CN102186820B

CN102186820B - Rassf1a表达和人癌细胞增殖的荧光调节剂

Info

Publication number: CN102186820B
Application number: CN2009801406819A
Authority: CN
Inventors: 密尔顿·L·布朗; 凯瑟琳·D·谢赫; 米凯尔·佩奇; 帕索·班纳吉; 尚卡尔·加格德施
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 2008-08-15
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2029-08-14
Also published as: AU2009282451B2; BRPI0917411A2; ATE547403T1; EP2323982B1; US10457639B2; US20110152339A1; EP2323982A1; AU2009282451A1; JP2012500197A; WO2010019271A1; WO2010019271A8; JP2014148545A; HK1158206A1; EP2484666A1; CN102186820A; CA2734225A1

Abstract

本发明提供治疗受试者癌症的方法，其包含投予丹磺酰基-咔唑化合物。

Description

RASSF1A表达和人癌细胞增殖的荧光调节剂

相关申请案

本申请案根据美国法典第35卷第119(e)条主张2008年8月15日申请的题为“RASSF1A表达和人癌细胞增殖的荧光调节剂(FLUORESCENT REGULATORS OFRASSF1A EXPRESSION AND HUMAN CANCER CELL PROLIFERATION)”的第61/189,059号美国临时申请案的权益，该案的完整教导按引用并入本文中。

背景技术

近年来，前列腺癌的发病率增加了142％。根据美国癌症协会(American CancerSociety)的报导，每年将有约180,000位男性被诊断患有前列腺癌(兰迪斯(Landis，SH)等人，临床医师癌症杂志(CA Cancer J Clin)(1999)49：8-31)。前列腺癌的侵袭性极强，在美国，它是导致男性癌症死亡的第二大主导原因(博林(Boring，CC)等人，临床医师癌症杂志(CACancer J Clin)(1993)43：7-26)。在前列腺癌早期，前列腺癌细胞的生长与雄激素相关，并能通过使用外科方法或药理学方法剥夺激素来有效治疗(霍金斯(Huggins，C)等人，外科学文献集(Arch Surg)(1941)43：209-223)。但是，激素剥夺疗法只能使前列腺肿瘤临时消退，而在6到18个月内，肿瘤终将会变为不依赖于雄激素的(普菲法(Pfeifer GP)等人.生物化学(Biol Chem)(2002)383：907-14；艾萨克(Isaacs)，JT Vitam Horm(1994)49：433-502)。因此，雄激素阻断对于治疗前列腺癌并不奏效。

发明内容

一方面，本发明提供治疗受试者癌症的方法、抑制细胞生长的方法以及确定来自受试者的一个或多个细胞是否为癌细胞的方法。一方面，本发明提供一种具有下式的丹磺酰基-咔唑化合物：

一方面，本发明提供治疗受试者癌症的方法，所述方法包含对需要此种治疗的受试者投予治疗有效量的包含丹磺酰基-咔唑KED-4-69的组合物，以便治疗受试者的癌症。一方面，本发明提供丹磺酰基-咔唑KED-4-69的用途，是用于治疗患有癌症的受试者，治疗方法包含对需要此种治疗的受试者投予治疗有效量的包含丹磺酰基-咔唑KED-4-69的组合物，以便治疗受试者的癌症。一方面，本发明提供丹磺酰基-咔唑KED-4-69的用途，是用于制备供治疗患有癌症的受试者的药物，治疗方法包含对需要此种治疗的受试者投予治疗有效量的包含丹磺酰基-咔唑KED-4-69的组合物，以便治疗受试者的癌症。在本文提供的方法和用途的一些实施例中，治疗抑制了癌症的进一步发展。在本文提供的方法和用途的一些实施例中，治疗引起癌症的消退。在本文提供的方法和用途的一些实施例中，癌症包含Ras相关结构域家族1A(Ras-associationdomain family 1A，RASSF1A)表达减少的癌细胞。在一些实施例中，Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达随着RASSF1A启动子甲基化增多而减少。在一些实施例中，投予组合物使Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达增加。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。在一些实施例中，投予马哈尼(mahanine)类似物或KED-4-69类似物。

一方面，本发明提供抑制细胞生长的方法，所述方法包含使细胞与包含技术方案1所述的化合物的组合物接触，以便抑制细胞生长。在一些实施例中，细胞中Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达减少。在一些实施例中，细胞为癌细胞。在一些实施例中，癌细胞为前列腺癌细胞。在一些实施例中，细胞是在受试者体内。在一些实施例中，细胞与马哈尼类似物或KED-4-69类似物接触。

一方面，本发明提供降低细胞中DNA甲基转移酶活性的方法，所述方法包含使细胞与包含丹磺酰基-咔唑KED-4-69的组合物接触，以便降低细胞中DNA甲基转移酶的活性。在一些实施例中，通过降低DNMT-3b活性来降低DNA甲基转移酶活性。在一些实施例中，通过将DNMT-3b隔离(sequestering)到细胞质来降低甲基转移酶活性。在一些实施例中，细胞为癌细胞。在一些实施例中，癌细胞为前列腺癌细胞。在一些实施例中，细胞是在受试者体内。在一些实施例中，细胞与马哈尼类似物或KED-4-69类似物接触。

一方面，本发明提供增加细胞中Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表达的方法，所述方法包含使细胞与包含丹磺酰基-咔唑KED-4-69的组合物接触，以便增加细胞中RASSF1A的表达。在一些实施例中，细胞中Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达减少。在一些实施例中，细胞为癌细胞。在一些实施例中，癌细胞为前列腺癌细胞。在一些实施例中，细胞是在受试者体内。在一些实施例中，细胞与马哈尼类似物或KED-4-69类似物接触。

一方面，本发明提供鉴别Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表达减少的细胞的方法，所述方法包含使细胞与包含丹磺酰基-咔唑KED-4-69的组合物接触，其中如果化合物保留在细胞中，就将该细胞鉴别为具有减少的RASSF1A表达。在一些实施例中，细胞是在受试者体内。在一些实施例中，细胞与马哈尼类似物或KED-4-69类似物接触。

一方面，本发明提供确定来自受试者的一个或多个细胞是否为癌细胞的方法，所述方法包含从受试者获得一个或多个细胞；使所述一个或多个细胞与包含丹磺酰基-咔唑KED-4-69的组合物接触；测量所述一个或多个细胞的荧光性，其中如果所述一个或多个细胞的荧光性指示存在丹磺酰基-咔唑KED-4-69，就将所述一个或多个细胞鉴别为是癌细胞。在一些实施例中，将所述一个或多个细胞的荧光性与对照细胞相比较。在一些实施例中，所述一个或多个细胞与马哈尼类似物或KED-4-69类似物接触。

一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含丹磺酰基-咔唑KED-4-69和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物进一步包含一种或多种其它抗癌化合物。

一方面，本发明提供一种试剂盒，其包含药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的丹磺酰基-咔唑KED-4-69；以及有关制备和/或投予所述药物组合物的说明。在一些实施例中，试剂盒进一步包含药学上可接受的载剂。在一些实施例中，试剂盒进一步包含一种或多种其它抗癌化合物。

在一些方面，本发明提供治疗个体癌症的方法。在一些实施例中，本发明提供治疗个体前列腺癌的方法。在一些实施例中，本发明提供癌症的治疗方法，在所述癌症的一些或全部癌细胞中，Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达减少。在一些实施例中，本发明提供癌症的治疗方法，在所述癌症的一些或全部癌细胞中，DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)活性增大。在一些实施例中，治疗方法包含投予丹磺酰基-咔唑KED-4-69。

在一些实施例中，本发明提供使用丹磺酰基-咔唑KED-4-69诊断癌症的方法。在一些实施例中，本发明提供鉴别Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表观遗传学上沉默的细胞的方法。在一些实施例中，鉴别Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的细胞的方法包含使细胞与丹磺酰基-咔唑(KED-4-69)接触。

本发明还涵盖丹磺酰基-咔唑KED-4-69作为研究工具和/或研究试剂的用途。

申请人合成了丹磺酰基-咔唑化合物KED-4-69，并证实这种化合物可以在体外抑制PC3前列腺癌细胞的生长。此外，如本文中所述，丹磺酰基-咔唑化合物还诱导人前列腺癌细胞中RASSF1A的表达。另外，本文中显示，用丹磺酰基-咔唑化合物进行治疗可抑制前列腺癌细胞中细胞周期素D1(cyclin D1)的转录活性。RASSF1A的表达与细胞周期素D1的活性降低相关。

根据本发明一方面，提供一种具有下式的丹磺酰基-咔唑化合物：

根据本发明另一方面，提供一种诱导细胞中表观遗传学上沉默的基因Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表达的方法。这种方法包含使细胞与图1A中所示的化合物接触。在一些实施例中，细胞是人癌细胞。在一些优选实施例中，癌细胞是前列腺癌细胞。细胞可以在个体体内。

根据本发明另一方面，提供一种治疗个体癌症的方法，在这种癌症中，Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表观遗传学上沉默。所述方法包含对个体投予治疗有效量的图1A中所示的化合物，这种化合物诱导个体体内癌细胞或癌前期细胞中RASSF1A的表达，从而限制个体RASSF1A表观遗传学上沉默的癌症发生的程度，或使个体RASSF1A表观遗传学上沉默的癌症(部分或完全)逆转。RASSF1A表观遗传学上沉默的癌症可以是前列腺癌、皮肤癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳癌、卵巢癌等癌症。

根据本发明另一方面，提供一种治疗男性前列腺癌的方法。所述方法包含对男性投予治疗有效量的图1A中所示的化合物，由此诱导表观遗传学上沉默的RASSF1A的表达，并使前列腺癌发生的程度相比未投予图1A中所示化合物的情形有所减轻。化合物可以通过肠胃外途径投予，例如皮下、肌肉内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内或静脉内途径。在一些实施例中，化合物是经肠投药，包括口服，例如利用管饲法。

根据本发明另一方面，提供一种抑制细胞中DNA甲基转移酶(DNMT)活性的方法。这种方法包含使细胞与图1A中所示的化合物接触。在一些实施例中，通过降低DNMT-3b的活性来降低DNMT活性。在一些实施例中，细胞是在个体体内。

根据本发明另一方面，提供一种鉴别Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表观遗传学上沉默的细胞的方法。所述方法包含使细胞与图1A中所示的化合物接触，其中如果化合物保留在细胞中，就将该细胞鉴别为是RASSF1A表观遗传学上沉默的。在一些实施例中，细胞是在受试者体内。

一方面，本发明提供一种具有以下结构的丹磺酰基-咔唑化合物：

一方面，本发明提供一种诱导细胞中表观遗传学上沉默的基因Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表达的方法，其包含使细胞与图1A的丹磺酰基-咔唑化合物接触。在一些实施例中，细胞是人癌细胞。在一些实施例中，人癌细胞是前列腺癌细胞。在一些实施例中，细胞是在个体体内。

