CN102816241A - 清蛋白融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涵盖清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖编码本发明清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有这些核酸的载体、经过这些核酸载体转化的宿主细胞、及使用这些核酸、载体和/或宿主细胞和生成本发明清蛋白融合蛋白的方法。另外，本发明还涵盖包含清蛋白融合蛋白的药物组合物以及使用本发明的清蛋白融合蛋白来治疗、预防或改善疾病、紊乱或状况的方法。

Description

清蛋白融合蛋白
本申请是申请日为2005年02月09日，申请号为200580012252.5(国际申请号为PCT/US2005/004041)，名称为“清蛋白融合蛋白”的发明专利申请的分案申请。 
光盘中的序列表的介绍 
本申请涉及下文列出的“序列表”，它作为电子文件在标有“拷贝1”、“拷贝2”和“拷贝3”的三张相同的光盘（CD-R）上提供。这些光盘每个都含有文件“PF612PCT SL.txt”（929,048个字节，建于2005年2月7日），将其完整引入作为参考。 
发明背景 
本发明主要涉及与清蛋白或清蛋白的片段或变体融合的治疗性蛋白质（包括但不限于至少一种多肽、抗体、肽或其片段和变体）。本发明涵盖编码治疗性清蛋白融合蛋白的多核苷酸、治疗性清蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、制剂和试剂盒。本发明还涵盖经过编码治疗性清蛋白融合蛋白的多核苷酸转化的宿主细胞，以及使用这些多核苷酸和/或宿主细胞来生成本发明清蛋白融合蛋白的方法。 
人血清清蛋白（HSA或HA），其成熟形式具有585个氨基酸的一种蛋白质（如表1(SEQ ID NO:1)所示），负责血清渗透压的重大比例，而且还作为内源和外源配体的载体而起作用。目前，临床使用的HA是从人血中提取而生产的。在微生物中生产重组HA（rHA）已在EP 330 451和EP 361 991中公开。 
天然状态或重组生成的治疗性蛋白质，诸如干扰素和生长激素，通常是呈现短暂保存期的不稳定分子，特别是在水溶液中配制时。在配制用于施用时，这些分子的不稳定性提示很多分子必须冻干并在贮藏时一直冷藏，因而使得这些分子难以运输和/或贮藏。当药学制剂必须在医院环境以外贮藏和分配时，贮藏问题就显得特别尖锐。 
对于不稳定蛋白质分子的贮藏问题的实用解决方案少有提出。因此，需要稳定的、持久的、容易分配的蛋白质治疗性分子制剂，优选需要最小限度贮藏后操作的简单制剂。 
体内施用后，天然状态或重组生成的治疗性蛋白质，诸如干扰素和生长激素，由于从血流中迅速清除从而呈现短暂的血浆稳定性。因此，这些蛋白质提供的治疗效果也是短期的。因此，为了维持它们的期望体内治疗效果，这些蛋白质从血液中迅速清除提示必须以更高频率或更高剂量施用治疗性分子。然而，增加施用治疗性蛋白质的服药方案常常导致患者的注射部位的反应、副作用、和毒性增加。类似的，以更高剂量施用治疗性蛋白质也常常导致患者的毒性和副作用增加。 
已提议的提高治疗性分子的血浆稳定性的少数实用解决方案，包括化学缀合，为患者带来有限的受益。通常，在多数情况中，这些化学修饰的治疗性分子仍以频繁的服药方案施用，在患者中保持严重的注射部位反应、副作用、和毒性。因此，需要稳定形式的治疗性分子，它能在体内保持比单独的天然状态或重组生成的治疗性蛋白质更高的血浆稳定性并可以较低频率施用，从而降低对患者的潜在副作用。 
发明概述 
本发明涵盖包含与清蛋白或清蛋白的片段（部分）或变体融合的治疗性蛋白质（如多肽、抗体、或肽或其片段或变体）的清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖包含编码与清蛋白或清蛋白的片段（部分）或变体融合的治疗性蛋白质（如多肽、抗体、或肽或其片段或变体）的核酸分子或由其组成的多核苷酸。本发明还涵盖包含编码如下蛋白质的核苷酸分子或由其组成的多核苷酸，该蛋白质包含与清蛋白或清蛋白的片段（部分）或变体融合的治疗性蛋白质（如多肽、抗体、或肽或其片段或变体），该清蛋白或清蛋白的片段（部分）或变体足以延长治疗性蛋白质的保存期，与其未融合状态相比提高治疗性蛋白质的血浆稳定性，和/或在体外和/或在体内稳定溶液中（或药物组合物中）的治疗性蛋白质和/或其活性。本发明还涵盖由本发明多核苷酸编码的清蛋白融合蛋白，以及经过本发明多核苷酸转化的宿主细胞，及使用本发明的这些多核苷酸和/或宿主细胞和生成本发明的清蛋白融合蛋白的方法。 
在本发明的一个优选方面，清蛋白融合蛋白包括但不限于表2中所描述 的那些蛋白质和编码此类蛋白质的多核苷酸。 
本发明还涵盖包含本发明清蛋白融合蛋白和制药学可接受稀释剂或载体的药学制剂。这些制剂可装在试剂盒或容器中。该试剂盒或容器可与关于该治疗性蛋白质的延长保存期的说明书一起包装。这些制剂可用于在患者中治疗、预防、改善或诊断疾病或疾病症状的方法，包括对患者施用药学制剂的步骤，其中患者优选哺乳动物，最优选人类。 
在其它实施方案中，本发明涵盖预防、治疗或改善疾病或紊乱的方法。在优选的实施方案中，本发明涵盖治疗表1“优选适应症：Y”列中所列出的疾病或紊乱的方法，包括以有效治疗、预防或改善疾病或紊乱的数量对需要这种治疗、预防或改善的患者施用本发明的清蛋白融合蛋白，该清蛋白融合蛋白包含与表1“治疗性蛋白质：X”列（与表1“优选适应症：Y”列中所列出的待治疗疾病或紊乱位于同一行）中所公开的治疗性蛋白质（或其片段或变体）对应的治疗性蛋白质或其部分。 
在一个实施方案中，表1或2中所描述的清蛋白融合蛋白具有延长的保存期。 
在另一个实施方案中，表1或2中所描述的清蛋白融合蛋白比表1中所描述的相应未融合治疗性分子更加稳定。 
本发明还包括修饰后含有本发明核酸分子（包括但不限于表1和2中所描述的多核苷酸）的转基因生物体，优选修饰后表达本发明清蛋白融合蛋白的转基因生物体。 
具体地，本发明涉及如下方面： 
1.包含选自下组的成员的清蛋白融合蛋白： 
(a)治疗性蛋白质：X和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的清蛋白； 
(b)治疗性蛋白质：X和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性； 
(c)治疗性蛋白质：X和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性，且其中所述清蛋白活性是与未融合状态的治疗性蛋白质：X的保存期相比延长治疗性蛋白质：X的保存期的能力； 
(d)治疗性蛋白质：X和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性，且其中所述片段或变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-387的氨基酸序列； 
(e)治疗性蛋白质：X的片段或变体和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的清蛋白，其中所述片段或变体具有治疗性蛋白质：X的生物学活性； 
(f)(a)-(e)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质：X或其片段或变体融合在清蛋白的N-末端，或清蛋白片段或变体的N-末端； 
(g)(a)-(e)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质：X或其片段或变体融合在清蛋白的C-末端，或清蛋白片段或变体的C-末端； 
(h)(a)-(e)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质：X或其片段或变体融合在清蛋白的N-末端和C-末端，或清蛋白片段或变体的N-末端和C-末端； 
(i)(a)-(e)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，它包含第一治疗性蛋白质：X或其片段或变体和第二治疗性蛋白质：X或其片段或变体，其中所述第一治疗性蛋白质：X或其片段或变体不同于所述第二治疗性蛋白质：X或其片段或变体； 
(j)(a)-(i)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质：X或其片段或变体通过接头与所述清蛋白或清蛋白片段或变体分开；和 
(k)(a)-(j)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白具有如下通式：R1-L-R2；R2-L-R1；或R1-L-R2-L-R1，且其中R1是治疗性蛋白质：X或其片段或变体，L是肽接头，而R2是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的清蛋白或清蛋白的片段或变体。 
2.项1的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白的保存期或血浆稳定性大于未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性。 
3.项1的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性。 
4.项1的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性。 
5.包含插入到清蛋白或其片段或变体中的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的清蛋白融合蛋白，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段或变体。 
6.包含插入到清蛋白或其片段或变体中的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的清蛋白融合蛋白，包含选自下组的一个或多个氨基酸序列： 
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸54-61； 
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸76-89； 
(c)SEQ ID NO：1的氨基酸92-100； 
(d)SEQ ID NO：1的氨基酸170-176； 
(e)SEQ ID NO：1的氨基酸247-252； 
(f)SEQ ID NO：1的氨基酸266-277； 
(g)SEQ ID NO：1的氨基酸280-288； 
(h)SEQ ID NO：1的氨基酸362-368； 
(i)SEQ ID NO：1的氨基酸439-447； 
(j)SEQ ID NO：1的氨基酸462-475； 
(k)SEQ ID NO：1的氨基酸478-486；和 
(l)SEQ ID NO：1的氨基酸560-566。 
7.项5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比足以延长治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的部分清蛋白。 
8.项6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比足以延长治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的部分清蛋白。 
9.项5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性的部分清蛋白。 
10.项6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性的部分清蛋白。 
11.项5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性的部分清蛋白。 
12.项6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性的部分清蛋白。 
13.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是非糖基化的。 
14.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是在酵母中表达的。 
15.项14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化缺陷的。 
16.项14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化和蛋白酶缺陷的。 
17.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是由哺乳动物细胞表达的。 
18.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白是由培养中的哺乳动物细胞表达的。 
19.项1-12任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白还包含分泌前导序列。 
20.包含项1-12任一项的清蛋白融合蛋白和制药学可接受载体的组合物。 
21.包含项20的组合物的试剂盒。 
22.治疗患者的疾病或紊乱的方法，包括施用项1-12任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。 
23.项22的方法，其中所述疾病或紊乱包含适应症：Y。 
24.治疗患有受治疗性蛋白质：X或其片段或变体调节的疾病或紊乱的患者的方法，包括施用有效量的项1-12任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。 
25.项24的方法，其中所述疾病或紊乱是适应症：Y。 
26.延长治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的方法，包括将治疗性蛋白质：X或其片段或变体与清蛋白或其片段或变体融合的步骤，与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比，所述清蛋白或其片段或变体足以延长治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性。 
27.核酸分子，包含编码项1-12任一项的清蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。 
28.包含项27的核酸分子的载体。 
29.包含项28的核酸分子的宿主细胞。 
附图简述 
图1A-D显示了人清蛋白的成熟形式的氨基酸序列（SEQ ID NO：1）和 编码它的多核苷酸（SEQ ID NO：2）。SEQ ID NO：2的核苷酸1-1755编码人清蛋白的成熟形式（SEQ ID NO：1）。 
图2显示了pPPC0005克隆载体ATCC保藏物PTA-3278的限制性图谱。 
图3显示了pSAC35酿酒酵母表达载体的限制性图谱（Sleep等人，BioTechnology 8：42，1990）。 
图4显示了由CID 2011和2053中包含的DNA所编码的IFNb清蛋白融合蛋白的各种稀释度在ISRE-SEAP/293F报道细胞中对SEAP活性的影响（见实施例76）。将蛋白质在DMEM/10%FBS中连续稀释，从5e-7到1e-14g/ml，并用于处理ISRE-SEAP/293F报道细胞。24小时后由报道细胞取出上清液并测定SEAP活性。从三个稳定克隆：293F/#2011、CHO/#2011和NSO/#2053纯化IFNb清蛋白融合蛋白。哺乳动物衍生的IFNb，Avonex来自Biogen且据报道有2.0e5IU/μg的比活。 
图5比较了由CID 3165编码的IFN清蛋白融合蛋白（CID 3165蛋白质）和重组蛋白IFNa（rIFNa）对Hs294T黑素瘤细胞的抗增殖活性。将细胞在含不同浓度CID 3165蛋白质或rIFNa的培养基中进行培养，并在培养3天后通过BrdU掺入来测量增殖情况。CID 3165蛋白质在浓度高于10ng/ml时对细胞增殖引起了可测量的抑制作用，在约200ng/ml时达到了50%抑制。(■)=CID 3165蛋白质，(◆)=rIFNa。 
图6显示了IFNa清蛋白融合蛋白的各种稀释度在ISRE-SEAP/293F报道细胞中对SEAP活性的影响。测试了在清蛋白的上游融合IFNa的一种制备物(◆)以及在清蛋白的下游融合IFNa的两种不同制备物(●)和(◆)。 
图7显示了由构建物2249中包含的DNA所编码的IFNa清蛋白融合蛋白（CID 2249蛋白质）的时间和剂量在经过处理的猴子中对OAS（p41）mRNA水平的影响（见实施例78）。每个时间点：第一条为赋形剂对照，第二条为第一天静脉内注射30μg/kg CID 2249蛋白质，第三条为第一天皮下注射30μg/kg CID 2249蛋白质，第四条为第一天皮下注射300μg/kg CID 2249蛋白质，第五条为第一、三、五天皮下注射40μg/kg重组IFNa。 
图8显示了由构建物CID 3691和3618中包含的DNA所编码的BNP清蛋白融合蛋白（CID 3691和3618蛋白质）在NPR-A/293F报道细胞中对激活cGMP形成的剂量-应答关系（见实施例80和81）。测试了重组BNP(■)以及在清蛋白的上游融合BNP的两种不同制备物(□)和(●)。 
图9显示了BNP清蛋白融合蛋白在自发性高血压大鼠中对平均动脉压的影响（见实施例80）。赋形剂(□)、重组BNP蛋白(●)、或BNP清蛋白融合蛋白(○)通过尾部静脉注射进行投递。收缩压和舒张压通过套尾法(cuff-tail)进行记录。 
图10显示了11-12周龄的雄性C57/BL6小鼠在静脉内注射重组BNP蛋白质(●)或BNP清蛋白融合蛋白(○)后的血浆cGMP水平（见实施例80）。在静脉内注射后的几个时间点收集尾部血液制备血浆来测定cGMP水平。 
图11显示了禁食的约8周龄糖尿病db/db小鼠中在单次施用串联GLP-1(7-36A8G)2x-HSA融合物（CID 3610）(◇)、单体GLP-1(7-36A8G)-HSA融合物(Δ)、或单独的HSA(●)后24小时的血糖水平。血糖水平通过口服葡萄糖耐受测试法进行测量。在禁食的约8周龄糖尿病db/db小鼠中，在单次施用后24小时，串联GLP-1(7-36A8G)2x-HAS融合物（CID 3610）(◇)比单体GLP-1(7-36A8G)-HSA融合物(Δ)具有意想不到的更有效的使葡萄糖正常化的活性(glucose-normalizing activity)。 
发明详述 
定义
提供下面的定义是为了便于理解贯穿本说明书所使用的某些术语。 
在用于本文时，“多核苷酸”指具有编码如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，该融合蛋白包含以相同读码框与至少一个治疗性蛋白质X（或其片段或变体）连接的至少一个清蛋白（或其片段或变体）分子或由其组成；具有编码如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，该融合蛋白包含SEQ IDNO：Y（如表2第6列所述）的氨基酸序列或其片段或变体或由其组成；具有包含SEQ ID NO：X所示序列或由其组成的核苷酸序列的核酸分子；具有编码如下融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，该融合蛋白包含SEQ ID NO：Z的氨基酸序列或由其组成；具有编码如表2或实施例中所述生成的本发明清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；具有编码本发明治疗性清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子；具有表2中描述的清蛋白融合构建物所含有的核苷酸序列的核酸分子；或者具有于ATCC保藏的清蛋白融合构建物（如表3所述）所含有的核苷酸序列的核酸分子。 
在用于本文时，“清蛋白融合构建物”指包含以相同读码框与编码至少 一个分子的治疗性蛋白质（或其片段或变体）的至少一段多核苷酸连接的编码至少一个分子的清蛋白（或其片段或变体）的多核苷酸或由其组成的核酸分子；包含以相同读码框与编码至少一个分子的如表2或实施例中所述产生的治疗性蛋白质（或其片段或变体）的至少一段多核苷酸连接的编码至少一个分子的清蛋白（或其片段或变体）的多核苷酸或由其组成的核酸分子；或者包含以相同读码框与编码至少一个分子的治疗性蛋白质（或其片段或变体）的至少一段多核苷酸连接的编码至少一个分子的清蛋白（或其片段或变体）的多核苷酸或由其组成的核苷酸分子，它还包含例如一种或多种下列元件：(1)功能性自主复制载体（包括但并不限于穿梭载体、表达载体、整合载体、和/或复制系统），(2)转录起始区（例如启动子区，诸如例如可调节或可诱导的启动子、组成型启动子），(3)转录终止区，(4)前导序列，和(5)选择标记。编码治疗性蛋白质和清蛋白的多核苷酸，一旦成为清蛋白融合构建物的一部分，每个可称为该清蛋白融合构建物的“部分”、“区域”或“模块”。 
本发明主要涉及编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸；清蛋白融合蛋白；以及使用清蛋白融合蛋白或编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防或改善疾病或紊乱的方法。在用于本文时，“清蛋白融合蛋白”指通过将至少一个清蛋白（或其片段或变体）分子与至少一个治疗性蛋白质（或其片段或变体）分子融合而形成的蛋白质。本发明的清蛋白融合蛋白包含治疗性蛋白质的至少一个片段或变体以及人血清清蛋白的至少一个片段或变体，它们是通过基因融合相连的（即清蛋白融合蛋白是通过翻译如下核酸产生的，其中编码完整或部分治疗性蛋白质的多核苷酸以相同读码框与编码完整或部分清蛋白的多核苷酸相连接）。治疗性蛋白质和清蛋白蛋白质，一旦成为清蛋白融合蛋白的一部分，每个可称为该清蛋白融合蛋白的“部分”、“区域”或“模块”（例如“治疗性蛋白质部分”或“清蛋白蛋白质部分”）。在高度优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白包含治疗性蛋白质X或其片段或变体（包括但不限于治疗性蛋白质X的成熟形式）的至少一个分子以及清蛋白或其片段或变体（包括但不限于清蛋白的成熟形式）的至少一个分子。 
在另一个优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白由宿主细胞加工并分泌到周围的培养基中。在用于表达的宿主的分泌途径中发生的对新生清蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于信号肽切割、二硫键形成、正确折叠、碳水化合物的添加和加工（诸如例如N-和O-连接的糖基化）、特异性蛋白水 解切割、和组装成多聚体蛋白质。本发明的清蛋白融合蛋白优选是经过加工形式的。在最优选的实施方案中，“清蛋白融合蛋白的经过加工形式”指经过N-末端信号肽切割的清蛋白融合蛋白产物，本文还称为“成熟的清蛋白融合蛋白”。 
在几种情况中，具有代表性的含有本发明清蛋白融合构建物的克隆保藏于美国典型培养物保藏中心（本文称为“ATCC 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800101
”）。此外，通过本领域已知的和本文其它地方描述的技术有可能从保藏物重新得到指定的清蛋白融合构建物。ATCC 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800102
位于美国维吉尼亚州20110-2209马纳萨斯镇大学路10801号（10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA）。ATCC 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800103
保藏物是根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际公认的微生物保藏条款生成的。 
在一个实施方案中，本发明提供了编码包含治疗性蛋白质和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，本发明提供了由表2中描述的多核苷酸所编码的包含治疗性蛋白质和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了编码其序列显示于表2中SEQ IDNO：Y的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗性活性片段和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗性活性变体和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白质成分是血清清蛋白的成熟部分。本发明还涵盖编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。 
在另外的实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗性活性片段或由其组成的清蛋白融合蛋白。在另外的实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗性活性变体或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是治疗性蛋白质的成熟部分。在另一个优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是治疗性蛋白质的胞外可溶性结构域。在候选实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分 是治疗性蛋白质的活性形式。本发明还涵盖编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。 
在另外的实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗性活性片段或变体和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗性活性片段或变体或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分或由其组成的清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。 
治疗性蛋白质
如上所述，本发明的多核苷酸编码包含治疗性蛋白质的至少一个片段或变体和人血清清蛋白的至少一个片段或变体或由其组成的蛋白质，所述片段或变体是优选通过基因融合而彼此相连的。 
另一个实施方案包括编码包含治疗性蛋白质的至少一个片段或变体和人血清清蛋白的至少一个片段或变体或由其组成的蛋白质的多核苷酸，所述片段或变体是通过化学缀合而彼此相连的。 
在用于本文时，“治疗性蛋白质”指具有一种或多种治疗性和/或生物学活性的蛋白质、多肽、抗体、肽或其片段或变体。本发明所涵盖的治疗性蛋白质包括但不限于蛋白质、多肽、肽、抗体、和生物制品。（术语肽、蛋白质、和多肽在本文中可互换使用）。明确设想了术语“治疗性蛋白质”涵盖抗体及其片段和变体。因此，本发明的蛋白质可含有治疗性蛋白质的至少一个片段或变体和/或抗体的至少一个片段或变体。此外，术语“治疗性蛋白质”可指治疗性蛋白质的内源性或天然存在的关联物。 
呈现“治疗性活性”的多肽或具有“治疗性活性”的蛋白质是指拥有与治疗性蛋白质诸如本文描述的或本领域其它途径已知的一种或多种治疗性蛋白质有关的一种或多种已知生物学和/或治疗性活性的多肽。作为非限制性实例，“治疗性蛋白质”指可用于治疗、预防或改善疾病、状况或紊乱的蛋白质。作为非限制性实例，“治疗性蛋白质”可以是与特定细胞类型（正常的（如淋巴细胞）或异常的（如癌细胞））特异结合并因此可用于将化合物（药物或胞毒剂）特异靶向该细胞类型的蛋白质。 
例如，可由本发明的清蛋白融合蛋白包含的“治疗性蛋白质”部分的不完全列表包括但并不限于GLP-1、GLP-2、PACAP-27、PACAP-28、VIP、CD4M33、分泌素、胰高血糖素样肽、泌酸调节素、PHM、IFNα、IFNβ、 ANP、BNP、NGF、BDNF、GDNF、和促生长素抑制素。 
干扰素杂化物(hybrid)也可融合于清蛋白的氨基或羧基末端以形成干扰素杂化物清蛋白融合蛋白。干扰素杂化物清蛋白融合蛋白可具有得到增强或者抑制的干扰素活性，诸如抗病毒应答、细胞生长的调控、和免疫应答的调节（Lebleu等人，PNAS USA 73：3107-3111，1976；Gresser等人，Nature 251：543-545，1974；及Johnson，Texas Reports Biol Med 35：357-369，1977）。每种干扰素杂化物清蛋白融合蛋白可用于治疗、预防、或改善病毒感染（如肝炎（如HCV）；或HIV）、多发性硬化症、或癌症。 
在一个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分包含干扰素α-干扰素α杂化物（在本文中称为α-α杂化物）。例如，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的α-α杂化物部分包含与干扰素αD融合的干扰素αA或由其组成。在另一个实施方案中，A/D杂化物在共有的BglII限制性位点处与干扰素αD融合，其中A/D杂化物的N-末端部分与干扰素αA的氨基酸1-62对应而C-末端部分与干扰素αD的氨基酸64-166对应。例如，此A/D杂化物将包含氨基酸序列： 
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX2DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE（SEQ ID NO：99）， 
其中X1是R或K而X2是A或V（例如见构建物ID＃2875）。在另一个实施方案中，A/D杂化物在共有的PvuIII限制性位点处融合，其中A/D杂化物的N-末端部分与干扰素αA的氨基酸1-91对应而C-末端部分与干扰素αD氨基酸93-166对应。例如，此A/D杂化物将包含氨基酸序列： 
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDS SAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX2DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE（SEQ ID NO：100）， 
其中X1是R或K而第二个X2是A或V（例如见构建物ID＃2872）。这些杂化物在美国专利号4,414,510中有进一步的描述，将其完整引入本文作为参考。 
在另一个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的α-α杂化物部分包含与干扰素αF融合的干扰素αA或由其组成。在另一个实施方案中，A/F 杂化物在共有的PvuIII限制性位点处融合，其中A/F杂化物的N-末端部分与干扰素αA的氨基酸1-91对应而C-末端部分与干扰素αF的氨基酸93-166对应。例如，此A/F杂化物将包含氨基酸序列： 
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRXISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDMEACVIQEVGVEETPLMNVD SILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSKIFQERLRRKE（SEQ ID NO：101）， 
其中X或是R或是K（例如见构建物ID＃2874）。这些杂化物在美国专利号4,414,510中有进一步的描述，将其完整引入本文作为参考。在另一个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的α-α杂化物部分包含与干扰素αB融合的干扰素αA或由其组成。在另一个实施方案中，A/B杂化物在共有的PvuIII限制性位点处融合，其中A/B杂化物的N-末端部分与干扰素αA的氨基酸1-91对应而C-末端部分与干扰素αB的氨基酸93-166对应。例如，此A/B杂化物将包含氨基酸序列： 
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEX2X3X4X5QEVGVIESPLMYEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSSCAWEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE（SEQ ID NO：102）， 
其中X1是R或K而X2到X5是SCVM或VLCD（例如见构建物ID＃2873）。这些杂化物在美国专利号4,414,510中有进一步的描述，将其完整引入本文作为参考。 
在另一个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分包含干扰素β-干扰素α杂化物（在本文中称为β-α杂化物）。例如，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的β-α杂化物部分包含与干扰素αD（在本文中称为干扰素α-1）融合的干扰素β-1或由其组成。在另一个实施方案中，β-1/αD杂化物是这样融合的，其中N-末端部分与干扰素β-1的氨基酸1-73对应而C-末端部分与干扰素αD的氨基酸74-167对应。例如，此β-1/αD杂化物将包含氨基酸序列： 
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNXDSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEI MRSLSLSTNLQERLRRKE（SEQ ID NO：103）， 
其中X是A或V。这些杂化物在美国专利号4,758,428中有进一步的描述，将其完整引入本文作为参考。 
在另一个实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分包含干扰素α-干扰素β杂化物（在本文中称为α-β杂化物）。例如，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的α-β杂化物部分包含与干扰素β-1融合的干扰素αD（也称为干扰素α-1）或由其组成。在另一个实施方案中，αD/β-1杂化物是这样融合的，其中N-末端部分与干扰素αD的氨基酸1-73对应而C-末端部分与干扰素β-1的氨基酸74-166对应。例如，此αD/β-1杂化物将包含氨基酸序列： 
MCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMS SLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN（SEQ ID NO：104）。 
这些杂化物在美国专利号4,758,428中有进一步的描述，将其完整引入本文作为参考。 
在另外的实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分可包含α-α干扰素杂化物、α-β干扰素杂化物、和β-α干扰素杂化物的其它组合物。在另外的实施方案中，干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的干扰素杂化物部分可进行修饰以包括对干扰素杂化物氨基酸序列的突变、替代、删除、或添加。这些对干扰素杂化物清蛋白融合蛋白的修饰可用于例如提高产量水平、提高稳定性、提高或降低活性、或赋予新的生物学特性。 
本发明涵盖上文所述干扰素杂化物清蛋白融合蛋白，以及含有编码这些多肽的多核苷酸的宿主细胞和包载体。在一个实施方案中，由上述多核苷酸编码的干扰素杂化物清蛋白融合蛋白具有延长的保存期。在另一个实施方案中，由上述多核苷酸编码的干扰素杂化物清蛋白融合蛋白与相应的未融合干扰素杂化物分子相比在体外和/或在体内在溶液中（或在药物组合物中）具有更长的血清半衰期和/或更稳定的活性。 
在另一个非限制性实例中，“治疗性蛋白质”指具有生物学活性特别是可用于治疗、预防或改善疾病的生物学活性的蛋白质。治疗性蛋白质可具有的生物学活性的不完全列表包括抑制细胞的HIV-1感染、刺激肠上皮细胞增 殖、降低肠上皮细胞通透性、刺激胰岛素分泌、诱导支气管扩张和血管舒张、抑制醛固酮和肾素分泌、调节血压、促进神经生长、增强免疫应答、增强炎症、抑制食欲、或者下文“生物学活性”部分所描述的和/或表1（第二列）对指定治疗性蛋白质所公开的任何一种或多种生物学活性。 
在一个实施方案中，将IFN-β-HSA融合物用于抑制埃博拉病毒（Ebola virus）和SARS病毒（多伦多-2毒株，Toronto-2 strain）。例如，在Vero细胞中评估了融合于成熟HSA上游的IFN-β（CID 2053蛋白）针对埃博拉病毒和SARS病毒的体外抗病毒活性。以细胞病理效应（CPE）的抑制作用和细胞存活力的中性红测定法为基础，将这些细胞用于评估CID 2053蛋白质的保护作用。体外信号转导通过基因表达分析进行评估。另外，CID 2053蛋白质的药动学和药效学在恒河猴中进行评估。结果显示以有利的安全指数实现了有力的体外抗病毒活性。CID 2053蛋白质针对埃博拉病毒的IC50为0.4ng/ml而针对SARS病毒的IC50为2ng/ml。阵列分析(array analysis)显示CID 2053蛋白质和IFN-β诱导一组相似基因的表达并引发IFN激发的应答元件（ISRE）信号转导途径。在以静脉内50μg/kg或皮下300μg/kg的剂量施用CID 2053蛋白质的恒河猴中，末端半衰期(terminal half-life)是36-40小时。施用CID 2053蛋白质引起血清新喋呤(neopterin)水平及OAS1 mRNA的表达的持续升高。 
在另一个实施方案中，将IFN-α-HSA融合物用于抑制归类于A类-纤丝病毒(Filo)（埃博拉）、沙粒病毒(Arena)（Pichende）、B类-披膜病毒(Toga)（VEE）或C类-布尼亚病毒(Bunya)（庞塔托鲁(Punto toro)）、黄病毒(Flavi)（黄热病、西尼罗(West Nile)）的病毒因子。例如，采用CPE抑制、中性红染色和病毒产率测定法来评估融合于HSA下游的IFN-α（CID 3165蛋白质）的抗病毒活性。CID 3165蛋白质的药动学和药效学在恒河猴及人类受试者中进行评估。结果显示以有利的安全指数实现了针对所有RNA病毒的抗病毒活性。在CPE测定法中IC50值的范围为<0.1ng/ml（庞塔托鲁A）到19ng/ml（VEE）。在恒河猴中，CID 3165蛋白质的半衰期为90小时并在长达服药后14天仍能检测到。在人类受试者中，CID 3165蛋白质是安全的并且耐受性良好。单次注射服药后的Cmax与剂量成比例。在500μg组中平均Cmax为22ng/ml，而平均t1/2为150小时。每2-4周或更长时间服药一次得到了药动学的支持。在单次注射组（120-500μg）中在多数受试者中观察到针对丙型肝炎的抗病毒反应。 
在另一个实施方案中，将IFN-α-HSA融合物用于治疗慢性丙型肝炎感染（HCV）的患者。干扰素α，也称为干扰素alfa或白细胞干扰素，是治疗感染HCV患者的护理标准。术语“干扰素α”指具有抗病毒活性的高度同源的相关多肽的家族。IFN-α-HAS融合物的干扰素α部分包含本领域已知的任何干扰素α或其片段或由其组成。本发明所涵盖的干扰素α的非限制性实例包括但不限于表1治疗性蛋白质一列中所公开的干扰素α蛋白质。在具体的实施方案中，干扰素α部分包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-2c、共有干扰素、干扰素alfacon-1、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素α的任何商品化形式诸如例如INTRON 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800161
A（Schering Corp.，Kenilworth，N.J.）、ROFERON 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800162
（Hoffman-La Roche，Nutley，N.J.）、Berofor α干扰素（Boehringer Ingelheim Pharmaceutical,Inc.，Ridgefied，Conn.）、OMNIFERONTM（Viragen,Inc.，Plantation，FL）、MULTIFERONTM（Viragen,Inc.，Plantation，FL）、WELLFERON （GlaxoSmithKline，London，Great Britian）、INFERGEN （Amgen,Inc.，Thousands Oaks，CA）、SUMIFERON 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800165
（Sumitomo，Japan）、BELEROFON 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800166
（Nautilus Biotech，France）或任何纯化的干扰素α产品或其片段或由其组成。在另外的实施方案中，IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分可通过附着化学模块而得以修饰。例如，干扰素α部分可通过聚乙二醇化得以修饰。因此，在另外的实施方案中，IFN-α-HSA融合蛋白的干扰素α部分包含干扰素α-2a、2b、或共有干扰素的聚乙二醇化形式或由其组成，并且包含但不限于商品化聚乙二醇化干扰素α，诸如例如PEG-INTRON 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800167
（Schering Corp.，Kenilworth，N.J.）、PEGASYS 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285800168
（Hoffman-La Roche，Nutley，N.J.）、PEG-OMNIFERONTM（Viragen,Inc.，Plantation，FL）或其片段。然而，在用于本文时，“IFN-α-HSA”融合物指与本领域已知的任何干扰素α蛋白质或其片段融合的HSA。 
根据先前是否接受过用于治疗HCV感染的干扰素治疗方案，可将感染HCV的患者分为两类。“首次接受治疗的患者”指那些从未接受过干扰素治疗方案治疗的患者。“曾经接受治疗的患者”指那些曾经接受过或者正在接受干扰素治疗方案治疗的患者。“不应答者”指这样的曾经接受治疗的患者，他们先前接受过干扰素治疗方案治疗但未达到治疗的主要目的诸如早期病毒载量减少（EVR）或治疗终末应答（ETR）。然而，在用于本文时，“HCV患者”指感染了HCV的患者并且不论他是首次接受治疗的、曾经接受治疗的、或是不应答者。 
另外，丙型肝炎病毒可分为四种基因型，基因型1、2、3、或4。通常，感染HCV患者的丙型肝炎病毒包含单一基因型。然而，肝炎病毒可包含两种或多种基因型的组合。另外，丙型肝炎病毒的基因型还可以是已知HCV基因型之一的变体。在另一个实施方案中，HCV患者的丙型肝炎病毒是基因型1或其变体。然而，在用于本文时，“HCV”指任何基因型的丙型肝炎病毒，或其组合或变体。 
对携带HCV的患者的标准治疗牵涉用干扰素α联合抗病毒剂诸如利巴韦林（病毒唑）进行治疗。通常，每日一次，每周两次，或每周一次施用干扰素α而每日一次施用利巴韦林。然而，最近的研究也使用了干扰素α并联合本领域已知的用于治疗HCV的其它抗病毒剂。因此，在另一个实施方案中，可将IFN-α-HSA融合物单独或联合抗病毒剂诸如例如利巴韦林施用于HCV患者。 
如上所述，CID 3165蛋白质的药动学支持每2-4周或更长时间一次的服药方案。因此，在另一个实施方案中，通过每2-4周一次单独或联合有效量的抗病毒剂施用IFN-α-HSA融合物来治疗HCV患者。在优选的实施方案中，通过每2-4周一次联合有效量的抗病毒剂施用IFN-α-HSA融合物来治疗HCV患者。在另一个优选的实施方案中，每4周一次对HCV患者施用IFN-α-HSA融合物。在另一个优选的实施方案中，每4周超过一次对HCV患者施用IFN-α-HSA融合物。在另外的实施方案中，每4周或更长时间一次对HCV患者施用IFN-α-HSA融合物，其中治疗还包括施用有效量的抗病毒剂。 
在另一个实施方案中，IFN-α-HSA融合物可作为低剂量的单一疗法用于HCV的维持疗法。在另一个实施方案中，IFN-α-HSA融合物可联合利巴韦林和一种或多种其它抗病毒剂用于HCV的治疗。或者，在另一个实施方案中，IFN-α-HSA融合物可联合除利巴韦林以外的一种或多种抗病毒剂用于HCV的治疗。 
在另一个实施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治疗其它病毒感染。例如，在一个实施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治疗乙型肝炎（HBV）。在另一个实施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治疗人乳头状瘤病毒（HPV）。在另一个实施方案中，IFN-α-HSA融合物可用于治疗癌症，包括但不限于毛细胞性白血病、恶性黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、AIDS相关卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、或肾细胞癌。 
在另一个实施方案中，将GLP-1-HAS融合物用于调节糖尿病患者的血糖水平。在另一个实施方案中，将野生型或突变型GLP-1的串联融合物用于调节糖尿病患者的血糖水平。例如，在给约8周龄的糖尿病db/db小鼠皮下注射GLP-1-HAS蛋白后，通过口服葡萄糖耐量测试（通过口服管饲法每kg体重给予1g葡萄糖）评估了单体GLP-1(7-36A8G)-HAS和串联GLP-1(7-36A8G)-HSA（CID 3610）融合物调节血糖水平的能力。此葡萄糖耐量试验包括皮下注射GLP-1-HSA融合物，随后通过口服管饲法每kg体重给予1g葡萄糖。给禁食的糖尿病db/db小鼠施用等摩尔剂量（100和171nmol/kg）的单体或串联GLP-1-HSA融合蛋白，并在单次施药后6或24小时进行口服葡萄糖耐量测试。相当令人惊讶和出乎意料的是，与单体GLP-1(7-36A8G)-HSA融合物相比，串联GLP-1(7-36A8G)-HAS融合物（CID 3610）在注射后6小时显著降低血糖。另外，在注射后24小时对糖尿病db/db小鼠进行评估时，单体GLP-1(7-36A8G)-HSA和串联GLP-1(7-36A8G)-HAS（CID 3610）融合物之间的差异甚至更加显著。如图11所示，串联GLP-1(7-36A8G)-HAS融合物（CID 3610）(◇)拥有出乎意料有力的血糖正常化活性，然而单个GLP-1(7-36A8G)-HAS(△)融合物的禁食血糖水平与本质上显然是糖尿病且单独施用HSA(●)的动物相似。 
在用于本文时，“治疗活性”或“活性”可指其在人体中的作用符合期望治疗成果的活性，或指在非人哺乳动物或其它物种或生物体中的期望效果。治疗活性可在体内或在体外测量。例如，可在细胞培养物中测定期望效果。这些体外或细胞培养物测定法对于所述治疗性蛋白质在本领域通常是可获得的。测定法的实例包括但不限于本文实施例部分或表1“例示性活性测定法”一列（第3列）中所描述的。 
与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质，诸如细胞表面和分泌性蛋白质，通常通过附着一个或多个寡糖基团进行修饰。这种修饰，称为糖基化，可显著影响蛋白质的物理特性，而且对于蛋白质的稳定性、分泌、和定位可能是重要的。糖基化发生于沿着多肽主链的特定位置。通常有两种主要的糖基化类型：附着于丝氨酸或苏氨酸残基的特征为O-连接寡糖的糖基化；附着于Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列中的天冬酰胺残基的特征为N-连接寡糖的糖基化，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。N-乙酰神经氨酸（也称为唾液酸）通常是N-连接和O-连接寡糖的末端 残基。诸如蛋白质结构和细胞类型等变数影响不同糖基化位点处链内碳水化合物单位的数量和本质。糖基化异构体也常常存在于指定细胞类型中的相同位点处。 
与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质及其类似物和变体可进行修饰，因此由于对其核酸序列的操作，由表达它们的宿主细胞改变一个或多个位点处的糖基化，或者由于它们的其它表达条件。例如，可通过消除或引入糖基化位点来产生糖基化异构体，例如通过氨基酸残基的替代或删除，诸如用谷氨酰胺替代天冬酰胺，或者可通过在不会将其糖基化的宿主细胞中表达蛋白质来产生未糖基化的重组蛋白，例如在大肠杆菌或糖基化缺陷的酵母中。这些方法在下文中有更详细的描述且在本领域是已知的。 
治疗性蛋白质，特别是表1中所公开的那些，和它们的核酸和氨基酸序列在本领域是众所周知的，并且可从公共数据库诸如化学文摘社数据库（如CAS注册号）、GenBank、和提供订阅的数据库诸如GenSeq（如Derwent）获得。可用于衍生本发明多核苷酸的例示性治疗性蛋白质核苷酸序列显示于表2的第7列“SEQ ID NO：X”。SEQ ID NO：X所示序列可以是编码指定治疗性蛋白质（如全长的或成熟的）的野生型多核苷酸序列，或在一些情况中该序列可以是所述野生型多核苷酸序列的变体（如编码野生型治疗性蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸的DNA序列已经优化，例如用于在特定物种中进行表达；或编码野生型治疗性蛋白质的变体的多核苷酸（即定点突变体；等位基因变体））。利用SEQ ID NO：X所示序列衍生同一行中所描述的构建物完全在熟练技术人员的能力之内。例如，如果SEQ ID NO：X对应于全长蛋白质，但是该蛋白质只有一部分用于生成特定CID，那么根据分子生物学技术诸如PCR来扩增特定片段并将其克隆到合适载体中在本领域技术之内。 
与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的其它治疗性蛋白质包括但不限于表1“治疗性蛋白质X”一列（第1列）中所公开的一种或多种治疗性蛋白质或多肽或其片段或变体。 
表1提供了与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质或由本发明的多核苷酸编码的清蛋白融合蛋白的不完全列表。第一列“治疗性蛋白质X”公开了治疗性蛋白质分子，随后可能的圆括号中包括包 含该治疗性蛋白质分子或其片段或变体或由其组成的蛋白质的学名和品牌。在用于本文时，“治疗性蛋白质X”可指个别治疗性蛋白质分子，或指与此列中所公开的指定治疗性蛋白质分子相关的整组治疗性蛋白质。“生物学活性”列（第2列）描述了与治疗性蛋白质分子相关的生物学活性。第3列“例示性活性测定法”提供了描述可用于测试治疗性蛋白质X或包含治疗性蛋白质X（或其片段）部分的清蛋白融合蛋白的治疗性和/或生物学活性的测定法的参考文献。将“生物学活性”列中所引用的每篇参考文献完整引入本文作为参考，特别是在参考文献中所描述的用于测定表1“生物学活性”列所示相应生物学活性的各自活性测定法的描述方面（例如见其中的方法部分）。第四列“优选的适应症：Y”描述了可通过治疗性蛋白质X或包含治疗性蛋白质X(或其片段）部分的清蛋白融合蛋白来治疗、预防、诊断、和/或改善的疾病、紊乱、和/或状况。“构建物ID”列（第5列）提供了与表2中所公开的编码包含所提到的治疗性蛋白质X（或其片段）部分或由其组成的清蛋白融合蛋白的例示性清蛋白融合构建物的链接。 
表1 
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表2 
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表2提供了本发明中包含编码清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其组成的多核苷酸的非详尽清单。第一列“融合No.”给出了每种多核苷酸的融合编号。第2列“构建物ID”为本发明的每种多核苷酸提供了唯一的数字标识符。构建物ID可以用来鉴别编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸，其中清蛋白融合蛋白包含与给定的治疗性蛋白质X对应的治疗性蛋白质部分或者由其组成，给定的治疗性蛋白质X列在表1的对应列，其中构建物ID列在第5列。“构建物名称”列（第3列）为给定的清蛋白融合构建物或多核苷酸提供了名称。 
