CN102625695A - 长效胰岛素组合物 - Google Patents

长效胰岛素组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102625695A
CN102625695A CN2010800440213A CN201080044021A CN102625695A CN 102625695 A CN102625695 A CN 102625695A CN 2010800440213 A CN2010800440213 A CN 2010800440213A CN 201080044021 A CN201080044021 A CN 201080044021A CN 102625695 A CN102625695 A CN 102625695A
Authority
CN
China
Prior art keywords
insulin
hydrogel
administration
compositions
compounds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010800440213A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102625695B (zh
Inventor
K.斯普罗格
F.克里曼
U.赫赛尔
S.卡登-瓦格特
T.莱斯曼
H.劳
T.韦格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland GmbH filed Critical Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Publication of CN102625695A publication Critical patent/CN102625695A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102625695B publication Critical patent/CN102625695B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/13—Hollow or container type article [e.g., tube, vase, etc.]

Abstract

本发明涉及包含胰岛素化合物的药物组合物，所述胰岛素化合物的浓度足以将所述胰岛素化合物在血浆中的治疗有效水平维持至少三天，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的体内药物代谢动力学分布。本发明还涉及胰岛素化合物用于制备所述药物组合物的用途以及包含所述药物组合物的套盒。

Description

长效胰岛素组合物
技术领域
本发明涉及包含胰岛素化合物的药物组合物、所述组合物的用途、治疗方法、套盒以及使用GLP-1化合物诸如GLP-1激动剂的组合治疗。所述药物组合物可不像目前长效胰岛素那样频繁给药且其特征在于在给药之间的全部时间内释放结构完整的胰岛素而基本上无胰岛素化合物的爆发(burst)。该治疗可帮助患者降低注射频率，从而能够维持对胰岛素的血浆水平以及进而的血糖的最优控制。
背景技术
胰岛素疗法的特征在于由于治疗窗狭窄导致对将胰岛素药物释放保持在非常严格的水平的高需求，并且高胰岛素血症的不良反应可能会潜在地威胁生命。已经可商购具有满足糖尿病群体的特殊需求的不同作用分布的多种胰岛素制剂。快速作用胰岛素类似物在正要进食前给药，以在摄食后控制血糖的峰值，而长效胰岛素类似物典型地每日给药一次或者两次以提供稳定的基础胰岛素水平。
目前进展也已经包括口服胰岛素和吸入的胰岛素。然而，由于胰岛素为蛋白质，当口服摄入时其容易被胃和胃肠系统消化。可替换地，经吸入器递送至肺的可吸入胰岛素在有限的时间内可商购得到(
Figure BDA0000148803070000011
Pfizer在2007年停止生产)。该制剂提供胰岛素达数小时，仍然需要患者继续注射长效基础胰岛素。可吸入胰岛素的另外的劣势包括导致成本抑制的递送系统的制造困难。因此，所有可商购得到的胰岛素制剂必须经皮下或者静脉内注射进行给药。
各种可用的胰岛素的血浆分布的特征在于具有不同的血浆分布。所述血浆分布可用具有最大和最小血浆浓度进行描述，这取决于所用胰岛素的制剂和类型。非常重要的是获得在患者之间和患者内可重现的血浆分布，从而能够预测给药的胰岛素的血糖降低作用。此外，在基础胰岛素的多重给药的情况下，理想的是最大血浆浓度和最小血浆浓度之间具有尽可能小的差异。这将导致胰岛素的更恒定的血浆浓度，且由此导致在整个给药间隔更一致的血糖降低作用。
目前标准的基础胰岛素疗法由每日一次或者每日两次的长效基础胰岛素诸如NPH胰岛素、甘精胰岛素或者地特胰岛素的给药构成。尽管较新的胰岛素类似物的发展意在降低促胰岛素作用的可变性，这些长效制剂的血糖降低作用的特征仍然在于大的受试者间差异和受试者内差异，如Heise et al.(Diabetes，2004(53)，1614-1620)所述。在该研究中，地特胰岛素显示了最小的药物代谢动力学变化，其具有15的变异系数，相比于NPH胰岛素和甘精胰岛素各自26和34的CV而言。该相当大的可变性是获得最优血糖控制的主要障碍，这是因为很难预测向胰岛素分子的暴露。
相同研究对经葡萄糖输注率(GIR)评估的药效变化进行了研究。该评价也证实了地特胰岛素相比于NPH胰岛素和甘精胰岛素在药效标记GIR方面具有较低的受试者内可变性。此外，该研究证实了对葡萄糖输注率的胰岛素作用并不持续整个24小时的完全给药时期，这清楚地证实需要提供针对给药之间的完整时间内的完全葡萄糖降低作用的长效胰岛素。为了防止目前每日基础胰岛素并不持续完整24小时的问题的发生，一些患者将他们的基础胰岛素剂量分为每日两次注射，以获得全天更好的葡萄糖控制。
因此，明确需要新的长效胰岛素制剂，其在给药之间的全部时间内持续释放胰岛素。
此外，即使患者可通过每日注射基础胰岛素来控制他们的血糖，由于每日注射方案导致胰岛素疗法的起始产生厌恶(reluctance)。这是不期望的，因为美国糖尿病协会(ADA)和欧洲糖尿病研究协会(EASD)认识到胰岛素作为口服给予二甲双胍后提供最好治疗结果的一线治疗(DM Nathan et al.，Diabetologica(2008)51：8-11)。
如果可降低胰岛素治疗的注射频率，可能的是对胰岛素疗法的起始的心理障碍将减弱，因此允许患者在较早时期开始胰岛素治疗，这很好地改善了他们的健康状况。
开发长效基础胰岛素制剂的挑战在于胰岛素的狭窄治疗范围，且应该在所有情况下避免胰岛素药物代谢动力学的大的峰/谷变化以及爆发作用。
已经提出降低给药频率而仍然将胰岛素释放保持在狭窄限定范围内的几种方法，但不能使葡萄糖降低作用的持续时间延长超过几天，而其特征仍然在于具有最大血浆浓度和最小血浆浓度之间的小比例。
WO 06003014描述了相比于标准每日基础胰岛素注射，具有降低的给药频率的可能性的能够释放胰岛素的水凝胶。然而，胰岛素以极快的速率释放而不能保证严格的促胰岛素控制达延长2天的时期。事实上，胰岛素以约30小时的半衰期释放，这表示必须至少每30小时给药前药以使得稳态的峰/谷比低于2。
制备胰岛素的可逆聚合物结合物的概念经Shechter等人探究且在科学论文和和专利申请(例如(European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics 2008(70)，19-28)和WO 2004/089280)中有述。胰岛素经9-羟基甲基-7-(氨基-3-马来酰亚氨基丙酸酯)-芴-N-羟基琥珀酰亚胺间隔分子与40kDa PEG聚合物结合。所述间隔分子的水解以约30小时的半衰期释放胰岛素，这表示必须至少每30小时给药前药以使得稳态的峰/谷比低于2。
已经进行了降低胰岛素给药频率的其它尝试。Hinds等人(Journal ofControlled Release，2005(104)，447-460)描述了通过如下步骤产生每周一次给药的胰岛素的方法：首先持久地PEG化胰岛素分子，然后将所述PEG化胰岛素在PLGA微粒中进行微囊化。蛋白质的PLGA包囊已经显示引起聚合物酯与肽或者蛋白质氨基的副反应。乳酸酰化产物已经在制剂暴露于中性pH的缓冲溶液后观察到(Nat.Biotechnol.18(2000)52-57；Pharm.Res.11(1994)865-868；Pharm.Res.19(2002)175-181)。
特别针对胰岛素，聚合物制剂的有害效应已经得到证实(Pharm.Dev.Technol.4(1999)633-642；Pharm.Dev.Technol.5(2000)1-9)。
在上面提及的情况下，胰岛素已经经历了通过高分子量聚合物实体进行持久修饰的本质结构修饰，这是因为胰岛素的PEG化明显用于保护肽以防止在PLGA聚合物制剂中的变质。
不幸的是，所述高分子量修饰的胰岛素可通过减少的受体结合而显示降低的效能并且也可显示注射位点反应诸如高浓度的高分子量胰岛素在皮下组织的延长存在而导致的脂肪营养不良。此外，所述PEG化胰岛素显示较低的分布体积，其在治疗糖尿病中尤其不利的。
此外，释放的胰岛素结合物的药物代谢动力学分布的特征在于给药后的起始爆发样立即释放，之后出现胰岛素结合物血浆浓度的下降，之后历时随后几天出现胰岛素结合物血浆浓度的升高。该药物代谢动力学分布在微囊化的药物制剂中是典型的且可在用所述制剂治疗的受试者中导致不可预测的葡萄糖反应。
因此，挑战仍然为开发长效胰岛素而不由于高分子量实体的持久连接损害胰岛素药效学作用。
基于如下事实，该情形进一步复杂：胰岛素已知为容易地经历与分子中三个二硫键的存在相关的副反应。例如，胰岛素可由二硫桥断裂而分裂为A和B链或者由于二硫交换反应可形成二聚体或者寡聚体。如果迫使胰岛素分子以随机方式密切接触，则所述二硫重组(disulfide reshuffling)是极有可能的(“Stability of insulin：studies on the physical and chemical stability of insulin inpharmaceutical formulation”，Jens Brange，Springer，1994)。该胰岛素分子的内在不稳定性显著地妨碍研发长效贮药库的进展且阻止使用其它聚合物制剂，其中胰岛素以类似于无定形沉淀的方式进行包囊，所述无定形沉淀熟知引起由广泛的二硫交换产生的各种降解产物。
副反应速率进一步受胰岛素浓度的影响，其中当胰岛素以高浓度存在时，所述速率更高。因此配制高浓度长效胰岛素制剂是具有挑战的，其中胰岛素不发生不预期的副反应。
因此，存在对新的胰岛素长效制剂的明确需求，该制剂在给药之间的全部时间内持续释放结构完整的胰岛素，同时保持最高和最低胰岛素血浆浓度的小比例以避免过高或者过低的胰岛素浓度(其可能对患者是有害的)。
对于糖尿病的胰岛素需求是高度个体化的，其中所述剂量取决于若干生理因素，包括胰β细胞机能、胰岛素敏感度、体重和摄食。患者每日需要40IU或者更多的胰岛素不是罕见的。这相当于280IU/周，其相应于每周12.6mg人胰岛素。为了最小化患者的不适，应该配制为小体积，例如一毫升。因此本发明的目标是提供胰岛素制剂，其中胰岛素浓度为至少10mg/mL，其仍然释放结构完整的胰岛素且显示基本上无爆发的药物代谢动力学分布。此外，作为结果，本发明的目标是单一剂量的所述长效胰岛素可作为单次注射的含有至少10mg胰岛素化合物的制剂来给药。
US2007/0207210 A1描述了制备高分子量蛋白质且特别是抗体的无定形微粒的方法。根据该公开，胰岛素在以至多400mg/ml配制的实施例中提及。然而，发明的目的是提供具有与天然蛋白质相似的药物代谢动力学分布的制剂，从而不提供持续释放。US2007/0207210A1因此未提供降低胰岛素给药频率的解决方法。
定义
用于理解本发明的一些相关定义如下阐述。
本申请使用的术语“基本上没爆发(substantially no burst)”或者“基本上无爆发(substantially burstless)”(两个术语在本发明中可互换使用)意指在给药胰岛素化合物(其可为前药或者活性胰岛素化合物)后，在给药(诸如皮下或者肌内给药)后的首48小时内可检测的胰岛素化合物在血浆中的峰浓度与在给药后的首48小时内在峰浓度之后的可检测的胰岛素化合物在血浆中的最低浓度的比例小于2(基本上无可检测的爆发)，优选小于1.5(无可检测的爆发)。
本申请使用的术语“爆发”意指在给药胰岛素化合物(其可为前药或者活性胰岛素化合物)后，在给药(诸如皮下或者肌内给药)后的首48小时内可检测的胰岛素化合物在血浆中的峰浓度与在给药后的首48小时内在峰浓度之后的可检测的胰岛素化合物在血浆中的最低浓度的比例为2或者更高。
关于在血浆中检测胰岛素化合物，所述胰岛素化合物可为给药的胰岛素化合物的结构完整的形式，或者在所述胰岛素化合物为前药的情况下，所述可检测的胰岛素化合物为由前药(诸如人胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素衍生物及其片段)释放的完整的胰岛素化合物。
本申请使用的术语“GLP-1化合物”意指任何GLP-1化合物，诸如GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)NH2、GLP-1类似物包括GLP-1激动剂。本申请使用的GLP-1激动剂的实例为GLP-1、艾塞那肽(exendin)-3或者艾塞那肽-4激动剂，包括但不限于：
(i)艾塞那肽-4类似物和酰胺化的艾塞那肽-4类似物，在该序列中一个或者多个氨基酸残基已经被不同的氨基酸残基代替，包括N-末端修饰，
(ii)截断的艾塞那肽-4和酰胺化的截断形式，
(iii)截断的艾塞那肽-4和酰胺化的截断形式，在该序列中一个或者多个氨基酸残基已经被不同的氨基酸残基代替，
(iv)GLP-1和酰胺化的GLP-1，
(v)GLP-1-类似物和酰胺化的G1P-1类似物，在该序列中一个或者多个氨基酸残基已经被不同的氨基酸残基代替，包括N-末端修饰，
(vi)截断的GLP-1和酰胺化的截断形式，
(vii)截断的GLP-1和酰胺化的截断形式，在该序列中一个或者多个氨基酸残基已经被不同的氨基酸残基代替，
(viii)已知的物质AVE-0010(ZP-10)(Sanofi-Aventis Zealand Pharma)、BAY-73-7977(Bayer)、TH-0318、BIM-51077(Ipsen，Tejin，Roche)、NN-2211(Novo Nordisk)、LY315902。
GLP-1激动剂通过如下步骤模拟天然GLP-1的活性：结合一种或者多种受体(在此GLP-1展现其作为促胰岛素且在治疗糖尿病中有益的作用)或者模拟艾塞那肽对尿流的作用、减缓胃排空的作用、诱发饱腹感的作用、增加尿钠外排的作用和/或者降低尿钾浓度的作用，其通过与一种或者多种受体(其中艾塞那肽引起上述这些作用)结合。
本申请使用的术语“峰/谷比”意指在给药之间的给定时间内胰岛素化合物诸如人胰岛素的最高血浆浓度和最低血浆浓度之间的比例。
本申请使用的术语“结构完整的胰岛素化合物”意指由称为A-链和B-链的两个肽(其通过两个二硫键连接)构成的完整的胰岛素。此外，所述A-链含有分子内二硫键。分子内或者分子间二硫键的缺失或者两个链的重排(如A-A或者B-B同二聚体)可引起胰岛素失活。结构完整性通过如下步骤来测量：将胰岛素用适当的内切蛋白酶例如endo-gluC消化，并且通过质谱分析所得的片段。由单一胰岛素链导致的信号的缺失表明胰岛素完整。本申请使用的术语“前药”意指在显示其药理学作用之前经历生物转化的胰岛素化合物。由此前药可被视为含有特定无毒性保护基团的生物活性部分，所述保护基团按瞬时方式使用以改变或者消除母体分子的不预期性质。例如，所述前药可为可生物水解的酰胺和可生物水解的酯且也涵盖这样的化合物：a)其中在所述前药中的可生物水解的官能团涵盖在所述化合物中，以及b)可在给定的官能团上进行生物氧化或者还原。典型的前药可为载体连接的前药，其含有给定活性物质与瞬时载体基团的暂时连接键，所述载体基团产生改善的物理化学或者药物代谢动力学性质且可在体内容易地移去(通常通过水解裂解)；级联前药，其中载体基团的裂解仅在使活性基团暴露之后变得有效。
为了增强药物诸如胰岛素的体内物理化学或者药物代谢动力学性质，所述药物可与载体结合。如果所述药物与载体和/或者衔接物瞬时连接，则所述系统通常指定为载体连接的前药。根据IUPAC提供的定义(http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem所给出，于2009年7月22日访问)，载体连接的前药为这样的前药，其含有给定活性物质与瞬时载体基团的暂时连接键，所述载体基团产生改善的物理化学或者药物代谢动力学性质且可在体内容易地移去(通常通过水解裂解)。
在所述载体连接的前药中采用的衔接物为暂时的，这表示它们在生理条件(含水缓冲液，pH 7.4，37℃)下为非酶水解可降解的(裂解的)，具有范围为例如一小时至三个月的半衰期。
适当的载体为聚合物且可与衔接物直接结合或者经不可裂解的间隔物结合。“胰岛素-水凝胶前药”是指前药，其中所述胰岛素与水凝胶载体瞬时连接。术语“水凝胶前药”和“水凝胶连接的前药”是指与水凝胶瞬时连接的生物活性剂的前药，且它们同义使用。
术语″药物″、″生物活性分子″、″生物活性部分″、″生物活性剂″、″活性剂″等是指可影响生物有机体(包括但不限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人)的任何物理或者生物化学性质的任何物质。特别地，本申请使用的生物活性分子包括用于诊断、治愈、缓解、治疗或者预防人或者其它动物的疾病或者增强人或者动物的身体或者精神健康的任何物质。
本申请使用的胰岛素的″治疗有效量″是指足以治愈、减轻或者部分抑制给定疾病及其并发症的临床表现的量。将适于完成该目的的量定义为″治疗有效量″。对于每个目的的有效量取决于疾病或者损伤的严重度以及受试者的体重和一般健康状态。应该理解的是确定适当剂量可使用常规试验通过建立数值的矩阵并测试该矩阵的不同点来实现，所有这些均在训练有素的医师的常规技术范围内。
“稳定的”和“稳定性”是指在指定的储存时间内，水凝胶结合物保持结合状态且不发生显著程度的水解并且显示与胰岛素相关的可接受的杂质分布。为了被认定为是稳定的，组合物含有小于5％的游离形式的药物。
本申请使用的术语“生物可水解的酯”为化合物的酯，其a)不干扰母体物质的生物活性而赋予该物质体内有益性质诸如作用持续时间、作用起始等，或者b)为生物学惰性的，但在受试者体内容易转化为生物活性成分。
本申请使用的术语“生物可水解的酰胺”为化合物的酰胺，其a)不干扰母体物质的生物活性而赋予该物质体内有益性质诸如作用持续时间、作用起始等，或者b)为生物学惰性的，但在受试者体内容易转化为生物活性成分。
本申请使用的术语“水凝胶”意指能够容乃大量水的亲水或者两亲聚合物三维网络。该网络由均聚物或者共聚物构成，由于共价化学或者物理(离子的、疏水性相互作用、牵连)交联的存在而不溶。所述交联向网络提供结构和物理完整性。水凝胶显示与水的热力学相容性，这允许它们在含水介质中溶胀。所述网络的链以如下方式连接：存在孔隙且大部分的这些孔隙的尺寸在1nm和1000nm之间。
术语“凝胶”是指不交联的、胶状聚合物溶液。
本申请使用的术语“贮药库”意指药物递送系统，典型地作为胰岛素化合物的皮下或者肌内给药注射进行注射，其能够在延长的时间内持续释放活性化合物。
本申请使用的术语“峰浓度”意指在给药胰岛素化合物后得到的最高浓度。
本申请使用的术语“胰岛素化合物”意指哺乳动物来源的任何胰岛素，诸如在CysA7和CysB7之间且在CysA20和CysB19之间具有二硫键以及在CysA6和CysA11之间具有内部二硫键的人胰岛素、猪胰岛素或者牛胰岛素，重组体哺乳动物胰岛素，诸如重组体人胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素衍生物，以及它们的片段，典型的实例为重组胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、谷赖胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、与低分子量PEG结合的胰岛素，其中所述低分子量PEG具有小于10kDa的分子量。所述胰岛素化合物可为前药的形式，在这种情况下，在血浆释放的化合物为在给药前药后形成的活性胰岛素。
本申请使用的″胰岛素类似物″是指多肽，其具有在形式上可通过删除和/或者交换在天然存在的胰岛素上存在的至少一个氨基酸残基和/或者加入至少一个氨基酸残基而衍生自天然存在的胰岛素例如人胰岛素的结构的分子结构。所述加入的和/或者交换的氨基酸残基可为可编码的氨基酸残基或者其它天然存在的残基或者纯合成的氨基酸残基。
胰岛素类似物可为这样的：其中B链的28位可从天然脯氨酸残基修饰为Asp、Lys或者lie中的一个。在另一方面，B29位的Lys修饰为Pro。此外，A21位的Asn可修饰为Ala、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或者Val，特别是Gly、Ala、Ser或者Thr且优选地Gly。此外，B3位的Asn可修饰为Lys或者Asp。胰岛素类似物的另外的实例为des(B30)人胰岛素；des(B30)人胰岛素类似物；其中PheB1已经删除的胰岛素类似物；其中A-链和/或者B-链具有N-末端伸长的胰岛素类似物，以及其中A-链和/或者B-链具有C-末端伸长的胰岛素类似物。由此，一个或者两个Arg可加入至B1位。
″desB30胰岛素″、″desB30人胰岛素″意指缺乏B30氨基酸残基的天然胰岛素或者其类似物。类似地，″desB29desB30胰岛素″或者″desB29desB30人胰岛素″是指缺乏B29和B30氨基酸残基的天然胰岛素或者其类似物。
″B1″、″A1″等是指分别在胰岛素B-链的1位(由N-末端开始计算)的氨基酸残基以及在胰岛素A-链的1位(由N-末端开始计算)的氨基酸残基。也可表示出在特定位置的氨基酸残基，例如PheB1，这表示B1位的氨基酸残基为苯丙氨酸残基。
本申请使用的术语“非活性衔接物”是指不显示衍生自生物活性剂的药物的药理作用的衔接物。
本申请使用的术语“烷基”是指直链或者支链碳链。烷基碳的每个氢可被取代基取代。
本申请使用的术语″C1-4烷基″是指具有1-4个碳原子的烷基链，例如存在于分子末端的烷基链：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或者例如当两个分子部分经烷基连接时，-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-4烷基碳的各氢可被取代基取代。
本申请使用的术语″C1-6烷基″是指具有1-6个碳原子的烷基链，例如存在于分子末端的烷基链：C1-4烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基，或者例如当两个分子部分经烷基连接时，-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-6烷基碳的每个氢可被取代基取代。
因此，“C1-18烷基”是指具有1至18个碳原子的烷基链且“C8-18烷基”是指具有8至18个碳原子的烷基链。因此，“C1-50烷基”是指具有1至50个碳原子的烷基链。
本申请使用的术语“C2-50烯基”是指具有2至50个碳原子的支链或者非支链的烯基链，例如存在于分子末端的烯基链：-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CH-CH2-CH3、-CH＝CH-CH＝CH2，或者例如当两个分子部分经烯基连接时，-CH＝CH-。C2-50烯基碳的每个氢可被进一步说明的取代基取代。因此，术语“烯基”涉及具有至少一个碳碳双键的碳链。优选地，可存在一个或者多个三键。
本申请使用的术语“C2-50炔基”是指具有2至50个碳原子的支链或者非支链的炔基链，例如存在于分子末端的炔基链：-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH、CH2-C≡C-CH3，或者例如当两个分子部分经炔基连接时，-C≡C-。C2-50炔基碳的每个氢可被进一步说明的取代基取代。因此，术语“炔基”涉及具有至少一个碳碳三键的碳链。优选地，可存在一个或者多个双键。
本申请使用的术语″C3-7环烷基″或者″C3-7环烷基环″是指具有3至7个碳原子的环状烷基链，其可具有碳碳双键且为至少部分饱和的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基。环烷基碳的每个氢可被取代基取代。术语″C3-7环烷基″或者″C3-7环烷基环″也包括桥接二环，如降冰片烷或者降冰片烯。因此，″C3-5环烷基″是指具有3至5个碳原子的环烷基。
因此，“C3-10环烷基”是指具有3至10个碳原子的环状烷基，例如C3-7环烷基；环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。术语“C3-10环烷基”也包括至少部分饱和的碳单环和二环。
本申请使用的术语″卤素″是指氟、氯、溴或者碘。通常优选的是卤素为氟或者氯。
本申请使用的术语″4至7元杂环基″或者″4至7元杂环″是指具有4、5、6或者7个环原子的环，其可含有至多为最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或者不饱和的芳族或者非芳族环)，其中至少一个环原子且至多4个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子取代且其中所述环经碳或者氮原子连接至分子的剩余部分。4至7元杂环的实例为氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、异噁唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷、氮杂
Figure BDA0000148803070000101
或者高哌嗪。
本申请使用的术语″9至11元杂二环基″或者″9至11元杂二环″是指具有9至11个环原子的两个环的杂环系统，其中至少一个环原子被两个环共享且所述杂环系统可含有至多为最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或者不饱和的芳族或者非芳族环)，其中至少一个环原子且至多6个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子取代且其中所述环经碳或者氮原子连接至分子的剩余部分。9至11元杂二环的实例为吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂
Figure BDA0000148803070000111
嘌呤或者蝶啶。术语9至11元杂二环也包括两个环的螺结构，如1，4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷，或者桥接的杂环结构，如8-氮杂-二环[3.2.1]辛烷。
本申请使用的术语术语“药用”表示经管理机构诸如EMEA(Europe)和/或者FDA(US)和/或者任何其它国家管理机构所批准在动物优选人中使用的。
本申请使用的术语″药物组合物″或者“组合物”是指一种或者多种活性成分，和一种或者多种惰性成分，以及任何产物，其直接或者间接通过以下方式来产生：任何两种或者多种成分的组合、络合或者聚集，或者一种或者多种成分的解离，或者一种或者多种成分的其它类型的反应或者相互作用。因此，本发明的药物组合物涵盖通过将本发明化合物和药用赋形剂(药用载体)混合来制备的任何组合物。
药物的“游离形式”是指呈其未修饰的、药理活性形式(诸如在从聚合物结合物中释出之后)的药物。
“干燥组合物”表示在容器中以干燥形式提供的胰岛素水凝胶前药组合物。干燥的适当方法为喷雾干燥和低压冻干(冷冻干燥)。胰岛素水凝胶前药的所述干燥组合物具有最大为10％、优选为小于5％且更优选为小于2％(根据Karl Fischer确定)的剩余含水量。干燥的优选方法为低压冻干。“低压冻干组合物”表示首先冷冻且随后经历减压方式除水的胰岛素水凝胶聚合物前药组合物。该术语不排除发生在组合物装填至最终容器之前的制造过程中的额外干燥步骤。
“低压冻干”(冷冻干燥)为脱水过程，其特征在于冷冻组合物，然后降低周围压力，且任选地加热以允许组合物中的冷冻水直接由固相升华为气体。典型地，升华的水通过凝结来收集。
“重建”表示加入液体以使组合物回到原始形式。
“重建溶液”是指在对有需要的患者给药之前用于重建胰岛素水凝胶前药的干燥组合物的液体。
“容器”表示其中胰岛素水凝胶前药组合物包括在内且可储存直到重建的任何容器。
本申请使用的胰岛素化合物的″治疗有效量″是指足以治愈、减轻或者部分抑制给定疾病及其并发症的临床表现的量。将适于完成该目的的量定义为″治疗有效量″。对于每个目的的有效量取决于疾病或者损伤的严重度以及受试者的体重和一般健康状态。应该理解的是确定适当剂量可使用常规试验通过建立数值的矩阵并测试该矩阵的不同点来实现，所有这些均在训练有素的医师或者兽医的常规技术范围内。
“缓冲液”或者“缓冲剂”是指维持pH在预期范围内的化合物。生理耐受缓冲液为例如磷酸钠、琥珀酸钠、组氨酸钠、碳酸氢钠、枸橼酸钠和乙酸钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钠、丙酮酸钠。也可使用抗酸剂诸如Mg(OH)2或者ZnCO3。可调节缓冲能力以符合对pH稳定性最敏感的条件。
“赋形剂”是指与治疗剂一起给药的化合物，例如缓冲剂、等渗调节剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂或者其它辅助剂。然而，在一些情况下，一种赋形剂可具有双重或者三重功能。
″冻干保护剂″为这样的分子，当与感兴趣的蛋白质混合时，其在一般干燥时和特别地在冷冻干燥以及随后的储存过程中显著避免或者降低蛋白质的化学和/或者物理不稳定性。示例性冻干保护剂包括糖类，诸如蔗糖或者海藻糖；氨基酸，诸如谷氨酸钠或者组氨酸钠；甲基胺，诸如甜菜碱；易容盐类，诸如硫酸镁；多元醇，诸如三元或者更多元的糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；乙二醇；丙二醇；聚乙二醇；普郎尼克类(pluronics)；羟基烷基淀粉类，例如羟基乙基淀粉(HES)，以及它们的组合。