一方面，本发明提供一种治疗个体Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表观遗传学上沉默的癌症的方法，其包含对个体投予治疗有效量的图1A化合物，这种化合物诱导个体体内癌细胞或癌前期细胞中RASSF1A的表达，从而限制个体RASSF1A表观遗传学上沉默的癌症发生的程度，或使个体RASSF1A表观遗传学上沉默的癌症(部分或完全)逆转。在一些实施例中，癌症是前列腺癌、皮肤癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳癌、卵巢癌，或RASSF1A表观遗传学上沉默的其它癌症。

一方面，本发明提供一种治疗男性前列腺癌的方法，其包含对男性投予治疗有效量的图1A化合物，由此诱导表观遗传学上沉默的RASSF1A的表达，并使前列腺癌发生的程度相比未投予图1A化合物的情形有所减轻。在一些实施例中，图1A化合物是通过肠胃外途径投予，例如皮下、肌肉内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内或静脉内途径。

一方面，本发明提供一种抑制细胞中DNA甲基转移酶(DNMT)活性的方法，其包含使细胞与图1A化合物接触。在一些实施例中，通过降低DNMT-3b的活性来降低细胞中DNMT的活性。在一些实施例中，细胞是在个体体内。

一方面，本发明提供一种鉴别Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表观遗传学上沉默的细胞的方法，其包含使细胞与图1A化合物接触，其中如果化合物保留在细胞中，就将细胞鉴别为是RASSF1A表观遗传学上沉默的。在一些实施例中，细胞是在受试者体内。

本发明的每一限制都可涵盖本发明的各种实施例。因此，预期涉及任一要素或要素组合的本发明的每一限制都可以包括在本发明各方面中。本发明的应用不局限于以下描述中所陈述或各图式中所说明的组分的构建和布置细节。本发明能够以各种方式实践或进行其它实施例。另外，本文使用的措辞和术语都是出于描述的目的，并不应将其视为限制。本文中使用的“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”和其变体打算涵盖后文所列各项和其等效物以及其它项目。

附图说明

各图式只是出于说明的目的，而非实现本文中揭示的发明所必需的。

图1A-B显示本发明丹磺酰基-咔唑(即，KED-4-69，化合物6a)(A)和马哈尼(B)的结构。

图2显示在用马哈尼类似物处理的化合物(包括丹磺酰基-咔唑化合物KED-4-69，即化合物6a)中观察到DNA合成减少。将PC-3细胞接种于96孔板中，并用5μM化合物处理。24小时后，使用购自罗氏公司(Roche)的ELISA BrdU细胞增殖检测试剂盒分析细胞中BrdU标记情况，扣除背景BrdU并入量(不存在抗BrdU-过氧化物酶溶液)，并将得到的值相对于未处理的对照细胞值归一化。

图3显示马哈尼类似物诱导RASSF1A表达并下调细胞周期素D1。重复拍摄实验的代表性照片3次。在提取RNA和进行RT-PCR扩增前，用15μM化合物6、7、7a、8、9、10，或5μM化合物KED-4-69(化合物6a)处理PC-3细胞24小时。

图4A-D显示在PC-3细胞的细胞质中只看到荧光化合物6a且看起来将DNMT3b隔离在了细胞质中。(A)化合物6a的荧光光谱；(B)用5μM化合物6a的溶液处理PC-3细胞1小时，随后用碘化丙锭和DNMT3b抗体固定和染色；(C)用5μM化合物6a的溶液处理细胞6小时，随后固定；(D)用5μMDMSO溶液处理细胞6小时，随后固定。每组图像中的画面从左到右，从上到下为：碘化丙锭；清晰视野；DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)；化合物6a或媒剂；和合并图。在725nm下，用多光子激光激发化合物6a并用500-550nm滤光器成像。箭头指示仅DNMT3b在细胞质中的代表性细胞。

图5显示合成化合物6a和7a的方案。试剂：(a)K₂CO₃、MeCN；(b)乙酸钯、K₂CO₃、PEG；(c)PPh₃、1，3-二氯苯；(d)Pd/C(以重量计，5％)、甲酸铵、MeOH；(e)丹磺酰氯、TEA、DCM。

图6显示合成化合物10的方案。试剂：(a)柠檬醛、吡啶。

图7显示上调RASSF1A的马哈尼类似物也抑制DNA甲基转移酶活性。黑色条形：用马哈尼，或5μM化合物6a，或15μM化合物6、7、7a、8或9处理PC-3细胞72小时，随后使用购自艾美捷公司(Epigentek)的DNMT活性试剂盒分析DNMT活性。数据是三个独立实验的平均值±标准差。灰色条形：RT-PCR印迹的密度测量值，其中通过马哈尼处理而再表达的RASSF1AmRNA的量归一化至100％。

图8显示用化合物6a处理减小了人前列腺异种移植肿瘤的体积。对雄性无胸腺Balb/c裸小鼠注射PC-3细胞，并使由此产生的肿瘤生长1周，随后每隔一天一次腹膜内给予含10mg/kg化合物6a或DMSO对照物的1∶1PEG/PBS。数据表示为平均值±标准差(n＝4)。

具体实施方式

本发明并未将其应用局限于以下描述中所陈述或各图式中所说明的组分的构建和布置细节。本发明能够以各种方式实践或进行其它实施例。另外，本文使用的措辞和术语都是出于描述的目的，并不应将其视为限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”和其变体将涵盖后文所列各项和其等效物以及其它项目。

一方面，本发明提供治疗受试者癌症的方法。在一些实施例中，所述方法包含对需要此种治疗的受试者投予治疗有效量的包含咔唑化合物的组合物，以便治疗受试者的癌症。在一些实施例中，咔唑化合物是图1A的丹磺酰基-咔唑化合物(即，KED-4-69或化合物6a)。在一些实施例中，治疗抑制癌症的进一步发展和/或使癌症消退。在一些实施例中，癌症包含Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表达减少的癌细胞。在一些实施例中，Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达随着RASSF1A启动子甲基化增多而减少。在一些实施例中，投予组合物使Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达增加。在一些实施例中，癌症是前列腺癌。

在一些方面，本发明提供治疗个体癌症的方法。在一些实施例中，本发明提供治疗个体前列腺癌的方法。在一些实施例中，本发明提供治疗癌症的方法，在所述癌症的一些或全部癌细胞中，Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达受到抑制。在一些实施例中，本发明提供治疗癌症的方法，在所述癌症的一些或全部癌细胞中，DNA甲基转移酶(DNMT)活性增大。在一些实施例中，治疗方法包含投予丹磺酰基-咔唑KED-4-69。

在人肿瘤中一个常见异常是Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)基因的启动子甲基化(范德威顿(van der Weyden，L.)等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta.)2007，1776，58-85)。RASSF1基因的基因座位于染色体3p21.3上，编码7种不同的转录物，其中RASSF1A是在正常细胞中发现的两种主要同工型中的一种。这些Ras效应蛋白共有保守基元RalGDS/AF6Ras相关结构域，而其对Ras介导的增殖和细胞凋亡的影响显示其为肿瘤抑制子。由过甲基化(表观遗传)沉默引起的RASSF1A蛋白表达损失将破坏细胞周期控制，诱导遗传不稳定性，增强细胞运动力并使癌细胞具有细胞凋亡抗性。然而，RASSF1A的异位表达可以诱导此致瘤表型逆转(范德威顿(van der Weyden，L.)等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta.)2007，1776，58-85；道宁格(Donninger，H.)等人，细胞科学杂志(J.of Cell Sci.)2007，120，3163-3172)。

人前列腺癌的病因学在很大程度上仍未得到确定。然而，显而易见的是，各种肿瘤抑制基因的表观遗传失活在包括前列腺癌在内的各种癌症发展中起到关键作用。一种这样的肿瘤抑制子是Ras相关结构域家族1(RASSF1)基因。染色体3p21.3上的人RASSF1基因产生RASSF1的两种主要同工型A和C(1、2)。在RASSF1A的氨基末端存在二酰基甘油结合结构域。RASSF1A的羧基末端含有Ras相关结构域。RASSF1A的生物功能在很大程度上还不了解。RASSF1C是一种缺乏氨基末端C1结构域的较小蛋白质(50个氨基酸)。RASSF1C被认为在RAS介导的细胞活性中起作用(3)。在前列腺癌中，如RB1等典型肿瘤抑制基因功能的丧失并不常见；然而，在71％的原发前列腺肿瘤中，RASSF1A启动子区被甲基化。当只考虑侵袭性更强的前列腺肿瘤(格里森评分(Gleason score)7-10)时，RASSF1A甲基化的发生率增加了近85％(李(Li)等人，生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)，2004，1704：87-102)。相比之下，在原代正常前列腺上皮和基质细胞中，未发现RASSF1A启动子甲基化(库兹敏(Kuzmin)等人，癌症研究(CancerRes.)2002，62：3498-3502)。

RASSF1A可能是目前描述的人癌症中最常甲基化的基因(4、5)。在至少37种类型的肿瘤中曾报导过RASSF1A基因甲基化。举例来说，在80％小细胞肺癌(2、6)、超过60％乳房肿瘤(2、7、8)、90％肝癌(9-11)、63％胰腺肿瘤(12)、40％非回肠(nonileal)肿瘤(12)、69％回肠肿瘤(12)、70％原发鼻咽癌(13)、91％原发肾细胞癌(14)、62％膀胱肿瘤(15)和超过70％前列腺癌(16-18)中发现RASSF1A甲基化。

在缺乏内源RASSF1A转录物的癌细胞系中RASSF1A的异位表达导致体外和裸小鼠中细胞的生长减少，从而支持了RASSF1A作为肿瘤抑制基因的作用(1、2、14、16、19-21)。已经证实，RASSF1A和NORE1(新颖Ras效应子1)与促细胞凋亡激酶MST1(哺乳动物不育20样激酶1(mammalian sterile 20-like 1)))缔合将诱导细胞凋亡(22)。其它研究表明，RASSF1A是一种微管结合蛋白，可使微管稳定，而且其过度表达将通过与后期促进复合物的组分相互作用而引起中期停滞(23-26)。也已表明，RASSF1A抑制c-Jun-NH2激酶路径，引起细胞周期进展的抑制(30)。因此，RASSF1A在调节细胞周期方面起作用。

RASSF1A KO小鼠可以存活，并且能繁殖，但正如所预期的，此类小鼠在高龄(18-20个月)时很可能发生自发性肿瘤(淋巴瘤、白血病、肺腺瘤、乳腺癌、直肠乳头瘤)(27)。西瓦库玛(Shivakumar)和同事已经证明，RASSF1A的外源表达诱导处于G1期的人肺癌细胞(H1299)的细胞周期停滞，这与细胞周期素D1下调相关(28)。RASSF1A也与p120^E4F(细胞周期素A表达的负调节剂)相互作用(29)。