表2的第四列“描述”为给定的清蛋白融合构建物提供了概括描述，而第五列“表达载体”列出了包含编码给定清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其组成的多核苷酸克隆其中的载体。载体是本领域已知的，且可通过商业途径或其它地方所述途径获得。例如，如实施例所述，可以在方便的克隆载体中装配包含（1）编码给定清蛋白融合蛋白的多核苷酸，（2）前导序列，（3）启动子区，和（4）翻译终止子其中一项或多项或者由其组成的“表达盒”，然后将其转移到其它载体中，诸如例如包括例如酵母表达载体或哺乳动物表达载体在内的表达载体。在一个实施方案中，为了在酿酒酵母中进行表达，将包含编码清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其组成的表达盒克隆到pSAC35中。在另一个实施方案中，为了在CHO细胞中进行表达，将包含编码清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其组成的表达盒克隆到pC4中。在又一个实施方案中，将包含编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的核酸分子或者由其组成的多核苷酸克隆到pC4:HSA中。在又一个实施方案中，为了在NSO细胞中进行表达，将包含编码清蛋白融合蛋白的核酸分子或者由其组成的表达盒克隆到pEE12中。熟练技术人员还知道其它有用的克隆和/或表达载体，而它们也在本发明的范围之内。 
第6列“SEQ ID NO：Y”提供了本发明的清蛋白融合蛋白的全长氨基酸序列。在多数情况中，SEQ ID NO：Y显示所编码清蛋白融合蛋白的未加工形式，换句话说，SEQ ID NO：Y显示全部由特定构建物编码的信号序列、HSA部分、和治疗性部分。本发明明确涵盖编码SEQ ID NO：Y的所有多核苷酸。在利用这些多核苷酸由细胞表达所编码蛋白质时，细胞的天然分泌和加工步骤产生缺少表2的第4列和/或第11列中列出的信号序列的蛋白质。所列信号序列的具体氨基酸序列显示在后面的说明书中，或者已经为本领域 所熟知。因此，本发明的最优选实施方案包括由细胞产生的清蛋白融合蛋白（它将缺少表2的第4列和/或第11列中所显示的前导序列）。同样最优选的还有包含SEQ ID NO：Y但不具有表2的第4列和/或第11列中列出的具体前导序列的多肽。包含这两个优选实施方案的组合物，包括药物组合物，也是优选的。而且，用不同的信号序列诸如后面的说明书中描述的有助于经加工的清蛋白融合蛋白分泌的信号序列替换表2的第4列和/或第11列中列出的信号序列也完全在熟练技术人员的能力范围之内。 
第七列“SEQ ID NO：X”提供了可衍生编码给定清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸的亲本核酸序列。在一个实施方案中，可衍生编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸的亲本核酸序列包括编码表1中显示的治疗性蛋白质的野生型基因序列。在候选实施方案中，可衍生编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸的亲本核酸序列包括编码表1中显示的治疗性蛋白质的野生型基因序列的变体或衍生物，诸如例如编码治疗性蛋白质的野生型基因序列的合成密码子优化变体。 
第八列“SEQ ID NO：Z”提供了亲本核酸序列（SEQ ID NO：X）的预测翻译结果。此亲本序列可以是用来衍生特定构建物的全长亲本蛋白质、亲本蛋白质的成熟部分、野生型蛋白质的变体或片段、或者可用于产生所述构建物的人工序列。本领域技术人员可以利用SEQ ID NO：Z中显示的此氨基酸序列来确定给定构建物编码的清蛋白融合蛋白的哪些氨基酸残基是由治疗性蛋白质提供的。而且，利用SEQ ID NO：Z显示的序列衍生同一行中描述的构建物也完全在熟练技术人员的能力范围之内。例如，如果SEQ ID NO：Z对应于全长蛋白质，而只利用该蛋白质的一部分来产生特定CID，那么依靠分子生物学技术诸如PCR扩增特定片段并将它克隆到适当的载体中，这在本领域的技术范围之内。 
第9和10列分别提供的扩增引物“SEQ ID NO：A”和“SEQ ID NO：B”是用来产生包含编码给定清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的核酸分子或者由其组成的多核苷酸的示范引物。在本发明的一个实施方案中，具有第9和/或第10列所示序列（SEQ ID NO：A和/或B）的寡核苷酸引物用于PCR扩增编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸，其中利用包含对应行的第7列提供的核苷酸序列（SEQ ID NO：X）或者由其组成的核酸分子作为模板DNA。本领域已经很好地建立了PCR方法。本领域普通技 术人员可容易的设想和使用其它有用的引物序列。 
在候选实施方案中，寡核苷酸可以在重叠PCR反应用于在模板DNA序列中产生突变。PCR方法是本领域已知的。 
如表3所示，本申请中公开的某些清蛋白融合构建物已经保藏于ATCC。 
表3
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通过本领域已知的技术从保藏处重新得到给定的清蛋白融合构建物是可能的，在本申请的其它地方也进行了描述（参见实施例10）。ATCC位于美国弗吉尼亚20110-2209的Manassas的大学路10801号（10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA）。按照布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏条款进行了ATCC保藏。 
在本发明又一个实施方案中，包含（1）编码给定清蛋白融合蛋白的多核苷酸，（2）前导序列，（3）启动子区，和（4）翻译终止子其中一项或多项或者由其组成的“表达盒”可以从一种载体移动或“亚克隆”到另一种载体中。通过本领域众所周知的方法，诸如例如PCR扩增（例如利用具有SEQ ID NO：A或B所示序列的寡核苷酸引物）和/或限制酶消化，可以产生用于亚克隆的片段。 
在优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白具有与治疗性蛋白质的 治疗活性和/或生物学活性对应的治疗活性和/或生物学活性，其中治疗性蛋白质对应于表1的对应行所列出的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分。在又一个优选方案中，本发明的清蛋白融合蛋白的治疗活性蛋白质部分是由表2的SEQ ID NO：X列显示的序列编码的蛋白质的片段或变体，且具有对应的治疗性蛋白质的治疗活性和/或生物学活性。 
多肽和多核苷酸片段和变体
片段 
本发明还涉及表1中描述的治疗性蛋白质的片段、清蛋白蛋白质、和/或本发明的清蛋白融合蛋白。 
本发明还涉及编码表1中描述的治疗性蛋白质的片段、清蛋白蛋白质、和/或本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸。 
即使从蛋白质的N-末端删除一个或多个氨基酸会导致治疗性蛋白质、清蛋白蛋白质、和/或本发明的清蛋白融合蛋白的一种或多种生物功能的修饰或丧失，但仍然可保留其它治疗活性和/或功能活性（如生物学活性、多聚化的能力、结合配体的能力）。例如，在从N-末端除去少于完整多肽的多数残基时，通常能保留具有N-末端删除的多肽诱导和/或结合识别这种多肽的完整或成熟形式的抗体的能力。通过本申请所描述的和本领域其它途径知道的常规方法，可以容易的确定缺乏完整多肽N-末端残基的特定多肽是否保留了这种免疫学活性。N-末端氨基酸残基遭到大量删除的突变蛋白保留一些生物学或免疫学活性并不是不可能的。事实上，由少至六个氨基酸残基构成的肽经常可以引发免疫应答。 
因此，与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质的片段包括全长蛋白质，以及从参考多肽（即表1中提到的治疗性蛋白质，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分）的氨基酸序列的氨基末端删除了一个或多个残基的多肽。具体而言，N-末端删除可以用m至q的通式来描述，其中q是代表参考多肽（例如表1中提到的治疗性蛋白质，或者本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分）中氨基酸残基总数的完整整数，而m定义为范围为2到q减6的任何整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
另外，与本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分对应的血清清蛋白多肽的片段包括全长蛋白质，以及从参考多肽（即血清清蛋白，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白的血清清蛋白部分）的氨基酸序列的氨基末端删除了一个或多个残基的多肽。在优选的实施方案中，N-末端删除可以用m至585的通式来描述，其中585是代表成熟人血清清蛋白（SEQ ID NO：1）的氨基酸残基总数的完整整数，而m定义为范围为2到579的任何整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。在另外的实施方案中，N-末端删除可以用m至609的通式来描述，其中609是代表全长人血清清蛋白（SEQ ID NO：3）的氨基酸残基总数的完整整数，而m定义为范围为2到603的任何整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
而且，本发明的清蛋白融合蛋白的片段包括全长清蛋白融合蛋白，以及从清蛋白融合蛋白（即由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白，或者具有表2的第6列公开的氨基酸序列的清蛋白融合蛋白）的氨基末端删除了一个或多个残基的多肽。具体而言，N-末端删除可以用m至q的通式来描述，其中q是代表清蛋白融合蛋白的氨基酸残基总数的完整整数，而m定义为范围为2到q减6的任何整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
同样如上所述，即使从参考多肽（例如治疗性蛋白质、血清清蛋白蛋白质、或本发明的清蛋白融合蛋白）的N-末端或C-末端删除一个或多个氨基酸会导致蛋白质的一种或多种生物功能的修饰或丧失，但仍然可以保留其它功能活性（例如生物学活性、多聚化的能力、结合配体的能力）和/或治疗活性。例如，在从C-末端除去少于完整或成熟多肽的多数残基时，通常能保留具有C-末端删除多肽诱导和/或结合识别这种多肽的完整或成熟形式的抗体的能力。通过本申请所描述的和/或本领域其它途径知道的常规方法，可以容易的确定缺乏参考多肽N-末端和/或C-末端残基的特定多肽是否保留了治疗活性。 
本发明还提供了从与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质（例如表1中提到的治疗性蛋白质，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分）的氨基酸序列的羧基末端删除了一个或多个残基的多肽。具体而言，C末端删除可以用1至n的通式来描述，其中n是范围为6到q减1的任何完整整数，而q是代表参考多肽（例如表1中提到的治疗性蛋白质，或者由表2中 描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分）中氨基酸残基总数的完整整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
另外，本发明提供了从与本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分对应的清蛋白蛋白质（例如血清清蛋白，或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分）的氨基酸序列的羧基末端删除了一个或多个残基的多肽。具体而言，C-末端删除可以用1至n的通式来描述，其中n是范围为6到584的任何完整整数，而584是代表成熟人血清清蛋白（SEQ ID NO：1）的氨基酸残基总数减1的完整整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。具体而言，C-末端删除可以用1至n的通式来描述，其中n是范围为6到608的任何完整整数，而608是代表血清清蛋白（SEQ ID NO：3）的氨基酸残基总数减1的完整整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
而且，本发明提供了从本发明的清蛋白融合蛋白的羧基末端删除了一个或多个残基的多肽。具体而言，C-末端删除可以用1到n的通式来描述，其中n是范围为6到q减1的任何完整整数，而q是代表本发明的清蛋白融合蛋白的氨基酸残基总数的完整整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
另外，可以组合上述任何N-或C-末端删除以产生N-和C-末端删除的参考多肽。本发明还提供了从氨基和羧基两个末端删除了一个或多个氨基酸的多肽，这通常可描述为具有参考多肽（例如表1中提到的治疗性蛋白质、或者本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分、或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的治疗性蛋白质部分、或者血清清蛋白（例如SEQ ID NO：1）、或者本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分、或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白蛋白质部分、或者清蛋白融合蛋白、或者由本发明的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白）的残基m至n，其中n和m是上文所述的整数。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
本申请还涉及包含与本文所列参考多肽序列（例如表1中提到的治疗性蛋白质、或者本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分、或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的治疗性蛋白质部分、或者血清清蛋白（例如SEQ ID NO：1）、或者本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质 部分、或者由表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白蛋白质部分、或者清蛋白融合蛋白、或者由本发明的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白）或其片段具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多肽的蛋白质。在优选的实施方案中，本申请涉及包含与参考多肽具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性且具有上文所述N-和C-末端删除的氨基酸序列的多肽的蛋白质。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
本发明的优选多肽片段是包含表现出治疗性蛋白质或血清清蛋白蛋白质多肽序列的治疗活性和/或功能活性（例如生物学活性）的氨基酸序列或者由其组成的片段，其中所述氨基酸序列是所述治疗性蛋白质或血清清蛋白蛋白质的多肽序列的片段。 
其它优选的多肽片段有生物学活性片段。生物学活性片段是那些显示出与本发明的多肽的活性相似但不必相同的活性的片段。片段的生物学活性可包括改进的期望活性，或者减弱的不良活性。 
变体 
“变体”指与参考核酸或多肽不同但保留其本质特性的多肽或核酸。通常，变体与参考核酸或多肽在总体上紧密相似且在许多区域相同。 
在用于本文时，“变体”指序列分别与治疗性蛋白质（例如参见表1的“治疗性”列）、清蛋白蛋白质、和/或清蛋白融合蛋白不同但保留其本文中其它地方描述的或本领域其它途径知道的至少一种功能和/或治疗特性的本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分、本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分、或本发明的清蛋白融合蛋白。通常，变体与对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质、对应于清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分的清蛋白蛋白质、和/或清蛋白融合蛋白的氨基酸序列在总体上非常相似且在许多区域与其相同。本发明还涵盖编码这些变体的核酸。 
本发明还涉及包含与例如对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的治疗性蛋白质（例如表1中公开的治疗性蛋白质X的氨基酸序列；或者由表1和表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的氨基酸序列；或其片段或变体）、对应于本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分的清蛋白蛋白质（例如由表1和表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建物编码的清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋 白质部分的氨基酸序列；SEQ ID NO：1中显示的氨基酸序列；或其片段或变体的氨基酸序列）、和/或清蛋白融合蛋白的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列或者由其组成的蛋白质。还提供了这些多肽的片段（例如本文描述的片段）。本发明还包括由这样的多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在严谨杂交条件下（例如在约45摄氏度，在6X氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中与滤膜结合的DNA杂交，然后在约50-65摄氏度，在0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次）、在高度严谨条件下（例如在约45摄氏度，在6X氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中与滤膜结合的DNA杂交，然后在约68摄氏度，在0.1X SSC、0.2%SDS中洗涤一次或多次）、或在本领域技术人员知道的其它严谨杂交条件下（例如参见Ausubel,F.M.等人，编，1989，《Current protocol in Molecular Biology》，Green publishing associates,Inc.及John Wiley & Sons Inc.，New York，6.3.1-6.3.6和2.10.3）下与编码本发明的清蛋白融合蛋白的核酸分子的互补链发生杂交。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸。 
具有与查询氨基酸序列具有至少例如95%“同一性”的氨基酸序列的多肽指目的多肽的氨基酸序列与查询序列相同，只是目的多肽序列在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中可包括多达五个氨基酸改变。换句话说，要获得具有与查询氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽，可以插入、删除、或用另一种氨基酸替代目的序列中多达5%的氨基酸残基。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或那些末端位置之间的任何地方，可以个别地散布在参考序列的残基之间或散布在参考序列内的一个或多个邻近组中。 
实际上，可以利用已知的计算机程序照惯例确定任何特定多肽与本发明的清蛋白融合蛋白或其片段（例如清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分或清蛋白融合蛋白的清蛋白部分）的氨基酸序列是否具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。利用以Brutlag等人（Comp.App.Biosci.6：237-245，1990）的算法为基础的FASTDB计算机程序可以确定用于测定查询序列（本发明的序列）与目的序列之间的最佳整体匹配的优选方法，也称为全局序列比对。在序列比对中，查询和目的序列可以都是核苷酸序列或者都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果用同一性百分比表示。用于FASTDB氨基酸比对的优选参数为∶矩阵=PAM 0，k-tuple=2，错配罚分=l，连接罚分=20， 随机化组长=0，截止得分=l，窗口尺度=序列长度，缺口罚分=5，缺口大小罚分=0.05，窗口尺度=500或目的氨基酸序列的长度中的较短者。 
如果目的序列因为N-或C-末端删除而非内部删除比查询序列短，那么必须对结果进行人工修正。这是因为FASTDB程序在计算全局同一性百分比时不会考虑目的序列的N-和C-末端截短。对于相对于查询序列在N-和C-末端截短的目的序列，如下修正同一性百分比，计算查询序列中位于目的序列的N-和C-末端、不与对应的目的序列匹配/比对的残基数目，作为查询序列碱基总数的百分比。残基是否匹配/比对是由FASTDB序列比对的结果确定的。然后从通过上述FASTDB程序利用特定参数计算得出的同一性百分比减去这一百分比，得出最终同一性百分比得分。此最终同一性百分比得分就是用于本发明的得分。人工调整同一性百分比得分时只考虑位于目的序列的N-和C-末端、与查询序列不匹配/比对的残基。也就是说，只考虑位于目的序列最远N-和C-末端残基以外的查询残基残基。 
例如，将90个氨基酸残基的目的序列与100个残基的查询序列进行比对以测定同一性百分比。删除发生在目的序列的N-末端，因此FASTDB比对不显示N-末端最初10个残基的匹配/比对结果。10个不配对的残基占到序列的10%（N-和C-末端不匹配的残基数/查询序列的残基总数），因此从通过FASTDB程序计算得出的同一性百分比得分中减去10%。如果剩余的90个残基是完全匹配的，则最终的同一性百分比将是90%。在另一个实例中，将90个残基的目的序列与100个残基的查询序列进行比较。这次删除是内部删除，因此目的序列的N-或C-末端没有不与查询序列匹配/比对的残基。在这种情况中，通过FASTDB计算得出的同一性百分比无需进行手工修正。再次申明，只有根据FASTDB比对的显示位于目的序列的N-和C-末端以外、不与查询序列匹配/比对的残基位置需要手工矫正。在本发明中没有进行其它形式的人工修正。 
变体通常与长度与其相同的正常HA或治疗性蛋白质具有至少75%（优选至少约80%、90%、95%或99%）的序列同一性。利用为了序列相似性搜索而修改的程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx（Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990；及Altschul，J.Mol.Evol.36：290-300，1993，完整引入作为参考）所采用的算法，通过BLAST（Basic Local Alignment Search Tool即基本局部比对搜索工具）分析测定核苷酸或氨基酸 序列水平的同源性或同一性。 
BLAST程序所利用的方法首先考虑查询序列与数据库序列之间的相似区段，然后对鉴定得出的所有匹配评估统计学显著性，最后只总结那些满足预定显著性阈值的匹配。关于序列数据库的相似性搜索中的基本问题的讨论，参见Altschul等人，Nature Genetics 6：119-129，1994，将其完整引入作为参考。直方图、描述、比对、期望值（即报告针对数据库序列的配对的序列的统计学显著性阈值）、截止值、矩阵和过滤器的搜索参数都采用默认设置。blastp、blastx、tblastn、和tblastx所采用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵（Henikoff等人，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 89：10915-10919，1992，完整引入作为参考）。对于blastn，由M（即匹配残基的奖分）和N（不匹配残基的罚分）的比值来设置评分矩阵，其中M和N的缺省值分别是5和-4。可以如下调整四个blastn参数∶Ｑ=10（缺口产生罚分）；R=10（缺口延伸罚分）；wink=1（沿着查询序列在每一个winkth位置产生词采样数）；gapw=16（设定窗口宽度，其中产生含缺口比对）。同等的blastp参数设置为Q=9；R=2；wink=l和gapw=32。可从GCG软件包版本10.0中获得的序列间比较程序Bestfit使用的DNA参数为GAP=50（缺口产生罚分）和LEN=3（缺口延伸罚分），而蛋白质比较的同等设置为GAP=8和LEN=2。 
本发明的多核苷酸变体可在编码区、非编码区、或二者中含有改变。尤其优选含有产生沉默替代、添加、或删除但不改变所编码多肽的特性或活性的改变的多核苷酸变体。优选由遗传密码简并性引起的沉默替代产生的核苷酸变体。而且，还优选任意组合的小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、或5-50、5-25、5-10、1-5或1-2个氨基酸遭到替代、删除、或添加的多肽变体。可以为了多种原因来产生多核苷酸变体，例如为了针对特定宿主优化密码子表达（将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主诸如酵母或大肠杆菌偏爱的密码子）。 
在一个优选方案中，为了在酵母或哺乳动物细胞中表达，对编码清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的本发明多核苷酸进行了优化。在另一个优选实施方案中，为了在酵母或哺乳动物细胞中表达，对编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的本发明多核苷酸进行了优化。在又一个优选实施方案中，为了在酵母或哺乳动物细胞中表达，对编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸进行了优化。 
在一个候选实施方案中，经过密码子优化的编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸在本文描述的严谨杂交条件下不与编码治疗性蛋白质的野生型多核苷酸发生杂交。在又一个实施方案中，经过密码子优化的编码清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的多核苷酸在本文描述的严谨杂交条件下不与编码清蛋白蛋白质的野生型多核苷酸发生杂交。在另一个实施方案中，经过密码子优化的编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸在本文描述的严谨杂交条件下不与编码治疗性蛋白质部分或清蛋白蛋白质部分的野生型多核苷酸发生杂交。 
在另外的实施方案中，编码清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸不包含治疗性蛋白质的天然存在序列或者不由其组成。在又一个实施方案中，编码清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分的多核苷酸不包含清蛋白蛋白质的天然存在序列或者不由其组成。在候选实施方案中，编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含治疗性蛋白质部分或清蛋白蛋白质部分的天然存在序列或者不由其组成。 
天然存在变体称为“等位基因变体”，指占据生物体染色体上给定基因座的基因的几种可替换形式之一（Genesll,Lewin,B.编，John Wiley & Sons，New York，1985）。这些等位基因变体可以在多核苷酸和/或多肽水平有所不同，而且包括在本发明中。或者，可通过诱变技术或直接合成技术制备非天然存在的变体。 
利用已知的蛋白质工程和重组DNA技术的方法，可以产生变体以改进或改变本发明多肽的特征。例如，可以从本发明多肽的N-末端或C-末端删除一个或多个氨基酸而不导致生物学功能的实质性丧失。例如，Ron等人（J.Biol.Chem.268：2984-2988，1993）报道了甚至在删除3、8、或27个氨基末端氨基酸残基后仍具有肝素结合活性的变体KGF蛋白质。类似地，γ干扰素在从此蛋白质的羧基末端删除8-10个氨基酸残基后表现出更高的可达十倍的活性（Dobeli等人，J.Biotechnology 7：199-216，1988）。 
而且，有充足的证据证明，变体通常会保留与天然存在蛋白质相似的生物学活性。例如，Gayle及其同事（J.Biol.Chem.268：22105-22111，1993）对人细胞因子IL-1a进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变产生了超过3,500种独特IL-1a突变体，即在分子的全长上每种变体平均有2.5个氨基酸改变。在每个可能的氨基酸位置对多种突变进行了检查。研究人员发现“多 数分子可在遭到改变的同时对[结合或生物学活性]影响很小”。事实上，在检查的超过3,500种核苷酸序列中，只有23种独特氨基酸序列产生了活性与野生型显著不同的蛋白质。 
而且，即使从多肽的N-末端或C-末端删除一个或多个氨基酸会导致一种或多种生物学功能的修饰或丧失，但仍可保留其它生物学活性。例如，在从N-末端或C-末端除去少于分泌形式的多数残基时，将有可能保留删除变体诱导和/或结合识别分泌形式的抗体的能力。通过本文描述的和本领域其它途径知道的常规方法可以容易的确定缺乏蛋白质的N-末端或C-末端残基的特定多肽是否保留了这种免疫原性活性。 
因此，本发明还包括具有功能活性（例如生物学活性和/或治疗活性）的多肽变体。在一个实施方案中，本发明提供了具有与治疗性蛋白质的一种或多种生物学和/或治疗活性对应的功能活性（例如生物学活性和/或治疗活性）的清蛋白融合蛋白变体，其中治疗性蛋白质对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分。在另一个实施方案中，本发明提供了具有与治疗性蛋白质的一种或多种生物学和/或治疗活性对应的功能活性（例如生物学活性/或治疗活性）的清蛋白融合蛋白变体，其中治疗性蛋白质对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分。这种变体包括依照本领域已知的一般规则选择的对活性影响很小的删除、插入、倒位、重复、和替代。本发明还涵盖编码这种变体的多核苷酸。 
在优选的实施方案中，本发明的变体具有保守替代。“保守替代”指在组内交换，诸如脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替换；羟基残基Ser和Thr的替换；酸性残基Asp和Glu的替换；酰胺残基Asn和Gln的替换；碱性残基Lys、Arg、和His的替换；芳香族残基Phe、Tyr、和Trp的替换；及小型氨基酸Ala、Ser、Thr、Met、和Gly的替换。 
例如，Bowie等人，“Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions”，Science 247：1306-1310，1990中提供了关于如何进行表型沉默氨基酸替代的指导，其中作者指出研究氨基酸序列对变化的耐受性有两种主要的策略。 
第一种策略利用了进化过程中自然选择的氨基酸替代的耐受性。通过比较不同物种的氨基酸序列可以鉴定保守氨基酸。这些保守氨基酸对蛋白质的功能可能是重要的。相反，自然选择已经耐受的替换的氨基酸位置表明这些 位置对蛋白质功能不是至关重要的。因此，可以修饰耐受氨基酸替代的位置，同时仍保持该蛋白质的生物学活性。 
第二种策略利用遗传工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸变化，以鉴定对蛋白质功能至关重要的区域。例如，可以使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变（在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变）。参见Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085，1989。然后可测试如此产生的突变分子的生物学活性。 
如作者所述，这两种策略已经揭示了蛋白质能令人惊讶的耐受氨基酸替代。作者还指出了哪些氨基酸变化是蛋白质中某些氨基酸位置有可能容许的。例如，大多数埋藏（在蛋白质的三级结构内）的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的很少特色通常是保守的。而且，耐受的保守氨基酸替代涉及脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替换；羟基残基Ser和Thr的替换；酸性残基Asp和Glu的替换；酰胺残基Asn和Gln的替换；碱性残基Lys、Arg和His的替换；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的替换；及小型氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替换。除保守氨基酸替代之外，本发明的变体包括（i）含有一个或多个非保守氨基酸残基的提到的多肽，其中替代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的，或（ii）含有一个或多个具有取代基的氨基酸残基的替代的多肽，或（iii）已经与另一化合物诸如提高多肽稳定性和/或溶解度的化合物（例如聚乙二醇）融合或化学缀合的多肽，或（iv）含有另外的氨基酸诸如例如IgG Fc区融合肽的多肽。依据本文的教导，认为这种变体多肽在本领域熟练技术人员的范围之内。 
例如，含有用其它带电荷或中性氨基酸替代带电荷氨基酸的氨基酸替代的多肽变体可产生具有改良特性的蛋白质，诸如聚集更少。药学制剂的聚集不但降低活性，而且还提高因聚集物的免疫原性引起的清除。参见Pinckard等人，Clin.Exp.Immunol.2：331-340，1967；Robbins等人，Diabetes 36：838-845，1987；Cleland等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10：307-377，1993。 
在具体的实施方案中，本发明的多肽包含清蛋白融合蛋白的氨基酸序列、治疗性蛋白质和/或人血清清蛋白的氨基酸序列的片段或变体或者由其组成，其中片段或变体与参考氨基酸序列相比具有1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150个氨基酸残基添加、替代、和/或删除。在优选的实施方案中，氨基酸替代是保守的。本发明还涵盖编码这些多肽的核酸。 
本发明的多肽可以由彼此通过肽键或修饰肽键即肽电子等排体连接在一起的氨基酸构成，而且可包含20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。可以通过天然过程，诸如翻译后加工，或者通过本领域众所周知的化学修饰技术来修饰多肽。基础教科书和更为详细的专著，以及长篇研究文献中对这种修饰进行了很好的描述。修饰可发生在多肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链、及氨基或羧基末端。应理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定多肽的几个位点处。而且，给定多肽可含有多种类型的修饰。多肽可以是分支的，例如由于泛蛋白化作用，而且它们也可以是具有或没有分支的环状。可以由翻译后天然加工产生环状的、分支的、和分支环状的多肽，或者可以通过合成方法来生成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟化、碘化、甲基化、肉豆蔻基化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯基化、外消旋化、硒化（selenoylation）、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质上添加氨基酸诸如精氨酰化（arginylation）、和泛蛋白化。（参见例如《PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES》，第2版，T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company，New York，1993；《POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS》，B.C.Johnson编，Academic Press，New York，第1-12页，1983；Seifter等人，Meth.Enzymol.182：626-646，1990；Rattan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992）。 
功能活性
“具有功能活性的多肽”指能够表现出与治疗性蛋白质的全长、前蛋白、和/或成熟形式有关的一种或多种已知功能活性的多肽。这种功能活性包括但不限于生物学活性、抗原性[结合（或与多肽竞争结合）抗多肽抗体的能力]、免疫原性（产生与本发明的特定多肽结合的抗体的能力）、与本发明的多肽形成多聚体的能力、和与多肽的受体或配体结合的能力。 
“具有生物学活性的多肽”指根据具有或没有剂量依赖性的特定生物学测定法的测量，显示出与本发明的治疗性蛋白质包括成熟形式的活性相似但不必相同的活性的多肽。在确实存在剂量依赖性的情况中，与本发明的多肽 相比，给定活性的剂量依赖性不必与多肽相同，只需基本相似（即相对于本发明的多肽，侯选多肽将显示出更大的活性或不超过约25倍的更小活性，优选不超过约10倍的更小活性，最优选不超过约3倍的更小活性）。 
在优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白具有至少一种与治疗性蛋白质部分（或其片段或变体）未与清蛋白融合时有关的生物学和/或治疗活性。 
在另外的优选实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白具有与融合状态的治疗性蛋白质部分（或其片段或变体）相比升高的血浆稳定性。可利用或常规修改本领域已知的测定法来测定本发明的清蛋白融合蛋白或未融合的治疗性蛋白质部分（或其片段或变体）的血浆稳定性。 
可利用或常规修改本领域已知的测定法以及本文描述的测定法来测定本发明的清蛋白融合蛋白的功能活性（例如生物学活性）。另外，本领域技术人员利用其在表1的对应行（例如表1的第3列）中参考的测定法可常规测定与清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质的片段的活性。另外，本领域技术人员利用本领域已知的和/或下文实施例部分描述的测定法可常规测定与清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分对应的清蛋白蛋白质的片段的活性。 
例如，在测定清蛋白融合蛋白结合或与治疗性蛋白质竞争结合抗治疗性多肽抗体和/或抗清蛋白抗体的能力的一个实施方案中，可以使用本领域已知的各种免疫测定法，包括但不限于利用诸如放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“三明治免疫测定法”、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法（例如利用胶体金、酶或放射性同位素标记物）、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定法（例如凝胶凝集测定法、血凝集测定法）、补体结合测定法、免疫荧光测定法、蛋白质A测定法和免疫电泳测定法等技术的竞争性和非竞争性测定系统。在一个实施方案中，通过检测一抗上的标记物来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测二抗或试剂与一抗的结合来检测一抗。在又一个实施方案中，二抗经过标记。本领域知道用于在免疫测定法中检测结合的许多方法，而且它们在本发明的范围之内。 
在鉴定治疗性蛋白质的结合配偶体（例如受体或配体）的一个优选实施例中，例如通过本领域众所周知的方法诸如例如还原性和非还原性凝胶层析、蛋白质亲和层析和亲和印迹可以测定包含该治疗性蛋白质作为融合物的 治疗性蛋白质部分的清蛋白融合蛋白与该结合配偶体的结合。通常参见Phizicky等人，Microbiol.Rev.59：94-123，1995。在另一个实施方案中，利用本领域已知的技术可以常规测定清蛋白融合蛋白结合与融合物的治疗性蛋白质部分对应的治疗性多肽的底物的生理学关联能力。 
在评估清蛋白融合蛋白的多聚化能力的候选实施方案中，例如通过本领域众所周知的方法诸如例如还原性和非还原性凝胶层析、蛋白质亲和层析和亲和印迹可以测定多聚体与其它组分的缔合。通常参见Phizicky等人，见上文。 
在优选的实施方案中，包含结合治疗性蛋白质的抗体的整个或部分的清蛋白融合蛋白具有至少一种与结合治疗性蛋白质的抗体（或其片段或变体）未与清蛋白融合时有关的生物学和/或治疗活性（例如特异结合多肽或表位）。在其它优选实施方案中，包含结合治疗性蛋白质的抗体的整个或部分的清蛋白融合蛋白的生物学活性和/或治疗活性是对与受到结合治疗性蛋白质的抗体特异结合的多肽有关的一种或多种生物学活性和/或治疗活性的抑制（即拮抗作用）或激活（即激动作用）。 
可以以多种方式表征包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白。具体而言，利用本文描述的技术或常规修改本领域已知的技术，可以对包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白测定清蛋白融合蛋白特异性结合受到结合治疗性蛋白质的抗体特异结合的相同抗原的能力，其中所述治疗性蛋白质对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分。 
针对清蛋白融合蛋白（例如包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体）（特异）结合特定蛋白质或表位的能力的测定法可以在溶液中（例如Houghten，Bio/Techniques 13：412-421，1992)、在珠子上（例如Lam，Nature 354：82-84，1991)、在芯片上（例如Fodor，Nature 364：555-556，1993）、在细菌上（例如美国专利号5,223,409）、在孢子上（例如专利号5,571,698；5,403,484；和5,223,409）、在质粒上（例如Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869，1992）、或在噬菌体上（例如Scott和Smith，Science 249：386-390，1990；Devlin，Science 249：404-406，1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382，1990；及Felici，J.Mol.Biol.222：301-310，1991）进行。（将这些参考文献全部完整引入本文作为参考）。利用或常规修改本文描述的或本领域其它途径知道的技术，也可以对包含治 疗性抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白测定其对特定蛋白质或表位的特异性和亲和力。 
利用本领域已知的任何方法，可以对包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白测定与其它抗原（例如与受到抗体特异结合的分子具有序列/结构保守性的分子，其中抗体结合与本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质（或其片段或变体））的交叉反应性。 
可用于分析（免疫特异性）结合和交叉反应性的免疫测定法包括但不限于利用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“三明治”免疫测定法、免测沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、和蛋白质A免疫测定法等技术的竞争性和非竞争性测定系统，这里只提到了一些。这种测定法是常规的，而且是本领域众所周知的（例如参见Ausubel等人，编，1994，《Current Protocols in Molecular Biology》，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.，New York，将其完整引入本文作为参考）。下文简述了示例性的免疫测定法（但无意限制）。 
免测沉淀方案通常包括在溶解缓冲液诸如补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂（例如EDTA、PMSF、抑酶肽、钒酸钠）的RIPA缓冲液（1%NP-40或Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，0.15M NaCl，pH7.2的0.01M磷酸钠，1%Trasylol）中溶解细胞群，向细胞溶解物中添加本发明的清蛋白融合蛋白（例如包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体），于40摄氏度温育一段时间（例如1到4小时），向细胞溶解物中添加例如与抗清蛋白抗体偶联的sepharose珠，于40摄氏度温育约一小时或更长时间，在溶解缓冲液中洗涤珠子，并将珠子重悬于SDS/样品缓冲液。利用例如蛋白质印迹分析可以评估清蛋白融合蛋白免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员了解可以通过修改参数来增加清蛋白融合蛋白与抗原的结合并降低背景（例如用sepharose珠预先澄清细胞溶解物）。关于免测沉淀方案的更多讨论参见例如Ausubel等人，编，1994，《Current Protocols in Molecular Biology》，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.，New York，页码10.16.1。 
蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶（例如依据抗原分子量选择8%-20%的SDS-PAGE）中电泳蛋白质样品，将蛋白质样 品从聚丙烯酰胺凝胶转移至薄膜诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙，在封闭液（例如含有3%BSA或脱脂奶的PBS）中封闭薄膜，在洗涤缓冲液（例如PBS-吐温20）中洗涤薄膜，将本发明的清蛋白融合蛋白（在封闭缓冲液中稀释）施加到薄膜上，在洗涤缓冲液中洗涤薄膜，施加在封闭缓冲液中稀释的与酶底物（例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶）或放射性分子（例如32P或 125I）缀合的二抗（它识别清蛋白融合蛋白，例如抗人血清清蛋白抗体），在洗涤缓冲液中洗涤薄膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员了解可以通过修改参数来增加检测的信号并降低背景噪声。关于蛋白质印迹方案的更多讨论参见例如Ausubel等人，编，1994，《Current Protocols in Molecular Biology》，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.，New York，页码10.8.1。 
ELISA包括制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，洗去未与孔结合的抗原，向孔中添加与可检测化合物诸如酶底物（例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶）缀合的本发明的清蛋白融合蛋白（例如包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体）并温育一段时间，洗去未结合的或非特异结合的清蛋白融合蛋白，并检测与包被孔的抗原特异性结合的清蛋白融合蛋白的存在。在ELISA中，清蛋白融合蛋白不必与可检测化合物缀合；而是可将与可检测化合物缀合的二抗（它识别清蛋白融合蛋白）添加到孔中。另外，可用清蛋白融合蛋白包被孔代替用抗原包被孔。在这种情况中，可检测分子可以是与可检测化合物诸如酶底物（例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶）缀合的抗原。本领域技术人员了解可以通过修改参数来增加检测信号，以及本领域知道的的其它ELISA变化。关于ELISA的更多讨论参见Ausubel等人，编，1994，《Current Protocols in Molecular Biology》，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.，New York，页码11.2.1。 
通过竞争性结合测定法可以测定清蛋白融合蛋白与蛋白质、抗原、或表位的结合亲和力及清蛋白融合蛋白-蛋白质/抗原/表位相互作用的解离速率(off-rate)。竞争性结合测定法的一个实例是放射免疫测定法，它包括在存在数量渐增的未标记抗原的条件下，将经标记抗原（例如3H或125I）与本发明的清蛋白融合蛋白一起温育，并检测与经标记抗原结合的抗体。可以由Scatchard绘图分析的数据测定清蛋白融合蛋白对特定蛋白质、抗原、或表位的亲和力和结合解离速率。利用放射免疫测定法还可以测定与第二蛋白质的竞争，所述第二蛋白质与清蛋白融合蛋白结合相同的蛋白质、抗原、或表位。 在这种情况中，将蛋白质、抗原、或表位与缀合了标记化合物（例如3H或 125I）的清蛋白融合蛋白在存在数量渐增的未标记第二蛋白质的条件下一起温育，所述第二蛋白质与本发明的清蛋白融合蛋白结合相同的蛋白质、抗原、或表位。 
在一个优选的实施方案中，利用BIAcore动力学分析来测定本发明的清蛋白融合蛋白与蛋白质、抗原、或表位的结合和解离速率(binding on and off rate)。BIAcore动力学分析包括分析清蛋白融合蛋白或者特定多肽、抗原或表位与其表面上分别固定了特定多肽、抗原或表位或者清蛋白融合蛋白的芯片的结合和解离。 
结合与清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质的抗体也可在其对给定蛋白质或抗原优选它们特异结合的抗原的结合亲和力方面进行描述或说明。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4的结合亲和力。更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、107M、5x10-8M或10-8M的结合亲和力。甚至更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的结合亲和力。在优选的实施方案中，考虑到清蛋白融合蛋白（包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体）的效价和对应抗体的效价，包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白对给定蛋白质或表位的亲和力与对应的结合治疗性蛋白质的抗体（未与清蛋白融合）的亲和力相似。另外，可以常规利用本文描述的（参见实施例和表1）和本领域其它途径知道的测定法来测量清蛋白融合蛋白及其片段、变体和衍生物引发与清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分和/或清蛋白部分有关的生物学活性和/或治疗活性（或在体外或在体内）的能力。熟练技术人员还知道其它方法，而且它们在本发明的范围之内。 
清蛋白
如上所述，本发明的清蛋白融合蛋白包含治疗性蛋白质的至少一个片段或变体及人血清清蛋白的至少一个片段或变体，两者彼此相连，优选通过基因融合。 
另外的实施方案包含治疗性蛋白质的至少一个片段或变体及人血清清 蛋白的至少一个片段或变体，两者通过化学缀合彼此相连。 
术语人血清清蛋白（HSA）和人清蛋白（HA）在本文中可互换使用。术语“清蛋白”和“血清清蛋白”范围更宽，涵盖人血清清蛋白（及其片段和变体）以及来自其它的物种的清蛋白（及其片段和变体）。 
在用于本文时，“清蛋白”指清蛋白蛋白质或氨基酸序列，或者具有清蛋白的一种或多种功能活性（例如生物学活性）的清蛋白片段或变体的总体。具体而言，“清蛋白”指人清蛋白或其片段（例如参见EP 201 239、EP 322 094、WO 97/24445、WO 95/23857），尤其是如图1和SEQ ID NO：1所示的人清蛋白的成熟形式，或者来自其它脊椎动物的清蛋白或其片段，或者这些分子或其片段的类似物或变体。 
在优选的实施方案中，用于本发明的清蛋白融合蛋白的人血清清蛋白蛋白质含有下列两组点突变组合中的一组或两组：编号参考SEQ ID NO：1，Leu-407突变为Ala、Leu-408突变为Val、Val-409突变为Ala且Arg-410突变为Ala；或者Arg-410突变为A、Lys-413突变为Gln且Lys-414突变为Gln（例如参见国际公开号WO 95/23857，完整引入本文作为参考）。在甚至更优选的实施方案中，含有上述两组点突变中的一组或两组的本发明的清蛋白融合蛋白具有改进的稳定性/对酵母Yap3p蛋白水解切割的抵抗性，允许在酵母宿主细胞中表达的重组清蛋白融合蛋白的产量升高。 
