sleep等，BioTechnology 8：42(1990))。

图4比较CID 3165编码的IFN清蛋白融合蛋白(CID 3165蛋白)与重组IFNa(rIFNa)对Hs294T黑素瘤细胞的抗增殖活性。以不同浓度的CID 3165蛋白或rIFNa培养细胞并在培养3天后由BrdU掺入测量增殖。CID 3165蛋白在高于10ng/ml的浓度引起对细胞增殖可测量的抑制，在大约200ng/ml达到50％抑制。(■)＝CID 3165蛋白、(◆)＝rIFNa。

图5显示IFNa清蛋白融合蛋白的各种稀释物对ISRE-SEAP/293F报告细胞中SEAP活性的效应。测试了IFNa融合在清蛋白上游的的一种制备物(◆)，和IFNa融合在清蛋白下游的两种不同制备物(●)和(■)。

图6显示由构建体2249中包括的DNA编码的IFNa清蛋白融合蛋白(CID2249蛋白)在治疗的猴中对OAS(p41)的mRNA水平的时间和剂量效应(见于实施例76)。每个时间点：第一条＝媒介物对照、第二条＝30ug/kg CID 2249蛋白第1天iv、第三条＝30ug/kg CID 2249蛋白第1天sc、第四条＝300ug/kg CID 2249蛋白第1天sc、第五条＝40ug/kg重组IFNa第1、3和5天sc。

图7显示在感染慢性丙型肝炎基因型1且之前未能响应于至少一个聚乙二醇化的干扰素α联合利巴韦林(PEG-RBV)的治疗方案的患者(无应答者)，以HSA-IFNα2b联合利巴韦林治疗持续0至24周后，由中值HCV RNA改变(log10IU/ml)测量的HCV RNA滴度减少。

图8A显示感染慢性丙型肝炎基因型1且之前未能响应于至少一个干扰素α联合利巴韦林的治疗方案的患者(无应答者)，以每两周或四周900μg、1200μg、1500μg或1800μg的HSA-IFNα2b联合利巴韦林治疗持续48周后以实时定量PCR测量的达到HCV RNA阴性(如，治疗结束时应答或ETR)的百分比。

图8B显示之前未能响应于至少一个聚乙二醇化的干扰素α联合利巴韦林(PEG+RBV)的治疗方案的无应答者患者亚组以每两或四周900μg、1200μg、1500μg或1800μg的HSA-IFNα2b联合利巴韦林治疗持续48周后具有ETR的百分比。

图8C显示以每两周或四周900μg、1200μg、1500μg或1800μg的HSA-IFNα2b联合利巴韦林治疗持续48周、随后24周的随访期后无应答者达到的总持续病毒学应答(SVR)率。

图8D显示以每两周或四周900μg、1200μg、1500μg或1800μg的HSA-IFNα2b联合利巴韦林治疗持续48周、随后24周的随访期后PEG+RBV无应答者达到的SVR率。

详述

定义

提供如下定义以便于理解本说明书中所用的一些术语。

本文所用的″多核苷酸″指具有编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，所述融合蛋白包括或可选地由以下组成：框内连接于至少一治疗性蛋白X(或其片段或变体)的至少一分子清蛋白(或其片段或变体)；指具有编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，所述融合蛋白包括或可选地由以下组成：SEQID NO：Y的氨基酸序列(如表2的列6中所述的)或其片段或变体；指具有包括SEQ ID NO：X显示的序列或可选地由SEQ ID NO：X所示的序列组成的核苷酸序列的核酸分子；指具有编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，所述融合蛋白包括或可选地由以下组成：SEQ ID NO：Z的氨基酸序列；指具有编码本发明的如表2或实施例中所述的产生的清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；指具有编码本发明的治疗性清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；指具有表2中所述的清蛋白融合构建体中包含的核苷酸序列的核酸分子；或指具有保藏于ATCC的清蛋白融合构建体中包含的核苷酸序列(如表3中所述的)的核酸分子。

本文所用的″清蛋白融合构建体″指核酸分子，其包括或可选地由以下组成：框内连接于编码至少一分子治疗性蛋白(或其片段或变体)的至少一多核苷酸的编码至少一分子清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸；指核酸分子，其包括或可选地由以下组成：如表2或实施例中所述的产生的框内连接于编码至少一分子治疗性蛋白(或其片段或变体)的至少一多核苷酸的编码至少一分子清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸；或指核酸分子，其包括或可选地由以下组成：框内连接于编码至少一分子治疗性蛋白(或其片段或变体)的至少一多核苷酸的编码至少一分子清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸，进一步包括例如一个或多个以下元件：(1)功能性自复制载体(包括但不限于，穿梭载体、表达载体、整合载体和/或复制系统)、(2)起始转录的区域(如，启动子区，诸如例如，调控型或诱导型启动子、组成型启动子)、(3)转录终止区、(4)前导序列和(5)选择标记。编码治疗性蛋白和清蛋白蛋白的多核苷酸当作为清蛋白融合构建体的部分时，可各自被称为清蛋白融合构建体的″部分(portion)″、″区域″或″部分(moiety)″。

本发明通常涉及编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸；清蛋白融合蛋白；和使用清蛋白融合蛋白或编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防或缓解疾病或疾患的方法。本文所用的″清蛋白融合蛋白″指至少一分子清蛋白(或其片段或变体)与至少一分子治疗性蛋白(或其片段或变体)融合形成的蛋白。本发明的清蛋白融合蛋白包括治疗性蛋白的至少一片段或变体和人类血清清蛋白的至少一片段或变体，它们通过遗传融合互相连接(即，所述清蛋白融合蛋白由翻译核酸而产生，该核酸中编码全部或部分治疗性蛋白的多核苷酸框内连接于编码全部或部分清蛋白的多核苷酸)。治疗性蛋白和清蛋白蛋白当作为清蛋白融合蛋白的部分时，可各自被称为清蛋白融合蛋白的″部分(portion)″、″区域″或″部分(moiety)″(如，″治疗性蛋白部分″或″清蛋白蛋白部分″)。在一种实施方式，本发明的清蛋白融合蛋白包括至少一分子治疗性蛋白X或其片段或变体(包括但不限于成熟形式的治疗性蛋白X)和至少一分子清蛋白或其片段或变体(包括但不限于成熟形式的清蛋白)。

在进一步的实施方式，本发明的清蛋白融合蛋白由宿主细胞加工并分泌到周围培养基中。发生在用于表达的宿主的分泌途径的新生清蛋白融合蛋白加工可包括但不限于信号肽切割；形成二硫键；正确折叠；加入并加工糖类(诸如例如，N-和O-连接的糖基化)；特异性蛋白水解切割；和组装为多聚体蛋白。在另一实施方式，本发明的清蛋白融合蛋白是加工形式。在进一步的实施方式，″清蛋白融合蛋白的加工形式″指已经经过N-末端信号肽切割的清蛋白融合蛋白产物，此处还称为″成熟清蛋白融合蛋白″。

在许多情况，含有本发明的清蛋白融合构建体的代表性克隆保藏于美国典型培养物保藏中心(这里称为

)。此外，可能通过本领域已知的和本文在别处描述的技术从保藏物恢复指定的清蛋白融合构建体。

位于10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款制备

保藏物。

在一个实施方式，本发明提供编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸，所述清蛋白融合蛋白包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白和血清清蛋白蛋白。在进一步的实施方式，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白和血清清蛋白蛋白。在另一实施方式，本发明提供一种由表2中所述的多核苷酸编码的清蛋白融合蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白和血清清蛋白蛋白。在进一步的实施方式，本发明提供一种编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸，所述清蛋白融合蛋白的序列显示于表2中的SEQ ID NO：Y。在其它实施方式，本发明提供清蛋白融合蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白的生物活性的和/或治疗活性的片段和血清清蛋白蛋白。在其它实施方式，本发明提供清蛋白融合蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白的生物活性的和/或治疗活性的变体和血清清蛋白蛋白。在其它实施方式，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白成分是血清清蛋白的成熟部分。本发明还包括编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。

在进一步的实施方式，本发明提供清蛋白融合蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白和血清清蛋白的生物活性的和/或治疗活性的片段。在进一步的实施方式，本发明提供清蛋白融合蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白和血清清蛋白的生物活性的和/或治疗活性的变体。在其它实施方式，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是治疗性蛋白的成熟部分。在进一步的实施方式，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是治疗性蛋白的可溶性胞外域。在可选实施方式，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是治疗性蛋白的活性形式。本发明还包括编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。

在进一步的实施方式，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白的生物活性的和/或治疗活性的片段或变体和血清清蛋白的生物活性的和/或治疗活性的片段或变体。在其它实施方式，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分。本发明还包括编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。

治疗性蛋白

如上所述，本发明的多核苷酸编码蛋白，其包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白的至少一片段或变体和人类血清清蛋白的至少一片段或变体，它们例如通过遗传融合互相连接。

其它实施方式包含编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白的至少一片段或变体和人类血清清蛋白的至少一片段或变体，它们通过化学结合彼此连接。

本文所用的″治疗性蛋白″指具有一种或多种治疗和/或生物活性的蛋白、多肽、抗体、肽或其片段或变体。本发明包括的治疗性蛋白包括但不限于，蛋白、多肽、肽、抗体和生物物质(biologics)。(术语肽、蛋白和多肽在本文可互换地使用)。特别地预期术语″治疗性蛋白″包括抗体和其片段和变体。因此本发明的蛋白可含有治疗性蛋白的至少一片段或变体和/或抗体的至少一片段或变体。此外，术语″治疗性蛋白″可指治疗性蛋白的内源或天然产生的相关物。

表现″治疗活性″的多肽或″治疗活性的″蛋白指多肽，其具有与治疗性蛋白(例如一种或多种本文所述的治疗性蛋白或本领域已知的其他治疗性蛋白)相关的一种或多种已知生物学和/或治疗活性。作为非限制性例子，″治疗性蛋白″是可用于治疗、预防或缓解疾病、病症或疾患的蛋白。作为非限制性例子，″治疗性蛋白″可为特异性结合特定细胞类型(正常(如淋巴细胞)或不正常的如(癌细胞))的蛋白并因此可用于特异性地靶向化合物(药物或细胞毒性剂)于那种细胞类型。

在一个实施方式，可被本发明的清蛋白融合蛋白包括的″治疗性蛋白″部分是干扰素。在另一实施方式，本发明的清蛋白融合蛋白的″治疗性蛋白″部分是干扰素α。在另外的实施方式，可被本发明的清蛋白融合蛋白包括的″治疗性蛋白″部分包括但不限于干扰素β、干扰素γ或干扰素ω。

在另外的实施方式，干扰素杂合体也可融合于清蛋白的氨基或羧基末端以形成干扰素杂合体清蛋白融合蛋白。干扰素杂合体清蛋白融合蛋白可具有增强的干扰素活性或可选地具有抑制的干扰素活性，诸如抗病毒响应、调节细胞生长、和调节免疫应答(Lebleu等，PNAS USA，73：3107-3111(1976)；Gresser等，Nature，251：543-545(1974)；和Johnson，Texas Reports Biol Med，35：357-369(1977))。每种干扰素杂合体清蛋白融合蛋白可用于治疗、预防或缓解病毒感染(如，肝炎(如HCV)；或HIV)、多发性硬化或癌症。

在一个实施方式，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的干扰素杂合体部分包括干扰素α-干扰素α杂合体(本文称为α-α杂合体)。例如干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的α-α杂合体部分由以下组成或可选地包括，融合于干扰素αD的干扰素αA。在进一步的实施方式，A/D杂合体融合在干扰素αD的共同BgIII限制性酶切位点，其中A/D杂合体的N-末端部分对应于干扰素αA的氨基酸1-62，C-末端部分对应于干扰素αD的氨基酸64-166。例如，该A/D杂合体可包括如下氨基酸序列：

CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX₁ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX₂DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO：99)，其中X₁是R或K，X₂是A或V。

在另外的实施方式，A/D杂合体融合在共同的PvuIII限制性酶切位点，其中A/D杂合体的N-末端部分对应于干扰素αA的氨基酸1-91，C-末端部分对应于干扰素αD的氨基酸93-166。例如，该A/D杂合体可包括如下氨基酸序列：

CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX₁ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX₂DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO：100)，其中X₁是R或K，第二个X₂是A或V。这些杂合体进一步描述于美国专利第4,414,510号，其在此以其整体通过引用并入。

在另外的实施方式，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的α-α杂合体部分由以下组成或可选地包括，融合于干扰素αF的干扰素αA。在进一步的实施方式，A/F杂合体融合在共同的PvuIII限制性酶切位点，其中A/F杂合体的N-末端部分对应于干扰素αA的氨基酸1-91，C-末端部分对应于干扰素αF的氨基酸93-166。例如，该A/F杂合体可包括如下氨基酸序列：

CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRXISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDMEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSKIFQERLRRKE(SEQ ID NO：101)，其中X是R或K。这些杂合体进一步描述于美国专利第4,414,510号，其在此以其整体通过引用并入。在进一步的实施方式，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的α-α杂合体部分由以下组成或可选地包括，干扰素αA融合于干扰素αB。在另外的实施方式，A/B杂合体融合在共同的PvuIII限制性酶切位点，其中A/B杂合体的N-末端部分对应于干扰素αA的氨基酸1-91，C-末端部分对应于干扰素αB的氨基酸93-166。例如，该A/B杂合体可包括氨基酸序列：

CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX₁ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEX₂X₃X₄X₅QEVGVIESPLMYEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSSCAWEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE(SEQ ID NO：102)，其中X₁是R或K，X₂至X₅是SCVM或VLCD。这些杂合体进一步描述于美国专利第4,414,510号，其在此以其整体通过引用并入。

在另一实施方式，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的干扰素杂合体部分包括干扰素β-干扰素α杂合体(此处称为β-α杂合体)。例如，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的β-α杂合体部分由以下组成或可选地包括，融合于干扰素αD(也称为干扰素α-1)的干扰素β-1。在进一步的实施方式，融合β-1/αD杂合体，其中N-末端部分对应于干扰素β-1的氨基酸1-73，C-末端部分对应于干扰素αD的氨基酸74-167。例如，该β-1/αD杂合体可包括氨基酸序列：

MSYNLLGFLQRS SNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNXDSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO：103)，其中X是A或V。这些杂合体进一步描述于美国专利第4,758,428号，其在此以其整体通过引用并入。

在另一实施方式，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的干扰素杂合体部分包括干扰素α-干扰素β杂合体(此处称为α-β杂合体)。例如，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的α-β杂合体部分由以下组成或可选地包括，融合于干扰素β-1的干扰素αD(也称为干扰素α-1)。在进一步的实施方式，融合αD/β-1杂合体，其中N-末端部分对应于干扰素αD的氨基酸1-73，C-末端部分对应于干扰素β-1的氨基酸74-166。例如，该αD/β-1杂合体可具有氨基酸序列：

MCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQ ID NO：104)。这些杂合体进一步描述于美国专利第4,758,428号，其在此以其整体通过引用并入。

在进一步的实施方式，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的干扰素杂合体部分可包括α-α干扰素杂合体、α-β干扰素杂合体和β-α干扰素杂合体的其它组合。在另外的实施方式，干扰素杂合体清蛋白融合蛋白的干扰素杂合体部分可被修饰以包含对干扰素杂合体的氨基酸序列的突变、取代、缺失或添加。可对干扰素杂合体清蛋白融合蛋白进行这种修饰，例如以提高制备水平、增加稳定性、增加或降低活性、或赋予新的生物学特征。

上述的干扰素杂合体清蛋白融合蛋白、及含有编码所述多肽的多核苷酸的宿主细胞和载体包括在本发明中。在一个实施方式，如上所述的多核苷酸编码的干扰素杂合体清蛋白融合蛋白具有延长的贮存期限。在另外的实施方式，如上所述的多核苷酸编码的干扰素杂合体清蛋白融合蛋白比相应的未融合的干扰素杂合体分子具有更长的血清半衰期和/或溶液中(或药物组合物中)更稳定的体外和/或体内活性。

在另一非限制性例子，″治疗性蛋白″是具有生物活性，尤其是可用于治疗、预防或缓解疾病、疾患或感染的生物活性的蛋白。治疗性蛋白可具有的生物活性的非包括性(non-inclusive)列表包括：抑制HIV-1感染细胞、刺激肠上皮细胞增殖、减少肠上皮细胞渗透性、刺激胰岛素分泌、诱导支气管扩张和血管舒张、抑制醛固酮和肾素分泌、调节血压、促进神经元生长、增强免疫应答、增强炎症、抑制食欲、或以下″生物活性″部分中所述的和/或在表1对指定治疗性蛋白公开的(列2)生物活性的任何一种或多种。

在一个实施方式，IFN-α-HSA融合体用于抑制分为A类-纤丝病毒(Filo)(埃博拉病毒)(Ebola)、沙粒病毒(Arena)(Pichende)、B类-批膜病毒(Toga)(VEE)或C类-布尼亚病毒(Bunya)(潘塔托若病毒)(Punto toro)、黄病毒(Flavi)(黄热病病毒、西尼罗病毒(West Nile))的病毒因子(viral agent)。例如，CPE抑制、中性红染色和病毒产率检测用于评价融合在HAS下游的INF-α(CID 3165蛋白)的抗病毒活性。评价CID 3165蛋白在短尾猴和人类受治疗者的药代动力学和药效动力学活性。结果表示对评价的所有RNA病毒以有利的安全性指数达到抗病毒活性。CPE检测中IC50值从＜0.1ng/ml(潘塔托若病毒A)到19ng/ml(VEE)。在短尾猴，CID 3165蛋白的半衰期是90小时，并在给药后达14天是可检测的。在人类受治疗者，CID 3165蛋白是安全的并耐受良好。单次注射剂量后的C_max是与剂量成比例的。500ug组中平均C_max是22ng/ml，平均t_1/2是150小时。每2-4周给药一次或更多由药代动力学支持。在单次注射组(120-500ug)中大多数受治疗者观察到对丙型肝炎的抗病毒应答。

在进一步的实施方式，IFN-α-HSA融合体用于治疗患有丙型肝炎和/或慢性丙型肝炎感染(HCV)的患者。干扰素α，还称为干扰素alfa或白细胞干扰素是治疗感染HCV的患者的标准疗法。术语″干扰素α″指具有抗病毒活性的高度同源相关多肽的家族。IFN-α-HSA融合体的干扰素α部分由以下组成或可选地包括：本领域已知的任何干扰素α或其片段。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分的非限制性例子包括但不限于公开于表1的治疗性蛋白列的干扰素α蛋白。在特定实施方式，干扰素α部分由以下组成或可选地包括：干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-2c、复合干扰素(consensusinterferon)、干扰素alfacon-1、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素α的任何市售可获得形式，诸如例如，

A(Schering Corp.，Kenilworth，N.J.)、

A(Hoffman-La Roche，Nutley，N.J.)、Berofor干扰素α(BoehringerIngelheim Pharmaceutical，Inc.，Ridgefied，Conn.)、OMNIFERON^TM(Viragen，Inc.，Plantation，FL)、MULTIFERON^TM(Viragen，Inc.，Plantation，FL)、(GlaxoSmithKline，London，Great Britian)、

(Amgen，Inc.，Thousands Oaks，CA)、

(Sumitomo，Japan)、

(Nautilus Biotech，France)、MAXY-ALPHA^TM(Maxygen，Redwood City，CA/Hoffman-La Roche，Nutley，N.J.)、或任何纯化的干扰素α产物或其片段。在进一步的实施方式，IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分由以下组成或可选地包括：修饰为或配制为用于延长释放或控释的干扰素α。例如，干扰素α部分由以下组成或可选地包括市售可获得的延长释放或控释的干扰素α，包括但不限于干扰素-α-XL(Flamel Technologies，France)和LOCTERON^TM(BioLex Therapeutics/OctoPlus，Pittsboro，NC)。在另外的实施方式，IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分可通过连接化学部分被修饰。例如，干扰素α部分可通过聚乙二醇化被修饰。因此，在另外的实施方式，IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分由以下组成或可选地包括：干扰素α-2a、2b或复合干扰素的聚乙二醇化形式，且包括但不限于市售可获得的聚乙二醇化的干扰素α，诸如例如，PEG-

(Schering Corp.，Kenilworth，N.J.)、(Hoffman-La Roche，Nutley，N.J.)、PEG-OMNDFERON^TM(Viragen，Inc.，Plantation，FL)或其片段。然而，本文所用的″IFN-α-HSA″融合体指融合于本领域已知的任何干扰素α蛋白或其片段的HSA。

感染HCV的患者可基于此前是否接触过治疗HCV感染的干扰素疗法分为两类。″初次治疗的患者″或″初次患者″是从未以干扰素疗法治疗过的患者。″经历过治疗的患者″或″经历过的患者″是以干扰素疗法治疗过或目前正以干扰素疗法治疗的患者。″无应答者″是经历过治疗的患者，此前以干扰素疗法治疗过但未能达到主要治疗终点，诸如早期病毒量减少(early viral loadreduction)(EVR)或治疗终末应答(end-of-treatment response，ETR)。″复发者″是经历过治疗的患者，此前以干扰素疗法治疗过并具有达到的主要治疗终点诸如EVR或ETR，但在后来的时间点对HCV变为阳性。然而，本文所用的″HCV患者″指初次治疗的或经历过治疗的感染HCV的患者。此外，本文所用的″经历过″的″HCV患者″是无应答者或复发者。

此外，丙型肝炎病毒可分为多种基因型，四种基因型即基因型1、2、3或4是最普遍的。通常，感染HCV患者的丙型肝炎病毒包括单个基因型。然而，肝炎病毒可包括两种或多种基因型的组合。此外，丙型肝炎病毒的基因型也可为已知HCV基因型的变体。在进一步的实施方式，HCV患者的丙型肝炎病毒是基因型1、2或3或其变体。然而，本文所用的″HCV″指任何基因型的丙型肝炎病毒，或其组合或变体。

对患有HCV的患者的标准治疗方案包括以干扰素α组合抗病毒剂诸如利巴韦林(ribavirin)治疗。通常，每天一次、每周两次或每周一次地施用干扰素α，每天施用利巴韦林持续至少24周、48周或更长。然而，近来的研究还已使用干扰素α组合本领域已知的其它抗病毒剂以治疗HCV。因此在进一步的实施方式，IFN-α-HSA融合体可单独或与抗病毒剂诸如例如利巴韦林组合施用于HCV患者。在另一实施方式，IFN-α-HSA融合体可组合一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒剂(诸如例如，利巴韦林和/或其它抗病毒剂)施用于HCV患者。

如上所述，对患有HCV的患者的标准治疗包括以干扰素组合抗病毒剂诸如利巴韦林治疗，以每天一次、每周两次或每周一次的给药计划。然而，干扰素治疗伴有显著副作用，包括但不限于流感样症状、疲乏、失眠、头痛、恶心和抑郁，它们可严重地限制患者对治疗的耐受性。目前标准疗法需要的频繁施用干扰素导致延长时期的降低生活质量，导致患者受挫而不能完成治疗。频繁施用和降低生活质量的组合已导致显著数目的患者中断治疗。因此清楚地需要以较不频繁给药计划的改善的治疗方案，其从而对患者的生活质量影响减少并提供对顺从性的更大鼓励。

给药疗法的主要目标是尽快将病毒水平减少到低于定量限并随后在整个治疗中和治愈后维持病毒阴性。在HCV领域，在第4周由HCV RNA水平低于定量限定义的快速病毒学应答(rapid virologic response)(RVR)是持续病毒学应答的有力阳性预示信号(positive predictor)。在第4周达到RVR并直到第12周维持这种阴性的患者将很可能在治疗方案完成后保持HCVRNA阴性。因此，本领域中需要将在第4周达到HCV RNA阴性并直到第12周维持这种阴性至持续病毒学应答(SVR)或治愈的HCV患者的数目最大化。

本发明提供给药计划，其结合了较不频繁给药的需要和在第4周最大化RVR的需要。在一个实施方式，本发明提供一种给药计划，包括向HCV患者较频繁地单独施用干扰素或组合抗病毒剂施用干扰素短时期，随后较不频繁地施用更长时期。在特定实施方式，给药计划包括短时期每天一次、每周两次、每周一次或每2周一次单独施用干扰素或组合抗病毒剂施用干扰素，随后在治疗方案的持续时间每2周一次、每3周一次或每4周一次施用干扰素组合抗病毒剂。在另一实施方式，所述干扰素是干扰素α。如上所述，本发明包括的干扰素α包含本领域已知的任何干扰素α或其片段或变体。因此在另一实施方式，施用包括但不限于IFN-α-HSA融合蛋白或聚乙二醇化的干扰素的长效的干扰素α。如本发明所定义的，单独施用干扰素α或组合抗病毒剂施用干扰素α的所述短时期包括但不限于不多于1、2、3、4、5、6、7或8周。而且，所述更长时期包括但不限于至少16周、至少20周、至少24周、至少30周、至少36周、至少40周、至少46周、至少48周、至少50周、至少60周或更长。在特定实施方式，每周一次单独施用干扰素α或组合抗病毒剂施用干扰素α持续2-4周，随后在治疗方案的持续时间每月一次。在其它特定实施方式，每2周一次单独施用干扰素α或组合抗病毒剂施用干扰素α持续2-4周，随后在治疗方案的持续时间每月一次。在另外的实施方式，在短时期以较低剂量或较大剂量施用干扰素α，在长时期以较低剂量施用。

如上所述，CID 3165蛋白的药代动力学(pharmokinetics)支持每2-4周一次或更久一次的给药计划。因此在进一步的实施方式，每2-4周一次单独或组合有效量的抗病毒剂施用IFN-α-HSA融合体来治疗HCV患者。在另一实施方式，每2-4周一次组合有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒剂施用IFN-α-HSA融合体来治疗HCV患者。在另外的实施方式，每4周一次IFN-α-HSA融合体施用于HCV患者。在另外的实施方式，多于每4周一次IFN-α-HSA融合体施用于HCV患者。在另外的实施方式，向HCV患者每4周一次或更多施用IFN-α-HSA融合体，其中治疗还包含施用有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒剂。

在另一实施方式，每两周一次或每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗HCV患者持续至少24周。在进一步的实施方式，每两周一次或每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗HCV患者持续48周。在另外的实施方式，所述HCV患者感染了基因型1。在另一实施方式，所述HCV患者感染了基因型2或3。在另外的实施方式，组合至少一种、两种、三种或四种包括但不限于利巴韦林的抗病毒剂施用IFN-α-HSA融合体。

因此在进一步的实施方式，以每两周一次和每四周一次的组合用IFN-α-HSA融合体治疗HCV患者。在一个实施方式，在治疗方案开始时每两周一次以IFN-α-HSA融合体治疗HCV患者两次，随后在余下的治疗时期每四周一次以EFN-α-HSA融合体治疗。在进一步的实施方式，这种以IFN-α-HSA融合体的治疗是组合至少一种、两种、三种或四种包括但不限于利巴韦林的抗病毒剂。在另外的实施方式，这种治疗持续共24或48周。

在另一实施方式，IFN-α-HSA融合体可用作对HCV的维持治疗的低剂量单治疗。在进一步的其它实施方式，IFN-α-HSA融合体可组合利巴韦林和一种或多种其它抗病毒剂使用以治疗HCV。可选地，在另一实施方式，IFN-α-HSA融合体可组合一种、两种、三种或更多种不同于利巴韦林的抗病毒剂以治疗HCV。

在另外的实施方式，IFN-α-HSA融合体可用于治疗其它病毒感染或组合HCV感染的其它病毒感染。例如，在一个实施方式，IFN-α-HSA融合体可用于治疗乙型肝炎(HBV)。在另外的实施方式，DFN-α-HSA融合体可用于治疗人类乳头瘤病毒(HPV)。在进一步的实施方式，IFN-α-HSA融合体可用于治疗癌症，包括但不限于毛细胞性白血病(hairy cell leukemia)、恶性黑素瘤、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenous leukemia)、AIDS相关卡波西肉瘤(AIDS related Kaposi’sSarcoma)、多发性骨髓瘤、或肾细胞癌。

任何治疗方案的主要目标是尽快治疗和根除疾病或疾患并保持根除所述疾病或疾患的治疗效力从而治愈患者。而且，对药物的快速应答通常是最终治疗结果的阳性预示信号。然而，干扰素治疗患有疾病或疾患的患者可伴有显著副作用，包括但不限于流感样症状、疲乏、失眠、头痛、恶心和抑郁。干扰素治疗的这些副作用影响患者对治疗方案的耐受性，导致显著数目的患者中断治疗。因此需要新的设计以使干扰素治疗的早期效力和耐受性最大的治疗方案。

本发明提供治疗方案，其包括向患有疾病或疾患的患者施用干扰素，其中在短时期以较频繁的给药计划向患者施用干扰素，并在更长时期以较不频繁的给药计划。本文所用的给药频率指在特定时间段中患者接受干扰素施用的次数。例如，给药计划可包括但不限于，每天一次、每天两次、每周一次、每周两次、每周三次、每两周一次、每三周一次、每四周一次等等。因此本文所用的较频繁的给药计划是一种给药计划，其中患者比以较不频繁的给药计划更经常地接受干扰素。在干扰素治疗开始时增加给药频率用以干扰素″前施用(front-load)″患者以使早期效力最大。然后随后减少给药频率用以在治疗方案其余时间保持效力并通过减少由干扰素治疗的结果而发生的副作用时期而增加耐受性。其中较频繁的给药计划有用的时期取决于被治疗的疾病或疾患。因此如本文所定义的，″短时期″指为了使干扰素根除患者的疾病或疾患的早期效力最大所需的时间段。较不频繁给药的″更长时期″指干扰素最大效力时期之后剩余的治疗时期。例如，所述短时期可包括但不限于，1、2、3、4、5、6、7或8周。所述更长时期可包括但不限于，至少16周、至少20周、至少24周、至少30周、至少36周、至少40周、至少46周、至少48周、至少50周、至少60周或更长。

在另外的实施方式，本发明提供治疗方案，其包括以可接受的安全性向患有疾病或疾患的患者施用最大剂量的干扰素短时期，随后施用维持剂量的干扰素更长时期。本文所用的具有可接受的安全性的最大剂量的干扰素是已知对患者具有可接受的安全性的最高剂量的干扰素。在特定实施方式，具有可接受的安全性的最大剂量的干扰素包括但不限于，至少为本发明所给标准剂量的剂量，或至少一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍高于标准剂量的剂量。干扰素的剂量可由本领域已知标准确定。作为非限制性例子，剂量可基于体重(如，μg/kg)或基于如下所述的总配制浓度。而且，本文所用的维持剂量指少于具有可接受的安全性的最大剂量、并能够在患者维持干扰素效力的剂量。例如，维持剂量可包括但不限于所述干扰素的标准剂量或至少二分之一、三分之一、四分之一、八分之一、一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍或更多地少于具有可接受的安全性的最大剂量的剂量。如本文所定义的，″短时期″指允许具有可接受的安全性的最大剂量使干扰素根除患者的疾病或疾患的早期效力最大所需的时间段。″更长时期″指干扰素最大效力时期之后剩余的治疗时期。例如，所述短时期可包括但不限于，1、2、3、4、5、6、7或8周。所述更长时期可包括但不限于，至少16周、至少20周、至少24周、至少30周、至少36周、至少40周、至少46周、至少48周、至少50周、至少60周或更长。

在进一步的实施方式，本发明提供一种方案，包括向患有疾病或疾患的患者短时期施用具有可接受的安全性的最大剂量干扰素，随后更长时期施用维持剂量的干扰素，其中以比维持剂量的干扰素更频繁的给药计划施用具有可接受的安全性的最大剂量干扰素。

本文所用的″治疗活性″或″活性″可指活性，其效应与在人类期望的治疗结果一致，或指在非人类哺乳动物或其它物种或生物体中的期望的效应。可体内或体外测量治疗活性。例如，可细胞培养物中检测期望的效应。这种体外或细胞培养物检测如本领域中所述的许多治疗性蛋白是通常可得的。检测的例子包括但不限于本文实施例部分中或表1的″示例活性检测″列(列3)所述的检测。

对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白，诸如细胞表面和分泌蛋白，通常是通过连接一个或多个寡糖基团而修饰的。称为糖基化的该修饰可显著影响蛋白的物理特征并可对蛋白稳定性、分泌和定位重要。糖基化发生在沿多肽主链的特定位置。通常有两种主要类型的糖基化：特征为O-连接的寡糖的糖基化，寡糖连接于丝氨酸或苏氨酸残基；和特征为N-连接的寡糖的糖基化，寡糖连接于Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列中的天冬酰胺残基，其中X可为脯氨酸外的任何氨基酸。N-乙酰神经氨酸(也称为唾液酸)通常是N-连接的和O-连接的寡糖的末端残基。诸如蛋白结构和细胞类型等变量影响链中在不同糖基化位点的糖单元数目和性质。还在指定细胞类型中同一位点常见多种糖基化异构体。

对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白以及其类似物和变体可被修饰以便作为操纵它们核酸序列的结果改变在一个或多个位点的糖基化，该操纵是由它们表达于其中的宿主细胞或由于它们表达的其它情况。例如，可通过取消或引入糖基化位点制备糖基化异构体，如通过取代或缺失氨基酸残基，诸如谷氨酰胺取代天冬酰胺，或未糖基化的重组蛋白可通过在不会糖基化它们的宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli)或糖基化-缺陷型酵母)中表达蛋白而制备。这些方法在下文更详细描述并是本领域已知的。

治疗性蛋白，尤其是公开于表1的治疗性蛋白，和其核酸和氨基酸序列是本领域熟知的并可得自公共数据库，诸如Chemical Abstracts ServicesDatabases(如，CAS登记处)、GenBank、和订购提供的数据库诸如GenSeq(如Derwent)。可用于衍生本发明的多核苷酸的治疗性蛋白的示例性核苷酸序列显示于表2的列7，″SEQ ID NO：X″。显示为SEQ ID NO：X的序列可为编码指定治疗性蛋白(如全长或成熟的)的野生型多核苷酸序列，或在一些情况该序列可为所述野生型多核苷酸序列的变体(如，编码野生型治疗性蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸的DNA序列已被优化，例如用于在特定物种表达；或编码该野生型治疗性蛋白变体的多核苷酸(即定点突变体；等位变体))。使用显示为SEQ ID NO：X的序列衍生同一行中所述的构建体是在本领域技术人员能力内的。例如，如果SEQ ID NO：X对应于全长蛋白，但仅该蛋白的一部分用于产生具体CID，依赖于分子生物学技术诸如PCR来扩增该具体片段并将其克隆入合适载体是在本领域技术人员能力内的。

对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的其它治疗性蛋白包括但不限于，公开于表1的″治疗性蛋白X″列(列1)的一种或多种治疗性蛋白或肽，或其片段或变体。

表1提供对应于本发明的清蛋白融合蛋白或由本发明的多核苷酸编码的清蛋白融合蛋白的的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的非穷举列表。第一列″治疗性蛋白X″公开了治疗性蛋白分子，其可随后带有含有蛋白的学名和商品名的括号，该蛋白包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白分子或其片段或变体。本文所用的″治疗性蛋白X″可指个体治疗性蛋白分子，或指与公开于此列的指定治疗性蛋白分子相关的整组的治疗性蛋白。″生物活性″列(列2)描述与该治疗性蛋白分子相关的生物活性。列3″示例活性检测″提供描述可用于检测治疗性蛋白：X或包括治疗性蛋白X(或其片段)部分的清蛋白融合蛋白的治疗和/或生物活性的检测的参考文献。在″示例活性检测″列引用的每篇参考文献在此以其整体通过引用并入，尤其是参考文献中描述的用于检测表1的″生物活性″列中所列的相应生物活性的相应活性检测的相关描述(例如见于其中方法部分)。第四列″适应症：Y″描述了可由治疗性蛋白X或包括治疗性蛋白X(或其片段)部分的清蛋白融合蛋白治疗、预防、诊断和/或缓解的疾病、疾患、感染和/或病症。″构建体ID″列(列5)提供对公开于表2的编码清蛋白融合蛋白的示例性清蛋白融合构建体的链接，该清蛋白融合蛋白包括或可选地由以下组成：所提到的治疗性蛋白X(或其片段)部分。

表2提供本发明的多核苷酸的非穷举列表，其包括或可选地由以下组成：编码清蛋白融合蛋白的核酸分子。第一列″融合体No.″提供对每种多核苷酸的融合体编号。列2″构建体ID″提供对本发明的每种多核苷酸的独特数字标识符。构建体ID可用于标识编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸，该清蛋白融合蛋白包括或可选地由以下组成：对应于列在表1相应行的指定治疗性蛋白：X的治疗性蛋白部分，其中该构建体ID列在列5。″构建体名称″列(列3)提供指定清蛋白融合构建体或多核苷酸的名称。

表2中第四列″描述″提供指定清蛋白融合构建体的大致描述，第五列″表达载体″列出克隆入多核苷酸的载体，该多核苷酸包括或可选地由以下组成：编码指定清蛋白融合蛋白的核酸分子。载体是本领域已知的并市售可获得或描述于别处。例如，如在实施例中所述的，包括或可选地由以下一种或多种组成的″表达盒″可组装入方便的克隆载体并随后移入诸如例如包括例如酵母表达载体或哺乳动物表达载体的表达载体的可选载体：(1)编码指定清蛋白融合蛋白的多核苷酸、(2)前导序列、(3)启动子区和(4)转录终止子。在一个实施方式，对于在酿酒酵母(S.cervisiae)中表达，将包括或可选地由编码清蛋白融合蛋白的核酸分子组成的表达盒克隆入pSAC35。在另一实施方式，对于在CHO细胞中表达，将包括或可选地由编码清蛋白融合蛋白的核酸分子组成的表达盒克隆入pC4。在进一步的实施方式，将包括或可选地由编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的核酸分子组成的多核苷酸克隆入pC4：HAS。在又进一步的实施方式，对于在NSO细胞中表达，将包括或可选地由编码清蛋白融合蛋白的核酸分子组成的表达盒克隆入pEE12。其它可用的克隆载体和/或表达载体对本领域技术人员是已知的并在本发明范围内。

列6″SEQ ID NO：Y″提供本发明的清蛋白融合蛋白的全长氨基酸序列。在大多数情况，SEQ ID NO：Y显示所编码的清蛋白融合蛋白的未加工形式-换言之，SEQ ID NO：Y显示全部由特定构建体编码的信号序列、HSA部分和治疗性部分。具体地由本发明包括的是编码SEQ ID NO：Y的所有多核苷酸。当这些多核苷酸用于从细胞表达编码的蛋白时，细胞的天然分泌和加工步骤产生缺少列在表2的列4和/或11的信号序列的蛋白。所列信号序列的具体氨基酸序列随后显示在说明书中或是本领域已知的。因此本发明的一些实施方式包含细胞产生的清蛋白融合蛋白(其将缺少表2的列4和/或11显示的前导序列)。还包含在本发明的实施方式中的是包括SEQ ID NO：Y而没有列在表2的列4和/或11的具体前导序列的多肽。本发明的组合物以及药物组合物还包括这两种实施方式。而且，以不同信号序列代替列在表2的列4和/或11的信号序列以促进加工的清蛋白融合蛋白的分泌在本领域技术人员能力内，所述不同信号序列诸如随后在说明书中描述的。

第7列″SEQ ID NO：X″提供可从中衍生编码指定清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的多核苷酸的母体核酸序列。在一个实施方式，可从中衍生编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的多核苷酸的母体核酸序列包括编码表1中显示的治疗性蛋白的野生型基因序列。在可选实施方式，可从中衍生编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的多核苷酸的母体核酸序列包括编码表1中显示的治疗性蛋白的野生型基因序列的变体或衍生物，诸如例如编码治疗性蛋白的野生型基因序列的合成密码子优化变体。

第8列″SEQ ID NO：Z″提供母体核酸序列(SEQ ID NO：X)的预测翻译。该母体序列可为用于衍生具体构建体的全长母体蛋白、母体蛋白的成熟部分、野生型蛋白的变体或片段、或可用于产生所描述构建体的人工序列。本领域技术人员可使用SEQ ID NO：Z中显示的氨基酸序列来确定治疗性蛋白提供了指定构建体编码的清蛋白融合蛋白的哪些氨基酸残基。而且，使用显示为SEQ ID NO：Z的序列来衍生同一行中所述的构建体完全在本领域技术人员能力内。例如，如果SEQ ID NO：Z对应于全长蛋白，但仅部分该蛋白用于产生具体CID，依赖分子生物学技术诸如PCR来扩增具体片段并将其克隆入合适载体是在本领域技术人员能力内的。

列9和10分别提供的扩增引物″SEQ ID NO：A″和″SEQ ID NO：B″是用于产生多核苷酸的示例性引物，该多核苷酸包括或可选地由编码指定清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的核酸分子组成。在本发明的一个实施方式，具有列9和/或10显示的序列(SEQ ID NO：A和/或B)的寡核苷酸引物用于PCR扩增编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的多核苷酸，使用包括或可选地由以下组成的核酸分子：相应行的列7提供的核苷酸序列(SEQ ID NO：X)作为模板DNA。PCR方法是本领域中发展成熟的。本领域普通技术人员可易于预想和使用其它有用的引物序列。

在可选实施方式，寡核苷酸引物可用于重叠PCR反应以在模板DNA序列中产生突变。PCR方法是本领域已知的。

如表3所示，公开于本申请的一些清蛋白融合构建体已保藏于

表3

构建体ID	构建体名称	ATCC保藏号/日期
			2249	pSAC35：IFNa2-HSA也称为pSAC23：IFNα2-HSA	PTA-37632001年10月4日
2343	pSAC35.INV-IFNA2.HSA	PTA-39402001年12月19日
			2381	pC4：HSA-IFNa2(C17-E181)	PTA-39422001年12月19日
2382	pC4：IFNa2-HSA	PTA-39392001年12月19日
			3165	pSAC35：HSA.IFNa也称为CID 3165，pSAC35：HSA.INFα	PTA46702002年9月16日

可能通过本领域已知的和本文在别处描述的技术(见实施例10)从保藏物恢复指定的清蛋白融合构建体。ATCC位于10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款制备ATCC保藏物。

在本发明的进一步的实施方式，包括或可选地由以下一种或多种组成的″表达盒″可从一个载体移入或″亚克隆″入另一载体：(1)编码指定清蛋白融合蛋白的多核苷酸、(2)前导序列、(3)启动子区和(4)转录终止子。待被亚克隆的片段可由本领域熟知方法产生，诸如例如，PCR扩增(如，使用具有SEQ IDNO：A或B中显示的序列的寡核苷酸引物)，和/或限制性酶切消化。

在一些实施方式，本发明的清蛋白融合蛋白能够具有相应于对应于列在表1相应行的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的治疗活性和/或生物活性的治疗活性和/或生物活性。在进一步的实施方式，本发明的清蛋白融合蛋白的该治疗活性蛋白部分是表2的SEQ ID NO：X列显示的序列编码的蛋白的片段或变体，并能够具有相应治疗性蛋白的治疗活性和/或生物活性。

多肽和多核苷酸片段和变体

片段

本发明进一步涉及表1中所述的治疗性蛋白、清蛋白蛋白和/或本发明清蛋白融合蛋白的片段。

本发明还涉及编码表1中所述的治疗性蛋白、清蛋白蛋白和/或本发明清蛋白融合蛋白的片段的多核苷酸。

即使从蛋白N-末端缺失一个或多个氨基酸导致修饰或失去治疗性蛋白、清蛋白蛋白和/或本发明清蛋白融合蛋白的一种或多种生物学功能，仍可保持其它治疗活性和/或功能活性(如，生物活性、多聚的能力、结合配体的能力)。例如，当完整多肽的少于大多数残基从N-末端移除时，具有N-末端缺失的多肽通常将保持诱导和/或结合于识别完整或成熟形式的多肽的抗体的能力。缺少完整多肽的N-末端残基的特定多肽是否保持这种免疫活性可易于通过本文所述的例行方法和除此以外本领域已知的方法确定。具有大量缺失的N-末端氨基酸残基的突变蛋白不太可能可保持一些生物学或免疫原性活性。实际上，主要由少至六个氨基酸残基组成的肽通常可引起免疫应答。

因此，对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的片段包含全长蛋白以及从参考多肽(即表1中提及的治疗性蛋白、或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分)的氨基酸序列的氨基末端具有一个或多个残基缺失的多肽。尤其是，N-末端缺失可由通式m至q描述，其中q是代表参考多肽(如，表1中提及的治疗性蛋白、或本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分、或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分)中氨基酸残基总数的完整整数(whole integer)，m定义为从2至q-6的任何整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

此外，对应于本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白部分的血清清蛋白多肽的片段包含全长蛋白以及从参考多肽(即血清清蛋白或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白的血清清蛋白部分)的氨基酸序列的氨基末端具有一个或多个残基缺失的多肽。在一些实施方式，N-末端缺失可由通式m至585描述，其中585是代表成熟人类血清清蛋白(SEQID NO：1)中氨基酸残基总数目的完整整数，m定义为从2至579的任何整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。在另外的实施方式，N-末端缺失可由通式m至609描述，其中609是代表全长人类血清清蛋白(SEQID NO：3)中氨基酸残基总数目的完整整数，m定义为从2至603的任何整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

而且，本发明的清蛋白融合蛋白的片段包含全长清蛋白融合蛋白以及从清蛋白融合蛋白(如，表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白；或具有公开于表2列6的氨基酸序列的清蛋白融合蛋白)的氨基末端具有一个或多个残基缺失的多肽。尤其是，N-末端缺失可由通式m至q描述，其中q是代表清蛋白融合蛋白中氨基酸残基总数目的完整整数，m定义为从2至q-6的任何整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

还如上所述，即使从参考多肽(如，治疗性蛋白；血清清蛋白蛋白；或本发明的清蛋白融合蛋白)N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸导致修饰或失去蛋白的一种或多种生物学功能，仍可保持其它功能活性(如，生物活性、多聚的能力、结合配体的能力)和/或治疗活性。例如，当完整或成熟多肽的少于大多数残基从C-末端移除时，具有C-末端缺失的多肽通常将保持诱导和/或结合于识别完整或成熟形式的多肽的抗体的能力。缺少参考多肽的N-末端和/或C-末端残基的特定多肽是否保持治疗活性可易于通过本文所述的例行方法和除此以外本领域已知的方法确定。

本发明进一步提供对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白(即表1中提及的治疗性蛋白、或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分)的氨基酸序列的羧基末端具有一个或多个残基缺失的多肽。尤其是，C-末端缺失可由通式1至n描述，其中n是从6至q-1的任何完整整数，和其中q是代表参考多肽(如表1中提及的治疗性蛋白、或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分)中氨基酸残基总数目的完整整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

此外，本发明提供了对应于本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白部分的清蛋白蛋白(即血清清蛋白或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白的血清清蛋白部分)的氨基酸序列的羧基末端具有一个或多个残基缺失的多肽。尤其是，C-末端缺失可由通式1至n描述，其中n是从6至584的任何完整整数，其中584代表成熟人类血清清蛋白(SEQ IDNO：1)中氨基酸残基总数目-1的完整整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。尤其是，C-末端缺失可由通式1至n描述，其中n是从6至608的任何完整整数，其中608是代表血清清蛋白(SEQ ID NO：3)中氨基酸残基总数目-1的完整整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

而且，本发明提供了从本发明的清蛋白融合蛋白的羧基末端具有一个或多个残基缺失的多肽。尤其是，C-末端缺失可由通式1至n描述，其中n是从6至q-1的任何整数，且其中q是代表本发明的清蛋白融合蛋白中氨基酸残基总数目的完整整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

此外，可结合上述的任何N-或C-末端缺失以产生N-和C-末端缺失的参考多肽。本发明还提供从氨基和羧基末端两者都具有一个或多个氨基酸缺失的多肽，其通常可描述为具有参考多肽(如，表1中提及的治疗性蛋白、本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分、或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的治疗性蛋白部分、或血清清蛋白(如SEQ ID NO：1)、或本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白部分、或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白蛋白部分、或清蛋白融合蛋白、或本发明的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白)的m至n残基，其中n和m是如上所述的整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

本申请还涉及蛋白，其含有与本文所列的参考多肽序列(如，表1中提及的治疗性蛋白、本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分、或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的治疗性蛋白部分、或血清清蛋白(如SEQ ID NO：1)、或本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白部分、或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白蛋白部分、或清蛋白融合蛋白、或本发明的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白)或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。在一些实施方式，本申请涉及蛋白，其包括与如上所述的具有N-和C-末端缺失的氨基酸序列的参考多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

本发明的多肽片段包含片段，其包括或可选地由以下组成：表现氨基酸序列是片段的治疗性蛋白或血清清蛋白蛋白的多肽序列的治疗活性和/或功能活性(如生物活性)的氨基酸序列。

其它多肽片段包含生物活性的片段。生物活性的片段是表现出与本发明的多肽的活性相似但不必相同的活性的多肽片段。片段的生物活性可包含提高的期望活性或降低的不期望的活性。

变体

″变体″指不同于参考核酸或多肽但保持其必要特征的多核苷酸或核酸。通常，变体与参考核酸或多肽总体接近地相似，并在许多区域与参考核酸或多肽相同。

本文所用的″变体″指序列分别不同于治疗性蛋白(如见于表1的″治疗″列)、清蛋白和/或清蛋白融合蛋白，但保持本文在别处描述的或除此之外本领域已知的其至少一种功能和/或治疗特征的本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分、本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分、或本发明的清蛋白融合蛋白。通常，变体与对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白、对应于清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的清蛋白部分和/或清蛋白融合蛋白的氨基酸序列总体很相似，并在一些区域相同。编码这些变体的核酸也包括在本发明中。

本发明还涉及蛋白，其包括或可选地由以下组成：与例如对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的氨基酸序列(如，公开于表1的治疗性蛋白：X的氨基酸序列；或表1和2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的氨基酸序列，或其片段或变体)、对应于本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的清蛋白的氨基酸序列(如，表1和2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的氨基酸序列；显示于SEQ ID NO：1的氨基酸序列；或其片段或变体)和/或清蛋白融合蛋白的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。还提供这些多肽的片段(如，本文所述的那些片段)。本发明包括的其他多肽是多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在下述条件下与编码本发明的清蛋白融合蛋白的核酸分子的互补物杂交：严格杂交条件(如，在约45摄氏度在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交于滤器结合的DNA，随后在约50-65摄氏度在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次)、高严格条件(如，在约45摄氏度在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交于滤器结合的DNA，随后在约68摄氏度在0.1X SSC、0.2％SDS中洗涤一次或多次)、或本领域技术人员已知的其它严格杂交条件(见于例如，Ausubel，F.M.等编辑，1989 Current Protocols inMolecular Biology(最新分子生物学实验指南)，Green publishing associates，Inc.，和John Wiley & Sons Inc.，New York，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。

具有与询问氨基酸序列具有至少例如95％″同一性″的氨基酸序列的多肽，意为主题多肽的氨基酸序列与该询问序列(query sequence)相同，除了主题多肽序列可包含询问氨基酸序列的每100氨基酸的最多五个氨基酸改变。换言之，为了获得具有与询问氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，主题序列(subject sequence)的最多5％的氨基酸残基可被插入、缺失、或以另一氨基酸取代。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基-或羧基-末端位置或这些末端位置之间的任何位置，单独散布在参考序列中各残基之间或以一个或多个连续组散布在参考序列内。

实际来看，可使用已知计算机程序常规地确定任何特定多肽是否与例如，本发明的清蛋白融合蛋白或其片段(诸如清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分或清蛋白融合蛋白的清蛋白部分)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。确定询问序列(本发明的序列)和主题序列之间最佳总匹配的方法，还称为总序列比对，可使用基于Brutlag等(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))算法的FASTDB计算机程序确定。在序列比对中，询问序列和主题序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述总序列比对的结果表示为同一性百分比。用于FASTDB氨基酸比对的优选的参数是：矩阵＝PAM 0、k-tuple＝2、错配罚分＝1、连接罚分＝20、随机组长度＝0、阈值(Cutoff)分数＝1、窗口大小＝序列长度、缺口罚分＝5、缺口大小罚分＝0.05、窗口大小＝500或任何更短的主题氨基酸序列的长度。

如果由于N-或C-末端缺失而不是因为内部缺失，主题序列短于询问序列，则必须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序当计算总同一性百分比时不考虑主题序列N-和C-末端的截短。对于在N-和C-末端相对于询问序列截短的主题序列，通过计算询问序列在主题序列N-和C-末端的未与相应主题残基匹配/比对的残基数目作为询问序列的总碱基的百分比来校正同一性百分比。残基是否匹配/比对由FASTDB序列比对的结果确定。从由上述FASTDB程序使用规定参数计算的同一性百分比减去该百分比以获得最终百同一性分比分数。这最终同一性百分比分数用于本发明目的。只有对主题序列N-和C-末端未与询问序列匹配/比对的残基被认为是为了人工调整同一性百分比分数的目的。即，只有主题序列的最远的N-和C-末端残基之外的询问残基位置。

例如，将90氨基酸残基的主题序列与100残基的询问序列比对以确定同一性百分比。缺失发生在主题序列的N-末端，因此，FASTDB比对不显示N-末端前10残基的匹配/比对。10个未配对的残基代表序列的10％(在N-和C-末端不匹配的残基数目/询问序列中残基总数目)，所以从FASTDB程序计算的同一性百分比分数减去10％。如果剩余的90残基完全匹配，则最终同一性百分比将为90％。在另一例子，将90残基的主题序列与100残基的询问序列比较。这次缺失是内部缺失，所以没有不与询问序列匹配/比对的在主题序列N-或C-末端的残基。本例中不人工校正FASTDB计算的同一性百分比。再一次地，如在FASTDB比对中表现的，只有主题序列N-和C-末端之外的不与询问序列匹配/比对的残基位置被人工校正。为了本发明目的不进行其它人工校正。

变体通常与该变体相同长度的正常HA或治疗性蛋白的长度具有至少75％(例如，至少约80％、90％、95％或99％)的序列同一性。由BLAST(基础局部比对搜索工具)分析确定在核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或同一性，使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx(Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268(1990)和Altschul，J.Mol.Evol.36：290-300(1993)，以其整体通过引用并入)采用的算法，这些程序被调制用于序列相似性搜索。

BLAST程序使用的方法是首先考虑询问序列和数据库序列之间的相似区段，然后评价鉴定的所有匹配之间的统计显著性，最终概括出满足预选的显著性阈值的那些匹配。对于序列数据库的相似性搜索中基础问题的讨论，见于Altschul等(Nature Genetics 6：119-129(1994))，其以其整体通过引用并入。对柱状图、描述、比对、预期值(即对数据库序列报告匹配的统计显著性阈值)、阈值、矩阵和排除值(filter)的搜索参数是默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认计分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919(1992)，以其整体通过引用并入)。对于blastn，计分矩阵由M(即对一对匹配残基的奖励分数)对N(即对错配残基的罚分分数)的比值设定，其中M和N的默认值分别是5和-4。四个blastn参数可如下调整：Q＝10(产生缺口的罚分)；R＝10(缺口延伸的罚分)；wink＝1(沿着询问序列的每个wink位置产生字符击中(word hits))；和gapw＝16(设置窗宽度，在该宽度中产生带缺口的比对)。相当的Blastp参数设置为Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。GCG软件包10.0版本中可得的序列之间最佳拟合(Bestfit)比较使用DNA参数GAP＝50(产生缺口的罚分)和LEN＝3(缺口延伸的罚分)，蛋白比较中相当的设置是GAP＝8和LEN＝2。

本发明的多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中含有改变。本发明的实施方式包含多核苷酸变体，其含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的特征或活性的改变。由于遗传密码子的简并性，由沉默取代产生的核苷酸变体也是本发明的实施方式。而且，其中少于50、少于40、少于30、少于20、少于10、或5-50、5-25、5-10、1-5、或1-2个氨基酸被以任何组合取代、缺失、或添加的多肽变体也是本发明的实施方式。为了多种原因可制备多核苷酸变体，如为了对特定宿主优化密码子表达(改变人类mRNA中密码子为细菌宿主诸如酵母或大肠杆菌优选的密码子)。

在一个实施方式，编码清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的本发明的多核苷酸被优化用于在酵母或哺乳动物细胞中表达。在进一步的实施方式，编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的本发明的多核苷酸被优化用于在酵母或哺乳动物细胞中表达。在又进一步的实施方式，编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸被优化用于在酵母或哺乳动物细胞中表达。

在可选实施方式，在本文所述的严格杂交条件下，编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的密码子优化的多核苷酸不与编码治疗性蛋白的野生型多核苷酸杂交。在进一步的实施方式，在本文所述的严格杂交条件下，编码清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的密码子优化的多核苷酸不与编码清蛋白的野生型多核苷酸杂交。在另一实施方式，在本文所述的严格杂交条件下，编码清蛋白融合蛋白的密码子优化的多核苷酸不与编码治疗性蛋白部分或清蛋白部分的野生型多核苷酸杂交。

在另外的实施方式，编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的多核苷酸不包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白的天然产生的序列。在进一步的实施方式，编码清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的多核苷酸不包括或可选地由以下组成：清蛋白的天然产生的序列。在可选实施方式，编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸不包括或可选地由以下组成：治疗性蛋白部分或清蛋白部分的天然产生的序列。

天然产生的变体称为″等位变体″，并指占据生物体的染色体上指定位点的基因的多个可选形式之一。(Genes II，Lewin，B.编辑，John Wiley & Sons，New York(1985))。这些等位变体可在多核苷酸和/或多肽水平变化并包含在本发明中。可选地，非天然产生的变体可由诱变技术或由直接合成制备。

使用蛋白工程和重组DNA技术的已知方法，可产生变体以改进或改变本发明的多肽的特性。例如，可从本发明的多肽N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸而不实质损失生物功能。作为一个例子，Ron等(J.Biol.Chem.268：2984-2988(1993))报道了甚至在缺失3、8或27个氨基-末端氨基酸残基后具有肝素结合活性的变体KGF蛋白。类似地，从干扰素γ蛋白羧基末端缺失8-10氨基酸残基后干扰素γ显示多达十倍更高的活性。(Dobeli等，J.Biotechnology 7：199-216(1988).)

而且，足够的证据证明变体常保持与天然产生的蛋白相似的生物活性。例如，Gayle和合作者(J.Biol.Chem.268：22105-22111(1993))进行了人类细胞因子IL-1a的大量突变分析。他们使用随机诱变来产生超过3,500个单独IL-1a突变体，在分子的整个长度上平均每变体有2.5个氨基酸改变。在每个可能的氨基酸位置检查多种突变。研究者发现″可改变大多数分子而对[结合活性或生物活性]几乎无影响″。实际上，在检查的超过3,500个核苷酸序列中只有23个独特氨基酸序列产生与野生型蛋白的活性显著地不同的蛋白。

此外，甚至如果从多肽N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸导致修饰或失去一种或多种生物功能，仍可保持其它生物活性。例如，当分泌形式的少于大多数残基从N-末端或C-末端移除时，缺失变体很可能保持诱导和/或结合识别分泌形式的抗体的能力。可易于由本文所述的和除此之外本领域已知的例行方法确定缺少蛋白的N-或C-末端残基的特定多肽是否保持这种免疫原性活性。

因此本发明进一步包含具有功能活性(如，生物活性和/或治疗活性)的多肽变体。在一个实施方式，本发明提供具有对应于对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的一种或多种生物和/或治疗活性的功能活性(如，生物活性和/或治疗活性)的清蛋白融合蛋白变体。在另一实施方式，本发明提供对应于对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的一种或多种生物和/或治疗活性的功能活性(如，生物活性和/或治疗活性)的清蛋白融合蛋白变体。这种变体包含根据本领域已知普遍规则选择的缺失、插入、倒位、重复和取代从而对活性几乎无影响。编码这种变体的多核苷酸也包括在本发明中。

在一些实施方式，本发明的变体具有保守性取代。″保守性取代″意为组内交换，诸如脂族或疏水的氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替代；羟基残基Ser和Thr的替代；酸性残基Asp和Glu的替代；酰胺残基Asn和Gln的替代，碱性残基Lys、Arg和His的替代；芳族残基Phe、Tyr和Trp的替代，和小(small-sized)的氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替代。

关于如何产生表型沉默的氨基酸取代的指导提供于例如，在Bowie等，″Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino AcidSubstitutions(译解蛋白序列中的信息：容忍氨基酸取代)，″Science 247：1306-1310(1990)，其中作者指出有两种主要策略研究氨基酸序列对改变的耐受。

第一种策略采用进化过程中由自然选择进行的氨基酸取代的耐受。通过比较不同物种中的氨基酸序列，可鉴定保守的氨基酸。这些保守的氨基酸很可能对蛋白功能重要。相反，已经由自然选择耐受的取代的氨基酸位置表示这些位置对蛋白功能不是关键的。因此，耐受氨基酸取代的位置可被修饰而仍维持蛋白的生物活性。

第二种策略使用遗传工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸改变以鉴定对蛋白功能关键的区域。例如，可使用位点定向诱变或丙氨酸-扫描诱变(在分子中每个残基引入单个丙氨酸突变)。见于Cunningham和Wells，Science244：1081-1085(1989)。随后可测试所得的突变体分子的生物活性。

如这些作者所述的，这两种策略已经揭示了蛋白令人惊讶地耐受氨基酸取代。这些作者进一步指出哪些氨基酸改变在蛋白中一些氨基酸位置可能是许可的。例如，大多数掩藏的(在蛋白三级结构中)氨基酸残基需要非极性侧链，而通常保留很少的表面侧链特征。而且，耐受的保守的氨基酸取代包括脂族或疏水的氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替代；羟基残基Ser和Thr的替代；酸性残基Asp和Glu的替代；酰胺残基Asn和Gln的替代，碱性残基Lys、Arg和His的替代；芳族残基Phe、Tyr和Trp的替代，和小尺寸的氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替代。除了保守的氨基酸取代以外，本发明变体还包含(i)含有一个或多个非保守氨基酸残基取代的多肽，其中该取代的氨基酸残基可为遗传密码子编码的或可不为遗传密码子编码的，或(ii)含有一个或多个具有取代基的氨基酸残基的取代的多肽，或(iii)已与另一种化合物融合或化学结合的多肽，该化合物诸如增加多肽稳定性和/或溶解度的化合物(例如，聚乙二醇)，(iv)含有其它氨基酸的多肽，诸如例如，IgG Fc融合区肽。从本文的教导，这种变体多肽视为在本领域技术人员范围内。

例如，含有以其它带电荷的或中性氨基酸取代带电荷的氨基酸的氨基酸取代的多肽变体可产生具有改进的特性(诸如聚集较少)的蛋白。由于聚集物的免疫原性活性，药物制剂的聚集减少活性和增加清除。见于Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2：331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36：838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10：307-377(1993)。

在特定实施方式，本发明的多肽包括或可选地由以下组成：清蛋白融合蛋白的氨基酸序列的片段或变体、治疗性蛋白和/或人类血清清蛋白的氨基酸序列的片段或变体；其中该片段或变体与参考氨基酸序列相比具有1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150个氨基酸残基添加、取代和/或缺失。在其它实施方式，氨基酸取代是保守的。编码这些多肽的核酸也包括在本发明中。

本发明的多肽可主要由彼此由肽键或修饰的肽键(即肽电子等排体)连接的氨基酸组成，并可含有不同于20种基因-编码的氨基酸的氨基酸。多肽可由天然加工(诸如翻译后加工)或由本领域熟知的化学修饰技术被修饰。这种修饰描述于基础教科书和更详细的专题论文以及大的研究文献。修饰可发生在多肽任何位置，包含肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应理解，相同类型的修饰可在指定多肽的多个位点以相同或不同程度存在。而且指定多肽可含有许多类型的修饰。例如由于泛素化，多肽可为分支的，并且多肽可为带有或不带有分支的环状。环状、分支的和分支的环状多肽可从翻译后天然加工获得或可由合成方法制备。修饰包含乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联键、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒基化(selenoylation)、硫酸盐化(sulfation)、转移-RNA介导的向蛋白添加氨基酸，诸如精氨酰化(arginylation)和泛素化。(见于例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES(蛋白-结构和分子特征)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS(翻译后共价修饰蛋白)，B.C.Johnson，编辑，Academic Press，NewYork，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62(1992))。

功能活性

″具有功能活性的多肽″指能够表现治疗性蛋白的全长、前蛋白和/或成熟形式相关的一种或多种已知功能活性的多肽。这种功能活性包括但不限于，生物活性、抗原性[结合(或与多肽竞争结合)于抗-多肽抗体的能力]、免疫原性(产生结合于本发明的具体多肽的抗体的能力)、与本发明的多肽形成多聚物的能力、和结合于多肽的受体或配体的能力。

″具有生物活性的多肽″指表现与本发明的治疗性蛋白(包含成熟形式)的活性相似但不必相同的活性的多肽，如在特定生物学检测中测量的，具有或不具有剂量依赖性。在存在剂量依赖性的情形，剂量依赖性不必须与多肽的相同，而是与本发明的多肽相比在指定活性的剂量-依赖性大致相似(即候选多肽相对于本发明的多肽表现更大活性或不超过约25倍少的活性，在一个实施方式，不超过约10倍少的活性，和在进一步的实施方式，不超过约3倍少的活性)。

在一些实施方式，本发明的清蛋白融合蛋白具有与未与清蛋白融合时的治疗性蛋白部分(或其片段或变体)相关的至少一种生物和/或治疗活性。

在另外的实施方式，本发明的清蛋白融合蛋白与未融合状态的治疗性蛋白部分(或其片段或变体)相比具有增加的血浆稳定性。可使用本领域已知的检测法或例行地修改的本领域已知的检测法检测本发明的清蛋白融合蛋白或未融合的治疗性蛋白部分(或其片段或变体)的血浆稳定性。

可使用本领域已知的检测法或例行地修改的本领域已知的检测法及本文所述的检测法检测本发明的清蛋白融合蛋白的功能活性(如，生物活性)。此外，使用表1相应列(如，在表1的列3)提到的检测法，本领域技术人员可例行地检测对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白片段的活性。进一步地，本领域技术人员可使用本领域已知和/或如下实施例部分中所述的检测法例行地检测对应于清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白部分的清蛋白蛋白片段的活性。

例如，在一个检测清蛋白融合蛋白结合或与治疗性蛋白竞争结合抗-治疗性多肽抗体和/或抗-清蛋白抗体的能力的实施方式，可使用本领域已知的各种免疫检测，包含但不限于，竞争性和非-竞争性检测体系，使用诸如放射免疫检测、ELISA(酶联免疫吸附检测)、″三明治″免疫检测、免疫放射检测、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散检测、原位免疫检测(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹、沉淀反应、凝集检测(如，凝胶凝集检测、凝血检测)、补体结合检测、免疫荧光检测、蛋白A检测和免疫电泳检测等技术。在一个实施方式，由检测第一抗体上的标记而检测抗体结合。在另一实施方式，由检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合而检测第一抗体。在进一步的实施方式，第二抗体是标记的。许多方法是本领域已知用于检测在免疫检测中的结合的并在本发明范围内。

在一个实施方式，当鉴定了治疗性蛋白的结合配偶体(如，受体或配体)时，可检测包括该治疗性蛋白(作为融合体的治疗性蛋白部分)的清蛋白融合蛋白对结合配偶体的结合，如，由本领域熟知的方法，诸如例如，还原性和非还原性凝胶色谱、蛋白亲合色谱和亲合印迹法。通常见于，Phizicky等，Microbiol.Rev.59：94-123(1995)。在另一实施方式，可例行地使用本领域已知技术检测清蛋白融合蛋白的生理相关物结合对应于融合体的治疗性蛋白部分的治疗性多肽的基质(substrate)的能力。

在可选实施方式，当评价清蛋白融合蛋白多聚的能力时，可如由本领域熟知的方法检测与多聚物的其它组分的缔合，所述方法诸如例如，还原性和非还原性凝胶色谱、蛋白亲合色谱和亲合印迹法。通常见于，上述Phizicky等。

在一些实施方式，包括与治疗性蛋白结合的抗体的全部或部分的清蛋白融合蛋白具有与当治疗性蛋白未与清蛋白融合时结合治疗性蛋白(或其片段或变体)的抗体相关的至少一种生物和/或治疗活性(如，特异性结合多肽或表位)。在其它实施方式，包括与治疗性蛋白结合的抗体的全部或部分的清蛋白融合蛋白的生物活性和/或治疗活性是抑制(即拮抗)或活化(即激动)与由结合治疗性蛋白的抗体特异性地结合的多肽相关的一种或多种生物活性和/或治疗活性。

包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白可以多种方式表征。尤其是，使用本文所述的技术或例行地修改的本领域已知的技术可检测包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白特异性结合对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的抗体特异性地结合的相同抗原的能力。

对清蛋白融合蛋白(如，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体)(特异性地)结合具体蛋白或表位的能力的检测可在溶液中进行(如，Houghten，Bio/Techniques 13：412-421(1992))、在微珠上进行(如，Lam，Nature354：82-84(1991))、在芯片上进行(如，Fodor，Nature 364：555-556(1993))、在细菌上(如，美国专利第5,223,409号)、在孢子上进行(如，专利第5,571,698；5,403,484；和5,223,409号)、在质粒上进行(如，Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869(1992))或在噬菌体上进行(如，Scott和Smith，Science 249：386-390(1990)；Devlin，Science 249：404-406(1990)；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382(1990)；和Felici，J.Mol.Biol.222：301-310(1991))(这些参考文献各自在此以其整体通过引用并入)。可使用或例行修改本文所述或除此之外本领域已知的技术检测包括治疗性抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白对具体蛋白或表位的特异性和亲和力。

可由本领域已知任何方法检测包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白与其它抗原(如，与对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白(或其片段或变体)结合的抗体特异性地结合的分子具有序列/结构保守性的分子)的交叉反应性。

可用于分析(免疫特异性)结合和交叉反应性的免疫检测包括但不限于竞争性和非-竞争性检测系统，使用诸如western印迹、放射免疫检测、ELISA(酶联免疫吸附检测)、″三明治″免疫检测、免疫沉淀检测、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散检测、凝集检测、补体固定检测、免疫放射检测、荧光免疫检测和蛋白A免疫检测等技术，仅举几个例子。这种检测是常规的和本领域熟知的(见于如，Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in MolecularBiology(最新分子生物学实验指南)，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，在此以其整体通过引用并入)。示例性免疫检测简要描述于以下(但不意为限制)。

免疫沉淀方案一般包括在加有蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的裂解缓冲液诸如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠、在pH 7.2、1％Trasylol)中裂解细胞群体，向细胞裂解物加入本发明的清蛋白融合蛋白(如，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体)，在40℃孵育一段时间(如，1至4小时)，例如向细胞裂解物加入偶联于抗-清蛋白抗体的琼脂糖微珠，在40℃孵育约一小时或更长，在裂解缓冲液中清洗微珠并在SDS/样品缓冲液中重悬微珠。可由如western印迹分析评价清蛋白融合蛋白免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员将知道可被修改以增加清蛋白融合蛋白对抗原的结合并减少背景(如，以琼脂糖微珠预澄清细胞裂解物)的参数。关于免疫沉淀方案的进一步讨论见于，如，Ausubel等编辑，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，第1卷的10.16.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York。

Western印迹分析一般包括制备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶(如，取决于抗原分子量，8％-20％SDS-PAGE)中电泳蛋白样品，从聚丙烯酰胺凝胶转移蛋白样品到膜诸如硝酸纤维素、PVD或尼龙，在封闭溶液(如，含3％BSA或脱脂奶粉的PBS)中封闭膜，在清洗缓冲液(如，PBS-Tween 20)中清洗膜，向膜加入本发明的清蛋白融合蛋白(稀释于封闭缓冲液)，在清洗缓冲液中清洗膜，施加稀释于封闭缓冲液的轭合于酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射活性分子(如，³²P或¹²⁵I)的第二抗体(其识别清蛋白融合蛋白，如抗-人类血清清蛋白抗体)，在清洗缓冲液中清洗膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员将知道可被修改以增加检测的信号并减少背景噪音的参数。关于western印迹方案的进一步讨论见于，如，Ausubel等编辑，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，第1卷的10.8.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York。

ELISA包括制备抗原，以抗原包被96-孔微量滴定板的孔，洗去未结合孔的抗原，向孔加入轭合于可检测的化合物诸如酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的本发明的清蛋白融合蛋白(如，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体)并孵育一段时间，洗去未结合的或非-特异性地结合的清蛋白融合蛋白，并检测特异性地结合抗原包被孔的清蛋白融合蛋白的存在。ELISA中清蛋白融合蛋白不必轭合于可检测的化合物；相反，可向孔加入轭合于可检测的化合物的第二抗体(其识别清蛋白融合蛋白)。进一步地，代替以抗原包被孔，可以清蛋白融合蛋白包被孔。这种情形，可检测的分子可为轭合于可检测的化合物诸如酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗原。本领域技术人员将知道可被修改以增加检测的信号的参数以及本领域已知ELISA的其它变量。关于ELISA的进一步讨论见于如，Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，第1卷的11.2.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York。

可由竞争性结合检测确定清蛋白融合蛋白对蛋白、抗原或表位的结合亲和力和清蛋白融合蛋白-蛋白/抗原/表位相互作用的解离率。竞争性结合检测的一个例子是放射免疫检测，包括在增加量的未标记抗原存在下孵育标记的抗原(如，³H或¹²⁵I)与本发明的清蛋白融合蛋白，并检测结合于标记的抗原的抗体。可从Scatchard曲线分析的数据确定清蛋白融合蛋白对具体蛋白、抗原或表位的亲和力和结合解离率。与清蛋白融合蛋白结合于同一蛋白、抗原或表位的第二蛋白的竞争还可使用放射免疫检测确定。这种情形，在增加量的与本发明的清蛋白融合蛋白结合于同一蛋白、抗原或表位的未标记的第二蛋白存在下孵育蛋白、抗原或表位与轭合于标记的化合物(如，³H或¹²⁵I)的清蛋白融合蛋白。

在一个实施方式，BIAcore动力学分析用于确定本发明的清蛋白融合蛋白对蛋白、抗原或表位的结合率和解离率。BIAcore动力学分析包括从在其表面分别具有固定化的具体多肽、抗原或表位或清蛋白融合蛋白的芯片的分析清蛋白融合蛋白或具体多肽、抗原或表位的结合和解离。

结合对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的抗体也可以它们对指定蛋白或抗原(例如，它们特异性结合的抗原)的结合亲和力来描述或说明。结合亲和力包含解离常数或Kd少于5×10^-2M、10^-2M、5×10^-3M、10^-3M、5×10^-4M、10^-4M的结合亲和力。其它结合亲和力包含解离常数或Kd少于5×10^-5M、10^-5M、5×10^-6M、10^-6M、5×10^-7M、10^-7M、5×10^-8M或10^-8M的结合亲和力。其它结合亲和力包含解离常数或Kd少于5×10^-9M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^-13M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M或10^-15M的结合亲和力。在一些实施方式，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白对指定蛋白或表位具有的亲和力与结合治疗性蛋白的相应抗体(未与清蛋白融合)的相似，考虑到清蛋白融合蛋白(包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体)的效价和相应抗体的效价。此外，可例行地采用本文所述的检测(见于实施例和表1)和除此之外本领域已知的检测以测量清蛋白融合蛋白和其片段、变体和衍生物引起与清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分和/或清蛋白部分相关的生物活性和/或治疗活性(体外或体内)的能力。其它方法对本领域技术人员是已知的并在本发明范围内。

清蛋白

如上所述，本发明的清蛋白融合蛋白包括治疗性蛋白的至少片段或变体和人类血清清蛋白的至少片段或变体，它们例如通过遗传融合互相连接。

其它实施方式包含治疗性蛋白的至少片段或变体和人类血清清蛋白的至少片段或变体，它们由化学结合彼此连接。

术语人类血清清蛋白(HSA)和人类清蛋白(HA)在本文可互换地使用。术语″清蛋白″和″血清清蛋白″更宽泛，包括人类血清清蛋白(和其片段和变体)以及从其它物种的清蛋白(和其片段和变体)。

本文所用的″清蛋白″共同指清蛋白蛋白或清蛋白氨基酸序列、或具有清蛋白的一种或多种功能活性(如，生物活性)的清蛋白片段或变体。尤其是，″清蛋白″指人类清蛋白或其片段(见于例如，EP 201239、EP 322094、WO97/24445、WO95/23857)，尤其是显示在图1和SEQ ID NO：1的人类清蛋白成熟形式，或来自其它脊椎动物的清蛋白或其片段，或这些分子或其片段的类似物或变体。

在一些实施方式，用于本发明的清蛋白融合蛋白的人类血清清蛋白蛋白相对于SEQ ID NO：1含有以下一组或两组点突变：Leu-407至Ala、Leu-408至Val、Val-409至Ala、和Arg-410至Ala；或Arg-410至A、Lys-413至Gln、和Lys-414至Gln(见于如，国际公布第WO95/23857号，在此以其整体通过引用并入)。在其它实施方式，本发明的含有上述一组或两组点突变的清蛋白融合蛋白对酵母Yap3p蛋白水解裂解具有提高的稳定性/抗性，允许增加制备在酵母宿主细胞中表达的重组清蛋白融合蛋白。

本文所用的足以延长治疗性蛋白的治疗活性或血浆稳定性或贮存期限的清蛋白部分指，长度或结构上足以稳定或延长蛋白的治疗活性或血浆稳定性从而与非-融合体状态的贮存期限或血浆稳定性相比延长或延伸清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的贮存期限或血浆稳定性的清蛋白部分。清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可包括如上所述的HA序列的全长，或可包含其能够稳定或延长治疗活性的一个或多个片段。这种片段的长度可为10个或更多氨基酸或可包含来自HA序列的约15、20、25、30、50或更多连续氨基酸或可包含HA的部分或全部具体结构域。例如，可使用HA的一个或多个跨前两个免疫球蛋白-类结构域的片段。在一个实施方式，HA片段是HA的成熟形式。

本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可为正常HA的变体。本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分也可为如本文所述的治疗性蛋白的变体。术语″变体″包含保守的或非保守的插入、缺失和取代，其中这种变化不实质改变清蛋白的胶体渗透(oncotic)、有用配体-结合和非-免疫原性特征的一种或多种或赋予治疗性蛋白的治疗活性的活性位点或活性结构域。

尤其是，本发明的清蛋白融合蛋白可包含人类清蛋白的天然产生的多态性变体和人类清蛋白的片段，例如公开于EP 322094的片段(称为HA(Pn)，其中n是369至419)。清蛋白可衍生自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人类、牛、绵羊或猪。非哺乳动物的清蛋白包括但不限于母鸡和鲑鱼的清蛋白。清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可与治疗性蛋白部分来自不同的动物。

一般来说，HA片段或变体至少100氨基酸长，例如，至少150氨基酸长。HA变体可由以下组成或可选地包括：至少一个全结构域的HA，例如结构域1(SEQ ID NO：1的氨基酸1-194)、结构域2(SEQ ID NO：1的氨基酸195-387)、结构域3(SEQ ID NO：1的氨基酸388-585)、结构域1和2(SEQID NO：1的1-387)、结构域2和3(SEQ ID NO：1的195-585)或结构域1和3(SEQ ID NO：1的氨基酸1-194和SEQ ID NO：1的氨基酸388-585)。每个结构域本身由两个同源亚结构域组成，即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585，带有包括残基Lys106至Glu119、Glu292至Val315和Glu492至Ala511的柔性内-亚结构域连接体区。

一方面，本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分包括HA的至少一个亚结构域或结构域或其保守的修饰。如果融合体是基于亚结构域，一些或所有相邻连接体可用于连接至治疗性蛋白部分。

特异性结合治疗性蛋白的抗体也是治疗性蛋白

本发明还包括清蛋白融合蛋白，其包括特异性结合公开于表1的治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体。具体地包括，术语″治疗性蛋白″包括结合治疗性蛋白(如，表1的列I中所述的)的抗体和其片段和变体。因此本发明的清蛋白融合蛋白可含有治疗性蛋白的至少片段或变体，和/或结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体。

抗体结构和背景

已知基本抗体结构单元包括四聚物。每个四聚物主要由以下组成：两对相同的多肽链，每对具有一″轻″(约25kDa)和一″重″链(约50-70kDa)。每条链的氨基-末端部分包含约100至110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基-末端部分限定恒定区，主要负责效应子功能。人类轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并分别限定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。通常见于，Fundamental Immunology(基础免疫学)第3-5章(Paul，W.编辑，第4版.Raven Press，N.Y.(1998))(为所有目的在此以其整体通过引用并入)。每对轻/重链的可变区形成抗体结合位点。

因此完整IgG抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，这两个结合位点是相同的。

链都表现相同的一般结构：相对保守的框架区(FR)连接于三个高变区，还称为互补决定区或CDR。CDR区通常是抗体接触抗原和确定其特异性的部分。每对的重和轻链的CDR与框架区对齐，使得结合至特定表位。从N-末端至C-末端，轻和重链可变区都包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可变区连接于重或轻链恒定区。氨基酸向各结构域的分配是根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学方面的Kabat蛋白序列)(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))的定义，或Chothia & Lesk J Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等Nature342：878-883(1989)。

本文所用的″抗体″指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子(如，含有一个或多个抗体CDR区的分子)。可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体包括但不限于，单克隆、多特异性、人类、人源化或嵌合抗体、单链抗体(如，单链Fv)、Fab片段、F(ab′)片段、Fab表达文库制备的片段、抗-独特型(抗-Id)抗体(包含如，具体对本发明的抗体特异性的抗-Id抗体)，和任何上述抗体的表位-结合片段(如，VH结构域、VL结构域或一个或多个CDR区)。

结合治疗性蛋白的抗体

本发明包括包含结合治疗性蛋白(如，公开于表1的)或其片段或变体的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白。

结合治疗性蛋白(或其片段或变体)的抗体可来自任何动物来源，包含鸟类和哺乳动物。抗体可为人类、鼠(如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。在一个实施方式，该抗体是人类抗体。本文所用的″人类″抗体包含具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体并包含从人类免疫球蛋白文库和已被遗传改造以制备人类抗体的异种小鼠(xenomice)或其它生物体分离的抗体。

结合于治疗性蛋白和可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体分子可为免疫球蛋白分子的任何型(如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类(如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一些实施方式，结合于治疗性蛋白和可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体分子是IgG1。在其它实施方式，结合于治疗性蛋白和可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的免疫球蛋白分子是IgG2。在其它实施方式，结合于治疗性蛋白和可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的免疫球蛋白分子是IgG4。

在一个实施方式，结合于治疗性蛋白和可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体是本发明的人类抗原-结合抗体片段并包括但不限于，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包括VL或VH结构域的片段。包含单链抗体的抗原-结合抗体片段可包括单独或与以下整体或部分结合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。可结合于治疗性蛋白或清蛋白融合蛋白的其它抗原-结合蛋白包含，如，Small Modular ImmunoPharmaceuticals(SMIPSs^TM)(见于如，美国公布专利申请第20050202534号)。

结合于治疗性蛋白和可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体可为单特异性的、双特异性的、三特异性的或更多特异性的。多特异性抗体可为对治疗性蛋白不同表位特异性的或可为对治疗性蛋白以及异源表位两者特异性的，诸如异源多肽或固相支持材料。见于如，PCT公布WO93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利第4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819号；Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。

结合治疗性蛋白(或其片段或变体)的抗体可为双特异性的或双功能的，这表示抗体是人工杂合抗体，具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点。可由多种方法制备双特异性的抗体，包含融合杂交瘤或连接Fab′片段。见于如，Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)、Kostelny等J Immunol.148：15471553(1992)。此外，双特异性的抗体可形成为″双抗体″(Holliger等′″Diabodies′：small bivalent and bispecific antibody fragments(′双抗体′：小的双价和双特异性的抗体片段)″PNAS USA 90：6444-6448(1993))或″Janusins″(Traunecker等″Bispecific single chain molecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells(双特异性单链分子(Janusins)靶向HIV感染的细胞上的细胞毒性淋巴细胞)″EMBO J 10：3655-3659(1991)和Traunecker等″Janusin：new molecular design for bispecificreagents(Janusin：双特异性试剂的新分子设计)″Int J Cancer Suppl 7：51-52(1992))。

本发明还提供包括本文所述的或本领域中别处已知的抗体的片段或变体(包含衍生物)的清蛋白融合蛋白。对本领域技术人员已知的可用于在编码本发明的分子的核苷酸序列中引入突变的标准技术包含，例如，造成氨基酸取代的位点定向诱变和PCR-介导的诱变。在一个实施方式，变体(包含衍生物)相对于参考VH结构域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL结构域、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3编码少于50氨基酸取代、少于40氨基酸取代、少于30氨基酸取代、少于25氨基酸取代、少于20氨基酸取代、少于15氨基酸取代、少于10氨基酸取代、少于5氨基酸取代、少于4氨基酸取代、少于3氨基酸取代、或少于2氨基酸取代。在特定实施方式，变体编码VHCDR3的取代。在一个实施方式，变体在一个或多个预测的非必需氨基酸残基具有保守的氨基酸取代。

结合于治疗性蛋白和可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体可以它们识别或特异性结合的治疗性蛋白的表位或部分描述或说明。也可不包括特异性结合治疗性蛋白或治疗性蛋白的特定表位的抗体。因此，本发明包括特异性结合治疗性蛋白的抗体，并允许不包括它们。在一些实施方式，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白与抗体本身未融合的片段或变体结合相同表位。

结合于治疗性蛋白并可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体也可以它们的交叉反应性描述或说明。包含不结合治疗性蛋白的任何其它类似物、直系同源物或同源物的抗体。本发明还包含结合与治疗性蛋白具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％的序列同一性(使用本领域已知和本文所述的方法计算)的多肽的抗体。在特定实施方式，结合于治疗性蛋白并可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体与人类蛋白的鼠、大鼠和/或兔同源物和其相应表位交叉反应。本发明还包含不结合与治疗性蛋白具有少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％和少于50％的序列同一性(使用本领域已知和本文所述的方法计算)的多肽的抗体。在特定实施方式，上述交叉反应性是关于本文公开的任何单个特异性抗原性或免疫原性多肽，或2、3、4、5或更多特异性抗原性和/或免疫原性多肽的组合。在另外的实施方式，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白与特定抗体本身的片段或变体相比具有相似或大致相同的交叉反应特性。

本发明进一步包含抗体，其结合在严格杂交条件下(如本文所述的)与编码治疗性蛋白的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽。结合治疗性蛋白并可对应于本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体也可以它们对本发明多肽的结合亲和力来描述或说明。结合亲和力包含解离常数或Kd少于5×10^-2M、10^-2M、5×10^-3M、10^-3M、5×10^-4M、10^-4M的结合亲和力。其它结合亲和力包含解离常数或Kd少于5×10^-5M、10^-5M、5×10^-6M、10^-6M、5×10^-7M、10^-7M、5×10^-8M或10^-8M的结合亲和力。进一步地，结合亲和力包含解离常数或Kd少于5×10^-9M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^-13M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M或10^-15M的结合亲和力。在一些实施方式，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白对指定蛋白或表位具有的亲和力与结合治疗性蛋白的相应抗体(不与清蛋白融合)的相似，考虑了清蛋白融合蛋白(包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体)的效价和相应抗体的效价。

本发明还提供竞争性抑制抗体对治疗性蛋白表位的结合的抗体，如由本领域已知用于确定竞争性结合的任何方法例如本文所述的免疫检测确定的。在一些实施方式，抗体竞争性抑制对表位的结合的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。在其它实施方式，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白竞争性抑制第二抗体对治疗性蛋白表位的结合。在其它实施方式，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白竞争性抑制第二抗体对治疗性蛋白表位的结合的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。

结合于治疗性蛋白并可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体可作为治疗性蛋白的激动剂或拮抗剂。例如，本发明包含部分地或完全地破坏受体/配体与本发明的多肽相互作用的抗体。本发明特征为受体-特异性抗体和配体-特异性抗体。本发明还特征为受体-特异性抗体，其不防止配体结合但防止受体活化。可由本文所述的或除此之外本领域已知的技术确定受体活化(即信号转导)。例如，可由免疫沉淀、随后western印迹分析(例如，如上述的)检测受体或其底物的磷酸化(如，酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)而确定受体活化。在特定实施方式，提供抑制配体活性或受体活性是不存在抗体时活性的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％的抗体。在一些实施方式，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白与结合治疗性蛋白的抗体的未融合的片段或变体相比关于防止配体结合和/或防止受体活化方面具有相似或大致相似的特性。

本发明还特征为既防止配体结合又防止受体活化的受体-特异性抗体以及识别受体-配体复合体并不特异性地识别未结合的受体或未结合的配体的抗体。类似地，本发明包含中和抗体，其结合配体并防止配体对受体的结合，以及结合配体的抗体，从而防止受体活化但不防止配体结合受体。本发明进一步包含活化受体的抗体。这些抗体可作用为受体激动剂，即强化或活化配体-介导的受体活化的生物活性的全部或一部分，例如，通过诱导受体二聚化。可说明抗体为对包括治疗性蛋白(如公开于表1的)的具体生物活性的生物活性的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。可使用本领域已知方法制备上述抗体激动剂。见于如，PCT公布WO 96/40281；美国专利第5,811,097号；Deng等，Blood 92(6)：1981-1988(1998)；Chen等，Cancer Res.58(16)：3668-3678(1998)；Harrop等，J.Immunol.161(4)：1786-1794(1998)；Zhu等，Cancer Res.58(15)：3209-3214(1998)；Yoon等，J.Immunol.160(7)：3170-3179(1998)；Prat等，J.Cell.Sci.111(Pt2)：237-247(1998)；Pitard等，J.Immunol.Methods205(2)：177-190(1997)；Liautard等，Cytokine 9(4)：233-241(1997)；Carlson等，J.Biol.Chem.272(17)：11295-11301(1997)；Taryman等，Neuron 14(4)：755-762(1995)；Muller等，Structure 6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek等，Cytokine 8(1)：14-20(1996)(都在此以其整体通过引用并入)。在一些实施方式，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白与结合治疗性蛋白的抗体的未融合的片段或变体具有相似或大致相同的激动或拮抗特征。

结合于治疗性蛋白并可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体可用于在包含体外和体内的诊断和治疗方法中例如纯化、检测、和靶向治疗性蛋白。例如，抗体可用于免疫检测以定性地和定量地测量生物样品中治疗性蛋白的水平。见于如，Harlow等，Antibodies：A LaboratoryManual(抗体实验室手册)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版.1988)；在此以其整体通过引用并入。类似地，包括结合治疗性蛋白的抗体的至少片段或变体的清蛋白融合蛋白可用于在包含体外和体内的诊断和治疗方法中例如纯化、检测、和靶向治疗性蛋白。

结合于治疗性蛋白并可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体包含修饰过的衍生物，即由共价连接任何类型分子于抗体。例如但不限于，抗体衍生物包含已修饰过的抗体，如，由糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、连接于细胞配体或其它蛋白等。可以已知技术进行任何的多种化学修饰，包括但不限于具体化学裂解、乙酰化、甲酰化、代谢合成衣霉素等。此外，衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。也可如上所述的修饰本发明的清蛋白融合蛋白。

结合治疗性蛋白的抗体的制备方法

可由本领域已知的任何合适方法产生结合于治疗性蛋白并可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体。可由本领域熟知的各种方案制备对目标抗原的多克隆抗体。例如，可施用治疗性蛋白于各种宿主动物，包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等以诱导产生含有特异性对该抗原的多克隆抗体的血清。取决于宿主物种，各种佐剂可用于增加免疫响应，并包含但不限于，弗氏佐剂(完全和不完全的)、矿物胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽类、油性乳剂、钥孔戚血蓝素、二硝基酚、和潜在地有用的人类佐剂诸如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。这种佐剂也是本领域熟知的。

可使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组、和噬菌体展示技术或其组合。例如，可使用包含本领域已知的和教导于例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体实验室手册)，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，第2版.1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述参考文献在此以其整体通过引用并入)的杂交瘤技术制备单克隆抗体。本文所用的术语″单克隆抗体″不限于由杂交瘤技术制备的抗体。术语″单克隆抗体″指衍生自单克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，不是指制备其的方法。

使用杂交瘤技术产生和筛选具体抗体的方法是例行和本领域熟知的。在非限制性例子，可以治疗性蛋白或其片段或变体、清蛋白融合蛋白、或表达这种治疗性蛋白或其片段或变体或清蛋白融合蛋白的细胞免疫小鼠。检测到免疫应答后，如，在小鼠血清中检测到特异对该抗原的抗体，则收集小鼠脾脏并分离脾细胞。随后由熟知技术将脾细胞融合于任何合适的骨髓瘤细胞，例如可从ATCC获得的细胞系SP20的细胞。选择杂交瘤并由有限稀释克隆。随后由本领域已知方法检测杂交瘤克隆中分泌能够结合本发明的多肽的抗体的细胞。以阳性杂交瘤克隆免疫小鼠可产生一般含有高水平抗体的腹水液。

因此，本发明提供制备单克隆抗体的方法以及由该方法制备的抗体，该方法包括培养分泌抗体的杂交瘤细胞，其中，例如，该杂交瘤如下产生：融合从以本发明的抗原免疫的小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞，和随后从融合所得的杂交瘤筛选分泌能结合本发明的多肽的抗体的杂交瘤克隆。

另一种熟知的产生多克隆和单克隆的人类B细胞系的方法是使用EB病毒(EBV)转化。制备EBV-转化的B细胞系的方案是本领域通常已知的，诸如例如，列在Current Protocols in Immunology(免疫学最新实验方案)的第7.22章的方案，Coligan等编辑，1994，John Wiley & Sons，NY，其在此以其整体通过引用并入。用于转化的B细胞的来源通常是人类外周血，但用于转化的B细胞也可来自其它来源，包括但不限于，淋巴结、扁桃体、脾脏、肿瘤组织和感染组织。在EBV转化前一般将组织制备为单细胞悬浮液。此外，可采取步骤以在含有B细胞的样品中物理地除去或失活T细胞(如，以环孢霉素A处理)，因为从对抗-EBV抗体血清阳性的个体获得的T细胞可抑制EBV的B细胞永生化。

通常，以EBV接种含有人类B细胞的样品并培养3-4周。EBV的典型来源是B95-8细胞系(ATCC#VR-1492)的培养上清液。在3-4周培养期的末期一般可观察到EBV转化的生理迹象。相差显微镜下，转化的细胞可表现大、透明、毛状和趋于聚集为细胞的紧密簇。最初，EBV细胞系一般是多克隆的。然而经过长时间细胞培养后，作为选择性发展特定B细胞克隆的结果，EBV细胞系可变为单克隆或多克隆。可选地，多克隆EBV转化的细胞系可被亚克隆(如，由有限稀释培养)或与合适的融合配偶体融合并以有限稀释铺板以获得单克隆B细胞系。对EBV转化的细胞系合适的融合配偶体包含小鼠骨髓瘤细胞系(如，SP2/0、X63-Ag8.653)、杂合骨髓瘤细胞系(人类x小鼠；如，SPAM-8、SBC-H20和CB-F7)、和人类细胞系(如，GM 1500、SKO-007、RPMI 8226和KR-4)。因此本发明还提供制备针对本发明的多肽或其片段的多克隆或单克隆人类抗体的方法，包括EBV-转化人类B细胞。

可由已知技术产生识别具体表位的抗体片段。例如，可由蛋白水解裂解免疫球蛋白分子制备本发明的Fab和F(ab′)2片段，使用酶诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。

例如，还可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生结合于治疗性蛋白的抗体。在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域展示在携带编码功能抗体结构域的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。在特定实施方式，这种噬菌体可用于展示从所有组成成分(repertoire)或组合抗体文库(如，人类或鼠)表达的抗原结合结构域。可以抗原选择或鉴定表达结合所关注的抗原的抗原结合结构域的噬菌体，如，使用标记的抗原或固相表面或微珠结合或捕获的抗原。用于这些方法的噬菌体通常是丝状噬菌体，包含从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，具有重组融合于噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域。可用于制备结合于治疗性蛋白的抗体的噬菌体展示方法的例子包含公开于以下的展示方法：Brinkman等，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等，Gene1879-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology(免疫学进展)57：191-280(1994)；PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公布WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利第5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108号；其各自在此以其整体通过引用并入。

如上述参考文献中所述的，选择噬菌体后，可从噬菌体分离抗体编码区并用于产生包含人类抗体的全长抗体，或任何其它期望的抗原结合片段，并在任何期望的宿主表达，包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，如以下详述的。例如，重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术还可使用本领域已知的方法采用，诸如公开于以下的方法：PCT公布WO92/22324；Mullinax等，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；和Sawai等，AJRI34：26-34(1995)；和Better等，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献在此以其整体通过引用并入)。

可用于产生单链Fv和抗体的技术的例子包含描述于以下的技术：美国专利第4,946,778和5,258,498号；Huston等，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等，PNAS 90：7995-7999(1993)；和Skerra等，Science 240：1038-1040(1988)。对一些包含在人类体内应用抗体和体外检测分析的应用可使用嵌合、人源化或人类抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，诸如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。见于如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等，(1989)J.Immunol.Methods 125：191-202；美国专利第5,807,715；4,816,567；和4,816397号，其在此以其整体通过引用并入。人源化抗体是结合期望的抗原的来自非人类物种抗体的抗体分子，其具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区。通常，人类框架区中的框架残基将被CDR供体抗体的相应残基取代，以改变例如，改进抗原结合。这些框架取代由本领域熟知方法鉴定，如，由模拟(modeling)CDR与框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合重要的框架残基并比较序列以鉴定在特定位置不常见的框架残基。(见于如，Queen等，美国专利第5,585,089号；Riechmann等，Nature 332：323(1988)，其在此以其整体通过引用并入。)可使用本领域已知多种技术人源化抗体，包含例如，CDR-移植(EP 239,400；PCT公布WO 91/09967；美国专利第5,225,539；5,530,101和5,585,089号)、胶合(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，ProteinEngineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91：969-973(1994))和链改组(美国专利第5,565,332号)。

完全人类抗体对治疗性治疗人类患者是特别期望的。由本领域已知多种方法可产生人类抗体，包含如上所述的噬菌体展示方法，使用从人类免疫球蛋白序列衍生的抗体文库。也见于美国专利第4,444,887和4,716,111号；和PCT公布WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；其各自在此以其整体通过引用并入。

还可使用不能够表达功能内源免疫球蛋白但可表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备人类抗体。例如，人类重和轻链免疫球蛋白基因复合体可随机地引入或由同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除了人类重和轻链基因还可将人类可变区、恒定区和多变区引入小鼠胚胎干细胞。由同源重组引入人类免疫球蛋白位点可分别或同时地致使小鼠重和轻链免疫球蛋白基因无功能。尤其是，纯合的缺失JH区阻止内源抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并微注射入胚泡以产生嵌合小鼠。随后繁殖嵌合小鼠以产生表达人类抗体的纯合的后代。以所选抗原如，本发明的多肽的全部或部分以正常方式免疫转基因小鼠。使用常规杂交瘤技术可从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠拥有的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并随后经历类转换和体细胞突变。因此使用这种技术可能产生治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。产生人类抗体的这种技术的概述见于Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。产生人类抗体和人类单克隆抗体的这种技术和产生这种抗体的方案的详细讨论见于如，PCT公布WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利第0598877号；美国专利第5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181；和6,114,598号，其在此以其整体通过引用并入。此外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)等公司可使用相似于如上所述的技术的技术致力于提供针对所选抗原的人类抗体。

可使用称为″导向选择″的技术产生识别所选表位的完全人类抗体。该方法中所选的非人类单克隆抗体，如，小鼠抗体，用于指导选择识别同一表位完全人类抗体。(Jespers等，Bio/technology 12：899-903(1988))。

编码抗体的多核苷酸

本发明进一步提供包括编码抗体和其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还包括在如上述定义的严格条件下或可选地在较低严格的杂交条件下与编码例如特异性结合治疗性蛋白的抗体，和在进一步的方面，结合具有如公开于表2的″SEQ ID NO：Z″列的″治疗性蛋白：X″的氨基酸序列的多肽的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

可由本领域已知任何方法获得多核苷酸，并确定该多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，编码该抗体的多核苷酸可从化学合成的寡核苷酸组装(如，Kutmeier等，BioTechniques 17：242(1994)中所述的)，简单地说包括合成含有编码该抗体的序列的部分的重叠的寡核苷酸、退火并连接这些寡核苷酸、随后由PCR扩增连接的寡核苷酸。

可选地，可从合适的来源的核酸产生编码抗体的多核苷酸。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可得，但该抗体分子的序列是已知的，则可化学合成或通过使用可杂交于该序列3′和5′末端的合成引物PCR扩增或通过使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针克隆从合适的来源(如，从表达抗体的任何组织或细胞诸如选择以表达抗体的杂交瘤细胞产生的抗体cDNA文库或cDNA文库或分离的核酸，例如，聚腺苷酸+RNA)获得编码该免疫球蛋白的核酸，以鉴定，如，来自编码该抗体的cDNA文库的cDNA克隆。随后由PCR产生的扩增的核酸可使用本领域熟知的任何方法克隆入可复制克隆载体(见于实施例65)。

确定抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列后，可使用本领域熟知用于操纵核苷酸序列的方法操纵抗体的核苷酸序列，如重组DNA技术、位点定向诱变、PCR等(见于例如，以下所述的技术：Sambrook等，1990，MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等编辑，1998，CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，John Wiley & Sons，NY，其在此以其整体通过引用并入)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或添加。

在特定实施方式，可检查重和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以由本领域中熟知的方法鉴定互补决定区(CDR)的序列，如由比较其它重和轻链可变区的已知氨基酸序列以确定序列高可变的区。使用例行重组DNA技术，一个或多个CDR可插入框架区，如，如上所述地插入人类框架区以人源化非人类抗体。框架区可为天然产生的或共有框架区、和例如人类框架区(见例如，Chothia等，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)的人类框架区列表)。一方面，组合框架区和CDR产生的多核苷酸编码特异性结合本发明的多肽的抗体。另一方面，如上所述，可在框架区内产生一个或多个氨基酸取代，且例如，该氨基酸取代改善抗体对其抗原的结合。此外，这种方法可用于产生一个或多个参与链内二硫键的可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。对多核苷酸的其它改变包括在本发明中并是在本领域技术人员能力内的。

此外，可使用由剪接具有合适的抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和具有合适的生物活性的人类抗体分子的基因开发用于产生″嵌合抗体″的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger等，Nature312：604-608(1984)；Takeda等，Nature 314：452-454(1985))。如上所述，嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物物种的分子，诸如具有衍生自鼠mAb的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的分子，如，人源化抗体。

可选地，可修改描述用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号；Bird，Science 242：423-42(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；和Ward等，Nature 334：544-54(1989))以产生单链抗体。由氨基酸桥连接Fv区的重和轻链片段形成单链多肽而形成单链抗体。也可使用在大肠杆菌中组装功能Fv片段的技术(Skerra等，Science 242：1038-1041(1988))。

重组表达抗体

重组表达抗体、或其片段、衍生物或类似物(如，抗体的重或轻链或单链抗体)，要求构建含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。获得编码本发明的抗体分子或抗体的重或轻链或其部分(例如含有重或轻链可变结构域)的多核苷酸后，可使用本领域熟知技术由重组DNA技术制备产生抗体分子的载体。因此本文描述了由表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸而制备蛋白的方法。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包含，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此本发明提供了包括编码本发明的抗体分子或其重或轻链或重或轻链可变结构域的核苷酸序列可操作地连接于启动子的可复制载体。这种载体可包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见于如，PCT公布WO 86/05807；PCT公布WO 89/01036；和美国专利第5,122,464号)且抗体的可变结构域可克隆入这种载体以表达完整重或轻链。