“表面活性剂”是指降低液体的表面张力的湿润剂。
“等渗调节剂”是指最小化可由细胞损伤导致的疼痛的化合物，所述细胞损伤由于在注射位点的渗透压差异所导致。
术语“稳定剂”是指用于稳定聚合物前药的化合物。稳定作用通过加强蛋白质稳定力、变性状态的去稳定化或者赋形剂与蛋白质的直接结合来实现。
“抗吸附剂”是指用于与组合物容器的内表面竞争性包衣或者吸附的主要离子型或者非离子型表面活性剂或者其它蛋白质或者可溶聚合物。赋形剂的选择浓度和类型取决于应避免的作用，但典型地在恰好高于CMC值在界面处形成单层的表面活性剂。
“氧化保护剂”是指抗氧化剂，诸如抗坏血酸、四氢甲基嘧啶羧酸(ectoine)、蛋氨酸、谷胱甘肽、单硫代甘油、桑色素、聚乙烯亚胺(PEI)、没食子酸丙酯、维生素E、螯合剂诸如枸橼酸、EDTA、六磷酸酯(盐)、巯基乙酸。
“抗菌剂”是指杀死或者抑制微生物(诸如细菌、真菌、酵母、原生动物)生长和/或者消灭病毒的化学物质。
“密封容器”表示容器以如下方式密闭：气密的，不允许气体在外部和内部之间交换以及保持内容物无菌。
″药用″意指涵盖任何赋形剂和/或者添加剂，其不干扰活性成分的生物活性的有效性且对所给药的宿主无毒性。
术语“试剂”是指在获得本发明前药的装配过程中使用的中间体或者起始物质。
术语“化学官能团”是指羧酸和活化衍生基团、氨基、马来酰亚胺、硫醇和衍生基团、磺酸和衍生基团、碳酸酯和衍生基团、氨基甲酸酯和衍生基团、羟基、醛、酮、肼、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磷酸和衍生基团、膦酸和衍生基团、卤代乙酰基、烷基卤、丙烯酰和其它α-β不饱和Michael受体、芳化剂如芳基氟、羟基胺、二硫化物如吡啶基二硫化物、乙烯基砜、乙烯基酮、重氮烷、重氮基乙酰基化合物、环氧乙烷和氮丙啶。
如果化学官能团与另外的化学官能团偶联，则所得的化学结构称为“连接键”。例如，氨基与羧基的反应得到酰胺连接键。
“反应官能团”为主链部分的化学官能团，其与超支化部分连接。
“官能团”为用于“反应官能团”、“可降解相互连接的官能团”或者“结合物官能团”的集体术语。
“可降解相互连接的官能团”为包含生物可降解化学键的连接键，所述生物可降解化学键在一侧与连接主链部分的间隔物部分相连接且在另一侧与交联部分相连接。术语“可降解相互连接的官能团”、“生物可降解相互连接的官能团”、“相互连接的生物可降解官能团”和“相互连接的官能团”同义使用。
术语“阻断基团”或者“封端基团”同义使用且是指不可逆地与反应官能团连接以使得它们不能与例如化学官能团反应的部分。
术语“保护基团(protecting group)”或者“保护性基团(protective group)”是指不可逆地与反应官能团连接以使得它们不能与例如其它化学官能团反应的部分。
术语“相互连接的官能团”是指化学官能团，其参与自由基聚合反应且作为交联试剂或者主链试剂的一部分。
术语“可聚合官能团”是指化学官能团，其参与配位型聚合反应且作为交联试剂和主链试剂的一部分。
对于相互连接的官能团，术语“水解可降解的”在本发明上下文中是指连接键，其在生理条件(含水缓冲液，pH 7.4，37℃)下是非酶水解可降解的，且具有一小时至三个月范围的半衰期，包括但不限于乌头类(aconityl)、缩醛、羧酸酐、酯、亚胺、腙、马来酰胺酸酰胺、原酸酯、磷酰胺、磷酸酯、磷酸甲硅烷基酯(phosphosilyl ester)、甲硅烷基酯、磺酸酯、芳香氨基甲酸酯及其它们的组合，等等。优选的生物可降解的连接键为羧酸酯、碳酸酯、磷酸酯和磺酸酯且最优选的为羧酸酯或者碳酸酯。应该理解的是对于体外研究，加速条件例如pH 9、37℃、含水缓冲液可用于实践目的。
主链部分可包含间隔物部分，其在一端与主链部分相连接且在另一侧与交联部分相连接。
术语“衍生物”是指适当取代有保护和/或者活化基团的化学官能团，或者本领域技术人员已知的相应的化学官能团的活化形式。例如，羧基的活化形式包括但不限于活性酯，诸如琥珀酰亚氨基酯、苯并三嗪基酯(benzotriazylester)、硝基苯基酯、五氟苯基酯、氮杂苯并三嗪基酯(azabenzotriazyl ester)、酰基卤化物、混合或者对称的酐、酰基咪唑。
术语“非酶可裂解的衔接物”是指在无酶活性的生理条件下为可水解降解的衔接物。
“非生物活性衔接物”是指不显示衍生自生物活性部分的药物(D-H)的药理作用的衔接物。
术语“间隔物”、“间隔物基团”、“间隔物分子”和“间隔物部分”可交换使用且如果用于描述存在于本发明水凝胶载体的部分时，其是指适于连接两个部分的任何部分，诸如C1-50烷基、C2-50烯基或者C2-50炔基，该片段任选被选自下述的一种或者多种基团中断：-NH-、-N(C1-4烷基)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C1-4烷基)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、4至7元杂环基、苯基或者萘基。
术语“末端(terminal)”、“末端(terminus)”或者“末端(distal end)”是指分子或者部分内的官能团或者连接键的位置，由此所述官能团可为化学官能团且所述连接键可为可降解或者持久的连接键，其特征在于位于与在两个部分之间的连接键邻近的位置或者在所述连接键内的位置或者在低聚物或者聚合链末端的位置。
短语“结合形式(in bound form)”或者“部分”是指作为较大分子的一部分的亚结构。短语“结合形式”用于通过命名或者列出本领域熟知的试剂、起始物质或者假定的起始物质来简化对部分的提及，且由此“结合形式”表示例如一个或者多个氢基团(-H)或者一个或者多个存在于试剂或者起始物质中的活化或者保护基团不存在于所述部分中。
应该理解的是包含聚合部分的所有试剂和部分是指已知在分子量、链长或者聚合度或者官能团数目方面显示可变性的大分子实体。主链试剂、主链部分、交联试剂和交联部分所显示的结构因此仅为代表性实例。
试剂或者部分可为直链或者支链的。如果所述试剂或者部分具有两个末端基团，则其是指直链试剂或者部分。如果所述试剂或者部分具有多于两个末端基团，则认为其为支链的或者多官能团的试剂或者部分。
术语“基于聚(乙二醇)的聚合链”或者“基于PEG的链”是指寡-或者聚合分子链。
优选地，所述基于聚(乙二醇)的聚合链与支化中心连接，其为直链聚(乙二醇)链，其一个末端与所述支化中心连接且另一个末端与超支化树状部分连接。应该理解的是基于PEG的链可被任选取代有杂原子和化学官能团的烷基或者芳基封端或者中断。
如果术语“基于聚(乙二醇)的聚合链”就交联试剂而言进行使用，则其是指包含至少20wt％乙二醇部分的交联部分或者链。
本申请使用的术语“一个”、“一种”和“该”和类似术语应该理解为涵盖单数和复数，除非在本申请另作说明或者与上下文明显矛盾。
发明内容
本发明涉及针对基础胰岛素作用范围的长效胰岛素制剂。基础胰岛素为胰岛素或者设计用于模拟胰β细胞的基础胰岛素输出的胰岛素类似物的长效配方。最理想的是由此在整个给药间隔以持续方式有效控制血糖。
本发明人已经发现胰岛素化合物可在给药之间从可注射贮药库(诸如皮下)中以结构完整的形式持续释放而未观察到任何爆发作用。释放的胰岛素化合物的结构完整性由充分水合的聚合物基质通过最小化胰岛素分子的分子间接触来提供。此外，通过避免胰岛素爆发，患者的有害副作用的风险得以降低。
本发明由于缺乏爆发式胰岛素释放而降低了在给药后低血糖的风险，降低了在给药末期高血糖症的风险，降低了注射频率，且提供了可预测的患者血浆中的胰岛素水平。
本发明的另一个目标是提供相比于目前每日基础胰岛素给药方案而言需要较少频率的注射的新的基础胰岛素，并且所述新的基础胰岛素通过在注射之间的全部间隔时间内释放结构完整的胰岛素来提供高水平的安全性并且典型地具有小于2的峰/谷比。
当阅读发明内容时将明白其它优点。
在第一方面，本发明涉及包含胰岛素化合物的药物组合物，所述胰岛素化合物的浓度足以将所述胰岛素化合物在血浆中的治疗有效水平维持至少三天(典型地至少80小时，例如一周或者更长时间)，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的体内药物代谢动力学分布。
所述浓度将在受试者之间变化且取决于各个受试者的治疗窗，但为了使治疗作用存在至少3天，例如一周(即约7天)，所述浓度典型地为至少约10mg/ml，例如多于10mg/ml。
因此，在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含以至少10mg/ml的浓度的胰岛素化合物，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的体内药物代谢动力学分布。
在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含按照至少10mg胰岛素化合物的单一剂量给药的以至少11mg/mL的浓度的胰岛素化合物。
本申请使用的单一胰岛素化合物剂量以mg给出且药物组合物中的胰岛素化合物的浓度以mg/mL给出。如果胰岛素化合物为前药，则浓度基于来自前药的游离胰岛素的定量释放。根据本领域熟知的方法，使组合物的等分样经历胰岛素释放条件(含水缓冲液，pH 7.4，37℃，或者pH升高的加速条件)，直到未观察到胰岛素浓度的显著提高并确定释放的胰岛素总量。应该理解的是，在可溶载体的情况下，定量释放与定量水解同义。
在本发明的一个实施方案中，胰岛素化合物的浓度为至少11mg/ml，诸如11mg/ml至35mg/ml，更优选为15mg/ml至25mg/ml，甚至更优选为约20mg/ml，且甚至更优选为约24mg/ml。
为了给药有效剂量例如通过注射器对受试者(诸如人)给药的体积优选地小于1.5ml，典型地为1.0ml或者更小。
在另一个实施方案中，胰岛素化合物的单一剂量为至少5mg，诸如5mg至100mg，更优选为5mg至50mg，且更优选为5mg至25mg。
在另一个实施方案中，在给药(诸如皮下或者肌内注射)后的首48小时内胰岛素化合物在血浆中的峰浓度与在给药后的首48小时内峰浓度后的胰岛素化合物在血浆中的最低浓度的比例小于2，典型地小于1.5。
上述实施方案以及此后所述的实施方案应该理解为适用于本申请所述的任何一个方面以及本申请所述的任何一个实施方案，除非具体指出实施方案涉及本发明某种或者某些方面。
所述药物组合物典型地为包含胰岛素化合物的控制递送系统，其特征在于将胰岛素化合物以基本上不经历爆发的方式递送至哺乳动物血浆。
在又一个实施方案中，药物代谢动力学分布在哺乳动物血浆诸如人血浆中测量。血浆胰岛素浓度可用可商购得到的ELISA试剂盒通过下面方法测量：将结果与由标准胰岛素获得的校正曲线关联。对于统计学显著性，试验使用适当数目的生物学和技术复制品来进行并且计算平均值和中位值以针对生物学和技术可变性进行调整。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于显示小于2的峰/谷比，典型地小于1.75，优选小于1.5，或者更优选小于1.25的峰/谷比。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于在给药之间的全部时间内结构完整的胰岛素化合物的持续释放。
“持续释放”是指胰岛素的未中断的释放。
在另一个实施方案中，给药之间的全部时间为至少约80小时，诸如约110小时，典型地至少一周，诸如1-2周或者更长时间。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物为前药。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物为载体连接的前药。
在另一个实施方案中，胰岛素化合物为级联(cascade)前药。
所述前药可作为液体(诸如溶液剂或者凝胶)给药，或者可包含在贮药库中，或者甚至可整合至贮药库中，由此该贮药库作为前药起作用。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物完全包含在贮药库中。
术语“完全包含”是指这样的贮药库，其中在将1ml水加入1ml贮药库中、混合并分离贮药库和水后，小于10％的药物即胰岛素存在于水成分中。
在另一个实施方案中，所述贮药库为聚合物凝胶，诸如水凝胶。
在另一个实施方案中，所述贮药库为充分水合的聚合物基质。
所述胰岛素化合物可以若干方式包含在贮药库中，例如所述胰岛素化合物可以非共价方式结合或者所述胰岛素化合物与贮药库共价连接，其中贮药库非限制性选自聚合物凝胶、水凝胶或者充分水合的聚合物基质。适当的聚合物的非限制性实例为能够形成准无限(quasi-infinite)的充分水合的三维分子网络的聚合物。所述水凝胶为化学或者物理交联的官能化或者非官能化的基于聚烷基氧基的聚合物如聚(丙二醇)或者聚(乙二醇)、右旋糖酐、壳聚糖、透明质酸和衍生物、藻朊酸盐、木聚糖、甘露聚糖、角叉藻聚糖、琼脂糖、纤维素、淀粉、羟基乙基淀粉(HES)和其它基于糖类的聚合物、聚(乙烯醇)、聚(噁唑啉)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚氨酯、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)诸如聚(羟基丙基异丁烯酰胺)(HMPA)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)如聚(羟基乙基异丁烯酸酯)、聚(有机磷腈)、聚(硅氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(酯)诸如聚(乳酸)或者聚(羟乙酸)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(氨基酸)诸如聚(谷氨酸)或者聚(赖氨酸)、胶原、明胶、共聚物、移植共聚物、交联聚合物、水凝胶和来自上面列出的聚合物的嵌段共聚物。这些聚合物可作为主链部分或者交联部分，并且不同聚合物的组合作为共聚物是可能的，条件是高水平的分子网状结构的水合。除了上面列出的聚合物类型的低聚或者聚合交联部分之外，可使用低分子量交联部分，特别是当亲水高分子量主链部分用于形成水凝胶前药载体时。
最小化分子水平的胰岛素间接触的一个方式是将胰岛素分子在充分水合的聚合物基质中均匀间隔。均匀间隔(homogeneous spacing)可通过胰岛素与聚合物的共价连接且使用在中性pH的含水环境中裂解的衔接物来实现，确保结构完整的胰岛素的缓慢释放。
优选的是基本不具有生物活性的聚合物连接的胰岛素前药，引起所有促胰岛素活性的所述性质归因于释放的胰岛素。因此，通过操纵(engineering)前药的释放性质，可实现对胰岛素血浆水平的高度控制。
胰岛素可经分子提供的所有相关官能团进行连接，且所述由生物源氨基酸提供的优选的官能团典型地选自胍基、咪唑基、吲哚基、羧基、甲酰氨基、伯羟基和仲羟基、苯酚和伯氨基。例如，人胰岛素具有下述相关的官能团：羧基、羧基酰胺、伯羟基和仲羟基、苯酚、咪唑基和伯氨基。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物与前药载体通过如下方式连接：与赖氨酸部分共价连接和/或者与胰岛素化合物的A-链和/或者B-链的N-末端共价连接。
在一具体的实施方案中，所述前药或者其药用盐包含胰岛素衔接物结合物D-L，其中
D表示胰岛素部分；且
-L为式(I)表示的非生物活性衔接物部分-L1，
Figure BDA0000148803070000191
其中虚线表示通过形成酰胺键与胰岛素的氨基中的一个连接；
X为C(R3R3a)；或者N(R3)；
R1a、R3a独立选自H、NH(R2b)、N(R2b)C(O)R4和C1-4烷基；
R1、R2、R2a、R2b、R3、R4独立选自H和C1-4烷基，
其中L1取代有一个L2-Z且任选进一步被取代，条件是式(I)中用星号标记的氢不被取代基取代且其中：
L2为单一化学键或者间隔物；且
Z为水凝胶。
在式(I)的化合物含有一个或者多个酸性基团或者碱性基团的情况下，本发明也包括它们相应的药用或者毒理学可接受的盐，特别是它们的可药用盐。因此，含有酸性基团的式(I)的化合物可根据本发明使用，例如，作为碱金属盐、碱土金属盐或者铵盐使用。所述盐的更精确实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或者与氨或者有机胺(例如乙基胺、乙醇胺、三乙醇胺或者氨基酸)的盐。含有一个或者多个碱性基团的式(I)的化合物(即可被质子化的基团)可以以它们的与无机酸或者有机酸的加成盐的形式存在且可根据本发明使用。适当的酸的实例包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、枸橼酸、已二酸以及本领域技术人员已知的其它酸。如果式(I)的化合物在分子中同时含有酸性和碱性基团，则本发明除了提及的盐形式之外，也包括内盐或者甜菜碱(两性离子)。式(I)的各个盐可通过本领域技术人员已知的常规方法来获得，例如通过使其与有机或者无机的酸或碱在溶剂或者分散剂中接触，或者通过与其它盐的阴离子交换或者阳离子交换。本发明也包括式(I)的化合物的所有盐，其由于具有低生理学相容性而不能直接适于在药物制剂中使用，但是可例如用作化学反应或者药用盐制备的中间体。
优选地，在式(I)中，R2被L2-Z代替。
优选地，在式(I)中，R1被L2-Z代替。
优选地，在式(I)中，X为N(R3)。
优选地，在式(I)中，X为C(R3R3a)且R3a为N(R2b)C(O)R4。
优选地，X为C(R3R3a)，R3a为N(R2b)-L2-Z。
本发明的优选的前药包含胰岛素衔接物结合物D-L，其中式(I)的L1由式(Ia)、(Ib)、(Ic)或者(Id)表示：
Figure BDA0000148803070000201
Figure BDA0000148803070000211
其中R1、R1a、R2、R2a、R2b、R3、R4、L2、Z具有本申请说明的涵义且其中L1任选进一步被取代，条件是式(Ia)至(Id)中用星号标记的氢不被取代基取代。
优选地，L1不进一步被取代(除了必须取代基L2-Z之外)。
如在例如式(Ia)至(Id)中显示，一个氢被基团L2-Z代替。
一般地，L2可在任何位置(除了代替式(I)中用星号标记的氢之外)与L1连接。优选地，R1、R1a、R2、R2a、R2b、R3、R3a、R4直接给出的氢或者作为C1-4烷基或者其它基团的氢中一个氢被L2-Z代替。
此外，L1可任选进一步被取代。一般地，在裂解成分不受影响的情况下可使用任何取代基。然而，优选的是L1不进一步被取代。
优选地，一个或者多个进一步优选的取代基独立选自氢、CN、COOR9、OR9、C(O)R9、C(O)N(R9R9a)、S(O)2N(R9R9a)、S(O)N(R9R9a)、S(O)2R9、S(O)R9、N(R9)S(O)2N(R9aR9b)、SR9、N(R9R9a)、NO2、OC(O)R9、N(R9)C(O)R9a、N(R9)S(O)2R9a、N(R9)S(O)R9a、N(R9)C(O)OR9a、N(R9)C(O)N(R9aR9b)、OC(O)N(R9R9a)、T、C1-50烷基、C2-50烯基或者C2-50炔基，其中T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选取代有一个或者多个相同的或者不同的R10，且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或者多个选自下述的基团中断：T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R11)-、-S(O)2N(R11)-、-S(O)N(R11)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R11)S(O)2N(R11a)-、-S-、-N(R11)-、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)-、-N(R11)S(O)2-、-N(R11)S(O)-、-N(R11)C(O)O-、-N(R11)C(O)N(R11a)-和-OC(O)N(R11R11a)；
R9、R9a、R9b独立选自H、T和C1-50烷基、C2-50烯基或者C2-50炔基，其中T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选取代有一个或者多个相同的或者不同的R10，且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或者多个选自下述的基团中断：T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R11)-、-S(O)2N(R11)-、-S(O)N(R11)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R11)S(O)2N(R11a)-、-S-、-N(R11)-、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)-、-N(R11)S(O)2-、-N(R11)S(O)-、-N(R11)C(O)O-、-N(R11)C(O)N(R11a)-和-OC(O)N(R11R11a)；
T选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、4至7元杂环基或者9至11元杂二环基，其中T任选取代有一个或者多个相同的或者不同的R10；
R10为氢、CN、氧代(＝O)、COOR12、OR12、C(O)R12、C(O)N(R12R12a)、S(O)2N(R12R12a)、S(O)N(R12R12a)、S(O)2R12、S(O)R12、N(R12)S(O)2N(R12aR12b)、SR12、N(R12R12a)、NO2、OC(O)R12、N(R12)C(O)R12a、N(R12)S(O)2R12a、N(R12)S(O)R12a、N(R12)C(O)OR12a、N(R12)C(O)N(R12aR12b)、OC(O)N(R12R12a)或者C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或者多个相同或者不同的卤素；
R11、R11a、R12、R12a、R12b独立选自H或者C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或者多个相同或者不同的卤素。
术语“中断”表示在两个碳之间插入基团或者在碳链末端在碳和氢之间插入基团。
L2为单一化学键或者间隔物。在L2为间隔物的情况下，优选地将其定义为如上定义的一个或者多个任选取代基，条件是L2取代有Z。
因此，当L2不为单一化学键时，L2-Z为COOR9、OR9、C(O)R9、C(O)N(R9R9a)、S(O)2N(R9R9a)、S(O)N(R9R9a)、S(O)2R9、S(O)R9、N(R9)S(O)2N(R9aR9b)、SR9、N(R9R9a)、OC(O)R9、N(R9)C(O)R9a、N(R9)S(O)2R9a、N(R9)S(O)R9a、N(R9)C(O)OR9a、N(R9)C(O)N(R9aR9b)、OC(O)N(R9R9a)、T、C1-50烷基、C2-50烯基或者C2-50炔基，其中T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选取代有一个或者多个R10，其为相同或者不同的且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或者多个选自下述的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R11)-、-S(O)2N(R11)-、-S(O)N(R11)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R11)S(O)2N(R11a)-、-S-、-N(R11)-、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)-、-N(R11)S(O)2-、-N(R11)S(O)-、-N(R11)C(O)O-、-N(R11)C(O)N(R11a)-和-OC(O)N(R11R11a)；
R9、R9a、R9b独立选自H、Z、T和C1-50烷基、C2-50烯基或者C2-50炔基，其中T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选取代有一个或者多个相同或者不同的R10，且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或者多个选自下述的基团中断：T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R11)-、-S(O)2N(R11)-、-S(O)N(R11)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R11)S(O)2N(R11a)-、-S-、-N(R11)-、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)-、-N(R11)S(O)2-、-N(R11)S(O)-、-N(R11)C(O)O-、-N(R11)C(O)N(R11a)-和-OC(O)N(R11R11a)；
T选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、4至7元杂环基或者9至11元杂二环基，其中t任选取代有一个或者多个相同或者不同的R10；
R10为Z、卤素、CN、氧代(＝O)、COOR12、OR12、C(O)R12、C(O)N(R12R12a)、S(O)2N(R12R12a)、S(O)N(R12R12a)、S(O)2R12、S(O)R12、N(R12)S(O)2N(R12aR12b)、SR12、N(R12R12a)、NO2、OC(O)R12、N(R12)C(O)R12a、N(R12)S(O)2R12a、N(R12)S(O)R12a、N(R12)C(O)OR12a、N(R12)C(O)N(R12aR12b)、OC(O)N(R12R12a)或者C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或者多个相同或者不同的卤素；
R11、R11a、R12、R12a、R12b独立选自H、Z或者C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或者多个相同或者不同的卤素；
条件是R9、R9a、R9b、R10、R11、R11a、R12、R12a、R12b中的一个为Z。
更优选地，L2为C1-20烷基链，其任选被一个或者多个独立选自下述的基团中断：-O-和C(O)N(R3aa)；任选取代有独立选自下述的一个或者多个基团：OH和C(O)N(R3aaR3aaa)；且其中R3aa、R3aaa独立选自H和C1-4烷基。
优选地，L2具有在14g/mol至750g/mol范围内的分子量。
优选地，L2经选自下述的末端基团与Z连接：
Figure BDA0000148803070000231
在L2具有所述末端基团的情况下，进一步优选的是L2具有14g/mol至500g/mol范围内的分子量(不计算所述末端基团)。
优选地，衔接物和水凝胶Z之间形成的共价连接为持久的化学键。
优选地，水凝胶Z为生物可降解的基于聚乙二醇(PEG)的水不溶的水凝胶。本申请理解的术语“基于PEG的”表示PEG链在水凝胶中的质量比例为至少10wt％(基于水凝胶的总量)，优选地至少25％。剩余部分可由其它间隔物和/或者寡聚体或者聚合物(诸如寡或者聚赖氨酸)构成。
此外，术语“水不溶的”是指形成水凝胶的可溶胀的三维交联分子网络。如果混悬在大量过剩的水或者生理学重量克分子渗透压浓度(physiologicalosmolality)的含水缓冲液中，则水凝胶可吸纳大量的水，例如多达10倍(基于w/w)，因此是可溶胀的，但在除去过量的水后其仍然保留凝胶的物理稳定性和形状。所述形状可为任意的几何形状且应该理解的是所述单独的水凝胶对象被当作由组分构成的单一分子，其中各个组分与其它组分经化学键相互连接。
根据本发明，水凝胶可由通过水解可降解的化学键相互连接的主链部分组成。
优选地，所述主链部分具有1kDa至20kDa的分子量，更优选地1kDa至15kDa且甚至更优选地1kDa至10kDa的分子量。所述主链部分也优选的是包含一种或者多种PEG链的基于PEG的部分。
在带有本发明的药物-衔接物结合物的水凝胶中，主链部分的特征在于大量的官能团，包括相互连接的生物可降解的官能团和水凝胶-连接的药物-衔接物结合物以及任选封端基团。这表示主链部分的特征在于大量的水凝胶-连接的药物-衔接物结合物；官能团，包括生物可降解的相互连接的官能团；以及任选封端基团。优选地，相互连接的生物可降解的官能团和药物-衔接物结合物以及封端基团的总数为16-128，优选的20-100，更优选的24-80且最优选的30-60。
优选地，主链部分的相互连接的官能团和水凝胶-连接的药物-衔接物结合物以及封端基团的总数被由支化中心延伸的基于PEG的聚合链数目平分。例如，如果存在32个相互连接的官能团和水凝胶-连接的药物-衔接物结合物以及封端基团，则由所述中心延伸的四个基于PEG的聚合链中的每个可得到8个基团，优选地借助与每个基于PEG的聚合链末端连接的树枝状部分可得到8个基团。可替换地，由所述中心延伸的八个基于PEG的聚合链中的每个可得到四个基团或者16个基于PEG的聚合链中的每个可得到两个基团。如果由所述支化中心延伸的基于PEG的聚合链的数目不允许平均分布，优选的是与每个基于PEG的聚合链的相互连接的官能团和水凝胶-连接的药物-衔接物结合物以及封端基团的总数的平均数的偏差保持最小。
在所述本发明载体连接的前药中，理想的是几乎所有药物释放(＞90％)在显著量的主链部分的释放(＜10％)发生之前已经发生。这可通过调节载体连接的前药的半衰期与本发明水凝胶的降解动力学来实现。