在用于本文时，足以延长治疗性蛋白质的治疗活性、血浆稳定性或保存期的部分清蛋白指在长度或结构上足以稳定或延长蛋白质的治疗活性或血浆稳定性，因此清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的保存期或血浆稳定性与非融合状态的保存期或血浆稳定性相比得到了延长或延伸的部分清蛋白。清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可以包含如上所述的全长HA序列，或者可以包括其能够稳定或延长治疗活性的一个或多个片段。这种片段的长度可以是10个或更多氨基酸，或者可以包括大约15、20、25、30、50或更多的来自HA序列的连续氨基酸，或者可以包括HA的特定结构域的部分或整个。例如，可以利用跨越最初两个免疫球蛋白样结构域的一个或多个HA片段。在优选的实施方案中，HA片段是成熟形式的HA。 
本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可以是正常HA的变体。本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分也可以是本文描述的治疗性蛋白质的变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入、删除和替代，其中这种变化基本 上不改变清蛋白的渗透(oncotic)、有用的配体结合和非免疫原性特性中的一种或多种，或者赋予治疗性蛋白质以治疗活性的活性位点或活性结构域。 
具体而言，本发明的清蛋白融合蛋白可以包括人清蛋白的天然存在多态变体和人清蛋白的片段，例如EP 322094中公开的片段（即HA(Pn)，其中n是369到419）。清蛋白可以衍生自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人、牛、绵羊或猪。非哺乳动物清蛋白包括但不限于鸡和鲑鱼。清蛋白融合蛋白的清蛋白部分可来自与治疗性蛋白质部分不同的动物。 
一般而言，HA片段或变体至少长100个氨基酸，优选至少长150个氨基酸。HA变体可以由HA的至少一个完整结构域组成或者包含它，例如结构域1（SEQ ID NO：1的氨基酸1-194）、结构域2（SEQ ID NO：1的氨基酸195-387）、结构域3（SEQ ID NO：1的氨基酸388-585）、结构域1和2（SEQ ID NO：1的1-387），结构域2和3（SEQ ID NO：1的195-585）、或者结构域1和3（SEQ ID NO：1的氨基酸1-194和SEQ ID NO：1的氨基酸388-585）。每个结构域自身由两个同源子结构域组成，即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585，而子结构域间柔性接头区包含残基Lys106到Glu119、Glu292到Val315和G1u492到Ala511。 
优选的是，本发明的清蛋白融合蛋白的清蛋白部分包含至少一个HA的子结构域或结构域或其保守修饰。如果融合物以子结构域为基础，优选用一些或所有相邻接头来连接治疗性蛋白质部分。 
特异结合治疗性蛋白质的抗体也是治疗性蛋白质
本发明还涵盖包含特异结合表1中公开的治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白。明确考虑了术语“治疗性蛋白质”涵盖结合治疗性蛋白质（例如表1的第1列中所述）及其片段和变体的抗体。因此，本发明的清蛋白融合蛋白可以含有治疗性蛋白质的至少一个片段或变体和/或结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体。 
抗体结构和背景 
已知基本的抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每一对具有一条“轻链”（大约25kDa）和一条“重链”（大约50-70kDa）。每条链的氨基末端部分包括大约100到110个或更多个氨基酸的可变区，它主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分定义为恒定区，它主要负责效应物功能。人轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并分别将抗体 同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。一般参见《Fundamental Immunology》，第3-5章（Paul,W.，编，第4版，Raven Press，N.Y.，1998）（将其完整引入本文用于所有目的）。每对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点。 
因此，完整的IgG抗体具有两个结合位点。除双功能或双特异性抗体外，这两个结合位点是相同的。 
所有链都显示出相同的整体结构，即由三个高变区，也称为互补决定区或CDR，连接起来的相对保守的框架区（FR）。CDR区通常是抗体中与抗原接触并决定其特异性的部分。来自每一对的重链和轻链的CDR通过框架区而对齐，从而能够与特异表位结合。从N-末端到C-末端，轻链和重链可变区都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可变区与重链或轻链恒定区相连。每个结构域的氨基酸分配符合Kabat，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917，1987；Chothia等人，Nature 342：878-883，1989的定义。 
在用于本文时，“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异结合抗原的抗原结合位点的分子（例如含有抗体的一个或多个CDR区的分子）。可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体包括但不限于单克隆的、多特异性的、人的、人源化的或嵌合的抗体、单链抗体（例如单链Fv）、Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表达库产生的片段、抗独特型（抗Id）抗体（包括例如对本发明的抗体特异的抗Id抗体）、和任何上述的表位结合片段（例如VH结构域、VL结构域、或者一个或多个CDR区）。 
结合治疗性蛋白质的抗体 
本发明涵盖包含结合治疗性蛋白质（例如表1中所公开的）或其片段或变体的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白。 
结合治疗性蛋白质（或其片段或变体）的抗体可以来自任何动物起源，包括鸟和哺乳动物。优选的是，抗体是人、鼠（例如小鼠和大鼠）、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。最优选的是，抗体是人的抗体。在用于本文时，“人的”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，而且包括从人免疫球蛋白库和经过遗传工程改造而产生人抗体的转基因小鼠(xenomice)或其它生物体分离得到的抗体。 
结合治疗性蛋白质且可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。在优选的实施方案中，结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体分子是IgG1。在其它优选的实施方案中，结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的免疫球蛋白分子是IgG2。在其它优选的实施方案中，结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的免疫球蛋白分子是IgG4。 
最优选的是，结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体是本发明的人抗原结合抗体片段，包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv（scFv）、单链抗体、二硫键连接的Fv（sdfv）和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合抗体片段，包括单链抗体，可只包含可变区，或者连同下列的整个或部分：绞链区、CH1、CH2和CH3结构域。 
结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更高多特异性的抗体。多特异性抗体可以是对治疗性蛋白质的不同表位具有特异性，或者可以是对治疗性蛋白质以及以及异源表位诸如异源多肽或固相支持物二者都具有特异性。参见例如PCT出版物WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人，J.Immunol.147：60-69，1991；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553，1992。 
结合治疗性蛋白质（或其片段或变体）的抗体可以是双特异性或双功能性的，这意味着抗体是具有两对不同的重链/轻链和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。可以利用多种方法，包括杂交瘤融合或Fab′片段的连接来生成双特异性抗体。参见例如Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321，1990；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553，1992。另外，双特异性抗体可以以“双抗体”（Holliger等人，“′Diabodies′:small bivalent and bispecific antibody fragments”，PNAS USA 90：6444-6448，1993）或“Janusins”（Traunecker等人，“Bispecific single chain molecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells”，EMBO J 10：3655-3659，1991；及Traunecker等人，“Janusin:new molecular design for bispecific reagents”，Int. J.Cancer增刊7：51-52，1992）的形式形成。 
本发明还提供包含本文描述的或本领域其它途径知道的抗体的片段或变体（包括衍生物）的清蛋白融合蛋白。可以利用本领域技术人员知道的标准技术，包括例如导致氨基酸替代的定点诱变和PCR介导的诱变，将突变引入编码本发明分子的核苷酸序列中。优选的是，变体（包括衍生物）相对于参考VH结构域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL结构域、VLCDR1、VLCDR2、或VLCDR3编码少于50个氨基酸替代、少于40个氨基酸替代、少于30个氨基酸替代、少于25个氨基酸替代、少于20个氨基酸替代、少于15个氨基酸替代、少于10个氨基酸替代、少于5个氨基酸替代、少于4个氨基酸替代、少于3个氨基酸替代、或少于2个氨基酸替换。在具体的实施方案中，变体编码VHCDR3的替代。在一个优选的实施方案中，变体在一个或多个预测的非关键氨基酸残基处具有保守氨基酸替代。 
结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体可在其识别或特异结合的治疗性蛋白质的表位或部分方面进行描述或说明。还可以排除特异结合治疗性蛋白质或治疗性蛋白质的特定表位的抗体。因此，本发明涵盖特异结合治疗性蛋白质的抗体，并容许排除所述抗体。在优选的实施方案中，包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白与该抗体自身的未融合片段或变体结合相同的表位。 
结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体也可在其交叉反应性方面进行描述或说明。不结合治疗性蛋白质的任何其它类似物、直向同源物(ortholog)或同系物的抗体也包括在内。结合与治疗性蛋白质具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、和至少50%序列同一性（利用本领域已知的和本文描述的方法计算）的多肽的抗体也包括在本发明中。在具体的实施方案中，结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体与人蛋白质的鼠、大鼠/或兔同系物及其对应的表位发生交叉反应。不结合与治疗性蛋白质具有小于95%、小于90%、小于85%、小于80%、小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%、和小于50%序列同一性（利用本领域已知的和本文描述的方法计算）的多肽的抗体也包括在本发明中。在一个具体的实施方案中，上文所述交叉反应性涉及任何本文公开的单一的特定抗原性或免疫原性多肽，或者2、3、4、5或更多 种特定抗原性和/或免疫原性多肽的组合。在优选的实施方案中，包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白具有与该特定抗体自身的片段或变体相似或基本相同的交叉反应性特征。 
本发明还包括结合由在严谨杂交条件下（如本文所述）与编码治疗性蛋白质的多核苷酸发生杂交的多核苷酸编码的多肽的抗体。结合治疗性蛋白质且可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分结合的抗体也可在其对本发明的多肽的结合亲和力方面进行描述或说明。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4的结合亲和力。更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、107M、5x10-8M或10-8M的结合亲和力。甚至更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的结合亲和力。在优选的实施方案中，考虑到清蛋白融合蛋白（包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体）的效价和对应抗体的效价，包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白对给定蛋白质或表位的亲和力与对应的结合治疗性蛋白质的抗体（未与清蛋白融合）的亲和力相似。 
本发明还提供了根据本领域已知的用于测定竞争性结合的任何方法例如本文描述的免疫测定法的测定，竞争性抑制抗体对治疗性蛋白质的表位的结合的抗体。在优选的实施方案中，抗体竞争性抑制了至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、或至少50%对表位的结合。在优选的实施方案中，包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白竞争性抑制二抗对治疗性蛋白质的表位的结合。在其它优选的实施方案中，包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白竞争性抑制至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、或至少50%二抗对治疗性蛋白质的表位的结合。 
结合治疗性蛋白质且可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体可以作为治疗性蛋白质的激动剂或拮抗剂起作用。例如，本发明包括部分或完全中断受体/配体与本发明的多肽相互作用的抗体。本发明的特色不但有受体特异性抗体，而且有配体特异性抗体。本发明的特色还有不 阻止配体结合但阻止受体活化的受体特异性抗体。可以利用本文描述的或本领域其它途径知道的技术来确定受体活化（即信号传导）。例如，通过免疫沉淀和随后的蛋白质印迹分析（例如上文所述）检测受体或其底物的磷酸化（例如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸）可以确定受体活化。在具体的实施方案中，提供了将配体活性或受体活性相对于不存在抗体时的活性抑制了至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、或至少50%的抗体。在优选的实施方案中，包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白在阻止配体结合和/受体活化方面性具有与结合治疗性蛋白质的抗体的未融合片段或变体相似或基本相似的特征。 
本发明的特色还有阻止配体结合和受体活化二者的受体特异性抗体，以及识别受体-配体复合物的抗体，且优选不特异性识别未结合的受体或未结合的配体。同样地，本发明包括结合配体且阻止配体与受体结合的中和性抗体，以及结合配体由此阻止受体活化但不阻止配体与受体结合的抗体。本发明还包括活化受体的抗体。这些抗体可以作为受体激动剂，即强化或活化配体介导的受体活化的生物学活性的全部或子集，例如通过诱导受体的二聚化。可以指定抗体是生物学活性包括治疗性蛋白质（例如表1中所公开的）的特定生物学活性的激动剂、拮抗剂或反相激动剂。利用本领域已知的方法可以生成上述抗体激动剂。例如参见PCT出版物WO 96/40281；美国专利号5,811,097；Deng等人，Blood 92(6)：1981-1988，1988；Chen等人，Cancer Res.58(16)：3668-3678，1998；Harrop等人，J.Immunol.161(4)：1786-1794，1998；Zhu等人，Cancer Res.58(15)：3209-3214，1998；Yoon等人，J.Immunol.160(7)：3170-3179，1998；Prat等人，J.Cell.Sci.111(Pt2)：237-147，1998；Pitard等人，J.Immunol.Methods 205(2)：177-190，1997；Liautard等人，Cytokine 9(4)：233-241，1997；Carlson等人，J.Biol.Chem.271(17)：11295-11301，1997；Taryman等人，Neuron 14(4)：755-762，1995；Muller等人，Structure 6(9)：1153-1167，1998；Bartunek等人，Cytokine 8(1)：14-20，1996（将它们都完整引入本文作为参考）。在优选的实施方案中，包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白具有与结合治疗性蛋白质的抗体的未融合片段或变体相似或基本相同的激动剂或拮抗剂特性。 
例如，可以利用结合治疗性蛋白质且可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体来纯化、检测、和靶向治疗性蛋白质，包括体外 和体内的诊断和治疗方法。例如，抗体可用于定性和定量测量生物学样本中治疗性蛋白质的水平的免疫测定法。例如参见Harlow等人，《Antibodies:A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988，将其完整引入本文作为参考。同样地，例如，可以利用包含结合治疗性蛋白质的抗体的至少一个片段或变体的清蛋白融合蛋白来纯化、检测、和靶向治疗性蛋白质，包括体外和体内的诊断和治疗方法。 
结合治疗性蛋白质且可对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体包括经过修饰的衍生物，即通过将任何类型的分子共价附着于抗体。例如而非限制，抗体衍生物包括例如通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接等经过修饰的抗体。可以利用已知的技术来进行多种化学修饰中的任何一种，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。也可以如上所述修饰本发明的清蛋白融合蛋白。 
生成结合治疗性蛋白质的抗体的方法 
可以通过本领域已知的任何适当的方法来生成结合治疗性蛋白质且可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体。可以通过本领域众所周知的各种程序来生成针对目的抗原的多克隆抗体。例如，可以给各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，施用治疗性蛋白质以诱导产生含有对抗原特异的多克隆抗体的血清。根据宿主物种，可以利用各种佐剂来提高免疫应答，包括但不限于弗氏（完全和不完全）佐剂、矿物凝胶剂诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、多聚阴离子、肽、油乳状液、钥孔 
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血蓝蛋白、二硝基酚、和潜在有用的人佐剂诸如BCG（卡介苗）和小棒杆菌。这种佐剂也是本领域众所周知的。 
可以利用本领域已知的多种技术，包括利用杂交瘤、重组体、和噬菌体展示技术或其组合，来制备单克隆抗体。例如，可以利用杂交瘤技术，包括本领域已知的和例如Harlow等人，《Antibodies:A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988；Hammering等人，在《Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas》中，页码563-681，Elsevier，N.Y.，1981（将所述参考文献完整引入作为参考）中教导的杂交瘤技术，来生成单克隆抗体。术语“单克隆抗体”在用于本文时并不限于通过杂交瘤技术产生的抗 体。术语“单克隆抗体”指衍生自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆，而不是指生成它的方法。 
利用杂交瘤技术生成和筛选特异抗体的方法在本领域是常规的且众所周知的。在非限制性实例中，可以用治疗性蛋白质或其片段或变体、清蛋白融合蛋白、表达这种治疗性蛋白质或其片段或变体或者清蛋白融合蛋白的细胞免疫小鼠。一旦检测出免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对抗原特异的抗体，就收获小鼠的脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何适当的骨髓瘤细胞，例如来自可从ATCC获得的细胞系SP20的细胞，进行融合。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆，以选择出分泌能结合本发明多肽的抗体的细胞。用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠可以产生通常含有高水平抗体的腹水。 
因此，本发明提供了生成单克隆抗体的方法，以及通过包括下列步骤的方法生成的抗体，即培养分泌抗体的杂交瘤细胞，其中优选的是，杂交瘤是通过将由经本发明抗原免疫的小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合而生成的，然后对融合产生的杂交瘤筛选分泌能结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。 
用于生成多克隆和单克隆两种人B细胞系的另一种众所周知的方法是利用埃巴二氏病毒（EBV）进行的转化。用于生成EBV转化B细胞系的方案是本领域普遍知道的，诸如例如Coligan等人，编，《Current Protocols in Immunology》，1994，John Wiley & Sons，NY，7.22章概述的方案，将其完整引入本文作为参考。转化用B细胞的来源一般是人外周血，但转化用B细胞也可衍生自其它来源，包括但不限于淋巴结、扁桃体、脾脏、肿瘤组织、和受感染组织。在EBV转化前，通常先将组织制成单细胞悬浮液。另外，在含有B细胞的样品中可以采取一些步骤物理清除或灭活T细胞（例如用环孢菌素A处理），因为来自血清抗EBV抗体呈阳性的个体的T细胞可抑制EBV引起的B细胞永生化。 
通常，用EBV接种含有人B细胞的样品，并培养3-4周。EBV的典型来源是B95-8细胞系（ATCC编号VR-1492）的培养物上清液。3-4周培养期接近结束时，通常可以看见EBV转化的物理迹象。通过相差显徽镜观察，转化细胞可表现为大、清晰、毛状、且倾向于在紧密细胞群中聚集。最初，EBV系通常是多克隆的。然而，在延长细胞培养时间后，EBV系可由于特定B细胞克隆的选择性生长而变成单克隆或多克隆的。或者，可以对多克隆 的EBV转化系进行亚克隆（例如通过有限稀释培养），或者与适当的融合配偶体融合并以有限稀释进行涂布以获得单克隆的B细胞系。EBV转化细胞系的适当融合配偶体包括小鼠骨髓瘤细胞系（例如SP2/0、X63-Ag8.653）、杂骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系（人x小鼠；例如SPAM-8、SBC-H20和CB-F7）和人细胞系（例如GM1500、SKO-007、RPMI 8226和KR4）。因此，本发明还提供了生成针对本发明的多肽或其片段的多克隆或单克隆人抗体的方法，包括人B细胞的EBV转化。 
可以通过已知的技术来制备识别特定表位的抗体片段。例如，可以利用酶，诸如木瓜蛋白酶（产生Fab片段）或胃蛋白酶（产生F(ab′)2片段），通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割来生成本发明的Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。 
例如，还可以利用本领域已知的各种噬菌体展示方法来生成结合治疗性蛋白质的抗体。在噬菌体展示方法中，将功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。在一个具体的实施方案中，这种噬菌体可以用来展示由全集或组合抗体库（例如人或鼠的）表达的抗原结合结构域。可以用抗原，例如标记抗原或者结合或捕获在固体表面或珠子上的抗原来选择或鉴定表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体典型的是包括fd和M13在内的丝状噬菌体，其中由具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的噬菌体表达的结合结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合。可用于生成结合治疗性蛋白质的抗体的噬菌体展示方法的实例包括Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50，1995；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186，1995；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958，1994；Persic等人，Gene 187：9-18，1997；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280，1994；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT出版物WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的方法，将每一篇完整引入本文作为参考。 
如上述参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以从噬菌体分离抗体编码区，并用来生成完整的抗体，包括人抗体或任何其它想要的抗原结合片段， 而且可以在任何期望宿主中进行表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、和细菌，例如下文所详细描述的。例如，利用本领域已知的方法，诸如PCT出版物WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869，1992；Sawai等人，AJRI 34：26-34，1995；及Better等人，Science 240：1041-1043，1988中所公开的，也可以采用重组生成Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术（将所述参考文献完整引入作为参考）。 
可用于生成单链Fv和抗体的技术的实例包括美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88，1991；Shu等人，PNAS 90：7995-7999，1993；及Skerra等人，Science 240：1038-1040，1988中所描述的。对于有些用途，包括抗体在人体中的体内用途和体外检测测定法，可能优选使用嵌合的、人源化的或人的抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，诸如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生成嵌合抗体的方法是本领域已知的。例如参见Morrison，Science 229：1202，1985；Oi等人，BioTechniques 4：214，1986；Gillies等人，J.Immunol.Methods 125：191-202，1989；美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816397，将它们完整引入本文作为参考。人源化抗体是来自结合期望抗原的非人物种抗体、具有一个或多个来自非人物种的互补决定区（CDR）和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子。经常用来自CDR供体抗体的相应残基替代人框架区中的框架残基，以改变，优选改善与抗原的结合。利用本领域众所周知的方法可以鉴定这些框架替代，例如建立CDR和框架残基相互作用的模型以鉴定对抗原结合重要的框架残基，以及比较序列以鉴定特定位置处不常见的框架残基。（例如参见Queen等人，美国专利号5,585,089；Riechmann等人，Nature 332：323，1988，将它们完整引入本文作为参考)。可以利用本领域已知的多种方法将抗体人源化，包括例如CDR嫁接（EP 239,400；PCT出版物WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089）、饰面(veneering)或重修表面(resurfacing)（EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498，1991；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814，1994；Roguska等人，PNAS 91：969-973，1994）和链改组（美国专利号5,565,332）。 
完全人的抗体是治疗人类患者特别想要的。可以通过本领域已知的多种方法，包括如上所述的利用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示 方法来生成人抗体。也可参见美国专利号4,444,887和4,716,111；PCT出版物WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，将每一篇完整引入本文作为参考。 
也可以利用不能表达功能性内源免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来生成人抗体。例如，可以随机的或通过同源重组将人免疫球蛋白重链和轻链基因复合物导入小鼠胚胎干细胞。或者，除人重链和轻链基因之外，还可将人可变区、恒定区和多样性区域导入小鼠胚胎干细胞中。通过同源重组导入人免疫球蛋白基因座，可分别或同时使小鼠免疫球蛋白重链和轻链无功能。具体而言，JH区的纯合缺失阻止生成内源抗体。扩增经过修饰的胚胎干细胞，并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。以正常方式，用选择的抗原，例如本发明的多肽的整个或部分免疫转基因小鼠。利用常规的杂交瘤技术可从经过免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，利用这一技术，有可能生成在治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。用于生成人抗体的这种技术的概述可参见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93，1995。用于生成人抗体和人单克隆抗体的这种技术的详细讨论，以及用于生成这种抗体的方案可参见PCT出版物WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利号0 598 877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181和6,114,598，将它们完整引入本文作为参考。另外，可以雇佣诸如Abgenix（Freemont，CA）和Genpharm（San Jose，CA）等公司利用与上文所述相似的技术来提供针对选定抗原的人抗体。 
利用称为“导向选择”的技术可以生成识别选定表位的完全人的抗体。在该方法中，利用选定的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，来引导选择识别相同表位的完全人的抗体（Jespers等人，Bio/technology 12：899-903，1988）。 
编码抗体的多核苷酸 
本发明还提供了包含编码抗体及其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还涵盖在例如上文定义的严谨或低严谨杂交条件下与编码抗体的多核苷酸发生杂交的多核苷酸，其中优选特异性结合治疗性蛋白质的抗体，更优选结合具有表2的“SEQ ID NO：Z”列中公开的“治疗性蛋白质X”的氨基 酸序列的多肽的抗体。 
可通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸和测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么可以从化学合成的寡核苷酸装配编码该抗体的多核苷酸（例如如Kutmeier等人，BioTechniques 17：242，1994中所述），简单说来，它涉及合成含有编码抗体的部分序列的交叠寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接后的寡核苷酸。 
或者，可以从来自适当来源的核酸生成编码抗体的多核苷酸。如果不能得到含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列是已知的，那么可以化学合成编码免疫球蛋白的核酸，或者利用与序列的3′和5′端发生杂交的合成引物通过PCR扩增而从适当来源（例如抗体cDNA库，或者从表达该抗体的任何组织或细胞，诸如选择表达抗体的杂交瘤细胞生成的cDNA库或由其分离的核酸，优选polyA+RNA）获得或利用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针进行的克隆来鉴定，例如来自编码抗体的cDNA库的cDNA克隆。然后可利用本领域众所周知的任何方法将通过PCR生成的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中（参见实施例65）。 
一旦测定了抗体的核苷酸序列和对应的氨基酸序列，可以利用本领域众所周知的用于操作核苷酸序列的方法来操作抗体的核苷酸，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等等（例如参见Sambrook等人，1990，《Molecular Cloning,A Laboratory Manual》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等人，编，1998，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley & Sons，NY中描述的技术，将它们完整引入本文作为参考），以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸替代、删除/或插入。 
在一个具体的实施方案中，通过本领域众所周知的方法，例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较以确定序列高变区，可以检查重链和/或轻链可变区的氨基酸序列以鉴定互补决定区（CDR）的序列。利用常规的重组DNA技术，可以将一个或多个CDR插入到框架区内，例如人的框架区，使非人抗体人源化，正如上文所述。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人的框架区（例如参见Chothia等人，J.Mol.Biol.278：457-479，1998列出的人框架区）。优选的是，通过组合框架区和CDR产生的多核苷酸编码特异结合本发明多肽的抗体。优选的是，如上所述，可以在框架区内产生一个或多个氨基酸替代，优选的是，氨基酸替代改进了抗体对 其抗原的结合。另外，可以用这种方法对参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基进行氨基酸替代或删除以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。本发明涵盖对多核苷酸的其它改变，而且它们也在本领域的技术范围内。 
另外，可以利用为了生成“嵌合抗体”而开发的技术（Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855，1984；Neuberger等人，Nature 312：604-608，1984；Takeda等人，Nature 314：452-454，1985），即将来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起。如上所述，嵌合抗体是不同部分衍生自不同动物物种的分子，诸如那些具有衍生自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，例如人源化抗体。 
或者，可以使描述用于制备单链抗体的技术（美国专利号4,946,778；Bird，Science 242：423-42，1988；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988；及Ward等人，Nature 334：544-54，1989）适于生成单链抗体。通过氨基酸桥将Fv区的重链和轻链片段连接起来，产生单链多肽，由此形成单链抗体。也可以使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术（Skerra等人，Science 242：1038-1041，1988）。 
抗体的重组体表达 
抗体或其片段、衍生物或类似物（例如抗体的重链或轻链或者单链抗体）的重组表达需要构建含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。一旦得到编码本发明的抗体分子或者抗体重链或轻链或其部分（优选含有重链或轻链可变区）的多核苷酸，就可利用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术生成用于生产抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以利用本领域技术人员众所周知的方法来构建含有抗体编码序列及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了包含与启动子可操作连接的编码本发明的抗体分子或其重链或轻链或者重链或轻链可变区的核苷酸序列的可复制载体。这种载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列（例如参见PCT出版物WO 86/05807；PCT出版物WO 89/01036；和美国专利号5,122,464），而且为了表达整个重链或轻链，可以将抗体的可变区克隆到这一载体中。 
通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规方法培养转染细胞以产生抗体。因此，本发明包括含有与异源启动子可操作连接的编码本发明的抗体分子或其重链或轻链或者单链抗体的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗体的优选实施方案中，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链二者的载体以表达整个免疫球蛋白分子，正如下文所详述的。 
可以利用多种宿主-表达载体系统来表达本发明的抗体分子。这种宿主-表达系统代表了可以生成并随后纯化目的编码序列的媒介，也代表了在用合适的核苷酸编码序列转化或转染后可原位表达本发明的抗体分子的细胞。它们包括但不限于经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物诸如细菌（例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）；经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母（例如糖酵母属、毕赤酵母属）；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体（例如杆状病毒）感染的昆虫细胞系统；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体（例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV）感染或经含有抗体编码序列的重组质粒表达载体（例如Ti质粒）转化的植物细胞系统；或包含含有衍生自哺乳动物细胞基因组（例如金属硫蛋白启动子）或哺乳动物病毒（例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子）的启动子的重组表达构建物的哺乳动物细胞系统（例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞）。优选的是，使用细菌细胞，诸如大肠杆菌，更优选真核细胞，尤其为了表达整个重组抗体分子时，来表达重组抗体分子。例如，诸如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等哺乳动物细胞连同诸如来自人细胞巨化病毒的主要中间早期基因启动子元件等载体是有效的抗体表达系统（Foecking等人，Gene 45：101，1986；Cockett等人，Bio/Technology 8：2，1990）。 
在细菌系统中，根据所表达抗体分子的预期用途，可以方便的选择多种表达载体。例如，在制备大量的这种蛋白质以生成抗体分子的药物组合物时，可能想要指导容易纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这种载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278（Ruther等人，EMBO J.2：1791，1983），其中可将抗体编码序列个别连接到载体中且读码框与lacZ编码区相同从而生成融合蛋白；pIN载体（Inouye和Inouye，NucleicAcids Res.13：3101-3109，1985；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509，1989）等等。也可以用pGEX载体来表达与谷胱甘肽S-转移酶（GST）形成融合蛋白的外 源多肽。一般说来，这种融合蛋白是可溶的，而且通过与基质谷胱甘肽-琼脂糖珠子的吸附和结合以及随后在存在游离谷胱甘肽时的洗脱可容易的从溶解细胞中纯化出来。将pGEX载体设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放出来。 
在昆虫系统中，利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus）（AcNPV）作为载体来表达外源基因。病毒在草地夜蛾（Spondoptera frugiperda）细胞中生长。可以将抗体编码序列个别克隆到病毒的非必需区（例如多角体蛋白基因）中，并置于AcNPV启动子（例如多角体蛋白启动子）的控制下。 
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。如果使用腺病毒作为表达载体，可以将目的抗体编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物例如晚期启动子和三联前导序列连接。然后通过体外或体内重组可以将嵌合基因插入腺病毒基因组中。病毒基因组非必需区（例如E1或E3区）中的插入将产生能存活且能够在受感染宿主中表达抗体分子的重组病毒。（例如参见Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359，1984）。为了有效翻译插入的抗体编码序列还可能需要特定起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻接的序列。而且，起始密码子必须与期望编码序列的读码框同相以保证整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，天然的和合成的二者皆可。通过包含合适的转录增强元件、转录终止子等可以增强表达效率（参见Bittner等人，Methods in Enzymol.153：51-544，1987）。 
另外，可以选择以想要的特定方式调控插入序列的表达，或者修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰（例如糖基化）和加工（例如切割）对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有特征性的和特异的蛋白质和基因产物翻译后加工和修饰机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以保证所表达外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有正确加工初始转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机构的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138，特别是乳癌细胞系，诸如例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常乳腺细胞系，诸如例如CRL7030和Hs578Bst。 
为了长期、高产量的生产重组蛋白质，优选稳定的表达。例如，可以改造 稳定表达抗体分子的细胞系。与其利用含有病毒复制起源的表达载体，还不如用受到合适表达控制元件（例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等等）控制的DNA和选择标记转化宿主细胞。在导入外源DNA后，可以允许经过改造的细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后换成选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予选择以抗性，而且允许细胞将质粒稳定的整合到它们的染色体中并生长形成焦点(foci)，继而可以克隆并扩增为细胞系。可以方便的利用该方法来改造表达抗体分子的细胞系。这种经过改造的细胞系在筛选和评估直接或间接与抗体分子相互作用的化合物方面特别有用。 
可以利用许多选择系统，包括但不限于可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶（Wigler等人，Cell 11：223，1977）、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（Szybalska和Szybalski，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 48：202，1992）和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（Lowy等人，Cell 22：817，1980）基因。而且，抗代谢物抗性也可以作为选择下列基因的基础：赋予氨甲蝶呤抗性的dhfr（Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77：357，1980；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527，1981）；赋予霉酚酸抗性的gpt（Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072，1981）；赋予氨基葡糖苷G-41抗性的neo（Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95，1991；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596，1993；Mulligan，Science 260：926-932，1993；及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217，1993；May，TIB TECH 11(5)：155-215，1993）；及赋予潮霉素抗性的hygro（Santerre等人，Gene 30：147，1984）。本领域普遍知道的重组DNA技术的方法可常规用于选择想得到的重组克隆，这些方法描述于例如Ausubel等人，编，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley & Sons，NY，1993；Kriegler，《Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual》，Stockton Press，NY，1990；及Dracopoli等人，编，《Current Protocols in Human Genetics》，第12和13章，John Wiley & Sons，NY，1994；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Bio1.150：1，1981，将它们完整引入本文作为参考。 
可以通过载体扩增来提高抗体分子的表达水平（综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷，Academic Press， New York，1987）。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，提高宿主细胞培养基中抑制剂的水平将增加标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与抗体基因有关，因此抗体的产量也将提高（Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257，1983）。 
可以在存在药物硫代甲硫氨酸(methionine sulphoximine)或氨甲蝶呤时分别扩增利用谷氨酰胺合酶（GS）或DHFR作为选择标记的载体。基于谷氨酰胺合酶的载体的优点是可利用谷氨酰胺合酶阴性细胞系（例如鼠骨髓瘤细胞系，NS0）。谷氨酰胺合酶表达系统还可以通过提供防止内源基因发挥功能的额外抑制剂在谷氨酰胺合酶表达细胞（例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞）中起作用。在PCT出版物WO 87/04462；WO 86/05807；WO 89/01036；WO 89/10404和WO 91/06657中详述了谷氨酰胺合酶表达系统及其成分，将它们完整引入本文作为参考。另外，可依照本发明使用的谷氨酰胺合酶表达载体可从包括Lonza Biologics公司（Portsmouth，NH）在内的供应商处购买。Bebbington等人，Bioltechnology 10：169，1992及Biblia和Robinson，Biolechnol.Prog.11：1，1995中描述了利用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达和生产单克隆抗体，在此将它们完整引入本文作为参考。 