由常规技术将表达载体转移到宿主细胞并随后由常规技术培养转染的细胞以产生抗体。因此本发明包含含有编码本发明的抗体或其重或轻链或单链抗体的多核苷酸可操作地连接于异源启动子的宿主细胞。在一些表达双链抗体的实施方式，编码重和轻链的载体可在宿主细胞中共表达以表达完整免疫球蛋白分子，如下详述。

多种宿主-表达载体系统可用于表达本发明的抗体分子。这种宿主-表达系统表示可制备和随后纯化所关注的编码序列的运载体，但还表示当以合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包含但不限于微生物，诸如以含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物(如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；以含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如，酿酒酵母、毕赤酵母)；感染含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；感染重组病毒表达载体(如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或以含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含含有衍生自哺乳动物细胞基因组(如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(如，COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。一方面，细菌细胞诸如大肠杆菌，和在进一步的方面真核细胞，尤其是用于表达完全重组抗体分子的细胞，用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)组合载体诸如人类巨细胞病毒的主要中间早期(major intermediate early)基因启动子元件是对抗体的有效表达系统(Foecking等，Gene 45：101(1986)；Cockett等，Bio/Technology 8：2(1990))。

在细菌系统中，可根据被表达的抗体分子计划的应用而有利地选择大量表达载体。例如，当待制备大量这种蛋白用于制备抗体分子的药物组合物时，可期望指引表达高水平易于纯化的融合蛋白产物的载体。这种载体包含但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2：1791(1983))，其中抗体编码序列可与lac Z编码区一起单独地框内连接入载体从而制备融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；VanHeeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；及类似物。pGEX载体也可用于表达外源多肽为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白可溶并可易于从裂解的细胞由吸附和结合于基质谷胱甘肽-琼脂糖微珠、随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而纯化。设计pGEX载体以包含凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点从而可从GST部分释放克隆的靶基因产物。

在昆虫系统中，苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)核多面体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒生长于贪食夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。抗体编码序列可单独克隆入病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可使用大量基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况，所关注的抗体编码序列可连接于腺病毒转录/翻译控制复合体，如，晚期启动子和三联前导序列。随后该嵌合基因可由体外或体内重组插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区(如，区E1或E3)将产生可存活和能够在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒。(如，见于Logan &Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359(1984)。对有效翻译插入的抗体编码序列也可要求特异性起始信号。这些信号包含ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列处于同一阅读框以确保翻译完整插入序列。这些外来翻译控制信号和起始密码子可为多种来源的，天然和合成的。可由包括合适的转录增强子元件、转录终止子等而增强表达效率(见于Bittner等，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。

此外，可选择以期望的特异性方式调节插入序列的表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞菌株。这种修饰(如，糖基化)和加工(如，裂解)蛋白产物对蛋白功能可为重要的。不同宿主细胞对翻译后加工和修饰蛋白和基因产物具有特有和特异性的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此目的，可使用具有正确加工最初转录子，糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包含但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38，且尤其是，乳腺癌细胞系诸如例如，BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，和正常乳腺细胞系诸如例如，CRL7030和Hs578Bst。

在一个实施方式，为了长期高产率产生重组蛋白，可稳定表达蛋白。例如，可改造稳定表达抗体分子的细胞系。不同于使用含有病毒复制起点的表达载体，可以由合适的表达控制元件(如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标记转化宿主细胞。引入外源DNA后，可允许改造细胞在富集培养基上生长1-2天，随后转到选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予抗性以选择并允许细胞稳定整合质粒进入其染色体和生长形成焦点(foci)，其反过来可被克隆和扩增成细胞系。该方法可有利地用于改造表达抗体分子的细胞系。这种改造的细胞系可尤其有用于筛选和评价直接或间接地与抗体分子相互作用的化合物。

可使用大量选择系统，包含但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 22：817(1980))基因，分别可用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。同样，抗代谢物抗性可用作对以下基因的选择基础：dhfr，赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527(1981))；gpt，赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，赋予对氨基糖苷G-418的抗性(ClinicalPharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，1993，TIB TECH 11(5)：155-215(1993))；和hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30：147(1984))。可例行地施用重组DNA技术领域通常已知的方法来选择期望的重组克隆，且这种方法描述于例如，Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual(基因转移和表达，实验室方案)，Stockton Press，NY(1990)；和Dracopoli等(编辑)，Current Protocols in Human Genetics(最新人类遗传学实验指南)的12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其在此以其整体通过引用并入。

可由载体扩增增加抗体分子的表达水平(综述见于Bebbington和Hentschel.The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned gene in mammalian cells in DNA cloning(使用基于基因扩增的载体用于以DNA克隆在哺乳动物细胞中表达克隆的基因)，第3卷.(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平增加将会增加标记基因的拷贝数。因为扩增的区与抗体基因相关，抗体的产生也将增加(Crouse等，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。

使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR为选择标记的载体可分别在存在药物甲硫氨酸砜亚胺或氨甲喋呤时扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优势是可利用谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(如，鼠骨髓瘤细胞系，NSO)。谷氨酰胺合酶表达系统还可在谷氨酰胺合酶表达细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用，通过提供其它抑制剂以防止内源基因发挥功能。谷氨酰胺合酶表达系统和其组分详述于PCT公布：WO87/04462；WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404和WO91/06657，其在此以其整体通过引用并入。此外，根据本发明可使用的谷氨酰胺合酶表达载体是从包含例如Lonza Biologies，Inc.(Portsmouth，NH)的供应商市售可获得的。使用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达和产生单克隆抗体描述于Bebbington等，Bio/Technology 10：169(1992)和Biblia和Robinson Biotechnol.Prog.11：1(1995)，其在此以其整体通过引用并入。

宿主细胞可以本发明的两个表达载体共转染，第一载体编码重链衍生多肽，第二载体编码轻链衍生多肽。这两个载体可含有相同选择标记，使得能均等地表达重和轻链多肽。可选地，可使用编码并能够表达重和轻链多肽的单个载体。在这种情况，轻链应置于重链之前以避免过量的有毒游离重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。重和轻链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。

由动物、化学合成或重组表达制备本发明的抗体分子后，可由本领域已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法纯化该抗体分子，例如，由色谱(如，离子交换、亲和力、尤其是由蛋白A后对特异性抗原的亲和力、和筛分柱色谱(sizing column chromatography))、离心、溶解度差异、或由用于纯化蛋白的任何其它标准技术。此外，结合于治疗性蛋白并可对应于本发明的清蛋白融合蛋白或其片段的治疗性蛋白部分的抗体可与本文所述的或除此之外本领域已知的异源多肽序列融合以便于纯化。

抗体的修饰

结合治疗性蛋白或片段或变体的抗体可与标记序列诸如肽融合以便于纯化。在其它实施方式中，标记氨基酸序列是六-组氨酸肽，诸如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的标签，以及其它，其中许多是市售可得的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)中所述的，例如，六-组氨酸提供对融合蛋白的方便纯化。用于纯化的其它肽标签包括但不限于血凝素标签(也称为″HA标签″)，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell 37：767(1984))和″旗(flag)″标签。

本发明进一步包括缀合于诊断或治疗剂的抗体或其片段。可在诊断上使用抗体以例如，监控肿瘤的发展或进展，作为临床检测方案的部分以例如，确定指定治疗方案的效力。偶联抗体于可检测的物质可有助于检测。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层成像的正电子发射金属、和非放射性顺磁性金属离子。可检测的物质可直接偶联或缀合于抗体(或其片段)，或使用本领域已知技术由中间物(诸如例如，本领域已知的接头)间接地偶联或缀合于抗体(或其片段)。见于例如，美国专利第4,741,900号的金属离子，其可根据本发明缀合于抗体以用作诊断剂。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白；合适的放射性材料的例子包括125I、131I、111In或99Tc。可检测的物质的其它例子描述于本文的别处。

进一步地，本发明的抗体可缀合于治疗性部分诸如细胞毒素，如，细胞抑制剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子，如，α-发射体诸如例如，213Bi。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害的剂。例子包括帕利他塞(paclitaxol)、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素和其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢剂(如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(如，氮芥、硫替哌(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、和顺二氯二胺铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(如，更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(如，长春新碱和长春碱)。

本发明的缀合物可用于修饰指定生物学应答，所述治疗剂或药物部分不解释为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可为具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如，毒素诸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌属外毒素或白喉毒素；蛋白诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂，如TNF-α、TNF-β、AIM I(见于国际公布第WO 97/33899号)、AIM II(见于国际公布第WO 97/34911号)、Fas配体(Takahashi等，Int.Immunol，6：1567-1574(1994))、VEGI(见于国际公布第WO 99/23105号)、血栓形成剂或抗-血管发生剂，如血管他丁或内皮他丁；或生物学应答修饰剂诸如例如，淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)、或其它生长因子。

抗体也可附接至固相支持体，这对目标抗原的免疫测定法或纯化尤其有用。这种固相支持体包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

将这种治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的。见于例如，Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy(在癌症治疗中用于免疫靶向药物的单克隆抗体)″，在Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)中，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery(用于递送药物的抗体)″，在Controlled Drug Delivery(受控的药物递送)(第2版)中，Robinson等(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibodies Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review(癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体的综述)″，在Monoclonal Antibodies′84：BiologicalAnd Clinical Applications(单克隆抗体′84：生物学和临床应用)中，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapy Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy(放射标记的抗体在癌症治疗中的治疗用途的分析、结果和未来展望)″，在Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和治疗的单克隆抗体)中，Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性特征)″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。

可选地，抗体可缀合于第二抗体以形成抗体杂合缀合物(heteroconjugate)，如由Segal在美国专利第4,676,980号中所述的，其在此以其整体通过引用并入。

无论是否带有缀合于抗体的治疗性部分，单独或联合细胞毒性因子和/或细胞因子施用的抗体可用作治疗剂。

抗体-清蛋白融合

结合于治疗性蛋白并可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体包括但不限于，结合公开于表1的″治疗性蛋白X″列的治疗性蛋白或其片段或变体的抗体。

在特定实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含VH结构域或可选地由VH结构域组成。在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含一个、两个或三个VHCDR或可选地由其组成。在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含VHCDR1或可选地由VH CDR1组成。在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含VH CDR2或可选地由VH CDR2组成。在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含VH CDR3或可选地由VH CDR3组成。

在特定实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含VL结构域或可选地由VL结构域组成。在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含一个、两个或三个VLCDR或可选地由其组成。在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含VLCDR1或可选地由VL CDR1组成。在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含VL CDR2或可选地由VL CDR2组成。在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含VL CDR3或可选地由VL CDR3组成。

在其它实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个VH和/或VL CDR或可选地由其组成。

在一些实施方式中，免疫特异性结合治疗性蛋白并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体的片段或变体包含scFv或可选地由scFv组成，所述scFv包含治疗性抗体的VH结构域，其通过诸如(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO：4)等的肽接头连接于治疗性抗体的VL结构域。

免疫分型

本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白(或其片段或变体)的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可用于细胞系和生物样品的免疫分型。本发明的治疗性蛋白可用作细胞-特异性标记，或更具体地用作在特定细胞类型分化和/或成熟的不同阶段差异表达的细胞标记。针对具体表位或表位组合的单克隆抗体(或包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白)将允许筛选表达该标记的细胞群体。可采用多种技术使用单克隆抗体(或包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白)来筛选表达该标记的细胞群体，并包括使用抗体包被的磁珠的磁性分离、用附接于固相基质(即板)的抗体的″淘选″和流式细胞术(见于如，美国专利第5,985,660号；和Morrison等，Cell，96：137-49(1999))。

这些技术允许筛选特定细胞群体，诸如见于血液学恶性肿瘤(即在急性白血病患者中的轻微后遗症(MRD))和移植中的″非自身″细胞以预防移植物抗宿主病(GVHD)。可选地，这些技术允许筛选能够进行增殖和/或分化的造血干细胞和祖细胞，如可在人类脐带血中发现。

表征结合治疗性蛋白的抗体和包含结合治疗性蛋白的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白

本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白(或其片段或变体)的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可以多种方式表征。具体而言，使用本文所述的技术或按常规修改的本领域已知的技术可测定包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白特异性结合由如下抗体特异性地结合的相同抗原的能力，所述抗体结合与结合清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的抗体对应的治疗性蛋白。

对本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白(或其片段或变体)的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白(特异性地)结合特定蛋白质或表位的能力的测定可在溶液中进行(如，Houghten，Bio/Techniques 13：412-421(1992))、在珠上进行(如，Lam，Nature 354：82-84(1991))、在芯片上进行(如，Fodor，Nature 364：555-556(1993))、在细菌上进行(如，美国专利第5,223,409号)、在孢子上进行(如，专利第5,571,698；5,403,484；和5,223,409号)、在质粒上进行(如，Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869(1992))或在噬菌体上进行(如，Scott和Smith，Science 249：386-390(1990)；Devlin，Science 249：404-406(1990)；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382(1990)；和Felici，J.Mol.Biol.222：301-310(1991))(这些参考文献各自在此以其整体通过引用并入)。还可使用或按常规修改本文所述的技术或除此之外本领域已知的技术来测定本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白(或其片段或变体)的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白对特定蛋白质或表位的特异性和亲和力。

可由本领域已知任何方法测定本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白与其它抗原(如，与由如下抗体特异性地结合的分子具有序列/结构保守性的分子，所述抗体结合对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的治疗性蛋白(或其片段或变体))的交叉反应性。

可用于分析(免疫特异性)结合和交叉反应性的免疫测定法包括但不限于，使用诸如western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、″三明治″免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的竞争性和非-竞争性测定系统，仅举几个例子。这样的测定法是常规的和本领域熟知的(见于如，Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York，在此以其整体通过引用并入)。示例性免疫测定法简要描述于下文(但不意为限制)。

免疫沉淀方案一般包括在裂解缓冲液诸如加有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠、在pH 7.2、1％Trasylol)中裂解细胞群体，向细胞裂解物加入本发明的抗体或包含结合治疗性蛋白(或其片段或变体)的抗体的至少一个片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白，在40℃温育一段时间(如，1至4小时)，向细胞裂解物加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠(或在包含治疗性抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白的情况下，加入用适当抗独特型抗体或抗清蛋白抗体包被的珠)，在40℃温育约一小时或更长，在裂解缓冲液中清洗珠子并在SDS/样品缓冲液中重悬珠子。可由如western印迹分析评估本发明的抗体或清蛋白融合蛋白免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员将知道可被修改以增加抗体或清蛋白融合蛋白对抗原的结合并减少背景的参数(如，以琼脂糖珠预澄清细胞裂解物)。关于免疫沉淀方案的进一步讨论见于，如，Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，第1卷的10.16.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York。

Western印迹分析一般包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(如，8％-20％SDS-PAGE，其取决于抗原分子量)中对蛋白质样品进行电泳，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到诸如硝酸纤维素、PVD或尼龙等膜上，在封闭溶液(如，含3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭膜，在清洗缓冲液(如，PBS-Tween 20)中清洗膜，将本发明的抗体或清蛋白融合蛋白(稀释于封闭缓冲液)施加于膜上，在清洗缓冲液中清洗膜，施加稀释于封闭缓冲液中的缀合于酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(如，³²P或¹²⁵I)的第二抗体(其识别清蛋白融合蛋白，如抗-人血清清蛋白抗体)，在清洗缓冲液中清洗膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员将知道可被修改以提高检测的信号并减少背景噪音的参数。关于western印迹方案的进一步讨论见于，如，Ausubel等编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，第1卷的10.8.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York。

ELISA包括制备抗原，以抗原包被96-孔微量滴定板的孔，洗去未结合到孔上的抗原，向孔加入缀合于可检测的化合物诸如酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的本发明的抗体或清蛋白融合蛋白(包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体)并温育一段时间，洗去未结合的或非-特异性地结合的清蛋白融合蛋白，并检测特异性地结合包被孔的抗原的抗体或清蛋白融合蛋白的存在。ELISA中抗体或清蛋白融合蛋白不必缀合于可检测的化合物；相反，可向孔加入缀合于可检测的化合物的第二抗体(其识别抗体或清蛋白融合蛋白)。进一步地，代替以抗原包被孔，可以将抗体或清蛋白融合蛋白包被到孔上。在这种情形下，可检测的分子可为缀合于可检测的化合物诸如酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗原。本领域技术人员将知道可被修改以提高检测的信号的参数以及本领域已知的ELISA的其它变型。关于ELISA的进一步讨论见于如，Ausubel等编辑，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验指南)，第1卷的11.2.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York。

可由竞争性结合测定法确定清蛋白融合蛋白对蛋白、抗原或表位的结合亲和力和抗体-或清蛋白融合蛋白-蛋白质/抗原/表位相互作用的解离率(off-rate)。竞争性结合测定法的一个例子是放射免疫测定法，包括在渐增量的未标记抗原存在下将标记的抗原(如，³H或¹²⁵I)与本发明的抗体或清蛋白融合蛋白一起温育，并检测与标记的抗原结合的抗体。可从Scatchard曲线分析的数据确定抗体或清蛋白融合蛋白对特定蛋白质、抗原或表位的亲和力和结合解离率。与抗体或清蛋白融合蛋白结合同一蛋白质、抗原或表位的第二蛋白质的竞争也可使用放射免疫检测确定。在这种情形下，在渐增量的与本发明的清蛋白融合蛋白结合同一蛋白质、抗原或表位的未标记的第二蛋白质存在下将蛋白质、抗原或表位与缀合于标记的化合物(如，³H或¹²⁵I)的本发明的抗体或清蛋白融合蛋白一起温育。

在一个实施方式中，将BIAcore动力学分析用于确定本发明的抗体或清蛋白融合蛋白对蛋白质、抗原或表位的结合和解离率。BIAcore动力学分析包括分析抗体、清蛋白融合蛋白或特定多肽、抗原或表位与芯片的结合和解离，其中芯片的表面上分别具有固定化的特定多肽、抗原或表位、抗体或清蛋白融合蛋白。

治疗用途

本发明进一步涉及基于抗体的疗法，其包括将本发明的抗体或本发明包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白(或其组合物，如，药物组合物)施用于动物，例如，哺乳动物或人类患者以治疗一种或多种公开的疾病、疾患或病症。本发明的治疗性化合物包括但不限于，本发明的抗体(包括其片段、类似物和衍生物，如本文所述的)、编码本发明的抗体(包括其片段、类似物和衍生物和如本文所述的抗-独特型抗体)的核酸、本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白、和编码这种清蛋白融合蛋白的核酸。本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可用于治疗、抑制或预防与治疗性蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病、疾患或病症，包括但不限于本文所述的任何一种或多种疾病、疾患或病症。与治疗性蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病、疾患或病症的治疗和/或预防包括但不限于缓解与这些疾病、疾患或病症相关的症状。本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可以在本领域已知或如本文所述的药学可接受的组合物中提供。

在特定实施方式中，本发明涉及基于抗体的疗法，其包括将本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白施用于动物，例如，哺乳动物或人类患者以治疗一种或多种疾病、疾患或病症，包含但不限于：神经疾患、免疫系统疾患、肌肉疾患、生殖疾患、胃肠疾患、肺疾患、心血管疾患、肾疾患、增殖疾患、和/或癌性疾病和病症、和/或本文在别处描述的。本发明的治疗性化合物包括但不限于本发明的抗体(如，针对哺乳动物细胞的细胞表面上表达的全长蛋白的抗体；针对治疗性蛋白的表位的抗体和编码本发明的抗体(包括其片段、类似物和衍生物和本文所述的抗-独特型抗体)的核酸。本发明的抗体可用于治疗、抑制或预防与治疗性蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病、疾患或病症，包括但不限于，本文所述的任何一种或多种疾病、疾患或病症。与治疗性蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病、疾患或病症的治疗和/或预防包括但不限于，缓解与这些疾病、疾患或病症相关的症状。本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可以在本领域已知或如本文所述的药学可接受的组合物中提供。

其中可以在治疗上使用本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白的方式的概要包括在体内局部或系统地结合治疗性蛋白或通过抗体的直接细胞毒性，如由补体(CDC)或由效应细胞(ADCC)介导的。这些方法中的一些在以下更详细地描述。利用本发明提供的教导，本领域普通技术人员将会知道为了诊断、监控或治疗目的如何使用本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白而不需要过度实验。

本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可有利地联合其它单克隆或嵌合抗体或淋巴因子或造血生长因子(诸如，如，IL-2、IL-3和IL-7)一起使用，例如，用于增加与抗体相互作用的效应细胞的数目或活性。

本发明的抗体或本发明的包含结合治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可单独施用或联合其它类型治疗(如，放疗、化疗、激素治疗、免疫治疗和抗肿瘤剂)一起施用。通常，可施用与患者属于相同物种的物种起源或物种反应性(在抗体的情况下)的产物。因此在一个实施方式中，将人抗体、片段衍生物、类似物或核酸施用于人患者用于治疗或预防。

在一个实施方式中，将针对治疗性蛋白的高亲和力的和/或有效在体内抑制和/或中和的抗体、其片段或区(或这种抗体的清蛋白融合蛋白相关物)用于针对本发明多核苷酸或多肽(包括其片段)的免疫测定法和与本发明多核苷酸或多肽(包括其片段)有关的疾患的治疗。这样的抗体、片段或区可具有对本发明的多核苷酸或多肽(包括其片段)的亲和力。结合亲和力包括解离常数或Kd少于5×10^-2M、10^-2M、5×10^-3M、10^-3M、5×10^-4M、10^-4M的结合亲和力。其它结合亲和力包括解离常数或Kd少于5×10^-5M、10^-5M、5×10^-6M、10^-6M、5×10^-7M、10^-7M、5×10^-8M或10^-8M的结合亲和力。其它结合亲和力还包括解离常数或Kd少于5×10^-9M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^-13M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M或10^-15M的结合亲和力。

基因治疗

在特定实施方式中，通过基因治疗的方式，施用包含编码结合治疗蛋白的抗体或包含结合治疗蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白的序列的核酸来治疗、抑制或预防与治疗蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病或疾患。基因治疗指向受治疗者施用表达的或可表达的核酸而进行的治疗。在本发明的这个实施方式中，该核酸产生其编码的介导治疗作用的蛋白质。

本领域中可得的任何用于基因治疗的方法可根据本发明使用。示例性方法更详细地描述于本申请别处。

证实治疗或预防活性

在用于人类之前，可体外并随后体内测试本发明的化合物或药物组合物期望的治疗或预防活性。例如，证明化合物或药物组合物的治疗或预防用途的体外测定法包括，化合物对细胞系或患者组织样品的作用。可使用本领域技术人员已知的技术确定化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的作用，包括但不限于，玫瑰花结形成测定法和细胞溶解测定法。根据本发明，可用于确定是否表明施用具体化合物的体外测定法包括体外细胞培养测定法，其中患者组织样品在培养物中生长，并暴露于化合物或以其它方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的作用。

治疗性/预防性的施用和组合物

本发明提供通过向受治疗者施用有效量的本发明的化合物或药物组合物，如清蛋白融合蛋白或其组合物(如，药物组合物)而治疗、抑制和预防的方法。在一个实施方式中，该化合物是基本上纯化的(如，基本不含限制其作用或产生不期望的副作用的物质)。该受治疗者可为动物，包含但不限于动物诸如牛、猪、马、鸡、猫、犬等，和在一个实施方式中是哺乳动物，和在另一实施方式中是人。

当化合物包含核酸或免疫球蛋白时可采用的制剂和施用方法是如上所述的；其它合适的制剂和施用途径可选自本文下述的那些。

各种递送系统是已知的并可用于施用本发明的化合物，如，封装在脂质体中、微颗粒、微胶囊内、能够表达化合物的重组细胞、受体-介导的胞吞作用(见于如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、构建作为逆转录病毒或其它载体的部分的核酸等。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可由任何方便的途径施用化合物或组合物，例如通过输注或快速浓注，通过经上皮或粘膜皮肤衬里(如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜，等)吸收并可与其它生物活性剂一起施用。施用可为系统的或局部的。此外，可能期望由任何合适的途径将本发明的药物化合物或组合物引入到中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；通过脑室内导管可便于脑室内注射，例如，连接于贮器诸如Ommaya贮器的脑室内导管。还可采用肺施用，如，通过使用吸入器或喷雾器和带有雾化剂的制剂。

在特定实施方式中，可能期望向需要治疗的部位局部施用本发明的药物化合物或组合物；这可以如下达到，例如但不限于，通过在手术过程中的局部输注、表面施用如结合手术后的创伤敷料、由注射、由导管方式、由栓剂方式、或由植入物方式，所述植入物为多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜，诸如sialastic膜或纤维。在一个实施方式中，当施用包含本发明的抗体的蛋白质时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。

在另一实施方式中，可以在小泡(vesicle)中、特别是脂质体中递送化合物或组合物(见于Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer(感染性疾病和癌症治疗中的脂质体)，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，New York，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同前，第317-327页；一般见于同前)。

在另一实施方式中，可以在控释系统中递送化合物或组合物。在一个实施方式中，可使用泵(见于上述Langer；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一实施方式中，可使用聚合材料(见于MedicalApplications of Controlled Release(控释的医学应用)，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，DrugProduct Design And Performance(控制的药物生物利用度、药物产物设计和表现)，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；还见于Levy等，Science228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。在另一实施方式中，可将控释系统置于治疗靶如脑的附近，从而仅需要系统剂量的一部分(见于如，Goodson，在上述MedicalApplications of Controlled Release(控释的医学应用)，第2卷，pp.115-138(1984))。

其它控释系统讨论于Langer的综述(Science 249：1527-1533(1990))。

在本发明的化合物是编码蛋白质的核酸的特定实施方式中，可体内施用核酸以促进其编码蛋白质的表达，通过将其构建为合适的核酸表达载体的部分并施用该载体从而使其变为细胞内的，如，通过使用逆转录病毒载体(见于美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射，或通过微颗粒轰击(如基因枪；Biolistic，Dupont)，或以脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过连接至已知进入细胞核的同源异型框类肽来施用它(见于如，Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868(1991))等。可选地，可由同源重组将核酸引入细胞内并整合入宿主细胞DNA以表达。

本发明还提供药物组合物，如，包含清蛋白融合蛋白、由清蛋白融合蛋白组成、或基本上由清蛋白融合蛋白组成的药物组合物。这样的组合物包含治疗有效量的化合物(如，清蛋白融合蛋白)，和药学可接受的载体。在特定实施方式中，术语″药学可接受的″指联邦政府或州政府的管理部门批准的或列在美国药典或其它公认药典中用于动物和更具体地用于人类的。术语″载体″指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物(vehicle)。这样的药物载体可为无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油及类似物。在一个实施方式中，当静脉内施用药物组合物时水是载体。还可采用盐水溶液和含水的右旋糖和甘油溶液为液态载体，尤其是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及类似物。如果期望，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放剂型等形式。组合物可以用传统粘合剂和载体诸如甘油三酸酯配制为栓剂。口服剂型可包含标准载体诸如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的例子描述于E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷氏药学原理)″。这样的组合物将含有治疗有效量的化合物，例如，以纯化形式，与合适的量的载体一起以提供适合施用于患者的形式。剂型应适应施用的方式。

在一个实施方式中，将组合物根据例行方案配制为适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，组合物也可包含增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因以缓解注射部位的疼痛。通常，各成分单独提供或混合为单位剂量形式，例如，作为在密封容器中的干燥冻干粉末或无水浓缩物，密封容器诸如指示活性剂的量的安瓿或药包(sachette)。当输注施用组合物时，可以用含有无菌药品级水或盐水的输注瓶配药。当注射施用组合物时，可提供一安瓿注射用无菌水或盐水从而可在施用前混合各成分。

本发明的化合物可配制为中性或盐形式。药学可接受的盐包括以阴离子形成的盐，诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，和以阳离子形成的盐，诸如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

有效治疗、抑制和预防与治疗蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病或疾患的本发明的化合物的量可由标准临床技术确定。此外，体外测定法可任选用于帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中采取的准确剂量还取决于施用途径、和疾病或疾患的严重度，并应根据开业医师的判断和各患者的情况确定。可从衍生自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线外推有效剂量。

对于抗体，施用于患者的剂量通常是0.1mg/kg至100mg/kg患者体重。在一个实施方式中，施用于患者的剂量是0.1mg/kg至20mg/kg患者体重。在另一实施方式中，剂量是1mg/kg至10mg/kg患者体重。通常，由于对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内比来自其它物种的抗体具有更长的半衰期。因此较低剂量的人抗体和较不频繁的施用常常是可能的。进一步地，可通过修饰诸如例如脂质化增加抗体的摄取和组织穿透(如，进入脑)而减少施用本发明的抗体的剂量和频率。

诊断和成像

结合治疗蛋白(或其片段或变体)的标记的抗体和其衍生物和类似物(包括包含结合治疗蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白)可用于诊断目的以检测、诊断或监控与治疗蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病、疾患和/或病症。本发明提供对治疗蛋白的异常表达的检测，包括(a)使用对目标多肽特异性的一种或多种抗体测定治疗蛋白在个体的细胞或体液中的表达和(b)将基因表达水平与标准基因表达水平比较，从而测得的治疗蛋白的表达水平与标准表达水平相比的增加或减少表示异常表达。

本发明提供一种用于诊断疾患的诊断性测定法，包括(a)使用对治疗蛋白特异性的一种或多种抗体或包含对治疗蛋白特异性的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白来测定治疗蛋白在个体的细胞或体液中的表达和(b)将基因表达水平与标准基因表达水平比较，从而测得的治疗蛋白基因的表达水平与标准表达水平相比的增加或减少表示特定疾患。对于癌症，个体的生物活检组织中存在相对高量的转录物可指示发展疾病的易患病体质，或可提供在实际临床症状出现之前检测疾病的手段。这种类型的更可靠的诊断可允许健康专家更早地采用预防性措施或主动性治疗从而防止癌症的发展或进一步进展。

本发明的抗体或包含对治疗蛋白特异性的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可用于使用对本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法测定生物样品中的蛋白质水平(如，见于Jalkanen等，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen等，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。其它可用于检测蛋白质基因表达的基于抗体的方法包括免疫测定法，诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的并包括酶标记，诸如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)、和锝(99Tc)；发光标记诸如鲁米诺；和荧光标记诸如荧光素和罗丹明、和生物素。

本发明的一个方面(facet)是检测和诊断动物例如，哺乳动物或人中与治疗蛋白的异常表达相关的疾病或疾患。在一个实施方式中，诊断包括：a)向受治疗者施用(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)有效量的特异性结合所关注的多肽的标记的分子；b)施用后等待一定时间间隔以允许标记的分子优先在受治疗者中表达治疗蛋白的位点浓缩(且对未结合的标记的分子允许被清除至背景水平)；c)确定背景水平；和d)检测受治疗者中标记的分子，由此检测到标记的分子高于背景水平指示受治疗者患有与治疗蛋白的异常表达相关的特定疾病或疾患。可由各种方法确定背景水平，包括将检测的标记的分子的量与对特定系统预先确定的标准值比较。

应理解，本领域中受治疗者的体型大小和所用成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况，对于人类受治疗者，注射的放射性的量通常将从约5至20毫居的99mTc。随后标记的抗体、抗体片段或包含结合治疗蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白将优先在含有特定治疗蛋白的细胞部位积累。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments(放射标记抗体和其片段的免疫药代动力学)。″(Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer(肿瘤成像：放射化学检测癌症)的第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson Publishing Inc.(1982))。

取决于包括所用标记的类型和施用方式的多个变量，施用后允许标记的分子优先在受治疗者中的部位浓缩且允许未结合的标记的分子被清除至背景水平的时间间隔是6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一实施方式中，施用后时间间隔是5至20天或5至10天。

在一个实施方式中，通过重复用于诊断疾病或疾病的方法来进行疾病或疾患的监控，例如，在最初诊断后一个月、最初诊断后六个月、最初诊断后一年等。

使用本领域已知用于体内扫描的方法可检测患者中标记的分子的存在。这些方法取决于所用标记的类型。本领域技术人员将能够确定检测特定标记的合适方法。可用于本发明的诊断方法的方法和装置包括但不限于，计算机断层成像(CT)、全身扫描诸如位置发射断层成像(positon emission tomography)(PET)、核磁共振成像(MRI)和超声造影术。

在特定实施方式中，分子以放射性同位素标记并使用放射响应外科仪器在患者中检测(Thurston等，美国专利第5,441,050号)。在另一实施方式中，分子以荧光化合物标记并使用荧光响应扫描仪器在患者中检测。在另一实施方式中，分子以正电子发射金属标记并使用正电子发射断层成像在患者(patent)中检测。在另一实施方式中，分子以顺磁性标记标记并使用核磁共振成像(MRI)在患者中检测。特异性地检测清蛋白融合蛋白但不检测单独的清蛋白或治疗蛋白的抗体是一种实施方式。这些可用于检测如说明书整篇所述的清蛋白融合蛋白。

试剂盒

本发明提供可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含在一个或多个容器中的抗体，例如，纯化的抗体。在特定实施方式中，本发明的试剂盒含有基本上分离的多肽，所述多肽包含与试剂盒中包括的抗体起特异性免疫反应的表位。在另一实施方式中，本发明的试剂盒进一步包含不与所关注的多肽反应的对照抗体。在另一特定实施方式中，本发明的试剂盒含有检测抗体与所关注的多肽结合(如，抗体可缀合于可检测的底物诸如荧光化合物、酶的底物、放射性化合物或发光化合物，或识别第一抗体的第二抗体可缀合于可检测的底物)的手段。

在本发明的另一特定实施方式中，该试剂盒是用于筛选含有特异性针对增殖性和/或癌性多核苷酸和多肽的抗体的血清的诊断试剂盒。这种试剂盒可包含不与所关注的多肽反应的对照抗体。这种试剂盒可包含基本上分离的多肽抗原，其包含与至少一种抗-多肽抗原抗体起特异性免疫反应的表位。进一步地，这种试剂盒包含检测所述抗体与抗原的结合(如，该抗体可缀合于可由流式细胞术检测的荧光化合物诸如荧光素或罗丹明)的手段。在特定实施方式中，该试剂盒可包含重组制备或化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原也可附接于固相支持体。

在更具体实施方式中，上述试剂盒的检测手段包括附接有所述多肽抗原的固相支持体。这种试剂盒也可包括非附接的报告分子标记的抗-人抗体。在该实施方式中，抗体与多肽抗原的结合可由所述报告分子标记的抗体的结合而检测。

在另外的实施方式中，本发明包含用于筛选含有本发明的多肽的抗原的血清的诊断试剂盒。该诊断试剂盒包含与多肽或多核苷酸抗原起特异性免疫反应的基本上分离的抗体，和用于检测多核苷酸或多肽抗原与抗体的结合的手段。在一个实施方式中，该抗体附接于固相支持体。在特定实施方式中，该抗体可为单克隆抗体。试剂盒的检测手段可包含第二种标记的单克隆抗体。可选地，或此外，检测手段可包含标记的竞争抗原。

在一种诊断配置中，使测试血清与具有以本发明的方法获得的表面结合抗原的固相试剂反应。特异性抗原抗体与试剂结合并通过清洗除去未结合的血清成分后，使试剂与报告分子标记的抗-人抗体反应以将报告分子按与固相支持体上结合的抗-抗原抗体的量的一定比例与试剂结合。再次清洗试剂以除去未结合的标记的抗体，并确定与试剂结合的报告分子的量。通常，报告分子是酶，其通过将固相在存在合适的荧光、发光或比色底物(Sigma，St.Louis，MO)时进行温育来检测。

上述测定法中的固相表面试剂通过将蛋白质材料附接于固相支持材料的已知技术制备，诸如聚合物珠、浸渍条(dip sticks)、96-孔板或过滤材料。这些附接方法一般包括蛋白质对支持体的非-特异性吸附，或蛋白质通常通过游离胺基共价附接于固相支持体上的化学反应性基团，诸如活化的羧基、羟基、或醛基。可选地，链霉亲和素包被的板可结合生物素化的抗原使用。

因此本发明提供一种用于执行该诊断方法的测定系统或试剂盒。试剂盒一般包含表面结合有重组抗原的支持体，和用于检测表面结合的抗-抗原抗体的报告分子标记的抗-人抗体。

清蛋白融合蛋白

本发明概括地涉及清蛋白融合蛋白和治疗、预防或缓解疾病或疾患的方法。本文所用的″清蛋白融合蛋白″指至少一分子清蛋白(或其片段或变体)与至少一分子治疗蛋白(或其片段或变体)融合形成的蛋白质。本发明的清蛋白融合蛋白包含治疗蛋白的至少一个片段或变体和人血清清蛋白的至少一个片段或变体，它们通过例如遗传融合互相连接(即，所述清蛋白融合蛋白由核酸翻译而产生，该核酸中编码全部或部分治疗蛋白的多核苷酸与编码全部或部分清蛋白的多核苷酸以相同读码框连接)。治疗性蛋白和清蛋白一旦作为清蛋白融合蛋白的部分时，可各自被称为清蛋白融合蛋白的″部分(portion)″、″区域″或″部分(moiety)″。

在一个实施方式中，本发明提供一种由表1或表2中所述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白。编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸也包括在本发明中。

本发明的清蛋白融合蛋白的实施方式包括但不限于，由如下核酸分子编码的清蛋白融合蛋白：一种核酸分子，其包含以相同读码框与编码至少一分子治疗性蛋白(或其片段或变体)的至少一段多核苷酸连接的编码至少一分子清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸或可选地由其组成；一种核酸分子，其包含以相同读码框与编码至少一分子如表1、表2或实施例中所述的产生的治疗性蛋白(或其片段或变体)的至少一段多核苷酸连接的编码至少一分子清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸或可选地由其组成；或一种核酸分子，其包含以相同读码框与编码至少一分子治疗性蛋白(或其片段或变体)的至少一段多核苷酸连接的编码至少一分子清蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸或可选地由其组成，进一步包含例如一个或多个以下元件：(1)功能性自复制载体(包括但不限于，穿梭载体、表达载体、整合载体和/或复制系统)、(2)起始转录的区域(如，启动子区，诸如例如，调控型或诱导型启动子、组成型启动子)、(3)转录终止区、(4)前导序列和(5)选择标记。

在一个实施方式中，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包含治疗性蛋白(如表1中所述的)和血清清蛋白蛋白或可选地由其组成。在其它实施方式中，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包含治疗性蛋白的生物学活性的和/或治疗活性的片段和血清清蛋白蛋白或可选地由其组成。在其它实施方式中，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包含治疗性蛋白的生物学活性的和/或治疗活性的变体和血清清蛋白蛋白或可选地由其组成。在一些实施方式中，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白成分是血清清蛋白的成熟部分。

在进一步的实施方式中，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包含治疗性蛋白和血清清蛋白的生物学活性的和/或治疗活性的片段或可选地由其组成。在进一步的实施方式中，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包含治疗性蛋白和血清清蛋白的生物学活性的和/或治疗活性的变体或可选地由其组成。在一些实施方式中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是治疗性蛋白的成熟部分。

在进一步的实施方式中，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其包含治疗性蛋白的生物学活性的和/或治疗活性的片段或变体和血清清蛋白的生物学活性的和/或治疗活性的片段或变体，或可选地由其组成。在其它实施方式中，本发明提供一种清蛋白融合蛋白，其含治疗性蛋白的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分或可选地由其组成。

一方面，清蛋白融合蛋白包含HA作为N-末端部分和治疗性蛋白作为C-末端部分。可选地，也可使用包含HA作为C-末端部分和治疗性蛋白作为N-末端部分的清蛋白融合蛋白。

在其它实施方式中，清蛋白融合蛋白具有与清蛋白的N-末端和C-末端都融合的治疗性蛋白。在一个实施方式中，融合在N-和C-末端的治疗性蛋白是相同的治疗性蛋白。在可选实施方式中，融合在N-和C-末端的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白。在另一实施方式中，融合在N-和C-末端的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白，其可用于治疗或预防相同或相关的疾病、疾患或病症(如列在表1的″适应症Y″列的)。在另一实施方式中，融合在N-和C-末端的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白，其可用于治疗、缓解或预防疾病或疾患(如列在表1的″适应症Y″列的)，这些疾病或疾患是本领域已知通常同时地、并发地、或连续地在患者中存在的，或通常彼此相关地在患者中存在的。

本发明的清蛋白融合蛋白包括这样的蛋白质，其含有与本发明的清蛋白融合蛋白的N-或C-末端和/或清蛋白或其变体的N-和/或C-末端融合的一、二、三、四或更多分子的指定治疗性蛋白X或其变体。指定治疗性蛋白X或其变体的分子可以是任何数目的方向，包括但不限于，′头对头′方向(如，其中一分子的治疗性蛋白X的N-末端与另一分子的治疗性蛋白X的N-末端融合)，或′头对尾′方向(如，其中一分子的治疗性蛋白X的C-末端与另一分子的治疗性蛋白X的N-末端融合)。

在一个实施方式中，一、二、三或更多个串联定向的治疗性蛋白X多肽(或其片段或变体)与本发明的清蛋白融合蛋白的N-或C-末端和/或清蛋白或其变体的N-和/或C-末端融合。

本发明的清蛋白融合蛋白进一步包括这样的蛋白质，其含有与本发明的清蛋白融合蛋白的N-或C-末端和/或清蛋白或其变体的N-和/或C-末端融合的一、二、三、四或更多个分子的指定治疗性蛋白X或其变体，其中各分子通过肽接头连接。例子包含描述于美国专利第5,073,627号(在此通过引用并入)的肽接头。可使用常规重组DNA技术制备包含由肽接头分隔的多个治疗性蛋白X多肽的清蛋白融合蛋白。当融合小肽于大HSA分子时接头尤其重要。通过融合肽的串联拷贝，肽本身可为接头，或可使用其它已知接头。并入接头的构建体在表2中描述或当检查SEQ ID NO：Y时显而易见。

进一步地，本发明的清蛋白融合蛋白也可通过将治疗性蛋白X或其变体与清蛋白或其变体的N-末端和/或C-末端融合而制备，其融合的方式允许形成分子内和/或分子间多聚物形式。在本发明的一个实施方式中，清蛋白融合蛋白可为单体或多聚物形式(即二聚物、三聚物、四聚物和更高多聚物)。在本发明的进一步的实施方式中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分可为单体形式或多聚物形式(即二聚物、三聚物、四聚物和更高多聚物)。在特定实施方式中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是多聚物形式(即二聚物、三聚物、四聚物和更高多聚物)，且清蛋白蛋白部分是单体形式。

除了其中清蛋白部分融合于治疗性蛋白部分的N-末端和/或C-末端的清蛋白融合蛋白，本发明的清蛋白融合蛋白也可通过将所关注的治疗性蛋白或肽(如，公开于表1的治疗性蛋白X、或结合治疗性蛋白或其片段或变体的抗体)插入到HA的内部区域而制备。例如，在HA分子的蛋白质序列中的α-螺旋末端和开端之间存在大量由二硫键稳定的环或回转(turn)。从HA的晶体结构确定的环(PDB标识符1AO6、1BJ5、IBKE、IBM0、1E7E至1E7I和1UOR)的大部分从分子的主体延伸开。这些环可用于插入或内部融合治疗活性的肽，尤其是需要二级结构以有功能的肽，或治疗性蛋白，以实质上产生具有特定生物学活性的清蛋白分子。

可插入肽或多肽以产生本发明的清蛋白融合蛋白的人清蛋白结构中的环包括：Val54-Asn61、Thr76-Asp89、Ala92-Glu100、Gln170-Ala176、His247-Glu252、Glu266-Glu277、Glu280-His288、Ala362-Glu368、Lys439-Pro447、Val462-Lys475、Thr478-Pro486、和Lys560-Thr566。在另外的实施方式中，将肽或多肽插入成熟人清蛋白(SEQ ID NO：1)的Val54-Asn61、Gln170-Ala176、和/或Lys560-Thr566环。

待插入的肽可衍生自对特定生物活性进行筛选的噬菌体展示或合成肽文库或衍生自具有期望功能的分子的活性部分。此外，可以在特定环内生成随机肽文库或通过将随机化肽插入到HA分子的特定环中而产生随机肽文库，并且其中代表了氨基酸的所有可能组合。

这样的文库可通过以下方法之一在HA或HA的结构域片段上严生：

随机化突变HA或HA结构域片段的一个或多个肽环中的氨基酸。环中的一个、多个或所有残基可以这种方式突变；

将长度X_n的随机化的肽(其中X是氨基酸而n是残基数目)代替HA或HA结构域片段的一个或多个环或插入HA或HA结构域片段的一个或多个环(即内部融合)；

除了(a)和/或(b)，融合N-、C-或N-和C-末端肽/蛋白。

也可通过将衍生自针对不同靶对不同环进行的不同筛选的肽接枝到同一HA或HA结构域片段而使得HA或HA结构域片段成为多功能的。

在一些实施方式中，插入人血清清蛋白的环的肽是公开于表1的治疗性蛋白的肽片段或肽变体。更具体地，本发明包括包含插入人血清清蛋白的环的长度为至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。本发明还包括包含与人血清清蛋白的N-末端融合的至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。本发明还包括包含与人血清清蛋白的C-末端融合的至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。例如，可将表1和2中所述的短肽(如，治疗剂Y)插入到清蛋白环中。

通常，本发明的清蛋白融合蛋白可具有一个HA-衍生区和一个治疗性蛋白-衍生区。然而各蛋白的多个区可用于制备本发明的清蛋白融合蛋白。类似地，多于一种治疗性蛋白可用于制备本发明的清蛋白融合蛋白。例如，治疗性蛋白可与HA的N-和C-末端二者融合。以这种构型中，治疗性蛋白部分可为相同或不同的治疗性蛋白分子。双功能的清蛋白融合蛋白的结构可表示为：X-HA-Y或Y-HA-X。

例如，可制备抗-BLyS^TM scFv-HA-IFNα-2b融合体以调节抗-BLyS^TM scFv对IFNα-2b的免疫应答。一种可选择的方式是制备HA-融合体的双(或甚至多)功能药剂，如以取决于功能、半衰期等的各种比例与HA-抗-BLyS^TM scFv融合体或其它HA-融合体混合的HA-IFNα-2b融合体。

也可制备双-或多-功能清蛋白融合蛋白以藉由HA相反末端的蛋白质或肽使融合体的治疗性蛋白部分靶向于目标器官或细胞类型。

作为已知治疗分子的融合体的替代方式，可通过筛选文库来获得肽，将所述文库构建为通常6、8、12、20或25或X_n(其中X是氨基酸(aa)和n等于残基数目)个随机化的氨基酸与HA或HA结构域片段的N-、C-或N-和C-末端的融合体，且其中代表了氨基酸的所有可能组合。该方法的一个特别优势是可在HA分子上原位选择肽，且因此肽的特征就像选择的那样，而不会像由任何其它方法衍生肽然后附着到HA上的情况那样发生潜在改变。

此外，本发明的清蛋白融合蛋白可在融合的各部分之间包括接头肽以提供各部分之间更大的物理分隔从而使治疗性蛋白部分的可及性最大，例如，以结合于其相关受体。接头肽可由氨基酸组成以使其为柔性的或更刚性。

接头序列可由蛋白酶裂解或化学裂解以产生生长激素相关的部分。一方面，蛋白酶是由宿主天然产生的，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)蛋白酶kex2或等效蛋白酶。

因此，如上所述，本发明的清蛋白融合蛋白可具有下式R1-L-R2；R2-L-R1；或R1-L-R2-L-R1，其中R1是至少一种治疗性蛋白、肽或多肽序列，且不必是相同的治疗性蛋白，L是接头和R2是血清清蛋白序列。

在一些实施方式中，包含治疗性蛋白的本发明的清蛋白融合蛋白与未与清蛋白融合的相同治疗性蛋白的血浆稳定性相比具有更高血浆稳定性。血浆稳定性通常指介于体内施用治疗性蛋白并载入血流时和治疗性蛋白被降解并从血流清除进入最终将治疗性蛋白从体内清除的器官诸如肾或肝中时之间的时间段。血浆稳定性根据血流中治疗性蛋白的半衰期计算。血流中治疗性蛋白的半衰期可由本领域通常已知的测定法容易地确定。

在一些实施方式中，包含治疗性蛋白的本发明的清蛋白融合蛋白与未与清蛋白融合时的相同治疗性蛋白的贮存期限相比具有延长的贮存期限。贮存期限通常指溶液或一些其它贮存制剂中治疗性蛋白治疗活性经过该时间段是稳定的而不过度失去治疗活性。许多治疗性蛋白在其未融合状态是高度不稳定的。如下所述，这些治疗性蛋白的典型贮存期限在掺入本发明的清蛋白融合蛋白后显著地延长。

本发明的具有″延长″或″延伸″的贮存期限的清蛋白融合蛋白相对于经受相同贮存和操作条件后的标准品表现更大治疗活性。标准品可为未融合的全长治疗性蛋白。当清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分是该蛋白质的类似物、变体或以其他方式改变的或不包含蛋白质完整序列时，治疗活性的延长可以可选地与该类似物、变体、改变的肽或不完整序列的未融合的等效物相比。作为一个例子，当与标准品经受相同贮存和操作条件时，在指定时间点进行比较时，本发明的清蛋白融合蛋白可保持标准品的治疗活性的大于约100％、或大于治疗活性的约105％、110％、120％、130％、150％或200％。

贮存期限也可以根据贮存后保持的、针对贮存开始时的治疗活性标准化的治疗活性来评价。本发明的具有延长或延伸贮存期限的清蛋白融合蛋白(显示为延长或延伸的治疗活性)当经受相同条件时可保持等效未融合的治疗性蛋白的治疗活性的大于约50％、约60％、70％、80％或90％或更多。

表达融合蛋白

本发明的清蛋白融合蛋白可通过从酵母、微生物诸如细菌、或人或动物细胞系分泌作为重组分子产生。一方面，多肽是从宿主细胞分泌的。

本发明的特定实施方式包括DNA构建体，其编码有效引导在酵母中分泌的信号序列尤其是酵母-衍生信号序列(尤其是与酵母宿主同源的)和本发明第一方面的融合分子，其中信号和成熟多肽之间没有酵母-衍生的原序列(pro sequence)。

酿酒酵母转化酶信号是酵母-衍生信号序列的一个例子。

不包括Poznansky等(FEBS Lett.239：18(1988))制备的那类缀合物，其中分别制备的多肽通过化学交联连接在一起。

本发明还包括细胞，例如，经转化以表达本发明的清蛋白融合蛋白的酵母细胞。除了所转化的宿主细胞本身，本发明还包括这些细胞在营养培养基中的培养物，例如，单克隆(克隆上同质的)培养物或衍生自单克隆培养物的培养物。如果多肽是分泌的，则培养基将含有该多肽，连同细胞，或不连同细胞(如果已过滤或离心除去细胞)。许多表达系统是已知的并可使用，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillum subtilis))、酵母(例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))、丝状真菌(例如曲霉(Aspergillus))、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。

用于产生清蛋白融合蛋白的酵母菌株的例子是D88、DXY1和BXP10。D88[leu2-3，leu2-122，can1，pral，ubc4]是亲本菌株AH22his+(也称为DB1；见于如，Sleep等Biotechnology 8：42-46(1990))的衍生物。该菌株含有leu2突变，这允许对含有LEU2基因的基于2微米的质粒进行营养缺陷(auxotropic)选择。D88在葡萄糖过量时还表现PRB1的去阻遏。该PRB1启动子通常由监控葡萄糖水平和生长阶段的两个检查点控制。在野生型酵母中当葡萄糖耗尽并进入静止期时该启动子被活化。菌株D88表现出受葡萄糖阻遏，但当进入静止期时维持诱导。PRA1基因编码酵母液泡蛋白酶YscA内切蛋白酶-A，其定位于ER中。UBC4基因存在于泛素化途径中并牵涉使短寿和异常蛋白靶向于泛素依赖性降解。发现这种ubc4突变的分离增加表达质粒在细胞中的拷贝教并导致从质粒表达的期望蛋白的表达水平增加(见于如，国际公布第WO99/00504号，在此以其整体通过引用并入)。

DXY1是D88的衍生物，具有以下基因型：[leu2-3，leu2-122，can1，pra1，ubc4，ura3::yap3]。除了D88中分离的突变，该菌株还具有YAP3蛋白酶敲除。该蛋白酶导致大多数二碱性残基(RR、RK、KR、KK)的裂解，但也可促进蛋白中在单碱性残基的裂解。该yap3突变的分离导致更高水平的全长HSA产生(见于如，美国专利第5,965,386号和Kerry-Williams等，Yeast 14：161-169(1998)，在此以其整体通过引用并入)。

BXP10具有以下基因型：leu2-3，leu2-122，can1，pra1，ubc4，ura3，yap3::URA3，lys2，hsp150::LYS2，pmt1::URA3。除了在DXY1分离的突变，该菌株还具有PMT1基因和HSP 150基因的敲除。PMT1基因是进化上保守的多萜基磷酸-D-甘露糖蛋白O-甘露糖基转移酶(Pmts)家族的成员。Pmt1p的跨膜拓扑学表示它是内质网的膜内在蛋白，在O-联糖基化中起作用。该突变用于减少/消除HSA融合体的O-联糖基化(见于如，国际公布第WO00/44772号，在此以其整体通过引用并入)。研究揭示Hsp150蛋白不能通过离子交换层析有效地从rHA分离。HSP 150基因中的突变可除去可能的污染物，已证明该污染物难以由标准纯化技术除去。见于如，美国专利第5,783,423号，在此以其整体通过引用并入。

以常规方式制备期望的蛋白，例如从插入到宿主染色体或游离质粒上的编码序列。以任何常用方式例如电穿孔来用期望蛋白质的编码序列转化酵母。由电穿孔转化酵母的方法公开于Becker & Guarente(1990)MethodsEnzymol.194，182。

可由熟知技术鉴定成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞。例如，可培养引入表达构建体所得的细胞以产生期望的多肽。可收集并裂解细胞并使用诸如由Southern(1975)J.Mol.Biol.98，503或Berent等(1985)Biotech.3，208描述的方法检查其DNA成分中是否存在该DNA。可选地，上清液中蛋白质的存在可使用抗体检测。

可用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416并一般可从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037，USA得到。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合质粒(YIp)，并且并入酵母选择标记HIS3、7RP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(Ycp)。

用于在酵母中表达产生清蛋白融合蛋白的载体的例子包括pPPC0005、pScCHSA、pScNHSA和pC4:HSA，它们详细描述于实施例1。图2显示pPPC0005质粒的图谱，该质粒可用作可将编码治疗性蛋白的多核苷酸克隆到其中以形成HA-融合体的基础载体。其含有PRB1酿酒酵母启动子(PRB1p)、融合前导序列(FL)、编码HA的DNA(rHA)和ADH1酿酒酵母终止子序列。融合前导序列的序列由以下组成：人类血清清蛋白(SEQ ID NO：3)的信号肽的前19氨基酸和交配因子α1启动子的最后五个氨基酸(SLDKR，见于EP-A-387319，其在此以其整体通过引用并入)。

质粒pPPC0005、pScCHSA、pScNHSA和pC4:HSA在2001年4月11日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，分别给予登录号ATCC PTA-3278、PTA-3276、PTA-3279和PTA-3277。用于在酵母中表达清蛋白融合蛋白的另一载体pSAC35载体描述于Sleep等，Biotechnology 8：42(1990)，其在此以其整体通过引用并入。

可用于表达清蛋白融合蛋白的酵母启动子是MET25启动子。见于例如，Dominik Mumburg，Rolf Muller和Martin Funk.Nucleic Acids Research(核酸研究)，1994，第22卷，No.25，第5767-5768页。Met25启动子长383个碱基(碱基-382至-1)，由该启动子表达的基因还称为Met15、Met17和YLR303W。

一个实施方式使用以下序列，其中在以下序列的5′端，为用于克隆的Not 1位点加下划线，并且在3′端，为ATG起始密码子加下划线：

GCGGCCGCCGGATGCAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTCTCATTATTTTTTGCTTTTTCTCTTGAGGTCACATGATCGCA

AAATGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATATTGGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAAGTTAGTCAAG

GCGCCATCCTCATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAAGTGTCGAAAAGGTGGCACCTTGTCCAATTGAACACGCT

CGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAGCGTCTGTTAGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTGCTCTCT

TGTCTTTTCATCTACTATTTCCTTCGTGTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACCCCCATCCATA

CAATG(SEQ ID NO：5)

可用于在酵母中表达清蛋白融合蛋白的其它启动子包括以下启动子：

a)cbh1启动子：

TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTG

CGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAG

AAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGC

AGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAAT

ACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTC

TTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGAC

CGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTG

GGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGT

CGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGT

AAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAG

AAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGT

GGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGG

TGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTC

GGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAG

CCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCT

GGTGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAG

ATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAG

GATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGC

ATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAAT

GAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCC

CATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTC

AACCGCGGACTGGCATC(SEQ ID NO：113)

b)来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的cysD启动子：

AGATCTGGTTCCTGAGTACATCTACCGATGCGCCTCGATCCCCCTCTTAGCCGCATGAGATTCCTACCATTT

ATGTCCTATCGTTCAGGGTCCTATTTGGACCGCTAGAAATAGACTCTGCTCGATTTGTTTCCATTATTCACGC

AATTACGATAGTATTTGGCTCTTTTCGTTTGGCCCAGGTCAATTCGGGTAAGACGCGATCACGCCATTGTGG

CCGCCGGCGTTGTGCTGCTGCTATTCCCCGCATATAAACAACCCCTCCACCAGTTCGTTGGGCTTTGCGAAT

GCTGTACTCTATTTCAAGTTGTCAAAAGAGAGGATTCAAAAAATTATACCCCAGATATCAAAGATATCAAA

GCCATC(SEQ ID NO：114)

c)具有如下序列的经修饰的cbh1启动子：

TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTG

CGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAG

AAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGC

AGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAAT

ACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTC

TTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGAC

CGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTG

GGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGT

CGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGT

AAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAG

AAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGT

GGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGG

TGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTC

GGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAG

CCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCT

GGTGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAG

ATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAG

GATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGC

ATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCTGCAGCCTCTTATCGAGAAAGAAATTACCGTCGCTCGTGA

TTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAACCCAGACACGCTCGACTTCCTGTCTTCC TATTGATTGCAG

CTTCCAATTTCGTCACACAACAAGGTCCTAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTA

AACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCA

TGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAAC

CCAATAGTCAACCGCGGACTGGCATC(SEQ ID NO：115)

d)来自构巢曲霉具有以下序列的cysD启动子：

AGATCTGGTTCCTGAGTACATCTACCGATGCGCCTCGATCCCCCTCTTAGCCGCATGAGATTCCTACCATT

TATGTCCTATCGTTCAGGGTCCTATTTGGACCGCTAGAAATAGACTCTGCTCGATTTGTTTCCATTATTCAC

GCAATTACGATAGTATTTGGCTCTTTTCGTTTGGCCCAGGTCAATTCGGGTAAGACGCGATCACGCCATTG

TGGCCGCCGGCGCTGCAGCCTCTTATCGAGAAAGAAATTACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAA

CAAAACTGAAAAAACCCAGACACGCTCGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTCGTCACA

CAACAAGGTCCTACGCCGGCGTTGTGCTGCTGCTATTCCCCGCATATAAACAACCCCTCCACCAGTTCGTT

GGGCTTTGCGAATGCTGTACTCTATTTCAAGTTGTCAAAAGAGAGGATTCAAAAAATTATACCCCAGATAT

CAAAGATATCAAAGCCATC(SEQ ID NO：116)

已开发了多种方法以藉由互补粘末端将DNA与载体可操作地连接。例如，可向待插入到载体DNA的DNA区段加入互补均聚物束(tract)。随后通过互补均聚物尾之间的氢键来连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。

含有一个或多个限制性位点的合成接头提供了一种将DNA区段与载体连接的可选方法。将通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段以噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，这些酶以其3′5′-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并以其聚合活性填充凹陷的3′-端。

因此这些活性的组合产生平末端的DNA区段。随后在能够催化平末端的DNA分子连接的酶诸如噬菌体T4DNA连接酶存在下，将平末端的区段与大摩尔过量的接头分子一起温育。因此反应产物是在其末端携带聚合接头序列的DNA区段。随后以合适的限制性酶裂解这些DNA区段并连接至表达载体，该表达载体已用产生与该DNA区段末端相容的末端的酶裂解。

含有多种限制性内切核酸酶位点的合成接头是可从包括InternationalBiotechnologies Inc，New Haven，CT，USA的大量来源市售获得的。

如果例如要制备HA变体，一种理想的修饰根据本发明DNA的方式是使用如Saiki等(1988)Science 239，487-491公开的聚合酶链式反应。该方法中待酶促扩增的DNA侧翼为两个特异性寡核苷酸引物，其本身并入扩增的DNA。特异性引物可含有限制性内切核酸酶识别位点，其可用于使用本领域已知方法克隆入表达载体。

预期可作为表达清蛋白融合蛋白的宿主用于本发明实践的酵母的示例性属是毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))、酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、德巴利酵母属(Debaromyces)、梅齐酵母属(Metschunikowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、Botryoascus、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、拟内孢霉属(Endomycopsis)等等。示例性属选自下组：酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母和有孢圆酵母属。酵母属种的例子是酿酒酵母、意大利酵母(S.italicus)和鲁氏酵母(S.rouxii)。

克鲁维酵母属种的例子是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)。合适的有孢圆酵母属的种是戴尔有孢圆酵母(T.delbrueckii)。毕赤酵母属(汉逊酵母属)种的例子是安格斯毕赤酵母(P.angusta)(以前称为多形汉逊酵母(H.polymorpha))、异常毕赤酵母(P.anomala)(以前称为异常汉逊酵母(H.anomala))和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。转化酿酒酵母的方法概括教导于EP 251744、EP 258067和WO90/01063，这些参考文献都在此通过引用并入。

酵母属的示例性种包括酿酒酵母、意大利酵母、糖化酵母(S.diastaticus)和鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。克鲁维酵母属的示例性种包括脆壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母。汉逊酵母属的示例性种包括多形汉逊酵母(现在称为安格斯毕赤酵母)、异常汉逊酵母(现在称为异常毕赤酵母)和荚膜毕赤酵母(Pichia capsulata)。毕赤酵母属的其它示例性种包含巴斯德毕赤酵母。曲霉属(Aspergillus)的示例性种包含黑曲霉(A.niger)和构巢曲霉(A.nidulans)。耶氏酵母属(Yarrowia)的示例性种包含解脂耶氏酵母(Y.lipolytics)。许多酵母物种可从ATCC获得。例如，以下酵母物种可从ATCC获得并用于表达清蛋白融合蛋白：汉森氏酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)、有性型菌株BY4743 yap3突变体(ATCC检索号4022731)；汉森氏酿酒酵母、有性型菌株BY4743 hsp150突变体(ATCC检索号4021266)；汉森氏酿酒酵母、有性型菌株BY4743 pmt1突变体(ATCC检索号4023792)；汉森氏酿酒酵母、有性型(ATCC检索号20626；44773；44774和62995)；糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus Andrews et Gilliland ex van der Walt)、有性型(ATCC检索号62987)；乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis(Dombrowski)van der Walt)、有性型(ATCC检索号76492)；安格斯毕赤酵母(Pichia angusta(Teunisson等)Kurtzman)、有性型保藏为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha de Morals etMaia)、有性型(ATCC检索号26012)；黑曲霉(Aspergillus niger van Tieghem)、无性型(ATCC检索号9029)；黑曲霉(Aspergillus niger van Tieghem)、无性型(ATCC检索号16404)；构巢曲霉(Aspergillus nidulans(Eidam)Winter)、无性型(ATCC检索号48756)；和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica(Wickerham等)van der Walt et von Arx)、有性型(ATCC检索号201847)。

对酿酒酵母合适的启动子包括与PGKI基因、GAL1或GAL10基因、CYCI、PHO5、TRPI、ADHI、ADH2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶、α-交配因子信息素、[交配因子信息素]的基因相关的启动子、PRBI启动子、GUT2启动子、GPDI启动子、和包含部分5′调控区与其它启动子的部分5′调控区或与上游活化位点的杂合子的杂合启动子(如EP-A-258067的启动子)。

用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pomhe)的方便的可调控型启动子是来自nmt基因的硫胺-阻遏的启动子(如Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265，10857-10864所述)和葡萄糖阻遏的jbp1基因启动子(如Hoffman &Winston(1990)Genetics 124，807-816所述的)。

转化毕赤酵母以表达外源基因的方法教导于例如，Cregg等(1993)和多项Phillips专利(如美国专利第4857467号，在此通过引用并入)，且毕赤酵母表达试剂盒从Invitrogen BV，Leek，Netherlands和Invitrogen Corp.，SanDiego，California可市售获得。合适的启动子包括AOXI和AOX2。GIeeson等(1986)J.Gen.Microbiol.132，3459-3465包括关于汉逊酵母载体和转化的信息，合适的启动子为MOX1和FMD1；而EP 361991、Fleer等(1991)和Rhone-Poulenc Rorer的其它公开文献教导如何在克鲁维酵母属物种中表达外源蛋白，合适的启动子为PGKI。

示例性转录终止信号包括真核基因的含有用于转录终止和多腺苷酸化的正确信号的3′侧翼序列。合适的3′侧翼序列可为例如天然连接于所用的表达控制序列的基因的3′侧翼序列，即可对应于启动子。可选地，3′侧翼序列可以是不同的，在这种情况下终止信号可为酿酒酵母ADHI基因。

期望的清蛋白融合蛋白起初可以与分泌前导序列一起表达，前导序列可为在所选酵母中有效的任何前导序列。可用于酵母的前导序列包括以下任何一种：

a)MPIF-1信号序列(如，GenBank检索号AAB51134的氨基酸1-21)MKVSVAALSCLMLVTALGSQA(SEQ ID NO：6)

b)司腺钙蛋白信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO：7)

c)HSA信号序列的前-原区(如，MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR，SEQID NO：8)

d)HSA信号序列的前区(如，MKWVTFISLLFLFSSAYS，SEQ ID NO：9)或其变体，诸如例如，MKWVSFISLLFLFSSAYS，(SEQ ID NO：10)

e)转化酶信号序列(如，MLLQAFLFLLAGFAAKISA，SEQ ID NO：11)

f)酵母交配因子α信号序列(如，MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR，SEQ ID NO：12或MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR，SEQ ID NO：12)

g)乳酸克鲁维酵母杀伤毒素前导序列

h)杂合信号序列(如，MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR，SEQ ID NO：13)

i)HSA/MFα-1杂合信号序列(也称为HSA/kex2)(如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR，SEQ ID NO：14)

j)乳酸克鲁维酵母杀伤/MFα-1融合前导序列(如MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR，SEQ ID NO：15)

k)免疫球蛋白Ig信号序列(如，MGWSCIILFLVATATGVHS，SEQ ID NO：16)

l)纤蛋白B前体信号序列(如MERAAP SRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA，SEQ ID NO：17)

m)簇集蛋白前体信号序列(如MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG，SEQID NO：18)

n)胰岛素样生长因子-结合蛋白4信号序列(如MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG，SEQ ID NO：19)

o)HSA信号序列的前-原-区的变体诸如例如，

MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR(SEQ ID NO：20)，

MKWVTFISLLFLFAGVLG(SEQ ID NO：21)，

MKWVTFISLLFLFSGVLG(SEQ ID NO：22)，

MKWVTFISLLFLFGGVLG(SEQ ID NO：23)，

修饰的HSA前导序列HSA#64-MKWVTFISLLFLFAGVSG(SEQ IDNO：24)；

修饰的HSA前导序列HSA#66-MKWVTFISLLFLFGGVSG(SEQ IDNO：25)；

修饰的HSA(A14)前导序列-MKWVTFISLLFLFAGVSG(SEQ ID NO：26)；

修饰的HSA(S14)前导序列(也称为修饰的HSA#65)-MKWVTFISLLFLFSGVSG(SEQ ID NO：27)，

修饰的HSA(G14)前导序列-MKWVTFISLLFLFGGVSG(SEQ ID NO：28)，或MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS(SEQ ID NO：29)

p)共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO：3O)

q)酸性磷酸酯酶(PH05)前导序列(如，MFKSVVYSILAASLANA SEQ IDNO：31)

r)MFoz-1的前-序列

s)0葡聚糖酶(BGL2)的前-序列

t)杀伤毒素前导序列

u)杀伤毒素的前序列

v)乳酸克鲁维酵母杀伤毒素前原(29个氨基酸；16个前(pre)的氨基酸和13个原(pro)的氨基酸)MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR(SEQID NO：32)

w)糖化酵母葡萄糖淀粉酶(glucoarnylase)II分泌前导序列

x)卡尔酵母(S.carlsbergensis)α-半乳糖苷酶(MEL1)分泌前导序列

y)假丝酵母属葡萄糖淀粉酶(glucoarnylase)前导序列

z)公开于EP-A-387319(在此通过引用并入)的杂合前导序列

aa)gp67信号序列(与杆状病毒表达系统联合)(如，GenBank检索号AAA72759的氨基酸1-19)或

bb)治疗性蛋白X的天然前导序列；

cc)酿酒酵母转化酶(SUC2)前导序列，公开于JP 62-096086(授权号为911036516，在此通过引用并入)；或

dd)复旋花粉酶-MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR(SEQ ID NO：33)

ee)修饰的TA57前肽前导序列变体#1-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR(SEQ ID NO：34)

ff)修饰的TA57前肽前导序列变体#2-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR(SEQ ID NO：35)

gg)共有信号肽-MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA(SEQ ID NO：111)

hh)修饰的HSA/kex2信号序列-MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR(SEQ ID NO：112)

ii)共有信号肽#2-MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO：105)

重组和合成产生清蛋白融合蛋白的其它方法

本发明还涉及含有编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的载体、宿主细胞、和由合成和重组技术产生清蛋白融合蛋白。该载体可为例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可为可复制型或复制缺陷型。在复制缺陷型的情况，病毒繁殖一般只在互补性宿主细胞中发生。

编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可与含有选择标记的载体连接以在宿主中繁殖。通常，将质粒载体引入沉淀(诸如磷酸钙沉淀)或与带电荷的脂质复合物。如果载体是病毒，则可在体外使用合适的包装细胞系包装病毒并随后转导入宿主细胞。

多核苷酸插入子应可操作地连接于合适的启动子，诸如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTR的启动子，仅举几个例子。其它合适的启动子对本领域技术人员是已知的。表达构建体将进一步含有用于转录起始、终止的位点，且在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。构建体表达的转录子的编码部分可在待被翻译的多肽的开端包含翻译起始密码子，并且包含适当地置于末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。

如所述的，表达载体可包含至少一种选择标记。这样的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性，和在大肠杆菌和其它细菌中用于培养的四环素、卡那霉素或氨苄霉素抗性基因。合适的宿主的代表性例子包括但不限于，细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞(如，酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(ATCC检索号201178))；昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞诸如CHO、COS、NSO、293和Bowes黑素瘤细胞和植物细胞。对上述宿主细胞合适的培养基和条件是本领域已知的。

用于细菌的示例性载体包括可从QIAGEN，Inc.获得的pQE70、pQE60和pQE-9；可从Stratagene Cloning Systems，Inc.获得的pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；和可从PharmaciaBiotech，Inc获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。示例性真核载体包括可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；和可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。用于酵母系统的示例性表达载体包括但不限于pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K和PAO815(都可从Invitrogen，Carlbad，CA获得)。其它合适的载体对本领域技术人员将是明显的。

在一个实施方式中，编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可与信号序列融合，该信号序列将指引本发明的蛋白质定位于原核或真核细胞的特定区室和/或指引本发明的蛋白质从原核或真核细胞分泌。例如，在大肠杆菌中，可期望指引蛋白质表达到周质空间。可与本发明的清蛋白融合蛋白融合以指引多肽表达至细菌周质空间的信号序列或蛋白质(或其片段)的例子包括但不限于，pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌热-不稳定的肠毒素B-亚基的信号序列、和碱性磷酸酶的信号序列。用于构建融合蛋白的将指引蛋白质定位的多种载体是市售可获得的，诸如可从New England Biolabs获得的pMAL系列载体(尤其是pMAL-p系列)。在特定实施方式中，编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可与pelB果胶裂解酶信号序列融合以增加这些多肽在革兰氏阴性细菌中的表达和纯化效率。见于，美国专利第5,576,195和5,846,818号，其内容在此以其整体通过引用并入。

可与本发明的清蛋白融合蛋白融合以指引其在哺乳动物细胞中分泌的信号肽的例子包括但不限于：

a)MPIF-1信号序列(如，GenBank检索号AAB51134的氨基酸1-21)MKVSVAALSCLMLVTALGSQA(SEQ ID NO：6)

b)司腺钙蛋白信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO：7)

c)HSA信号序列的前-原区(如，MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR，SEQID NO：8)

d)HSA信号序列的前区(如，MKWVTFISLLFLFSSAYS，SEQ ID NO：9)或其变体，诸如例如，MKWVSFISLLFLFSSAYS，(SEQ ID NO：10)

e)转化酶信号序列(如，MLLQAFLFLLAGFAAKISA，SEQ ID NO：11)

f)酵母交配因子α信号序列(如，MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR，SEQ ID NO：12或MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR，SEQ ID NO：12)

g)乳酸克鲁维酵母杀伤毒素前导序列

h)杂合信号序列(如，MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR，SEQ ID NO：13)

i)HSA/MFα-1杂合信号序列(也称为HSA/kex2)(如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR，SEQ ID NO：14)

j)乳酸克鲁维酵母杀伤/MFα-1融合前导序列(如MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR，SEQ ID NO：15)

k)免疫球蛋白Ig信号序列(如，MGWSCIILFLVATATGVHS，SEQ ID NO：16)

l)纤蛋白B前体信号序列(如

MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA，SEQ ID NO：17)

m)簇集蛋白前体信号序列(如MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG，SEQID NO：18)

n)胰岛素样生长因子-结合蛋白4信号序列(如MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG，SEQ ID NO：19)

o)HSA信号序列的前-原-区的变体诸如例如，

MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR(SEQ ID NO：20)，

MKWVTFISLLFLFAGVLG(SEQ ID NO：21)，

MKWVTFISLLFLFSGVLG(SEQ ID NO：22)，

MKWVTFISLLFLFGGVLG(SEQ ID NO：23)，

修饰的HSA前导序列HSA#64-MKWVTFISLLFLFAGVSG(SEQ IDNO：24)；

修饰的HSA前导序列HSA#66-MKWVTFISLLFLFGGVSG(SEQ IDNO：25)；

修饰的HSA(A14)前导序列-MKWVTFISLLFLFAGVSG(SEQ ID NO：26)；

修饰的HSA(S14)前导序列(也称为修饰的HSA#65)-MKWVTFISLLFLFSGVSG(SEQ ID NO：27)，

修饰的HSA(G14)前导序列-MKWVTFISLLFLFGGVSG(SEQ ID NO：28)，或MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS(SEQ ID NO：29)

p)共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO：30)

q)酸性磷酸酯酶(PH05)前导序列(如，MFKSVVYSILAASLANA SEQ IDNO：31)

r)MFoz-1的前-序列

s)0葡聚糖酶(BGL2)的前-序列

t)杀伤毒素前导序列

u)杀伤毒素的前序列

v)乳酸克鲁维酵母杀伤毒素前原(29个氨基酸；16个前(pre)的氨基酸和13个原(pro)的氨基酸)MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR(SEQID NO：32)

w)糖化酵母葡萄糖淀粉酶(glucoarnylase)II分泌前导序列

x)卡尔酵母(S.carlsbergensis)α-半乳糖苷酶(MEL1)分泌前导序列

y)假丝酵母属葡萄糖淀粉酶(glucoarnylase)前导序列

z)公开于EP-A-387319(在此通过引用并入)的杂合前导序列

aa)gp67信号序列(与杆状病毒表达系统联合)(如，GenBank检索号AAA72759的氨基酸1-19)或

bb)治疗性蛋白X的天然前导序列；

cc)酿酒酵母转化酶(SUC2)前导序列，公开于JP 62-096086(授权号为911036516，在此通过引用并入)；或

dd)复旋花粉酶-MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR(SEQ ID NO：33)

ee)修饰的TA57前肽前导序列变体#1-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR(SEQ ID NO：34)

ff)修饰的TA57前肽前导序列变体#2-MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR(SEQ ID NO：35)

gg)共有信号肽-MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA(SEQ ID NO：111)

jj)修饰的HSA/kex2信号序列-MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR(SEQID NO：112)

kk)共有信号肽#2-MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO：105)

在一个实施方式中，修饰的HSA/kex2信号序列(SEQ ID NO：112)与清蛋白融合蛋白的氨基末端融合，所述清蛋白融合蛋白包括本文所述的包含清蛋白和治疗性蛋白的融合蛋白以及公开于WO93/15199；WO97/24445；WO03/60071；WO03/59934；和PCT/US04/01369(其各自在此以其整体通过引用并入)的清蛋白融合蛋白。修饰的HSA/kex2信号序列是基于公开于如Sleep等，Biotechnology 1990，第8卷，第42-46页；和美国专利第5,302,697号(两者在此以其整体通过引用并入)的HSA/kex2信号序列(SEQ ID NO：14)。本文公开的修饰的HSA/kex2前导序列在亲本信号肽的残基19处含有非保守的氨基酸取代(Arg至Gly)。已发现当在酵母里表达时修饰的HSA/kex2信号肽比未修饰的HSA/kex2信号序列意外地获得清蛋白融合蛋白的更好的表达产率和/或更好的裂解效率。修饰的HSA/kex2信号肽的变体也包括在本发明中。尤其是SEQ ID NO：112的位置19的Gly残基可被Pro残基取代。还包括修饰的HSA/kex2信号序列的其它保守性取代变体。编码SEQ ID NO：112的修饰的HSA/kex2的信号序列以及其保守性取代变体的核酸也包括在本发明中。

使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择标记的载体可分别在存在药物甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine)或氨甲喋呤时扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优势是谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(如，鼠骨髓瘤细胞系，NSO)易于获得。谷氨酰胺合酶表达系统还可通过提供额外的抑制剂以防止内源基因的功能而在表达谷氨酰胺合酶的细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表达系统和其组分详述于PCT公布：WO87/04462；WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404和WO91/06657，其在此以其整体通过引用并入。此外，谷氨酰胺合酶表达载体可从Lonza Biologies，Inc.(Portsmouth，NH)获得。使用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达和产生单克隆抗体描述于Bebbington等，Bio/Technology 10：169(1992)和Biblia和Robinson Biotechnol.Prog.11：1(1995)，其在此以其整体通过引用并入。

本发明还涉及含有本文所述的上述载体构建体的宿主细胞，此外包括含有使用本领域中已知技术可操作地与一种或多种异源控制区(如，启动子和/或增强子)相连的本发明的核苷酸序列的宿主细胞。宿主细胞可为高等真核细胞，诸如哺乳动物细胞(如，人衍生细胞)，或低等真核细胞，诸如酵母细胞，或宿主细胞可为原核细胞，诸如细菌细胞。可选择调节插入基因序列的表达，或以期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。存在一些诱导子时可提高从一些启动子的表达；从而可控制遗传改造的多肽的表达。此外，不同宿主细胞具有翻译和翻译后加工和修饰(如，磷酸化、裂解)蛋白质的特征和特异性机制。可选择合适的细胞系以确保表达的外源蛋白的期望的修饰和加工。

将本发明的核酸和核酸构建体引入宿主细胞可由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法实现。这些方法描述于许多标准实验室手册，诸如Davis等，BasicMethods In Molecular Biology(分子生物学基本方法)(1986)。具体地设想了本发明的多肽事实上可由缺少重组载体的宿主细胞表达。

除了包括含有本文讨论的载体构建体的宿主细胞，本发明还包括已被改造以缺失或替换了内源遗传材料(如，对应于治疗性蛋白的编码序列可被对应于治疗性蛋白的清蛋白融合蛋白替换)、和/或以包含遗传材料(如，异源多核苷酸序列诸如例如，可包含对应于治疗性蛋白的本发明的清蛋白融合蛋白)的脊椎动物来源、尤其是哺乳动物来源的原代、继代的和永生化的宿主细胞。可操作地与内源多核苷酸相连的遗传材料可活化、改变和/或扩增内源多核苷酸。

此外，本领域已知技术可用于藉由同源重组将异源多核苷酸(如，编码清蛋白蛋白或其片段或变体的多核苷酸)和/或异源控制区(如，启动子和/或增强子)与编码治疗性蛋白的内源多核苷酸序列可操作地相连(见于如，1997年6月24日发布的美国专利第5,641,670号；国际公布第WO 96/29411号；国际公布第WO 94/12650号；Roller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，Nature 342：435-438(1989)，其各自的公开内容在此以其整体通过引用并入)。

可由包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲合层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷相互作用层析和凝集素层析在内的熟知方法从重组细胞培养物回收和纯化本发明的清蛋白融合蛋白。另一方面，采用高效液相层析(″HPLC″)来纯化。

在一些实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白使用阴离子交换层析纯化，包括但不限于在Q-琼脂糖凝胶、DEAE琼脂糖凝胶、孔状(poros)HQ、孔状DEAE、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、Toyopearl DEAE、Resource/SourceQ和DEAE、Fractogel Q和DEAE柱上进行的层析。

在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白使用阳离子交换层析纯化，包括但不限于SP-琼脂糖凝胶、CM琼脂糖凝胶、孔状HS、孔状CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱和它们的等效物和相当物。

在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白使用疏水相互作用层析纯化，包括但不限于苯基、丁基、甲基、辛基、己基-琼脂糖凝胶，孔状苯基、丁基、甲基、辛基、己基，Toyopearl苯基、丁基、甲基、辛基、己基，Resource/Source苯基、丁基、甲基、辛基、己基，Fractogel苯基、丁基、甲基、辛基、己基柱和它们的等效物和相当物。

在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白使用尺寸排阻层析纯化，包括但不限于琼脂糖凝胶S100、S200、S300、superdex树脂柱和它们的等效物和相当物。

在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白使用亲合层析纯化，包括但不限于对HSA或″融合目标″分子有选择性的模拟染料亲合柱、肽亲合柱和抗体亲合柱。

在一些实施方式中，使用一种或多种上述层析方法纯化本发明的清蛋白融合蛋白。在其它实施方式中，使用一种或多种以下层析柱纯化本发明的清蛋白融合蛋白：Q琼脂糖凝胶FF柱、SP琼脂糖凝胶FF柱、Q琼脂糖凝胶高效柱、Blue琼脂糖凝胶FF柱、Blue柱、苯基琼脂糖凝胶FF柱、DEAE琼脂糖凝胶FF、或甲基柱。

此外，可使用PCT国际公布WO 00/44772(其在此以其整体通过引用并入)中所述的方法纯化本发明的清蛋白融合蛋白。本领域技术人员可简单地对其中描述的方法进行修改以用于纯化本发明的清蛋白融合蛋白。

本发明的清蛋白融合蛋白可从以下回收：化学合成方案的产物；和由重组技术从包括例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞在内的原核或真核宿主制备的产物。根据重组产生方案中采用的宿主，本发明的多肽可为糖基化的或为非糖基化的。此外，本发明的清蛋白融合蛋白也可括含起始修饰的甲硫氨酸残基，在一些情形是宿主-介导的加工的结果。因此本领域熟知，由翻译起始密码子编码的N-末端甲硫氨酸一般在所有真核细胞中翻译后从任何蛋白质以高效率除去。尽管在大多数原核生物中也有效除去大多数蛋白质上的N-末端甲硫氨酸，对一些蛋白质来说这种原核除去加工是无效的，这取决于N-末端甲硫氨酸共价连接的氨基酸的性质。

在一个实施方式中，酵母巴斯德毕赤酵母用于在真核系统中表达本发明的清蛋白融合蛋白。巴斯德毕赤酵母是可将甲醇作为唯一碳源进行代谢的甲基营养酵母。甲醇代谢途径的主要步骤是使用O₂氧化甲醇为甲醛。该反应由酶醇氧化酶催化。为了将甲醇作为唯一碳源进行代谢，巴斯德毕赤酵母必须产生高水平醇氧化酶，部分是由于醇氧化酶对O₂相对低的亲合性。因此，在依赖于甲醇为主要碳源的生长培养基中，两个醇氧化酶基因之一(AOX1)的启动子区是高活性的。存在甲醇时，从AOX1基因产生的醇氧化酶占巴斯德毕赤酵母中总可溶蛋白的多达大约30％。见于Ellis，S.B等，Mol.Cell.Biol.5：1111-21(1985)；Koutz，P.J等，Yeast 5：167-77(1989)；Tschopp，J.F.等，Nucl.Acids Res.15：3859-76(1987)。因此异源编码序列，诸如例如，本发明的多核苷酸，在所有或部分AOX1调控序列的转录调控下以异常高的水平于在甲醇存在下生长的毕赤酵母中表达。

在一个例子中，质粒载体pPIC9K用于在毕赤酵母系统中表达编码如本文所列的本发明的清蛋白融合蛋白的DNA，基本上如描述于″PichiaProtocols：Methods in Molecular Biology(毕赤酵母实验方案：分子生物学方法)，″D.R.Higgins和J.Cregg编辑.The Humana Press，Totowa，NJ，1998。借助连接于位于多克隆位点上游的巴斯德毕赤酵母碱性磷酸酶(PHO)分泌信号肽(即前导序列)的强AOX1启动子，该表达载体允许表达和分泌本发明的多肽。

如本领域技术人员将易于理解的，许多其它酵母载体可代替pPIC9K使用，诸如pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K和PAO815，只要所提议的表达构建体提供用于转录、翻译、分泌(如果期望)及类似行为的合适的定位信号，包括所需的框内AUG。

在另一实施方式中，通过将本发明的异源多核苷酸克隆入诸如例如，pGAPZ或pGAPZα等的表达载体，并在不存在甲醇时培养酵母培养物，可达到异源编码序列的高水平表达，诸如例如，编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。

此外，可使用本领域已知技术化学合成本发明的清蛋白融合蛋白(如，见于Creighton，1983，Proteins：Structures and Molecular Principles(蛋白结构和分子原理)，W.H.Freeman & Co.，N.Y.，和Hunkapiller等，Nature，310：105-111(1984))。例如，对应于多肽片段的多肽可使用肽合成器合成。此外如果期望，可向多肽序列引入非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、a-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、b-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计的(designer)氨基酸诸如b-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸和一般氨基酸类似物。此外，该氨基酸可为D(右旋的)或L(左旋的)。

本发明包括在翻译过程中或之后经不同修饰的本发明的清蛋白融合蛋白，如，由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、连接于抗体分子或其它细胞配体，等。以已知技术可进行任意的多种化学修饰，包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH₄的特异性化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；衣霉素存在下的代谢合成；等。

本发明包括的其它翻译后修饰包含，例如，如，N-联的或O-联的糖链、加工N-末端或C-末端)、将化学部分附接到氨基酸主链、化学修饰N-联的或O-联的糖链、和添加或缺失N-末端甲硫氨酸残基(为原核宿主细胞表达的结果)。也可以用可检测的标记修饰清蛋白融合蛋白，诸如酶标记、荧光标记、同位素或亲合性标记以允许检测和分离蛋白。

合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包含萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白；和合适的放射性材料的例子包含碘(¹²¹I、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹¹In、¹¹²In、¹¹³mIn、¹¹⁵mIn)、锝(⁹⁹Tc、⁹⁹mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh和⁹⁷Ru。

在特定实施方式中，将本发明的清蛋白融合蛋白或其片段或变体附接于大环螯合剂，所述螯合剂通过包括但不限于¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁶⁶Ho和¹⁵³Sm的放射性金属离子连接至多肽。在一个实施方式中，与大环螯合剂相连的放射性金属离子是¹¹¹In。在另一实施方式中，与大环螯合剂相连的放射性金属离子是⁹⁰Y。在特定实施方式中，该大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸(DOTA)。在其它具体实施方式中，DOTA藉由接头分子附接于本发明的抗体或其片段。用于将DOTA与多肽缀合的接头分子的例子是本领域通常已知的-见于例如，DeNardo等，Clin Cancer Res.4(10)：2483-90(1998)；Peterson等，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7(1999)；和Zimmerman等，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50(1999)；其在此以其整体通过引用并入。

如上所述，本发明的清蛋白融合蛋白可通过天然加工诸如翻译后加工，或通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰。应理解，相同类型的修饰可在指定多肽的多个位点以相同或不同程度存在。本发明的多肽可为分支的，例如，为泛素化的结果，并且多肽可为带有或不带有分支的环状。环状、分支的和分支的环状多肽可从翻译后天然加工获得或可由合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、与黄素共价附接、与血红素部分共价附接、与核苷酸或核苷酸衍生物共价附接、与脂质或脂质衍生物共价附接、与磷脂酰肌醇共价附接、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联键、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化(pegylation)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒基化(selenoylation)、硫酸盐化、转移-RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，诸如精氨酰化和泛素化。(见于例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES(蛋白-结构和分子特征)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，NewYork(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS(翻译后共价修饰蛋白质)，B.C.Johnson，编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62(1992))。

本发明的清蛋白融合蛋白和结合治疗性蛋白或片段或变体的抗体可与标记序列诸如肽融合以便于纯化。在其它实施方式中，标记氨基酸序列是六-组氨酸肽，诸如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的标签，以及其它，其中许多是市售可得的。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)中所述的，例如，六-组氨酸提供对融合蛋白的方便纯化。用于纯化的其它肽标签包括但不限于″HA″标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell 37：767(1984))和″旗″标签。

进一步地，本发明的清蛋白融合蛋白可缀合于治疗性部分诸如细胞毒素，如，细胞抑制剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子，如，α-发射体诸如例如，213Bi。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害的剂。例子包括帕利他塞、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素和其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢剂(如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(如，氮芥、硫替哌(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、和顺铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(如，更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(如，长春新碱和长春碱)。

本发明的缀合物可用于修饰指定生物学应答，所述治疗剂或药物部分不解释为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可为具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如，毒素诸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌属外毒素或白喉毒素；蛋白诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂，如TNF-α、TNF-β、AIM I(见于国际公布第WO 97/33899号)、AIM II(见于国际公布第WO 97/34911号)、Fas配体(Takahashi等，Int.Immunol，6：1567-1574(1994))、VEGI(见于国际公布第WO 99/23105号)、血栓形成剂或抗-血管发生剂，如血管他丁或内皮他丁；或生物学应答修饰剂诸如例如，淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)、或其它生长因子。用于将这种治疗性部分与蛋白质(例如清蛋白融合蛋白)缀合的技术是本领域已知的。

清蛋白融合蛋白也可附接至固相支持体，这对免疫测定或纯化由本发明的清蛋白融合蛋白结合的或结合于本发明的清蛋白融合蛋白的或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽尤其有用。这种固相支持体包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

可将缀合或未缀合治疗性部分的清蛋白融合蛋白单独地或与细胞毒性因子和/或细胞因子联合作为治疗剂施用。

在本发明的清蛋白融合蛋白仅包含结合治疗性蛋白的抗体的VH结构域的实施方式中，可能必须和/或期望共表达具有结合治疗性蛋白的同一抗体的VL结构域的融合蛋白，以使VH-清蛋白融合蛋白和VL蛋白将在翻译后缔合(共价或非共价地)。

在本发明的清蛋白融合蛋白仅包含结合治疗性蛋白的抗体的VL结构域的实施方式中，可能必须和/或期望共表达具有结合治疗性蛋白的同一抗体的VH结构域的融合蛋白，以使VL-清蛋白融合蛋白和VH蛋白将在翻译后缔合(共价或非共价地)。

一些治疗性抗体是双特异性的抗体，表示结合治疗性蛋白的抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。为了产生对应于该治疗性蛋白的清蛋白融合蛋白，可产生具有与清蛋白蛋白部分的N-和C-末端融合的scFv片段的清蛋白融合蛋白。更具体地，与清蛋白N-末端融合的scFv将对应于结合治疗性蛋白的原始抗体的重/轻(VH/VL)对之一，且与清蛋白的C-末端融合的scFv将对应于结合治疗性蛋白的原始抗体的另一重/轻(VH/VL)对。

本发明还提供本发明的清蛋白融合蛋白的化学修饰的衍生物，它可提供其它优势诸如增加多肽的溶解度、稳定性和循环时间，或降低免疫原性(见于美国专利第4,179,337号)。用于衍生的化学部分可选自水溶性聚合物诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖(dextran)、聚乙烯醇及类似物。清蛋白融合蛋白可在分子内的随机位置或分子内预先确定的位置被修饰并可包含一个、两个、三个或更多个附接的化学部分。

聚合物可为任何分子量，并可为分支的或未分支的。对于聚乙二醇，分子量可为约1kDa和约100kDa之间(术语″约″表示在聚乙二醇制品中，一些分子的分子量将比所示分子量更大或更小)以便于操纵和制造。取决于期望的治疗特征(如，期望的持续释放的持续时间、对生物活性的影响(如果有)、易于操纵、抗原性的程度或缺乏、和聚乙二醇对治疗性蛋白或类似物的其它已知效应)，可使用其它大小。例如，聚乙二醇的平均分子量可为约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa。

如上所述，聚乙二醇可具有分支的结构。分支的聚乙二醇描述于例如，美国专利第5,643,575号；Morpurgo等，Appl Biochem.Biotechnol.56：59-12(1996)；Vorobjev等，Nucleosides Nucleotides 18：2745-2750(1999)；和Caliceti等，Bioconjug.Chem.70：638-646(1999)，其各自的公开内容在此通过引用并入。

聚乙二醇分子(或其它化学部分)应与蛋白质附接并考虑到对蛋白质的功能性或抗原性结构域的影响。对本领域技术人员有大量可得的附接方法，诸如例如，公开于EP 0401384的方法(将PEG与G-CSF偶联)，在此通过引用并入；还见于Malik等，Exp.Hematol.20：1028-1035(1992)，报道使用三氟乙烷磺酰氯(tresyl chloride)来聚乙二醇化GM-CSF。例如，聚乙二醇可通过氨基酸残基藉由反应性基团诸如游离氨基或羧基基团共价结合。反应性基团是可结合活化的聚乙二醇分子的基团。具有游离氨基基团的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N-末端氨基酸残基；具有游离羧基基团的氨基酸残基可包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C-末端氨基酸残基。巯基基团也可用作附接聚乙二醇分子的反应性基团。为了治疗目的，可在氨基基团进行附接，诸如在N-末端或赖氨酸基团进行附接。

如上所述，聚乙二醇可藉由与大量氨基酸残基中的任一的键合而附接于蛋白质。例如，聚乙二醇可藉由对赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸残基的共价键而连接于蛋白质。一种或多种反应化学可用于将聚乙二醇附接于蛋白质的特定氨基酸残基(如，赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸)或将聚乙二醇附接于蛋白质的多于一种类型的氨基酸残基(如，赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和其组合)。

人们可特别期望在N-末端经化学修饰的蛋白质。使用聚乙二醇为本组合物的示例，可从多种聚乙二醇分子选择(根据分子量、分支等)：反应混合物中聚乙二醇分子与蛋白质(多肽)分子的比例、要进行的聚乙二醇化反应的类型、和获得所选的N-末端聚乙二醇化的蛋白质的方法。获得N-末端聚乙二醇化的制品的方法(即如果需要，从其它单聚乙二醇化的部分分离此部分)可通过从聚乙二醇化的蛋白质分子群体纯化N-末端聚乙二醇化的材料。在N-末端化学修饰的选择性蛋白的修饰可通过还原性烷基化而实现，其利用在特定蛋白中可用于衍生化的不同类型伯氨基基团(赖氨酸或N-末端)的不同反应性。在合适的反应条件下，可实现以含有羰基基团的聚合物在N-末端对蛋白质的大致选择性衍生化。

如上所述，聚乙二醇化本发明的清蛋白融合蛋白可由任何种方式实现。例如，聚乙二醇可直接或通过其间的接头与清蛋白融合蛋白附接。用于将聚乙二醇与蛋白质的无接头系统描述于Delgado等，Crit.Rev.Thera.DrugCarrier Sys.9：249-304(1992)；Francis等，Intern.J.of Hematol.68：1-18(1998)；美国专利第4,002,531号；美国专利第5,349,052号；WO 95/06058；和WO 98/32466，其各自的公开在此通过引用并入。

用于将聚乙二醇直接与蛋白质的氨基酸残基附接而没有其间的接头的一种系统采用三氟乙烷磺酰化的MPEG，其是使用三氟乙烷磺酰氯(ClSO₂CH₂CF₃)修饰单甲氧基(monmethoxy)聚乙二醇(MPEG)而制备的。蛋白质与三氟乙烷磺酰化的MPEG反应后，将聚乙二醇直接与蛋白质的胺基团附接。因此本发明包括将本发明的蛋白质与具有2，2，2-三氟乙烷(trifluoreothane)磺酰基团的聚乙二醇分子反应而制备的蛋白质-聚乙二醇缀合物。

还可使用大量不同的其间的接头将聚乙二醇附接于蛋白质。例如，美国专利第5,612,460号，其完整公开内容在此通过引用并入，公开了用于将聚乙二醇与蛋白质附接的尿烷接头。其中聚乙二醇通过接头附接于蛋白质的蛋白质-聚乙二醇缀合物还可通过将蛋白质与化合物反应而制备，该化合物诸如MPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯、1，1’-羰基二咪唑活化的MPEG、MPEG-2，4，5-三氯戊基碳酸酯、MPEG-对硝基苯酚碳酸酯、和各种MPEG-琥珀酸酯衍生物。用于将聚乙二醇附接于蛋白质的大量其它聚乙二醇衍生物和反应化学是国际公布第WO 98/32466号中所述的，其完整公开内容在此通过引用并入。使用本文所述的反应化学制备的聚乙二醇化蛋白产物包含在本发明范围内。

附接于本发明的各清蛋白融合蛋白的聚乙二醇部分的数目(即取代度)也可变化。例如，本发明的聚乙二醇化的蛋白质可平均与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多个聚乙二醇分子附接。类似地，平均取代度在每蛋白分子诸如1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19或18-20个聚乙二醇部分的范围中。确定取代度的方法讨论于例如，Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304(1992)。

可通过包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲合层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析的标准方法从化学合成和重组细胞培养物回收和纯化本发明的多肽。在本发明的一个方面中，采用高效液相层析(″HPLC″)来纯化。当多肽在分离和/或纯化过程中变性时可采用折叠蛋白的熟知技术来再生活性构型。

可使用本领域广泛已知的免疫测定法ELISA确定本发明的清蛋白融合蛋白的存在和量。在一个ELISA中，将用于检测/定量本发明的清蛋白融合蛋白的方案包括以下步骤：以抗-人血清清蛋白抗体包被ELISA板，封闭板以防止非-特异性结合，清洗ELISA板，加入含有本发明的清蛋白融合蛋白(以一种或多种不同浓度)的溶液，加入偶联于可检测的标记(如本文所述的或除此之外本领域已知的)的第二抗-治疗性蛋白特异性抗体，并检测第二抗体的存在。在该方案的可选版本中，可以抗-治疗性蛋白特异性抗体包被ELISA板，标记的第二试剂可为抗-人清蛋白特异性抗体。

多核苷酸的用途

本文鉴定的每种多核苷酸可以多种方式作为试剂使用。以下描述应认为是示例性的并使用已知技术。

本发明的多核苷酸可用于产生本发明的清蛋白融合蛋白。如以下更详细描述的，本发明的多核苷酸(编码清蛋白融合蛋白)可用于重组DNA方法，用于遗传工程以制备表达由编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸编码的清蛋白融合蛋白的细胞、细胞系或组织。

本发明的多核苷酸还可用于基因治疗。基因治疗的一个目标是将正常基因插入到具有缺陷型基因的生物体，作用于改正遗传缺陷。公开于本发明的多核苷酸提供了以高度准确的方式靶向这些遗传缺陷的手段。另一目标是插入宿主基因组中不存在的新基因，从而在宿主细胞中产生新性状。本发明包括的基因治疗方法的其它非限制性例子更透彻地描述于本文的别处(见于如，标为″基因治疗″的部分和实施例61和62)。

多肽的用途

本文鉴定的每种多肽可以多种方式使用。以下描述应认为是示例性并使用已知技术。

本发明的清蛋白融合蛋白可用于为差异性地鉴定组织(如，免疫组织化学测定法诸如例如，ABC免疫过氧化物酶(Hsu等，J.Histochem.Cytochem.29：577-580(1981))或细胞类型(如，免疫细胞化学测定法)提供免疫学探针。

清蛋白融合蛋白可用于使用对本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法来测定生物样品中多肽水平(如，见于Jalkanen等，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen等，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。其它可用于检测蛋白基因表达的方法包括免疫测定法，诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。合适的测定标记是本领域已知的并包括酶标记，诸如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(^115mIn、^113mIn、¹¹²In、¹¹¹In)、和锝(⁹⁹Tc、^99mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru；发光标记诸如鲁米诺；和荧光标记诸如荧光素和罗丹明、和生物素。

还可通过成像体内检测本发明的清蛋白融合蛋白。用于体内成像蛋白质的标记或标记物包括可由X-放射照相、核磁共振(NMR)或电子自旋弛豫(electron spin relaxtion)(ESR)检测的标记或标记物。对于X-放射照相，合适的标记包括放射性同位素诸如钡或铯，它们发射可检测的辐射但不明显伤害受治疗者。对NMR和ESR，合适的标记包括具有可检测的特征自旋(characteristic spin)的标记，诸如氘，其可通过标记提供给表达本发明的清蛋白融合蛋白的细胞系的营养物质而掺入清蛋白融合蛋白。

将已用合适的可检测的成像部分诸如放射性同位素(例如，¹³¹I、¹¹²In、^99mTc、(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(^115mIn、^113mIn、¹¹²In、¹¹¹In)、和锝(⁹⁹Tc、^99mTc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh和⁹⁷Ru)、射线不透性物质或核磁共振可检测的材料标记的清蛋白融合蛋白引入(例如，肠胃外、皮下或腹膜内地)待检查免疫系统疾患的哺乳动物。应理解，本领域中受治疗者的体格和所用成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况，对于人受治疗者，注射的放射性的量通常将为从约5至20毫居的^99mTc。标记的清蛋白融合蛋白随后将优先在体内一种或多种受体、配体或底物(对应于用于制备本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白的受体、配体或底物)位于的位置(如，器官、细胞、细胞外空间或基质)积累。可选地，在清蛋白融合蛋白包含治疗性抗体的至少一个片段或变体的情况，标记的清蛋白融合蛋白随后将优先在体内对应于治疗性抗体(用于制备本发明的清蛋白融合蛋白)结合的多肽/表位的多肽/表位位于的位置(如，器官、细胞、细胞外空间或基质)积累。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等，″Immunopharmacokineticsof Radiolabeled Antibodies and Their Fragments(免疫标记抗体和其片段的免疫药代动力学)″(Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer(肿瘤成像：放射化学检测癌症)的第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson Publishing Inc.(1982))。本文描述的方案可易于被本领域技术人员修改用于本发明的清蛋白融合蛋白。

在一个实施方式中，本发明提供一种特异性递送本发明的清蛋白融合蛋白到细胞中的方法，通过施用与异源多肽或核酸缔合的本发明的清蛋白融合蛋白(如，由编码本发明的清蛋白融合蛋白和/或抗体的多核苷酸编码的多肽)。在一个例子中，本发明提供一种递送治疗性蛋白到所靶向的细胞中的方法。在另一例子中，本发明提供一种递送单链核酸(如，反义或核酶)或双链核酸(如，可整合入细胞的基因组或游离地复制并可被转录的DNA)到所靶向的细胞中的方法。