肿瘤细胞系中RASSF1A表达的恢复减弱其致肿瘤性(14、16)，因此，恢复RASSF1A的表达提供了一种癌症预防和治疗方法。

如本文中所述，本发明化合物诱导人前列腺癌细胞中表观遗传学上沉默的肿瘤抑制基因RASSF1A的表达。此外还显示，本发明化合物可下调细胞周期素D1。本发明化合物经由RASSF1A路径抑制细胞周期素D1转录，提供了一种新的癌症治疗方法。

经由不同的启动子DNA序列，通过包括Ras、Src、Stat3、Stat5和Erbb2在内的多种促有丝分裂和致癌信号传导路径，可诱导细胞周期素D1基因转录(37)。已经证明，数种转录因子，例如CREB、AP-1、β-连接素(catenin)/Tcf-1，可与细胞周期素D1启动子相互作用(35、38)。RASSF1A对细胞周期素D1的转录调节很可能涉及一个或多个所述信号传导路径和转录因子。细胞周期素D1基因转录的活化依赖于Ras、Raf、有丝分裂原活化蛋白激酶(MEK1和MEK2)、Akt的活化，并且细胞外信号的持续活化调节蛋白激酶(ERK)(37)。另一方面，磷酸化引发的泛素依赖性蛋白水解将介导细胞周期素D1降解(39)。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)催化细胞周期素D1的Thr286磷酸化，并使细胞核中蛋白质重定向到细胞质(39)。

细胞周期素D1的过度表达是包括前列腺癌在内的多种形式癌症中的常见事件(40-42)。细胞周期素D1过度表达使小鼠中器官生长增强(43)。利用细胞周期素D1瞬时转染肝细胞引起大量增殖，并使肝质量在6天内增加超过50％(44)。相反，细胞周期素D1基因敲除小鼠比野生型小鼠小，并且p27基因纯合子缺失(抑制细胞周期素D1/Cdk4/6复合物)的小鼠显示巨大症以及较大的器官尺寸(45)。此外，细胞周期素D1的表达通过增加胶质瘤细胞中基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)活性和运动力来调节侵袭能力(46)。此外，细胞周期素D1的过度表达与前列腺癌转移到骨骼相关(47)。这些发现表明，细胞周期素D1除了在细胞周期进展中具有明确确定的作用外，还在细胞生长和转移调节中起到重要作用。

一方面，本发明提供治疗受试者癌症的方法。一方面，本发明提供抑制细胞生长的方法，所述方法包含使细胞与包含图1A化合物(即KED-4-69或化合物6a)的组合物接触，以便抑制细胞生长。在一些实施例中，细胞中Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达减少。

一方面，本发明提供降低细胞中DNA甲基转移酶活性的方法，所述方法包含使细胞与包含图1A化合物(即KED-4-69或化合物6a)的组合物接触，以便降低细胞中DNA甲基转移酶的活性。在一些实施例中，通过降低DNMT-3b活性来降低DNA甲基转移酶活性。在一些实施例中，通过将DNMT-3b隔离到细胞质来降低甲基转移酶活性。

一方面，本发明提供增加细胞中Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表达的方法，所述方法包含使细胞与包含图1A化合物(即KED-4-69或化合物6a)的组合物接触，以便增加细胞中RASSF1A的表达。在一些实施例中，细胞中Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)的表达减少。在一些实施例中，细胞是癌细胞，如前列腺癌细胞，和/或在受试者体内。

本文中显示，本发明化合物抑制DNMT活性，此事件可促成RASSF1A表达的恢复，并由此用作癌症治疗方法。人们已经证实，启动子过甲基化是多种人癌症中RASSF1A基因沉默的主要原因(2、4-18)。细胞中DNA的甲基化是由DNA甲基转移酶(DNMT)进行。细胞含有三种酶活性DNMT变异体(DNMT-1、DNMT-3a和DNMT-3b)，其中，DNMT-3b是唯一一种在细胞质和细胞核中都发现的酶(玛君德(Majumder，S.)等人，生物化学杂志(J.of Biol.Chem.)2002，277，16048-16058)。如通过荧光化合物6a定位所显示，本发明化合物很可能是通过结合于DNMT-3b来抑制甲基化。PC-3细胞与此化合物接触后，荧光图像即显示，化合物只定位于PC-3细胞的细胞质中。这些发现表明，化合物6a与DNMT-3b相互作用。因此，丹磺酰基-咔唑化合物具有同工型特异性作用模式。由于本发明丹磺酰基-咔唑化合物具有同工型特异性作用，使得可能避免与核苷DNMT抑制剂相关的细胞毒性(赖科(Lyko，F.)等人，国立癌症研究所杂志(J.Natl.CancerInst.)2005，97，1498-1506)。

申请人合成了多种马哈尼类似物(参看图5)，并且证实，这些化合物可抑制PC3前列腺癌细胞生长(例如参看图2)。此外，如本文中所述，这些马哈尼类似物诱导人前列腺癌细胞中RASSF1A的表达，同时抑制DNMT活性(例如参看图7)。另外，本文中显示，用马哈尼类似物进行治疗也可抑制前列腺癌细胞中细胞周期素D1的转录活性(例如参看图2)。RASSF1A的表达与前列腺癌细胞中细胞周期素D1信息和蛋白质含量降低以及G0/G1细胞周期停滞有关。也就是说，RASSF1A与细胞周期素D1表达之间存在相反关系。RASSF1A通过抑制细胞周期素D1的启动子活性来抑制细胞周期素D1转录，而加入RASSF1A siRNA可防止此抑制作用。

本发明化合物在本文中也称为马哈尼类似物，因为这些化合物是基于相同的咔唑结构。天然产物马哈尼是不依赖于雄激素的人前列腺癌细胞的有效生长抑制剂(例如参看PCT/US2007/02241，按全文引用并入本文中)。在经过马哈尼处理的PC-3细胞中观察到RASSF1A mRNA含量增加，以及细胞周期素D1mRNA含量降低。这与先前发现的RASSF1A表达增加将下调细胞周期素D1从而引起细胞生长抑制相一致(西瓦库玛(Shivakumar，L.)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)2002，22，4309-4318)。申请人先前还证实(33)，马哈尼使前列腺癌细胞中的Akt减活。活化的Akt通过磷酸化使GSK-3β减活。因此，除RASSF1A抑制细胞周期素D1转录外，丹磺酰基-咔唑化合物还使Akt减活，最终活化GSK-3β，从而降解细胞周期素D1。

马哈尼的抗增殖活性与其对PC-3细胞中DNA甲基转移酶(DNMT)活性的抑制作用相关。在71％原发前列腺肿瘤中，RASSF1A启动子区被甲基化，而当只考虑侵袭性更强的肿瘤(格里森评分为7-10的肿瘤；刘(Liu，L.)等人，癌基因(Oncogene.)2002，21，6835-6840)时，这些情形增加到83％。推测起来，马哈尼对DNMT活性的抑制可防止RASSF1A基因的过甲基化和随后的沉默。先前已经在包括前列腺癌在内的多种细胞系中观察到RASSF1A和其它过甲基化基因的此类表观遗传调节(布鲁克纳(Brueckner，B.)等人，癌症研究(CancerRes.)2005，65，6305-6311；李(Li，L.)等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta.)2004，7704，87-102；保利麓(Beaulieu，N.)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2002，31，28-176-28181)。

如利用前列腺癌细胞进行的实验所证实，本文中揭示的化合物与马哈尼相同，也能够抑制癌细胞生长。本文中揭示的一种化合物，即化合物6a的活性是马哈尼抑制前列腺癌细胞生长的作用的6倍(参看表1)。化合物6a除了能以低于马哈尼的剂量抑制人前列腺细胞增殖外，细胞毒性也低于马哈尼。本发明化合物可上调蛋白质抑制蛋白RASSF1A，下调细胞周期素D1并抑制DNMT活性，其中化合物6a的作用最强。

一方面，本发明提供鉴别Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)表达减少的细胞的方法，所述方法包含使细胞与包含荧光马哈尼类似物的组合物接触，其中如果化合物保留在细胞中，就将该细胞鉴别为具有减少的RASSF1A表达。在一些实施例中，荧光马哈尼类似物是图1A的化合物(即，KED-4-69或化合物6a)。在一些实施例中，细胞是在受试者体内。

一方面，本发明提供确定来自受试者的一个或多个细胞是否为癌细胞的方法，所述方法包含从受试者获得一个或多个细胞；使所述一个或多个细胞与包含荧光马哈尼类似物的组合物接触；测量所述一个或多个细胞的荧光性，如果所述一个或多个细胞的荧光性指示存在荧光马哈尼类似物，就将所述一个或多个细胞鉴别为是癌细胞。在一些实施例中，荧光马哈尼类似物是图1A的化合物(即，KED-4-69或化合物6a)。在一些实施例中，将荧光性与对照细胞相比较。对照细胞可以是野生型对照细胞(即，预期不会保留荧光马哈尼类似物的负对照)或RASSF1A表达减少的癌细胞(即，将提供荧光马哈尼类似物存在的荧光性指示的正对照)。

作者已经证明，马哈尼类似物可结合DNMT3b，并且能将DNMT3b隔离在细胞质中。因此，荧光马哈尼类似物(例如化合物6a)提供监测细胞内DNMT3b移动的方法。此外，荧光马哈尼类似物能够鉴别出DNMT(如由DNMT3b所证实)是RASFF1甲基化的重要因子的细胞。因此，本发明的荧光马哈尼类似物能够鉴别RASSF1下调的细胞，例如前列腺癌细胞。本发明的荧光马哈尼类似物由此提供一种在体外和体内确定细胞的“癌症”状态的诊断工具(例如，如果细胞中的RASSF1下调，那么该细胞很可能是癌细胞)。此外，本发明的荧光马哈尼类似物适用于多种分析(例如在药物发现中)，在这些分析中测定RASSF1和/或DNMT3b活性和DNMT3b定位十分重要。

在本文所述的任何一个或多个实施例中，所述方法包含投予受试者包含咔唑化合物的组合物，或使细胞与包含咔唑化合物的组合物接触。在一些实施例中，咔唑化合物是包含杂芳基的咔唑化合物。在一些实施例中，咔唑化合物是丹磺酰基-咔唑。在一些实施例中，丹磺酰基-咔唑化合物具有以下结构：

上文所述的丹磺酰基-咔唑化合物在本文中也称为“KED-4-69”、“化合物6a”、“图1A化合物”或“图1A中所示的化合物”。

咔唑化合物在此项技术中是已知的，且被定义为包含由两个6元苯环稠合到一个5元含氮环的任一侧上组成的三环结构的芳香族杂环有机化合物。在一些实施例中，咔唑化合物是马哈尼(图1B)、化合物6a(图1A)、化合物6、化合物7、化合物7a、化合物8、化合物9或化合物10(参看图5和图6)。本文中揭示的化合物也称为马哈尼类似物或本发明化合物。