可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，其中第一种载体编码重链衍生的多肽，而第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可以含有使得重链和轻链多肽等量表达的相同选择标记。或者，也可以使用编码且能够重链和轻链多肽二者的单一载体。在这些情形中，轻链应置于重链之前，以避免有毒游离重链过量（Proudfoot，Nature 322：52，1986；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197，1980）。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。 
一旦通过动物、化学合成或重组表达生成了本发明的抗体分子，就可以利用本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化，例如通过层析（例如离子交换、亲和力特别是在蛋白质A之后对特定抗原的亲和力、和排阻(sizing)柱层析）、离心、差别可溶性、或用于纯化蛋白质的任何其它标准技术。另外，可以将结合治疗性蛋白质且可对应于本发明的清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体或其片段与本文描述的或本领域其它途径知道的异源多肽序列融合以促进纯化。 
抗体的修饰 
可以将结合治疗性蛋白质或其片段或变体的抗体与标记序列诸如肽融合以促进纯化。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六聚组氨酸肽，诸如pQE载体（QIAGEN,Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA 91311）等中提供的标签，其中许多可以通过商业途径获得。正如例如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824，1989中所述，六聚组氨酸为融合蛋白提供了方便的纯化。其它对纯化有用的肽标签包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白质的表位的血凝素标签（也称为“HA标签”）（Wilson等人，Cell 37：767，1984）和“flag”标签。 
本发明还涵盖与诊断剂或治疗剂缀合的抗体或其片段。抗体可在诊断上用于例如作为临床检验程序的一部分监测肿瘤的发展或进展，从而例如测定给定治疗方案的效力。通过将抗体与可检测物质偶联可促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性物质、利用各种正电子发射断层成像术的正电子发射金属、和非放射性的顺磁性金属离子。利用本领域已知的技术，可以将可检测物质直接的或通过中间物（诸如例如本领域已知的接头）间接的与抗体（或其片段）偶联或缀合。可与抗体缀合从而依照本发明用作诊断剂的金属离子可参见例如美国专利号4,741,900。适当的酶的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适当的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；而适当的放射性物质的实例包括125I、131I、111I或99Tc。本文其它地方还描述了可检测物质的其它实例。 
另外，可将本发明的抗体与治疗性模块缀合，诸如细胞毒素，例如抑制细胞剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子，例如α-发射体，诸如例如213Bi。细胞毒素或胞毒剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷（鬼臼乙叉苷，etoposide）、替尼泊苷（鬼臼噻吩苷，tenoposide）、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗 代谢物（例如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺）、烷化剂（例如二氯甲基二乙胺（氮芥）、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀（BSNU）和洛莫司汀（CCNU）、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺二氯二氨络铂（II）（DDP）顺铂）、蒽环类抗生素（例如柔红霉素（以前称为道诺霉素）和阿霉素）、抗生素（例如更生霉素（以前称为放线菌素），博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素（AMC））和抗有丝分裂剂（例如长春新碱和长春花碱）。 
本发明的缀合物可用于修饰给定的生物学应答，并不认为治疗剂或药物模块限于经典的化学治疗剂。例如，药物模块可以是具有期望生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括例如毒素，诸如相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂、例如TNF-α、TNF-β、AIM I（参见国际公布号WO 97/33899）、AIM II（参见国际公布号WO 97/34911）、Fas配体（Takahashi等人，Int.Immunol.6：1567-1574，1994）、VEGI（参见国际公布号WO 99/23105）、血栓形成剂或抗血管发生剂，例如血管他丁或内皮他丁；或生物学应答修饰剂，诸如例如淋巴因子、白介素-1（“IL-1”）、白介素-2（“IL-2”）、白介素-6（“IL-6”）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（“GM-CSF”）、粒细胞集落刺激因子（“G-CSF”）或其它生长因子。 
还可以将抗体附着于固相支持物，这对靶抗原的免疫测定法或纯化是特别有用的。这种固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。 
用于将治疗性模块与抗体缀合的技术是众所周知的。例如参见Amon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，在《Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy》中，Reisfeld等人，编，页码243-56，Alan R.Liss,Inc.，1985；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，在《Controlled Drug Delivery》中，第2版，Robinson等人，编，页码623-53，Marcel Dekker,Inc.，1987；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，在《Monoclonal Antibodies ′84:Biological And Clinical Applications》中，Pinchera等人，编，页码475-506，1985；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of  Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，在《Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy》，Baldwin等人，编，页码303-16，Academic Press，1985；及Thorpe等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.62：119-58，1982。 
或者，如Segal在美国专利号4,676,980中所述，可将抗体与二抗缀合以形成抗体异源缀合物，将其完整引入本文作为参考。 
单独或者连同细胞毒性因子和/或细胞因子施用的、缀合或未缀合治疗性模块的抗体可用作治疗剂。 
抗体-清蛋白融合物 
结合治疗性蛋白质并可对应于本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体包括但不限于结合表1“治疗性蛋白质X”列中公开的治疗性蛋白质的抗体，或其片段或变体。 
在具体的实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含VH结构域或由其组成。在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含1、2或3个VHCDR或由其组成。在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含VHCDR1或由其组成。在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含VHCDR2或由其组成。在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含VHCDR3或由其组成。 
在具体的实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含VL结构域或由其组成。在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含1、2或3个VLCDR或由其组成。在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含VLCDR1或由其组成。在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含VL CDR2或由其组成。在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含VLCDR3或由其组成。 
在其它实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含1、2、3、4、5或6个VH和/或VL CDR或由其组成。 
在优选的实施方案中，所述免疫特异性结合治疗性蛋白质并对应于清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的片段或变体包含scFv或由其组成，所述scFv包含通过诸如(Gly4Ser)3（SEQ ID NO：4）等肽接头连接的治疗性抗体VL结构域和治疗性抗体VH结构域。 
免疫分型 
至少包含结合治疗性蛋白质（或其片段或变体）的抗体的片段或变体的本发明抗体或本发明清蛋白融合蛋白可用于细胞系和生物学样品的免疫分型。本发明的治疗性蛋白质可用作细胞特异标志物，或更具体的说就是在特定细胞类型的不同分化和/或成熟阶段差异表达的细胞标志物。针对特定表位或表位组合的单克隆抗体（或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白）将容许筛选表达标志物的细胞群。可利用多种技术使用单克隆抗体（或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白）来筛选表达标志物的细胞群，包括使用抗体包被的磁珠的磁分离、用附着于固体基质（即板）上的抗体的“淘选”、及流式细胞术（参见例如美国专利5,985,660；及Morrison等人，Cell 96：737-49，1999）。 
这些技术容许筛选特定细胞群，诸如可发现血液学恶性肿瘤（即急性白血病患者中的轻微后遗症(MRD)）和移植中“非自身”细胞以预防移植物抗宿主病(GVHD)。或者，这些技术容许筛选能够进行增殖和/或分化的造血干细胞和祖细胞，如可在人脐带血中发现。 
鉴定结合治疗性蛋白质的抗体和包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白 
本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质（或其片段或变体）的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白可以多种方式进行鉴定。具体而言，可使用本文描述的技术或常规修改本领域已知的技术，对至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白测定特异性结合由 如下抗体特异结合的相同抗原的能力，所述抗体结合与结合清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体对应的治疗性蛋白质。 
用于本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质（或其片段或变体）的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白（特异性）结合特定蛋白质或表位的能力的测定可在溶液中（如Houghten，Bio/Techniques 13：412-421，1992）、在珠上（如Lam，Nature 354：82-84，1991）、在芯片上（如Fodor，Nature 364：555-556，1993）、在细菌上（如美国专利号5,223,409）、在孢子上（如专利号5,571,698；5,403,484；和5,223,409）、在质粒上（如Cull等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869，1992）、或在噬菌体上（如Scott和Smith，Science 249：386-390，1990；Devlin，Science 249：404-406，1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382，1990；及Felici，J.Mol.Biol.222：301-310，1991）进行（将这些参考文献的每一篇完整引入本文作为参考）。使用或常规修改本文描述的或本领域其它途径知道的技术，也可对本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质（或其片段或变体）的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白测定它们对特定蛋白质或表位的特异性和亲和力。 
可通过本领域知道的任何方法，对至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白测定与其它抗原（例如与由如下抗体特异性结合的分子具有序列/结构保守性的分子，所述抗体结合与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质（或其片段或变体））的交叉反应性。 
可用于分析（免疫特异性）结合和交叉反应性的免疫测定法包括但不限于，使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的竞争性和非竞争性测定系统，仅举了几个例子。这样的测定法是常规的且在本领域是众所周知（参见例如Ausubel等人编，1994，《Current Protocols in Molecular Biology》，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.，New York，将其完整引入本文作为参考）。例示性免疫测定法简述于下文（但并不旨在作为限制）。 
免疫沉淀方案通常包括在诸如补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂 （如EDTA、PMSF、抑酶肽、钒酸钠）的RIPA缓冲液（1%NP-40或Triton X-100、1%去氧胆酸钠、0.1%SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠pH7.2、1%Trasylol）等裂解缓冲液中裂解细胞群，向细胞裂解液中添加本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质（或其片段或变体）的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白，于40℃保温一段时间（例如1-4小时），向细胞裂解液中添加蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠（或在至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白的情况中，经合适抗独特型抗体或抗清蛋白抗体包被的珠），于40℃保温约1小时或更久，在裂解缓冲液中清洗珠子并将珠子重悬于SDS/样品缓冲液中。可通过例如蛋白质印迹分析来评估本发明抗体或清蛋白融合蛋白免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员应当知道能进行修改以增加抗体或清蛋白融合蛋白与抗原结合并降低背景的参数（如用琼脂糖珠预清除细胞裂解液）。关于免疫沉淀方案的进一步讨论参见例如Ausubel等人编，1994，《Current Protocols in Molecular Biology》，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.，New York，10.16.1。 
蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶（例如8%-20%SDS-PAGE，取决于抗原的分子量）中对蛋白质样品进行电泳，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到诸如消化纤维、PVDF或尼龙等膜上，在封闭液（例如含3%BSA或脱脂奶的PBS）中封闭膜，在清洗缓冲液（例如PBS-Tween 20）中清洗膜，将本发明的抗体或清蛋白融合蛋白（在封闭缓冲液中稀释）施加到膜上，在清洗缓冲液中清洗膜，施加在封闭缓冲液中稀释的缀合有酶底物（例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或放射性分子（例如32P或125I）的二抗（它识别清蛋白融合蛋白，例如抗人血清清蛋白抗体），在清洗缓冲液中清洗膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员应当知道能进行修改以提高检测的信号并降低背景噪声的参数。关于蛋白质印迹方案的进一步讨论参见例如Ausubel等人编，1994，《Current Protocols in Molecular Biology》，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.，New York，10.8.1。 
ELISA包括制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，洗去未结合到孔上的抗原，向孔中添加缀合有诸如酶底物（例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）等可检测化合物的本发明抗体或清蛋白融合蛋白（至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体）并保温一段时间，洗去未结合或非特异性结合的清蛋白融合蛋白，并检测特异性结合包被孔的抗原的抗体或清蛋白融 合蛋白的存在。在ELISA中，抗体或清蛋白融合蛋白并非一定要缀合可检测化合物；相反，可向孔中添加将缀合有可检测化合物的二抗（它分别识别抗体或清蛋白融合蛋白）。此外，可用抗体或清蛋白融合蛋白包被到孔上以代替用抗原包被孔。在此情况中，可检测分子可以是缀合有诸如酶底物（例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）等可检测化合物的抗原。本领域技术人员应当知道能进行修改以提高检测的信号的参数，以及本领域知道的ELISA的其它变型。关于ELISA的进一步讨论参见例如Ausubel等人编，1994，《Current Protocols in Molecular Biology》，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.，New York，11.2.1。 
可通过竞争性结合测定法来测定清蛋白融合蛋白与蛋白质、抗原或表位的结合亲和力以及抗体或清蛋白融合蛋白-蛋白质/抗原/表位相互作用的解离速率(off-rate)。竞争性结合测定法的一个例子是放射免疫测定法，包括在存在渐增量的未标记抗原时将经标记抗原（如3H或125I）和本发明的抗体或清蛋白融合蛋白一起保温，并检测与经标记抗原结合的抗体。可通过斯卡恰特作图分析的数据来测定本发明抗体或清蛋白融合蛋白与特定蛋白质、抗原或表位的亲和力及结合解离速率。也可使用放射免疫测定法来测定与所述抗体或清蛋白融合蛋白结合相同蛋白质、抗原或表位的第二蛋白质的竞争。在此情况中，在存在渐增量的与本发明清蛋白融合蛋白结合相同蛋白质、抗原或表位的未标记第二蛋白质时，将蛋白质、抗原或表位与缀合有已标记化合物（如3H或125I）的本发明抗体或清蛋白融合蛋白一起保温。 
在一个优选的实施方案中，使用BIAcore动力学分析来测定本发明抗体或清蛋白融合蛋白与蛋白质、抗原或表位结合的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗体、清蛋白融合蛋白或特定多肽、抗原或表位与芯片的结合和解离，其中芯片的表面上分别固定有特定多肽、抗原或表位、抗体或清蛋白融合蛋白。 
治疗性用途 
本发明还致力于基于抗体的疗法，它包括将本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白施用于动物，优选哺乳动物，最优选人患者，用于治疗一种或多种公开的疾病、紊乱或状况。本发明的治疗性化合物包括但不限于本发明的抗体（包括本文描述的其片段、类似物和衍生物）、编码本发明抗体（包括本文描述的其片段、类似 物和衍生物及抗独特型抗体）的核酸、至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白及编码这样的清蛋白融合蛋白的核酸。本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白可用于治疗、抑制或预防与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱或状况，包括但不限于任何一种或多种本文描述的疾病、紊乱或状况。与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱或状况的治疗和/或预防包括但不限于减轻与那些疾病、紊乱或状况有关的症状。本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白可在本领域知道的或本文描述的制药学可接受组合物中提供。 
一个具体且优选的实施方案中，本发明致力于基于抗体的疗法，它包括将本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白施用于动物，优选哺乳动物，最优选人患者，用于治疗一种或多种疾病、紊乱或状况，包括但不限于：神经紊乱、免疫系统紊乱、肌肉紊乱、生殖紊乱、胃肠紊乱、肺紊乱、心血管紊乱、肾紊乱、增殖性紊乱、和/或癌性疾病和状况，和/或本文其它地方所描述的。本发明的治疗性化合物包括但不限于本发明的抗体（例如针对在哺乳动物细胞表面上表达的全长蛋白质的抗体；针对治疗性蛋白质表位的抗体）及编码本发明抗体（包括本文描述的其片段、类似物和衍生物及抗独特性抗体）的核酸。本发明的抗体可用于治疗、抑制或预防与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱或状况，包括但不限于任何一种或多种本文描述的疾病、紊乱或状况。所述与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱或状况的治疗和/或预防包括但不限于减轻与那些疾病、紊乱或状况有关的症状。本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白可在本领域知道的或本文描述的制药学可接受组合物中提供。 
其中本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白可在治疗上使用的方式的概要包括在体内局部或系统性结合治疗性蛋白质，或通过抗体的直接细胞毒性，如由补体(CDC)或效应细胞(ADCC)介导的。这些方法中的某些详述于下文。利用本文提供的教导，本领域普通技术人员应当知道如何将本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白用于诊断、监测或治疗目的，而无需过度实验。 
本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白可有利的与其它单克隆或嵌合抗体、或与淋巴因子或造血生长因子（诸如IL-2、IL-3和IL-7）联合使用，例如有助于增加与抗体相互作用的效应细胞的数量或活性的。 
本发明的抗体或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白可单独施用或与其它类型的治疗（例如放疗、化疗、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂）联合施用。一般而言，优选施用与患者属于相同物种的物种起源或物种反应性（就抗体来说）的产品。因此，在一个优选的实施方案中，将人抗体、片段、衍生物、类似物或核酸施用于人患者用于治疗或预防。 
优选将针对治疗性蛋白质的高亲和力的和/或在体内有效抑制和/或中和的抗体、其片段或区域（或与这样的抗体相关的清蛋白融合蛋白）用于针对本发明多核苷酸或多肽包括其片段的免疫测定法和与其有关的紊乱的治疗。这样的抗体、片段或区域优选对本发明的多核苷酸或多肽包括其片段具有亲和力。优选的结合亲和力包括小于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M的解离常数或Kd。更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M或10-8M的那些。甚至更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的那些。 
基因疗法 
在一个具体的实施方案中，通过基因疗法的方式，施用包含编码结合治疗性蛋白质的抗体或至少包括结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白的序列的核酸来治疗、抑制或预防与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性有关的疾病或紊乱。基因疗法指通过对受试者施用表达的或可表达的核酸而进行的治疗。在本发明的此实施方案中，所述核酸产生介导治疗效果的其编码的蛋白质。 
本领域可利用的基因疗法的任何方法都可根据本发明使用。例示性的方法更为详细的描述于本申请的其它地方。 
治疗或预防活性的实证
在用于人之前，本发明的化合物或药物组合物优选先在体外测试，然后 在体内测试所需治疗或预防活性。例如，用于证实化合物或药物组合物的治疗或预防效用的体外测定法包括化合物对细胞系或患者组织样品的效果。可利用本领域技术人员知道的技术来测定化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的效果，包括但不限于玫瑰花结形成测定法和细胞溶解测定法。依照本发明，简述了可用于决定是否施用特定化合物的体外测定法，包括体外细胞培养测定法，其中培养患者的组织样品并暴露于或以其它方式施用化合物，并观察到这样的化合物对组织样品的效果。 
治疗性/预防性施用和组合物 
本发明提供了通过对受试者施用有效量的本发明化合物或药物组合物的治疗、抑制和预防方法。在一个优选的实施方案中，化合物是基本上纯化的（例如基本上不含限制其效果或产生不想要的副作用的物质）。受试者优选动物，包括但不限于诸如牛、猪、马、鸡、猫、犬等动物，且优选哺乳动物，最优选人。 
当化合物包含核酸或免疫球蛋白时，可使用的制剂和施用方法如上所述；其它合适的制剂和施用途径可选自下文所描述的那些。 
已知多种投递系统且可用于施用本发明的化合物，例如包囊在脂质体、微粒、微胶囊内、能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的胞吞作用（参见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432，1987）、作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸的构建等。导入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。化合物或组合物可通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注、通过经上皮或粘膜皮肤内衬（如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等）的吸收，且可与其它生物学活性试剂联合施用。可系统或局部施用。此外，可能希望通过任何合适的途径将本发明的药物化合物或组合物导入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；通过脑室内导管可便于脑室内注射，例如连接贮器，诸如奥马耶(Ommaya)贮器。也可采用肺部施药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及含雾化剂的剂型。 
在一个具体的实施方案中，可能希望将本发明的药物化合物或组合物局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如但不限于手术期间的局部输注、局部应用如结合手术后的伤口敷料、通过注射、经由导管、借助栓剂、或通过植入物来实现，所述植入物是多孔的、非多孔的或凝胶状物质，包括膜，例如sialastic膜或纤维。优选的是，在施用本发明的蛋白质时，包括抗体，必 须注意所使用的材料应当是不吸收蛋白质的。 
在另一个实施方案中，化合物或组合物可在囊泡中投递，特别是在脂质体中（参见Langer，Science 249：1527-1533，1990；Treat等人，在《Liposomes in the Therapy of Infectiou sDiseas ean dCancer》中，Lopez-Berestein和Fidler编，Liss，New York，pp.353-365，1989；Lopez-Berestein，同前，pp.317-327；主要参见同前）。 
在又一个实施方案中，化合物或组合物可在受控释放系统中投递。在一个实施方案中，可使用泵（参见Langer，见前；Seflon，CR CCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201，1987；Buchwald等人，Surgery 88：507，1980；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574，1989）。在另一个实施方案中，可使用聚合材料（参见《Medical Applications of Controlled Release》，Langer和Wise编，CRC Pres.，Boca Raton，Florida，1974；《Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance》，Smolen和Ball编，Wiley，New York，1984；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61，1983；也参见Levy等人，Scienc e228：190，1985；During等人，Ann.Neurol.25：351，1989；Howard等人，J.Neurosurg.71：105，1989）。在又一个实施方案中，受控释放系统可置于治疗靶如脑的附近，因此仅需要系统剂量的一部分（参见例如Goodson，在《Medical Applications of Controlled Release》中，同前，第2卷，pp.115-138，1984）。 
其它受控释放系统的讨论见Langer的评论(Science 249：1527-1533，1990）。在本发明的化合物是编码蛋白质的核酸的一个具体实施方案中，可在体内施用核酸以促进其所编码的蛋白质的表达，可通过将其构建作为合适核酸表达载体的一部分并施用它使其进入细胞内，例如通过利用逆转录病毒载体（参见美国专利号4,980,286），或通过直接注射，或通过利用微粒轰击（例如基因枪；Biolistic，Dupont），或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过连接已知进入细胞核的同源框样肽来施用它（参见例如Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.US A88：1864-1868，1991）等。或者，可将核酸导入细胞内并通过同源重组掺入宿主细胞DNA以表达。 
本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含治疗有效量的化合物，和制药学可接受载体。在一个具体的实施方案中，术语“制药学可接受的”指得到联邦或州政府管理机构的批准或列于美国药典或其它公认的药典 供动物使用，更具体的说是人。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。这样的制药学载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。在静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和含水右旋糖及甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射液。合适的制药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放剂型等形式。组合物可配制成栓剂，含有传统的粘合剂和诸如甘油三酯等载体。口服剂型可包括标准载体，诸如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的制药学载体的例子描述于E.W.Martin的《Remington′s Pharmaceutical Sciences》。这样的组合物将含有治疗有效量的化合物，优选纯化的形式，以及合适量的载体以提供适于对患者施用的形式。剂型应当适合施用方式。 
在一个优选的实施方案中，按照常规流程将组合物配制成适于人静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。需要时，组合物还可包括增溶剂和诸如利多卡因等局部麻醉剂以在注射部位减轻疼痛。一般而言，成分是分开提供的或以单位剂量形式混合的，像熔封容器中的冻干粉末或无水浓缩物，诸如标示有活性剂数量的安瓿或小袋(sachette)。当组合物将通过输注施用时，可用装有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当组合物通过注射施用时，可提供一安瓿注射用无菌水或盐水以便成分可在施用前混合。 
本发明的化合物可配制成中性或盐形式。制药学可接受的盐包括与阴离子形成的那些，诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及与阳离子形成的那些，诸如衍生自氢氧化钠、钾、铵、钙、铁、异丙胺、三乙胺、3-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。 
可通过标准临床技术来测定在与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性有关的疾病或紊乱的治疗、抑制和预防中有效的本发明化合物的量。此外，可任选采用体外测定法来帮助确定最佳剂量范围。制剂中将要采用的精确剂量还取决于施用途径、和疾病或紊乱的严重程度，而且应根据开业医生的判断 和每位患者的情况来决定。根据体外或动物模型测试系统的剂量-应答曲线可外推有效剂量。 
对于抗体而言，对患者施用的剂量通常是0.1mg/kg-100mg/kg患者体重。优选的是，对患者施用的剂量是0.1mg/kg-20mg/kg患者体重，更优选1mg/kg-10mg/kg患者体重。一般而言，由于对外来多肽的免疫反应，人抗体在人体中较来自其它物种的抗体具有更长的半衰期。因此，较低剂量的人抗体和较低频率的施药常常是可能的。此外，可通过诸如例如脂化等修饰增强抗体的摄取和组织穿透（如进入脑）来降低本发明抗体的施用剂量和频率。 
诊断和成像
经过标记的结合治疗性蛋白质（或其片段或变体）的抗体及其衍生物和类似物（包括至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白）可用于诊断目的以检测、诊断或监测与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱和/或状况。本发明提供了治疗性蛋白质的异常表达的检测方法，包括(a)使用一种或多种对目的多肽特异的抗体测定个体细胞或体液中治疗性蛋白质的表达，并(b)将基因表达水平与标准基因表达水平进行比较，由此测得的治疗性蛋白质表达水平较之标准表达水平的升高或降低指示异常表达。 
本发明提供了用于诊断紊乱的诊断性测定法，包括(a)使用一种或多种对治疗性蛋白质特异的抗体或至少包含对治疗性蛋白质特异的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白测定个体细胞或体液中治疗性蛋白质的表达，并(b)将基因表达水平与标准基因表达水平进行比较，由此测得的治疗性蛋白质表达水平较之标准表达水平的升高或降低指示特定紊乱。就癌症而言，在个体活检组织中存在相对较高数量的转录本可指示形成疾病的易患病体质，或者可提供用于在实际临床症状出现前检测疾病的方法。这种类型的更确切诊断可容许医务人员更早采取预防措施或攻击治疗，由此阻止癌症的发展或进一步的进展。 
本发明的抗体或至少包含对治疗性蛋白质特异的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白可用于测定生物学样品中的蛋白质水平，使用了本领域技术人员知道的经典免疫组织学方法（例如参见Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101：976-985，1985；Jalkanen等人，J.Cell.Biol.105：3087-3096，1987）。可用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定法，诸如酶联免 疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。合适的抗体测定标记物是本领域知道的，包括酶标记物，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘（125I、121I）、碳（14C）、硫（35S）、氚（3H）、铟（121In）和锝（99Tc）；发光标记物，诸如鲁米诺；荧光标记物，诸如荧光素和罗丹明；以及生物素。 
本发明的一个方面是动物，优选哺乳动物，最优选人中与治疗性蛋白质的异常表达有关的疾病或紊乱的检测和诊断。在一个实施方案中，诊断包括：a)对受试者施用（例如肠胃外、皮下或腹膜内）有效量的经过标记的特异性结合目的多肽的分子；b)在施药后等待一段时间以容许标记分子在受试者中表达治疗性蛋白质的部位优先集中（且未结合的标记分子清除至背景水平）；c)测定背景水平；并d)检测受试者中的标记分子，标记分子超过背景水平的检测结果指示受试者患有与治疗性蛋白质的异常表达有关的特定疾病或紊乱。可通过多种方法来测定背景水平，包括将检测得到的标记分子的量与先前对特定系统测定的标准值进行比较。 
本领域将理解，受试者的大小和所用的成像系统将决定产生诊断影像所需的成像模块的量。在放射性同位素模块的例子中，对于人类受试者，注射放射性的量通常在约5到20毫居里99mTc的范围内。然后经过标记的抗体、抗体片段或至少包含结合治疗性蛋白质的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白将优先在含有特定治疗性蛋白质的细胞部位积累。体内肿瘤成像的描述可参见S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments”，第13章，《Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer》，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，Masson Publishing Inc.，1982。 
根据一些变数，包括使用的标记物类型和施药模式，施药后容许标记分子在受试者中的部位优先集中且未结合标记分子清除至背景水平的时间间隔是6-48小时或6-24小时或6-12小时。在另一个实施方案中，施药后的时间间隔是5-20天或5-10天。 
在一个实施方案中，通过重复用于诊断疾病或紊乱的方法来进行疾病或紊乱的监测，例如在初次诊断后1个月、在初次诊断后6个月、在初次诊断后1年等。 
可使用本领域知道的用于体内扫描的方法来检测患者中标记分子的存在。这些方法取决于所使用的标记物类型。技术人员将能够确定用于检测特定标记物的合适方法。可用于本发明的诊断方法的方法和装置包括但不限于 计算机断层摄影术(CT)、全身扫描诸如正电子发射体层摄影术(PET)的、磁共振成像(MRI)和超声检查。 
在一个具体的实施方案中，分子用放射性同位素标记并在患者中使用放射响应的外科器械检测（Thurston等人，美国专利号5,441,050）。在另一个实施方案中，分子用荧光化合物标记并在患者中使用荧光响应的扫描器械检测。在另一个实施方案中，分子用正电子发射金属标记并在患者中使用正电子发射断层摄影术检测。在又一个实施方案中，分子用顺磁标记物标记并在患者中使用磁共振成像(MRI)检测。特异性检测清蛋白融合蛋白而非单独的清蛋白或治疗性蛋白质的抗体是优选的实施方案。这些可用于检测说明书全文中描述的清蛋白融合蛋白。 
试剂盒
本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含抗体，优选纯化的抗体，装在一个或多个容器中。在一个具体的实施方案中，本发明的试剂盒含有基本上分离的多肽，它包含与试剂盒中所包括的抗体起特异性免疫反应的表位。优选的是，本发明的试剂盒还包含对照抗体，它不与目的多肽起反应。在另一个具体的实施方案中，本发明的试剂盒含有用于检测抗体与目的多肽结合的手段（例如抗体可缀合有可检测底物，例如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物，或识别一抗的二抗可缀合到可检测底物上）。 
在本发明另一个具体的实施方案中，试剂盒是用于筛选含有特异性针对增殖性和/或癌性多核苷酸和多肽的抗体的血清的诊断试剂盒。这样的试剂盒可包括不与目的多肽起反应的对照抗体。这样的试剂盒可包括基本上分离的多肽抗原，它包含与至少一种抗多肽抗原抗体起特异性免疫反应的表位。此外，这样的试剂盒包括用于检测所述抗体与抗原结合的手段（例如抗体可缀合有诸如荧光素或罗丹明等荧光化合物，可通过流式细胞术检测）。在具体的实施方案中，试剂盒可包括重组生产的或化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原还可附着在固体支持物上。 
在一个更具体的实施方案中，上述试剂盒的检测手段包括附着有所述多肽抗原的固体支持物。这样的试剂盒还可包括未附着报道分子标记的抗人抗体。在此实施方案中，可通过所述报道分子标记的抗体来检测抗体和多肽抗原的结合。 
在另一个实施方案中，本发明包括用于筛选含有本发明多肽的抗原的血清的诊断试剂盒。诊断试剂盒包括与多肽或多核苷酸抗原起特异性免疫反应的基本上分离的抗体，以及用于检测多核苷酸或多肽抗原与抗体结合的手段。在一个实施方案中，抗体附着在固体支持物上。在一个具体的实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。试剂盒的检测手段可包括第二种经过标记的单克隆抗体。或者/另外，检测手段可包括经过标记的竞争性抗原。 
在一种诊断形式中，使测试血清与通过本发明方法获得的具有表面结合抗原的固相试剂进行反应。在特异性抗原抗体与试剂结合并通过清洗除去未结合的血清成分后，使试剂与报道分子标记的抗人抗体进行反应以使报道分子以与固体支持物上结合的抗抗原抗体量的一定比例结合试剂。再次清洗试剂以除去未结合的标记抗体，并测定与试剂缔合的报道分子的量。通常，报道分子是酶，它通过在存在合适的荧光、发光或比色底物（Sigma，St.Louis，MO）时将固相保温来检测。 
通过用于将蛋白质物质附着于固体支持物物质诸如聚合物珠、浸量尺、96孔板或滤器物质的已知技术来制备上述测定法中的固体表面试剂。这些附着方法通常包括蛋白质与支持物的非特异性吸附，或蛋白质通常通过游离胺基共价附着于固体支持物上的化学反应基团，诸如活化的羧基、羟基或醛基。或者，可连同生物素化的抗原使用链霉亲合素包被的板。 
如此，本发明提供了用于执行此诊断方法的测定系统或试剂盒。试剂盒通常包括具有表面结合的重组抗原的载体和用于检测表面结合的抗抗原抗体的报道分子标记的抗人抗体。 
清蛋白融合蛋白
本发明主要涉及清蛋白融合蛋白及治疗、预防或改善疾病或紊乱的方法。在用于本文时，“清蛋白融合蛋白”指通过至少一个分子的清蛋白（或其片段或变体）与至少一个分子的治疗性蛋白质（或其片段或变体）融合而形成的蛋白质。本发明的清蛋白融合蛋白包含至少治疗性蛋白质的片段或变体和至少人血清清蛋白的片段或变体，它们优选通过基因融合（即清蛋白融合蛋白是由其中编码完整或部分治疗性蛋白质的多核苷酸以相同读码框与编码完整或部分清蛋白的多核苷酸连接的核酸翻译生成的）彼此相互连接。治疗性蛋白质和清蛋白，一旦成为清蛋白融合蛋白的一部分，可称为清蛋白融合蛋白的“部份”、“区域”或“模块”。 
在一个优选的实施方案中，本发明提供了由表1或表2中描述的多核苷酸或清蛋白融合构建体编码的清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖编码这些清蛋白融合蛋白的多核苷酸。 
本发明优选的清蛋白融合蛋白包括但不限于由如下核酸分子编码的清蛋白融合蛋白，所述核酸分子包含以相同读码框与编码至少一个分子的治疗性蛋白质（或其片段或变体）的至少一段多核苷酸连接的编码至少一个分子的清蛋白（或其片段或变体）的多核苷酸或由其组成；所述核素分子包含以相同读码框与编码至少一个分子的如表1、表2或实施例中所述产生的治疗性蛋白质（或其片段或变体）的至少一段多核苷酸连接的编码至少一个分子的清蛋白（或其片段或变体）的多核苷酸或由其组成；或者所述核酸分子包含以相同读码框与编码至少一个分子的治疗性蛋白质（或其片段或变体）的至少一段多核苷酸连接的编码至少一个分子的清蛋白（或其片段或变体）的多核苷酸或由其组成，还包含例如一种或多种下列元件：(1)功能性自主复制载体（包括但并不限于穿梭载体、表达载体、整合载体、和/或复制系统），(2)转录起始区（例如启动子区，诸如例如可调节或可诱导的启动子、组成型启动子），(3)转录终止区，(4)前导序列，和(5)选择标记。 
在一个实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质（例如表1中所描述的）和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗活性片段和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗活性变体和血清清蛋白蛋白质或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白质成分是血清清蛋白的成熟部分。 
在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗活性片段或由其组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗活性变体或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是治疗性蛋白质的成熟部分。 
在其它实施方案中，本发明提供了包含治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗活性片段或变体和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗活性片段或变体或由其组成的清蛋白融合蛋白。在优选的实施方案中，本发明提供了包含 治疗性蛋白质的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分或由其组成的清蛋白融合蛋白。 
优选的是，清蛋白融合蛋白包含HA作为N端部分，且包含治疗性蛋白质作为C端部分。或者，也可使用包含HA作为C端部分且包含治疗性蛋白质作为N端部分的清蛋白融合蛋白。 
在其它实施方案中，清蛋白融合蛋白在清蛋白的N末端和C末端都融合有治疗性蛋白质。在一个优选的实施方案中，在N末端和C末端融合的治疗性蛋白质是相同的治疗性蛋白质。在另一个优选的实施方案中，在N末端和C末端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在另一个优选的实施方案中，在N末端和C末端融合的治疗性蛋白质是可用于治疗或预防相同或相关疾病、紊乱或状况（例如表1“优选适应症Y”列中所列举的）的不同治疗性蛋白质。在另一个优选的实施方案中，在N末端和C末端融合的治疗性蛋白质是可用于治疗、改善或预防本领域知道的通常在患者中同时、并发或连续存在或通常在患者中彼此关联存在的疾病或紊乱（例如表1“优选适应症Y”列中所列举的）的不同治疗性蛋白质。 
本发明的清蛋白融合蛋白涵盖含有融合在本发明清蛋白融合蛋白的N-或C-末端和/或融合在清蛋白或其变体的N-和/或C-末端的1、2、3、4或更多个分子的指定治疗性蛋白质X或其变体的蛋白质。指定治疗性蛋白质X或其变体的分子可以是任何数目的取向，包括但不限于“头对头”取向（例如其中一个治疗性蛋白质X分子的N-末端融合到另一个治疗性蛋白质X分子的N-末端），或“头对尾”取向（例如其中一个治疗性蛋白质X分子的C-末端融合到另一个治疗性蛋白质X分子的N-末端）。 
在一个实施方案中，1、2、3或更多个串联取向的治疗性蛋白质X多肽（或其片段或变体）融合到本发明清蛋白融合蛋白的N-或C-末端，和/或融合到清蛋白或其变体的N-和/或C-末端。 
本发明的清蛋白融合蛋白还涵盖含有融合在本发明清蛋白融合蛋白的N-或C-末端和/或融合在清蛋白或其变体的N-和/或C-末端的1、2、3、4或更多个分子的指定治疗性蛋白质X或其变体的蛋白质，其中所述分子通过肽接头连接。例子包括美国专利号5,073,627（引入本文作为参考）中描述的那些肽接头。可使用常规重组DNA技术来生成包含通过肽接头分开的多个治疗性蛋白质X多肽的清蛋白融合蛋白。在将小肽融合到大HAS分子上时， 接头是特别重要的。肽自身可通过串联拷贝的肽的融合而作为接头，或者可施用其它已知接头。掺入接头的构建体描述于表2或在检查SEQ ID NO：Y时是显而易见的。 
此外，本发明的清蛋白融合蛋白还可通过以这样的一种容许形成分子内和/或分子间多聚体形式的方式将治疗性蛋白质X或其变体融合到清蛋白或其变体的N-末端和/或C-末端而产生。在本发明的一个实施方案中，清蛋白融合蛋白可以是单体或多聚体的形式（即二聚体、三聚体、四聚体和更高聚合体）。在本发明的另一个实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分可以是单体或多聚体的形式（即二聚体、三聚体、四聚体和更高聚合体）。在一个具体的实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是多聚体的形式（即二聚体、三聚体、四聚体和更高聚合体），而清蛋白蛋白质部分是单体的形式。 
除了其中清蛋白部分融合治疗性蛋白质部分的N-末端和/或C-末端的清蛋白融合蛋白之外，本发明的清蛋白融合蛋白还可通过将治疗性蛋白质或目的肽（例如表1中公开的治疗性蛋白质X，或结合治疗性蛋白质或其片段或变体的抗体）插入HA的内部区域而产生。例如，在HA分子的蛋白质序列中在α-螺旋的终点和起点之间存在通过二硫键稳定的许多环或转角。根据HA的晶体结构（PDB标示符1AO6、1BJ5、1BKE、1BM0、1E7E至1E71和1UOR），这些环大部分远离分子主体。这些环可用于治疗活性肽的插入或内部融合，特别是需要二级结构才有功能的那些，或治疗性蛋白质，以本质上产生具有特定生物学活性的清蛋白分子。 
人清蛋白结构中可插入肽或多肽以产生本发明清蛋白融合蛋白的环包括：Val54-Asn61、Thr76-Asp89、A1a92-Glu100、Gln170-Ala176、His247-Glu252、Glu266-Glu277、Glu280-His288、Ala362-Glu368、Lys439-Pro447、Val462-Lys475、Thr478-Pro486和Lys560-Thr566。在更优选的实施方案中，肽或多肽插入成熟人清蛋白（SEQ ID NO：1）的环Val54-Asn61、Gln170-Ala176和/或Lys560-Thr566。 
待插入的肽可衍生自对特定生物学活性进行筛选的噬菌体展示或合成肽文库或来自具有期望功能的分子的活性部分。此外，可在特定环内产生随机肽文库，或通过将随机肽插入HA分子的特定环中，其中展现了所有可能的氨基酸组合。 
这样的文库可通过下列方法之一在HA或HA结构域片段上产生： 
(a)将HA或HA结构域片段的一个或多个肽环中的氨基酸进行随机突变。可以这种方式突变环内的一个、多个或所有残基； 
(b)在HA或HA结构域片段（即内部融合）的一个或多个环中进行长度为Xn（其中X是氨基酸，n是残基数目）的随机肽的置换或插入； 