在另一实施方式中，本发明提供一种通过将本发明的清蛋白融合蛋白与毒素或细胞毒性前药联用来特异性破坏细胞(如，破坏肿瘤细胞)的方法。

″毒素″意为结合和活化内源细胞毒性效应系统的一种或多种化合物、放射性同位素、全毒素、修饰的毒素、毒素的催化性亚基、或通常不存在于细胞中或细胞表面上、在限定条件下导致细胞死亡的任何分子或酶。根据本发明的方法可使用的毒素包括但不限于，本领域已知的放射性同位素、化合物诸如例如，结合固有或诱导的内源细胞毒性效应系统的抗体(或含有其部分的补体固定)、胸苷激酶、内切核酸酶、RNA酶、α毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、假单胞菌属外毒素A、白喉毒素、皂草素、木鳖子皂苷、白树毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、α-八叠球菌和霍乱毒素。″毒素″还包括细胞抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，如，α-发射体诸如例如，²¹³Bi、或其它放射性同位素诸如例如，¹⁰³Pd、¹³³Xe、¹³¹I、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、³⁵S、⁹⁰Y、¹⁵³Sm、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn、⁹⁰钇、¹¹⁷Tin、¹⁸⁶铼、¹⁶⁶钬和¹⁸⁸铼；发光标记诸如鲁米诺；和荧光标记诸如荧光素和罗丹明、和生物素。在特定实施方式中，本发明提供一种通过将本发明的多肽或本发明的抗体与放射性同位素⁹⁰Y联用特异性破坏细胞(如，破坏肿瘤细胞)的方法。在另一特定实施方式中，本发明提供一种通过将本发明的多肽或本发明的抗体与放射性同位素¹¹¹In联用特异性破坏细胞(如，破坏肿瘤细胞)的方法。在进一步具体实施方式中，本发明提供一种通过将本发明的多肽或本发明的抗体与放射性同位素¹³¹I联用特异性破坏细胞(如，破坏肿瘤细胞)的方法。

可施用本领域已知技术以标记本发明的多肽。这种技术包括但不限于，使用双功能缀合剂(见于如，美国专利第5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003号；其各自的内容在此以其整体通过引用并入)。

本发明的清蛋白融合蛋白可用于哺乳动物例如人中各种疾患的诊断、治疗、预防和/或预后。这些疾患包括但不限于本文下述的标题为″生物活性″的部分中的疾患。

本发明提供疾患的诊断方法，包括(a)使用本发明的清蛋白融合蛋白测定特定多肽在个体的细胞或体液中的表达水平；和(b)将所测定多肽的表达水平与标准多肽的表达水平比较，从而测定的多肽的表达水平与标准表达水平相比的增加或减少表示疾患。对于癌症，个体的生物活检组织中存在相对高量的转录物可指示发展疾病的易感体质，或可提供在实际临床症状出现之前检测疾病的手段。这种类型的更可靠的诊断可允许健康专家更早地采用预防性措施或主动性治疗从而防止癌症的发展或进一步进展。

而且，本发明的清蛋白融合蛋白可用于治疗或预防疾病或病症诸如例如，神经疾患、免疫系统疾患、肌肉疾患、生殖疾患、胃肠疾患、肺疾患、心血管疾患、肾疾患、增殖疾患和/或癌性疾病和病症。例如，患者可被施用本发明的多肽，作用以代替不存在的或低水平多肽(如，胰岛素)、以补充不存在的或低水平不同多肽(如，血红素S代替血红素B、SOD、过氧化氢酶、DNA修复蛋白)、以抑制多肽(如，癌基因或肿瘤抑制物)的活性、以活化多肽的活性(如，通过结合于受体)、以通过与膜结合受体竞争游离配体降低膜结合受体的活性(如，用于降低炎症的可溶性TNF受体)、或以导致期望的应答(如，血管生长抑制、增强对增殖性细胞或组织的免疫应答)。

尤其是，包含治疗性抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白也可用于治疗疾病(如上和本文别处所述的)。例如，施用包含治疗性抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可结合、和/或中和用于制备清蛋白融合蛋白的治疗性抗体特异性结合的多肽、和/或减少用于制备清蛋白融合蛋白的治疗性抗体特异性结合的多肽的过度产生。类似地，施用包含治疗性抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可活化用于制备清蛋白融合蛋白的治疗性抗体特异性结合的多肽，通过与结合于膜的多肽(受体)结合。

至少，使用本领域技术人员熟知的方法，本发明的本发明的清蛋白融合蛋白可用作SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱上的分子量标记。本发明的清蛋白融合蛋白还可用于产生抗体，该抗体反过来可用于测量本发明的治疗性蛋白、清蛋白蛋白、和/或清蛋白融合蛋白从重组细胞的蛋白表达，作为评价宿主细胞转化或在生物样品中的转化的一种方式。而且，本发明的清蛋白融合蛋白可用于测试本文所述的生物活性。

诊断测定法

本发明的化合物可用于哺乳动物例如人中各种疾患的诊断、治疗、预防和/或预后。这些疾患包括但不限于，表1相应列中对每种治疗性蛋白的和本文中以下标题为″免疫活性″、″血液相关疾患″、″过度增殖疾患″、″肾疾患″、″心血管疾患″、″呼吸疾患″、″抗-血管发生活性″、″细胞水平的疾病″、″创伤愈合和上皮细胞增殖″、″神经活性和神经学疾病″、″内分泌疾患″、″生殖系统疾患″、″感染性疾病″、″再生″和/或″胃肠疾患″的部分中描述的疾患。

对于多种疾患，可从来自患有这种疾患的个体获得的组织、细胞或体液(如，血清、血浆、尿、精液、滑液或脊髓液)中检测到基因表达水平相对于″标准″基因表达水平，即，来自不患有该疾患的个体的组织或体液中的表达水平的实质改变(增加或减少)。因此本发明提供一种可用于诊断疾患过程中的诊断方法，包括测量编码多肽的基因在个体的组织、细胞或体液中的表达水平并将所测量的基因表达水平与标准基因表达水平比较，从而基因表达水平与标准相比的增加或减少表示疾患。这些诊断测定法可在体内或体外进行，诸如例如，对血液样品、活检组织或尸检组织进行。

本发明还可用作预后指标，从而表现增强的或降低的基因表达的患者将获得更坏的临床结果。

″测定编码多肽的基因的表达水平″意为直接(如，通过确定或估计绝对蛋白质水平或mRNA水平)或相对地(如，通过与第二生物样品中的多肽水平或mRNA水平比较)定性或定量测量或估计第一生物样品中的特定多肽(如对应于公开于表1的治疗性蛋白的多肽)的水平或编码本发明的多肽的mRNA水平。在一个实施方式中，测量或估计第一生物样品中多肽表达水平或mRNA水平，并与标准多肽水平或mRNA水平相比较，该标准来自获得自不患有该疾患的个体的第二生物样品或通过得自不患有该疾患的个体的群体的平均水平来确定。如本领域应理解的，一旦标准多肽水平或mRNA水平是已知的，则可重复使用它作为标准用以比较。

″生物样品″意为从个体、细胞系、组织培养物或其它含有本发明的多肽(包括其部分)或mRNA的来源获得的任何生物样品。如所示的，生物样品包括发现表达多肽或mRNA的全长或其片段的体液(诸如血清、血浆、尿、滑液和脊髓液)和组织来源。从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域熟知的。其中生物样品意为包括mRNA，mRNA可从组织活检获得。

可使用任何合适的技术从生物样品分离总细胞RNA，诸如Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162：156-159(1987)中所述的单步骤的胍-硫氰酸盐-苯酚-氯仿方法。随后使用任何合适的方法测定编码本发明的多肽的mRNA水平。这些包括Northern印迹分析、S1核酸酶作图、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录联合聚合酶链式反应(RT-PCR)、和逆转录联合连接酶链式反应(RT-LCR)。

本发明还涉及诊断测定法，诸如定量和诊断测定法，用于测定结合于本发明的清蛋白融合蛋白的多肽、由本发明的清蛋白融合蛋白结合的多肽、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽在生物样品(如，细胞和组织)中的水平，包括确定多肽的正常和异常水平。因此例如，根据本发明用于检测结合于本发明的清蛋白融合蛋白的多肽、由本发明的清蛋白融合蛋白结合的多肽、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽与正常对照组织样品相比的异常表达的诊断测定法可用于检测肿瘤的存在。可用于确定结合于本发明的清蛋白融合蛋白的多肽、由本发明的清蛋白融合蛋白结合的多肽、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽在来自宿主的样品中的水平的测定技术是对本领域技术人员熟知的。这些测定方法包括放射免疫测定法、竞争性-结合测定法、Western印迹分析和ELISA测定法。测定多肽在生物样品中的水平可使用任何本领域已知方法进行。

可使用多种技术进行生物样品中多肽水平的测定。例如，可以用经典免疫组织学方法研究组织中的多肽表达(Jalkanen等，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen等，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。其它可用于检测多肽基因表达的方法包括免疫测定法，诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的并包括酶标记，诸如，葡萄糖氧化酶；和放射性同位素，诸如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In)、和锝(^99mTc)；和荧光标记诸如荧光素和罗丹明、和生物素。

待分析的组织或细胞类型将一般包括已知或疑似表达所关注的基因的组织或细胞类型(诸如例如，癌症)。本文采用的蛋白分离方法可为，例如，描述于Harlow和Lane(Harlow，E.和Lane，D.，1988，″Antibodies：A LaboratoryManual(抗体的实验室手册)″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)(其在此以其整体通过引用并入)中的那些。分离的细胞可衍生自细胞培养物或来自患者。分析从培养物获得的细胞可为评价细胞的必需步骤，其可用作基于细胞的基因治疗技术的部分，或可选地，用于测试化合物对基因表达的作用。

例如，清蛋白融合蛋白可用于定量或定性检测结合于本发明的清蛋白融合蛋白的多肽、由本发明的清蛋白融合蛋白结合的多肽、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽的存在。这可通过例如，与光显微镜法、流式细胞术、或荧光检测偶联的采用荧光标记清蛋白融合蛋白的免疫荧光技术来实现。

在一个实施方式中，包含特异性结合至少一个本文公开的治疗性蛋白(如，公开于表1的治疗性蛋白)或除此之外本领域已知的治疗性蛋白的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白可用于定量或定性检测基因产物或其保守变体或肽片段的存在。这可通过例如，与光显微镜法、流式细胞术、或荧光检测偶联的、采用荧光标记的抗体的免疫荧光技术来实现。

此外，可组织学地采用本发明的清蛋白融合蛋白，如在免疫荧光、免疫电子显微镜或非免疫学测定法中，用于原位检测结合于本发明的清蛋白融合蛋白的多肽、由本发明的清蛋白融合蛋白结合的多肽、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽。可通过从患者移去组织学样本，并将本发明的标记的抗体或多肽施加于其上来实现原位检测。可通过将标记的清蛋白融合蛋白覆盖在生物样品上而施加清蛋白融合蛋白。通过使用这种方案，不仅有可能确定结合于本发明的清蛋白融合蛋白的多肽、由本发明的清蛋白融合蛋白结合的多肽、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽的存在，还有可能确定其在检查的组织中的分布。使用本发明，本领域普通技术人员将易于理解，可修改许多组织学方法的任何一种(诸如染色方案)以实现这种原位检测。

检测结合于本发明的清蛋白融合蛋白的多肽、由本发明的清蛋白融合蛋白结合的多肽、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽的免疫测定法和非免疫测定法将通常包括在能够结合基因产物或其保守变体或肽片段的可检测标记抗体存在下温育样品，诸如生物流体、组织提取液、新收集的细胞、或已在细胞培养中经过温育的细胞的裂解物，并通过本领域熟知的许多技术的任何一种检测结合的抗体。

可使生物样品接触和固定于固相支持体或载体诸如硝酸纤维素、或能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的其它固相支持体上。随后可以合适的缓冲液洗涤该支持体，随后用可检测地标记的本发明的清蛋白融合蛋白处理。随后可以缓冲液二次洗涤该固相支持体以除去未结合的抗体或多肽。任选地随后标记该抗体。随后可由常规方法检测固相支持体上结合的标记的量。

″固相支持体或载体″意为能够结合多肽(如，清蛋白融合蛋白、或结合于本发明的清蛋白融合蛋白、由本发明的清蛋白融合蛋白结合、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽)的任何支持体。熟知的支持体或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁。为了本发明目的，载体的性质可为在一定程度可溶或不可溶。支持体材料可具有实质上任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合于多肽。因此支持体构型可为球形，如珠，或圆柱形，如试管的内表面或棒的外表面。可选地，表面可为平坦的诸如片层、测试带等。示例性支持体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将知道用于结合抗体或抗原的许多其它合适的载体，或将能够通过使用例行试验确定合适的载体。

可根据熟知方法确定所给批次的清蛋白融合蛋白的结合活性。通过采用例行试验本领域技术人员将能够确定对每次测定有效的和最佳的测定条件。

除了测定多肽在从个体获得的生物样品中的水平，还可在体内由成像检测多肽。例如，在本发明的一个实施方式中，使用本发明的清蛋白融合蛋白成像患病或肿瘤细胞。

用于体内成像本发明的清蛋白融合蛋白的标记或标记物包括可由X-放射照相、NMR、MRI、CAT-扫描或ESR检测的标记或标记物。对于X-放射照相，合适的标记包括放射性同位素诸如钡或铯，它们发射可检测的辐射但不明显伤害受治疗者。对NMR和ESR合适的标记包括可检测的特征自旋的标记，诸如氘，其可通过标记经改造的细胞系(或细菌或酵母菌株)的营养物质而掺入清蛋白融合蛋白。

此外，可施用其存在可被检测的本发明的清蛋白融合蛋白。例如，可施用以射线不透性或其它合适的化合物标记的本发明的清蛋白融合蛋白并如上述对标记的抗体讨论的，使其可在体内可见。进一步地，这样的多肽可用于体外诊断方案。

将已用合适的可检测的成像部分诸如放射性同位素(例如，¹³¹I、¹¹²In、^99mTc)、射线不透性物质、或可由核磁共振检测的材料标记的多肽-特异性抗体或抗体片段引入(例如，肠胃外、皮下或腹膜内地)待检查疾患的哺乳动物。应理解，本领域中受治疗者的体格和所用成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况，对于人受治疗者，注射的放射性的量通常将为从约5至20毫居^99mTc。标记的清蛋白融合蛋白随后将优先在体内含有结合于本发明的清蛋白融合蛋白、由本发明的清蛋白融合蛋白结合、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽或其它物质的位置处积累。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等，″Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments(免疫标记抗体和其片段的免疫药代动力学)″(Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer(肿瘤成像：放射化学检测癌症)的第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，MassonPublishing Inc.(1982))。

其中能够可检测地标记本发明的清蛋白融合蛋白的方式之一是通过将其连接于报告酶并在酶免疫测定法(EIA)中使用该连接产物(Voller，A.，″TheEnzyme Linked Immunosorbent Assay(酶联免疫吸附测定法)(ELISA)″，1978，Diagnostic Horizons 2：1-7，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，MD)；Voller等，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(编辑)，1980，EnzymeImmunoassay(酶的免疫测定法)，CRC Press，Boca Raton，FL，；Ishikawa，E.等，(编辑)，1981，Enzyme Immunoassay(酶的免疫测定法)，Kgaku Shoin，Tokyo)。结合于抗体的报告酶将与合适的底物例如生色底物反应，反应的方式是产生例如，由分光光度计、荧光或由可视方法可检测的化学部分。可用于可检测地标记抗体的报告酶包括但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过采用报告酶的生色底物的比色分析方法进行检测。也可通过视觉上与类似地制备的标准品比较底物的酶促反应程度来进行检测。

清蛋白融合蛋白也可被放射标记并用于多种其它免疫检测中的任一种。例如，通过放射性标记清蛋白融合蛋白，有可能在放射免疫测定法(RIA)(见于例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays(放射免疫测定法原理)，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques(放射性配体测定技术的第七次培训课程)，The Endocrine Society，March，1986，其在此通过引用并入)中使用该清蛋白融合蛋白。可以用以下方式检测放射活性同位素，包括但不限于γ计数器、闪烁计数器、或放射自显影。

此外，螯合剂分子是本领域已知的并可用于标记清蛋白融合蛋白。可将螯合剂分子附接于本发明的清蛋白融合蛋白以便于用包括放射性核素的金属离子或荧光标记来标记所述蛋白。例如，见于Subramanian，R.和Meares，C.F.，″Bifunctional Chelating Agents for Radiometal-labeled monoclonalAntibodies(用于放射性金属标记的单克隆抗体的双功能螯合剂)，″CancerImaging with Radiolabeled Antibodies(使用放射标记的癌症成像)(D.M.Goldenberg编辑)Kluwer Academic Publications，Boston；Saji，H.，″Targeteddelivery of radiolabeled imaging and therapeutic agents：bifunctionalradiopharmaceuticals(靶向递送放射标记的成像和治疗剂：双功能的放射性药物).″Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.16：209-244(1999)；Srivastava S.C.和Mease R.C.，″Progress in research on ligands，nuclides and techniques forlabeling monoclonal antibodies(标记单克隆抗体的配体、核素和技术的研究进展).″Int.J.Rad.Appl.Instrum.B18：589-603(1991)；和Liu，S.和Edwards，D.S.，″Bifunctional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals(用于治疗性镧系放射性药物的双功能螯合剂).″Bioconjug.Chem.12：7-34(2001)。可共价结合于所述清蛋白融合蛋白的任何螯合剂可根据本发明使用。该螯合剂可进一步包含将螯合部分与清蛋白融合蛋白连接的接头部分。

在一个实施方式中，将本发明的清蛋白融合蛋白附接于非环的螯合剂诸如二乙烯三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(DPTA)、DPTA类似物和DPTA衍生物。作为非限制性例子，螯合剂可为2-(对异硫氰基苄基)-6-甲基二乙烯三胺五乙酸(1B4M-DPTA，还称为MX-DTPA)、2-甲基-6-(ρ-硝基苄基)-1，4，7-三氮杂庚烷-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(硝基-1B4M-DTPA或硝基-MX-DTPA)；2-(对异硫氰基苄基)-环己基二乙烯三胺五乙酸(CHX-DTPA)、或N-[2-氨基-3-(ρ-硝基苯基)丙基]-反式-环己烷-1，2-二胺-N，N′，N″-五乙酸(硝基-CHX-A-DTPA)。

在另一实施方式中，将本发明的清蛋白融合蛋白附接于非环的三联吡啶螯合剂诸如6，6″-双[[N，N，N″，N″-四(羧基甲基)氨基]甲基]-4′-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2，2′：6′，2″-三联吡啶(TMT-胺)。

在特定实施方式中，附接于本发明的清蛋白融合蛋白的大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N″，N′″-四乙酸(DOTA)。在其它特定实施方式中，将DOTA藉由接头分子附接于本发明的清蛋白融合蛋白。可用于将DOTA缀合于多肽的接头分子的例子是本领域通常已知的-见于例如，DeNardo等，Clin.Cancer Res.4(10)：2483-90，1998；Peterson等，Bioconjug.Chem.70(4)：553-7，1999；和Zimmerman等，Nucl Med.Biol.26(8)：943-50，1999，其在此以其整体通过引用并入。此外，美国专利第5,652,361和5,756,065号公开了可缀合于抗体的螯合剂和制备和使用它们的方法，在此以其整体通过引用并入。尽管美国专利第5,652,361和5,756,065号重点在于将螯合剂与抗体缀合，但本领域技术人员可易于修改所公开的方法以将螯合剂与其它多肽缀合。

可采用基于大环配体的双功能螯合剂，其中缀合是藉由连接于配体的碳主链的活化的臂或功能基团，如以下所述的：M.Moi等，J.Amer.Chem.Soc.49：2639(1989)(2-对硝基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸)；S.V.Deshpande等，J.Nucl.Med.31：413(1990)；G.Ruser等，Bioconj.Chem.1：345(1990)；C.J.Broan等，J.C.S.Chem.Comm.23：1739(1990)；和C.J.Anderson等，J.Nucl Med.36：850(1995)。

在一个实施方式中，将大环螯合剂诸如任选含有一个或多个羧基、氨基、氧肟酸酯、膦酸酯或磷酸根基团的聚氮杂大环螯合剂附接于本发明的清蛋白融合蛋白。在另一实施方式中，该螯合剂是选自下组的螯合剂：DOTA、DOTA类似物、和DOTA衍生物。

在一个实施方式中，可附接于本发明的清蛋白融合蛋白的合适的螯合剂分子包含DOXA(1-氧杂-4，7，10-三氮杂环十二烷三乙酸)、NOTA(1，4，7-三氮杂环壬烷三乙酸)、TETA(1，4，8，11-四氮杂环十四烷四乙酸)、和THT(4′-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6″-双(N′，N′-二羧基甲基-N-甲基肼)-2，2′：6′，2″-三联吡啶)、和其类似物和衍生物。见于如，Ohmono等，J.Med.Chem.35：157-162(1992)；Kung等，J.Nucl.Med.25：326-332(1984)；Jurisson等，Chem.Rev.93：1137-1156(1993)；和美国专利第5,367,080号。其它合适的螯合剂包含公开于美国专利第4,647,447；4,687,659；4,885,363号；EP-A-71564；WO89/00557；和EP-A-232751的螯合剂。

在另一实施方式中，本发明中可使用的合适的大环羧酸螯合剂包括1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″N′″-四乙酸(DOTA)；1，4，8，12-四氮杂环十五烷-N，N′，N″N′″-四乙酸(15N4)；1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(9N3)；1，5，9-三氮杂环十二烷-N，N′，N″-三乙酸(12N3)；和6-溴乙酰氨基-苄基-1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″N′″-四乙酸(BAT)。

可附接于本发明的清蛋白融合蛋白的示例性螯合剂是α-(5-异硫氰基-2-甲氧基苯基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸，还称为MeO-DOTA-NCS。也可使用α-(5-异硫氰基-2-甲氧基苯基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸的盐或酯。

共价附接如所述的螯合剂的本发明的清蛋白融合蛋白可以用适合用于治疗、诊断、或治疗和诊断两种目的的放射性核素标记(经螯合剂的配位位点)。合适的金属的例子包括Ag、At、Au、Bi、Cu、Ga、Ho、In、Lu、Pb、Pd、Pm、Pr、Rb、Re、Rh、Sc、Sr、Tc、Tl、Y和Yb。用于诊断目的的放射性核素的例子是Fe、Gd、¹¹¹In、⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。在另一实施方式中，用于诊断目的的放射性核素是¹¹¹In或⁶⁷Ga。用于治疗目的的放射性核素的例子是¹⁶⁶Ho、¹⁶⁵Dy、⁹⁰Y、^115mIn、⁵²Fe或⁷²Ga。在一个实施方式中，用于诊断目的的放射性核素是¹⁶⁶Ho或⁹⁰Y。用于治疗和诊断两种目的的放射性核素的例子包含¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁷⁵Yb或⁴⁷Sc。在一个实施方式中，放射性核素是¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁷⁵Yb或¹⁵⁹Gd。

示例性金属放射性核素包括⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、⁴⁷Sc、⁶⁷Ga、⁵¹Cr、^177mSn、⁶⁷Cu、¹⁶⁷Tm、⁹⁷Ru、¹⁸⁸Re、¹⁷⁷Lu、¹⁹⁹Au、⁴⁷Sc、⁶⁷Ga、⁵¹Cr、^177mSn、⁶⁷Cu、¹⁶⁷Tm、⁹⁵Ru、¹⁸⁸Re、¹⁷⁷Lu、¹⁹⁹Au、²⁰³Pb和¹⁴¹Ce。

在特定实施方式中，共价附接螯合剂的本发明的清蛋白融合蛋白可以用选自下组的金属离子标记：⁹⁰Y、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho、²¹⁵Bi和²²⁵Ac。

而且，γ-发射放射性核素诸如^99mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga和¹⁶⁹Yb已被批准用于诊断成像或正研究用于诊断成像，而β-发射体诸如⁶⁷Cu、¹¹¹Ag、¹⁸⁶Re和⁹⁰Y可用于肿瘤治疗的应用。可用的其它放射性核素还包括γ-发射体，诸如^99mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga和¹⁶⁹Yb，和β-发射体，诸如⁶⁷Cu、¹¹¹Ag、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和⁹⁰Y，以及其它所关注的放射性核素诸如²¹¹At、²¹²Bi、¹⁷⁷Lu、⁸⁶Rb、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、¹⁹⁸Au、¹⁴⁹Pm、⁸⁵Sr、¹⁴²Pr、²¹⁴Pb、¹⁰⁹Pd、¹⁶⁶Ho、²⁰⁸Tl和⁴⁴Sc。共价附接螯合剂的本发明的清蛋白融合蛋白可以用如上所述的放射性核素标记。

在另一实施方式中，共价附接螯合剂的本发明的清蛋白融合蛋白可以用顺磁性金属离子标记，该顺磁性金属离子包括过渡金属和镧系金属的离子，诸如具有21-29、42、43、44或57-71的原子序的金属，尤其是Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。用于核磁共振成像的组合物中使用的顺磁性金属包括具有22至29、42、44和58-70的原子序的元素。

在另一实施方式中，共价附接螯合剂的本发明的清蛋白融合蛋白可以用包括镧系的荧光金属离子标记，尤其是La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu(如，¹⁵²Eu)、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。

在另一实施方式中，共价附接螯合剂的本发明的清蛋白融合蛋白可以用含有重金属(可包括Mo、Bi、Si和W原子)的报告分子标记。

还有可能以荧光化合物标记清蛋白融合蛋白。当荧光标记的抗体暴露于合适波长的光时，随后可由于荧光检测到它的存在。最常用的荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。

还可使用荧光发射金属诸如¹⁵²Eu或镧系其它金属可检测地标记清蛋白融合蛋白。使用这样的金属螯合基团如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)，可将这些金属附接于抗体。

清蛋白融合蛋白还可通过将其偶联于化学发光化合物而可检测地标记。随后化学发光-标记的清蛋白融合蛋白的存在通过检测化学反应过程中产生的发光的存在而确定。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

类似地，生物发光化合物可用于标记本发明的清蛋白融合蛋白。生物发光是一类见于生物系统的化学发光，其中催化性蛋白增加化学发光反应的效率。由检测发光的存在而确定生物发光蛋白的存在。以标记为目的的重要生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。

转基因生物体

表达本发明的清蛋白融合蛋白的转基因生物体也包括在本发明中。转基因生物体是已向其中转移重组、外源或克隆的遗传材料的经遗传修饰的生物体。这种遗传材料常称为转基因。转基因的核酸序列可包括一种或多种转录调控序列和其它核酸序列诸如内含子，这对优化表达和分泌编码的蛋白质可能为必需的。可设计转基因以指引编码的蛋白质以便于从生物体或从生物体产生的产物中回收的方式表达，如从生物体的乳、血液、尿、卵、毛发或种。转基因可由以下组成：衍生自与目标动物的物种相同或不同的物种的基因组的核酸序列。转基因可被整合在特定核酸序列通常不出现的基因组位点或转基因的正常位点。

术语″生殖细胞系转基因生物体″指其中遗传改变或遗传信息已引入生殖系细胞，从而赋予转基因生物体将遗传信息转移到后代的能力的转基因生物体。如果这些后代实际上具有一些或全部的所述改变或遗传信息，那么这些后代也是转基因生物体。所述改变或遗传信息对接受者所属的生物体物种可为外源的，仅对特定个体接受者为外源的，或可为接受者已具有的遗传信息。在最后一种情形中，改变的或引入的基因可与天然基因以不同方式表达。

转基因生物体可为转基因动物或转基因植物。转基因动物可由多种不同方法制备，包含转染、电穿孔、显微注射、胚胎干细胞中的基因寻靶和重组病毒和逆转录病毒感染(见于如，美国专利第4,736,866号；美国专利第5,602,307号；Mullins等(1993)Hypertension 22(4)：630-633；Brenin等(1997)Surg.Oncol.6(2)99-110；Tuan(编辑)，Recombinant Gene Expression Protocols，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法，重组基因表达方案)No.62，Humana Press(1997))。将核酸片段引入重组感受态哺乳动物细胞的方法可为任何有利于共转化多种核酸分子的方法。产生转基因动物的详细方案是本领域技术人员易于获得的，包括美国专利第5,489,743号和美国专利第5,602,307号中的公开。

已制备了大量重组或转基因小鼠，包括表达活化的癌基因序列的小鼠(美国专利第4,736,866号)；表达猿猴SV40 T-抗原的小鼠(美国专利第5,728,915号)；缺少干扰素调控因子1(IRF-1)表达的小鼠(美国专利第5,731,490号)；表现多巴胺能功能障碍的小鼠(美国专利第5,723,719号)；表达至少一种参与血压控制的人基因的小鼠(美国专利第5,731,489号)；与天然存在的阿尔茨海默病中存在的情况表现极大相似性的小鼠(美国专利第5,720,936号)；介导细胞粘附的能力降低的小鼠(美国专利第5,602,307号)；具有牛生长激素基因的小鼠(Clutter等(1996)Genetics 143(4)：1753-1760)；或能够产生完全人抗体应答的小鼠(McCarthy(1997)The Lancet 349(9049)：405)。

尽管小鼠和大鼠仍是大多数转基因实验所选的动物，但在一些情况优选或甚至必须使用替代的动物物种。转基因方案已成功地用于多种非鼠动物，包括绵羊、山羊、猪、犬、猫、猴、黑猩猩、仓鼠、兔、牛和豚鼠(见于如，Kim等(1997)Mol.Reprod.Dev.46(4)：515-526；Houdebine(1995)Reprod.Nutr.Dev.35(6)：609-617；Peters(1994)Reprod.Fertil.Dev.6(5)：643-645；Schnieke等(1997)Science 278(5346)：2130-2133；和Amoah(1997)J.AnimalScience 75(2)：578-585)。

为了指引转基因-编码的本发明的蛋白质分泌到转基因哺乳动物的乳中，可将其置于优先在乳腺上皮细胞活化的启动子控制下。可使用控制编码乳蛋白的基因的启动子，例如酪蛋白、β乳球蛋白、乳清酸性蛋白、或乳清蛋白的启动子(见于如，DiTullio(1992)Biotechnology 10：74-77；Clark等(1989)Biotechnology 7：487-492；Gorton等(1987)Biotechnology 5：1183-1187；和Soulier等(1992)FEBS Letts.297：13)。所选的转基因哺乳动物将产生大量乳并具有长的泌乳期，例如山羊、牛、骆驼或绵羊。

本发明的清蛋白融合蛋白还可在转基因植物中表达，如其中将DNA转基因插入核或质体基因组的植物。用于将外源核酸引入植物细胞或原生质体的植物转化方案是本领域已知的。通常见于Methods in Enzymology(酶学方法)第153卷(″Recombinant DNA Part D(重组DNA第D部分)″)1987，Wu和Grossman编辑，Academic Press和欧洲专利申请EP 693554。产生遗传工程改造的植物的方法进一步描述于美国专利第5,283,184号、美国专利第5,482,852号和欧洲专利申请EP 693554，其均在此通过引用并入。

药物或治疗组合物

本发明的清蛋白融合蛋白或其制剂可由任何常规方法施用，包括肠胃外(如皮下或肌内)注射或静脉内输注。治疗可由单剂量或持续一段时间的多个剂量组成。

尽管可能单独施用本发明的清蛋白融合蛋白，但其也可与一种或多种可接受的载体一起呈现为药物制剂。载体必须是″可接受的″意为与清蛋白融合蛋白相容且对其接受者无害。通常，载体是无菌和无热原的水或盐水。本发明的清蛋白融合蛋白尤其适合于在含水载体诸如无菌无热原水、盐水或其它等渗溶液中的制剂，因为它们在溶液中的贮存期限延长。例如，本发明的药物组合物可在配药之前例如数周或数月或更长时间及早(well in advance)配制为含水形式。

例如，制备含有清蛋白融合蛋白的制剂时可考虑到清蛋白融合蛋白在含水制剂中延长的贮存期限。如上讨论的，许多这些治疗性蛋白在融合于HA后贮存期限显著增加或延长。

在适合施用气溶胶的情形中，可使用标准方案将本发明的清蛋白融合蛋白配制为气溶胶。术语″气溶胶″包含本发明的清蛋白融合蛋白的任何气载悬浮相，其能够被吸入到细支气管或鼻道。具体地，气溶胶包含本发明的清蛋白融合蛋白的微滴的气载悬浮液，如可在计量的剂量吸入器或喷散器(nebulizer)中或在喷雾器(mist sprayer)中制备。气溶胶还包含本发明的化合物悬浮于空气或其它媒介气体(carrier gas)中的干粉组合物，可从例如吸入器设备通过吹入递送。见于Ganderton & Jones，Drug Delivery to the RespiratoryTract(递送药物至呼吸道)，Ellis Horwood(1987)；Gonda(1990)CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems(治疗药物载体系统的关键综述)6：273-313；和Raeburn等，.(1992)Pharmacol.Toxicol.Methods 27：143-159。

本发明的制剂还通常是非免疫原性的，部分是由于使用的清蛋白融合蛋白的成分衍生自适当物种。例如，对于人类使用，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白和清蛋白部分将通常是人的。在其中任一组分是非人类-衍生的一些情形中，则可通过取代关键氨基酸使该组分人源化从而使表现于人免疫系统的具体表位在性质上是人的而不是外源的。

制剂可方便地以单位剂量形式呈现并可由药学领域熟知任何方法制备。这些方法包含将清蛋白融合蛋白与构成一种或多种附加成分的载体联合(association)的步骤。通常通过均匀地和紧密地将活性成分与液体载体或精细的固态载体或两者联合然后如果需要的话使产物成型而制备制剂。

适合肠胃外施用的制剂包含可含有使得制剂适合预期接受者的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质的含水和非-含水无菌注射溶液，和可包含悬浮剂和增稠剂的含水和非-含水无菌悬浮液。该制剂可呈现在单位-剂量或多-剂量容器中，例如密封安瓿、小瓶或注射器，并可贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在即将使用前添加无菌液体载体，例如注射用水。即时注射溶液和悬浮液可从无菌粉末制备。由于本发明的许多清蛋白融合蛋白显示延长的血清半衰期，剂量制剂与治疗性蛋白的未融合的标准制剂相比可以较低摩尔浓度或较低剂量含有治疗性蛋白部分。

作为一个例子，当本发明的清蛋白融合蛋白包括列在表1的″治疗性蛋白：X″列的一种蛋白作为一个或多个治疗性蛋白区时，可基于清蛋白融合蛋白的效价(potency)相对于单独治疗性蛋白的效价来计算剂量形式，同时考虑到清蛋白融合蛋白与天然治疗性蛋白相比血清半衰期和贮存期限延长。例如，如果治疗性蛋白通常以0.3至30.0IU/kg/周或0.9至12.0IU/kg/周分成三个或七个剂量施用一年或更长。对于由融合于治疗性(therpeutic)蛋白的全长HA组成的清蛋白融合蛋白，以单位表示的等价剂量将代表更大重量的药剂但可减少剂量频率，例如减少到每周两次、每周一次或更少。

本发明的制剂或组合物可与指出清蛋白融合蛋白组分的延长的贮存期限的说明书或包装插入物一起包装，或一起包含在套盒中。例如，这种说明书或包装插入物可指明推荐的贮存条件，诸如时间、温度和光照，考虑到本发明的清蛋白融合蛋白的贮存期限延伸或延长。这种说明书或包装插入物也可指明本发明的清蛋白融合蛋白的具体优势，诸如便于贮存制剂，所述制剂需要在控制的医院、诊所或办公室条件以外的场地中使用。如上所述，本发明的制剂可为含水形式并可贮存在低于理想环境下而不显著失去治疗活性。

本发明的清蛋白融合蛋白还可包含在营养药品(netraceuticals)中。例如，本发明的一些清蛋白融合蛋白可以以天然产物施用，包含从表达清蛋白融合蛋白的转基因哺乳动物获得的乳或乳产物。这种组合物还可包含从表达清蛋白融合蛋白的转基因植物获得的植物或植物产物。清蛋白融合蛋白还可以以含有或不含有其它已知添加剂、载体、填充剂和稀释剂的粉末或片剂形式提供。营养药品(netraceuticals)描述于Scott Hegenhart，Food Product Design(食物产品设计)，1993年12月。

本发明还提供治疗和/或预防疾病或疾患(诸如例如，本文公开的任何一种或多种疾病或疾患)的方法，通过向受治疗者施用在药学可接受的载体中的有效量的本发明的清蛋白融合蛋白或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸(″清蛋白融合多核苷酸″)。

清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸将以与良好的医疗实践一致的方式配制和剂量给药，考虑到个体患者的临床情况(尤其是仅以清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸治疗的副作用)、递送部位、施用方法、施用日程和医师已知的其它因素。因此本文目的的″有效量″是由这些考虑而确定的。

作为总的建议，肠胃外施用清蛋白融合蛋白的每剂量总药物有效量在患者体重的约1ug/kg/天至10mg/kg/天的范围，尽管如上所述，这将接受治疗判断。在一个实施方式中，该剂量是至少0.01mg/kg/天，和在另一实施方式中，对人类，对于激素是约0.01至1mg/kg/天。如果持续给药，通常以约1ug/kg/小时至约50ug/kg/小时的剂量率施用清蛋白融合蛋白，每天注射1-4次或持续皮下输注，例如使用微型泵。也可采用静脉内包(bag)溶液。观察到变化所需的治疗长度和治疗后发生响应所需的时间间隔表现出取决于期望的效应而变化。

如上所述，本发明的清蛋白融合蛋白与单独的治疗性蛋白部分(或其片段或变体)相比具有更高血浆稳定性。当确定每剂量待施用的清蛋白融合蛋白的有效量和给药施用日程时应考虑到血浆稳定性的这种增加。尤其是，更高血浆稳定性可允许以相同施用频率以较低剂量施用清蛋白融合蛋白，或可选地可允许以较少给药施用清蛋白融合蛋白。更高稳定性可允许以较少给药较不经常地施用本发明的清蛋白融合蛋白。在一个实施方式中，可每两周一次施用清蛋白融合蛋白。在另一实施方式中，取决于清蛋白融合蛋白的药代动力学，可每三周一次、每四周一次、每五周一次、或更多周一次施用清蛋白融合蛋白。例如，如上讨论的，IFN-α-HSA融合蛋白的药代动力学支持每2-4周一次或更多周一次的给药方案、和甚至以4周或超过每4周的时间间隔给药。

每剂量待施用的清蛋白融合蛋白的治疗有效量还可表示为提供的每剂量的总配制清蛋白融合蛋白浓度。在一个实施方式中，每剂量施用于患者的总配制清蛋白融合蛋白浓度在约10ug/剂至约2400ug/剂的范围。在一个实施方式中，总浓度在约100ug/剂至约1000ug/剂，或可选地，约1000ug/剂至约1200ug/剂或约900ug/剂至约1800ug/剂的范围。

在具体的实施方式中，本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度给药。在其它实施方式中，本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)以约900ug/剂至约2400ug/剂、约900ug/剂至约2100ug/剂、约900ug/剂至约2000ug/剂、约900ug/剂至约1200ug/剂、约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度给药和在另一其它实施方式中，以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度给药。在另外的实施方式中，本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)以600ug/剂、720ug/剂、800ug/剂、900ug/剂、1000ug/剂、1200ug/剂、1500ug/剂、1800ug/剂、2000ug/剂、2100ug/剂或2400ug/剂的总配制浓度给药。在另外的实施方式中，总配制剂量的本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)单独使用或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用。在另外的实施方式中，总配制剂量的本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用。

在另外的实施方式中，施用总配制浓度的本发明IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)以治疗感染HCV的患者。在具体的实施方式中，单独或与有效量的抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的患有HCV的患者。在另外的实施方式中，单独或与有效量的抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以约900ug/剂至约2400ug/剂、约900ug/剂至约2100ug/剂、约900ug/剂至约2000ug/剂、约900ug/剂至约1200ug/剂、约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度和在另一进一步实施方式以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的患有HCV的患者。在另外的实施方式中，单独或与有效量的抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以600ug/剂、720ug/剂、800ug/剂、900ug/剂、1000ug/剂、1200ug/剂、1500ug/剂、1800ug/剂、2000ug/剂、2100ug/剂或2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的患有HCV的患者。

在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用总配制浓度的本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于未经治疗的患有HCV的患者。在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以约900ug/剂至约2400ug/剂、约900ug/剂至约2100ug/剂、约900ug/剂至约2000ug/剂、约900ug/剂至约1200ug/剂、约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度和在进一步的实施方式以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的患有HCV的患者。在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以600ug/剂、720ug/剂、800ug/剂、900ug/剂、1000ug/剂、1200ug/剂、1500ug/剂、1800ug/剂、2000ug/剂、2100ug/剂或2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的患有HCV的患者。

在另外的实施方式中，单独或与有效量的抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的患有HCV的患者。在其它实施方式中，单独或与有效量的抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以约900ug/剂至约2400ug/剂、约900ug/剂至约2100ug/剂、约900ug/剂至约2000ug/剂、约900ug/剂至约1200ug/剂、约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度和在其它实施方式以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的患有HCV的患者。在另外的实施方式中，单独或与有效量的抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以600ug/剂、720ug/剂、800ug/剂、900ug/剂、1000ug/剂、1200ug/剂、1500ug/剂、1800ug/剂、2000ug/剂、2100ug/剂或2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的患有HCV的患者。

在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的患有HCV的患者。在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以约900ug/剂至约2400ug/剂、900ug/剂至约2100ug/剂、约900ug/剂至约2000ug/剂、约900ug/剂至约1200ug/剂、约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度和在另外的实施方式以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的患有HCV的患者。在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合以600ug/剂、720ug/剂、800ug/剂、900ug/剂、1000ug/剂、1200ug/剂、1500ug/剂、1800ug/剂、2000ug/剂、2100ug/剂或2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的患有HCV的患者。

清蛋白融合蛋白的总配制浓度和其中施用清蛋白融合蛋白的给药间隔将取决于期望的效果和施用的特定治疗性蛋白而改变。在一个实施方式中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或更多周一次每剂量施用于患者的总配制的清蛋白融合蛋白浓度在约10ug/剂至约2400ug/剂的范围。在另一实施方式中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或更多周一次的总浓度在约100ug/剂至约1000ug/剂的范围，或可选地，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或更多周一次的总浓度为约1000ug/剂至约1200ug/剂或约900ug/剂至约1800ug/剂。

在具体的实施方式中，每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)。在另外的实施方式中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2100ug/剂的总配制浓度，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度；和在另一实施方式中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约1200ug/剂至1800ug/剂的总配制浓度给药本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)。在另外的实施方式中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以800ug/剂的总配制浓度，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以900ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1500ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1800ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2000ug/剂的总配制浓度，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2100ug/剂的总配制浓度，或每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)。在更多实施方式中，每两周一次以900ug/剂的总配制浓度，和在进一步的实施方式每两周一次以1200ug/剂的总浓度、每四周一次以1200ug/剂的总浓度或每四周一次以1800ug/剂的总浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)。在另外的实施方式中，单独或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用总配制剂量的本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)。在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用总配制剂量的本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)。

在具体的实施方式中，单独或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。在另外的实施方式中，单独或与抗病毒化合物，包括诸如利巴韦林组合每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2100ug/剂的总配制浓度，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次约900ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度；和在其它实施方式中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。在另外的实施方式中，单独或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以800ug/剂的总配制浓度，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以900ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1500ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1800ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2100ug/剂的总配制浓度；或每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。

在具体的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。在另外的实施方式中，与一种或多种抗病毒化合物，包括例如，利巴韦林组合与一种、两种、三种或更多种抗病毒化合物，包含例如，利巴韦林和任选另一种抗病毒化合物组合每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2100ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度；和在进一步实施方式中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以800ug/剂的总配制浓度、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以900ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1500ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1800ug/剂的总配制浓度；或每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2100ug/剂的总配制浓度；或每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。

在另外的实施方式中，单独或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每两周一次以900ug/剂的总配制浓度，和在另外的实施方式中，每两周一次以1200ug/剂的总浓度、每四周一次以1200ug/剂的总浓度、或每四周一次以1800ug/剂的总浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每两周一次以900ug/剂的总配制浓度，和在另外的实施方式中，每两周一次以1200ug/剂的总浓度、每四周一次以1200ug/剂的总浓度、或每四周一次以1800ug/剂的总浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。

在另一实施方式中，每两周一次以900ug/剂的总配制浓度持续至少24周，和在其它实施方式中，每两周一次以1200ug/剂的总浓度持续至少24周、每四周一次以1200ug/剂的总浓度持续至少24周、或每四周一次以1800ug/剂的总浓度持续至少24周施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一个实施方式中，未经治疗的HCV患者感染了HCV基因型2或3。在另外的实施方式中，每两周一次以900ug/剂的总配制浓度持续至少48周，和在另一实施方式中，每两周一次以1200ug/剂的总浓度持续至少48周、每四周一次以1200ug/剂的总浓度持续至少48周、或每四周一次以1800ug/剂的总浓度持续至少48周施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一个实施方式中，未经治疗的HCV患者感染了HCV基因型1。

如前所述的，在治疗第4周的快速病毒学响应(RVR)已被鉴定为持续病毒学应答(SVR)的阳性预示信号。而且，直到治疗的第12周维持HCV RNA阴性已被建立为SVR的进一步阳性预示信号。总之，在第4周达到HCV RNA阴性和直到第12周维持这种阴性的患者可能在完成治疗方案后维持HCVRNA阴性。因此，需要将在以IFN-α-HSA单独或与至少一种、两种、三种或四种抗病毒剂诸如利巴韦林组合治疗后的第4周达到HCV RNA阴性并直到第12周维持这种阴性的HCV患者的数目最大化。因此在另外的实施方式中，以每两周一次和每四周一次的组合以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。在其它实施方式中，以每两周一次和每四周一次的组合以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以约900ug/剂至约2100ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以约900ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以约900ug/剂至约1200ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度；和在另外的实施方式中，以每两周一次和每四周一次的组合以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。

在另外的实施方式中，以每两周一次和每四周一次的组合以约600ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以800ug/剂的总配制浓度、以每两周一次和每四周一次的组合以900ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1000ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1200ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1500ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1600ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1800ug/剂；以每两周一次和每四周一次的组合以2000ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以2100ug/剂的总配制浓度；或以每两周一次和每四周一次的组合以2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种或四种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一些实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于未经治疗的感染基因型1的HCV患者持续至少24周，和在其它实施方式中，持续至少48周。在另外的实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于未经治疗的感染基因型2或3的HCV患者持续24周。

在一个实施方式中，在治疗方案开始时每两周一次以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者两次，随后在治疗的剩余时间每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗。在具体的实施方式中，在治疗方案开始时每两周一次以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者两次，随后在治疗的剩余时间每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗。在另外的实施方式中，在治疗方案开始时每两周一次以约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者两次，随后在治疗的剩余时间每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一些实施方式中，一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于未经治疗的感染基因型1的HCV患者持续至少24周，和在一个实施方式中，持续至少48周。在另外的实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于未经治疗的感染基因型2或3的HCV患者持续24周。

在另外的实施方式中，在治疗方案开始时每两周一次以约600ug/剂、800ug/剂、900ug/剂、1000ug/剂、1200ug/剂、1500ug/剂、1600ug/剂、1800ug/剂、2000ug/剂、2100ug/剂或2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于未经治疗的HCV患者两次，随后在治疗的剩余时间每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一个实施方式中，本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的总配制浓度是1200ug/剂或1800ug/剂。在另外的实施方式中，与一种、两种、三种或四种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于未经治疗的感染基因型1的HCV患者持续至少24周，和在另一实施方式中，持续至少48周。在另外的实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于未经治疗的感染基因型2或3的HCV患者持续24周。

在另外的具体实施方式中，单独或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约90ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。在另外的实施方式中，单独或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2100ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度；和在其它实施方式中，每周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次或在另一实施方式中，每两周一次以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度，施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。在另外的实施方式中，单独或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以800ug/剂的总配制浓度、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以900ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1500ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1800ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2100ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。

在更具体的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约90ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。在一些实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2100ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约900ug/剂至约1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度；和在其它实施方式中，每周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次或在另一些其它实施方式每两周一次以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度，施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。在另外的实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以约600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以800ug/剂的总配制浓度，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以900ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1200ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1500ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1600ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以1800ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2000ug/剂的总配制浓度；每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2100ug/剂的总配制浓度；或每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每五周一次以2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。

在一些实施方式中，单独或与抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每两周一次以900ug/剂的总配制浓度，和在一个实施方式中，每两周一次以1200ug/剂的总浓度、每四周一次以1200ug/剂的总浓度、或每四周一次以1800ug/剂的总浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。在其它实施方式中，与有效量的一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合每两周一次以900ug/剂的总配制浓度，和在另一个实施方式中每两周一次以1200ug/剂的总浓度、每四周一次以1200ug/剂的总浓度、或每四周一次以1800ug/剂的总浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。

在另一实施方式中，每两周一次以900ug/剂的总配制浓度持续至少24周，和在一些实施方式中，每两周一次以1200ug/剂的总浓度持续至少24周、每四周一次以1200ug/剂的总浓度持续至少24周、或每四周一次以1800ug/剂的总浓度持续至少24周施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一个实施方式中，经历过治疗的HCV患者感染了HCV基因型2或3。在另外的实施方式中，每两周一次以900ug/剂的总配制浓度持续至少48周，和在另一实施方式中，每两周一次以1200ug/剂的总浓度持续至少48周、每四周一次以1200ug/剂的总浓度持续至少48周、或每四周一次以1800ug/剂的总浓度持续至少48周施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一个实施方式中，经历过治疗的HCV患者感染了HCV基因型1。

如前所述的，在治疗第4周的快速病毒学响应(RVR)已被鉴定为持续病毒学应答(SVR)的阳性预示信号。而且，直到治疗的第12周维持HCV RNA阴性已被建立为SVR的进一步阳性预示信号。总之，在第4周达到HCV RNA阴性和直到第12周维持这种阴性的患者可能在完成治疗方案后维持HCVRNA阴性。因此，需要将在以IFN-α-HSA单独或与至少一种、两种、三种或四种抗病毒剂诸如利巴韦林组合治疗后的第4周达到HCV RNA阴性并直到第12周维持这种阴性的HCV患者的数目最大化。因此在另外的实施方式中，以每两周一次和每四周一次的组合以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。在一些实施方式中，以每两周一次和每四周一次的组合以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以约900ug/剂至约2100ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合约900ug/剂至约2000ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合约900ug/剂至约1200ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度；和在一些其它实施方式中，以每两周一次和每四周一次的组合以约1200ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。

在另外的实施方式中，以每两周一次和每四周一次的组合以约600ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以800ug/剂的总配制浓度、以每两周一次和每四周一次的组合以900ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1000ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1200ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1500ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1600ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以1800ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以2000ug/剂的总配制浓度；以每两周一次和每四周一次的组合以2100ug/剂的总配制浓度；或以每两周一次和每四周一次的组合以2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种或四种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一些实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于经历过治疗的感染基因型1的HCV患者持续至少24周，和在另外的实施方式中，持续至少48周。在另外的实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于经历过治疗的感染基因型2或3的HCV患者持续24周。

在一个实施方式中，在治疗方案开始时每两周一次以约90ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者两次，随后在治疗的剩余时间每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗。在一个实施方式中，在治疗方案开始时每两周一次以约900ug/剂至约2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者两次，随后在治疗的剩余时间每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗。在另外的实施方式中，在治疗方案开始时每两周一次以约900ug/剂至约1800ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者两次，随后在治疗的剩余时间每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在其它实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于经历过治疗的感染基因型1的HCV患者持续至少24周，和在另外的实施方式中，持续至少48周。在另外的实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于经历过治疗的感染基因型2或3的HCV患者持续24周。

在另外的实施方式中，在治疗方案开始时每两周一次以约600ug/剂、800ug/剂、900ug/剂、1000ug/剂、1200ug/剂、1500ug/剂、1600ug/剂、1800ug/剂、2000ug/剂、2100ug/剂或2400ug/剂的总配制浓度施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白(如，由CID 2249、2343、2366、2381、2382、2410、3165、3422、3423、3424、3476、3960、4290、4291、4292、4295或4296制备的)于经历过治疗的HCV患者两次，随后在治疗的剩余时间每四周一次以IFN-α-HSA融合体治疗。本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的所述施用是单独的或与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合。在一个实施方式中，本发明的IFN-α-HSA融合蛋白的总配制浓度是1200ug/剂或1800ug/剂。在另外的实施方式中，与一种、两种、三种或四种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于经历过治疗的感染基因型1的HCV患者持续至少24周，和在另一实施方式中，持续至少48周。在另外的实施方式中，与一种、两种、三种、四种或更多种抗病毒化合物诸如利巴韦林组合施用本发明的IFN-α-HSA融合蛋白于经历过治疗的感染基因型2或3的HCV患者持续24周。

清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部地(如以粉末、软膏、凝胶剂、滴剂或经皮贴片)、含服、或以口或鼻喷雾剂施用。″药学可接受的载体″指任何非毒性固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包封材料或配制助剂。本文所用的术语″肠胃外″指包含静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸还适合以缓释系统施用。缓释的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的例子以口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部地(如以粉末、软膏、凝胶剂、滴剂或经皮贴片)、含服、或以口或鼻喷雾剂施用。″药学可接受的载体″指任何类型的非毒性固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包封材料或配制助剂。本文所用的术语″肠胃外″指包含静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。缓释的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的其它例子包含合适的聚合材料(诸如例如，以成型物品形式的半透性聚合物基质如，膜或微胶囊)、合适的疏水材料(例如可接受的油中的乳液)或离子交换树脂和微溶的衍生物(诸如例如，微溶的盐)。

缓释的基质包含聚交酯(美国专利第3,773,919号、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers 22：547-556(1983))、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(ethylenevinyl acetate)(Langer等，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。

缓释的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸还包含脂质体包裹的本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸(见于通常，Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer(治疗感染性疾病和癌症中的脂质体)，Lopez-Berestein，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，New York，pp.317-327和353-365(1989))。由已知方法本身制备含有清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的脂质体：DE 3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请第83-118008号；美国专利第4,485,045和4,544,545号；和EP 102,324。通常，脂质体是小的(约200-800埃)单层型，其中脂质含量大于约30摩尔百分比胆固醇，为了最佳治疗调整所选的比例。

在另一其它实施方式中，以泵递送本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸(见于上述Langer；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。

其它控释系统讨论于Langer的综述(Science 249：1527-1533(1990))。

对于肠胃外施用，在一个实施方式中，清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一般通过将其以期望程度的纯度、以单位剂量注射形式(溶液、悬浮液或乳液)与药学可接受的载体混合而配制，药学可接受的载体即在采用的剂量和浓度对接受者非毒性并与制剂其它成分相容的载体。例如，制剂不包括已知对治疗有害的氧化剂和其它化合物。

通常通过将清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与液体载体或精细的固态载体或两者均匀而紧密地接触而制备制剂。随后如果需要的话，使产物成型为期望的制剂。示例性载体是肠胃外载体或与接受者血液等渗的溶液。这种载体赋形物的例子包含水、盐水、林格氏溶液、和右旋糖溶液。还可使用非含水赋形物诸如固定油和油酸乙酯以及脂质体。

载体适宜地含有少量的添加剂，诸如增强等渗性和化学稳定性的物质。这种材料以所采用的剂量和浓度对接受者是非毒性的，并包含缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸或其盐；抗氧化剂诸如抗坏血酸；低分子量(少于约十残基)多肽，如，聚精氨酸或三肽；蛋白，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包含纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖(manose)或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露醇或山梨醇；抗衡离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂诸如聚山梨醇酯(包括例如，Tween-20)、泊洛沙姆或PEG。

清蛋白融合蛋白通常在这种赋形物中以约0.1mg/ml至100mg/ml例如1-10mg/ml的浓度、以约3至8的pH配制。应理解使用前述一些赋形剂、载体或稳定剂将导致形成多肽盐。

用于治疗施用的任何药物可为无菌的。过滤通过无菌滤膜(如，0.2微米膜)而易于实现无菌。清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一般置于具有无菌进入口的容器中，例如，具有可由皮下注射的注射针头刺透的塞的静脉内溶液包或小瓶。

清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸通常贮存于单位或多-剂量容器例如密封安瓿或小瓶中，作为水性溶液或作为可重构的冻干制剂。作为冻干制剂的例子，向10-ml小瓶填充5ml无菌过滤的1％(w/v)清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸水溶液，并冻干所得的混合物。通过使用抑菌性注射用水重构冻干的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸而制备输注溶液。

在具体的实施方式中，清蛋白融合蛋白制剂包括0.01M磷酸钠、0.15mM氯化钠、0.16微摩尔辛酸钠/毫克融合蛋白、15微克/毫升聚山梨醇酯80，pH 7.2。在另一个具体实施方式中，清蛋白融合蛋白制剂由0.01M磷酸钠、0.15mM氯化钠、0.16微摩尔辛酸钠/毫克融合蛋白、15微克/毫升聚山梨醇酯80，pH 7.2组成。选择pH和缓冲液以匹配生理条件，并加入盐作为张力调节剂(tonicifier)。选择辛酸钠，由于报道其能增加蛋白在溶液中的热稳定性。最终加入聚山梨醇酯作为一般表面活性剂，它降低溶液的表面张力和降低清蛋白融合蛋白对容器闭合系统的非-特异性吸附。

本发明还提供包括填充有一种或多种本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的成分的一个或多个容器的药物包或套盒。这种容器可附带以管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映管理制造、使用或销售的机构对人类施用的批准。此外，清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可与其它治疗性化合物组合使用。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可单独或与佐剂组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的佐剂包括但不限于，明矾、明矾加脱氧胆酸盐(ImmunoAg)、MTP-PE(Biocine Corp.)、QS21(Genentech，Inc.)、BCG(如，

)、MPL和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)的灭活制品。在具体的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与明矾组合施用。在另一个具体实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与QS-21组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的进一步佐剂包括但不限于，单磷酰脂质免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐、MF-59和病毒体佐剂技术。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的疫苗包括但不限于，用于预防MMR(麻疹、腮腺炎、风疹)、脊髓灰质炎(polio)、水痘、破伤风/白喉(diphtheria)、甲型肝炎、乙型肝炎、B型流感嗜血杆菌、百日咳(whooping cough)、肺炎、流感、莱姆病、轮状病毒、霍乱、黄热病、日本脑炎、脊髓灰质炎(poliomyelitis)、狂犬病、伤寒和百日咳(pertussis)的疫苗。可相伴地，如，作为混合物，分别地但同时(simultaneously)或并行地(concurrently)；或顺序地施用组合。这包含其中组合的药剂作为治疗混合物一起施用的方案，还包括其中组合的药剂分别地但同时施用，如，经由不同的静脉内管进入同一个体的方案。″组合″施用进一步包含首先单独施用所给的化合物或药剂之一，随后施用第二种。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可单独或与其它治疗剂组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸药剂包括但不限于，化疗剂、抗生素、甾体和非甾体抗炎剂、常规免疫治疗剂和/或下述的治疗性治疗。可相伴地，如，作为混合物，分别地但同时或并行地(concurrently)；或顺序地施用组合。这包含其中组合的药剂作为治疗混合物一起施用的方案，还包括其中组合的药剂分别地但同时施用，如，经由不同的静脉内管进入同一个体的方案。″组合″施用进一步包含首先单独施用所给的化合物或药剂之一，随后施用第二种。

在一个实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗凝血剂组合施用。可与本发明的组合物一起施用的抗凝血剂包括但不限于，肝素、低分子量肝素、华法林钠(如，

)、双香豆素、4-羟基香豆素、茴茚二酮(如，MIRADON^TM)、醋硝香豆素类(如，醋硝香豆素、SINTHROME^TM)、二氢化茚-1，3-二酮、苯丙香豆素(如，MARCUMAR^TM)、双香豆乙酸乙酯(如，TROMEXAN^TM)和阿斯匹林。在具体的实施方式中，本发明的组合物与肝素和/或华法林组合施用。在另一个具体实施方式中，本发明的组合物与华法林组合施用。在另一个具体实施方式中，本发明的组合物与华法林和阿斯匹林组合施用。在另一个具体实施方式中，本发明的组合物与肝素组合施用。在另一个具体实施方式中，本发明的组合物与肝素和阿斯匹林组合施用。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与血栓溶解药物组合施用。可与本发明的组合物一起施用的血栓溶解药物包括但不限于，纤溶酶原、lys-纤溶酶原、α2-抗血纤维蛋白溶素、链激酶(streptokinae)(如，KABIKINASE^TM)、antiresplace(如，EMESfASE^TM)、组织纤溶酶原激活物(t-PA、altevase、ACTIVASE^TM)、尿激酶(如，ABBOKINASE^TM)、沙芦普酶(sauruplase)、(尿激酶原、单链尿激酶)、和氨基己酸(如，AMICAR^TM)。在具体的实施方式中，本发明的组合物与组织纤溶酶原激活物和阿斯匹林组合施用。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗血小板药物组合施用。可与本发明的组合物一起施用的抗血小板药物包括但不限于，阿斯匹林、双嘧达莫(如，PERSANTINE^TM)和噻氯匹定(如，TICLID^TM)。

在具体的实施方式中，预期与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合使用抗凝血剂、血栓溶解和/或抗血小板药物以预防、诊断和/或治疗血栓形成、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血栓栓塞、肺栓塞、动脉硬化、心肌梗死、短暂性缺血发作、不稳定心绞痛。在具体的实施方式中，预期与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合使用抗凝血剂、血栓溶解药物和/或抗血小板药物以预防隐静脉移植物阻塞(occulsion)，以降低血管成形术可能伴有的围手术期(periprocedural)血栓形成的风险，以降低患有包含非风湿性心房颤动的心房颤动患者中风的风险，以降低与人工心脏瓣和或二尖瓣疾病相关的栓塞风险。本发明治疗剂单独或与抗血小板剂、抗凝血剂和/或血栓溶解药物组合的其它治疗用途包括但不限于，防止身体外装置(如，血管内插管、血液透析患者的血管通路分流器、血液透析机和心肺分流机)的阻塞。

在一些实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗逆转录病毒剂、核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)、非-核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)和/或蛋白酶抑制剂(PI)组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的NRTI包括但不限于，RETROVIR^TM(齐多夫定/AZT)、VIDEX^TM(地达诺新/ddI)、HIVID^TM(扎西他滨/ddC)、ZERTT^TM(司他夫定/d4T)、EPIVIR^TM(拉米夫定/3TC)和COMBIVTR^TM(齐多夫定/拉米夫定)。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的NNRTI包括但不限于，VIRAMUNE^TM(奈韦拉平)、RESCRIPTOR^TM(地拉夫定)和SUSTIVA^TM(依法韦仑)。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的蛋白酶抑制剂包括但不限于，CRIXIVAN^TM(茚地那韦)、NORVIR^TM(利托那韦)、INVIRASE^TM(沙奎那韦)和VTRACEPT^TM(那非那韦)。在具体的实施方式中，抗逆转录病毒剂、核苷逆转录酶抑制剂、非-核苷逆转录酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂可以任何组合与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起使用以治疗AIDS和/或预防或治疗HIV感染。

其它NRTI包括洛德腺苷(LODENOSINE^TM)(F-ddA；一种酸稳定的腺苷NRTI；Triangle/Abbott；COVIRACIL^TM(恩曲他滨/FTC；结构上与拉米夫定(3TC)相关但具有3至10倍大的体外活性；Triangle/Abbott)；dOTC(BCH-10652，结构上也与拉米夫定相关，但对大致比例的拉米夫定抗性隔离群保持活性；Biochem Pharma)；阿德福韦(FDA拒绝批准用于抗-HIV治疗；Gilead Sciences)；

(阿德福韦二匹伏酯，阿德福韦的活性前药；其活性形式是PMEA-pp)；替诺福韦(TENOFOVIR^TM)(双-POC PMPA，PMPA前药；Gilead)；DAPD/DXG(DAPD的活性代谢物；Triangle/Abbott)；D-D4FC(与3TC相关，对AZT/3TC-抗性病毒有活性)；GW420867X(Glaxo Wellcome)；ZIAGEN^TM(阿巴卡韦/159U89；Glaxo Wellcome Inc.)；CS-87(3′叠氮基-2′，3′-双脱氧尿苷；WO 99/66936)；和β-L-FD4C和β-L-FddC的带有S-酰基-2-硫乙基(SATE)的前药形式(WO 98/17281)。

其它NNRTI包括COACTINON^TM(乙米韦林/MKC-442，HEPT类的强效NNRTI；Triangle/Abbott)；卡普韦林(CAPRAVIRINE^TM)(AG-1549/S-1153，下一代NNRTI，对含有K103N突变的病毒具有活性；Agouron)；PNU-142721(活性是其前驱物地拉夫定的20至50倍并对K103N突变体有活性；Pharmacia& Upjohn)；DPC-961和DPC-963(依法韦仑的第二代衍生物，设计为对具有K103N突变的病毒有活性；DuPont)；GW-420867X(活性比HBY097大25倍并对K103N突变体有活性；Glaxo Wellcome)；CALANOLIDE A(从橡胶树天然产生的药剂；对含有Y181C突变或K103N突变或两者的病毒有活性)；和蜂胶(WO 99/49830)。

其它蛋白酶抑制剂包括LOPINAVTR^TM(ABT378/r；Abbott Laboratories)；BMS-232632(氮杂肽；Bristol-Myres Squibb)；替拉那韦(TIPRANAVIR^TM)(PNU-140690，非肽类二氢吡喃酮；Pharmacia & Upjohn)；PD-178390(非肽类二氢吡喃酮；Parke-Davis)；BMS 232632(氮杂肽；Bristol-Myers Squibb)；L-756,423(茚地那韦类似物；Merck)；DMP-450(环状脲化合物；Avid &DuPont)；AG-1776(拟肽，对蛋白酶抑制剂抗性病毒具有体外活性；Agouron)；VX-175/GW-433908(安泼那韦的磷酸酯前药；Vertex & Glaxo Welcome)；CGP61755(Ciba)和AGENERASE^TM(安泼那韦；Glaxo Wellcome Inc.)。

其它抗逆转录病毒剂包括融合抑制剂/gp41结合剂。融合抑制剂/gp41结合剂包含T-20(来自HIV gp41跨膜蛋白外结构域的残基643-678的肽，其结合静止态的gp41并防止转化为融合态；Trimeris)和T-1249(第二代融合抑制剂；Trimeris)。

其它抗逆转录病毒剂包括融合抑制剂/趋化因子受体拮抗剂。融合抑制剂/趋化因子受体拮抗剂包括CXCR4拮抗剂，诸如AMD 3100(一种bicyclam)、SDF-1和其类似物，和ALX40-4C(一种阳离子肽)、T22(18氨基酸的肽；Trimeris)和T22类似物T134和T140；CCR5拮抗剂，诸如RANTES(9-68)、AOP-RANTES、NNY-RANTES和TAK-779；和CCR5/CXCR4拮抗剂，诸如NSC 651016(偏端霉素类似物)。还包括CCR2B、CCR3和CCR6拮抗剂。趋化因子受体激动剂诸如RANTES、SDF-1、MIP-1α、MIP-1β等也可抑制融合。

其它抗逆转录病毒剂包括整合酶抑制剂。整合酶抑制剂包含二咖啡酰奎宁(DFQA)酸；L-菊苣酸(一种二咖啡酰酒石(DCTA)酸)；醌茜素(QLC)和相关的蒽醌；ZINTEVIR^TM(AR 177，很可能作用于细胞表面而不是真正整合酶抑制剂的一种寡核苷酸；Arondex)；和萘酚类诸如公开于WO 98/50347的那些。

其它抗逆转录病毒剂包括羟基脲样化合物诸如BCX-34(一种嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；Biocryst)；核糖核苷酸还原酶抑制剂诸如DIDOX^TM(Molecules for Health)；肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂诸如VX-497(Vertex)；和霉酚酸(mycopholic acid)诸如CellCept(霉酚酸酸吗乙酯；Roche)。

其它抗逆转录病毒剂包括病毒整合酶抑制剂、病毒基因组核易位抑制剂诸如亚芳基双(甲基酮)化合物；HIV进入的抑制剂诸如AOP-RANTES、NNY-RANTES、RANTES-IgG融合蛋白、RANTES和糖胺聚糖(GAG)的可溶复合体、和AMD-3100；核衣壳锌指抑制剂诸如二噻烷化合物；HIV Tat和Rev的靶；和药物增强剂(pharmacoenhancer)诸如ABT-378。

其它抗逆转录病毒疗法和辅助疗法包括细胞因子和淋巴因子诸如MIP-1α、MIP-1β、SDF-1α、IL-2、PROLEUKIN^TM(阿地白介素/L2-7001；Chiron)、IL-4、IL-10、IL-12和IL-13；干扰素诸如IFN-α2a、IFN-α2b或IFN-β；TNF、NFKB、GM-CSF、M-CSF和IL-10的拮抗剂；调节免疫活化的药剂诸如环孢霉素和泼尼松；疫苗诸如Remune^TM(HIV Immunogen)、APL 400-003(Apollon)、重组gp120和片段、二价(B/E)重组包膜糖蛋白、rgp120CM235、MN rgp120、SF-2rgp120、gp120/可溶CD4复合体、ΔJR-FL蛋白、衍生自不连续gp120C3/C4结构域的分支合成肽、能够融合的免疫原和Gag、Pol、Nef和Tat疫苗；基于基因的疗法诸如遗传抑制元件(GSE；WO 98/54366)、和细胞内趋化因子(intrakine)(靶向ER以阻碍新合成CCR5的表面表达的遗传修饰的CC趋化因子(Yang等，PNAS 94：11567-72(1997)；Chen等，Nat.Med.3：1110-16(1997))；抗体诸如抗-CXCR4抗体12G5、抗-CCR5抗体2D7、5C7、PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14，抗-CD4抗体Q4120和RPA-T4、抗-CCR3抗体7B11、抗-gp120抗体17b、48d、447-52D、257-D、268-D和50.1、抗-Tat抗体、抗-TNF-α抗体、和单克隆抗体33A；芳烃(AH)受体激动剂和拮抗剂诸如TCDD、3，3′，4，4′，5-五氯联苯、3，3′，4，4′-四氯联苯、和α-萘黄酮(WO 98/30213)；和抗氧化剂诸如γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸乙酯(γ-GCE；WO 99/56764)。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与一种或多种抗病毒剂组合施用。在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与两种或更多种抗病毒剂组合施用。在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与三种或更多种抗病毒剂组合施用。

在一个实施方式中，可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的抗病毒剂包括但不限于，病毒酶的小分子抑制剂、RNA聚合酶的小分子抑制剂、基于核酸的抗病毒剂、反义寡核苷酸抑制剂、thiazolide、抗病毒抗体、新型免疫调节剂、亲环蛋白抑制剂、保肝剂、和干扰素增强剂。在具体的实施方式中，可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的抗病毒剂包括但不限于，阿昔洛韦、利巴韦林、利巴韦林类似物、金刚烷胺、remantidine、二盐酸组胺或胸腺法新。具体地，干扰素清蛋白融合蛋白可与任何这些药剂组合施用。而且，干扰素α清蛋白融合蛋白还可与任何这些药剂一起施用，且在一个实施方式中，干扰素α2a或2b清蛋白融合蛋白可与任何这些药剂一起施用。此外，干扰素β清蛋白融合蛋白还可与任何这些药剂一起施用。此外，任何IFN杂合清蛋白融合蛋白可与任何这些药剂组合施用。

在一个实施方式中，本发明的干扰素清蛋白融合蛋白与利巴韦林或利巴韦林类似物组合施用。在另一实施方式中，可与干扰素清蛋白融合蛋白组合施用的利巴韦林或利巴韦林类似物包括但不限于(Hoffman-LaRoche，Nutley，N.J.)、

(Schering Corp.，Kenilworth，NJ.)、病毒唑

(Valeant，Costa Mesa，CA)、RIBAVIN^TM(Lupin，Baltimore，MD)、RIBAZID^TM(EpIa，Kirachi，Pakistan)、三氮唑苷、VIRAMIDINE^TM(Valeant，Costa Mesa，CA)和RIBASPHERE^TM(Three Rivers Pharmaceuticals，Cranberry Township，PA)。在另外的实施方式中，干扰素α清蛋白融合蛋白与利巴韦林或利巴韦林类似物组合施用。在另外的实施方式中，干扰素α2a清蛋白融合蛋白与利巴韦林或利巴韦林类似物组合施用。在另外的实施方式中，干扰素α2b清蛋白融合蛋白与利巴韦林或利巴韦林类似物组合施用。在另外的实施方式中，干扰素β清蛋白融合蛋白与利巴韦林或利巴韦林类似物组合施用。在另外的实施方式中，杂合干扰素清蛋白融合蛋白与利巴韦林或利巴韦林类似物组合施用。在另外的实施方式中，本发明的干扰素清蛋白融合蛋白与利巴韦林或利巴韦林类似物和一种或多种其它抗病毒剂组合施用。在另外的实施方式中，与本发明的干扰素清蛋白融合蛋白和利巴韦林或利巴韦林类似物组合施用的其它抗病毒剂包括但不限于，病毒酶的小分子抑制剂、RNA聚合酶的小分子抑制剂、基于核酸的抗病毒剂、反义寡核苷酸抑制剂、thiazolide、抗病毒抗体、新型免疫调节剂、亲环蛋白抑制剂、保肝剂、和干扰素增强剂。

在另外的实施方式中，可单独或与一种或多种抗病毒剂组合施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以治疗病毒感染。在一个实施方式中，本发明的干扰素-清蛋白融合蛋白可与一种或多种抗病毒剂组合施用。在另外的实施方式中，该病毒感染来自肝炎病毒感染。在另一实施方式中，肝炎病毒是丙型肝炎病毒(HCV)。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的抗病毒剂包括但不限于，病毒酶的小分子抑制剂、RNA聚合酶的小分子抑制剂、基于核酸的抗病毒剂、反义寡核苷酸抑制剂、thiazolide、抗病毒抗体、新型免疫调节剂、亲环蛋白抑制剂、保肝剂、和干扰素增强剂。

可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的抗病毒酶抑制剂包括但不限于，VX-950(蛋白酶抑制剂，Vertex，Cambridge，MA)、VX-497(美泊地布(merimepodib)，口服IMPDH抑制剂，Vertex，Cambridge，MA)、BILB1941(蛋白酶抑制剂，Boehringer Ingelheim，Germany)、SCH7(蛋白酶抑制剂，Schering Corp.，Kenilworth，N.J.)、MX-3253(西戈斯韦，α-葡萄糖苷酶抑制剂，Migenix，Vancouver，BC)、IDN-6556(半胱天冬酶抑制剂，Pfizer，New York，NY)、UT231B(葡萄糖苷酶抑制剂，United Therapeutics，Silver Spring，MD)、R1626(病毒蛋白酶抑制剂，F.Hoffman-La Roche，Switzerland)、ITMN-B(ITMN-191，蛋白酶抑制剂，InterMune，Brisbane，CA)、SCH 503034(蛋白酶抑制剂，Schering Corp.，Kenilworth，NJ.)、ACH 806(GS9132，口服蛋白酶抑制剂，Achillion，New Haven，CT/Gilead Sciences，Foster City，CA)。

可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的抗病毒聚合酶抑制剂可为核苷类似物或非-核苷抑制剂(NNI)。在一个实施方式中，抗病毒聚合酶抑制剂抑制HCV RNA聚合酶。在一个实施方式中，抗病毒聚合酶抑制剂可为核苷类似物，包括但不限于，NM283(23′-C-甲基-胞啶的口服前药，Idenix，Cambride，MA)、R1626(F.Hoffman-La Roche，Switzerland)和2′-C-甲基核苷。在另一实施方式中，抗病毒聚合酶抑制剂可为非-核苷抑制剂，包括但不限于，JTK-103、JTK-003和JTK-109(Japan Tabacco，Tokyo，Japan)、R803(Rigel，South San Francisco，CA)、HCV-371、HCV-086、和HCV-796(ViroPharm，Exton，PA/Wyeth，Madison，NJ)、XTL-2125(BC2125，XTLbio，New York，NY)、A-831(Arrow Therapeutics，London，United Kingdom)。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的其它抗病毒聚合酶抑制剂包括但不限于MK-0608(Merck，Whitehouse Station；NJ)、NS5a(口服非-核苷聚合酶抑制剂，Genelabs，Redwood City，CA)、NS5b(口服核苷聚合酶抑制剂，Genelabs，Redwood City，CA)和ANA025-1(聚合酶抑制剂，AnadysPharmaceuticals，San Diego，CA)。

可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的基于抗病毒核酸的药剂包括但不限于，反义寡核苷酸、核酶、和siRNA或短发夹RNA(shRNA)。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的抗病毒反义寡核苷酸抑制剂包括但不限于，

AVI-4065(AVIBiopharma，Portland，OR)。

在另一实施方式中，可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用thiazolide。在一个实施方式中，可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的thiazolide包括但不限于

(硝唑尼特，RomarkLaboratories，L.C.，Tampa，FL)。

可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的抗病毒免疫调节剂包括但不限于，

(胸腺素α1，胸腺法新，SciClonePharmaceuticals Int′l，Hong Kong)和toll-样受体(TLR)激动剂，包括但不限于，ANA245(TLR-7激动剂，Anadys Pharmaceuticals，San Diego，CA)、ANA975(ANA245的口服前药，Anadys Pharmaceuticals，San Diego，CA)和CPG-10101(ACTILON^TM，TLR-9激动剂，Coley Pharmaceutical Group，Wellesley，MA)。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的亲环蛋白抑制剂包括但不限于，Debio-025(Debiopharm Group，Lausanne，Switzerland)。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的保肝剂包括但不限于，NOV-205(Novelos Therapeutics，Newton，MA)。

可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的干扰素增强剂包括但不限于EMZ702(Transition Therapeutics，Toronto，Ontario)。而且，可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的抗病毒抗体包括但不限于Tarvacin(巴维昔单抗(bavituximab)，一种靶向肿瘤内皮细胞表面的磷脂酰丝氨酸的人源化单克隆抗体，Peregrine Pharmaceuticals，Inc.，Tustin，CA)。

在一个实施方式中，可单独或与本发明包括的一种或多种抗病毒剂组合施用的清蛋白融合蛋白是干扰素-清蛋白融合蛋白。在另外的实施方式中，干扰素-清蛋白融合蛋白的干扰素部分是干扰素α。本发明包括的干扰素α的非限制性例子包括但不限于，公开于表1的治疗蛋白列的干扰素α蛋白。在具体的实施方式中，干扰素α部分由以下组成或可选地包含：干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-2c、复合干扰素、干扰素alfacon-1、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素α的任何商业上可获得形式诸如例如，A(Schering Corp.，Kenil worth，NJ.)、

A(Hoffman-La Roche，Nutley，N.J.)、Berofor干扰素α(Boehringer Ingelheim Pharmaceutical，Inc.，Ridgefied，Conn.)、OMNIFERON^TM(Viragen，Inc.，Plantation，FL)、MULTIFERON^TM(Viragen，Inc.，Plantation，FL)

(GlaxoSmithKline，London，Great Britian)、

(Amgen，Inc.，Thousands Oaks，CA)、

(Sumitomo，Japan)、

(Nautilus Biotech，France)、MAXY-ALPHA^TM(Maxygen，Redwood City，CA/Hoffman-La Roche，Nutley，N.J.)、或任何纯化的干扰素α产物或其片段。在另外的实施方式中，IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分由以下组成或可选地包含包含：为延长释放或控释而修饰或配制的干扰素α。例如，干扰素α部分由以下组成或可选地包含：商业上可获得的延长释放或控释干扰素α，包括但不限于干扰素-α-XL(Flamel Technologies，France)和LOCTERON^TM(BioLexTherapeutics/OctoPlus，Pittsboro，NC)。在另外的实施方式中，IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分可由连接化学部分而被修饰。例如，干扰素α部分可由聚乙二醇化修饰。因此在另外的实施方式中，IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分由以下组成或可选地包含：干扰素α-2a、2b、或复合干扰素的聚乙二醇化形式和包括但不限于商业上可获得的聚乙二醇化的干扰素α，诸如例如，

(Schering Corp.，Kenilworth，N.J.)、

(Hoffman-La Roche，Nutley，N.J.)、PEG-OMNIFERON^TM(Viragen，Inc.，Plantation，FL)或其片段。在另外的实施方式中，清蛋白融合蛋白的干扰素部分是干扰素α2a或2b干扰素，干扰素清蛋白融合蛋白可与任何这些药剂组合施用。而且，在另一实施方式中，干扰素-清蛋白融合蛋白的干扰素部分是干扰素β或干扰素杂合体。在另外的实施方式中，干扰素-清蛋白融合蛋白的未融合的干扰素部分可单独或与本发明包括的一种或多种抗病毒剂组合使用。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可与抗-机会性感染剂组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的抗-机会性剂包括但不限于，TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE^TM、DAPSONE^TM、PENTAMIDINE^TM、ATOVAQUONE^TM、ISONIAZID^TM、RIFAMPIN^TM、PYRAZINAMIDE^TM、ETHAMBUTOL^TM、RIFABUTIN^TM、CLARITHROMYCIN^TM、AZITHROMYCIN^TM、GANCICLOVIR^TM、FOSCARNET^TM、CIDOFOVIR^TM、FLUCONAZOLE^TM、ITRACONAZOLE^TM、KETOCONAZOLE^TM、ACYCLOVIR^TM、FAMCICOLVIR^TM、PYRIMETHAMINE^TM、LEUCOVORIN^TM、NEUPOGEN^TM(非格司亭/G-CSF)和LEUKINE^TM(沙格司亭/GM-CSF)。在具体的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以与TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE^TM、DAPSONE^TM、PENTAMIDINE^TM和/或ATOVAQUONE^TM的任何组合使用以预防地治疗或防止机会性卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)肺炎感染。在另一个具体实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以与ISONIAZID^TM、RIFAMPIN^TM、PYRAZINAMIDE^TM和/或ETHAMBUTOL^TM的任何组合使用以预防地治疗或防止机会性鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)复合感染。在另一个具体实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以与RIFABUTIN^TM、CLARITHROMYCIN^TM和/或AZITHROMYCIN^TM的任何组合使用以预防地治疗或防止机会性结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染。在另一个具体实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以与GANCICLOVIR^TM、FOSCARNET^TM和/或CIDOFOVIR^TM的任何组合使用以预防地治疗或防止机会性巨细胞病毒感染。在另一个具体实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以与FLUCONAZOLE^TM、ITRACONAZOLE^TM和/或KETOCONAZOLE^TM的任何组合使用以预防地治疗或防止机会性真菌感染。在另一个具体实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以与ACYCLOVIR^TM和/或FAMCICOLVIR^TM的任何组合使用以预防地治疗或防止机会性I型和/或II型单纯疱疹病毒感染。在另一个具体实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以与PYRIMETHAMINE^TM和/或LEUCOVORIN^TM的任何组合使用以预防地治疗或防止机会性鼠弓形体(Toxoplasma gondii)感染。在另一个具体实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸以与LEUCOVORIN^TM和/或NEUPOGEN^TM的任何组合使用以预防地治疗或防止机会性细菌感染。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗生素组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的抗生素包括但不限于，阿莫西林、β-内酰胺酶类、氨基糖苷类、β-内酰胺(糖肽)、β-内酰胺酶、克林霉素、氯霉素、头孢菌素类、环丙沙星、红霉素、氟喹诺酮类、大环内酯类、甲硝唑、青霉素类、喹诺酮类、雷帕霉素、利福平、链霉素、氨苯磺胺、四环素类、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和万古霉素。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与免疫刺激剂组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的免疫刺激剂包括但不限于，左旋咪唑(如，ERGAMISOL^TM)、异丙肌苷(如INOSIPLEX^TM)、干扰素(如干扰素α)和白介素(如，IL-2)。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与免疫抑制剂组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的免疫抑制剂包括但不限于，类固醇、环孢霉素、环孢霉素类似物、环磷酰胺甲基泼尼松、泼尼松、硫唑嘌呤、FK-506、15-脱氧精胍菌素和通过抑制响应性T细胞的功能而起作用的其它免疫抑制剂。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的其它免疫抑制剂包括但不限于，泼尼松龙、氨甲喋呤、沙利度胺、甲氧沙林、雷帕霉素、来氟米特、咪唑立宾(BREDININ^TM)、布喹那、脱氧精胍菌素、和氮杂螺烷(azaspirane)(SKF 105685)、ORTHOCLONE3(莫罗单抗-CD3)、SANDIMMUNE^TM、NEORAL^TM、SANGDYA^TM(环孢霉素)、(FK506，他克莫司)、

(霉酚酸吗乙酯(motefil)，其活性代谢物是霉酚酸)、IMURAN^TM(硫唑嘌呤)、糖皮质类固醇、肾上腺皮质类固醇诸如DELTASONE^TM(泼尼松)和HYDELTRASOL^TM(泼尼松龙)、FOLEX^TM和MEXATE^TM(甲氨喋呤)、OXSORALEN-ULTRA^TM(甲氧沙林)和RAPAMUNE^TM(西罗莫司)。在具体的实施方式中，免疫抑制剂可用于预防器官或骨髓移植排斥。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸单独或与一种或多种静脉内免疫球蛋白制品组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的静脉内免疫球蛋白制品包括但不限于，GAMMAR^TM、IVEEGAM^TM、SANDOGLOBULIN^TM、GAMMAGARD S/D^TM、ATGAM^TM(抗胸腺细胞球蛋白(glubulin))、和GAMIMUNE^TM。在具体的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸在移植治疗(如，骨髓移植)中与静脉内免疫球蛋白制品组合施用。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸单独或作为组合治疗的部分体内施用于患者或体外施用于细胞以治疗癌症。在具体的实施方式中，清蛋白融合蛋白尤其是IL-2-清蛋白融合体，在被动免疫治疗癌症诸如Dudley等(Science Express，2002年9月19日，在www.scienceexpress.org，在此以其整体通过引用并入)中所述的继承性细胞转移治疗转移性黑素瘤期间重复施用。

在一些实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸单独或与抗炎剂组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的抗炎剂包括但不限于，皮质类固醇(如倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松和曲安西龙)、非类固醇抗炎药物(如，双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、艾氟洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯灭酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸和托美丁)、以及抗组胺剂、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑啉酮、水杨酸衍生物、噻嗪羧酰胺、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗沙唑和替尼达普。

在另外的实施方式中，本发明的组合物单独或与抗-血管生成剂组合施用。可与本发明的组合物一起施用的抗-血管生成剂包括但不限于，血管他汀(Entremed，Rockville，MD)、肌钙蛋白-1(Boston Life Sciences，Boston，MA)、抗侵袭因子、视黄酸和其衍生物、紫杉醇(Taxol)、苏拉明、金属蛋白酶-1的组织抑制剂、金属蛋白酶-2的组织抑制剂、VEGI、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、和较轻″d组″过渡金属的各种形式。

较轻″d组″过渡金属包含，例如，钒、钼、钨、钛、铌和钽物质。这种过渡金属物质可形成过渡金属络合物。上述过渡金属物质的合适的络合物包含氧代过渡金属络合物。

钒络合物的代表例子包含氧代钒络合物诸如钒酸盐和氧钒络合物。合适的钒酸盐络合物包含偏钒酸盐和正钒酸盐络合物诸如例如，偏钒酸铵、偏钒酸钠和正钒酸钠。合适的氧钒络合物包含，例如，乙酰丙酮酸氧钒和硫酸氧钒，包含水合硫酸氧钒诸如单水合硫酸氧钒和三水合硫酸氧钒。

钨和钼络合物的代表例子还包含氧代络合物。合适的氧代钨络合物包含钨酸盐和氧化钨络合物。合适的钨酸盐络合物包含钨酸铵、钨酸钙、二水合钨酸钠和钨酸。合适的氧化钨包含氧化钨(IV)和氧化钨(VI)。合适的氧代钼络合物包含钼酸盐、氧化钼和氧钼基络合物。合适的钼酸盐络合物包含钼酸铵和其水合物、钼酸钠和其水合物、和钼酸钾和其水合物。合适的氧化钼包含氧化钼(VI)、氧化钼(VI)和钼酸。合适的氧钼基络合物包含，例如，乙酰丙酮酸氧钼。其它合适的钨和钼络合物包含衍生自例如，甘油、酒石酸和糖的羟衍生物。

大量其它抗-血管生成因子也可用于本发明的上下文中。代表性例子包括但不限于，血小板因子4；硫酸鱼精蛋白；硫酸化壳多糖衍生物(从雪花蟹壳制备)，(Murata等，Cancer Res.51：22-26，(1991))；硫酸化多糖肽聚糖复合体(SP-PG)(该化合物的功能可由存在类固醇诸如雌激素和柠檬酸他莫昔芬而增强)；十字孢碱；基质代谢调节物，包含例如脯氨酸类似物、顺式羟基脯氨酸、d，L-3，4-脱氢脯氨酸、硫杂脯氨酸、α，α-联吡啶、氨基丙腈富马酸酯；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-噁唑酮；氨甲喋呤；米托蒽醌；肝素；干扰素；2巨球蛋白-血清；ChIMP-3(Pavloff等，J.Bio.Chem.267：17321-17326，(1992))；抑糜酶素(Tomkinson等，Biochem J.286：475-480，(1992))；环糊精十四硫酸酯；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素(Ingber等，Nature 348：555-557，(1990))；硫代苹果酸金钠(″GST″；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.79：1440-1446，(1987))；抗胶原酶-血清；α2-抗血纤维蛋白酶(Holmes等，J.Biol.Chem.262(4)：1659-1664，(1987))；比生群(National Cancer Institute)；氯苯扎利二钠(N-(2)-羧基苯基-4-氯代邻氨基苯甲酸(chloroanthronilic acid)二钠或″CCA″；(Takeuchi等，Agents Actions 36：312-316，(1992))；和金属蛋白酶抑制剂诸如BB94。

也可用于本发明上下文的其它抗-血管生成因子包含沙利度胺(Celgene，Warren，NJ)；抑制血管生成类固醇；AGM-1470(H.Brem和J.Folkman JPediatr.Surg.28：445-51(1993))；整联蛋白αvβ3拮抗剂(C.Storgard等，JClin.Invest.103：47-54(1999))；carboxynaminolmidazole；羧基酰胺三唑(CAI)(National Cancer Institute，Bethesda，MD)；Conbretastatin A-4(CA4P)(OXiGENE，Boston，MA)；角鲨胺(Magainin Pharmaceuticals，PlymouthMeeting，PA)；TNP-470(Tap Pharmaceuticals，Deerfield，IL)；ZD-0101AstraZeneca(London，UK)；APRA(CT2584)；氟草胺，Byrostatin-1(SC339555)；CGP-41251(PKC 412)；CM101；右雷佐生(ICRF 187)；DMXAA；内皮他汀；Flavopridiol；Genestein；GTE；ImmTher；易瑞沙(ZD1839)；奥曲肽(生长抑素)；Panretin；Penacillamine；Photopoint；PI-88；普啉司他(AG-3340)Purlytin；Suradista(FCE26644)；他莫昔芬(Nolvadex)；他扎罗汀；四硫钼酸盐；希罗达(卡培他滨)；和5-氟尿嘧啶。

可与本发明的化合物组合施用的抗-血管生成剂可以多种机制起作用，包括但不限于，抑制细胞外基质的蛋白酶解，阻碍内皮细胞-细胞外基质粘附分子的功能，拮抗血管发生诱导物诸如生长因子的功能，和抑制增殖内皮细胞中表达的整联蛋白受体。干扰细胞外基质蛋白酶解并可与本发明的组合物组合施用的抗-血管生成抑制剂的例子包括但不限于，AG-3340(Agouron，La Jolla，CA)、BAY-12-9566(Bayer，West Haven，CT)、BMS-275291(BristolMyers Squibb，Princeton，NJ)、CGS-27032A(Novartis，East Hanover，NJ)，马立马司他(British Biotech，Oxford，UK)和Metastat(Aeterna，St-Foy，Quebec)。通过阻碍内皮细胞-细胞外基质粘附分子的功能来起作用并可与本发明的组合物组合施用的抗-血管生成抑制剂的例子包括但不限于，EMD-121974(MerckKcgaA Darmstadt，Germany)和Vitaxin(Ixsys，La Jolla，CA/Medimmune，Gaithersburg，MD)。直接拮抗或抑制血管发生诱导物而起作用并可与本发明的组合物组合施用的抗-血管生成剂的例子包括但不限于，Angiozyme(Ribozyme，Boulder，CO)、抗-VEGF抗体(Genentech，S.San Francisco，CA)、PTK-787/ZK-225846(Novartis，Basel，Switzerland)、SU-101(Sugen，S.SanFrancisco，CA)、SU-5416(Sugen/Pharmacia Upjohn，Bridgewater，NJ)和SU-6668(Sugen)。其它抗-血管生成剂起作用而间接地抑制血管发生。可与本发明的组合物组合施用的血管发生的间接抑制剂的例子包括但不限于，IM-862(Cytran，Kirkland，WA)、干扰素-α、IL-12(Roche，Nutley，NJ)和聚硫酸戊聚糖(Georgetown University，Washington，DC)。

在具体的实施方式中，预期本发明的组合物与抗-血管生成剂组合使用以治疗、预防和/或缓解自身免疫疾病，诸如例如，本文所述的自身免疫疾病。

在具体的实施方式中，预期本发明的组合物与抗-血管生成剂组合使用以治疗、预防和/或缓解关节炎。在更特定实施方式中，预期本发明的组合物组合抗-血管生成剂使用以治疗、预防和/或缓解类风湿性关节炎。

在另一实施方式中，编码本发明的多肽的多核苷酸与血管生成蛋白或编码血管生成蛋白的多核苷酸组合施用。可与本发明的组合物一起施用的血管生成蛋白的例子包括但不限于，酸性和碱性成纤维细胞生长因子、VEGF-1、VEGF-2、VEGF-3、表皮生长因子α和β、血小板-衍生内皮细胞生长因子、血小板-衍生生长因子、肿瘤坏死因子α、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和一氧化氮合酶。

在另外的实施方式中，本发明的组合物与化疗剂组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的化疗剂包括但不限于烷化剂诸如氮芥类(例如，双氯乙基甲胺、环磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-沙可来新)和苯丁酸氮芥)、氮丙啶和甲基三聚氰胺类(例如，六甲基三聚氰胺和塞替派)、磺酸烷基酯(例如，白消安)、硝基脲(例如，卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)和链佐星(链唑霉素))、三氮烯(例如，达卡巴嗪(DTIC；二甲基三氮烯咪唑羧酰胺))、叶酸类似物(例如，氨甲喋呤(氨甲叶酸))、嘧啶类似物(例如，氟尿嘧啶(Fluorouacil)(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FudR)、和阿糖胞苷(阿糖胞苷(cytosinearabinoside)))、嘌呤类似物和相关抑制剂(例如，巯嘌呤(6-巯嘌呤；6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他汀(2′-脱氧柯福霉素))、长春花生物碱(例如，长春碱(VLB，长春花碱(vinblastine sulfate)))和长春新碱(硫酸长春新碱))、鬼臼乙叉甙(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、抗生素(例如，更生霉素(放线菌素D)、红比霉素(柔红霉素；红比霉素)、多柔比星、争光霉素、普卡霉素(光辉霉素)、和丝裂霉素(丝裂霉素C)、酶(例如，L-天冬酰胺酶)、生物响应调节物(例如，干扰素-α和干扰素-α-2b)、铂配位化合物(例如，顺铂(顺式-DDP)和卡铂)、蒽醌(米托蒽醌)、取代的脲(例如，羟基脲)、甲肼衍生物(例如，丙卡巴肼(N-甲肼；MIH)、肾上腺皮质类固醇(例如，泼尼松)、黄体酮(例如，己酸羟孕酮、甲羟孕酮、乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮)、雌激素(例如，己烯雌酚(DES)、二磷酸己烯雌酚、雌二醇和乙炔雌二醇)、抗雌激素药(例如，他莫昔芬)、雄激素(丙酸睾酮和氟甲睾酮)、抗雄激素药(例如，氟他胺)、促性腺激素释放激素类似物(例如，利普安)、其它激素和激素类似物(例如，甲睾酮、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、氯烯雌醚和睾内酯)、和其它(例如，达卡巴嗪(dicarbazine)、谷氨酸和米托坦)。

在一个实施方式中，本发明的组合物与一种或多种以下药物组合施用：英夫利昔单抗(也称为Remicade^TM Centocor，Inc.)、托卡特(Roche，RO-32-3555)、来氟米特(也称为Arava^TM，来自Hoechst Marion Roussel)、Kineret^TM(一种IL-1受体拮抗剂，还称为阿那白滞素，来自Amgen，Inc.)。

在具体的实施方式中，本发明的组合物与CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)组合或与CHOP的一种或多种成分组合施用。在一个实施方式中，本发明的组合物与抗-CD20抗体、人类单克隆抗-CD20抗体组合施用。在另一实施方式中，本发明的组合物与抗-CD20抗体和CHOP组合、或与抗-CD20抗体和CHOP的一种或多种成分的任意组合尤其是环磷酰胺和/或泼尼松组合施用。在具体的实施方式中，本发明的组合物美罗华组合施用。在另外的实施方式中，本发明的组合物与美罗华和CHOP、或美罗华和CHOP的一种或多种成分的任意组合尤其是环磷酰胺和/或泼尼松一起施用。在具体的实施方式中，本发明的组合物与托西莫单抗组合施用。在另外的实施方式中，本发明的组合物与托西莫单抗和CHOP、或托西莫单抗和CHOP的一种或多种成分的任意组合尤其是环磷酰胺和/或泼尼松一起施用。抗-CD20抗体可任选地与放射性同位素、毒素或细胞毒性前药联合。

在另一个具体实施方式中，本发明的组合物与Zevalin^TM组合施用。在另外的实施方式中，本发明的组合物与Zevalin^TM和CHOP、或Zevalin^TM和CHOP的一种或多种成分的任意组合尤其是环磷酰胺和/或泼尼松一起施用。Zevalin^TM可与一种或多种放射性同位素(radisotope)联合。示例性同位素是⁹⁰Y和¹¹¹In。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与细胞因子组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的细胞因子包括但不限于，IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗-CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α。在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可与任何白介素一起施用，包括但不限于，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。

在一个实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与TNF家族的成员组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的TNF、TNF相关的或TNF-样分子包括但不限于，TNF-α的可溶形式、淋巴毒素-α(LT-α，还称为TNF-β)、LT-β(见于复合异源三聚体LT-α2-β)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国际公布第WO 96/14328号)、AIM-I(国际公布第WO 97/33899号)、endokine-α(国际公布第WO 98/07880号)、OPG、和neutrokine-α(国际公布第WO 98/18921号、OX40、和神经生长因子(NGF)、和Fas的可溶形式、CD30、CD27、CD40和4-IBB、TR2(国际公布第WO 96/34095号)、DR3(国际公布第WO97/33904号)、DR4(国际公布第WO 98/32856号)、TR5(国际公布第WO98/30693号)、TRANK、TR9(国际公布第WO 98/56892号)、TR10(国际公布第WO 98/54202号)、312C2(国际公布第WO 98/06842号)、和TR12、和可溶形式CD154、CD70和CD153。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与血管生成蛋白组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的血管生成蛋白包括但不限于，神经胶质瘤衍生生长因子(GDGF)，如公开于欧洲专利第EP-399816号；血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)，如公开于欧洲专利第EP-682110号；血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)，如公开于欧洲专利第EP-282317号；胎盘生长因子(PlGF)，如公开于国际公布第WO92/06194号；胎盘生长因子-2(PlGF-2)，如公开于Hauser等，Growth Factors，4：259-268(1993)；血管内皮生长因子(VEGF)，如公开于国际公布第WO90/13649号；血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，如公开于欧洲专利第EP-506477号；血管内皮生长因子-2(VEGF-2)，如公开于国际公布第WO96/39515号；血管内皮生长因子B(VEGF-3)；血管内皮生长因子B-186(VEGF-B 186)，如公开于国际公布第WO 96/26736号；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如公开于国际公布第WO 98/02543号；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如公开于国际公布第WO 98/07832号；和血管内皮生长因子-E(VEGF-E)，如公开于德国专利第DE 19639601号。上述参考文献在此以其整体通过引用并入。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与成纤维细胞生长因子组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的成纤维细胞生长因子包括但不限于，FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与造血生长因子组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的造血生长因子包括但不限于，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(沙格司亭，LEUKINE^TM、PROKINE^TM)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(非格司亭，NEUPOGEN^TM)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，CSF-1)促红细胞生成素(阿法依伯汀，EPOGEN^TM、PROCRIT^TM)、干细胞因子(SCF、c-kit配体、青灰因子)、巨核细胞集落刺激因子、PIXY321(一种GMCSF/IL-3融合蛋白)、白介素、尤其是IL-1至IL-12的任何一种或多种、干扰素-γ或促血小板生成素。

在一些实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与肾上腺素能阻断药组合施用，所述肾上腺素能阻断药诸如例如，醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他索洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、拉贝洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗心律不齐药物(如，腺苷、酰氨基芳酮(amidoarone)、溴苄胺、洋地黄、地高辛、洋地黄毒苷、地尔硫卓(diliazem)、丙吡胺、艾司洛尔、氟卡尼、利多卡因、美西律、莫雷西嗪、苯妥英、普鲁卡因胺、N-乙酰普鲁卡因胺、普罗帕酮、普萘洛尔、奎尼丁、索他洛尔、妥卡尼和维拉帕米)组合施用。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与利尿剂组合施用，诸如碳酸酐酶-抑制剂(如，乙酰唑胺、二氯磺胺和美舍唑米)、渗透利尿剂(如，甘油、异山梨醇、甘露醇和脲)、抑制Na⁺-K⁺-2Cl^-共运输的利尿剂(如，呋塞米、布美他尼、阿佐塞米、吡咯他尼、曲帕胺、依他尼酸、莫唑胺和托塞米)、噻嗪类和噻嗪类-样利尿剂(如，苄氟噻嗪、苄噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、泊利噻嗪、三氯噻嗪、氯噻酮、吲达帕胺、美托拉宗和喹乙宗)、保钾利尿剂(如，阿米洛利和氨苯喋啶)和盐皮质激素受体拮抗剂(如，螺内酯、坎利酮和烯睾丙酸钾)。

在一个实施方式中，与对内分泌和/或激素失调疾患的治疗组合施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸。对内分泌和/或激素失调疾患的治疗包括但不限于，¹²⁷I、碘的放射活性同位素诸如¹³¹I和¹²³I；重组生长激素诸如HUMATROPE^TM(重组促生长激素)；生长激素类似物诸如PROTROPIN^TM(人蛋氨生长素)；多巴胺激动剂诸如PARLODEL^TM(溴隐亭)；生长抑素类似物诸如SANDOSTATIN^TM(奥曲肽)；促性腺激素制剂诸如PREGNYL^TM、A.P.L.^TM和PROFASI^TM(绒毛膜促性腺激素(CG))、PERGONAL^TM(促生育素)和METRODIN^TM(尿促卵泡素(uFSH))；合成人类促性腺激素释放激素制剂诸如FACTREL^TM和LUTREPULSE^TM(盐酸促性腺激素)；合成促性腺激素激动剂诸如LUPRON^TM(乙酸利普安)、SUPPRELIN^TM(乙酸组氨瑞林)、SYNAREL^TM(乙酸那法瑞林)和ZOLADEX^TM(乙酸戈舍瑞林)；促甲状腺素-释放激素的合成制剂诸如RELEFACT TRH^TM和THYPINONE^TM(普罗瑞林)；重组人类TSH诸如THYROGEN^TM；甲状腺激素天然异构体钠盐的合成制剂诸如L-T₄ ^TM、SYNTHROID^TM和LEVOTHROID^TM(左甲状腺素钠)、L-T3^TM、CYTOMEL^TM和TRIOSTAT^TM(碘甲腺氨酸钠(liothyroine sodium))和THYROLAR^TM(复方甲状腺素)；抗甲状腺化合物诸如6-正丙基硫脲嘧啶(丙基硫脲嘧啶)、1-甲基-2-巯基咪唑和TAPAZOLE^TM(美赛唑)、NEO-MERCAZOLE^TM(卡比马唑)；β-肾上腺素能受体拮抗剂诸如普萘洛尔和艾司洛尔；Ca²⁺通道阻滞剂；地塞米松和碘化放射造影剂诸如TELEPAQUE^TM(碘番酸)和ORAGRAFIN^TM(碘泊酸钠)。