在一些实施例中，咔唑化合物是包含芳基取代基的咔唑化合物。在一些实施例中，所述化合物包含至少一个苯甲基取代基，其中苯甲基包含苯环。在一些情况下，苯环可任选经至少一个OH、NH₂、NHR₉、OCH₃或烷基取代，其中R₉是H、烷基、C＝O或S＝O。在一些实施例中，咔唑化合物是化合物6a(参看图5)。

在一些实施例中，咔唑化合物是包含杂芳基取代基的咔唑化合物。杂芳基包含非碳分子(杂基团(heterogroup))与芳基偶合。在一些实施例中，杂基团是SO₂、SO、CO、NH或PO₃。在一些实施例中，芳基包含一个或多个苯环。在一些实施例中，芳基经至少一个OH、NH₂、NR₁R₂、NHR₁、OCH₃、OCHR₁R₂、OCH₂R₁、OCR₁R₂R₃、C＝O或S＝O取代，其中R₁、R₂和R₃是烷基。在一些实施例中，杂芳基是丹磺酰基。在一些实施例中，杂芳基是荧光基团。在一些实施例中，丹磺酰基-咔唑化合物是图1A的化合物(即，KED-4-69或化合物6a)。

在一些实施例中，本文中描述的化合物可为“任选取代的”，也就是说，这些化合物可以是经取代的或未取代的。应了解，“取代”或“经…取代”包括暗含的限制性条件，即，所述取代遵照经取代原子和取代基的允许的价态，而且所述取代会产生稳定化合物，例如，化合物不会例如因重排、环化、消除等而自发转变。

本文中使用的术语“经取代”应包括有机化合物的所有可允许的取代基。从广义上看，可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳香族和非芳香族取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个相同或不同的取代基。出于本发明的目的，杂原子(例如氮)可具有本文中所述有机化合物的氢取代基和/或任何可允许的取代基，这些取代基将满足杂原子的价态。本发明不打算以任何方式受限于有机化合物的可允许的取代基。

本发明还包含KED-4-69类似物。KED-4-69类似物是KED-4-69的化学修饰型式。在一些实施例中，KED-4-69类似物具有一种或多种KED-4-69活性(如本文中所述)，例如抗癌活性。所述一种或多种活性优选在KED-4-69类似物中大量存在，例如高于KED-4-69相应活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。KED-4-69类似物的所述一种或多种活性更优选是高于KED-4-69活性的100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或更高。KED-4-69类似物可能不具有KED-4-69的所有活性。不过，不具有大量KED-4-69活性的非活性KED-4-69类似物不适用于本发明方法中。

本发明还包含KED-4-69、KED-4-69类似物和本文中揭示的其它马哈尼类似物的前药。KED-4-69、KED-4-69类似物和马哈尼类似物的前药是KED-4-69、KED-4-69类似物和马哈尼类似物的经修饰型式，与KED-4-69、KED-4-69类似物和马哈尼类似物的未修饰型式相比较，其可具有改进的稳定性和/或操作特性。KED-4-69、KED-4-69类似物和马哈尼类似物的前药在体内代谢，分别产生KED-4-69、KED-4-69类似物和马哈尼类似物。

KED-4-69、KED-4-69类似物、马哈尼类似物以及KED-4-69的前药、KED-4-69类似物的前药和马哈尼类似物的前药在本文中也称为本发明化合物。

应理解，只要本发明提到投予KED-4-69、KED-4-69类似物或马哈尼类似物的方法，或是使细胞与KED-4-69、KED-4-69类似物或马哈尼类似物接触的方法，本发明就还涵盖投予KED-4-69的前药、KED-4-69类似物的前药或马哈尼类似物的前药，或使细胞与KED-4-69的前药、KED-4-69类似物的前药或马哈尼类似物的前药接触。

本发明还包含投予KED-4-69的前药、KED-4-69类似物的前药和马哈尼类似物的前药。本文中使用的术语“前药”是指在投予生物系统时会因自发化学反应、酶催化的化学反应和/或代谢化学反应或这些反应中两个或两个以上反应的组合而产生生物活性化合物(即KED-4-69、KED-4-69类似物或马哈尼类似物)的任何化合物。标准前药是使用连接有如HO-、HS-、HOOC-、R₂N-等在体内裂解的官能团的基团与药物缔合而形成。标准前药包括(但不限于)羧酸酯，其中所述基团是烷基、芳基、芳烷基、酰氧基烷基、烷氧羰基氧基烷基；以及羟基、硫醇和胺的酯，其中连接的基团是酰基、烷氧羰基、氨基羰基、磷酸酯或硫酸酯。所说明的基团是示范性的，并不详尽，而且所属领域技术人员可制备其它已知种类的前药。前药可经历某种形式的化学转变，以产生具有生物活性或作为生物活性化合物的前体的化合物。在一些情况下，前药的生物活性一般低于药物本身，并通过改进口服生物利用率、药效半衰期等来改进药物功效或安全性。举例来说，化合物的前药形式可用于改进生物利用率；例如通过遮蔽或减少不愉快的特性，例如苦味或胃肠刺激，来改进受试者的可接受性；改变溶解性，例如用于静脉内使用；提供延长或持续的释放或递送；提高配制的便利性；或提供化合物的位点特异性递送。前药例如描述于以下文献中：药物设计和药物作用的有机化学(The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action)，理查德B.希文曼(Richard B.Silverman)，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，1992.第8章：″前药和药物递送系统(Prodrugs and Drug Delivery Systems)″第352-401页；前药的设计(Design of Prodrugs)，布德盖得(H.Bundgaard)编辑，爱思唯尔科技出版社(Elsevier Science)，阿姆斯特丹(Amsterdam)，1985；经由前药和类似物设计生物药物特性(Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugsand Analogs)，罗奇(E.B.Roche)编辑，美国药学协会(American PharmaceuticalAssociation)，华盛顿(Washington)，1977；和药物递送系统(Drug Delivery Systems)，朱莉诺(R.L.Juliano)编辑，牛津大学出版社(Oxford Univ.Press)，牛津(Oxford)，1980。

本发明化合物是以有效量投予。有效量是足以提供医学上所需结果的化合物剂量。有效量意味着这种量是延迟所治疗的特定病症或疾病发作、抑制其进展或完全停止其发作或进展所必需的。举例来说，在治疗癌症时，有效量一般为例如抑制癌细胞复制、降低癌细胞负荷或减少癌症的一种或多种病征或症状所需的量。当投予受试者时，有效量应当取决于：所治疗的特定癌症；癌症的严重程度；个别患者的参数，包括年龄、身体状况、体格和体重；同时进行的治疗；治疗频率；和投药模式。这些因素是所属领域一般技术人员众所周知的，并且可以只利用常规实验确定。在一些实施例中，优选根据合理的医学判断使用最高的安全剂量。

一方面，本发明提供治疗受试者癌症的方法。本文中使用的“受试者”是人或其它有脊椎哺乳动物，包括(但不限于)小鼠、大鼠、狗、猫、马、奶牛、猪、绵羊、山羊或非人灵长类动物。本文中使用的术语“受试者”与“个体”可以互换使用。在一些实施例中，受试者是男性。

本文中使用的“需要治疗的受试者”是指鉴别为需要治疗的受试者。例如，需要癌症治疗的受试者是鉴别为患有癌症或有发展癌症风险的受试者。受试者可由医疗专业人员和/或通过进行一种或多种诊断分析而诊断为需要治疗。例如，需要癌症治疗的受试者可以是被医疗专业人员诊断为患有癌症或有患癌症风险的受试者。此项技术中已知用于评估一位受试者是否患有癌症或有发展癌症风险的诊断分析。

本文中使用的“治疗癌症”包括(但不限于)预防或减少癌症发展；减少癌症症状；抑制已确定癌症的生长；预防现有癌症转移和/或侵入；促进或诱导癌症消退；抑制癌细胞增殖；减少血管生成或增加凋亡癌细胞的量。在一些实施例中，将本发明化合物投予有发展癌症风险的受试者以降低发展癌症的风险。

在一些实施例中，本发明提供治疗特定癌症的方法。在一些实施例中，本发明提供治疗前列腺癌的方法。在一些实施例中，本发明提供治疗包含RASSF1A表达减少的癌细胞的癌症的方法。癌症可以只由RASSF1A表达减少的细胞组成，或者癌症可能包括RASSF1A表达减少的细胞亚群。本文中使用的术语“RASSF1A表达减少”是指与野生型(即，非癌症)细胞相比较，细胞中RASSF1A的表达水平较低。此项技术中已知可以检测RASSF1A表达的水平或活化状态的分析，且其包括蛋白免疫印迹法(western blot)和蛋白质阵列分析。RASSF1A含量比野生型低，包括RASSF1A是野生型的1％或更低、5％或更低、10％或更低、20％或更低、50％或更低、100％或更低。

在一些实施例中，使用的本发明化合物可以是治疗有效量。术语“治疗有效量”或“有效量”可互换使用，意思指实现所需治疗效果(例如，收缩肿瘤、抑制细胞增殖)所需或足够的量。有效量通常会在每天一剂或多剂投药的约0.001mg/kg到约1000mg/kg、约0.01mg/kg到约750mg/kg、约0.1mg/kg到约500mg/kg、约1.0mg/kg到约250mg/kg、约10.0mg/kg到约150mg/kg内变化，持续一天或数天(应当视投药模式和上文论述的因素而定)。其它适合的剂量范围包括每天1mg到10000mg、每天100mg到10000mg、每天500mg到10000mg以及每天500mg到1000mg。在一些特定实施例中，所述量小于每天10,000mg，范围在每天750mg到9000mg内。

本发明的主题还有组合物，例如药物组合物或制剂，其包含(1)至少本文中提供的化合物；和(2)适合的(药学上有用的)载剂。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量可以变化，以便得到有效实现特定患者、组合物和投药模式所需的治疗反应的活性化合物量。所选剂量取决于特定化合物的活性、投药途径、所治疗病症的严重程度、所治疗患者的状况和先前病史。不过，所属领域技术人员应了解，以低于实现所需治疗效果所需水平的化合物剂量开始治疗，并逐渐增加剂量，直到达到所需作用。

在一些实施例中，KED-4-69可与其它治疗剂组合投予。KED-4-69和其它治疗剂可同时或依次投药。当同时投予其它治疗剂时，它们可在相同或分开的制剂中投予，但投药同时进行。当其它治疗剂和KED-4-69是暂时分开投药时，其它治疗剂之间以及与KED-4-69是依次投药的。这些化合物投药间的时间间隔可能为约数分钟，或者可能更长时间。

在一些实施例中，所述其它治疗剂是抗癌化合物。本文中使用的“抗癌化合物”是指投予受试者以实现治疗癌症目的的药剂。抗癌化合物包括(但不限于)抗增殖化合物、抗肿瘤化合物、抗癌补充增效剂和放射性试剂。所属领域一般技术人员熟知多种抗癌剂，或者可以在常规技术中发现其它在医学技术中用于治疗癌症的药剂。