优选地，主链部分的特征在于具有支化中心，其中至少三个基于PEG的聚合链由所述中心延伸。因此，在本发明优选地方面，主链试剂包括支化中心，其中至少三个基于PEG的聚合链由所述中心延伸。所述支化中心可由结合形式的聚-或者寡醇构成，优选为季戊四醇、三季戊四醇、六聚甘油、蔗糖、山梨醇、果糖、甘露醇、葡萄糖、纤维素、直链淀粉、淀粉类、羟基烷基淀粉类、聚乙烯醇、右旋糖酐、透明质酸，或者支化中心可由结合形式的聚-或者寡胺构成，所述胺诸如鸟氨酸、二氨基丁酸、三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸、八赖氨酸、九赖氨酸、十赖氨酸、十一赖氨酸、十二赖氨酸、十三赖氨酸、十四赖氨酸、十五赖氨酸或者寡赖氨酸、聚亚乙基亚胺、聚乙烯胺。
优选地，所述支化中心延伸三至十六个基于PEG的聚合链，更优选地四至八个。优选的支化中心可由结合形式的季戊四醇、鸟氨酸、二氨基丁酸、三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸或者寡赖氨酸、低分子量的PEI、六聚甘油、三季戊四醇构成。优选地，所述支化中心延伸三至十六个基于PEG的聚合链，更优选地四至八个。优选地，基于PEG的聚合链为直链聚(乙二醇)链，其中一个末端与所述支化中心连接且另一个末端与超支化树状部分连接。应该理解的是聚合的基于PEG的链可由任选取代有杂原子和化学官能团的烷基或者芳基封端或者中断。
优选地，基于PEG的聚合链为适当取代的聚乙二醇衍生物(基于PEG的)。
对于主链部分含有的由支化中心延伸的相应的基于PEG的聚合链的优选结构为如在例如JenKem Technology，USA(通过由www.jenkemusa.com于2009年7月28日下载获得)的产品名单中详述的多枝PEG衍生物、4枝-PEG衍生物(季戊四醇中心)、8枝-PEG衍生物(六聚甘油中心)和8枝-PEG衍生物(三季戊四醇中心)。最优选的为4枝PEG胺(季戊四醇中心)和4枝PEG羧基(季戊四醇中心)、8枝PEG胺(六聚甘油中心)、8枝PEG羧基(六聚甘油中心)、8枝PEG胺(三季戊四醇中心)和8枝PEG羧基(三季戊四醇中心)。对于主链部分中的所述多枝PEG-衍生物的优选分子量为1kDa至20kDa，更优选地1kDa至15kDa且甚至更优选地1kDa至10kDa。
应该理解的是上面提及的多枝分子的末端氨基以结合形式存在于主链部分中以进一步提供主链部分的相互连接的官能团和反应官能团。
优选的是主链部分的相互连接的官能团和反应官能团的总数被由支化中心延伸的基于PEG的聚合链的数目平分。如果由支化中心延伸的基于PEG的聚合链的数目不允许平均分布，则优选的是与每个基于PEG的聚合链的相互连接的官能团和反应官能团的总数的平均数的偏差保持最小。
更优选地，主链部分的相互连接的官能团和反应官能团总数被由支化中心延伸的基于PEG的聚合链的数目平分。例如，如果存在32个相互连接的官能团和反应官能团，则由所述中心延伸的四个基于PEG的聚合链中的每个可得到8个基团，优选地借助与每个基于PEG的聚合链末端连接的树枝状部分可得到8个基团。可替换地，由所述中心延伸的八个基于PEG的聚合链中的每个可得到四个基团或者16个基于PEG的聚合链中的每个可得到两个基团。
所述树枝状部分可得到额外的官能团。优选地，每个树枝状部分具有0.4kDa至4kDa的范围内的分子量，更优选地0.4kDa至2kDa的范围内的分子量。优选地，每个树枝状部分具有至少3个分支和至少4个反应官能团，且最多63个分支和64个反应官能团，优选地至少7个分支和至少8个反应官能团且最多31个分支和32个反应官能团。
所述树枝状部分的实例体由结合形式的三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸、八赖氨酸、九赖氨酸、十赖氨酸、十一赖氨酸、十二赖氨酸、十三赖氨酸、十四赖氨酸、十五赖氨酸、十六赖氨酸、十七赖氨酸、十八赖氨酸、十九赖氨酸构成。所述优选的树枝状部分的实例由结合形式的三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸构成，最优选地由结合形式的三赖氨酸、五赖氨酸或者七赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸构成。
最优选地，本发明的水凝胶载体的特征在于所述主链部分具有式C(A-Hyp)4的季碳，其中每个A独立为经固定的共价键与季碳末端连接的基于聚(乙二醇)的聚合链且所述基于PEG的聚合链的末端与树枝状部分Hyp共价结合，具有至少四个官能团的每个树枝状部分Hyp表示相互连接的官能团和反应官能团。
优选地，每个A独立选自式-(CH2)n1(OCH2CH2)nX-，其中n1为1或者2；n为5至50的范围内的整数；且X为共价连接A和Hyp的化学官能团。
优选地，A和Hyp经酰胺连接键共价连接。
优选地，所述树枝状部分Hyp为超支化多肽。优选地，所述超支化多肽包含结合形式的赖氨酸。优选地，每个树枝状部分Hyp具有0.4kDa至4kDa的范围内的分子量。应该理解的是主链部分C(A-Hyp)4可由相同或者不同的树枝状部分Hyp构成且每个Hyp可独立选择。每个部分Hyp由5至32个赖氨酸构成，优选地由至少7个赖氨酸构成，即每个部分Hyp由结合形式的5至32个赖氨酸构成，优选地由结合形式的至少7个赖氨酸构成。最优选地Hyp由七赖氨酸基(heptalysinyl)构成。
主链试剂(更具体地Hyp)的聚合的官能团与基于聚乙二醇的交联试剂的聚合的官能团的反应得到持久的酰胺键。
优选地，C(A-Hyp)4具有1kDa至20kDa的范围内的分子量，更优选地1kDa至15kDa且甚至更优选地1kDa至10kDa的范围内的分子量。
如下显示一个优选的主链部分，虚线表示与交联部分相互连接的生物可降解的连接键且n为5至50的整数：
Figure BDA0000148803070000271
本发明水凝胶的生物可降解性通过引入水解可降解的化学键来实现。
术语“水解可降解的”、“生物可降解的”或者“水解可裂解的”、“自动可裂解的”或者“自身裂解”、“自身裂解的”、“暂时”或者“临时”在本发明的上下文中是指键和连接键，其在生理条件(含水缓冲液，pH 7.4，37℃)下为非酶水解可降解的或者可裂解的，具有一小时至三个月的范围内的半衰期，包括但不限于乌头类、缩醛、酰胺、羧酸酐、酯、亚胺、腙、马来酰胺酸酰胺、原酸酯、磷酰胺、磷酸酯、磷酸甲硅烷基酯、甲硅烷基酯、磺酸酯、芳香氨基甲酸酯以及它们的组合等。
如果存在于本发明的水凝胶中的为可降解的相互连接的官能团，则优选的生物可降解的连接键为酯、碳酸酯、磷酸酯和磺酸酯且最优选的为酯或者碳酸酯。
持久的连接键为在生理条件(含水缓冲液，pH 7.4，37℃)下非酶水解可降解的，具有六个月或者更长的半衰期，例如酰胺。
为了将水解可裂解的键引入至本发明的水凝胶载体中，所述主链部分可通过生物可降解的键直接相互连接。
在一个实施方案中，生物可降解的水凝胶载体的主链部分可直接连接在一起，即无交联部分。所述生物可降解的水凝胶的两个主链部分的超支化树状部分可经连接两个超支化树状部分的相互连接的官能团直接连接。可替换地，两个不同主链部分的两个超支化树状部分可经两个间隔物部分相互连接，所述两个间隔物部分与主链部分连接且在另一侧与由相互连接的官能团分离的交联部分连接。
可替换地，主链部分可经交联部分连接在一起，每个交联部分通过水解可降解的键中的至少两个来封端。除了封端可降解化学键之外，所述交联部分还可含有其它的生物可降解的键。因此，与主链部分连接的交联部分的每个末端包含水解可降解的键，且额外的生物可降解的键可任选存在于交联部分中。
优选地，所述生物可降解的水凝胶载体由通过水解可降解的键相互连接的主链部分构成并且主链部分经交联部分连接在一起。
所述生物可降解的水凝胶载体可含有一种或者多种不同类型的交联部分，优选地一种交联部分。所述交联部分可为直链或者支链分子且优选为直链分子。在本发明优选的实施方案中，所述交联部分经至少两个生物可降解的键与主链部分连接。
优选地，交联部分具有60Da至5kDa的范围内的分子量，更优选地，0.5kDa至4kDa，甚至更优选地1kDa至4kDa，甚至更优选地1kDa至3kDa的范围内的分子量。在一个实施方案中，交联部分由聚合物构成。
除了低聚或者聚合的交联部分之外，可使用低分子量的交联部分，特别是当亲水的高分子量主链部分用于形成本发明的生物可降解的水凝胶时。
优选地，所述基于聚(乙二醇)的交联部分为包含乙二醇单元且任选包含另外的化学官能团的烃链，其中所述基于聚(乙二醇)的交联部分包含至少m个乙二醇单元，其中m为3至100的范围内的整数，优选地10至70的范围内的整数。优选地，所述基于聚(乙二醇)的交联部分具有0.5kDa至5kDa的范围内的分子量。
如果关于与支化中心连接的交联部分或者基于PEG的聚合链而使用，则术语“基于PEG的”是指包含至少20wt％的乙二醇部分的交联部分或者基于PEG的聚合链。
在一个实施方案中，构成聚合的交联部分的单体经生物可降解的化学键连接。所述聚合的交联部分可含有多达100个生物可降解的化学键或者更多，这取决于交联部分的分子量以及单体单元的分子量。所述交联部分的实例为基于聚(乳酸)或者聚(羟乙酸)的聚合物。应该理解的是所述聚(乳酸)或者聚(羟乙酸)链可被烷基或者芳基封端或者中断且所述烷基或者芳基可任选取代有杂原子和化学官能团。
优选地，所述交联部分为基于PEG的，优选地仅由一个基于PEG的分子链来表示。优选地，所述基于聚(乙二醇)的交联部分为包含乙二醇单元且任选包含另外的化学官能团的烃链，其中所述基于聚(乙二醇)的交联部分包含至少m个乙二醇单元，其中m为3至100的范围内的整数，优选地10至70的范围内的整数。优选地，所述基于聚(乙二醇)的交联部分具有0.5kDa至5kDa的范围内的分子量。
在本发明优选的实施方案中，所述交联部分由PEG构成，其经酯键与两个α、ω-脂族二羧基间隔物对称连接，所述间隔物由通过持久的酰胺键与超支化树状部分连接的主链部分来提供。
所述间隔物部分的二羧酸与主链部分连接且在另一侧与交联部分连接，所述二羧酸由3至12个碳原子构成，最优选地由5至8个碳原子构成并且可在一个或者多个碳原子被取代。优选地取代基为烷基、羟基或者酰氨基或者取代的氨基。一个或者多个脂族二羧酸的亚甲基可任选被O或者NH或者烷基取代的N取代。优选的烷基为具有1至6个碳原子的直链或者支链烷基。
优选地，在超支化树状部分和间隔物部分之间存在持久的酰胺键，所述间隔物部分与主链部分连接且在另一侧与交联部分连接。
一个优选的交联部分如下显示；虚线表示与主链部分相互连接的生物可降解的连接键：
Figure BDA0000148803070000301
其中n为5至50的整数。
优选地，水凝胶载体由通过水解可降解的化学键相互连接的主链部分构成。
更优选地，所述主链部分包含下式的支化中心：
Figure BDA0000148803070000302
其中虚线表示与主链部分的剩余部分的连接。
更优选地，所述主链部分包含下式的结构：
Figure BDA0000148803070000303
其中n为5至50的整数且虚线表示与主链部分的剩余部分的连接。
优选地，主链部分包含超支化部分Hyp。
更优选地，所述主链部分包含下式的超支化部分Hyp：
Figure BDA0000148803070000311
其中虚线表示与分子的剩余部分的连接且用星号标记的碳原子表示S-构型。
优选地，所述主链部分与至少一个下式的间隔物连接：
Figure BDA0000148803070000312
其中用星号标记的虚线表示水凝胶和硫代琥珀酰亚氨基的N之间的化学键，
其中另外的虚线表示与Hyp的连接，且
其中p为0至10的整数。
优选地，所述主链部分与下式的至少一个间隔物连接：
Figure BDA0000148803070000313
其中虚线中的一条表示与超支化部分Hyp的连接且第二条虚线表示与分子的剩余部分的连接；且
其中m为2至4的整数。
优选地，所述主链部分经具有下式的交联部分连接在一起：
Figure BDA0000148803070000321
其中
q为3至100的整数；
所述主链部分和交联部分之间的生物可降解的键的水解速率由邻近PEG-酯羧基的连接的原子的数目和类型影响或者决定。例如，通过针对PEG酯形成由琥珀酸、己二酸或者戊二酸进行选择，可改变本发明的生物可降解的水凝胶载体的降解半衰期。
可在完成本发明水凝胶的完全降解之后在溶液中测量主链部分的总量，并且在降解过程中，可溶的主链降解产物部分可与本发明不溶的水凝胶分离且可在不受由本发明水凝胶释放的其它可溶的降解产物干扰的情况下定量。本发明的水凝胶对象可通过沉降或者离心与生理学重量克分子渗透压浓度的缓冲液的过量的水分离。离心可以上清液提供至少10％体积的本发明溶胀的水凝胶的方式来进行。在所述沉降或者离心步骤后，可溶的水凝胶降解产物保留在含水上清液中，并且包含一个或者多个主链部分的水溶性降解产物通过使所述上清液的等分样经历适当的分离和/或者分析方法来检测。
优选地，水溶性降解产物可通过经0.45μm滤器滤过而与水不溶性降解产物分离，之后水溶性降解产物可发现存在于流体(flow-through)中。水溶性降解产物也可通过离心和滤过步骤的组合与水不溶性降解产物分离。
例如，所述主链部分可携带在其它降解产物不显示UV吸收的波长处显示UV吸收的基团。这样的选择性UV-吸收基团可为主链部分的结构组分诸如酰胺键或者可通过借助芳环系统诸如吲哚基与其反应官能团连接来引入至主链。
在本发明的所述水凝胶连接的胰岛素前药中，理想的是在显著量的主链降解产物的释放(＜10％)发生之前，几乎所有胰岛素释放(＞90％)已经发生。这可通过调节水凝胶连接的胰岛素前药的半衰期与水凝胶降解动力学来实现。
本发明的水凝胶连接的胰岛素前药可起始于本发明的水凝胶通过本领域已知的适当方法来制备。对于本领域的从业者来说清楚的是存在若干途径。例如与生物活性部分即胰岛素共价连接的上面提及的前药衔接物可与已经带有或者未带有部分或者整体的活性部分即胰岛素的本发明的水凝胶的反应官能团反应。
在制备的优选方法中，水凝胶通过化学连接反应产生。水凝胶可由两个具有互补官能团的大分子离析物形成，所述官能团经历诸如缩合或者加成的反应。这些起始物质中的一个为具有至少两个相同的官能团的交联试剂且其它起始物质为同种多官能团(homomultifunctional)的主链试剂。存在于交联试剂的适当的官能团包括末端氨基、羧酸和衍生物、马来酰亚胺以及其它α，β不饱和Michael受体如乙烯基砜、硫醇、羟基。存在于主链试剂的适当的官能团包括但不限于氨基、羧酸和衍生物、马来酰亚胺及其它α，β不饱和Michael受体如乙烯基砜、硫醇、羟基。
如果交联试剂可聚合的基团针对主链可聚合的基团以亚化学计量使用，则所得的水凝胶将为具有与主链结构连接的游离反应官能团的反应性水凝胶。
任选地，所述前药衔接物可首先与胰岛素结合，然后所得的胰岛素-前药衔接物结合物可与水凝胶的反应官能团反应。可替换地，在激活前药衔接物的一个官能团后，所述衔接物-水凝胶结合物可在第二反应步骤中与胰岛素接触并且在胰岛素与水凝胶结合的前药衔接物结合后，过量的胰岛素可经滤过除去。
用于制备本发明前药的优选的方法如下：
对于主链试剂合成的优选的起始物质为4-枝PEG四胺或者8-枝PEG八胺，其中PEG试剂具有2000至10000Da的范围内的分子量，最优选地2000至5000Da的范围内的分子量。赖氨酸残基顺序地与所述多枝PEG-衍生物偶联以形成超支化主链试剂。应该理解的是在偶联步骤中赖氨酸可被保护基团部分或者完全保护并且最终的主链试剂可含有保护基团。优选的组成部分为双-BOC赖氨酸。可替换地，树枝状聚-赖氨酸部分可首先装配随后与4-枝PEG四胺或者8-枝PEG八胺偶联来代替赖氨酸残基的顺序加成。理想的是获得带有32个氨基的主链试剂，因而七个赖氨酸将与4-枝PEG的每枝连接，或者五个赖氨酸将与8-枝PEG的每枝连接。在另外的实施方案中，所述多枝PEG衍生物为四或者八羧基PEG。在这种情况下，所述树枝状部分可由戊二酸或者门冬氨酸产生，且所得的主链试剂将带有32个羧基。应该理解的是所有或者部分主链试剂的官能团可以游离形式、作为盐或者与保护基团连接的形式存在。应该理解的是由于实践原因，所述主链试剂的每个PEG枝的赖氨酸的数目将为六至七个，更优选地约七个。
优选的主链试剂如下显示：
Figure BDA0000148803070000341
交联试剂的合成起始于具有0.2至5kDa、更优选地0.6至2kDa的范围内的分子量的直链PEG链，其用二羧酸(最常用的已二酸或者戊二酸)的半酯进行酯化。用于半酯形成的优选的保护基团为苄基。所得的双二羧酸PEG半酯转化为更具反应性的羧基化合物诸如酰氯或者活性酯，例如五氟苯基酯或者N-羟基琥珀酰亚胺酯，最优选地N-羟基琥珀酰亚胺酯，其中优选的结构如下显示。
Figure BDA0000148803070000342
其中每个m独立为2至4的范围内的整数，且
q为3至100的整数。
更优选的为如下结构：
Figure BDA0000148803070000343
可替换地，所述双二羧酸PEG半酯可在偶联剂(诸如DCC或者HOBt或者PyBOP)的存在下活化。
在可替换的实施方案中，所述主链试剂带有羧基且相应的交联试剂可选自含有酯的氨基封端的PEG-链。
主链试剂和交联试剂可使用反相乳液聚合(inverse emulsionpolymerization)来聚合以形成本发明的水凝胶。在选择主链和交联剂可聚合基团之间的期望的化学计量后，将主链和交联剂溶解在DMSO中并且采用具有适当选择的HLB值的适当的乳化剂(优选地Arlacel P135)使用机械搅拌器并控制搅拌速度以形成反相乳液。通过加入适当的碱(优选地N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)引发聚合。在搅拌适当时间后，通过加入酸(诸如乙酸)和水淬灭反应混合物。收集珠子，洗涤，并根据粒度通过机械过筛进行分级。任选地，保护基团可在此阶段除去。
在本发明可替换的实施方案中，多官能团部分与聚合的反应水凝胶的反应官能团偶联以增加官能团的数目，其允许增加水凝胶的载药量。所述多官能团部分可由赖氨酸、二赖氨酸、三赖氨酸、四赖氨酸、五赖氨酸、六赖氨酸、七赖氨酸或者寡赖氨酸、低分子量PEI的适当取代的衍生物来提供。优选地，所述多官能团部分为赖氨酸。
此外，本发明的所述水凝胶可用带有相同官能团的间隔物进行官能化，例如氨基可通过偶联异种二官能团间隔物(诸如适当活化的COOH-(EG)6-NH-fmoc(EG＝乙二醇))并除去fmoc-保护基团来引入至水凝胶中。
在将胰岛素-衔接物结合物载入至含有官能化马来酰亚氨基的水凝胶后，所有剩余的官能团用适当的封闭剂(诸如巯基乙醇)封闭以防止不期望的副反应。
在本发明优选的实施方案中，带有与衔接物部分连接的游离巯基的胰岛素-衔接物结合物与马来酰亚胺官能化的水凝胶在室温和4℃之间的、更优选的室温的温度在pH 2-5、优选地pH 2.5-4.5、更优选地pH 3.0-4.0的缓冲水溶液中反应。随后，相应得到的胰岛素-衔接物-水凝胶结合物用巯基乙醇在室温和4℃之间的、更优选在室温的温度在pH 2-5、优选地pH 2.5-4.0、更优选地pH 2.5-3.5的缓冲水溶液中处理。
在本发明另外优选的实施方案中，带有与衔接物部分连接的马来酰亚氨基的胰岛素-衔接物结合物与巯基官能化的水凝胶在室温和4℃之间的、更优选的室温的温度在pH 2-5、优选地pH 2.5-4.5、更优选地pH 3.0-4.0的缓冲水溶液中反应。随后，相应得到的胰岛素-衔接物-水凝胶结合物用包含马来酰亚氨基的低分子量的化合物，优选地100至300Da的含有马来酰亚胺的化合物(例如N-乙基-马来酰亚胺)，在室温和4℃之间的、更优选在室温的温度在pH 2-5、优选地pH 2.5-4.0、更优选地pH 2.5-3.5的缓冲水溶液中处理。
本发明的另一方面为包括以下步骤的方法：
(a)使包含马来酰亚胺官能化的水凝胶微粒的含水混悬液与包含带有巯基的胰岛素-衔接物试剂的溶液在室温和4℃之间的温度在pH 2-5的缓冲水溶液中接触，得到胰岛素-衔接物-水凝胶结合物；
(b)任选地，将步骤(a)的胰岛素-衔接物-水凝胶结合物用34Da至500Da的含有巯基的化合物在室温和4℃之间的温度在pH 2-5的缓冲水溶液中处理。
本发明的另一方面为包括以下步骤的方法：
(a)使包含巯基官能化的水凝胶微粒的含水混悬液与包含带有马来酰亚氨基的胰岛素-衔接物试剂的溶液在室温和4℃之间的温度在pH 2-5的缓冲水溶液中接触，得到胰岛素-衔接物-水凝胶结合物；
(b)任选地，将步骤(a)的胰岛素-衔接物-水凝胶结合物用100Da至300Da的含有马来酰亚胺的化合物在室温和4℃之间的温度在pH 2-5的缓冲水溶液中处理。
用于制备本发明胰岛素前药的特别优选的方法包括以下步骤：
(a)使式C(A’-X1)4的化合物(其中A’-X1在其与Hyp或者Hyp前体结合之前表示A且X1为适当的官能团)与式Hyp’-X2的化合物(其中Hyp’-X2在其与A或者Hyp前体结合之前表示Hyp且X2为与X1反应的适当的官能团)反应；
(b)任选使由步骤(a)所得的化合物在一个或者多个另外步骤中反应以得到具有至少四个官能团的式C(A-Hyp)4的化合物；
(c)使来自步骤(b)的所得的化合物的至少四个官能团与基于聚乙二醇的交联试剂反应得到水凝胶，其中按照相比于C(A-Hyp)4的反应官能团的总数的亚化学计量使用交联试剂的反应基团；
(d)使步骤(c)的水凝胶主链中剩余未反应的官能团(表示包含在本发明水凝胶中的主链的反应官能团)与胰岛素和暂时前药衔接物的共价结合物反应，或者首先使未反应的官能团与暂时前药衔接物反应且随后与胰岛素反应；
(e)任选封闭的剩余未反应的官能团以得到本发明的前药。
具体地，用于本发明胰岛素前药的水凝胶如下合成：
对于本体聚合，主链试剂和交联试剂以2∶1至1.05∶1的胺/活性酯比混合。
主链试剂和交联试剂均在DMSO中溶解以得到浓度为5至50g/100mL的溶液，优选地7.5至20g/100ml且最优选地10至20g/100ml的溶液。
为了有效聚合，将2至10％(vol.)N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TMEDA)加入至含有交联试剂和主链试剂的DMSO溶液中并将混合物振摇1至20秒且留置静置。混合物在小于1分钟内固化。
本发明的所述水凝胶优选地通过机械方法诸如搅拌、捣碎、切割、压制或者研磨以及任选过筛来粉碎。
对于乳化聚合，反应混合物由分散相和连续相构成。
对于分散相，主链试剂和交联试剂以2∶1至1.05∶1的胺/活性酯比混合并且在DMSO中溶解以得到浓度为5至50g/100mL的溶液，优选地7.5至20g/100ml且最优选地10至20g/100ml的溶液。
所述连续相为任意溶剂，其不与DMSO混容，为非碱性的，质子惰性的且显示小于10Pa*s的粘度。优选地，所述溶剂不与DMSO混容，为非碱性的，质子惰性的且显示小于2Pa*s的粘度并且为非毒性的。更优选地，所述溶剂为具有5至10个碳原子的饱和直链或者支链烃。最优选地，所述溶剂为正庚烷。
为了形成分散相在连续相中的乳剂，在加入分散相之前将乳化剂加入至连续相中。乳化剂的量为2至50mg/mL分散相，更优选地5至20mg/mL分散相，最优选地10mg/mL分散相。
所述乳化剂具有3至8的HLB-值。优选地，所述乳化剂为山梨醇三酯以及脂肪酸或者聚(羟基脂肪酸)-聚(乙二醇)结合物。更优选地，所述乳化剂为聚(羟基脂肪酸)-聚乙二醇结合物，其中在链的每个末端的直链聚(乙二醇)以及聚(羟基脂肪酸)单元的分子量分别为0.5kDa至5kDa、0.5kDa至3kDa的范围内。最优选地，所述乳化剂为聚(乙二醇)二聚羟基硬脂酸酯、CithrolDPHS(Cithrol DPHS，先前Arlacel P135，Croda International Plc)。
分散相的微滴通过用轴流式叶轮搅拌来产生，所述轴流式叶轮具有与搅拌器诸如Isojet、Intermig、Propeller(EKATO Rühr-und Mischtechnik GmbH，Germany)类似的几何形状，最优选地与具有反应器直径的50至90％的直径的Isojet类似。优选地，在加入分散相之前开始搅拌。搅拌速度设置为0.6至1.7m/s。在室温加入分散相，并且分散相的浓度为总反应体积的2％至70％，优选地5至50％，更优选地10至40％，且最优选地20至35％。在加入碱以进行聚合之前，将分散相、乳化剂和连续相的混合物搅拌5至60分钟。
将5至10当量(涉及待形成的每个酰胺键)的碱加入至分散相和连续相的混合物中。所述碱为质子惰性的，非亲核的且在分散相中可溶的。优选地，所述碱为质子惰性的，非亲核的且在分散相和DMSO中均很好溶解的。更优选地，所述碱为质子惰性的，非亲核的且在分散相和DMSO中均很好溶解的，其为胺碱且无毒的。最优选地，所述碱为N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TMEDA)。在碱的存在下继续搅拌1至16小时。
在搅拌过程中，分散相的微滴变硬而变成本发明交联的水凝胶珠子，其可被收集且根据大小在具有75μm和32μm台面(deck)的振动连续过筛机上进行分级以得到本发明的水凝胶微粒。
对于本发明胰岛素前药的水凝胶可由按微粒形式的制备方法来获得。在本发明优选的实施方案中，所述反应水凝胶为成形的物品诸如筛网或者支架。最优选地，水凝胶形成作为微粒珠子，其可通过标准注射器作为皮下或者肌内注射来给药。所述软珠子可具有1至500微米之间的直径。
优选地，如果所述微粒在等渗含水制剂缓冲液中混悬，则其具有10至100微米之间的直径，更优选地20至100微米之间的直径，最优选地25至80微米之间的直径。
优选地，所述微粒可通过注射经小于0.6mm内径的注射针头来给药，优选地经小于0.3mm内径的注射针头来给药，更优选地经小于0.225mm内径的注射针头来给药，甚至更优选地经小于0.175mm内径的注射针头来给药，且最优选地经小于0.16mm内径的注射针头来给药。
应该理解的是，术语“可通过注射来给药”、“可注射的”或者“可注射性”涉及多种因素的组合，诸如施加于含有本发明生物可降解的水凝胶(在液体中在某种浓度(w/v)且在某种温度溶胀)的注射器的活塞的某种力，与所述注射器的出口连接的给定内径的注射针头，以及需要将某种体积的本发明生物可降解的水凝胶由注射器经针头挤出的时间。
为了提供可注射性，1mL体积的本发明胰岛素前药在水中溶胀以得到至少5％(w/v)的浓度且包含在支持4.7mm直径的活塞的注射器中，可施加小于50牛顿的力在室温在10秒内将其挤出。
优选地，在水中溶胀以得到约10％(w/v)的浓度的本发明的胰岛素前药可实现可注射性。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于其为在注射后形成贮药库的液体组合物。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于通过注射给药，诸如皮下或者肌内给药。
在另一个实施方案中，所述组合物用于治疗或者预防与胰岛素缺陷相关的疾病或者病症，诸如高血糖症、前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X，在所述疾病或者病症中用胰岛素化合物治疗或者预防是有益的。典型地，所述疾病或者病症为II型糖尿病。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物选自人类或者非人类胰岛素或者胰岛素类似物及其衍生物或者结合物。更优选地为人胰岛素和胰岛素类似物，诸如甘精胰岛素、地特胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素。当给药胰岛素化合物时，最大峰浓度典型地在首48小时内达到。在另一个实施方案中，所述峰浓度在给药的首24小时内达到，诸如在给药的首12小时内，例如在给药的首6小时内达到。
在另一方面，本发明的药物组合物进一步包含GLP-1化合物，典型地GLP-1激动剂。
所述GLP-1化合物典型地选自下述中的任一个：
[序列号：1]艾塞那肽-4
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2
[序列号：2]艾塞那肽-3
HSDGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2
[序列号：3]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG P
[序列号：4]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG Y
[序列号：5]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG
[序列号：6]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG-NH2
[序列号：7]
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKN-NH2
[序列号：8]
HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEFLKNGG PSSGAPPPS-NH2
[序列号：9]
HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEFLKN-NH2
[序列号：10]
HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LAIEFLKN-NH2
[序列号：11]
HGEGTFTSDL SKQLEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2
[序列号：12]
HGDGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2
[序列号13]GLP-1(7-36)酰胺
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2
[序列号14]
HSEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2
[序列号15]GLP-1(7-37)
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGRG
[序列号16]
HAXaaGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2
其中Xaa选自P、F、Y。
[序列号17]
HXaaEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2
其中Xaa选自T、a-氨基丁酸、D-Ala、V、Gly。