(c)除(a)和/或(b)以外的N末端、C末端、或N和C末端肽/蛋白质融合。 
还可通过将针对不同靶对不同环进行的不同筛选衍生的肽移植到相同的HA或HA结构域片段中，使HA或HA结构域片段成为多功能的。 
在优选的实施方案中，插入人血清清蛋白的环中的肽是表1中所公开的治疗性蛋白质的肽片段或肽变体。更具体的说，本发明涵盖包含在人血清清蛋白的环中插入了长度为至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖包含在人血清清蛋白的N末端融合了长度为至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。本发明还涵盖包含在人血清清蛋白的C末端融合了长度为至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。例如，表1和2（例如治疗剂Y）中描述的短肽可插入到清蛋白的环中。 
一般而言，本发明的清蛋白融合蛋白可具有一个HA衍生区域和一个治疗性蛋白质衍生区域。然而，每种蛋白质的多个区域可用于构建本发明的清蛋白融合蛋白。相似的，超过一种治疗性蛋白质可用于构建本发明的清蛋白融合蛋白。例如，可将治疗性蛋白质融合到HA的N-和C-两个末端。在这样一种构造中，治疗性蛋白质部分可以是相同或不同的治疗性蛋白质分子。双功能清蛋白融合蛋白的结构可表示为：X-HA-Y或Y-HA-X。 
例如，可制备抗BLySTM scFv-HA-IFNα-2b融合物以通过抗BLySTM scFv调节对IFNα-2b的免疫应答。或者，可制备HA-融合物的双（或甚至多）功能药剂，例如HA-IFNα-2b融合物，并根据功能、半衰期等以不同比例混合 HA-抗BLySTMscFv融合物或其它HA-融合物。 
还可通过位于HA另一端的蛋白质或肽制备将融合物的治疗性蛋白质部分靶向靶器官或细胞类型的双或多功能清蛋白融合蛋白。 
作为已知治疗性分子的融合物的替代方法，可通过筛选作为HA或HA结构域片段N末端、C末端、或N和C末端融合物而构建的文库来获得肽，它们通常是6个、8个、12个、20个或25个或Xn个（其中X是氨基酸(aa)，n是残基数目）随机氨基酸，其中展现了所有可能的氨基酸组合。这种方法的特殊优点是可在HA分子上原位选择肽，因此肽的特性就像选择的那样，而不会像由任何其它方法衍生肽然后附着到HA上的情况那样发生潜在改变。 
另外，本发明的清蛋白融合蛋白可在融合部分之间包含接头肽，从而在模块之间提供更大物理间隔，并由此使治疗性蛋白质部分的可达性最大化，例如与其相关受体结合。接头肽可由氨基酸组成，使其具柔性或更具刚性。 
接头序列可通过蛋白酶或化学切除以产生生长激素相关部分。优选的是，蛋白酶是宿主天然产生的，例如酿酒酵母蛋白酶kex2或等效的蛋白酶。 
因此，如上所述，本发明的清蛋白融合蛋白可具有如下通式：R1-L-R2；R2-L-R1或R1-L-R2-L-R1，其中R1是至少一种治疗性蛋白质、肽或多肽序列，且不必是相同的治疗性蛋白质，L是接头，而R2是血清清蛋白序列。 
在优选的实施方案中，包含治疗性蛋白质的本发明清蛋白融合蛋白具有与未与清蛋白融合的相同治疗性蛋白质的血浆稳定性相比更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常指在体内施用治疗性蛋白质并进入血流时和在治疗性蛋白质降解并从血流中清除进入诸如肾或肝等器官，最终从体内清除时之间的时间间隔。根据血流中治疗性蛋白质的半衰期计算血浆稳定性。血流中治疗性蛋白质的半衰期可通过本领域知道的常用测定法容易的测定。 
在优选的实施方案中，包含治疗性蛋白质的本发明清蛋白融合蛋白具有与未与清蛋白融合的相同治疗性蛋白质的保质期相比延长的保质期。保质期通常指溶液中的或有些其它贮存制剂中的治疗性蛋白质的治疗活性保持稳定而无治疗活性过度丧失的时间期限。许多治疗性蛋白质在其未融合状态下高度易变。如下所述，这些治疗性蛋白质在引入本发明清蛋白融合蛋白后其保质期通常显著延长。 
保质期“延长的”本发明清蛋白融合蛋白相对于接受相同贮存和处理条件的标准品表现出更大的治疗活性。标准品可以是未融合的全长治疗性蛋白 质。当清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是该蛋白质的类似物、变体、或有其它改变或不包含完整序列时，治疗活性的延长或者可与该类似物、变体、改变的肽或不完整序列的未融合等同物进行比较。作为实例，在给定时间点进行比较时，本发明的清蛋白融合蛋白可保留接受相同贮存及处理条件的标准品的治疗活性的大于约100%或大于治疗活性的约105%、110%、120%、130%、150%或200%。 
保质期也可根据贮存后残余的治疗活性来评估，针对贮存开始时的治疗活性进行标准化。保质期延长的本发明清蛋白融合蛋白表现出治疗活性延长，可保留接受相同条件的等价未融合治疗性蛋白质的治疗活性的大于约50%、治疗活性的约60%、70%、80%、或90%或更多。 
融合蛋白的表达
本发明的清蛋白融合蛋白可作为重组分子由酵母、微生物诸如细菌、或人或动物细胞系分泌而产生。任选的是，多肽由宿主细胞分泌。 
本发明的一个具体实施方案包括编码对于在酵母中指导分泌有效的信号序列的DNA构建体，特别是酵母衍生的信号序列（尤其是与酵母宿主同源的），和本发明第一方面的融合分子，在信号和成熟多肽之间没有酵母衍生的原(pro)序列。 
酿酒酵母转化酶信号是酵母衍生的信号序列的优选例子。 
并未设想Poznansky等人（FEBS Lett.239：18，1988）制备的那类缀合物，其中分开制备的多肽通过化学交联得以连接。 
本发明还包括经转化表达本发明清蛋白融合蛋白的细胞，优选酵母细胞。除了经转化宿主细胞本身外，本发明还涵盖那些细胞在营养培养基中的培养物，优选单克隆（克隆上同质的）培养物或由单克隆培养物衍生的培养物。如果多肽是分泌的，则培养基将含有多肽，带有细胞，或如果细胞已被过滤或离心去除则不带有细胞。许多表达系统是已知的且可使用的，包括细菌（例如大肠埃希氏菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)）、酵母（例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)）、丝状真菌（例如曲霉属）、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。 
优选用于生产清蛋白融合蛋白的酵母菌株是D88、DXY1和BXP10。D88[leu2-3,leu2-122,can1,pra1,ubc4]是亲本菌株AH22his+（也称为DB1； 参见例如Sleep等人，Biotechnology 8：42-46，1990）的衍生物。该菌株含有leu2突变，它容许对含有LEU2基因的基于2μm的质粒进行营养缺陷型选择。D88在葡萄糖过量时还表现出PRB1的去阻遏。PRB1启动子通常受到监测葡萄糖水平和生长阶段的两种检查点的控制。在野生型酵母中，该启动子在葡萄糖耗尽并进入静止期后激活。菌株D88表现出受葡萄糖的阻遏，但在进入静止期后保持诱导。PRA1基因编码酵母液泡蛋白酶，YscA内切蛋白酶A，它定位于ER。UBC4基因处于泛蛋白化途径中并参与使短命和异常的蛋白质靶向泛蛋白依赖性降解。发现此ubc4突变的分离增加细胞中表达质粒的拷贝数并引起由质粒表达的期望蛋白质的表达水平升高（参见例如国际发布号WO 99/00504，将其完整引入本文作为参考）。 
DXY1，D88的一种衍生物，具有如下基因型：[leu2-3,leu2-122,can1,pra1,ubc4,ura3::yap3]。除D88中分离的突变之外，此菌株还具有YAP3蛋白酶的敲除。此蛋白酶主要引起蛋白质中两个碱性残基（RR、RK、KR、KK）的切割，但是也能促进单个碱性残基处的切割。此yap3突变的分离导致高水平的全长HAS产物（参见例如美国专利号5,965,386及Kerry-Williams等人，Yeast 14：161-169，1998，将其完整引入本文作为参考）。 
BXP10具有如下基因型：leu2-3,leu2-122,can1,pra1,ubc4,ura3,yap3::URA3,lys2,hsp150::LYS2,pmt1::URA3。除DXY1中分离的突变之外，此菌株还具有PMT1基因和HSP150基因的敲除。PMT1基因是多萜醇-磷酸-D-甘露糖蛋白质O-甘露糖基转移酶（Pmt）进化保守家族的成员。Pmt1p的跨膜拓扑学表明它是内质网的膜内在蛋白质，在O-连接糖基化中起作用。此突变有助于减少/消除HAS融合物的O-连接糖基化（参见例如国际发布号WO 00/44772，将其完整引入本文作为参考）。研究揭示了通过离子交换层析不能自rHA中有效分离Hsp150蛋白质。HSP150基因中的突变消除了已证实难以通过标准纯化技术清除的潜在污染物。参见例如美国专利号5,783,423，将其完整引入本文作为参考。 
以常规方法产生所需蛋白质，例如由插入宿主染色体中或游离质粒上的编码序列产生。以任何常用方法例如电穿孔用所需蛋白质的编码序列转化酵母。通过电穿孔转化酵母的方法公开于Becker和Guarente，Methods Enzymol.194：182，1990。 
成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞可通过众所周知的 技术进行鉴定。例如，可培养由导入表达构建体产生的细胞以产生所需多肽。可收获细胞，裂解，并使用诸如Southern，J.Mol.Biol.98：503，1975或Berent等人，Biotech.3：208，1985描述的方法对DNA内容物检验DNA的存在。或者，可使用抗体来检测上清液中蛋白质的存在。 
有用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416，且一般可从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037，USA获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合质粒（YIp），且掺入了酵母选择标记HIS3、7RP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒（YCp）。 
优选用于在酵母中表达以制备清蛋白融合蛋白的载体包括pPPC0005、pScCHSA、pScNHSA、和pC4:HAS，它们详述于实施例1中。图2显示了可用作基本载体的pPPC0005质粒图谱，可向其中克隆编码治疗性蛋白质的多核苷酸以形成HA-融合物。它含有PRB1酿酒酵母启动子（PRB1p）、融合前导序列（FL）、编码HA的DNA（rHA）和ADH1酿酒酵母终止序列。融合前导序列的序列由人血清清蛋白（SEQ ID NO：3）信号肽的前19个氨基酸和交配因子α1启动子的最后5个氨基酸（SLDKR，参见EP-A-387319，将其完整引入本文作为参考）组成。 
质粒pPPC0005、pScCHSA、pScNHSA和pC4:Has于2001年4月11日保藏于美国典型培养物收藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，并分别给予了保藏号ATCC PTA-3278、PTA-3276、PTA-3279和PTA-3277。可用于在酵母中表达清蛋白融合蛋白的另一种载体pSAC35载体描述于Sleep等人，BioTechnology 8：42，1990，将其完整引入本文作为参考。 
可用于表达清蛋白融合蛋白的酵母启动子有MET25启动子。参见例如Dominik Mumburg、Rolf Muller和Martin Funk，Nucleic Acids Research 22(25)：5767-5768，1994。Met25启动子的长度是383个碱基（碱基-382至-1），且通过此启动子表达的基因也称为Met15、Met17和YLR303W。一个优选的实施方案使用如下序列，其中如下序列中位于5’末端的用于克隆的Not I位点标有下划线，且位于3’末端的ATG起始密码子标有下划线： 
GCGGCCGCCGGATGCAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTCTCATTATTTTTTGCTTTTTCTCTTGAGGTCACATGATCGCAAAATGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATATTGGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAAGTTAGTCAAGGCGCCATCCTCATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAA GTGTCGAAAAGGTGGCACCTTGTCCAATTGAACACGCTCGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAGCGTCTGTTAGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTGCTCTCTTGTCTTTTCATCTACTATTTCCTTCGTGTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACCCCCATCCATACAATG  (SEQ ID NO:5) 
可用于在酵母中表达清蛋白融合蛋白的其它启动子包括如下： 
a)cbh 1启动子： 
TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTC 
GCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGAT 
GTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCT 
ATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCT 
TCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCG 
AAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATAT 
AATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGT 
ACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCT 
TTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTA 
TTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAAT 
AATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTG 
TTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAG 
GCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCA 
CGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAA 
AGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAA 
GTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAA 
TTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTG 
TGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGT 
TTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCG 
CTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTC 
TGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGAC 
AGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGA 
GTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTA 
TAGTCACTTCTGGTGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCAC 
TGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCC 
CTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAA 
TGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCA 
GCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGT 
TTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAG 
ATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAAT 
GTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCC 
ATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTT 
TTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGGCATC 
(SEQ ID NO:113) 
b)构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的cysD启动子： 
AGATCTGGTTCCTGAGTACATCTACCGATGCGCCTCGATCCCCCTC 
TTAGCCGCATGAGATTCCTACCATTTATGTCCTATCGTTCAGGGTCC 
TATTTGGACCGCTAGAAATAGACTCTGCTCGATTTGTTTCCATTATT 
CACGCAATTACGATAGTATTTGGCTCTTTTCGTTTGGCCCAGGTCA 
ATTCGGGTAAGACGCGATCACGCCATTGTGGCCGCCGGCGTTGTG 
CTGCTGCTATTCCCCGCATATAAACAACCCCTCCACCAGTTCGTTG 
GGCTTTGCGAATGCTGTACTCTATTTCAAGTTGTCAAAAGAGAGGA 
TTCAAAAAATTATACCCCAGATATCAAAGATATCAAAGCCATC 
(SEQ ID NO:114) 
c)经修饰cbh1启动子，具有序列： 
TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTC 
GCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGAT 
GTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCT 
ATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCT 
TCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCG 
AAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATAT 
AATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGT 
ACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCT 
TTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTA 
TTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAAT 
AATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTG 
TTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAG 
GCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCA 
CGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAA 
AGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAA 
GTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAA 
TTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTG 
TGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGT 
TTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCG 
CTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTC 
TGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGAC 
AGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGA 
GTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTA 
TAGTCACTTCTGGTGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCAC 
TGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCC 
CTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAA 
TGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCA 
GCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGT 
TTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCTGCAGCCTCTTATCGAGAAA 
GAAATTACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTG 
AAAAAACCCAGACACGCTCGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCA 
GCTTCCAATTTCGTCACACAACAAGGTCCTAGCTTAGCCAAGAAC 
AATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGC 
AAAGTCAGCGAATGTGTATTATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCC 
CTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGAC 
TTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCG 
GACTGGCATC(SEQ ID NO:115) 
d)构巢曲霉的cysD启动子，具有序列： 
AGATCTGGTTCCTGAGTACATCTACCGATGCGCCTCGATCCCCCTC 
TTAGCCGCATGAGATTCCTACCATTTATGTCCTATCGTTCAGGGTCC 
TATTTGGACCGCTAGAAATAGACTCTGCTCGATTTGTTTCCATTATT 
CACGCAATTACGATAGTATTTGGCTCTTTTCGTTTGGCCCAGGTCA 
ATTCGGGTAAGACGCGATCACGCCATTGTGGCCGCCGGCGCTGCA 
GCCTCTTATCGAGAAAGAAATTACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCA 
AAAAGAACAAAACTGAAAAAACCCAGACACGCTCGACTTCCTGT 
CTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTCGTCACACAACAAGGTCCT 
ACGCCGGCGTTGTGCTGCTGCTATTCCCCGCATATAAACAACCCCT 
CCACCAGTTCGTTGGGCTTTGCGAATGCTGTACTCTATTTCAAGTT 
GTCAAAAGAGAGGATTCAAAAAATTATACCCCAGATATCAAAGATA 
TCAAAGCCATC(SEQ ID NO:116) 
已开发了多种方法用于经互补粘端将DNA与载体可操作连接。例如，可以将互补同聚物束添加至待插入载体DNA中的DNA区段。然后，将载体和DNA区段通过互补同聚物尾之间氢键连接以形成重组DNA分子。 
含有一种或多种限制性位点的合成接头提供了连接DNA区段和载体的另一种方法。将通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I进行处理，这些酶以其3′-5′外切核酸水解活性消除凸出的5′单链末端，并以其聚合活性填平凹进的3′末端。 
因此，这些活性的结合产生末端补平的DNA区段。然后，在存在能够催化平端DNA分子连接的酶诸如噬菌体T4DNA连接酶时将末端补平的区段与摩尔数大大过量的接头分子一起保温。由此，反应产物是在其末端携带多聚接头序列的DNA区段。然后，用合适的限制酶切割这些DNA区段，并与已用产生与DNA区段末端相容的末端的酶切割过的表达载体进行连接。 
含有多种限制性内切核酸酶位点的合成接头可从许多来源购得，包括International Biotechnologies Inc，New Haven，CT，USA。 
如果例如要制备HA变体的话，根据本发明修饰DNA的一种理想方法是使用Saiki等人，Science 239：487-491，1988公开的聚合酶链式反应。在此方法中，将要酶促扩增的DNA的侧翼为两种特异寡核苷酸引物，它们本身掺入扩增的DNA中。特异引物可含有限制性内切核酸酶识别位点，可用于通过本领域知道的方法克隆到表达载体中。 
设想可作为表达清蛋白融合蛋白的宿主用于本发明实践的酵母的例示 属有毕赤酵母属（Pichia）（汉逊酵母属Hansenula）、糖酵母属（Saccharomyces）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、假丝酵母属（Candida）、球拟酵母属（Torulopsis）、有孢圆酵母属（Torulaspora）、裂殖糖酵母属（Schizosaccharomyces）、固囊酵母属（Citeromyces）、管囊酵母属（Pachysolen）、德巴利酵母属（Debaryomyces）、梅奇酵母属（Metschunikowia）、红冬孢属（Rhodosporidium）、白冬孢酵母（Leucosporidium）、葡状子囊菌属（Botryoascus）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、拟内孢霉属（Endomycopsis）等等。优选的属是选自下组的属：糖酵母属、裂殖糖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、和有孢圆酵母属。糖酵母属的实例有啤酒糖酵母（S.cerevisiae）、意大利糖酵母（S.italicus）和鲁式糖酵母（S.rouxii）。 
克鲁维酵母属的例子有壁脆克鲁维酵母(K.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)。合适的有孢圆酵母物种有戴尔有孢圆酵母(T.delbrueckii)。毕赤酵母（汉逊酵母）的例子有P.angusta（以前是多形汉逊酵母H.polymorpha）、异常毕赤氏酵母(P.anomala)（以前是异常汉逊氏酵母H.anomala）和巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)。用于酿酒酵母转化的方法通常教导自EP 251 744、EP 258 067和WO 90/01063，都引入本文作为参考。 
优选的酿酒酵母示例种包括啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、意大利糖酵母(S.italicus)、糖化糖酵母(S.diastaticus)和鲁氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。优选的克鲁维酵母示例种包括壁脆克鲁维酵母(K.fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)。优选的汉逊酵母示例种包括多形汉逊酵母(H.polymorpha)（现在是P.angusta）、异常汉逊酵母(H.anomala)（现在是异常毕赤酵母P.anomala）、和碎囊毕赤酵母(Pichia capsulata)。另外优选的毕赤酵母示例种包括巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)。优选的曲霉示例种包括黑曲霉(A.niger)和构巢曲霉(A.nidulans)。优选的亚罗酵母(Yarrowia)示例种包括解脂亚罗酵母(Y.lipolytica)。许多优选的酵母物种可从ATCC获得。例如，下列优选的酵母物种可从ATCC获得且可用于表达清蛋白融合蛋白：Saccharomyces cerevisiae Hansen,teleomorph株BY4743 yap3突变体（ATCC登录号4022731）；Saccharomyces cerevisiae Hansen,teleomorph株BY4743 hsp150突变体（ATCC登录号4021266）；Saccharomyces cerevisiae Hansen, teleomorph株BY4743pmt1突变体（ATCC登录号4023792）；Saccharomyces cerevisiae Hansen,teleomorph（ATCC登录号20626；44773；44774和62995）；Saccharomyces diastaticus Andrews et Gilliland ex van der Walt,teleomorph（ATCC登录号62987）；Kluyveromyces lactis(Dombrowski)van der Walt,teleomorph（ATCC登录号76492）；Pichia angusta(Teunisson et al.)Kurtzman,teleomorph作为Hansenula polymorpha de Morais et Maia,teleomorph保藏（ATCC登录号26012）；Aspergillus niger van Tieghem,anamorph（ATCC登录号9029）；Aspergillus niger van Tieghem,anamorph（ATCC登录号16404）；Aspergillus nidulans(Eidam)Winter,anamorph（ATCC登录号48756）；和Yarrowia lipolytica(Wickerham et al.)van der Walt et von Arx,teleomorph（ATCC登录号201847）。 
适用于酿酒酵母的启动子包括与PGK1基因、GAL1或GAL10基因、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶、葡糖激酶的基因、α-交配因子信息素、（a交配因子信息素）有关的启动子、PRB1启动子、GUT2启动子、GPD1启动子、及牵涉部分5’调控区与其它启动子部分5’调控区或与上游激活位点的杂合体的杂合启动子（例如EP-A-258 067的启动子）。 
用于粟酒裂殖糖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的便于调节的启动子是如Maundrell，J.Biol.Chem.265：10857-10864，1990描述的来自nmt基因的硫胺素可抑制启动子，以及如Hoffman和Winston，Genetics 124：807-816，1990描述的葡萄糖可抑制jbp1基因启动子。 
转化毕赤酵母以表达外源基因的方法的教导见例如Cregg等人，1993及多项Philips专利（例如US 4 857 467，引入本文作为参考），而毕赤酵母表达试剂盒可购自Invitrogen BV，Leek，Netherlands和Invitrogen Corp.，San Diego，California。合适的启动子包括AOX1和AOX2。Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132：3459-3465，1986包括关于汉逊酵母载体及转化的信息，合适的启动子是MOX1和FMD1；而EP 361 991，Fleer等人，1991及来自Rhone-Poulenc Rorer的其它出版物教导了如何在克鲁维酵母（Kluyveromyces spp.）中表达外源蛋白，合适的启动子是PGK1。 
转录终止信号优选真核基因的3’侧翼序列，它包含用于转录终止和多腺 苷酸化的正确信号。合适的3’侧翼序列可以是例如基因中与所用表达调控序列天然连接的那些，即可对应于启动子。或者，它们可以是不同的，在这种情况中优选酿酒酵母ADH1基因的终止信号。 
所需清蛋白融合蛋白可最初用分泌前导序列表达，它可以是在选定酵母中有效的任何前导序列。在酵母中有用的前导序列包括任何如下： 
a)MPIF-1信号序列（例如GenBank登记号AAB51134的氨基酸1-21），MKVSVAALSCLMLVTALGSQA（SEQ ID NO：6） 
b)司腺钙蛋白信号序列（MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO：7） 
c)HAS  信号序列的pre-pro区（例如MKWVTFISLLFLFS SAYSRGVFRR，SEQ ID NO：8） 
d)HAS信号序列的pre区（例如MKWVTFISLLFLFSSAYS，SEQ ID NO：9）或其变体，诸如例如MKWVSFISLLFLFSSAYS（SEQ ID NO：10） 
e)转化酶信号序列（例如MLLQAFLFLLAGFAAKISA，SEQ ID NO：11） 
f)酵母交配因子α信号序列（例如MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR，SEQ ID NO：12或MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR，SEQ ID NO：12） 
g)乳酸克鲁维酵母（K.Lactis）杀伤毒素前导序列 
h)杂合信号序列（例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR，SEQ ID NO：13） 
i)HSA/MFa-1杂合信号序列（也称为HSA/kex2）（例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR，SEQ ID NO：14） 
j)乳酸克鲁维酵母杀伤/MFα-1融合前导序列（例如MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR，SEQ ID NO：15） 
k)免疫球蛋白Ig信号序列（例如MGWSCIILFLVATATGVHS，SEQ ID NO：16） 
l)纤蛋白B  前体信号序列（例如MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA，SEQ ID NO：17） 
m)簇蛋白前体信号序列（例如MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG，SEQ ID NO：18） 
n)胰岛素样生长因子结合蛋白4信号序列（例如MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG，SEQ ID NO：19） 
o)HAS信号序列pre-pro区的变体，例如 
MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR（SEQ ID NO：20）， 
MKWVTFISLLFLFAGVLG（SEQ ID NO：21）， 
MKWVTFISLLFLFSGVLG（SEQ ID NO：22）， 
MKWVTFISLLFLFGGVLG（SEQ ID NO：23）， 
经修饰HAS前导HSA＃64-MKWVTFISLLFLFAGVSG（SEQ ID NO：24）； 
经修饰HAS前导HSA＃66-MKWVTFISLLFLFGGVSG（SEQ ID NO：25）； 
经修饰HAS(A14)前导-MKWVTFISLLFLFAGVSG（SEQ ID NO：26）； 
经修饰HAS(S14)前导（也称作经修饰HAS＃65）-MKWVTFISLLFLFSGVSG（SEQ ID NO：27）， 
经修饰HAS(G14)前导-MKWVTFISLLFLFGGVSG（SEQ ID NO：28），或MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS（SEQ ID NO：29） 
p)共有信号序列（MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO：30） 
q)酸性磷酸酶（PH05）前导（例如MFKSVVYSILAASLANA，SEQ ID NO：31） 
r)MFoz-1的pre序列 
s)0葡聚糖酶（BGL2）的pre序列 
t)杀伤毒素前导 
u)杀伤毒素的pre序列 
v)乳酸克鲁维酵母杀伤毒素prepro（29个氨基酸；16个pre氨基酸和13个pro氨基酸）MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR（SEQ ID NO：32） 
w)糖化酵母（S.diastaticus）萄糖淀粉酶II分泌前导序列 
x)卡尔酵母（S.carbergensis）α-半乳糖苷酶（MEL1）分泌前导序列 
y)假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列 
z)EP-A-387319中公开的杂合前导（引入本文作为参考） 
aa)gp67信号序列（与杆状病毒表达系统联合）（例如GenBank登记号AAA72759的氨基酸1-19）或 
bb)治疗性蛋白质X的天然前导； 
cc)酿酒酵母转化酶（SUC2）前导，公开于JP 62-096086（授权号911036516，引入本文作为参考）；或 
dd)复旋花粉酶-MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR（SEQ ID NO：33） 
ee)经修饰TA57原肽前导变体＃1- 
MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESA 
FATQTNSGGLDVVGLISMAKR（SEQ ID NO：34） 
ff)经修饰TA57原肽前导变体＃2- 
MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESA 
FATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR（SEQ ID NO：35） 
gg)共有信号肽-MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA（SEQ ID NO：111） 
jj)经修饰HSA/kex2信号序列-MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR（SEQ ID NO：112） 
kk)共有信号肽＃2-MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG（SEQ ID NO：105） 
重组和合成生产清蛋白融合蛋白的其它方法
本发明还涉及含有编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的载体、宿主细胞、以及通过合成和重组技术来生产清蛋白融合蛋白。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒、或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是复制胜任的或复制缺陷的。在后一种情况中，病毒的繁殖通常只能在互补的宿主细胞中发生。 
编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可以与含有用于在宿主中复制的选择标记的载体连接。通常，将质粒载体引入沉淀物，诸如磷酸钙沉淀物，或者是与带电荷脂质的复合物。如果载体是病毒，那么它可用适当的包装细胞系进行体外包装，然后转导到宿主细胞中。 
多核苷酸插入物应当与适当的启动子可操作连接，诸如λ噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac、trp、phA和和tac启动子、SV40早期和晚期启动子及逆转录病毒LTR等。其它合适的启动子是本领域技术人员所知道的。表达构建体中还将包含用于转录起始和终止的位点，以及转录区中用于翻译的核糖体 结合位点。由构建体表达的转录本的编码区优选在待翻译多肽的起点包括翻译起始密码子，在终点的适当位置包含终止密码子（UAA、UGA或UAG）。 
如上所述，表达载体优选包含至少一种选择标记。这样的标记包括二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶、或用于真核细胞培养的新霉素抗性、以及用于在大肠杆菌或其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性。适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉属和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞（例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris，ATCC登记号201178））；昆虫细胞，诸如果蝇S2细胞和夜蛾Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、NSO、293、和鲍斯黑素瘤细胞；及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和培养条件在本领域是知道的。 
用于细菌的优选载体包括pQE70、pQE60和pQE-9，可从QIAGEN公司购买；pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46，可从Stratagene Cloning Systems公司购买；及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可从Pharmacia Biotech公司购买。优选的真核载体有pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可从Stratagene公司购买；及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，可从Pharmacia公司购买。用于酵母系统的优选表达载体包括但不限于pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、和PAO815（均可从Invitrogen，Carlbad，CA购买）。其它合适载体对于本领域技术人员是显而易见的。 
在一个实施方案中，编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可以与信号序列融合，该信号序列将引导本发明的蛋白质定位于原核或真核细胞的特定区室和/或引导本发明的蛋白质从原核或真核细胞分泌。例如，在大肠杆菌中，可能希望将蛋白质的表达引导到周质空间。为了引导多肽表达到细菌的周质空间而与本发明的清蛋白融合蛋白融合的信号序列或蛋白质（或其片段）的例子包括但不限于pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白（MBP）信号序列、MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的信号序列、和碱性磷酸酶的信号序列。用于构建将引导蛋白质定位的融合蛋白的一些载体可通过商业途径获得，诸如pMAL系列载体（特别是pMAL-p系列）可从New England Biolabs公司购买。在一个具体的实施方案中，可将编码本 发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸与pelB果胶裂解酶信号序列融合以提高该多肽在革兰氏阴性细菌中表达和纯化的效率。参见美国专利号5,576,195和5,846,818，将其内容完整引入本文作为参考。 
为了引导本发明的清蛋白融合蛋白在哺乳动物细胞中分泌，可与其融合的信号肽的例子包括但不限于： 
a)MPIF-1信号序列（例如GenBank登记号AAB51134的氨基酸1-21），MKVSVAALSCLMLVTALGSQA（SEQ ID NO：6） 
b)司腺钙蛋白信号序列（MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO：7） 
c)HAS  信号序列的pre-pro区（例如MKWVTFISLLFLFS SAYSRGVFRR，SEQ ID NO：8） 
d)HAS信号序列的pre区（例如MKWVTFISLLFLFSSAYS，SEQ ID NO：9）或其变体，诸如例如MKWVSFISLLFLFSSAYS（SEQ ID NO：10） 
e)转化酶信号序列（例如MLLQAFLFLLAGFAAKISA，SEQ ID NO：11） 
f)酵母交配因子α信号序列（例如MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR，SEQ ID NO：12或MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR，SEQ ID NO：12） 
g)乳酸克鲁维酵母（K.Lactis）杀伤毒素前导序列 
h)杂合信号序列（例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR，SEQ ID NO：13） 
i)HSA/MFa-1杂合信号序列（也称为HSA/kex2）（例如MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR，SEQ ID NO：14） 
j)乳酸克鲁维酵母杀伤/MFα-1融合前导序列（例如MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR，SEQ ID NO：15） 
k)免疫球蛋白Ig信号序列（例如MGWSCIILFLVATATGVHS，SEQ ID NO：16） 
l)纤蛋白B  前体信号序列（例如MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA，SEQ ID NO：17） 
m)簇蛋白前体信号序列（例如MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG，SEQ ID NO：18） 
n)胰岛素样生长因子结合蛋白4信号序列（例如MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG，SEQ ID NO：19） 
o)HAS信号序列pre-pro区的变体，例如 
MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR（SEQ ID NO：20）， 
MKWVTFISLLFLFAGVLG（SEQ ID NO：21）， 
MKWVTFISLLFLF SGVLG（SEQ ID NO：22）， 
MKWVTFISLLFLFGGVLG（SEQ ID NO：23）， 
经修饰HAS前导HSA＃64-MKWVTFISLLFLFAGVSG（SEQ ID NO：24）； 
经修饰HAS前导HSA＃66-MKWVTFISLLFLFGGVSG（SEQ ID NO：25）； 
经修饰HAS(A 14)前导-MKWVTFISLLFLFAGVSG（SEQ ID NO：26）； 
经修饰HAS(S14)前导（也称作经修饰HAS＃65）-MKWVTFISLLFLFSGVSG（SEQ ID NO：27）， 
经修饰HAS(G 14)前导-MKWVTFISLLFLFGGVSG（SEQ ID NO：28），或MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS（SEQ ID NO：29） 
p)共有信号序列（MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO：30） 
q)酸性磷酸酶（PH05）前导（例如MFKSVVYSILAASLANA，SEQ ID NO：31） 
r)MFoz-1的pre序列 
s)0葡聚糖酶（BGL2）的pre序列 
t)杀伤毒素前导 
u)杀伤毒素的pre序列 
v)乳酸克鲁维酵母杀伤毒素prepro（29个氨基酸；16个pre氨基酸和13个pro氨基酸）MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR（SEQ ID NO：32） 
w)糖化酵母（S.diastaticus）萄糖淀粉酶II分泌前导序列 
x)卡尔酵母（S.carbergensis）α-半乳糖苷酶（MEL1）分泌前导序列 
y)假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列 
z)EP-A-387319中公开的杂合前导（引入本文作为参考） 
aa)gp67信号序列（与杆状病毒表达系统联合）（例如GenBank登记号AAA72759的氨基酸1-19）或 
bb)治疗性蛋白质X的天然前导； 
cc)酿酒酵母转化酶（SUC2）前导，公开于JP 62-096086（授权号911036516，引入本文作为参考）；或 
dd)复旋花粉酶-MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR（SEQ ID NO：33） 
ee)经修饰TA57原肽前导变体＃1- 
MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR（SEQ ID NO：34） 
ff)经修饰TA57原肽前导变体＃2- 
MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR（SEQ ID NO：35） 
gg)共有信号肽-MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA（SEQ ID NO：111） 
jj)经修饰HSA/kex2信号序列-MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR（SEQ ID NO：112） 
kk)共有信号肽＃2-MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG（SEQ ID NO：105） 
在一个优选的实施方案中，将经修饰HAS/kex2信号序列（SEQ ID NO：112）融合到清蛋白融合蛋白的氨基末端，包括本文描述的包含清蛋白和治疗性蛋白质的融合蛋白，以及WO 93/15199、WO 97/24445、WO 03/60071、WO 03/59934、和PCT/US04/01369中公开的清蛋白融合蛋白，将每一篇完整引入本文作为参考。经修饰HSA/kex2信号序列是以HSA/kex2信号序列（SEQ ID NO：14）为基础的，它公开于例如Sleep等人，Biotechnology 8：42-46，1990；和美国专利5,302,697，将这两篇完整引入本文作为参考。本文中公开的经修饰HSA/kex2前导序列在亲本信号肽的第19位残基处含有非保守氨基酸替代（Arg变成Gly）。发现在酵母中表达时，经修饰HSA/kex2信号序列与未修饰HSA/kex2信号序列相比，使清蛋白融合蛋白产生预料不到的更好表达产率和/或更好切割效率。本发明还涵盖经修饰HSA/kex2信号肽的变体。具体而言，SEQ ID NO：112的第19位Gly残基可用Pro残基替代。还设想了经修饰HSA/kex2信号序列的其它保守替代变体。本发明还涵盖编码SEQ ID NO：112的经修饰HSA/kex2信号序列的核酸及其保守替代变体。 