在一些实施例中，将本发明化合物与抗癌疗法组合投予。抗癌疗法包括(但不限于)投予抗癌化合物、放射疗法和外科程序。

本发明化合物和药物组合物可以借助任何适合的途径投予受试者。举个例子，组合物可口服(包括舌下)、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部和透皮(如利用粉末、油膏或滴液)、颊或鼻投药。本文中使用的术语“肠胃外”投药是指除通过胃肠道外的其它投药模式，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、乳腺内、眼内、眼球后、肺内、鞘内、皮下和关节内注射和输注。也涵盖外科植入，例如包括将本发明组合物包埋于体内，例如脑中、腹腔中、脾被膜、脑下或角膜中。

本发明化合物也可呈脂质体形式投药。如此项技术中所知的，脂质体一般是衍生自磷脂或其它脂质物质。脂质体是由单层或多层水合液晶分散于水性介质中形成。能够形成脂质体的任何无毒、生理学上可接受的可代谢脂质都可以使用。呈脂质体形式的本发明组合物除含有本发明化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选脂质是天然和合成两种的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。此项技术中已知形成脂质体的方法。例如参看普雷科特(Prescott)编，细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)，第XIV卷，学术出版社(Academic Press)，纽约州纽约(New York，N.Y).(1976)，第33页等。

供局部投予本发明化合物的剂型包括本文中所述的散剂、喷雾剂、油膏和吸入剂。在无菌条件下，将活性化合物与药学上可接受的载剂以及(必要时)任何需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、眼膏、散剂和溶液也涵盖在本发明的范围内。

供肠胃外注射的本发明药物组合物包含药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及在即将使用前复水成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。适合的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。举个例子，可利用如卵磷脂等包覆材料，在分散液情况下通过保持所需粒度，以及利用表面活性剂，来保持适当流动性。

组合物也可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包括如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等多种抗细菌剂和抗真菌剂来确保防止微生物作用。还可能需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过包括例如单硬脂酸铝和明胶等延迟吸收的药剂来实现可注射药物形式的延长吸收。

在一些情况下，为了延长药物的作用，需要延缓通过皮下或肌肉内注射的药物的吸收。这可以使用具有弱水溶性的结晶或非晶形物质的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，而其溶解速率又可视晶体尺寸和晶形而定。或者，通过将药物溶解或悬浮于油性媒剂中来延缓肠胃外投予的药物形式的吸收。

通过以生物可降解聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)形成药物的微胶囊基质来制得可注射积存形式。取决于药物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也可通过将药物封装于可与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备积存式可注射制剂。

举例来说，可通过利用细菌或病毒截留过滤器进行过滤，或通过将灭菌剂并入可于使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式中来对可注射制剂灭菌。

本发明提供口服本发明药物组合物的方法。口服固体剂型一般描述于雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，1990(默克出版公司(MackPublishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Eaton Pa).18042)，第89章。供口服的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂、口含片或锭剂、扁囊剂、药丸和颗粒剂。也可以使用脂质体或类蛋白质包封来配制本发明组合物(例如美国专利第4,925,673号中报导的类蛋白质微球)。脂质体包封可包括用各种聚合物衍生化的脂质体(例如美国专利第5,013,556号)。一般说来，制剂包括本发明化合物和惰性成分，这些惰性成分可防止在胃中降解，并使生物活性物质在肠中释放。

在此类固体剂型中，活性化合物与至少一种药学上可接受的惰性赋形剂或载剂混合，或者经过化学修饰而包括至少一种药学上可接受的惰性赋形剂或载剂。赋形剂或载剂优选允许(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃或肠中吸收到血流中。在最优选的实施例中，赋形剂或载剂增加化合物的吸收、化合物的总体稳定性和/或化合物在体内的循环时间。赋形剂和载剂包括例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或(a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、纤维素、改性葡聚糖、甘露糖醇和硅酸，以及无机盐，例如三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠，和市售稀释剂，例如

和

(b)粘合剂，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、树胶(例如海藻酸盐、阿拉伯胶)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖；(c)保湿剂，例如甘油；(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、碳酸钠、淀粉(包括基于淀粉的市售崩解剂：

即羟乙酸淀粉钠；

即羧甲基纤维素钠)、超级支链淀粉(ultramylopectin)、明胶、橙皮、羧甲基纤维素、天然海绵、膨润土、不溶性阳离子交换树脂，和粉末状树胶，例如琼脂、刺梧桐胶或黄芪胶；(e)阻溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如季铵化合物，和脂肪酸，包括油酸、亚油酸和亚麻酸；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯、阴离子清洁剂表面活性剂(包括月桂基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠)、阳离子清洁剂(例如苯扎氯铵或苄索氯铵(benzethonium chloride))、非离子清洁剂(包括聚桂醇400；硬脂酸聚烃氧40酯；聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60；单硬脂酸甘油酯；聚山梨醇酯40、60、65和80；蔗糖脂肪酸酯；甲基纤维素；和羧甲基纤维素)；(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土；(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)、液体石蜡、植物油、蜡、

4000、

6000、月桂基硫酸镁和其混合物；(j)助流剂，用于改进药物在配制期间的流动性以及在压制期间帮助重排，包括淀粉、滑石、煅制二氧化硅和水合硅铝酸盐。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型中也可包含缓冲剂。

使用例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂，也可将类似类型的固体组合物用作软质和硬质填充明胶胶囊中的填充剂。

制备的片剂、糖衣锭、胶囊、丸剂和颗粒剂固体剂型可具有包衣和外壳(例如肠衣和药物配制领域中众所周知的其它包衣)。它们可任选包含乳浊剂，并且也可具有使其只在或优先在肠道的某一部分中任选以延缓方式释放活性成分的组成。例示性材料包括具有pH敏感性溶解度的聚合物，例如以

销售的物质。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

适当时，活性化合物也可呈与一种或多种上文所述的赋形剂一起微封装的形式。

供口服的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可含有此项技术中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯，和其混合物。

除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、着色剂、调味剂和芳香剂。口服组合物可经过配制并进一步含有可食用的产品，例如饮料。口服组合物也可经由管饲法投予。

除活性化合物外，悬浮液还可含有悬浮剂，例如乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄芪胶和其混合物。

本文中还涵盖经肺递送本发明化合物。吸入时，化合物被递送到哺乳动物的肺部，由此促进化合物跨过肺上皮内层进入血流。参看艾德杰(Adjei)等人，药物研究(Pharmaceutical Research)7：565-569(1990)；艾德杰等人，国际制药学杂志(International Journal of Pharmaceutics)63：135-144(1990)(醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate))；布拉奎特(Braquet)等人，心血管药理学杂志(Journal of CardiovascularPharmacology)13(增刊5)：s.143-146(1989)(内皮素-1)；胡贝德(Hubbard)等人，内科学文献(Annals of Internal Medicine)3：206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；史密斯(Smith)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)84：1145-1146(1989)(α1-蛋白酶)；奥斯文(Oswein)等人，″蛋白质的气雾化(Aerosolization of Proteins)，″有关呼吸系统药物递送的会议论文集II(Proceedings of Symposium on Respiratory Drug DeliveryII)，金斯顿(Keystone)，科罗拉多州(Colorado)，1990年3月(重组人生长激素)；德布斯(Debs)等人，免疫学杂志(The Journal of Immunology)140：3482-3488(1988)(干扰素-γ和肿瘤坏死因子α)；和普雷兹(Platz)等人，美国专利第5,284,656号(粒细胞集落刺激因子)。

预计设计用于经肺递送治疗性产品的机械装置都可用于实践本发明，包括(但不限于)喷雾器、定计量吸入器和粉末吸入器，所有这些装置都为所属领域技术人员所熟知。

适用于实践本发明的市售装置的一些具体实例为喷雾器，由莫林克特有限公司(Mallinckrodt，Inc.；位于密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))制造；

喷雾器，由马奎斯特医疗产品公司(Marquest Medical Products；位于科罗拉多州恩格尔伍德(Englewood，CO.))制造；

定计量吸入器，由盖雷索有限公司(Glaxo Inc.；位于北卡罗来纳州三角研究园区(Research Triangle Park，N.C.))制造；和

粉末吸入器，由费森斯公司(Fisons Corp.；位于马萨诸塞州贝德福德(Bedford，MA))制造。

所有这些装置都需要使用适于分配本发明化合物的制剂。通常，每一制剂都特别针对所使用的某种类型装置，并且除使用适用于疗法中的稀释剂、佐剂和/或载剂外，还可能涉及使用适当的推进剂材料。

组合物可制备成特定形式，优选平均粒度小于10μm，最优选为0.5到5μm，以便最有效地递送到远端肺。

载剂包括碳水化合物，例如海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。适用于制剂中的其它成分可包括脂质(例如DPPC、DOPE、DSPC和DOPC)、天然或合成表面活性剂、聚乙二醇(甚至除其用于衍生化抑制剂本身的用途外)、葡聚糖(例如环糊精)、胆汁盐，以及其它相关增强剂、纤维素和纤维素衍生物，和氨基酸。

预期也可使用脂质体、微囊或微球体、包涵体复合物，或其它类型的载剂。

适用于喷射式或超声波式喷雾器的制剂通常包含溶解于水中达到每毫升溶液约0.1到25mg生物活性蛋白质的浓度的本发明化合物。制剂也可包括缓冲剂和单糖(例如用于稳定蛋白质和调节渗透压)。喷雾器制剂也可含有表面活性剂，用于减少或防止由形成气雾剂的溶液雾化所引起的表面诱导的抑制剂组合物聚集。

用于定计量吸入器装置的制剂一般包括含有抑制剂化合物的细粉，所述抑制剂化合物在表面活性剂作用下悬浮于推进剂中。推进剂可以是任何常用于此目的的材料，例如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃，或烃，包括四氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合。适合的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。

可由粉末吸入器装置分配的制剂包括含有抑制剂的细干粉，也可包括增积剂，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或木糖醇，其量应便利从装置分散粉末，例如以制剂重量计占50％到90％。

还涵盖经鼻递送本发明化合物和组合物。经鼻递送允许在投予鼻治疗产品后使化合物或组合物直接通过进入血流中，而无需使产品沉积于肺中。供经鼻递送的制剂包括含有葡聚糖或环糊精的制剂。还涵盖经由跨其它粘膜输送进行的递送。

供直肠或阴道投予的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明化合物与适合的无刺激性赋形剂或载剂(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，这些赋形剂或载剂在室温下为固体但在体温下为液体，因此在直肠或阴道腔中熔解并释放活性化合物。