其它对内分泌和/或激素失调疾患的治疗包括但不限于，雌激素或缀合的(congugated)雌激素诸如ESTRACE^TM(雌二醇)、ESTINYL^TM(乙炔雌二醇)、PREMARIN^TM、ESTRATAB^TM、ORTHO-EST^TM、OGEN^TM和哌嗪雌酮(雌酮)、ESTROVIS^TM(炔雌醚)、ESTRADERM^TM(雌二醇)、DELESTROGEN^TM和VALERGEN^TM(戊酸雌二醇)、DEPO-ESTRADIOL CYPIONATE^TM和ESTROJECT LA^TM(环戊丙酸雌二醇)；抗雌激素药诸如NOLVADEX^TM(他莫昔芬)、SEROPHENE^TM和CLOMID^TM(氯米芬)；黄体酮诸如DURALUTIN^TM(羟基己酸黄体酮)、MPA^TM和DEPO-PROVERA^TM(乙酸甲羟孕酮)、PROVERA^TM和CYCRIN^TM(MPA)、MEGACE^TM(乙酸甲地孕酮)、NORLUTIN^TM(炔诺酮)和NORLUTATE^TM和AYGESTIN^TM(乙酸炔诺酮)；黄体酮植入剂诸如NORPLANT SYSTEM^TM(炔诺孕酮皮下植入剂)；抗孕素诸如RU 486^TM(米非司酮)；激素避孕剂诸如ENOVID^TM(异炔诺酮+美雌醇)、PROGESTASERT^TM(释放黄体酮的子宫内装置)、LOESTRIN^TM、BREVICON^TM、MODICON^TM、GENORA^TM、NELONA^TM、NORINYL^TM、OVACON-35^TM和OVACON-50^TM(乙炔雌二醇/炔诺酮)、LEVLEN^TM、NORDETTE^TM、TRI-LEVLEN^TM和TRIPHASIL-21^TM(乙炔雌二醇/左炔诺孕酮)LO/OVRAL^TM和OVRAL^TM(乙炔雌二醇/炔诺孕酮)、DEMULEN^TM(乙炔雌二醇/二乙酸炔诺醇)、NORINYL^TM、ORTHO-NOVUM^TM、NORETHIN^TM、GENORA^TM和NELOVA^TM(炔诺酮/美雌醇)、DESOGEN^TM和ORTHO-CEPT^TM(乙炔雌二醇/去氧孕烯)、ORTHO-CYCLEN^TM和ORTHO-TRICYCLEN^TM(乙炔雌二醇/诺孕酯)、MICRONOR^TM和NOR-QD^TM(炔诺酮)和OVRETTE^TM(炔诺孕酮)。

其它对内分泌和/或激素失调疾患的治疗包括但不限于，睾酮酯诸如乙酸美替诺龙和十一酸睾酮；肠胃外和口服雄激素诸如TESTOJECT-50^TM(睾酮)、TESTEX^TM(丙酸睾酮)、DELATESTRYL^TM(庚酸睾酮)、DEPO-TESTOSTERONE^TM(环戊丙酸睾酮)、DANOCRINE^TM(达那唑)、HALOTESTIN^TM(氟甲睾酮)、ORETON METHYL^TM、TESTRED^TM和VIRILON^TM(甲基睾酮)和OXANDRIN^TM(氧雄龙)；睾酮经皮系统诸如TESTODERM^TM；雄激素受体拮抗剂和5-α-还原酶抑制剂诸如ANDROCUR^TM(乙酸环丙孕酮)、EULEXIN^TM(氟他胺)和PROSCAR^TM(非那雄胺)；促肾上腺皮质激素制剂诸如CORTROSYN^TM(促皮质素)；肾上腺皮质类固醇和其合成类似物诸如ACLOVATE^TM(二丙酸阿氯米松)、CYCLOCORT^TM(安西奈德)、BECLOVENT^TM和VANCERIL^TM(二丙酸倍氯米松)、CELESTONE^TM(倍他米松)、BENISONE^TM和UTICORT^TM(苯甲酸倍他米松)、DIPROSONE^TM(二丙酸倍他米松)、CELESTONE PHOSPHATE^TM(倍他米松磷酸钠)、CELESTONE SOLUSPAN^TM(倍他米松磷酸钠和倍他米松乙酸钠)、BETA-VAL^TM和VALISONE^TM(戊酸倍他米松)、TEMOVATE^TM(二丙酸氯倍他索)、CLODERM^TM(特戊酸氯可托龙)、CORTEF^TM和HYDROCORTONE^TM(皮质醇(氢化可的松))、HYDROCORTONEACETATE^TM(乙酸皮质醇(氢化可的松))、LOCOID^TM(丁酸皮质醇(氢化可的松))、HYDROCORTONE PHOSPHATE^TM(皮质醇(氢化可的松)磷酸钠)、A-HYDROCORT^TM和SOLU CORTEF^TM(皮质醇(氢化可的松)琥珀酸钠)、WESTCORT^TM(戊酸皮质醇(氢化可的松))、CORTISONE ACETATE^TM(乙酸可的松)、DESOWEN^TM和TRIDESILON^TM(地奈德)、TOPICORT^TM(去羟米松)、DECADRON^TM(地塞米松)、DECADRON LA^TM(乙酸地塞米松)、DECADRON PHOSPHATE^TM和HEXADROL PHOSPHATE^TM(地塞米松磷酸钠)、FLORONE^TM和MAXIFLOR^TM(二乙酸二氟拉松)、FLORINEFACETATE^TM(乙酸氟氢可的松)、AEROBID^TM和NASALIDE^TM(氟尼缩松)、FLUONID^TM和SYNALAR^TM(氟轻松)、LIDEX^TM(醋酸氟轻松)、FLUOR-OP^TM和FML^TM(氟米龙)、CORDRAN^TM(氟氢缩松)、HALOG^TM(哈西奈德)、HMS LIZUIFILM^TM(甲羟松)、MEDROL^TM(甲基泼尼松龙)、DEPO-MEDROL^TM和MEDROL ACETATE^TM(甲基乙酸泼尼松)、A-METHAPRED^TM和SOLUMEDROL^TM(甲基泼尼松龙琥珀酸钠)、ELOCON^TM(糠酸莫米松)、HALDRONE^TM(乙酸对氟米松)、DELTA-CORTEF^TM(泼尼松龙)、ECONOPRED^TM(乙酸泼尼松龙)、HYDELTRASOL^TM(泼尼松龙磷酸钠)、HYDELTRA-T.B.A^TM(叔丁乙酸泼尼松龙)、DELTASONE^TM(泼尼松)、ARISTOCORT^TM和KENACORT^TM(曲安西龙)、KENALOG^TM(曲安奈德)、ARISTOCORT^TM和KENACORT DIACETATE^TM(二乙酸曲安西龙)和ARISTOSPAN^TM(己曲安奈德)；肾上腺皮质类固醇生物合成和作用的抑制剂诸如CYTADREN^TM(氨鲁米特)、NIZORAL^TM(酮康唑)、MODRASTANE^TM(曲洛司坦)和METOPIRONE^TM(美替拉酮)；牛、猪或人类胰岛素或其混合物；胰岛素类似物；重组人类胰岛素诸如HUMULIN^TM和NOVOLIN^TM；口服降血糖药诸如ORAMIDE^TM和ORINASE^TM(甲糖宁)、DIABINESE^TM(氯磺丙脲)、TOLAMIDE^TM和TOLINASE^TM(妥拉磺脲)、DYMELOR^TM(醋酸己脲)、格列本脲、MICRONASE^TM、DIBETA^TM和GLYNASE^TM(优降糖)、GLUCOTROL^TM(格列吡嗪)和DIAMICRON^TM(格列齐特)、GLUCOPHAGE^TM(二甲双胍)、环格列酮、吡格列酮和α-葡萄糖苷酶抑制剂；牛或猪高血糖素；生长抑素诸如SANDOSTATIN^TM(奥曲肽)；和二氮嗪类诸如PROGLYCEM^TM(二氮嗪)。

在一个实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与对子宫活动性疾患的治疗组合施用。对子宫活动性疾患的治疗包括但不限于，雌激素药物诸如缀合的雌激素(如，

和

)、雌二醇(如，

和

)、哌嗪雌酮硫酯(estropipate)和氯烯雌醚；黄体酮药物(如，

(甲羟孕酮)、

(乙酸炔诺酮(norethidrone acetate))、

黄体酮和乙酸甲地孕酮)；和雌激素/黄体酮组合疗法诸如例如，缀合的雌激素/甲羟孕酮(如，PREMPRO^TM和)和乙酸炔诺酮/乙炔雌二醇(ethinyl estsradiol)(如，FEMHRT^TM)。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与有效治疗缺铁性贫血和低血色素贫血的药物组合施用，所述药物包括但不限于，硫酸亚铁(硫酸亚铁(iron sulfate)，FEOSOL^TM)、富马酸亚铁(如，FEOSTAT^TM)、葡萄糖酸亚铁(如，FERGON^TM)、多糖-铁复合体(如，NIFEREX^TM)、葡聚糖铁注射剂(如，INFED^TM)、硫酸铜、吡哆醇、核黄素、维生素B₁₂、氰钴胺注射剂(如，REDISOL^TM、RUBRAMIN PC^TM)、羟钴胺、叶酸(如，FOLVITE^TM)、亚叶酸(亚叶酸，5-CHOH4PteGlu，嗜橙菌因子)或WELLCOVORIN(亚叶酸的钙盐)、转铁蛋白或铁蛋白。

在一些实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与用于治疗精神病疾患的药物组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的精神病药物包括但不限于，精神安定药物(如，氯丙嗪、氯普噻吨、氯氮平、氟奋乃静、氟哌啶醇、洛沙平、美索达嗪、吗茚酮、奥氮平、奋乃静、匹莫齐特、喹硫平、利培酮、硫利达嗪、替沃噻吨、三氟拉嗪和三氟丙嗪)、抗躁狂剂(如，卡马西平、双丙戊酸钠、碳酸锂和柠檬酸锂)、抗抑郁药(如，阿米替林、阿莫沙平、丁氨苯丙酮、西酞普兰、氯米帕明、地昔帕明、多塞平、氟伏沙明、氟西汀、丙米嗪、异卡波肼、马普替林、米氮平、奈法唑酮、去甲替林、帕罗西汀、苯乙肼、普罗替林、舍曲林、反苯环丙胺；曲唑酮、曲米帕明和文拉法辛)、抗焦虑药(如，阿普唑仑、丁螺环酮、氯氮卓、氯卓酸、地西泮、哈拉西泮、劳拉西泮、奥沙西泮和普拉西泮)和兴奋剂(如，右旋安非他明(d-amphetamine)、哌甲酯和匹莫林)。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与用于治疗神经障碍的药物组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的神经药物包括但不限于，抗癫痫药(如，卡马西平、氯硝西泮、乙琥胺、苯巴比妥、苯妥英、扑米酮、丙戊酸、双丙戊酸钠、非氨酯、加巴喷丁、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、硫加宾、托吡酯、唑尼沙胺、地西泮、劳拉西泮和氯硝西泮)、抗帕金森病药(如，左旋多巴/卡比多巴、司来吉兰、金刚胺、溴隐亭、培高利特、罗匹尼罗、普拉克索、苯扎托品；比哌立登；普罗吩胺；丙环定；苯海索、托卡朋)和ALS治疗剂(如利鲁唑)。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与血管舒张剂和/或钙通道阻滞剂组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的血管舒张剂包括但不限于，血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂(如，罂粟碱、异克舒令、贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、群多普利和布酚宁)和硝酸酯(如，二硝酸异山梨醇酯、单硝酸异山梨醇酯和硝酸甘油酯)。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸组合施用的钙通道阻滞剂的例子包括但不限于氨氯地平、苄普地尔、地尔硫卓、非洛地平、氟桂利嗪、依拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平和维拉帕米。

在一些实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与对胃肠疾患的治疗组合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的对胃肠疾患的治疗包括但不限于，H₂组胺受体拮抗剂(如，TAGAMET^TM(西咪替丁)、ZANTAC^TM(雷尼替丁)、PEPCID^TM(法莫替丁)和AXID^TM(尼扎替丁))；H⁺，K⁺ATP酶抑制剂(如，PREVACID^TM(兰索拉唑)和PRILOSEC^TM(奥美拉唑))；铋化合物(如，PEPTO-BISMOL^TM(次水杨酸铋)和DE-NOL^TM(次柠檬酸铋))；各种抗酸药；硫糖铝；前列腺素类似物(如CYTOTEC^TM(米索前列醇))；毒蕈碱胆碱能拮抗剂；轻泻药(如，表面活性剂轻泻药、兴奋剂轻泻药、盐水和渗透轻泻药)；止泻药(如，LOMOTIL^TM(地芬诺酯)、MOTOFEN^TM(地芬诺新(diphenoxin))和IMODIUM^TM(盐酸洛哌丁胺))、生长抑素的合成类似物诸如SANDOSTATIN^TM(奥曲肽)、止吐药(如，ZOFRAN^TM(昂丹司琼)、KYTRIL^TM(盐酸格拉司琼)、托烷司琼、多拉司琼、甲氧氯普胺、氯丙嗪、奋乃静、丙氯拉嗪、异丙嗪、硫乙拉嗪、三氟丙嗪、多潘立酮、氟哌啶醇、氟哌利多、曲美苄胺、地塞米松、甲基泼尼松龙、屈大麻酚和大麻隆)；D2拮抗剂(如，甲氧氯普胺、曲美苄胺和氯丙嗪)；胆酸盐；鹅去氧胆酸；熊去氧胆酸；和胰脏酶制剂诸如胰酶和胰脂肪酶。

在另外的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与其它治疗性或预防性疗法诸如例如放射疗法组合施用。

本发明还提供包含填充有包括本发明的清蛋白融合蛋白的药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器的药物包或套盒。任选地这些容器可附有以管理药物或生物产品的制造、使用或销售的管理机构规定的形式的通知，该通知反映管理制造、使用或销售的管理机构对人类施用的批准。

基因治疗

编码本发明的清蛋白融合蛋白的构建体可用作基因治疗方案的一部分以递送治疗有效剂量的清蛋白融合蛋白。体内引入核酸到细胞的示例性方法是使用含有编码本发明的清蛋白融合蛋白的核酸的病毒载体。以病毒载体感染细胞的优势是较大比例的靶向细胞可获得核酸。此外，病毒载体内如由病毒载体中含有的cDNA编码的分子在已获取病毒载体核酸的细胞中有效表达。

逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体可用作重组基因递送系统以体内转移编码清蛋白融合蛋白的外源核酸分子。这些载体提供向细胞有效递送核酸，且转移的核酸稳定地整合到宿主染色体DNA中。开发仅产生复制-缺陷逆转录病毒的专门化细胞系(称为″包装细胞″)增加了逆转录病毒用于基因治疗的效用，且缺陷型逆转录病毒被表征为用于基因治疗目的的基因转移中(综述见于Miller，A.D.(1990)Blood 76：271)。复制缺陷型逆转录病毒可包装到病毒粒子中，病毒粒子可用于以标准技术通过使用辅助病毒感染目标细胞。用于产生重组逆转录病毒和以这类病毒体外或体内感染细胞的规程可见于Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等，(编)GreenePublishing Associates，(1989)，9.10-9.14部分和其它标准实验室手册。

本发明中可用的另一种病毒基因递送系统使用腺病毒-衍生载体。可操纵腺病毒的基因组以使其编码和表达感兴趣的基因产物，但在正常溶解病毒生命周期中复制的能力被失活。见于例如，Berkner等，Biotechniques 6：616(1988)；Rosenfeld等，Science 252：431-434(1991)；和Rosenfeld等，Cell 68：143-155(1992)。衍生自腺病毒菌株Ad类型5d1324或其它腺病毒菌株(如，Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员已知的。重组腺病毒在一些情况可为有利的，因为它们不能够感染不分裂的细胞并可用于感染很多种细胞类型，包括上皮细胞(Rosenfeld等，(1992)上述)。此外，病毒颗粒是相对稳定的并适于纯化和浓缩，且如上所述，可被修饰从而影响感染谱。此外，所引入的腺病毒DNA(和本文所包含的外源DNA)不被整合入宿主细胞基因组而保持为附加体，从而避免所引入的DNA整合入宿主基因组(如，逆转录病毒DNA)的情况中由于插入诱变而发生的潜在问题。而且，相对于其它基因递送载体，腺病毒基因组对外源DNA的携带能力大(多至8千碱基)(Berkner等，上述；Haj-Ahmand等，J.Virol.57：267(1986))。

在另一实施方式中，本发明的非-病毒基因递送系统依赖于胞吞途径以使所述核苷酸分子被靶向的细胞摄取。这类示例性基因递送系统包括脂质体衍生系统、聚-赖氨酸缀合物和人工病毒包膜。在代表性实施方式中，编码本发明的清蛋白融合蛋白的核酸分子可被捕获到表面上携带正电荷并(任选)以针对靶组织的细胞表面抗原的抗体标记的脂质体中(如，lipofectin)(Mizuno等(1992)No Shinkei Geka 20：547-551；PCT公布WO91/06309；日本专利申请第1047381号；和欧洲专利公布第EP-A-43075号)。

编码本发明的清蛋白融合蛋白的基因的基因递送系统可由任何大量方法引入患者。例如，可系统地如通过静脉内注射引入基因递送系统的药物制剂，且靶细胞中特异性蛋白转导主要根据基因递送载体提供的转染特异性、由于控制受体基因表达的转录调控序列而导致的细胞-类型或组织-类型表达，或其组合而发生。在其它实施方式中，起始递送重组基因更局限于引入动物是相当局域化的(localized)。例如，基因递送载体可由导管(见于美国专利第5,328,470号)或由立体定向注射(如Chen等(1994)PNAS 91：3054-3057)引入。基因治疗构建体的药物制剂可主要由在可接受的稀释剂中的基因递送系统组成，或可包含其中嵌入基因递送载体的缓释基质。在清蛋白融合蛋白可从重组细胞如逆转录病毒载体完整制备的情况，药物制剂可包含一种或多种产生清蛋白融合蛋白的细胞。

其它基因治疗方法

本发明还包括治疗或预防疾患、疾病和病症的基因治疗方法。基因治疗方法涉及将核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)序列引入动物以实现本发明的清蛋白融合蛋白的表达。该方法要求编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可操作地连接于启动子和靶组织表达融合蛋白必需的任何其它遗传元件。这类基因治疗和递送技术是本领域已知的，见于例如，WO90/11092，其在此通过引用并入。

因此，例如，患者的细胞可用包括可操作地连接于编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的启动子的多核苷酸(DNA或RNA)进行活体外改造，并将所改造细胞随后提供于待用本发明的融合蛋白治疗的患者。这类方法是本领域熟知的。例如，见于Belldegrun，A.等，J.Natl.Cancer Inst.85：207-216(1993)；Ferrantini，M.等，Cancer Research 53：1107-1112(1993)；Ferrantini，M.等，J.Immunology 153：4604-4615(1994)；Kaido，T.等，Int.J.Cancer 60：221-229(1995)；Ogura，H.等，Cancer Research 50：5102-5106(1990)；Santodonato，L.等，Human Gene Therapy 7：1-10(1996)；Santodonato，L.等，Gene Therapy 4：1246-1255(1997)；和Zhang，J.-F.等，Cancer Gene Therapy 3：31-38(1996))，其在此通过引用并入。在一个实施方式中，被改造的细胞是动脉细胞。动脉细胞可经由直接注射到动脉、到动脉周围组织或经由导管注射重新引入患者。

如以下更详细讨论的，多核苷酸构建体可由递送可注射材料到动物细胞的任何方法递送，诸如，注射到组织(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝脏及类似组织)的间质间隙。多核苷酸构建体可以药物上可接受的液态或含水媒介物递送。

在一个实施方式中，编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸以裸多核苷酸递送。术语″裸″多核苷酸、DNA或RNA指不含作用为辅助、促进或便于进入细胞的任何递送载体(包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、lipofectin或沉淀剂及类似物)的序列。然而，编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可以脂质体制剂递送，lipofectin制剂及类似物可由本领域技术人员熟知的方法制备。这类方法描述于例如，美国专利第5,593,972、5,589,466和5,580,859号，其在此通过引用并入。

用于基因治疗方法的多核苷酸载体构建体可为不整合入宿主基因组也不含有允许复制的序列的构建体。合适的载体包括可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；和可从Invitrogen获得的pEF1/V5、pcDNA3.1和pRc/CMV2。其它合适的载体对本领域技术人员是容易明显的。

本领域技术人员已知的任何强启动子可用于驱动多核苷酸序列的表达。合适的启动子包括腺病毒启动子，诸如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，诸如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，诸如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热激启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，诸如单纯疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR；b-肌动蛋白启动子；和人类生长激素启动子。启动子还可为对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗蛋白部分的基因的天然启动子。

不同于其它基因治疗技术，将裸核酸序列引入靶细胞的一个主要优势是多核苷酸在细胞中合成的暂时性。研究已显示，可将非-复制性DNA序列引入细胞以提供产生期望的多肽持续多达六个月的时期。

可将多核苷酸构建体递送到动物组织的间质间隙，所述组织包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝脏、脾脏、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰脏、肾脏、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织。组织的间质间隙包含细胞间、流体、器官组织网状纤维间的粘多糖基质、血管壁或腔室壁中的弹性纤维、纤维组织的胶原纤维、或结缔组织鞘肌肉细胞内或骨腔隙中的相同基质。类似地是循环血浆和淋巴隙的淋巴液占据的空间。因为以下讨论的原因，可进行递送至肌肉组织的间质间隙。通过注射到包含这些细胞的组织可方便地递送多核苷酸构建体。多核苷酸构建体可递送到为分化的永久非-分裂细胞并在其中表达，尽管递送和表达可在非-分化的或较不完全分化的细胞(诸如例如，血液干细胞或皮肤成纤维细胞)中实现。体内肌肉细胞获取和表达多核苷酸的能力尤其强。

对于裸核酸序列注射，有效剂量的DNA或RNA的量将为约0.05mg/kg体重至约50mg/kg体重的范围。在一个实施方式中，剂量将为从约0.005mg/kg至约20mg/kg和在另一实施方式中约0.05mg/kg至约5mg/kg。当然如本领域普通技术人员将理解的，该剂量将根据注射的组织部位而变化。合适的和有效剂量的核酸序列可容易由本领域普通技术人员确定，并可取决于被治疗的病症和施用途径。

在一个实施方式中，施用途径是由肠胃外途径注射到组织的间质间隙。然而也可使用其它肠胃外途径，诸如吸入气雾剂制剂，尤其用于递送至肺或支气管组织、咽喉或鼻粘膜。此外，裸DNA构建体可在血管成形术期间由本方法中所用的导管递送至动脉。

裸多核苷酸由本领域已知任何方法递送，包括但不限于，在递送部位直接针头注射、静脉内注射、局部施用、导管输注、和所谓″基因枪″。这些递送方法是本领域已知的。

构建体也可与递送载体诸如病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、lipofectin、沉淀剂等一起递送。这类递送方法是本领域已知的。

在一些实施方式中，多核苷酸构建体被复合在脂质体制剂中。用于本发明的脂质体制剂包含阳离子(带正电荷)、阴离子(带负电荷)和中性制剂。然而可使用阳离子脂质体，因为在阳离子脂质体和聚阴离子核酸之间可形成紧密电荷复合体。已显示阳离子脂质体介导细胞内递送功能形式的质粒DNA(Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1987)84：7413-7416，其在此通过引用并入)；mRNA(Malone等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1989)86：6077-6081，其在此通过引用并入)；和纯化转录因子(Debs等，J.Biol.Chem.(1990)265：10189-10192，其在此通过引用并入)。

阳离子脂质体易于获得。例如，N[1-2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三乙基铵(DOTMA)脂质体尤其有用并以商标Lipofectin可从GIBCO BRL，GrandIsland，N.Y.获得(还见于Feigner等，Proc.Natl Acad.Sci USA(1987)84：7413-7416，其在此通过引用并入)。其它商业上可获得的脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。

其它阳离子脂质体可使用本领域熟知技术从易于获得的材料制备。见于如PCT公布第WO 90/11092号(其在此通过引用并入)，描述了合成DOTAP(1，2-双(油酰基氧基)-3-(三甲基铵)丙烷)脂质体。制备DOTMA脂质体描述于文献，见于如，P.Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：7413-7417，其在此通过引用并入。相似方法可用于从其它阳离子脂质材料制备脂质体。

类似地，阴离子和中性脂质体易于诸如从Avanti Polar Lipids(Birmingham，Ala.)获得，或可使用易于获得的材料易于制备。这类材料包含磷脂酰、胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰(phoshatidyl)乙醇胺(DOPE)以及其它。这些材料还可以合适的比例与DOTMA和DOTAP起始材料混合。使用这些材料制备脂质体的方法是本领域熟知的。

例如，可以各种组合使用市售的二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)并添加或不添加胆固醇以制备常规脂质体。因此例如，可通过在氮气流下干燥各50mg的DOPG和DOPC到超声处理小瓶而制备DOPG/DOPC小泡(vesicle)。将样品置于真空泵下过夜并在次日以去离子水水合。随后使用装有颠倒杯(浴型)探针的Heat Systems 350型超声处理仪以最大设置将样品在加盖小瓶中超声处理2小时，同时将水浴在15摄氏度循环。可选地，可不经超声处理制备带负电荷的小泡以产生多层小泡或挤压通过核孔膜以产生不同尺寸的单层小泡。其它方法是已知的并对本领域技术人员是可获得的。

脂质体可包括多层小泡(MLV)、小单层小泡(SUV)、或大的单层小泡(LUV)，其中SUV是特定实施方式。使用本领域熟知方法制备各种脂质体-核酸复合体。见于如，Straubinger等，Methods of Immunology(1983)，101：512-527，其在此通过引用并入。例如，可通过将磷脂薄膜沉积在玻璃管壁上并随后以待被包覆的材料的溶液水合而制备含有核酸的MLV。通过延长的超声处理MLV以产生均匀群体的单层脂质体而制备SUV。将待被捕获的材料加入预成形的MLV的悬浮液，随后超声处理。当使用含有阳离子脂质的脂质体时，干燥的脂质膜重悬于合适的溶液诸如无菌水或等渗缓冲溶液诸如10mM Tris/NaCl中，超声处理，且随后将预成形的脂质体直接与DNA混合。由于带正电荷的脂质体结合于阳离子DNA，脂质体与DNA形成稳定的复合物。SUV用于小核酸片段。LUV由本领域熟知大量方法制备。常用方法包括Ca²⁺-EDTA螯合(Papahadjopoulos等，Biochim.Biophys.Acta(1975)394：483；Wilson等，Cell 17：77(1979))；醚注射(Deamer，D.和Bangham，A.，Biochim.Biophys.Acta 443：629(1976)；Ostro等，Biochem.Biophys.Res.Commun.76：836(1977)；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 76：3348(1979))；洗涤剂透析(Enoch，H.和Strittmatter，P.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 76：145(1979))；和反相蒸发(REV)(Fraley等，J.Biol.Chem.255：10431(1980)；Szoka，F.和Papahadjopoulos，D.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 75：145(1978)；Schaefer-Ridder等，Science 215：166(1982))，上述文件在此通过引用并入。

通常，DNA与脂质体的比例为从约10∶1至约1∶10。在一个实施方式中，比例为从约5∶1至约1∶5。在另一实施方式中，比例为约3∶1至约1∶3。在另一实施方式中，比例为约1∶1。

美国专利第5,676,954号(其在此通过引用并入)报道了将与阳离子脂质体载体复合的遗传材料注射到小鼠。美国专利第4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055号，和国际公布第WO 94/9469号(其在此通过引用并入)提供用于将DNA转染到细胞和哺乳动物的阳离子脂质。美国专利第5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055号、和国际公布第WO 94/9469号提供将DNA-阳离子脂质复合体递送到哺乳动物的方法。

在一些实施方式中，使用含有包括编码本发明的清蛋白融合蛋白的序列的RNA的逆转录病毒颗粒活体外或体内改造细胞。可从中衍生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾脏坏死病毒、劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、鸟类造白细胞组织增生病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。

采用逆转录病毒质粒载体来转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞的例子包括但不限于，PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系，如Miller，Human Gene Therapy 1：5-14(1990)中所述的，其在此以其整体通过引用并入。载体可经由本领域已知任何方式转导包装细胞。这种方式包括但不限于，电穿孔、使用脂质体和CaPO₄沉淀。在一个选择方案，逆转录病毒质粒载体可被包覆入脂质体或偶联于脂质，随后施用于宿主。

生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，其包括编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。随后可采用这种逆转录病毒载体颗粒体外或体内地转导真核细胞。转导的真核细胞将表达本发明的融合蛋白(protin)。

在一些其它实施方式中，细胞以腺病毒载体中含有的多核苷酸活体外或体内改造。可操纵腺病毒以使其编码和表达本发明的融合蛋白，且同时其在正常溶解病毒生命周期中复制的能力被失活。实现腺病毒表达而不将病毒DNA整合到宿主细胞染色体中，从而减轻了关于插入诱变的问题。此外，多年来腺病毒已被用作活的肠疫苗，具有优异的安全性(Schwartz等Am.Rev.Respir.Dis.109：233-238(1974))。最终，腺病毒介导的基因转移已在大量情形中被证明，包括将α-1-抗胰蛋白酶和CFTR转移到棉鼠肺中(Rosenfeld，M.A.等(1991)Science 252：431-434；Rosenfeld等，(1992)Cell 68：143-155)。此外，试图确定腺病毒为人类癌症的致病因子的广泛研究一律是否定的(negative)(Green，M.等(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：6606)。

可用于本发明的合适的腺病毒载体描述于例如，Kozarsky和Wilson，Curr.Opin.Genet.Devel.3：499-503(1993)；Rosenfeld等，Cell 68：143-155(1992)；Engelhardt等，Human Genet.Ther.4：759-769(1993)；Yang等，Nature Genet.7：362-369(1994)；Wilson等，Nature 365：691-692(1993)；和美国专利第5,652,224号，其在此通过引用并入。例如，腺病毒载体Ad2可用并可在人类293细胞中生长。这些细胞含有腺病毒的E1区并组成型地表达E1a和E1b，这通过提供该从载体缺失的基因的产物而与缺陷型腺病毒互补。除了Ad2，其它种类的腺病毒(如，Ad3、Ad5和Ad7)也可用于本发明。

在一个实施方式中，用于本发明的腺病毒是复制缺陷的。复制缺陷的腺病毒需要辅助病毒和/或包装细胞系的帮助来形成感染性颗粒。所得的病毒能够感染细胞并可表达可操作地连接于启动子的感兴趣的多核苷酸，但在大多数细胞中不能复制。复制缺陷的腺病毒可缺失一种或多种所有或部分的以下基因：E1a、E1b、E3、E4、E2a、或L1至L5。

在一些其它实施方式中，使用腺伴随病毒(AAV)活体外或体内地改造细胞。AAV是天然存在的缺陷病毒，需要辅助病毒来产生感染性颗粒(Muzyczka，N.，Curr.Topics in Microbiol.Immunol.158：97(1992))。它还是可将其DNA整合到非-分裂细胞中的少数病毒之一。含有少至300碱基对的AAV的载体可被包装并可整合，但对外源DNA的空间限于约4.5kb。产生和使用这种AAV的方法是本领域已知的。见于例如，美国专利第5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,935、5,478,745和5,589,377号。

例如，用于本发明的合适的AAV载体将包括DNA复制、壳体化和宿主-细胞整合必需的所有序列。使用标准克隆方法，诸如Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1989)中所述的那些将多核苷酸构建体插入到AAV载体中。随后使用任何标准技术，包括脂质转染法、电穿孔、磷酸钙沉淀等将重组AAV载体转染到感染了辅助病毒的包装细胞。合适的辅助病毒包括腺病毒；巨细胞病毒、痘苗病毒或疱疹病毒。转染和感染包装细胞后，包装细胞将产生含有多核苷酸构建体的感染性AAV病毒颗粒。这些病毒颗粒随后用于活体外或体内地转导真核细胞。转导的细胞将含有整合入其基因组的多核苷酸构建体，并将表达本发明的融合蛋白。

另一种基因治疗方法包括经由同源重组可操作地连接异源控制区和内源多核苷酸序列(如编码本发明的多肽)(见于如，1997年6月24日授权的美国专利第5,641,670号；1996年9月26日公布的国际公布第WO 96/29411号；1994年8月4日公布的国际公布第WO 94/12650号；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，Nature 342：435-438(1989)，其在此通过引用并入。该方法包括活化存在于靶细胞中但通常在该细胞中不表达或以低于期望的水平表达的基因。

使用本领域已知标准技术制备多核苷酸构建体，其含有启动子和启动子侧翼的靶向序列。合适的启动子是本文所述的。靶向序列与内源序列足够互补以允许同源重组启动子-靶向序列与内源序列。靶向序列将足够靠近期望的内源多核苷酸序列的5′端，从而启动子将在同源重组后可操作地连接于内源序列。

可使用PCR扩增启动子和靶向序列。在一个实施方式中，扩增的启动子在5′和3′端含有不同的限制性酶切位点。在另一实施方式中，第一靶向序列的3′端与扩增的启动子的5′端含有相同的限制性酶切位点，且第二靶向序列的5′端与扩增的启动子的3′端含有相同的限制性酶切位点。扩增的启动子和靶向序列被消化并连接在一起。

启动子-靶向序列构建体作为裸多核苷酸或与转染-促进剂诸如脂质体、病毒序列、病毒颗粒、全病毒、脂质转染物、沉淀剂等一起递送至细胞，如上更详细地描述的。可由任何方法递送P启动子-靶向序列，包括直接针头注射、静脉内注射、局部施用、导管输注、颗粒加速器等。这些方法在以下更详细地描述。

启动子-靶向序列构建体被细胞获取。构建体和内源序列之间发生同源重组，以使内源序列被置于启动子控制之下。启动子随后驱动内源序列的表达。

编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可含有便于分泌蛋白的分泌信号序列。通常，信号序列位于待被表达的多核苷酸的编码区或在该编码区的5′端。信号序列可与感兴趣的多核苷酸同源或异源并可与待被转染的细胞同源或异源。此外，可使用本领域已知方法化学合成信号序列。

可使用任何方式施用任何上述多核苷酸构建体，只要该方式导致一种或多种分子以足以提供治疗作用的量表达。这包括直接针头注射、系统注射、导管输注、生物射弹注射器(biolistic injector)、粒子加速器(即″基因枪″)、凝胶泡沫海绵贮器(gelfoam sponge depots)、其它商业上可获得贮器材料、渗透泵(如，Alza微型泵)、口服或栓剂固态(片或丸)药物制剂、和在手术期间倾析(decanting)或局部施用。例如，将裸磷酸钙-沉淀的质粒直接注射到大鼠肝脏和大鼠脾脏或将蛋白-包被的质粒直接注射到门静脉已经导致外来基因在大鼠肝脏中的基因表达(Kaneda等，Science 243：375(1989))。

在一个实施方式中，局部施用方法是通过直接注射。在另一实施方式中，与递送载体复合的本发明的清蛋白融合蛋白通过直接注射入动脉施用或局部施用在动脉区域内。将组合物局部施用在动脉区域内指在动脉数厘米范围内和在一个实施方式在动脉数毫米范围内注射组合物。

另一种局部施用方法是在手术伤口中或周围接触本发明的多核苷酸构建体。例如，患者可经历手术且多核苷酸构建体可被涂覆在伤口内组织表面或构建体可被注射到伤口内组织区域内。

可用于系统施用的治疗组合物包括与本发明的靶向的递送载体复合的本发明的融合蛋白。用于系统施用的合适的递送载体包括包含配体的脂质体以使载体靶向于特定部位。在具体的实施方式中，用于系统施用的合适的递送载体包括包含本发明的清蛋白融合蛋白的脂质体以使载体靶向于特定部位。

在一个实施方式中，系统施用方法包括静脉内注射、气雾剂、口服和经皮(局部)递送。静脉内注射可使用本领域中标准方法进行。气雾剂递送也可使用本领域标准方法进行(见于例如，Stribling等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA189：11277-11281，1992，其在此通过引用并入)。口服递送可通过使本发明的多核苷酸构建体与能够经受动物肠道中消化酶的降解的载体复合而进行。这种载体的例子包含塑封胶囊或片剂，诸如本领域已知的那些。局部递送可由混合本发明的多核苷酸构建体与能够穿过皮肤的亲脂试剂(如，DMSO)而进行。

确定待递送物质的有效量可取决于大量因素，包括例如，物质的化学结构和生物活性、动物年龄和重量、需要治疗的准确病症和其严重度、和施用途径。治疗频率取决于大量因素，诸如每剂量施用多核苷酸构建体的量、以及受治疗者的健康状态和病史。将由主治医师或兽医确定准确量、剂量数目、和给药的时间安排。

本发明的清蛋白融合蛋白可施用于任何动物，例如，哺乳动物和鸟类。示例性哺乳动物包括人、犬、猫、小鼠、大鼠、兔、羊、牛、马和猪，人为特定实施方式。

生物活性

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在测定中测试一种或多种生物活性。如果清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸在特定测定中表现活性，很可能对应于融合蛋白(portein)的治疗蛋白可牵涉在与该生物活性相关的疾病中。因此融合蛋白可用于治疗相关疾病。

在一些实施方式中，本发明涵盖治疗列于表1″适应症Y″列的疾病或疾患的方法，包括向期望这种治疗、预防或缓解的患者以有效治疗、预防或缓解疾病或疾患的量施用本发明的清蛋白融合蛋白，该融合蛋白包含对应于公开于表1″治疗蛋白X″列(与列在表1″适应症Y″列的待治疗的疾病或疾患同一行)的治疗蛋白的治疗蛋白部分。

在另外的实施方式中，本发明涵盖治疗对特定治疗蛋白列在表1的″适应症：Y″列的疾病或疾患的方法，包括向期望这种治疗、预防或缓解的患者以有效治疗、预防或缓解疾病或疾患的量施用本发明的清蛋白融合蛋白，该融合蛋白包含对应于与实施例中适应症相关的治疗蛋白的治疗蛋白部分。

本发明具体地包括编码SEQ ID NO：Y的多核苷酸所编码的细胞产生的清蛋白融合蛋白。当这些多核苷酸用于从细胞表达编码的蛋白时，细胞的天然分泌和加工步骤产生缺少明确地列在表2的列4和/或11的信号序列的蛋白。所列信号序列的具体氨基酸序列显示在本说明书中或是本领域熟知的。因此在一些实施方式中，本发明包含由细胞产生的清蛋白融合蛋白(缺少表2的列4和/或11显示的前导序列)。还在其它实施方式中，多肽包括SEQ IDNO：Y而没有列在表2的列4和/或11的具体前导序列。也可提供包括这两种实施方式的组合物(包含药物组合物)。特异性地包括这些清蛋白融合蛋白以治疗、预防或缓解对特定治疗蛋白的列在表1的″适应症：Y″列的疾病或疾患。

在一些实施方式中，本发明的融合蛋白可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗涉及内分泌系统(见于例如，以下″内分泌疾患″部分)、神经系统(见于例如，以下″神经疾患″部分)、免疫系统(见于例如，以下″免疫活性″部分)、呼吸系统(见于例如，以下″呼吸疾患″部分)、心血管系统(见于例如，以下″心血管疾患″部分)、生殖系统(见于例如，以下″生殖系统疾患″部分)、消化系统(见于例如，以下″胃肠疾患″部分)的疾病和疾患的疾病和/或疾患、涉及细胞增殖的疾病和/或疾患(见于例如，以下″过度增殖疾患″部分)、和/或涉及血液的疾病或疾患(见于例如，以下″血液-相关疾患″部分)。

在一些实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白可用于诊断和/或预后评估与其中表达对应于本发明的融合蛋白的治疗蛋白部分的基因的组织相关的疾病和/或疾患。

因此本发明的融合蛋白和编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于诊断、测定和/或治疗与活性相关的疾病和/或疾患，所述活性包括但不限于，激素原活化、神经递质活性、细胞信号传导、细胞增殖、细胞分化和细胞迁移。

更一般地，本发明的融合蛋白和编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗与以下系统相关的疾病和/或疾患。

免疫活性

本发明的清蛋白融合蛋白和编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估免疫系统的疾病、疾患和/或病症，通过例如，活化或抑制免疫细胞的增殖、分化或移动(mobility)(趋化性)。免疫细胞经由称为血细胞生成的过程而产生，从多能干细胞产生髓细胞(血小板、红细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)和淋巴样细胞(B和T淋巴细胞)。这些免疫疾病、疾患和/或病症的病因学可为遗传的、体细胞的(诸如癌症和一些自身免疫疾病)、获得性(如，由化疗或毒素)或感染性的。而且，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作特定免疫系统疾病或疾患的标记或检测物。

在另一实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗免疫系统的疾病和疾患和/或抑制或增强与其中表达本发明的多肽的组织相关的细胞产生的免疫应答。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估免疫缺陷，包括先天的和获得性免疫缺陷。其中免疫球蛋白水平B细胞功能和/或B细胞数目减少的B细胞免疫缺陷的例子包括：X-连锁无丙种球蛋白血症(布鲁顿氏病)、X-连锁婴幼儿无丙种球蛋白血症、X-连锁免疫缺陷伴高IgM、非X-连锁免疫缺陷伴高IgM、X-连锁淋巴细胞增生综合征(XLP)、无丙种球蛋白血症包括先天的和获得性无丙种球蛋白血症、成人初发性无丙种球蛋白血症、迟发性无丙种球蛋白血症、丙种球蛋白异常血症、低丙种球蛋白血症、非特异性低丙种球蛋白血症、隐性无丙种球蛋白血症(Swiss型)、选择性IgM缺陷、选择性IgA缺陷、选择性IgG亚类缺陷、IgG亚类缺陷(有或没有IgA缺陷)、Ig缺陷伴IgM增加、IgG和IgA缺陷伴IgM增加、伴有正常或升高Ig的抗体缺陷、Ig重链缺失、κ链缺陷、B细胞淋巴增生疾患(BLPD)、普通变异型免疫缺陷(CVID)、普通变异型免疫缺陷(CVI)(获得性)、和婴幼儿暂时性低丙种球蛋白血症。

在具体的实施方式中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预后评估共济失调-毛细血管扩张症或与共济失调-毛细血管扩张症相关的病症。

其中T细胞和/或B细胞功能和/或数目减少的先天免疫缺陷的例子包括但不限于：DiGeorge畸形(DiGeorge anomaly)、重症组合免疫缺陷(SCID)(包括但不限于，X-连锁SCID、常染色体隐性SCID、腺苷脱胺酶缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺陷、II类MHC缺陷(裸淋巴细胞综合征)、维-奥二氏综合征和共济失调性毛细血管扩张症)、胸腺发育不全、第三和第四咽囊综合征、22q11.2缺失、慢性粘膜皮肤念珠菌病、自然杀伤细胞缺陷(NK)、先天性CD4+T-淋巴细胞减少症、主要T细胞缺陷(非特异性)伴免疫缺陷、和细胞介导的免疫的非特异性免疫缺陷。

在具体的实施方式中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预后评估DiGeorge畸形或与DiGeorge畸形相关的病症。

使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防、诊断和/或预后评估的其它免疫缺陷包括但不限于，慢性肉芽肿病、切-东二氏综合征、髓过氧化物酶缺陷、白细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、X-连锁淋巴细胞增生综合征(XLP)、白细胞粘附缺陷、补体成分缺陷(包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和/或C9缺陷)、网状细胞发育不全、胸腺淋巴组织发育不全-不发育、免疫缺陷伴胸腺瘤、重症先天白细胞减少、发育异常伴免疫缺陷、新生嗜中性粒细胞减少、短肢侏儒症，和内兹罗夫综合征-组合Ig免疫缺陷(Nezelof syndrome-combined immunodeficiency withIgs)。

在一个实施方式中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预后评估免疫缺陷和/或与上述免疫缺陷相关的病症。

在一个实施方式本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作在免疫缺陷个体当中加强免疫应答的药剂。在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作在B细胞和/或T细胞免疫缺陷个体当中加强免疫应答的药剂。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估自身免疫疾患。许多自身免疫疾患是由于免疫细胞不恰当地将自身识别为外源材料。这种不恰当的识别导致免疫应答，造成破坏宿主组织。因此，施用可抑制免疫应答，尤其是T细胞增殖、分化、或趋化性的本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可为防止自身免疫疾患的有效治疗。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防、诊断和/或预后评估的自身免疫疾病或疾患包括但不限于以下一种或多种：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、溶血性贫血、血小板减少症、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性新生血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、紫癜(如，过敏性紫癜(Henloch-Scoenleinpurpura))、自身免疫性细胞减少症、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯病(甲状腺功能亢进症)和胰岛素抗性糖尿病(diabetesmellitus)。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防和/或诊断的可能具有自身免疫成分的其它疾患包括但不限于，II型胶原-引起的关节炎、抗磷脂综合征、皮炎、过敏性脑脊髓炎、心肌炎、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、神经炎、眼葡萄膜炎(uveitisophthalmia)、多内分泌腺疾病、莱特氏病、僵体综合征、自身免疫性肺炎症、孤独症、格-巴二氏综合征、胰岛素依赖性糖尿病和自身免疫性炎性眼疾患。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防、诊断和/或预后评估的可能具有自身免疫成分的其它疾患包括但不限于，具有抗-胶原抗体的硬皮病(常通过如，核仁和其它核抗体表征)、混合型结缔组织病(常通过如，对可提取的核抗原的抗体(如核糖核蛋白)表征)、多肌炎(常通过如，非组蛋白ANA表征)、恶性贫血(常通过如，抗壁细胞、微粒体和内因子抗体表征)、先天性阿狄森氏病(常通过如，体液和细胞-介导的肾上腺细胞毒性表征、不育症(常通过如，抗精子抗体表征)、肾小球性肾炎(常通过如，肾小球基底膜抗体或免疫复合体表征)、大疱性类天疱疮(常通过如，基底膜中的IgG和补体表征)、斯耶格伦氏综合征(常通过如，多组织抗体和/或特异性非组蛋白ANA(SS-B)表征)、糖尿病(常通过如，细胞-介导的和体液胰岛细胞抗体表征)、和肾上腺素能药物抗性(包括肾上腺素能药物抗性伴哮喘或囊性纤维化)(常通过如，β-肾上腺素能受体抗体表征)。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防、诊断和/或预后评估的可能具有自身免疫成分的其它疾患包括但不限于，慢性活动性肝炎(常通过如，平滑肌抗体表征)、原发性胆汁性肝硬化(常通过如，线粒体抗体表征)、其它内分泌腺体衰竭(在一些情形常通过如，特异性组织抗体表征)、白癜风(常通过如，黑素细胞抗体表征)、血管炎(常通过如，Ig和血管壁中补体和/或低血清补体表征)、心肌梗死后(post-MI)(常通过如，心肌抗体表征)、心切开术综合征(常通过如，心肌抗体表征)、荨麻疹(常通过如，IgG和IgM抗体至IgE表征)、特应性皮炎(常通过如，IgG和IgM抗体至IgE表征)、哮喘(常通过如，IgG和IgM抗体至IgE表征)、和许多其它炎性、肉芽肿性、退行性和萎缩性疾患。

在一个实施方式中，使用例如本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预后评估与上述疾病和疾患相关的自身免疫疾病和疾患和/或病症。在具体的实施方式中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防和/或诊断类风湿性关节炎。

在另一个具体实施方式中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防和/或诊断系统性红斑狼疮。在另一个具体实施方式中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防和/或诊断特发性血小板减少性紫癜。

在另一特定实施方式使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防和/或诊断IgA肾病。

在一个实施方式中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预后评估与上述疾病和疾患相关的自身免疫疾病和疾患和/或病症。

在一些实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作免疫抑制剂。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、预后评估和/或诊断造血细胞的疾病、疾患和/或病症。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加造血细胞包括多能干细胞的分化和增殖，以致力于治疗或预防与一些(或许多)类型造血细胞减少相关的疾病、疾患和/或病症，包括但不限于，白细胞减少症、嗜中性粒细胞减少症、贫血症和血小板减少症。可选地，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加造血细胞包括多能干细胞的分化和增殖，以治疗或预防与一些(或许多)类型造血细胞增加相关的疾病、疾患和/或病症，包括但不限于组织细胞增多病。

使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可治疗、预防、诊断和/或预后评估过敏反应和病症，诸如哮喘(尤其是过敏性哮喘)或其它呼吸问题。而且，这些分子可用于治疗、预防、预后评估和/或诊断过敏反应、对抗原分子超敏反应或血型不相容。

此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估IgE-介导的过敏反应。这种过敏反应包括但不限于哮喘、鼻炎和湿疹。在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于体外或体内调节IgE浓度。

而且，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗炎性病症。例如，由于本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可抑制炎性反应中涉及的细胞的活化、增殖和/或分化，因此这些分子可用于预防和/或治疗慢性和急性炎性病症。这种炎性病症包括但不限于，例如，与感染相关的炎症(如，感染性休克、败血病、或系统炎性反应综合征)、缺血-再灌注损伤、内毒素致死、补体-介导的超急性排斥、肾炎、细胞因子或趋化因子诱导的肺损伤、炎性肠病、克隆氏病、细胞因子(如，TNF或IL-1)过度产生、呼吸疾患(如，哮喘和过敏症)；胃肠疾患(如，炎性肠病)；癌症(如，胃、卵巢、肺、膀胱、肝脏和乳腺)；CNS疾患(如，多发性硬化；缺血性脑损伤和/或中风、外伤性脑损伤、神经退行性疾患(如，帕金森病和阿尔茨海默病)；AIDS-相关的痴呆；和朊蛋白病)；心血管疾患(如，动脉硬化、心肌炎、心血管疾病和心肺旁路并发症)；以及许多特征为炎症的其它疾病、病症和疾患(如，肝炎、类风湿性关节炎、痛风、外伤、胰腺炎、结节病、皮炎、肾缺血-再灌注损伤、格雷夫斯病、系统性红斑狼疮、糖尿病和同种异体移植排斥)。

因为炎症是基本防御机制，炎性疾患可影响身体的几乎任何组织。因此，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗组织-特异性炎性疾患，包括但不限于，肾上腺炎、肺泡炎、胆管胆囊炎、阑尾炎、龟头炎、眼睑炎、支气管炎、滑囊炎、心脏炎(carditis)、蜂窝组织炎、子宫颈炎、胆囊炎、声带炎、耳蜗炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、皮炎、憩室炎、脑炎、心内膜炎、食道炎、咽鼓管炎、纤维组织炎、毛囊炎、胃炎、肠胃炎、齿龈炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉炎、淋巴管炎、乳腺炎、中耳炎、脑膜炎、子宫炎、粘膜炎、心肌炎、肌炎(myosititis)、鼓膜炎、肾炎、神经炎、睾丸炎、骨软骨炎、耳炎、心囊炎、腱鞘炎(peritendonitis)、腹膜炎、咽炎、静脉炎、脊髓灰质炎、前列腺炎、牙髓炎、视网膜炎、鼻炎、输卵管炎、巩膜炎、巩膜脉络膜炎、阴囊炎、窦炎、脊椎炎、脂肪组织炎、口腔炎、滑膜炎、咽鼓管炎、腱炎、扁桃体炎、尿道炎和阴道炎。

在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗器官移植排斥和移植物抗宿主病。器官排斥由宿主免疫细胞经由免疫应答破坏移植的组织而发生。类似地，免疫应答还涉及GVHD，但在这种情形，外源移植的免疫细胞破坏宿主组织。本发明的抑制免疫应答、尤其是T-细胞的活化、增殖、分化、或趋化多肽、抗体或多核苷酸、和/或其激动剂或拮抗剂可为预防器官排斥或GVHD的有效治疗。在具体的实施方式中，本发明的抑制免疫应答、尤其是T-细胞的活化、增殖、分化、或趋化的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可为预防实验性过敏和超急性异体移植排斥的有效治疗。

在其它实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗免疫复合物病，包括但不限于，血清病、链球菌感染后肾小球肾炎、结节性多动脉炎和免疫复合物引起的血管炎。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、测定和/或预防感染原(infectious agent)。例如，通过增加免疫应答，尤其是增加B和/或T细胞的增殖、活化和/或分化，可治疗、测定和/或预防感染性疾病。可通过增强已有的免疫应答或通过开始新的免疫应答来增加免疫应答。可选地，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可直接抑制感染原(参考本申请列出感染原的部分等等)，而不必引发免疫应答。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作增强对抗原的免疫响应性的疫苗佐剂。在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作增强肿瘤-特异性免疫应答的佐剂。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作增强抗病毒免疫应答的佐剂。可使用本发明的组合物作为佐剂而增强的抗病毒免疫应答包括本文所述的或以其它方式为本领域所知的病毒和病毒相关疾病或症状。在特定实施方式中，本发明的组合物用作佐剂来增强对选自由以下组成的组的病毒、疾病或症状的免疫应答：AIDS、脑膜炎、登革热、EBV和肝炎(如，乙型肝炎)。在另一特定实施方式中，本发明的组合物用作佐剂来增强对选自由以下组成的组的病毒、疾病或症状的免疫应答：HIV/AIDS、呼吸合胞病毒、登革热、轮状病毒、日本乙型脑炎、甲型和乙型流感、副流感、麻疹、巨细胞病毒、狂犬病、胡宁热、基孔肯雅病、立夫特山谷热、单纯疱疹和黄热病。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作增强抗-细菌或抗-真菌免疫应答的佐剂。使用本发明的组合物作为佐剂可增强的抗-细菌或抗-真菌免疫应答包括本文所述的或以其它方式为本领域所知的细菌或真菌和细菌或真菌相关疾病或症状。在特定实施方式中，本发明的组合物用作佐剂来增强针对选自由以下组成的组的细菌或真菌、疾病或症状的免疫应答：破伤风、白喉、肉毒中毒和乙型脑膜炎。

在另一特定实施方式中，本发明的组合物用作佐剂来增强对选自由以下组成的组的细菌或真菌、疾病或症状的免疫应答：霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、脑膜炎萘瑟氏菌(Meisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、B组链球菌、志贺氏菌属某些种(Shigella spp.)、肠产毒性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌和博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作佐剂来增强抗寄生物免疫应答。使用本发明的组合物作为佐剂可增强的抗寄生物免疫应答包括本文所述的或以其它方式为本领域所知的寄生物和寄生物相关疾病或症状。在特定实施方式中，本发明的组合物用作佐剂来增强对寄生物的免疫应答。在另一特定实施方式中，本发明的组合物用作佐剂来增强对疟原虫(疟疾)或利什曼原虫的免疫应答。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于治疗感染性疾病，包括硅肺病、结节病和特发性肺纤维化，例如通过防止单核吞噬细胞的募集和活化。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作抗原来产生抗体以抑制或增强针对本发明的多肽的免疫介导的响应。

在一个实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸施用于动物(如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪(micro-pig)、鸡、骆驼、山羊、马、牛、绵羊、犬、猫、非人灵长类和人类，在特定实施方式中为人类)来加强免疫系统以产生增加量的一种或多种抗体(如，IgG、IgA、IgM和IgE)以诱导更高亲和力抗体的产生和免疫球蛋白类转换(如，IgG、IgA、IgM和IgE)和/或以增加免疫应答。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作B细胞对病原体响应性的刺激物。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作T细胞的活化物。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作在个体接受免疫抑制疗法之前提升其免疫状态的药剂。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作诱导更高亲和力的抗体的药剂。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作增加血清免疫球蛋白浓度的药剂。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作加快免疫妥协的个体的恢复的药剂。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作对年老群体和/或新生儿加强免疫应答的药剂。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸在骨髓移植和/或其它移植(如，同种或异种器官移植)之前、期间或之后用作免疫系统增强剂。对于移植，可在移植之前、同时和/或之后施用本发明的组合物。在特定实施方式中，在移植后、在T细胞群体的恢复开始之前施用本发明的组合物。在另一特定实施方式中，在移植后，于T细胞群体开始恢复之后但在B细胞群体完全恢复之前首次施用本发明的组合物。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作对患有获得性B细胞功能丧失的个体加强免疫响应性的药剂。导致可通过施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来缓解或治疗的获得性B细胞功能丧失的状况包括但不限于，HIV感染、AIDS、骨髓移植、和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作对患有暂时性免疫缺陷的个体加强免疫应答的药剂。导致可通过施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来缓解或治疗的暂时性免疫缺陷的状况包括但不限于，从病毒感染(如，流感)的恢复、与营养不良相关的病症、从感染性单核细胞增多症的恢复、或与应激相关的病症、从麻疹的恢复、从输血的恢复、和从手术的恢复。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作单核细胞、树突细胞和/或B-细胞的抗原呈递的调节剂。在一个实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸体外或体内增强抗原呈递或拮抗抗原呈递。而且，在相关实施方式中，该抗原呈递的增强或拮抗可用作抗-肿瘤治疗或用以调节免疫系统。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作引导个体的免疫系统朝向发展与TH1细胞应答相反的体液应答(即TH2)的药剂。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作诱导肿瘤增殖，并由此使其对抗肿瘤剂更易感的手段。例如，多发性骨髓瘤是缓慢分裂性疾病，因此是几乎所有抗-肿瘤疗法都难以治疗它。如果迫使这些细胞更快地增殖，那么可能改变它们的易感性特征。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸在诸如AIDS、慢性淋巴细胞疾患和/或普通变异型免疫缺陷(Common Variable Immunodificiency)等病理学中用作B细胞产生的刺激物。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作在手术、外伤或遗传缺陷后产生和/或再生淋巴组织的疗法。在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于在移植前预处理骨髓样品。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作治疗导致免疫功能不全/免疫缺陷(诸如在SCID患者中观察到的)的遗传承受(genetically inherited)的疾患的基于基因的疗法。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作活化单核细胞/巨噬细胞的手段以防御影响单核细胞的寄生性疾病诸如利什曼原虫。

在另一特定实施方式中，利用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为手段来调节由本发明的多肽引发产生的被分泌的细胞因子。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于本文所述的一种或多种应用，因为它们可应用于兽医学。

在另一特定实施方式中，利用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为手段来阻止针对外来物质或自身的免疫应答的各个方面。期望阻止免疫应答的某些方面的疾病或病症的例子包括自身免疫疾患诸如狼疮和关节炎，以及对皮肤过敏症、炎症、肠病、损伤和与病原体相关的疾病/疾患的免疫响应性。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作预防与自身免疫疾病诸如特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮和多发性硬化相关的B细胞增殖和Ig分泌的疗法。

在另一特定实施方式中，本发明的多肽、抗体、多核苷酸和/或本发明的融合蛋白的激动剂或拮抗剂和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作B和/或T细胞在内皮细胞迁移的抑制剂。该活性破坏组织结构或天然应答，并可用于例如中断免疫应答和阻止败血病。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗如意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、沃尔丹斯特伦病(Waldenstrom’s disease)、相关的特发性单克隆丙种球蛋白病和浆细胞瘤等疾病中明显的慢性高丙种球蛋白血症。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于例如在某些自身免疫和慢性炎性和感染性疾病中抑制巨噬细胞及其前体和嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B淋巴细胞和一些T-细胞亚群如活化T细胞和CD8细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的活化及多肽趋化性。自身免疫疾病的例子在本文中有记载，包括多发性硬化和胰岛素依赖性糖尿病。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于治疗特发性嗜酸性粒细胞过多综合征，例如通过防止嗜酸性粒细胞的产生和迁移。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于增强或抑制补体介导的细胞裂解。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于增强或抑制抗体依赖性细胞细胞毒作用。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于治疗动脉硬化，例如通过防止单核细胞在动脉壁中的浸润。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于刺激伤口和组织修复、刺激血管发生、和/或刺激血管或淋巴疾病或疾患的修复。此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于刺激粘膜表面再生。

在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于诊断、预后评估、治疗和/或预防以原发性或获得性免疫缺陷、血清免疫球蛋白产生缺陷、复发性感染和/或免疫系统功能障碍为特征的疾患。而且，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防关节、骨、皮肤、和/或腮腺的感染、血液播散的感染(如，败血病、脑膜炎、脓毒性关节炎、和/或骨髓炎)、自身免疫疾病(如本文公开的自身免疫疾病)、炎性疾患、以及恶变、和/或与这些感染、疾病、疾患和/或恶变相关的任何疾病或疾患或病症，包括但不限于，CVID、其它原发性免疫缺陷、HIV疾病、CLL、复发性支气管炎、窦炎、中耳炎、结膜炎、肺炎、肝炎、脑膜炎、带状疱疹(如，严重带状疱疹)、和/或卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carnii)。可利用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来预防、诊断、预后评估和/或治疗的其它疾病和疾患包括但不限于，HIV感染、HTLV-BLV感染、淋巴细胞减少、吞噬细胞杀菌功能障碍性贫血、血小板减少症和血红蛋白尿。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗和/或诊断患有普通变异型免疫缺陷病(″CVID″；还称为″获得性无丙种球蛋白血症″和″获得性低丙种球蛋白血症″)或该病的子集的个体。

在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗癌症或新生物，包括免疫细胞或免疫组织-相关癌症或新生物。本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可预防、诊断或治疗的癌症或新生物的例子包括但不限于，急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞性贫血(ALL)慢性淋巴细胞性白血病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、伯基特淋巴瘤、EBV-转化的疾病、和/或本文别处标题为″过度增殖性疾患″的部分中所述的疾病和疾患。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作减少大B细胞淋巴瘤的细胞增殖的疗法。

在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作减少B细胞和Ig与慢性髓细胞性白血病相关的干系的手段。

在特定实施方式中，本发明的组合物用作在B细胞免疫缺陷个体(例如经历了部分或完整脾切除的个体)中加强免疫应答的药剂。

血液相关疾患

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于调节止血(停止出血)或血栓溶解(溶解血凝块)活性。例如，通过增加止血或血栓溶解活性，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防血液凝结疾病、疾患和/或病症(如，纤维蛋白原缺乏血症、凝血因子缺乏症、血友病)、血液血小板疾病、疾患和/或病症(如，血小板减少症)、或外伤、手术或其它原因造成的伤口。或者，可减少止血或血栓溶解活性的本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制或溶解血凝。这些分子在治疗或预防心脏病发作(梗死)、中风或瘢痕形成中可具有重要意义。

在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、诊断、预测和/或治疗血栓形成、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血栓栓塞、肺栓塞、动脉硬化、心肌梗死、短暂性缺血发作、不稳定心绞痛。在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防隐静脉移植物的阻塞(occulsion)，以降低血管成形术可能伴有的围手术期血栓形成(periprocedural thromosis)的风险，以降低患有心房颤动(包括非风湿性心房颤动)的患者中风的风险，以降低与人工心脏瓣和或二尖瓣疾病相关的栓塞风险。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的其它用途包括但不限于，防止身体外装置(Extrcorporeal device)(如，血管内插管、血液透析患者的血管通路分流器、血液透析机和心肺分流机)的阻塞。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、诊断、预测和/或治疗血液和/或与表达本发明的多肽的组织相关的血液形成器官的疾病和疾患。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于调节造血活性(形成血液细胞)。例如，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加所有血液细胞或其亚群的量，诸如例如，红细胞、淋巴细胞(B或T细胞)、骨髓细胞(如，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞)和血小板。减少血液细胞或血液细胞亚群的量的能力对于预防、检测、诊断和/或治疗下述的贫血和白细胞减少可能是有用的。或者，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于减少所有血液细胞或其亚群的量，诸如例如，红细胞、淋巴细胞(B或T细胞)、骨髓细胞(如，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞)和血小板。减少血液细胞或血液细胞亚群的量的能力可对于预防、检测、诊断和/或治疗白细胞增多(leukocytose)，诸如例如嗜酸性粒细胞增多是有用的。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、治疗或诊断血恶液质。

贫血是其中红细胞数目或红细胞中血红素(携带氧的蛋白)的量低于正常值的病症。贫血可由过量出血、红细胞产生的减少或红细胞破坏的增加(溶血)引起。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断贫血。可使用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防或诊断的贫血包括缺铁性贫血、低血色素贫血、小红细胞性贫血、绿色贫血(chlorosis)、遗传性铁粒幼细胞性贫血(siderob；astic anemia)、特发性获得性铁粒幼细胞性贫血、红细胞发育不全、巨幼细胞性贫血(如，恶性贫血(维生素B12缺乏)和叶酸缺乏性贫血)、再生障碍性贫血、溶血性贫血(如，自身免疫性溶血性贫血(helolytic anemia)、微血管病性溶血性贫血和突发性夜间血红蛋白尿)。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断与疾病相关的贫血，包括但不限于与系统性红斑狼疮、癌症、淋巴瘤、慢性肾病和脾肿大相关的贫血。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断药物治疗产生的贫血，诸如与甲基多巴、氨苯砜和/或磺胺药物相关的贫血。此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断与红细胞结构异常相关的贫血，包含但不限于遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏和镰状细胞性贫血。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断血红素异常(如，与镰状细胞性贫血、血红素C疾病、血红素S-C疾病和血红素E疾病相关的血红素异常)。此外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗地中海贫血，包括但不限于α-地中海贫血和β-地中海贫血的主要和次要形式。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗出血障碍，包括但不限于血小板减少症(如，特发性血小板减少性紫癜和血栓形成性血小板减少性紫癜)、Von Willebrand氏病、遗传性血小板疾患(如贮存池病(storagepool disease)诸如切-东二氏综合征和海-普二氏综合征、血栓素A2功能障碍、血小板机能不全和伯-索二氏综合征)、溶血性尿毒症综合征、血友病(hemophelia)诸如血友病(hemophelia)A或凝血因子VII缺乏和克里斯马斯病(Christmas disease)或凝血因子IX缺乏、遗传性出血性毛细血管扩张症(Hemorhhagic Telangiectsia)又称朗-奥-韦三氏综合征、过敏性紫癜(HenochSchonlein紫癜)和弥散性血管内凝血。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸对血液凝固时间的影响可使用本领域已知的任何凝血试验来监控，包括但不限于，全血部分促凝血酶原激酶时间(PTT)、活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)、活化凝血时间(ACT)、复钙活化凝血时间或李-怀二氏血凝时间。

数种疾病和多种药物可造成血小板功能障碍。因此在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗获得性血小板功能障碍，诸如伴随肾衰竭、白血病、多发性骨髓瘤、肝硬化、和系统性红斑狼疮的血小板功能障碍以及与药物治疗相关的血小板功能障碍，所述药物治疗包括高剂量的阿斯匹林、噻氯匹定、非类固醇抗炎药物(用于关节炎、疼痛和扭伤)和青霉素治疗。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗特征为白细胞数目增加或减少或与白细胞数目增加或减少相关的疾病和疾患。当白细胞数目减少到低于正常值时发生白细胞减少。白细胞减少包括但不限于嗜中性粒细胞减少和淋巴细胞减少。白细胞数目比正常值增加称为白细胞增多。身体在感染期间产生数目增加的白细胞。因此白细胞增多可能仅是反映感染的正常生理学参数。或者，白细胞增多可能指示损伤或其它疾病诸如癌症。白细胞增多(leukocytose)包括但不限于嗜酸性粒细胞增多和巨噬细胞聚集。在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗白细胞减少。在其它特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗白细胞增多。

白细胞减少可以是所有类型白细胞普遍减少，或者可以是特定的某些类型白细胞的耗竭。因此在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗称为嗜中性粒细胞减少的嗜中性粒细胞数目减少。可使用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防和/或治疗的嗜中性粒细胞减少包括但不限于幼儿遗传性粒细胞缺乏症、家族性嗜中性粒细胞减少、循环嗜中性粒细胞减少、饮食性缺乏(如，维生素B12缺乏或叶酸缺乏)造成的或与之相关的嗜中性粒细胞减少、药物治疗(如，抗生素疗法诸如青霉素治疗、氨磺胺(sulfonamide)治疗、抗凝血剂治疗、抗惊厥药物、抗甲状腺药物和癌症化疗)造成的或与之相关的嗜中性粒细胞减少、和嗜中性粒细胞破坏增加造成的嗜中性粒细胞减少，其中嗜中性粒细胞破坏增加可伴随于某些细菌或病毒感染、过敏疾患、自身免疫疾病、个体患有脾肿大的病症(如费尔蒂综合征、疟疾和结节病)和某些药物治疗方案而发生。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗淋巴细胞减少(B和/或T淋巴细胞数目减少)，包括但不限于由下述造成的或与之相关的淋巴细胞减少：应激、药物治疗(如皮质类固醇药物治疗、癌症化疗和/或放射疗法)、AIDS感染和/或其它疾病诸如例如，癌症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性感染、一些病毒感染和/或遗传性疾患(如，DiGeorge综合征、维-奥二氏综合征、重症联合免疫缺陷、毛细血管共济性失调(ataxia telangiectsia))。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗与巨噬细胞数目和/或巨噬细胞功能相关的疾病和疾患，包括但不限于高歇氏病、尼-皮二氏病、累-赛二氏病和汉-许-克三氏病。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗与嗜酸性粒细胞数目和/或嗜酸性粒细胞功能相关的疾病和疾患，包括但不限于特发性嗜酸性粒细胞过多综合征、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征和汉-许-克三氏病。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗白血病和淋巴瘤，包括但不限于急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性(lymphpblastic))白血病(ALL)、急性骨髓(髓细胞性、骨髓性、成髓细胞性或骨髓单核细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病(如，B细胞白血病、T细胞白血病、塞扎里综合征、和毛细胞白血病(leukenia))、慢性髓细胞性(骨髓、骨髓性或粒细胞性)白血病、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和蕈样肉芽肿病。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗浆细胞的疾病和疾患，包括但不限于浆细胞不调症、单克隆丙种球蛋白病(gammaopathies)、意义未定的单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、冷球蛋白血症和雷诺氏现象。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断骨髓增生疾患，包括但不限于真性红细胞增多症、相对性红细胞增多、继发性红细胞增多、骨髓纤维化、急性骨髓纤维化、病因不明的髓样化生(myelod metaplasia)、血小板增多(包括原发性和继发性血小板增多)和慢性髓细胞性白血病。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作手术前的治疗以增加血液细胞产生。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作增强嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的迁移、吞噬作用、超氧化物产生、抗体依赖性细胞的细胞毒性的药剂。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作在干细胞提取法之前增加循环中干细胞数目的药剂。在另一特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作在血小板提取法之前增加循环中干细胞数目的药剂。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作增加细胞因子产生的药剂。

在其它实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、诊断和/或治疗原发性造血疾患。

过度增殖疾患

在一些实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测过度增殖疾患，包括新生物。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可经由直接或间接相互作用而抑制疾患的增殖。或者，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可增殖其它可抑制过度增殖疾患的细胞。

例如，通过增加过度增殖疾患的免疫应答，尤其是增加过度增殖疾患的抗原性质，或通过增殖、分化或动员T细胞，可治疗过度增殖疾患。可通过增强已有的免疫应答或通过开始新的免疫应答来增加这种免疫应答。或者，减少免疫应答也可作为治疗过度增殖疾患的方法，诸如化疗剂。

可使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗或检测的过度增殖疾患的例子包括但不限于位于以下部位的新生物：结肠、腹部、骨、乳腺、消化系统、肝脏、胰脏、腹膜、内分泌腺体(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖道。

类似地，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可治疗或检测其它过度增殖疾患。这样的过度增殖疾患的例子包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人何杰金病、成人何杰金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非何杰金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS-相关淋巴瘤、AIDS-相关恶变、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童何杰金病、儿童何杰金淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非何杰金淋巴瘤、儿童松果腺和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌性胰腺癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、雌性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠瘤、生殖细胞瘤、妊娠期滋养层瘤、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰金病、何杰金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、喉咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生疾患、巨球蛋白血症、雄性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐性原发性鳞状上皮颈癌、转移性原发性鳞状上皮颈癌、转移性鳞状上皮颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞新生物、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、骨髓白血病、骨髓增生疾患、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、妊娠期非何杰金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐性原发性转移性鳞状上皮颈癌、口咽癌、骨-/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜在瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、紫癜、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞新生物/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉样瘤肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状上皮颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果腺瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯氏瘤、和位于上述器官系统中的任何其它过度增殖疾病，除了瘤形成以外。

在另一实施方式中，使用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防和/或治疗恶变前病症和防止向新生物或恶性状态(包括但不限于如上所述的疾患)的进展。这样的使用在下述情况下是有必要的：出现向新生物或恶性状态(包括但不限于如上所述的疾患)进展的先行状况(包括已知或可疑的先行状况)时，特别是已出现了包括增生、化生、特别是发育异常等非新生性细胞生长的状况时(对这种异常生长病症的综述见于Robbins和Angell，1976，Basic Pathology(基础病理学)，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页)。

增生是细胞受控增殖的一种形式，包括组织或器官中细胞数目增加而不显著改变结构或功能。可使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防和/或治疗的增生性疾患包括但不限于，血管滤泡纵隔淋巴结增生、血管淋巴样增生伴有嗜酸性粒细胞增多、非典型黑素细胞增生、基底细胞增生、良性大淋巴结增生、牙骨质增生、先天的肾上腺增生、先天的皮脂腺增生、囊性增生、乳腺囊性增生、义齿性增生、导管增生、子宫内膜增生、纤维肌性增生、局灶性上皮增生、齿龈增生、炎性纤维增生、炎性乳头状增生、血管内乳头状内皮增生、前列腺结节性增生、结节再生性增生、假性上皮瘤性增生、老年皮脂腺增生和疣状增生。

化生是细胞受控生长的一种形式，其中一种类型的成体或完全分化的细胞代替另一类型的成体细胞。可使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防和/或治疗的化生性疾患包括但不限于病因不明的骨髓化生、顶泌化生、非典型化生、自实质化生(autoparenchymatous metaplasia)、结缔组织化生、上皮化生、肠化生、化生性贫血、化生性成骨、化生性息肉、骨髓化生、原发性骨髓化生、继发性骨髓化生、鳞状化生、羊膜鳞状化生和症状性骨髓化生。

发育异常通常是癌的前兆，并主要见于上皮；它是最无序的非肿瘤性细胞生长形式，包括细胞个体一致性的丧失和细胞结构性取向的丧失。发育异常细胞常具有异常巨大的深染色核，并表现多形性。发育异常典型地当存在慢性刺激或炎症时发生。可使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防和/或治疗的发育异常疾患包括但不限于止汗性外胚层发育异常、前颜面(anterofacial)发育异常、窒息性胸发育异常、心房-手指发育异常、支气管肺发育异常、脑发育异常、宫颈非典型增生(cervical dysplasia)、软骨外胚层发育异常、锁骨颅骨发育异常、先天的外胚层发育异常、颅骨骨干(craniodiaphysial)发育异常、颅腕跖骨发育异常、颅骨骺(craniometaphysial)发育异常、牙本质发育异常、骨干发育异常、外胚层发育异常、釉质发育异常、脑性眼球发育异常、骨骺半肢发育异常、多发性骨骺发育异常、点状骨骺发育不良、上皮发育异常、面-指-生殖器发育异常、家族性颌纤维发育异常、家族性白色皱褶性发育异常、纤维肌性发育异常、骨纤维发育异常、红骨性发育异常、遗传性肾-视网膜发育异常、出汗性外胚层发育异常、少汗性外胚层发育异常、淋巴细胞减少性胸腺发育异常、乳腺发育异常、下颌骨颜面发育异常、干骨后端发育异常、蒙迪尼发育异常(Mondini dysplasia)、单骨纤维性发育异常、粘膜上皮发育异常、多发性骨骺发育异常、眼耳脊椎发育异常、眼齿指发育异常、眼椎骨发育异常、牙原性发育异常、眼下颌支发育异常、根尖周牙骨质发育异常、多发性纤维性发育异常、假性软骨发育不良性椎骺(pseudoachondroplasticspondyloepiphysial)发育异常、视网膜发育异常、中隔-眼发育异常、脊柱骨骺(spondyloepiphysial)发育异常和室径向发育异常(ventriculoradialdysplasia)。

其它可以使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防和/或治疗的肿瘤发生前疾患包括但不限于良性异常增殖疾患(如，良性瘤、纤维囊性病症、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食管发育异常)、粘膜白斑病、角化病、博温氏病、慢性光化性皮炎(Farmer′s skin)、日光性唇炎和日光性角化病。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断和/或预后评估与表达本发明多肽的组织相关的疾患。

在另一实施方式中，如本文所述的缀合于毒素或放射活性同位素的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗癌和新生物，包括但不限于本文所述的癌和新生物。在进一步的实施方式中，如本文所述的缀合于毒素或放射活性同位素的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗急性髓细胞性白血病。

此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可影响凋亡，因此可用于治疗多种与细胞存活增加或凋亡抑制相关的疾病。例如，可利用本发明的多核苷酸、多肽、和/或激动剂或拮抗剂来诊断、预后评估、预防和/或治疗的与细胞存活增加或凋亡抑制相关的疾病包括癌症(诸如滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、和激素依赖性肿瘤，包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波西肉瘤和卵巢癌)；自身免疫疾患诸如，多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关性肾小球性肾炎和风湿性关节炎)和病毒感染(诸如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎症、移植物抗宿主病、急性移植排斥和慢性移植排斥。

在其它实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于抑制癌症尤其是上文所列的癌症的生长、进展和/或转移。

可使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防、和/或治疗的其它与细胞存活增加相关的疾病或病症包括但不限于恶变和相关疾患的进展和/或转移，所述恶变和相关疾患诸如白血病(包括急性白血病(如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括原始粒细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(如，何杰金病和非何杰金病)、多发性骨髓瘤、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

可使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防和/或治疗的与凋亡增加相关的疾病包括AIDS；神经退行性疾患(诸如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性和脑瘤或之前的相关疾病)；自身免疫疾患(诸如多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球性肾炎和类风湿性关节炎)骨髓增生异常综合征(诸如再生障碍性贫血)、移植物抗宿主病、缺血性损伤(诸如心肌梗死、中风和再灌注损伤引起的)、肝脏损伤(如，肝炎相关肝脏损伤、缺血/再灌注损伤、胆汁淤积(胆管损伤)和肝癌)；毒素引起的肝脏疾病(诸如酒精引起的肝脏疾病)、感染性休克、恶病质和厌食症。

可使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预后评估、预防和/或治疗的过度增殖疾病和/或疾患包括但不限于位于以下部位的新生物：肝脏、腹部、骨、乳腺、消化系统、胰脏、腹膜、内分泌腺体(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖道。

类似地，还可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预后评估、预防和/或治疗其它过度增殖疾患。这样的过度增殖疾患的例子包括但不限于：高丙种球蛋白血症、淋巴增生疾患、病变蛋白血症、紫癜、结节病、塞扎里综合征、沃尔丹斯特伦(Waldenstron)巨球蛋白血症、戈谢病、组织细胞增多病、和除了瘤形成以外位于上述器官系统中的任何其它过度增殖疾病。

另一实施方式使用编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来抑制异常细胞分裂，通过使用本发明和/或其蛋白融合体或片段的基因治疗。

因此本发明提供一种治疗细胞增殖疾患的方法，该方法系通过向异常增殖细胞插入编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸抑制所述表达。

本发明的另一实施方式提供一种治疗个体中细胞增殖疾患的方法，包括施用本发明的一个或多个活性基因拷贝到异常增殖的一个或多个细胞。在一个实施方式中，本发明的多核苷酸是包括有效表达编码所述多核苷酸的DNA序列的重组表达载体的DNA构建体。在本发明的另一实施方式中，利用逆转录病毒，或在另一实施方式中利用腺病毒载体，将编码本发明的融合蛋白的DNA构建体插入待治疗细胞(见于G J.Nabel等，PNAS 199996：324-326，其在此通过引用并入)。在一个实施方式中，病毒载体是缺陷型的，并且不会转化非增殖细胞，只会转化增殖中的细胞。而且，在另一实施方式中，本发明的多核苷酸单独地插入增殖细胞或与其它多核苷酸组合或融合后插入增殖细胞后，可以通过外来刺激物(即磁性、特异性小分子、化学品或药物施用等)加以调节，这些外来刺激物作用于所述多核苷酸上游的启动子而诱导编码的蛋白产物的表达。这样，基于所述外来刺激物可明显地调节(即增加、减少、或抑制本发明的表达)本发明的有益治疗作用。

本发明的多核苷酸可用于抑制致癌基因或抗原的表达。″抑制致癌基因表达″意为阻遏基因转录、降解基因转录物(前信使RNA)、抑制剪接、破坏信使RNA、阻止蛋白的翻译后修饰、破坏蛋白或抑制蛋白的正常功能。

为了局部施用于异常增殖细胞，可由本领域技术人员已知任何方法施用本发明的多核苷酸，包括但不限于转染、电穿孔、细胞微注射、或在载体诸如脂质体、脂质转染试剂(lipofectin)中，或以裸多核苷酸的形式，或通过说明书全文中述及的任何其它方法。本发明的多核苷酸可由已知基因递送系统递送，诸如但不限于，逆转录病毒载体(Gilboa，J.Virology 44：845(1982)；Hocke，Nature 320：275(1986)；Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：3014)、痘苗病毒系统(Chakrabarty等，Mol.Cell Biol.5：3403(1985)或本领域技术人员已知的其它有效DNA递送系统(Yates等，Nature 313：812(1985))。这些参考文献仅为示例性并在此通过引用并入。为了特异性地递送或转染异常增殖的细胞而不涉及非分裂中的细胞，可使用本领域技术人员已知的逆转录病毒或腺病毒(如本领域中有记载的和本文别处所述的)递送系统。由于整合逆转录病毒DNA要求宿主DNA复制，且由于缺少逆转录病毒生命周期所需的逆转录病毒基因，逆转录病毒将不能自我复制。对本发明的多核苷酸使用这种逆转录病毒递送系统将使所述基因和构建体靶向于异常增殖细胞而不涉及非分裂中的正常细胞。

通过使用用于将注射针头直接引导到疾病部位的成像装置，可将本发明的多核苷酸直接递送到内部器官、体腔及类似部位中的细胞增殖疾患/疾病部位。也可在手术干预时将本发明的多核苷酸施用于疾病部位。

″细胞增殖疾病″意为影响任何一个器官、体腔或身体部分或它们的任何组合的、任何以细胞、细胞群或组织的单处或多处局部异常增殖(无论良性还是恶性)为特征的人类或动物疾病或疾患。

可施用任何量的本发明多核苷酸，只要它对治疗细胞的增殖具有生物学上的抑制作用。而且，向同一部位同时施用多于一种的本发明多核苷酸是可能的。″生物学抑制″意为部分或完全的生长抑制以及降低细胞的增殖或生长率。生物学抑制剂量可通过评价本发明的多核苷酸对组织培养中的目标恶性细胞生长或异常增殖的细胞生长的效应、对动物和细胞培养物中肿瘤生长的效应或本领域普通技术人员已知的任何其它方法来加以确定。

而且，如本文在别处描述的，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可单独使用、以蛋白融合体的形式使用，或与其它多肽联用，来直接或间接地抑制增殖性细胞或组织的血管发生。在一个实施方式中，所述抗血管发生效应可间接地实现，例如通过抑制造血、肿瘤特异性细胞，诸如肿瘤相关巨噬细胞(见于Joseph IB等J Natl Cancer Inst，90(21)：1648-53(1998)，其在此通过引用并入)。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通过诱导凋亡来抑制增殖性细胞或组织。这些融合蛋白和/或多核苷酸可直接或间接地起作用来诱导增殖性细胞和组织的凋亡，例如在活化死亡结构域受体的活化中，所述死亡结构域受体诸如肿瘤坏死因子(TNF)受体-1、CD95(Fas/APO-1)、TNF受体相关的凋亡介导的蛋白(TRAMP)和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)受体-1和-2(见于Schulze-Osthoff K等，Eur J Biochem254(3)：439-59(1998)，其在此通过引用并入)。而且，在本发明的另一实施方式中，这些融合蛋白和/或多核苷酸——单独地或与其它小分子药物或佐剂如apoptonin、半乳凝素、硫氧还蛋白、抗炎性蛋白组合——可经由其它机制诱导凋亡，例如在其它会激活凋亡的蛋白的活化中，或者通过刺激这些蛋白的表达(参见例如，Mutat Res 400(1-2)：447-55(1998)，Med Hypotheses.50(5)：423-33(1998)，Chem Biol Interact.Apr 24；111-112：23-34(1998)，J MolMed.76(6)：402-12(1998)，Int J Tissue React；20(1)：3-15(1998)，其都在此通过引用并入)。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制增殖细胞或组织的转移。抑制可作为施用这些清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的直接结果而发生，或间接地发生，诸如活化已知抑制可转移的蛋白例如α4整联蛋白的表达(见于如Curr Top Microbiol Immunol 1998；231：125-41，其在此通过引用并入)。本发明的这种治疗作用可单独或联合小分子药物或佐剂来实现。

在另一实施方式中，本发明提供一种向表达结合于本发明的清蛋白融合蛋白的多肽、被本发明的清蛋白融合蛋白结合的多肽、或与本发明的清蛋白融合蛋白缔合的多肽的靶细胞递送含有本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的组合物的方法。本发明的清蛋白融合蛋白可经由疏水的、亲水、离子和/或共价相互作用与异源多肽、异源核酸、毒素或前药缔合。

本发明的清蛋白融合蛋白可用于直接或间接地增强增殖细胞或组织的免疫原性和/或抗原性，例如当本发明的清蛋白融合蛋白“接种”(vaccinate)免疫应答以响应于增殖抗原和免疫原时，将发生直接增强；而间接增强体现为例如活化已知可增强对所述抗原和免疫原的免疫应答的蛋白(如趋化因子)的表达。

肾疾患

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估肾系统的疾患。可使用本发明的组合物诊断、预后评估、预防和/或治疗的肾疾患包括但不限于肾衰竭、肾炎、肾脏血管疾患、代谢性和先天性肾脏疾患、肾脏的泌尿疾患、自身免疫疾患、硬化症和坏死、电解质失衡和肾癌。

可使用本发明的组合物诊断、预后评估、预防和/或治疗的肾脏疾病包括但不限于，急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉栓塞性肾衰竭、晚期肾病、肾脏炎性疾病(如，急性肾小球性肾炎、感染后肾小球性肾炎、快速进展的肾小球性肾炎、肾病综合征、膜性肾小球性肾炎、家族性肾病综合征、膜增殖性肾小球性肾炎I和II、肾小球膜增生性肾小球性肾炎、慢性肾小球性肾炎、急性肾小管间质性肾炎、慢性肾小管间质性肾炎、急性链球菌感染后肾小球性肾炎(PSGN)、肾盂肾炎、狼疮性肾炎、慢性肾炎、间质性肾炎、和链球菌感染后肾小球性肾炎)、肾脏血管疾患(如，肾脏梗死、动脉栓塞性肾脏病、皮质坏死、恶性肾硬化、肾静脉血栓形成、肾灌注低下、肾性视网膜病、肾缺血-再灌注、肾动脉栓塞和肾动脉狭窄)、和尿道疾病导致的肾脏疾患(如，肾盂肾炎、肾盂积水、尿石病(肾结石、肾石病)、反流性肾病、尿道感染、尿潴留、和急性或慢性单侧梗阻性尿路病)。

此外，本发明的组合物可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗肾脏的代谢性和先天性疾患(如，尿毒症、肾淀粉样变性、肾性骨营养不良症、肾小管性酸中毒、肾性糖尿、肾性尿崩症、胱氨酸尿症、范康尼氏综合征、肾性纤维囊状骨质生成(肾性软骨病)、哈特奈扑病、巴特氏综合征、李德尔氏综合征、多囊肾病、髓质囊性病、髓样海绵肾、阿尔波特氏综合征、指甲髌骨综合征、先天性肾病综合征、CRUSH综合征、马蹄形肾、糖尿病肾病、肾性尿崩症、镇痛药性肾病、肾结石和膜性肾病)、和肾脏自身免疫疾患(如，系统性红斑狼疮(SLE)、古德帕斯丘综合征、IgA肾病、和IgM肾小球膜增生性肾小球性肾炎)。

本发明的组合物还可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗肾脏的硬化性或坏死性疾患(如，肾小球硬化症、糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、坏死性肾小球性肾炎和肾乳头状坏死)、肾脏癌症(如，肾瘤、肾上腺样瘤、肾胚细胞瘤、肾细胞癌、移行细胞癌、肾腺癌、鳞状细胞癌和维尔姆斯氏瘤)、和电解质失衡(如，肾钙沉着症、脓尿、水肿、肾积水(hydronephritis)、蛋白尿、低钠血症、高钠血症、低钾血症、高钾血症、低钙血症、高钙血症、低磷血症和高磷血症)。

可使用本领域已知任何方法施用本发明的组合物，包括但不限于，在递送部位直接针头注射、静脉内注射、局部施用、导管输注、生物射弹注射器、粒子加速器、凝胶泡沫海绵贮器、其它市售的贮器材料、渗透泵、口服或栓剂固态药物制剂、在手术期间倾析(decanting)或局部施用、气雾剂递送。这样的方法是本领域已知的。可施用本发明的组合物作为治疗的一部分，如以下更详细地描述的。递送本发明的多核苷酸的方法在本文更详细地描述。

心血管疾患

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估心血管疾患，包括但不限于外周动脉疾病诸如肢缺血。

心血管疾患包括但不限于，心血管异常诸如动脉-动脉瘘、动静脉瘘、脑动静脉畸形、先天心脏缺陷、肺动脉瓣闭锁和弯刀综合征。先天心脏缺陷包括但不限于，主动脉缩窄、三房心、冠状动脉畸形、十字叉心脏、右位心、动脉导管未闭、埃布斯坦氏畸形、艾森曼格尔复征、左心发育不全综合征、左位、法洛四联症、大血管转位、右心室双出口、三尖瓣闭锁、永存动脉干、和心脏间隔缺陷，诸如主动脉肺动脉间隔缺陷、心内膜垫缺陷、鲁腾巴赫氏综合征、法乐氏三联症、心室心脏间隔缺陷。

心血管疾患还包括但不限于，心脏疾病诸如心律失常、类癌心脏病、心输出量高、心输出量低、心脏压塞、心内膜炎(包括细菌性的)、心脏动脉瘤、心脏停搏、充血性心力衰竭、充血性心肌病、阵发性呼吸困难、心脏水肿、心脏肥大、充血性心肌病、左心室肥大、右心室肥大、梗死后心脏破裂、心室间隔破裂、心瓣膜疾病、心肌疾病、心肌缺血、心包积液、心囊炎(包括缩窄性和结核性)、心包积气、心包切开术后综合征、肺心脏病、风湿性心脏病、心室功能障碍、充血、心血管妊娠并发症、弯刀综合征、心血管梅毒和心血管结核病。

心律失常包括但不限于，窦性心律不齐、心房颤动、心房扑动、心动过缓、额外收缩、亚-斯二氏综合征、束支传导阻滞、窦房传导阻滞、长QT综合征、并行收缩、娄-加-列三氏综合征、Mahaim-型兴奋前综合征、沃-帕-怀综合征、病窦综合征、心动过速和心室颤动。心动过速包括阵发性心动过速、室上性心动过速、加速性心室自主心律、房室结折返性心动过速、异位性房性心动过速、异位性交接处性心动过速、窦房结折返性心动过速、窦性心动过速、扭转型室性心动过速和室性心动过速。

心瓣膜疾病包括但不限于，主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、心脏(hear)杂音、主动脉瓣脱垂、二尖瓣脱垂、三尖瓣脱垂、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄、肺动脉瓣闭锁、肺动脉瓣闭锁不全、肺动脉瓣狭窄、三尖瓣闭锁、三尖瓣闭锁不全和三尖瓣狭窄。

心肌疾病包括但不限于，酒精中毒性心肌病、充血性心肌病、肥厚型心肌病、主动脉动脉瓣下狭窄、肺动脉瓣下狭窄、限制型心肌病、Chagas心肌病、心内膜弹力纤维增生症、心肌心内膜纤维化、Kearns综合征(KearnsSyndrome)、心肌再灌注损伤和心肌炎。

心肌缺血包括但不限于冠状动脉疾病，诸如心绞痛、冠状动脉瘤、冠状动脉硬化、冠状血栓形成、冠状动脉痉挛、心肌梗死和心肌顿抑。

心血管疾病还包括血管疾病诸如动脉瘤、血管发育不良、血管瘤病、杆菌性血管瘤病、希-林二氏病、克-特-韦三氏综合征、斯德奇-韦伯综合征、血管神经性水肿、主动脉病、高安氏动脉炎、主动脉炎、勒里施氏综合征、动脉阻塞性疾病、动脉炎、动脉内膜炎(enarteritis)、结节性多动脉炎、脑血管疾患、糖尿病性血管病、糖尿病性视网膜病、栓塞、血栓形成、红斑性肢痛病、痔、肝静脉闭塞性疾病、高血压、低血压、缺血、外周血管疾病、静脉炎、肺静脉闭塞性疾病、雷诺氏病、CREST综合征、视网膜静脉阻塞、弯刀综合征、上腔静脉综合征、毛细血管扩张、共济失调性毛细血管扩张症(atacia telangiectasia)、遗传性出血性毛细血管扩张症、精索静脉曲张、曲张静脉、静脉曲张性溃疡、血管炎和静脉机能不全。

动脉瘤包括但不限于夹层动脉瘤、假性动脉瘤、感染性动脉瘤、破裂性动脉瘤、主动脉瘤、脑动脉瘤、冠状动脉瘤、心动脉瘤和髂动脉瘤。

动脉阻塞性疾病包括但不限于，动脉硬化、间歇性跛行、颈动脉狭窄、纤维肌性发育异常、肠系膜血管闭塞、烟雾病、肾动脉梗阻、视网膜动脉阻塞和血栓闭塞性血管炎。

脑血管疾患包括但不限于，颈动脉疾病、脑淀粉样血管病、脑动脉瘤、脑缺氧、脑动脉硬化、脑动静脉畸形、脑动脉疾病、脑栓塞和血栓形成、颈动脉血栓形成、窦血栓形成、瓦伦伯格氏综合征、脑出血、硬膜外血肿、硬脑膜下血肿、蛛网膜下腔出血(subaraxhnoid hemorrhage)、脑梗死、脑缺血(包含暂时的)、锁骨下动脉盗血综合征、脑室周围白质软化、血管性头痛、丛集性头痛、偏头痛和脊椎基底动脉机能不全。

栓塞包括但不限于，空气栓塞、羊水栓塞、胆固醇栓塞、蓝趾综合征、脂肪栓塞、肺栓塞和血栓栓塞(thromoboembolism)。血栓形成包括但不限于，冠状动脉血栓形成、肝静脉血栓形成、视网膜静脉阻塞、颈动脉血栓形成、窦血栓形成、瓦伦伯格氏综合征和血栓性静脉炎。

缺血性疾患包括但不限于，脑缺血、缺血性结肠炎、间隔综合征、胫前肌综合征、心肌缺血、再灌注损伤和外周肢缺血。血管炎包括但不限于，主动脉炎、动脉炎、贝切特氏综合征、丘-施二氏综合征、粘膜皮肤淋巴综合征、血栓闭塞性血管炎、超敏反应血管炎、许兰-亨诺氏紫癜、过敏性皮肤血管炎和韦格纳氏肉芽肿病。

可使用本领域已知任何方法施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸，包括但不限于，在递送部位直接针头注射、静脉内注射、局部施用、导管输注、生物射弹注射器、粒子加速器、凝胶泡沫海绵贮器、其它市售贮器材料、渗透泵、口服或栓剂固态药物制剂、在手术期间倾析(decanting)或局部施用、气雾剂递送。这些方法是本领域已知的。递送多核苷酸的方法在本文中有更详细地描述。

呼吸疾患

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估呼吸系统疾病和/或疾患。

呼吸系统疾病和疾患包括但不限于，鼻前庭炎、非变应性鼻炎(如，急性鼻炎、慢性鼻炎、萎缩性鼻炎、血管运动性鼻炎)、鼻息肉、和窦炎、幼年性血管纤维瘤、鼻癌和幼年性乳头状瘤、声带息肉、小结节(歌唱者小结节)、喉接触性溃疡、声带麻痹、喉膨出、咽炎(如，病毒性和细菌性)、扁桃体炎、扁桃体蜂窝组织炎、咽旁脓肿、喉炎、喉膨出和咽喉癌症(如，鼻咽癌、扁桃体癌、喉癌)、肺癌(如，鳞状细胞癌、小细胞(燕麦细胞)癌、大细胞癌和腺癌)、变应性疾患(嗜酸性粒细胞肺炎、超敏反应肺炎(如，外在变应性肺泡炎、变应性间质性肺炎、有机粉尘尘肺病、变应性支气管肺曲霉病、哮喘、韦格纳氏肉芽肿病(肉芽肿血管炎)、古德帕斯丘综合征))、肺炎(如，细菌性肺炎(如，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌性肺炎)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(葡萄球菌性肺炎)、革兰氏阴性菌肺炎(如，克雷伯氏菌属(Klebsiella)和假单胞菌属(Pseudomas)某些种引起的)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)肺炎、流感嗜血杆菌(Hemophilusinfluenzae)肺炎、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)(军团病)、和鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)(鹦鹉病))和病毒性肺炎(如，流感、禽痘(水痘)。

其它呼吸系统疾病和疾患包括但不限于细支气管炎、脊髓灰质炎(脊髓灰质炎)、哮吼、呼吸道合胞病毒感染、腮腺炎、传染性红斑(第五病)、幼儿急疹、进行性风疹全脑炎、德国麻疹、和亚急性硬化性全脑炎)、真菌性肺炎(如，组织胞浆菌病、球孢子菌病、芽生菌病、免疫系统严重抑制的人群中的真菌感染(如，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)引起的隐球菌病；曲霉属(Aspergillus)某些种引起的曲霉病；念珠菌属(Candida)引起的念珠菌病；和毛霉病))、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)(卡氏肺囊虫性肺炎)、非典型肺炎(如，支原体(Mycoplasma)和衣原体(Chlamydia)属某些种)、机会性感染肺炎、医院性肺炎、化学性肺炎、和吸入性肺炎、胸膜疾患(如，胸膜炎、胸腔积液、和气胸(如单纯自发性气胸、并发自发性气胸、张力性气胸))、阻塞性气道疾病(如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、慢性或急性支气管炎)、职业性肺病(如硅肺病、黑肺病(煤矿工人尘肺病)、石棉沉着病、铍中毒、职业性哮喘(asthsma)、棉尘肺和良性尘肺病(pneumoconioses))、浸润型肺疾病(如，肺纤维化(如纤维化肺泡炎、常见间质性肺炎)、特发性肺纤维化、脱屑性间质性肺炎、淋巴样间质性肺炎、组织细胞增多病X(如莱特勒-西韦病、汉-许-克三氏病、嗜酸性粒细胞肉芽肿)、特发性肺含铁血黄素沉着症、结节病和肺泡蛋白沉积症)、急性呼吸窘迫综合征(也称为例如成人呼吸窘迫综合征)、水肿、肺栓塞、支气管炎(如病毒性、细菌性)、支气管扩张、肺膨胀不全、肺脓肿(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)引起的)和囊性纤维化。

抗-血管发生活性

血管发生的内源刺激物和抑制物之间的天然平衡是抑制性影响占优势的平衡。Rastinejad等，Cell 56：345-355(1989)。在那些少有的、正常生理学条件下发生新血管形成的情形(诸如创伤愈合、器官再生、胚胎发育、和雌性生殖过程)中，血管发生被严格地调节并在空间上和时间上被界定。在病理性血管发生的状况，诸如以实体瘤生长为特征的状况中，这些调控失灵。失调的血管发生转变为病理性，并维持许多肿瘤和非-肿瘤疾病的进展。有多种严重疾病是由异常新血管形成支配的，这些疾病包括实体瘤生长和转移、关节炎、一些类型的眼疾患和银屑病。参见如Moses等，Biotech.9：630-634(1991)；Folkman等，N.Engl.J.Med.，333：1757-1763(1995)；Auerbach等，J.Microvasc.Res.29：401-411(1985)；Folkman，Advances in Cancer Research(癌症研究进展).Klein和Weinhouse编辑，Academic Press，New York，第175-203页(1985)；Patz，Am.J.Opthalmol.94：715-743(1982)；和Folkman等，Science221：719-725(1983)的综述。在多种病理状况下，血管发生过程对疾病状态起贡献作用。例如，已有大量数据表明实体瘤生长依赖于血管发生。Folkman和Klagsbrun，Science 235：442-447(1987)。

本发明为通过施用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗与新血管形成相关的疾病或疾患提供了可能。可使用本发明的多核苷酸和多肽、或激动剂或拮抗剂来治疗的恶性和转移性病症包括但不限于本文所述的以及以其它方式为本领域所知的恶变、实体瘤和癌症(对这些疾患的综述见于Fishman等，Medicine(医学)，第2版，J.B.LippincottCo.，Philadelphia(1985))。因此本发明提供一种治疗血管发生相关疾病和/或疾患的方法，包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。例如，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于多种其它方法中以治疗性地处理癌症或肿瘤。可以用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗的癌症包括但不限于实体瘤，包括前列腺、肺、乳腺、卵巢、胃、胰脏、喉、食道、睾丸、肝脏、腮腺、胆管、结肠、直肠、子宫颈、子宫、子宫内膜、肾脏、膀胱、甲状腺癌；原发性肿瘤和转移灶；黑素瘤；成胶质细胞瘤；卡波西肉瘤；平滑肌肉瘤；非小细胞肺癌；结肠直肠癌；晚期恶变；和血液播散瘤诸如白血病。例如，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可局部地递送以治疗癌诸如皮肤癌症、头颈肿瘤、乳腺肿瘤和卡波西肉瘤。

在其它方面中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗浅表型膀胱癌症，例如通过膀胱内施用。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可经由注射或导管直接递送入肿瘤或肿瘤部位附近。当然，本领域技术人员将理解，合适的施用方式将根据待治疗的癌症而不同。其它递送方式在本文中有讨论。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗除了癌症以外其它牵涉血管发生的疾患。这些疾患包括但不限于：良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；动脉粥样硬化斑块(artheroscleric plaques)；眼血管生成病，例如，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生症、发红、视网膜母细胞瘤、葡萄膜炎(uvietis)和眼翼状胬肉(异常血管生长)；类风湿性关节炎；银屑病；创伤愈合延迟；子宫内膜异位；血管发生；肉芽形成；肥厚性瘢痕(瘢痕疙瘩)；不结合性骨折；硬皮病；沙眼；血管粘附；心肌血管发生；冠状动脉侧支；脑侧支；动静脉畸形；缺血性肢血管发生；奥-韦二氏(Osler-Webber)综合征；斑块新血管形成；毛细血管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤；纤维肌性发育异常；伤口肉芽；克罗恩氏病；和动脉硬化。

例如，本发明在一个方面中提供治疗肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的方法，包括施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸至肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩的步骤。

在本发明的一个实施方式中，将本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸直接注射到肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩中以阻止这些损害的进展。这种治疗在预防性处理已知会导致肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩发病的状况(如烧伤)方面尤其有价值，并且可在增殖期已有时间进展(after theproliferative phase has had time to progress)之后但在肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩发病之前(最初损伤后大约14天)开始治疗。如上所述，本发明还提供治疗眼的新生血管性疾病的方法，所述疾病包括例如，角膜新血管形成、新生血管性青光眼、增殖糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织增生症和黄斑变性。