[序列号18]
HaEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGG
[序列号19]
R-HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2
其中R选自乙酰基、焦谷氨酰基、N-2-羟基苯甲酰基、N-反-3-己烯酰基。
[序列号20]
HXaaAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR-NH2
其中Xaa为6-氨基-己酰基。
在另一方面，本发明涉及胰岛素化合物在制备用于治疗或者预防与胰岛素缺陷相关的疾病或者病症的药物组合物中的用途，所述药物组合物包含胰岛素化合物，所述胰岛素化合物的浓度足以将所述胰岛素化合物在血浆中的治疗有效水平维持至少三天、典型地至少80小时(例如一周或者更长时间)，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的体内药物代谢动力学分布，且在所述疾病或者病症中用胰岛素化合物治疗或者预防是有益的。
所述浓度将在受试者之间变化且取决于各个受试者的治疗窗，但为了使治疗作用存在至少3天，例如一周(即约7天)，所述浓度典型地为至少约10mg/ml，例如多于10mg/ml。
胰岛素-水凝胶前药的优选的组合物在下述段落中给出。
所述胰岛素-水凝胶前药的组合物可作为混悬液组合物或者作为干燥组合物来提供。优选地，所述胰岛素-水凝胶前药的药物组合物为干燥组合物。干燥的适当方法为例如，喷雾干燥和低压冻干(冷冻干燥)。优选地，所述胰岛素-水凝胶前药的药物组合物经低压冻干进行干燥。
优选地，所述胰岛素水凝胶前药在组合物中足量给药以在一次施用中提供至少三天的治疗有效量的胰岛素。更优选地，胰岛素水凝胶前药的一次施用在一周内是足量的。
本发明的胰岛素-水凝胶前药的药物组合物含有一种或者多种赋形剂。
在肠胃外组合物中使用的赋形剂可分为如下几类：缓冲剂、等渗调节剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂、增粘剂/粘度增强剂、或者其它辅助剂。在一些情况下，这些成分可具有双重或者三重功能。本发明的胰岛素-水凝胶前药的组合物含有一种或者多种赋形剂，其选自：
(i)缓冲剂：维持pH在理想范围内的生理耐受缓冲剂，诸如磷酸钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、组氨酸钠、枸橼酸钠和乙酸钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钠、丙酮酸钠。也可使用抗酸剂诸如Mg(OH)2或者ZnCO3。可调节缓冲能力以符合对pH稳定性最敏感的条件。
(ii)等渗调节剂：最小化可由细胞损伤导致的疼痛的化合物，所述细胞损伤由于在注射贮药库的渗透压差异所导致。实例为甘油和氯化钠。有效浓度可通过使用对于血清为285-315mOsmol/kg的假定重量克分子渗透压浓度进行渗透压力测定法来确定。
(iii)防腐剂和/或者抗菌剂：多剂量肠胃外制剂需要加入以最小化患者在注射后变为受感染的风险的足量浓度的防腐剂，且已经建立了相应的法规需要量。典型的防腐剂包括间甲酚、苯酚、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、氯丁醇、苯甲醇、苯基硝酸汞、硫柳汞、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵。
(iv)稳定剂：稳定作用通过加强蛋白质稳定力、变性状态的去稳定化或者赋形剂与蛋白质的直接结合来实现。稳定剂可为氨基酸诸如丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸，糖类诸如葡萄糖、蔗糖、海藻糖，多元醇诸如甘油、甘露醇、山梨醇，盐类诸如磷酸钾、硫酸钠，螯合剂诸如EDTA、六磷酸盐，配体诸如二价金属离子(锌离子、钙离子等)，其它盐类或者有机分子诸如苯酚衍生物。此外，可使用寡聚体或者聚合物诸如环糊精、右旋糖酐、树状聚体、PEG或者PVP或者鱼精蛋白或者HAS。
(v)抗吸附剂：用于与组合物或者组合物容器的内表面竞争性包衣或者吸附的主要离子型或者非离子型表面活性剂或者其它蛋白质或者可溶聚合物。例如泊洛沙姆(Pluronic F-68)、PEG十二烷基醚(Brij 35)、聚山梨酸酯20和80、右旋糖酐、聚乙二醇、PEG-聚组氨酸、BSA和HAS和明胶。赋形剂的选择浓度和类型取决于应避免的作用，但典型地在恰好高于CMC值在界面处形成单层的表面活性剂。
(vi)冻干保护剂和/或者冷冻保护剂：在冷冻干燥或者喷雾干燥过程中，赋形剂可抵消由氢键断裂和水除去引起的不稳定作用。对于该目的，可使用糖类和多元醇，但相应的正性作用也已经在表面活性剂、氨基酸、非水溶剂和其它肽中观察到。海藻糖特别有效地降低潮湿引起的聚集且也增强了可能通过将蛋白疏水基暴露于水引起的热稳定性。也可使用甘露醇和蔗糖作为单独的冻干保护剂/冷冻保护剂或者彼此联用，其中高比例的甘露醇∶蔗糖已知为增强冷冻干燥饼的物理稳定性。甘露醇也可与海藻糖组合。海藻糖也可与山梨醇或者作为单独保护剂使用的山梨醇组合。也可使用淀粉或者淀粉衍生物。
(vii)氧化保护剂：抗氧化剂诸如抗坏血酸、四氢甲基嘧啶羧酸、蛋氨酸、谷胱甘肽、单硫代甘油、桑色素、聚乙烯亚胺(PEI)、没食子酸丙酯、维生素E，螯合剂诸如枸橼酸、EDTA、六磷酸盐(盐)、巯基乙酸。
(viii)增粘剂或者粘度增强剂：使用颗粒在小瓶和注射器中的延缓沉降以促进颗粒的混合和重新混悬并且使得所述混悬液易于注射(即施加于注射器活塞的力小)。适当的增粘剂或者粘度增强剂为例如，卡波姆增粘剂如卡波泊尔940、卡波泊尔Ultrez 10，纤维素衍生物如羟基丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素、HPMC)或者二乙基氨基乙基纤维素(DEAE或者DEAE-C)，胶状硅酸镁(Veegum)或者硅酸钠，羟基磷灰石凝胶、磷酸三钙凝胶，黄色素，角叉藻聚糖如Satia树胶UTC 30，脂族聚(羟基酸)诸如聚(D，L-或者L-乳酸)(PLA)和聚(羟乙酸)(PGA)以及它们的共聚物(PLGA)，D，L-丙交酯、乙交酯和己内酯的三聚物，泊洛沙姆，亲水聚(氧乙烯)嵌段和疏水聚(氧丙烯)嵌段以制成聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)的三嵌段(例如
Figure BDA0000148803070000431
)，聚醚酯共聚物诸如聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚对苯二甲酸丁二醇共聚物，乙酸-异丁酸蔗糖酯(SAIB)，右旋糖酐或者其衍生物，右旋糖酐和PEG的组合，聚二甲基硅氧烷、胶原、壳聚糖，聚乙烯醇(PVA)和衍生物，聚烷基酰亚胺，聚(丙烯酰胺-共-二烯丙基二甲基铵(DADMA))，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，葡萄糖胺聚糖(GAGs)诸如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素，透明质烷，由疏水A-嵌段(诸如聚丙交酯(PLA)或者聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA))和亲水B-嵌段(诸如聚乙二醇(PEG)或者聚乙烯基吡咯烷酮)构成的ABA三嵌段或者AB嵌段共聚物。所述嵌段共聚物以及上面提及的泊洛沙姆可显示相反的热量胶凝作用行为(在室温为流体状态以便于给药且在注射后在高于溶胶-凝胶转换温度在体温为凝胶状态)。
(ix)扩展剂或者分散剂：通过在细胞间隔的细胞外基质中的组分(诸如但不限于透明质酸，其为存在于结缔组织的细胞间隙中的多糖)的水解来修饰结缔组织的渗透性。扩展剂诸如但不限于玻璃酸酶，其暂时降低细胞外基质的粘度且促进注射药物的分散。
(x)其它辅助剂：诸如湿润剂、粘度修饰剂、抗生素、玻璃酸酶。酸和碱诸如盐酸和氢氧化钠为对于在制造过程中pH调节所必需的辅助剂。
优选地，胰岛素-水凝胶前药的组合物含有一种或者多于一种增粘剂和/或者粘度调节剂。
术语″赋形剂″优选地是指与治疗药物一起给药的稀释剂、辅料或者媒介物。所述药物赋形剂可为无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的油，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、麻油等。当药物组合物口服给药时，水为优选的赋形剂。当药物组合物静脉内给药时，盐水和葡萄糖水溶液为优选的赋形剂。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液优选地用作可注射溶液的液体赋形剂。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物也可含有少量的润湿剂或者乳化剂或者pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、持续释放制剂等形式。所述组合物可用传统粘合剂和赋形剂诸如甘油三酯配制为栓剂。口服制剂可包含标准赋形剂诸如药学级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适当的药物赋形剂的实例在E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中有述。所述组合物将含有治疗有效量的治疗药物(优选地为纯化形式)以及适当量的赋形剂以提供对患者适当给药的形式。该制剂适合给药模式。
在一般实施方案中，无论是干燥形式还是混悬液或者是其它形式的本发明的药物组合物可作为单一或者多剂量组合物来提供。
在本发明的一个实施方案中，胰岛素-水凝胶前药的干燥组合物作为单一剂量来提供，这表示提供其的容器中含有一个药物剂量。
因此在本发明的另一方面，所述组合物作为单一剂量组合物来提供。
优选地，混悬液组合物为多剂量组合物，这表示其含有多于一个治疗剂量。优选地，多剂量组合物含有至少2个剂量。胰岛素-水凝胶的所述多剂量组合物可用于有此需要的不同患者或者意在一个患者中使用，其中在施用第一剂量后储存剩余剂量，直到需要所述剩余剂量。
在本发明的另一方面，所述组合物包含在容器中。优选地所述容器为二室注射器。特别地在二室注射器的第一室中提供本发明的干燥组合物且在二室注射器的第二室中提供重建溶液。
在对有此需要的患者施用胰岛素-水凝胶前药的干燥组合物之前，重建所述干燥组合物。可在容器中进行重建，在所述容器中胰岛素-水凝胶前药的干燥组合物可在诸如小瓶、注射器、二室注射器、安瓿和药筒中提供。通过将预定量的重建溶液加入至所述干燥组合物中完成重建。重建溶液为无菌液体，诸如水或者缓冲液，其可进一步含有添加剂，诸如防腐剂和/或者抗菌剂。如果胰岛素-水凝胶前药组合物作为单一剂量提供时，则所述重建溶液可含有一种或者多种防腐剂和/或者抗菌剂。优选地，所述重建溶液为无菌水。如果胰岛素-水凝胶前药的组合物为多剂量组合物，则优选的是所述重建溶液含有一种或者多种防腐剂和/或者抗菌剂，例如苯甲醇和甲酚。
本发明的另一方面涉及给药重建的胰岛素水凝胶前药组合物的方法。所述胰岛素水凝胶前药组合物可通过包括皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内和腹膜内的注射或者输注的方法来给药。
另一方面为制备重建的组合物的方法，所述组合物包含治疗有效量的胰岛素水凝胶前药以及任选一种或者多种药用赋形剂，其中所述胰岛素与水凝胶暂时连接，所述方法包括以下步骤：
·使本发明的组合物与重建溶液接触。
另一方面为重建的组合物，其包含治疗有效量的胰岛素水凝胶前药以及任选一种或者多种药用赋形剂，其中所述胰岛素与通过上面方法得到的水凝胶暂时连接。
本发明的另一方面为制造胰岛素-水凝胶前药的干燥组合物的方法。在一个实施方案中，所述混悬液组合物通过如下制备：
(i)使胰岛素-水凝胶前药与一种或者多种赋形剂混合，
(ii)转移相当于单一或者多剂量的量的组合物于适当的容器中，
(iii)在所述容器中干燥组合物，且
(iv)密封容器。
适当的容器为小瓶、注射器、二室注射器、安瓿和药筒。
另一方面为套盒。当给药装置仅为皮下注射器时，所述试剂盒可包含注射器、注射针头以及与注射器一起使用的包含干燥胰岛素-水凝胶前药组合物的容器和包含重建溶液的第二容器。在更优选的实施方案中，所述注射装置不为简单的皮下注射器，且由此含有重建的胰岛素-水凝胶前药的分开的容器适于与注射装置接合以使得在使用时在容器中的液体组合物在流体中与注射装置的出口流体连接。给药装置的实例包括但不限于皮下注射器和笔式注射装置。特别优选的注射装置为笔式注射器，在该情况下所述容器为药筒，优选地为可更换的药筒。
优选的套盒包括注射针头以及含有本发明组合物和任选进一步含有重建溶液的容器，所述容器适于与注射针头一起使用。优选地，所述容器为二室注射器。
在另一方面，本发明提供了与笔式注射器装置一起使用的含有如上所述的胰岛素-水凝胶前药的组合物的药筒。所述药筒可含有单一剂量或者多剂量的胰岛素。
在本发明的一个实施方案中，胰岛素-水凝胶前药的混悬液组合物不仅包含胰岛素-水凝胶前药以及一种或者多种赋形剂，而且还含有游离形式或者作为前药的其它生物活性剂。优选地，所述另外的一种或者多种生物活性剂为前药，更优选地为水凝胶前药。所述生物活性剂包括但不限于以下各类的化合物：
(i)磺脲类，例如氯磺丙脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲等，
(ii)氯茴苯酸类，例如瑞格列奈，
(iii)胰升糖素样肽-1(GLP-1)及其模拟物、葡萄糖促胰岛素肽(GIP)及其模拟物、艾塞那肽及其模拟物以及二肽基蛋白酶抑制剂(DPPIV)，
(iv)双胍，例如二甲双胍，
(v)噻唑烷二酮类，例如罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、伊沙列酮(称为MCC-555)、2-[2-[(2R)-4-己基-3，4-二氢-3-氧代-2H-1，4-苯并噁嗪-2-基]乙氧基]-苯乙酸等
(vi)GW2570等，
(vii)视黄醇类X受体(RXR)调节剂，例如塔革雷汀、9-顺式视黄酸等，
(viii)其它胰岛素致敏剂，例如INS-1、PTP-1B抑制剂、GSK3抑制剂、糖原磷酸化酶a抑制剂、果糖-1，6-二磷酸酶抑制剂等，
(ix)胰岛素，包括常规或者短效、中效和长效胰岛素，吸入的胰岛素和胰岛素类似物，诸如在天然氨基酸序列中具有微小差异的胰岛素分子，
(x)胰岛素的小分子模拟物，包括但不限于L-783281、TE-17411等，
(xi)Na-葡萄糖协同转运蛋白抑制剂，诸如T-1095、T-1095A、根皮苷等，
(xii)支链淀粉激动剂，包括但不限于普兰林肽等，
(xiii)高血糖素拮抗剂诸如AY-279955等。
除了抗糖尿病药之外，生物活性化合物可为减肥药诸如奥利司他、胰脂酶抑制药，其预防脂肪的分解和吸收；或者西布曲明(一种食欲抑制剂)以及脑中5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺的重吸收抑制剂、增加脂肪动员的生长因子(例如生长激素、IGF-1、生长激素释放因子)、胃泌酸调节素和胃饥饿素调节剂。其它可能的生物活性减肥药包括但不限于通过肾上腺素能机制起作用的食欲抑制剂诸如苄非他明、芬美曲秦、芬特明、安非拉酮、马吲哚、西布曲明、苯丙醇胺或者麻黄碱；通过5-羟色胺能机制起作用的食欲抑制剂诸如喹哌嗪、氟西汀、舍曲林、芬氟拉明或者右芬氟拉明；通过多巴胺机制起作用的食欲抑制剂例如阿扑吗啡；通过组胺能机制起作用的食欲抑制剂(例如组胺模拟物、H3受体调节剂)；能量消耗强化剂诸如β-3肾上腺素能激动剂和解偶联蛋白机能刺激剂；瘦蛋白和瘦蛋白模拟物(例如美曲普汀)；神经肽Y拮抗剂；黑皮质素-1、3和4受体调节剂；胆囊收缩素激动剂；胰升糖素样肽-1(GLP-1)模拟物和类似物(例如艾塞那肽)；雄激素(例如脱氢表雄酮和衍生物诸如本胆烷二酮)、睾酮、促蛋白合成甾类(例如氧雄龙)和甾体激素；促生长激素神经肽受体拮抗剂；细胞因子药物诸如睫状节神经细胞营养因子；淀粉酶抑制剂；肠抑素激动剂/模拟物；阿立新/下视丘泌素拮抗剂；尿皮质醇拮抗剂；铃蟾肽激动剂；蛋白激酶A调节剂；促皮质激素释放因子模拟物；可卡因-和安非他命调节的转录子模拟物；降钙素基因相关肽模拟物；以及脂肪酸合酶抑制剂。
在可替换的实施方案中，本发明的胰岛素-水凝胶前药组合物与第二生物活性化合物以如下方式组合：首先对有此需要的患者给药胰岛素-水凝胶前药，接着给药第二化合物。可替换地，在另外的化合物已经对有此需要的患者给药后，对相同患者给药胰岛素-水凝胶组合物。
除了抗糖尿病药之外，生物活性化合物可为减肥药诸如奥利司他、胰脂酶抑制药，其预防脂肪的分解和吸收；或者西布曲明(一种食欲抑制剂)以及脑中5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺的重吸收抑制剂、增加脂肪动员的生长因子(例如生长激素、IGF-1、生长激素释放因子)、胃泌酸调节素和胃饥饿素调节剂。其它可能的生物活性减肥药包括但不限于通过肾上腺素能机制起作用的食欲抑制剂诸如苄非他明、芬美曲秦、芬特明、安非拉酮、马吲哚、西布曲明、苯丙醇胺或者麻黄碱；通过5-羟色胺能机制起作用的食欲抑制剂诸如喹哌嗪、氟西汀、舍曲林、芬氟拉明或者右芬氟拉明；通过多巴胺机制起作用的食欲抑制剂例如阿扑吗啡；通过组胺能机制起作用的食欲抑制剂(例如组胺模拟物、H3受体调节剂)；能量消耗强化剂诸如β-3肾上腺素能激动剂和解偶联蛋白机能刺激剂；瘦蛋白和瘦蛋白模拟物(例如美曲普汀)；神经肽Y拮抗剂；黑皮质素-1、3和4受体调节剂；胆囊收缩素激动剂；胰升糖素样肽-1(GLP-1)模拟物和类似物(例如艾塞那肽)；雄激素(例如脱氢表雄酮和衍生物诸如本胆烷二酮)、睾酮、促蛋白合成甾类(例如氧雄龙)和甾体激素；促生长激素神经肽受体拮抗剂；细胞因子药物诸如睫状节神经细胞营养因子；淀粉酶抑制剂；肠抑素激动剂/模拟物；阿立新/下视丘泌素拮抗剂；尿皮质醇拮抗剂；铃蟾肽激动剂；蛋白激酶A调节剂；促皮质激素释放因子模拟物；可卡因-和安非他命调节的转录子模拟物；降钙素基因相关肽模拟物；以及脂肪酸合酶抑制剂。
在可替换的实施方案中，本发明的胰岛素-水凝胶前药组合物与第二生物活性化合物以如下方式组合：首先对有此需要的患者给药胰岛素-水凝胶前药，接着给药第二化合物。可替换地，在另外的化合物已经对有此需要的患者给药后，对相同患者给药胰岛素-水凝胶组合物。
需要用本发明所述的长效胰岛素组合物治疗的患者具有发展并存病的高风险。因此，可使用本发明长效胰岛素与适当的生物活性化合物的组合，以用于例如预防选自下述的疾病和病症、延缓所述疾病和病症的进程或者治疗所述疾病和病症：高血压(包括但不限于分离的收缩期高血压和家族性脂质代谢障碍高血压)、充血性心力衰竭、左心室肥大、外周动脉疾病、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、白内障、糖尿病性肾病变、肾小球硬化症、慢性肾功能衰竭、糖尿病神经病变、综合征X、月经前期综合征、冠心病、心绞痛、血栓形成、动脉粥样硬化、心肌梗塞、暂时性局部缺血发作、中风、血管再狭窄、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酸酯血症胰岛素耐受、损伤的葡萄糖代谢、葡萄糖耐量降低病症、损伤的禁食血浆葡萄糖病症、肥胖症、勃起机能障碍、皮肤和结缔组织病症、足部溃疡和溃疡性结肠炎、内皮机能障碍和损伤的血管顺应性。
预防选自上述的疾病和病症、延缓所述疾病和病症的进程或者治疗所述疾病和病症可通过使本发明的长效胰岛素组合物与至少一种选自用于治疗所述病症的药物类别的生物活性化合物组合来实现，所述生物活性化合物包括AT1-受体拮抗剂；血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；肾素抑制剂；β肾上腺素能受体阻断剂；α肾上腺素能受体阻断剂；钙通道阻断剂；醛固酮合酶抑制剂；醛固酮受体拮抗剂；中性肽链内切酶(NEP)抑制剂；双重血管紧张素转化酶/中性肽链内切酶(ACE/NEP)抑制剂；内皮素受体拮抗剂；利尿剂；抑制素；硝酸盐；抗凝固剂；利钠肽；洋地黄化合物；PPAR调节剂。
因此，在另一方面，本发明涉及胰岛素化合物在制备用于治疗或者预防与胰岛素缺陷相关的疾病或者病症的药物组合物中的用途，所述药物组合物包含至少10mg/ml的浓度的胰岛素化合物，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的药物代谢动力学分布，且在所述疾病或者病症中用胰岛素化合物治疗或者预防是有益的。
在本发明的一个实施方案中，所述胰岛素化合物的浓度为至少11mg/ml，诸如11mg/ml至35mg/ml，更优选地15mg/ml至25mg/ml，甚至更优选地约20mg/ml，且甚至更优选地约24mg/ml。
通过诸如注射器对受试者诸如人给药的体积为优选地小于1.5ml，典型地1.0ml或者更小。
在另一个实施方案中，所述与胰岛素缺陷相关的疾病或者病症(其中用胰岛素化合物治疗或者预防是有益的)选自高血糖症、前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X。典型地，所述疾病或者病症为II型糖尿病。
另一个实施方案涉及治疗或者预防哺乳动物受试者诸如人受试者中的高血糖症、前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X。
在另一个实施方案中，所述人受试者已经诊断为具有前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X。
在另一个实施方案中，所述药物代谢动力学分布在哺乳动物血浆诸如人血浆中测量。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于显示小于2的峰/谷比，诸如小于1.75、小于1.5或者小于1.25的峰/谷比。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于结构完整的胰岛素化合物在给药之间的全部时间内的持续释放。
在另一个实施方案中，所述给药之间的全部时间为至少约80小时，诸如约110小时，典型地一周。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物为前药。所述前药可典型地选自由式D-L表示的如上所述的那些。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物完全包含在贮药库中，典型地聚合物凝胶，诸如水凝胶，例如充分水合的聚合物基质。典型地，充分水合的聚合物基质最小化胰岛素分子的分子间接触。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物在贮药库(典型地聚合物凝胶，诸如水凝胶，例如充分水合的聚合物基质)中共价连接。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于其为在注射后形成贮药库的液体组合物。
在另一个实施方案中，组合物通过注射诸如皮下或者肌内注射给药。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物选自人或者非人胰岛素或者胰岛素类似物及其衍生物或者结合物。更优选地为人胰岛素和胰岛素类似物，诸如甘精胰岛素、地特胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素。
在另一个实施方案中，所述峰浓度在给药的首24小时内达到，诸如在给药的首12小时内，例如在给药的首6小时内达到。
在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含GLP-1化合物。
另一个实施方案为与GLP-1化合物的组合。典型地，所述胰岛素化合物可首先给药(反之亦然)，并且所述胰岛素化合物和GLP-1化合物可同时或者先后给药。
在另一方面，本发明涉及用于治疗或者预防在需要所述治疗或者预防的哺乳动物受试者中的与胰岛素缺陷相关的疾病或者病症(其中用胰岛素化合物治疗或者预防是有益的)的方法，所述疾病或者病症诸如高血糖症、前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X，其中通过给药治疗有效量的胰岛素化合物来治疗或者预防，所述胰岛素化合物的浓度足以将所述胰岛素化合物在血浆中的治疗有效水平维持至少三天、典型地至少80小时(例如一周或者更长时间)，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的体内药物代谢动力学分布。
在另一方面，本发明涉及用于治疗或者预防在需要所述治疗或者预防的哺乳动物受试者中的与胰岛素缺陷相关的疾病或者病症(其中用胰岛素化合物治疗或者预防是有益的)的方法，所述疾病或者病症诸如高血糖症、前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X，其中通过给药以至少10mg/ml的浓度的治疗有效量的胰岛素化合物来治疗或者预防，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的药物代谢动力学分布。
一个实施方案涉及治疗或者预防在哺乳动物受试者诸如人受试者中的高血糖症、前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X。典型地，人受试者已经诊断为具有前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物的浓度为至少11mg/ml，诸如11mg/ml至35mg/ml。
在另一个实施方案中，所述药物代谢动力学分布在哺乳动物血浆诸如人血浆中测量。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于显示小于2的峰/谷比，诸如小于1.75，小于1.5或者小于1.25的峰/谷比。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于结构完整的胰岛素化合物在给药之间的全部时间内的持续释放。
在另一个实施方案中，所述给药之间的全部时间为至少约80小时，诸如约110小时，典型地一周。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物为前药，诸如本申请所述的任意一种前药。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物完全包含在贮药库(典型地聚合物凝胶，诸如水凝胶，例如充分水合的聚合物基质)中。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物在贮药库(典型地聚合物凝胶，诸如水凝胶，例如充分水合的聚合物基质)中共价连接。
在另一个实施方案中，所述组合物的特征在于其为在注射后形成贮药库的液体组合物。
在另一个实施方案中，所述组合物通过注射诸如皮下或者肌内注射给药。
在另一个实施方案中，所述胰岛素化合物选自人或者非人胰岛素或者胰岛素类似物及其衍生物或者结合物。更优选的为人胰岛素和胰岛素类似物，诸如甘精胰岛素、地特胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素。在另一个实施方案中，所述峰浓度在给药的首24小时内达到，诸如在给药的首12小时内，例如在给药的首6小时内达到。
在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含GLP-1化合物。
另一个实施方案为与GLP-1化合物的组合。典型地，所述胰岛素化合物可首先给药(反之亦然)，并且所述胰岛素化合物和GLP-1化合物可同时或者先后给药。
在另一方面，本发明涉及套盒，其包含本申请所述的任一实施方案的药物组合物以及用于给药该组合物的容器。典型地，所述容器为注射器。
所述试剂盒的实施方案进一步包含GLP-1化合物。
附图说明
图1a：胰岛素-衔接物结合物12a的UPLC色谱图
图1b：胰岛素-衔接物结合物12b的UPLC色谱图
图2显示历时2周的时间在对健康大鼠给予单一皮下剂量的含有6mg胰岛素的测试物品11a后，动物1-10的平均血浆胰岛素浓度(误差棒表示为±由所有10只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的3天)。
图3：历时13天的时间在对健康大鼠给予单一皮下剂量的含有3mg胰岛素的测试物品11da后，动物1-8的平均血浆胰岛素浓度(误差棒表示为±由所有8只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的1天)。
图4：在对糖尿病大鼠(n＝7)给予单一皮下剂量的含有6.4mg胰岛素的测试物品11da后，血浆胰岛素浓度(灰色方块)和血糖水平(黑色圆)(误差棒表示为±由所有7只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的4天)。
图5：在给药后的首24小时的时间内，在对健康大鼠给予单一皮下剂量的8mg/kg测试物品11db后的平均血浆胰岛素水平(爆发分析)。8只大鼠分为两组并且用于药物代谢动力学的血样在两组之间交替采用。两组均未观察到爆发作用(误差棒表示为±由每组所有动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的1天)。
图6：在对糖尿病大鼠(n＝8)给予三个每周一次皮下剂量的8mg/kg的测试物品11da后，四周时间内的血浆胰岛素浓度(灰色方块)和血糖水平(黑色圆)(误差棒表示为±由所有8只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的3天)。
图7：历时13天的时间，在对健康大鼠给予单一皮下注射的配制于测试物品11dc中的12mg/kg胰岛素后动物1-8(分别对于0.3、1h、2和4h值的动物1-4和动物5-8)的平均血浆胰岛素浓度(误差棒表示为+/-由所有8只动物得到的标准偏差，t0值选用给药前的4天)。