为了便利跨细胞和/或核膜递送化合物，优选疏水性相对较高的组合物。可以增加疏水性的方式修饰化合物，或者可以将化合物封装于疏水性载剂或使疏水性增加的溶液中。

一方面，本发明提供试剂盒，包含药物组合物，其包含一种或多种本发明化合物；和有关投予药物组合物的说明。在本发明一些方面中，试剂盒可包括药物制剂小瓶、药物制剂稀释剂小瓶和本发明化合物。稀释剂小瓶含有稀释剂，例如生理盐水，用于稀释本发明化合物的浓溶液或冻干粉。在一些实施例中，说明包括有关将特定量稀释剂与特定量浓药物制剂混合，由此制备出供注射或输注的最终制剂的说明。在一些实施例中，说明包括有关使用注射器或其它投药装置的说明。在一些实施例中，说明包括有关利用有效量本发明化合物治疗患者的说明。还应了解，含有制剂的容器，无论是瓶子、带隔膜的小瓶、带隔膜的安瓿、输液袋等，都可以含有标记，例如常用标示，当制剂经过高压灭菌或以其它方式灭菌时，这些标记将改变颜色。

以下实例将进一步说明本发明，而不应解释为以任何方式进一步限制本发明。本申请案全文中所引用的所有文献(包括参考文献、颁布的专利、公开的专利申请案和共同待决的专利申请案)的完整内容都按引用明确地并入本文中，尤其是有关上文提到的教导部分。

实例

材料与方法1：化学。

所有试剂和溶剂都是从商业供应商处购得，并以原样使用。熔点是在开口毛细管中，于电热式熔点测量设备(Electrothermal melting point apparatus)上测定，并且未经过校正。¹H和¹³C NMR光谱是在22.5℃下，于瓦里安公司(Varian)400Mz光谱仪(加利福尼亚州帕罗奥图(Palo Alto，CA))上，利用化合物的CDCl₃或DMSO-d₆溶液测量。质谱是在Finnegan LcQ Classic质谱仪(赛默飞公司(Thermo)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham，MA))上获得。元素分析是由大西洋麦博公司(AtlanticMicrolabs；乔治亚州诺克罗斯(Norcross，GA))进行，且除非规定，否则微量分析数据是在计算值的±0.4％范围以内。

1-(苯甲氧基)-4-碘-2-甲基苯(图5：化合物3)。在50mLDMF中组合4-碘-2-甲基苯酚(5.00g，21.4mmol)和无水碳酸钾(14.8g，106.8mmol)。搅拌10分钟后，加入苯甲基溴(7.61mL，64.1mmol)。将混合物加热到90℃，并搅拌，直到TLC检测反应完成(1-2小时)。冷却后，经由硅藻土塞过滤反应物，同时用乙酸乙酯洗涤。在压力下去除大部分DMF，随后加入水(50mL)，并用乙酸乙酯萃取水层2次，每次50mL。用饱和氯化锂水溶液洗涤有机层3次，每次50mL，随后用硫酸镁干燥。去除溶剂，并在乙醇和己烷中再结晶所得残余物，得到呈有光泽的灰白色晶体的经保护醇(4.92g，71％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.45-7.33(m，7H)，6.64(d，J＝8.4Hz，1H)，5.06(s，2H)，2.23(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，CDCl₃)：δ156.72，139.09，136.87，135.43，129.90，128.53，127.86，127.02，113.60，82.88，69.87，16.04；mp 58℃。

4′-(苯甲氧基)-4-甲氧基-3′-甲基-2-硝基联苯(图5：化合物5)。真空下，将PEG 4600(70.9g，15.4mmol)加热到120℃，保持24小时。转换成氮气氛围，加入化合物3(5.00g，15.4mmol)、4-溴-3-硝基苯甲醚(7.16g，30.8mmol)、无水碳酸钾(4.26g，30.8mmol)和乙酸钯(0.17g，0.77mmol)，并在120℃下再搅拌反应物48小时。冷却混合物，得到褐色固体，使用研钵和杵粉碎，并使用索格斯利特萃取设备(Soxhletextraction apparatus)，用乙醚进行萃取。去除溶剂，并经由柱色谱法纯化所得黄色残余物，得到呈亮黄色晶体的产物(2.16g，40％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.46(d，J＝7.2Hz，2H)，7.40(t，J＝7.2Hz，2H)，7.35-7.31(m，3H)，7.12(dd，J_S＝2.8Hz，J_L＝8.4Hz，1H)，7.10(d，J＝2.0Hz，1H)，7.06(dd，J_S＝2.0Hz，J_L＝8.4Hz，1H)，6.90(d，J＝8.0Hz，1H)，5.11(s，2H)，3.89(s，3H)，2.30(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，CDCl₃)：δ158.90，156.98，149.87，137.44，132.99，130.57，129.47，128.76，128.60，128.05，127.66，127.36，126.58，118.79，111.53，109.03，70.10，56.11，16.72；mp 119℃。

2-(苯甲氧基)-7-甲氧基-1-甲基-9H-咔唑(图5：化合物6)和2-(苯甲氧基)-7-甲氧基-3-甲基-9H-咔唑(图5：化合物7)。将化合物5(0.50g，1.4mmol)溶解于2mL1，3-二氯苯(1，3-DCB)中。用氮气吹扫溶液，并置于氮气氛围下。向其中加入三苯膦(0.94g，3.6mmol)，并使反应物回流48小时。在真空下去除1，3-DCB，并将残余物再溶解于氯仿中，且灌注到硅胶上。经由柱色谱法进行纯化，得到两种环化产物：微黄色固体(化合物6)(0.22g)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.84(d，J＝8.4Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.73(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(d，J＝7.6Hz，2H)，7.41(t，J＝7.6Hz，2H)，7.34(m，1H)，6.93(d，J＝2.0Hz，1H)，6.91(d，J＝8.4Hz，1H)，6.83(dd，J_S＝2.0Hz，J_L＝8.4Hz，1H)，5.18(s，2H)，3.90(s，3H)，2.44(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，CDCl₃)：δ158.21，154.40，141.09，140.27，137.76，128.46，127.71，127.29，120.33，117.90，117.67，116.88，107.96，107.69，106.14，95.00，71.33，55.60，10.12；mp 167-168℃。(C₂₁H₁₉NO₂)C，H，N.C：计算值79.47；实验值77.98；以及呈浅棕褐色固体的化合物7(0.20g)，总产率92％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.80(d，J＝8.4Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.72(s，1H)，7.49(d，J＝7.2Hz，2H)，7.41(t，J＝7.2Hz，2H)，7.33(m，1H)，6.89(s，1H)，6.87(d，J＝2.4Hz，1H)，6.81(dd，J_S＝2.4Hz，J_L＝8.4Hz，1H)，5.16(s，2H)，3.88(s，3H)，2.42(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，DMSO-d₆)：δ157.25，154.53，140.69，139.13，137.56，128.33，127.51，127.11，120.38，119.64，117.34，116.30，115.66，107.05，94.47，94.26，69.20，55.10，16.59；mp 250-251℃。(C₂₁H₁₉NO₂)C，H，N.C：计算值79.47；实验值78.60。

7-甲氧基-1-甲基-9H-咔唑-2-醇(图5：化合物8)。将化合物6(0.051g，0.16mmol)溶解于5mL甲醇中。用氮气吹扫溶液，并置于氮气氛围下。加入甲酸铵(0.10g，1.6mmol)和一勺钯/活性碳(以重量计5％)。搅拌混合物3小时后，经由硅藻土塞进行过滤，同时用甲醇和乙酸乙酯洗涤。在真空下去除溶剂，并将所得残余物再溶解于20mL乙酸乙酯中，并用水洗涤3次，每次20mL。用硫酸镁干燥有机层，并去除溶剂。柱色谱法分离，得到呈浅黄褐色固体的产物(0.038g，100％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ10.73(s，1H)，9.08(s，1H)，7.75(d，J＝8.4Hz，1H)，7.55(d，J＝8.4Hz，1H)，6.89(d，J＝2.4Hz，1H)，6.69(dd，J_S＝2.4Hz，J_L＝8.4Hz，1H)，6.65(d，J＝8.4Hz，1H)，3.80(s，3H)，2.29(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，DMSO-d₆)：δ157.05，152.55，141.03，119.47，117.29，116.47，115.10，113.60，107.93，106.61，104.74，94.58，55.19，10.22；mp200-202℃(分解)。(C₁₄H₁₃NO₂)C，H，N.C：计算值73.99；实验值73.43。

7-甲氧基-3-甲基-9H-咔唑-2-醇(图5：化合物9)。使用化合物7(0.11g，0.35mmol)，遵循上述程序。柱色谱法分离，得到呈灰白色固体的产物(0.082g，100％)。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ10.66(s，1H)，9.18(s，1H)，7.73(d，J＝8.4Hz，1H)，7.60(s，1H)，6.84(d，J＝2.4Hz，1H)，6.82(s，1H)，6.66(dd，J_S＝2.4Hz，J_L＝8.4Hz，1H)，3.79(s，3H)，2.22(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，DMSO-d₆)：δ156.96，153.45，140.54，139.45，120.27，119.23，116.68，115.79，114.97，106.58，96.02，94.42，55.10，16.40；mp 238-240℃(分解)。(C₁₄H₁₃NO₂)C，H，N，C：计算值73.99；实验值73.45。

5-(二甲基氨基)萘-1-磺酸7-甲氧基-1-甲基-9H-咔唑-2-基酯(图5：化合物6a)。将化合物8(0.15g，0.66mmol)溶解于DCM中，随后加入TEA(0.18mL，1.3mmol)，并搅拌反应物1小时。加入丹磺酰氯(0.18g，0.66mmol)，3小时后，去除溶剂，并将残余物灌注到硅胶上。柱色谱法分离，得到呈蓬松黄色固体的丹磺酰基化产物(0.30g，99％)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δ8.62(d，J＝8.4Hz，1H)，8.55(d，J＝8.4Hz，1H)，8.09(d，J＝7.6Hz，1H)，7.95(s，1H)，7.75(d，J＝8.4Hz，1H)，7.65(t，J＝7.6Hz，1H)，7.45(m，2H)，7.24(m，1H)，6.89(s，1H)，6.79(d，J＝8.4Hz，1H)，6.33(d，J＝8.4Hz，1H)，3.85(s，3H)，2.91(s，6H)，2.40(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，CDCl₃)：δ159.02，151.82，145.35，141.32，139.32，132.00，131.77，130.91，130.14，129.83，128.93，123.02，121.58，121.08，119.74，117.02，116.81，115.59，113.87，113.57，108.68，94.78，55.60，45.43，11.30；mp 174℃。分析得到(C₂₆H₂₄N₂O₄S)C，H，N。

