CN101999342B - 一种卵黄稀释液的配制方法 - Google Patents

一种卵黄稀释液的配制方法 Download PDF

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胡树香
李喜和
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Abstract

一种卵黄稀释液的配制新方法，属于动物生殖生物领域，它包括：卵黄的制备；配制4.6倍Tris-A母液及6倍Tris-B母液，无菌过滤；用无菌水稀释为0.5倍Tris-A和Tris-B溶液；分别和卵黄混合、搅拌、静置、离心后收取上清液；用4.6倍Tris-A和6倍Tris-B母液分别调节上清液的浓度，使Tris-A和Tris-B达到1倍；分别加入抗生素及无菌甘油，调pH值，于4℃保存备用。本发明省去过滤，方法简单，卵黄稀释液颗粒少，保证冷冻精子的活率，提高冻精产品质量，减少生产成本。

Description

一种卵黄稀释液的配制方法
技术领域：
本发明属于动物生殖生物技术领域，适用于牛冻精生产中稀释液的配制，主要提供一种卵黄稀释液的配制方法。
背景技术：
稀释液是牛冷冻精液生产中的主要和必要试剂，而卵黄稀释液因对精子有更好的保护作用，广泛使用于牛性控冷冻精液的生产中。卵黄稀释液中有很多颗粒杂质成分影响稀释液的质量和产品的检测，目前主要通过离心加过滤手段除去这些杂质颗粒。因卵黄中含有大量的有机成分，用0.22μm的无菌滤器过滤，不但耗时耗力，而且成本高昂，为此开发了该技术。
发明内容：
本发明提供一种用于牛冻精生产的卵黄稀释液配制方法，该技术原理是利用盐离子浓度对卵黄中颗粒成分的聚集起重要作用，低盐离子浓度有助于颗粒的聚集，从而可以通过离心去除大部分颗粒，这样就可以省去过滤的步骤，降低成本，节省人力物力。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种卵黄稀释液的配制方法，其特征在于：它包括下述步骤：
1)卵黄的制备：选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75％的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄；
2)4.6倍Tris-A及6倍Tris-B母液的配制：
Figure GSB00000897488200011
Figure GSB00000897488200021
按照上述配方用双蒸水配制4.6倍Tris-A母液，6倍Tris-B母液，分别调pH值为6.80±0.02，用0.22μm无菌滤器过滤；
3)0.5倍Tris-A溶液和0.5倍Tris-B溶液的配制：用无菌水将4.6倍Tris-A母液与6倍Tris-B母液分别稀释为0.5倍Tris-A溶液和0.5倍Tris-B溶液，配制好的溶液在4℃环境下保存，备用；
4)Tris-A、Tris-B稀释液的配制
①Tris-A稀释液的配制
将0.5倍Tris-A溶液和卵黄按7∶2的体积比加到一无菌容器中，于4℃环境下用磁力搅拌器以400-500转/分钟搅拌2小时，再静置20h，然后将上清液4℃、3850g离心60min，取上清液，并按1∶9.4的体积比加入4.6倍Tris-A母液，摇匀，加入抗生素：庆大霉素终浓度500μg/ml；林可霉素终浓度300μg/ml；奇霉素终浓度600μg/ml；泰乐菌素终浓度100μg/ml，调pH值为6.80±0.02，于4℃冰箱中保存备用；
②Tris-B稀释液的配制
将0.5倍Tris-B溶液和卵黄按7∶2.3的体积比加到一无菌容器中，于4℃环境下用磁力搅拌器以400-500转/分钟搅拌2小时，再静置20h，然后将上清液4℃、3850g离心60min，取上清液，并按7∶93的体积比加入6倍Tris-B母液，再加入无菌甘油，甘油最终比例为12％v/v，摇匀，加入抗生素：庆大霉素终浓度26.6μg/ml；林可霉素终浓度15.9μg/ml；奇霉素终浓度31.9μg/ml；泰乐菌素终浓度5.3μg/ml，调pH值为6.80±0.02，于4℃冰箱中保存备用。
一种卵黄稀释液在牛性控冻精与常规冻精生产中的应用。
本发明的有益效果是：该技术原理是利用盐离子浓度对卵黄中颗粒成分的聚集起重要作用，低盐离子浓度有助于颗粒的聚集，从而可以通过离心去除大部分颗粒，这样就可以省去过滤的步骤，这种卵黄稀释液配制方法简单，同时配制出的卵黄稀释液颗粒少，保证冷冻精子的活率，提高了冻精产品质量，减少生产成本。
附图说明
图1是牛号11103832(X)应用新型卵黄稀释液和原卵黄稀释液显微镜图。a：新型卵黄稀释液b：原卵黄稀释液。
图2是牛号YE025(X)应用新型卵黄稀释液和原卵黄稀释液显微镜图。a：新型卵黄稀释液b：原卵黄稀释液。