利用谷氨酰胺合酶（GS）或DHFR作为选择标记的载体可分别在存在药物硫代甲硫氨酸(methionine sulphoximine)或氨甲碟呤时扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优点是谷氨酰胺合酶阴性的细胞系（例如鼠骨髓瘤细胞系，NSO）易于获得。谷氨酰胺合酶表达系统还可通过提供阻止内源基因发挥功能的额外抑制剂而在谷氨酰胺合酶表达细胞（例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞）中发挥功能。谷氨酰胺合酶表达系统及其组分详见PCT公开：WO 87/04462；WO 86/05807；WO 89/01036；WO 89/10404；和WO 91/06657，将其完整引入本文作为参考。另外，谷氨酰胺合酶表达载体可从Lonza Biologics公司（Portsmouth，NH）购买。利用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达和生成单克隆抗体见Bebbington等人，Bio/technology 10：169，1992；及Biblia和Robinson，Biotechnol.Prog.11：1，1995，将其引入本文作为参考。 
本发明还涉及含有本文描述的上述载体构建体的宿主细胞，另外还涵盖含有通过本领域已知的技术与一种或多种异源控制区（例如启动子和/或增强子）可操作连接的本发明核苷酸序列的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，诸如哺乳动物细胞（例如人衍生细胞），或低等真核细胞，诸如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞。可选择能够调控所插入基因序列的表达，或者以期望的特定模式修饰和加工基因产物的宿主株。某些诱导物的存在可提高来自某些启动子的表达；如此可控制基因工程多肽的表达。另外，不同的宿主细胞对蛋白质的翻译、翻译后加工和修饰（例如磷酸化、切割）具有特点和特定机制。选择适当的细胞系可保证所表达的外源蛋白质受到期望的修饰和加工。 
将本发明的核酸和核酸构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、转染、或其它方法来实现。这些方法描述于许多标准实验室手册，诸如Davis等人，《Basic Methods In Molecular Biology》，1986。具体设想了事实上可通过缺乏重组载体的宿主细胞来表达本发明的多肽。除了涵盖含有本文所述载体构建体的宿主细胞外，本发明还涵盖经改造删除或替换了内源遗传物质（例如可用与治疗性蛋白质对应的清蛋白融合蛋白替换与治疗性蛋白质对应的编码序列）和/或引入了遗传物质（例如可引入异源多核苷酸序列，诸如例如与治疗性蛋白质对应的本发明清蛋白融合蛋白）的脊椎动物起源，特别是哺乳动物起源的原代细胞、继代细胞、和永生化细胞。与内源多核苷酸可操作相 连的遗传物质可激活、改变、和/或扩增内源多核苷酸。 
另外，可用本领域已知的技术通过同源重组使异源多核苷酸（例如编码清蛋白蛋白质或其片段或变体的多核苷酸）和/或异源控制区（例如启动子和/或增强子）与编码治疗性蛋白质的内源多核苷酸可操作相连（参见例如1997年6月24日发布的美国专利号5,641,670；国际公布号WO 96/29411；国际公布号WO 94/12650；Koller等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：8932-8935，1989；及Zijlstra等人，Nature，342：435-438，1989，将每一篇的公开内容完整引入本文作为参考）。 
本发明的清蛋白融合蛋白可通过众所周知的方法从重组细胞培养物回收和纯化，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析、疏水电荷相互作用层析、和凝集素层析。最优选的是，采用高效液相层析（“HPLC”）进行纯化。 
在优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白用阴离子交换层析进行纯化，包括但不限于在Q-Sepharose、DEAE Sepharose、poros HQ、poros DEAE、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、Toyopearl DEAE、Resource/Source Q和DEAE、Fractogel Q和DEAE柱上进行层析。 
在具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白用阳离子交换层析进行纯化，包括但不限于SP-Sepharose、CM Sepharose、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱及其等效物和可比物。 
在具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白用疏水相互作用层析进行纯化，包括但不限于苯基、丁基、甲基、辛基、己基-Sepharose，poros苯基、丁基、甲基、辛基、己基，Toyopearl苯基、丁基、甲基、辛基、己基，Resource/Source苯基、丁基、甲基、辛基、己基，Fractogel苯基、丁基、甲基、辛基、己基柱及其等效物和可比物。 
在具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白用大小排阻层析进行纯化，包括但不限于Sepharose S100、S200、S300、superdex树脂柱及其等效物和可比物。 
在具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白用亲和层析进行纯化，包括但不限于对HAS或“融合靶”分子有选择性的类染料亲和柱、肽亲和 柱和抗体亲和柱。 
在优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白用上述一种或多种层析方法进行纯化。在其它优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白用下列一种或多种层析柱进行纯化：Q Sepharose FF柱、SP Sepharose FF柱、Q Sepharose高效柱、Blue Sepharose FF柱、Blue柱、苯基Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF、或甲基柱。 
另外，本发明的清蛋白融合蛋白可用PCT国际公开WO 00/44772中描述的方法进行纯化，将其完整引入本文作为参考。本领域技术人员可容易的修改其中描述的方法以用于纯化本发明的清蛋白融合蛋白。 
本发明的清蛋白融合蛋白可从化学合成流程的产物和通过重组技术从原核或真核宿主生成的产物回收，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫、和哺乳动物细胞。根据重组生产流程中所采用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或未糖基化的。另外，在有些情况中作为宿主介导的加工的结果，本发明的清蛋白融合蛋白还可包括最初修饰的甲硫氨酸残基。因此，本领域众所周知，由翻译起始密码子编码的N-末端甲硫氨酸通常在所有真核细胞中在翻译后从任何蛋白质高效消除。虽然多数蛋白质的N-末端甲硫氨酸在多数原核细胞中也有效清除，但对于有些蛋白质来说，此原核清除加工是无效的，这取决于与N-末端甲硫氨酸共价连接的氨基酸的性质。 
在一个实施方案中，使用巴斯德毕赤酵母在真核系统中表达本发明的清蛋白融合蛋白。巴斯德毕赤酵母是能将甲醇作为唯一碳源进行代谢的甲基营养酵母。甲醇代谢途径中的主要步骤是利用O2把甲醇氧化成甲醛。此反应由乙醇氧化酶催化。为了以甲醇作为唯一碳源进行代谢，巴斯德毕赤酵母必须生成高水平的乙醇氧化酶，部分原因是乙醇氧化酶对O2的亲和力相对较低。所以，在依赖甲醇作为主要碳源的生长培养基中，两种乙醇氧化酶基因之一（AOX1）的启动子区域高度有活性。在存在甲醇时，从AOX1基因产生的乙醇氧化酶占巴斯德毕赤酵母全部可溶性蛋白质的约30%。参见Ellis,S.B.等人，Mol.Cell.Biol.5：1111-21，1985；Koutz,P.J.等人，Yeast 5：167-77，1989；Tschopp,J.F.等人，Nucl.Acids Res.15：3859-76，1987。如此，异源编码序列，诸如例如本发明的多核苷酸，在整个或部分AOX1调控序列的转录调节下，在存在甲醇时培养的毕赤酵母中以特别高的水平表达。 
在一个实施例中，本质上如“Pichia Protocols:Methods in Molecular  Biology”，D.R.Higgins和J.Cregg编，The Humana Press，Totowa，NJ，1998中描述的方法，使用质粒载体pPIC9K在毕赤酵母系统中表达本文所列编码本发明清蛋白融合蛋白的DNA。通过与位于多克隆位点上游的巴斯德毕赤酵母碱性磷酸酶（PHO）分泌信号肽（即前导）连接的强AOX1启动子，此表达质粒容许表达和分泌本发明的多肽。 
本领域技术人员将容易的领会，可使用许多其它酵母载体来替换pPIC9K，诸如pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalpha、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、和PAO815，只要建议的表达构建体提供适当定位的转录、翻译、分泌（如果需要的话）等信号，包括相同读码框内的所需AUG。 
在另一个实施方案中，异源编码序列，诸如例如编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的高水平表达可通过将本发明的异源多核苷酸克隆到表达载体诸如例如pGAPZ或pGAPZalpha中并在不存在甲醇时培养酵母培养物而实现。 
另外，本发明的清蛋白融合蛋白可利用本领域已知技术化学合成（例如参见Creighton，1983，Proteins:Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman & Co.，N.Y.；及Hunkapiller等人，Nature，310：105-111，1984）。例如，相当于多肽之片段的多肽可使用多肽合成仪来合成。另外，如果需要的话，非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可作为替代或添加而引入到多肽序列中。非经典氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、b-丙氨酸、氟代氨基酸、带标签氨基酸诸如b-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸、及一般的氨基酸类似物。另外，氨基酸可以是D型（右旋的）或L型（左旋的）。 
本发明涵盖在翻译中或翻译后进行不同修饰的本发明清蛋白融合蛋白，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团衍生、蛋白水解切割、与抗体分子或其它细胞配体的连接等。可通过已知技术进行任何众多化学修饰，包括但不限于溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特异化学切割；乙酰化、甲酰化、氧化、还原； 在存在衣霉素时的代谢合成；等等。 
本发明所涵盖的其它翻译后修饰包括例如N-连接或O-连接的碳水化合物链、N-末端或C-末端的加工、在氨基酸主链上附着化学模块、N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰、及添加或删除由于原核宿主细胞表达而产生的N-末端甲硫氨酸残基。清蛋白融合蛋白还可用可检测标记物进行修饰，诸如酶、荧光素、同位素或亲和标记物，从而能够检测和分离蛋白质。 
合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱脂酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲合素/生物素和亲合素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、荧光素、和水母发光蛋白；而合适的放射性物质的例子包括碘（121I、123I、125I、131I）、碳（14C）、硫（35S）、氚（3H）、铟（111In、112In、113In、115mIn）、锝（99Tc、99mTc）、铊（201Ti）、镓（68Ga、67Ga）、钯（103Pd）、钼（99Mo）、氙（133Xe）、氟（18F）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、 140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、和97Ru。 
在具体的实施方案中，将本发明的清蛋白融合蛋白或其片段或其变体附着于与射电金属离子缔合的大环螯合剂，所述射电金属离子包括但不限于 177Lu、90Y、166Ho、和153Sm。在一个优选的实施方案中，与大环螯合剂缔合的射电金属离子是111In。在另一个优选的实施方案中，与大环螯合剂缔合的射电金属离子是90Y。在具体的实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸（DOTA）。在其它具体的实施方案中，DOTA通过接头分子附着于本发明的抗体或其片段。可用于将DOTA与多肽缀合的接头分子的例子在本领域是普遍知道的，参见例如DeNardo等人，Clin.Cancer Res.4(10)：2483-90，1998；Peterson等人，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7，1999；及Zimmerman等人，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，1999；将其完整引入本文作为参考。 
如上所述，本发明的清蛋白融合蛋白可通过天然过程进行修饰，诸如翻译后加工，或者通过本领域众所周知的化学修饰技术进行修饰。应领会，在给定的多肽中，相同类型的修饰可在几个位点处以相同或不同程度存在。本发明的多肽可以是分枝的，例如由于泛蛋白化作用导致的分枝，而且它们也可以是环状的，有或没有分枝。环状的、分枝的、和分枝环状的多肽可以是 由翻译后天然加工造成的，也可以是由合成方法造成的。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素模块的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚的形成、羟化、碘化、甲基化、肉豆蔻基化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、硒酰化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质上添加氨基酸诸如精氨酰化、和泛蛋白化（参见例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson编，Academic Press，New York，pg.1-12，1983；Seifter等人，Meth.Enzymol.182：626-646，1990；Rattan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992） 
可将结合治疗性蛋白质或其片段或变体的本发明清蛋白融合蛋白和抗体与标志物序列融合，诸如便于纯化的肽。在优选的实施方案中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽，诸如在pQE载体中提供的标签（QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）等，它们中的许多可通过商业途径获得。例如，如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824，1989中所述，六组氨酸为融合蛋白的纯化提供便利。可用于纯化的其它肽标签包括但不限于“HA”标签，它对应于衍生自流感血凝素蛋白质的表位（Wilson等人，Cell 37：767，1984），还有“flag”标签。 
另外，可将本发明的清蛋白融合蛋白与治疗性模块缀合，诸如细胞毒素，例如抑制细胞剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子，例如α-发射体，诸如例如213Bi。细胞毒素或胞毒剂包括对细胞有害的任何试剂。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢物（例如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺）、烷化剂（例如二氯甲基二乙胺（氮芥）、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀（BSNU）和洛莫司汀（CCNU）、 环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺二氯二氨络铂（II）（DDP）顺铂）、蒽环类（例如柔红霉素（以前称为道诺霉素）和阿霉素）、抗生素（例如更生霉素（以前称为放线菌素），博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素（AMC））和抗有丝分裂剂（例如长春新碱和长春花碱）。 
本发明的缀合物可用于修饰给定的生物学应答，并不认为治疗剂或药物模块限于经典的化学治疗剂。例如，药物模块可以是具有期望生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括例如毒素，诸如相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂例如TNF-α、TNF-β、AIM I（参见国际公布号WO 97/33899）、AIM II（参见国际公布号WO 97/34911）、Fas配体（Takahashi等人，Int.Immunol.6：1567-1574，1994）、VEGI（参见国际公布号WO 99/23105）、血栓形成剂或抗血管发生剂，例如血管他丁或内皮他丁；或生物学应答修饰剂，诸如例如淋巴因子、白介素-1（“IL-1”）、白介素-2（“IL-2”）、白介素-6（“IL-6”）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（“GM-CSF”）、粒细胞集落刺激因子（“G-CSF”）或其它生长因子。用于将这些治疗性模块缀合到蛋白质（例如清蛋白融合蛋白）上的技术是本领域众所周知的。 
还可以将清蛋白融合蛋白附着于固相支持物，这对本发明清蛋白融合蛋白所结合的、与其结合的、或与之缔合的多肽的免疫测定法或纯化是特别有用的。这种固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。 
清蛋白融合蛋白，有或没有与治疗性模块缀合，可单独施用或与可用作治疗剂的细胞毒性因子和/或细胞因子联合施用。 
在本发明的清蛋白融合蛋白只包含结合治疗性蛋白质的抗体的VH结构域的实施方案中，可能必须和/或希望共表达结合治疗性蛋白质的相同抗体的VL结构域的融合蛋白，使得所述VH-清蛋白融合蛋白和VL蛋白质在翻译后（共价或非共价）结合。 
在本发明的清蛋白融合蛋白只包含结合治疗性蛋白质的抗体的VL结构域的实施方案中，可能必须和/或希望共表达结合治疗性蛋白质的相同抗体的VH结构域的融合蛋白，使得所述VL-清蛋白融合蛋白和VH蛋白质在翻译后（共价或非共价）结合。 
有些治疗性抗体是双特异性抗体，这意味着结合治疗性蛋白质的抗体是人工杂合抗体，它具有两对不同的重链/轻链和两个不同的结合位点。为了产生与该治疗性蛋白质对应的清蛋白融合蛋白，有可能创建这样的清蛋白融合蛋白，即它在清蛋白蛋白质模块的N-和C-两个末端都融合有scFv片段。更具体的说，融合于清蛋白N末端的scFv将对应于结合治疗性蛋白质的原始抗体的一对重链/轻链（VH/VL），而融合于清蛋白C末端的scFv将对应于结合治疗性蛋白质的原始抗体的另一对重链/轻链（VH/VL）。 
本发明还提供了本发明清蛋白融合蛋白的化学修饰衍生物，它可提供额外的优点，诸如多肽的可溶性、稳定性和循环时间增加或免疫原性降低（参见美国专利号4,179,337）。用于衍生物的化学模块可选自水溶性聚合物，诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇等。清蛋白融合蛋白可在分子内的随机位置或在分子内的预定位置进行修饰，且可包含一个、两个、三个或更多附着的化学模块。 
聚合物可以是任何分子量的，且可以是分枝的或不分枝的。对于聚乙二醇，为了易于操作和制造，优选的分子量在约1kDa和约100kDa之间（术语“约”指的是在聚乙二醇制品中，一些分子可能比规定的分子量大或小）。也可采用其它分子量，这取决于期望的治疗特性（例如期望的缓释时间、如果有的话对生物学活性的影响、操作的容易程度、抗原性的程度或缺乏、及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物的其它已知效果）。例如，聚乙二醇的平均分子量可以是约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa。 
如上所述，聚乙二醇可具有分枝结构。分枝的聚乙二醇描述于例如美国专利号5,643,575；Morpurgo等人，Appl.Biochem.Biotechnol.56：59-72，1996；Vorobjev等人，Nucleosides Nucleotides 18：2745-2750，1999；及Caliceti等人，Bioconjug.Chem.10：638-646，1999，将每一篇的公开内容引入本文作为参考。 
在将聚乙二醇分子（或其它化学模块）附着于蛋白质时应考虑对蛋白质功能性或抗原性区域的影响。本领域技术人员可利用多种附着方法，诸如例如EP 0 401 384中公开的方法（将PEG偶联到G-CSF上），引入本文作为参考；也可参见Malik等人，Exp.Hematol.20：1028-1035，1992，其中报道了用三氟乙烷磺酸(tresyl)氯化物将GM-GSF进行PEG化。例如，聚乙二醇可经由氨基酸残基通过反应基诸如游离氨基或羧基共价附着。反应基是可结合活化聚乙二醇分子的基团。具有游离氨基的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；具有游离羧基的氨基酸可包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基也可用作用于附着聚乙二醇分子的反应基。为了治疗目的而优选的是附着于氨基，诸如附着于N末端或赖氨酸基团上。 
如上所述，聚乙二醇可通过与任何多种氨基酸残基的连接而附着在蛋白质上。例如，聚乙二醇可通过与赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸残基的共价键而与蛋白质连接。可采用一种或多种反应化学将聚乙二醇附着于蛋白质的特定氨基酸残基（例如赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸）或蛋白质的超过一种类型的氨基酸残基（例如赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸及其组合）。 
可能特别希望在N末端化学修饰蛋白质。以聚乙二醇作为组合物的例子，可在多种聚乙二醇分子（根据分子量、分枝情况、等）、反应混合物中聚乙二醇分子和蛋白质（多肽）分子之间的比例、待进行PEG化反应的类型、及获得选定N末端PEG化蛋白质的方法中进行选择。获得选定N末端PEG化制品的方法（即在必要时将此模块与其它单PEG化模块分离）可以是通过从PEG化蛋白质分子群体中纯化N末端PEG化物质。在N末端选择性化学修饰蛋白质可通过还原性烷化来实现，还原性烷化利用特定蛋白质可用于衍生的不同类型伯氨基（赖氨酸对N末端）的差异反应性。在适当反应条件下，用含羧基聚合物在N端实现蛋白质的基本上选择性衍生。 
如上所述，本发明清蛋白融合蛋白的PEG化可通过多种方法来实现。例如，可将聚乙二醇直接或通过中间接头附着于清蛋白融合蛋白。用于将聚乙二醇附着于蛋白质的无接头系统描述于Delgado等人，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304，1992；Francis等人，Intern.J.of Hematol.68：1-18，1998；美国专利号4,002,531；美国专利号5,349,052；WO 95/06058；及WO 98/32466，将每一篇的公开内容引入本文作为参考。 
用于将聚乙二醇直接附着于蛋白质的氨基酸残基而没有中间接头的一种系统采用三氟乙烷磺酸化MPEG，它是用三氟乙烷磺酸的氯化物（ClSO2CH2CF3）对单甲氧聚乙二醇（MPEG）进行修饰而生成的。在蛋白质与三氟乙烷磺酸化MPEG反应后，将聚乙二醇直接附着于蛋白质的氨基。如此，本发明包括通过使本发明的蛋白质与具有2,2,2-三氟乙烷磺酸基的聚乙二醇分子发生反应而生成的蛋白质-聚乙二醇缀合物。 
还可用多种不同中间接头将聚乙二醇附着于蛋白质。例如，美国专利号5,612,460公开了用于将聚乙二醇连接到蛋白质上的尿烷接头，将其完整公开书引入本文作为参考。其中聚乙二醇通过接头附着于蛋白质的蛋白质-聚乙二醇缀合物还可通过使蛋白质与下列化合物发生反应来生成，诸如MPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸盐/酯、用1，1′-羰基二咪唑活化的MPEG、MPEG-2,4,5-三氯戊基碳酸盐/酯、MPEG-对硝基苯酚碳酸盐/酯、及各种MPEG-琥珀酸盐/酯衍生物。国际公开号WO 98/32466中描述了用于将聚乙二醇附着于蛋白质的许多其它聚乙二醇衍生物和反应化学，将其完整公开书引入本文作为参考。利用本文记载的反应化学生成的PEG化蛋白质产物包括在本发明的范围之内。 
每个本发明清蛋白融合蛋白上附着的聚乙二醇模块的数目（即取代程度）也可以有所变化。例如，本发明的PEG化蛋白质可以连接有平均1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多聚乙二醇分子。类似的，平均取代程度的范围是每个蛋白质分子连接有1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19或18-20个聚乙二醇模块。用于测定取代程度的方法在文献中有讨论，例如参见Delgado等人，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304，1992。 
本发明的多肽可通过标准方法从化学合成和重组细胞培养物回收和纯化，包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析、和凝集素层析。最优选的是，采用高效液相层析（“HPLC”）进行纯化。当多肽在分离和/或纯化过程中变性时，可采用众所周知的使蛋白质重折叠的技术来恢复活性构象。 
本发明清蛋白融合蛋白的存在和数量可用本领域众所周知的免疫测定法即ELISA测定。在可用于检测/定量本发明清蛋白融合蛋白的一种ELISA方案中，包括以下步骤：用抗人血清清蛋白抗体包被ELISA板，将板封闭 以阻止非特异性结合，清洗ELISA板，（以一种或多种不同浓度）加入含有本发明清蛋白融合蛋白的溶液，加入缀合有可检测标记物（如本文所述或本领域其它途径知道的）的抗治疗性蛋白质的特异性二抗，并检测二抗的存在。在此方案的可选形式中，ELISA板可用抗治疗性蛋白质的特异性抗体包被且经标记二抗可以是抗人清蛋白特异性抗体。 
多核苷酸的用途
本发明鉴定的每一种多核苷酸都可以多种方式用作试剂。下面的说明应认为是示范性的且利用了已知技术。 
本发明的多核苷酸可用于生成本发明的清蛋白融合蛋白。正如下文更详细的说明，（编码清蛋白融合蛋白的）本发明的多核苷酸可在重组DNA方法中用于通过基因工程产生表达由编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸所编码的清蛋白融合蛋白的细胞、细胞系或组织。 
本发明的多核苷酸还可用于基因疗法。基因疗法的一个目的是向具有缺陷基因的生物体中插入正常基因，以校正遗传缺陷。本发明公开的多核苷酸提供了以高度精确的方式靶向这些遗传缺陷的方法。另一个目的是插入宿主基因组中不存在的新基因，从而使宿主细胞产生新特征。本文其它地方更详尽的描述了本发明所涵盖的基因疗法的其它非限制性例子（参见例如标题为“基因疗法”的部分，以及实施例61和62）。 
多肽的用途
本发明鉴定的每一种多肽都可以多种方式应用。下面的说明应认为是示范性的且利用了已知技术。 
本发明的清蛋白融合蛋白可用于提供免疫学探针，用于差示鉴别组织（利如免疫组织化学测定法，诸如例如ABC免疫过氧化物酶(Hsu等人，J.Histochem.Cytochem.29：577-580，1981）或细胞类型（例如免疫细胞化学测定法）。 
清蛋白融合蛋白可用于使用本领域技术人员知道的经典免疫组织学方法测定生物学样品中的多肽水平（例如参见Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101：976-985，1985；Jalkanen等人，J.Cell.Biol.105：3087-3096，1987）。可用于检测蛋白质基因表达的其它方法包括免疫测定法，诸如酶联免疫吸附测定法（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）。合适的测定标记物是本领域所知道的，包括酶标记物，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘（131I、125I、 123I、121I）、碳（14C）、硫（35S）、氚（3H）、铟（115mIn、113In、112In、111In）、 锝（99Tc、99mTc）、铊（201Ti）、镓（68Ga、67Ga）、钯（103Pd）、钼（99Mo）、氙（133Xe）、氟（18F）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、 90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、和97Ru；发光标记物，诸如鲁米诺；荧光标记物，诸如荧光素和罗丹明；以及生物素。 
本发明的清蛋白融合蛋白还可通过成像在体内检测。用于蛋白质体内成像的标记物或标志物包括可通过X-射线照相术、核磁共振（NMR）或电子自旋共振（electron spin relaxtion，ESR）检测的物质。对于X-射线照相术，合适的标记物包括放射性同位素，诸如钡或铯，它们发出可检测的辐射但对受试者没有明显的伤害。NMR和ESR的合适标志物包括具有可检测的特征性自旋的物质，诸如氘，它可通过标记对提供给表达本发明清蛋白融合蛋白的细胞系的营养物而掺入清蛋白融合蛋白。 
将经适当可检测成像模块，诸如放射性同位素（例如131I、112In、99mTc、碘（131I、125I、123I、121I）、碳（14C）、硫（35S）、氚（3H）、铟（115mIn、113mIn、 112In、111In）、锝（99Tc、99mTc）、铊（201Ti）、镓（68Ga、67Ga）、钯（103Pd）、钼（99Mo）、氙（133Xe）、氟（18F）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、 166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru）、射线不通透物质、或可通过核磁共振检测的物质标记的清蛋白融合蛋白导入（例如肠胃外、皮下、或腹膜内）有待检查免疫系统紊乱的哺乳动物。本领域将理解，受试者的大小和所用的成像系统将决定产生诊断影像所需的成影模块的量。在放射性同位素模块的例子中，对于人类受试者，注射放射性的量通常在约5至20毫居里99mTc的范围内。然后将标记清蛋白融合蛋白将优先在体内存在一种或多种报道分子、配体或底物（与用于生成本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质的报道分子、配体或底物对应）的部位（例如器官、细胞、细胞外空间或基质）积累。或者，在清蛋白融合蛋白至少包含治疗性抗体的片段或变体的情况中，经标记清蛋白融合蛋白将优先在身体中存在与（用于生成本发明清蛋白融合蛋白的）治疗性抗体所结合的多肽/表位对应的多肽/表位的部位（例如器官、细胞、细胞外空间或基质）积累。体内肿瘤成像的描述可参见S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments”，第13章，《Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer》，S.W.Burchiel和B.A.Thodes编，Masson Publishing Inc.，1982。本领域技术人员可容易的修改其中描述的方案以用于本发明的清蛋白融合蛋白。 
在一个实施方案中，本发明提供了通过施用与异源多肽或核酸分子缔合的本发明清蛋白融合蛋白（例如由编码本发明清蛋白融合蛋白和/或抗体的多核苷酸所编码的多肽）而将本发明的清蛋白融合蛋白特异投递至细胞的方法。在一个实施例中，本发明提供了将治疗性蛋白质投递到靶细胞中的方法。在另一个实施例中，本发明提供了将单链核酸（例如反义或核酶）或双链核酸（例如可整合到细胞基因组中或作为游离体复制并能转录的DNA）投递到靶细胞中的方法。 
在另一个实施方案中，本发明提供了通过施用与毒素或细胞毒性药物前体缔合的本发明清蛋白融合蛋白而特异性破坏细胞（例如破坏肿瘤细胞）的方法。 
“毒素”指结合并活化内源细胞毒效应系统的一种或多种化合物、放射性同位素、全毒素、改良毒素、毒素的催化亚基、或细胞中或表面上通常不存在的、在特定条件下引起细胞死亡的任何分子或酶。可依照本发明的方法使用的毒素包括但不限于本领域已知的放射性同位素、化合物诸如例如结合固有的或诱导的内源细胞毒效应系统的抗体（或其含补体固定部分）、胸苷激酶、内切核酸酶、α-毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、肥皂草毒蛋白、苦瓜毒蛋白、多花白树毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、α-帚曲霉素和霍乱毒素。“毒素”还包括抑制细胞剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，例如α-发射体，诸如例如213Bi，或其它放射性同位素，诸如例如103Pd、 133Xe、131I、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、35S、90Y、153Sm、153Gd、169Yb、51Cr、 54Mn、75Se、113Sn、90钇、117锡、186铼、166钬、和188铼；发光标记物，诸如鲁米诺；荧光标记物，诸如荧光素和罗丹明；以及生物素。在一个具体的实施方案中，本发明提供了通过施用与放射性同位素90Y缔合的本发明多肽或抗体而特异性破坏细胞（例如破坏肿瘤细胞）的方法。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了通过施用与放射性同位素111In缔合的本发明多肽或抗体而特异性破坏细胞（例如破坏肿瘤细胞）的方法。在另一个具体的的实施方案中，本发明提供了通过施用与放射性同位素131I缔合的本发明多肽或抗体而特异性破坏细胞（例如破坏肿瘤细胞）的方法。 
可使用本领域已知的技术来标记本发明的多肽。这些技术包括但不限于双功能缀合剂的应用（参见例如美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119； 4,994,560；和5,808,003；将每一篇的内容完整引入本文作为参考）。 
本发明的清蛋白融合蛋白可用于诊断、治疗、预防和/或预测哺乳动物优选人的各种紊乱。这样的紊乱包括但不限于本文中下文标题为“生物学活性”部分所记载的。 
如此，本发明提供了诊断紊乱的方法，包括（a）用本发明的清蛋白融合蛋白测定个体的细胞或体液中某种多肽的表达水平；并（b）将测得的多肽表达水平与标准多肽表达水平相比较，测得的多肽表达水平相对于标准表达水平的升高或降低作为紊乱的指标。对于癌症而言，个体活检组织中出现相对大量的转录物可能指示疾病发展的倾向，或者可提供在实际临床症状出现前检测疾病的方法。这种类型的更确切诊断可以使医务人员更早采用预防措施或攻击治疗以阻止癌症的发展或进一步加重。 
另外，本发明的清蛋白融合蛋白可用于治疗或预防下列疾病或状况，诸如例如神经紊乱、免疫系统紊乱、肌肉紊乱、生殖紊乱、胃肠紊乱、肺紊乱、心血管紊乱、肾紊乱、增殖性紊乱、和/或癌性疾病和状况。例如，可给患者施用本发明的多肽，以替代缺失或水平下降的多肽（例如胰岛素）、补充缺失或水平较低的不同多肽（例如血红蛋白S以补充血红蛋白B、SOD、过氧化氢酶、DNA修复蛋白）、抑制多肽的活性（例如癌基因或肿瘤抑制基因）、活化多肽的活性（例如结合到受体上）、通过与膜结合受体竞争游离配体来降低膜结合受体的活性（例如在降低炎症时使用可溶性TNF受体）、或引起期望应答（例如抑制血管生长、增强对增殖细胞或组织的免疫应答）。 
具体而言，至少包含治疗性抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白可用于治疗疾病（正如上文和本文其它地方所述）。例如，施用至少包含治疗性抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白可结合和/或中和用于生成清蛋白融合蛋白的治疗性抗体所特异结合的多肽，和/或减少用于生成清蛋白融合蛋白的治疗性抗体所特异结合的多肽的过量产生。类似的，施用至少包含治疗性抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白可活化用于生成清蛋白融合蛋白的治疗性抗体所特异结合的多肽，其通过结合膜（受体）上结合的多肽而实现。 
至少，使用本领域技术人员熟知的方法，本发明的清蛋白融合蛋白可在SDS-PAGE凝胶上或分子筛凝胶过滤柱中用作分子量标志物。本发明的清蛋白融合蛋白还可用于产生抗体，抗体继而可用于测量来自重组细胞的治疗性蛋白质、清蛋白蛋白质、和/或本发明清蛋白融合蛋白的蛋白质表达，作为评 估宿主细胞转化或生物学样品的方法。另外，本发明的清蛋白融合蛋白可用于测试本文描述的生物学活性。 
诊断性测定法
本发明的化合物可用于诊断、治疗、预防和/或预测哺乳动物特别是人的各种紊乱。这样的紊乱包括但不限于表1对应行中及本文中标题为“免疫活性”、“血液相关紊乱”、“过度增殖性紊乱”、“肾紊乱”、“心血管紊乱”、“呼吸紊乱”、“抗血管发生活性”、“细胞水平疾病”、“伤口愈合和上皮细胞增殖”、“神经活性和神经学疾病”、“内分泌紊乱”、“生殖系统紊乱”、“传染病”、“再生”、和/或“胃肠紊乱”的部分中为每种治疗性蛋白质所记载的紊乱。 
对于许多紊乱来说，可在取自患有这样一种紊乱的个体的组织、细胞或体液（例如血清、血浆、尿液、精液、滑液或脊髓液）中检测到基因表达水平相对于“标准”基因表达水平即取自没有该紊乱的个体的组织或体液中的表达水平的实质性改变（上升或下降）。因此，本发明提供了在紊乱的诊断过程中有用的诊断方法，包括测量取自个体的组织、细胞或体液中编码多肽的基因的表达水平，并将测得的基因表达水平与标准基因表达水平比较，基因表达水平相对于标准的上升或降低为紊乱的指示。这些诊断性测定法可在体内或在体外进行，诸如例如在血样、活检组织或尸检组织上进行。 
本发明还可用作预测指示，由此显示出基因表达增强或降低的患者将遭受糟糕的临床结果。 
“测定编码多肽的基因的表达水平”意图定性或定量测量或估计第一生物学样品中本发明特定多肽（例如与表1中所公开的治疗性蛋白质对应的多肽）的水平或编码多肽的mRNA的水平，或是直接的（例如通过测定或估计蛋白质或mRNA的绝对水平）或是相对的（例如通过与第二生物学样品中多肽或mRNA水平相比较）。优选的是，测量或估计第一生物学样品中的多肽表达水平或mRNA水平，并与标准的多肽水平或mRNA水平进行对比，标准来自没有该紊乱的个体的第二生物学样品，或者由没有该紊乱的个体人群的平均水平决定。本领域技术人员将领会，一旦知道了标准多肽水平或mRNA水平，它可以重复用作比较的标准。 
“生物学样品”意指取自个体、细胞系、组织培养物、或含有本发明多肽（包括其部分）或mRNA的其它来源的任何生物学样品。正如上文所指出的，生物学样品包括体液（诸如血清、血浆、尿液、精液、滑液和脊髓液） 和发现表达多肽或mRNA的全长或其片段的组织来源。从哺乳动物取得活检组织和体液的方法在本领域是众所周知的。在生物学样品包括mRNA时，活检组织是优选的来源。 
可以用任何适当的技术从生物学样品分离总细胞RNA，诸如Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162：156-159，1987中记载的一步硫氰酸胍-苯酚-氯仿法。然后可采用任何适当的方法测定编码本发明多肽的mRNA的水平。这些包括Northern印迹分析、S1核酸酶作图、聚合酶链式反应（PCR）、逆转录联合聚合酶链式反应（RT-PCR）、和逆转录联合连接酶链式反应（RT-LCR）。 
本发明还涉及用于检测生物学样品（例如细胞和组织）中与本发明清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽的水平的诊断性方法法，诸如定量的和诊断性的测定法，包括测定多肽的正常和异常水平。如此，例如，依照本发明的用于检测与清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽相对于正常对照组织样品的异常水平的诊断性测定法可用于检测肿瘤的存在。可用于测定衍生自宿主的样品中与本发明清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽的水平的测定技术对本领域技术人员是熟知的。这样的测定方法包括放射免疫测定法、竞争性结合测定法、Western印迹分析和ELISA测定法。可用本领域已知的任何方法来测定生物学样品中的多肽水平。 
可以用多种技术来测定生物学样品中的多肽水平。例如，可以用经典的免疫组织学方法（Jalkanen等人，J.Cell.Biol.101：976-985，1985；Jalkanen,M.等人，J.Cell.Biol.105：3087-3096，1987）来研究组织中的多肽表达。可用于检测多肽基因表达的其它方法包括免疫测定法，诸如酶联免疫吸附测定法（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）。合适的抗体测定标记物是本领域所知道的，包括酶标记物，诸如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素，诸如碘（125I、 121I）、碳（14C）、硫（35S）、氚（3H）、铟（112In）和锝（99mTc），和荧光标记物，诸如荧光素和罗丹明，及生物素。 
待分析的组织或细胞类型通常包括那些已知或怀疑表达目的基因的那些（诸如例如癌）。本发明中采用的蛋白质分离方法可以是例如诸如Harlow和Lane（Harlow，E.和Lane,D.，1988，“Antibodies:A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York）中所记 载的，将其完整引入本文作为参考。分离的细胞可衍生自细胞培养物或来自患者。对来自培养物的细胞进行分析可能是对可用作基于细胞的基因治疗技术的一部分的细胞进行评估或者测试化合物对基因表达的影响的必要步骤。 
例如，清蛋白融合蛋白可用于定量或定性检测与本发明清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽的存在。这可通过例如免疫荧光技术来实现，它使用荧光标记的清蛋白融合蛋白，并与光学显微镜检查、流式细胞术或荧光分析法检测相偶联。 
在一个优选的实施方案中，至少包含特异结合至少一种本发明中公开的或本领域其它途径知道的治疗性蛋白质（例如表1中公开的治疗性蛋白质）的抗体的片段或变体的清蛋白融合蛋白可用于定量或定性检测基因产物或其保守变体或肽片段的存在。这可通过例如免疫荧光技术来实现，它采用荧光标记的抗体，并与光学显微镜检查、流式细胞术或荧光分析法检测相偶联。 
本发明的清蛋白融合蛋白还可在组织学上用于像在免疫荧光、免疫电子显微镜或非免疫学测定法中用于原位检测与本发明清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽。原位检测可通过从患者取出组织学标本，并对其应用经过标记的抗体或本发明多肽来实现。优选通过将经过标记的清蛋白融合蛋白覆盖在生物学样品上来应用清蛋白融合蛋白。通过这样一种程序，不仅有可能确定与清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽的存在，还可能确定其在受检组织中的分布。利用本发明，本领域技术人员将容易的察觉可修改极其多种组织学方法中的任何一种（诸如染色程序）来实现原位检测。 
检测与清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽的免疫测定法和非免疫测定法通常包括将样品，诸如生物学液体、组织提取物、新收集的细胞、或已在细胞培养中保温过的细胞的裂解物，在存在能够结合基因产物或其保守变体或肽片段的可检测经标记抗体时保温，并通过本领域众所周知的多种技术中的任何一种来检测结合的抗体。 
可以使生物学样品与固相支持物或载体接触并固定在上面，诸如硝酸纤维素或能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的其它固相支持物其。然后可以用合适的缓冲液清洗支持物，随后用可检测经标记的本发明清蛋白融合蛋白进行处理。然后可用缓冲液再次清洗固相支持物以除去未结合的抗体或多肽。任选随后标记抗体。然后可通过常规方法检测固相支持物上结合的标 记物的数量。 
“固相支持物或载体”意指能够结合多肽（例如清蛋白融合蛋白，或与本发明清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽）的任何支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然的和改良的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩、和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质可以是一定程度可溶的或者不溶的。事实上支持物可具有任何可能的结构外形，只要偶联的分子能够结合多肽。因此，支持物的外形可以是球形的，如珠子，或圆柱形的，如试管的内壁，或杆的外表面。或者，表面可以是平的，诸如薄片、试纸条等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员还知道适于结合抗体或抗原的许多其它载体，或者能够通过常规实验确定合适的载体。 
给定批次的多种清蛋白融合蛋白的结合活性可依照众所周知的方法来测定。本领域技术人员通过常规实验将能够确定每种测定的操作和最佳测定条件。 
除了测定取自个体的生物学样品中的多肽水平以外，还可通过成像在体内检测多肽。例如，在本发明的一个实施方案中，使用本发明的清蛋白融合蛋白来对患病的细胞或赘生物细胞成像。 
用于本发明清蛋白融合蛋白体内成像的标记物或标志物包括可用X-射线照相术、NMR、MRI、CAT-扫描或ESR检测的物质。对于X-射线照相术，合适的标记物包括放射性同位素，诸如钡或铯，它们发出可检测的辐射但对受试者没有明显的伤害。适用于NMR和ESR的标志物包括具有可检测的特征性自旋的物质，诸如氘，它可通过标记经改造细胞系（或者细菌或酵母菌株）的营养物而掺入清蛋白融合蛋白。 
另外，可施用其存在可检测的本发明清蛋白融合蛋白。例如，可施用经射线不透性化合物或其它适当化合物标记的本发明清蛋白融合蛋白并在体内成像，正如上文关于标记抗体所讨论的。另外，这样的多肽还可用于体外诊断程序。 
将经适当可检测成像模块诸如放射性同位素（例如131I、112In、99mTc）、射线不透性物质、或可通过核磁共振检测的物质标记的多肽特异性抗体或抗体片段导入（例如肠胃外、皮下或腹膜内）有待检查紊乱的哺乳动物。本领域将理解，受试者的大小和所用的成像系统将决定产生诊断影像所需的成像 模块的量。在放射性同位素模块的例子中，对于人类受试者，注射放射性同位素的量通常在约5到20毫居里99mTc的范围内。然后经标记清蛋白融合蛋白将优先在体内含有与本发明清蛋白融合蛋白结合的、或由其结合的、或与其缔合的多肽或其它物质的部位积累。体内肿瘤成像的描述可参见S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments”，第13章，《Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer》，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，Masson Publishing Inc.，1982。 
对本发明的清蛋白融合蛋白进行可检测标记的一种方法是将它与报道酶连接，并将连接产物用于酶免疫测定法（EIA）（Voller,A.，“The enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)”，1978，Diagnostic Horizons 2：1-7，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，MD）；Voller等人，J.Clin.Pathol.31：507-520，1978；Butler,J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523，1981；Maggio,E.编，1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FL；Ishikawa,E.等人编，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo。与抗体结合的报道酶将与适当的底物优选显色底物以这样一种方式发生反应，即产生可检测的化学模块，例如通过分光光度法、荧光测定术或目测方式。可用于可检测标记抗体的报道酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，可通过比色法来进行检测，它采用报道酶的显色底物。还可通过将底物的酶促反应程度与类似制备的标准品进行目测比较而进行检测。 
清蛋白融合蛋白还可进行放射性标记并用于多种其它免疫测定法。例如，通过放射性标记清蛋白融合蛋白，有可能将清蛋白融合蛋白用于放射免疫测定法（RIA）（参见例如Weintraub,B.，Principles of radioimmunoassay,Seventh training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，1986年3月，引入本文作为参考）。可通过下列手段来检测放射性同位素，包括但不限于伽马计数器、闪烁计数器、或放射自显影。 
另外，本领域知道螯合分子且它们可用于标记清蛋白融合蛋白。螯合分子可附着于本发明的清蛋白融合蛋白以便用金属离子标记所述蛋白质，金属 离子包括放射性核素或荧光标记物。例如，参见Subramanian,R.和Meares,C.F.，“Bifunctional Chelating Agents for Radiometal-labeled monoclonal Antibodies”，在《Cancer Imaging with Radiolabeled Antibodies》中，D.M.Goldenberg编，Kluwer Academic Publications，Boston；Saji,H.，“Targeted delivery of radiolabeled imaging and therapeutic agents:bifunctional radiopharmaceuticals”，Crit.Rev.The r.Drug Carrier Syst.16：209-244，1999；Srivastava,S.C.和Mease,R.C.，“Progress in research on ligands,nuclides and techniques for labeling monoclonal antibodies”，Int.J.Rad.Appl.Instrum.B 18：589-603，1991；及Liu.S.和Edwards,D.S.，“Bifunctional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals”，Bioconjug.Chem.12：7-34，2001。可与所述清蛋白融合共价结合的任何螯合剂都可用于本发明。螯合剂还可包括连将螯合模块与清蛋白融合蛋白连接起来的接头模块。 
在一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白附着于无环螯合剂，诸如二亚乙基三胺-N,N,N’,N”,N”-五乙酸（DPTA）、DPTA的类似物、及DPTA的衍生物。作为非限制性的例子，螯合剂可以是2-(对-异硫氰酸根合苄基)-6-甲基二亚乙基三胺五乙酸（IB4M-DPTA，也称作MX-DTPA）、2-甲基-6-(ρ-硝基苄基)-1,4,7-三氮杂庚烷-N,N,N’,N”,N”-五乙酸（硝基-IB4M-DTPA或硝基-MX-DTPA）；2-(对-异硫氰酸根合苄基)-环已基二亚乙基三胺五乙酸（CHX-DTPA），或N-[2-氨基-3-(ρ-硝基苯基)丙基]-反式-环已烷-1,2-二胺-N,N’,N”-五乙酸（硝基-CHX-A-DTPA）。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白附着于无环的三联吡啶螯合剂，诸如6,6″-二[[N,N,N″,N″-四(羧甲基)氨基]甲基]-4′-(3-氨基-4-甲氧苯基)-2,2′:6′,2″-三联吡啶（TMT-胺）。 