图8：胰岛素-衔接物-水凝胶11a的胰岛素释放和水凝胶降解的叠加。胰岛素-衔接物-水凝胶在pH 7.4和37℃孵育后胰岛素在胰岛素-衔接物-水凝胶中的含量(三角形)和主链部分释放(圆形)的量针对孵育时间进行绘图。
图9显示绘制力与流动(使用30G注射针头)的图。数据点：黑色方块＝乙二醇；黑色三角形＝水；黑色点＝水凝胶胰岛素前药。
具体实施方式
实施例
材料和方法
重组体人胰岛素由Biocon Ltd.，Bangalore，India获得。
氨基4-枝PEG 5kDa由JenKem Technology，Beijing，P.R.China获得。
N-(3-马来酰亚氨基丙基)-21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂-二十一烷酸NHS酯(Mal-PEG6-NHS)由Celares GmbH，Berlin，Germany获得。
2-氯三苯甲基氯树脂、HATU、N-环己基-碳二亚胺-N′-甲基聚苯乙烯和氨基酸由Merck Biosciences GmbH，Schwalbach/Ts，Germany获得，除非另作说明。Fmoc(NMe)-Asp(OtBu)-OH由Bachem AG，Bubendorf，Switzerland获得。S-三苯甲基-6-巯基己酸购自Polypeptide，Strasbourg，France。所用的氨基酸为L构型，除非另作说明。
所有其它化学试剂由Sigma-ALDRICH Chemie GmbH，Taufkirchen，Germany获得。
固相合成在2-氯三苯甲基氯(TCP)树脂上进行，其中载量为1.3mmol/g。配备有聚丙烯玻璃料的注射器用作为反应容器。
将第一氨基酸载入至树脂根据厂商说明书来进行。
Fmoc脱保护：
对于Fmoc保护基团除去，所述树脂用2/2/96(v/v/v)的哌啶/DBU/DMF(两次，每次10分钟)搅动并用DMF洗涤(十次)。
Fmoc-Aib-载入的树脂的Fmoc脱保护：
固定的Fmoc-Aib-OH的Fmoc脱保护通过将树脂在4/1(v/v)的DMF/哌啶中在50℃搅拌20分钟(2次)来实现。
2-氯三苯甲基氯树脂的断裂程序：
完成合成后，将树脂用DCM洗涤，真空干燥并用6/4(v/v)的DCM/HFIP处理两次达30分钟。合并洗脱物，将挥发物在氮气流下除去并将所得的粗产物经RP-HPLC纯化。将含有产物的HPLC馏分合并并低压冻干。
使用离子交换树脂(Discovery DSC-SAX，Supelco，USA)将作为TFA盐得到的含有胺的产物转化为相应的盐酸盐。该步骤在如下情况下进行：预期残留的TFA干扰例如随后的偶联反应。
RP-HPLC纯化：
RP-HPLC在与Waters 600HPLC系统和Waters 2487吸光度检测器连接的100x20mm或者100x40mm C18 ReproSil-Pur 300 ODS-35μ柱(Dr.Maisch，Ammerbuch，Germany)上完成。使用溶液A(0.1％TFA于H2O中)和溶液B(0.1％TFA于乙腈中)的线性梯度。将含有产物的HPLC馏分低压冻干。
快速色谱法：
快速色谱法纯化在来自Biotage AB，Sweden的Isolera One系统上进行，使用Biotage KP-Sil硅胶柱并且使用正庚烷和乙酸乙酯作为洗脱剂。将产物在254nm检测。
对于水凝胶珠子，配备有聚丙烯玻璃料的注射器用作反应容器或者用于洗涤步骤。
分析方法
分析性超高效LC(UPLC)在与来自Thermo Scientific的LTQ OrbitrapDiscovery质谱仪偶联的配备有Waters BEH300 C18柱(2.1x50mm，1.7μm粒度)的Waters Acquity系统上进行。
由于PEG起始物质的多分散性，PEG产物的MS显示一系列(CH2CH2O)n部分。为了更易于解释，仅一个单一代表性m/z信号在实施例中给出。胰岛素结合物的MS报道有代表性同位素且指作四质子加合物[M+4H]4+。
除非另作说明，尺寸排阻色谱(SEC)使用配备有Superdex200 5/150 GL柱(Amersham Bioscience/GE Healthcare)的Amersham Bioscience AEKTAbasic系统进行，所述柱配备有0.45μm入口滤器。20mM磷酸钠、140mM NaCl，pH 7.4用作流动相。
实施例1
主链试剂1g的合成
Figure BDA0000148803070000551
主链试剂1g由氨基4-枝PEG5000 1a根据下述方案合成：
Figure BDA0000148803070000552
为了合成化合物1b，将氨基4-枝PEG5000 1a(MW约5200g/mol，5.20g，1.00mmol，盐酸盐)在20mL DMSO(无水)中溶解。加入Boc-Lys(Boc)-OH(2.17g，6.25mmol)在5mL DMSO(无水)中的溶液、EDC HCl(1.15g，6.00mmol)、HOBt·H2O(0.96g，6.25mmol)和可力丁(5.20mL，40mmol)。将反应混合物在RT搅拌30分钟。
将反应混合物用1200mL二氯甲烷稀释并用600mL 0.1N H2SO4(2x)、盐水(1x)、0.1M NaOH(2x)和1/1(v/v)的盐水/水(4x)洗涤。将水层再次用500mL DCM萃取。将有机相经Na2SO4干燥，滤过并蒸发得到6.3g粗产物1b，其为无色油状物。将化合物1b经RP-HPLC纯化。
收率3.85g(59％)无色玻璃状产物1b。
MS：m/z 1294.4＝[M+5H]5+(计算值＝1294.6)。
化合物1c通过将3.40g化合物1b(0.521mmol)在5mL甲醇和9mL 4NHCl于二噁烷中的溶液中的溶液在RT搅拌15分钟来得到。将挥发物真空除去。产物无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 1151.9＝[M+5H]5+(计算值＝1152.0)。
为了合成化合物1d，将3.26g化合物1c(0.54mmol)在15mL DMSO(无水)中溶解。加入2.99g Boc-Lys(Boc)-OH(8.64mmol)在15mL DMSO(无水)中的溶液、1.55g EDC HCl(8.1mmol)、1.24g HOBt·H2O(8.1mmol)和5.62mL可力丁(43mmol)。将反应混合物在RT搅拌30分钟。
将反应混合物用800mL DCM稀释并用400mL 0.1N H2SO4(2x)、盐水(1x)、0.1M NaOH(2x)和1/1(v/v)的盐水/水(4x)洗涤。将水层再次用800mLDCM萃取。将有机相用Na2SO4干燥，滤过并蒸发得到玻璃状粗产物。
将产物在DCM中溶解并用冷的(-18℃)乙醚沉淀。该操作重复两次并将沉淀物真空干燥。
收率：4.01g(89％)无色玻璃状产物1d，其无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 1405.4＝[M+6H]6+(计算值＝1405.4)。
化合物1e通过将化合物1d(3.96g，0.47mmol)在7mL甲醇和20mL 4NHCl于二噁烷中的溶液中的溶液在RT搅拌15分钟来得到。将挥发物真空除去。产物无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 969.6＝[M+7H]7+(计算值＝969.7)。
为了合成化合物1f，将化合物1e(3.55g，0.48mmol)在20mL DMSO(无水)中溶解。加入Boc-Lys(Boc)-OH(5.32g，15.4mmol)在18.8mL DMSO(无水)中的溶液、EDC HCl(2.76g，14.4mmol)、HOBt·H2O(2.20g，14.4mmol)和10.0mL可力丁(76.8mmol)。将反应混合物在RT搅拌60分钟。
将反应混合物用800mL DCM稀释并用400mL 0.1N H2SO4(2x)、盐水(1x)、0.1M NaOH(2x)和1/1(v/v)的盐水/水(4x)洗涤。将水层再次用800mLDCM萃取。将有机相经Na2SO4干燥，滤过并蒸发得到粗产物1f，其为无色油状物。
将产物在DCM中溶解并用冷的(-18℃)乙醚沉淀。该步骤重复两次并将沉淀物真空干燥。
收率4.72g(82％)无色玻璃状产物1f，其无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 1505.3＝[M+8H]8+(计算值＝1505.4)。
主链试剂1g通过将化合物1f(MW约12035g/mol，4.72g，0，39mmol)在20mL甲醇和40mL 4N HCl于二噁烷中的溶液中的溶液在RT搅拌30分钟来得到。将挥发物真空除去。
收率3.91g(100％)，玻璃状产物主链试剂1g。
MS：m/z 977.2＝[M+9H]9+(计算值＝977.4)。
1g的可替换合成途径
为了合成化合物1b，在45℃向4-枝-PEG5000四胺(1a)(50.0g，10.0mmol)在250mL iPrOH(无水)中的混悬液中加入boc-Lys(boc)-OSu(26.6g，60.0mmol)和DIEA(20.9mL，120mmol)并将混合物搅拌30分钟。
随后，加入正丙基胺(2.48mL，30.0mmol)。5分钟后，将溶液用1000mLMTBE稀释并在-20℃保存过夜(不搅拌)。将约500mL上清液倾出并弃去。加入300mL冷的MTBE并且在振摇1分钟后，将产物通过滤过经玻璃滤器收集并用500mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥16小时。
收率：65.6g(74％)1b，其为白色块状固体。
MS：m/z 937.4＝[M+7H]7+(计算值＝937.6)。
化合物1c通过将来自前述步骤的化合物1b(48.8g，7.44mmol)在156mL 2-丙醇中在40℃搅拌来得到。在搅拌下在1-2分钟内加入196mL 2-丙醇和78.3mL乙酰基氯的混合物。将溶液在40℃搅拌30分钟并冷却至-30℃且保持过夜(不搅拌)。加入100mL冷的MTBE，将混悬液振摇1分钟并在-30℃冷却1小时。将产物通过滤过经玻璃滤器收集并用200mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥16小时。
收率：38.9g(86％)1c，其为白色粉末状物。
MS：m/z 960.1＝[M+6H]6+(计算值＝960.2)。
为了合成化合物1d，在45℃向来自前述步骤的1c(19.0g，3.14mmol)在80ml 2-丙醇中的混悬液中加入boc-Lys(boc)-OSu(16.7g，37.7mmol)和DIEA(13.1mL，75.4mmol)，并将混合物在45℃搅拌30分钟。随后，加入正丙基胺(1.56mL，18.9mmol)。5分钟后，将溶液用600mL冷的MTBE沉淀并离心(3000min-1，1分钟)。将沉淀物真空干燥1小时并在400mL THF中溶解。加入200mL乙醚并将产物冷却至-30℃且保持16小时(不搅拌)。将混悬液经玻璃滤器滤过并用300mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥16小时。
收率：21.0g(80％)1d，其为白色固体。
MS：m/z 1405.4＝[M+6H]6+(计算值＝1405.4)。
化合物1e通过将来自前述步骤的化合物1d(15.6g，1.86mmol)溶解在3N HCl于甲醇(81mL，243mmol)中的溶液中并在40℃搅拌90分钟来得到。加入200mL MeOH和700mL iPrOH并将混合物在-30℃保存2小时。为了完成结晶，加入100mL MTBE并将混悬液在-30℃保存过夜。加入250mL冷的MTBE，将混悬液振摇1分钟并经玻璃滤器滤过并用100mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥。
收率：13.2g(96％)1e，其为白色粉末状物。
MS：m/z 679.1＝[M+10H]10+(计算值＝679.1)。
为了合成化合物1f，在45℃向来自前述步骤的1e(8.22g，1.12mmol)在165ml 2-丙醇中的混悬液中加入boc-Lys(boc)-OSu(11.9g，26.8mmol)和DIEA(9.34mL，53.6mmol)并将混合物搅拌30分钟。随后，加入正丙基胺(1.47mL，17.9mmol)。5分钟后，将溶液冷却至-18℃且保持2小时，然后加入165mL冷的MTBE，将混悬液振摇1分钟并经玻璃滤器滤过。随后，将滤饼用4x200mL冷的MTBE/iPrOH(4∶1)和1x200mL冷的MTBE洗涤。将产物真空干燥16小时。
收率：12.8g，MW(90％)1f，其为淡黄色块状固体。
MS：m/z 1505.3＝[M+8H]8+(计算值＝1505.4)。
主链试剂1g通过将4枝PEG5kDa(-LysLys2Lys4(boc)8)4(1f)(15.5g，1.29mmol)在30mL MeOH中溶解并冷却至0℃来得到。3分钟内加入4NHCl在二噁烷(120mL，480mmol，冷却至0℃)中的溶液并移去冰浴。20分钟后，15分钟内加入3N HCl在甲醇(200mL，600mmol，冷却至0℃)中的溶液，并将溶液在室温搅拌10分钟。将产物溶液用480mL冷的MTBE沉淀并在3000rpm离心1分钟。将沉淀物真空干燥1小时并再次在90mLMeOH中溶解，用240mL冷的MTBE沉淀并将混悬液在3000rpm离心1分钟。将产物1g真空干燥。
收率：11.5g(89％)，其为淡黄色薄片。
MS：m/z 1104.9＝[M+8H]8+(计算值＝1104.9)。
实施例2
交联试剂2d的合成
交联试剂2d由已二酸一苄酯(English，Arthur R.et al.，Journal ofMedicinal Chemistry，1990，33(1)，344-347)和PEG2000根据下述方案来制备：
Figure BDA0000148803070000591
将PEG 2000(2a)(11.0g，5.5mmol)和己二酸苄酯半酯(4.8g，20.6mmol)在二氯甲烷(90.0mL)中的溶液冷却至0℃。加入二环己基碳二亚胺(4.47g，21.7mmol)，接着加入催化量的DMAP(5mg)并将溶液搅拌且使其达到室温且保持过夜(12小时)。将烧瓶在+4℃保存5小时。将固体滤过并通过真空蒸馏将溶剂完全除去。将残留物在1000mL 1/1(v/v)的乙醚/乙酸乙酯中溶解并在RT保存2小时，同时形成少量的薄片状固体。将固体通过滤过经
Figure BDA0000148803070000592
填料除去。将溶液在密闭烧瓶中在-30℃冰箱中保存12小时直到结晶完成。将晶状产物经玻璃料滤过并用冷的乙醚(-30℃)洗涤。将滤饼真空干燥。收率：11.6g(86％)2b，其为无色固体。产物无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 813.1＝[M+3H]3+(计算值＝813.3)。
在500mL玻璃高压釜中，将PEG2000-二-已二酸-二-苄酯2b(13.3g，5.5mmol)在乙酸乙酯(180mL)中溶解并加入10％钯/炭(0.4g)。将溶液在6巴、40℃氢化直到氢气消耗已经停止(5-12小时)。将催化剂通过滤过经
Figure BDA0000148803070000601
填料除去并将溶剂真空蒸发。收率：12.3g(定量)2c，其为浅黄色油状物。产物无需进一步纯化即可在下一步中使用。
MS：m/z 753.1＝[M+3H]3+(计算值＝753.2)。
将PEG2000-二-已二酸半酯2c(9.43g，4.18mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(1.92g，16.7mmol)和二环己基碳二亚胺(3.44g，16.7mmol)在75mL DCM(无水)中的溶液在室温搅拌过夜。将反应混合物冷却至0℃并将沉淀物滤出。蒸发DCM并将残留物由THF重结晶。
收率：8.73g(85％)交联试剂2d，其为无色固体。
MS：m/z 817.8＝[M+3H]3+(计算值＝817.9g/mol)。
实施例3
含有游离氨基的水凝胶珠子(3)和(3a)的制备
将275mg 1g和866mg 2d在14mL DMSO中的溶液加入至100mgArlacel P135(Croda International Plc)在60mL庚烷中的溶液中。将混合物在700rpm在25℃用常用金属搅拌器搅拌10分钟以形成混悬液。加入1.0mLN，N，N’，N’-四甲基-乙二胺以实现聚合。2小时后，搅拌器速度降低至400rpm并将混合物搅拌额外的16小时。加入1.5mL乙酸然后在10分钟后，加入50mL水。5分钟后，停止搅拌器并将水相排出。
对于珠子大小分级，将水-水凝胶混悬液在75、50、40、32和20μm目钢筛上进行湿筛。汇集保留在32、40和50μm筛上的珠子级分并用水洗涤3次，用乙醇洗涤10次并在0.1毫巴干燥16小时，得到3，其为白色粉末状物。
3a如3所述制备，除了使用1200mg 1g、3840mg 2d、28.6ml DMSO、425mg Arlacel P135、100mL庚烷和4.3ml TMEDA之外。对于后处理，加入6.6ml乙酸然后在10分钟后，加入50mL水和50mL饱和氯化钠水溶液。
水凝胶的氨基含量通过如下确定：将fmoc-氨基酸与水凝胶上的游离氨基结合且随后确定fmoc，如Gude，M.，J.Ryf，et al.(2002)Letters in Peptide  Science 9(4)：203-206所述。
3和3a的氨基含量确定为0.11至0.16mmol/g。
实施例4
马来酰亚胺官能化水凝胶珠子(4)、(4a)和(4aa)的制备以及马来酰亚胺取代的确定
Figure BDA0000148803070000611
Mal-PEG6-NHS
将600mg Mal-PEG6-NHS(1.0mmol)在4.5mL 2/1(v/v)的乙腈/水中的溶液加入至200mg干燥水凝胶珠子3中。加入500μL磷酸钠缓冲液(pH 7.4，0.5M)并将混悬液在室温振摇30分钟。将珠子4分别用2/1(v/v)的乙腈/水、甲醇和1/1/0.001(v/v/v/)的乙腈/水/TFA洗涤五次。
4a如上所述合成，除了使用3a代替3。
可替换地，水凝胶珠子3a预先用99/1(v/v)的DMSO/DIEA洗涤，用DMSO洗涤并与Mal-PEG6-NHS(2.0当量，相对于水凝胶上的氨基的理论量而言)在DMSO中的溶液孵育45分钟。珠子4aa用DMSO洗涤两次并用pH3.0琥珀酸盐(20mM，1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤三次。将样品在RT在pH 6.0磷酸钠(50mM，50mM乙醇胺，0.01％Tween-20)中孵育1小时并用pH 3.0琥珀酸钠(20mM，1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤五次。
为了确定马来酰亚胺含量，将水凝胶珠子4、4a或者4aa的等分样分别低压冻干并称重。将水凝胶珠子4、4a或者4aa的另外的等分样分别与过量的巯基乙醇(于50mM磷酸钠缓冲液中，30分钟在RT)反应，并且巯基乙醇的消耗通过Ellman测试(Ellman，G.L.et al.，Biochem.Pharmacol.，1961，7，88-95)进行检测。马来酰亚胺含量确定为0.11至0.13mmol/g干燥水凝胶。
实施例5
衔接物试剂5d的合成
衔接物试剂5d根据下述方案合成：
Figure BDA0000148803070000621
衔接物试剂中间体5a的合成：
将4-甲氧基三苯甲基氯(3g，9.71mmol)在DCM(20mL)中溶解并逐滴加入至乙二胺(6.5mL，97.1mmol)在DCM(20mL)中的溶液中。2小时后，将溶液倒入乙醚(300mL)中并用30/1(v/v)的盐水/0.1m NaOH溶液(各自50ml)洗涤三次且用盐水(50mL)洗涤一次。将有机相经Na2SO4干燥并将挥发物减压除去得到Mmt-保护的中间体(3.18g，9.56mmol)。
将Mmt-保护的中间体(3.18g，9.56mmol)在无水DCM(30mL)中溶解。加入6-(三苯甲基巯基)-己酸(4.48g，11.47mmol)、PyBOP(5.67g，11.47mmol)和DIEA(5.0mL，28.68mmol)并将混合物在RT振摇30分钟。将溶液用乙醚(250mL)稀释并用30/1(v/v)的盐水/0.1m NaOH溶液(各自50ml)洗涤三次且用盐水(50mL)洗涤一次。将有机相经Na2SO4干燥并将挥发物减压除去。将5a经快速色谱法纯化。
收率：5.69g(8.09mmol)。
MS：m/z 705.4＝[M+H]+(计算值＝705.0)。
衔接物试剂中间体5b的合成：
向5a(3.19g，4.53mmol)在无水THF(50mL)中的溶液中加入BH3·THF(1M溶液，8.5mL，8.5mmol)并将溶液在RT搅拌16小时。加入另外的BH3·THF(1M溶液，14mL，14mmol)并在RT搅拌16小时。将反应混合物通过加入甲醇(8.5mL)进行淬灭，加入N，N-二甲基-乙二胺(3mL，27.2mmol)并将溶液加热至回流并搅拌三小时。将混合物在RT用乙酸乙酯(300mL)稀释，用饱和Na2CO3水溶液(2x100mL)和饱和NaHCO3水溶液(2x100mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并将挥发物减压蒸发得到粗的胺中间体(3.22g)。
将胺中间体在DCM(5mL)中溶解，加入Boc2O(2.97g，13.69mmol)在DCM(5mL)中的溶液和DIEA(3.95mL，22.65mmol)并将混合物在RT振摇30分钟。将混合物经快速色谱法纯化得到粗的Boc-和Mmt-保护的中间体(3g)。
MS：m/z 791.4＝[M+H]+，519.3＝[M-Mmt+H]+(计算值＝791.1)。
将0.4M盐酸水溶液(48mL)加入至Boc-和Mmt-保护的中间体在乙腈(45mL)中的溶液中。将混合物用乙腈(10mL)稀释并在RT搅拌一小时。随后，通过加入5M NaOH溶液将反应混合物的pH值调节为5.5，将乙腈减压除去并将水溶液用DCM(4x100mL)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥并将挥发物减压除去。粗的5b无需进一步纯化即可使用。
收率：2.52g(3.19mmol)。
MS：m/z 519.3＝[M+H]+(MW计算值＝518.8g/mol)。
衔接物试剂中间体5c的合成：
将5b(780mg，0.98mmol，～65％纯度)和NaCNBH3(128mg，1.97mmol)在无水甲醇(13mL)中溶解。加入2，4-二甲氧基苯甲醛(195mg，1.17mmol)在DCM(2mL)中的溶液，并将混合物在RT搅拌2小时。将溶剂减压蒸发，并将粗产物在DCM中溶解并用饱和NaCO3溶液洗涤。将水相用DCM萃取三次，并将合并的有机相用盐水洗涤，经MgSO4干燥并减压浓缩。将5c经快速色谱法纯化(使用DCM和MeOH作为洗脱剂)。
收率：343mg(0.512mmol)。
MS：m/z 669.37＝[M+H]+，(计算值＝669.95)。
衔接物试剂5d的合成：
将Fmoc-Aib-载入的TCP树脂(980mg，～0.9mmol)用DMF/哌啶脱保护，用DMF(5次)和DCM(6次)洗涤并真空干燥。将树脂用氯甲酸对硝基苯酯(364mg，1.81mmol)和可力丁(398μL，3.0mmol)在无水THF(6mL)中的溶液处理并振摇30分钟。将试剂溶液通过滤过除去并将树脂用THF(5次)洗涤，之后加入胺5c(490mg，0.7mmol)和DIEA(1.23mL，7.1mmol)在无水THF(6mL)中的溶液。在RT振摇18小时后，将试剂溶液通过滤过除去并将树脂用DCM(5次)洗涤。将衔接物试剂从树脂上断裂并经RP-HPLC纯化。通过加入饱和NaHCO3水溶液使产物馏分回到pH 6并减压浓缩。将所得的淤浆在饱和NaCl水溶液和DCM之间分配，并将水层用DCM萃取。将合并的有机馏分浓缩干燥得到衔接物试剂5d。
收率：230mg，(0.29mmol)。
MS m/z 798.41＝[M+H]+，(计算值＝798.1)。
实施例6
衔接物试剂6c的合成：
衔接物试剂6c根据下述方案合成：
Figure BDA0000148803070000641
胺6a的合成：
将三苯基甲硫醇(11.90g，43.08mmol)在DMSO(40mL)中混悬。加入DBU(7.41mL，49.55mmol)和6-溴己基酞酰亚胺(13.32g，42.94mmol)，并使混合物反应约15分钟。将反应混合物在乙酸乙酯(700mL)和0.1M HCl(200mL)之间分配。将水相用乙酸乙酯(3x50mL)萃取，并将合并的有机馏分用饱和NaHCO3(80mL)和盐水(80mL)洗涤，经MgSO4干燥，滤过并浓缩。将粗的黄色油状物由正庚烷/乙酸乙酯重结晶。得到中间体6-(S-三苯甲基-)巯基己基酞酰亚胺，其为白色固体(13.3g，26.4mmol，62％)。
将6-(S-三苯甲基-)巯基己基酞酰亚胺(14.27g，28.2mmol)在乙醇(250mL)中混悬。加入肼水合物(3.45mL，70.5mmol)，并将混合物加热至回流且保持2小时。将混合物滤过并将滤液真空浓缩。将氯仿(180mL)加入至残留的油状物中并将所得的混悬液在室温搅拌1.5小时。将混合物滤过，并将滤液用水(60mL)和盐水(60mL)萃取，经MgSO4干燥并浓缩得到粗6-(三苯甲基巯基)-己基胺(10.10g，26.87mmol，95％)。
MS：m/z 376.22＝[M+H]+，(计算值＝376.20)。
将DIEA(1.41mL，8.11mmol)和氯甲酸正丁酯(908μL，7.14mmol，于1mL THF中)加入至冷的(0℃)6-(三苯甲基巯基)-己基胺(2.44g，6.49mmol)在THF(50mL)中的溶液中。30分钟后加入LiAlH4(1M于THF中，9.74mL，9.47mmol)，并将混合物加热至回流且保持90分钟。加入水、3.75M NaOH水溶液以及水导致形成沉淀物，将其经滤过从混合物中除去。将滤液真空浓缩得到6a。
收率：2.41g(6.20mmol)。
MS：m/z 390.22＝[M+H]+，(计算值＝390.22)。
衔接物试剂中间体6b的合成：
向6a(2.1g，5.31mmol)的溶液中加入2-溴乙基酞酰亚胺(1.96g，7.7mmol)和K2CO3(1.09g，7.9mmol)并将混合物加热至回流且保持6小时。滤过并浓缩后，将粗的混合物在乙酸乙酯和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将粗的中间体(2-(N-甲基-N-(6-三苯甲基巯基己基-)氨基-)乙基)酞酰亚胺经快速色谱法纯化。
收率：1.23g(2.18mmol)。
MS：m/z：563.27＝[M+H]+，(计算值＝563.27)。
向(2-(N-甲基-N-(6-三苯甲基巯基己基-)氨基-)乙基)酞酰亚胺(672mg，1.19mmol)在乙醇(12mL)中的溶液中加入肼一水合物(208μL，4.17mmol)，并将混合物加热至回流且保持1小时。将反应混合物滤过，浓缩并将N-(2-氨基乙基-)-N-甲基-N-(6-三苯甲基巯基己基-)胺经RP-HPLC纯化。
收率：624mg(0.944mmol)。
MS：m/z 433.27＝[M+H]+，(计算值＝433.26)。
向N-(2-氨基乙基-)-N-甲基-N-(6-三苯甲基巯基己基-)胺(151mg，0.229mmol)和NaCNBH3(30mg，0.463mmol)在无水MeOH(6mL)中的溶液中加入2，4-二甲氧基苯甲醛在无水CH2Cl2(0.6μL)中的溶液。在RT搅拌1小时后，将反应混合物浓缩，重新在2mL的1/9(v/v)水/乙腈中溶解并将6b经RP-HPLC纯化。
收率：177mg(0.219mmol)。
MS：m/z 583.33＝[M+H]+，(计算值＝583.33)。
衔接物试剂6c的合成：
衔接物试剂6c由Fmoc-Aib-载入的树脂(704mg，～0.6mmol)如5d所述制备，除了使用胺6b(作为TFA盐，430mg，0.53mmol)代替5c。
收率：285mg，(0.330mmol)。
MS：m/z 712.37＝[M+H]+，(计算值＝712.37)。
实施例7
衔接物试剂7f的合成
衔接物试剂7f根据下述方案合成：
Figure BDA0000148803070000661
向冷的(0℃)N-甲基-N-boc-乙二胺(0.5mL，2.79mmol)和NaCNBH3(140mg，2.23mmol)在MeOH(10mL)和乙酸(0.5mL)中的溶液中加入2，4，6-三甲氧基苯甲醛(0.547mg，2.79mmol)在EtOH(10mL)中的溶液。将混合物在RT搅拌2小时，用2M HCl(1mL)酸化并用饱和Na2CO3水溶液(50mL)中和。蒸发所有挥发物，将所得的含水淤浆用DCM萃取并将有机馏分浓缩得到N-甲基-N-boc-N’-tmob-乙二胺(7a)，其为粗油状物，将其经RP-HPLC纯化。
收率：593mg(1.52mmol)
MS：m/z 377.35＝[M+Na]+，(计算值＝377.14)。
将N-Fmoc-N-Me-Asp(OtBu)-OH(225mg，0.529mmol)在DMF(3mL)中溶解并加入7a(300mg，0.847mmol)、HATU(201mg，0.529mmol)和可力丁(0.48mL，3.70mmol)。将混合物在RT搅拌2小时得到7b。对于fmoc脱保护，加入哌啶(0.22mL，2.16mmol)并继续搅拌1小时。加入乙酸(1mL)，并将7c经RP-HLPC纯化。
收率：285mg(0.436mmol，其为TFA盐)
MS：m/z 562.54＝[M+Na]+，(计算值＝562.67)。
将6-三苯甲基巯基己酸(0.847g，2.17mmol)在无水DMF(7mL)中溶解。加入HATU(0.825g，2.17mmol)、可力丁(0.8mL，6.1mmol)和7c(0.78g，1.44mmol)。将反应混合物在RT搅拌60分钟，用AcOH(1mL)酸化并经RP-HPLC纯化。将产物馏分用饱和NaHCO3水溶液中和并浓缩。将残留的水相用DCM萃取并在蒸发溶剂后分离7d。
收率：1.4g(94％)