图3是牛号11102390(X)应用新型卵黄稀释液和原卵黄稀释液显微镜图。a：新型卵黄稀释液b：原卵黄稀释液。
具体实施方式
实施例：一种用于牛冻精生产的卵黄稀释液的配制方法，它包括下述步骤：
1、卵黄的制备：选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75％(v/v)的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清，用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄；
2、4.6倍Tris-A及6倍Tris-B母液的配制：
表1 100ml 4.6×Tris-A母液配方
  药品名称   重量(g)
  Tris base   16.25
  柠檬酸   7.92
  D-Fructose   5.82
表2 100ml 6×Tris-B母液配方
  药品名称   重量(g)
  Tris base   21.45
  柠檬酸   11.99
  D-Fructose   8.83
按照上表配方用双蒸水配制4.6倍Tris-A母液、6倍Tris-B母液，分别调pH值为6.80±0.02，用0.22μm无菌滤器过滤；
3、0.5倍Tris-A溶液和0.5倍Tris-B溶液的配制：用无菌水将4.6倍Tris-A母液与6倍Tris-B母液分别稀释为0.5倍Tris-A溶液和0.5倍Tris-B溶液，配制好的溶液在4℃环境下保存、备用；
4.Tris-A、Tris-B稀释液的配制：
(1)Tris-A稀释液的配制
将0.5倍Tris-A溶液和卵黄按7∶2的体积比加到一无菌容器中，于4℃环境下用磁力搅拌器以400-500转/分钟搅拌2小时，在4℃条件下静置20h后，将上清液4℃、3850g离心60min，取上清液，并按1∶9.4的体积比加入4.6倍Tris-A母液，摇匀，加入抗生素：庆大霉素终浓度500μg/ml；林可霉素终浓度300μg/ml；奇霉素终浓度600μg/ml；泰乐菌素终浓度100μg/ml，调pH值为6.80±0.02，于4℃冰箱中保存备用；
(2)Tris-B稀释液的配制
将0.5倍Tris-B溶液和卵黄按7∶2.3的体积比加到一无菌容器中，于4℃环境下用磁力搅拌器以400-500转/分钟搅拌2小时，在4℃条件下静置20h后，将上清液4℃、3850g离心60min，取上清液，并按7∶93的体积比加入6倍Tris-B母液，按比例加入无菌甘油，甘油最终比例为12％(v/v)，摇匀，加入抗生素：庆大霉素终浓度26.6μg/ml；林可霉素终浓度15.9μg/ml；奇霉素终浓度31.9μg/ml；泰乐菌素终浓度5.3μg/ml，调pH值为6.80±0.02，于4℃冰箱中保存备用。
应用实例1：用原稀释液和新型稀释液生产编号为11103832种公牛X精子，按照冻精流程冷冻精液(中华人民共和国农业行业标准，NY/T1234-2006)，精液冷冻24h后，检测精液各项质量指标，其中包括解冻后活力、解冻后4h活力、存活时间以及细菌数，结果显示两种卵黄稀释液对同一种公牛精液的冻后活力、4h活力、存活时间的冷冻保护效果一致，细菌数无显著差别；而新型卵黄稀释液颗粒数量明显少于原卵黄稀释液。
表3 不同卵黄稀释液对冻精质量的影响
  卵黄稀释液   冻后活力   4小时活力   存活时间   细菌数
  新稀释液   0.60   0.30   T＝5.5   0
  原稀释液   0.61   0.20   T＝5.5   11
应用例2：用原稀释液和新型稀释液生产编号为YE025种公牛X精子，按照冻精流程冷冻精液，精液冷冻24h后，检测精液各项质量指标，其中包括解冻后活力、解冻后4h活力、存活时间以及细菌数。结果显示两种卵黄稀释液对同一种公牛精液的冻后活力、4h活力、存活时间的冷冻保护效果一致，细菌数无显著差别。而新型卵黄稀释液颗粒数量明显少于原卵黄稀释液。
表4 不同卵黄稀释液对冻精质量的影响
  卵黄稀释液   冻后活力   4小时活力   存活时间   细菌数
  新稀释液   0.58   0.28   T＝5   1
  原稀释液   0.55   0.26   T＝5.5   15
应用例3：用原稀释液和新型稀释液生产编号为11102390种公牛X精子，按照冻精流程冷冻精液，精液冷冻24h后，检测精液各项质量指标，其中包括解冻后活力、解冻后4h活力、存活时间以及细菌数。结果显示两种卵黄稀释液对同一种公牛精液的冻后活力、4h活力、存活时间的冷冻保护效果一致，细菌数无显著差别。而新型卵黄稀释液颗粒数量明显少于原卵黄稀释液。
表5 不同卵黄稀释液对冻精质量的影响
  卵黄稀释液   冻后活力   4小时活力   存活时间   细菌数
  新稀释液   0.54   0.20   T＝5   3
  原稀释液   0.55   0.27   T＝5   0