5-(二甲基氨基)萘-1-磺酸7-甲氧基-3-甲基-9H-咔唑-2-基酯(图5：化合物7a)。使用化合物9(0.020g，0.90mmol)，遵循上述程序。柱色谱法分离，得到呈黄色固体的丹磺酰基化产物(0.032g，79％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ10.96(s，1H)，8.66(d，J＝8.4Hz，1H)，8.38(d，J＝8.4Hz，1H)，8.13(d，J＝7.6Hz，1H)，7.89(d，J＝8.4Hz，1H)，7.85(s，1H)，7.78(t，J＝8.0Hz，1H)，7.66(t，J＝8.0Hz，1H)，7.37(d，J＝7.6Hz，1H)，6.86(d，J＝2.4Hz，1H)，6.74(dd，J_S＝2.4Hz，J_L＝8.4Hz，1H)，6.58(s，1H)，3.80(s，3H)，2.90(s，6H)，2.23(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，DMSO-d₆)：δ158.52，151.58，145.06，141.71，137.73，131.83，131.26，130.60，129.18，129.06，128.99，123.46，121.46，120.90，120.81，120.72，118.44，115.54，115.07，107.98，103.34，94.29，55.07，44.97，16.39；mp242℃。

甲基保护的甲基向下的马哈尼(图5：化合物10)。在1mL吡啶中，将化合物8(0.061g，0.26mmol)与柠檬醛(0.09mL，0.53mmol)组合。使反应物回流过夜，随后在真空下去除溶剂。将得到的残余物再溶解于DCM中，并用水洗涤3次，每次10mL。用硫酸镁干燥有机层，并经由柱色谱法纯化，得到呈黄色固体的产物(0.0040g，4％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ7.77(d，J＝8.4Hz，1H)，7.74(s，1H)，7.40(s，1H)，6.90(d，J＝2.4Hz，1H)，6.80(dd，J_S＝2.4Hz，J_L＝8.4Hz，1H)，6.51(d，J＝10.0Hz，1H)，5.54(d，J＝10.0Hz，1H)，5.11(m，1H)，3.88(s，3H)，2.35(s，3H)，2.16(m，2H)，1.73(m，2H)，1.65(s，3H)，1.57(s，3H)，1.43(s，3H)；¹³C NMR(100.6MHz，CDCl₃)：δ131.51，129.02，127.44，124.32，124.09，120.06，118.24，116.31，115.10，114.44，107.73，104.77，95.11，78.31，55.64，41.04，27.31，26.13，25.66，22.76，21.70，17.57，9.51；mp℃。

材料与方法2：生物

细胞系和细胞生长分析.人前列腺癌细胞系PC-3是从美国典型细胞培养物保藏中心(American Type Cell Culture Collection；位于弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))获得。37℃下，在5％CO₂存在下，使细胞在含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素G钠盐和100μg/mL硫酸链霉素(西格玛公司(Sigma)，位于密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))的无酚红IMEM(英杰公司(Invitrogen)，位于加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))中生长。在细胞生长实验中，一式三份，将PC-3细胞接种到6孔板中，其中初始密度为每孔2×10³个细胞。接种后24小时，用媒剂(DMSO)，或1、5、15、30和60μM化合物处理附着的细胞。再培养24小时后，用1倍PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶处理并再悬浮于完全生长培养基中。将台盼蓝(Trypan blue)(0.4％)加入细胞悬浮液中，并使用血球计对活细胞和死亡细胞进行计数。

BrdU标记.在BrdU实验中，将PC-3细胞接种于96孔板中，密度为每孔2×10³个细胞，用5μM化合物处理24小时，并根据制造商的方案，使用ELISABrdU细胞增殖检测试剂盒(Cell Proliferation ELISABrdU)(化学发光)(罗氏诊断产品(RocheDiagnostics)，位于印第安那州(IN))分析BrdU。简单点说，将10μL 100μM的BrdU标记溶液加入培养的细胞中，并在37℃下培育1小时，去除标记溶液，且加入试剂盒中配备的FixDenat溶液，保持30分钟，并在室温下培育。随后将细胞与抗BrdU和过氧化物酶的结合物(1∶1500)一起培育60分钟。最后，洗涤板，并向各孔中加入100μL底物溶液(substrate solution)，且使用微孔板光度计(哈塔仪器有限公司(Harta Instruments，Inc.)，位于马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD))测量发光。

逆转录酶-聚合酶链反应(Reverse Transcriptase-polymerase Chain Reaction，RT-PCR).用TRIzol溶液(英杰公司(Invitrogen)，位于加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))，从与15μM化合物6、7、7a、8、9、10或者5μM KED-4-69(化合物6a)一起培育24小时的PC-3细胞中提取出RNA，并使用500ng逆转录成cDNA的总RNA，使用Superscript II试剂盒(英杰公司)，用随机六聚物扩增相关基因。使用Primer Quest程序设计人特异性引物，并从美国集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies，Inc.；位于爱荷华州科尔威尔(Coralville，IA))购买。其序列和产品谱带尺寸为：细胞周期素D1正向引物5′-CACACGGACTACAGGGGAGT-3′(SEQ IDNO：1)，细胞周期素D1反向引物5′-AGGAAGCGGTCCAGGTAGTT-3′(SEQ ID NO：2)(475bp)；以及GAPDH正向引物：5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′(SEQID NO：3)，GAPDH反向引物：5′-TCTAGACGGCAG GTCAGGTCCACC-3′(SEQ IDNO：4)(598bp)。在94℃下起始PCR，保持2分钟，随后是28个周期的以下操作：94℃保持1分钟，退火温度保持1分钟，72℃保持1分钟，最后在72℃下延伸，保持5分钟。细胞周期素D1和GAPDH的退火温度为60℃。如荣(Rong)等人(癌基因(Oncogene).2004，23，8216-8230)所述，使用RASSF1A的引物和PCR条件。扩增后，在1.5％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并使用富士公司的LAS-1000型成像仪(Fuji LAS-1000Imager)，利用溴化乙锭荧光观察。捕获图像，并输入到AdobePhotoshop图形编辑软件中。使用ImageJ软件(NIH，位于马里兰州贝塞斯塔(Bethesda，MD))定量谱带强度。

DNA甲基转移酶活性分析.将PC-3细胞接种于完全生长培养基中，用马哈尼，或2μM化合物6a，或15μM化合物6、7、7a、8、9、10处理3天，随后采集细胞。根据制造商的方案(核提取试剂盒(Nuclear extraction kit)，艾美捷公司(Epigentek))，制备核提取物。使用EpiQuik DNA甲基转移酶活性分析试剂盒(艾美捷公司)测量DNMT活性。结果表示为DNMT活性与作为100％的DMSO对照品相比较的百分比。

多光子激光成像.用纤维结合蛋白/皮层肌动蛋白(cortactin)溶液培育载片30分钟，随后将PC-3细胞接种到载片上，并培育过夜。随后用5μM化合物6a溶液或DMSO对照品处理细胞，并培育1-6小时，随后用PBS洗涤。用4％甲醛溶液固定载片，用PBS洗涤，随后用碘化丙锭(核定位)和DNMT3a或DNMT3b处理。在725nm下，用多光子激光激发化合物，并用500-550nm滤光器成像。

动物.Balb/c小鼠和无胸腺Balb/c裸小鼠是购自美国国立癌症研究所(NationalCancer Institute；NCI)。每一个带有隔离饲养盖(microisolater top)的笼子圈养4-6只动物，并无限制提供食物(法雷纳小鼠饲料(Furina mice chow))和水。光周期(12小时亮/暗周期)自动调节，且温度保持在23±1℃。在进行实验操作前，使所有动物适应此环境1周。乔治城大学动物护理和使用委员会(Georgetown University AnimalCare and Use Committee)根据美国国立卫生研究院(National Institute of Health)所采用的指南，批准了所有动物研究。

针对异种移植物的细胞培养.在37℃和5％CO₂下，用含5％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)、2.5mM L-谷氨酰胺的含L-谷氨酰胺RPMI-1640(麦迪泰克公司(Mediatech Inc.)，位于弗吉尼亚州赫恩登(Herdon，VA))中培养PC-3细胞系(ATCC，位于弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))。

异种移植物研究.对雄性无胸腺Balb/c裸小鼠(18-22g)注射3×106(0.3mL)人前列腺癌细胞(PC-3)。将人前列腺癌细胞注射到小鼠右腋窝的皮下组织中。注射后1周，将小鼠随机分选到2个组中，每组4只小鼠。通过将1mg化合物溶解于1μlDMSO中，获得化合物6a的储备液。将储备液加入1∶1比率的聚乙二醇400(PEG)(汉普顿公司(Hampton))和PBS中。通过用PEG/PBS稀释，获得测试浓度。每隔一天一次，对带有肿瘤的小鼠腹膜内注射(intraperitoneal injection，IP)10mg/kg 6a或对照媒剂，持续4周。同时，用测径器测量每只小鼠的肿瘤尺寸，并通过下式计算：长度×宽度×高度/2。

统计学分析.所有数据都来自至少三次独立的实验，并使用Prism 3GraphPad软件(加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla，CA))进行统计学分析。各值都表示为平均值±标准差。使用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，随后进行杜南特事后检验(Dunnett′s post test)计算显著性水平，其中指定的置信区间为95％。p值＜0.05被认为是显著的。

实例1：合成RASSF1A抑制剂

在开发新的RASSF1A抑制剂中，由于合成的问题以及咔唑结构不常见，使得将修饰咔唑主链选作主要焦点。在合成上，我们预想通过使联芳基系统环化来形成咔唑部分。在化合物3和4的相应官能化变体的交叉偶合方面所尝试的许多典型偶合反应(根岸(Negishi)、铃木(Suzuki)、熊田(Kumada))失败后(图5)，发现王(Wang，L.)等人的一种底物特异性反应适用于我们的芳基卤化物系统(化合物5；王(Wang，L.)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)，2006，71，1284-1287)。随后，根据弗雷曼(Freeman，A.W.)等人的程序，使所得联芳基5环化，得到两种可能的区位异构体化合物6和7(弗雷曼(Freeman)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)2005，70，5014-5019)。据发现，通过改变溶剂和三苯膦(PPh₃)当量数，得到不同的化合物6比化合物7比率。使用1，3-二氯苯(DCB)和2.5eq PPh₃，得到空间位阻较大的过量的化合物6(60∶40)，而使用1，2-DCB和3-5eq PPh₃则提供空间位阻较小的略微过量的化合物7(45∶55)。在钯/碳作用下脱除化合物6和7的苯甲基保护基，得到醇化合物8和9，进行丹磺酰基保护，得到荧光类似物化合物6a和7a。利用柠檬醛使化合物8环化，得到外消旋马哈尼类似物化合物10(图6)。在化合物10中，对马哈尼中存在的游离醇进行甲基保护，并交换马哈尼中甲基和环状醚部分的相对位置。

实例2：马哈尼前体和类似物抑制人前列腺细胞生长.