在一个具体的实施方案中，附着于本发明清蛋白融合蛋白上的大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸（DOTA）。在其它具体的实施方案中，DOTA是通过接头分子附着于本发明清蛋白融合蛋白的。可用于将DOTA缀合到多肽上的接头分子的例子是本领域普遍知道的，参见例如DeNardo等人，Clin.Cancer Res.4(10)：2483-90，1998；Peterson等人，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7，1999；及Zimmerman等人，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，1999，将其完整引入本文作为参考。另外，美国专利5,652,361和5,756,065，其中公开了可缀合到抗体上的螯合剂及其生产和使用方法，将 其完整引入本文作为参考。尽管美国专利5,652,361和5,756,065着重于将螯合剂缀合到抗体上，但本领域技术人员可容易的将其中公开的方法进行修改从而将螯合剂缀合到其它多肽上。 
可按照M.Moi等人，J.Amer.Chem.Soc.49：2639，1989（2-对-硝基苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸）；S.V.Deshpande等人，J.Nucl.Med.31：473，1990；G.Ruser等人，Bioconj.Chem.1：345，1990；C.J.Broan等人，J.C.S.Chem.Comm.23：1739，1990；及C.J.Anderson等人，J.Nucl.Med.36：850，1995所述采用基于大环配体的双功能螯合剂，它是通过活化臂或官能基附着到配体碳骨架上而实现缀合的。 
在一个实施方案中，将大环螯合剂诸如多氮杂大环螯合剂，任选含有一个或多个羧基、氨基、异羟肟酸、膦酸、或磷酸基团，附着于本发明的清蛋白融合蛋白。在另一个实施方案中，螯合剂是选自DOTA、DOTA类似物、和DOTA衍生物的螯合剂。 
在一个实施方案中，可附着于本发明清蛋白融合蛋白的合适螯合剂分子包括DOXA（1-氧-4,7,10-三氮杂环十二烷三乙酸）、NOTA（1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸）、TETA（1,4,8,11-四氮杂环十四烷四乙酸）、和THT（4′-(3-氨基-4-甲氧-苯基)-6,6″-二(N′,N′-二羧甲基-N-甲肼)-2,2′:6′,2″-三联吡啶）及其类似物和衍生物。参见例如Ohmono等人，J.Med.Chem.35：157-162，1992；Kung等人，J.Nucl.Med.25：326-332，1984；Jurisson等人，Chem.Rev.93：1137-1156，1993；及美国专利号5,367,080。其它合适螯合剂包括美国专利号4,647,447；4,687,659；4,885,363；EP-A-71564；WO 89/00557；及EP-A-232751中公开的螯合剂。 
在另一个实施方案中，可用于本发明的合适大环羧酸螯合剂包括1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸（DOTA）；1,4,8,12-四氮杂环十五烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸（15N4）；1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N′,N″-三乙酸（9N3）；1,5,9-三氮杂环十二烷-N,N′,N″-三乙酸（12N3）；及6-溴乙酰氨基-苄基-1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸（BAT）。 
可附着于本发明清蛋白融合蛋白的优选螯合剂是α-(5-异硫氰酸根合-2-甲氧苯基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸，也称作MeO-DOTA-NCS。也可使用α-(5-异硫氰酸根合-2-甲氧苯基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸的盐或酯。 
共价附着了上述螯合剂的本发明清蛋白融合蛋白可以（通过螯合剂的配位位点）用适于治疗、诊断、或治疗兼诊断目的的放射性核素标记。合适金属的例子包括Ag、At、Au、Bi、Cu、Ga、Ho、In、Lu、Pb、Pd、Pm、Pr、Rb、Re、Rh、Sc、Sr、Tc、Tl、Y和Yb。用于诊断目的的放射性核素的例子有Fe、Gd、111In、67Ga或68Ga。在另一个实施方案中，用于诊断目的的放射性核素是111In或67Ga。用于治疗目的的放射性核素的例子有166Ho、 165Dy、90Y、115mIn、52Fe或72Ga。在一个实施方案中，用于治疗目的的放射性核素是166Ho或90Y。用于治疗兼诊断目的的放射性核素的例子包括153Sm、 177Lu、159Gd、175Yb或47Sc。在一个实施方案中，放射性核素是153Sm、177Lu、 175Yb或159Gd。 
优选的金属放射性核素包括90Y、99mTc、111In、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、 67Cu、167Tm、97Ru、188Re、177Lu、199Au、47Sc、67Ga、51Cr、177mSn、67Cu、 167Tm、95Ru、188Re、177Lu、199Au、203Pb及141Ce。 
在一个具体的实施方案中，共价附着了螯合剂的本发明清蛋白融合蛋白可以用选自90Y、111In、177Lu、166Ho、215Bi和225Ac的金属离子进行标记。 
另外，发射γ的放射性核素，诸如99mTc、111In、67Ga和169Yb已经批准用于诊断成像或正在调查中，而β发射体，诸如67Cu、111Ag、186Re和90Y可用于肿瘤治疗中的应用。其它有用的放射性核素包括γ发射体，诸如99mTc、 111In、67Ga及169Yb，而β发射体，诸如67Cu、111Ag、186Re、188Re和90Y，以及其它感兴趣的放射性核素，诸如211At、212Bi、177Lu、86Rb、105Rh、153Sm、 198Au、149Pm、85Sr、142Pr、214Pb、109Pd、166Ho、203Tl和44Sc。共价附着了螯合剂的本发明清蛋白融合蛋白可用上述放射性核素进行标记。 
在另一个实施方案中，共价附着了螯合剂的本发明清蛋白融合蛋白可用顺磁性金属离子进行标记，包括过渡金属和镧系金属的离子，诸如原子序数为21-29、42、43、44、或57-71的金属，特别是Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。用于磁共振成像组合物的顺磁性金属包括原子序号为22至29、42、44和58-70的元素。 
在另一个实施方案中，共价附着了螯合剂的本发明清蛋白融合蛋白可用荧光金属离子进行标记，包括镧系金属，特别是La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu（例如152Eu）、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。 
在另一个实施方案中，共价附着了螯合剂的本发明清蛋白融合蛋白可用含重金属的报道物进行标记，可包括Mo、Bi、Si和W的原子。 
有可能用荧光化合物标记清蛋白融合蛋白。在将荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，由于荧光，可检测到它的存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、苯二醛(ophthaldehyde)和荧胺。 
清蛋白融合蛋白还可用发射荧光的金属进行可检测标记，诸如152Eu或其它镧系金属。这些金属可用诸如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二胺四乙酸（EDTA）等金属螯合基团附着到抗体上。 
清蛋白融合蛋白还可通过与化学发光化合物的偶联而进行可检测标记。然后可通过检测化学反应过程中产生的冷光而确定化学发光标记的清蛋白融合蛋白的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。 
同样，生物发光化合物也可用于标记本发明的清蛋白融合蛋白。生物发光是在生物学系统中发现的一类化学发光，在该系统中催化性蛋白质提高化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在通过检测冷光的存在而确定。用于标记目的的重要生物发光化合物有萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。 
转基因生物体
本发明还包括表达本发明清蛋白融合蛋白的转基因生物体。转基因生物体指其中转移有重组、外源或克隆遗传物质的遗传修饰生物体。这样的遗传物质常称为转基因。转基因的核酸序列可包含一种或多种转录调控序列及其它核酸序列诸如内含子，它们可能是所编码蛋白质的最佳表达和分泌所必需的。转基因可设计成指导所编码蛋白质以这样的方式表达，即有利于由生物体或由生物体产生的产物如生物体的乳汁、血液、尿液、卵、毛发或种子回收该蛋白质。转基因可由自与靶动物物种相同的物种或不同的物种的基因组衍生的核酸序列组成。转基因可整合至基因组中该特定核酸序列在其它情况下通常未发现的基因座或该转基因的正常基因座。 
术语“种系细胞系转基因生物体”指这样的转基因生物体，其中将遗传改变或遗传信息导入种系细胞，从而赋予转基因生物体将遗传信息传递给后代的能力。如果这样的后代实际上具有一些或所有该改变或遗传信息，那么它们也是转基因生物体。该改变或遗传信息对于接受者所属的生物物种可以 是外源的，外源仅就特定个体接受者而言，或者可以是接受者已具有的遗传信息。在后一种情况中，改变的或引入的基因的表达可与天然基因有所不同。 
转基因生物体可以是转基因动物或转基因植物。转基因动物可通过多种不同方法产生，包括转染、电穿孔、显微注射、胚胎干细胞中的基因打靶及重组病毒和逆转录病毒感染（参见例如美国专利号4,736,866；美国专利号5,602,307；Mullins等人，Hypertension 22(4)：630-633，1993；Brenin等人，Surg.Oncol.6(2)：99-110，1997；Tuan编，Recombinant Gene Expression Protocols，《Methods in Molecular Biology》，No.62，Humana Press，1997）。将核酸片段导入重组胜任哺乳动物细胞的方法可以是有利于多种核酸分子共转化的任何方法。本领域技术人员可容易获得用于产生转基因动物的详细流程，包括美国专利号5,489,743和美国专利号5,602,307中公开的方法。 
已经产生了许多重组或转基因小鼠，包括表达活化癌基因的（美国专利号4,736,866）；表达猿SV40 T-抗原的（美国专利号5,728,915）；不表达干扰素调控因子1（IRF-1）的（美国专利号5,731,490）；表现出多巴胺能功能障碍的（美国专利号5,723,719）；表达至少一种参与血压控制的人基因的（美国专利号5,731,489）；表现出与天然发生阿尔茨海默氏病展示的症状高度相似性的（美国专利号5,720,936）；介导细胞粘附能力下降的（美国专利号5,602,307）；拥有牛生长激素基因的（Clutter等人，Genetics 143(4)：1753-1760，1996）；或者，能够产生完全人抗体应答的（McCarthy，The Lancet 349(9049)：405，1997）小鼠。 
虽然大多数转基因实验仍然选择小鼠和大鼠，但在有些情况中优选或甚至必须使用其它动物物种。转基因过程已经成功应用于多种非鼠动物，包括绵羊、山羊、猪、犬、猫、猴、黑猩猩、仓鼠、兔、牛和豚鼠（参见例如Kim等人，Mol.Reprod.Dev.46(4)：515-526，1997；Houdebine，Reprod.Nutr.Dev.35(6)：609-617，1995；Petters，Reprod.Fertil.Dev.6(5)：643-645，1994；Schnieke等人，Science 278(5346)：2130-2133，1997；及Amoah，J.Animal Science 75(2)：578-585，1997）。 
为了引导转基因编码的本发明蛋白质分泌进入转基因动物的乳汁，可以使其处于启动子的控制之下，该启动子优先在乳腺上皮细胞中激活。优选控制编码乳汁蛋白质的基因的启动子，例如酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸蛋白、或乳清蛋白的启动子（参见例如DiTullio，BioTechnology 10：74-77，1992； Clark等人，BioTechnology 7：487-492，1989；Gorton等人，BioTechnology 5：1183-1187，1987；及Soulier等人，FEBS Letts.297：13，1992）。选择的转基因哺乳动物将产生大量的乳汁并具有很长的泌乳期，例如山羊、牛、骆驼或绵羊。 
本发明的清蛋白融合蛋白还可以在转基因植物中表达，例如将DNA转基因插入到细胞核或质体基因组中的植物。用于将外来核酸导入植物细胞或原生质体的植物转化流程在本领域是知道的。参加例如Methods in Enzymology Vol.153，“Recombinant DNA Part D”，1987，Wu和Grossman编，Academic Press及欧洲专利申请EP 693554。美国专利号5,283,184、美国专利号5,482,852及欧洲专利申请EP 693 554中还描述了用于产生遗传工程植物的方法，将它们都引入本文作为参考。 
药物或治疗性组合物
可以通过任何常规方法来施用本发的清蛋白融合蛋白或其制剂，包括肠胃外（例如皮下或肌肉内）注射或静脉内灌输。治疗可以由单一服药或一段时期内的多次服药构成。 
尽管有可能单独施用本发明的清蛋白融合蛋白，但是优选以药学制剂的形式与一种或多种可接受载体一起提供。就与清蛋白融合蛋白相容且对其接受者无害而言，载体必须是“可接受的”。通常，载体将是无菌且无热原的水或盐水。本发明的清蛋白融合蛋白特别适合于在水性载体诸如无菌无热原的水、盐水或其它等张溶液中配制，因为它们在溶液中的保质期延长了。例如，本发明的药物组合物可以在例如分发前数周或数月或更长时期之前以水性形式预先配制好。 
例如，可以在考虑到清蛋白融合蛋白在水性制剂中的保质期延长了而制备含有清蛋白融合蛋白的制剂。正如上文所讨论的，这些治疗性蛋白质中的许多的保质期在与HA融合后显著增加或延长了。 
在适于以气雾剂施用的情况中，可使用表征程序将本发明的清蛋白融合蛋白配制成气雾剂。术语“气雾剂”包括能够吸入到细支气管或鼻道中的本发明清蛋白融合蛋白的任何气媒悬浮相。具体而言，气雾剂包括本发明清蛋白融合蛋白的小滴的气媒悬浮物，它可以在计量剂量的吸入器或雾化器中或在喷雾器中生成。气雾剂还包括本发明化合物悬浮在空气或其它载体气体中的干粉组合物，它可以例如用吸入装置通过吹入来投递。参见Ganderton和 Jones，《Drug Delivery to the Respiratory Tract》，Ellis Horwood，1987；Gonda，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6：273-313，1990；及Raeburn等人，Pharmacol.Toxicol.Methods 27：143-159，1992。 
部分由于所使用的清蛋白融合蛋白的成分衍生自合适物种，本发明的制剂通常还是无免疫原性的。例如，用于人时，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质和清蛋白部分二者通常都是人的。在其中两种成分任一不是衍生自人的一些情况中，可以通过替代关键氨基酸使得特定表位对于人免疫系统显示出本质上是人的而不是外源的，由此将该成分人源化。 
制剂可以单位剂量形式方便的呈现，且可通过制药领域众所周知的任何方法来制备。这样的方法包括将清蛋白融合蛋白与构成一种或多种附加成分的载体相结合的步骤。通常，通过将活性成分与液态载体或细分固体载体或两者均一且紧密相结合，然后根据需要使产品成形，如此制备所述制剂。 
适于肠胃外施用的制剂包括水性或非水下无菌注射液，可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得所述制剂适于预定接收者的溶质；及水性或非水性无菌悬浮液，可含有悬浮剂和增稠剂。制剂可以在单位剂量或多剂量容器中呈现，例如密封的安瓿瓶、小药瓶或注射器，且可以存储于冷冻-干燥（冻干）条件下，只需在临使用前加入无菌液态载体例如水即可用于注射。现配注射液和悬浮液可以由无菌粉末制备。由于许多本发明清蛋白融合蛋白显示出延长的血清半衰期，剂量制剂可含有与指定治疗性蛋白质的未融合标准制剂相比较低摩尔浓度或较低剂量的治疗性蛋白质部分。 
作为例子，当本发明清蛋白融合蛋白包含表I“治疗性蛋白质：X”列所列蛋白质之一作为一个或多个治疗性蛋白质区时，可以以清蛋白融合蛋白的效力相对于单独的治疗性蛋白质的效力为基础计算剂量形式，同时考虑清蛋白融合蛋白与天然治疗性蛋白质相比延长的血清半衰期和保质期。例如，如果治疗性蛋白质通常以0.3至30.0IU/kg/周或0.9至12.0IU/kg/周施用，那么一年或更长时间分三次或七次服用。在由全长HA与治疗性蛋白质融合而组成的清蛋白融合蛋白中，单位上的等价剂量将呈现更大重量的试剂，但服药频率可减少至例如每周两次、每周一次或更少。 
本发明的制剂或组合物可与关于清蛋白融合蛋白成分保质期延长的说明书或包装插页一起包装或包括在试剂盒中。例如，这样的说明书或包装插页可给出考虑到本发明清蛋白融合蛋白延长的或扩展的保质期而推荐的贮 存条件，诸如时间、温度和光照。这样的说明书或包装插页还可给出本发明清蛋白融合蛋白的具体优点，诸如易于贮存可能需要在野外、受控医院、临床或诊所条件以外使用的制剂。如上所述，本发明的制剂可以是水性形式，且可在不太理想的环境下贮存而治疗活性没有明显丧失。 
本发明的清蛋白融合蛋白也可以包含在保健品(nutraceuticals)中。例如，本发明的某些清蛋白融合蛋白可在天然产品中施用，包括由表达清蛋白融合蛋白的转基因哺乳动物获得的乳或乳制品。这样的组合物还可以包括由表达清蛋白融合蛋白的转基因植物获得的植物或植物产品。还可以以含有或不含其它已知添加剂、载体、填充剂和稀释剂的药粉或药片形式提供清蛋白融合蛋白。保健品描述于Scott Hegenhart，《Food Product Design》，1993年12月。 
本发明还提供了通过在制药学可接受载体中对受试者施用有效量的本发明清蛋白融合蛋白或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸（“清蛋白融合物多核苷酸”）来治疗和/或预防疾病或紊乱（诸如例如本文公开的任何一种或多种疾病或紊乱）的方法。 
考虑到个别患者的临床状况（尤其是单独使用清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸进行治疗的副作用）、投递部位、施药方法、施药方案、和从业人员知道的其它因素，按照与优良医疗实践一致的方式配制并施用清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸。因此，用于本发明的“有效量”将由此类考虑因素而决定。 
作为一般性建议，每次服药时肠胃外施用清蛋白融合蛋白的总制药学有效量将在约1μg/kg/天至10mg/kg/天患者体重的范围内，尽管如上所述这将进行治疗判断。更优选的是，此剂量是至少0.01mg/kg/天，且对人而言最优选的是激素在约0.01和1mg/kg/天之间。如果连续服药，通常以约1μg/kg/小时至约50μg/kg/小时的剂量速率施用清蛋白融合蛋白，或是通过每天注射1-4次或是通过例如使用微型泵的连续皮下灌输。还可以使用静脉内袋装溶液。观察到变化所需要的治疗长度和治疗后发生应答的间隔依据所需效果而变化。 
如上所述，本发明的清蛋白融合蛋白与单独的治疗性蛋白质部分（或其片段或变体）相比具有更高的血浆稳定性。在决定每次服药施用清蛋白融合蛋白的有效量及服药施用方案时应当考虑到此血浆稳定性的增加。具体而言，较高的血浆稳定性可允许在相同的施用频率以较低的剂量施用清蛋白融合蛋白，或者可允许以较少次数施用清蛋白融合蛋白。优选的是，较高的稳定性允许以较少的次数不太频繁的施用本发明的清蛋白融合蛋白。更优选的 是，可以每两周施用一次清蛋白融合蛋白。仍然更优选的是，可以每三、四、五或更多周施用一次清蛋白融合蛋白，这取决于清蛋白融合蛋白的药代学。例如，正如上文所讨论的，IFN-α-HAS融合蛋白的药代学支持每2-4周或更长时间一次的服药方案，甚至以4周或4周以上的间隔服药。 
清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可通过口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部（通过粉剂、软膏、凝胶剂、滴剂或透皮贴剂）、口含、或口或鼻喷雾来施用。“制药学可接受载体”指任何无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或制剂辅料。术语“肠胃外”在用于本文时指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和灌注在内的施用模式。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸还适于通过缓释系统来施用。缓释清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的例子有口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部（通过粉剂、软膏、凝胶剂、滴剂或透皮贴剂）、口含、或口或鼻喷雾施用。“制药学可接受载体”指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或制剂辅料。术语“肠胃外”在用于本文时指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和灌注在内的施用模式。缓释清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的其它例子包括合适的聚合材料（诸如例如成形产品形式的半透性聚合基质，例如薄膜或微囊）、合适的疏水材料（例如可接受油中的乳状液）或离子交换树脂、和少量可溶衍生物（诸如例如少量可溶盐）。 
缓释基质包括聚交酯（美国专利号3,773,919、EP 58,481）、L-谷氨酸与L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物（Sidman等人，Biopolymers 22：547-556，1983）、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)（Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277，1981；及Langer，Chem.Tech.12：98-105，1982）、乙烯乙酸乙烯酯（Langer等人，同上）或聚-D-(-)-3-羟基丁酸（EP 133,988）。 
缓释清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸还包括脂质体捕获的本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸（一般参见Langer，Science 249：1527-1533，1990；Treat等人，在《Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer》中，Lopez-Berestein和Fidler编，Liss，New York，pp.317-327和353-365，1989）。含有清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的脂质体通过本质上已知的方法来制备：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：3688-3692，1985；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4030-4034，1980；EP 52,322； EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利号4,485,045和4,544,545；及EP 102,324）。通常，脂质体是小（约200-800埃）单层类型，其中脂质成分大于约30mol%胆固醇，并为最佳疗效调整所选比例。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸通过泵投递（参见Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201，1987；Buchwald等人，Surgery 88：507，1980；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574，1989）。 
Langer，Science 249：1527-1533，1990的综述中讨论了其它受控释放系统。 
关于肠胃外施用，在一个实施方案中，清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一般通过以所需程度的纯度在单位剂量可注射形式（溶液、悬浮液、或乳状液）中与制药学可接受载体即在所采用的剂量和浓度对接受者无毒且与制剂的其它成分相容的载体一起混和来配制。例如，制剂优选不含氧化剂和已知对疗效有害的其它化合物。 
通常，通过将清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与液态载体或细分固态载体或两者均一且紧密接触来制备制剂。然后，根据需要，将产品定形成所需剂型。优选的是，载体是肠胃外载体，更优选与接受者的血液等渗的溶液。这样的载体媒介的例子包括水、盐水、Ringer氏液、和右旋糖溶液。本发明也可以使用非水性媒介，诸如不挥发性油和油酸乙酯，以及脂质体。 
载体适当含有少量的添加剂，诸如增强等渗性和化学稳定性的物质。这样的材料在所采用的剂量和浓度对接受者无毒，包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸、和其它有机酸或其盐；抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量（少于约10个残基）多肽，例如多精氨酸或三肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯（包括例如Tween-20）、poloxamer、或PEG。 
清蛋白融合蛋白通常在这样的媒介中以约0.1mg/ml至100mg/ml的浓度，优选1-10mg/ml，以约3至8的pH配制。可以理解，使用某些前述赋形剂、载体、或稳定剂将导致多肽盐的形成。 
用于治疗性施用的任何药物可以是无菌的。无菌易于通过无菌滤膜（例如0.2微米膜）过滤来实现。通常将清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸置于具有无菌存取口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小药瓶。 
清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸通常作为水溶液或用于复水的冻干制剂贮存在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶或小药瓶中。作为冻干制剂的例子，将5ml经过无菌过滤的1%(w/v)清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸水溶液装入小药瓶中，并将所得混合物冻干。用注射用抑菌水使冻干的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸复水以制备灌注液。 
在一个具体且优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白制剂包含0.01M磷酸钠、0.15mM氯化钠、0.16微摩尔辛酸钠/毫克融合蛋白、15微克/毫升聚山梨醇酯80pH7.2。在另一个具体且优选的实施方案中，清蛋白融合蛋白制剂由0.01M磷酸钠、0.15mM氯化钠、0.16微摩尔辛酸钠/毫克融合蛋白、15微克/毫升聚山梨醇酯80pH7.2组成。选择与生理学条件匹配的pH和缓冲剂，并加入盐作为增渗剂(tonicifier)。选择辛酸钠是因为所报导的其增加蛋白质在溶液中的热稳定性的能力。最后，加入聚山梨醇酯作为通用表面活性剂，它降低溶液的表面张力并降低清蛋白融合蛋白对容器封闭系统的非特异吸附。 
本发明还提供了包括一个或多个容器的制药学包装或试剂盒，所述容器中装有一种或多种包含本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的一种或多种成分。可以与这样的容器一起提供由政府行政机构颁布的规范药品或生物学产品的生产、使用或销售的通告，该通告反映了行政机构对人体施药的生产、使用或销售的批准。此外，清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以与其它治疗性化合物联合使用。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以单独施用或联合佐剂施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一起施用的佐剂包括但不限于明矾、明矾加脱氧胆酸盐（ImmunoAg）、MTP-PE（Biocine Corp.）、QS21（Genentech,Inc.）、BCG（例如THERACYS 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801471
）、MPL和小棒杆菌（Corynebacterium parvum）的非活体制品。在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与明矾联合施用。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与QS-21联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的其它佐剂包括但不限于单磷酰脂 质免疫调节剂、Adju Vax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐、MF-59、和病毒体(Virosomal)佐剂技术。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的疫苗包括但不限于致力于针对MMR（麻疹、腮腺炎、风疹）、小儿麻痹症(polio)、水痘、破伤风/白喉、甲肝、乙肝、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）B、百日咳(whooping cough)、肺炎、流感、莱姆氏病、轮状病毒、霍乱、黄热病、日本脑炎、脊髓灰质炎(poliomyelitis)、狂犬病、伤寒、和百日咳(pertussis)提供保护的疫苗。联合施用既可以是伴随施用，例如作为混合物、分开但同时或并行施用；也可以是顺序施用。这包括其中联合药剂作为治疗性混合物一起施用的呈现，也包括其中联合药剂分开但同时施用的程序，例如经由分开的静脉内线路进入同一个体。“联合”施用还包括这样的分开施用，即先给予化合物或药剂中的一种，然后给予第二种。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可以单独施用或联合其它治疗剂施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的其它治疗剂包括但不限于化疗剂、抗生素、甾族和非甾族抗炎药、常规免疫治疗剂、和/或下文描述的治疗性处理。联合施用既可以是伴随施用，例如作为混合物、分开但同时或并行施用；也可以是顺序施用。这包括其中联合药剂作为治疗下混合物一起施用的呈现，也包括其中联合药剂分开但同时施用的程序，例如经由分开的静脉内线路进入同一个体。“联合”施用还包括这样的分开施用，即先给予化合物或药剂中的一种，然后给予第二种。 
在一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗凝剂联合施用。可与本发明的组合物联合施用的抗凝剂包括但不限于肝素、低分子量肝素、华法林(warfarin)钠（例如COUMADIN 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801481
）、双香豆素、4-羟基香豆素、茴茚二酮（例如MIRADONTM）、醋硝香豆素(acenocoumarol)（例如醋硝香豆素(nicoumalone)，SINTHROMETM）、1,3-茚二酮、苯丙香豆素（例如MARCUMARTM）、双香豆素乙酸乙酯（例如TROMEXATM）、及阿斯匹林。在一个具体的实施方案中，本发明的组合物与肝素和/或华法林联合施用。在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物与华法林联合施用。在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物与华法林和阿斯匹林联合施用。在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物与肝素联合施用。在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物与肝素和阿斯匹林联合施用。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与溶栓药 联合施用。可与本发明的组合物一起施用的溶栓药包括但不限于纤溶酶原、lys-纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、链激酶（例如KABIKINASETM）、antiresplace（例如EMINASETM）、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA，altevase，ACTIVASETM）、尿激酶（例如ABBOKINASETM）、sauruplase、（尿激酶原，单链尿激酶）、及氨基己酸（例如AMICARTM）。在一个具体的实施方案中，本发明的组合物与组织型纤溶酶原激活剂和阿斯匹林联合施用。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗血小板药联合施用。可与本发明的组合物一起施用的抗血小板药包括但不限于阿斯匹林、双嘧达莫(dipyridamole)（例如PERSANTINETM）、和噻氯匹定(ticlopidine)（例如TICLIDTM）。 
在一个具体的实施方案中，设想通过抗凝剂、溶栓药和/或抗血小板药与本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的联合使用来预防、诊断和/或治疗血栓形成、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血栓栓塞、肺部栓塞、动脉粥样硬化、心肌梗死、短暂性脑缺血发作、不稳定性心绞痛。在一个具体的实施方案中，设想通过抗凝血剂、溶栓药和/或抗血小板药物与本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的联合使用来预防隐静脉移植物闭塞(occulsion of saphenous grafts)、降低可能与血管成形术伴随的围手术期血栓形成风险、降低心房纤维颤动包括非风湿性心房纤维颤动患者的中风风险、降低与人工心脏瓣膜和/或二尖瓣疾病有关的栓塞风险。本发明的治疗剂单独或与抗血小板、抗凝、和/或溶栓药物联合的其它用途包括但不限于预防身体外装置（例如血管内套管、血液透析患者中的血管通路分流装置、血液透析装置、和心肺旁路装置）中的阻塞。 
在某些实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗逆转录病毒试剂、核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂（NRTI）、非核苷逆转录酶抑制剂（NNRTI）、和/或蛋白酶抑制剂（PI）联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的NRTI包括但不限于RETROVIRTM（齐多夫定，zidovudine/AZT）、VIDEXTM（地达诺新，didanosine/ddI）、HIVIDTM（扎西他滨，zalcitabine/ddC）、ZERITTM（司他夫定，stavudine/d4T）、EPIVIRTM（拉米夫定，lamivudine/3TC）、及COMBIVIRTM（齐多夫定/拉米夫定）。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的NNRTI包括但不限于VIRAMUNETM（奈韦拉平，nevirapine）、RESCRIPTORTM（地拉韦啶， delavirdine）、和SUSTIVATM（依法韦伦，efavirenz）。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的蛋白酶抑制剂包括但不限于CRIXIVANTM（茚地那韦，indinavir）、NORVIRTM（利托那韦，ritonavir）、INVIRASETM（沙喹那韦，saquinavir）、和VIRACEPTTM（奈非那韦，nelfinavir）。在一个具体的实施方案中，可以将抗逆转录病毒剂、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、和/或蛋白酶抑制剂与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的任意组合用于治疗AIDS和/或预防或治疗HIV感染。 
其它NRTI包括LODENOSINETM（F-ddA；一种酸稳定性腺苷NRTI；Triangle/Abbott）；COVIRACILTM（恩曲他滨，emtricitabine/FTC；与拉米夫定（3TC）结构上相关但体外活性大3至10倍；Triangle/Abbott）；dOTC（BCH-10652，也与拉米夫定结构上相关但保留了针对拉米夫定抗性分离物的实质比例的活性；Biochem Pharma）；阿德福韦(Adefovir)（FDA拒绝批准用于抗HIV治疗；Gilead Sciences）；PREVEON 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801501
（阿德福韦二匹伏酯，阿德福韦的活性原药；其活性形式是PMEA-pp）；TENOFOVIRTM（bis-POC PMPA，PMPA原药；Gilead）；DAPD/DXG（DAPD的活性代谢物；Triangle/Abbott）；D-D4FC（与3TC相关，具有针对AZT/3TC抗性病毒的活性）；GW420867X（Glaxo Wellcome）；ZIAGENTM（阿巴卡韦，abacavir/159U89；Glaxo Wellcome Inc.）；CS-87（3’-叠氮-2’,3’-二脱氧尿苷；WO 99/66936）；和β-L-FD4C和β-L-FddC的携带S-酰基-2-乙硫酯（SATE）的原药形式（WO 98/17281）。 
其它NNRTI包括COACTINONTM（乙米韦林，Emivirine/MKC-442，HEPT类的有效NNRTI；Triangle/Abbott）；CAPRAVIRINETM（AG-1549/S-1153，具有针对含K130N突变的病毒的下一代NNRTI；Agouron）；PNU-142721（具有比其前身地拉韦啶高20至50倍的活性且对K130N突变体有活性；Pharmacia & Upjohn）；DPC-961和DPC-963（依非韦仑的第二代衍生物，设计对具有K103N突变的病毒有活性；DuPont）；GW-420867X（具有比HBY097高25倍的活性且对K103N突变体有活性；Glaxo Wellcome）；CALANOLIDEA（来自橡胶树的天然存在药物；对含有Y181C和K103N突变中的一种或两种的病毒有活性）；和Propolis（WO99/49830）。 
其它蛋白酶抑制剂包括LOPINAVIRTM（ABT378/r；Abbott Laboratories）；BMS-232632（一种氮杂肽；Bristol-Myres Squibb）；TIPRANAVIRTM（PNU-140690，一种非肽二羟吡喃酮；Pharmacia & Upjohn）；PD-178390（一 种非肽二羟吡喃酮；Parke-Davis）；BMS 232632（一种氮杂肽；Bristol-Myres Squibb）；L-756,423（茚地那韦类似物；Merck）；DMP-450（环化尿素化合物；Avid & DuPont）；AG-1776（在体外具有针对蛋白酶抑制剂抗性病毒的活性的肽模拟物；Agouron）；VX-175/GW-433908（安瑞那韦，amprenavir的磷酸盐原药；Vertex & Glaxo Welcome）；CGP61755（Ciba）；和AGENERASETM（安瑞那韦；Glaxo Welcome Inc.）。 
其它抗逆转录病毒药包括融合抑制剂/gp41粘合剂。融合抑制剂/gp41粘合剂包括T-20（来自HIV gp41跨膜蛋白胞外域残基643-678的肽，该胞外域在休眠状态结合gp41并阻止向融合状态转化；Trimeris）和T-1249（第二代融合抑制剂；Trimeris）。 
其它抗逆转录病毒药包括融合抑制剂/趋化因子受体拮抗剂。融合抑制剂/趋化因子受体拮抗剂包括CXCR4拮抗剂，诸如AMD 3100（bicyclam）、SDF-1及其类似物、和ALX40-4C（阳离子肽）、T22（18氨基酸肽；Trimeris）和T22类似物T134和T140；CCR5拮抗剂，诸如RANTES(9-68)、AOP-RANTES、NNY-RANTES、和TAK-779；及CCR5/CXCR4拮抗剂，诸如NSC 651016（偏端霉素类似物）。还包括CCR2B、CCR3、和CCR6拮抗剂。趋化因子受体激动剂诸如RANTES、SDF-1、MIP-1α、MIP-1β等也可抑制融合。 
其它抗逆转录病毒药包括整合酶抑制剂。整合酶抑制剂包括二咖啡酰奎宁(DFQA)酸；L-菊苣酸（二咖啡酰酒石(DFQA)酸）；醌茜素（QLC）及相关蒽醌；ZINTEVIRTM（AR 177，可能作用于细胞表面而非真正整合酶抑制剂的寡核苷酸；Arondex）；及萘酚，诸如WO 98/50347中所公开的。 
其它抗逆转录病毒药包括羟脲样化合物，诸如BCX-34（嘌呤核苷磷酸酶抑制剂；Biocryst）；核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如DIDOXTM（Molecules for Health）；次黄苷单磷酸脱氢酶（IMPDH）抑制剂，诸如VX-497（Vertex）；及霉酚酸（mycopholic acid），诸如CellCept（霉酚酸吗乙酯；Roche）。 
其它抗逆转录病毒药包括病毒整合酶的抑制剂、病毒基因组核转位的抑制剂诸如芳撑二甲酮（arylene bis(methylketone））化合物；HIV侵入的抑制剂，诸如AOP-RANTES、NNY-RANTES、RANTES-IgG融合蛋白、RANTES和糖胺聚糖（GAG）的可溶性复合物、及AMD-3100；核衣壳锌指抑制剂，诸如二噻烷化合物；HIV Tat和Rev的靶；以及药效增强剂(pharmacoenhancer)，诸如ABT-378。 
其它抗逆转录病毒疗法和辅助疗法包括细胞因子和淋巴因子，诸如MIP-1α、MIP-1β、SDF-1α、IL-2、PROLEUKINTM（阿地白介素，aldesleukin/L2-7001；Chiron）、IL-4、IL-10、IL-12和IL-13；干扰素，诸如IFN-α2a、IFN-α2b、或IFN-β；TNF、NFκB、GM-CSF、M-CSF、和IL-10的拮抗剂；调节免疫激活的药剂，诸如环孢霉素和强的松；疫苗，诸如RemuneTM（HIV Immunogen）、APL 400-003（Apollon）、重组gp120及片段、二价(B/E)重组包膜糖蛋白、rgp120CM235、MN rgp120、SF-2rgp120、gp120/可溶性CD4复合物、Delta JR-FL蛋白、衍生自不连续gp120 C3/C4结构域的分支合成肽、融合胜任免疫原、及Gag、Pol、Nef和Tat疫苗；基于基因的疗法，诸如基因抑制物元件（GSE；WO 98/54366），和胞内因子(intrakine)（经过遗传修饰的CC趋化因子靶向ER以阻断新合成的CCR5的表面表达（Yang等人，PNAS 94：11567-72，1997；Chen等人，Nat.Med.3：1110-16，1997））；抗体，诸如抗CXCR4抗体12G5，抗CCR5抗体2D7、5C7、PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14，抗CD4抗体Q4120和RPA-T4，抗CCR3抗体7B11，抗gp120抗体17b、48d、447-52D、257-D、268-D和50.1，抗Tat抗体，抗TNF-α抗体，和单克隆抗体33A；芳烃（AH）受体激动剂和拮抗剂，诸如TCDD、3,3′,4,4′,5-五氯联苯、3,3′,4,4′-四氯联苯、和α-萘黄酮（WO 98/30213）；及抗氧化剂，诸如γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸乙酯（γ-GCE；WO 99/56764）。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗病毒药联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的抗病毒药包括但不限于阿昔洛韦(acyclovir)、利巴韦林(ribavirin)、金刚烷胺(amantadine)、remantidine、maxamine、或胸腺法新(thymalfasin)。具体而言，干扰素清蛋白融合蛋白可以与任何这些药剂联合施用。另外，干扰素α清蛋白融合蛋白也可以与任何这些药剂联合施用，优选的是，干扰素α-2a或2b清蛋白融合蛋白可以与任何这些药剂联合施用。此外，干扰素β清蛋白融合蛋白也可以与任何这些药剂联合施用。另外，任何IFN杂化物清蛋白融合蛋白都可以与任何这些药剂联合施用。 
在一个最优选的实施方案中，干扰素清蛋白融合蛋白与利巴韦林联合施用。在另一个优选的实施方案中，干扰素α清蛋白融合蛋白与利巴韦林联合施用。在另一个优选的实施方案中，干扰素α2a清蛋白融合蛋白与利巴韦林联合施用。在另一个优选的实施方案中，干扰素α2b清蛋白融合蛋白与利巴 韦林联合施用。在另一个优选的实施方案中，干扰素β清蛋白融合蛋白与利巴韦林联合施用。在另一个优选的实施方案中，杂化干扰素清蛋白融合蛋白与利巴韦林联合施用。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可与抗机会性感染药联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的抗机会药包括但不限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM、DAPSONETM、PENTAMIDINETM、ATOVAQUONETM、ISONIAZIDTM、RIFAMPINTM、PYRAZINAMIDETM、ETHAMBUTOLTM、RIFABUTINTM、CLARITHROMYCINTM、AZITHROMYCINTM、GANCICLOVIRTM、FOSCARNETTM、CIDOFOVIRTM、FLUCONAZOLETM、ITRACONAZOLETM、KETOCONAZOLETM、ACYCLOVIRTM、FAMCICOLVIRTM、PYRIMETHAMINETM、LEUCOVORINTM、NEUPOGENTM（非格司亭，filgrastim/G-C SF）、和LEUKINETM（沙格司亭，sargramostim/GM-CSF）。在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM、DAPSONETM、PENTAMIDINETM、和/或ATOVAQUONETM以任意组合预防性用于治疗或预防机会性卡氏肺囊虫（Pneumocystis carinii）肺炎感染。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与ISONIAZIDTM、RIFAMPINTM、PYRAZINAMIDETM、和/或ETHAMBUTOLTM以任意组合预防性用于治疗或预防机会性鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）复合感染。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与RIFABUTINTM、CLARITHROMYCINTM、和/或AZITHROMYCINTM以任意组合预防性用于治疗或预防机会性结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与GANCICLOVIRTM、FOSCARNETTM、和/或CIDOFOVIRTM以任意组合预防性用于治疗或预防机会性细胞巨化病毒感染。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与FLUCONAZOLETM、ITRACONAZOLETM、和/或KETOCONAZOLETM以任意组合预防性用于治疗或预防机会性真菌感染。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与ACYCLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM以任意组合预防性用于治疗或预防机会性I型和/或II型单 纯疱疹病毒感染。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与PYRIMETHAMINETM和/或LEUCOVORINTM以任意组合预防性用于治疗或预防机会性鼠弓形虫（Toxoplasma gondii）感染。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM以任意组合预防性用于治疗或预防机会性细菌感染。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗生药联合施用。可以与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的抗生药包括但不限于阿莫西林、β-内酰胺酶、氨基糖苷、β-内酰胺（糖肽）、β-内酰胺酶、氯林肯霉素、氯霉素、头孢菌素、环丙沙星、红霉素、氟喹诺酮、大环内酯、甲硝唑、青霉素、喹诺酮、雷帕霉素、利福平、链霉素、磺胺、四环素、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑、和万古霉素。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与免疫刺激物联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的免疫刺激物包括但不限于左旋咪唑（例如ERGAMISOLTM）、异丙肌酐（例如INOSIPLEXTM）、干扰素（例如干扰素α）、和白介素（例如IL-2）。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与免疫抑制剂联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的免疫抑制剂包括但不限于类固醇、环孢菌素、环孢菌素类似物、环磷酰胺甲基强的松、强的松、咪唑硫嘌呤、FK-506、15-脱氧精胍菌素、和通过抑制响应性T细胞的功能而起作用的其它免疫抑制剂。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的其它免疫抑制剂包括但不限于强的松龙、氨甲蝶呤、沙立度胺(thalidomide)、甲氧沙林(methoxsalen)、雷帕霉素、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宾(mizoribine)（BREDININTM）、布喹那(brequinar)、脱氧精胍菌素、和氮杂螺烷(azaspirane)（SKF 105685）、ORTHOCLONE OKT 