Claims (1)

1.一种卵黄稀释液的配制方法，其特征在于：它包括下述步骤：
1)卵黄的制备：选取新鲜鸡蛋，将蛋壳用75％的酒精消毒，在无菌条件下去蛋壳、蛋清；用已灭菌滤纸将卵黄膜表面的蛋清吸干，用无菌注射器抽取卵黄；
2)4.6倍Tris-A及6倍Tris-B母液的配制：
Figure FSB00000897488100011
按照上述配方用双蒸水配制4.6倍Tris-A母液，6倍Tris-B母液，分别调pH值为6.80±0.02，用0.22μm无菌滤器过滤；
3)0.5倍Tris-A溶液和0.5倍Tris-B溶液的配制：用无菌水将4.6倍Tris-A母液与6倍Tris-B母液分别稀释为0.5倍Tris-A溶液和0.5倍Tris-B溶液，配制好的溶液在4℃环境下保存，备用；
4)Tris-A、Tris-B稀释液的配制
①Tris-A稀释液的配制
将0.5倍Tris-A溶液和卵黄按7∶2的体积比加到一无菌容器中，于4℃环境下用磁力搅拌器以400-500转/分钟搅拌2小时，再静置20h，然后将上清液4℃、3850g离心60min，取上清液，并按1∶9.4的体积比加入4.6倍Tris-A母液，摇匀，加入抗生素：庆大霉素终浓度500μg/ml；林可霉素终浓度300μg/ml；奇霉素终浓度600μg/ml；泰乐菌素终浓度100μg/ml，调pH值为6.80±0.02，于4℃冰箱中保存备用；
②Tris-B稀释液的配制
将0.5倍Tris-B溶液和卵黄按7∶2.3的体积比加到一无菌容器中，于4℃环境下用磁力搅拌器以400-500转/分钟搅拌2小时，再静置20h，然后将上清液4℃、3850g离心60min，取上清液，并按7∶93的体积比加入6倍Tris-B母液，再加入无菌甘油，甘油最终比例为12％v/v，摇匀，加入抗生素：庆大霉素终浓度26.6μg/ml；林可霉素终浓度15.9μg/ml；奇霉素终浓度31.9μg/ml；泰乐菌素终浓度5.3μg/ml，调pH值为6.80±0.02，于4℃冰箱中保存备用。
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