而且，可使用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗的与新血管形成相关的眼疾患包括但不限于：新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、视网膜母细胞瘤、晶状体后纤维组织增生症、葡萄膜炎、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植新血管形成、以及其它眼炎性疾病、眼肿瘤和与脉络膜或虹膜新血管形成相关的疾病。参见例如Waltman等，Am.J.Ophthal.85：704-710(1978)和Gartner等，Surv.Ophthal.22：291-312(1978)的综述。

因此在本发明的一方面中提供了治疗眼新生血管性疾病诸如角膜新血管形成(包括角膜移植新血管形成)的方法，包括向患者角膜施用治疗有效量的化合物(如本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸)的步骤，以使血管形成被抑制。简要地说，角膜是通常没有血管的组织。然而在一些病理学情形，毛细血管可从角膜缘的角膜周血管丛延伸入角膜。当角膜血管化时，其同时发生阴影化，导致患者视敏度下降。如果角膜完全浑浊，可能完全丧失视力。大量疾患可导致角膜新血管形成，包括例如，角膜感染(如，沙眼、单纯疱疹性角膜炎、利什曼病和盘尾丝虫病)、免疫学过程(如，移植排斥和斯-约二氏综合征)、碱烧伤、外伤、炎症(任何原因的)、毒性和营养缺乏状态、和佩戴接触镜片的并发症。

在本发明的一些实施方式中，可制备为用于局部施用(配合通常用于眼用制剂的任何防腐剂和抗菌剂)的生理盐水溶液，并以眼滴液的形式施用。溶液或悬浮液可制备为其纯的形式并每天施用多次。或者，如上所述制备的抗-血管生成组合物也可直接施用于角膜。在一些实施方式中，用能结合于角膜的粘膜粘着性聚合物来制备该抗-血管生成组合物。在进一步的实施方式中，该抗血管生成因子或抗血管生成组合物可用作常规类固醇治疗的辅助手段。局部治疗也可预防性地用于已知有诱导血管生成响应的高可能性的角膜损伤(诸如化学烧伤)。在这些情形下，可立即开始治疗(很可能与类固醇联用)以帮助预防随后的并发症。

在其它实施方式中，如上所述的化合物可由眼科医师在显微镜指引下直接注射入角膜基质。注射位点可随着个体病变的形态而不同，但施用的目标是将组合物置于脉管系统前沿(即在血管和正常角膜之间)。在大多数情形下，这需要进行缘周(perilimbic)角膜注射以″保护″角膜不受血管进展的影响。该方法也可在角膜创伤后立刻使用以预防性地阻止角膜新血管形成。在这种情形下，可将材料注射到位于角膜病变和其可能的角膜缘血源之间的缘周角膜中。这种方法也可以类似方式用于预防移植角膜的毛细血管侵入。缓释形式每年可能只需要2-3次的注射。注射溶液中还可加入类固醇以减少注射本身造成的炎症。

在本发明的另一方面，提供了治疗新生血管性青光眼的方法，包括向患者眼施用治疗有效量的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步骤，以使血管形成被抑制。在一个实施方式中，化合物可局部地施用于眼以治疗早期形式的新生血管性青光眼。在其它实施方式中，可通过注射将化合物植入到前房角区域。在其它实施方式中，化合物也可被置于任何位置以使化合物连续地释放入房水。在本发明的另一方面，提供了治疗增殖性糖尿病性视网膜病的方法，包括向患者眼施用治疗有效量的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步骤，以使血管形成被抑制。

在本发明的一些实施方式中，通过注射入房水或玻璃体以增加多核苷酸、多肽、拮抗剂和/或激动剂在视网膜中的局部浓度，可治疗增殖性糖尿病性视网膜病。在一些实施方式中，应在获得需要光凝固术的严重疾病之前开始该治疗。

在本发明的另一个方面中，提供了治疗晶状体后纤维组织增生症的方法，包括向患者眼施用治疗有效量的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步骤，以使血管形成被抑制。化合物可经由玻璃体内注射和/或经由眼内植入而局部地施用。

此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗的疾患包括但不限于，血管瘤、关节炎、银屑病、血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑块、创伤愈合延迟、肉芽形成、血友病性关节、肥厚性瘢痕、不结合性骨折、奥-韦二氏综合征、化脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼和血管粘附。

而且，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防、诊断和/或预后评估的疾患和/或状态包括但不限于，实体瘤、血液播散瘤诸如白血病、肿瘤转移、卡波西肉瘤、良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼、和化脓性肉芽肿、类风湿性关节炎、银屑病、眼血管生成疾病，例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生症、发红、视网膜母细胞瘤、和葡萄膜炎(uvietis)、创伤愈合延迟、子宫内膜异位、血管发生(vascluogenesis)、肉芽形成、肥厚性瘢痕(瘢痕疙瘩)、不结合性骨折、硬皮病、沙眼、血管粘附、心肌血管发生、冠状动脉侧支、脑侧支、动静脉畸形、缺血性肢血管发生、奥-韦二氏(Osler-Webber)综合征、斑块新血管形成、毛细血管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、纤维肌性发育异常、伤口肉芽、克罗恩氏病、动脉硬化、通过防止胚胎着床控制月经所需的血管形成的控制生育剂、以血管发生为病理后果的疾病诸如猫抓病(Rochele minaliaquintosa)、溃疡(幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、巴尔通体病和杆菌性血管瘤病。

在所述控制生育方法的一个方面中，在性交和受精发生之前或已发生之后施用足以阻止胚胎着床的量的化合物，从而提供控制生育的有效方法，可能是″事后″方法。也可使用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸以控制月经，或以腹腔灌洗液或腹膜植入施用以治疗子宫内膜异位。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可掺入手术缝合线中以预防缝合性肉芽肿。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于多种手术方案。例如，在本发明的一个方面中，组合物(以例如喷雾或薄膜的形式)可用于在除去肿瘤之前包被或喷洒某个区域，以将恶性组织与周围的正常组织隔离开来，和/或预防疾病扩散到周围组织。在本发明其它方面，组合物(如以喷雾形式)可经由内窥镜术递送以包被肿瘤或抑制期望位置的血管发生。在本发明其它又一些方面中，已用本发明的抗血管生成组合物包被的手术网状织物可用于任何可能使用手术网状织物(surgical mesh)的方案。例如在本发明的一个实施方式中，装满抗血管生成组合物的手术网状织物可用在腹部癌切除手术(如结肠切除术之后)期间以对结构提供支持并释放一定量的抗血管生成因子。

在本发明的进一步的方面中，提供了处理肿瘤切除部位的方法，包括在肿瘤切除后向切除边缘施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸以抑制癌症的局部复发和在该部位形成新血管。在本发明的一个实施方式中，抗血管生成化合物直接施用于肿瘤切除部位(如由涂抹、刷或其它方式以抗-血管生成化合物包被肿瘤切除边缘)。或者，抗血管生成化合物可在施用前并入已知手术糊料(surgical paste)。在本发明的一些实施方式中，抗血管生成化合物在肝切除恶变之后和神经手术操作后施用。

在本发明的一个方面中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可施用于多种肿瘤的切除边缘，所述肿瘤包括例如乳腺、结肠、脑和肝肿瘤。例如在本发明的一个实施方式中，抗血管生成化合物可在切除后施用于神经肿瘤部位，以使该部位的新血管形成被抑制。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可与其它抗血管生成因子一起施用。其它抗血管生成因子的代表例子包括：抗侵袭因子、视黄酸和其衍生物、紫杉醇、苏拉明、金属蛋白酶-1的组织抑制剂、金属蛋白酶-2的组织抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、和较轻″d族″过渡金属的各种形式。

较轻″d族″过渡金属包括例如钒、钼、钨、钛、铌和钽种类。这种过渡金属物质可形成过渡金属络合物。上述过渡金属物质的合适的络合物包括氧代过渡金属络合物(oxo transition metal complexes)。

钒络合物的代表例子包含氧代钒络合物诸如钒酸盐和氧钒络合物。合适的钒酸盐络合物包含偏钒酸盐和正钒酸盐络合物诸如例如偏钒酸铵、偏钒酸钠和正钒酸钠。合适的氧钒络合物包含，例如氧钒基乙酰丙酮酯和包含水合硫酸氧钒诸如单水合硫酸氧钒和三水合硫酸氧钒的硫酸氧钒。

钨和钼络合物的代表例子还包含氧代络合物。合适的氧代钨络合物包含钨酸盐和氧化钨络合物。合适的钨酸盐络合物包含钨酸铵、钨酸钙、二水合钨酸钠和钨酸。合适的氧化钨包含氧化钨(IV)和氧化钨(VI)。合适的氧代钼络合物包括钼酸盐、氧化钼和氧钼基络合物。合适的钼酸盐络合物包含钼酸铵和其水合物、钼酸钠和其水合物、和钼酸钾和其水合物。合适的氧化钼包括氧化钼(VI)、氧化钼(VI)和钼酸。合适的氧钼基络合物包括，例如氧钼基乙酰丙酮酯。其它合适的钨和钼络合物包括衍生自例如甘油、酒石酸和糖的羟衍生物。

很多其它抗血管生成因子也可用于本发明。代表性例子包括血小板因子4；硫酸鱼精蛋白；硫酸化壳多糖衍生物(从雪花蟹壳制备)，(Murata等，CancerRes.51：22-26，(1991))；硫酸化多糖肽聚糖复合体(SP-PG)(该化合物的功能可由存在类固醇诸如雌激素和柠檬酸他莫昔芬而增强)；十字孢碱；基质代谢调节物，包括例如脯氨酸类似物、顺式羟基脯氨酸、d，L-3，4-脱氢脯氨酸、硫杂脯氨酸、α，α-联吡啶、氨基丙腈富马酸酯；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-噁唑酮；氨甲喋呤；米托蒽醌；肝素；干扰素；2巨球蛋白-血清；ChIMP-3(Pavloff等，J.Bio.Chem.267：17321-17326，(1992))；抑糜酶素(Tomkinson等，Biochem J.286：475-480，(1992))；环糊精十四硫酸酯；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素(Ingber等，Nature 348：555-557，(1990))；硫代苹果酸金钠(″GST″；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.79：1440-1446，(1987))；抗胶原酶-血清；α2-抗血纤维蛋白酶(Holmes等，J.Biol.Chem.262(4)：1659-1664，(1987))；比生群(National Cancer Institute)；氯苯扎利二钠(N-(2)-羧基苯基-4-氯邻氨基苯甲酸(anthronilic acid)二钠或″CCA″；Takeuchi等，Agents Actions36：312-316，(1992))；沙利度胺；血管稳定类固醇(angostatic steroid)；AGM-1470；羧基氨基咪唑(carboxynaminolmidazole)；和金属蛋白酶抑制剂诸如BB94。

细胞水平的疾病

使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防、诊断和/或预后评估的与细胞存活增加或凋亡抑制相关的疾病包括癌症(诸如滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、和依赖于激素的肿瘤，包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波西肉瘤和卵巢癌)；自身免疫疾患诸如多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球性肾炎和类风湿性关节炎)和病毒感染(诸如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎症、移植物抗宿主病、急性移植排斥和慢性移植排斥。

在一些实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于抑制癌症尤其是上文所列的癌症的生长、进展和/或转移(metasis)。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的与细胞存活增加相关的其它疾病或病症包括但不限于，恶变和相关疾患的进展和/或转移，诸如白血病(包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括原始粒细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(如何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤(hemangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防、诊断和/或预后评估(prognesed)的与凋亡增加相关的疾病包括但不限于AIDS；神经变性性疾患(诸如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性和脑瘤或之前的相关疾病)；自身免疫疾患(诸如多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球性肾炎和类风湿性关节炎)骨髓增生异常综合征(诸如再生障碍性贫血)、移植物抗宿主病、缺血性损伤(诸如心肌梗死、中风和再灌注损伤引起的)、肝脏损伤(如肝炎相关肝脏损伤、缺血/再灌注损伤、胆汁淤积(胆管损伤)和肝癌)；毒素引起的肝脏疾病(诸如酒精引起的)、感染性休克、恶病质和厌食症。

创伤愈合和上皮细胞增殖

根据本发明的进一步方面，提供了为了治疗目的使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的方法，例如为了创伤愈合的目的刺激上皮细胞增殖和基底角质化细胞，和刺激毛囊产生和真皮创伤愈合。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸临床上可用于刺激创伤愈合，所述创伤包括手术创伤、切除创伤、包括真皮和表皮的毁坏的深创伤、眼组织创伤、牙组织创伤、口腔创伤、糖尿病性溃疡、真皮溃疡、肘溃疡、动脉溃疡、静脉停滞溃疡、暴露于热或化学品导致的烧伤、和其它异常创伤愈合病症，诸如尿毒症、营养不良、维生素缺乏和与以类固醇、放疗和抗肿瘤药物和抗代谢剂全身治疗相关的并发症。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在真皮丧失后促进真皮重建。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加皮肤移植物对创伤床的粘附以及用于刺激从创伤床的上皮再形成。以下是本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加其对创伤床的粘附的移植物类型：自体移植物、人工皮肤、同种异体移植物、自体皮移植物、自体表皮(autoepdermic)移植物、无血管性(avacular)移植物、布-布二氏移植物、骨移植物、胚组织移植物、皮移植物、延迟移植物(delayed graft)、真皮移植物、表皮移植物、筋膜移植物、全厚皮(full thickness)移植物、异源移植物、异种移植物、同源移植物、增生性皮移植物、角膜板层移植物、网孔皮(mesh)移植物、粘膜移植物、奥-提二氏移植物、网膜(omenpal)移植物、修补移植物、带蒂移植物、全层角膜移植物、分层皮肤移植物、厚分层皮移植物。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于提升皮肤强度和改善衰老皮肤的表观。

认为本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还将产生肝细胞增殖和肺、乳腺、胰脏、胃、小肠和大肠中上皮细胞增殖的变化。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可促进上皮细胞增殖，所述上皮细胞诸如皮脂腺细胞、毛囊、肝细胞、II型肺细胞、产生粘蛋白的杯形细胞、和皮肤、肺、肝脏和胃肠道中包含的其它上皮细胞及其祖先。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可促进内皮细胞、角质化细胞和基底角质化细胞增殖。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于减轻放疗、化疗或病毒感染造成的肠毒性副作用。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸对小肠粘膜可具有细胞保护作用。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可刺激化疗和病毒感染造成的粘膜炎(口溃疡)愈合。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可进一步用于全厚度和部分厚度的皮肤缺陷(包括烧伤)的皮肤完全再生(即毛囊、汗腺和皮脂腺再生)、治疗其它皮肤缺陷诸如银屑病。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗大疱性表皮松解症，大疱性表皮松解症是表皮与其下方真皮的粘附的缺陷，导致频繁出现的、开放性的、有痛感的大疱，所述融合蛋白和/或多核苷酸通过加速这些损伤的表皮细胞再生(reepithelializatoin)来治疗它们。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于治疗胃和十二指肠(doudenal)溃疡并通过粘膜内衬更快地形成瘢痕和再生腺粘膜和十二指肠粘膜内衬而帮助愈合。炎性肠病诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，分别是导致小肠或大肠粘膜表面破坏的疾病。因此本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于促进粘膜表面的重新修整(resurfacing)以帮助更快愈合和预防炎性肠病进展。利用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸进行治疗，对整个胃肠道中的粘液产生有显著作用，并可用于保护肠粘膜不受身体摄取的有害物质的影响，或者用于在手术后保护肠粘膜。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗与低表达相关的疾病。

而且，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防和治愈由于各种病理学状态对肺的损害。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可刺激增殖和分化并促进肺泡和细支气管(brochiolar)上皮的修复以预防或治疗急性或慢性肺损害。例如，使用本发明的多核苷酸或多肽、激动剂或拮抗剂可有效治疗导致进行性肺泡(aveoli)丧失的肺气肿和导致细支气管上皮和肺泡坏死的吸入性损伤(即吸入烟雾和烧伤造成的)。本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于刺激II型肺细胞增殖和分化，这可帮助治疗或预防疾病诸如透明膜病，诸如幼儿呼吸窘迫综合征和早产儿支气管肺发育异常(displasia)。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可刺激肝细胞增殖和分化，因此可用于缓解或治疗肝脏疾病和病状诸如肝硬化导致的暴发型肝脏衰竭、病毒性肝炎和毒性物质(即对乙酰氨基酚、四氯化碳(carbon tetraholoride)和本领域已知其它肝毒素)导致的肝脏损害。

此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防糖尿病发病。在新近被诊断为I和II型糖尿病的、尚有一些胰岛细胞保持功能的患者中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于维持胰岛功能从而缓解、延缓或预防疾病的永久性征候。而且，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于辅助胰岛细胞移植以改善或促进胰岛细胞功能。

神经活性和神经学疾病

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断和/或治疗脑和/或神经系统的疾病、疾患、损害或损伤。本发明的组合物(如本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸)可治疗的神经系统疾患包括但不限于：神经系统损伤，以及导致轴突断开、神经元减少或变性或脱髓鞘的疾病或疾患。根据本发明的方法可治疗的患者(包括人类和非人类哺乳动物患者)中的神经系统损害包括但不限于中枢(包括脊髓、脑)或外周神经系统的以下损害：(1)缺血性损害，其中神经系统的一部分中缺氧导致神经元损伤或死亡，包括脑梗死或缺血、或脊髓梗死或缺血；(2)外伤性损害，包括物理损伤导致的损害或与手术相关的损害，例如切断神经系统的一部分的损害或受压性损伤；(3)恶性损害，其中神经系统的部分被恶性组织破坏或损伤，该恶性组织是神经系统相关恶变或衍生自非神经系统组织的恶变；(4)感染性损害，其中神经系统的一部分由于感染被破坏或损伤，例如由脓肿或与人类免疫缺陷病毒、带状疱疹或单纯疱疹病毒感染相关的或莱姆病、结核病或梅毒；(5)变性性损害，其中神经系统的部分由于包括但不限于与帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病或肌萎缩侧索硬化(ALS)相关的变性的变性性过程被破坏或损伤；(6)与营养疾病或疾患相关的损害，其中神经系统的部分被营养疾患或代谢疾患破坏或损伤，所述营养疾患或代谢疾患包括但不限于维生素B12缺乏、叶酸缺乏、韦尼克病、烟草-酒精中毒性弱视、马-比二氏病(原发性胼胝体变性)、和酒精性小脑变性；(7)与全身性疾病(包括但不限于糖尿病(糖尿病性神经病、贝耳氏麻痹)、系统性红斑狼疮、癌、或结节病)相关的神经学损害；(8)毒性物质包含酒精、铅或特定神经毒素引起的损害；和(9)脱髓鞘损害，其中神经系统的部分被脱髓鞘疾病破坏或损伤，所述脱髓鞘疾病包括但不限于多发性硬化、人类免疫缺陷病毒相关脊髓病、横贯性脊髓病或各种病因、进行性多灶性白质脑病、和脑桥中央髓鞘溶解。

在一个实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于保护神经细胞不受缺氧的破坏作用。在进一步的实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于保护神经细胞不受脑缺氧的破坏作用。根据该实施方式，本发明的组合物用于治疗或预防与脑缺氧相关的神经细胞损伤。在该实施方式的一个非排它性的方面中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与脑缺血相关的神经细胞损伤。在该实施方式的另一非排它性的方面中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与脑梗死相关的神经细胞损伤。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与中风相关的神经细胞损伤。在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与中风相关的脑神经细胞损伤。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与心脏病发作相关的神经细胞损伤。在特定实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与心脏病发作相关的脑神经细胞损伤。

可用于治疗或预防神经系统疾患的本发明的组合物可通过检测其促进神经元的存活或分化的生物活性来选择。例如但不作为限制，引起任何以下效应的本发明组合物可根据本发明使用：(1)在存在或不存在缺氧或缺氧性条件下增加培养中神经元的存活时间；(2)增加培养中或体内神经元的发芽；(3)增加培养中或体内神经元相关分子(如对于运动神经元而言，胆碱乙酰转移酶或乙酰胆碱酯酶)的产生；或(4)减少体内神经元功能障碍的症状。这些效应可由本领域已知的任何方法测量。在一些非限制性的实施方式中，神经元存活的增加可使用本文所列的或以其它方式为本领域所知的方法来例行地加以测量，诸如Zhang等，Proc Natl Acad Sci USA 97：3637-42(2000)或Arakawa等，J.Neurosci.，10：3507-15(1990)；神经元发芽的增加可用本领域已知的方法来检测，诸如Pestronk等，Exp.Neurol.，70：65-82(1980)，或Brown等，Ann.Rev.Neurosci.，4：17-42(1981)中所列的方法；神经元相关分子产生的增加可使用生物检测、酶检测、抗体结合、Northern印迹检测等测量，上述方法均使用本领域已知的技术并取决于待测量的分子；而运动神经元功能障碍可以通过评价运动神经元疾患的身体表现(如虚弱、运动神经元传导速率、或功能失能)来测量。

在特定实施方式中，根据本发明可治疗的运动神经元疾患包括但不限于，可影响运动神经元以及神经系统其它组成部分的疾患诸如梗死、感染、接触毒素、外伤、手术损害、变性性疾病或恶变，以及选择性影响神经元的疾患诸如肌萎缩侧索硬化的疾患，包括但不限于，进行性脊髓性肌萎缩、进行性延髓性麻痹、原发性侧索硬化症、幼儿和少年肌萎缩、儿童进行性球麻痹(法齐奥-隆德综合征)、脊髓灰质炎和脊髓灰质炎后综合征、和遗传性运动感觉神经病(夏-马-图三氏病)。

进一步地，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在神经元存活、突触形成、传导、神经分化等中起作用。因此本发明的组合物(包括本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸)可用于诊断和/或治疗或预防与这些作用相关的疾病或疾患，包括但不限于学习和/或认知疾患。本发明的组合物也可用于治疗或预防神经变性性疾病状态和/或行为疾患。这些神经变性性疾病状态和/或行为疾患包括但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、图雷特多综合征、精神分裂症、躁狂症、痴呆、偏执狂、强迫性疾患、惊恐性疾患、学习能力缺失、ALS、精神病、孤独症、和行为改变，包括摄食、睡眠模式、平衡和知觉疾患。此外，本发明的组合物也可在治疗、预防和/或检测与发育中的胚胎相关的发育疾患或性相关疾患中起作用。

此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于保护神经细胞免于与脑血管疾患相关的疾病、损害、疾患或损伤，包括但不限于颈动脉疾病(如颈动脉血栓形成、颈动脉狭窄、或烟雾病)、脑淀粉样血管病、脑动脉瘤、脑缺氧、脑动脉硬化、脑动静脉畸形、脑动脉疾病、脑栓塞和血栓形成(如颈动脉血栓形成、窦血栓形成、或瓦伦伯格氏综合征)、脑出血(如硬膜外或硬脑膜下血肿、或蛛网膜下腔出血)、脑梗、脑缺血(如暂时性脑缺血、锁骨下动脉盗血综合征、或脊椎基底动脉机能不全)、血管性痴呆(如多发性脑梗死)、脑室周白质软化症和血管性头痛(如丛集性头痛或偏头痛)。

根据本发明的又进一步的方面，提供为了利用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的治疗目的例如刺激神经学细胞增殖和/或分化方法。因此，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗和/或检测神经病学疾病。而且，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作特定神经系统疾病或疾患的标记或检测。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的神经病学疾病的例子包含脑疾病，诸如代谢性脑疾病，包括苯丙酮尿症诸如母体苯丙酮尿症、丙酮酸羧化酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症、韦尼克脑病、脑水肿、脑新生物诸如小脑新生物，包括幕下新生物、脑室新生物诸如脉络丛新生物、下丘脑新生物、幕上新生物、卡纳万病、小脑疾病诸如小脑共济失调，包括脊髓小脑变性诸如共济失调性毛细血管扩张症、小脑协同失调、弗里德赖希(Friederich′s)氏共济失调、马-约病、橄榄体脑桥小脑萎缩、小脑新生物诸如幕下新生物、弥漫性脑硬化症诸如轴周性脑炎、球样细胞脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良和亚急性硬化性全脑炎。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的其它神经病学疾病包括脑血管疾患(诸如包括颈动脉血栓形成、颈动脉狭窄和烟雾病的颈动脉疾病)、脑淀粉样血管病、脑动脉瘤、脑缺氧、脑动脉硬化、脑动静脉畸形、脑动脉疾病、脑栓塞和血栓形成诸如颈动脉血栓形成、窦血栓形成和瓦伦伯格氏综合征、脑出血诸如硬膜外血肿、硬脑膜下血肿和蛛网膜下腔出血、脑梗死、脑缺血诸如暂时性脑缺血、锁骨下动脉盗血综合征和脊椎基底动脉机能不全、血管性痴呆诸如多发性脑梗死性痴呆、脑室周白质软化症、血管性头痛诸如丛集性头痛和偏头痛。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的其它神经病学疾病包括痴呆诸如AIDS痴呆综合征、早老性痴呆诸如阿尔茨海默病和克-雅综合征、老年性痴呆诸如阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹、血管性痴呆诸如多发性脑梗死性痴呆、脑炎，包括轴周性脑炎、病毒性脑炎诸如流行性脑炎、日本脑炎、圣路易脑炎、蜱传脑炎和西尼罗热、急性播散性脑脊髓炎、脑膜脑炎诸如葡萄膜脑膜脑炎综合征、脑炎后帕金森病和亚急性硬化性全脑炎、脑软化诸如脑室周围白质软化、癫痫诸如全身性癫痫，包括幼儿痉挛、失神性癫痫、肌阵挛型癫痫，包括MERRF综合征、阵挛型癫痫、局限性癫痫诸如复杂的局限性癫痫、额叶性癫痫和颞叶性癫痫、外伤后癫痫、癫痫持续状态诸如持续性局限性癫痫和哈-斯二氏综合征。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的其它神经病学疾病包括脑积水诸如丹-沃二氏综合征和正常颅压脑积水、下丘脑疾病诸如下丘脑新生物、脑型疟疾、昏睡病，包括猝倒、延髓性脊髓灰质炎、大脑假肿瘤、Rett综合征、雷耶氏综合征、丘脑性疾病、脑弓形体病、颅内结核球和泽韦格综合征、中枢神经系统感染诸如AIDS痴呆综合征、脑脓肿、硬脑膜下积脓、脑脊髓炎、诸如马脑脊髓炎、委内瑞拉马脑脊髓炎、坏死性出血性脑脊髓炎、绵羊脱髓鞘性脑白质炎(Visna)、和脑型疟疾。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的其它神经病学疾病包括脑膜炎诸如蛛网膜炎、无菌性脑膜炎(meningtitis)诸如病毒性脑膜炎(meningtitis)，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、细菌性脑膜炎(meningtitis)，包括嗜血杆菌脑膜炎(meningtitis)、李斯特杆菌性脑膜炎(meningtitis)、脑膜炎球菌性脑膜炎(meningtitis)诸如沃-弗二氏综合征、肺炎球菌性脑膜炎(meningtitis)和脑膜结核病、真菌性脑膜炎诸如隐球菌性脑膜炎(meningtitis)、硬脑膜下积液、脑膜脑炎诸如葡萄膜脑膜脑炎(uvemeningoencephalitic)综合征、脊髓炎诸如横贯性脊髓炎、神经梅毒诸如脊髓痨、脊髓灰质炎，包括延髓性脊髓灰质炎和脊髓灰质炎后综合征、朊蛋白病(诸如克-雅综合征、牛海绵样脑病、吉斯综合征、库鲁病、绵羊瘙痒病)、和脑弓形体病。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的其它神经病学疾病包括中枢神经系统新生物诸如脑新生物，包括小脑新生物诸如幕下新生物、脑室新生物诸如脉络丛新生物、下丘脑新生物和幕上新生物、脑膜新生物、脊髓新生物，包括硬膜外新生物、脱髓鞘疾病诸如卡纳万病、弥漫性脑硬化症(sceloris)，包括肾上腺脑白质营养不良、轴周性脑炎、球样细胞脑白质营养不良、弥漫性脑硬化症诸如异染性脑白质营养不良、变应脑脊髓炎、坏死性出血性脑脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、多发性硬化、脑桥中央髓鞘溶解、横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎、绵羊瘙痒病、地方性家畜运动失调症(Swayback)、慢性疲劳综合征、绵羊脱髓鞘性脑白质炎、高压神经综合征、假性脑膜炎、脊髓疾病诸如特发性肌弛缓、肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩诸如韦-霍二氏病、脊髓受压、脊髓新生物诸如硬膜外新生物、脊髓空洞症、脊髓痨、僵体综合征、智力低下诸如Angelman综合征、猫叫综合征、德朗热综合征、唐氏综合征、神经节苷酯病(Gangliosidoses)诸如神经节苷酯病G(M1)、桑德霍夫病、泰-萨克斯病、哈特奈扑病、高胱氨酸尿症、劳-穆-比综合征、莱-萘二氏综合征、槭糖尿疾病、粘脂贮积症诸如岩藻糖苷贮积症、神经元蜡样质-脂褐素增多症、眼-脑-肾综合征、苯丙酮尿症诸如母体苯丙酮尿症、帕-魏二氏综合征、Rett综合征、鲁-泰二氏综合征、结节性硬化症、WAGR综合征、神经系统异常诸如前脑无裂畸形、神经管缺陷诸如无脑畸形，包含积水性无脑畸形(hydrangencephaly)、阿-希二氏畸形、脑膨出、脑膜膨出、脊髓脊膜膨出、脊柱裂病诸如囊性脊柱裂和隐性脊柱裂。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的其它神经病学疾病包含遗传性运动和感觉神经病，包括夏-马二氏病、遗传性视神经萎缩、雷弗素姆氏病、遗传性痉挛性截瘫、韦-霍二氏病、遗传性感觉和自主神经病诸如特发性痛觉缺失和家族性自主神经异常、神经病学表现(诸如包含格斯特曼氏综合征的失认症、健忘症诸如逆行性遗忘、失用症、神经源性膀胱、猝倒、沟通障碍，诸如听觉障碍包括耳聋、部分听力丧失、响度重振和耳鸣；语言障碍诸如失语症，包括失写症、命名不能症、布罗卡失语症、和韦尼克失语症；阅读障碍诸如获得性阅读障碍、语言发育疾患、言语障碍诸如失语症，包括命名不能症、布罗卡失语症和韦尼克失语症；发音障碍；沟通障碍诸如言语障碍，包括构音困难、模仿言语、缄默症和口吃；发声障碍诸如失声和声嘶、去大脑状态、谵妄、肌束震颤、幻觉、假性脑膜炎、运动疾患诸如angelman综合征、共济失调、手足徐动症、舞蹈症、张力障碍、运动功能减退、肌肉张力过低、肌阵挛、抽搐、斜颈和震颤、肌肉张力过高诸如肌肉强直诸如僵体综合征、肌痉挛状态、麻痹诸如面神经麻痹，包括耳部带状疱疹、胃轻瘫、偏瘫、眼肌麻痹诸如复视、杜安氏综合征、霍纳综合征、慢性进行性外眼肌麻痹诸如Keams综合征、延髓性麻痹、热带痉挛性下肢轻瘫、截瘫诸如布朗-塞卡尔综合征、四肢瘫痪、呼吸麻痹和声带麻痹、轻瘫、幻肢、味觉疾患诸如味觉缺失和味觉障碍、视力疾患诸如弱视、失明、色觉缺陷、复视、偏盲、暗点和低常视力、睡眠疾患诸如睡眠过度，包括克-列二氏综合征、失眠症、和梦游症、痉挛诸如牙关紧闭、意识丧失诸如昏迷、持续性植物状态和晕厥和眩晕、神经肌肉疾病诸如特发性肌弛缓、肌萎缩侧索硬化、Lambert-Eaton肌无力综合征、运动神经元疾病、肌萎缩诸如脊髓性肌萎缩、夏-马二氏萎缩病和韦-霍二氏病、脊髓灰质炎后综合征、肌肉萎缩症、重症肌无力、萎缩性肌强直、特发性肌强直病(Myotonia Confenita)、纤维状肌病、家族性周期性瘫痪、多发性轻肌阵挛(Multiplex Paramyloclonus)、热带痉挛性下肢瘫痪和僵体综合征、外周神经系统疾病诸如肢端痛、淀粉样变性神经病、自主神经系统疾病诸如艾迪氏综合征、巴-利二氏综合征、家族性自主神经异常、霍纳氏综合征、反射交感性营养不良和希-德二氏综合征、颅神经疾病诸如听神经疾病诸如听神经瘤，包括2型神经纤维瘤病、面神经疾病诸如面神经痛、迈-罗二氏综合征、眼能动性疾患包括弱视、眼震、动眼神经麻痹、眼肌麻痹诸如杜安氏综合征、霍纳氏综合征、慢性进行性外眼肌麻痹，包括Kearns综合征、斜视诸如内斜视和外斜视、动眼神经麻痹、视神经疾病诸如视神经萎缩，包括遗传性视神经萎缩、视盘玻璃疣、视神经炎诸如视神经脊髓炎、视神经乳头水肿、三叉神经痛、声带麻痹、脱髓鞘疾病诸如视神经脊髓炎和地方性家畜运动失调症、和糖尿病性神经病诸如糖尿病足。

本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的其它神经病学疾病包括神经受压综合征诸如腕管综合征、跗管综合征、胸出口综合征诸如颈肋综合征、尺神经受压综合征、神经痛诸如灼性神经痛、颈臂神经痛、面神经痛和三叉神经痛、神经炎诸如实验性变应神经炎、眼神经炎、多发性神经炎、多发性神经根性神经炎和脊神经根炎(radiculities)诸如多神经根炎、遗传性运动和感觉神经病诸如夏-马二氏萎缩病、遗传性视神经萎缩、雷弗素姆氏病、遗传性痉挛性截瘫和韦-霍二氏病、遗传性感觉和自主神经病，包括特发性痛觉缺失和家族性自主神经异常、POEMS综合征、坐骨神经痛、味觉性出汗和手足搐搦)。

内分泌疾患

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估涉及激素失衡的疾患和/或疾病、和/或内分泌系统疾患或疾病。

内分泌系统腺体分泌的激素控制身体生长、性功能、代谢和其它功能。疾患可以两种方式分类：扰乱激素产生、和组织不能响应于激素。这些激素失衡或内分泌系统疾病、疾患或病症的病因可为遗传的、体细胞性的诸如癌症和某些自身免疫疾病、获得性的(如化疗、损伤或毒素引起)或感染性的。而且，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作涉及内分泌系统和/或激素失衡的特定疾病或疾患标记或探测物。

内分泌系统和/或激素失衡和/或疾病包括子宫活动性的疾患，包括但不限于：妊娠和分娩并发症(如未足月产、过期妊娠、自然流产和分娩缓慢或分娩中止)；和月经周期疾患和/或疾病(如痛经和子宫内膜异位)。

内分泌系统和/或激素失衡疾患和/或疾病包括胰脏疾患和/或疾病，诸如例如糖尿病、尿崩症、先天性胰脏发育不全、嗜铬细胞瘤-胰岛细胞瘤综合征；肾上腺疾患和/或疾病诸如例如阿狄森氏病、皮质类固醇缺乏、男性化疾病、多毛症、柯兴氏综合征、醛甾酮过多症、嗜铬细胞瘤；垂体腺体疾患和/或疾病，诸如例如垂体功能亢进、垂体功能减退、垂体性侏儒症、垂体腺瘤、全垂体功能减退、肢端肥大症、巨人症；甲状腺疾患和/或疾病，包括但不限于，甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退、普卢默病、格雷夫斯病(毒性弥漫性甲状腺肿)、毒性结节性甲状腺肿、甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎、亚急性肉芽肿性甲状腺炎和沉默淋巴细胞性甲状腺炎)、潘德雷德氏综合征、粘液性水肿、呆小病、甲状腺毒症、甲状腺激素偶联缺陷、胸腺发育不全、甲状腺嗜酸性细胞肿瘤、甲状腺癌症、甲状腺癌、髓样甲状腺癌；甲状旁腺疾患和/或疾病，诸如例如甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退；下丘脑疾患和/或疾病。

此外，内分泌系统和/或激素失衡疾患和/或疾病也可包括睾丸或卵巢疾患和/或疾病，包括癌症。睾丸或卵巢的其它疾患和/或疾病进一步包括，例如卵巢癌、多囊卵巢综合征、克莱恩费尔特氏综合征、睾丸逸失综合征(双侧无睾症)、先天性缺乏睾丸间质细胞、隐睾症、努南综合征、强直性肌营养不良、睾丸毛细血管血管瘤(良性)、睾丸瘤形成和新睾丸。

而且，内分泌系统和/或激素失衡疾患和/或疾病也可包括如多内分泌腺缺乏综合征、嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤、多发性内分泌瘤病、和内分泌组织疾患和/或癌症等疾患和/或疾病。

在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预后评估、预防和/或治疗与其中表达对应于本发明的清蛋白治疗性蛋白部分的治疗性蛋白的组织相关的内分泌疾病和/或疾患。

生殖系统疾患

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗或预防生殖系统疾病和/或疾患。本发明的组合物可治疗的生殖系统疾患包括但不限于，生殖系统损伤、感染、新生性疾患、先天性缺陷、和导致不育症的疾病或疾患、妊娠、分娩或生产并发症、和产后问题。

生殖系统疾患和/或疾病包括睾丸疾病和/或疾患，包括睾丸萎缩、睾丸女性化、隐睾病(单侧和双侧)、无睾症、异位睾丸、附睾炎和睾丸炎(通常是感染诸如例如淋病、腮腺炎、结核病和梅毒造成的)、睾丸扭转、结节性输精管炎、生殖细胞肿瘤(如精原细胞瘤、胚胎性细胞癌、恶性畸胎瘤、绒毛膜癌、卵黄囊肿瘤和畸胎瘤)、基质瘤(如睾丸间质细胞瘤)、阴囊积水、阴囊血肿、精索静脉曲张、精液囊肿、腹股沟疝、和精子产生的疾患(如纤毛不能移动综合征、无精、弱精子症、无精子症、少精液症和畸性活精子症)。

生殖系统疾患还包括前列腺疾患，诸如急性非-细菌性前列腺炎、慢性非-细菌性前列腺炎、急性细菌性前列腺炎、慢性细菌性前列腺炎、前列腺张力障碍(prostatodystonia)、前列腺病、肉芽肿性前列腺炎、软化斑、良性前列腺肥大或增生、和前列腺新生性疾患，包括腺癌、移行细胞癌、导管癌和鳞状细胞癌。

此外，本发明的组合物可用于诊断、治疗和/或预防阴茎和尿道疾患或疾病，包括炎性疾患，诸如龟头包皮炎、闭塞性干燥性龟头炎、包茎、箝顿包茎、梅毒、单纯疱疹病毒、淋病、非淋病性尿道炎、衣原体、支原体、毛滴虫、HIV、AIDS、莱特氏综合征、尖锐湿疣、扁头湿疣、和珍珠样阴茎丘疹；尿道异常，诸如尿道下裂、尿道上裂和包茎；恶变前病变，包括凯拉增生性红斑、博温氏病、鲍恩样丘疹病(paplosis)、Buscke-Lowenstein巨大尖锐湿疣和疣状(varrucous)癌；阴茎癌症，包括鳞状细胞癌、原位癌、疣状癌和播散性阴茎癌；尿道新生性疾患，包括阴茎尿道癌、球膜尿道癌(bulbomembranousurethral carcinoma)、和前列腺尿道癌；和勃起疾患，诸如阴茎异常勃起、佩伦涅氏病、勃起功能障碍、和阳萎。

而且，输精管疾病和/或疾患包括血管炎(vasculititis)和CBAVD(先天性双侧无输精管)；此外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗和/或预防精囊疾病和/或疾患，包括囊虫病、先天性氯化物腹泻和多囊性肾病。

男性生殖系统的其它疾患和/或疾病包括，例如克莱恩费尔特氏综合征、杨氏综合征、早泄、糖尿病、囊性纤维化、卡塔格纳氏综合征、高热(high fever)、多发性硬化、和男子乳腺发育。

进一步地，本发明的多核苷酸、融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗和/或预防阴道和外阴疾病和/或疾患，包括细菌性阴道病、假丝酵母性阴道炎、单纯疱疹病毒、软下疳、腹股沟肉芽肿、性病淋巴肉芽肿、疥疮、人乳头状瘤病毒、阴道外伤、外阴外伤、腺病、衣原体性阴道炎、淋病、毛滴虫性阴道炎、尖锐湿疣、梅毒、传染性软疣、萎缩性阴道炎、佩吉特氏病、硬化性苔癣、扁平苔藓、外阴痛、中毒性休克综合征、阴道痉挛、外阴阴道炎、外阴前庭炎、和新生性疾患，诸如鳞状细胞增生、透明细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤、前庭大腺癌和外阴上皮内瘤形成。

子宫疾患和/或疾病包括痛经、子宫后倾、子宫内膜异位症、纤维瘤、子宫内膜异位、无排卵性出血、闭经、柯兴氏综合征、水泡状胎块、阿谢曼氏综合征、过早绝经、性早熟、子宫息肉、功能障碍性子宫出血(如由于异常激素信号)、和新生性疾患，诸如腺癌、平滑肌肉瘤(keiomyosarcomas)和肉瘤。此外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作先天性子宫异常的标记或探测物，以及用于诊断、治疗和/或预防先天性子宫异常，诸如双角子宫、有隔子宫、简单单角子宫、具有非空洞性原始角的单角子宫、具有非-连通的空洞性原始角的单角子宫、具有连通的空洞性角的单角子宫、弓形子宫、双子宫(uterine didelfus)、和T形子宫。

卵巢疾病和/或疾患包括不排卵、多囊卵巢综合征(斯坦因-利文撒尔综合征)、卵巢囊肿、卵巢机能减退、卵巢对促性腺激素不敏感、卵巢过量生产雄激素、右卵巢静脉综合征、闭经、多毛症(hirutism)、和卵巢癌症(包括但不限于，初生和次生性癌性生长、Sertoli-Leydig细胞瘤、卵巢内膜样腺癌、卵巢乳头状浆液性腺癌、卵巢粘液腺癌和卵巢克鲁肯贝格瘤)。

子宫颈疾病和/或疾患包括子宫颈炎、慢性子宫颈炎、粘液脓性子宫颈炎、宫颈非典型增生、子宫颈息肉、纳博特氏囊肿、子宫颈糜烂、宫颈机能不全、和子宫颈新生物(包括例如子宫颈癌、鳞状化生、鳞状细胞癌、腺鳞细胞瘤形成、和柱状细胞瘤形成)。

此外，生殖系统疾病和/或疾患包括妊娠疾患和/或疾病，包括流产和死产，诸如早期流产、晚期流产、自然流产、引产、治疗性流产、先兆流产、稽留流产、不全流产、完全流产、习惯性流产、稽留流产、和流产感染；异位妊娠、贫血、Rh不相容、妊娠期阴道出血、妊娠糖尿病、子宫内发育迟缓、羊水过多、HELLP综合征、胎盘早期脱离、前置胎盘、剧吐、先兆子痫、子痫、妊娠疱疹、和妊娠性荨麻疹。此外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗和/或预防可使妊娠复杂化的疾病，包括心脏病、心脏衰竭、风湿性心脏病、先天性心脏病、二尖瓣脱垂、高血压、贫血、肾脏病、感染性疾病(如风疹、巨细胞病毒、弓形虫病、感染性肝炎、衣原体、HIV、AIDS和生殖器疱疹)、糖尿病、格雷夫斯病、甲状腺炎、甲状腺功能减退、桥本氏甲状腺炎、慢性活动性肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、哮喘、系统性红斑狼疮(systemic lupuseryematosis)、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、阑尾炎、卵巢囊肿、胆囊疾患、和肠梗阻。

与分娩和生产相关的并发症包括胎膜早破、未足月产、过期妊娠、胎儿过熟、生产进展过慢、胎儿窘迫(如心率异常(胎儿或母亲)、呼吸问题和胎儿位置异常)、肩难产、脐带脱垂、羊水栓塞、和异常子宫出血。

进一步地，产后阶段的疾病和/或疾患包括子宫内膜炎、子宫肌炎、子宫旁组织炎、腹膜炎、盆腔血栓性静脉炎、肺栓塞、内毒素血症、肾盂肾炎、隐静脉血栓性静脉炎、乳腺炎、膀胱炎、产后出血和子宫内翻。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可诊断、治疗和/或预防的其它女性生殖系统疾患和/或疾病包括例如特纳综合征、假两性畸形、经前综合征、盆腔炎性疾病、盆腔充血症(血管充血)、性感缺失、性快感缺失、性交困难、输卵管破裂和经间痛。

感染性疾病

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测感染原。例如通过增加免疫应答，尤其是增加B和/或T细胞的增殖和分化，可治疗感染性疾病。可通过增强已有的免疫应答或通过开始新的免疫应答来增加免疫应答。或者，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可直接抑制感染原而不必引发免疫应答。

病毒是可导致本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的疾病或症状的感染原的一个例子。病毒的例子包括但不限于以下DNA和RNA病毒和病毒科：虫媒病毒、腺病毒科、沙粒病毒科、动脉炎病毒、双核糖核酸病毒科、本扬病毒科、杯状病毒科、环病毒科、冠状病毒科、登革热病毒、EBV、HIV、黄病毒科、肝DNA病毒科(肝炎病毒)、疱疹病毒科(诸如巨细胞病毒、单纯疱疹、带状疱疹)、单分子负链RNA病毒(如副粘病毒科、麻疹病毒属、弹状病毒科)、正粘病毒科(如甲型流感、乙型流感和副流感)、乳头瘤病毒属、乳多空病毒科、微小病毒科、小核糖核酸病毒科、痘病毒科(诸如天花或牛痘)、呼肠孤病毒科(如轮状病毒)、逆转录病毒科(HTLV-I、HTLV-II、慢病毒)和披膜病毒科(如风疹病毒属)。这些科的病毒可导致多种疾病或症状，包括但不限于：关节炎、细支气管炎、呼吸合胞病毒、脑炎、眼感染(如结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合征、肝炎(甲型、乙型、丙型、戊型、慢性活动性、丁型)、日本乙型脑炎、胡宁热、基孔肯雅病、裂谷热、黄热病、脑膜炎、机会性感染(如AIDS)、肺炎、伯基特淋巴瘤、水痘、出血热、麻疹、腮腺炎、副流感、狂犬病、感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传播疾病、皮肤疾病(如卡波西、疣)和病毒血症。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。在特定实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗：脑膜炎、登革热、EBV和/或肝炎(如乙型肝炎)。在其它特定实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗不响应于一种或多种其它市售的肝炎疫苗的患者。在进一步具体实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗AIDS或HIV、或肝炎(heptatitis)感染(如慢性丙型肝炎感染)联合HIV感染。

类似地，可导致疾病或症状且本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗或检测的细菌和真菌原包括但不限于以下革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、细菌科和真菌：放线菌属(如诺卡氏菌(Norcardia))、不动杆菌属(Acinetobacter)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌科(如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthrasis))、拟杆菌属(如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、芽生菌病、博德特氏菌属、疏螺旋体属(如博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属、念珠菌、弯曲杆菌属、衣原体、梭菌(Clostridium)如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium dificile)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani))、球孢子菌属(Coccidioides)、棒杆菌属(如白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae))、隐球菌属(Cryptococcus)、皮肤真菌病(Dermatocycoses)、大肠杆菌(如肠产毒性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)(如产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes))、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)(如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))、沙雷菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella))、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、嗜血杆菌属(如乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza type B))、螺杆菌属(Helicobacter)、军团杆菌属(Legionella)(如嗜肺性军团杆菌(Legionellapneumophila))、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria)(如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes))、支原体、分支杆菌属(Mycobacterium)(如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、弧菌属(Vibrio)(如霍乱弧菌(Vibrio cholerae))、萘瑟氏菌科(Neisseriaceae)(如淋病萘瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)、脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitidis))、巴斯德菌科(Pasteurellacea)、变形杆菌(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、立克次氏体科(Rickettsiaceae)、螺旋体属(Spirochetes)(如密螺旋体属某些种、钩端螺旋体属某些种、疏螺旋体属某些种)、志贺氏菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、脑膜炎球菌、肺炎球菌属和链球菌属(如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和A、B和C组链球菌)和解脲支原体(Ureaplasmas)。这些细菌、寄生和真菌家族可导致的疾病或症状包括但不限于：抗生素耐药性感染、菌血症、心内膜炎、败血病、眼感染(如结膜炎)、葡萄膜炎、结核病、齿龈炎、细菌性腹泻、机会性感染(如AIDS相关感染)、甲沟炎、假体-相关感染、龋齿、莱特氏病、呼吸道感染，诸如百日咳或脓胸、败血病、莱姆病、猫抓病、痢疾、副伤寒、食物中毒、军团杆菌病、慢性和急性炎症、红斑、酵母感染、伤寒、肺炎、淋病、脑膜炎(如甲型和乙型脑膜炎(mengitis))、衣原体、梅毒(syphillis)、白喉、麻风病、布氏菌病、消化性溃疡、炭疽、自然流产、出生缺陷、肺炎、肺感染、耳感染、耳聋、失明、嗜睡、不适、呕吐、慢性腹泻、克罗恩氏病、结肠炎、阴道病、不育、盆腔炎性疾病、念珠菌病、类结核病、结核病、狼疮、肉毒中毒、坏疽、破伤风、脓疱病、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤疾病(如蜂窝组织炎、皮肤真菌病)、毒血症、尿道感染、伤口感染、医院内(noscomial)感染。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。在特定实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗：破伤风、白喉(diptheria)、肉毒中毒和/或乙型脑膜炎。

而且，导致本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可治疗、预防和/或诊断的疾病或症状的寄生原包括但不限于以下家族或类群：阿米巴病、巴贝虫病、球虫病、隐孢子虫病、双核阿米巴病(Dientamoebiasis)、马类锥虫病、体外寄生物、贾第虫病、蠕虫病、利什曼病、血吸虫(Schistisoma)、泰来虫病、弓形虫病、锥虫病、和毛滴虫和孢子虫(如间日疟原虫(Plasmodium virax)、镰状疟原虫(Plasmodium falciparium)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale))。这些寄生物可导致多种疾病或症状，包括但不限于：疥疮、恙螨病、眼感染、肠疾病(如痢疾、贾第虫病)、肝脏疾病、肺疾病、机会性感染(如AIDS相关的)、疟疾、妊娠并发症和弓形虫病。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断任何这些症状或疾病。在特定实施方式中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗、预防和/或诊断疟疾。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可通过施用有效量的本发明的清蛋白融合蛋白于患者，或通过从患者移出细胞、向该细胞供应本发明的多核苷酸、并将改造的细胞送回患者(回体治疗)。而且，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作疫苗中的抗原以引起针对感染性疾病的免疫应答。

再生

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于分化、增殖和吸引细胞，引起组织再生。(见Science 276：59-87(1997))。组织再生可用于修复、代替或保护由于先天性缺陷、外伤(创伤、烧伤、切割或溃疡)、衰老、疾病(如骨质疏松症、骨关节炎(osteocarthritis)、牙周疾病、肝脏衰竭)、手术(包括美容整形手术)、纤维化、再灌注损伤、或全身性细胞因子损害而受损的组织。

可使用本发明再生的组织包括器官(如胰脏、肝脏、肠、肾脏、皮肤、内皮)、肌肉(平滑肌、骨骼肌或心肌)、血管系统(包括血管和淋巴)、神经、造血和骨骼(骨、软骨、腱和韧带)组织。在一个实施方式中，再生没有瘢痕形成或瘢痕形成减少。再生还可包括血管发生。

而且，本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可增加难以愈合的组织的再生。例如增加腱/韧带再生能加快损伤后的恢复时间。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于预防性地避免损伤。可治疗的具体疾病包括腱炎、腕管综合征、和其它腱或韧带缺陷。非愈合伤口的组织再生的进一步例子包括压迫性溃疡、与血管功能不全、手术和外伤性伤口相关的溃疡。

类似地，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可再生神经和脑组织以增殖和分化神经细胞。使用该方法可治疗的疾病包括中枢和外周神经系统疾病、神经病或机械和外伤性疾患(如脊髓疾患、头外伤、脑血管疾病和中风(stoke))。具体地，与外周神经损伤相关的疾病、外周神经病(如化疗或其它医药疗法造成的)、局部神经病、和中枢神经系统疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化和希-德二氏综合征)都可使用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗。

胃肠疾患

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预后评估胃肠疾患，包括炎性疾病和/或病症、感染、癌(如肠新生物(小肠类癌瘤、小肠非何杰金氏淋巴瘤、小肠(smallbowl)淋巴瘤))和溃疡，诸如消化性溃疡。

胃肠疾患包括吞咽困难、吞咽痛、食道炎症、消化性食道炎、胃反流、粘膜下纤维化和狭窄、马-韦二氏损害、平滑肌瘤、脂肪瘤、表皮癌症、腺瘤(adeoncarcinomas)、胃潴留疾患、肠胃炎、胃萎缩、胃/胃癌、胃息肉、自身免疫疾患诸如恶性贫血、幽门狭窄、胃炎(细菌性、病毒性、嗜酸粒细胞性、压力引起的、慢性腐蚀性、萎缩性、浆细胞性和梅内特里耶病)、和腹膜疾病(如乳糜性水腹(chyloperioneum)、腹腔积血、肠系膜囊肿、肠系膜淋巴结炎、肠系膜血管闭塞、脂膜炎、新生物、腹膜炎、气腹、膈下脓肿(bubphrenic abscess))。

胃肠疾患还包括与小肠相关的疾患，诸如吸收不良综合征、膨胀、肠应激综合征、糖不耐受、乳糜泻、十二指肠溃疡、十二指肠炎、热带性口炎、惠普尔氏病、肠淋巴管扩张、克罗恩氏病、阑尾炎、回肠梗阻、麦克尔憩室、多憩室、小肠和大肠不能全旋转、淋巴瘤、和细菌和寄生疾病(诸如旅行性腹泻、伤害和副伤寒、霍乱、蛔虫(人蛔虫(Ascariasis lumbricoides))、钩虫(十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale))、蛲虫(蛲虫(Enterobius vermicularis))、绦虫(牛肉绦虫(Taenia saginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、裂头绦虫属和猪肉绦虫(T.solium))感染。

肝脏疾病和/或疾患包括肝内胆汁淤积(alagille综合征、胆汁性肝硬化)、脂肪肝(酒精性脂肪肝、莱耶综合征)、肝静脉血栓形成、肝豆状核变性(hepatolentricular degeneration)、肝肿大、肝肺综合征、肝肾综合征、门静脉高压(食管和胃静脉曲张)、肝脓肿(阿米巴性肝脓肿)、肝硬化(酒精性、胆汁性和实验性)、酒精性肝脏疾病(脂肪肝、肝炎、肝硬化)、寄生(肝包虫病、片吸虫病、阿米巴性肝脓肿)、黄疸(溶血性、肝细胞性和胆汁郁积性)、胆汁郁积、门静脉高压、肝膨大、腹水、肝炎(酒精性肝炎、动物肝炎、慢性肝炎(自身免疫、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、药物引起的)、中毒性肝炎、病毒性人类肝炎(甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎)、威尔逊氏病、肉芽肿性肝炎、继发性胆汁性肝硬化、肝性脑病、门静脉高压、静脉曲张、肝性脑病、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、肝细胞腺瘤、血管瘤、胆石、肝脏衰竭(肝性脑病、急性肝脏衰竭)、和肝脏新生物(血管肌脂瘤、钙化性肝脏转移灶、囊肿性肝脏转移灶、上皮瘤、纤维层肝癌、局灶性结节性增生、肝腺瘤、肝胆囊腺瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、肝细胞瘤、肝癌、肝脏血管内皮瘤、间叶性错构瘤、肝脏间质瘤、结节再生性增生、良性肝脏肿瘤(肝囊肿[单纯性囊肿、多囊肝脏疾病、肝胆囊腺瘤、胆总管囊肿]、间质瘤[间叶性错构瘤、幼儿血管内皮瘤、血管瘤、紫癜样肝病、脂肪瘤、炎性假瘤、杂类]、上皮瘤[胆管上皮(胆管错构瘤、胆管腺瘤)、肝细胞(腺瘤、局灶性结节性增生、结节再生性增生)]、恶性肝脏肿瘤[肝细胞的、肝母细胞瘤、肝细胞癌、胆管细胞的、胆管癌、囊腺癌、血管肿瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、血管内皮瘤、其它肿瘤、胚胎性肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、癌肉瘤、畸胎瘤、类癌、鳞状癌、原发性淋巴瘤])、紫癜样肝病、红细胞肝性卟啉症、肝性卟啉症(急性间歇性卟啉症、迟发性皮肤卟啉症)、泽韦格综合征)。

胰腺疾病和/或疾患包括急性胰腺炎、慢性胰腺炎(急性坏死性胰腺炎、酒精中毒性胰腺炎)、新生物(胰脏腺癌、囊腺癌、胰岛瘤、胃泌素瘤、和胰高血糖素瘤、囊性新生物、胰岛细胞肿瘤、胰胚细胞瘤(pancreoblastoma))、和其它胰腺疾病(如囊性纤维化、囊肿(胰腺假囊肿、胰腺瘘、功能不全))。

胆囊疾病包括胆石(胆石病和胆总管结石病)、胆囊切除术后综合征、胆囊憩室病、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、胆管肿瘤和粘液囊肿。

大肠疾病和/或疾患包括抗生素-相关结肠炎、憩室炎、溃疡性结肠炎、获得性巨结肠、脓肿、真菌和细菌感染、肛门直肠疾患(如裂隙、痔)、结肠疾病(结肠炎、结肠新生物[结肠癌、腺瘤性结肠息肉(如绒毛状腺瘤)、结肠癌、结肠直肠癌]、结肠憩室炎、结肠憩室病、巨结肠[希尔施普龙病、中毒性巨结肠]；乙状结肠疾病[直肠结肠炎、乙状结肠新生物])、便秘、克罗恩氏病、腹泻(幼儿腹泻、痢疾)、十二指肠疾病(十二指肠新生物、十二指肠梗阻、十二指肠溃疡、十二指肠炎)、小肠炎(小肠结肠炎)、HIV肠病、回肠疾病(回肠新生物、回肠炎)、免疫增生性小肠病、炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)、肠闭锁、寄生物病(异尖线虫病、肠袋虫病、酵母菌感染、隐孢子虫病、双核阿米巴病(dientamoebiasis)、阿米巴痢疾、贾第虫病)、肠瘘(直肠瘘)、肠新生物(盲肠新生物、结肠新生物、十二指肠新生物、回肠新生物、肠息肉、空肠新生物、直肠新生物)、肠梗阻(输入肠袢综合征、十二指肠梗阻、嵌顿粪便、肠假性梗阻[盲肠扭转]、肠套叠)、肠穿孔、肠息肉(结肠息肉、加德纳综合征、波伊茨-耶格综合征)、空肠疾病(空肠新生物)、吸收不良综合征(盲袢综合征、乳糜泻、乳糖不耐受、短肠(short bowl)综合征、热带性口炎、惠普尔氏病)、肠系膜血管闭塞、肠壁囊样积气、蛋白流失肠病(肠淋巴管扩张)、直肠疾病(肛门疾病、大便失禁、痔、直肠炎、直肠瘘、直肠脱垂、脱肛)、消化性溃疡(十二指肠溃疡、消化性食道炎、出血、穿孔、胃溃疡、佐林格-埃利森综合征)、胃切除术后综合征(倾倒综合征)、胃疾病(如胃酸缺乏、十二指肠胃反流(胆汁反流)、胃窦血管扩张症、胃瘘、胃出口梗阻、胃炎(萎缩性或肥厚性)、胃轻瘫、胃扩张、胃憩室、胃新生物(胃癌、胃息肉、胃腺癌、增生性胃息肉)、胃破裂、胃溃疡、胃扭转)、结核病、内脏下垂、呕吐(如呕血、妊娠剧吐、手术后恶心和呕吐)和出血性结肠炎。

胃肠系统的进一步疾病和/或疾患包括胆管疾病，诸如腹裂、瘘(如胆瘘、食管瘘、胃瘘、肠瘘、胰腺瘘)、新生物(如胆管新生物、食管新生物，诸如食道腺癌、食管鳞状细胞癌、胃肠新生物、胰腺新生物，诸如胰脏腺癌、胰脏粘液囊性新生物、胰腺囊性新生物、胰胚细胞瘤和腹膜新生物)、食管疾病(如大疱病、念珠菌病、糖原棘皮症、溃疡形成、巴雷特食道静脉曲张、闭锁、囊肿、憩室(如岑克尔氏憩室)、瘘(如气管食管瘘)、运动性疾患(如CREST综合征、吞咽疾患、弛缓不能、痉挛、胃食管反流)、新生物、穿孔(如布尔哈弗综合征、马洛里-魏斯综合征)、狭窄、食道炎、膈疝(如食管裂孔疝)；胃肠疾病，诸如肠胃炎(如假霍乱、诺瓦克病毒感染)、出血(如呕血、黑粪症、消化性溃疡出血)、胃新生物(胃癌、胃息肉、胃腺癌、胃癌))、疝(如先天性膈疝、股疝、腹股沟疝、闭孔疝、脐疝、腹疝)、和肠疾病(如盲肠疾病(阑尾炎、盲肠新生物))。

趋化性

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有趋化性活性。趋化性分子吸引或动员细胞(如单核细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞、T-细胞、肥大细胞、嗜曙红细胞、上皮和/或内皮细胞)到体内特定部位，诸如炎症、感染或过度增殖部位。被动员的细胞可随后击退和/或愈合特定的外伤或异常。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可增加特定细胞的趋化性活性。这些趋化性分子随后可通过增加靶向于体内特定位置的细胞数目用于治疗炎症、感染、过度增殖疾患或任何免疫系统疾患。例如通过吸引免疫细胞到受损位置，趋化性分子可用于治疗组织的创伤和其它外伤。本发明的趋化性分子还可吸引成纤维细胞，这可用于治疗创伤。

还预期本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可抑制趋化活性。这些分子也可用于治疗疾患。因此本发明的融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作趋化性的抑制剂。

结合活性

本发明的清蛋白融合蛋白可用于筛选能结合融合蛋白的治疗性蛋白部分的分子或融合蛋白的治疗性蛋白部分能结合的分子。融合蛋白与分子的结合可活化(如激动剂、部分激动剂等)、增加、抑制(如拮抗剂、部分拮抗剂等)、或减少融合蛋白或所结合分子的活性。这类分子的例子包括抗体、寡核苷酸、蛋白(如受体)或小分子。

在一个实施方式中，该分子与本发明的融合蛋白的治疗性蛋白部分的天然配体(如配体片段、或天然底物、配体、结构或功能模拟物)紧密相关。(见Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)：第5章(1991))。类似地，该分子可与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分能结合的天然受体紧密相关，或至少与该受体的能够被本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分结合的片段(如活性位点)紧密相关。在任一种情形下，可使用已知技术合理地设计分子。

在一个实施方式中，筛选这些分子包括产生表达本发明的清蛋白融合蛋白的合适细胞。示例性细胞包括来自哺乳动物、酵母、果蝇或大肠杆菌的细胞。

检测可仅测试候选化合物与本发明的清蛋白融合蛋白的结合，其中结合由标记物来检测，或在包括与标记的竞争者竞争的测定系统中检测。进一步地，测定可测试候选化合物是否导致由结合于融合蛋白而产生的信号。

或者，可使用无细胞制品、附于固相支持体的融合蛋白/分子、化学文库或天然产品混合物进行检测。检测也可仅包括如下步骤：混合候选化合物与含有清蛋白融合蛋白的溶液、测量融合蛋白/分子活性或结合、并比较融合蛋白/分子活性或与标准品的结合。

在一个实施方式中，使用单克隆或多克隆抗体，ELISA检测可测量样品(如生物样品)中融合蛋白水平或活性。抗体可通过直接或间接地结合于清蛋白融合蛋白或通过与清蛋白融合蛋白竞争底物而测量融合蛋白水平或活性。

此外，结合本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的受体可以通过本领域技术人员已知的多种方法来鉴定，例如配体淘选和FACS分选(Coligan等，Current Protocols in Immun.(免疫学最新实验方案)，1(2)，第5章，(1991))。例如在融合蛋白的治疗性蛋白部分对应于FGF的情形，可采用表达克隆，其中从响应于清蛋白融合蛋白的细胞(例如已知含有多种针对FGF家族蛋白的受体的NIH3T3细胞，以及SC-3细胞)制备多腺苷酸化的RNA，将由该RNA产生的cDNA文库分成多个池(pools)，用它们转染不响应于清蛋白融合蛋白的COS细胞或其它细胞。在标记本发明的清蛋白融合蛋白后，将生长在载玻片的转染细胞暴露于本发明的清蛋白融合蛋白。清蛋白融合蛋白可以多种方式标记，包括碘化或掺入位点-特异性蛋白激酶的识别位点。

固定和培养后，对载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性池，制备子池(sub-pool)并通过反复分子池(sub-pooling)和再筛选的过程进行再转染，最终产生编码推定受体的单克隆。

作为鉴定受体的一种备选方法，可将标记的清蛋白融合蛋白光亲和连接于表达本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性(Therapeutoc)蛋白部分的受体分子的细胞膜或提取制备物，连接后的材料可通过PAGE分析来解析并对X-射线胶片曝光。可将含有融合蛋白的受体的标记的复合物切下，解析为肽片段，并进行蛋白微测序。可使用从微测序获得的氨基酸序列设计一组简并寡核苷酸探针来筛选cDNA文库以鉴定编码推定受体的基因。

而且，基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总称为″DNA改组″)的技术可用于调节本发明的清蛋白融合蛋白的融合蛋白和/或治疗性蛋白部分或清蛋白部分的活性，从而有效地产生本发明的清蛋白融合蛋白的激动剂和拮抗剂。一般参见美国专利第5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458号、和Patten，P.A.等，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33(1997)；Harayama，S.Trends Biotechnol.16(2)：76-82(1998)；Hansson，L.O.等，J.Mol.Biol.287：265-76(1999)；和Lorenzo，M.M.和Blasco，R.Biotechniques 24(2)：308-13(1998)；这些专利和出版物都在此通过引用并入)。在一个实施方式中，DNA改组可实现改变编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸和因此改变编码的清蛋白融合蛋白。DNA改组包括通过同源重组或位点特异性重组，将两个或多个DNA区段组装成期望的分子。在另一实施方式中，通过在重组前对其进行易错PCR、添加随机核苷酸或其它方法的随机诱变，可改变编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸，并因此改变编码的清蛋白融合蛋白。在另一实施方式中，本发明的清蛋白融合蛋白的一个或多个部分、基序、区段、部分、结构域、片段等可与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。在一些实施方式中，该异源分子是家族成员。在进一步的实施方式中，该异源分子是生长因子，诸如例如血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、转化生长因子(TGF)-α、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、激活素(activin)A和B、decapentaplegic(dpp)、6OA、OP-2、普鲁卡因青霉素、生长分化因子(GDF)、nodal、MIS、抑制素-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5和神经胶质衍生神经营养因子(GDNF)。

其它示例性片段是本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分和/或清蛋白部分的生物活性片段。生物活性片段是表现与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分和/或清蛋白部分的活性相似但不一定相同的活性的片段。片段的生物活性可包括改进的期望活性、或减少的不期望活性。

此外，本发明提供一种筛选化合物以鉴定调节本发明的清蛋白融合蛋白作用的化合物的方法。这类测定法的一个例子包括在成纤维细胞正常增殖的细胞培养条件下将哺乳动物成纤维细胞、本发明的清蛋白融合蛋白和待筛选的化合物与³[H]胸苷混合。可在不存在待筛选的化合物下进行对照测定，并与化合物存在下成纤维细胞增殖的量相比以通过确定每种情况下摄取的³[H]胸苷而确定化合物是否刺激增殖。成纤维细胞增殖的量由测量³[H]胸苷掺入的液相闪烁色谱测量。激动剂和拮抗剂化合物均可由此方案鉴定。

在另一种方法中，将表达本发明的融合蛋白的治疗性蛋白部分的受体的哺乳动物细胞或膜制备物与带标记物的本发明融合蛋白在化合物存在下培养。可随后测量该化合物增强或阻止这种相互作用的能力。或者，对已知的第二信使系统在待筛选化合物与受体相互作用后的响应进行测量，并测量该化合物结合于受体并引发第二信使响应的能力，以确定该化合物是否是潜在的融合蛋白。这种第二信使系统包括但不限于cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或磷酸肌醇水解。

上述所有这些测定均可用作诊断或预后标记。使用这些测定法发现的分子可通过活化或抑制融合蛋白/分子而用于治疗疾病或在患者中引起特定结果(如血管生长)。而且，这些测定法能够发现这样的作用剂，它们可抑制或增强经过适当操作的细胞或组织产生本发明的清蛋白融合蛋白。

因此，本发明包括鉴定结合于本发明的清蛋白融合蛋白的化合物的方法，包括以下步骤：(a)将候选结合化合物与本发明的清蛋白融合蛋白一起温育；和(b)确定是否发生了结合。而且，本发明包括鉴定激动剂/拮抗剂的方法，包括以下步骤：(a)将候选化合物与本发明的清蛋白融合蛋白一起温育，(b)测定生物活性，和(b)确定融合蛋白的生物活性是否被改变。

靶向递送

在另一实施方式中，本发明提供一种向靶细胞递送组合物的方法，其中靶细胞表达本发明的清蛋白融合蛋白的组分的受体。

如本文所述，本发明的融合蛋白(如清蛋白融合蛋白)可经由疏水的、亲水、离子和/或共价相互作用与异源多肽、异源核酸、毒素或前药缔合。在一个实施方式中，本发明提供一种特异性递送本发明的组合物到细胞的方法，该方法系通过施用与异源多肽或核酸缔合的本发明的融合蛋白(包括抗体)。在一个实例中，本发明提供一种递送治疗性蛋白到所靶向的细胞的方法。在另一个实例中，本发明提供一种递送单链核酸(如反义核酸或核酶)或双链核酸(如可整合入细胞的基因组或游离地复制并可被转录的DNA)到所靶向的细胞的方法。

在另一实施方式中，本发明提供一种特异性破坏细胞(如破坏肿瘤细胞)的方法，该方法系通过将本发明的清蛋白融合蛋白(如本发明的多肽或本发明的抗体)与毒素或细胞毒性前药组合施用。

″毒素″意为结合和活化内源细胞毒性效应器系统的化合物、放射性同位素、全毒素、修饰的毒素、毒素的催化性亚单元、或任何通常不存在于细胞中或细胞表面上、在限定条件下导致细胞死亡的分子或酶。根据本发明的方法可使用的毒素包括但不限于，本领域已知的放射性同位素、化合物，诸如例如结合固有的或诱导产生的内源细胞毒性效应系统的抗体(或其含有补体固定部分的部分)、胸苷激酶、内切核酸酶、RNA酶、α毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假单胞菌属外毒素A、白喉毒素、皂素、木鳖子皂苷、白树毒素、商陆抗病毒蛋白、α-帚曲菌素和霍乱毒素。″细胞毒性前药″指这样的非毒性化合物，其被通常存在于细胞中的酶转化为细胞毒性化合物。根据本发明的方法可使用的细胞毒性前药包括但不限于苯甲酸芥烷化剂的谷氨酰衍生物、依托泊苷或丝裂霉素C、阿糖胞苷、柔红霉素(daunorubisin)的磷酸衍生物、和多柔比星的苯氧基乙酰胺衍生物。

药物筛选

进一步预期本发明的清蛋白融合蛋白或编码这些融合蛋白的多核苷酸筛选改变本发明的清蛋白融合蛋白或对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的蛋白的活性的分子的用途。这种方法将包括将融合蛋白与所选的怀疑具有拮抗剂或激动剂活性的化合物接触，并在结合后测定融合蛋白的活性。

本发明尤其有用于通过在多种药物筛选技术的任何一种中使用本发明的清蛋白融合蛋白或其结合片段来筛选治疗性化合物。这类测试中采用的清蛋白融合蛋白可附着在固相支持体上、表达在细胞表面上、游离于溶液中、或位于细胞内。一种药物筛选方法使用以表达清蛋白融合蛋白的重组核酸稳定转化的真核或原核宿主细胞。在竞争性结合检测中，针对这种转化的细胞或从培养这种细胞获得的上清液筛选药物。例如可以测量被测试的作用剂与本发明的清蛋白融合蛋白之间的复合物的形成。

因此本发明提供影响本发明的清蛋白融合蛋白介导的活性的药物或任何其它作用剂的筛选方法。这些方法包括将这样的作用剂接触本发明的清蛋白融合蛋白或其片段并通过本领域熟知方法检测所述作用剂与清蛋白融合蛋白或其片段之间复合物的存在。在这种竞争性结合检测中，待筛选的作用剂通常是被标记的。培养后，将游离的作用剂与结合形式存在的作用剂分离，且游离或未复合的标记物的量是特定作用剂结合本发明的清蛋白融合蛋白的能力的量度。

另一种药物筛选技术提供高通量筛选与本发明的清蛋白融合蛋白具有合适的结合亲合力的化合物，该方法详细描述于1984年9月13日公布的欧洲专利申请84/03564，其在此通过引用并入。简单地说，在固态基质诸如塑料针(plastic pin)或一些其它表面上合成大数目的不同小肽测试化合物。使肽测试化合物与本发明的清蛋白融合蛋白反应并洗涤。随后由本领域熟知方法检测结合的肽。可直接将纯化的清蛋白融合蛋白包被在板上以用于前述药物筛选技术。此外，可利用非中和性抗体捕获肽并将其固定在固相支持体上。

本发明还包括使用竞争性药物筛选测定法，其中能够结合本发明的清蛋白融合蛋白的中和抗体特异性地与测试化合物竞争对清蛋白融合蛋白或其片段的结合。以这种方式，用抗体检测任何与本发明的清蛋白融合蛋白有一个或多个相同的抗原表位的肽的存在。

结合肽和其它分子

本发明还包括鉴定结合本发明的清蛋白融合蛋白的多肽和非多肽的筛选方法，和由其所鉴定的结合分子。这些结合分子可用作例如本发明的清蛋白融合蛋白的激动剂和拮抗剂。这样的激动剂和拮抗剂可根据本发明在以下详述的治疗实施方式中使用。

该方法包括如下步骤：使本发明的清蛋白融合蛋白接触多个分子；和鉴定结合清蛋白融合蛋白的分子。

使本发明的清蛋白融合蛋白接触多个分子的步骤可以多种方式进行。例如可考虑将清蛋白融合蛋白固定在固相支持体上并将多个分子的溶液与固定化的多肽接触。这种方案类似于亲合色谱方法，亲合基质包括固定化的本发明清蛋白融合蛋白。随后可通过亲合性选择纯化对清蛋白融合蛋白具有选择性亲合力的分子。固相支持体的性质、将清蛋白融合蛋白连接于固相支持体的方法、亲合性分离或选择的溶剂和条件是大体上是常规的，并是本领域普通技术人员熟知的。

或者，也可将多个多肽分为基本上分离的级分，这样的级分包含多肽的亚群或单独的多肽。例如，可通过凝胶电泳、柱色谱、或本领域技术人员已知的类似的多肽分离方法分离多个多肽。单独的多肽还可通过转化的宿主细胞制备，在其外表面上或周围(如重组噬菌体)表达。然后可以用本发明的清蛋白融合蛋白″探测″单独分离物，任选地，如果需要诱导物，则在诱导物存在下进行探测，以确定清蛋白融合蛋白和单个克隆之间是否发生任何选择性亲合力相互作用。在使清蛋白融合蛋白接触包括单独多肽的各个级分之前，为了更方便可先将多肽转移到固相支持体。这种固相支持体可仅为一片滤膜，诸如硝酸纤维素或尼龙制成的滤膜。以这种方式，可从表达文库转化的、包括编码对本发明的清蛋白融合蛋白具有选择性亲合力的多肽的DNA构建体的一群宿主细胞中鉴定出阳性克隆。此外，对本发明的清蛋白融合蛋白具有选择性亲合力的多肽的氨基酸序列可通过常规方法直接确定，或者，编码多肽的DNA的编码序列往往可更方便地确定。然后可从相应DNA序列推导一级序列。如果要从多肽本身确定氨基酸序列，可使用微测序技术。测序技术可包括质谱分析。

在一些情况下，在试图确定或检测选择性亲合力相互作用的存在之前，可能最好从本发明的清蛋白融合蛋白和多个多肽的混合物洗去任何未结合的多肽。当本发明的清蛋白融合蛋白或多个多肽结合于固相支持体时，这样的洗涤步骤可为特别期望的。

根据该方法提供的多个分子可通过多样性文库的方式提供，诸如可用于筛选特异性结合本发明的清蛋白融合蛋白的分子的随机或组合的肽或非肽文库。许多文库是本领域已知并可使用的，如化学合成的文库、重组体(如噬菌体展示文库)、和基于体外翻译的文库。化学合成的文库的例子描述于Fodor等，Science 251：767-773(1991)；Houghten等，Nature 354：84-86(1991)；Lam等，Nature 354：82-84(1991)；Medynski，Bio/Technology 12：709-710(1994)；Gallop等，J.Medicinal Chemistry 37(9)：1233-1251(1994)；Ohlmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926(1993)；Erb等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422-11426(1994)；Houghten等，Biotechniques 13：412(1992)；Jayawickreme等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1614-1618(1994)；Salmon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11708-11712(1993)；PCT公布第WO93/20242号；和Brenner和Lerner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5381-5383(1992)。

噬菌体展示文库的例子描述于Scott等，Science 249：386-390(1990)；Devlin等，Science，249：404-406(1990)；Christian等，1992，J.Mol.Biol.227：711-7181992)；Lenstra，J.Immunol.Meth.152：149-157(1992)；Kay等，Gene128：59-65(1993)；和1994年8月18日的PCT公布第WO 94/18318号。

基于体外翻译的文库包括但不限于如下所述的：1991年4月18日的PCT公布第WO 91/05058号；和Mattheakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9022-9026(1994)。

作为非肽文库的例子，苯并二氮杂卓文库(见于如Bunin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4708-4712(1994))可适于使用。还可使用类肽文库(Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367-9371(1992))。可使用的文库的另一例子描述于Ostresh等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11138-11142(1994))，其中肽的酰胺官能团已被全甲基化(permethylated)以产生化学转化的组合文库。

可用于本发明的非肽文库的种类很多。例如Ecker和Crooke(Bio/Technology 13：351-360(1995)列出了构成各种文库基础的化学物质中的苯并二氮杂卓、乙内酰脲、哌嗪双酮、联苯、糖类似物、β-巯基酮、芳基乙酸、酰基哌啶、苯并吡喃、立方烷、黄嘌呤、胺化酰亚胺和噁唑酮。

非肽文库可广泛地分为两种类型：修饰的(decorated)单体和低聚物。修饰的单体文库采用相对简单的支架结构，向其上加入多种功能基团。支架多是具有已知有用药理学活性的分子。例如支架可为苯并二氮杂卓。

非-肽低聚物文库使用大数目的单体，它们以一定的方式组装在一起，形成取决于单体顺序的形状。已经使用的单体单元包括氨基甲酸酯、吡咯啉酮和吗啉代。类肽——一类其中侧链连接于α氨基基团而不是α碳原子的肽样低聚物——是另一种非肽低聚物文库的基础。第一非肽低聚物文库使用单一类型的单体，因此含有重复的主链(repeating backbone)。近来的文库使用了多于一种单体，使得文库具有更多灵活性。

可通过多种常用已知方法中的任何方法来实现文库筛选。参见例如公开了肽文库筛选的以下参考文献：Parmley等，Adv.Exp.Med.Biol.251：215-218(1989)；Scott等，Science 249：386-390(1990)；Fowlkes等，Biotechnologys13：422-427(1992)；Oldenburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5393-5397(1992)；Yu等，Cell 76：933-945(1994)；Staudt等，Science 241：577-580(1988)；Bock等，Nature 355：564-566(1992)；Tuerk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6988-6992(1992)；Ellington等，Nature 355：850-852(1992)；授予Ladner等的美国专利第5,096,815号、美国专利第5,223,409号和美国专利第5,198,346号；Rebar等，Science 263：671-673(1993)；和PCT公布第WO94/18318号。

在特定实施方式中，可通过使文库成员接触固定于固相上的本发明的清蛋白融合蛋白，并收集结合于清蛋白融合蛋白的文库成员而进行筛选以鉴定结合本发明的清蛋白融合蛋白的分子。这种称为″淘选″技术的筛选方法的例子描述于例如Parmley等，Gene 73：305-318(1988)；Fowlkes等，Biotechniques13：422-427(1992)；PCT公布第WO 94/18318号；和本文所引用的参考文献。

在另一实施方式中，在酵母中选择相互作用蛋白的双杂交系统(Fields等，Nature 340：245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582(1991)可用于鉴定特异性结合于本发明的多肽的分子。

当结合分子是多肽时，该多肽可方便地选自任何肽文库，包括随机肽文库、组合肽文库或偏倚的(biased)肽文库。本文所用的术语″偏倚的″是指操纵文库产生方法，从而对支配所得的分子(这种情形下是肽)集合的多样性的一种或多种参数进行限制。

因此真正随机的肽文库将产生肽的集合，其中在肽的指定位置发现特定氨基酸的概率对所有20种氨基酸是相同的。不过例如也可用下面的方式来将偏倚引入文库：规定每五个氨基酸出现一个赖氨酸，或规定十肽文库的位置4、8和9固定为仅包含精氨酸。显然，可以想到许多类型的偏倚，且本发明不限于任何特定的偏倚。此外，本发明考虑了具体类型的肽文库，诸如噬菌体展示肽文库和利用DNA构建体(包括具有DNA插入片段的λ噬菌体)载体的肽文库。

如上所述，在结合分子为多肽的情形，该多肽可具有约6个至少于约60个氨基酸残基，例如约6个至约10个氨基酸残基，且进一步地，约6个至约22个氨基酸。在另一实施方式中，结合多肽具有15-100个氨基酸或20-50个氨基酸范围的氨基酸。

所选的结合多肽可由化学合成或重组表达获得。

其它活性

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在治疗中用于刺激由于各种疾病状况(诸如血栓形成、动脉硬化和其它心血管病症)而缺血的组织的血管再形成。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于刺激血管发生和肢再生，如上讨论的。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的也可用于治疗由于损伤、烧伤、手术后组织修复和溃疡所致的伤口，这是由于它们对各种不同来源的细胞(诸如成纤维细胞和骨骼肌细胞)具有促有丝分裂的作用，因此可促进受损或生病组织的修复或替换。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于刺激神经元生长和治疗和预防在一些神经元疾患或神经变性性病症诸如阿尔茨海默病、帕金森病和AIDS相关复合症中发生的神经元损害。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有刺激软骨细胞生长的能力，因此可用于增强骨和牙周再生并帮助组织移植或骨移植。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于通过刺激角质化细胞生长防止日晒导致的皮肤衰老。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于预防脱发。同样地，当与其它细胞因子组合使用时，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于刺激造血细胞和骨髓细胞生长和分化。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于在移植前维持器官或支持原代组织的细胞培养。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于诱导中胚层起源的组织在早期胚胎中分化。

除了如上讨论的造血谱系外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可增加或减少胚胎干细胞的分化或增殖。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的也可用于调节哺乳动物特征，诸如身高、体重、毛发颜色、眼色、皮肤、脂肪组织百分比、色素沉着、尺寸和外形(如美容手术)。类似地，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于调节哺乳动物代谢，影响能量的分解代谢、合成代谢、加工、利用和贮存。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于改变哺乳动物的精神状态或身体状态，通过影响生物节律、心节律(caricadic rhythms)、抑郁(包括抑郁疾患)、暴力趋势、对疼痛的耐受、生殖能力(例如通过激活素或抑制素样活性)、激素或内分泌水平、食欲、性欲、记忆力、压力或其它认知性。

本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用作食品添加剂或防腐剂，诸如为了增加或减少贮存容量、脂肪含量、脂质、蛋白质、糖、维生素、矿物质、辅因子或其它营养成分。

上述应用可用于广泛的宿主。这种宿主包括但不限于，人类、鼠类、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、小型猪、鸡、山羊、牛、绵羊、犬、猫、非-人类灵长类和人类。在特定实施方式中，该宿主是小鼠、兔、山羊、豚鼠、鸡、大鼠、仓鼠、猪、绵羊、犬或猫。在一些实施方式中，该宿主是哺乳动物。在其它实施方式中，该宿主是人类。

如上一般性地描述了本发明，参考以下实施例将更易理解本发明，实施例是作为示例说明提供并不意为限制。

无需进一步描述，相信本领域普通技术人员使用以上的描述和下文的示例性实施例可作出和利用本发明中所发现的改变，并实施所要求保护的方法。因此以下工作实施例具体地指出本发明的实施方式中，并不解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例

实施例1：pScNHSA和pScCHSA的产生

载体pScNHSA(ATCC保藏号PTA-3279)和载体pScCHSA(ATCC保藏号PTA-3276)是pPPC0005(ATCC保藏号PTA-3278)的衍生物，并用作克隆载体，将编码治疗性蛋白或其片段或变体的多核苷酸插入所述两种载体，使其邻近编码人类血清清蛋白“HSA”的多核苷酸，并与该多核苷酸处于同一翻译读码框内。pScCHSA可用于产生治疗性蛋白-HSA融合体，而pScNHSA可用于产生HSA-治疗性蛋白融合体。

pScCHSA的构建：清蛋白部分位于治疗性部分的C末端的清蛋白融合 体

通过改变pPPC0005上编码嵌合HSA信号肽的核酸序列而引入Xho I和Cla I的限制性位点，制备有利于编码治疗性蛋白的DNA克隆到编码成熟清蛋白的DNA的N末端的载体。

首先用Xho I和Cla I消化pPPC0005，去除pPPC0005内在的Xho I和Cla I位点(位于ADH1终止子序列的3’末端)，而后用T4DNA聚合酶补平粘末端，最后重新连接平末端，得到pPPC0006。

其次，采用两轮PCR在pPPC0006上编码HSA信号肽(HSA前导序列和来自交配因子α“MAF”的kex2位点的嵌合体)的核酸序列内人为引入Xho I和ClaI的限制性位点。第一轮PCR使用显示为SEQ ID NO：36和SEQID NO：37的引物进行扩增。其序列显示为SEQ ID NO：36的引物包含编码部分HSA信号肽序列、来自交配因子α前导序列的kex2位点，以及部分HSA成熟形式的氨基末端的核酸序列。这段序列引入4个点突变，产生在嵌合信号肽和HSA成熟形式连接处发现的Xho I和Cla I位点。这4个突变在下面所示序列中加下划线。在pPPC0005中，这4个位置的核苷酸从5’端到3’端是T、G、T和G。

5’-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGATTTGGG-3’(SEQ ID NO：36)和

5’-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAATAAGC-3’(SEQ ID NO：37)。然后第二轮PCR用上游侧翼引物5’-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3’(SEQ ID NO：38)和下游侧翼引物5’-CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT(SEQ ID NO：39)进行扩增。然后将得到的PCR产物纯化，用Afl ∏和Xba I消化，连接入pPPC0006的相同位点，得到pScCHSA。这样形成的质粒其信号序列内人工引入了Xho I和Cla I的位点。该Xho I位点的存在导致信号序列的末端单个氨基酸的改变，从LDKR变成了LEKR。将具有5’端Sal I位点(其与Xho I位点相容)和3’端Cla I位点的、包含编码清蛋白融合蛋白治疗性部分的多核苷酸的核酸序列连接入pScCHSA中的Xho I和Cla I位点，最终的清蛋白融合蛋白表达质粒中不存在D到E的改变。Sal I与Xho I的连接恢复了信号肽序列初始的氨基酸序列。编码清蛋白融合蛋白治疗性部分的DNA可以插在Kex2位点(Kex2的切点位于信号肽末端的双碱性氨基酸序列KR之后)之后，Cla I位点之前。

pScNHSA的构建：清蛋白部分位于治疗性蛋白的N末端的清蛋白融合 体

通过在pScCHSA上增加3个8碱基对的限制性位点，制备有利于编码治疗性蛋白的DNA克隆到编码成熟清蛋白的DNA的C末端的载体。在编码成熟HSA蛋白的核酸序列末端的Bsu36 I和Hind III位点之间加入Asc I、Fse I和Pme I限制性位点。这通过使用两条含有Asc I、Fse I和Pme I限制性位点(加下划线)的互补的合成引物(SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41)，5’-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCTTAATTCT-3’(SEQ ID NO：40)和5’-AGAATTAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3’(SEQ ID NO：41)而实现。这些引物退火后，用Bsu36 I和Hind III消化，连接入pScCHSA的相同位点，得到pScNHSA。

实施例2：用于酵母转化的一般构建体制备

载体pScNHSA和pScCHSA可用作克隆载体，将编码治疗性蛋白或其片段或变体的多核苷酸插入所述两种载体，使其邻近编码成熟人类血清清蛋白“HSA”的多核苷酸。pScCHSA用于产生治疗性蛋白-HSA融合体，而pScNHSA用于产生HSA-治疗性蛋白融合体。

包含HSA-治疗性蛋白融合产物的清蛋白融合构建体的制备

使用有利于融合构建体产生的引物(例如，通过增加限制性位点，编码无缝融合蛋白，编码接头序列等)进行PCR扩增编码治疗性蛋白的DNA(如显示为SEQ ID NO：X的序列或本领域已知序列)。例如，本领域技术人员可以设计5’端引物和3’端引物，5’端引物将编码HSA成熟形式的最后4个氨基酸(和含有Bsu36I位点)的多核苷酸加在编码治疗性蛋白的DNA的5’末端；3’端引物在治疗性蛋白编码序列的3’末端加入一个终止密码子和合适的克隆位点。比如，用于扩增编码治疗性蛋白的DNA的正向引物可具有序列5’-aagctGCCTTAGGCTTA-(N)₁₅-3’(SEQ ID NO：42)，其中加下划线的序列是Bsu36I位点，大写字母的核苷酸编码成熟HSA蛋白的最后4个氨基酸(ALGL)，(N)₁₅与编码感兴趣的治疗性蛋白的前15个核苷酸相同。相似地，用于扩增编码治疗性蛋白的DNA的反向引物可具有序列5’-GCGCGCGTTTAAAC

GGCGCGCC (N)₁₅-3’(SEQ IDNO：43)，其中斜体的序列是Pme I位点，加双下划线的序列是Fse I位点，加单下划线的序列是Asc I位点，加边框的核苷酸是两个串联终止密码子的反向互补序列，(N)₁₅与编码感兴趣的治疗性蛋白的最后15个核苷酸的反向互补序列相同。PCR产物一经扩增，即用Bsu 36I和Asc I、Fse I或Pme I三者之一进行切割，然后连接入pScNHSA。

HSA嵌合前导序列内Xho I位点的存在导致嵌合信号序列即HSA-kex2信号序列的末端单个氨基酸的改变，从LDKR(SEQ ID NO：44)变成了LEKR(SEQ ID NO：45)。

包含基因-HSA融合产物的清蛋白融合构建体的制备

与上述方法类似，可以使用下述引物PCR扩增编码治疗性蛋白的DNA：5’端引物将含有一个Sal I位点和编码HSA前导序列最后3个氨基酸DKR的多核苷酸加在编码治疗性蛋白的DNA的5’末端；3’端引物在编码治疗性蛋白的DNA的3’末端加入编码成熟HSA前几个氨基酸和含有Cla I位点的多核苷酸。例如，用于扩增编码治疗性蛋白的DNA的正向引物可具有序列5’aggagcgtcGACAAAAGA(N)₁₅-3’(SEQ ID NO：46)，其中加下划线的序列是Sal I位点，大写字母的核苷酸编码HSA前导序列的最后3个氨基酸(DKR)，(N)₁₅与编码感兴趣的治疗性蛋白的前15个核苷酸相同。相似地，用于扩增编码治疗性蛋白的DNA  的反向引物可具有序列5’-CTTTAAATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)₁₅-3’(SEQ IDNO：47)，其中斜体的序列是Cla I位点，加下划线的核苷酸是编码HSA成熟形式的前9个氨基酸(DAHKSEVAH，SEQ ID NO：48)的DNA的反向互补序列，(N)₁₅与编码感兴趣的治疗性蛋白的最后15个核苷酸的反向互补序列相同。PCR产物一经扩增，即用Sal I和Cla I消化，连接入经Xho I和Cla I消化的pScCHSA。可能想要不同的信号或前导序列，例如，转化酶“INV”(Swiss-Prot检索号P00724)、交配因子α“MAF”(Genbank检索号AAA18405)、MPIF(Geneseq AAF82936)、纤蛋白B(Swiss-Prot检索号P23142)、簇集蛋白(Swiss-Prot检索号P10909)、胰岛素样生长因子结合蛋白4(Swiss-Prot检索号P22692)，HSA前导序列的变换形式(permutations)可用本领域已知的标准方法亚克隆到适当的载体上。

适合在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的清蛋白融合构建体的制备

将来自pScNHSA或pScCHSA的含有编码N末端或C末端清蛋白融合蛋白的DNA的Not I片段克隆到具有LEU2选择标记的pSAC35的Not I位点内。这样得到的载体用于酿酒酵母表达系统的转化。

实施例3：在酿酒酵母中的一般表达

通过醋酸锂转化、电穿孔，或本领域已知其他方法，或如Sambrook、Fritsch和Maniatis，1989，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第二版”，1-3卷和Ausubel等，2000，Massachusetts GeneralHospital and Harvard Medical School“Current Protocols in MolecularBiology”(麻省综合医院和哈佛医学院“现代分子生物学通用方案”)，1-4卷中部分所述方法，可将适合酵母表达的表达载体转化进酿酒酵母。通过转化，将表达载体引入酿酒酵母菌株DXY1、D88或BXP10，10毫升YEPD(1％质量/体积的酵母提取物，2％质量/体积的蛋白胨，2％质量/体积的右旋糖)中的转化体个体可在30℃生长3天，生长60小时后，收集处于稳定期的细胞。将细胞3000g离心10分钟澄清细胞，收集上清液。

除了LEU2选择标记外，pSAC35(Sleep等，1990，Biotechnology 8：42和参见图3)包含提供复制功能的完整酵母2微米质粒、PRB1启动子和ADH1终止信号。

实施例4：从酿酒酵母清蛋白融合体中表达的清蛋白融合蛋白的一般纯 化

在有些实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白包括融合到治疗性蛋白或其部分成熟形式(如表1中所列的治疗性蛋白的成熟形式，或表2中显示为SEQ ID NO：Z的治疗性蛋白的成熟形式)的N末端或C末端的HSA的成熟形式。在本发明的一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白还包括一段在用于表达的宿主分泌途径中指引新生融合多肽的信号序列。在一个实施方案中，信号序列编码的信号肽被去除，成熟的清蛋白融合蛋白直接分泌到培养基中。本发明的清蛋白融合蛋白可包括异源信号序列(例如，特定治疗性蛋白的非天然信号序列)，包括但不限于MAF、INV、免疫球蛋白、纤蛋白B、簇集蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白4、HSA前导序列的变体(包括但不限于嵌合HSA/MAF前导序列)，或本领域已知其它异源信号序列。实例包括表2中所列的那些信号序列和/或说明书前述“融合蛋白的表达”和/或“重组和合成制备清蛋白融合蛋白的其他方法”部分所列的信号序列。在有些实施方案中，本发明的融合蛋白还包括一个N末端的甲硫氨酸残基。编码这些多肽的多核苷酸(包括片段和/或变体)也包括在本发明中。

前述酵母中表达的清蛋白融合蛋白可以按下述方法用Dyax的肽亲和柱进行小规模纯化。表达清蛋白融合蛋白的酵母上清液用3mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.2)，20mM的NaCl和0.01％的吐温20渗滤，以减少体积和除去色素。然后溶液用0.22μm的装置进行过滤。滤液上样到Dyax的肽亲和柱上。柱子用100mM的Tris/HCl缓冲液(pH 8.2)洗脱。收集含有蛋白的峰级分，浓缩5倍后用SDS-PAGE进行分析。

可用下述方法进行大规模纯化。超过2升的上清液在20mM Tris/HCl(pH8.0)中渗滤、浓缩到500毫升。浓缩的蛋白溶液上样到预平衡的50毫升DEAE-Sepharose快速柱上，柱子漂洗后，用具有0到0.4M NaCl的NaCl线性梯度的20mM Tris/HCl(pH 8.0)洗脱蛋白。将含有蛋白的那些级分汇集起来，用0.5M的磷酸钠(NaH₂PO₄)调整到pH 6.8。在蛋白溶液中加入终浓度0.9M的(NH₄)₂SO₄，全部溶液上样到预平衡的50毫升Butyl650S柱上。蛋白用硫酸铵线性梯度洗脱(0.9到0M(NH₄)₂SO₄)。再次将含有清蛋白融合体的那些级分汇集起来，用10mM的Na₂HPO₄/柠檬酸缓冲液(pH5.75)渗滤，然后上样到50毫升预平衡的SP-Sepharose快速柱上。蛋白用从0到0.5M的NaCl线性梯度洗脱。混合含有感兴趣蛋白的级分，用Amicon浓缩器将缓冲液转换为10mM的Na₂HPO₄/柠檬酸(pH 6.25)，电导率小于2.5mS/cm。将该蛋白溶液上样到15毫升预平衡的Q-Sepharose高效柱上，柱子漂洗后，蛋白用从0到0.15M NaCl的NaCl线性梯度洗脱。然后，纯化的蛋白可以通过缓冲液交换配制到特定的缓冲液组成物中。

实施例5：用于哺乳动物细胞转染的一般构建体制备

适合在哺乳动物细胞系中表达的清蛋白融合构建体的制备

可以用在哺乳动物细胞培养系统中使用的表达载体来构建清蛋白融合构建体。通过本领域已知的标准方法(例如，PCR扩增、限制性消化和连接)，可以将编码治疗性蛋白的DNA克隆到哺乳动物表达载体中HSA的N末端或C末端。构建好表达载体之后，就可以进行哺乳动物表达系统的转染了。本领域已知的合适的载体包括但不限于，例如，载体pC4和/或可获自LonzaBiologics，Inc.(Portsmouth，NH)的载体。

将编码人类血清清蛋白的DNA克隆到适合哺乳动物培养系统的pC4载体上，形成质粒pC4:HSA(ATCC保藏号PTA-3277)。该载体上含有二氢叶酸还原酶“DHFR”基因，该基因可用于在氨甲喋呤存在时进行选择。

pC4:HSA载体可用于在CHO细胞中表达清蛋白融合蛋白。对于在其它哺乳动物细胞培养系统中的表达，可能想要将包含或者由编码清蛋白融合蛋白的DNA组成的片段亚克隆到替代的表达载体中。例如，可将包含或者由编码成熟清蛋白融合蛋白的DNA组成的片段亚克隆到另一个表达载体中，包括但不限于在此所述的任何哺乳动物表达载体。

在一个实施方案中，通过本领域已知的方法，将编码清蛋白融合构建体的DNA亚克隆到由Lonza Biologics，Inc.(Portsmouth，NH)提供的载体上，用于在NS0细胞中的表达。

包含HSA-治疗性蛋白融合产物的清蛋白融合构建体的制备

用pC4:HSA(ATCC保藏号PTA-3277)可以得到治疗性蛋白部分位于成熟清蛋白序列C末端的清蛋白融合构建体。例如，可将编码治疗性蛋白或其片段或变体的DNA克隆到载体的Bsu 36I和Asc I限制性位点之间。克隆到Bsu 36I和Asc I位点之后，可使用用于酵母载体系统克隆的同样的引物设计(SEQ ID NO：42和43，参见实施例2)。

包含基因-HSA融合产物的清蛋白融合构建体的制备

用pC4:HSA(ATCC保藏号PTA-3277)可以得到治疗性蛋白部分克隆到成熟清蛋白序列N末端的清蛋白融合构建体。例如，可将编码含有其自身信号序列的治疗性蛋白的DNA克隆到pC4:HSA的Bam HI(或Hind III)和Cla I位点之间。克隆到Bam HI或Hind III位点之后，可在编码治疗性蛋白的DNA的翻译起始密码子之前加入一段Kozak序列(CCGCCACCATG，SEQID NO：49)。如果治疗性蛋白不含有信号序列，编码治疗性蛋白的DNA可以克隆到pC4:HSA的Xho I和Cla I位点之间。使用Xho I位点时，可使用下述5’(SEQ ID NO：50)和3’(SEQ ID NO：51)末端示例性的PCR引物：5’-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)₁₈-3’(SEQ ID NO：50)和5’-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)₁₈-3’(SEQ IDNO：51)。

所述5’引物(SEQ ID NO：50)中，加下划线的序列是Xho I位点；Xho I位点和Xho I位点之后的DNA编码天然人类血清清蛋白前导序列的最后7个氨基酸。在SEQ ID NO：50中，“(N)₁₈”是与编码感兴趣的治疗性蛋白的前18个核苷酸相同的DNA。所述3’引物(SEQ ID NO：51)中，加下划线的序列是Cla I位点；Cla I位点和其之后的DNA是编码成熟HSA蛋白(SEQ IDNO：1)的前10个氨基酸的DNA的反向互补序列。在SEQ ID NO：51中，“(N)₁₈”是编码感兴趣的治疗性蛋白的最后18个核苷酸的DNA的反向互补序列。使用这两个引物，可以PCR扩增感兴趣的治疗性蛋白，然后纯化PCR产物，用Xho I和Cla I限制酶消化，然后将其克隆到pC4:HSA载体的Xho I和Cla I位点内。

如果想要替代的前导序列，可通过本领域已知的标准方法用嵌合清蛋白前导(即HSA-kex2信号肽)或替代的前导替代天然清蛋白前导序列。(例如，本领域技术人员可通过常规PCR扩增替代前导，将PCR产物亚克隆到清蛋白融合构建体上，替代清蛋白前导，同时保留了阅读框)。

实施例6：在哺乳动物细胞系中的一般表达

通过磷酸钙沉淀、脂质转染胺(lipofectamine)、电穿孔或其它本领域已知转染方法和/或如Sambrook、Fritsch和Maniatis，1989，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第二版”和Ausubel等，2000，Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School“Current Protocolsin Molecular Biology(麻省综合医院和哈佛医学院“现代分子生物学通用方案”)”，1-4卷中所述其它方法，适合在哺乳动物细胞系中表达的表达载体产生的清蛋白融合构建体可转染到合适的细胞系中。然后，在选择剂存在的条件下，通过表达载体上的选择标记选择转染细胞。

pC4表达载体(ATCC检索号209646)是质粒pSV2-DHFR(ATCC检索号37146)的衍生物。pC4包含劳氏肉瘤病毒强启动子长末端重复“LTR”(Cullen等，1985年3月，Molecular and Cellular Biology，438-447)和巨细胞病毒“CMV”增强子的片段(Boshart等，1985，Cell 41：521-530)。该载体还包含3’内含子、大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷化和终止信号和由SV40早期启动子控制的小鼠DHFR基因。中国仓鼠卵巢“CHO”细胞或其它缺乏活性DHFR基因的细胞系可用于转染。通过本领域已知方法将pC4上的清蛋白融合构建体转染到CHO细胞中，可使清蛋白融合蛋白在CHO细胞中表达，然后切除掉前导序列，分泌到上清液中。随后可从上清液中纯化得到清蛋白融合蛋白。

由Lonza Biologics，Inc.(Portsmouth，NH)提供的pEE12.1表达载体是pEE6(Stephens和Cockett，1989，Nucl.Acids Res.17：7110)的衍生物。该载体包括位于感兴趣序列上游的人类巨细胞病毒主要即刻早期基因“hCMV-MIE”(国际公布第WO89/01036号)的启动子、增强子和完整5’-非翻译区，和用于在含甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine)的选择培养基上选择转染细胞的谷氨酰胺合成酶基因(Murphy等，1991，Biochem J.227：277-279；Bebbington等，1992，Bio/Technology 10：169-175；美国专利第5,122,464号)。通过本领域已知方法将pEE12.1上的清蛋白融合构建体转染到NS0细胞(国际公布第WO86/05807号)中，可使清蛋白融合蛋白在NS0细胞中表达，然后切除掉前导序列，分泌到上清液中。随后可使用此处所述技术或本领域已知其它技术从上清液中纯化得到清蛋白融合蛋白。