MS：m/z 934.7＝[M+Na]+，(计算值＝934.5)。
向7d(1.40mg，1.53mmol)在MeOH(12mL)和H2O(2mL)中的溶液中加入LiOH(250mg，10.4mmol)并将反应混合物在70℃搅拌14小时。将混合物用AcOH(0.8mL)酸化并将7e经RP-HPLC纯化。将产物馏分用饱和NaHCO3水溶液中和并浓缩。将水相用DCM萃取并在蒸发溶剂后分离7e。
收率：780mg(60％)
MS：m/z 878.8＝[M+Na]+，(计算值＝878.40)。
向7e(170mg，0.198mmol)在无水DCM(4mL)中的溶液中加入DCC(123mg，0.59mmol)和N-羟基-琥珀酰亚胺(114mg，0.99mmol)，并将反应混合物在RT搅拌1小时。将混合物滤过，并将滤液用0.5mL AcOH酸化并将7f经RP-HPLC纯化。将产物馏分用饱和NaHCO3水溶液中和并浓缩。将残留的水相用DCM萃取并在蒸发溶剂后分离7f。
收率：154mg(0.161mmol)
MS：m/z 953.4＝[M+H]+，(计算值＝953.43)。
可替换地，衔接物试剂7f根据下述方法合成：
可替换的反应方案：
Figure BDA0000148803070000681
向N-甲基-N-boc-乙二胺(2g，11.48mmol)和NaCNBH3(819mg，12.63mmol)在MeOH(20mL)中的溶液中分批加入2，4，6-三甲氧基苯甲醛(2.08mg，10.61mmol)。将混合物在RT搅拌90分钟，用3M HCl(4mL)酸化并再搅拌15分钟。将反应混合物加入至饱和NaHCO3溶液(200mL)中并用CH2Cl2萃取五次。将合并的有机相经Na2SO4干燥并将溶剂真空蒸发。将所得的N-甲基-N-boc-N’-tmob-乙二胺(7a)在高真空完全干燥并且无需进一步纯化即可在下一反应步骤中使用。
收率：3.76g(11.48mmol，89％纯度，7a∶两个Tmob保护的产物＝8∶1)
MS：m/z 355.22＝[M+H]+，(计算值＝354.21)。
向7a(2g，5.65mmol)在CH2Cl2(24ml)中的溶液中加入COMU(4.84g，11.3mmol)、N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH(2.08g，4.52mmol)和可力丁(2.65mL，20.34mmol)。将反应混合物在RT搅拌3小时，用CH2Cl2(250mL)稀释并用0.1M H2SO4(100ml)洗涤三次并用盐水(100ml)洗涤三次。将水相再次用CH2Cl2(100ml)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，滤过并将残留物浓缩为24mL的体积。使用快速色谱法纯化7g。
收率：5.31g(148％，6.66mmol)
MS：m/z 796.38＝[M+H]+，(计算值＝795.37)。
向7g[5.31g，最大4.51mmol，N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH]在THF(60mL)中的溶液中加入DBU(1.8mL，3％v/v)。将溶液在RT搅拌12分钟，用CH2Cl2(400ml)稀释并用0.1M H2SO4(150ml)洗涤三次并用盐水(150ml)洗涤三次。将水相再次用CH2Cl2(100ml)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥并滤过。蒸发溶剂后分离7h并且无需进一步纯化即可在下一步反应中使用。
MS：m/z 574.31＝[M+H]+，(计算值＝573.30)。
将7h(5.31g，4.51mmol，粗品)在乙腈(26mL)中溶解并加入COMU(3.87g，9.04mmol)、6-三苯甲基巯基己酸(2.12g，5.42mmol)和可力丁(2.35mL，18.08mmol)。将反应混合物在RT搅拌4小时，用CH2Cl2(400ml)稀释并用0.1M H2SO4(100ml)洗涤三次并用盐水(100ml)洗涤三次。将水相再次用CH2Cl2(100ml)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，滤过并在蒸发溶剂后分离7i。使用快速色谱法纯化产物7i。
收率：2.63g(62％，94％纯度)
MS：m/z 856.41＝[M+H]+，(计算值＝855.41)。
向7i(2.63g，2.78mmol)在i-PrOH(33mL)和H2O(11mL)中的溶液中加入LiOH(267mg，11.12mmol)并将反应混合物在RT搅拌70分钟。将混合物用CH2Cl2(200ml)稀释并用0.1M H2SO4(50ml)洗涤三次并用盐水(50ml)洗涤三次。将水相再次用CH2Cl2(100ml)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，滤过并在蒸发溶剂后分离7e。使用快速色谱法纯化7j。
收率：2.1g(88％)
MS：m/z 878.4＝[M+Na]+，(计算值＝878.40)。
向7e(170mg，0.198mmol)在无水DCM(4mL)中的溶液中加入DCC(123mg，0.59mmol)和催化量的DMAP。5分钟后，加入N-羟基-琥珀酰亚胺(114mg，0.99mmol)并将反应混合物在RT搅拌1小时。将反应混合物滤过，将溶剂真空除去并将残留物在90％乙腈和0.1％TFA(3.4ml)中吸收。将粗的混合物经RP-HPLC纯化。将产物馏分用0.5M pH 7.4磷酸盐缓冲液中和并浓缩。将残留的水相用DCM萃取并在蒸发溶剂后分离7f。
收率：154mg(81％)
MS：m/z 953.4＝[M+H]+，(计算值＝953.43)。
实施例8
NαA1-胰岛素-衔接物结合物8b和8c的合成
Figure BDA0000148803070000701
受保护的胰岛素衔接物结合物8a的合成
将衔接物试剂5d在DCM(20mg/mL)中溶解并用N-环己基-碳二亚胺-N′-甲基聚苯乙烯-树脂(1.9mmol/g，10当量)活化1小时。将活化的衔接物试剂溶液加入至胰岛素(1.2当量)和DIEA(3.5当量)在DMSO(100mg胰岛素/mL)中的溶液中，并将混合物在RT振摇45分钟。将溶液用乙酸酸化，将DCM减压蒸发，并将NαA1-结合物保护的胰岛素-衔接物结合物8a经RP-HPLC纯化。
将低压冻干的8a用HFIP/TFA/水/三乙基甲硅烷的90/10/2/2(v/v/v/v)混合物(2mL/100mg的8a)在RT处理45分钟。将反应混合物用水稀释，并将所有挥发物在氮气流下除去。将NαA1-结合的胰岛素-衔接物结合物8b经RP-HPLC纯化。
8b：
收率：由62mg(0.078mmol)衔接物5d得到139mg(0.023mmol)
MS：m/z 1524.45＝[M+4H]4+(计算值＝1524.75)。
NαA1-结合的胰岛素-衔接物结合物8c如8b所述合成，除了使用6c(72mg，0.101mmol)代替5d之外。
8c：
收率：237mg(0.039mmol)
MS：m/z 1528.23＝[M+4H]4+(计算值＝1528.28)。
实施例9
NαB1-胰岛素-衔接物结合物9的合成
Figure BDA0000148803070000711
双重保护的Nα-boc-GlyA1-Nε-boc-LysB29-胰岛素如前所述(J.Markussen，J.
Figure BDA0000148803070000712
F.C.Wiberg，L.
Figure BDA0000148803070000713
J.Biol.Chem.1991，266，18814-18818)制备。
将衔接物试剂5d(0.04mmol)在DCM(0.5mL)中溶解并用N-环己基-碳二亚胺-N′-甲基聚苯乙烯树脂(0.205mmol)在RT活化2小时。将所得的活化的衔接物试剂溶液加入至二-boc-保护的胰岛素(24mg，0.004mmol)和DIEA(5μL，0.0229mmol)的溶液中并在RT振摇1小时。将反应混合物用100μL乙酸酸化并将受保护的胰岛素-衔接物结合物经RP-HPLC纯化。
收率：5mg(0.00075mmol)。
MS：m/z 1660.27＝[M+4H]4+(计算值＝1660.43)。
将低压冻干的受保护的胰岛素-衔接物结合物用1mL 90/10/2/2(v/v/v/v)的HFIP/TFA/水/TES在RT处理45分钟。将反应混合物用0.5mL水稀释并将所有的挥发物在氮气流下除去。将NαB1-结合的胰岛素-衔接物结合物9经RP-HPLC纯化。
收率：4mg(0.0007mmol)
MS：m/z 1524.46＝[M+4H]4+(计算值＝1524.75)。
实施例10
NεB29-胰岛素衔接物结合物10的合成
Figure BDA0000148803070000721
将胰岛素(644mg，0.111mmol)在6.5mL DMSO中溶解。加入3mL冷的(4℃)0.5M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)和7f(70mg，0.073mmol)在2.5mL DMSO中的溶液并将混合物在RT搅拌5分钟。加入400μLAcOH并将受保护的胰岛素结合物经RP HPLC纯化。
收率：172mg(0.025mmol)
MS：m/z 1662.27＝[M+4H]4+(计算值＝1662.48)。
保护基团的除去通过将低压冻干的产物馏分用6mL 90/10/2/2(v/v/v/v)的HFIP/TFA/TES/水在RT处理1小时来完成。将NεB29-结合的胰岛素-衔接物结合物10经RP HPLC纯化。
收率：143mg(0.023mmol)
MS：m/z 1531.46＝[M+4H]4+(计算值＝1531.71)。
实施例11
胰岛素-衔接物-水凝胶11a、11b、11c、11d、11da、11db和11dc的制备
Figure BDA0000148803070000731
将干燥的马来酰亚胺官能化水凝胶4(82mg，10.3μmol马来酰亚氨基)填充至配备有滤器玻璃料的注射器中。加入胰岛素-衔接物-硫醇8b(27.8mg，4.6μmol)在1.0mL乙腈/水/TFA 1/1/0.001(v/v/v)中的溶液并将混悬液在RT孵育5分钟。加入乙酸盐缓冲液(0.4mL，pH 4.8，1.0M)并将样品在RT孵育1小时。硫醇的消耗经Ellman测试监测。将水凝胶用1/0.43/0.001(v/v/v)的乙腈/水/TFA洗涤10次并用1/1/0.2/0.25(v/v/v/v)的1.0M肌氨酸pH 7.4/乙腈/0.5M磷酸盐缓冲液pH 7.4/水洗涤两次。最后，将水凝胶在肌氨酸溶液中混悬并在RT孵育2小时。
将胰岛素-衔接物-水凝胶11a用1/1/0.001(v/v/v)的乙腈/水/TFA洗涤10次并在4℃保存。
胰岛素含量通过将胰岛素-衔接物-水凝胶的等分样在还原条件下在pH12的全部水解且随后经RP-HPLC的胰岛素A-链和胰岛素B-链定量来确定。
11a的胰岛素载入量：175mg胰岛素/g胰岛素-衔接物-水凝胶
11a在10mM乙酸钠缓冲液pH 5、135mM氯化钠中的混悬液中的胰岛素的量：12mg胰岛素/1ml 11a混悬液。
11b、11c和11d如上所述制备，除了分别使用8c、9和10代替8b。
11da如上所述制备，除了使用10和4a代替8b和4。
11db如下制备：将马来酰亚胺官能化的水凝胶4a在pH 2.5HCl，0.01％Tween-20(5.0mL，119μmol马来酰亚氨基)中的混悬液填充至配备有滤器的注射器中。加入胰岛素-衔接物-硫醇10(166mg，24.4μmol)在8.0mL HCl pH2.5，0.01％Tween-20中的溶液并将混悬液在RT孵育5分钟。加入琥珀酸钠缓冲液(3.9mL，pH 4.0，150mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)以得到pH3.6并将样品在RT孵育90分钟。硫醇的消耗经Ellman测试监测。将水凝胶用琥珀酸钠缓冲液(pH 3.0，50mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤10次并用含有200mM乙酰基半胱氨酸的琥珀酸钠缓冲液(pH 3.0，50mM；1mM EDTA，0.01％ Tween-20)洗涤3次。最后，将水凝胶在含有乙酰基半胱氨酸的缓冲液中混悬并在RT孵育1小时。
将胰岛素-衔接物-水凝胶11db用琥珀酸盐缓冲液(pH 3.0，50mM；1mMEDTA，0.01％Tween-20)洗涤10次并用乙酸钠缓冲液(pH 5.0，10mM；130mM NaCl，0.01％Tween-20)洗涤8次。
11db的胰岛素载入量：6.12mg胰岛素/mL胰岛素-衔接物-水凝胶混悬液。
11dc如下制备：将马来酰亚胺官能化的水凝胶4a在pH 2.5HCl，0.01％Tween-20(58.3mL，958μmol马来酰亚氨基)中的混悬液加入至固相合成反应器中。将胰岛素-衔接物-硫醇10(117mL，460μmol)在2.5HCl，0.01％Tween-20中的溶液加入至4a。将混悬液在RT孵育5分钟。加入琥珀酸盐缓冲液(4.8mL，pH 4.0，150mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)以得到pH 3.6并将混悬液在RT孵育90分钟。
硫醇的消耗经Ellman测试进行监测。将水凝胶用琥珀酸盐缓冲液(pH3.0，50mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤10次并用含有10mM巯基乙醇的琥珀酸盐缓冲液(pH 3.0，50mM；1mM EDTA，0.01％Tween-20)洗涤2次。最后，将水凝胶在含有巯基乙醇的缓冲液中混悬并在RT孵育3小时。
将胰岛素-衔接物-水凝胶11dc用琥珀酸盐缓冲液(pH 3.0，50mM；1mMEDTA，0.01％Tween-20)洗涤10次并用琥珀酸盐/Tris缓冲液(pH 5.0，10mM；85g/L海藻糖，0.01％Tween-20)洗涤6次。
11dc的胰岛素载入量：18.7mg胰岛素/mL胰岛素-衔接物-水凝胶混悬液。
可替换地，可使用马来酰亚胺衍生的水凝胶微粒4aa代替4a。
实施例12
体外释放动力学
分别将胰岛素-衔接物-水凝胶11a、11b、11c和11d(含有约1mg胰岛素的胰岛素-衔接物-水凝胶)在2ml 60mM磷酸钠，3mM EDTA，0.01％Tween-20，pH 7.4中混悬，并在37℃孵育。将混悬液在时间间隔离心并将上清液经RP-HPLC(215nm)和ESI-MS分析。将与释放的胰岛素相关的UV-信号进行整合且针对孵育时间进行绘图。
应用曲线拟合软件来评估释放的相应的半衰期。
分别针对11a、11b、11c和11d进行确定16天、10天、30天和14天的体外半衰期。
可替换地，将胰岛素-衔接物-水凝胶11db转移至配备有滤器的注射器中，于6ml 60mM磷酸钠、3mM EDTA、0.01％Tween-20、pH 7.4中混悬，并在37℃孵育。在确定的时间点，交换上清液并将释放的胰岛素经RP-HPLC在215nm定量。将释放的胰岛素的量针对孵育时间进行绘图。应用曲线拟合软件且针对11db确定体外半衰期为15天。
可替换地，将胰岛素-衔接物-水凝胶11db填充在色谱柱上并置于温度控制培养箱(37℃)中。将磷酸钠(pH 7.4，60mM；3mM EDTA，0.01％Tween-20)泵送通过柱(恒定流速为0.25mL/h(额定))并且在培养箱外进行收集。在确定的时间点，将溶液经RP-HPLC在215nm分析。将释放的胰岛素的量针对孵育时间进行绘图。应用曲线拟合软件且针对11db确定体外半衰期为13天。
实施例13
胰岛素的LysB29-衔接物结合物(12a)和赖脯胰岛素的LysB28-衔接物结合物(12b)的合成：
胰岛素的LysB29-衔接物结合物(12a)的合成
Figure BDA0000148803070000761
将1.2g(0.206mmol，0.85当量)胰岛素在RT在DMSO中溶解。30分钟后，将溶液冷却至0℃，同时历时4.40分钟的时间加入硼酸盐缓冲液(0.5M，pH 8.5，21.6ml)。溶液的温度保持在25和28℃之间。历时3分钟的时间、非时间变化地加入228mg(0.239mmol，1当量)7f在40ml DMSO中的溶液。移去冰浴并将反应混合物在RT搅拌5分钟。将反应混合物通过加入70mLMeCN/H2O(1∶1，0.1％TFA)和400μl AcOH进行淬灭。将12a经RP HPLC(溶剂A：含有0.1％TFA的H2O，溶剂B：含有0.1％TFA的MeCN，梯度：30-80％B，历时14分钟，流速：40ml/min)纯化。
UPLC分析(RP HPLC纯化前)的区域选择性：0.70％与胰岛素的GlyA1连接的7f以及76.2％与胰岛素的LysB29连接的7f(参见图1a)。
收率：862mg (TFA-盐，60％)。
MS[M+H]1/4 +＝1662.25g/mol((MW+H)1/4计算值＝1662.35g/mol)。
赖脯胰岛素的LysB28-衔接物结合物(12b)的合成
Figure BDA0000148803070000762
将0.347g(0.059mmol，0.85当量)赖脯胰岛素在RT在6ml DMSO中溶解。30分钟后，将溶液冷却至0℃，同时历时1.40分钟的时间加入硼酸盐缓冲液(0.5M，pH 8.5，5.64ml)。溶液的温度保持在25和30℃之间。历时2分钟的时间、非时间变化地加入67mg(0.070mmol，1当量)7f在8ml DMSO中的溶液。移去冰浴并将反应混合物在RT搅拌5分钟。将反应混合物通过加入20mL MeCN/H2O(1∶1，0.1％TFA)和1ml AcOH进行淬灭。将12b经RP HPLC(溶剂A：含有0.1％TFA的H2O，溶剂B：含有0.1％TFA的MeCN，梯度：30-80％B，历时14分钟，流速：40ml/min)纯化。
UPLC分析(RP HPLC纯化前)的区域选择性：1.3％的产物为与赖脯胰岛素的GlyA1连接的7f，76.7％的产物为与赖脯胰岛素的LysB28连接的7f(参见图1b)。
收率：305mg(TFA-盐，72％)。
MS[M+H]1/4 +＝1662.25g/mol((MW+H)1/4计算值＝1662.35g/mol)。
实施例14
大鼠的药物代谢动力学研究
11a的药物代谢动力学通过在将单一剂量皮下施用至大鼠后测量血浆胰岛素浓度来确定。
由10只雄性Wistar大鼠(200-250g)构成的一组用于研究历时14天的血浆胰岛素水平。各只动物接受含有6mg胰岛素(12mg胰岛素/ml)的500μL的11a在乙酸盐缓冲液pH 5中的混悬液的单一皮下注射。在每只动物和每个时间点舌下抽取200μL血液以获得100μL肝素锂血浆。在施用前以及在注射后4小时和1、2、3、4、7、9、11和14天后收集样品。血液抽取后，血浆样品在15分钟内冷冻且在-80℃保存直到测定。
血浆胰岛素浓度使用超灵敏胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia)按照制造商的程序来测量。测量前将血浆样品在ELISA缓冲液(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。胰岛素浓度由校正曲线计算，所述校正曲线通过一式两份测量胰岛素标准品且使用线性回归拟合数值来产生。胰岛素浓度定义为两个独立稀释系列的平均值，所述独立稀释系列通过各自的稀释因子来校正且针对时间来绘图。对于各个时间点的平均血浆胰岛素浓度通过计算所有使用的动物的平均值来获得，如在图2中显示。
观察到历时14天的胰岛素无爆发且持续释放。
实施例15：
大鼠的药物代谢动力学研究
11da的药物代谢动力学通过在健康大鼠中历时13天测量血浆胰岛素浓度来确定。
8只Wistar大鼠(约250g体重)接受含有3mg胰岛素(约12mg/kg)于乙酸盐缓冲液pH 5中的500μL测试物品11da的单一皮下注射。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在测试物品给药前1天以及给药后4小时、1天、2天、3天、6天、7天、8天、10天和13天收集样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素超灵敏ELISA试剂盒(DRG Instruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且从样品数值中扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。对于待研究的所有动物的直到第13天的血浆胰岛素含量结果在图3中显示。
在含有3mg胰岛素的500μL 11d的单一皮下注射后，第一天的平均血浆胰岛素水平升至最大约500pM。如所预期的，血浆胰岛素浓度随后在两周内持续降低。在研究的第一周内的血浆胰岛素水平的峰/谷比为约1.7。
实施例16：
大鼠的药物代谢动力学和药效动力学研究
释放的胰岛素的量和生物活性通过在研究性药物代谢动力学/药效学研究中使用糖尿病性Sprague-Dawley(SD)大鼠分析血浆胰岛素浓度和血糖降低作用来研究。
针对该目的，在8只大鼠中使用链唑霉素(STZ)诱导糖尿病且将在第0天具有高于350mg/dL的血糖水平的所有动物包括在该研究中。8只SD大鼠中的7只变为具有糖尿病且接受含有6.4mg胰岛素于乙酸盐缓冲液pH 5中的500μL测试物品11da的单一皮下注射。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在测试物品给药前4天以及给药后2小时、1天、2天、3天、6天、7天、8天、10天和13天收集样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。在注射前以及测试物品给药后2小时、1天、2天、3天、6天、7天、8天、10天、13天、15天、17天、20天、22天和24天使用AccuChek Comfort装置由尾静脉测量血糖3次。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素ELISA试剂盒(DRG InstrumentsGmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且从样品数值中扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。历时2周监测血浆胰岛素水平且历时3周监测血糖水平，如在图4中显示。
在胰岛素水凝胶11da的单一皮下注射后，历时10天的血糖水平有效地降低，具有低于100mg/dL的值，且无低血糖的任何症状。由于每只动物6.4mg胰岛素的较高剂量，在第1天的最大血浆胰岛素浓度为约800pM且在2周内持续降低至约300pM。同时，在10天后血糖值开始上升且在3周后达到给药前水平。
实施例17：
在大鼠中历时24小时的药物代谢动力学研究(爆发研究)
为了证实胰岛素由胰岛素-衔接物-水凝胶释放而无爆发，在健康大鼠中历时24小时监测血浆胰岛素浓度。
将8只Sprague-Dawley大鼠(200-250g体重)分为两组且每千克体重接受于乙酸盐缓冲液pH 5中的2mL测试物品11db的单一皮下注射。所述测试物品具有4mg/mL的胰岛素浓度，以使得每只动物每千克体重接受8mg胰岛素。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在给药前以及施用测试物品后5分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时收集组A样品，且在给药前以及测试物品给药后15分钟、1小时、3小时、6小时和24小时收集组B样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素超灵敏ELISA试剂盒(DRGInstruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且从样品数值中扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。结果在图5中显示且清楚地表明胰岛素释放而无任何爆发。
实施例18：
在大鼠中的药物代谢动力学和药效动力学多剂量研究
在11da的三个每周一次给药后的药物代谢动力学和药效动力学通过在糖尿病大鼠中历时4周测量血浆胰岛素浓度和血糖水平来确定。
使用具有239g的平均体重的8只Sprague-Dawley大鼠。使用链唑霉素(STZ)诱导糖尿病且在第0天(测试物品注射日)具有高于350mg/dL的血糖水平的所有动物包括在该研究中。接受STZ处理的8只动物中的8只变为具有糖尿病且每千克体重接受于乙酸盐缓冲液pH 5中的2mL测试物品11da的在第0、7和14天的三个每周一次的皮下注射。在测试物品胰岛素浓度为4mg/mL的情况下，施用的剂量为每千克体重8mg胰岛素。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在测试物品给药前3天以及测试物品给药后至多28天收集样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。在注射前以及在注射后至多30天使用AccuChekComfort装置由尾静脉测量血糖3次。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素ELISA试剂盒(DRG Instruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且从样品数值中扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。历时4周监测血浆胰岛素水平和血糖水平并且均在图6中显示。
曲线的形状表明释放的胰岛素具有在第三次注射后稳定地降低血糖水平至约100mg/dL的值且维持该低水平约一周的生物活性。同时，最大胰岛素浓度稳定地由第一次给药后的200pM和第二次给药后的300pM增加至第三次给药后的400pM且随后在2周内再次降低至低于100pM的值。
实施例19：
大鼠中的药物代谢动力学研究
11dc的药物代谢动力学通过在健康大鼠中历时13天测量血浆胰岛素浓度来确定。
8只Wistar大鼠(约230g体重)接受含有3mg胰岛素(12mg/kg剂量)的于琥珀酸盐缓冲液pH 5(10mM琥珀酸盐/Tris，85g/l海藻糖，0.01％Tween-20，pH 5.0)中的2ml/kg测试物品11dc的单一皮下注射。在每只动物和每个时间点由尾静脉抽取200μL血液以获得约100μL肝素锂血浆。在测试物品给药前4天以及给药后0.3小时(4只动物)、1小时(4只动物)、2小时(4只动物)、4小时(4只动物)、1天、2天、3天、6天、8天、10天和13天收集样品。血浆样品冷冻且在-80℃保存直到测定。血浆样品的胰岛素含量使用人胰岛素超灵敏ELISA试剂盒(DRG Instruments GmbH，Germany)按照制造商的程序来测量。空白数值(校准器0)包含在校正曲线中且由样品数值扣除，并且校正曲线使用三次多项方程式来拟合。分析前，将血浆样品涡旋且在反应管(1∶5和1∶10，校准器0)中稀释。针对分析，450nm处的OD用微量滴定板读取器(Tecan Ultra)在无参照波长校正的情况下测量。对于所有待研究的动物的直至第13天的血浆胰岛素含量的结果在图7中显示。
在12mg/kg 11dc的单一皮下注射后，在第1天平均血浆胰岛素水平升至约500pM的最大值。如所预期的，血浆胰岛素浓度随后在2周内持续地降低。在第一周内血浆胰岛素的峰/谷比为约1.4。
实施例20
pH 7.4的实时胰岛素释放和水凝胶降解
将胰岛素-衔接物水凝胶11a在pH 5.0乙酸盐缓冲液(10mM，130mMNaCl，0.01％(w/v)tween-20)中的混悬液(730μL，含有3.19mg胰岛素)填充至样品配制管中，用pH 7.4释放缓冲液(60mM磷酸钠，3mM EDTA，0.01％(w/v)Tween-20)洗涤三次并填充至1.00mL。将混悬液的等分样(0.5mL，1.59mg胰岛素)填充在色谱柱中且置于温度控制培养箱(37℃)中。将释放缓冲液(pH 7.4)泵送通过柱(恒定流速为0.25mL/h(额定))并且在培养箱外收集。在确定的时间点，将溶液经RP-HPLC(215nm)分析。将释放的胰岛素的量针对孵育时间进行绘图，且应用曲线拟合软件以评估相应的释放半衰期。针对胰岛素释放的半衰期确定为9.4天。
在37℃孵育39天后，将水凝胶混悬液转移至样品配制管中，使用pH 7.4的释放缓冲液将残留的水凝胶由柱洗出并且样品至多填充1.00mL。将两个等分溶液(各300μL)转移至无菌样品配制管中，至多填充1.5mL，且在37℃孵育。在一定时间间隔采集样品并且通过尺寸排阻色谱分析。将相应于水凝胶释放的包含一种或者多种主链部分(对应于反应性官能团)的水溶性降解产物的UV-信号进行整合并且针对孵育时间进行绘图，参见图8。
实施例21
胰岛素-衔接物-水凝胶前药的可注射性
使用5mL胰岛素-衔接物-水凝胶前药11dc(32-75μm的珠子大小分布，18mg胰岛素/ml)在pH 5.0琥珀酸/Tris(10mM，40g/L甘露醇；10g/L海藻糖二水合物；0.05％TWEEN-20)中的混悬液。将胰岛素-衔接物-水凝胶前药混悬液经20G注射针头填充至1mL注射器(长度为57mm)中。将20G注射针头用30G注射针头替换且置于注射器台座(Aqua Computer GmbH&Co.KG)上，并且以172mm/min(等于50μL/s)的活塞速度开始测量(力测试架：Multitest 1-d，数据记录软件：EvaluatEmperor Lite，版本1.16-015，测力计：BFG 200N(均为Mecmesin Ltd.，UK))。在下表中显示的具有增加活塞速度的试验使用新的胰岛素-衔接物-水凝胶前药样品来进行。相应地使用水和乙二醇进行该试验。对于所有试验，使用相同的30G注射针头。使用30G注射针头的力/流动在图9中显示。
Figure BDA0000148803070000821
缩写：
Figure BDA0000148803070000822
Figure BDA0000148803070000831