使用先前报导的方法，针对PC-3人前列腺癌细胞的生长抑制来筛选化合物6-10(表1；辛格(Sinha)等人，前列腺(The Prostate.)2006，66，1257-1265)。与化合物7和7a相比较，化合物6及其衍生物化合物6a和8尽管只是甲基的位置发生变化(1位对3位)，但其抑制作用明显有所改进。这是在意料之外的，因为马哈尼的甲基部分是在3位。GI₅₀值接近化合物6系列(化合物6、6a、8)且2位上羟基脱保护的化合物9显示，如果2位处的空间体积减小，就能部分克服3位上甲基所强加的位阻。事实上，观察马哈尼的结构，醚环的约束可以使2位处的表观体积降低到足以节制其3位上的甲基。此外，醚环系统将甲基等效物放到1位，这可能也有助于马哈尼的低微摩尔浓度活性，如果化合物6系列的相对较低的值是任何指示的话。而且，根据相同标准分析化合物10的结构，3位上醚环的双键碳和2位体积减小可能解释为什么其生长抑制作用不如马哈尼，而1位甲基仍使其活性高于化合物7和7a。

总的说来，在评估的化合物中，只有化合物6a的抑制作用强于马哈尼。另外，尽管观察到较高剂量(高于5μM)的马哈尼具有细胞毒性，但经证实，化合物6a只抑制细胞生长，在浓度高达30μM下24小时后，仍保持0时的初始细胞计数(数据未显示)。因此，化合物6a在细胞中没有较高剂量毒性。

表1.马哈尼和合成化合物在治疗人前列腺癌细胞中的GI₅₀值.^a

化合物	GI₅₀(μM)
		马哈尼	2.5±0.18
6	17.6±2.7
		6a	1.5±0.11
7	48.9±1.1
		7a	22.9±4.5
8	18.7±1.8
		9	15.3±2.8
10	11.3±1.8

^a对PC3细胞产生50％生长抑制所需的浓度。一式三份，将细胞接种于孔中，并暴露于各种浓度(0、1、5、15、30、60μM)的各化合物。处理24小时后，使用血球计对活细胞(借助于台盼蓝染料排除分析进行评估)计数。值表示为三个独立观察结果的平均值±标准差。

实例3：活性化合物降低DNA合成能力.

为了评估用马哈尼处理的细胞与用化合物6-10处理的细胞内DNA的合成水平的差异，根据标准程序，在处理24小时后，用5-溴-2-脱氧-尿苷(BrdU)处理培养的细胞(图2)。仅三种合成化合物与马哈尼一样，引起DNA合成能力的降低：化合物6、6a和9。由于DNA合成能力与细胞增殖相关，故用化合物6和6a处理的细胞的增殖能力不如用5μM化合物7或7a处理的细胞也在意料之中(假定后两种化合物具有较高的抑制浓度值)。然而，值得注意的是，抑制浓度与化合物9相当或低于化合物9的化合物8和10的生长抑制作用似乎对增殖没有任何作用，因为用这些化合物处理的细胞的DNA合成能力没有发生改变，表明细胞仍然在繁殖。

实例4：上调RASSF1A和下调细胞周期素D1.

据报导，RASSF1A的mRNA含量与其蛋白质表达水平相关(荣(Rong)等人，癌基因(Oncogene)，2004，23：8216-8230)。为了研究合成化合物对RASSF1A和细胞周期素D1表达的影响，分析经处理细胞相比于对照组的相应mRNAs含量(图3)。化合物6和6a显示的特征与马哈尼相同：RASSF1A显著增加，而细胞周期素D1相应减少。化合物8和9也观察到相同的增加/减少情况，但程度较低。由于细胞周期素D1的过度表达与致肿瘤性和包括前列腺癌在内的多种肿瘤的增殖相关，所以这一下调作用提供了一种癌症治疗方法(陈(Chen，Y.)等人，癌基因(Oncogene.)1998，16，1913-1920；摩斯戈夫(Musgrove，E.A.)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Nati.Acad.Sci.USA.)1994，91，8022-8026)。化合物7、7a和10的表达水平与对照组没有不同。

实例5：合成化合物抑制DNA甲基转移酶活性.

使用购自艾美捷公司(Epigentek)的DNMT分析试剂盒，测量经处理相对于未处理前列腺癌细胞的DNMT活性水平的差异。利用马哈尼以及化合物6和6a观察到DNMT活性的显著抑制，其中化合物6a的抑制作用最有效(图7，黑色条形)。化合物8和9也使DNMT活性略有降低。这些DNMT活性的降低与上述RASSF1A诱导模式相关(图7，灰色条形)。数据表明，对DNMT的抑制作用防止RASSF1A启动子区过甲基化，并因此恢复RASSF1A。

实例6：荧光类似物确定细胞内递送并展现细胞定位.

化合物6a中存在的丹磺酰基部分使其在370nm下激发时，于552nm下可以看到荧光(图4A)。用化合物6a处理PC-3细胞，随后使用多光子激光激发化合物，并借助共聚焦显微镜观察细胞内化合物的发光情况(图4B-D)。利用碘化丙锭对细胞核染色，很明显看到，化合物6a存在于细胞的细胞质内，而不是在细胞核中(图4B、C)。为了进一步确定有关化合物6a与DNMT相互作用是最终上调RASSF1A的关键因素的假设，利用已知会在细胞核与细胞质之间穿梭的DNMT同工型DNMT3a和DNMT3b的抗体对细胞样品染色(金姆(Kim)等人，欧洲分子生物学研究期刊(EMBOJ)，2002，21：4183-4195；马加姆博(Majumber)等人，生物化学杂志(JBC)，2002，277：16048-16058)。有趣的是，尽管DNMT3b存在于对照细胞的细胞质和细胞核中(图4D)，但在1小时后，经处理细胞群只在细胞质中含有DNMT3b(图4B，箭头)。到6小时时，此效应很明显，大部分经处理细胞都只在细胞质中含有DNMT3b(图4C)。利用DNMT3a未观察到相应的效应(数据未显示)，使得其作用不太可能是细胞核进入的总体抑制作用。因此，DNMT3b的细胞质隔离是化合物6a的作用模式。

实例7：体内研究表明用化合物6a处理的小鼠中人前列腺异种移植肿瘤具有较大治疗指数，并使肿瘤体积显著减小.

使用急性口服毒性上下法(up-and-down procedure)，给予野生型Balb/c小鼠多达550mg/kg化合物6a，未观察到毒性(急性口服毒性(Acute Oral Toxicity，AOT)上下法；http://www.epa.gov/oppfead1/harmonization)。这使得在10mg/kg的起始功效剂量下提供大于55的足够的治疗指数。每隔一天一次，对带有人前列腺肿瘤异种移植物的无胸腺Balb/c裸小鼠腹膜内注射10mg/kg化合物6a，持续25天。对照小鼠只给予媒剂。经过25天，与对照组相比较，化合物6a使肿瘤体积减小大约40％(图8)。这些结果表明，使用化合物6a可降低人前列腺肿瘤的体积。

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等效内容

前文描述的说明书将足以使所属领域技术人员实践本发明。本发明的范围不受所提供实例限制，因为这些实例只是对本发明一个方面的单纯说明，并且其它功能相当的实施例也在本发明的范围内。所属领域技术人员将从前述描述而对除本文所显示和描述的内容外的针对本发明的各种修改显而易见，并且这些修改都在所附权利要求书的范围内。本发明的益处和目的未必都涵盖在本发明的每一实施例中。

Claims

1.一种丹磺酰基-咔唑化合物，其具有结构：

2.治疗有效量的包含权利要求1所述的化合物的组合物在制备用于治疗受试者癌症的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其中治疗抑制所述癌症进一步发展。

4.根据权利要求2所述的应用，其中治疗使所述癌症消退。

5.根据权利要求2所述的应用，其中所述癌症包含Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）表达减少的癌细胞。

6.根据权利要求3所述的应用，其中所述癌症包含Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）表达减少的癌细胞。

7.根据权利要求4所述的应用，其中所述癌症包含Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）表达减少的癌细胞。

8.根据权利要求5所述的应用，其中所述Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达随着RASSF1A启动子甲基化增多而减少。

9.根据权利要求6所述的应用，其中所述Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达随着RASSF1A启动子甲基化增多而减少。

10.根据权利要求7所述的应用，其中所述Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达随着RASSF1A启动子甲基化增多而减少。

11.根据权利要求5所述的应用，其中投予所述组合物增加Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达。

12.根据权利要求6所述的应用，其中投予所述组合物增加Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达。

13.根据权利要求7所述的应用，其中投予所述组合物增加Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达。

14.根据权利要求8所述的应用，其中投予所述组合物增加Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达。

15.根据权利要求9所述的应用，其中投予所述组合物增加Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达。

16.根据权利要求10所述的应用，其中投予所述组合物增加Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达。

17.根据权利要求2至16中任一权利要求所述的应用，其中所述癌症是前列腺癌。

18.治疗有效量的包含权利要求1所述的化合物的组合物在制备用于抑制细胞生长的药物中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，其中所述细胞中Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达减少。

20.治疗有效量的包含权利要求1所述的化合物的组合物在制备用于降低细胞中DNA甲基转移酶活性的药物中的应用。

21.根据权利要求20所述的应用，其中通过降低DNMT-3b的活性来降低所述DNA甲基转移酶活性。

22.根据权利要求20所述的应用，其中通过将DNMT-3b隔离（sequestering）到细胞质来降低所述DNA甲基转移酶活性。

23.治疗有效量的包含权利要求1所述的化合物的组合物在制备用于增加细胞中Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）表达的药物中的应用。

24.根据权利要求23所述的应用，其中所述细胞中Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）的表达减少。

25.根据权利要求18至24中任一权利要求所述的应用，其中所述细胞是癌细胞。

26.根据权利要求25所述的应用，其中所述癌细胞为前列腺癌细胞。

27.根据权利要求18至24中任一权利要求所述的应用，其中所述细胞是在受试者体内。

28.根据权利要求25所述的应用，其中所述细胞是在受试者体内。

29.根据权利要求26所述的应用，其中所述细胞是在受试者体内。

30.治疗有效量的包含权利要求1所述的化合物的组合物在制备用于鉴别Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）表达减少的细胞的药物中的应用，其中：

使所述细胞与所述药物接触，

其中如果所述化合物保留在所述细胞中，就将所述细胞鉴别为具有减少的RASSF1A表达。

31.根据权利要求30所述的应用，其中所述细胞是在受试者体内。

32.治疗有效量的包含权利要求1所述的化合物的组合物在制备用于确定来自受试者的一个或多个细胞是否为癌细胞的药物中的应用，其中：

从受试者获得一个或多个细胞并使其与所述药物接触，

测量所述一个或多个细胞的荧光性，

其中如果所述一个或多个细胞的荧光性指示存在权利要求1所述的化合物，就将所述一个或多个细胞鉴别为是癌细胞。

33.根据权利要求32所述的应用，其中将所述一个或多个细胞的荧光性与对照细胞相比较。

34.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载剂。

35.根据权利要求34所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种其它抗癌化合物。

36.一种试剂盒，其包含药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1所述的化合物；以及有关制备和/或投予所述药物组合物的说明。

37.根据权利要求36所述的试剂盒，其进一步包含药学上可接受的载剂。

38.根据权利要求36或37所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种其它抗癌化合物。