例如，可通过SDS-PAGE和Western印迹、反相HPLC分析或本领域已知其它方法，分析清蛋白融合蛋白的表达。

通过本领域已知方法(如脂质转染胺转染)可获得转染清蛋白融合构建体的稳定CHO和NS0细胞系，例如对于含有二氢叶酸还原酶“DHFR”基因作为选择标记的载体，可用100nM的氨甲喋呤进行选择，或者通过在缺乏谷氨酰胺的条件下生长来进行选择。然后主要地用抗HSA血清作为一抗或者其次地用含有针对特定清蛋白融合蛋白治疗性蛋白部分的抗体的血清作为一抗进行免疫印迹来检验表达水平。

用抗HSA血清作为一抗进行免疫印迹检测来检测表达水平。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定比生产率，ELISA的捕捉抗体可以是针对清蛋白融合体治疗性蛋白部分的单克隆抗体，检测抗体可以是单克隆抗HSA生物素化的抗体(或反之亦然)，然后进行辣根过氧化物酶/链霉亲合素的结合，参照制造厂商提供的方案进行分析。

实施例7：清蛋白融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

本发明的清蛋白融合蛋白可以在哺乳动物细胞中表达。典型的哺乳动物表达载体包括介导mRNA转录起始的启动子元件、蛋白编码序列和终止转录和多聚腺苷酸化转录物所需的信号。其它的元件包括增强子、Kozak序列和侧翼为RNA剪接供体和受体位点的间插序列。来自SV40的早期和晚期启动子、来自反转录病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复(LTR)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可实现高效的转录。然而，也可以使用细胞元件(例如，人类肌动蛋白的启动子)。

本发明实践中使用的合适的表达载体包括，例如，诸如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)、pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport 2.0和pCMVSport 3.0等载体。可使用的哺乳动物宿主细胞包括但不限于人类Hela、293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos 1、Cos 7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

或者，清蛋白融合蛋白也可以在含有整合到染色体上的编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸的稳定细胞系中表达。与诸如DHFR、gpt、新霉素或潮霉素等选择标记共转染使转染细胞的鉴定和分离成为可能。

转染的编码融合蛋白的多核苷酸也可以通过扩增表达大量的编码的融合蛋白。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于发展携带几百或甚至几千感兴趣基因拷贝的细胞系(参见例如Alt等，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；Hamlin等，Biochem.et Biophys.Acta，1097：107-143(1990)；Page等，Biotechnology 9：64-68(1991))。另一个有用的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，Biochem J.227：277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology10：169-175(1992))。使用这些标记，哺乳动物细胞可以在选择培养基上生长，然后选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体上的扩增的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和NSO细胞常用于蛋白的制备。

质粒pSV2-dhfr(ATCC检索号37146)的衍生物：表达载体pC4(ATCC检索号209646)和pC6(ATCC检索号209647)含有劳氏肉瘤病毒强启动子(LTR)(Cullen等，Molecular and Cellular Biology，438-447(1985年3月))加上CMV-增强子的片段(Boshart等，Cell 41：521-530(1985))。具有例如限制酶Bam HI、Xba I和Asp 718切割位点的多克隆位点有利于感兴趣基因的克隆。这些载体也含有3’内含子、大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷化信号和终止信号和由SV40早期启动子控制的小鼠DHFR基因。

具体地，例如，质粒pC6用合适的限制酶消化后，通过本领域已知方法用小牛小肠磷酸酶去磷酸化。然后从1％的琼脂糖凝胶中分离得到载体。

编码本发明中清蛋白融合蛋白的多核苷酸可通过本领域已知技术产生，该多核苷酸可通过本领域已知的PCR技术进行扩增。如果使用天然存在的信号序列来产生本发明中的融合蛋白，则载体不需要其他的信号肽。或者，如果不使用天然存在的信号序列，可以修饰载体来引入异源的信号序列(参见例如国际公布第WO 96/34891号)。

本发明中编码融合蛋白的扩增片段可使用可商业途径获得的试剂盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶分离得到。得到的片段用合适的限制酶消化，然后再用1％的琼脂糖凝胶纯化。

然后，编码本发明中清蛋白融合蛋白的扩增片段可用同样的限制酶消化，并用1％的琼脂糖凝胶纯化。用T4DNA连接酶将分离得到的片段和去磷酸化的载体连接。然后转化大肠杆菌(E.coli)HB101或XL-1 Blue细胞，使用例如限制酶分析鉴定含有插入质粒pC6的片段的细菌。

缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。用脂转染试剂(lipofectin)(上述Felgner等)将5μg表达质粒pC6或pC4与0.5μg pSVneo质粒共转染。质粒pSV2-neo含有显性选择标记：来自Tn5的neo基因，编码的酶赋予对包括G418的一组抗生素的抗性。细胞接种在补加了1mg/mlG418的α-MEM培养基上。2天后，细胞经胰蛋白酶消化，接种在补加了10、25或50ng/ml氨甲喋呤和1mg/ml G418的α-MEM培养基的杂交瘤克隆板(Greiner，Germany)上。约10-14天后，单克隆经胰蛋白酶消化，接种在具有不同浓度氨甲喋呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的6孔培养皿或10毫升培养瓶中。然后将生长在最高浓度氨甲喋呤的克隆转移到新的含有甚至更高浓度氨甲喋呤(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)的6孔板上。重复同样的方法，直至得到可在100-200μM浓度上生长的克隆。通过例如SDS-PAGE和Western印迹或反相HPLC分析的方法分析所需融合蛋白的表达。

实施例8：在哺乳动物细胞系中清蛋白融合构建体中表达的清蛋白融合 蛋白的一般纯化

在有些实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白包括融合到治疗性蛋白或其一部分成熟形式(如表1中所列治疗性蛋白的成熟形式，或表2中显示为SEQ ID NO：Z的治疗性蛋白的成熟形式)的N末端或C末端的HSA成熟形式。在本发明的某个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白还包括一段在用于表达的宿主分泌途径中指引新生融合多肽的信号序列。在一个实施方案中，信号序列编码的信号肽被去除，成熟的清蛋白融合蛋白直接分泌到培养基中。本发明的清蛋白融合蛋白可包括异源信号序列(例如，特定治疗性蛋白的非天然信号序列)，包括但不限于MAF、INV、免疫球蛋白、纤蛋白B、簇集蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白4、HSA前导序列的变体(包括但不限于嵌合HSA/MAF前导序列)，或本领域已知其它异源信号序列。示例性的信号序列包括表2中所列的信号序列和/或说明书前述“融合蛋白的表达”和/或“重组和合成制备清蛋白融合蛋白的其他方法”部分所列的信号序列。在有些实施方案中，本发明的融合蛋白还包括一个N末端的甲硫氨酸残基。编码这些多肽的多核苷酸(包括片段和/或变体)也包括在本发明中。

因使用的表达系统的不同，可使用不同的方案来纯化哺乳动物细胞系上清液中的清蛋白融合蛋白。

从CHO和293T细胞系的纯化

从CHO细胞上清液或从瞬时转染的293T细胞上清液的清蛋白融合蛋白的纯化步骤包括，使用磷酸钠缓冲液的阴离子HQ树脂的初始捕获和磷酸盐梯度洗脱，和随后的使用盐梯度洗脱在Blue Sepharose FF柱上亲和层析。BlueSepharose FF去除主要的BSA/胎球蛋白污染物。用磷酸盐梯度对Poros PI 50树脂的进一步纯化可去除和降低内毒素的污染，并浓缩清蛋白融合蛋白。

从NSO细胞系的纯化

从NS0细胞上清液的清蛋白融合蛋白的纯化步骤可包括，Q-Sepharose阴离子交换层析、随后一步洗脱的SP-Sepharose纯化、随后一步洗脱的Phenyl-650M纯化和最后的渗滤。

纯化的蛋白可以通过缓冲液交换进行配制。

实施例9：清蛋白融合蛋白在细菌中的表达

使用对应于DNA序列5’和3’末端的PCR寡核苷酸引物扩增包含细菌信号序列的编码本发明中清蛋白融合蛋白的多核苷酸，来合成插入片段。用于扩增编码插入物的多核苷酸的引物可在引物的5’末端含有诸如Bam HI和Xba I的限制性位点，以便将扩增产物克隆到表达载体上。例如，Bam HI和Xba I与细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)上的限制酶位点相对应。该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、细菌复制起点(ori)、IPTG调节的启动子/操纵基因(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6组氨酸标签(6-His)和限制酶克隆位点。

pQE-9载体经Bam HI和Xba I消化后，将扩增片段连接入该pQE-9载体，同时保留在细菌RBS起始的阅读框。连接混合物用于转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)，该菌株含有多拷贝的pREP4质粒，该质粒表达lac I阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kan^r)。通过可在LB平板上生长的能力来鉴定转化体，选择具有氨苄青霉素/卡那霉素抗性的菌落。分离得到质粒DNA并通过限制性分析进行确认。

含有所需构建体的克隆在补加了氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的液体LB培养基中生长过夜。使用过夜培养物以1∶100到1∶250的比例接种大的培养物。细胞生长到光密度600(O.D.⁶⁰⁰)在0.4到0.6之间。加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)使其终浓度达到1mM。IPTG通过失活lac I阻遏物、诱导启动(clearing)P/O，致使基因表达增加。

细胞继续生长3到4小时。然后通过离心(6000g，20分钟)收集细胞。细胞沉淀溶解于离液剂6摩尔的盐酸胍或例如8M的尿素和浓度高于0.14M的2-巯基乙醇中，4℃搅拌3-4小时(参见，例如，Burton等，Eur.J.Biochem.179：379-387(1989))。离心去除细胞碎片，将含有多肽的上清液上样到镍-次氮基-三乙酸(“Ni-NTA”)亲和树脂柱上(来自上述QIAGEN，Inc.)。带有6-His标签的蛋白以高亲和力结合到Ni-NTA树脂上，并可通过简单的一步程序纯化(详见上述QIAexpressionist(1995)QIAGEN，Inc.)。

简单地说，于6M盐酸胍(pH 8)中的上清液上样到柱子上。先用10倍体积的6M盐酸胍(pH 8)漂洗柱子，然后用10倍体积的6M盐酸胍(pH6)继续漂洗，最后用6M盐酸胍(pH 5)洗脱多肽。

通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或50mM乙酸钠缓冲液(pH 6)加上200mM NaCl进行透析来复性纯化的蛋白。或者，可通过将蛋白固定化在Ni-NTA柱上来使蛋白成功地重新折叠。示例性的条件如下：用具有6M到1M尿素的线性梯度、并含蛋白酶抑制剂的500mM NaCl、20％甘油、20mMTris/HCl(pH 7.4)进行复性。复性应该在1.5小时或更长时间进行。复性后，添加250mM咪唑洗脱蛋白。最后通过用PBS或50mM乙酸钠缓冲液(pH6)加上200mM NaCl进行透析步骤来去除咪唑。纯化的蛋白保存在4℃或冻存于-80℃。

除了上述表达载体外，本发明还包括称为pHE4a(ATCC检索号209645，保藏于1998年2月25日)的表达载体，该载体含有可操作地连接到编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸的噬菌体操纵基因和启动子元件。该载体包括：1)新霉素磷酸转移酶基因为选择标记，2)大肠杆菌复制起点，3)T5噬菌体的启动子序列，4)两个lac操纵子序列，5)Shine-Delgarno序列，和6)乳糖操纵基因阻遏基因(lacIq)。复制起点(oriC)衍生自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。启动子和操纵基因序列是人工合成的。

通过用Nde I和Xba I、Bam HI、Xho I或ASP 718限制性酶切pHE4a载体，并将限制性酶切产物跑胶，分离较大的片段(填充片段应当是约310个碱基对)，可将DNA插入pHE4a。根据此处所述的PCR方案或本领域已知其它方法，使用具有限制性位点Nde I(5’引物)和Xba I、Bam HI、Xho I或ASP 718(3’引物)的PCR引物得到DNA插入物。PCR插入物经凝胶纯化和合适酶的限制性酶切。根据标准的方案将插入物与载体连接。

上述方案中可替代人工构建的载体，在细菌系统中表达蛋白。

实施例10：从保藏样品中分离选定的cDNA克隆

本发明的许多清蛋白融合构建体保藏于ATCC(如表3所示)。这些清蛋白融合构建体可包括下述表达载体中的任何一种：酿酒酵母表达载体pSAC35、哺乳动物表达载体pC4或哺乳动物表达载体pEE12.1。

pSAC35(Sleep等，1990，Biotechnology 8：42)、pC4(ATCC检索号209646；Cullen等，Molecular and Cellular Biology，438-447(1985)；Boshart等，Cell 41：521-530(1985))和pEE12.1(Lonza Biologics，Inc.；Stephens和Cockett，Nucl.Acids Res.17：7110(1989)；国际公布第WO89/01036号；Murphy等，Biochem J.227：277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology10：169-175(1992)；美国专利第5,122,464号；国际公布第WO86/05807号)载体包含用于在细菌细胞中生长的氨苄青霉素抗性基因。使用本领域所述技术(如Hanahan)，这些载体和/或包含这些载体的清蛋白融合构建体可转化大肠杆菌菌株，如Stratagene的XL-1 Blue(Stratagene Cloning Systems，Inc.，11011N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA，92037)，然后铺在含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Broth琼脂平板上，37℃生长过夜。

对任何给定的清蛋白融合构建体，表3中引用的具有ATCC保藏号的样品中的保藏材料也可含有一种或多种额外的清蛋白融合构建体，每个编码不同的清蛋白融合蛋白。因此，具有同一ATCC保藏号的保藏物含有至少一个表3相应行中鉴定的清蛋白融合构建体。

可通过两种方法从表3中引用的清蛋白融合构建体的质粒DNA的保藏样品中分离特定的清蛋白融合构建体。

方法1：筛选

首先，使用本领域已知方法，用对应于表1中个体构建体ID号的SEQ IDNO：X的多核苷酸探针筛选保藏的质粒DNA样品，来直接分离清蛋白融合构建体。例如，根据已报道的序列，可使用Applied Biosystems DNA合成仪来合成具有30-40个核苷酸的一段特定的多核苷酸。可使用T4多核苷酸激酶用例如³²P-γ-ATP标记寡核苷酸并根据常规方法纯化(例如，Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring，NY(1982))。使用本领域技术人员已知的技术，如载体供应厂商提供的技术或上述引用的相关出版物或专利中提到的技术，将来自给定ATCC保藏物的清蛋白融合构建体转化到如前述合适的宿主中(如XL-1 Blue(Stratagene))。转化子铺在1.5％的琼脂平板上(含合适的选择剂，如氨苄青霉素)，密度为每个平板上约150个转化体(菌落)。根据常规用于细菌菌落筛选的方法(例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，第2版，(1989)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1.93到1.104页)或本领域技术人员已知其它方法，用尼龙膜筛选这些平板。

方法2：PCR

或者，例如通过使用两条在编码给定清蛋白融合蛋白的DNA的5’和3’末端可杂交到保藏清蛋白融合构建体的17-20个核苷酸的引物，可从具有SEQ ID NO：X的保藏清蛋白融合构建体样品中扩增编码给定清蛋白融合蛋白的DNA。在常规条件下运行聚合酶链式反应，例如，在25μl的反应混合物中含0.5μg的上述cDNA模板。合适的反应混合物包括1.5-5mM MgCl₂、0.01％(质量/体积)明胶，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各20μM，每条引物25pmol和0.25个单位的Taq聚合酶。用Perkin-Elmer Cetus自动热循环仪运行35个循环的PCR(94℃变性1分钟；55℃退火1分钟；72℃延伸1分钟)。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，切下具有预期分子量的DNA条带，然后进行纯化。通过亚克隆和测序DNA产物来验证得到的PCR产物即为选定的序列。

有几种方法可用于鉴定可能不存在于保藏克隆中的基因的5’或3’非编码部分。这些方法包括但不限于滤膜探测法、使用特异探针的克隆富集法和与本领域已知的5’和3’“RACE”方案类似或一样的方案。例如，一种类似于5’RACE的方法可用于产生所需全长转录物的缺失5’末端(Fromont-Racine等，Nucleic Acids Res.，21(7)：1683-1684(1993))。

简单地说，将特异的RNA寡核苷酸连接到假定含有全长基因RNA转录物的RNA群体的5’末端。用含有特异于连接的RNA寡核苷酸的引物和特异于感兴趣基因已知序列的引物的引物集PCR扩增所需全长基因的5’部分。该扩增产物可被测序，并可用于产生全长基因。

尽管可以使用poly-A+RNA，但上述方法从所需来源中分离的总RNA开始。如果必要，得到的RNA制备物可用磷酸酶处理以除去可能干扰后续RNA连接酶步骤的降解或损坏RNA的5’磷酸根基团。然后应失活磷酸酶，用烟草酸焦磷酸酶处理RNA以除去存在于信使RNA 5’末端的帽结构。该反应使切去帽的RNA的5’末端保留一个5’磷酸根基团，使用T4RNA连接酶可将该RNA连接到RNA寡核苷酸上。

用上述修饰的RNA制备物作模板进行第一链cDNA的合成，其使用基因特异性寡核苷酸。第一链合成反应作为PCR扩增所需5’末端的模板，该PCR扩增使用特异于连接的RNA寡核苷酸的引物和特异于感兴趣基因已知序列的引物。然后，将得到的产物测序并分析以确认5’末端序列属于所需基因。

实施例11：多融合的融合体

此外，清蛋白融合蛋白(例如，含有融合到清蛋白(或其片段或变体)的治疗性蛋白(或其片段或变体))也可以融合到其它蛋白上，产生“多融合蛋白”。这些多融合蛋白有许多应用。例如，可将本发明的清蛋白融合蛋白融合到His标签、HA标签、蛋白A、IgG结构域和麦芽糖结合蛋白上以利于纯化(参见例如EP A 394,827；Traunecker等，Nature 331：84-86(1988))。融合到本发明多肽上的核定位信号可将蛋白靶向特定的亚细胞定位，而共价的异二聚体或同二聚体可以提高或降低清蛋白融合蛋白的活性。此外，将额外的蛋白序列融合到本发明的清蛋白融合蛋白上可以进一步提高融合蛋白的溶解度和/或稳定性。上述融合蛋白可通过使用本领域已知的技术或例行修改的本领域已知技术和/或修改下述方案得到，下述方案概述了多肽与IgG分子的融合。

简单地说，可使用跨下述序列5’和3’末端的引物PCR扩增IgG分子的人类Fc部分。这些引物还应具有合适的限制酶位点，以利于将其克隆到表达载体中(如哺乳动物或酵母表达载体)。

例如，如果使用pC4(ATCC检索号209646)，人类Fc部分可连接到Bam HI克隆位点内。注意，应该破坏3’端的Bam HI位点。然后，含有人类Fc部分的载体重新用Bam HI限制性酶切，载体线性化后，将编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸(使用本领域已知技术产生和分离)连接到该BamHI位点内。注意，克隆的编码本发明融合蛋白的多核苷酸没有终止密码子，否则将不能产生含有Fc的融合蛋白。

如果使用天然存在的信号序列来产生本发明中的清蛋白融合蛋白，pC4不需要其他的信号肽。或者，如果不使用天然存在的信号序列，可以修饰载体来引入异源的信号序列(参见例如国际公布第WO96/34891号)。

人类IgG的Fc区：

GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC

CTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCC

TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACAT

GCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACC

CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAA

AGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG

TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG

TACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC

CCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG

GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA

GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGA

CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC

AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT

TCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGA

GCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA

ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT

CTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT  (SEQ ID NO：52)

实施例12：从清蛋白融合蛋白产生抗体

杂交瘤技术

许多方法都可以制备结合本发明清蛋白融合蛋白和本发明清蛋白融合蛋白一部分(例如，融合蛋白的治疗性蛋白部分或清蛋白部分)的抗体(参见Current Protocols(通用方案)，第2章)。这些方法中一个例子是，制备并纯化本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分的制备物，使其基本上不含天然污染物。随后将得到的制备物引入动物中来产生具有更大比活性(specific activity)的多克隆抗血清。

通过杂交瘤技术制备特异于本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分的单克隆抗体(Kohler等，Nature 256：495(1975)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；Hammerling等，在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)，Elsevier，N.Y.，563-681(1981))。一般地，用本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分免疫动物(如小鼠)。提取所述小鼠的脾细胞，并与合适的骨髓瘤细胞系融合。依照本发明可使用任何合适的骨髓瘤细胞系；然而可使用可从ATCC得到的亲本骨髓瘤细胞系(SP2O)。融合后，得到的杂交瘤细胞选择性地在HAT培养基上维持，并随后通过如Wands等(Gastroenterology 80：225-232(1981))所述的有限稀释进行克隆。随后检测通过这种选择得到的杂交瘤细胞用于鉴定分泌能结合本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分的抗体的克隆。

或者，在一个两步的方案中，使用抗独特型抗体可产生能结合本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分的其它抗体。这种方法利用了抗体本身也是抗原的事实，因此有可能得到能结合第二抗体的抗体。依照这一方法，用蛋白特异的抗体免疫动物(如小鼠)。随后该动物的脾细胞用于产生杂交瘤细胞，通过筛选该杂交瘤细胞来鉴定产生一种抗体的克隆，该抗体结合本发明清蛋白融合蛋白(或本发明清蛋白融合蛋白一部分)-特异抗体的能力可为本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分所阻断。该抗体包括针对本发明融合蛋白(或本发明清蛋白融合蛋白一部分)-特异抗体的抗独特型抗体，用于免疫动物来诱导更多本发明融合蛋白(或本发明清蛋白融合蛋白一部分)-特异抗体的形成。

为了在人类体内使用抗体，将抗体“人源化”。可使用衍生自上述产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的遗传构建体来产生人源化抗体。产生嵌合的和人源化的抗体的方法本领域已知，并在此处讨论(参见Morrison，Science229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Taniguchi等，EP 171496；Morrison等，EP 173494；Neuberger等，WO 8601533；Robinson等，国际公布第WO 8702671号；Boulianne等，Nature 312：643(1984)；Neuberger等，Nature 314：268(1985))。

从scFv文库中分离针对本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分的抗体片段。将从人类PBL中分离的天然存在的V基因构建到具有针对本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分的反应性的抗体片段的文库中，其供体可以是已接触本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分的，也可以是未接触的(参见例如美国专利第5,885,793号，通过引用完整收入本文)。

文库的拯救。scFv文库是如国际公布第WO 92/01047号所述从人类PBL的RNA构建的。为了拯救噬菌体展示抗体片段，用含有噬菌粒的大概10⁹个大肠杆菌接种50毫升含1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY(2×TY-AMP-GLU)，通过振荡生长到O.D.达到0.8。然后取5毫升该培养物接种50毫升2×TY-AMP-GLU，并添加2×10⁸TU的Δ基因3辅助噬菌体(M13Δ基因III，参见国际公布第WO 92/01047号)，培养物于37℃无振荡温育45分钟，然后再于37℃振荡温育45分钟。得到的培养物4000r.p.m.离心10分钟，将沉淀重悬于2升含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×TY，并生长过夜。最后如国际公布第WO 92/01047号所述制备噬菌体。

按下述方法制备M13Δ基因III：M13Δ基因III辅助噬菌体不编码基因III蛋白，因此展示抗体片段的噬菌体(噬菌粒)具有更大的结合抗原的亲合力。在噬菌体形态建成过程中，通过在含有可提供野生型基因III蛋白的pUC19衍生物的细胞中培养辅助噬菌体，获得感染性M13Δ基因III颗粒。培养物于37℃无振荡温育1小时，然后再于37℃振荡温育1小时。细胞离心后(IEC-Centra 8400r.p.m.离心10分钟)重悬于300毫升含100μg氨苄青霉素/ml和25μg卡那霉素/ml的2×TY肉汤培养基中(2×TY-AMP-KAN)，37℃振荡培养过夜。通过两步PEG沉淀(Sambrook等，1990)从培养基中纯化和浓缩噬菌体颗粒，然后将噬菌体颗粒重悬于2毫升PBS，滤过0.45μm滤膜(Minisart NML；Sartorius)，最后得到的终浓度为约10¹³转导单位/ml(氨苄青霉素抗性克隆)。

文库的淘选。用4毫升100μg/ml或10μg/ml本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分的PBS包被免疫管(Nunc)过夜。然后用2％的Marvel-PBS于37℃封闭管2小时，PBS漂洗3次。加约10¹³TU的噬菌体到管中，置于上下翻转台上转动，室温温育30分钟，然后静置另外1.5小时。用含0.1％吐温-20的PBS和PBS各洗管10次。加1毫升100mM的三乙胺，并置于上下翻转台上旋转15分钟洗脱噬菌体，然后立即用0.5毫升1.0M的Tris-HCl(pH 7.4)中和溶液。通过将洗脱的噬菌体与细菌一起于37℃温育30分钟，噬菌体用于感染10毫升对数中期的大肠杆菌TG1。然后将大肠杆菌铺在含1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE平板上。得到的细菌文库再如上所述用Δ基因3辅助噬菌体进行拯救，以制备用于下一轮选择的噬菌体。然后重复上述过程进行共4轮的亲和纯化，第3和4轮用含0.1％吐温-20的PBS和PBS漂洗各增加到20次。

结合物的表在。来自第3和第4轮选择的洗脱噬菌体用于感染大肠杆菌HB 2151，从单菌落中产生可溶的scFv(Marks等，1991)以检测。用溶于50mM碳酸氢盐(pH 9.6)的10pg/ml的本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白一部分包被微量滴定板进行ELISA。ELISA中的阳性克隆可通过PCR指纹法(参见例如国际公布第WO 92/01047号)和随后测序来进一步表征。这些ELISA阳性克隆也可通过本领域已知技术进行进一步的鉴定，诸如例如，表位作图、结合亲和力、受体信号转导、阻断或竞争性抑制抗体/抗原结合的能力和竞争性激动或拮抗活性。

实施例13：[ ³ H]-2-脱氧葡萄糖的摄取实验

脂肪、骨骼肌和肝是胰岛素敏感组织。胰岛素可以刺激葡萄糖的摄取/转运入这些组织。对脂肪和骨骼肌而言，胰岛素起始信号转导，最终导致葡萄糖转运蛋白4分子(GLUT4)从特定的细胞内区室转运到细胞表面。一旦位于细胞表面，GLUT4就允许葡萄糖的摄取/转运。

[ ³ H]-2-脱氧葡萄糖的摄取

在任何一种或多种列出用于糖尿病治疗的治疗药物的组合缺乏或存在的条件下，许多脂肪和肌肉相关细胞系可用于葡萄糖摄取/转运活性的测定。特别地，3T3-L1鼠成纤维细胞和L6鼠骨骼肌细胞可分别分化成3T3-L1脂肪细胞和肌管，用作[³H]-2-脱氧葡萄糖摄取实验合适的体外模型(Urso等，J Biol Chem，274(43)：30864-73(1999)；Wang等，J Mol Endocrinol，19(3)：241-8(1997)；Haspel等，J Membr Biol，169(1)：45-53(1999)；Tsakiridis等，Endocrinology，136(10)：4315-22(1995))。简单地说，2×10⁵个细胞/100μL的脂肪细胞或分化的L6细胞在分化后培养基中转移到用50μg/mL的多聚-L-赖氨酸处理(即包被)的96孔组织培养板(“TC”)上，然后在5％的CO₂中于37℃温育过夜。细胞首先用不含血清的低葡萄糖DMEM培养基漂洗一次，然后用100μL/孔的同样培养基，再用100μL/孔的缓冲液或任何一种或几种列出用于糖尿病治疗的治疗药物的组合(例如，1nM、10nM和100nM增加浓度的本发明的治疗剂(如公开为SEQ ID NO：Y的特定融合体和其片段和变体))在缺乏或存在1nM胰岛素的条件下，置于37℃16小时，使其处于饥饿状态。用100μL/孔的HEPES缓冲盐水漂洗培养板3次。在10μM标记的[³H]-2-脱氧葡萄糖(Amersham，#TRK672)和10μM未标记的2-脱氧葡萄糖(SIGMA，D-3179)存在的条件下，加入在HEPES缓冲盐水中1nM的胰岛素，置于37℃30分钟。作为对照，在同样条件下进行同样的实验，只是不加入胰岛素。以100μL/孔在每个孔中加入终浓度为10μM的松胞菌素B(SIGMA，C6762)来测定非特异性摄取。细胞用HEPES缓冲盐水漂洗3次。加入标记的10μM的[³H]-2-脱氧葡萄糖和未标记的10μM的2-脱氧葡萄糖，室温10分钟。细胞用冷的磷酸盐缓冲盐水“PBS”漂洗3次。加入150μL/孔的0.2N的NaOH，随后室温振荡温育20分钟，细胞被裂解。然后将样品转移到加有5毫升闪烁液的闪烁瓶中。用β闪烁计数器对闪烁瓶计数。在差别为缺乏或存在胰岛素的两个条件下的摄取量用下列等式确定：[(每分钟的胰岛素计数“cpm”-非特异cpm/(无胰岛素cpm-非特异cpm)]。脂肪细胞和肌管的平均响应分别落在约5倍和3倍于对照的限值内。

细胞的分化

在T-75cm²的瓶内允许细胞完全汇合。弃掉培养基，替换成25毫升的分化前培养基培养48小时。细胞于37℃在5％CO₂和85％湿度下温育。48小时后，弃掉分化前培养基，替换成25毫升分化培养基培养48小时。细胞再于37℃在5％CO₂和85％湿度下温育。48小时后，弃掉培养基，替换成30毫升分化后培养基。细胞在分化后培养基上继续维持14-20天，或直至实现完全分化。每2-3天更换一次培养基。人类脂肪细胞可从Zen-Bio，INC(#SA-1096)购买。

实施例14：[ ³ H]-胸苷掺入胰腺细胞系的体外试验

近来的研究表明，GLP-1以依赖于时间和剂量的模式诱导大鼠胰管上皮细胞系ARIP的分化，这种诱导作用与胰岛十二指肠同源异型框-1(IDX-1)和胰岛素mRNA水平的升高相关(Hui等，2001，Diabetes，50(4)：785-96)。IDX-1继而提高GLP-1受体的mRNA水平。

试验的细胞类型

RIN-M细胞：这些细胞可从美国典型组织培养物保藏中心(ATCC细胞系编号CRL-2057)得到。RIN-M细胞系衍生自辐射诱导的可移植性大鼠胰岛细胞瘤。该细胞系是从裸鼠肿瘤异种移植物建立的。该细胞产生和分泌胰岛多肽激素，并产生L-多巴脱羧酶(具有胺前体摄取和脱羧或APUD活性的细胞的标志)。

ARIP细胞：这些细胞是具有上皮形态的胰腺外分泌细胞，可从美国典型组织培养物保藏中心(ATCC细胞系编号CRL-1674)得到。也参见参考文献：Jessop，N.W.和Hay，R.J.，″Characteristics of two rat pancreatic exocrinecell lines derived from transplantable tumors(衍生自可移植性肿瘤的两个大鼠胰腺外分泌细胞系的特征)″，In Vitro 16：212，(1980)；Cockell，M.等，″Identification of a cell-specific DNA-binding activity that interacts with atranscriptional activator of genes expressed in the acinar pancreas(与在胰腺腺泡中表达的基因的转录激活剂相互作用的细胞特异性DNA结合活性的鉴定)″，Mol.Cell.Biol.9：2464-2476，(1989)；Roux，E.等，″The cell-specifictranscription factor PTF1 contains two different subunits that interact with theDNA(细胞特异性转录因子PTF1含有两个不同的可与DNA相互作用的亚基)″Genes Dev.3：1613-1624，(1989)；和Hui，H.等，″Glucagon-like peptide1induces differentiation of islet duodenal homeobox-1-positive pancreatic ductalcells into insulin-secreting cells(胰高血糖素样肽1诱导胰岛十二指肠同源异型框阳性的胰管细胞分化为胰岛素分泌细胞)″Diebetes 50：785-796，(2001)。

细胞的制备

RIN-M细胞系生长在含10％胎牛血清(HyClone，#SH30088.03)的RPMI1640培养基中(Hyclone，#SH300027.01)，每6到8天以1∶3到1∶6的比例继代培养。每3到4天更换一次培养基。

ARIP细胞系(ATCC编号CRL-1674)生长在含2mM的L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的Ham氏F12K培养基(ATCC，#30-2004)中。每周两次以1∶3到1∶6的比例继代培养ARIP细胞系。每3到4天更换一次培养基。

试验方案

细胞以4000个细胞/孔接种到96孔板内，培养48到72小时达到50％的汇合。然后将细胞以100μL/孔转移到不含血清的培养基。温育48-72小时后，将血清和/或本发明的治疗剂(如本发明的清蛋白融合蛋白和其片段或变体)加到孔。再温育36个小时。将[³H]-胸苷(5-20Ci/mmol)(AmershamPharmacia，#TRK120)稀释到1微居里/5微升。36小时温育后每孔加5微升，继续温育24小时。用冷的磷酸盐缓冲盐水“PBS”轻柔漂洗细胞一次终止反应。然后用100微升10％的冰冷的TCA于4℃固定细胞15分钟。弃掉PBS，加200微升0.2N的NaOH。板于室温振荡温育1小时。将溶液转移到闪烁瓶中，加5毫升与水溶液相容的闪烁液，剧烈混合。闪烁瓶用β闪烁计数器计数。使用仅缓冲液作为阴性对照。胎牛血清作为阳性对照。

实施例15：糖尿试验

糖尿(即尿中过量的糖)容易测定，可作为糖尿病疾病状态的指标。与正常患者样品相比患者样品中过量的尿是IDDM和NIDDM的症状。此类IDDM和NIDDM患者的治疗功效显示为由此所致的尿中过量葡萄糖含量的降低。在一个监测IDDM和NIDDM的实施方案中，使用本领域已知技术来测定患者尿样中葡萄糖的存在。人类糖尿的定义为尿液中葡萄糖的浓度超过100mg/100ml。甚至可以通过获得患者的血样进行血清葡萄糖的测定来更精确地测定糖尿患者过量的糖水平。

实施例16：检测对B细胞增殖和分化的刺激或抑制的试验

功能性体液免疫应答的产生要求B-谱系细胞和其微环境之间的可溶性的和关联(cognate)的两类信号传导。信号可以产生正刺激，允许B-谱系细胞继续其程序性发育，或负刺激，指示细胞中断其目前的发育途径。迄今为止，发现许多刺激性和抑制性信号可影响B细胞的响应性，包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-13、IL-14和IL-15。有趣的是，这些信号本身是弱效应物，但与各种共刺激蛋白组合，能诱导B细胞群体的激活、增殖、分化、归巢、耐受和死亡。

研究得最清楚的B细胞共刺激蛋白类别之一是TNF超家族。这个家族内，已发现CD40、CD27和CD30以及它们各自的配体CD154、CD70和CD153调节许多免疫应答。用于检测和/或观察这些B-细胞群体及其前体增殖和分化的试验是确定各种蛋白对这些B-细胞群体的增殖和分化的影响的有用的工具。下文列出了两个设计用来检测B-细胞群体及其前体的分化、增殖或抑制的试验。

体外试验-可评定本发明的清蛋白融合蛋白(包括含有治疗性蛋白的片段或变体和/或清蛋白或清蛋白的片段或变体的融合蛋白)诱导B-细胞群体及其前体激活、增殖、分化或抑制和/或死亡的能力。本发明的清蛋白融合蛋白对纯化的人类扁桃体B细胞的活性定性地在从0.1到10,000ng/mL的剂量范围内测定，用标准的B-淋巴细胞共刺激试验评定，该试验中，纯化的扁桃体B细胞在福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CowanI(SAC)或固定化的抗人类IgM抗体作为引发剂存在的条件下培养。诸如IL-2和IL-15的第二信号与SAC和IgM协同交联引起B细胞增殖，通过氚标记的胸苷的掺入进行测定。使用这一试验可以容易地鉴定新的协同剂。该试验包括通过磁珠(MACS)清除CD3阳性细胞来分离人类扁桃体B细胞。得到的细胞群体含有超过95％的B细胞，通过CD45R(B220)的表达进行评定。

将每个样品的不同稀释物加入96孔板的各个孔内，孔内加有总体积150μl的用培养基(含10％的FBS、5×10^-5M的2ME、100U/ml的青霉素、10μg/ml的链霉素和10^-5倍稀释的SAC的RPMI 1640培养基)悬浮的10⁵的B细胞。加入因子后72小时，开始用³H-胸苷(6.7Ci/mM)进行20小时的脉冲(1uCi/孔)来定量细胞的增殖或抑制。阳性和阴性对照分别是IL2和培养基。

体内试验-每天两次用仅缓冲液或含2mg/Kg的本发明的清蛋白融合蛋白(包括含有治疗性蛋白的片段或变体和/或清蛋白或清蛋白片段或变体的融合蛋白)的缓冲液注射(i.p.)BALB/c小鼠。小鼠连续4天接受该处理，然后处死小鼠，收集各种组织和血清用于分析。通过比较正常脾和用本发明清蛋白融合蛋白处理的脾的H&E切片，鉴定融合蛋白对脾细胞的活性结果，诸如，动脉周围淋巴鞘的扩散和/或红髓区带核细胞性的显著增长，这可指示B细胞群体分化和增殖的激活。用B细胞标记抗CD45R(B220)进行的免疫组织化学研究用于确定脾细胞的任何生理改变(如脾结构的破坏)是否是由渗入建成T细胞区的松散限定的B细胞区内B细胞表现度增长造成的。

用流式细胞术分析用清蛋白融合蛋白处理的小鼠的脾用于指示清蛋白融合蛋白是否与对照小鼠相比特异地增加ThB+/CD45R(B220)暗淡的B细胞的比例。

同样地，预测的体内增加的成熟B细胞表现度的结果是Ig血清滴度的相对增加。相应地，比较缓冲液和融合蛋白处理的小鼠间的IgM和IgA血清水平。

实施例17：T细胞增殖试验

对PBMC进行CD3诱导的增殖试验，通过³H-胸苷的摄取进行测定。试验进行如下：用100μl/孔的CD3的mAb(HIT3a，Pharmingen)或同种型匹配的对照mAb(B33.1)包被96孔板4℃过夜(溶于0.05M、pH 9.5的碳酸氢盐缓冲液，1μg/ml)，然后用PBS漂洗3次。用F/H梯度离心从人类外周血中分离PBMC，在RPMI(含10％的FCS、P/S和不同浓度的本发明清蛋白融合蛋白(包括含有治疗性蛋白的片段或变体和/或清蛋白或清蛋白的片段或变体的融合蛋白))中加到mAb包被板的四重复孔内(5×10⁴/孔，总体积200μl)。仅相关蛋白缓冲液和培养基作为对照。37℃培养48小时后，将板1000rpm离心2分钟，若观察到对细胞增殖的影响，则取出100μl上清液，保存到-20℃用于IL-2(或其它细胞因子)的测定。然后在孔内补加100μl含0.5μCi的³H-胸苷的培养基，于37℃培养18-24小时。收集各孔，掺入的³H-胸苷用于增殖的测定。单独的抗CD3作为增殖的阳性对照。IL-2(100U/ml)也用作增强增殖的对照。不诱导T细胞增殖的对照抗体作为本发明融合蛋白效应的阴性对照。

实施例18：本发明融合蛋白对MHC ∏类、共刺激和黏着分子的表达和 对单核细胞和单核细胞衍生的人类树突细胞分化的影响

树突细胞是由存在于外周血的增殖前体扩张(expansion)产生的：粘着的PBMC或淘洗的(elutriated)单核细胞级分用GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(20ng/ml)培养7-10天。这些树突细胞具有未成熟细胞的特征表型(CD1、CD80、CD86、CD40和MHC ∏类抗原的表达)。用诸如TNF-α的激活因子处理引起表面表型的迅速改变(MHC I类和∏类、共刺激和黏着分子表达的增强、FCγR∏的下调和CD83的上调)。这些改变是与抗原呈递能力的增强和树突细胞的功能性成熟相关的。

表面抗原的FACS分析可按下述方案进行。细胞用增加浓度的本发明清蛋白融合蛋白或LPS(阳性对照)处理1-3天，用含1％BSA和0.02mM叠氮化钠的PBS漂洗，然后与1∶20稀释的合适的FITC-或PE-标记的单克隆抗体共同于4℃温育30分钟。再漂洗一次之后，在FACScan(Becton Dickinson)上进行标记细胞的流式细胞术分析。

对细胞因子产生的影响。树突细胞产生的细胞因子(特别是IL-12)在启动依赖于T细胞的免疫应答中发挥重要作用。IL-12强烈影响Thl辅助T细胞免疫应答的发生，并诱导细胞毒性T和NK细胞发挥作用。用ELISA测定IL-12释放的方案如下所述。用增加浓度的本发明清蛋白融合蛋白处理树突细胞(10⁶/ml)24小时。加到细胞培养物的LPS(100ng/ml)作为阳性对照。收集细胞培养物的上清液，用商业化的ELISA试剂盒(如R&D Systems(Minneapolis，MN))分析IL-12的含量。使用该试剂盒提供的标准方案。

对MHC ∏类、共刺激和黏着分子表达的影响。单核细胞上可鉴定3大家族的细胞表面抗原：黏着分子、参与抗原呈递的分子和Fc受体。通过调节MHC ∏类抗原和其它共刺激分子(如B7和ICAM-1)的表达，可导致单核细胞抗原呈递能力的改变和诱导T细胞激活能力的改变。Fc受体表达的增强可能与改进的单核细胞细胞毒性、细胞因子的释放和吞噬作用相关。

用于检测表面抗原的FACS分析可按下述方案进行。单核细胞用增加浓度的本发明清蛋白融合蛋白或LPS(阳性对照)处理1-5天，用含1％BSA和0.02mM叠氮化钠的PBS漂洗，然后与1∶20稀释的合适的FITC-或PE-标记的单克隆抗体共同于4℃温育30分钟。再漂冼一次，最后在FACScan(Becton Dickinson)上进行标记细胞的流式细胞术分析。

单核细胞激活和/或增加的存活。研究激活(或失活)单核细胞和/或增加单核细胞的存活(或降低单核细胞的存活)的分子的试验是本领域已知的，通常可用于确定本发明的分子是否可作为单核细胞的抑制剂或激活剂发挥作用。本发明的清蛋白融合蛋白可通过下述3个试验进行筛选。对于这些实验的每一个而言，外周血单个核细胞(PBMC)都是通过Histopaque梯度(Sigma)离心从单个供体白细胞袋(美国红十字会，Baltimore，MD)中纯化的。然后，通过逆流离心淘洗，从PBMC中分离得到单核细胞。

单核细胞存活试验。当在缺乏血清或其它刺激的培养基中培养时，人类外周血单核细胞会逐渐地丧失生存力。其死亡源自内在调节的过程(凋亡)。在培养物中添加诸如TNF-α的激活因子可显著提高细胞的存活，阻止DNA的片段化。碘化丙锭(PI)染色用于凋亡的测定，其方案如下。单核细胞在聚丙烯管内在下述培养基内培养48小时：不含血清的培养基(阳性对照)、含100ng/ml TNF-α的培养基(阴性对照)和含不同浓度所测融合蛋白的培养基。用含终浓度为5μg/ml PI的PBS以2×10⁶/ml的浓度悬浮细胞，室温温育5分钟后进行FACScan分析。在本实验范例中，PI的摄取表现出是与DNA的片段化相关的。

对细胞因子释放的影响。单核细胞/巨噬细胞的一个重要功能是它们通过刺激后释放细胞因子，对免疫系统的其它细胞群体的调节活性。测定细胞因子释放的ELISA如下进行。人类单核细胞以5×10⁵个细胞/ml的密度与增加浓度的本发明清蛋白融合蛋白共同温育，并在缺少了融合蛋白的同样温育条件下温育。为了产生IL-12，在融合蛋白存在的条件下，用IFN(100U/ml)引发(prime)细胞过夜。然后加入LPS(10ng/ml)。24小时后收集条件培养基，并使其保持冷冻状态直至使用。然后用商业化的ELISA试剂盒(如R&D Systems(Minneapolis，MN))及随试剂盒提供的标准方案测定TNF-α、IL-10、MCP-1和IL-8。

氧化爆发。纯化的单核细胞以2-1×10⁵个细胞/孔铺到96孔板内。在总体积0.2ml的培养基内(RPMI 1640+10％FCS、谷氨酰胺和抗生素)，将增加浓度的本发明清蛋白融合蛋白加入到孔内。温育3天后，离心平板，弃掉孔内的培养基。向巨噬细胞单层，每孔内加入0.2ml的酚红溶液(140mMNaCl、10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、5.5mM右旋糖、0.56mM酚红和19U/ml HRPO)和刺激物(200nM PMA)。平板于37℃温育2小时，每孔加入20μl 1N的NaOH终止反应。测定610nm的吸光度。为计算巨噬细胞产生的H₂O₂量，每个实验绘制已知摩尔浓度的H₂O₂溶液的标准曲线。

实施例19：本发明清蛋白融合蛋白对血管内皮细胞生长的影响

第1天，将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)以2-5×10⁴个细胞/35mm盘的密度接种到M199培养基，该培养基含4％胎牛血清(FBS)、16单位/ml肝素和50单位/ml内皮细胞生长添加物(ECGS，Biotechnique，Inc.)。第2天，将培养基替换为含10％FBS和8单位/ml肝素的M199培养基。加入不同浓度的本发明清蛋白融合蛋白和诸如VEGF和碱性FGF(bFGF)的阳性对照。第4天和第6天，更换培养基。第8天，用Coulter计数器测定细胞数目。

HUVEC细胞数目的增加说明融合蛋白可以增殖血管内皮细胞，而HUVEC细胞数目的减少说明融合蛋白抑制血管内皮细胞。

实施例20：大鼠角膜伤口愈合模型

该动物模型表明了本发明清蛋白融合蛋白对新血管形成的影响。实验方案包括：

从角膜中心到基质层作一个1-1.5毫米长的切口。

在所述切口边缘下方面向外眼角插入一个压舌板(spatula)。

做一个口袋(其底部距眼睛的边缘1-1.5毫米(its base is 1-1.5mm formthe edge of the eye))。

将含50ng-5ug本发明清蛋白融合蛋白的小丸放入口袋。

本发明清蛋白融合蛋白的处理也可局部地加在角膜伤口处，剂量范围在20mg-500mg(每天处理，处理5天)。

实施例21：糖尿病小鼠和糖皮质激素受损的伤口愈合模型

糖尿病db+/db+小鼠模型

用遗传糖尿病的小鼠伤口愈合模型来证明本发明的清蛋白融合蛋白可加速愈合的过程。在db+/db+小鼠中的全层皮肤伤口愈合模型是研究得比较清楚、临床相关和可重复的受损伤口愈合模型。糖尿病伤口的愈合依赖于肉芽组织的形成和上皮的重新形成，而不是收缩(Gartner，M.H.等，J.Surg.Res.52：389，(1992)；Greenhalgh，D.G.等，Am.J.Pathol.136：1235，(1990))。

糖尿病动物具有∏型糖尿病中观察到的许多典型特征。与同窝出生的正常杂合小鼠(db+/+m)相比，纯合(db+/db+)小鼠肥胖。突变型糖尿病小鼠(db+/db+)在4号染色体上有一个单一的常染色体隐性突变(db+)(Coleman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：283-293，1982)。动物表现为多食、多饮和多尿。突变型糖尿病小鼠(db+/db+)血糖水平升高、胰岛素水平正常或升高，细胞介导的免疫性受到抑制(Mandel等，J.Immunol.120：1375，(1978)；Debray-Sachs，M.等，Clin.Exp.Immunol.51(1)：1-7，(1983)；Leiter等，Am.J.of Pathol.114：46-55，(1985))。这些动物还表现为外周神经病、心肌并发症、微血管损伤、基膜加厚和肾小球滤过异常(Norido，F.等，Exp.Neurol.83(2)：221-232，(1984)；Robertson等，Diabetes 29(1)：60-67，(1980)；Giacomelli等，Lab Invest.40(4)：460-473，(1979)；Coleman，D.L.，Diabetes 31(增刊)：1-6，(1982))。这些纯合糖尿病小鼠发生了类似于人类II型糖尿病的对胰岛素耐受的高血糖(Mandel等，J.Immunol.120：1375-1377，(1978))。

这些动物中观察到的特征说明，该模型的愈合过程与人类糖尿病中观察到的愈合过程类似(Greenhalgh等，Am.J.of Pathol.136：1235-1246，(1990))。

本研究使用的是遗传糖尿病的雌性C57BL/KsJ小鼠(db+/db+)和与其同窝出生的非糖尿病杂合小鼠(db+/+m)(Jackson实验室)。这些动物购买来时6周大，开始研究时8周大。动物单独饲养，随意进食和喝水。所有操作都是使用无菌技术进行的。实验是根据人类基因组科学公司实验动物管理和使用委员会(Human Genome Sciences，Inc.Institutional Animal Care andUse Committee)的规定和准则以及实验动物管理和使用的准则(Guidelines forthe Care and Use of Laboratory Animals)进行的。

产生伤口的方案是按照已经发表的方法进行的(Tsuboi，R.和Rifkin，D.B.，J.Exp.Med.172：245-251，(1990))。简单地说，在产生伤口当天，先腹膜内注射溶于去离子水的阿伏丁(Avertin，0.01mg/ml)、2，2，2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇麻醉动物。将动物的背侧区域刮毛，用70％乙醇溶液和碘清洗皮肤。在产生伤口前，用无菌纱布将手术区域擦干。然后，用Keyes组织穿孔器产生一个8毫米的全层皮肤伤口。伤口产生后，马上小心地拉伸周边皮肤防止伤口扩大。实验过程中一直保持伤口的开放。从伤口产生当天开始，连续5天进行表面处理。处理前，先用无菌的盐水和纱布海绵轻柔地清理伤口。

手术当天和之后每两天用肉眼检查伤口并在固定距离处照相。在第1-5天和第8天每天测量伤口来确定伤口的闭合。用已校准的Jameson卡尺水平和垂直地测量伤口。如果肉芽组织不再可见，并且伤口被连续的上皮所覆盖，则认为伤口已经愈合。

所使用的本发明清蛋白融合蛋白处于不同剂量的范围内，媒介中每天每个伤口从4mg到500mg，处理8天。媒介对照组用50mL的媒介溶液处理。

第8天，动物通过腹膜内注射戊巴比妥钠(300mg/kg)施以安乐死。然后收集伤口和周边皮肤用于组织学和免疫组织化学分析。将组织样品置于含10％中性缓冲的福尔马林的组织盒内，在活体解剖海绵之间，用于进一步处理。

评价每组10个动物(5个糖尿病样品和5个非糖尿病对照)的3组样品：1)媒介安慰剂对照，2)未治疗组，3)治疗组。

通过测定垂直和水平轴方向的伤口并得到伤口的整个方形面积来分析伤口的闭合。然后通过确立起始伤口面积(第0天)和处理后伤口面积(第8天)之差来估计伤口的收缩。第1天的伤口面积为64mm²，与皮肤穿孔的大小相对应。使用下式进行计算：

a.[第8天的开口面积]-[第1天的开口面积]/[第1天的开口面积]

样品用10％缓冲的福尔马林固定，用Reichert-Jung切片机将石蜡包埋块垂直于伤口表面(5mm)进行切片。对切片的伤口横切面进行常规的苏木精-伊红染色(H&E)。对伤口的组织学检测用于评估愈合过程和修复的皮肤的形态学表观是否因本发明清蛋白融合蛋白的处理而改变。这种评估包括验证细胞积累、炎性细胞、毛细血管、成纤维细胞、上皮再形成和表皮成熟度的存在(Greenhalgh，D.G.等，Am.J.Pathol.136：1235，1990)。已校准的透镜测微器由盲法观察者使用。

组织切片也通过免疫组织化学方法用多克隆兔抗人的角蛋白抗体染色，用ABC Elite检测系统进行检测。人类的皮肤用作阳性组织对照；而非免疫的IgG用作阴性对照。用已校准的透镜测微器通过评估伤口上皮再形成的程度来确定角质形成细胞的生长。

用ABC Elite检测系统、使用抗PCNA抗体(1∶50)来证明皮肤标本中增殖细胞核抗原/细胞周期蛋白(PCNA)的存在。人类结肠癌作为阳性组织对照，人类脑组织用作阴性组织对照。每个标本包括用非免疫小鼠IgG替换的不含一抗的切片。根据增殖的程度(按0-8的等级)对这些切片进行分级，较低的等级反映了轻微的增殖程度，较高的等级反映了强烈的增殖程度。

用非配对t检验分析实验数据。p值＜0.05视为显著。

类固醇受损的大鼠模型

各种体外和体内系统中都充分证明，类固醇可抑制伤口的愈合(Wahl，Glucocorticoids and Wound healing(糖皮质激素和伤口愈合)。在Anti-Inflammatory Steroid Action：Basic and Clinical Aspects(抗炎性类固醇作用：基础和临床方面).280-302，(1989)；Wahl等，J.Immunol.115：476-481，1975；Werb等，J.Exp.Med.147：1684-1694，1978)。通过抑制血管发生、降低血管通透性(Ebert等，An.Intern.Med.37：701-705，1952)、成纤维细胞增殖、胶原蛋白合成(Beck等，Growth Factors.5：295-304，1991；Haynes等，J.Clin.Invest.61：703-797，1978)和使循环的单核细胞瞬时减少(Haynes等，J.Clin.Invest.61：703-797，1978；Wahl，″Glucocorticoids and Wound healing(糖皮质激素和伤口愈合)″，在Anti-Inflammatory Steroid Action：Basic and ClinicalAspects(抗炎性类固醇作用：基础和临床方面)，Academic Press，New York，280-302页，1989)，糖皮质激素可延迟伤口的愈合。对受损的伤口愈合系统地给药类固醇是大鼠中比较确定的现象(Beck等，Growth Factors.5：295-304，1991；Haynes等，J.Clin.Invest.61：703-797，1978；Wahl，″Glucocorticoids andWound healing(糖皮质激素和伤口愈合)″，在Anti-Inflammatory SteroidAction：Basic and Clinical Aspects(抗炎性类固醇作用：基础和临床方面)，Academic Press，New York，280-302页，1989；Pierce等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2229-2233，1989)。

为证明本发明的清蛋白融合蛋白可加速愈合过程，对由于系统给药甲泼尼龙而使愈合受损的大鼠评估多次表面的融合蛋白施用对全层皮肤切除皮肤伤口的影响。

本实施例中使用的是重250-300g的年轻的成体雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River实验室)。这些动物购买来时8周大，开始研究时9周大。在伤口形成时，通过甲泼尼龙(肌内注射17mg/kg/大鼠)系统给药，使大鼠的愈合反应受损。动物单独饲养，随意进食和喝水。所有操作都是使用无菌技术进行的。本研究是根据人类基因组科学公司实验动物管理和使用委员会(Human Genome Sciences，Inc.Institutional Animal Care and UseCommittee)的规定和准则以及实验动物管理和使用的准则(Guidelines for theCare and Use of Laboratory Animals)进行的。

产生伤口的方案如前所述。在产生伤口当天，肌内注射氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉动物。将动物的背侧区域刮毛，用70％乙醇和碘溶液清洗皮肤。在产生伤口前，用无菌纱布将手术区域擦干。用Keyes组织穿孔器产生一个8毫米的全层皮肤伤口。实验过程中一直保持伤口的开放。从伤口产生当天开始，甲泼尼龙给药后，连续7天，每天一次进行表面施加测试材料。处理前，用无菌盐水和纱布海绵小心地清洗伤口。

产生伤口当天和处理结束时用肉眼检查伤口并在固定距离处照相。在第1-5天和第8天每天测量伤口来确定伤口的闭合。用已校准的Jameson卡尺水平和垂直地测量伤口。如果肉芽组织不再可见，并且伤口被连续的上皮所覆盖，则认为伤口已经愈合。

所使用的本发明清蛋白融合蛋白处于不同剂量的范围内，媒介中每天每个伤口从4mg到500mg，处理8天。媒介对照组用50mL的媒介溶液处理。

第8天，动物通过腹膜内注射戊巴比妥钠(300mg/kg)施以安乐死。然后收集伤口和周边皮肤用于组织学分析。将组织标本置于含10％中性缓冲的福尔马林的组织盒内，在活体解剖海绵之间，用于进一步处理。

评价每组10个动物(5个甲泼尼龙处理样品和5个不含糖皮质激素的样品)的3组样品：1)未治疗组，2)媒介安慰剂对照，3)治疗组。

通过测定垂直和水平轴方向的伤口并得到伤口的整个面积来分析伤口的闭合。然后通过确立起始伤口面积(第0天)和处理后伤口面积(第8天)之差来评估伤口的闭合。第1天的伤口面积为64mm²，与皮肤穿孔的大小相对应。使用下式进行计算：

b.[第8天的开口面积]-[第1天的开口面积]/[第1天的开口面积]

标本用10％缓冲的福尔马林固定，用奥林巴斯切片机将石蜡包埋块垂直于伤口表面(5mm)切片。对切片的伤口横切面进行常规的苏木精-伊红染色(H&E)。对伤口的组织学检测允许评估愈合过程和修复的皮肤的形态学表观是否因本发明清蛋白融合蛋白的处理而得到改善。盲法观察者使用已校准的透镜测微器来确定伤口缺口的距离。

用非配对t检验分析实验数据。p值＜0.05视为显著。

实施例22：淋巴水肿动物模型

本实验方法的目的是产生合适和一致的淋巴水肿模型，用于测定本发明清蛋白融合蛋白在大鼠后肢淋巴管生成和淋巴循环系统重建中的治疗效果。通过受影响肢的膨胀体积、淋巴维管结构的量的定量、总血浆蛋白和组织病理学分析，测定其有效性。急性淋巴水肿观察7-10天。可能更重要的是，水肿的慢性发展继续观察3-4周。

开始手术前，抽取血样用于蛋白浓度的分析。重约350g的雄性大鼠用戊巴比妥处理。随后，将右腿从膝盖到髋刮毛。刮毛的区域用浸有70％乙醇的纱布棉拭干净。抽取血样用于血清总蛋白测定。足内注射染料之前，界定2个测量高度(后足跟上0.5cm，位于背足的中部)之后，进行周长和体积测定。在右足和左足的皮内背面注射0.05ml 1％的Evan氏蓝。足内注射染料后，进行周长和体积测定。

用膝关节作为位标，环切得到腿中部腹股沟处的切口，来定位股血管。用镊子和止血钳解剖和分离皮瓣。定位了股血管后，就可定位沿血管侧面和在血管下面的淋巴管。然后此区域的主要淋巴管用电凝固或用缝合线结扎。

在显微镜下，平端解剖腿后面的肌肉(临近半腱肌和收肌)。定位腘淋巴结。然后通过缝合线结扎腘淋巴结的2个近端和2个远端淋巴管和远端血液供给。再通过切割结缔组织除去腘淋巴结和任何相伴的脂肪组织。

小心处理来控制由于该操作引起的任何轻微的出血。淋巴系统闭合后，用液态皮肤(Vetbond，AJ Buck)封闭皮瓣。分开的皮肤边缘用下面的肌肉组织封闭，同时在腿周围留一个约0.5cm的缺口。如果必要，也可通过将皮肤缝合到下面的肌肉上来固定皮肤。

为避免感染，动物用网单独圈养(无垫草)。通过最佳水肿峰(典型地出现在第5-7天)每天检测恢复中的动物。然后观察平台水肿峰。为评估淋巴水肿的强度，在操作前和之后每天共7天，测定每个足上2个指定位置的周长和体积。测定血浆蛋白对淋巴水肿的影响，也研究蛋白分析是否是一个有用的测定方法(perimeter)。在2个位置测定对照和水肿肢的重量。分析以盲性模式进行。

周长测定：通过简短的气体麻醉来防止肢的移动，用布条来测定肢的周长。由2个不同的人在踝骨和背足处进行测定，平均2个读数。读数来自对照和水肿肢。

体积测定：手术当天，用戊巴比妥麻醉动物，并在手术前测定。为进行每日的体积测定，简短地用氟烷(快速制动和快速恢复)麻醉动物，将双腿都刮毛，用防水的标记在腿上做同样的标记。先将腿浸入水中，然后浸入仪器中至每个标记的高度，用Buxco水肿软件(Chen/Victor)进行测定。一个人记录数据，而另一个人将动物肢浸至标记区域。

血浆蛋白的测定：手术前抽取血样，随后在结束时，旋转分离血清，用于比较总蛋白和Ca²⁺。

肢重量比较：抽取血样后，为收集动物的组织做好准备。用quillitine切除动物肢，然后将实验和对照的腿在结扎线处切下，称重。在胫跟部关节脱节时，进行第二次称重，称足重。

组织学准备：解剖定位于膝盖(腘)区后面的横肌，置于金属模内，用冷冻胶填充，浸入冷甲基丁烷，放入-80℃标记的样品袋内，直至开始切片。切片后，用荧光显微镜观察肌肉的淋巴系统。

实施例23：本发明清蛋白融合蛋白对TNF-α诱导的黏着分子表达的抑 制

将淋巴细胞募集到炎症和血管发生区域包括淋巴细胞和血管内皮上细胞表面黏着分子(CAM)之间的特异性受体-配体相互作用。正常和病理状态下的黏着过程遵循一个多步骤的级联，该级联牵涉细胞间黏着分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏着分子-1(VCAM-1)和内皮白细胞黏着分子-1(E-选择蛋白)在内皮细胞(EC)上的表达。这些分子以及其他分子在血管内皮上的表达决定了在炎症反应的发生过程中，白细胞黏着到局部血管结构和外渗入局部组织的效率。细胞因子和生长因子的局部富集参与了对这些CAM表达的调控。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)(一种有效的促炎细胞因子)是内皮细胞上所有3种CAM的刺激物，可能参与许多炎症反应，通常会导致病理性的结果。

可检测本发明清蛋白融合蛋白介导对TNF-α诱导的CAM表达的抑制的潜力。当与FGF蛋白家族成员共刺激时，用EC作为固相吸收剂的改进的ELISA检测来测定TNF-α处理的EC上CAM的表达量。

为进行此实验，从合并带收集物中获得人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养物，保存在加有10％FCS和1％青霉素/链霉素的生长培养基中(EGM-2；Clonetics，San Diego，CA)，置于含5％CO₂的37℃湿润培养箱内。在EGM培养基中将HUVEC以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板内，于37℃培养18-24小时，或直至汇合。随后单层用加有100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的不含血清的RPMI-1640溶液漂洗3次，用给定的细胞因子和/或生长因子于37℃处理24小时。温育后，评定细胞中CAM的表达。

将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长在标准的96孔板内直至汇合。从细胞中弃掉生长培养基，替换成90μl的199培养基(10％FBS)。将测试样品和阳性或阴性对照加到板内，三重复(以10μl的体积)。将平板于37℃温育5小时(选择蛋白和整联蛋白表达)或24小时(只有整联蛋白表达)。将平板抽吸除去培养基，每孔加入100μl 0.1％的低聚甲醛-PBS(含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺)。将平板置于4℃30分钟。

除去孔内的固定剂，用PBS(+Ca和Mg)+0.5％BSA漂洗孔1次，排出。不要使孔干燥。加10μl稀释的一抗到测试和对照孔内。抗ICAM-1-生物素、抗VCAM-1-生物素和抗E-选择蛋白-生物素的使用浓度为10μg/ml(1∶10稀释0.1mg/ml的抗体母液)。细胞在湿润环境下，于37℃温育30分钟。孔用PBS(+Ca和Mg)+0.5％BSA漂洗3次。

然后加每孔20μl稀释的ExtrAvidin-碱性磷酸酶(1∶5,000稀释)，于37℃温育30分钟。孔用PBS(+Ca和Mg)+0.5％BSA漂洗3次。将1片对硝基苯酚磷酸pNPP溶解于5ml甘氨酸缓冲液中(pH 10.4)。每个测试孔加入溶于甘氨酸缓冲液的100μl的pNPP底物。准备三重复的标准孔，其使用甘氨酸缓冲液中的ExtrAvidin-碱性磷酸酶的工作稀释：1∶5,000(10⁰)＞10^-0.5＞10^-1＞10^-1.5。将5μl每种稀释液加到三重复孔内，这样得到的每孔的AP含量为5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng。然后每个标准孔内必须加入100μl的pNPP试剂。平板必须于37℃温育4小时。所有孔内加入50μl 3M的NaOH。结果在平板读数器405nm处进行定量分析。背景扣除选项用只填充甘氨酸缓冲液的空白孔。模板设定为指示每个标准孔内AP-偶联物的浓度(5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng)。结果显示为每个样品中结合的AP-偶联物的量。

实施例24：GAS报告构建体的构建

一个参与细胞分化和增殖的信号转导途径称为Jak-STAT途径。Jak-STAT途径中激活的蛋白与位于许多基因启动子上的γ激活位点“GAS”元件或干扰素敏感应答元件(“ISRE”)结合。蛋白与这些元件的结合改变相关基因的表达。

GAS和ISRE元件由一类称为信号转导物和转录激活物或“STAT”的转录因子所识别。STAT家族有6个成员。与Stat2一样，Stat1和Stat3存在于许多细胞类型(因为对IFN-α的响应是普遍的)。Stat4更受限制，它尽管存在于T辅助细胞I类，IL-12处理后的细胞中，但并不存在于许多细胞类型。Stat5最初称为乳腺生长因子，但它在包括髓细胞的许多其它细胞中浓度更高。它可在组织培养细胞中被许多细胞因子激活。

STAT的酪氨酸被一组称为Janus激酶(“Jak”)家族的激酶磷酸化后，被激活，从细胞质转运到细胞核。Jak代表独特的可溶性酪氨酸激酶家族，包括Tyk2、Jak1、Jak2和Jak3。这些激酶表现为明显的序列相似性，在静息细胞中通常不具有催化活性。

Jak被许多总结于下表的受体所激活(摘自综述Schidler和Darnell，Ann.Rev.Biochem.64：621-51，1995)。能激活Jak的细胞因子受体家族分为两组：(a)第1类包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、Epo、PRL、GH、G-CSF、GM-CSF、LIF、CNTF和血小板生成素的受体；和(b)第2类包括IFN-a、IFN-g和IL-10。第1类受体共有一段保守的半胱氨酸基序(一组4个保守的半胱氨酸和1个色氨酸)和WSXWS基序(近膜区，编码Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser(SEQ ID NO：53))。

因此，配体结合到受体上后，Jak被激活，进而激活STAT，然后STAT被转运并与GAS元件结合。整个这一过程都包括在Jak-STAT信号转导途径中。因此，通过结合GAS或ISRE元件而反映出来的Jak-STAT途径的激活可用于指示参与细胞增殖和分化的蛋白。例如，已知生长因子和细胞因子可激活Jak-STAT途径(见下表4)。因此，通过使用与报告分子连接的GAS元件，可鉴定Jak-STAT途径的激活剂。

表4

JAK                  STAT                        GAS(元件)或ISRE

配体           tyk2  Jak1  Jak2  Jak3

IFN家族

IFN-a/B        +     +     -     -      1，2，3  ISRE

IFN-g                +     +     -      1        GAS(IRF1＞Lys6＞IFP)

IL-10          +     ？    ？    -      1，3

gp130家族

IL-6(多效的)   +     +     +     ？     1，3     GAS(IRF1＞Ly6＞IFP)

IL-11(多效的)  ？    +     ？    ？     1，3

OnM(多效的)    ？    +     +     ？     1，3

LIF(多效的)    ？    +     +     ？     1，3

CNTF(多效的)   -/+   +     +     ？     1，3

G-CSF(多效的)  ？    +     ？    ？     1，3

IL-12(多效的)  +     -     +     +      1，3

g-C家族

IL-2(淋巴细胞) -     +     -     +      1，3，5  GAS

IL-4(淋巴/髓样)-     +     -     +      6        GAS(IRF1＝IFP＞＞Ly6)(IgH)

IL-7(淋巴细胞) -     +     -     +      5        GAS

IL-9(淋巴细胞) -     +     -     +      5        GAS

IL-13(淋巴细胞)-     +     ？    ？     6        GAS

IL-15          ？    +     ？    +      5        GAS

gp140家族

IL-3(髓样)     -     -     +     -      5        GAS(IRF1＞IFP＞＞Ly6)

IL-5(髓样)     -     -     +     -      5        GAS

GM-CSF(髓样)   -     -     +     -      5        GAS

生长激素家族

GH     ？    -    +    -    5

PRL    ？    +/-  +    -    1，3，5

EPO    ？    -    +    -    5       GAS(B-CAS＞IRF1＝IFP＞＞Ly6)

受体酪氨酸激酶

EGF    ？    +    +    -    1，3    GAS(IRF1)

PDGF   ？    +    +    -    1，3

CSF-1  ？    +    +    -    1，3    GAS(非IRF1)

为构建用于如实施例27-29所述生物试验的合成的含GAS的启动子元件，用基于PCR的策略来构建一段GAS-SV40启动子序列。5’引物含有4个串联拷贝的GAS结合位点，该位点存在于IRF1启动子中，先前证明经许多细胞因子诱导后，可与STAT结合(Rothman等，Immunity 1：457-468，1994)，当然也可以使用其它的GAS或ISRE元件。5’引物还包含一段与SV40早期启动子序列互补的18bp的序列，侧翼有一个Xho I位点。5’引物序列为：5’-GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG-3’(SEQ IDNO：54)。

下游引物与SV40启动子互补，侧翼有一个Hind III位点：5’-GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC-3’(SEQ ID NO：55)。

使用获自Clontech的β-gal：启动子质粒中存在的SV40启动子模板进行PCR扩增。得到的PCR片段用Xho I/Hind III消化，亚克隆到BLSK2-(Stratagene)。使用正向和反向引物测序来验证插入物含有如下序列：5，：CTCGAGATTFCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTFATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT：3’(SEQ ID NO：56)

用这个与SV40启动子相连的GAS启动子元件，就可以人工构建GAS:SEAP2的报告载体。这里的报告分子是分泌的碱性磷酸酶或“SEAP”。然而，明显地，在本实施例或任何其它实施例中，任何报告分子都可替换SEAP。可用于替换SEAP的熟知报告分子包括氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)或任何可用抗体检测的蛋白。

上述序列证明，合成的GAS-SV40启动子元件用Hind III和Xho I亚克隆到获自Clontech的pSEAP-启动子载体上，有效地用扩增的GAS:SV40启动子元件替换了SV40启动子，得到GAS-SEAP载体。然而，这个载体不含有新霉素抗性基因，因此，不适合哺乳动物表达系统。

因此，为了产生表达GAS-SEAP报告分子的哺乳动物稳定的细胞系，用Sal I和Not I从GAS-SEAP载体上切下GAS-SEAP盒，用多克隆位点内的限制性位点插入含新霉素抗性基因的骨架载体，如pGFP-1(Clontech)，得到GAS-SEAP/Neo载体。该载体转染到哺乳动物细胞后，即可用作如实施例27-29中所述的GAS结合的报告分子。

使用上述方法并用不同的启动子序列来替换GAS，可以得到其它载体。例如，含有EGR和NF-κB启动子序列的报告分子的构建描述于实施例27-31。然而，使用这些实施例中所述方案可以替换许多其它的启动子。例如，可以单独或组合替换SRE、IL-2、NFAT或骨钙蛋白启动子(如：GAS/NF-κB/EGR、GAS/NF-κB、IL-2/NFAT或NF-κB/GAS)。相似地，其它细胞系也可用来测定报告构建体的活性，如HELA(上皮)、HUVEC(内皮)、Reh(B-细胞)、Saos-2(成骨细胞)、HUVAC(主动脉)或心肌细胞。

实施例25：SEAP活性试验

作为本文公开实施例中所述的试验的报告分子，SEAP的活性可根据如下一般方案使用Tropix Phospho-light试剂盒(目录号BP-400)测定。TropixPhospho-light试剂盒提供了下面用到的稀释、试验和反应缓冲液。

将2.5倍的稀释缓冲液注入分配器，向含有35μl含本发明清蛋白融合蛋白溶液的Optiplate分配15μl 2.5倍的稀释缓冲液。用塑料封闭器封闭平板，65℃温育30分钟。分开各Optiplate以避免加热不均。

将样品冷却至室温15分钟。倒空分配器，注入试验缓冲液。加50ml试验缓冲液，室温温育5分钟。倒空分配器，注入反应缓冲液(见下表)。加50μl反应缓冲液，室温温育20分钟。由于化学发光信号的强度是依赖于时间的，要用约10分钟读取发光计上的5个平板，所以应一次处理5个平板，10分钟后开始第二组。

读取发光计上的相对光单位。设定H12为空白，打印结果。化学发光的增加指示报告分子的活性。

表5

平板号	反应缓冲液稀释液(ml)	CSPD(ml)	平板号	反应缓冲液稀释液(ml)	CSPD(ml)
						10	60	3	31	165	8.25
11	65	3.25	32	170	8.5
						12	70	3.5	33	175	8.75
13	75	3.75	34	180	9
						14	80	4	35	185	9.25
15	85	4.25	36	190	9.5
						16	90	4.5	37	195	9.75
17	95	4.75	38	200	10
						18	100	5	39	205	10.25
19	105	5.25	40	210	10.5
						20	110	5.5	41	215	10.75
21	115	5.75	42	220	11
						22	120	6	43	225	11.25
23	125	6.25	44	230	11.5
						24	130	6.5	45	235	11.75
25	135	6.75	46	240	12
						26	140	7	47	245	12.25
27	145	7.25	48	250	12.5
						28	150	7.5	49	255	12.75
29	155	7.75	50	260	13
						30	160	8

实施例26：神经元活性鉴定试验

当细胞进行分化和增殖时，一组基因可通过许多不同的信号转导途径被激活。其中的一个基因EGR1(早期生长响应基因1)经激活可在各种组织和细胞类型中被诱导。EGR1的启动子负责这种诱导。使用与报告分子连接的EGR1启动子，可评估本发明融合蛋白激活细胞的能力。

特别地，下述方案可用于评估PC12细胞系中的神经元活性。已知PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞)在被许多促细胞分裂原(诸如TPA(十四烷酰佛波醇乙酸酯)、NGF(神经生长因子)和EGF(表皮生长因子))激活后可以增殖和/或分化。这种处理激活EGR1基因的表达。因此，用含有与SEAP报告分子连接的EGR1启动子的构建体稳定转染的PC12细胞，即可评估本发明清蛋白融合蛋白对PC12细胞的激活作用。

EGR/SEAP报告构建体可通过下述方案组装。EGR-1启动子序列(-633到+1)(Sakamoto K等，Oncogene 6：867-871，1991)可使用下述引物从人类基因组DNA中经PCR扩增得到：

第一条引物：5’GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3’(SEQ ID NO：57)

第二条引物：5’GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3’(SEQ ID NO：58)

使用实施例24中产生的GAS:SEAP/Neo载体，可将EGR1扩增产物插入该载体。用限制酶Xho I/Hind III线性化GAS:SEAP/Neo载体，切掉GAS/SV40填充物。用同样的这些酶限制性酶切EGR1扩增产物。然后连接载体和EGR1启动子。

为制备用于细胞培养的96孔板，每个10cm平板加入2毫升包被液(1∶30稀释溶于30％乙醇的I型胶原(Upstate Biotech Inc.目录号08-115)(过滤器灭菌))，或96孔板每孔50ml，空气干燥2小时。

PC12细胞常规地生长于含RPMI-1640培养基(Bio Whittaker)的预先包被的10cm组织培养盘上，该培养基含10％的马血清(JRH BIOSCIENCES，目录号12449-78P)和5％的热失活胎牛血清(FBS)，同时加有100个单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。每3-4天完成1-4次分拆。从平板上刮去而除去细胞，通过上下吸取超过15次重悬细胞。

使用本领域已知技术将EGR/SEAP/Neo构建体转染到PC12细胞中。通过使细胞生长于300μg/ml的G418中，得到EGR/SEAP/PC12稳定的细胞。不含G418的培养基用于常规生长，但每1-2个月，细胞应重新生长于300μg/ml的G418中传代几次。

为进行神经元活性试验，通过移去旧的培养基来筛选含约70％到80％汇合细胞的10cm平板。用PBS(磷酸盐缓冲盐水)漂洗细胞一次。然后在低血清培养基(含1％马血清、0.5％FBS和抗生素的RPMI-1640)上使细胞处于饥饿状态过夜。

次日早上，移去培养基，用PBS漂洗细胞。从平板上刮去细胞，用2毫升低血清培养基悬浮细胞。计数细胞数目，加更多低血清培养基以使最终的细胞密度达到5×10⁵个细胞/毫升。

加200μl细胞悬浮液到96孔板的每个孔内(等同于1×10⁵个细胞/孔)。加入一系列不同浓度的本发明清蛋白融合蛋白，37℃温育48到72小时。可用已知可通过EGR激活PC12细胞的生长因子作为阳性对照，诸如50ng/μl的神经元生长因子(NGF)。阳性对照孔内通常观察到超过50倍的SEAP诱导。SEAP试验可常规地使用本领域已知技术和/或如实施例25所述技术来进行。

实施例27：T细胞活性试验

下述方案用于评估T细胞活性，通过鉴定因子并确定本发明清蛋白融合蛋白是否可以增殖和/或分化T细胞。可使用实施例24中产生的GAS/SEAP/Neo构建体来评估T细胞活性。因此，提高SEAP活性的因子表明了其激活Jak-STAT信号转导途径的能力。本试验所使用的T细胞是JurkatT细胞(ATCC检索号TIB-152)，尽管也可以使用Molt-3细胞(ATCC检索号CRL-1552)和Molt-4细胞(ATCC检索号CRL-1582)。

Jurkat T细胞是淋巴母细胞CD4+Th1辅助细胞。为了产生稳定的细胞系，使用DMRIE-C(Life Technologies)，大概2百万Jurkat细胞以GAS-SEAP/Neo载体转染(转染方案如下所述)。转染细胞以大约每孔20,000个细胞的密度接种，选择对1mg/ml庆大霉素有抗性的转染子。将抗性菌落扩增，测定其对增加浓度干扰素γ的响应。展示了一个选定克隆的剂量响应。

特别地，下述方案将产生足够的细胞，用于75孔每孔200μl细胞。因此，或者将规模扩大，或者进行多次重复来产生足够用于多个96孔板的细胞。Jurkat细胞维持于含1％青霉素-链霉素的RPMI+10％血清中。在T25瓶内，混合2.5毫升OPTI-MEM(Life Technologies)和10μg的质粒DNA。加入含50μl DMRIE-C的2.5毫升OPTI-MEM，室温温育15-45分钟。

温育期间，计数细胞浓度，离心得到所需数目的细胞(每次转染10⁷个细胞)，用OPTI-MEM重悬到终浓度10⁷个细胞/毫升。然后加1毫升OPTI-MEM中的1×10⁷个细胞到T25瓶中，37℃温育6小时。温育后，加10毫升RPMI+15％血清。

Jurkat：GAS-SEAP稳定的报告细胞系维持在含1mg/ml庆大霉素和1％青霉素-链霉素的RPMI+10％血清中。这些细胞用不同浓度的一种或几种本发明融合蛋白进行处理。

融合蛋白处理当天，细胞应用新鲜的RPMI+10％血清漂洗和重悬到每毫升500,000个细胞的密度。所需细胞的精确数目将依赖于融合蛋白的数目和筛选的不同浓度融合蛋白的数目。对1个96孔板来说，大约需要1千万个细胞(10个板，1亿个细胞)。

含用融合蛋白处理的Jurkat细胞的孔盘置于温育箱内48小时(注意：此时间是可变的，48-72小时之间)。然后用12通道移液器将每孔35μl样品转移到一个不透明的96孔板。不透明的平板应被盖上(用sellophene覆盖物)，储存于-20℃，直至进行如实施例25所述的SEAP试验。含剩余处理细胞的平板置于4℃，用作需要时特定孔重复试验的材料来源。

可用已知可激活Jurkat T细胞的100个单位/毫升的干扰素γ作为阳性对照。阳性对照孔内一般观察到超过30倍的诱导。

对本领域技术人员明显的是，上述方案可用于构建瞬时和稳定的转染细胞。

实施例28：T细胞活性试验

NF-κB(核因子κB)是由暴露于LPS或凝血酶、由某些病毒基因产物的表达、和由许多刺激物激活的转录因子，这些刺激物包括炎性细胞因子IL-1和TNF、CD30和CD40、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β。作为转录因子，NF-κB调节许多基因的表达，这些基因参与免疫细胞激活、控制凋亡(NF-κB可保护细胞免于凋亡)、B和T细胞发育、抗病毒和抗微生物应答和多种应激反应。

非刺激条件下，NF-κB与I-κB(抑制剂κB)保留于细胞质中。然而，刺激后，I-κB被磷酸化和降解，导致NF-κB穿梭到细胞核内，因此激活了靶基因的转录。NF-κB激活的靶基因包括IL-2、IL-6、GM-CSF、ICAM-1和1类MHC。

由于NF-κB的中心作用和响应于多种刺激的能力，我们使用用NF-κB启动子元件构建的报告构建体来筛选融合蛋白。NF-κB的激活剂或抑制剂可用来治疗、预防和/或诊断疾病。例如，NF-κB的抑制剂可用于治疗与急性或慢性NF-κB激活相关的疾病，如类风湿性关节炎。

为了构建含NF-κB启动子元件的载体，我们使用基于PCR的策略。上游引物含有4个串联拷贝的NF-κB结合位点(GGGGACTTTCCC)(SEQ IDNO：59)、与SV40早期启动子序列5’末端互补的一段18bp的序列，侧翼有Xho I位点：

5’：GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG：3’(SEQ ID NO：60)

下游引物与SV40启动子3’末端互补，侧翼具有一个Hind III位点：

5’：GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC：3’(SEQ ID NO：55)

用存在于从Clontech获得的pB-gal：启动子质粒的SV40启动子模板进行PCR扩增。得到的PCR片段用Xho I和Hind III消化，然后亚克隆到BLSK2-(Stratagene)上。用T7和T3引物的测序证实，插入物含下述序列：5’：CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT：3’(SEQ ID NO：61)

接下来，使用Xho I和Hind III，用该NF-κB/SV40片段替换存在于pSEAP2-启动子质粒(Clontech)的SV40最小启动子元件。然而，该载体不含新霉素抗性基因，因此，不适合哺乳动物表达系统。

为了产生稳定的哺乳动物细胞系，用限制酶Sal I和Not I从上述NF-κB/SEAP载体上切掉NF-κB/SV40/SEAP盒，将其插入含新霉素抗性的载体。特别地，用Sal I和Not I限制性酶切pGFP-1后，将NF-κB/SV40/SEAP盒插入pGFP-1(Clontech)，替换GFP基因。

产生了NF-κB/SV40/SEAP/Neo载体后，就可根据实施例25中所述的方案产生和维持稳定的Jurkat T细胞。相似地，用于检测融合蛋白与这些稳定Jurkat T细胞的方法也如实施例25所述。作为阳性对照，将外源TNFα(0.1、1、10ng)加入孔H9、H10和H11，一般观察到5-10倍的激活。

实施例29：鉴定髓样活性试验

用下述方案通过确定融合蛋白是否增殖和/或分化髓样细胞，来评估本发明清蛋白融合蛋白的髓样活性。使用实施例24中产生的GAS/SEAP/Neo构建体来评估髓样细胞活性。因此，提高SEAP活性的因子表明了其激活Jak-STAT信号转导途径的能力。本试验中使用的髓样细胞是U937(一种前单核细胞系)，尽管也可使用TF-1、HL60或KG1。

为了以实施例24中产生的GAS/SEAP/Neo构建体瞬时转染U937细胞，使用DEAE-右旋糖苷法(Kharbanda等，1994，Cell Growth & Differentiation，5：259-265)。首先，收集2×10⁷个U937细胞，并用PBS漂洗。U937细胞通常生长于含10％热失活胎牛血清(FBS)、并加有100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中。

然后，用1ml 20mM的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液悬浮细胞，该缓冲液中含0.5mg/ml的DEAE-右旋糖苷、8μg GAS-SEAP2质粒DNA、140mMNaCl、5mM KCl、375μM Na₂HPO₄·7H₂O、1mM MgCl₂和675μM CaCl₂。于37℃温育45分钟。

用含10％FBS的RPMI-1640培养基漂洗细胞，然后将细胞重悬于10毫升完全培养基，37℃温育36小时。

通过使细胞生长于400μg/ml的G418中，可得到GAS-SEAP/U937稳定的细胞。不含G418的培养基用于常规生长，但每1-2个月，细胞应重新生长于400μg/ml的G418中传代几次。

收集1×10⁸个细胞(这些细胞足够用于10个96孔板的试验)用于测定，用PBS漂洗。将细胞悬浮于200毫升上述生长培养基，使终密度为5×10⁵个细胞/毫升。96孔板每孔加200μl细胞(或1×10⁵个细胞/孔)。

加入不同浓度的融合蛋白。37℃温育48到72小时。可用已知激活U937细胞的100个单位/毫升的干扰素γ作为阳性对照。阳性对照孔中一般可观察到超过30倍的诱导。根据本领域已知方法和/或实施例25中所述的方案进行上清液的SEAP试验。

实施例30：鉴定小分子浓度和膜通透性改变的试验

已知配体与受体结合可改变胞内小分子(如钙、钾、钠)的水平和pH以及膜电势。这些改变可通过鉴定与特定细胞受体结合的融合蛋白的试验来测定。尽管下述方案描述了用于钙的试验，可容易地改变该方案用于检测钾、钠、pH、膜电势或任何其它可通过荧光探针检测的小分子的改变。

下述试验使用荧光成像读板仪(“FLIPR”)来测定与小分子结合的荧光分子(Molecular Probes)的改变。明显地，除了钙荧光分子fluo-4(MolecularProbes，Inc.；目录号F-14202)外，可使用任何可检测小分子的荧光分子。

对黏着细胞而言，将细胞以10,000-20,000个细胞/孔接种到具有透明底部的Co-star黑色96孔板上。平板在CO₂温育箱内温育20小时。在Biotek洗板仪中用200μl HBSS(Hank氏平衡盐溶液)漂洗黏着细胞2次，最后一次漂洗后保留100μl缓冲液。

用10％pluronic酸DMSO制备1mg/ml的fluo-4母液。为使细胞载有fluo-4，每孔加50μl 12μg/ml的fluo-4。将平板于37℃在CO₂温育箱内温育60分钟。在Biotek洗板仪中用HBSS漂洗平板4次，保留100μl缓冲液。

对非黏着细胞而言，将细胞从培养基中离心下来。在50毫升锥形管内用HBSS重悬细胞至2-5×10⁶个细胞/毫升。每毫升细胞悬浮物加入4μl溶于10％pluronic酸DMSO的1mg/ml的fluo-4溶液。然后将管置于37℃水浴30-60分钟。细胞用HBSS漂洗2次，重悬到1×10⁶个细胞/毫升，以100μl/孔分装到微板。将板以1000rpm离心5分钟。然后用200μl Denley细胞洗液漂洗板1次，随后经一步抽吸至终体积100μl。

对基于非细胞的试验，每孔含一种荧光分子，如fluo-4。将本发明融合蛋白加到孔中，检测荧光的改变。

为测定胞内钙的荧光，FLIPR设定为下述参数：(1)系统增益为300-800mW；(2)曝光时间为0.4秒；(3)相机F/终止为F/2；(4)激发为488nm；(5)发射为530nm；和(6)样品加入为50μl。530nm增强的发射表明由本发明清蛋白融合蛋白或由本发明清蛋白融合蛋白诱导的分子所引起的胞外信号传导事件，这导致了胞内Ca⁺⁺浓度的增加。

实施例31：鉴定酪氨酸激酶活性的试验

蛋白酪氨酸激酶(PTK)代表一组多样的跨膜和胞质激酶。受体蛋白酪氨酸激酶(RPTK)组里有许多促有丝分裂和代谢生长因子的受体，包括PDGF、FGF、EGF、NGF、HGF和胰岛素受体亚家族。此外，还有一个对应配体未知的大的RPTK家族。RPTK的配体主要包括分泌性小蛋白，也包括膜结合和胞外基质蛋白。

配体激活RPTK的过程包括配体介导的受体二聚化，引起受体亚基的转磷酸作用和胞质酪氨酸激酶的激活。胞质酪氨酸激酶包括src家族的受体相关酪氨酸激酶(如src、yes、lck、lyn、fyn)和非受体偶联和细胞溶质蛋白酪氨酸激酶，如Jak家族，Jak家族成员介导由细胞因子受体超家族(如白介素、干扰素、GM-CSF和瘦蛋白(Leptin))触发的信号转导。

由于许多已知因子能刺激酪氨酸激酶的活性，鉴定本发明清蛋白融合蛋白或本发明融合蛋白诱导的分子是否能激活酪氨酸激酶信号转导途径是感兴趣的。因此，设计下述方案用于鉴定能激活酪氨酸激酶信号转导途径的此类分子。

以约每孔25,000个细胞的密度将靶细胞(如原代角质形成细胞)接种于购买自Nalge Nunc(Naperville，IL)的96孔Loprodyne Silent筛选板。平板用100％乙醇漂洗2次，每次30分钟而灭菌，然后用水漂洗，干燥过夜。一些平板用100毫升细胞培养级的I型胶原(50mg/ml)、明胶(2％)或聚赖氨酸(50mg/ml)(上述试剂均购自Sigma Chemicals(St.Louis，MO))或10％的Matrigel(购自Becton Dickinson，Bedford，MA)或小牛血清包被2小时，用PBS漂洗，储存于4℃。通过以每孔5,000个细胞将这些平板上生长的细胞接种到生长培养基上，48小时后，使用如供应商Alamar Biosciences，Inc.(Sacramento，CA)所述的alamarBlue对细胞数目进行间接的定量分析。用购自Becton Dickinson(Bedford，MA)的Falcon平板覆盖物(目录号3071)覆盖Loprodyne Silent筛选板。有些增殖实验中也可使用Falcon微量检测III型细胞培养板。

为制备提取物，将A431细胞接种到Loprodyne平板的尼龙膜上(20,000个细胞/200毫升/孔)，在完全培养基中培养过夜。将细胞在不含血清的基础培养基上温育24小时使细胞休眠。以EGF(60ng/ml)或不同浓度本发明清蛋白融合蛋白处理5-20分钟后，弃掉培养基，每孔加入100毫升提取缓冲液(20mM HEPES pH7.5、0.15M NaCl、1％Triton X-100、0.1％SDS、2mMNa₃VO₄、2mM Na₄P₂O₇和购自Boeheringer Mannheim(Indianapolis，IN)的蛋白酶抑制剂混合物(目录号1836170))，平板置于转动摇床上4℃摇动5分钟。然后将平板置于真空转移管内，用家用真空器使提取物通过0.45mm的膜过滤到每个孔的底部。收集真空管底部96孔接受器/试验板内的提取物，迅速置于冰上。为获得离心澄清的提取物，去污剂溶解5分钟后，取出每孔的内含物，4℃16,000×g离心15分钟。

测定过滤后提取物的酪氨酸激酶活性水平。尽管已知许多检测酪氨酸激酶活性的方法，本文描述一种方法。

一般地，本发明清蛋白融合蛋白的酪氨酸激酶活性是通过确定其磷酸化特定底物(生物素化的肽)上酪氨酸残基的能力来评价的。可用作此目的的生物素化的肽包括PSK1(对应于细胞分裂激酶cdc2-p34的氨基酸6-20)和PSK2(对应于胃泌素的氨基酸1-17)。这两种肽都是许多酪氨酸激酶的底物，可从Boeheringer Mannheim买到。

酪氨酸激酶反应通过顺序加入下述组分来建立。首先，加10μl 5μM生物素化的肽，然后加10μl ATP/Mg²⁺(5mM ATP/50mM MgCl₂)，然后加10μl 5×试验缓冲液(40mM盐酸咪唑，pH 7.3、40mM β-磷酸甘油、1mM EGTA、100mM MgCl₂、5mM MnCl₂、0.5mg/ml BSA)，然后加5μl钒酸钠(1mM)，再加5μl水。轻柔地混合各组分，将反应混合物于30℃预温育2分钟。加入10μl对照酶或过滤后的上清液起始反应。

加入10μl 120mM EDTA终止酪氨酸激酶试验反应，然后将反应置于冰上。

酪氨酸激酶活性的测定：将反应混合物的50μl等份试样转移到微量滴定板(MTP)模块上，37℃温育20分钟。这使得链霉亲合素包被的96孔板与生物素化的肽结合。用300μl/孔的PBS漂洗MTP模块4次。然后每孔加入75μl与辣根过氧化物酶偶联的抗磷酸酪氨酸抗体(抗P-Tyr-POD(0.5个单位/毫升))，37℃温育1小时。按上述方法漂洗孔。

然后加100μl过氧化物酶底物溶液(Boeheringer Mannheim)，室温温育至少5分钟(最多30分钟)。用ELISA读板仪测定405nm处样品的吸光度。结合的过氧化物酶的活性水平用ELISA读板仪定量，该水平反映了酪氨酸激酶的活性水平。

实施例32：鉴定磷酸化活性试验

作为如实施例31所述的蛋白酪氨酸激酶活性试验的潜在替代和/或补充，也可用检测主要胞内信号转导中间体激活(磷酸化)的试验。例如，如下所述的一个特定的试验可检测Erk-1和Erk-2激酶的酪氨酸磷酸化。然而，其它分子，如Raf、JNK、p38MAP、Map激酶的激酶(MEK)、MEK激酶、Src、肌肉特异性激酶(MuSK)、IRAK、Tec和Janus以及任何其它的磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸或磷酸苏氨酸分子的磷酸化，也可通过用这些分子代替下述试验中的Erk-1或Erk-2来检测。

具体地，通过用0.1毫升蛋白G(1ug/ml)室温2小时包被96孔ELISA板的孔来制备试验平板。然后用PBS漂洗平板，用3％的BSA/PBS室温封闭1小时。然后用2种商业化的针对Erk-1和Erk-2的单克隆抗体(100ng/孔)(Santa Cruz Biotechnology)处理蛋白G平板(室温1小时)。(为检测其它分子，这一步骤可通过替换成可检测任何上述分子的单克隆抗体而容易地进行改变。)用PBS漂洗3-5次后，将平板储存于4℃待用。

A431细胞以20,000个细胞/孔接种到96孔Loprodyne过滤板上，于生长培养基上过夜培养。然后将细胞置于基础培养基(DMEM)使其饥饿48小时，再用EGF(6ng/孔)或不同浓度的本发明融合蛋白处理5-20分钟。然后溶解细胞，将提取液直接过滤到试验平板内。

与提取物一起室温温育1小时后，再次漂洗孔。作为阳性对照，用商业化的MAP激酶制剂(10ng/孔)替代A431提取物。然后平板用特异性识别Erk-1和Erk-2激酶磷酸化表位的商业化多克隆(兔)抗体(1μg/ml)处理平板(室温1小时)。该抗体已经用标准方案生物素化。然后通过连续与铕-链霉亲合素和铕荧光增强剂于Wallac DELFIA仪器内温育来定量结合的多克隆抗体(时间分辨荧光)。高于背景的增强的荧光信号表明本发明融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白诱导的分子引起的磷酸化。

实施例33：磷酸化试验

为检测本发明清蛋白融合蛋白的磷酸化活性，使用如美国专利第5,958,405号所述的磷酸化试验(通过引用收入本文)。简单地说，可使用γ-标记³²P-ATP磷酸化蛋白底物的，然后用γ放射性同位素计数器定量分析掺入的放射性来测定磷酸化活性。将本发明融合蛋白与蛋白底物、³²P-ATP和激酶缓冲液共同温育。然后通过电泳将游离的³²P-ATP与掺入底物的³²P分开，计数掺入的³²P，并与阴性对照比较。高于阴性对照的放射性计数表明了融合蛋白的磷酸化活性。

实施例34：在多肽配体存在时检测本发明清蛋白融合蛋白的磷酸化活 性(激活)

本领域已知方法或本文所述方法可用于确定本发明清蛋白融合蛋白的磷酸化活性。在一个实施方式中，确定磷酸化活性的方法是通过使用如美国专利第5,817,471号所述的酪氨酸磷酸化试验(通过引用收入本文)。

实施例35：刺激骨髓CD34+细胞增殖试验

本试验是基于在造血生长因子存在时人类CD34+的增殖能力，来评价本发明融合蛋白刺激CD34+细胞增殖的能力。

先前的研究表明，多数成熟前体只响应单一的信号。更多不成熟的前体的响应需要至少2种信号。因此，为测定本发明融合蛋白对许多祖细胞造血活性的影响，在造血生长因子存在或不存在时，本试验包括一种给定的本发明融合蛋白。在干细胞因子(SCF)存在时，将分离的细胞与测试样品共同培养5天。单独的SCF对骨髓(BM)细胞增殖的影响非常有限，在这种条件下只作为“存活”因子起作用。然而，一旦与对这些细胞表现为刺激效应的任何因子(如IL-3)相组合，SCF将引起协同效应。因此，如果测试的融合蛋白对造血祖细胞具有刺激影响，这种活性可容易地检测到。由于正常BM细胞含有低水平的循环细胞，因此，可能不能检测到给定融合蛋白的任何抑制效应。相应地，对祖细胞抑制效应的试验可在先经体外SCF+IL+3刺激然后与被评价的化合物接触的细胞中进行来检测对这种诱导的增殖的抑制。

简单地说，用本领域已知方法分离CD34+细胞。融化细胞后，重悬于培养基中(QBSF 60不含血清的培养基，含1％的L-谷氨酰胺(500毫升)QualityBiological，Inc.，Gaithersburg，MD，目录号160-204-101)。经几次200×g的轻柔离心步骤后，使细胞休息1小时。将细胞计数调整为2.5×10⁵个细胞/毫升。期间，加入100μl无菌水到96孔板周围的孔内。本试验中可与本发明清蛋白融合蛋白一起测定的细胞因子是单独50ng/ml的rhSCF(R&D Systems，Minneapolis，MN，目录号255-SC)和30ng/ml的rhSCF和rhIL-3(R&DSystems，Minneapolis，MN，目录号203-ML)的组合。1小时后，将10μl制备好的细胞因子、不同浓度的本发明清蛋白融合蛋白和20μl稀释的细胞加到已存在于孔内的培养基中，使最终的总体积达到100μl。然后将平板置于37℃/5％CO₂的温育箱5天。

试验前18小时收集细胞，在10μl体积中，每孔加0.5μCi/孔的[3H]胸苷来确定增殖速率。用Tomtec Harvester 96从每个96孔板收集细胞到过滤包(filtermat)来终止实验。收集后，将过滤包干燥、修剪(trim)，并置于由一个OmniFilter平板和一个OmniFilter盘组成的OmniFilter组装体内。每孔加入60μl的Microscint，用TopSeal-A按压封口膜封闭平板。将条形码15标贴贴在第一块平板上用于计数。然后将封闭的平板装载，通过Packard Top计数器来确定放射性水平并打印为分析收集的数据。放射性水平反映了细胞的增殖量。

本实施例所述的研究测定了给定融合蛋白刺激骨髓CD34+细胞增殖的活性。本领域技术人员可容易地改变所示例的研究来测定本发明融合蛋白和多核苷酸(如基因治疗)及其激动剂和拮抗剂的活性。本发明清蛋白融合蛋白刺激骨髓CD34+细胞增殖的能力表明清蛋白融合蛋白和/或对应于融合蛋白的多核苷酸可用于影响免疫系统和血细胞发生的病症的诊断和治疗。典型的应用如上述“免疫活性”和“感染性疾病”部分和本文其它地方所述。

实施例36：胞外基质增强细胞响应(EMECR)试验

胞外基质增强细胞响应(EMECR)试验的目的是评价在胞外基质(ECM)诱导的信号的背景中，本发明融合蛋白作用于造血干细胞的能力。

细胞在自周边微环境接收的信号的背景中，对调节因子做出响应。例如，成纤维细胞和内皮和上皮干细胞在缺乏来自ECM的信号时不能复制。造血干细胞在骨髓中可进行自我更新，但在体外悬浮培养物中不能。干细胞在体外进行自我更新的能力依赖于它们与基质细胞和ECM蛋白纤连蛋白(fn)的相互作用。细胞对fn的黏着是受α₅.β₁和α₄.β₁整联蛋白受体介导的，这些受体是由人类和小鼠造血干细胞表达的。与ECM环境整合并负责刺激干细胞自我更新的因子还没有鉴定到。这种因子的发现在基因治疗和骨髓移植的应用上应该很有用。

简单地说，聚苯乙烯、非组织培养物处理的96孔板以0.2μg/cm²的包被浓度用fn片段包被。小鼠骨髓细胞铺在0.2毫升不含血清的培养基上(1,000个细胞/孔)。在IL-3(5ng/ml)+SCF(50ng/ml)存在的条件下培养的细胞作为阳性对照，这种条件下，预计干细胞很少自我更新但有明显的分化。在存在和缺乏SCF(5.0ng/ml)时，用合适的阴性对照测定本发明的清蛋白融合蛋白，此处含本发明的清蛋白融合蛋白的组合物的给药体积代表了总试验体积的10％。将平板上的细胞温育在低氧环境(5％CO₂、7％O₂和88％N₂)的组织培养温育箱内7天使其生长。孔内增殖细胞的数目则通过测定掺入细胞DNA的胸苷来定量。对本试验阳性命中的验证需要细胞的表型表征，这可通过扩大培养系统的规模和使用合适的针对细胞表面抗原的抗体试剂和FACScan来实现。

如果发现一种特定的本发明融合蛋白是造血祖细胞的刺激物，那么融合蛋白和对应于融合蛋白的多核苷酸可用于诸如影响免疫系统和血细胞发生的病症的诊断和治疗。典型的应用如上述“免疫活性”和“感染性疾病”部分和本文其它地方所述。融合蛋白也可用于干细胞和各种血谱系定型祖细胞的增殖以及各种细胞类型的分化和/或增殖。

此外，本发明的清蛋白融合蛋白和编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于抑制造血细胞的增殖和分化，因此可用于保护骨髓干细胞免受化学疗法过程中化疗剂的伤害。这种抗增殖效应可使更高剂量的化疗剂给药成为可能，因此可更有效地进行化学疗法的治疗。

此外，由于基质细胞在造血谱系细胞的产生中发挥重要作用，本发明融合蛋白和编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于造血相关病症(如贫血、各类血细胞减少症、白细胞减少、血小板减少或白血病)的治疗和诊断。其应用包括骨髓细胞先体外后体内培养、骨髓移植、骨髓重建、瘤形成的放射治疗或化学疗法。

实施例37：人类真皮成纤维细胞和主动脉平滑肌细胞的增殖

将本发明的清蛋白融合蛋白加到正常人类真皮成纤维细胞(NHDF)和人类主动脉平滑肌细胞(AoSMC)培养物中，每个样品同时进行2个试验。第一个试验检测融合蛋白对正常人类真皮成纤维细胞(NHDF)或主动脉平滑肌细胞(AoSMC)的增殖的影响。成纤维细胞或平滑肌细胞的异常生长是几种病理过程(包括纤维化和再狭窄)的一部分。第二个试验检测NHDF和SMC引起的IL6的产生。IL6的产生表示功能激活。激活的细胞的许多细胞因子和其它因子的产生增加，可引起促炎或免疫调节的结果。为检测共刺激或抑制活性，试验在有和没有TNFα共刺激的条件下进行。