Claims (32)

1.药物组合物，包含胰岛素化合物，所述胰岛素化合物的浓度足以将所述胰岛素化合物在血浆中的治疗有效水平维持至少三天，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的体内药物代谢动力学分布。
2.药物组合物，包含以至少10mg/ml的浓度的胰岛素化合物，其特征在于具有基本上无胰岛素化合物爆发的体内药物代谢动力学分布。
3.药物组合物，包含以至少11mg/mL的浓度的胰岛素化合物，其按照至少10mg胰岛素化合物的单一剂量给药。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述胰岛素化合物的浓度为至少11mg/ml，诸如11mg/ml至35mg/ml。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其特征在于显示小于2的峰/谷比，诸如小于1.75、小于1.5或者小于1.25的峰/谷比。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其特征在于在给药之间的全部时间内持续释放结构完整的胰岛素化合物。
7.权利要求6的组合物，其中所述给药之间的全部时间为至少约80小时，诸如至少约110小时，典型地至少一周。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述胰岛素化合物为前药。
9.权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述胰岛素化合物完全包含在贮药库中，所述贮药库典型地为聚合物凝胶，诸如水凝胶，例如充分水合的聚合物基质。
10.权利要求9的组合物，其中所述胰岛素化合物在所述贮药库中共价连接，所述贮药库典型地为聚合物凝胶，诸如水凝胶，例如充分水合的聚合物基质。
11.权利要求1-10中任一项的组合物，其特征在于通过注射给药，诸如皮下或者肌内给药。
12.权利要求1-11中任一项的组合物，其中所述胰岛素化合物选自人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素或者它们的前药。
13.权利要求1-12中任一项的组合物，其中在给药的首24小时内达到所述峰浓度，诸如在给药的首12小时内，例如在给药的首6小时内达到所述峰浓度。
14.权利要求1-13中任一项的组合物，还包含GLP-1化合物。
15.胰岛素化合物在制备用于治疗或者预防与胰岛素缺陷相关的疾病或者病症的权利要求1-14中任一项的药物组合物中的用途，在所述疾病或者病症中用胰岛素化合物治疗或者预防是有益的，所述疾病或者病症诸如高血糖症、前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、II型糖尿病、综合征X。
16.权利要求1-14中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物为干燥的。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述药物组合物经低压冻干进行干燥。
18.权利要求16或者17的组合物，其中所述胰岛素水凝胶前药在组合物中足量给药以在一次施用中至少提供三天治疗有效量的胰岛素。
19.权利要求1-14、16-18中任一项的组合物，其为单一剂量组合物。
20.权利要求1-14、16-18中任一项的组合物，其为多重剂量组合物。
21.权利要求1-14、16-20中任一项的组合物，其特征在于其含有游离形式的或者作为前药特别是水凝胶前药的一种或者多种额外的生物活性剂；且其中所述一种或者多种额外的生物活性剂选自磺脲类，例如氯磺丙脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲等；氯茴苯酸类，例如瑞格列奈；胰升糖素样肽-1(GLP-1)及其模拟物，葡萄糖促胰岛素肽(GIP)及其模拟物，艾塞那肽及其模拟物，以及二肽基蛋白酶抑制剂(DPPIV)；双胍，例如二甲双胍；噻唑烷二酮类，例如罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、伊沙列酮(称为MCC-555)、2-[2-[(2R)-4-己基-3，4-二氢-3-氧代-2H-1，4-苯并噁嗪-2-基]乙氧基]-苯乙酸等；GW2570等；视黄醇类X受体(RXR)调节剂，例如塔革雷汀、9-顺式视黄酸等；其它胰岛素致敏剂，例如INS-1、PTP-1B抑制剂、GSK3抑制剂、糖原磷酸化酶a抑制剂、果糖-1，6-二磷酸酶抑制剂等；胰岛素，包括常规或者短效、中效和长效胰岛素，吸入的胰岛素和胰岛素类似物，诸如在天然氨基酸序列中具有微小差异的胰岛素分子；胰岛素的小分子模拟物，包括但不限于L-783281、TE-17411等；Na-葡萄糖协同转运蛋白抑制剂，诸如T-1095、T-1095A、根皮苷等；支链淀粉激动剂，其包括但不限于普兰林肽等；高血糖素拮抗剂诸如AY-279955等；减肥药诸如奥利司他，胰脂酶抑制药；西布曲明；去甲肾上腺素和多巴胺；生长激素、IGF-1、生长激素释放因子；胃泌酸调节素和胃饥饿素调节剂；食欲抑制剂诸如苄非他明、芬美曲秦、芬特明、安非拉酮、马吲哚、西布曲明、苯丙醇胺或者麻黄碱；食欲抑制剂诸如喹哌嗪、氟西汀、舍曲林、芬氟拉明或者右芬氟拉明；食欲抑制剂诸如阿扑吗啡；食欲抑制剂诸如组胺模拟物、H3受体调节剂；能量消耗强化剂诸如β-3肾上腺素能激动剂和解偶联蛋白机能刺激剂；瘦蛋白和瘦蛋白模拟物(例如美曲普汀)；神经肽Y拮抗剂；黑皮质素-1、3和4受体调节剂；胆囊收缩素激动剂；胰升糖素样肽-1模拟物和类似物，例如艾塞那肽；雄激素诸如脱氢表雄酮和衍生物诸如本胆烷二酮；睾酮；促蛋白合成甾类诸如氧雄龙，以及甾体激素；促生长激素神经肽受体拮抗剂；细胞因子药物诸如睫状节神经细胞营养因子；淀粉酶抑制剂。
22.容器，包含权利要求1-14、16-21中任一项的药物组合物。
23.权利要求22的容器，其中所述容器为二室注射器。
24.混悬液，包含权利要求1-14、18-21中任一项的药物组合物。
25.制备权利要求24的混悬液的方法，包括通过加入重建溶液来重建权利要求16或者17的干燥的药物组合物的步骤。
26.套盒，包括权利要求1-14、16-21中任一项的药物组合物以及用于给药所述组合物的容器。
27.套盒，包括注射针头和含有重建溶液的容器，以及利用注射针头使用的权利要求16或者17的干燥组合物。
28.权利要求27的套盒，其中所述容器为二室注射器且其中所述二室注射器的两室之一含有所述重建溶液。
29.权利要求26至28中任一项的套盒，其中所述组合物经注射针头是可注射的。
30.权利要求29的套盒，其中所述注射针头具有小于300μm的内径。
31.权利要求29的套盒，其中所述注射针头具有小于225μm的内径。
32.权利要求29的套盒，其中所述注射针头具有小于175μm的内径。
CN201080044021.3A 2009-07-31 2010-07-30 长效胰岛素组合物 Expired - Fee Related CN102625695B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09167017 2009-07-31
EP09167017.4 2009-07-31
EP09179337 2009-12-15
EP09179337.2 2009-12-15
EP09179827.2 2009-12-18
EP09179827 2009-12-18
PCT/EP2010/061160 WO2011012719A1 (en) 2009-07-31 2010-07-30 Long acting insulin composition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102625695A true CN102625695A (zh) 2012-08-01
CN102625695B CN102625695B (zh) 2015-05-27