简单地说，第1天，在100μl培养基中，以1000个细胞/孔(NHDF)或2000个细胞/孔(AoSMC)设立96孔黑色板。NHDF培养基含有：Clonetics的FB基础培养基、1mg/ml hFGF、5mg/ml胰岛素、50mg/ml庆大霉素、2％FBS；而AoSMC培养基含有：Clonetics的SM基础培养基、0.5μg/mlhEGF、5mg/ml胰岛素、1μg/ml hFGF、50mg/ml庆大霉素、50μg/ml两性霉素B、5％FBS。37℃温育至少4-5小时后，将培养基抽吸，替换成生长停滞培养基。NHDF的生长停滞培养基含有：成纤维细胞基础培养基、50mg/ml庆大霉素、2％FBS；而AoSMC的生长停滞培养基含有SM基础培养基、50mg/ml庆大霉素、50μg/ml两性霉素B、0.4％FBS。37℃温育到第2天。

第2天，设计本发明清蛋白融合蛋白的系列稀释物和模板，使其总是包括培养基对照和已知蛋白对照。对刺激和抑制两种实验，用生长停滞培养基稀释蛋白。对抑制实验，将TNFα加至终浓度为2ng/ml(NHDF)或5ng/ml(AoSMC)。加入1/3体积的含对照或本发明清蛋白融合蛋白的培养基，37℃/5％CO₂温育到第5天。

从每孔转移60μl到另一个标记的96孔板中，用平板封口物覆盖，储存于4℃直至第6天(用于IL6的ELISA)。在细胞培养板中剩余的100μl中无菌地加入等于培养物体积10％量(10μl)的Alamar Blue。将平板放回温育箱3-4小时。然后用CytoFluor在530nm激发和590nm发射下测定荧光。这得到生长刺激/抑制数据。

第5天，用50-100μl/孔抗人类IL6单克隆抗体(用pH 7.4的PBS稀释)包被96孔板进行IL6的ELISA，室温温育过夜。

第6天，在水槽内将平板倒空，印迹到纸巾上。制备含PBS和4％BSA的试验缓冲液。用200μl/孔溶于PBS的Pierce Super Block封闭缓冲液封闭平板1-2小时，然后用漂洗缓冲液(PBS、0.05％吐温-20)漂洗平板。将平板印迹到纸巾上，然后加入50μl/孔稀释的抗人类IL-6的单克隆生物素标记的抗体至0.50mg/ml。在培养基中制备IL-6母液的稀释液(30、10、3、1、0.3、0ng/ml)。在平板的第一排加入两重复的样品。覆盖平板，室温摇床上温育2小时。

用漂洗缓冲液漂洗平板，印迹到纸巾上。用试验缓冲液以1∶1000稀释EU标记的链霉亲合素，加入100μl/孔。覆盖平板，室温温育1小时。再用漂洗缓冲液漂洗平板，印迹到纸巾上。

加100μl/孔的增强溶液。摇动5分钟。将平板置于Wallac DELFIA荧光计上读数。把每个试验来自三重复样品的读数列表显示，并取平均值。

本试验的阳性结果说明了AoSMC细胞的增殖，也说明了清蛋白融合蛋白可参与真皮成纤维细胞的增殖和/或平滑肌细胞的增殖。阳性结果也说明融合蛋白和编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸的许多潜在的应用。例如，如本说明书中所详述的炎症和免疫反应、伤口的愈合、血管发生。特别地，融合蛋白可用于伤口的愈合和真皮再生以及促进血管和淋巴系统的血管发生。血管的生长可用于例如心血管疾病的治疗。此外，本试验中显示拮抗活性的融合蛋白可作为抗血管剂(如抗血管发生)用于治疗牵涉到血管发生的疾病、病症和/或疾患。这些疾病、病症和/或疾患为本领域所已知和/或在本文所述，诸如例如恶性肿瘤、实体瘤、良性瘤，如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、和化脓性肉芽肿；动脉粥样硬化(artheroscleric)斑块；眼血管生成疾病，如糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植片排斥、新血管青光眼、晶状体后纤维组织增生症、发红、成视网膜细胞瘤、眼部的葡萄膜炎和翼状胬肉(异常血管生长)；类风湿性关节炎；银屑病；延迟的伤口愈合；子宫内膜炎；血管生成；肉芽形成；肥大芽痕(瘢痕疙瘩)；不结合性骨折；硬皮病；沙眼；血管黏着；心肌血管发生；冠状侧突；脑侧突；动静脉畸形；缺血性肢体血管发生；奥-韦二氏(Osler-Webber)综合征；斑块新血管形成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤；纤维肌肉发育异常；伤口肉芽形成；克罗恩氏病和动脉粥样硬化。此外，本试验中作为拮抗剂的清蛋白融合蛋白可用于治疗本领域已知和/或本文所述的抗过度增殖疾病和/或抗炎性疾病。

实施例38：细胞黏着分子(CAM)在内皮细胞上的表达

募集淋巴细胞到炎症和血管发生区域包括淋巴细胞和血管内皮上细胞表面黏着分子(CAM)之间的特异的受体-配体的相互作用。正常和病理状态下，这一黏着过程遵循一个多步骤的级联，包括细胞间黏着分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏着分子-1(VCAM-1)和内皮白细胞黏着分子-1(E-选择蛋白)在内皮细胞(EC)上的表达。这些分子以及其它分子在血管内皮上的表达决定了在炎症反应的发生过程中，白细胞黏着到局部血管结构和外渗入局部组织的效率。细胞因子和生长因子的局部富集参与了对这些CAM表达的调控。

简单地说，内皮细胞(如人类脐静脉内皮细胞(HUVEC))生长在标准的96孔板上使其汇合，除去细胞的生长培养基，替换成100μl的199培养基(10％胎牛血清(FBS))。将用于测试的样品(含本发明的清蛋白融合蛋白)和阳性或阴性对照三重复地加到平板内(10μl体积)。然后将平板置于37℃温育5小时(选择蛋白和整联蛋白表达)或24小时(只有整联蛋白表达)。将平板抽吸除去培养基，每孔加入100μl 0.1％的低聚甲醛-PBS(含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺)。将平板置于4℃30分钟。除去孔内的固定剂，用PBS(+Ca和Mg)+0.5％BSA漂洗1次，排出。加10μl稀释的一抗到测试和对照孔内。抗ICAM-1-生物素、抗VCAM-1-生物素和抗E-选择蛋白-生物素的使用浓度为10μg/ml(1∶10稀释0.1mg/ml的抗体母液)。细胞在湿润环境下，于37℃温育30分钟。孔用PBS(+Ca和Mg)+0.5％BSA漂洗3次。然后每孔加20μl稀释的ExtrAvidin-碱性磷酸酶(1∶5,000稀释，此处称为工作稀释液)，于37℃温育30分钟。孔用PBS(+Ca和Mg)+0.5％BSA漂洗3次。将1片对硝基苯酚磷酸pNPP溶解于5ml甘氨酸缓冲液中(pH 10.4)。每个测试孔加入溶于甘氨酸缓冲液的100μl的pNPP底物。准备标准三重复孔，其使用溶于甘氨酸缓冲液的ExtrAvidin-碱性磷酸酶的工作稀释液：1∶5,000(10⁰)＞10^-0.5＞10^-1＞10^-1.5。将5μl每种稀释液加到三重复孔内，这样得到的每孔的AP含量为5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng。然后每个标准孔内加入100μl的pNPP试剂。将平板于37℃温育4小时。所有孔内加入50μl 3M的NaOH。以平板读数器在405nm处读取平板，背景扣除选项用只含甘氨酸缓冲液的空白孔。此外，模板设定为指示每个标准孔内AP-偶联物的浓度(5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng)。结果显示为每个样品中结合的AP-偶联物的量。

实施例39：Alamar Blue内皮细胞增殖试验

本试验可用于定量确定蛋白介导的对bFGF诱导的牛淋巴内皮细胞(LEC)、牛主动脉内皮细胞(BAEC)或人类微血管子宫肌膜细胞(UTMEC)增殖的抑制作用。本试验包括基于代谢活性检测的荧光生长指示器。标准的Alamar Blue增殖试验在EGM-2MV中准备，其中加有10ng/ml bFGF作为内皮细胞刺激源。本试验也可通过轻微的改变生长培养基和细胞浓度用于许多种内皮细胞。将要测试的蛋白批次稀释成合适的稀释液。没有bFGF的不含血清的培养基(GIBCO SFM)用作非刺激对照，血管他丁或TSP-1作为已知的抑制对照包括在内。

简单地说，将LEC、BAEC或UTMEC以5000到2000个细胞/孔接种到含生长培养基的96孔板，置于37℃过夜。细胞过夜培养后，除去生长培养基，替换成GIBCO EC-SFM。在三重复孔中，将细胞用本发明清蛋白融合蛋白或对照蛋白样品合适的稀释液(制备在SFM中)处理，同时添加bFGF至浓度为10ng/ml。细胞经样品处理后，将平板放回37℃温育箱3天。3天后，每孔加入10毫升Alamar Blue母液(Biosource，目录号DAL1100)，将平板放回37℃温育箱4小时。然后平板用CytoFluor荧光读数器在530nm激发和590nm发射处读数。直接的输出结果是以相对荧光单位记录的。

Alamar Blue是一种氧化还原指示剂，可通过发荧光和改变颜色对由于细胞生长引起的生长培养基的化学还原做出响应。当细胞在培养基上生长时，内在的代谢活性引起即时周边环境的化学还原。与生长相关的还原使指示剂从氧化(非荧光蓝)形式变成还原(荧光红)形式(即刺激增殖将产生更强的信号，抑制增殖将产生更弱的信号，总信号是与细胞总数和它们的代谢活性成比例的)。背景活性水平在单独的饥饿培养基中观察到。这与从阳性对照样品(含bFGF的生长培养基)和蛋白稀释液观察到的结果进行比较。

实施例40：检测对混合淋巴细胞反应的抑制作用

本试验可用来检测和评价本发明融合蛋白对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。对MLR的抑制可能是由于对细胞增殖和存活力的直接影响、共刺激分子对相互作用细胞的调节、对淋巴细胞和辅助细胞间黏着作用的调节或辅助细胞的细胞因子产生的调节。许多细胞可能是抑制MLR的清蛋白融合蛋白的靶细胞，因为本试验所使用的外周血单个核级分包括T、B和天然杀伤淋巴细胞，以及单核细胞和树突细胞。

发现可抑制MLR的本发明清蛋白融合蛋白可应用于淋巴细胞和单核细胞激活或增殖相关的疾病。这些疾病包括但不限于哮喘、关节炎、糖尿病、炎性皮肤疾患、银屑病、湿疹、系统性红斑狼疮、多发性硬化、肾小球肾炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、动脉硬化、肝硬化、移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、肝炎、白血病和淋巴瘤。

简单地说，来自人类供体的PBMC通过密度梯度离心用淋巴细胞分离培养基(密度1.0770g/ml，Organon Teknika Corporation，West Chester，PA)来纯化。来自两个供体的PBMC在补加了10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640(Life Technologies，Grand Island，NY)中调整到2×10⁶个细胞/毫升。来自第三个供体的PBMC调整到2×10⁵个细胞/毫升。50微升来自每个供体的PBMC加到96孔圆底微量滴定板的孔中。测试材料的融合蛋白稀释液(50μl)三重复地加到微量滴定孔中。以最终1∶4的稀释加入(感兴趣蛋白的)测试样品；加入rhuIL-2(R&D Systems，Minneapolis，MN，目录号202-IL)使其终浓度为1μg/ml；加入抗CD4mAb(R&D Systems，克隆34930.11，目录号MAB379)使其终浓度为10μg/ml。细胞在5％CO₂中于37℃培养7-8天，最后16小时培养孔内加入1μC[³H]胸苷。收集细胞，用Packard Topcount确定掺入的胸苷。数据表示为三重复测量的均值和标准偏差。

感兴趣融合蛋白的样品在独立的实验中进行筛选，并与可抑制淋巴细胞增殖的阴性对照处理(抗CD4mAb)和可增强淋巴细胞增殖的阳性对照处理(IL-2，可以是重组材料或上清液)进行比较。

实施例41：蛋白酶活性试验

下述试验可用来评估本发明清蛋白融合蛋白的蛋白酶活性。

明胶和酪蛋白酶谱法基本如Heusen等和Wilson等所述的进行(Heusen等，Anal.Biochem.102：196-202，1980；Wilson等，Journal of Urology，149：653-658，1993)。样品在含1％明胶或酪蛋白的10％聚丙烯酰胺/0.1％SDS凝胶上电泳，室温浸泡于2.5％Triton 1小时，在0.1M甘氨酸(pH 8.3)中于37℃电泳5到16小时。经酰胺黑染色后，蛋白水解区域与蓝黑的背景相比显现为明亮的区域。胰蛋白酶(Sigma T8642)用作阳性对照。

蛋白酶活性也可通过监测n-a-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)(SigmaB-4500)的裂解来确定。反应在(25mM NaPO₄、1mM EDTA和1mM BAEE，pH 7.5)中设立。加入样品，在Beckman DU-6分光光度计上以时间驱动的模式监测260nm处吸光度的改变。胰蛋白酶用作阳性对照。

其它基于来自酪蛋白或血红蛋白的可溶于酸的肽的释放的试验测定280nm处的吸光度或使用Folin方法的比色分析试验如Bergmeyer等所述方法进行(Bergmeyer等，Methods of Enzymatic Analysis，5，1984)。其它试验包括显色底物的溶解(Ward，Applied Science，251-317，1983)。

实施例42：鉴定丝氨酸蛋白酶的底物特异性

本领域已知方法或本文所述方法可用来确定具有丝氨酸蛋白酶活性的本发明清蛋白融合蛋白的底物特异性。在一个实施方式中，确定底物特异性的方法是通过使用如GB 2324529(整体收入本文)所述的定位扫描合成组合文库。

实施例43：配体结合试验

下述试验可用来评估本发明清蛋白融合蛋白的配体结合活性。

配体结合试验提供了确定受体药物学的一种直接的方法，并可适用于高通量形式。针对本发明清蛋白融合蛋白的纯化的配体经放射性标记到高比活性(50-2000Ci/mmol)用于结合研究。试验证明，放射性标记的过程并没有降低配体对融合蛋白的活性。优化缓冲液、离子、pH和其它调节子(如核苷酸)的试验条件来建立对于膜和全细胞多肽来源二者而言可行的信噪比。这些试验中，特异性多肽结合定义为总的结合放射性减去在过量非标记竞争性配体存在时所测的放射性。如果可能，可使用一种以上竞争性配体来定义残留的非特异性结合。

实施例44：爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)中的功能试验

来自编码本发明清蛋白融合蛋白的线性化质粒模板的加帽RNA转录物用RNA聚合酶根据标准方案体外合成。体外，用水悬浮转录物使其终浓度为0.2mg/ml。取出成年雌性蟾蜍的卵巢叶，得到V期去滤泡的卵母细胞，使用显微注射装置将RNA转录物(10ng/卵母细胞)以50nl推注。用2个电极电压钳测定单个爪蟾卵母细胞响应暴露于融合蛋白和多肽激动剂的电流。室温条件下，在不含Ca²⁺的Barth氏培养基中记录。爪蟾系统可用来筛选已知配体和组织/细胞提取物来得到激活性配体。

实施例45：微生理测定试验

激活许多第二信使系统引起少量酸从细胞中排出。形成的酸主要是供应胞内信号传导过程所需的代谢活性增强的结果。细胞周围的培养基中pH的改变是非常小的，但可用CYTOSENSOR微生理测定仪(Molecular DevicesLtd.，Menlo Park，Calif.)检测到。因此，CYTOSENSOR能检测本发明清蛋白融合蛋白激活与能量利用胞内信号传导途径偶联的第二信使的能力。

实施例46：提取物/细胞上清液的筛选

有许多哺乳动物受体仍没有相关的激活配体(激动剂)。因此，这些受体的活性配体可能不包括在目前已鉴定的配体库内。相应地，也可通过功能性地针对组织提取物筛选(使用钙、cAMP、微生理测定仪、卵母细胞电生理等功能性筛选)本发明清蛋白融合蛋白来鉴定本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分和/或清蛋白部分的天然配体。产生积极功能响应的提取物可顺序地亚片段化，直至分离和鉴定到激活性配体。

实施例47：ATP结合试验

下述试验可用来评估本发明融合蛋白的ATP结合活性。

本发明清蛋白融合蛋白的ATP结合活性可用如美国专利第5,858,719号(通过引用整体收入本文)所述的ATP结合试验来检测。简单地说，与本发明清蛋白融合蛋白结合的ATP通过在竞争性试验中，用8-叠氮-ATP进行的光亲和标记来测定。含1mg/ml ABC转运蛋白的反应混合物与不同浓度的ATP或非水解性ATP类似物腺苷-5’-亚氨二磷酸共同于4℃温育10分钟。加入8-叠氮-ATP(Sigma Chem.Corp.，St.Louis，MO)和8-叠氮-ATP(³²P-ATP)(5mCi/μmol，ICN，Irvine CA)的混合物，使终浓度为100μM，将0.5ml等份试样放入瓷点板的孔内，并置于冰上。用短波254nm紫外灯在离平板2.5cm的距离处照射平板2次，每次1分钟，中间间隔1分钟冷却。加入二硫苏糖醇至终浓度2mM来终止反应。将温育物进行SDS-PAGE电泳、干燥和放射自显影。切下对应于本发明清蛋白融合蛋白的蛋白条带，定量分析其放射性。放射性随着ATP或腺苷-5’-亚氨二磷酸的增加而降低，提供了ATP对融合蛋白的亲和性的量度。

实施例48：鉴定与本发明清蛋白融合蛋白相互作用的信号转导蛋白

本发明清蛋白融合蛋白可作为信号转导途径蛋白或受体蛋白的鉴定、表征和纯化的研究工具。简单地说，标记的本发明融合蛋白可用作纯化与其相互作用分子的试剂。在亲和纯化的一个实施方式中，本发明清蛋白融合蛋白与层析柱共价偶联。衍生自推定靶细胞(如癌组织)的不含细胞的提取物过柱，具有合适亲和力的分子与清蛋白融合蛋白结合。从柱子上回收蛋白复合体并解离，将回收的分子进行N末端蛋白测序。得到的氨基酸序列随后用于鉴定捕获分子或设计简并寡核苷酸探针从合适的cDNA文库中克隆相关的基因。

实施例49：IL-6的生物测定

本领域已知许多试验可用于测定本发明清蛋白融合蛋白的增殖效应。例如，一个这样的试验是如Marz等所述的IL-6的生物测定(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，95：3251-56，1998，通过引用收入本文)。37℃温育68小时后，通过加入四氮唑盐噻唑蓝(MTT)并于37℃再温育4小时，来测定活细胞数目。用SDS裂解B9细胞，在570nm处测定光密度。含IL-6的对照是阳性对照，不含细胞因子的对照是阴性对照。简单地说，用不含IL-6的培养基漂洗依赖于IL-6的B9鼠细胞3次，用50μl以每孔5,000个细胞的浓度铺板，加50μl本发明的融合蛋白进行利用。测试样品(含本发明清蛋白融合蛋白)相对于阴性对照增强的增殖表明了融合蛋白介导的增殖效应。

实施例50：对鸡胚胎神经元存活的支持

为测定本发明清蛋白融合蛋白是否能支持交感神经元细胞的生存力，使用Senaldi等的鸡胚胎神经元存活试验(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96：11458-63，1998，通过引用收入本文)。简单地说，从鸡胚胎中分离运动神经元和交感神经元，分别重悬于L15培养基(含10％FCS、葡萄糖、亚硒酸钠、孕酮、伴清蛋白、腐胺和胰岛素；Life Technologies，Rockville，MD)和Dulbecco改良的Eagles培养基[含10％FCS、谷氨酰胺、青霉素和25mMHepes缓冲液(pH 7.2)；Life Technologies，Rockville，MD]，在不同浓度纯化的本发明融合蛋白存在的条件下，在5％CO₂中于37℃温育，阴性对照没有任何细胞因子。3天后，通过评价细胞形态和使用Mosmann的比色试验来确定神经元的存活(Mosmann，T.，J.Immunol.Methods，65：55-63，1983)。与缺少细胞因子的对照相比，增强的神经元细胞生存力表明清蛋白融合蛋白增强神经元细胞存活的能力。

实施例51：磷酸酶活性试验

下述试验可用来评估本发明清蛋白融合蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PTPase)活性。

为测定丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PTPase)活性，可使用广泛为本领域技术人员已知的试验。例如，本发明清蛋白融合蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PSPase)活性可使用New England Biolabs，Inc.的PSPase试验试剂盒来测定。在[³²P]ATP存在下，鞘磷脂碱性蛋白(MyBP)(PSPase的一种底物)的丝氨酸和苏氨酸残基被依赖于cAMP的蛋白激酶磷酸化。然后，可通过测定从³²P标记的MyBP释放的无机磷酸根来确定蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性。

实施例52：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶与其它蛋白的相互作用

例如，具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的本发明融合蛋白(如实施例51所确定)可用作其它相互作用蛋白或受体蛋白、或其他信号转导途径蛋白的鉴定、表征和纯化的研究工具。简单地说，标记的本发明融合蛋白可用作纯化与其相互作用的分子的试剂。在亲和纯化的一个实施方式中，本发明清蛋白融合蛋白与层析柱共价偶联。衍生自推定靶细胞(如神经细胞或肝细胞)的不含细胞的提取物过柱，具有合适亲和力的分子与融合蛋白结合。从柱子上回收融合蛋白复合体并解离，将回收的分子进行N末端蛋白测序。得到的氨基酸序列随后用于鉴定捕获分子或设计简并寡核苷酸探针从合适的cDNA文库中克隆相关的基因。

实施例53：类肝素酶活性试验

本领域已知许多试验可用来测定本发明清蛋白融合蛋白的类肝素酶活性。在一个例子中，本发明清蛋白融合蛋白的类肝素酶活性是如Vlodavsky等所述测定的(Vlodavsky等Nat.Med.，5：793-802，1999)。简单地说，将细胞裂解物、条件化培养基、完整细胞(每35-mm盘1×10⁶个细胞)、细胞培养物上清液或纯化的融合蛋白与³⁵S标记的ECM或可溶性ECM衍生的峰I蛋白聚糖共同于37℃温育18小时(pH 6.2-6.6)。将温育培养基离心，通过凝胶过滤法在Sepharose CL-6B柱(0.9×30cm)上分析上清液。用PBS洗脱各级分，并测定其放射性。硫酸乙酰肝素侧链的降解片段从Sepharose 6B柱在0.5＜K_av＜0.8(峰∏)处洗脱。每个实验至少做3次。如Vlodavsky所述对应于峰H的降解片段表明本发明清蛋白融合蛋白裂解硫酸乙酰肝素的活性。

实施例54：生物分子的固定化

本实施例提供了在非宿主细胞脂双层构建物中稳定本发明清蛋白融合蛋白的方法(参见例如Bieri等，Nature Biotech 17：1105-1108，1999，通过引用整体收入本文)，该方法适合研究各种上述功能试验中的本发明融合蛋白。简单地说，用于生物素化的碳水化合物特异的化学反应用于将生物素标签限制在本发明清蛋白融合蛋白，因此使固定化后具有一致的方向。洗膜上50μM的本发明清蛋白融合蛋白溶液与20mM NaIO₄和1.5mg/ml(4mM)BACH或2mg/ml(7.5mM)生物素-酰肼室温温育1小时(反应体积，150μl)。然后样品于4℃先透析(Pierce Slidealizer盒，10kDa截留，Pierce Chemical Co.，Rockford IL)5小时，每1小时后更换缓冲液，最后用500ml缓冲液R(0.15M NaCl、1mM MgCl₂、10mM磷酸钠，pH 7)透析12小时。在加到杯中前，用ROG50(补加50mM辛基葡萄糖苷的缓冲液R)缓冲液以1∶5稀释样品。

实施例55：金属蛋白酶活性试验

金属蛋白酶是用金属离子(如Zn²⁺)作为催化机理的肽水解酶。本发明清蛋白融合蛋白的金属蛋白酶活性可根据本领域已知方法测定。下文提供了示例性的方法：

α-2-巨球蛋白的蛋白水解

为验证蛋白酶活性，纯化的本发明融合蛋白与底物α-2-巨球蛋白(0.2个单位/毫升；Boehringer Mannheim，Germany)混合于1×试验缓冲液(50mMHEPES，pH 7.5、0.2M NaCl、10mM CaCl₂、25μM ZnCl₂和0.05％Brij-35)，37℃温育1-5天。胰蛋白酶用作阳性对照。阴性对照只含溶于试验缓冲液的α-2-巨球蛋白。收集样品，在含5％2-巯基乙醇的SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸5分钟，然后上样到8％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后通过银染观察到蛋白。与阴性对照相比出现更低分子量的条带表明了蛋白水解。

金属蛋白酶抑制剂对α-2-巨球蛋白蛋白水解的抑制作用

已知的金属蛋白酶抑制剂(金属螯合剂(EDTA、EGTA和HgCl₂)、肽金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1和TIMP-2)和商业化小分子MMP抑制剂)也可用来表征本发明清蛋白融合蛋白的蛋白水解活性。可使用的3种合成的MMP抑制剂是MMP抑制剂I，[对MMP-1和MMP-8的IC₅₀＝1.0μM；对MMP-9的IC₅₀＝30μM；对MMP-3的IC₅₀＝150μM]；MMP-3(基质降解酶1)抑制剂I[对MMP-3的IC₅₀＝5μM]和MMP-3抑制剂∏[对MMP-3的K_i＝130nM]；这些抑制剂可通过Calbiochem购买到(目录号分别为444250、444218和444225)。简单地说，不同浓度的小分子MMP抑制剂与纯化的本发明融合蛋白(50μg/ml)在22.9μl 1×HEPES缓冲液中(50mM HEPES，pH 7.5、0.2M NaCl、10mM CaCl₂、25μM ZnCl₂和0.05％Brij-35)混合，室温(24℃)温育2小时，然后加入7.1μl底物α-2-巨球蛋白(0.2个单位/毫升)，37℃温育20小时。加入4×上样缓冲液终止反应后，迅速煮沸5分钟。SDS-PAGE后，通过银染可见蛋白条带。

合成的荧光肽底物裂解试验

已证实具有金属蛋白酶活性的本发明融合蛋白的底物特异性可使用本领域已知技术来确定，如使用合成的荧光肽底物(购自BACHEM BioscienceInc.)。测试底物包括：M-1985、M-2225、M-2105、M-2110和M-2255。前4个是MMP底物，最后1个是肿瘤坏死因子α(TNF-α)转化酶(TACE)的底物。这些底物可在1∶1的二甲亚砜(DMSO)和水中制备。母液是50-500μM。荧光试验是使用配有恒温水浴的Perkin Elmer LS 50B发光光谱仪进行的。激发波长是328nm，发射波长是393nm。简单地说，试验按下述方案进行：将176μl 1×HEPES缓冲液(0.2M NaCl、10mM CaCl₂、0.05％Brij-35和50mM HEPES，pH 7.5)和4μl底物溶液(50μM)于25℃温育15分钟，然后加入20μl纯化的本发明融合蛋白到试验杯中。底物的终浓度是1μM。监测起始水解速率30分钟。

实施例56：NOD小鼠中糖尿病的发病

雌性NOD(非肥胖糖尿病)小鼠的特征是表现为IDDM(其过程与人类中发现的相似)，尽管疾病在雌性比雄性NOD小鼠中更明显。下文中除非特别指明，术语“NOD小鼠”指雌性NOD小鼠。NOD小鼠具有由慢性自身免疫病引起的β细胞的逐渐破坏。因此，NOD小鼠出生时血糖正常或血液葡萄糖水平正常。然而，到大概15-16周大时，NOD小鼠开始变得高血糖，说明其大多数胰腺β细胞受到破坏，并且相应地胰腺不能产生足够的胰岛素。因此，疾病的原因和进展都与人类IDDM患者类似。

可在雌性NOD/LtJ小鼠(可从The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Me.购买到)中进行免疫疗法效力的体内试验。有文献报道，80％的雌性小鼠会在24周大时发生糖尿病，而胰岛炎的发病开始于6-8周之间。NOD小鼠是近亲交配，可对多种免疫调节策略高度响应。成体NOD小鼠(6-8周大)的平均体重为20-25克。

这些小鼠或者为未处理的(对照)、或者为用本发明治疗剂(如本发明清蛋白融合蛋白及其片段和变体)单独或与其它上述提到的治疗性化合物共同处理的小鼠。这些不同的处理对糖尿病进展的影响可用下述方法测定：

14周大时，可根据葡萄糖耐量对雌性NOD小鼠进行表型确定。葡萄糖耐量可用腹膜内葡萄糖耐受测试(IPGTT)来测定。简单地说，在0分钟和腹膜内注射葡萄糖(1克/千克体重)60分钟后，从眶旁血管丛提取血样。正常的耐量定义为在0分钟时血浆葡萄糖少于144mg％，或在60分钟时少于160mg％。血液葡萄糖水平用Glucometer Elite仪器来确定。

基于这一表型分析，将动物分配到不同的实验组。特别地，具有更高血液葡萄糖水平升高的动物可分配到葡萄糖耐量受损组。小鼠可随意喂养，并提供酸化水(pH 2.3)。

葡萄糖耐受和不耐受小鼠可进一步再分成对照组、本发明清蛋白融合蛋白组和清蛋白融合蛋白/治疗性化合物组合组。对照组小鼠可每天接受腹膜间注射媒介，每周6次。清蛋白融合蛋白组小鼠可每天接受腹膜间注射溶于媒介的本发明治疗剂(如本发明清蛋白融合蛋白及其片段和变体)，每周6次。清蛋白融合蛋白/治疗性化合物组合组小鼠可接受上述清蛋白融合蛋白和治疗性化合物的组合。

NOD小鼠尿中的葡萄糖水平可用Labstix(Bayer Diagnostics，Hampshire，England)每周测定两次。体重和流体的摄取也可每周测定两次。糖尿病的发病定义为在连续两次测定中糖尿的出现。10周的处理后，可再进行一次IPGTT，然后在次日动物就可以被处死。

在处理的10周过程中，葡萄糖耐受和葡萄糖不耐受组中的对照动物分别以60％和86％的比例发生糖尿病(参见美国专利第5,866,546号，Gross等)。因此，如果不进行干预，甚至在起初葡萄糖耐受的NOD小鼠中，也会高比例地出现糖尿病。

可通过在处理前和处理后测定NOD小鼠中血液葡萄糖的水平来验证结果。所述所有组中葡萄糖耐受和不耐受小鼠的血液葡萄糖的水平按上述方法测定。

在一个备选的实施方式中，本发明的治疗剂(如公布为SEQ ID NO：Y的特定融合物及其片段和变体)可通过光谱分析进行定量测定，注射前合适的蛋白量可在50.mu.l磷酸盐缓冲盐水(PBS)/剂中重悬。2次注射(相隔1周)可在每个小鼠的背部皮肤下进行皮下给药。免疫前可在两个不同的时候进行监测，整个处理过程中也可每周监测一次，此后继续。每周测试尿中的葡萄糖(Keto-Diastix.RTM.；Miles Inc.，Kankakee，Ill)，糖尿小鼠可检测其血清葡萄糖(ExacTech.RTM.，MediSense，Inc.，Waltham，Mass.)。当空腹血糖超过2.5克/升时诊断为糖尿病。

实施例57：NOD小鼠的组织学分析

NOD小鼠组织样品的组织学分析可证明本发明组合物和/或本发明组合物和其它糖尿病治疗剂的组合提高胰腺中β细胞相对浓度的能力。实验方法如下所述：

来自实施例56的小鼠在处理期结束时被处死，从胰腺中提取组织样品。然后将样品固定在0.9％盐水的10％福尔马林中，包埋到蜡中。可以150.mu.m的切片间隔切2组5个连续5.mu.m切片用于免疫标记。可将切片进行免疫标记：胰岛素(豚鼠抗胰岛素抗血清稀释液1∶1000，ICN Thames U.K.)和胰高血糖素(兔抗胰腺胰高血糖素抗血清稀释液1∶2000)，用与过氧化物酶偶联的抗豚鼠(Dako，High Wycombe，U.K.)或与过氧化物酶偶联的抗兔抗血清(稀释液1∶50，Dako)进行检测。

本发明的组合物对β细胞的可见量的影响可能是或可能不是象它在葡萄糖耐受和葡萄糖不耐受动物中对糖尿病的临床表现的影响那样强。

实施例58：体内NIDDM小鼠模型

从Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)可买到3周大的雄性C57BL/6J小鼠，该小鼠是用常规食物或富含脂肪(35.5％重量/重量；Bioserv.Frenchtown，NJ)或果糖(60％重量/重量；Harlan Teklad，Madison，WI)的食物喂养的。常规食物是由4.5％重量/重量的脂肪、23％重量/重量的蛋白质、31.9％重量/重量的淀粉、3.7％重量/重量的果糖和5.3％重量/重量的纤维组成的。高脂肪(猪油)食物是由35.5％重量/重量的脂肪、20％重量/重量的蛋白质、36.4％重量/重量的淀粉、0.0％重量/重量的果糖和0.1％重量/重量的纤维组成的。高果糖食物是由5％重量/重量的脂肪、20％重量/重量的蛋白质、0.0％重量/重量的淀粉、60％重量/重量的果糖和9.4％重量/重量的纤维组成的。小鼠在22℃±3℃的温度和50％±20％的湿度控制、并具有12小时光照(6am到6pm)/黑暗周期的房间里圈养，每笼不超过5只(Luo等，1998，Metabolism47(6)：663-8，“Nongenetic mouse models of non-insulin-dependent diabetesmellitus”(非胰岛素依赖性糖尿病的非遗传性小鼠模型)；Larsen等，Diabetes50(11)：2530-9，2001，“Systemic administration of the long-acting GLP-1derivative NN2211induces lasting and reversible weight loss in both normal andobese rats”(长效GLP-1衍生物NN2211的系统性给药可诱导正常和肥胖大鼠中持久和可逆的重量减轻))。在接触各自的食物3周后，用100mg/kg体重的链脲菌素“STZ”(Sigma，St.Louis，MO)或媒介(0.05mol/L柠檬酸，pH 4.5)腹膜内注射小鼠，接下来的4周维持同样的食物。在非禁食条件下，通过剪掉尾巴的末端来获得STZ注射后1、2和4周的血样。样品用于测定非禁食血浆葡萄糖和胰岛素的浓度。每周记录体重和食物的摄取。

为直接确定高脂肪食物对胰岛素刺激葡萄糖处置能力的影响，在上述7周时期结束后，开始对3组小鼠进行实验：脂肪喂养组、用媒介注射的常规食物喂养组和用STZ注射的脂肪喂养组。实验前将小鼠禁食4小时。在第一组实验中，通过吸入甲氧氟烷(Pitman-Moor，Mundelein，IL)使小鼠麻醉。通过尾静脉静脉内注射([IV]0.1U/kg体重)常规胰岛素(Sigma)，注射后3、6、9、12和15分钟，从一条不同的尾静脉收集血液。测定这些样品的血浆葡萄糖浓度，葡萄糖从血浆中消失的半衰期(t_1/2)可用WinNonlin(ScientificConsulting，Apex，NC)(一种药动学/药效学软件程序)来计算。

在第二组实验中，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(Sigma)麻醉小鼠。打开腹腔，暴露出主腹静脉，插入24号IV导管(Johnson-Johnson Medical，Arlington，TX)。将导管固定到邻近腹静脉的肌肉组织，在注射器连接处底部作切口，并挂到预先填充的PE50塑料管上，再将塑料管连接到含注入溶液的注射器。然后通过缝合使腹腔关闭。用这种方法，将不会有因血液从躯体较低处倒流而引起的阻塞。用葡萄糖(24.1mg/kg/min)和胰岛素(10mU/kg/min)以10μl/min的注入体积连续注入小鼠。在开始注入后90、105、120和135分钟可提取眶后血样(每次70μl)用于血浆葡萄糖和胰岛素浓度的测定。这4个样品的平均值用于评估每只动物稳态血浆葡萄糖(SSPG)和胰岛素(SSPI)的浓度。

最后，在下述2组STZ注射的“NIDDM”小鼠模型中进行评价清蛋白融合蛋白、本申请的治疗性组合物(单独或与任何一种或多种列举为治疗糖尿病的治疗药物组合)降低血浆葡萄糖的能力的实验：(1)脂肪喂养的C57BL/6J和(2)果糖喂养的C57BL/6J。用于这些研究的小鼠的血浆葡萄糖浓度范围从255到555mg/dL。小鼠被随机分配处理：用媒介处理、用本发明清蛋白融合物治疗剂单独处理或与任何一种或多种列举为治疗糖尿病的治疗药物的组合处理。共给药3剂。在第1剂给药前和最后一剂给药后3小时提取尾静脉血样用于血浆葡萄糖浓度的测定。

血浆葡萄糖浓度可用Sigma的葡萄糖诊断试剂盒(Sigma目录号315)通过酶显色定量分析来测定。血浆胰岛素水平可用Linco Research的大鼠胰岛素RIA试剂盒(RI-13K；St.Charles，MO)来测定。

实施例59：体外H4IIe-SEAP报告基因试验建立胰岛素作用的参与 各种H4IIe报告基因

H4IIe/rMEP-SEAP：从大鼠中分离的苹果酸酶启动子(rMEP)含一个胰岛素途径的PPAR-γ元件。这个报告基因构建体可稳定转染肝H4IIe细胞系。

H4IIe/SREBP-SEAP：固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)是作用于许多胰岛素应答基因(如脂肪酸合成酶FAS)的启动子和调节成纤维细胞、脂肪细胞和肝细胞中脂肪酸代谢关键基因表达的转录因子。SREBP-1c(也称为脂肪细胞决定和分化因子1(ADD-1))被认为是脂肪细胞中胰岛素对基因表达的作用的主要介导物。其活性受胰岛素、固醇和葡萄糖水平的调节。该报告基因构建体可稳定转染肝H4IIe细胞系。

H4IIe/FAS-SEAP：脂肪酸合成酶报告基因构建体含一个最小的SREBP响应性FAS启动子。该报告基因构建体可稳定转染肝H4IIe细胞系。

H4IIe/PEPCK-SEAP：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子是激素调节PEPCK基因转录的主要位点，可调节PEPCK的活性。PEPCK催化肝糖异生途径的一个定向限速步骤，因此需要小心控制来维持血液葡萄糖水平在正常范围内。该报告基因构建体稳定转染肝H4IIe细胞系。

这些报告基因构建体也可稳定转染3T3-L1成纤维细胞和L6成肌细胞。然后，如实施例13所述，这些稳定细胞系可分化成3T3-L1脂肪细胞和L6肌管。接下来，分化的细胞系可用在下述的SEAP试验中。

生长和试验培养基

生长培养基包含10％胎牛血清(FBS)、10％小牛血清、1％NEAA、1×青霉素/链霉素和0.75mg/ml G418(用于H4IIe/rFAS-SEAP和H4IIe/SREBP-SEAP)或0.50mg/ml G418(用于H4IIe/rMEP-SEAP)。用于H4IIe/PEPCK-SEAP的生长培养基由10％FBS、1％青霉素/链霉素、15mMHEPES缓冲盐水和0.50mg/ml G418组成。

用于H4IIe/rFAS-SEAP、H4IIe/SREBP-SEAP和H4IIe/rMEP-SEAP报告基因的试验培养基由低葡萄糖DMEM培养基(Life Technologies)、1％NEAA、1×青霉素/链霉素组成。用于H4IIe/PEPCK-SEAP报告基因的试验培养基由0.1％FBS、1％青霉素/链霉素和15mM HEPES缓冲盐水组成。

方法

以75,000个细胞/孔用100μl/孔生长培养基接种96孔板，直至处于对数生长期的细胞开始附着。以200μl/孔将生长培养基替换成试验培养基(用于H4IIe/PEPCK-SEAP细胞的含0.5μM地塞米松的试验培养基为100μl/孔，温育约20小时)使细胞处于饥饿48小时。然后用100μl/孔新鲜的试验培养基替换试验培养基，将从表达本发明治疗剂(如本发明清蛋白融合蛋白及其片段和变体)的转染细胞系获得的细胞上清液的50μl等份试样加到孔内。来自空载体转染细胞系的上清液用作阴性对照。加10nM和/或100nM胰岛素到孔内用作阳性对照。48小时温育后，收集条件化培养基，测定SEAP活性(Phospha-Light System protocol，Tropix BP2500)。简单地说，样品用稀释缓冲液以1∶4稀释，65℃温育30分钟以失活内源非胎盘形式的SEAP。将稀释样品的50μl等份试样与50μl SEAP试验缓冲液(含对非胎盘SEAP同工酶有活性的抑制剂混合物)混合，再温育5分钟。CSPD化学发光底物(用Emerald发光增强子以1∶20稀释)的50μl等份试样加入到混合物中，温育15-20分钟。平板在Dynex平板发光计上读数。

实施例60：转基因动物

本发明清蛋白融合蛋白也可在转基因动物中表达。任何物种的动物可用来产生转基因动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪、山羊、绵羊、牛和非人类的灵长类(如狒狒、猴和黑猩猩)。在一个特定的实施方式中，本文所述技术或本领域已知技术用于在人类中表达本发明融合蛋白，作为基因治疗方案的一部分。

本领域已知的任何技术可用来将编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸引入动物以产生转基因动物的创始系(founder line)。这些技术包括但不限于前核显微注射(Paterson等，Appl.Microbiol.Biotechnol.40：691-698，1994；Carver等，Biotechnology(NY)11：1263-1270，1993；Wright等，Biotechnology(NY)9：830-834，1991和Hoppe等，美国专利第4,873,191号，1989)；反转录病毒介导的基因转移到种系(Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82：6148-6152，1985)、胚泡或胚胎；胚胎干细胞的基因打靶(Thompson等，Cell56：313-321，1989)；细胞或胚胎的电穿孔(Lo等，1983，Mol Cell.Biol.，3：1803-1814，1983)、用基因枪引入本发明的多核苷酸(参见Ulmer等，Science 259：1745，1993)；将核酸构建体引入胚胎多能性干细胞并将干细胞转移回胚泡；和精子介导的基因转移(Lavitrano等，Cell57：717-723，1989)等。这些技术的综述参见Gordon，“Transgenic Animals，”(“转基因动物”)Intl.Rev.Cytol.115：171-229，1989，通过引用整体收入本文。

本领域已知的任何技术可用于产生含编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的转基因克隆，例如，将来自诱导到静止状态的培养胚胎、胎儿或成体细胞的核转移到去核卵母细胞内(Campell等，Nature 380：64-66，1996；Wilmut等，Nature 385：810-813，1997)。

本发明提供了所有细胞中都携带编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的转基因动物，以及只在有些但不是所有细胞中携带这些多核苷酸的动物，即马赛克动物或嵌合体。转基因可以作为单个转基因或多个拷贝(如串联体，如头对头的串联或头对尾的串联)整合。转基因也可通过下述如Lasko等的教导被选择性地在特定细胞类型中引入并被激活(Lasko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236，1992)。这种细胞类型特异性激活所需的调节序列依赖于感兴趣的特定细胞类型，对本领域技术人员而言是明显的。当需要将编码本发明融合蛋白的多核苷酸整合到对应于本发明融合蛋白的治疗性蛋白部分或清蛋白部分的内源基因的染色体位点时，可使用基因打靶。简单地说，当使用这种技术时，设计含一些与内源基因同源的核苷酸序列的载体，用于通过与染色体序列的同源重组来整合入并破坏内源基因核苷酸序列的功能的目的。转基因也可通过下述如Gu等的教导选择性地引入特定的细胞类型，因此只在该细胞类型中失活内源基因(Gu等，Science 265：103-106，1994)。这种细胞类型特异性失活所需的调节序列依赖于感兴趣的特定细胞类型，对本领域技术人员而言是明显的。

产生了转基因动物后，可使用标准技术来测定重组基因的表达。最初筛选可通过Southern印迹分析或PCR技术分析动物组织来验证编码本发明融合蛋白的多核苷酸的整合的发生来实现。转基因动物组织中编码本发明融合蛋白的多核苷酸的mRNA表达水平也可使用下述技术来评估，这些技术包括但不限于Northern印迹分析从动物获得的组织样品、原位杂交分析和反转录PCR(rt-PCR)。表达融合蛋白的组织的样品也可用融合蛋白特异的抗体通过免疫细胞化学或免疫组织化学的方法来分析。

产生了创始动物后，它们可以繁殖、近交、远交或杂交产生特定的动物群体。这些繁殖策略的实例包括但不限于：创始动物与一个以上整合位点远交以建立独立系；独立系近交以产生由于每个转基因的累加表达效应而以更高水平表达转基因的复合转基因体；杂合转基因动物杂交以产生给定整合位点纯合的动物从而增强表达，并省去通过DNA分析筛选动物的需要；独立纯合系的杂交来产生复合杂合或纯合系；和通过繁殖将转基因(即编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸)放在适合感兴趣的实验模型的不同背景。本发明的转基因动物的应用包括但不限于：可用于详述本发明融合蛋白和本发明融合蛋白的治疗性蛋白和/或清蛋白组分的生物功能的动物模型系统，研究与异常表达相关的疾患和/或病症，和筛选可有效改善这种疾患和/或病症的化合物。

实施例61：使用基因治疗的治疗方法-先体外后体内

基因治疗的一种方法是移植能表达本发明清蛋白融合蛋白的成纤维细胞到患者。一般地，成纤维细胞是通过皮肤活检从受治疗者获得的。得到的组织放在组织培养培养基上，分离成小片。将小块组织放在组织培养瓶的潮湿表面，每个瓶放约10片。将培养瓶倒置、塞紧，置于室温过夜。室温24小时后，将培养瓶颠倒，组织块保持固定在培养瓶的底部，加入新鲜培养基(如含10％FBS、青霉素和链霉素的Ham氏F12培养基)。然后培养瓶在37℃温育约1周。

此时，加入新鲜培养基，然后每几天更换。再培养2周后，出现单层成纤维细胞。用胰蛋白酶消化单层，并扩大规模到更大的培养瓶。

侧翼为莫洛尼鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))用EcoRI和HindIII消化，然后用小牛小肠磷酸酶处理。线性化的载体在琼脂糖凝胶上分级，使用玻璃珠纯化。

编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可使用本领域已知技术生成，用对应于5’和3’末端序列和任选地具有合适的限制性位点和起始/终止密码子(如果必要)的PCR引物扩增。在一个实施方式中，5’引物含一个EcoRI位点，3’引物包括一个HindIII位点。在T4DNA连接酶存在时，将等量的莫洛尼鼠肉瘤病毒线性骨架和扩增的EcoRI和HindIII片段加到一起。得到的混合物维持在适于两种片段连接的条件下。然后使用连接混合物转化细菌HB101，然后细菌铺在含卡那霉素的琼脂板上，目的是为了证实载体具有正确插入的感兴趣的基因。

双向性pA317或GP+am12包装细胞生长在含10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco改良的Eagles培养基(DMEM)的组织培养物上至汇合密度。然后将含基因的MSV载体加到培养基，以载体转导包装细胞。现在包装细胞产生含基因的感染性病毒颗粒(包装细胞现在称为生产细胞)。

将新鲜培养基加到转导的生产细胞，随后从10cm平板的汇合生产细胞收集培养基。含感染性病毒颗粒的用过的培养基通过Millipore滤器过滤除去脱离的生产细胞，然后使用该培养基感染成纤维细胞。从成纤维细胞亚汇合平板除去培养基，迅速替换成来自生产细胞的培养基。除去该培养基，并替换成新鲜培养基。如果病毒滴度高，那么实际上所有成纤维细胞将被感染，不需要选择。如果滴度很低，那么有必要使用具有选择标记(如neo或his)的反转录病毒载体。成纤维细胞被有效地感染后，分析成纤维细胞来确定是否产生了清蛋白融合蛋白。

然后将人工改造的成纤维细胞单独或在cytodex 3微载体珠上生长到汇合后移植到宿主。

实施例62：使用基因治疗的治疗方法-体内

本发明的另一方面是使用体内基因治疗方法治疗病症、疾病和疾患。基因治疗方法涉及将编码本发明清蛋白融合蛋白的裸核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)序列引入动物。编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可以可操作地连接到(即与之结合)启动子或多肽在靶组织表达所需的任何其它遗传元件。这种基因治疗和递送技术和方法为本领域所已知，例如，WO90/11092、WO98/11779；美国专利第5693622、5705151、5580859号；Tabata等，Cardiovasc.Res.35(3)：470-479(1997)；Chao等，Pharmacol.Res.35(6)：517-522(1997)；Wolff，Neuromuscul.Disord.7(5)：314-318(1997)；Schwartz等，Gene Ther.3(5)：405-411(1996)；Tsurumi等，Circulation94(12)：3281-3290(1996)(通过引用收入本文)。

多核苷酸构建体可用任何递送可注射材料到动物细胞的方法递送，诸如，注射到组织(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝、肠等等)的间质间隙。多核苷酸构建体可在药学上可接受的液体或水载体中递送。

术语“裸”多核苷酸、DNA或RNA指不含用来帮助、促进或利于进入细胞的任何递送媒介物的序列，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体配制剂、脂转染试剂或沉淀剂等等。然而，编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可在脂质体配制剂中递送(诸如那些如Felgner P.L.等(1995)Ann.NY Acad.Sci.772：126-139和Abdallah B.等(1995)Biol.Cell 85(1)：1-7的教导)，其可通过本领域技术人员所熟知的方法来制备。

用在基因治疗方法中的多核苷酸载体构建体可包括不整合进宿主基因组、也不含有允许复制的序列的构建体。本领域技术人员已知的任何强启动子可用于驱动DNA的表达。与其它基因治疗技术不同，引入裸核酸序列到靶细胞的一个主要优势是细胞中多核苷酸合成的暂时性。研究显示非复制DNA序列可引入细胞，提供所需多肽的产生达6个月的时间。

多核苷酸构建体可递送到动物组织的间质间隙，这些组织包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织。组织间质间隙包括胞间液、在器官组织网状纤维间的黏多糖基质、血管或房室壁的弹性纤维、纤维组织的胶原纤维或在包盖肌肉细胞的结缔组织或骨骼陷窝内的同样的基质。它与循环的血浆和淋巴管的淋巴液占据的空间类似。递送到肌肉组织的间质间隙可由于下述原因进行。它们可通过注射到包括这些细胞的组织方便地被递送。它们可递送到并在分化的持久的、非分裂细胞中表达，尽管递送和表达可在非分化或未完全分化细胞中获得，诸如例如血液干细胞或皮肤成纤维细胞。体内肌肉细胞的获取和表达多核苷酸的能力特别强。

对裸多核苷酸注射，DNA或RNA的有效剂量在从约0.05g/kg体重到约50mg/kg体重的范围。在一个实施方式中，剂量将是从约0.005mg/kg到约20mg/kg；在另一个实施方式中，是从约0.05mg/kg到约5mg/kg。当然，本领域普通技术人员将意识到该剂量将根据注射的组织部位变化。核酸序列合适和有效的剂量可被本领域普通技术人员容易地确定，可能依赖于被治疗的疾患和施用途径。一个示例性的施用途径是通过肠胃外途径注射到组织的间质间隙。然而，也可使用其它肠胃外途径，诸如特别用于递送到肺或支气管组织、咽喉或鼻粘膜的吸入气溶胶配制剂。此外，裸多核苷酸构建体可在血管成形术过程中通过方案中使用的导管递送到动脉。

体内注射多核苷酸到肌肉的剂量响应效应可按下述方法确定。根据标准的重组DNA方法制备用于产生编码本发明多肽的mRNA的合适的模板DNA。模板DNA可以是环状或线性的，可用作裸DNA或与脂质体形成复合体。然后用各种量的模板DNA注射小鼠四头肌。

通过腹膜内注射0.3ml 2.5％的阿伏丁(Avertin)，来麻醉5-6周大的雌性和雄性Balb/C小鼠。在前腿上作一个1.5cm的切口，直接可见四头肌。溶于0.1ml载体的模板DNA用1cc注射器通过27号针在1分钟里注射，从肌肉的远侧插入部位进入膝盖约0.5cm，约0.2cm深。在注射部位上接入缝合线以便未来定位，用不锈钢钳闭合皮肤。

合适的温育时间后(如7天)，通过割去整个四头肌来制备肌肉提取物。单个四头肌每第5个15μm的横切片用组织化学染色来观察蛋白表达。融合蛋白表达的时间进程可以相似的模式进行，除了在不同时间收集不同小鼠的四头肌。注射后DNA在肌肉中的持久性可在从注射和对照小鼠中制备总细胞DNA和HIRT上清液后，通过Southern印迹分析确定。上述小鼠实验的结果可用来外推在人类和其他动物中使用裸DNA的合适剂量和其它治疗参数。

实施例62：本发明融合蛋白的生物学作用

星形胶质细胞和神经元试验

可测试本发明清蛋白融合蛋白促进生存、神经突向外长出或皮层神经元细胞的表型分化，以及诱导胶质细胞原纤维酸性蛋白免疫阳性细胞即星形胶质细胞增殖的活性。选择用于生物试验的皮层细胞是基于FGF-1和FGF-2在皮层结构中的普遍表达和先前报导的FGF-2处理增强了皮层神经元的生存。例如，胸苷掺入试验可用来说明本发明清蛋白融合蛋白对这些细胞的活性。

此外，先前描述FGF-2(碱性FGF)在体外对皮层或海马神经元的生物学作用的报导表明了神经元生存和神经突向外长出的增长(Walicke等，“Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neuronsand enhances neurite extension”(成纤维细胞生长因子促进解离的海马神经元的生存并增强了神经突的延伸)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：3012-3016.(1986)，试验通过引用整体收入本文)。然而，PC-12细胞上所做实验的报导表明，这两种响应不一定是同义的，可能不仅依赖于被测试的FGF，也依赖于在靶细胞上表达的那些受体。使用原代皮层神经元培养范例，可比较本发明清蛋白融合蛋白诱导神经突向外长出的能力和FGF-2获得的响应，例如使用胸苷掺入试验。

成纤维细胞和内皮细胞试验

人类肺成纤维细胞从Clonetics(San Diego，CA)获得，维持在来自Clonetics的生长培养基上。真皮微血管内皮细胞从Cell Applications(SanDiego，CA)获得。对增殖试验，人类肺成纤维细胞和真皮微血管内皮细胞可以5,000个细胞/孔培养在含生长培养基的96孔板1天。然后细胞在0.1％BSA的基础培养基中温育1天。用新鲜0.1％BSA培养基替换培养基后，细胞与本发明蛋白的测试融合蛋白温育3天。每孔加入Alamar Blue(AlamarBiosciences，Sacramento，CA)至终浓度10％。细胞温育4小时。通过在CytoFluor荧光读数器上读数来测定细胞的存活力。对PGE₂试验，人类肺成纤维细胞以5,000个细胞/孔在96孔板中培养1天。将培养基更换为0.1％BSA基础培养基后，细胞在有或没有IL-1α的条件下，与FGF-2或本发明融合蛋白温育24小时。收集上清液，用EIA试剂盒(Cayman，Ann Arbor，MI)进行PGE₂试验。对IL-6试验，人类肺成纤维细胞以5,000个细胞/孔在96孔板中培养1天。将培养基更换为0.1％BSA基础培养基后，细胞与FGF-2或有或没有本发明清蛋白融合蛋白和/或IL-1α温育24小时。收集上清液，用ELISA试剂盒(Endogen，Cambridge，MA)进行IL-6试验。

在加入Alamar Blue前，人类肺成纤维细胞与FGF-2或本发明清蛋白融合蛋白在基础培养基上培养3天，来评估对成纤维细胞生长的作用。FGF-2应在10-2500ng/ml显示出刺激作用，这可用来与本发明融合蛋白的刺激作用做比较。

基于[3H]胸苷掺入的细胞增殖

下述[3H]胸苷掺入试验可用来测定治疗性蛋白(如生长因子蛋白)对诸如成纤维细胞、上皮细胞或不成熟肌肉细胞的细胞增殖的作用。

通过在不含血清的培养基上温育18小时，使亚汇合培养物停滞在G1期。然后加入治疗性蛋白24小时，在最后4小时期间，用[3H]胸苷标记培养物，[3H]胸苷终浓度为0.33μM(25Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL)。掺入的[3H]胸苷用冰冷的10％三氯乙酸沉淀24小时。接着，细胞顺序地用冰冷的10％三氯乙酸和然后冰冷的水漂洗。在0.5M NaOH中裂解后，汇集裂解物和PBS漂洗物(500ml)，测定放射性的量。

帕金森模型

帕金森病中运动功能的丧失是因为由于黑质纹状体多巴胺能投射神经元的变性引起的纹状体多巴胺的缺陷。一个广泛鉴定的帕金森动物模型包括系统性施用1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)。在CNS中，MPTP被星形胶质细胞吸收，通过单胺氧化酶B分解代谢成1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺)并释放。接着，通过高亲和的多巴胺重摄取转运蛋白，MPP⁺主动地聚集在多巴胺能神经元。然后通过电化学梯度MPP⁺在线粒体浓缩，选择性抑制烟酰胺腺嘌呤二磷酸：泛醌氧化还原酶(复合体I)，因此干扰了电子传递，最终产生氧自由基。

组织培养范例表明FGF-2(碱性FGF)具有对黑质多巴胺能神经元的营养活性(Ferrari等，Dev.Biol.1989)。近来，Unsicker博士的研究组表明，以凝胶泡沫移植物施用FGF-2到纹状体导致对黑质多巴胺能神经元几乎完全的保护，使其免受与MPTP暴露相关的毒性(Otto和Unsicker，J.Neuroscience，1990)。

基于FGF-2的数据，可评价本发明清蛋白融合蛋白来确定其是否具有与FGF-2相似的体外增强多巴胺能神经元生存的作用，也可体内测试其保护纹状体内多巴胺能神经元免受与MPTP处理相关的损伤的作用。首先在多巴胺能神经元细胞培养范例中，体外检测本发明清蛋白融合蛋白的潜在作用。通过从妊娠第14天的Wistar大鼠胚胎中解剖中脑底板来制备培养物。用胰蛋白酶解离组织，并以200,000个细胞/cm²的密度接种到多聚鸟氨酸(polyorthinine)-层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片上。细胞维持在含激素补充(N1)的F12培养基和Dulbecco改良的Eagle氏培养基上。8天体外培养后，培养物用低聚甲醛固定，用酪氨酸羟化酶(多巴胺能神经元的特异性标记)处理，并进行免疫组织化学染色。从胚胎大鼠中制备解离的细胞培养物。每3天更换培养基，那时加入因子。

由于多巴胺能神经元是从妊娠第14天的动物中分离的，该发育时期经过了多巴胺能前体细胞增殖的时期，酪氨酸羟化酶免疫阳性神经元数目的增加代表了体外生存的多巴胺能神经元的数目增加。因此，如果本发明治疗性蛋白表现为延长多巴胺能神经元的生存，则说明融合蛋白可能参与帕金森病。

实施例64：胰腺β细胞移植组合治疗

移植是治疗自身免疫病的常用形式，特别是当靶自身组织已严重受损时。例如，不以任何方式限制，胰腺移植和胰岛细胞移植是IDDM的常用治疗选择(参见例如，Stewart等，Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism86(3)：984-988(2001)；Brunicardi，Transplant.Proc.28：2138-40(1996)；Kendall&Robertson，Diabetes Metab.22：157-163(1996)；Hamano等，Kove J.Med.Sci.42：93-104(1996)；Larsen & Stratta，Diabetes Metab.22：139-146(1996)和Kinkhabwala等，Am.J.Surg.171：516-520(1996))。如同任何移植方法一样，移植治疗自身免疫病患者包括减小移植组织的宿主排斥风险的处理。然而，自身免疫病包括额外而独立的风险：破坏原始自身组织的预先存在的宿主自身免疫应答将对移植组织产生同样的破坏性影响。相应地，本发明包括在经受自身免疫病移植治疗的个体中使用本发明清蛋白融合蛋白联合免疫调节剂/免疫抑制剂治疗自身免疫胰腺病的方法和组合物。

根据本发明，施用上述基于清蛋白融合物的组合物和配制剂，来预防和治疗由起初针对原始自身组织的宿主个体自身免疫响应引起的对移植器官、组织或细胞的损伤。施用可在移植前或移植后进行，施用2-4剂，每每相隔一周。

下述免疫调节剂/免疫抑制剂可在胰岛细胞或胰腺移植中与本发明清蛋白融合物治疗剂共同使用，这些免疫调节剂/免疫抑制剂包括但不限于AI-401、CDP-571(抗TNF的单克隆抗体)、CG-1088、Diamyd(糖尿病疫苗)、ICM3(抗ICAM-3的单克隆抗体)、利诺胺(Roquinimex)、NBI-6024(改变的肽配体)、TM-27、VX-740(HMR-3480)、胱天蛋白酶8蛋白酶抑制剂、沙利度胺、hOKT3γ1(Ala-ala)(抗CD3的单克隆抗体)、口服干扰素α、口服乳酸杆菌和LymphoStat-B^TM。

实施例65：VH和VL结构域的鉴定和克隆

从表达特定抗体的细胞系鉴定和克隆VH和VL结构域的一种方法是用VH和VL特异性的引物对从表达抗体的细胞系中获得的cDNA进行PCR。简单地说，从细胞系中分离RNA，并用作设计来扩增EBV细胞系表达的抗体的VH和VL结构域的RT-PCR的模板。细胞可在

试剂(LifeTechnologies，Rockville.MD)中裂解，用1/5体积的氯仿提取。加入氯仿后，使溶液在室温温育10分钟，在台式离心机上4℃14,000rpm离心15分钟。收集上清液，用等体积的异丙醇沉淀RNA。在台式离心机上4℃14,000rpm离心15分钟使沉淀的RNA成团。离心后，弃掉上清液，用75％乙醇漂洗。漂洗后，RNA再次在4℃800rpm离心5分钟。弃掉上清液，使小团在空气中干燥。RNA溶解于DEPC水中，加热到60℃10分钟。通过光密度测定确定RNA的量。

根据本领域已知方法，可使用反转录酶和随机六聚物引物从1.5-2.5微克RNA中合成cDNA。然后使用cDNA作为模板PCR扩增VH和VL结构域。用来扩增VH和VL基因的引物显示在表6中。一般PCR反应使用单条5’引物和单条3’引物。有时，当可利用RNA模板的量有限时，或为了更高的效率，可使用5’和/或3’引物组。例如，有时在单次PCR反应中使用所有5条VH-5’引物和所有JH3’引物。在含1×PCR缓冲液、2mM每种dNTP、0.7个单位的高保真Taq聚合酶、5’引物混合物、3’引物混合物和7.5微升cDNA的50微升体积中进行PCR反应。VH和VL二者的5’和3’引物混合物可通过将每个单条引物分别22皮摩尔和28皮摩尔汇集到一起获得。PCR条件是：96℃5分钟；接着是25个循环的94℃1分钟、50℃1分钟和72℃1分钟；接着是一个延伸循环72℃10分钟。反应完成后，样品管储存在4℃。

表6：用来扩增VH和VL结构域的引物序列

引物名称      SEQ ID NO     引物序列(5’-3’)

VH引物

Hu VH1-5’    62            CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG

Hu VH2-5’    63            CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG

Hu VH3-5’    64            GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG

Hu VH4-5’    65            CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG

Hu VH5-5’    66            GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC

Hu VH6-5’    67            CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG

Hu JH1，2-5’68    TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC

Hu JH3-5’   69    TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC

Hu JH4，5-5’70    TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC

Hu JH6-5’   71    TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC

VL引物

Hu Vκ1-5’  72    GACATCCAGATGACCCAGTCTCC

Hu Vκ2a-5’ 73    GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC

Hu Vκ2b-5’ 74    GATATTGTGATGACTCAGTCTCC

Hu Vκ3-5’  75    GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC

Hu Vκ4-5’  76    GACATCGTGATGACCCAGTCTCC

Hu Vκ5-5’  77    GAAACGACACTCACGCAGTCTCC

Hu Vκ6-5’  78    GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC

Hu Vλ1-5’  79    CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC

Hu Vλ2-5’  80    CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC

Hu Vλ3-5’  81    TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC

Hu Vλ3b-5’ 82    TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC

Hu Vλ4-5’  83    CACGTTATACTGACTCAACCGCC

Hu Vλ5-5’  84    CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC

Hu Vλ6-5’  85    AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA

Hu Jκ1-3’  86    ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC

Hu Jκ2-3’  87    ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC

Hu Jκ3-3’  88    ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC

Hu Jκ4-3’  89    ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC

Hu Jκ5-3’  90    ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC

Hu Jλ1-3’  91    CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC

Hu Jλ2-3’  92    CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC

Hu Jλ3-3’  93    TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC

Hu Jλ3b-3’ 94    TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC

Hu Jλ4-3’  95    CACGTTATACTGACTCAACCGCC

Hu Jλ5-3’  96    CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC

Hu Jλ6-3’  97    AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA

然后PCR样品在1.3％的琼脂糖凝胶上电泳。预期大小的DNA条带(VH结构域：～506碱基对；VL结构域：344碱基对)从胶上切下，用本领域已知方法纯化。纯化的PCR产物可连接进PCR克隆载体(TA载体，来自InvitrogenInc.，Carlsbad，CA)。转染大肠杆菌后可经蓝/白色筛选分离单个克隆的PCR产物。然后克隆的PCR产物可使用通常为本领域所已知的方法测序。

含VH结构域和VL结构域的PCR条带也可用来产生全长Ig表达载体。VH和VL结构域可克隆进含重链(如人类IgG1或人类IgG4)或轻链(人类κ或人类λ)恒定区核苷酸序列的载体，这样当转染进合适的宿主细胞时，完整的重链或轻链分子可从这些载体中表达。另外，当克隆的重链和轻链都在一个细胞系中(来自一个或两个载体)表达时，它们能装配成分泌到细胞培养基中的完整的功能性抗体分子。使用编码VH和VL抗体结构域的多核苷酸来产生编码完整抗体分子的表达载体的方法是本领域所熟知的。

实施例66：HA-细胞因子或HA-生长因子融合蛋白(诸如NGF、BDNFa、 BDNFb和BDNFc)的制备

感兴趣细胞因子或生长因子(如NGF)的cDNA可通过许多方法分离，这些方法包括使用标准方法从cDNA文库、通过RT-PCR和通过使用一系列交叠的合成寡核苷酸引物的PCR。所有这些蛋白的核苷酸序列都已知并可以得到。可在5’和3’末端剪裁cDNA产生限制性位点，以便可使用寡核苷酸接头将cDNA克隆进含HA cDNA的载体。可以使用或不使用间隔序列克隆到N或C末端。将NGF(或其它细胞因子)的cDNA克隆进诸如pPPC0005(图2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体，然后从这些载体上切下完整表达盒并将其插入质粒pSAC35，使清蛋白融合蛋白能在酵母中表达。然后可收集从酵母中分泌的清蛋白融合蛋白，并从培养基中纯化，测试其生物学活性。对在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的方案，除了使用的表达盒利用哺乳动物的启动子、前导序列和终止子(参见实施例1)。然后切下该表达盒，插入适合转染哺乳动物细胞系的质粒。

实施例67：HA-IFN融合蛋白(如IFNα)的制备

感兴趣干扰素(如IFNα)的cDNA可通过许多方法分离，这些方法包括但不排除使用标准方法从cDNA文库、通过RT-PCR和通过使用一系列交叠的合成寡核苷酸引物的PCR。干扰素(如IFNα)的核苷酸序列都已知并可以得到，例如在美国专利第5,326,859和4,588,585号、在EP32134中以及如GenBank的公共数据库。可在5’和3’末端剪裁cDNA产生限制性位点，以便可使用寡核苷酸接头将cDNA克隆进含HA cDNA的载体。可以使用或不使用间隔序列克隆到HA序列的N或C末端。将IFNα(或其它干扰素)的cDNA克隆进诸如pPPC0005(图2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体，然后从这些载体上切下完整表达盒并将其插入质粒pSAC35，使清蛋白融合蛋白能在酵母中表达。然后收集从酵母中分泌的清蛋白融合蛋白，并从培养基中纯化，测试其生物学活性。对在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的方案，除了使用的表达盒利用哺乳动物的启动子、前导序列和终止子(参见实施例1)。然后切下该表达盒，插入适合转染哺乳动物细胞系的质粒。

从小瓶中最大限度的回收蛋白

甚至当以低浓度被包装时，本发明清蛋白融合蛋白具有高度稳定性。此外，尽管蛋白浓度低，甚至当水溶液不包含加入来减少与小瓶壁结合的其它蛋白时，仍观察到好的融合蛋白回收。小瓶储存的HA-IFN溶液的回收与母液比较。6或30μg/ml HA-IFN溶液放到小瓶内，储存于4℃。48或72小时后，取出起初等于10ng样品的体积，在IFN三明治ELISA中测定。估计值与高浓度母液的估计值比较。如所显示的，这些小瓶中基本没有样品的损失，说明为阻止样品损失到小瓶壁上而加入诸如清蛋白的外源材料是不必要的。

HA-α-IFN融合体的体内稳定性和生物利用度

为确定HA-α-IFN融合体分子的体内稳定性和生物利用度，将纯化的融合体分子(从酵母)施用给猴。从HA-α-IFN融合体配制的药物组合物可解释延长的血清半衰期和生物利用度。相应地，可配制与天然α干扰素分子相比含更低剂量α干扰素活性的药物组合物。

含HA-α-IFN融合体的药物组合物可用来治疗或预防患有任何可通过施用α-IFN来调节的疾病或疾病状态的患者的疾病。这些疾病包括但不限于毛细胞性白血病、卡波西氏肉瘤、生殖器疣和肛疣、慢性乙型肝炎、慢性非甲非乙型肝炎、特别是丙型肝炎、丁型肝炎、慢性髓细胞性白血病、肾细胞癌、膀胱癌、卵巢癌和宫颈癌、皮肤癌、复发型呼吸道乳头状瘤病、非何杰金氏和皮肤T细胞淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、AIDS、多发性硬化、成胶质细胞瘤等(参见Interferon Alpha(干扰素α)，在：AHFS Drug Information(AHFS药物信息)，1997)。

相应地，本发明包括以适合人类施用的剂量配制的含HA-α-IFN融合蛋白、多肽或肽的药物组合物。本发明也包括治疗需要这种治疗的患者的方法，这种治疗至少包括施用含至少一种HA-α-IFN融合蛋白、多肽或肽的药物组合物的步骤。

双功能HA-α-IFN融合体

可修饰HA-α-IFN表达载体使其包括用于双功能HA-α-IFN融合蛋白表达的插入。例如，在除去或转移编码序列下游的两个终止密码子后，第二种感兴趣蛋白的cDNA可插入“rHA-IFN”序列的下游，并与其处于同一读码框。

在一种形式的双功能HA-α-IFN融合蛋白中，针对B淋巴细胞刺激蛋白(GenBank检索号4455139)或多肽的抗体或片段可融合到融合分子HA组分的一个末端。该双功能蛋白可用于调节由融合体的α-IFN组分产生的任何免疫响应。

实施例68：HA单链抗体融合蛋白的制备

几种方法可产生单链抗体，这些方法包括但不限于：从噬菌体文库选择、通过克隆抗体的cDNA来克隆特异性抗体的可变区和使用侧翼恒定区作为引物来克隆可变区，或通过合成对应于任何特异性抗体可变区的寡核苷酸。可在5’和3’末端剪裁cDNA以产生限制性位点，以便可使用寡核苷酸接头将cDNA克隆进含HA cDNA的载体。可以使用或不使用间隔序列克隆到HA的N或C末端。将细胞cDNA克隆进诸如pPPC0005(图2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体，然后从这些载体上切下完整表达盒并将其插入质粒pSAC35，使清蛋白融合蛋白能在酵母中表达。

在本发明的融合分子中，V_H和V_L可通过下述方法之一或其组合连接：在V_HC末端和V_LN末端之间的肽接头；V_H和V_L之间的Kex2p蛋白酶切割位点，以便分泌后将两者切割分开，然后自我结合；及以能使V_H和V_L之间形成二硫键将它们连接到一起的方式定位的胱氨酸残基。一个可选的选择是将V_H置于HA或HA结构域片段的N末端，V_L置于HA或HA结构域片段的C末端。

然后收集从酵母中分泌的清蛋白融合蛋白，并从培养基中纯化，测试其活性。对在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的方案，除了使用的表达盒利用哺乳动物的启动子、前导序列和终止子(参见实施例1)。然后切下该表达盒，插入适合转染哺乳动物细胞系的质粒。以这种方式产生的抗体可使用标准的免疫化学方法从培养基中纯化，并测试其与其抗原的结合。

实施例69：作为HA融合蛋白的抑制性因子和肽(诸如HA-抗病毒、 HA-抗菌、HA-酶抑制剂和HA-抗过敏蛋白)的制备

感兴趣肽(如抗菌肽)的cDNA可通过许多方法分离，这些方法包括但不限于使用标准方法从cDNA文库、通过RT-PCR和通过使用一系列交叠的合成寡核苷酸引物的PCR。可在5’和3’末端剪裁cDNA以产生限制性位点，以便可使用寡核苷酸接头将cDNA克隆进含HA cDNA的载体。可以使用或不使用间隔序列克隆到N或C末端。将肽的cDNA克隆进诸如pPPC0005(图2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体，然后从这些载体上切下完整表达盒并插入质粒pSAC35，使清蛋白融合蛋白能在酵母中表达。然后可收集从酵母中分泌的清蛋白融合蛋白，并从培养基中纯化，测试其生物学活性。对在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的方案，除了使用的表达盒利用哺乳动物的启动子、前导序列和终止子(参见实施例1)。然后切下该表达盒，插入适合转染哺乳动物细胞系的质粒。

实施例70：靶向HA融合蛋白的制备

感兴趣蛋白的cDNA可使用标准分子生物学方法从cDNA文库中分离或者可使用几种交叠的寡核苷酸合成获得。可改造cDNA中合适的核苷酸来形成方便的限制性位点，也允许蛋白cDNA连接到清蛋白cDNA。可指引蛋白进入细胞的靶向蛋白或肽的cDNA(如单链抗体或肽，如核定位信号)也可融合到清蛋白的另一末端。感兴趣的蛋白和靶向肽克隆进诸如pPPC0005(图2)、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体，这些载体允许与清蛋白cDNA融合。以这种方式清蛋白的N和C末端都融合到其它蛋白上。然后从pPPC0005上切下融合的cDNA，插入诸如pSAC35等质粒，使清蛋白融合蛋白能在酵母中表达。所有上述方案可使用标准分子生物学方法进行。可收集从酵母中分泌的清蛋白融合蛋白，并从培养基中纯化，使用合适的生物化学和生物学测试来测试其生物学活性和靶向活性。

实施例71：构建体ID2249(IFNα2-HSA)的产生

构建体ID2249(pSAC35:IFNα2.HSA)在酿酒酵母表达载体pSAC35内包含编码IFNα2清蛋白融合蛋白的DNA，该清蛋白融合蛋白具有HSA嵌合前导序列，后面是融合到HSA成熟形式的氨基末端的IFNα2蛋白的成熟形式(即C1-E165)。

IFNα2cDNA的克隆

使用下述引物IFNα2-1和IFNα2-2PCR扩增编码IFNα2的多核苷酸。PCR扩增物用Sal I/Cla I切割，并连接进Xho I/Cla I切割的pScCHSA。构建体ID 2249编码含HSA嵌合前导序列、IFNα2成熟形式、接着是成熟HSA蛋白的清蛋白融合蛋白。

合成适合PCR扩增编码IFNα2成熟形式)的多核苷酸的2条寡核苷酸(IFNα2-1和IFNα2-2：

IFNα2-1：

5’-CGCGCGCGTCGACAAAAGATGTGATCTGCCTCAAACCCACA-3’(SEQ ID NO：348)

IFNα2-2：

5’-GCGCGCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCT-3’(SEQ ID NO：349)

IFNα2-1引物含有一个Sal I克隆位点(下划线显示)、编码嵌合HSA前导序列最后3个氨基酸残基的核苷酸和编码IFNα2成熟形式前7个氨基酸残基的22个核苷酸(黑体显示)。在IFNα2-2中，Cla I位点(下划线显示)和其后的DNA是编码成熟HSA蛋白前10个氨基酸的DNA的反向互补序列，最后22个核苷酸(黑体显示)是编码IFNα2最后7个氨基酸残基的DNA的反向互补序列(参见实施例2)。IFNα2-HSA的PCR扩增物使用这些引物产生、纯化、用Sal I和Cla I限制酶消化，并克隆进pScCHSA载体的Xho I和Cla I位点。序列被证实后，编码该IFNα2清蛋白融合蛋白的表达盒被亚克隆进Not I消化的pSAC35。

另外，通过氨基酸测序分析表达的清蛋白融合蛋白的N末端可证实预期IFNα2序列的存在(参见下文)。

使用不同前导序列的其它IFNα2清蛋白融合蛋白已通过本领域已知方法构建(参见实施例2)。各种前导序列的实例包括但不限于转化酶“INV”(构建体2343和2410)和交配因子α“MAF”(构建体2366)。这些IFNα2清蛋白融合蛋白可被亚克隆进诸如前面所述的pC4(构建体2382)和pEE12.1等哺乳动物表达载体(参见实施例5)。也可构建治疗性部分融合到HSA C末端的IFNα2清蛋白融合蛋白(构建体2381)。

本发明的IFNα2清蛋白融合蛋白可包含融合到IFNα2成熟形式(即Cys-1到Glu-165)N-或C-末端的HSA的成熟形式(即Asp-25到Leu-609)。在本发明的一个实施方式中，本发明的IFNα2清蛋白融合蛋白进一步包括指引新生融合多肽进入用于表达的宿主分泌途径的信号序列。在一个进一步的实施方式中，信号序列编码的信号肽被除去，并且成熟IFNα2清蛋白融合蛋白直接分泌到培养基中。本发明的IFNα2清蛋白融合蛋白可包含异源信号序列，包括但不限于MAF、INV、Ig、纤蛋白(fibulin)B、簇集蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白4、HSA前导序列的变体(包括但不限于嵌合HSA/MAF前导序列)，或本领域已知的其它异源信号序列。在一个实施方式中，本发明的IFNα2清蛋白融合蛋白包含天然IFNα2。在一个进一步的实施方式中，本发明的IFNα2清蛋白融合蛋白进一步包含N末端的甲硫氨酸残基。编码这些多肽的多核苷酸(包括片段和/或变体)也包括在本发明中。

构建体ID 2249的表达和纯化

在酿酒酵母中表达

构建体2249转化到酿酒酵母菌株BXP10是通过本领域已知方法进行的(参见实施例3)。生长72小时后可在稳定期收集细胞。通过在3000g 10分钟澄清细胞来收集上清液。通过用抗HSA血清(Kent Laboratories)或作为一抗的免疫印迹检测来分析表达水平。可获得分子量约88.5kDa的IFNα2清蛋白融合蛋白。

从酿酒酵母细胞上清液中纯化

含从构建体ID 2249在酿酒酵母细胞中表达的IFNα2清蛋白融合蛋白的细胞上清液可用Dyax肽亲和柱小规模纯化(参见实施例4)，或通过下述5个步骤大规模纯化：渗滤、使用DEAE-Sepharose快速柱的阴离子交换层析、使用丁基650S柱的疏水相互作用层析(HIC)、使用SP-Sepharose快速柱或Blue-Sepharose层析的阳离子交换层析和使用Q-Sepharose高效柱层析的高效层析(参见实施例4)。IFNα2清蛋白融合蛋白可用100-250mM NaCl从DEAE-Sepharose快速柱上洗脱、用150-250mM NaCl从SP-Sepharose快速柱上洗脱和以5-7.5mS/cm从Q-Sepharose高效柱上洗脱。N末端测序应产生对应于IFNα2成熟形式的序列CDLPQ(SEQ ID NO：98)。

使用体外ISRE-SEAP试验可测定IFNα2的活性

方法

构建体ID 2249编码的IFNα2清蛋白融合蛋白可如前面实施例76所述在ISRE-SEAP试验中测定其活性。简单地说，条件化酵母上清液以1∶1000稀释液测定其在ISRE-SEAP/293F报告细胞系指引ISRE信号转导的能力。处理前1天，将ISRE-SEAP/293F报告细胞以3×10⁴个细胞/孔铺在96孔多聚-D-赖氨酸包被的平板上。然后在除去40μl用于SEAP报告基因化学发光试验(Roche目录号1779842)前，将报告细胞温育18或24小时。重组人类干扰素β“rhIFNb”(Biogen)用作阳性对照。

结果

IFNα2-HSA的纯化制备物说明在ISRE-SEAP试验中，浓度范围从10^-1到10¹ng/mL(参见图4)或10^-10到10^-8ng/mL(参见图5)的相对线性的增加。

构建体ID 2249编码的干扰素α融合体体内诱导OAS

方法

OAS酶(2’-5’-寡腺苷酸合成酶)响应于抗病毒感染在转录水平被干扰素激活。干扰素构建体的作用可通过从处理的猴获得血样并分析这些样品中2种OAS mRNA(p41和p69)的转录激活来测定。在7个不同时间点(第0天、第1天、第2天、第4天、第8天、第10天和第14天)从每组4只动物每只中获得体积0.5mL的全血。各组包括媒介对照、在第1天静脉内注射30μg/kg HSA-IFN、在第1天皮下注射30μg/kg HSA-IFN、在第1天皮下注射300μg/kg HSA-IFN和在第1、3和5天皮下注射40μg/kg干扰素α(Schering-Plough)作为阳性对照。使用p41-OAS和p69-OAS特异性探针通过实时定量PCR(Taqman)来确定p41和p69mRNA转录物的水平。OASmRNA水平相对于18S核糖体RNA内源对照来定量。构建体2249编码的清蛋白融合体可进行相似的实验。

结果

与IFNα处理的猴相反，在HSA-干扰素处理的猴中，观察到p41和p69OAS的mRNA转录物水平的显著增加(p41的数据参见图6)。作用持续了近10天。

实施例72：IFNα清蛋白融合蛋白适应症

IFNα清蛋白融合蛋白(包括但不限于构建体2249、2343、2410、2366、2382和2381编码的那些)可用来治疗、预防、改善和/或检测多发性硬化。其它适应症包括但不限于病毒感染，包括严重急性呼吸综合征(SARS)和其它冠状病毒感染；纤丝病毒(filoviruses)，包括但不限于埃博拉病毒(Ebolavirus)和马尔堡病毒(Marburg virus)；沙粒病毒(arenavirus)，包括但不限于皮秦德病毒(Pichende virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、胡宁病毒(Junin virus)、马丘坡病毒(Machupo virus)、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)；和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)；布尼亚病毒(bunyavirus)，包括但不限于庞塔托鲁病毒(Punta toro virus)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagic fever virus)、沙蝇热病毒(sandfly fever virus)、立夫特山谷热病毒(Rift Valley fever virus)、拉克罗斯病毒(La Crosse virus)和汉坦病毒(hantavirus)；黄病毒，包括但不限于黄热、斑齐病毒(Banzi virus)、西尼罗病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、蜱媒脑炎、鄂木斯克出血热(Omsk HemorrhagicFever)和科萨努尔森林病病毒(Kyasanur Forest Disease virus)；披膜病毒，包括但不限于委内瑞拉、东部、西部马脑炎病毒、罗斯河病毒(Ross River virus)和风疹病毒(Rubella virus)；正痘病毒(orthopox virus)，包括但不限于痘苗、牛痘、天花和猴痘；疱疹病毒；流感A/B；呼吸道合胞病毒(RSV)；副流感；麻疹；鼻病毒；腺病毒；塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)；病毒性出血热；杆状病毒(Rhabdovirus)；副黏病毒，包括但不限于尼帕病毒(Nipahvirus)和亨得拉病毒(Hendra virus)；和美国疾病控制和预防中心鉴定为高优先级疾病因子的其它病毒因子(即A、B和C类因子；参见例如Moran，Emerg.Med.Clin.North.Am.2002；20(2)：311-30和Darling等，Emerg.Med.Clin.North.Am.2002；20(2)：273-309)。在一个实施方式中，IFNα-清蛋白融合蛋白或IFN杂合融合蛋白与CCR5拮抗剂联合施用，进一步与仅利巴韦林、IL-2、IL-12、喷他夫西中至少之一或联合抗HIV药物治疗(如HAART)，来制备治疗初次治疗和经历过治疗的成体和儿科患者的HIV-1感染、HCV或HIV-1和HCV共感染的药物。

实施例73：HSA-IFNα2b联合利巴韦林在基因型1、初次干扰素治疗慢 性丙型肝炎(HCV)患者中的抗病毒活性

背景：

针对基因型1、初次干扰素治疗(初次IFN治疗)HCV患者的常规治疗使用干扰素α联合利巴韦林(RBV)48周。然而，该治疗具有显著的应用局限性。由于当前干扰素治疗已知的副作用，每次施用干扰素后，患者的生活质量显著地降低了。当前的方案要求至少每周给药，导致降低生活质量的时期延长。因此大量患者中断治疗，有研究报导，中断率超过50％。此外，当前干扰素治疗也有很大比例的显著血液学减少，这需要减少RBV的剂量，或更重要的是，暂时终止干扰素治疗法直至血液值正常化。因此，明显有需要改进治疗初次干扰素治疗患者的基因型1HCV的治疗方案。

原理：

通过遗传地融合成熟清蛋白的C末端到成熟干扰素α-2b的N末端来产生HSA-IFNα2b。用HSA-IFNα2b联合RBV治疗的安全性和效率在有活性对照(actively controlled)的临床研究中在基因型1、初次干扰素治疗的HCV人类患者中评价，并与作为活性对照的用PEG-IFNα-2a(PEG-IFN)联合RBV的常规治疗相比较。

方法：

基因型1、初次干扰素治疗的人类HCV患者用HSA-IFNα2b或活性对照PEG-IFN联合利巴韦林(RBV)治疗。更具体地，458个人类受治疗者被随机分成4个皮下(sc)治疗组：(a)每周一次180μg剂量的PEG-IFN(Q1w)；(b)每2周一次900μg剂量的HSA-IFNα2B(Q2w)；(c)1200μg剂量的HSA-IFNα2b Q2w；或(d)每4周一次1200μg剂量的HSA-IFNα2b(Q4w)。

每一治疗组的每个受治疗者也根据体重接受1000-1200mg/天的RBV。分层的基础包括体重指标(BMI)(＜25kg/m²或≥25kg/m²)和HCV RNA滴度(＜800,000IU/ml或≥800,000IU/ml)。

本研究的治疗持续时间是48周，伴有24周随访。本研究的主要效力终点是持续的病毒学应答(SVR)，定义为治疗完成后24周检测不到病毒载量(HCV RNA＜10IU/ml)。

HCV RNA滴度是使用实时PCR试验Quantasure^TM(Labcorp)测定的，其灵敏度范围(定量水平(LOQ))是43IU到6900万IU/mL，检测水平(LOD)是10IU/mL。使用本领域已知标准技术来测定丙氨酸转移酶(ALT)和血液效应，包括嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)、血红蛋白和血小板计数。

意向治疗(ITT)的患者定义为每个治疗组所有随机化和治疗的受试者，无论患者是否有任何缺失数据点或退出本研究。改良的意向治疗(MITT)的患者定义为基于他们在本研究中的登记日期可想得到的具有第24周就诊的患者。

结果和讨论：

受试者的人口统计学、抗病毒应答和血液学减少概括在表7(初步期中分析)和表11(最终期中分析)。总的来说，所有4种治疗方案耐受的很好，治疗组之间在3-4级实验室指标值或由于副作用的中断没有显著差异。

表7.人口统计学、抗病毒应答和血液效应的初步期中分析

^*p值＜0.05 HSA-IFNα2b 1200μg Q2w对Q4w；

值0.068HSA-IFNα2b 1200μg Q2w对

PEG-IFN；^#p值＜0.05 HSA-IFNα2B 1200μg Q4w对PEG-IFN；^**p值＜0.05 HSA-IFNα2b 1200μg Q4w对所有其它组

表8.人口统计学、抗病毒应答和血液效应的最终期中分析

^*p值＜0.05 HSA-IFNα2b 1200μg Q2w对Q4w；

值0.15 HSA-IFNα2b 1200μg Q2w对

PEG-IFN；^#p值＜0.05 HSA-IFNα2B 1200μg Q4w对PEG-IFN；^**p值＜0.05 HSA-IFNα2b 1200μgQ4w对所有其它组

SVR的抗病毒应答预示信号

SVR的抗病毒应答预示信号定义为治疗第12周时的阴性HCV RNA滴度(即具有HCV RNA滴度＜LOQ)，伴有第二阶段斜率＞0.6log/wk(第二斜率)。抗病毒应答曲线斜率的各阶段指示两种活性。第一阶段表示响应的直接抗病毒活性。第二阶段预测治疗化合物对HCV感染细胞的破坏。因此第二阶段斜率在＞0.6log/wk的值是SVR的好预示信号(阳性预测值(PPV)＞90％)。

HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗组第12周ITT的SVR抗病毒应答预示信号最高，与PEG-IFN对照治疗的75/114受试者或65.8％((最终期中分析)(70/112或62.5％(初步期中分析)))和49％相比，HSA-IFNα2b 1200μg Q2w中，82/110受试者或74.5％((最终期中分析)(77/104或74.0％(初步分析)))具有HCV RNA阴性水平(即水平低于LOQ(＜43IU/mL))，并且58％显示第二阶段斜率＞0.6log/wk。这些数据表明HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗方案具有的抗病毒活性至少与第12周的常规PEG-IFN治疗相当。因为与PEG-IFN对照治疗相比，在HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗方案中，第12周时的RNA阴性(即具有HCV RNA滴度水平低于LOQ的患者数)是约9％(最终期中分析)和12％更高(初步期中分析)，而第二阶段斜率是约9％更高(对最终和初步期中分析二者)，可能HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗方案可引起比常规PEG-IFN治疗更高的功效。在HSA-IFNα2b 900μg Q2w和HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗组中，具有HCV RNA阴性的患者数目与常规PEG-IFN治疗相似。

在第20和24周时的SVR抗病毒应答预示信号表示为HCV RNA滴度低于检测水平(LOD)(即＜10IU/mL)的受试者。HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗组第20周时的SVR抗病毒应答预示信号最高，与PEG-IFN对照治疗的77/114或67.5％(最终期中分析)相比，HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗组中，82/110或74.5％(最终期中分析)具有检测不到的HCV RNA水平(即＜10IU/mL)。相似地，IFNα2b 1200μg Q2w治疗组第24周时的SVR抗病毒应答预示信号最高，其中64/91受试者或70.3％(最终期中分析)具有检测不到的HCV RNA水平，而PEG-IFN对照治疗有57/90或63.3％具有检测不到的HCV RNA水平。第20和24周时的数据都表明HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗方案具有至少与常规PEG-IFN治疗相当的安全性和抗病毒活性，且具有改进的给药安排。

ALT水平正常化

常见的患者肝功能的量度是丙氨酸转移酶(ALT)的水平。HCV感染患者的一个特征是指示肝受损的高血清ALT水平。因此，ALT水平正常化表示肝功能的改善，对响应于治疗具有有利的预后。尽管所有治疗方案具有一些正常化ALT水平的能力，在HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗方案中观察到最显著的影响，与常规PEG-IFN治疗相比，在HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗方案中，超过两倍多的患者(最终和初步期中分析)获得了正常化的ALT水平。因此，在正常化肝功能上，1200μg Q4w剂量的HSA-IFNα2b意想不到地比常规PEG-IFN治疗基因型1、初次干扰素治疗的HCV患者更有效。

血液效应

为最大化SVR比率，在联合治疗方案中确保依从和暴露于全剂量的IFN和RBV是关键的。

在用IFN和RBV联合治疗过程中，血液学减少是常见的。由于RBV诱导溶血作用的血红蛋白(Hb)的减少要求减少RBV的剂量。特别地，Hb＜12g/dL要求减少RBV从1000-1200mg/天到800mg/天。RBV剂量对阻止HCV复发是关键的。HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗方案意想不到地具有显著更少的Hb＜12g/dL的减少(52％比PEG-IFN的65％(最终期中分析)；49.1％比PEG-IFN的64％(初步期中分析))。这可解释为用HSA-IFNα2b 1200μgQ4w治疗方案实现了更低的复发率，允许改进的SVR。

ANC＜750/mm³的减少要求减少联合治疗中IFN组分的剂量。令人惊奇地，HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗方案具有比PEG-IFN显著更少的ANC＜750/mm³(分别为6％比20.2％(最终期中分析)；4.3％比17.5％(初步期中分析))。这可再次解释为更高的SVE比率，考虑到HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗方案所需更少的剂量减少。

第12周HSA-IFNα2b Q2w和PEG-IFN治疗组发生了相似的血液学减少。然而，令人惊奇地，第12周HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗组中观察到的血液学减少比在PEG-IFN治疗组观察到的低约75％。这些结果表明与常规PEG-IFN治疗相比，HSA-IFNα2b Q4w可提供更好的安全性和改进的复发率。

治疗完成后第12周的抗病毒应答

ITT分析的治疗完成后第12周的持续病毒应答(SVR12)与PEG-IFN的54.4％相比，900Q2w是59.3％、1200Q2w是55.5％和1200Q4w是52.6％。在≥80％坚持IFN和RBV治疗的患者中，与1200Q4w的67.5％和PEG-IFN的63.0％相比，900Q2w和1200Q2w的SVR12比率最高(分别为73.8％和72.0％)。注意：较重的患者(≥75kg)中，当PEG-IFN的SVR12比率减少时，alb-IFN的SVR12比率保持不变。同样地，在≥80％坚持治疗的患者中，所有alb-IFN组的复发率降低，与PEG-IFN(29.7％)相比900Q2w(13.0％)最显著，p＝0.0261。总的来说，治疗头12周的抗病毒应答特征可预测SVR12，并且1200Q4w组的响应特征具有最高的阳性预示值。由于副作用的中断在PEG-IFN组是6.1％，相比之下，900Q2w是9.3％，1200Q4w是12.1％而1200Q2w组是19.1％。alb-IFN 1200Q4w组的血液学减少最低，其它组之间相当。通过SF-36测定的生活质量是900Q2w组最好。

治疗完成后第24周的抗病毒应答

如表9所示，基于ITT分析，治疗后第24周达到持续病毒应答(SVR)(HCV RNA＜10IU/ml)的患者百分比与PEG-IFN的57.9％相比，900Q2w为58.5％、1200Q2w为55.5％和1200Q4w为50.9％。总的来说，在治疗后第24周所有坚持治疗的患者中，与PEG-IFN的66.7％相比，SVR比率是900Q2w的72.3％、1200Q2w为70.6％和1200Q4w为62％。令人惊奇地，在体重至少75kg坚持治疗的患者中，alb-IFN组的SVR比率保持不变，而PEG-IFN的下降。在这一亚组中，与PEG-IFN的53.3％相比，SVR比率是900Q2w的74.2％、1200Q2w为67.9％和1200Q4w为61.0％。因此，在体重至少75kg的患者中，900Q2w、1200Q2w和1200Q4w的HSA-IFNα2b给药与常规PEG-IFN治疗相比引起更高的功效，甚至尽管接受PEG-IFN常规治疗的患者由于给药安排平均每个月额外给药2到3剂。

表9.治疗完成后第24周的人口统计学、抗病毒功效和血液效应分析

	Alb-IFN900μgQ2w(n＝118)	Alb-IFN1200μgQ2w(n＝110)	Alb-IFN1200μgQ4w(n＝116)	Peg-IFNα-2a180μg Qw(n＝114)
					人口统计学男性BMI均值(kg/m2)体重≥75kgHCV RNA中值(logIU/ml)	66(55.9％)25.459(50.0％)6.1	64(58.2％)25.659(53.6％)6.0	78(67.2％)26.162(53.4％)6.1	66(57.9％)25.146(40.4％)6.1
SVR比率总体≥80％坚持体重(＜75kg，≥75kg)	69(58.5％)47/65(72.3％)(70.6％，74.2％)	61(55.5％)36/51(70.6％)(73.9％，67.9％)	59(50.9％)49/79(62.0％)(63.2％，61.0％)	66(57.9％)48/72(66.7％)(76.2％，53.3％)
					实验室ANC＜750/mm3Hb＜10g/dL	28(23.7％)25(21.2％)	25(22.7％)31(28.2％)	12(10.3％)14(12.1％)	23(20.2％)22(19.3％)

生活质量分析

基于SF-36健康调查，在整个48周治疗组所有时间点通过生理部分和精神部分SP-36汇总测定，与PEG-IFN治疗组的患者相比，在清蛋白干扰素(Albuferon)900Q2w治疗组的患者报导较少的健康相关生活质量的破坏。此外，在第12和24周就诊前的那月期间，与PEG-IFN在12和24周分别为19.2％和22.4％相比，在清蛋白干扰素900Q2w治疗组只有3.0％和5.8％的工作患者报告缺席7天或更长的工作。在第12和24周治疗，在所有10个SF-36方面中，相对于PEG-IFN，900Q2w治疗组表现的更好。

结论

在第12周，在HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗组观察到对基因型1、初次IFN治疗HCV的最大的抗病毒活性。在HSA-IFNα2b 1200μg Q2w和PEG-IFN治疗组也观察到相似的对血液学减少的作用。此外，在第20和24周，在HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗组也观察到最大的抗病毒活性。在第20和24周，在HSA-IFNα2b 900μg Q2w治疗组继续观察到相当的抗病毒活性。治疗完成后第24周，在HSA-IFNα2b 900μg Q2w治疗组观察到对基因型1、初次IFN治疗HCV的最大功效。因此，HSA-IFNα2b 900μg Q2w可提供与当前的标准疗法PEG-IFN至少相当的功效和安全性，并有改进的给药安排，解释为对患者更大的方便。900μg Q2w给药安排所需的注射是PEG-IFN的一半，具有更好的生活质量影响和与PEG-IFN相当的SVR比率。此外，1200μg Q2w可提供与当前的标准疗法PEG-IFN至少相当的安全性，并有相当的功效和改进的给药安排，解释为对患者更大的方便。

用HSA-IFNα2b 1200μg Q4w方案治疗在第12周令人惊奇地显示与常规PEG-IFN治疗相比相当的功效，甚至尽管接受PEG-IFN常规治疗的受试者由于给药安排额外接受了3剂。HSA-IFNα2b 1200μg Q4w与常规PEG-IFN治疗相比相当的功效持续到第20和24周。在第12周HSA-IFNα2b 1200μgQ4w治疗组也观察到改进的稳定肝功能和显著降低血液因子减少的能力，说明治疗后这些患者中肝损伤的改进和剂量减少或暂时终止的发生率以及可能的复发降低。用HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗后第24周，超过一半的患者达到持续的病毒学应答。因此，这些结果表明用HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗可提供与用PEG-IFN联合治疗相当的功效，并具有改进的给药安排、更大的正常化肝功能的能力和更低的血液学减少的优势，导致患者更大的依从和方便和治疗后更好的结果。总之，考虑到HCV治疗领域近来的进展，HSA-IFNα2b Q4w治疗方案将具有理想的特性(例如，相当的功效、更好的耐受性、由于更大的依从导致的更大的方便)，以成为干扰素抗病毒联合治疗选择的干扰素骨架。

有利地，在900Q2w和1200Q2w HSA-IFNα2b治疗组中，至少80％坚持治疗并且体重至少75kg的患者在治疗完成后第24周，当与PEG-IFN相比时，达到更好的SVR比率。在较重患者整个治疗过程中达到更好SVR比率的能力，以及维持功效的能力在某些国家(如美国)特别重要，因为在那些国家大比例的患者体重超过75kg。

综上所述，这些结果表明用HSA-IFNα2b和RBV联合治疗基因型1、初次IFN治疗的HCV患者至少与用常规PEG-IFN和RBV联合治疗一样有效，并具有改进的给药安排优势。特别地，这些结果表明用HSA-IFNα2b联合RBV治疗与常规PEG-IFN联合RBV治疗相比，可具有或者相似的安全性和更好的功效、或者更好的安全性和相似的功效、或者既有更好的功效又有更好的安全性，但是具有改进的和高度有利的给药安排。

实施例74：在基因型1、初次干扰素治疗的慢性丙型肝炎(HCV)患者 中每2周一次或每4周一次施用HSA-IFNα2b联合利巴韦林在治疗第12周 证实相当的抗病毒应答

背景

如上面讨论，当前用于治疗慢性丙型肝炎(CHC)的干扰素治疗伴有显著的副作用，包括但不限于类似流感的症状、疲劳和抑郁。因此，在干扰素治疗过程中患者的生活质量显著降低了。因为当前标准疗法要求至少每周给药，降低生活质量的时期是显著的。此外，每周给药的要求也被看作对患者的不方便。频繁的给药安排和患者生活质量显著耗损的结合导致显著数目的患者中断治疗。因此，明显需要改进治疗初次IFN治疗基因型1HCV患者的治疗方案，这将导致患者方便性和耐受性的增长。给药疗法的主要目的是达到低于定量水平的HCV RNA水平和在干扰素治疗过程中维持该水平，以便达到持续的病毒学应答(SVR)或痊愈。然而，由于与每2周给药相比，每周给药导致施用给患者2倍的药物量，而与每4周给药相比，每周给药导致施用给患者4倍的药物量，这种给药安排能否达到该目标是有怀疑的。

原理

治疗第4周时的快速病毒应答(RVR)是用聚乙二醇化的干扰素(PEG-IFN)治疗的HCV患者中持续病毒学应答(SVR)的强阳性预示信号。通过遗传地融合成熟清蛋白的C末端到成熟干扰素α-2b的N末端来产生HSA-IFNα2b。用HSA-IFNα2b联合利巴韦林(RBV)治疗的安全性和功效在有活性对照的临床研究中在基因型1、初次IFN治疗的HCV人类患者中评价，并与作为活性对照的用PEG-IFNα-2a(PEG-IFN)联合RBV的常规治疗相比较。每2周(Q2w)或每4周(Q4w)给药的HSA-IFNα2b引起的早期抗病毒应答与PEG-IFN相比，确定以更少频率给药安排用HSA-IFNα2b联合RBV治疗是否能维持RNA阴性，如HCV RNA＜LOQ。

方法

基因型1、初次IFN治疗的人类HCV患者如实施例73所述治疗。在治疗第12周达到RVR(治疗第4周HCV RNA＜LOQ)的患者中分析早期病毒应答(EVR，定义为≥2log HCV RNA减少，或RNA阴性定义为HCVRNA＜LOQ)，显示在表10。

表10.治疗第12周具有RVR患者的早期病毒应答

ITT分析	Peg-IFNα2a180μg Q1w(n＝114)	HSA-IFNα2b1200μgQ2w(n＝110)	HSA-IFNα2b900μg Q2w(n＝118)	HSA-IFNα2b1200μg Q4w(n＝116)
					具有RVR的患者(第4周时HCV RNA＜LOQ)RVR患者中：第12周：未达到EVR第12周：HCVRNA＜LOQ	26％(30/114)0％(0/30)97％(29/30)	34％(37/110)0％(0/37)100％(37/37)	25％(29/118)3％(1/29)97％(28/29)	18％(21/116)0％(0/21)100％(21/21)
第2周时具有2log下降的患者这些患者中：第12周：未达到EVR第12周：HCVRNA＜LOQ	32％(36/114)6％(2/36)92％(33/36)	47％(52/110)6％(3/52)92％(48/52)	36％(43/118)2％(1/43)95％(41/43)	41％(47/116)2％(1/47)91％(43/47)

结果和讨论

第2周研究就诊发生在接受第2剂HSA-IFNα2b或第3剂PEG-IFN之前。接受900μg HSA-IFNα2b Q2w并在2周时达到≥2log HCV RNA的患者比例与接受PEG-IFN患者的比例相似。1200μg的两个治疗组在第2周时达到≥2log HCV RNA减少的患者比例都高于PEG-IFN，无论患者是每2周或每4周给药(P＝0.03)。大多数具有HCV RNA≥2log减少的患者在12周达到RNA阴性。此外，在第12周达到RNA阴性的这些患者的比例在所有治疗组相似(92％PEG-IFN；95％HSA-IFNα2b 900Q2w；92％HSA-IFNα2b 1200Q2w和91％HSA-IFNα2b 1200Q4w)。因此，第2周时的抗病毒应答很好的预测了Q2w和Q4w HSA-IFNα2b治疗组第12周时的应答结果。第4和12周时具有RNA阴性的患者有大于90％的机会达到SVR。此外，这些数据表明甚至通过第2周治疗(施用单剂HSA-IFNα2b后)，1200μg Q2w或Q4wHSA-IFNα2b治疗至少是与PEG-IFN治疗同样有效的，并且可能甚至比PEG-IFN治疗更有效。此外，由于在难于治疗的基因型1群体中，1200μg剂量HSA-IFNα2b提供比900μg 剂量HSA-IFNα2b或PEG-IFN更大的抗病毒活性，可能增加剂量(如到1800μg )将更有效。

尽管第2周时达到≥2log HCV RNA减少的患者比例在1200μg Q4w治疗组更高，HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗组中达到RVR的患者比例比HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗组或PEG-IFN治疗组低。HSA-IFNα2b 1200μg Q2w治疗组中达到RVR的患者比例比EPG-IFN治疗组高。此外，第12周时RVR与EVR和RNA阴性是正相关的(P＜0.001)。第12周时，在所有治疗组中，具有RVR的患者有相似的97-100％的EVR或HCV阴性率。因此，尽管达到RVR患者的比例在HSA-IFNα2b 1200μg Q4w治疗组中比PEG-IFN治疗组低，100％的这些患者第12周时保持RNA阴性，说明该治疗方案是一种可行的治疗方案。此外，HSA-IFNα2b 1200μg治疗组比PEG-IFN治疗组更高的达到RVR患者的比例表明，第2周时在Q4w治疗组增加第2剂可能增加RVR。

综上所述，数据表明在治疗基因型1初次治疗的患者时，HSA-IFNα2b联合RBV更不频繁的给药安排可能与PEG-IFN同样有效或更有效。此外，累计数据表明，包括以总浓度1200μg或更大(如1800μg)在前4周治疗方案中每2周施用HSA-IFNα2b、然后每4周施用24-48周的治疗方法可能与当前的标准疗法一样好或甚至更好。此外，这些数据表明这种联合治疗方法将为患者提供Q4w疗法的方便和耐受性，功效与Q2w疗法相当或更好。

实施例75：慢性丙型肝炎(HCV)无应答患者对HSA-IFNα2b联合利 巴韦林的响应

背景

美国超过4百万人感染丙型肝炎病毒(HCV)，使该病毒成为美国最常见的肝病起因。历史上干扰素α(IFNα)有或没有抗病毒分子(利巴韦林(RBV))的同时治疗被看作对患者最有效的治疗。更近年来，干扰素α的聚乙二醇化形式被批准与RBV联合用于HCV的治疗。这些聚乙二醇化的干扰素显示在治疗HCV时比标准干扰素或干扰素联合利巴韦林治疗更有效，变成常规的对HCV的治疗。

然而，该治疗具有显著的应用局限性。除了已知的在治疗过程中显著降低患者生活质量的副作用和常规治疗伴有的很大比例显著的血液学减少，常规治疗对大比例的经受当前HCV治疗的患者不起作用。对先前没有接受IFNα-RBV治疗的HCV患者的治疗的临床研究显示约45％的开始常规治疗的患者不能清除HCV，并保持慢性感染(例如，无应答者)。该群体中，对治疗作出响应的患者比例显著地更少。

临床研究者已响应于HCV患者中不能对先前的IFNα治疗或IFNα联合RBV治疗作出响应的非应答者群体的需要，通过用聚乙二醇化的IFNα和RBV常规治疗复治这些患者。参见Shiffman等，“Peginterferon alfa-2a andribavirin in patients with chronic hepatitis C who have failed prior treatment，”(患有慢性丙型肝炎而且先前治疗失败的患者中的聚乙二醇化干扰素α-2a和利巴韦林)Gastroenterology 126(4)：1015-23(2004)。尽管35％登记本次试验的患者在用常规治疗复治20周后没有HCV RNA迹象，但许多这些患者在治疗中断后复发。因此，只有18％的患者实际上达到持续的病毒应答(SVR)，并被治愈了HCV。相似地，当以前用常规聚乙二醇化的IFNα治疗失败的无应答患者用另一种聚乙二醇化的IFNα复治时，基于无对照的证据(anecdotalevidence)这些患者中只有～5-10％能达到SVR。因此，不仅一种干扰素治疗失败而且所有当前干扰素治疗失败的患者群体继续显著增加。相应地，明显有必要改进治疗方案，不仅为一般HCV治疗，而且为治疗先前已用干扰素治疗(如经历过IFNα治疗)治疗过并且无应答的患者，特别是那些最难治疗的无应答患者(如用当前传统疗法复治或先前治疗失败的患者)的备选治疗。

原理

通过遗传地融合成熟清蛋白的C末端到成熟干扰素α-2b的N末端来产生HSA-IFNα2b。用HSA-IFNα2b联合RBV治疗的安全性、耐受性和功效在随机化且开放标记的临床研究中在经历过IFNα治疗的无应答的HCV人类患者中评价。为了本研究的目的，无应答者定义为那些由于不能达到HCV RNA水平2-log减少(如第12周早期病毒响应或EVR12)而在第12周时停止先前治疗的HCV患者，或治疗方案完成后未能达到SVR的患者。治疗中断后复发的患者排除在本研究之外。此外，本研究中至少50％的患者先前以聚乙二醇化IFNα治疗方案治疗失败。

方法

先前至少1种IFNα治疗方案失败的人类经历过IFNα治疗的无应答HCV患者随机化成3个皮下(sc)HSA-IFNα2b治疗组：(a)900μg每2周一次(Q2w)；(b)1200μg Q2w和(c)1200μg每4周一次(Q4w)。每一治疗组中的每个受试者还接受1000-1200mg/天的RBV。评估来自这些起始3群人的安全性数据之后，通过顺序添加联合1000-1200mg/天RBV的以1500μgQ2w或1800μg Q2w接受HSA-IFNα2b的另外2群人来逐步增加HSA-IFNα2b的剂量。

本研究的治疗持续时间是48周，伴有24周随访。本研究的主要效力终点是持续的病毒学应答(SVR)。

HCV RNA滴度是使用实时PCR试验Quantasure^TM(Labcorp)测定的，其灵敏度范围是10IU到1亿IU/mL。使用本领域已知标准技术来测定丙氨酸转移酶(ALT)和血液效应，包括嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)、血红蛋白和血小板计数。

结果和讨论

人口统计学

鉴定了可作为具有对治疗无应答倾向(prevalence)的患者的独立指标的许多人口统计学特征。这些关键的无应答治疗前预示信号包括(1)基因型1，(2)高基线HCV RNA水平中值，(3)先前对PEG+RBV治疗的无应答，(4)非裔美国人，(5)F3-F4的晚期纤维化水平(使用

分类)和(6)高BMI(如≥25mg/kg)。可能最好的总体无应答指标是先前的PEG-RBV治疗失败和在这方面先前基于IFN疗法失败的数目。

受试者的人口统计学总结在表11。总的来说，所有受试者的人口统计学在所有治疗组相似。大多数受试者暴露于超过1种含干扰素的疗法，并且先前用PEG+RBV治疗失败。此外，尽管基线疾病特征在5个治疗组之间相当，1800μg Q2w治疗组具有显著更高的治疗前HCV RNA和最高的先前PEG+RBV失败比例。因此，1800μg Q2w治疗组中的受试者代表最难治疗的患者群体。

表11.人口统计学和基线特征

	900μgQ2wN＝23	1200μgQ2wN＝24	1200μgQ4wN＝24	1500μgQ2wN＝22	1800μgQ2wN＝22	P值
							年龄中值	53	50	49	51	47	0.0687
男性％	60.9％	58.3％	62.5％	86.4％	59.1％	0.2095
							基因型1	20(87.0％)	24(100％)	22(91.7％)	21(95.5％)	21(95.5％)	0.4531

HCVRNA中值(log10IU/ml)	7.1	6.6	6.2	7.0	7.6	＜0.0001
							PEG+RBV	14(60.9％)	16(66.7％)	15(62.5％)	16(72.2％)	20(90.9％)	0.1370
非裔美国人	2(8.7％)	3(12.5％)	1(4.2％)	7(31.8％)	2(9.1％)	0.0940
							F3-F4	7(30.4％)	7(29.2％)	4(16.7％)	9(40.9％)	7(31.8％)	0.5012
BMI≥25kg/m2	20(87.0％)	21(87.5％)	18(75.0％)	18(81.8％)	17(77.3％)	0.7637
							具有≥1种先前治疗的受试者％	47.8％	66.7％	66.6％	72.7％	54.5％	0.4087

功效和生物学活性

基因型1、PEG+RBV无应答者(最难治疗的HCV患者群体)在治疗期间HCV RNA相对于治疗前水平的减少显示在表12。第2-12周时，HCV RNA减少量在900-1500μg治疗组间是相当的。然而，最大病毒载量的减少在1800μg治疗组观察到。考虑到该治疗组中更高水平的治疗前HCV RNA和最高比例的PEG+RBV失败，这是令人惊奇的。治疗的头12周的抗病毒应答量反映了病毒动力学的第二阶段斜率，是SVR的阳性预示信号。

如图7所示，在基因型1、PEG+RBV无应答者中，第12周时900-1500μg治疗组的HCV RNA减少的斜率是相当的。令人惊奇的是，1800μg治疗组的HCV RNA减少量最大。1500μg和1800μg治疗组的HCV RNA减少在第24周时该亚组的患者中是相当的。

第24周时，HCV RNA阴性的受试者比例在900-1500μg治疗组间是相当的。与第12周类似，第24周时基因型1、PEG+RBV无应答者的亚组分析表明1800μg治疗组的响应率最高(数据未显示)。

基于研究者的判断和考虑到来自基于干扰素疗法的累计数据表明缺乏EVR12的高阴性预示信号和SVR在第24周时的RNA阴性，第24周时允许受治疗者由于缺乏功效而中断。

大多数第24周时具有RNA阴性的患者在48周时保持阴性。900-1200μg治疗组的总体治疗末期响应(ETR，第48周时的HCV阴性)是31％(图8A)。因此，在第12周(如EVR12)或第24周变得HCV RNA阴性的受试者中，高比例的受治疗者达到ETR。在基因型1PEG+RBV无应答者中，ETR率的范围从约15％到27％，1500μg和1800μg治疗组的ETR率最高(图8B)。

此外，48周治疗后的第12周随访时，显著数目的受试者继续HCV RNA阴性，例如达到SVR。900-1200μg治疗组的总体SVR率是21％(图8C)。在基因型1PEG+RBV无应答者中，SVR率的范围从10％到15.4％(图8D)。

总之，这些数据表明用900-1200μg HSA-IFNα2b联合RBV治疗具有高百分比的PEG+RBV的失败的经历过IFNα治疗的无应答HCV患者，引起强并相当的抗病毒活性。在该最难治疗无应答群体中也观察到低病毒突破(breakthrough)(如检测不到HCV RNA，但随后在2个或更多时间点为阳性)和低复发率。此外，治疗的头12周在1800μg治疗组也观察到显著更高的减少，表明以该剂量HSA-IFNα2b联合利巴韦林治疗的患者可具有SVR率的显著增加。

表12.GT1和PEG+RBV无应答者的抗病毒应答

	900μg Q2wN＝12	1200μg Q2wN＝16	1200μg Q4wN＝13	1500μg Q2wN＝15	1800μg Q2wN＝19
						第12周EVR12a95％C.I.b	5(41.7％)(15.1％，72.3％)	4(25％)(7.3％，52.4％)	3(23.1％)(7.2％，52.4％)	5(33.3％)(11.8％，61.6％)	12(63.2％)(38.4％，83.7％)
第24周检测不到HCVRNA95％C.I.b	2(16.7％)(2.1％，48.4％)	3(18.8％)(4.0％，45，6％)	2(15.4％)(1.9％，45.4％)	4(26.7％)(7.8％，55.1％)	6(31.6％)(12.6％，56.6％)
						第48周ETRa95％C.I.b	3(25％)(5.5％，57.2％)	3(18.8％)(4.0％，45.6％)	2(15.4％)(1.9％，45.4％)

a定义为检测不到HCV RNA或≥2log的HCV RNA减少

b严格95％置信区间

血液效应

联合治疗方案中，确保依从性和暴露于全部剂量的IFN和RBV对最大化SVR率是关键的。

在IFN和RBV联合治疗期间血液学减少是常见的。RBV剂量对预防HCV复发是关键的。然而，由于RBV诱导的溶血作用引起的血红蛋白(Hb)和血小板(PLT)计数的减少要求减少RBV剂量。嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)＜750/mm³的减少要求减少联合治疗中IFN组分的剂量。

尽管观察到一些ANC和PLT的减少，这些减少在所有Q2w治疗组间是相当的，并且在4到8周左右达到一个平台。同样地，Hb相对于基线的减少直到第12周和之后，在所有Q2w治疗组(包括1800μg治疗组)间是相当的。Q4w治疗组的血液值减少更少。总体上，有12/115受试者为控制副作用减少剂量。大多数HSA-IFNα2b剂量的减少是由于如治疗方案概述的ANC减少造成的。Q2w治疗组间没有观察到剂量响应。因此，在更高剂量治疗组中没有观察到剂量减少的增加的需要。

总之，尽管HSA-IFNα2b联合RBV治疗中观察到血液值的一些减少，这些减少在治疗组间是相当的，表明用900-1800μg HSA-IFNα2b联合RBV治疗经历过IFNα治疗的无应答HCV患者之间的安全性上没有显著差异。

结论

综上所述，这些结果表明在显著比例的经历过IFNα治疗的无应答HCV患者中(包括先前PEG+RBV治疗方案失败的患者)，用HSA-IFNα2b和RBV治疗可有效达到SVR，因此根除HCV。特别地，这些结果表明用HSA-IFNα2b900-1200μg联合RBV治疗导致本研究所有患者中的21％达到SVR。先前PEG+RBV疗法失败的患者甚至可达到SVR，有10％到15.4％的这些高度难治疗患者达到SVR。此外，在最难治疗患者群体中，1800μg治疗组显示最高的第24周HCV RNA阴性比率，表明该治疗可导致这些患者甚至更高的SVR率。此外，安全性在所有HSA-IFNα2b治疗组间是相似的。另外，这些结果表明HSA-IFNα2b可有效地每两周至四周施用，提供了改进的给药安排。因此，这些结果表明HSA-IFNα2b联合RBV治疗为基于干扰素的治疗失败的患者，特别是常规聚乙二醇化的干扰素-RBV治疗失败的患者提供了有效并安全的治疗选择，具有高度有利并改进的给药安排，这是当前本领域缺乏的。

实施例76：HSA-IFNα2b联合利巴韦林在基因型2或3、初次干扰素治 疗的慢性丙型肝炎(HCV)患者中的抗病毒活性

背景

世界范围有超过1.7亿人感染丙型肝炎病毒(HCV)，该病毒成为显著的公共健康忧虑，并且迅速成为世界范围最常见的肝病起因。急性HCV感染通常是无症状的，使早期诊断成问题。实际上，HCV感染倾向于是一种慢性疾患，其中约70％的急性感染变成持续性的。因此，尽管新感染的发病率已经在下降，预测HCV感染的传播在不远的将来会保持不变。

历史上干扰素α(IFNα)有或没有抗病毒分子(利巴韦林(RBV))的同时治疗被看作对患有慢性丙型肝炎(CHC)患者最有效的治疗。更近来，干扰素α的聚乙二醇化形式被批准与RBV联合用于HCV的治疗。这些聚乙二醇化的干扰素显示在治疗HCV时比标准干扰素或干扰素联合利巴韦林治疗更有效，已变成常规的对HCV的治疗。

对当前推荐疗法的总体持续抗病毒应答(SVR)在CHC患者中变化很大，依赖于病毒和宿主的特性，特别是病毒基因型。例如，具有最常见基因型1的患者的SVR率范围约42-46％。另一方面，具有较不常见基因型2或3的患者的SVR率在76-80％。此外，基因型2或3的患者，显著地不如基因型1的患者难治疗，可通过更短时间治疗和更低剂量的利巴韦林进行治疗。

尽管当前推荐的用聚乙二醇化的干扰素联合RBV治疗24周接着24周随访期来治疗基因型2或3引起显著比例的患者达到SVR，该治疗方案仍保持显著的基于干扰素治疗常见的应用局限性。特别地，当前推荐的治疗仍受困于每次施用后明显降低患者生活质量的副作用。因此，持续需要新的有效并更好耐受的治疗感染基因型2或3HCV患者的治疗方法。

原理

通过遗传地融合成熟清蛋白的C末端到成熟干扰素α-2b的N末端来产生HSA-IFNα2b。用HSA-IFNα2b联合RBV治疗的安全性和功效在随机化的、多中心、开放标记的临床研究中在基因型2或3、初次干扰素治疗的CHC人类患者中评价。

方法：

43个基因型2或3、初次干扰素治疗的人类HCV患者被随机化成2个皮下(sc)HSA-IFNα2b治疗组：(a)1500μg剂量每2周一次(Q2w)或(2)1500μg剂量每4周一次(Q4w)。每一治疗组的每个受试者还接受800mg/天的RBV。分层的主要基础包括基因型(2或3)和HCV RNA(＜800,000IU/ml或≥800,000IU/ml)。

本研究的治疗持续时间是24周，伴有24周随访。主要功效终点是持续的病毒学应答(SVR)。

HCV RNA滴度是使用实时PCR Quantasure^TM(Labcorp)测定的，其灵敏度范围(定量限(LOQ))是43IU到6900万IU/mL。使用稳态估计模型(HOMA)来估计胰岛素抗性。

意向治疗(ITT)的患者定义为每个治疗组所有随机化和治疗的受试者，无论患者是否有任何缺失数据点或退出本研究。改良的意向治疗(MITT)的患者定义为基于他们在本研究中的登记日期可想得到的具有第12周就诊的患者。

结果和讨论

第4和12周时，受试者的人口统计学和抗病毒应答总结在表13。总体上，HSA-IFNα2b在两个治疗组中都很好地耐受。

表13.人口统计学和抗病毒应答

ITT＝意向治疗；MITT＝改良的意向治疗(第12周就诊合格的受试者)

HCV RNA减少量和具有HCV RNA＜LOQ的基因型2或3的患者比例在HSA-IFNα2b Q2w和HSA-IFNα2b Q4w治疗组间是相当的。第4周时，具有HCV RNA＜LOQ的基因型2或3的患者比例是1500μg Q2w的76.2％和1500μg Q4w治疗组的68.2％。第12周时，两个治疗组中高比例的基因型2或3患者具有HCV RNA＜LOQ(1500Q2w的82.4％和1500Q4w的88.9％)。

因此，这些结果表明用1500μg HSA-IFNα2b以Q2w或Q4w周治疗基因型2或3的CHC患者引起强抗病毒应答率。此外，在基因型2或3的患者中，用HSA-IFNα2b 1500μg Q4w方案治疗表现出与用HSA-IFNα2b 1500μg Q2w方案治疗相当的功效。因此，这些结果表明用HSA-IFNα2b 1500μg以Q2w或Q4w治疗至少与当前推荐的对感染HCV基因型2或3患者的治疗同样有效，并具有极大改进的给药安排的优点，可能引起患者更好的耐受性和方便性。

实施例77：用HSA-IFNα2b联合利巴韦林治疗基因型1、初次干扰素治 疗的慢性丙型肝炎(HCV)患者的生活质量(QOL)

背景

如前面提到，常规用聚乙二醇化的干扰素α联合利巴韦林(RBV)治疗基因型1、初次干扰素治疗(初次IFN治疗)的HCV患者48周具有显著的应用局限性。由于当前推荐的干扰素治疗已知的副作用，每次施用干扰素后，患者的生活质量显著地降低了。当前的方案要求至少每周给药，导致延长的降低生活质量的时期和由于治疗引起的失去劳动能力天数的增加。因此大量患者中断治疗，有一些研究报导，中断率超过50％。因此，明显需要改进治疗初次干扰素治疗患者的基因型1HCV的治疗方案，与当前标准疗法相比具有改进的对生活质量的影响。

原理：

用HSA-IFNα2b联合RBV治疗的安全性和功效在有活性对照的临床研究中在基因型1、初次干扰素治疗的HCV人类患者中评价，并与如实施例73所述的作为活性对照的用PEG-IFNα2a(PEG-IFN)联合RBV的常规治疗相比较。在头12周治疗期间，用HSA-IFNα2b联合RBV治疗的治疗对QOL和失去劳动能力天数(如不去工作的天数)的影响与用PEG-IFN联合RBV进行比较。

方法

458个人类基因型1HCV患者被如实施例73所述进行随机化和治疗。在治疗前、治疗第4周和第12周时，通过SF-

测定模型(QualityMetric，Lincoln，RI)确定QOL和评估失去劳动能力的天数。特别地，评估8个SF-36v2方面：身体功能(PF)、身体角色(RP)、身体痛苦(BP)、一般健康(GH)、生活力(VT)、社会功能(SF)、情感角色(RE)和心理健康(MH)。前4个方面(PF、RP、BP和GH)对应于身体健康部分，余下4个方面(VT、SF、RE和MH)对应于QOL模型的心理健康部分。

治疗整个第12周中，评价8个SF-36v2方面的转化(原始)分，以及基于正常的身体部分概括(PCS)分和心理部分概括(MCS)分。

结果和讨论

表14.生活质量测定

^*p值＜0.05对Peg-IFN；^#超过(MCID)最小临床重要差异

第12周时，每次测定时接受900μg HSA-IFNα2b Q2w患者的QOL相对于PEG-IFN改进，在MCS和PCS，以及8个独立方面中的5个中达到统计学显著性。在1200μg Q2w和1200μg Q4w HSA-IFNα2b治疗组，在实际每次测定中，QOL的恶化相对于PEG-IFN降低了，并伴有在身体痛苦和心理健康中观察到的临床显著差异。

总体上，在任何HSA-IFNα2b治疗组中，基因型1HCV患者由于他们HCV感染和随后的治疗比PEG-IFN治疗组中的基因型1HCV患者不去工作的天数更少。特别地，接受900μg HSA-IFNα2b Q2w的患者具有比接受PEG-IFN的患者少75％的MDW，而接受1200μg HSA-IFNα2b Q2w或1200μg HSA-IFNα2b Q4w的患者具有比接受PEG-IFN的患者少25％的MDW。

综合实施例73中所示的HSA-IFNα2b的抗病毒活性，这些结果表明用HSA-IFNα2b和RBV联合治疗基因型1、初次干扰素治疗的HCV患者至少与用常规PEG-IFN和RBV联合治疗的治疗同样有效，并具有改进给药安排和改进QOL的优势。特别地，这些结果表明用HSA-IFNα2b联合RBV治疗可提供比常规PEG-IFN联合RBV治疗改进的并且高度有利的治疗方案，即向患者提供比PEG-IFN联合RBV治疗能提供的更少的不去工作的天数和QOL指标恶化的降低。

实施例78：在基因型1、初次干扰素治疗的慢性丙型肝炎(HCV)患者 中，每4周施用HSA-IFNα2b，并在第2周时额外施用一剂，同时联合每天 给药的利巴韦林，进行开放标记、随机化、多中心初步研究

背景

Alb-IFN的病毒动力学建模证明了HCV RNA非线性的双阶段减少。起始治疗后，病毒载量有迅速的剂量依赖性的下降(“第一阶段”)，随后是治疗下面几周期间相对缓慢但连续指数式衰减的“第二阶段”。第一阶段HCVRNA减少表现出剂量依赖性。相似地，HCV RNA的第二阶段减少具有剂量依赖性。这些看起来是如标准和PEG-IFNα治疗观察到的持续病毒减少(SVR)的强预示信号。Neumann等，Hepatology 36(4 pt 2)：357a(2002)；Perelson等，Hepatology 42：749-754(2005)。

原理

每4周施用HSA-IFNα2b，并在第2周时额外施用1剂，同时联合每天给药的利巴韦林的两剂疗法的安全性和功效在开放标记、随机化、多中心初步研究中评价。在患有基因型1慢性丙型肝炎并且初次干扰素治疗的患者中，比较两剂疗法与每4周施用HSA-IFNα2b联合每天给药的利巴韦林和每2周施用一半剂量的HSA-IFNα2b联合每天给药的利巴韦林。

方法

合格的患者以1∶1∶1的比例如表15所示随机化进3个治疗组之一。900Q2w治疗组作为本研究的内参考，因为该治疗组显示具有可接受的安全性和与PEG-IFNα-2a相似的HCV RNA减少。1800Q2/4治疗组在第2周时将接受额外1剂alb-IFN 1800μg，以提高第4周时的HCV RNA减少量从而提高第4周时的快速病毒学应答(RVR4)率和可能的SVR率。剂量减少也包括在本研究设计中。对900Q2w组，基于对初次干扰素治疗、基因型1慢性丙型肝炎患者的另一个2a相研究中在相似剂量观察到的显著抗病毒活性，选择将alb-IFN剂量减少到最低剂量水平600μg。对1800Q4w和1800Q2/4w组，基于每2周相似的暴露于600μg alb-IFN剂量，选择将剂量减少到每4周1200μg。

约225个患者被随机化(即每个治疗组75个患者)。根据筛选时HCVRNA(≥400,000IU/mL或＜400,000IU/mL)和根据种族对随机化进行分层。治疗总持续时间为48周。所有完成48周治疗的患者将在第52周和第60周回来就诊。第60周时具有HCV RNA＜100IU/mL的患者将在第72周时回来进行SVR评定。

第12周时没有达到早期病毒学应答(EVR12，定义为≥2-log10减少或HCV RNA＜LOQ[43IU/mL])或第24周或之后具有HCV RNA≥100IU/mL的患者将中断研究治疗。这些患者将被认为SVR失败，将不需要进行进一步的HDV RNA评定。

所有早期中断治疗的患者必须完成4和12周的治疗后安全性随访就诊。此外，在12周治疗后安全性随访就诊时具有HCV RNA＜100IU/mL的患者将在治疗后24周回来进行SVR评定。

除了4和12周的治疗后安全性随访就诊之外，研究期间任何时间具有阳性alb-IFN或HSA抗体响应的患者还必须完成24周治疗后安全性随访就诊，不论其HCV RNA应答。

通过有效的实时聚合酶链式反应(PCR)试验估计HCV RNA，其动态范围是43IU/mL(LOQ)到6900万IU/mL，更低的检测限(LOD)是15IU/mL。

表15.治疗组

治疗组	皮下施用Alb-IFN的给药间隔(施用的总剂量数)	口服施用利巴韦林＊
			900Q2w	每2周900μg alb-IFN(24剂)	1000或1200mg/天
1800Q4w	每4周1800μg alb-IFN(12剂)	1000或1200mg/天
			1800Q2/4w	每4周1800μg alb-IFN，第2周时额外	1000或1200mg/天

1剂(13剂)

^*利巴韦林给药将基于患者第1天时的体重(kg)，每天剂量分开2次施用，随食物服用，共48周：

·体重＜75kg的患者1000mg/天(400mg上午和600mg下午)

·体重≥75kg的患者1200mg/天(600mg上午和600mg下午)

功效评估

在下述就诊时间收集HCV RNA样本：第1天、第4天、第1周、第2周、第4周、第32天和第6、8、12、16、20、24、32、40、48、52、60和72周，除了那些没有达到EVR12第24周或之后具有HCV RNA≥100IU/mL的患者。

安全性评估

整个研究过程检测患者的副作用(AE)、严重副作用(SAE)、实验室异常和免疫原性状态。副作用的严重度根据改良的微生物和传染病分区(DMID)毒性表进行分级。

其它评估

在第1天、第4天、第8天(第1周)、第15天(第2周)、第29天(第4周)、第32天、第57天(第8周)和第85天(第12周)收集药物动力学(PK)样本。整个48周治疗期和随访期的第52、60和72周就诊时每2周一次收集患者汇报的结果问卷、急性版本的SF36健康调查和工作生产力和活动力损伤问卷(WPAI-SHP)。

数据分析

意向治疗(ITT)群体将由所有随机化的、接受至少1剂研究药物的患者组成。遵循ITT原则，根据他们在随机化时分配的治疗来分析患者。安全性群体将由所有接受至少1剂研究药物的患者组成，并根据接受的治疗进行分析。

alb-IFN的安全性和耐受性将通过检查每个治疗组的总体安全性来进行评价，包括AE/SAE、导致治疗中断的AE、导致剂量减少或遗漏的AE和实验室异常。治疗组呈现死亡、其它严重副作用、引起alb-IFN中断的副作用和导致剂量减少或遗漏的AE。这些事件的比例将以95％置信区间(CI)在所有3个治疗组中估计。此外，如果预期细胞计数(cell count)低于5，使用Pearson卡方检验或Fisher氏精确检验来评估配对组的比较。

分类(categorical)功效终点的响应率将以他们相应的95％CI报告。相似地，如果预期细胞计数低于5，使用Pearson卡方检验或Fisher氏精确检验来评估配对组的比较。使用Kaplan-Meier方法和logrank检验每个配对组比较来估计达到低于检测的HCV RNA的时间。

引用的每个文件(包括专利、专利申请、专利公布、期刊文章、摘要、实验室手册、书或其它公开)的完整公开，以及本申请中提及的诸如GenBank、GeneSeq或CAS登记的数据库的特定标识符可得到的信息通过引用整体收入入本文。

此外，下述每个国际申请和美国申请的说明书和序列表通过引用整体收入本文：国际申请第PCT/US02/40891号，2002年12月23日提交；国际申请第PCT/US2004/001369号，2004年1月20日提交；国际申请第PCT/US2005/004041号，2005年2月9日提交；国际申请第PCT/US06/29391号，2006年7月31日提交；美国申请第10/775,204号，2004年2月11日提交；美国申请第11/175,690号，2005年7月7日提交；美国申请第11/429,373号，2006年5月8日提交；美国申请第11/429,276号，2006年5月8日提交；美国申请第11/429,374号，2006年5月8日提交；美国申请第11/495,624号，2006年7月31日提交；和美国临时申请第60/707,521号，2005年8月12日提交；60/712,386，2005年8月31日提交；60/732,724，2005年11月3日提交；60/776,914，2006年2月28日提交；60/781，361，2006年3月13日提交；60/810,182，2006年6月2日提交；60/813,682，2006年6月15日提交；60/844,349，2006年9月14日提交；60/858,410，2006年11月13日提交；60/902,039，2007年2月20日提交；和60/942,647，2007年6月7日提交。

涉及保藏的生物材料的说明

(PCT实施细则13之二)

A.下面做的指示涉及说明书第30页表3提及的保藏的生物材料。

B.保藏证明：进一步的保藏证明在另一页：

保藏单位名称：美国典型培养物保藏中心(ATCC)

保藏单位地址：10801 University Boulevard

              Manassas，Virginia 20110-2209

              United States of America(美国)

	保藏号	保藏日
			1.	PTA-3763	2001-10-04
2.	PTA-3940	2001-12-19
			3.	PTA-3942	2001-12-19
4.	PTA-3939	2001-12-19
			5.	PTA-4670	2002-09-16

加拿大

申请人要求，直到在申请的基础上加拿大专利被授权或申请被驳回，或被放弃并不再恢复，或被撤回，专利行政长官只授权提供本申请所指的保藏的生物材料样品给行政长官指定的独立的专家，相应地，申请人必须在用于国际申请公布的技术准备完成前通过书面声明通知国际局。

挪威

申请人特此要求，直至申请被安排公开于公共审查(被挪威专利局)，或最终由挪威专利局决定不被公开审查，样品供给只有对本领域的专家有效。根据挪威专利法案条款22和33(3)，该效力的要求应由申请人在不晚于申请公开的时间提交给挪威专利局。如果申请人提交了该要求，任何第三方要求提供样品的要求应指明要使用的专家。该专家可以是挪威专利局拟订的公认专家名单上的任何人，或申请人在个案中批准的任何人。

澳大利亚

申请人特此提出通知，微生物样品供给仅在专利授予之前或申请失效、驳回或撤回之前对熟练的并且对本发明无利益的收件人有效(澳大利亚专利条例3.25(3)条)。

芬兰

申请人特此要求，直到申请被公开于公共审查(被国家专利和章程委员会)，或最终由国家专利和章程委员会决定不被安排公开于公共审查，样品供给仅对本领域的专家有效。

英国

申请人特此要求，微生物样品供给仅对专家有效。该效力的要求必须由申请人在用于申请的国际公布的技术准备完成前提交给国际局。

丹麦

申请人特此要求，直到申请公开于公共审查(被丹麦专利局)，或最终由丹麦专利局决定不公开于公共审查，样品供给仅对本领域的专家有效。根据丹麦专利法案条款22和33(3)，该效力的要求应由申请人在不晚于申请公开的时间提交给丹麦专利局。如果申请人提交了该要求，任何第三方要求提供样品的要求应指明要使用的专家。该专家可以是丹麦专利局拟订的公认专家名单上的任何人，或申请人在个案中规定的任何人。

瑞典

申请人特此要求，直到申请公开于公共审查(被瑞典专利局)，或最终由瑞典专利局决定不公开于公共审查，样品供给仅对本领域的专家有效。该效力的要求应由申请人在距优先权日期16个月过期前提交给国际局(优选地以复制在PCT申请人指南卷I附录Z的PCT/RO/134表的形式)。如果申请人提交了该要求，任何第三方要求提供样品的要求应指明要使用的专家。该专家可以是瑞典专利局拟订的公认专家名单上的任何人，或申请人在个案中批准的任何人。

荷兰

申请人特此要求，直到荷兰专利授予日期或直到申请被驳回或撤回或失效日期，参照专利法规31F(1)，只能通过将样品分配给专家来供给微生物。根据荷兰王国专利法案条款22C或25，该效力的要求必须由申请人在申请公开前提供给荷兰工业产权局，不管是两个日期中的哪个更早发生。

序列表

<110>人类基因科学公司(HUMAN GEN0ME SCIENCES，INC.)

<120>清蛋白融合蛋白

<130>PF619PP5

<160>189

<170>Patentin Ver.2.0

<210>1

<211>585

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>1

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1                 5                  10                  15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

             20                  25                  30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

        35                  40                  45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

    50                  55                  60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65                  70                  75                  80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

                 85                  90                  95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

            100                 105                 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

        115                 120                 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

    130                 135                 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

                165                 170                 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

            180                 185                 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

        195                 200                 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

    210                 215                 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225                 230                 235                 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

                245                 250                 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

            260                 265                 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

        275                 280                 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

    290                 295                 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305                 310                 315                 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

                325                 330                 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

            340                 345                 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

        355                 360                 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

    370                 375                 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385                 390                 395                 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

                405                 410                 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

            420                 425                 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

        435                 440                 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

    450                 455                 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465                 470                 475                 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

                485                 490                 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

            500                 505                 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

        515                 520                 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

    530                 535                 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545                 550                 555                 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

                565                 570                 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

            580                 585

<210>2

<211>1782

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>2

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa      60

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta     120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa     180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt     240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa     300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt     360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat     420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg     480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca     540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaaatgt     600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtggc tcgcctgagc     660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa     720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt     780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaggattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa     840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct     900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct     960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat    1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc    1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt    1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aactgtgagc tttttgagca gcttggagag    1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact    1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat    1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta    1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca caaaatgctg cacagagtcc    1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa    1500

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag    1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca    1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag    1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa    1740

gctgccttag gcttataaca tctacattta aaagcatctc ag                       1782

<210>3

<211>609

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>3

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1                 5                  10                  15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>转角

<223>可用于在scFv中连接VH和VL结构域的接头肽

<400>4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

  1               5                  10                  15

<210>5

<211>394

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>5

gcggccgccg gatgcaaggg ttcgaatccc ttagctctca ttattttttg ctttttctct 60

tgaggtcaca tgatcgcaaa atggcaaatg gcacgtgaag ctgtcgatat tggggaactg 120

tggtggttgg caaatgacta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta 180

acataataac cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa 240

aaaataagat atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt 300

cttgctctct tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca 360

tagatacaat tctattaccc ccatccatac aatg                             394

<210>6

<211>21

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>6

Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala

  1               5                  10                 15

Leu Gly Ser Gln Ala

             20

<210>7

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>司腺钙蛋白(Stanniocalcin)信号肽

<400>7

Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Ile Ser Ala Ser

  1               5                  10                 15

Al a

<210>8

<211>24

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>8

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg

             20

<210>9

<211>18

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>9

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                 15

Tyr Ser

<210>10

<211>18

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>10

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                 15

Tyr Ser

<210>11

<211>19

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>11

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys

  1               5                  10                  15

Ile Ser Ala

<210>12

<211>86

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(84)

<223>Xaa等于Glu或Asp其中任一

<400>12

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser

  1               5                  10                 15

Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala

             20                 25                 30

Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp

         35                 40                 45

Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu

    50                 55                 60

Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly

 65                 70                 75                 80

Val Ser Leu Xaa Lys Arg

                 85

<210>13

<211>24

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>13

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                 15

Tyr Ser Arg Ser Leu Glu Lys Arg

             20

<210>14

<211>24

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>14

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                 15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg

             20

<210>15

<211>21

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>15

Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly

  1               5                  10                 15

Ser Leu Asp Lys Arg

             20

<210>16

<211>19

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>16

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

  1               5                  10                 15

Val His Ser

<210>17

<211>29

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>17

Met Glu Arg Ala Ala Pro Ser Arg Arg Val Pro Leu Pro Leu Leu Leu

  1               5                 10                 15

Leu Gly Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Gly Val Asp Ala

             20                 25

<210>18

<211>22

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>18

Met Met Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu

  1               5                  10                 15

Ser Gly Gln Val Leu Gly

             20

<210>19

<211>21

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>19

Met Leu Pro Leu Cys Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Gly Pro

  1               5                  10                 15

Gly Pro Ser Leu Gly

             20

<210>20

<211>24

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>20

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg

             20

<210>21

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>诱变剂

<222>(14)to(18)

<223>HSA天然前导序列的变体

<400>21

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Val

  1               5                  10                 15

Leu Gly

<210>22

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>诱变剂

<222>(14)to(18)

<223>HSA天然前导序列的变体

<400>22

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Gly Val

  1               5                  10                 15

Leu Gly

<210>23

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>诱变剂

<222>(14)to(18)

<223>HSA天然前导序列的变体

<400>23

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val

  1               5                  10                 15

Leu Gly

<210>24

<211>18

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>24

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Val

  1               5                  10                 15

Ser Gly

<210>25

<211>18

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>25

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val

  1               5                  10                 15

Ser Gly

<210>26

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>诱变剂

<222>(14)to(18)

<223>HSA天然前导序列的变体

<400>26

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Val

  1               5                  10                 15

Ser Gly

<210>27

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>诱变剂

<222>(14)to(18)

<223>HSA天然前导序列的变体

<400>27

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Gly Val

  1               5                  10                 15

Ser Gly

<210>28

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>诱变剂

<222>(14)to(18)

<223>HSA天然前导序列的变体

<400>28

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val

  1               5                  10                 15

Ser Gly

<210>29

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>诱变剂

<222>(14)to(23)

<223>HSA天然前导序列的变体

<400>29

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val

  1               5                  10                 15

Leu Gly Asp Leu His Lys Ser

             20

<210>30

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成信号肽

<400>30

Met Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu

  1               5                  10                 15

Tr p Ala Pro Ala Arg Gly

              20

<210>31

<211>17

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>31

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn

  1               5                  10                 15

Ala

<210>32

<211>29

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>32

Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly

  1               5                  10                 15

Leu Glu His Thr His Arg Arg Gly Ser Leu Asp Lys Arg

             20                 25

<210>33

<211>23

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>33

Met Lys Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala Gly Val Ser Ala

  1               5                  10                 15

Ser Val Ile Asn Tyr Lys Arg

             20

<210>34

<211>65

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>34

Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Phe Ala

  1               5                  10                 15

Ser Gln Val Leu Gly Gln Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Gln Thr Thr

             20                 25                 30

Ser Val Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ala Phe Ala Thr Gln

         35                 40                 45

Thr Asn Ser Gly Gly Leu Asp Val Val Gly Leu Ile Ser Met Ala Lys

     50                 55                 60

Arg

65

<210>35

<211>70

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>35

Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Phe AIa

  1               5                  10                 15

Ser Gln Val Leu Gly Gln Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Gln Thr Thr

             20                 25                 30

Ser Val Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ala Phe Ala Thr Gln

         35                 40                 45

Thr Asn Ser Gly Gly Leu Asp Val Val Gly Leu Ile Ser Met Ala Glu

     50                 55                 60

Glu Gly Glu Pro Lys Arg

 65                 70

<210>36

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在pPPC0006中生成XhoI和ClaI位点的引物

<400>36

gcctcgagaa aagagatgca cacaagagtg aggttgctca tcgatttaaa gatttggg    58

<210>37

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在pPPC0006中生成XhoI和ClaI位点的引物

<400>37

aatcgatgag caacctcact cttgtgtgca tctcttttct cgaggctcct ggaataagc  59

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在pPPC0006中生成XhoI和ClaI位点的引物

<400>38

tacaaactta agagtccaat tagc                                        24

<210>39

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在pPPC0006中生成XhoI和ClaI位点的引物

<400>39

cacttctcta gagtggtttc atatgtctt                                   29

<210>40

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Misc_Structure

<223>用于在pPPC0007中改变限制性位点的合成寡核苷酸

<400>40

aagctgcctt aggcttataa taaggcgcgc cggccggccg tttaaactaa gcttaattct 60

<210>41

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Misc_Structure

<223>用于在pPPC0007中改变限制性位点的合成寡核苷酸

<400>41

agaattaagc ttagtttaaa cggccggccg gcgcgcctta ttataagcct aaggcagctt 60

<210>42

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>可用于生成清蛋白融合蛋白的正向引物，其中清蛋白模块(moiety)位于治疗性蛋白质的N端

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)

<223>n等于a、t、g或c

<400>42

aagctgcctt aggcttannn nnnnnnnnnn nn                                      32

<210>43

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>可用于生成清蛋白融合蛋白的反向引物，其中清蛋白模块位于治疗性蛋白质的N端

<220>

<221>misc_feature

<222>(37)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(41)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(42)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(43)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(44)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(45)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(46)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(47)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(48)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(49)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(50)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(51)

<223>n等于a、t、g或c

<400>43

gcgcgcgttt aaacggccgg ccggcgcgcc ttattannnn nnnnnnnnnn n            51

<210>44

<211>4

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>44

Leu Asp Lys Arg

  1

<210>45

<211>4

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>45

Leu Glu Lys Arg

  1

<210>46

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>可用于生成清蛋白融合蛋白的正向引物，其中清蛋白模块位于治疗性蛋白质的C端

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(26)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(27)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(28)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(29)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(30)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(31)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(32)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)

<223>n等于a、t、g或c

<400>46

aggagcgtcg acaaaagann nnnnnnnnnn nnn                                  33

<210>47

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>可用于生成清蛋白融合蛋白的反向引物，其中清蛋白模块位于治疗性蛋白质的C端

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(41)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(42)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(43)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(44)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(45)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(46)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(47)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(48)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(49)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(50)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(51)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(52)

<223>n等于a、t、g或c

<400>47

ctttaaatcg atgagcaacc tcactctt gtgtgcatcnnn nnnnnnnnnn nn         52

<210>48

<211>9

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>48

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His

  1               5

<210>49

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)to(11)

<223>Kozak序列

<400>49

ccgccaccat g                                      11

<210>50

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>可用于将治疗性蛋白质插入pC4：HSA载体的正向引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

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<222>(32)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(34)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(37)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(41)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(42)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(43)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(44)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(45)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(46)

<223>n等于a、t、g或c

<400>50

ccgccgctcg aggggtgtgt ttcgtcgann nnnnnnnnnn nnnnnn                  46

<210>51

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>可用于将治疗性蛋白质插入pC4:HSA载体的反向引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(41)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(42)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(43)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(44)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(45)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(46)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(47)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(48)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(49)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(50)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(51)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(52)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(53)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(54)

<223>n等于a、t、g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(55)

<223>n等于a、t、g或c

<400>51

agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnnnnnnnnn nnnnn      55

<210>52

<211>733

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>52

gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg   60

aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga  120

tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg  180

tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg  240

aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact  300

ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg  360

agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc  420

catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct  480

atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga  540

ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg  600

acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc  660

acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc    720

gact ctagag gat                                                      733

<210>53

<211>5

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)

<223>Xaa等于任何二十种天然存在L-氨基酸

<400>53

Trp Ser Xaa Trp Ser

  1               5

<210>54

<211>86

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有在1RF1启动子(Rothman等人，Immunity 1：457-468，1994)中发现的GAS结合位点的4个串联拷贝、与SV40早期启动子互补的18个核苷酸、和Xho I限制性位点的合成序列。

<400>54

gcgcctcgag atttccccga aatctagatt tccccgaaat gatttccccg aaatgatttc    60

cccgaaatat ctgccatctc aattag                                         86

<210>55

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>与SV40启动子互补的合成序列；包含Hind III限制性位点。

<400>55

gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc                                        27

<210>56

<211>271

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Protein_Bind

<223>用于生物学测定法的合成启动子；包含在IRF1启动子中发现的GAS结合位点。

<400>56

ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg   60

aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc  120

gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat  180

ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt  240

ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct t                                 271

<210>57

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>与人基因组EGR-1启动子序列互补的合成引物；包含Xho I限制性位点。

<400>57

gcgctcgagg gat gacagcg atagaacccc gg                                32

<210>58

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>与人基因组EGR-1启动子序列互补的合成引物；包含Hind III限制性位点。

<400>58

gcgaagcttc gcgactcccc ggatccgcct c                                  31

<210>59

<211>12

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>59

ggggactttc cc                                                       12

<210>60

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有NF-KB结合位点(GGGGACTTTCCC)的4个串联拷贝、与SV40早期启动子序列的5’端互补的18个核苷酸、

和Xho 1限制性位点的合成引物。

<400>60

gcggcctcga ggggactttc ccggggactt tccggggact ttccgggact ttccatcctg   60

ccatctcaat tag                                                      73

<210>61

<211>256

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>Protein_Bind

<223>用于生物学测定法的合成启动子；包含在NF-KB结合位点

<400>61

ctcgagggga ctttcccggg gactttccgg ggactttccg ggactttcca tctgccatct     60

caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc    120

cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga    180

ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg    240

cttttgcaaa aagctt                                                    256

<210>62

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并VH正向引物

<400>62

caggtgcagc tggtgcagtc tgg                                            23

<210>63

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并VH正向引物

<400>63

caggtcaact taagggagtc tgg                                            23

<210>64

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并VH正向引物

<400>64

gaggtgcagc tggtggagtc tgg                                            23

<210>65

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并VH正向引物

<400>65

caggtgcagc tgcaggagtc ggg                                      23

<210>66

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并VH正向引物

<400>66

gaggtgcagc tgttgcagtc tgc                                      23

<210>67

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并VH正向引物

<400>67

caggtacagc tgcagcagtc agg                                      23

<210>68

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并JH反向引物

<400>68

tgaggagacg gtgaccaggg tgcc                                     24

<210>69

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并JH反向引物

<400>69

tgaagagacg gtgaccattg tccc                                     24

<210>70

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并JH反向引物

<400>70

tgaggagacg gtgaccaggg ttcc                                     24

<210>71

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VH结构域的简并JH反向引物

<400>71

tgaggagacg gtgaccgtgg tccc                                     24

<210>72

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Vκ正向引物

<400>72

gacatccaga tgacccagtc tcc                                      23

<210>73

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Vκ正向引物

<400>73

gatgttgtga tgactcagtc tcc                                      23

<210>74

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Vκ正向引物

<400>74

gatattgtga tgactcagtc tcc                                      23

<210>75

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Vκ正向引物

<400>75

gaaattgtgt tgacgcagtc tcc                                      23

<210>76

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Vκ正向引物

<400>76

gacatcgtga tgacccagtc tcc                                      23

<210>77

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Vκ正向引物

<400>77

gaaacgacac tcacgcagtc tcc                                      23

<210>78

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Vκ正向引物

<400>78

gaaattgtgc tgactcagtc tcc                                      23

<210>79

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并V_λ正向引物

<400>79

cagtctgtgt tgacgcagcc gcc                                      23

<210>80

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并V_λ正向引物

<400>80

cagtctgccc tgactcagcc tgc                                      23

<210>81

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并V_λ正向引物

<400>81

tcctatgtgc tgactcagcc acc                                      23

<210>82

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并V_λ正向引物

<400>82

tcttctgagc tgactcagga ccc                                      23

<210>83

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并V_λ正向引物

<400>83

cacgttatac tgactcaacc gcc                                      23

<210>84

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并V_λ正向引物

<400>84

caggctgtgc tcactcagcc gtc                                      23

<210>85

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并V_λ正向引物

<400>85

aattttatgc tgactcagcc cca                                      23

<210>86

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Jκ反向引物

<400>86

acgtttgatt tccaccttgg tccc                                      24

<210>87

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Jκ反向引物

<400>87

acgtttgatc tccagcttgg tccc                                      24

<210>88

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Jκ反向引物

<400>88

acgtttgata tccactttgg tccc                                      24

<210>89

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Jκ反向引物

<400>89

acgtttgatc tccaccttgg tccc                                      24

<210>90

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并Jκ反向引物

<400>90

acgtttaatc tccagtcgtg tccc                                      24

<210>91

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并J_λ反向引物

<400>91

cagtctgtgt tgacgcagcc gcc                                       23

<210>92

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并J_λ反向引物

<400>92

cagtctgccc tgactcagcc tgc                                       23

<210>93

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并J_λ反向引物

<400>93

tcctatgtgc tgactcagcc acc                                      23

<210>94

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并J_λ反向引物

<400>94

tcttctgagc tgactcagga ccc                                      23

<210>95

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并J_λ反向引物

<400>95

cacgttatac tgactcaacc gcc                                      23

<210>96

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并J_λ反向引物

<400>96

caggctgtgc tcactcagcc gtc                                      23

<210>97

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增人VL结构域的简并J_λ反向引物

<400>97

aattttatgc tgactcagcc cca                                      23

<210>98

<211>5

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>98

Cys Asp Leu Pro Gln

  1               5

<210>99

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(23)

<223>Xaa等于Arg或Lys

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(113)

<223>Xaa等于Ala或Val

<400>99

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Xaa Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu

 65                  70                  75                 80

Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn

            100                 105                 110

Xaa Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg

145                 150                 155                 160

Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>100

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(23)

<223>Xaa等于Arg或Lys

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(113)

<223>Xaa等于Ala或Val

<400>100

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Xaa Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn

            100                 105                 110

Xaa Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg

145                 150                 155                 160

Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>101

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(23)

<223>Xaa等于Arg或Lys

<400>101

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Xaa Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

    50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Met Glu

                85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn

            100                 105                 110

Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu Arg

145                 150                 155                 160

Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>102

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(23)

<223>Xaa等于Arg或Lys

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(97)

<223>Xaa等于Ser或Val

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(98)

<223>Xaa等于Cys或Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(99)

<223>Xaa等于Val或Cys

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(100)

<223>Xaa等于Met或Asp

<400>102

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Xaa Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

         115                 120                 125

Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg

145                 150                 155                 160

Leu Lys Ser Lys Glu

                165

<210>103

<211>167

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(115)

<223>Xaa等于Ala或Val

<400>103

Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln

  1               5                  10                  15

Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu

             20                  25                  30

Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

         35                  40                  45

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

     50                  55                  60

Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu

 65                  70                  75                  80

Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

                 85                  90                  95

Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu

            100                 105                 110

Met Asn Xaa Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile

        115                 120                 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val

    130                 135                 140

Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln

145                 150                 155                 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>104

<211>166

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>104

Met Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu

  1               5                  10                  15

Met Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met

             20                  25                  30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

         35                  40                  45

Phe Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln

     50                  55                  60

Ile Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn

 65                  70                  75                  80

Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

                 85                  90                  95

His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

            100                 105                 110

Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

        115                 120                 125

Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

    130                 135                 140

Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu

145                 150                 155                 160

Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

                 165

<210>105

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成信号肽

<400>105

Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu

  1               5                  10                  15

Trp Ala Pro Ala Arg Gly

             20

<210>106

<211>0

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物(删除)

<400>106

000

<210>107

<211>106

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于全长IFNb扩增的引物，具有BamH I克隆位点

<400>107

gcgcggatcc gaattccgcc gccatgacca acaagtgtct cctccaaatt gctctcctgt 60

tgtgcttctc cactacagct ctttccatga gctacaactt gcttgg                106

<210>108

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于全长IFNb扩增的引物，具有Cla I克隆位点

<400>108

gcgcgcatcg atgagcaacc teactcttgtgt gcatcgttt cggaggtaa cctgt      55

<210>109

<211>41

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>109

cgcgcgcgtc gacaaaagat gtgatctgcc tcaaacccac a                     41

<210>110

<211>59

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>110

gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcttc cttacttctt aaactttct  59

<210>111

<211>21

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>111

Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp

  1               5                  10                  15

Pro Met Val Trp Ala

             20

<210>112

<211>24

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>112

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Gly Ser Leu Asp Lys Arg

             20

<210>113

<211>1497

<212>DNA

<213>红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)

<400>113

tctagagttg tgaagtcggt aatcccgctg tatagtaata cgagtcgcat ctaaatactc 60

cgaagctgct gcgaacccgg agaatcgaga tgtgctggaa agcttctagc gagcggctaa 120

attagcatga aaggctatga gaaattctgg agacggcttg ttgaatcatg gcgttccatt 180

cttcgacaag caaagcgttc cgtcgcagta gcaggcactc attcccgaaa aaactcggag 240

attcctaagt agcgatggaa ccggaataat ataataggca atacattgag ttgcctcgac 300

ggttgcaatg caggggtact gagcttggac ataactgttc cgtaccccac ctcttctcaa 360

cctttggcgt ttccctgatt cagcgtaccc gtacaagtcg taatcactat taacccagac 420

tgaccggacg tgttttgccc ttcatttgga gaaataatgt cattgcgatg tgtaatttgc 480

ctgcttgacc gactggggct gttcgaagcc cgaatgtagg attgttatcc gaactctgct 540

cgtagaggca tgttgtgaat ctgtgtcggg caggacacgc ctcgaaggtt cacggcaagg 600

gaaaccaccg atagcagtgt ctagtagcaa cctgtaaagc cgcaatgcag catcactgga 660

aaatacaaac caatggctaa aagtacataa gttaatgcct aaagaagtca tataccagcg 720

gctaataatt gtacaatcaa gtggctaaac gtaccgtaat ttgccaacgg cttgtggggt 780

tgcagaagca acggcaaagc cccacttccc cacgtttgtt tcttcactca gtccaatctc 840

agctggtgat cccccaattg ggtcgcttgt ttgttccggt gaagtgaaag aagacagagg 900

taagaatgtc tgactcggag cgttttgcat acaaccaagg gcagtgatgg aagacagtga 960

aatgttgaca ttcaaggagt atttagccag ggatgcttga gtgtatcgtg taaggaggtt 1020

tgtctgccga tacgacgaat actgtatagt cacttctggt gaagtggtcc atattgaaat 1080

gtaagtcggc actgaacagg caaaagattg agttgaaact gcctaagatc tcgggccctc 1140

gggccttcgg cctttgggtg tacatgtttg tgctccgggc aaatgcaaag tgtggtagga 1200

tcgaacacac tgctgccttt accaagcagc tgagggtatg tgataggcaa atgttcaggg 1260

gccactgcat ggtttcgaat agaaagagaa gcttagccaa gaacaatagc cgataaagat 1320

agcctcatta aacggaatga gctagtaggc aaagtcagcg aatgtgtata tataaaggtt 1380

cgaggtccgt gcctccctca tgctctcccc atctactcat caactcagat cctccaggag 1440

acttgtacac catcttttga ggcacagaaa cccaatagtc aaccgcggac tggcatc    1497

<210>114

<211>366

<212>DNA

<213>构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400>114

agatctggtt cctgagtaca tctaccgatg cgcctcgatc cccctcttag ccgcatgaga 60

ttcctaccat ttatgtccta tcgttcaggg tcctatttgg accgctagaa atagactctg 120

ctcgatttgt ttccattatt cacgcaatta cgatagtatt tggctctttt cgtttggccc 180

aggtcaattc gggtaagacg cgatcacgcc attgtggccg ccggcgttgt gctgctgcta 240

ttccccgcat ataaacaacc cctccaccag ttcgttgggc tttgcgaatg ctgtactcta 300

tttcaagttg tcaaaagaga ggattcaaaa aattataccc cagatatcaa agatatcaaa 360

gccatc                                                            366

<210>115

<211>1646

<212>DNA

<213>红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)

<400>115

tctagagttg tgaagtcggt aatcccgctg tatagtaata cgagtcgcat ctaaatactc 60

cgaagctgct gcgaacccgg agaatcgaga tgtgctggaa agcttctagc gagcggctaa 120

attagcatga aaggctatga gaaattctgg agacggcttg ttgaatcatg gcgttccatt 180

cttcgacaag caaagcgttc cgtcgcagta gcaggcactc attcccgaaa aaactcggag 240

attcctaagt agcgatggaa ccggaataat ataataggca atacattgag ttgcctcgac 300

ggttgcaatg caggggtact gagcttggac ataactgttc cgtaccccac ctcttctcaa 360

cctttggcgt ttccctgatt cagcgtaccc gtacaagtcg taatcactat taacccagac 420

tgaccggacg tgttttgccc ttcatttgga gaaataatgt cattgcgatg tgtaatttgc 480

ctgcttgacc gactggggct gttcgaagcc cgaatgtagg attgttatcc gaactctgct 540

cgtagaggca tgttgtgaat ctgtgtcggg caggacacgc ctcgaaggtt cacggcaagg 600

gaaaccaccg atagcagtgt ctagtagcaa cctgtaaagc cgcaatgcag catcactgga 660

aaatacaaac caatggctaa aagtacataa gttaatgcct aaagaagtca tataccagcg 720

gctaataatt gtacaatcaa gtggctaaac gtaccgtaat ttgccaacgg cttgtggggt 780

tgcagaagca acggcaaagc cccacttccc cacgtttgtt tcttcactca gtccaatctc 840

agctggtgat cccccaattg ggtcgcttgt ttgttccggt gaagtgaaag aagacagagg 900

taagaatgtc tgactcggag cgttttgcat acaaccaagg gcagtgatgg aagacagtga 960

aatgttgaca ttcaaggagt atttagccag ggatgcttga gtgtatcgtg taaggaggtt 1020

tgtctgccga tacgacgaat actgtatagt cacttctggt gaagtggtcc atattgaaat 1080

gtaagtcggc actgaacagg caaaagattg agttgaaact gcctaagatc tcgggccctc 1140

gggccttcgg cctttgggtg tacatgtttg tgctccgggc aaatgcaaag tgtggtagga 1200

tcgaacacac tgctgccttt accaagcagc tgagggtatg tgataggcaa atgttcaggg 1260

gccactgcat ggtttcgaat agaaagagaa gcttagcctg cagcctctta tcgagaaaga 1320

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1380

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1440

cttagccaag aacaatagcc gataaagata gcctcattaa acggaatgag ctagtaggca 1500

aagtcagcga atgtgtatat ataaaggttc gaggtccgtg cctccctcat gctctcccca 1560

tctactcatc aactcagatc ctccaggaga cttgtacacc atcttttgag gcacagaaac 1620

ccaatagtca accgcggact ggcatc                                      1646

<210>116

<211>516

<212>DNA

<213>构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400>116

agatctggtt cctgagtaca tctaccgatg cgcctcgatc cccctcttag ccgcatgaga 60

ttcctaccat ttatgtccta tcgttcaggg tcctatttgg accgctagaa atagactctg 120

ctcgatttgt ttccattatt cacgcaatta cgatagtatt tggctctttt cgtttggccc 180

aggtcaattc gggtaagacg cgatcacgcc attgtggccg ccggcgctgc agcctcttat 240

cgagaaagaa attaccgtcg ctcgtgattt gtttgcaaaa agaacaaaac tgaaaaaacc 300

cagacacgct cgacttcctg tcttcctatt gattgcagct tccaatttcg tcacacaaca 360

aggtcctacg ccggcgttgt gctgctgcta ttccccgcat ataaacaacc cctccaccag 420

ttcgttgggc tttgcgaatg ctgtactcta tttcaagttg tcaaaagaga ggattcaaaa 480

aattataccc cagatatcaa agatatcaaa gccatc                           516

<210>117

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>117

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaa                                                  495

<210>118

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>118

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaa                                                  495

<210>119

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>119

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaa                                                  495

<210>120

<211>498

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>120

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaataa                                                  498

<210>121

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>121

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaa                                                     495

<210>122

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>122

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaa                                                     495

<210>123

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>123

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaa                                                     495

<210>124

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>124

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaa                                                     495

<210>125

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>125

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaa                                                     495

<210>126

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>126

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaa                                                  495

<210>127

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>127

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaa                                                  495

<210>128

<211>767

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>128

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn

  1               5                  10                  15

Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

             20                  25                  30

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu

         35                  40                  45

Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr

     50                  55                  60

Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp

 65                  70                  75                  80

Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr

                 85                  90                  95

Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu

            100                 105                 110

Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn

        115                 120                 125

Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe

    130                 135                 140

His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala

145                 150                 155                 160

Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys

                165                 170                 175

Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala

            180                 185                 190

Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala

        195                 200                 205

Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly

    210                 215                 220

Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe

225                 230                 235                 240

Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr

                245                 250                 255

Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

            260                 265                 270

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile

        275                 280                 285

Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser

    290                 295                 300

His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro

305                 310                 315                 320

Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr

                325                 330                 335

Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala

            340                 345                 350

Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys

        355                 360                 365

Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His

    370                 375                 380

Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu

385                 390                 395                 400

Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly

                405                 410                 415

Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val

            420                 425                 430

Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly

        435                 440                 445

Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro

    450                 455                 460

Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu

465                 470                 475                 480

His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu

                485                 490                 495

Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

            500                 505                 510

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala

        515                 520                 525

Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr

    530                 535                 540

Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln

545                 550                 555                 560

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys

                565                 570                 575

Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu

            580                 585                 590

Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr

        595                 600                 605

His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg

    610                 615                 620

Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe

625                 630                 635                 640

Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro

                645                 650                 655

Val Leu His Glu Met lle Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys

            660                 665                 670

Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr

        675                 680                 685

Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly

     690                 695                 700

Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala

705                 710                 715                 720

Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys

                725                 730                 735

Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

            740                 745                 750

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu

        755                 760                 765

<210>129

<211>769

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>129

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Cly Phe Ala Ala Lys

  1               5                  10                  15

Ile Ser Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp

             20                  25                  30

Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln

         35                  40                  45

Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

     50                  55                  60

Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn

 65                  70                  75                  80

Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val

                85                  90                  95

Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys

            100                 105                 110

Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn

        115                 120                 125

Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr

    130                 135                 140

Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu

145                 150                 155                 160

Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe

                165                 170                 175

Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp

            180                 185                 190

Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly

        195                 200                 205

Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys

    210                 215                 220

Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln

225                 230                 235                 240

Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp

                245                 250                 255

Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys

            260                 265                 270

Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp

        275                 280                 285

Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

    290                 295                 300

Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp

305                 310                 315                 320

Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys

                325                 330                 335

Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu

            340                 345                 350

Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu

        355                 360                 365

Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp

    370                 375                 380

Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val

385                 390                 395                 400

Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln

                405                 410                 415

Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys

            420                 425                 430

Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn

        435                 440                 445

Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg

    450                 455                 460

Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys

465                 470                 475                 480

Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys

                485                 490                 495

Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val

            500                 505                 510

Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe

        515                 520                 525

His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

    530                 535                 540

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys

545                 550                 555                 560

Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys

                565                 570                 575

Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys

            580                 585                 590

Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Cys Asp Leu Pro

        595                 600                 605

Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln

    610                 615                 620

Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe

625                 630                 635                 640

Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr

                645                 650                 655

Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser

            660                 665                 670

Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe

        675                 680                 685

Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile

    690                 695                 700

Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile

705                 710                 715                 720

Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu

                725                 730                 735

Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met

            740                 745                 750

Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys

        755                 760                 765

Glu

<210>130

<211>779

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>130

Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly

  1               5                  10                  15

Leu Glu His Thr His Arg Arg Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His

             20                  25                  30

Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe

         35                  40                  45

Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro

     50                  55                  60

Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys

 65                  70                  75                  80

Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His

                 85                  90                  95

Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr

            100                 105                 110

Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn

        115                 120                 125

Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu

    130                 135                 140

Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu

145                 150                 155                 160

Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro

                165                 170                 175

Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala

            180                 185                 190

Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu

        195                 200                 205

Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

    210                 215                 220

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe

225                 230                 235                 240

Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu

                245                 250                 255

Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr

            260                 265                 270

Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp

        275                 280                 285

Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu

    290                 295                 300

Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala

305                 310                 315                 320

Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala

                325                 330                 335

Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys

            340                 345                 350

Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro

        355                 360                 365

Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr

    370                 375                 380

Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala

385                 390                 395                 400

Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu

                405                 410                 415

Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe

            420                 425                 430

Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser

        435                 440                 445

Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

    450                 455                 460

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp

465                 470                 475                 480

Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr

                485                 490                 495

Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn

            500                 505                 510

Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro

        515                 520                 525

Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr

    530                 535                 540

Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu

545                 550                 555                 560

Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val

                565                 570                 575

Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp

            580                 585                 590

Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser

        595                 600                 605

Gln Ala Ala Leu Gly Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly

    610                 615                 620

Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu

625                 630                 635                 640

Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu

                645                 650                 655

Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu

            660                 665                 670

Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala

        675                 680                 685

Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

    690                 695                 700

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr

70                 5710                 715                 720

Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr

                725                 730                 735

Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys

            740                 745                 750

Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser

        755                 760                 765

Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770                 775

<210>131

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>131

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser

             20                  25                  30

Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile

         35                  40                  45

Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln

     50                  55                  60

Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu

65                  70                  75                  80

His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser

                 85                  90                  95

Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu

            100                 105                 110

Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly

        115                 120                 125

Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

    130                 135                 140

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser

145                 150                 155                 160

Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser

                165                 170                 175

Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Asp Ala His

            180                 185                 190

Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro

    210                 215                 220

Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys

225                 230                 235                 240

Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His

                245                 250                 255

Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr

            260                 265                 270

Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn

        275                 280                 285

Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu

    290                 295                 300

Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu

305                 310                 315                 320

Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro

                325                 330                 335

Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala

            340                 345                 350

Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu

        355                 360                 365

Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

    370                 375                 380

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe

385                 390                 395                 400

Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu

                405                 410                 415

Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr

            420                 425                 430

Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp

        435                 440                 445

Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu

    450                 455                 460

Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala

465                 470                 475                 480

Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala

                485                 490                 495

Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys

            500                 505                 510

Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro

        515                 520                 525

Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr

    530                 535                 540

Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala

545                 550                 555                 560

Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu

                565                 570                 575

Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe

            580                 585                 590

Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser

        595                 600                 605

Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

    610                 615                 620

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp

625                 630                 635                 640

Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr

                645                 650                 655

Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn

            660                 665                 670

Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro

        675                 680                 685

Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr

    690                 695                 700

Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln lle Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu

705                 710                 715                 720

Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val

                725                 730                 735

Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp

            740                 745                 750

Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser

        755                 760                 765

Gln Ala Ala Leu Gly Leu

    770

<210>132

<211>769

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>132

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys

  1               5                  10                  15

Ile Ser Ala Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg

             20                  25                  30

Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys

         35                  40                  45

Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn

     50                  55                  60

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln

 65                  70                  75                  80

Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp

                 85                  90                  95

Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn

            100                 105                 110

Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro

        115                 120                 125

Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg

    130                 135                 140

Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu

145                 150                 155                 160

Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu

                165                 170                 175

Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

            180                 185                 190

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

        195                 200                 205

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

    210                 215                 220

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

225                 230                 235                 240

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                245                 250                 255

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            260                 265                 270

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        275                 280                 285

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    290                 295                 300

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

305                 310                 315                 320

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                325                 330                 335

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            340                 345                 350

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        355                 360                 365

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    370                 375                 380

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

385                 390                 395                 400

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                405                 410                 415

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            420                 425                 430

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        435                 440                 445

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    450                 455                 460

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

465                 470                 475                 480

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                485                 490                 495

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            500                 505                 510

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        515                 520                 525

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    530                 535                 540

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

545                 550                 555                 560

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                565                 570                 575

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            580                 585                 590

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        595                 600                 605

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    610                 615                 620

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

625                 630                 635                 640

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                645                 650                 655

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            660                 665                 670

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        675                 680                 685

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    690                 695                 700

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

705                 710                 715                 720

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                725                 730                 735

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            740                 745                 750

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        755                 760                 765

Leu

<210>133

<211>835

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>133

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

  1               5                  10                  15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

             20                  25                  30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

         35                  40                  45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

     50                  55                  60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65                  70                  75                  80

Ser Leu Asp Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser

                 85                  90                  95

Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe

            100                 105                 110

Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe

        115                 120                 125

Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met

    130                 135                 140

Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

145                 150                 155                 160

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln

                165                 170                 175

Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu

            180                 185                 190

Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe

        195                 200                 205

Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala

    210                 215                 220

Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr

225                 230                 235                 240

Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Asp Ala His Lys Ser Glu

                245                 250                 255

Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu

            260                 265                 270

Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp

        275                 280                 285

His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val

    290                 295                 300

Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe

305                 310                 315                 320

Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu

                325                 330                 335

Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe

            340                 345                 350

Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro

        355                 360                 365

Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe

    370                 375                 380

Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

385                 390                 395                 400

Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr

                405                 410                 415

Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu

            420                 425                 430

Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu

        435                 440                 445

Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp

    450                 455                 460

Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu

465                 470                 475                 480

Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys

                485                 490                 495

His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys

            500                 505                 510

Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys

        515                 520                 525

Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu

    530                 535                 540

Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val

545                 550                 555                 560

Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe

                565                 570                 575

Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser

            580                 585                 590

Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu

        595                 600                 605

Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe

    610                 615                 620

Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

625                 630                 635                 640

Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala

                645                 650                 655

Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr

            660                 665                 670

Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys

        675                 680                 685

Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser

    690                 695                 700

Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser

705                 710                 715                 720

Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro

                725                 730                 735

Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe

            740                 745                 750

Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu

        755                 760                 765

Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys

    770                 775                 780

His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp

785                 790                 795                 800

Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr

                805                 810                 815

Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala

            820                 825                 830

Leu Gly Leu

        835

<210>134

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>134

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

                645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

            660                 665                 670

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>135

<211>773

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>135

Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys

  1               5                  10                  15

Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu

             20                  25                  30

Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser

         35                  40                  45

Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu

     50                  55                  60

Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His

65                  70                  75                  80

Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser

                85                  90                  95

Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr

            100                 105                 110

Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

        115                 120                 125

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys

    130                 135                 140

Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro

145                 150                 155                 160

Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu

                165                 170                 175

Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Asp Ala His Lys

            180                 185                 190

Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys

        195                 200                 205

Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe

    210                 215                 220

Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr

225                 230                 235                 240

Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr

                245                 250                 255

Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr

            260                 265                 270

Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu

        275                 280                 285

Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val

    290                 295                 300

Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu

305                 310                 315                 320

Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr

                325                 330                 335

Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala

            340                 345                 350

Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

        355                 360                 365

Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln

    370                 375                 380

Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys

385                 390                 395                 400

Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe

                405                 410                 415

Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu

            420                 425                 430

Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu

        435                 440                 445

Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys

    450                 455                 460

Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu

465                 470                 475                 480

Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp

                485                 490                 495

Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp

            500                 505                 510

Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp

        515                 520                 525

Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr

    530                 535                 540

Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys

545                 550                 555                 560

Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile

                565                 570                 575

Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln

            580                 585                 590

Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

        595                 600                 605

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys

    610                 615                 620

Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr

625                 630                 635                 640

Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro

                645                 650                 655

Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg

            660                 665                 670

Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys

        675                 680                 685

Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu

    690                 695                 700

Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu

705                 710                 715                 720

Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met

                725                 730                 735

Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys

            740                 745                 750

Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln

        755                 760                 765

Ala Ala Leu Gly Leu

    770

<210>136

<211>769

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>136

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys

  1               5                  10                  15

Ile Ser Ala Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg

             20                  25                  30

Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys

         35                  40                  45

Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn

     50                  55                  60

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln

 65                  70                  75                  80

Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp

                 85                  90                  95

Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn

            100                 105                 110

Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro

        115                 120                 125

Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg

    130                 135                 140

Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu

145                 150                 155                 160

Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu

                165                 170                 175

Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

            180                 185                 190

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

        195                 200                 205

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

    210                 215                 220

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

225                 230                 235                 240

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                245                 250                 255

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            260                 265                 270

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        275                 280                 285

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    290                 295                 300

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

305                 310                 315                 320

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                325                 330                 335

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            340                 345                 350

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        355                 360                 365

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    370                 375                 380

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

385                 390                 395                 400

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                405                 410                 415

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            420                 425                 430

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        435                 440                 445

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    450                 455                 460

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

465                 470                 475                 480

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                485                 490                 495

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            500                 505                 510

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        515                 520                 525

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

     530                 535                 540

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

545                 550                 555                 560

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                565                 570                 575

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            580                 585                 590

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        595                 600                 605

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    610                 615                 620

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

625                 630                 635                 640

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                645                 650                 655

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            660                 665                 670

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        675                 680                 685

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    690                 695                 700

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

705                 710                 715                 720

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                725                 730                 735

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            740                 745                 750

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        755                 760                 765

Leu

<210>137

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>137

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lvs Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

                660                 665                 670

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>138

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>138

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

                645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

            660                 665                 670

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>139

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>139

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>140

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>140

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>141

<211>165

<212>PRT

<213>类(Homo sapiens)

<400>141

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>142

<211>165

<212>PRT

<213>类(Homo sapiens)

<400>142

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr A sn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>143

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>143

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

115                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>144

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>144

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>145

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>145

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>146

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>146

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>147

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>147

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>148

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>148

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>149

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>149

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>150

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>150

catacaaact taagagtcca                                              20

<210>151

<211>56

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>151

ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcagc gttagccaaa gaagca      56

<210>152

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>152

catacaaact  taagagtcca                                             20

<210>153

<211>56

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>153

ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctgc cgatattttg gctgca      56

<210>154

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>154

catacaaact taagagtcca                                              20

<210>155

<211>56

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>155

ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctct cttatccaaa gaacct      56

<210>156

<211>41

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>156

cgcgcgcgtc gacaaaagat gtgatctgcc tcaaacccac a                      41

<210>157

<211>59

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>157

gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcttc cttacttctt aaactttct   59

<210>158

<211>27

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>158

gttagcagag tagcagggct ttcggct                                      27

<210>159

<211>59

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>159

gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcttc cttacttctt aaactttct  59

<210>160

<211>41

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>160

cgcgcgcgtc gacaaaagat gtgatctgcc tcaaacccac a                     41

<210>161

<211>59

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>161

gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcttc cttacttctt aaactttct    59

<210>162

<211>38

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>162

caagctgcct taggcttatg tgatctgcct caaaccca                           38

<210>163

<211>39

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>163

gaattcggcg cgccttattc cttacttctt aaactttct                          39

<210>164

<211>107

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>164

gcgcgcggat ccgccaccat ggccttgacc tttgctttac tggtggccct cctggtgctc   60

agctgcaagt caagctgctc tgtgggctgt gatctgcctc aaaccca                107

<210>165

<211>59

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>165

gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcttc cttacttctt aaactttct    59

<210>166

<211>25

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>166

gcatgtgatc tgcctcaaac ccaca                                         25

<210>167

<211>59

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>167

gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcttc cttacttctt aaactttct    59

<210>168

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>168

catacaaact taagagtcca                                              20

<210>169

<211>67

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>169

ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctct cttatccaaa gaaccggaat  60

aagccga                                                            67

<210>170

<211>495

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>170

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag     60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaa                                                     495

<210>171

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>171

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

    515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

                645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

            660                 665                 670

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>172

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>172

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>173

<211>21

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>173

agaagtgctg caaggctgac g                                      21

<210>174

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>174

acctgaccta caggaaagag                                        20

<210>175

<211>501

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>175

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaataata a                                           501

<210>176

<211>501

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>176

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacacrga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaataata a                                           501

<210>177

<211>501

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>177

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaataata a                                           501

<210>178

<211>501

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>178

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctcrctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaataata a                                           501

<210>179

<211>501

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>179

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctggcacag 60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480

ttaagaagta aggaataata a                                           501

<210>180

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>180

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Ser Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

                645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

            660                 665                 670

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>181

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>181

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Ash Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Ser Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

                645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

            660                 665                 670

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>182

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>182

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                245                 250                 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

            260                 265                 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

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Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

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Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Ser Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

                645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

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Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>183

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>183

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

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His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

         35                  40                  45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                  55                  60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

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Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

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Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

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His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

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Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

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Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

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Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

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Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

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Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

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Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

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Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

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Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

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Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

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Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

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Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

                645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

            660                 665                 670

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Ser Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>184

<211>774

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>184

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

             20                  25                  30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

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Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

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Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                 85                  90                  95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

            100                 105                 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

        115                 120                 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

    130                 135                 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                 150                 155                 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

            180                 185                 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                 215                 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                 230                 235                 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

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Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

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Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                 295                 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                325                 330                 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

            340                 345                 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

        355                 360                 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                 390                 395                 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                405                 410                 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

            420                 425                 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

        435                 440                 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                 455                 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                 470                 475                 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                485                 490                 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

        515                 520                 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                 550                 555                 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                565                 570                 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

    610                 615                 620

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

625                 630                 635                 640

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

                645                 650                 655

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

            660                 665                 670

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

        675                 680                 685

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

    690                 695                 700

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

705                 710                 715                 720

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

                725                 730                 735

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Ser Ala Trp Glu Val Val

            740                 745                 750

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

        755                 760                 765

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

    770

<210>185

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>185

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>186

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>186

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Gl u Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>187

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>187

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>188

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>188

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

<210>189

<211>165

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>189

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

             20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

         35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

     50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                 85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

Claims (222)

1.一种清蛋白融合蛋白，其包括选自以下的成员：

(a)治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体，和清蛋白或其清蛋白片段或变体；

(b)治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体，和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述清蛋白或其清蛋白片段或变体包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(c)(a)或(b)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述治疗性X的片段或变体具有治疗性蛋白X的生物学活性，且其中所述其清蛋白片段或变体具有清蛋白活性；

(d)(c)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述清蛋白活性是相比于未融合状态的治疗性蛋白X的贮存期限延长治疗性蛋白X的贮存期限的能力；

(e)(c)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述清蛋白活性是相比于未融合状态的治疗性蛋白X的血清半衰期延长治疗性蛋白X的血清半衰期的能力；

(f)(a)-(e)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述清蛋白片段或变体包括SEQ ID NO：1的第1-387氨基酸的氨基酸序列；

(g)(a)至(f)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体融合于清蛋白的N-末端，或融合于所述其清蛋白片段或变体的N-末端；

(h)(a)至(f)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体融合于清蛋白的C-末端，或融合于所述其清蛋白片段或变体的C-末端；

(i)(a)至(f)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体融合于清蛋白的N-末端和C-末端，或融合于所述其清蛋白片段或变体的N-末端和C-末端；

(j)(a)至(f)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其包括第一治疗性蛋白X或其片段或变体和第二治疗性蛋白X或其片段或变体，其中所述第一治疗性蛋白X或其片段或变体不同于所述第二治疗性蛋白X或其片段或变体；

(k)(a)至(j)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体通过接头与所述清蛋白或所述其清蛋白片段或变体分开；

(l)(a)至(k)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白具有下式：

R1-L-R2；R2-L-R1；或R1-L-R2-L-R1，

且进一步地，其中R1是治疗性蛋白：X、或其片段或变体，L是肽接头，且R2是包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的清蛋白或清蛋白的片段或变体；

(m)(a)至(l)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白的贮存期限大于未融合状态的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的贮存期限；

(n)(a)至(l)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白的血清半衰期大于未融合状态的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的血清半衰期；

(o)(a)至(l)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的体外生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的体外生物学活性；和

(p)(a)至(l)的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体和清蛋白或其清蛋白片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的体内生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的体内生物学活性。

2.根据权利要求1所述的清蛋白融合蛋白，其在宿主细胞中表达，其中所述宿主细胞是酵母细胞、哺乳动物细胞或细菌细胞。

3.根据权利要求1所述的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白进一步包括分泌前导序列。

4.一种组合物，其包括权利要求1所述的清蛋白融合蛋白和药学上可接受的载体。

5.一种药盒，其包括权利要求4所述的组合物。

6.一种治疗患者的疾病、疾患或感染的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求1所述清蛋白融合蛋白的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述疾病、疾患或感染包括适应症Y。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述疾病、疾患或感染选自慢性肝炎感染；乙型肝炎感染；慢性乙型肝炎感染；丙型肝炎感染；慢性丙型肝炎感染；丁型肝炎感染；慢性丁型肝炎感染；人类乳头瘤病毒感染；单纯疱疹病毒感染；外部尖锐湿疣；HIV感染；肿瘤；癌症；实体瘤；黑素瘤；恶性黑素瘤；肾癌；肺癌；结肠癌；乳腺癌；肝癌；前列腺癌；膀胱癌；胃癌；肉瘤；AIDS相关的卡波西氏肉瘤；淋巴瘤；T细胞淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；非何杰金氏淋巴瘤；脑癌；神经胶质瘤；多形性成胶质细胞瘤；宫颈非典型增生；白血病；白血病前期；骨髓病；骨病；毛细胞性白血病；慢性髓细胞性白血病；血液恶性肿瘤；血液病；多发性骨髓瘤；细菌感染；化学保护；血小板减少症；多发性硬化；肺纤维化；与年龄相关的黄斑退行性改变；黄斑变性；克罗恩氏病；神经障碍；关节炎；类风湿性关节炎；溃疡性结肠炎；骨质疏松症、骨质减少、破骨细胞生成；纤维肌痛；斯耶格伦氏综合征；慢性疲劳综合征；发热；出血热；病毒性出血热；高血糖症；糖尿病；尿崩症；糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；胰岛素抵抗；胰岛素缺乏；高脂血症；高酮血症；非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)；胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)；严重急性呼吸器官综合征(SARS)或美国疾病控制中心鉴定的A、B或C类因子引起的感染，或其任何组合。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述疾病或疾患是丙型肝炎或乙型肝炎感染。

10.根据权利要求7至9任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患是丙型肝炎或HIV感染。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白由包括清蛋白融合构建体的宿主细胞表达，所述清蛋白融合构建体选自：

(a)构建体ID 2249；

(b)构建体ID 2343；

(c)构建体ID 2366；

(d)构建体ID 2381；

(e)构建体ID 2382；

(f)构建体ID 2410；

(g)构建体ID 3165；

(h)构建体ID 3422；

(i)构建体ID 3423；

(j)构建体ID 3424；

(k)构建体ID 3476；

(l)构建体ID 3960；

(m)构建体ID 4290；

(n)构建体ID 4291；

(o)构建体ID 4292；

(p)构建体ID 4295；和

(q)构建体ID 4296。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述清蛋白融合构建体是(d)。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述清蛋白融合构建体是(g)。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述清蛋白融合构建体是(l)。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述患者患有丙型肝炎感染且所述患者是初次治疗的或经历过治疗的。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述患者是经历过治疗的且是无应答者。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述无应答者之前失败于包括聚乙二醇化的干扰素α和利巴韦林的至少一次联合治疗方案。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述丙型肝炎感染是基因型1或基因型2/3。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白的所述治疗有效量选自：

(a)约600μg/剂；

(b)约900μg/剂；

(c)约1000μg/剂；

(d)约1200μg/剂；

(e)约1800μg/剂；

(f)约2000μg/剂；和

(g)约2400μg/剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中根据选自以下的给药计划给药所述清蛋白融合蛋白：

(a)每周一次；

(b)每两周一次；

(b)每三周一次；

(c)每四周一次；和

(d)每五周一次。

21.根据权利要求19所述的方法，其中根据包括每两周一次和每四周一次的组合的给药计划给药所述清蛋白融合蛋白。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白给药计划包括前四周每两周一次、随后每四周一次施用所述清蛋白融合蛋白。

23.根据权利要求20至22任一项所述的方法，其中所述给药计划持续24至48周。

24.根据权利要求15至23任一项所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

27.根据权利要求24所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与二种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

29.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型1，(3)所述治疗有效量是约900μg/剂至约1800μg/剂，且(4)每两周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；和

(c)约1800μg/剂。

31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

36.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型1，(3)所述治疗有效量是约900μg/剂至约1800μg/剂，且(4)每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；和

(c)约1800μg/剂。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

41.根据权利要求38所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

42.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

43.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型1，(3)所述治疗有效量是约900μg/剂至约1800μg/剂，且(4)在治疗的前四周每两周一次、随后每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白施用于所述患者持续共24至48周。

45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；和

(c)约1800μg/剂。

46.根据权利要求43至45任一项所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

49.根据权利要求46所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

51.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型1，(3)所述治疗有效量是约1200μg/剂至约1800μg/剂，且(4)每两周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

54.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

55.根据权利要求52所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

57.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型1，(3)所述治疗有效量是约1200μg/剂至约1800μg/剂，且(4)每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

60.根据权利要求58所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

61.根据权利要求58所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

63.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型1，(3)所述治疗有效量是约1200μg/剂至约1800μg/剂，且(4)在治疗的前四周每两周一次、随后每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者，持续24至48周。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白施用于所述患者持续共24至48周。

65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

67.根据权利要求65所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

68.根据权利要求65所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

69.根据权利要求69所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

70.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(3)所述治疗有效量是约900μg/剂至约1800μg/剂，且(4)每两周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；和

(c)约1800μg/剂。

72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

74.根据权利要求72所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

75.根据权利要求72所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

77.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(3)所述治疗有效量是约900μg/剂至约1800μg/剂，且(4)每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；和

(c)约1800μg/剂。

79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

81.根据权利要求79所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

82.根据权利要求79所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

84.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(3)所述治疗有效量是约900μg/剂至约1800μg/剂，且(4)在治疗的前四周每两周一次、随后每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

85.根据权利要求84所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白施用于所述患者持续共24至48周。

86.根据权利要求84或85所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；和

(c)约1800μg/剂。

87.根据权利要求84至86任一项所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

89.根据权利要求87所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

90.根据权利要求87所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

91.根据权利要求90所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

92.一种治疗患有疾病、疾患或感染的患者的方法，其中所述方法包括：

(a)短时期地向所述患者施用最大剂量的具有可接受的安全性的干扰素；并且

(b)更长时期地向所述患者施用维持剂量的所述干扰素。

93.根据权利要求92所述的方法，其中所述最大剂量选自：

(a)与所述干扰素的标准剂量相同的剂量；

(b)至少为所述干扰素的标准剂量的剂量；

(c)比所述干扰素的标准剂量高1倍的剂量；

(d)比所述干扰素的标准剂量高2倍的剂量；

(e)比所述干扰素的标准剂量高3倍的剂量；

(f)比所述干扰素的标准剂量高4倍的剂量；

(g)比所述干扰素的标准剂量高5倍的剂量；

(d)比所述干扰素的标准剂量高6倍的剂量；

(e)比所述干扰素的标准剂量高7倍的剂量；

(f)比所述干扰素的标准剂量高8倍的剂量；

(g)比所述干扰素的标准剂量高9倍的剂量；和

(h)比所述干扰素的标准剂量高10倍的剂量。

94.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述维持剂量选自：

(a)与所述干扰素的标准剂量相同的剂量；

(b)至少为所述干扰素的标准剂量的剂量；

(c)为最大剂量1/4剂量的剂量；

(d)为最大剂量1/2剂量的剂量；

(e)为最大剂量1/3剂量的剂量；

(f)为最大剂量1/8剂量的剂量；

(g)比最大剂量低1倍的剂量；

(h)比最大剂量低2倍的剂量；

(i)比最大剂量低3倍的剂量；

(j)比最大剂量低4倍的剂量；

(k)比最大剂量低5倍的剂量；和

(l)比最大剂量低6倍的剂量。

95.根据权利要求92至94任一项所述的方法，其中根据选自以下的给药计划施用所述最大剂量和所述维持剂量：

(a)每天一次；

(b)每天两次；

(c)每周一次；

(d)每周两次；

(e)每周三次；

(f)每周一次；

(g)每2周一次；

(h)每3周一次；和

(i)每4周一次。

96.根据权利要求92至95任一项所述的方法，其中所述短时期选自：

(a)一周；

(b)两周；

(c)三周；

(d)四周；

(e)五周；

(f)六周；

(g)七周；和

(h)八周。

97.根据权利要求92至96任一项所述的方法，其中所述更长时期选自：

(a)至少16周；

(b)至少20周；

(c)至少24周；

(d)至少30周；

(e)至少36周；

(f)至少40周；

(g)至少46周；

(h)至少48周；

(i)至少50周；和

(j)至少60周。

98.一种治疗患有疾病、疾患或感染的患者的方法，其中所述方法包括：

(a)短时期地以较频繁的给药计划向所述患者施用有效量的干扰素；并

(b)更长时期地以较不频繁的给药计划向所述患者施用所述干扰素。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述较频繁的给药计划选自：

(a)每天一次；

(b)每天两次；

(c)每周一次；

(d)每周两次；

(e)每周三次；和

(f)每2周一次。

100.根据权利要求98或99所述的方法，其中所述较不频繁的给药计划少于所述较频繁的给药计划并选自：

(a)每周一次；

(b)每周两次；

(c)每2周一次；

(d)每3周一次；和

(e)每4周一次。

101.根据权利要求98至100任一项所述的方法，其中所述短时期选自：

(a)一周；

(b)两周；

(c)三周；

(d)四周；

(e)五周；

(f)六周；

(g)七周；和

(h)八周。

102.根据权利要求98至101任一项所述的方法，其中所述更长时期选自：

(a)至少16周；

(b)至少20周；

(c)至少24周；

(d)至少30周；

(e)至少36周；

(f)至少40周；

(g)至少46周；

(h)至少48周；

(i)至少50周；和

(j)至少60周。

103.一种治疗患有疾病、疾患或感染的患者的方法，其中所述方法包括：

(a)短时期地以较频繁的给药计划向所述患者施用最大剂量的具有可接受的安全性的干扰素；并

(b)更长时期地以较不频繁的给药计划向所述患者施用维持剂量的所述干扰素。

104.根据权利要求103所述的方法，其中所述最大剂量选自：

(a)与所述干扰素的标准剂量相同的剂量；

(b)至少为所述干扰素的标准剂量的剂量；

(c)比所述干扰素的标准剂量高1倍的剂量；

(d)比所述干扰素的标准剂量高2倍的剂量；

(e)比所述干扰素的标准剂量高3倍的剂量；

(f)比所述干扰素的标准剂量高4倍的剂量；

(g)比所述干扰素的标准剂量高5倍的剂量；

(d)比所述干扰素的标准剂量高6倍的剂量；

(e)比所述干扰素的标准剂量高7倍的剂量；

(f)比所述干扰素的标准剂量高8倍的剂量；

(g)比所述干扰素的标准剂量高9倍的剂量；和

(h)比所述干扰素的标准剂量高10倍的剂量。

105.根据权利要求103或104所述的方法，其中所述维持剂量选自：

(a)与所述干扰素的标准剂量相同的剂量；

(b)至少为所述干扰素的标准剂量的剂量；

(c)为最大剂量1/4剂量的剂量；

(d)为最大剂量1/2剂量的剂量；

(e)为最大剂量1/3剂量的剂量；

(f)为最大剂量1/8剂量的剂量；

(g)比最大剂量低1倍的剂量；

(h)比最大剂量低2倍的剂量；

(i)比最大剂量低3倍的剂量；

(j)比最大剂量低4倍的剂量；

(k)比最大剂量低5倍的剂量；和

(l)比最大剂量低6倍的剂量。

106.根据权利要求103至105任一项所述的方法，其中所述较频繁的给药计划选自：

(a)每天一次；

(b)每天两次；

(c)每周一次；

(d)每周两次；

(e)每周三次；和

(f)每2周一次。

107.根据权利要求103至106任一项所述的方法，其中所述较不频繁的给药计划少于所述较频繁的给药计划且选自：

(a)每周一次；

(b)每周两次；

(c)每2周一次；

(d)每3周一次；和

(e)每4周一次。

108.根据权利要求103至107任一项所述的方法，其中所述短时期选自：

(a)一周；

(b)两周；

(c)三周；

(d)四周；

(e)五周；

(f)六周；

(g)七周；和

(h)八周。

109.根据权利要求103至108任一项所述的方法，其中所述更长时期选自：

(a)至少16周；

(b)至少20周；

(c)至少24周；

(d)至少30周；

(e)至少36周；

(f)至少40周；

(g)至少46周；

(h)至少48周；

(i)至少50周；和

(j)至少60周。

110.根据权利要求92至109任一项所述的方法，其中所述疾病、疾患或感染选自慢性肝炎感染；乙型肝炎感染；慢性乙型肝炎感染；丙型肝炎感染；慢性丙型肝炎感染；丁型肝炎感染；慢性丁型肝炎感染；人类乳头瘤病毒感染；单纯疱疹病毒感染；外部尖锐湿疣；HIV；HIV感染；肿瘤；癌症；实体瘤；黑素瘤；恶性黑素瘤；肾癌；肺癌；结肠癌；乳腺癌；肝癌；前列腺癌；膀胱癌；胃癌；肉瘤；AIDS相关的卡波西氏肉瘤；淋巴瘤；T细胞淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；非何杰金氏淋巴瘤；脑癌；神经胶质瘤；多形性成胶质细胞瘤；宫颈非典型增生；白血病；白血病前期；骨髓病；骨病；毛细胞性白血病；慢性髓细胞性白血病；血液恶性肿瘤；血液病；多发性骨髓瘤；细菌感染；化学保护；血小板减少症；多发性硬化；肺纤维化；与年龄相关的黄斑退行性改变；黄斑变性；克罗恩氏病；神经障碍；关节炎；类风湿性关节炎；溃疡性结肠炎；骨质疏松症、骨质减少、破骨细胞生成；纤维肌痛；斯耶格伦氏综合征；慢性疲劳综合征；发热；出血热；病毒性出血热；高血糖症；糖尿病；尿崩症；糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；胰岛素抵抗；胰岛素缺乏；高脂血症；高酮血症；非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)；胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)；严重急性呼吸器官综合征(SARS)和美国疾病控制中心鉴定的A、B或C类因子引起的感染，或其任何组合。

111.根据权利要求110所述的方法，其中所述疾病、疾患或感染是丙型肝炎或乙型肝炎感染。

112.根据权利要求111所述的方法，其中所述疾病或疾患是丙型肝炎或HIV感染。

113.根据权利要求110或111所述的方法，其中所述丙型肝炎是选自以下的基因型：

(a)基因型1；

(b)基因型2；和

(c)基因型3。

114.根据权利要求92至113任一项所述的方法，其中所述干扰素是干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω或其片段。

115.根据权利要求114所述的方法，其中所述干扰素α选自：

(a)干扰素α-2a；

(b)干扰素α-2b；

(c)干扰素α-2c；

(d)共有干扰素；

(c)干扰素alfacon-1；

(d)干扰素α-n1；

(e)干扰素α-n3；和

(f)干扰素α的任何市售可获得形式。

116.根据权利要求115所述的方法，其中所述市售可获得的干扰素α选自：

(a)

A；

(b)

A；

(c)Berofor干扰素α；

(d)OMNIFERON^TM；

(e)MULTIFERON^TM；

(f)

(g)

(h)

和

(i)MAXY-ALPHA^TM。

117.根据权利要求114所述的方法，其中所述干扰素是长效的。

118.根据权利要求117所述的方法，其中所述长效的干扰素选自：

(a)包括与清蛋白或其片段或变体融合的干扰素或其片段或变体的清蛋白融合蛋白；

(b)

(c)干扰素-α-XL；

(d)LOCTERON^TM；

(e)聚乙二醇化的干扰素α-2a；

(f)聚乙二醇化的干扰素α-2b；和

(g)聚乙二醇化的共有干扰素。

119.根据权利要求118所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白由包括清蛋白融合构建体的宿主细胞表达，所述清蛋白融合构建体选自：

(a)构建体ID 2249；

(b)构建体ID 2343；

(c)构建体ID 2366；

(d)构建体ID 2381；

(e)构建体ID 2382；

(f)构建体ID 2410；

(g)构建体ID 3165；

(h)构建体ID 3422；

(i)构建体ID 3423；

(j)构建体ID 3424；

(k)构建体ID 3476；

(l)构建体ID 3960；

(m)构建体ID 4290；

(n)构建体ID 4291；

(o)构建体ID 4292；

(p)构建体ID 4295；和

(q)构建体ID 4296。

120.根据权利要求92至119任一项所述的方法，其中所述干扰素与一种或多种抗病毒剂联合施用。

121.根据权利要求120所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)利巴韦林或利巴韦林类似物；

(b)抗病毒酶抑制剂；

(c)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(e)反义寡核苷酸抑制剂；

(f)thiazolide；

(g)抗病毒抗体；

(h)新型免疫调节剂；

(i)亲环蛋白抑制剂；

(j)保肝剂；和

(k)干扰素增强剂。

122.根据权利要求120或121所述的方法，其中所述抗病毒剂每天施用于所述患者。

123.一种延长治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的贮存期限或血清半衰期的方法，该方法包括将所述治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体融合于清蛋白或其清蛋白片段或变体的步骤，与未融合状态的所述治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的贮存期限或血清半衰期相比所述清蛋白或其清蛋白片段或变体足以延长所述治疗性蛋白X或治疗性X的片段或变体的贮存期限或血清半衰期。

124.一种包括编码权利要求123所述的清蛋白融合蛋白的多核苷酸序列的核酸分子。

125.一种包括权利要求124所述的核酸分子的载体。

126.一种包括权利要求124所述的核酸分子的宿主细胞。

127.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述患者体重至少为75kg，(3)所述丙型肝炎感染是基因型1，所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(4)每两周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

128.根据权利要求127所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

129.根据权利要求127或128所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

130.根据权利要求129所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

131.根据权利要求129所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

132.根据权利要求129所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

133.根据权利要求132所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

134.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述患者体重至少为75kg，(3)所述丙型肝炎感染是基因型1，所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(4)每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

135.根据权利要求134所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

136.根据权利要求134或135所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

137.根据权利要求136所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

138.根据权利要求136所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

139.根据权利要求136所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

140.根据权利要求139所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

141.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述患者体重至少为75kg，(3)所述丙型肝炎感染是基因型1，所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(4)在治疗的前四周每两周一次、随后每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

142.根据权利要求141所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白施用于所述患者持续共24至48周。

143.根据权利要求141或142所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

144.根据权利要求141至143任一项所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

145.根据权利要求144所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

146.根据权利要求144所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

147.根据权利要求144所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

148.根据权利要求147所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

149.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(2)所述患者体重至少为75kg，(3)所述丙型肝炎感染是基因型1，所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(4)每两周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

150.根据权利要求149所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

151.根据权利要求149或150所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

152.根据权利要求151所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

153.根据权利要求151所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

154.根据权利要求151所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

155.根据权利要求154所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

156.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(2)所述患者体重至少为75kg，(3)所述丙型肝炎感染是基因型1，所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(4)每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

157.根据权利要求156所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

158.根据权利要求156或157所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

159.根据权利要求158所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

160.根据权利要求158所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

161.根据权利要求158所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

162.根据权利要求161所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

163.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(2)所述患者体重至少为75kg，(3)所述丙型肝炎感染是基因型1，所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(4)在治疗的前四周每两周一次、随后每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

164.根据权利要求163所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白施用于所述患者持续共24至48周。

165.根据权利要求163或164所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

166.根据权利要求163至165任一项所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

167.根据权利要求169所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

168.根据权利要求166所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

169.根据权利要求166所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

170.根据权利要求169所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

171.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(3)所述患者体重至少为75kg，(4)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(5)所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(4)每两周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

172.根据权利要求171所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

173.根据权利要求171或172所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

174.根据权利要求173所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

175.根据权利要求173所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

176.根据权利要求173所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

177.根据权利要求176所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

178.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(3)所述患者体重至少为75kg，(4)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(5)所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(6)每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

179.根据权利要求178所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

180.根据权利要求178或179所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

181.根据权利要求180所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

182.根据权利要求180所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

183.根据权利要求180所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

184.根据权利要求183所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

185.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(3)所述患者体重至少为75kg，(4)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(5)所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(6)在治疗的前四周每两周一次、随后每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

186.根据权利要求185所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白施用于所述患者持续共24至48周。

187.根据权利要求185或186所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

188.根据权利要求185至187任一项所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

189.根据权利要求188所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

190.根据权利要求188所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

191.根据权利要求188所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

192.根据权利要求191所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

193.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(3)所述患者体重至少为75kg，(4)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(5)所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(6)每两周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

194.根据权利要求193所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

195.根据权利要求193或194所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

196.根据权利要求195所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

197.根据权利要求195所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

198.根据权利要求195所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

199.根据权利要求198所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

200.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(3)所述患者体重至少为75kg，(4)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(5)所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(6)每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

201.根据权利要求200所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

202.根据权利要求200或201所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

203.根据权利要求202所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

204.根据权利要求202所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

205.根据权利要求202所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

206.根据权利要求205所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

207.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α，其中所述成熟干扰素α融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是经历过治疗的，(3)所述患者体重至少为75kg，(4)所述丙型肝炎感染是基因型2或3，(5)所述治疗有效量是约900μg/剂至约2400μg/剂，且(6)在治疗的前四周每两周一次、随后每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者。

208.根据权利要求207所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白施用于所述患者持续共24至48周。

209.根据权利要求207或208所述的方法，其中所述治疗有效量选自：

(a)约900μg/剂；

(b)约1200μg/剂；

(c)约1800μg/剂；

(d)约2100μg/剂；和

(e)约2400μg/剂。

210.根据权利要求207至209任一项所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

211.根据权利要求210所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

212.根据权利要求210所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

213.根据权利要求210所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

214.根据权利要求213所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

215.一种以治疗有效量的清蛋白融合蛋白治疗患有丙型肝炎感染的患者的方法，所述清蛋白融合蛋白包括与成熟清蛋白融合的成熟干扰素α-2b，其中所述成熟干扰素α-2b融合于成熟清蛋白的C-末端，且进一步地其中(1)所述患者是初次治疗的，(2)所述丙型肝炎感染是基因型1，(3)所述治疗有效量是约1200μg/剂至约1800μg/剂，且(4)每四周一次以所述清蛋白融合蛋白给药所述患者并在施用后第二周给药额外剂量的所述清蛋白融合蛋白。

216.根据权利要求215所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白施用于所述患者持续共24至48周。

217.根据权利要求215或216所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与一种或多种抗病毒剂联合施用。

218.根据权利要求217所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：

(a)抗病毒酶抑制剂；

(b)核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(c)非核苷类似物抗病毒聚合酶抑制剂；

(d)反义寡核苷酸抑制剂；

(e)thiazolide；

(f)抗病毒抗体；

(g)新型免疫调节剂；

(h)亲环蛋白抑制剂；

(i)保肝剂；和

(j)干扰素增强剂。

219.根据权利要求217所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林或利巴韦林类似物。

220.根据权利要求217所述的方法，其中所述清蛋白融合蛋白与两种、三种或四种抗病毒剂联合施用。

221.根据权利要求220所述的方法，其中所述抗病毒剂之一是利巴韦林或利巴韦林类似物。

222.根据权利要求215至221任一项所述的方法，其中所述患者体重至少为75kg。

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