Family

ID=43033453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080044021.3A Expired - Fee Related CN102625695B (zh) 2009-07-31 2010-07-30 长效胰岛素组合物

Country Status (29)

Country Link
US (1) US9265723B2 (zh)
EP (1) EP2459171B1 (zh)
JP (1) JP5732053B2 (zh)
KR (1) KR101759499B1 (zh)
CN (1) CN102625695B (zh)
AU (1) AU2010277560B2 (zh)
BR (1) BR112012001988A2 (zh)
CA (1) CA2769540C (zh)
CL (1) CL2012000469A1 (zh)
CO (1) CO6491085A2 (zh)
CR (1) CR20120019A (zh)
DK (1) DK2459171T3 (zh)
EC (1) ECSP12011631A (zh)
ES (1) ES2636741T3 (zh)
GT (1) GT201200020A (zh)
IL (1) IL217613A (zh)
MA (1) MA33466B1 (zh)
MX (1) MX2012001141A (zh)
NI (1) NI201200013A (zh)
NZ (1) NZ597964A (zh)
PE (1) PE20121170A1 (zh)
PL (1) PL2459171T3 (zh)
PT (1) PT2459171T (zh)
RU (1) RU2556340C2 (zh)
SG (1) SG178195A1 (zh)
TN (1) TN2012000010A1 (zh)
UA (1) UA108475C2 (zh)
WO (1) WO2011012719A1 (zh)
ZA (1) ZA201200224B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103830189A (zh) * 2014-03-04 2014-06-04 山东新时代药业有限公司 一种重组甘精胰岛素制剂及其制备方法
CN105796508A (zh) * 2014-12-30 2016-07-27 江苏万邦生化医药股份有限公司 甘精胰岛素缓释微球、甘精胰岛素微球注射剂及其制备方法
CN105960249A (zh) * 2014-01-09 2016-09-21 赛诺菲 胰岛素类似物和/或胰岛素衍生物的稳定化药物制剂
CN109789188A (zh) * 2016-09-29 2019-05-21 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 具有低峰-谷比的pth化合物

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005099768A2 (en) * 2004-03-23 2005-10-27 Complex Biosystems Gmbh Polymeric prodrug with a self-immolative linker
LT2349324T (lt) 2008-10-17 2017-12-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulino ir glp-1 agonisto derinys
PE20120918A1 (es) 2009-07-31 2012-08-14 Sanofi Aventis Deutschland Profarmacos que comprenden un conjugado de insulina-conector
NZ597964A (en) 2009-07-31 2014-04-30 Sanofi Aventis Deutschland Long acting insulin composition
ES2855146T3 (es) 2009-11-13 2021-09-23 Sanofi Aventis Deutschland Composición farmacéutica que comprende un agonista de GLP-1, una insulina y metionina
TWI468171B (zh) 2009-11-13 2015-01-11 Sanofi Aventis Deutschland 含ｇｌｐ－１激動劑及甲硫胺酸之醫藥組成物
AU2012216648C1 (en) * 2010-05-19 2017-03-16 Sanofi Long-acting formulations of insulins
AU2011202239C1 (en) 2010-05-19 2017-03-16 Sanofi Long-acting formulations of insulins
CN103179978A (zh) 2010-08-30 2013-06-26 赛诺菲-安万特德国有限公司 Ave0010用于制造供治疗2型糖尿病用的药物的用途
EP2438930A1 (en) 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
JP6367115B2 (ja) 2011-08-29 2018-08-01 サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ２型糖尿病患者の血糖コントロールに使用する組合せ医薬
AR087744A1 (es) 2011-09-01 2014-04-16 Sanofi Aventis Deutschland Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa
SG11201402661TA (en) * 2011-11-28 2014-08-28 Phasebio Pharmaceuticals Inc Therapeutic agents comprising insulin amino acid sequences
TWI641381B (zh) 2013-02-04 2018-11-21 法商賽諾菲公司 胰島素類似物及／或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物
US20150231334A1 (en) * 2013-12-18 2015-08-20 Windgap Medical, Inc. Drug mixing and delivery system and method
RU2019133674A (ru) 2013-04-03 2020-05-20 Санофи Лечение сахарного диабета с помощью составов инсулинов длительного действия
TW201609145A (zh) * 2013-12-25 2016-03-16 參天製藥股份有限公司 注射劑及形成緩釋（ｄｅｐｏｔ）之方法
JP7173953B2 (ja) * 2014-01-09 2022-11-16 サノフイ インスリンアナログおよび／またはインスリン誘導体の安定化された医薬製剤
RU2016132386A (ru) 2014-01-09 2018-02-14 Санофи Стабилизированные фармацевтические составы без глицерина на основе инсулиновых аналогов и/или инсулиновых производных
JP2020114861A (ja) * 2014-01-09 2020-07-30 サノフイＳａｎｏｆｉ インスリンアナログおよび／またはインスリン誘導体の、グリセリンを含まない安定化された医薬製剤
RU2016132340A (ru) * 2014-01-09 2018-02-14 Санофи Стабилизированные фармацевтические составы на основе инсулина аспарта
JP2020143105A (ja) * 2014-01-09 2020-09-10 サノフイＳａｎｏｆｉ インスリンアスパルトの安定化された医薬製剤
AR099569A1 (es) * 2014-02-28 2016-08-03 Novo Nordisk As Derivados de insulina y los usos médicos de estos
WO2016065042A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
CR20170314A (es) 2014-12-12 2017-10-20 Sanofi Aventis Deutschland Formulación de relación fija de insulina glargina/lixisenatida
CN107205938A (zh) 2014-12-18 2017-09-26 温德加普医疗股份有限公司 用于溶解或增溶治疗剂的方法和组合物
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
KR102524255B1 (ko) 2016-03-01 2023-04-20 아센디스 파마 본 디지즈 에이/에스 Pth 프로드럭
WO2018057977A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Delpor, Inc. Stable compositions for incretin mimetic compounds
HRP20231079T1 (hr) * 2016-09-29 2023-12-22 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Režim za doziranje pth spoja s kontroliranim oslobađanjem
US10869851B1 (en) * 2017-03-13 2020-12-22 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Army Targeting NUR77 for mitigating perinatal neuroinflammation
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
KR20200044016A (ko) 2017-08-24 2020-04-28 노보 노르디스크 에이/에스 Glp-1 조성물 및 그 용도
AR116566A1 (es) 2018-10-03 2021-05-19 Novartis Ag Administración sostenida de polipéptidos similares a la angiopoyetina 3
CN114599665A (zh) 2019-08-16 2022-06-07 应用分子转运公司 组合物、制剂及白细胞介素产生和纯化
PE20221575A1 (es) 2020-02-18 2022-10-06 Novo Nordisk As Formulaciones farmaceuticas

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009010428A1 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, pegylated insulin analogues

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
DK257988D0 (da) 1988-05-11 1988-05-11 Novo Industri As Nye peptider
DE3837825A1 (de) 1988-11-08 1990-05-10 Hoechst Ag Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
KR910700262A (ko) 1988-12-23 1991-03-14 안네 제케르 사람 인슐린 유사체
PT93057B (pt) 1989-02-09 1995-12-29 Lilly Co Eli Processo para a preparacao de analogos da insulina
DK155690D0 (da) 1990-06-28 1990-06-28 Novo Nordisk As Nye peptider
US5634943A (en) 1990-07-12 1997-06-03 University Of Miami Injectable polyethylene oxide gel implant and method for production
ATE197125T1 (de) 1992-02-28 2000-11-15 Univ Texas Photopolymerinierbare, biologisch abbaubare hydrogele als gewebekontaktmaterialien und trägerstoffe für kontrollierte freisetzung
US5514379A (en) 1992-08-07 1996-05-07 The General Hospital Corporation Hydrogel compositions and methods of use
US5681811A (en) * 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5424286A (en) 1993-05-24 1995-06-13 Eng; John Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same
DE19626762A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Basf Ag Enzymatisch spaltbare Linker für Festphasensynthesen
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
US7157555B1 (en) 1997-08-08 2007-01-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Exendin agonist compounds
NZ504258A (en) 1997-11-14 2002-12-20 Amylin Pharmaceuticals Inc Exendin 3 and 4 agonist compounds for the treatment of diabetes
WO1999025728A1 (en) 1997-11-14 1999-05-27 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
UA72189C2 (uk) 1997-11-17 2005-02-15 Янссен Фармацевтика Н.В. Фармацевтична композиція, що містить водну суспензію субмікронних ефірів 9-гідроксирисперидон жирних кислот
CA2312975C (en) 1997-12-17 2012-08-21 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US6624142B2 (en) 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
JP3786832B2 (ja) 1998-01-07 2006-06-14 デビオ ルシェルシュ ファルマシュティーク ソシエテ アノニム 分解性のヘテロ二官能性ポリ（エチレングリコール）アクリレート及びそれから誘導されるゲル及び複合体
AU759058C (en) 1998-02-13 2005-09-15 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Inotropic and diuretic effects of exendin and GLP-1
CA2346329A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Kamal H. Bouhadir Hydrogels and water soluble polymeric carriers for drug delivery
WO2000033764A1 (en) 1998-12-04 2000-06-15 Pathak Chandrashekhar P Biocompatible crosslinked polymers
EP1181323B1 (en) 1999-02-01 2011-06-29 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Biomaterials formed by nucleophilic addition reaction to conjugated unsaturated groups
DE60026300T2 (de) 1999-05-17 2006-11-16 Conjuchem, Inc., Montreal Schutz endogener, therapeutisch aktiver peptide vor peptidaseaktivität durch konjugation an blutbestandteile
US6506724B1 (en) 1999-06-01 2003-01-14 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Use of exendins and agonists thereof for the treatment of gestational diabetes mellitus
AU1249001A (en) 1999-06-11 2001-01-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrogels derived from chitosan and poly(ethylene glycol) or related polymers
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
MXPA02007281A (es) 2000-01-28 2002-12-09 Infimed Therapeutics Inc Polimeros de proteina de liberacion lenta.
US6884778B2 (en) 2000-04-14 2005-04-26 William Marsh Rice University Biocompatible macromers
US7291673B2 (en) 2000-06-02 2007-11-06 Eidgenossiche Technische Hochschule Zurich Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds
JP4841066B2 (ja) 2000-09-01 2011-12-21 ライスユニバーシティ 酸化窒素生成ヒドロゲル物質
US6537569B2 (en) 2001-02-14 2003-03-25 Microvention, Inc. Radiation cross-linked hydrogels
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
EP1423093A4 (en) 2001-04-23 2005-11-30 Wisconsin Alumni Res Found BIFUNCTIONAL MODIFIED HYDROGEL
CZ20033182A3 (cs) 2001-05-21 2004-09-15 Nektar Therapeutics Inzulínový prostředek a způsob podávání inzulínu
DE60132094T3 (de) 2001-10-26 2012-02-02 Octoplus Polyactive Sciences B.V. Verfahren zur Herstellung von gereinigten Partikeln
US6960298B2 (en) 2001-12-10 2005-11-01 Nanogen, Inc. Mesoporous permeation layers for use on active electronic matrix devices
US7247609B2 (en) 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
US7393953B2 (en) 2002-04-04 2008-07-01 Enzon, Inc. Polymeric acyl derivatives of indoles
DE10221457A1 (de) 2002-05-15 2003-11-27 Behr Gmbh & Co Wärmeübertrager und Verfahren zu seiner Herstellung
CA2487720A1 (en) 2002-06-03 2003-12-11 Alnis Biosciences, Inc. Therapeutic agent-containing polymeric nanoarticles
WO2003104426A2 (en) 2002-06-10 2003-12-18 Merck & Co., Inc. Isolated nucleic acid molecule encoding a novel centromere-associated motor protein, and uses thereof
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
JP2006507322A (ja) 2002-11-14 2006-03-02 シンタルガ・ビーブイ 多重自己脱離放出スペーサーとして構築されたプロドラッグ
EP1620118B1 (en) 2003-04-08 2014-06-18 Yeda Research And Development Co., Ltd. Reversible pegylated drugs
DK2644206T3 (da) 2003-05-23 2019-06-11 Nektar Therapeutics PEG-derivater indeholdende to PEG-kæder
EP1525890A1 (en) 2003-10-02 2005-04-27 Complex Biosystems GmbH Protein-Proteophore complexes
WO2005099768A2 (en) 2004-03-23 2005-10-27 Complex Biosystems Gmbh Polymeric prodrug with a self-immolative linker
EP1586334A1 (en) 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
US8728525B2 (en) 2004-05-12 2014-05-20 Baxter International Inc. Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
US7968085B2 (en) * 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
JPWO2006038462A1 (ja) 2004-10-01 2008-05-15 国立大学法人九州大学 新規ステロイド産生細胞
DE102004051715A1 (de) 2004-10-23 2005-06-30 Clariant Gmbh Flüssigwaschmittel enthaltend Farbfixiermittel
US20060115865A1 (en) 2004-10-25 2006-06-01 Anlong Ouyang Lamotrigine analogs
US7678551B2 (en) 2004-10-25 2010-03-16 Seradyn, Inc. Immunoassays for lamotrigine
US7407117B2 (en) 2004-10-28 2008-08-05 Meadwestvaco Calmar, Inc. Liquid sprayer assembly
JP2006163996A (ja) 2004-12-09 2006-06-22 Evolium Sas 行動履歴に基づくプッシュ型の情報提供システム
EP1838317A4 (en) 2005-01-05 2012-02-29 Univ Minnesota ANALGESIC CONJUGATES
KR100665672B1 (ko) 2005-04-13 2007-01-09 성균관대학교산학협력단 새로운 온도 및 ｐＨ 민감성 블록 공중합체 및 이를 이용한고분자 하이드로겔
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
US8039432B2 (en) 2005-11-09 2011-10-18 Conjuchem, Llc Method of treatment of diabetes and/or obesity with reduced nausea side effect
EP1971290A2 (en) 2006-01-12 2008-09-24 Histogenics Corporation Method for repair and reconstruction of ruptured ligaments or tendons and for treatment of ligament and tendon injuries
EP1840152B1 (en) 2006-03-31 2009-07-08 Sony Deutschland Gmbh A method of forming a crosslinked polymer gel
US20070275030A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 The General Hospital Corporation Dba Massachusetts General Hospital Anti-cross-linking agents and methods for inhibiting cross-linking of injectable hydrogel formulations
WO2008015099A2 (en) 2006-07-31 2008-02-07 Novo Nordisk A/S Pegylated, extended insulins
WO2008034122A2 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Hindered ester-based biodegradable linkers for oligonucleotide delivery
GB0619175D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Univ Nottingham Polymer
EP2099845B1 (en) 2006-11-27 2020-12-23 Actamax Surgical Materials LLC Multi-functional polyalkylene oxides, hydrogels and tissue adhesives
JP2010519183A (ja) 2007-02-06 2010-06-03 インセプト エルエルシー 生理溶液の溶出のためのタンパク質の沈殿を用いる重合
US20080220047A1 (en) 2007-03-05 2008-09-11 Sawhney Amarpreet S Low-swelling biocompatible hydrogels
WO2008116913A2 (en) 2007-03-28 2008-10-02 Novo Nordisk A/S Peptide compounds with transient biodegradable pegylation
ES2733276T3 (es) 2007-04-13 2019-11-28 Kuros Biosurgery Ag Sellante polimérico para tejidos
EP2514412A1 (en) * 2007-04-30 2012-10-24 Novo Nordisk A/S Highly Concentrated Insulin Solutions and Compositions
US9353170B2 (en) 2007-06-08 2016-05-31 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Long-acting transient polymer conjugates of exendin
DE102008003566A1 (de) 2008-01-09 2009-07-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
DE102008003568A1 (de) 2008-01-09 2009-07-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil
MX2010008024A (es) 2008-02-01 2010-12-21 Ascendis Pharma As Profarmaco que comprende un enlazador que se puede separar por si mismo.
JP5739668B2 (ja) 2008-02-13 2015-06-24 ハイパーブランチ メディカル テクノロジー， インコーポレイテッド 調節可能な分解速度を有する架橋ポリアルキレンイミンヒドロゲル
EP3000462A1 (en) 2008-04-28 2016-03-30 Zogenix, Inc. Novel formulations for treatment of migraine
EP3050576B1 (en) 2008-04-29 2021-03-31 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Pegylated recombinant human growth hormone compounds
WO2010100220A1 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Ascendis Pharma As Interferon alpha carrier prodrugs
US11559482B2 (en) 2009-07-31 2023-01-24 Ascendis Pharma A/S Biodegradable polyethylene glycol based water-insoluble hydrogels
NZ597964A (en) 2009-07-31 2014-04-30 Sanofi Aventis Deutschland Long acting insulin composition
PE20120918A1 (es) 2009-07-31 2012-08-14 Sanofi Aventis Deutschland Profarmacos que comprenden un conjugado de insulina-conector
KR101756493B1 (ko) 2009-10-29 2017-07-10 아센디스 파마 에이에스 생분해성 하이드로겔의 살균
EP2438930A1 (en) 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009010428A1 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, pegylated insulin analogues

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105960249A (zh) * 2014-01-09 2016-09-21 赛诺菲 胰岛素类似物和/或胰岛素衍生物的稳定化药物制剂
CN105960249B (zh) * 2014-01-09 2021-03-16 赛诺菲 胰岛素类似物和/或胰岛素衍生物的稳定化药物制剂
CN103830189A (zh) * 2014-03-04 2014-06-04 山东新时代药业有限公司 一种重组甘精胰岛素制剂及其制备方法
CN105796508A (zh) * 2014-12-30 2016-07-27 江苏万邦生化医药股份有限公司 甘精胰岛素缓释微球、甘精胰岛素微球注射剂及其制备方法
CN109789188A (zh) * 2016-09-29 2019-05-21 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 具有低峰-谷比的pth化合物
CN109789188B (zh) * 2016-09-29 2023-07-14 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 具有低峰-谷比的pth化合物

Also Published As

Publication number Publication date
ES2636741T3 (es) 2017-10-09
DK2459171T3 (en) 2017-09-25
US20120183616A1 (en) 2012-07-19
BR112012001988A2 (pt) 2017-05-09
EP2459171A1 (en) 2012-06-06
AU2010277560A1 (en) 2012-02-23
WO2011012719A1 (en) 2011-02-03
NI201200013A (es) 2012-05-29
RU2012107487A (ru) 2013-09-10
CA2769540A1 (en) 2011-02-03
JP2013500952A (ja) 2013-01-10
MX2012001141A (es) 2012-03-29
TN2012000010A1 (en) 2013-09-19
IL217613A (en) 2016-08-31
PE20121170A1 (es) 2012-09-10
AU2010277560B2 (en) 2014-12-11
UA108475C2 (uk) 2015-05-12
CR20120019A (es) 2012-03-02
ZA201200224B (en) 2012-09-26
RU2556340C2 (ru) 2015-07-10
CA2769540C (en) 2017-08-15
CO6491085A2 (es) 2012-07-31
MA33466B1 (fr) 2012-07-03
JP5732053B2 (ja) 2015-06-10
KR20120089261A (ko) 2012-08-09
SG178195A1 (en) 2012-03-29
ECSP12011631A (es) 2012-02-29
PL2459171T3 (pl) 2017-11-30
CN102625695B (zh) 2015-05-27
US9265723B2 (en) 2016-02-23
NZ597964A (en) 2014-04-30
CL2012000469A1 (es) 2012-10-19
PT2459171T (pt) 2017-08-16
GT201200020A (es) 2014-09-10
EP2459171B1 (en) 2017-06-21
KR101759499B1 (ko) 2017-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102625695B (zh) 长效胰岛素组合物
CN102548583B (zh) 包含胰岛素连接物缀合物的前药
CN103237561B (zh) 包含毒蜥外泌肽连接物缀合物的前药
US11141489B2 (en) Conjugates comprising an GLP-1/Glucagon dual agonist, a linker and hyaluronic acid
EP3302567B1 (en) Prodrugs comprising an glp-1/glucagon dual agonist linker hyaluronic acid conjugate
RU2574667C2 (ru) Пролекарства, содержащие конъюгат инсулина и линкера
TW202015735A (zh) 包含ｇｌｐ－１／升糖素／ｇｉｐ三重受體促效劑、連接子及透明質酸之接合物
TW201300131A (zh) 包含艾塞那肽（ｅｘｅｎｄｉｎ）連接子接合物之前藥

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150527

Termination date: 20210730