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3（muromonab-CD3）、SANDIMMUNETM、NEORALTM、SANGDYATM（环孢菌素）、PROGRAF 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801542
（FK506，他克莫司）、CELLCEPT 
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（霉酚酸吗乙酯，其中的活性代谢物是霉酚酸）、IMURANTM（咪唑硫嘌呤）、糖皮质类固醇、肾上腺皮质类固醇诸如DELTASONETM（强的松）和HYDELTRASOLTM（强的松龙）、FOLEXTM和MEXATETM（氨甲喋呤）、OXSORALEN-ULTRATM（甲氧沙林）和RAPAMUNETM（西罗莫司）。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸单独施用或与一种或多种静脉内免疫球蛋白制品联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的静脉内免疫球蛋白制品包括但不限于GAMMARTM、IVEEGAMTM、SANDOGLOBULINTM、GAMMAGARD S/DTM、ATGAMTM（抗胸腺细胞球蛋白）、和GAMIMUNETM。在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与静脉内免疫球蛋白制品在移植疗法（例如骨髓移植）中联合施用。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸单独施用或作为组合疗法的一部分施用，或是在体内施用于患者或是在体外施用于细胞，以治疗癌症。在一个具体的实施方案中，清蛋白融合蛋白，特别是IL-2-清蛋白融合蛋白在癌症的被动免疫治疗期间反复施用，诸如转移性黑素瘤的过继性细胞转移疗法，正如Dudley等人（Science Express，2002年9月19日，www.scienceexpress.org，完整引入本文作为参考）所述。 
在某些实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸单独施用或与抗炎药联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的抗炎药包括但不限于皮质类固醇（例如倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、强的松龙、强的松、和曲安西龙）、非固醇类抗炎药（例如双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸酯、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、保泰松（苯丁唑酮）、吡罗昔康、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸、和托美丁），以及抗组胺药、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑啉酮、水杨酸衍生物、噻嗪甲酰胺(thiazinecarboxamide)、e-乙酰氨基己酸(acetamidocaproic acid)、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普鲁喹宗、普罗沙唑、和替尼达普。 
在另一个实施方案中，本发明的组合物单独施用或与抗血管发生药联合施用。可与本发明的组合物联合施用的抗血管发生药包括但不限于制管张素（Entremed，Rockville，MD）、肌钙蛋白-1（Boston Life Sciences，Boston，MA）、抗侵袭因子、视黄酸及其衍生物、紫杉醇（Taxol）、苏拉明、金属蛋 白酶-1组织抑制物、金属蛋白酶-2组织抑制物、VEGI、纤溶酶原激活剂抑制物-1、纤溶酶原激活剂抑制物-2、和各种形式的较轻“d组”过渡金属。 
较轻“d组”过渡金属包括例如钒、钼、钨、钛、铌和钽类。这些过渡金属类可形成过渡金属复合物。上述过渡金属类的合适复合物包括氧络过渡金属复合物。 
钒复合物的代表性例子包括氧络钒复合物，诸如钒酸盐和氧钒基复合物。合适的钒酸盐复合物包括偏钒酸盐和原钒酸盐复合物，诸如例如偏钒酸铵、偏钒酸钠、和原钒酸钠。合适的氧钒基复合物包括例如乙酰丙酮氧钒和硫酸氧钒，包括硫酸氧钒水合物，如一和三水合硫酸氧钒。 
钨和钼复合物的代表性例子也包括氧络复合物。合适的氧络钨复合物包括钨酸盐和氧化钨复合物。合适的钨酸盐复合物包括钨酸铵、钨酸钙、二水合钨酸钠、和钨酸。合适的氧化钨包括氧化钨(IV)和氧化钨(VI)。合适的氧络钼复合物包括钼酸盐、氧化钼和氧钼基复合物。合适的钼酸盐复合物包括钼酸铵及其水合物、钼酸钠及其水合物、和钼酸钾及其水合物。合适的氧化钼包括氧化钼(IV)、氧化钼(VI)、和钼酸。合适的氧钼基复合物包括例如乙酰丙酮氧钼。其它合适的钨和钼复合物包括衍生自例如甘油、酒石酸和糖的羟衍生物。 
极其多种其它抗血管发生因子也可用于本发明的内容。代表性例子包括但不限于血小板因子4；硫酸鱼精蛋白；硫酸化几丁质衍生物（由雪花蟹壳制得）（Murata等人，Cancer Res.51：22-26，1991）；硫酸化聚糖肽聚糖复合物（SP-PG）（类固醇诸如雌激素和柠檬酸他莫西芬的存在可增强此化合物的功能）；星形孢菌素；基质代谢调节剂，包括例如脯氨酸类似物、顺式羟脯氨酸、d,L-3,4-脱氢脯氨酸、Thiaproline、α,α-二吡啶、延胡索酸氨基丙腈；4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-口恶唑酮；氨甲蝶呤；米托蒽醌；肝素；干扰素；2巨球蛋白-血清；ChIMP-3（Pavloff等人，J.Bio.Chem.267：17321-17326，1992）；胰凝乳蛋白酶抑制剂（Tomkinson等人，Biochem J.286：475-480，1992）；十四烷基硫酸环糊精；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素（Ingber等人，Nature 348：555-557，1990）；硫代苹果酸金钠（“GST”；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.79：1440-1446，1987）；抗胶原酶-血清；α2-抗纤溶酶（Holmes等人，J.Biol.Chem.262(4)：1659-1664，1987）；比生群（National Cancer Institute）；氯苯扎利二钠（N-(2)-羧苯基-4-氯蒽茴酸(anthronilic acid) 二钠或“CCA”；Takeuchi等人，Agents Actions 36：312-316，1992）；和金属蛋白酶抑制剂，诸如BB94。 
可用于本发明内容的其它抗血管发生因子包括沙利度胺（Celgene，Warren，NJ）；抑制血管的类固醇；AGM-1470（H.Brem和J.Folkman，J.Pediatr.Surg.28：445-51，1993）；整合素αvβ3拮抗剂（C.Storgard等人，J.Clin.Invest.103：47-54，1999）；羧基氨基咪唑；羧基氨基三唑（CAI）（National Cancer Institute，Bethesda，MD）；Conbretastatin A-4（CA4P）（OXiGENE，Boston，MA）；角鲨胺（Magainin Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA）；TNP-470（Tap Pharmaceuticals，Deerfield，IL）；ZD-0101 AstraZeneca（London，UK）；APRA（CT2584）；Benefin、Byrostatin-1（SC339555）；CGP-41251（PKC 412）；CM101；右雷佐生（ICRF187）；DMXAA；内皮抑制素；Flavopridiol；Genestein；GTE；ImmTher；Iressa（ZD1839）；奥曲肽（生长激素抑制素）；Panretin；Penacillamine；Photopoint；PI-88；普啉司他（AG-3340）；Purlytin；Suradista（FCE26644）；他莫昔芬（Nolvadex）；他扎罗汀；四硫钼酸盐；希罗达（卡培他滨）；和5-氟尿嘧啶。 
可与本发明的组合物联合施用的抗血管发生药可通过多种机制起作用，包括但不限于抑制胞外基质的蛋白水解、阻断内皮细胞-胞外基质粘附分子的功能、拮抗血管发生诱导物诸如生长因子的功能、及抑制在增殖内皮细胞上表达的整合素受体。干扰胞外基质蛋白水解且可与本发明的组合物联合施用的抗血管发生抑制剂的例子包括但不限于AG-3340（Agouron，La Jolla，CA）、BAY-12-9566（Bayer，West Haven，CT）、BMS-275291（Bristol Myers Squibb，Princeton，NJ）、CGS-27032A（Novartis，East Hanover，NJ）、马立马司他（British Biotech，Oxford，UK）和美他司他(Metastat)（Aetema，St-Foy，Quebec）。通过阻断内皮细胞-胞外基质粘附分子的功能而起作用且可与本发明的组合物联合施用的抗血管发生抑制剂的例子包括但不限于EMD-121974（Merck KcgaA Darmstadt，Germany）和Vitaxin（Ixsys，La Jolla，CA/Medimmune，Gaithersburg，MD）。通过直接拮抗或抑制血管发生诱导物而起作用且可与本发明的组合物联合施用的抗血管发生剂的例子包括但不限于Angiozyme（Ribozyme，Boulder，CO）、抗VEGF抗体（Genentech，S.San Francisco，CA）、PTK-787/ZK-225846（Novartis，Basel，Switzerland）、SU-101（Sugen，S.San Francisco，CA）、SU-5416（Sugen/Pharmacia Upjohn， Bridgewater，NJ）、和SU-6668（Sugen）。其它抗血管发生剂通过间接抑制血管发生而起作用。可与本发明的组合物联合施用的血管发生间接抑制剂的例子包括但不限于IM-862（Cytran，Kirkland，WA）、干扰素α、IL-12（Roche，Nutley，NJ）、和多硫酸戊聚糖（Georgetown University，Washington，DC）。 
在具体的实施方案中，设想通过本发明的组合物与抗血管发生剂的联合使用来治疗、预防和/或改善自身免疫病，诸如例如本文描述的自身免疫病。 
在具体的实施方案中，设想通过本发明的组合物与抗血管发生剂的联合使用来治疗、预防和/或改善关节炎。在一个更具体的实施方案中，设想通过本发明的组合物与抗血管发生剂的联合使用来治疗、预防和/或改善类风湿性关节炎。 
在另一个实施方案中，编码本发明多肽的多核苷酸与血管发生性蛋白质或编码血管发生性蛋白质的多核苷酸联合施用。可与本发明的组合物联合施用的血管发生性蛋白质的例子包括但不限于酸性和碱性成纤维细胞生长因子、VEGF-1、VEGF-2、VEGF-3、表皮生长因子α和β、血小板衍生内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、肿瘤坏死因子α、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、和氧化一氮合酶。 
在其它实施方案中，本发明的组合物与化疗剂联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的化疗剂包括但不限于烷化剂，诸如氮芥（例如双氯乙基甲胺、环磷酰胺、环磷酰胺异环磷酰胺、美法仑（L-溶肉瘤素）、和苯丁酸氮芥）、乙撑亚胺和甲基蜜胺（例如六甲蜜胺和噻替哌）、烷基磺酸盐（例如白消安）、亚硝基脲（例如卡莫司汀（BCNU）、洛莫司汀（CCNU）、司莫司汀（甲基-CCNU）、和链佐星（streptozotocin））、三氮烯（例如达卡巴嗪（DTIC；二甲三氮咪唑酰胺））、叶酸类似物（例如甲氨蝶呤（氨甲蝶呤））、嘧啶类似物（例如氟尿嘧啶（5-氟尿嘧啶；5-FU）、氟尿苷（氟脱氧尿苷；FudR）、及阿糖胞苷（胞嘧啶阿拉伯糖苷））、嘌呤类似物及相关抑制剂（例如巯嘌呤（6-巯基嘌呤；6-MP）、硫鸟嘌呤（6-硫鸟嘌呤；TG）、及喷司他丁（2′-脱氧助间型霉素））、长春花生物碱（例如长春碱（VLB，硫酸长春碱））和长春新碱（硫酸长春新碱））、表鬼臼毒素（例如依托泊苷和替尼泊苷）、抗生素（例如更生霉素（放线菌素D）、道诺红霉素（道诺霉素；柔红霉素）、阿霉素、博来霉素、普卡霉素（光神霉素）、及丝裂霉素（丝 0裂霉素C）、酶（例如L-天冬酰胺酶）、生物学反应修饰剂（例如干扰素-α和干扰素-α-2b）、铂配位化合物（例如顺铂（顺式-DDP）和卡铂）、蒽二酮(anthracenedione)（米托蒽醌）、取代脲（例如羟脲）、甲肼衍生物（例如丙卡巴肼（N-甲肼；MIH））、肾上腺皮质类固醇（例如强的松）、孕酮（例如己酸羟基孕激素、甲羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、和醋酸甲地孕酮）、雌激素（例如己烯雌酚（DES）、二磷酸己烯雌酚、雌二醇、和乙炔雌二醇）、抗雌激素（例如他莫西芬）、雄激素（丙酸睾酮和氟甲睾酮）、抗雄激素（例如氟他胺）、促性腺激素释放激素类似物（例如亮丙瑞林）、其它激素和激素类似物（例如甲睾酮、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、氯烯雌醚、和睾内酯）、以及其它药剂（例如达卡巴嗪、谷氨酸、和米托坦）。 
在一个实施方案中，本发明的组合物与一种或多种下列药物联合施用：infliximab（也称为RemicadeTMCentocor,Inc.）、托卡特（Roche，RO-32-3555）、来氟米特（也称为AravaTM，来自Hoechst Marion Rousse1）、KineretTM（IL-1受体拮抗剂，也称为Anakinra，来自Amgen,Inc.）。 
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物与CHOP（环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、和强的松）或与CHOP一种或多种成分的组合联合施用。在一个实施方案中，本发明的组合物与抗CD20抗体、人单克隆抗CD20抗体联合施用。在另一个实施方案中，本发明的组合物与抗CD20抗体和CHOP、或抗CD20抗体和CHOP一种或多种成分特别是环磷酰胺和/或强的松的任意组合联合施用。在一个具体的实施方案中，本发明的组合物与Rituximab联合施用。在另一个实施方案中，本发明的组合物与Rituximab和CHOP，或与Rituximab和CHOP一种或多种成分特别是环磷酰胺和/或强的松的任意组合一起施用。在另一个实施方案中，本发明的组合物与tositumomab和CHOP、或tositumomab和CHOP一种或多种成分特别是环磷酰胺和/或强的松的任意组合一起施用。抗CD20抗体可任选与放射性同位素、毒素或胞毒性原药相关联。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物与ZevalinTM联合施用。在另一个实施方案中，本发明的组合物与ZevalinTM和CHOP、或ZevalinTM和CHOP一种或多种成分特别是环磷酰胺和/或强的松的任意组合一起施用。ZevalinTM可与一种或多种放射性同位素相关联。特别优选的同位素是90Y和111In。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与细胞因 子联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的细胞因子包括但不限于IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、ILI5、抗CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α。在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可与任何白介素一起施用，包括但不限于IL-1α、IL-lβ、IL-2、IL-3、IL4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、L-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。 
在一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与TNF家族成员联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的TNF、TNF相关分子或TNF样分子包括但不限于可溶性形式的TNF-α、淋巴毒素-α（LT-α，也称为TNF-β）、LT-β（发现于复合异源三聚物LT-α2-β）、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ（国际公布号WO 96/14328）、AIM-I（国际公布号WO 97/33899）、endokine-α（国际公布号WO 98/07880）、OPG、和neutrokine-α（国际公布号WO 98/18921）、OX40、和神经生长因子（NGF）、和可溶性形式的Fas、CD30、CD27、CD40和4-IBB、TR2（国际公布号WO 96/34095）、DR3（国际公布号WO 97/33904）、DR4（国际公布号WO 98/32856）、TR5（国际公布号WO 98/30693）、TRANK、TR9（国际公布号WO 98/56892）、TR10（国际公布号WO 98/54202）、312C2（国际公布号WO 98/06842）、和TR12、及可溶性形式的CD154、CD70、和CD153。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与血管发生性蛋白质联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的血管发生性蛋白质包括但不限于神经胶质衍生生长因子（GDGF），公开于欧洲专利号EP-399816；血小板衍生生长因子（PDGF-A），公开于欧洲专利号EP-682110；血小板衍生生长因子-B（PDGF-B），公开于欧洲专利号EP-282317；胎盘生长因子（PIGF），公开于国际公布号WO 92/06194；胎盘生长因子-2（PIGF-2），公开于Hauser等人，Growth Factors 4：259-268，1993）；血管内皮生长因子（VEGF），公开于国际公布号WO 90/13649；血管内皮生长因子-A（VEGF-A），公开于欧洲专利号EP-506477；血管内皮生长因子-2（VEGF-2），公开于国际公布号WO 96/39515；血管内皮生长因子B（VEGF-3）；血管内皮生长因子B-186（VEGF-B186），公开于国际公布号WO 96/26736；血管内皮生长因子-D（VEGF-D），公开于国际公布号WO  98/02543；血管内皮生长因子-D（VEGF-D），公开于国际公布号WO 98/07832；和血管内皮生长因子-E（VEGF-E），公开于德国专利号DE19639601。将上述参考文献完整引入本文作为参考。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与成纤维细胞生长因子联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的成纤维细胞生长因子包括但不限于FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与造血生长因子联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的造血生长因子包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（沙格司亭，sargramostim，LEUKINETM，PROKINETM）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）（非格司亭，filgrastim，NEUPOGENTM）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF、CSF-1）、红细胞生成素（阿法依泊汀，epoetin alfa，EPOGENTM，PROSCRITTM）、干细胞因子（SCF、c-kit配体、青灰因子）、巨核细胞集落刺激因子、PIXY321（GMCSF/IL-3融合蛋白）、白介素尤其是IL-1至IL-12任意一种或多种、干扰素γ、或血小板生成素。 
在某些实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与肾上腺素能阻断剂联合施用，诸如例如醋丁洛尔（acebutolol）、阿替洛尔（atenolol）、倍他洛尔（betaxolol）、比索洛尔（bisoprolol）、卡替洛尔（carteolol）、拉贝洛尔（labetalol）、美托洛尔（metoprolol）、纳多洛尔（nadolol）、氧烯洛尔（oxprenolol）、喷布洛尔（penbutolol）、吲哚洛尔（pindolol）、普萘洛尔（propranolol）、索他洛尔（sotalol）和噻吗洛尔（timolol）。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗心律不齐药联合施用（例如腺苷、amidoarone、溴卞铵（bretylium）、洋地黄（digitalis）、地高辛（digoxin）、洋地黄毒苷（digitoxin）、diliazem、双异丙吡胺、艾司洛尔（esmolol）、氟卡尼（flecainide）、利多卡因（lidocaine）、美西律（mexiletine）、莫雷西嗪（moricizine）、苯妥英（phenytoin）、普鲁卡因酰胺（procainamide）、N-乙酰普鲁卡因酰胺、普罗帕酮（propafenone）、普萘洛尔、奎尼丁（quinidine）、索他洛尔、妥卡尼（tocainide）、和维拉帕米（verapamil））。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与利尿剂联合施用，诸如碳酸酐酶抑制剂（例如乙酰唑胺、二氯磺胺(dichlorphenamide)、和醋甲唑胺）、渗透压性利尿剂（例如甘油、异山梨醇、甘露醇、和尿素）、抑制Na+-K+-2Cl-同向转运的利尿剂（例如呋塞米、布美他尼、阿佐塞米、吡咯他尼、曲帕胺、依他尼酸、莫唑胺、和托塞米）、噻嗪和噻嗪样利尿剂（例如苄氟噻嗪、苄噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、多噻嗪、三氯噻嗪、氯噻酮、吲达帕胺、美托拉宗、和喹乙宗）、保钾利尿剂（例如阿米洛利和氨苯蝶啶）、和盐皮质素受体拮抗剂（例如螺内酯、坎利酮、和坎利酸钾）。 
在一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与内分泌和/或激素失衡紊乱的治疗联合施用。内分泌和/或激素失衡紊乱的治疗包括但不限于127I、碘的放射性同位素诸如131I和123I；重组生长激素，诸如HUMATROPETM（重组促生长素）；生长激素类似物，诸如PROTROPINTM（人蛋氨生长素）；多巴胺激动剂，诸如PARLODELTM（溴隐亭）；生长激素抑制素类似物，诸如SANDOSTATINTM（奥曲肽）；促性腺激素制品，诸如PREGNYLTM、A.P.L.TM和PROFASITM（绒毛膜促性腺激素（CG））、PERGONALTM（绝经促性素）、和METRODINTM（尿促卵泡素（uFSH））；合成人促性腺激素释放激素制品，诸如FACTRELTM和LUTREPULSETM（盐酸戈那瑞林）；合成促性腺激素激动剂，诸如LUPRONTM（醋酸亮丙瑞林）、SUPPRELINTM（醋酸组氨瑞林）、SYNARELTM（醋酸那法瑞林）、和ZOLADEXTM（醋酸戈舍瑞林）；促甲状腺激素释放激素合成制品，诸如RELEFACT TRHTM和THYPINONETM（普罗瑞林）；重组人TSH，诸如THYROGENTM；甲状腺激素天然异构体钠盐合成制品，诸如L-T4 TM、SYNTHROIDTM和LEVOTHROIDTM（左旋甲状腺素钠，levothyroxine）、L-T3 TM、CYTOMELTM和TRIOSTATTM（碘甲腺氨酸钠，liothyroine sodium）、及THYROLARTM（复方甲状腺素，liotrix）；抗甲状腺化合物，诸如6-n-丙基硫尿嘧啶（丙基硫尿嘧啶）、1-甲基-2-疏基咪唑和TAPAZOLETM（甲硫咪唑）、NEO-MERCAZOLETM（卡比马唑）；β-肾上腺素能受体拮抗剂，诸如普萘洛尔（Propranolol）和艾司洛尔（esmolol）；Ca2+通道阻断剂；地塞米松和碘化放射学对比剂，诸如TELEPAQUETM（碘番酸）和ORAGRAFINTM（碘泊酸钠）。 
内分泌和/或激素失衡紊乱的其它治疗包括但不限于雌激素或缀合雌激素，诸如ESTRACETM（雌二醇）、ESTINYLTM（乙炔雌二醇）、PREMARINTM、ESTRATABTM、ORTHO-ESTM、OGENTM和哌嗪雌酮硫酯（雌酮）、ESTROVISTM（炔雌醚）、ESTRADERMTM（雌二醇）、DELESTROGENTM和VALERGENTM（戊酸雌二醇）、DEPO-ESTRADIOL CYPIONATETM和ESTROJECT LATM（环戊丙酸雌二醇）；抗雌激素，诸如NOLVADEXTM（他莫西芬）、SEROPHENETM和CLOMIDTM（克罗米酚）；孕酮，诸如DURALUTINTM（己酸羟基孕酮）、MPATM和DEPO-PROVERATM（醋酸甲孕酮）、PROVERATM和CYCRINTM（MPA）、MEGACETM（醋酸甲地孕酮）、NORLUTINTM（炔诺酮）、及NORLUTATETM和AYGESTINTM（醋酸炔诺酮）；孕酮植入物，诸如NORPLANT SYSTEMTM（炔诺孕酮的皮下植入物）；抗孕酮，诸如RU 486TM（米非司酮）；激素避孕药，诸如ENOVIDTM（异炔诺酮加美雌醇）、PROGESTASERTTM（释放孕酮的子宫内避孕装置）、LOESTRINTM、BREVICONTM、MODICONTM、GENORATM、NELONATM、NORINYLTM、OVACON-35TM和OVACON-50TM（乙炔雌二醇/炔诺酮）、LEVLENTM、NORDETTETM、TRI-LEVLENTM和TRIPHASIL-21TM（乙炔雌二醇/左炔诺孕酮）、LO/OVRALTM和OVRALTM（乙炔雌二醇/炔诺孕酮）、DEMULENTM（乙炔雌二醇/双醋炔诺醇）、NORINYLTM、ORTHO-NOVUMTM、NORETHINTM、GENORATM、和NELOVATM（炔诺酮/美雌醇）、DESOGENTM和ORTHO-CEPTTM（乙炔雌二醇/去氧孕烯）、ORTHO-CYCLENTM和ORTHO-TRICYCLENTM（乙炔雌二醇/诺孕酯）、MICRONORTM和NOR-QDTM（炔诺酮）、和OVRETTETM（炔诺孕酮）。 
内分泌和/或激素失衡紊乱的其它治疗包括但不限于睾酮酯，诸如醋酸美替诺龙和十一酸睾酮；肠胃外和口服雄激素，诸如TESTOJECT-50TM（睾酮）、TESTEXTM（丙酸睾酮）、DELATESTRYLTM（庚酸睾酮）、DEPO-TESTOSTERONETM（环戊丙酸睾酮）、DAQNOCRINETM（丹那唑）、HALOTETINTM（氟甲睾酮）、ORETON METHYLTM、TESTREDTM和VIRILONTM（甲睾酮）、和OXANDRINTM（氧雄龙）；睾酮透皮系统，诸如TESTODERMTM；雄激素受体拮抗剂和5-α-还原酶抑制剂，诸如ANDROCURTM（醋酸环丙孕酮）、EULEXINTM（氟他胺）、和PROSCARTM（非那雄胺）；促肾上腺皮质激素制品，诸如CORTROSYNTM（cosyntropin）； 肾上腺皮质类固醇及其合成类似物，诸如ACLOVATETM（二丙酸阿氯米松）、CYCLOCORTTM（安西奈德）、BECLOVENTTM和VANCERILTM（二丙酸倍氯米松）、CELESTONETM（倍他米松）、BENISONETM和UTICORTTM（苯甲酸倍他米松）、DDIPROSONETM（二丙酸倍他米松）、CELESTONE PHOSPHATETM（倍他米松磷酸钠）、CELESTONE SOLUSPANTM（倍他米松磷酸和醋酸钠）、BETA-VALTM和VALISONETM（戊酸倍他米松）、TEMOVATETM（丙酸氯倍他索）、CLODERMTM（三甲基乙酸氯可托龙）、CORTEFTM和HYDROCORTONETM（皮质醇（氢化可的松））、HYDROCORTONE ACETATETM（醋酸皮质醇（氢化可的松））、LOCOIDTM（丁酸皮质醇（氢化可的松））、HYDROCORTONE PHOSPHATETM（皮质醇（氢化可的松）磷酸钠）、A-HYDROCORTTM和SOLU CORTEFTM（皮质醇（氢化可的松）琥珀酸钠）、WESTCORTTM（戊酸皮质醇（氢化可的松））、CORTISONE ACETATETM（醋酸可的松）、DESOWENTM和TRIDESILONTM（地奈德）、TOPICORTTM（去羟米松）、DECADRONTM（地塞米松）、DECADRON LATM（醋酸地塞米松）、DECADRON PHOSPHATETM和HEXADROL PHOSPHATETM（地塞米松磷酸钠）、FLORONETM和MAXIFLORTM（二乙酸二氟拉松）、FLORINEF ACETATETM（醋酸氟氢可的松）、AEROBIDTM和NASALIDETM（氟尼缩松）、FLUONIDTM和SYNALARTM（氟轻松）、LIDEXTM（醋酸氟轻松）、FLUOR-OPTM和FMLTM（氟米龙）、CORDRANTM（氟氢缩松）、HALOGTM（哈西奈德）、HMSLIZUIFILMTM（甲羟松）、MEDROLTM（甲泼尼龙）、DEPO-MEDROLTM和MEDROL ACETATETM（醋酸甲泼尼龙）、A-METHAPREDTM  和SOLUMEDROLTM（甲泼尼龙琥珀酸钠）、ELOCONTM（糠酸莫米松）、HALDRONETM（醋酸帕拉米松）、DELTA-CORTEFTM（泼尼松龙）、ECONOPREDTM（醋酸泼尼松龙）、HYDELTRASOLTM（泼尼松龙磷酸钠）、HYDELTRA-T.B.ATM（叔丁基醋酸泼尼松龙）、DELTASONETM（泼尼松）、ARISTOCORTTM和KENACORTTM（曲安西龙）、KENALOGTM（曲安奈德）、ARISTOCORTTM和KENACORT DIACETATETM（双醋酸曲安西龙）、和ARISTOSPANTM（己曲安奈德）；肾上腺皮质类固醇生物合成与作用的抑制剂，诸如CYTADRENTM（氨鲁米特）、NIZORALTM（酮康唑）、MODRASTANETM（曲洛司坦）、和METOPIRONETM（美替拉酮）；牛、猪、或人胰岛素或其混 合物；胰岛素类似物；重组人胰岛素，诸如HUMULINTM和NOVOLINTM；口服降血糖药，诸如ORAMIDETM和ORINASETM（甲苯磺丁脲）、DIABINESETM（氯磺丙脲）、TOLAMIDETM和TOLINASETM（妥拉磺脲）、DYMELORTM（醋酸己脲）、格列本脲、MICRONASETM、DIBETATM和GLYNASETM（格列苯脲）、GLUCOTROLTM（格列吡嗪）、和DIAMICRONTM（格列齐特）、GLUCOPHAGETM（甲福明）、环格列酮、吡格列酮、和α-葡萄糖苷酶抑制剂；牛或猪胰高血糖素；促生长素抑制素，诸如SANDOSTATINTM（奥曲肽）；和二氮嗪，诸如PROGLYCEMTM（二氮嗪）。 
在一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与子宫活动性紊乱的治疗联合施用。子宫活动性紊乱的治疗包括但不限于雌激素药物，诸如缀合雌激素（例如PREMARIN
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801651
和ESTRATAB
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801652
）、雌二醇（例如CLIMARA
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801653
和ALORA
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801654
）、哌嗪雌酮硫酯、和氯烯雌醚；孕酮药物（例如AMEN
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801655
（甲羟孕酮）、MICRONOR
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801656
（醋酸炔诺酮）、PROMETRIUM
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801657
孕酮、和醋酸甲地孕酮）；以及雌激素/孕酮联合疗法，诸如例如缀合雌激素/甲羟孕酮（例如PREMPROTM和PREMPHASE
Figure DEST_PATH_BDA00002106285801658
）和醋酸炔诺酮/乙炔雌二醇（例如FEMHRTTM）。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与治疗缺铁性和低血色素性贫血有效的药物联合施用，包括但不限于硫酸亚铁（铁硫酸盐，FEOSOLTM）、富马酸亚铁（例如FEOSTATTM）、葡萄糖酸亚铁（例如FERGONTM）、多糖-铁复合物（例如NIFEREXTM）、铁右旋糖苷注射液（例如INFEDTM）、硫酸酮、吡哆醇(pyroxidine)、核黄素、维生素B12、氰钴胺注射液（例如REDISOLTM、RUBRAMIN PCTM）、羟钴胺素、叶酸（例如FOLVITETM）、甲酰四氢叶酸（亚叶酸，5-CHOH4PteGlu，亚叶酸钙）或WELLCOVORIN（甲酰四氢叶酸的钙盐）、转铁蛋白或铁蛋白。 
在某些实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与用于治疗精神紊乱的药剂联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的精神病药物包括但不限于安定药（例如氯丙嗪、氯普噻吨、氯氮平、氟奋乃静、氟哌啶醇、洛沙平、美索达嗪、吗茚酮、奥氮平、奋乃静、匹莫齐特、奎硫平、利培酮、硫利达嗪、替奥噻吨、三氟拉嗪、和三氟丙嗪）、抗狂躁药（例如卡马西平、双丙戊酸钠、碳酸锂、和柠檬酸锂）、抗抑郁药（例如阿米替林、阿莫沙平、丁氨苯丙酮、西酞普兰、氯米帕明、地昔帕明、 多塞平、氟伏沙明、氟西汀、丙米嗪、异卡波肼、马普替林、米氮平、萘法唑酮、去甲替林、帕罗西汀、苯乙肼、普罗替林、舍曲林、反苯环丙胺、曲唑酮、曲米帕明、和文拉法辛）、抗焦虑药（例如阿普唑仑、丁螺环酮、氯地庚波、氯氮卓、地西泮、哈拉西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、和普拉西泮）、和兴奋剂（例如d-苯丙胺、哌甲酯、和匹莫林）。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与用于治疗神经学紊乱的药剂联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的神经学药剂包括但不限于抗癫痫药（例如卡马西平、氯硝西泮、乙琥胺、苯巴比妥、苯妥英、扑米酮、丙戊酸、双丙戊酸钠、非尔氨酯、加巴喷丁、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡西平、噻加宾、托吡酯、唑尼沙胺、地西泮、劳拉西泮、和氯硝西泮）、抗帕金森病药（例如左旋多巴/卡比多巴、司来吉兰、金刚烷胺、溴隐亭、培高利特、罗匹尼罗、普拉克索、苯扎托品；比哌立登；爱普巴嗪；丙环定；苯海索、托卡朋）、和ALS治疗剂（例如利鲁唑）。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与血管舒张剂和/或钙通道阻断剂联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的血管舒张剂包括但不限于血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂（例如罂粟碱、异克舒令、贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、群多普利、和布酚宁）、和硝酸酯（例如二硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯、和硝酸甘油）。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的钙通道阻断剂的例子包括但不限于氨氯地平、苄普地尔、地尔卓尔、非洛地平、氟桂利嗪、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、和维拉帕米。 
在某些实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与胃肠紊乱的治疗剂联合施用。可与本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的胃肠紊乱的治疗剂包括但不限于H2组胺受体拮抗剂（例如TAGAMETTM（西米替丁）、ZANTACTM（雷尼替丁）、PEPCTDTM（法莫替丁）、和AXIDTM（尼扎替丁））；H+、K+ATP酶抑制剂（例如PREVACIDTM（兰索拉唑）和PRILOSECTM（奥美拉唑））；铋化合物（例如PEPTO-BISMOLTM（碱式水杨酸铋）和DE-NOLTM（碱式柠檬酸铋））；各种抗酸药；硫糖铝；前列腺素类似物（例如，CYTOTECTM（米索前列醇））；毒蕈碱胆碱能拮抗剂；轻泻药 （例如表面活性剂轻泻药、刺激性轻泻药、盐水和渗透性轻泻药）；止泻药（例如LOMOTILTM（地芬诺酯）、MOTOFENTM（diphenoxin）、和IMODIUMTM（盐酸洛哌丁胺））、促生长素抑制素的合成类似物，诸如SANDOSTATINTM（奥曲肽）、止吐药（例如ZOFRANTM（昂丹司琼）、KYTRILTM（盐酸格拉司琼）、托烷司琼、多拉司琼、甲氧氯普胺、氯丙嗪、奋乃静、丙氯拉嗪、异丙嗪、硫乙拉嗪、三氟丙嗪、多潘立酮、氟哌啶醇、氟哌利多、曲美苄胺、地塞米松、甲泼尼龙、屈大麻酚、和大麻龙）；D2拮抗剂（例如甲氧氯普胺、曲美苄胺和氯丙嗪）；胆盐；鹅去氧胆酸；熊去氧胆酸；和胰腺酶制品，诸如胰酶和胰脂肪酶。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与其它治疗性或预防性方案诸如例如放疗联合施用。 
本发明还提供了包括一个或多个容器的制药学包装或试剂盒，所述容器中装有一种或多种包含本发明清蛋白融合蛋白的药物组合物的成分。任选的是，与这样的容器一起提供由政府行政机构颁布的规范药品或生物学产品的生产、使用或销售的通告，该通告反映了行政机构对人体施药的生产、使用或销售的批准。 
基因疗法
编码本发明清蛋白融合蛋白的构建体可作为基因治疗方案的一部分用于投递治疗有效剂量的清蛋白融合蛋白。用于在体内将核酸导入细胞的优选方法是通过使用包含编码本发明清蛋白融合蛋白的核酸的病毒载体。用病毒载体感染细胞的优势是大部分靶细胞都能够获得所述核酸。另外，病毒载体内例如由病毒载体所含cDNA编码的分子在摄取病毒载体核酸的细胞中有效表达。 
逆转录病毒和腺伴随病毒载体可作为重组基因投递系统用于在体内转移编码清蛋白融合蛋白的外源核酸分子。这些载体将核酸有效投递到细胞中，且转染核酸稳定整合到宿主染色体DNA中。只产生复制缺陷型逆转录病毒的专用细胞系（称为“包装细胞”）的开发增加了逆转录病毒在基因疗法中的效用，而所鉴定的缺陷型逆转录病毒用于基因疗法目的的基因转移（综述参见Miller,A.D.，Blood 76：271，1990）。通过标准技术，复制缺陷型逆转录病毒可包装成病毒粒子，它可通过辅助病毒的使用而用于感染靶细胞。用于生成重组逆转录病毒和用于在体外或体内用这种病毒感染细胞的方 案可参见《Current Protocols in Molecular Biology》，Ausubel,F.M.等人编，Greene Publishing Associates，1989，Sections 9.10-9.14及其它标准实验指南。 
可用于本发明的另一种病毒基因投递系统使用腺病毒衍生的载体。可以这样操作腺病毒的基因组使之编码并表达目的基因产物，但灭活其在正常溶胞性病毒生命周期中复制的能力。参见例如Berkner等人，BioTechniques 6：616，1988；Rosenfeld等人，Science 252：431-434，1991；及Rosenfeld等人，Cell 68：143-155，1992。衍生自腺病毒株Ad5型d1324或其它腺病毒株（例如Ad2、Ad3、Ad7等）的合适腺病毒载体是本领域技术人员所知道的。在某些情况中重组腺病毒是有优势的，因为它们不能感染不分裂细胞，且可用于感染多种多样的细胞类型，包括上皮细胞（Rosenfeld等人，1992，引用同上）。此外，病毒颗粒相对稳定，且易于纯化和浓缩，且如上所述，可将改造以影响其感染谱。另外，导入的腺病毒DNA（及其中所含的外源DNA）不整合到宿主细胞基因组中，仍然作为附加体，从而避免了在导入的DNA整合到宿主基因组中（例如逆转录病毒DNA）的情况中因插入诱变而发生的潜在问题。另外，腺病毒基因组携带外来DNA的能力相对于其它基因投递载体是大的（可达8千碱基）（Berkner等人，引用同上；Haj-Ahmand等人，J.Virol.57：267，1986）。 
在另一个实施方案中，本发明的非病毒基因投递系统依赖于靶细胞摄取主题核苷酸分子的细胞内吞途径。这种类型的例示性基因投递系统包括脂质体衍生系统、多赖氨酸缀合物、及人工病毒包膜。在一个代表性实施方案中，可将编码本发明清蛋白融合蛋白的核酸分子捕获到其表面带正电荷且（任选）用针对靶组织细胞表面抗原的抗体加标签的脂质体中（例如lipofectin）（Mizuno等人，No Shinkei Geka 20：547-551，1992；PCT公布WO 91/06309；日本专利申请1047381；及欧洲专利公布EP-A-43075）。 
可以通过多种方法将编码本发明清蛋白融合蛋白的基因的基因投递系统导入到患者。例如，可以通过例如静脉内注射系统导入基因投递系统的药学制备物，而靶细胞中蛋白质的特异转导主要由基因投递媒介提供的转染特异性、可归于控制受体基因表达的转录调控序列的细胞类型或组织类型表达或其组合而发生。在其它实施方案中，重组基因的最初投递更多限制于相当局部的导入动物。例如，可通过导管（参见美国专利5,328,470）或通过定向注射（例如Chen等人，PNAS 91：3054-3057，1994）来导入基因投递媒介。 基因治疗构建体的药学制备物可本质上由可接受稀释剂中的基因投递系统组成，或者可包含其中埋有基因投递媒介的缓释基质。在可以由重组细胞生成完整清蛋白融合蛋白时，例如逆转录病毒载体，药学制备物可包含生成清蛋白融合蛋白的一种或多种细胞。 
其它基因疗法
本发明还涵盖用于治疗或预防紊乱、疾病和状况的基因疗法。基因疗法涉及将核酸（DNA、RNA和反义DNA或RNA）序列导入动物以实现本发明清蛋白融合蛋白的表达。此方法要求编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸与启动子和靶组织表达融合蛋白所必需的任何其它基因元件可操作连接。这样的基因治疗和投递技术是本领域已知的，参见例如WO90/11092，将其引入本文作为参考。 
因此，例如，可以用包含与编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可操作连接的启动子的多核苷酸（DNA或RNA）离体改造来自患者的细胞，然后将经过改造的细胞提供给将用本发明清蛋白融合蛋白治疗的患者。这样的方法是本领域众所周知的。例如，参见Belldegrun,A.等人，J.Natl.Cancer Inst.85：207-216，1993；Ferrantini,M.等人，Cancer Research 53：1107-1112，1993；Ferrantini,M.等人，J.Immunology 153：4604-4615，1994；Kaido,T.等人，Int.J.Cancer 60：221-229，1995；Ogura,H.等人，Cancer Research 50：5102-5106，1990；Santodonato,L.等人，Human Gene Therapy 7：1-10，1996；Santodonato,L.等人，Gene Therapy 4：1246-1255，1997；及Zhang,J.-F.等人，Cancer Gene Therapy 3：31-38，1996，将其引入本文作为参考。在一个实施方案中，进行改造的细胞是动脉细胞。可以通过直接注射到动脉中、动脉周围的组织中或者通过导管注射将动脉细胞重新导入患者。 
正如下文更详细的讨论，可以通过投递可注射材料的任何方法将多核苷酸构建体投递给动物细胞，诸如注射到组织（心、肌肉、皮肤、肺、肝等等）胞间隙。多核苷酸构建体可以在制药学可接受液体或水性载体中投递。 
在一个实施方案中，编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为裸露的多核苷酸投递。术语“裸露”的多核苷酸、DNA或RNA指序列游离于辅助、促进或加速进入细胞的任何投递媒介，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂转染或沉淀试剂等。然而，编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可以在可通过本领域技术人员熟知的方法制备的脂质体制剂和脂转染制剂 等中投递。例如美国专利号5,593,972、5,589,466、和5,580,859中描述了这样的方法，将其引入本文作为参考。 
用于基因疗法的多核苷酸载体构建物优选既不会整合到宿主基因组中也不含允许复制的序列的构建体。合适的载体包括可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；及可从Invitrogen获得的pEF1/V5、pcDNA3.1和pRc/CMV2。其它合适的载体对于熟练技术人员而言是显而易见的。 
本领域技术人员知道的任何强启动子均可用于驱动多核苷酸序列的表达。合适的启动子包括腺病毒启动子，诸如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，诸如细胞巨化病毒（CMV）启动子；呼吸道合胞病毒（RSV）启动子；诱导型启动子，诸如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；清蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，诸如单纯疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR；b-肌动蛋白启动子；及人生长激素启动子。启动子对于与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的基因来说也可以是天然的启动子。 
与其它基因治疗技术不同，将裸落的核酸序列导入靶细胞的一个主要优点是细胞中多核苷酸合成的短暂性质。研究表明可以将非复制DNA序列导入细胞，从而在可长达6个月的期间提供期望多肽的生成。 
可以将多核苷酸构建物投递至动物的组织胞间隙，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、软骨、胰、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺、和结缔组织。组织胞间隙包括细胞间、液体、器官组织的网状纤维间的粘多糖层、管壁或室壁中的弹性纤维、纤维组织的胶原纤维、或者纳入肌细胞的结缔组织或骨隙中的相同基质。由循环血浆和淋巴管道的淋巴液占据的空间也类似。由于下面讨论的原因优选投递至肌肉组织胞间隙。它们可以通过注射方便的投递至包含这些细胞的组织。它们优选投递至持久的、不分裂的已分化细胞并在其中表达，尽管投递和表达可以在未分化或者分化较不完全的细胞，诸如例如血液的干细胞或皮肤成纤维细胞中完成。在体内肌肉细胞在它们摄取和表达多核苷酸的能力方面特别胜任有效。 
对于裸露核酸序列注射，DNA或RNA的有效剂量将在约0.05g/kg体重至约50mg/kg体重的范围内。优选的是，剂量将是约0.005mg/kg至约20mg/kg 且更优选约0.05mg/kg至约5mg/kg。当然，本领域普通技术人员将领会，这个剂量将随着注射的组织部位而变化。核酸序列的适当且有效的剂量可由本领域普通技术人员容易的确定，而且可能取决于治疗的状况和施药途径。 
优选的施药途径是通过肠胃外注射途径至组织胞间隙中。然而，也可以使用其它肠胃外途径，诸如气雾剂吸入，特别适用于投递至肺或支气管组织、喉或鼻粘膜。此外，裸露DNA构建物可在血管成形术过程中通过程序中使用的导管投递至动脉。 
通过本领域知道的任何方法投递裸露的多核苷酸，包括不限于投递部位的直接针注射、静脉内注射、局部施用、导管灌输、及所谓的“基因枪”。这些投递方法是本领域已知的。 
也可以用投递媒介诸如病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂转染、沉淀试剂等投递构建体。这些投递方法是本领域已知的。 
在某些实施方案中，将多核苷酸构建体复合到脂质体制备物中。用于本发明的脂质体制备物包括阳离子（带正电荷的）、阴离子（带负电荷的）和中性制备物。然而，特别优选阳离子脂质体，因为可以在阳离子脂质体和多阴离子核酸之间形成紧密的电荷复合体。已经显示了阳离子脂质体以功能性形式介导质粒DNA（Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416，1987，将其引入本文作为参考）；mRNA（Malone等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6077-6081，1989，将其引入本文作为参考）；和纯化的转录因子（Debs等人，J.Biol.Chem.265：10189-10192，1990，将其引入本文作为参考）的细胞内投递。 
阳离子脂质体易于获得。例如，N[1-2,3-二油基氧]丙基]-N,N,N-三乙基铵（DOTMA）脂质体特别有用，且可从GIBCO BRL，Grand Island，N.Y.获得，商标为Lipofectin（也可参见Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416，1987，将其引入本文作为参考）。其它商品化脂质体包括transfectace（DDAB/DOPE）和DOTAP/DOPE（Boehringer）。 
其它阳离子脂质体可以使用本领域众所周知的技术由易于获得的材料制备。参见例如PCT公布号WO 90/11092（将其引入本文作为参考）所描述的DOTAP（1,2-二(油酰氧)-3-(三甲铵)丙烷）脂质体的合成。文献中描述了DOTMA脂质体的制备，参见例如P.Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417，将其引入本文作为参考。类似方法可用于由其它阳离子脂 质材料制备脂质体。 
类似的，阴离子和中性脂质体也易于获得，诸如从Avanti Polar Lipids（Birmingham，Ala.）获得，或者可以用易于获得的材料容易的制备。这样的材料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）等。这些材料还可与DOTMA和DOTAP起始材料以适当比例混合。用这些材料制备脂质体的方法是本领域众所周知的。 
例如，在商业上二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）和二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）可以不同组合用于制备常规脂质体，可以添加或不添加胆固醇。因此，例如，可以通过将各50mg DOPG和DOPC在氮气流下在超声处理瓶中干燥来制备DOPG/DOPC脂质体。将样品置于真空泵下过夜，第二天用去离子水水合。然后将样品在盖盖的瓶中用配备有倒置杯（水浴型）探针的350型Heat Systems超声仪以最大设置超声处理2小时，同时水浴以15℃循环。或者，可以不用超声处理产生多层囊泡或者通过挤出核孔膜产生大小各异的单层囊泡来制备带负电荷的囊泡。本领域技术人员还知道且可利用其它方法。 
脂质体可包含多层囊泡（MLV）、小单层囊泡（SUV）、或大单层囊泡（LUV），优选SUV。使用本领域众所周知的方法制备各种脂质体-核酸复合物。参见例如Straubinger等人，Methods of Immunology 101：512-527，1983，将其引入本文作为参考。例如，可以通过将磷脂薄膜沉积在玻璃试管壁上，随后用将要装囊的材料的溶液水化来制备含核酸的MLV。SUV通过延长超声处理MLV而产生均质的单层脂质体群来制备。将欲捕获的材料加到经过处理的MLV悬浮液中然后超声处理。在使用含阳离子脂质的脂质体时，将干燥的脂质膜重悬于适当溶液诸如无菌水或等张缓冲液诸如10mM Tris/NaCl，超声处理，然后将经过处理的脂质体直接与DNA混合。由于带正电荷的脂质体与阴离子DNA的结合，因而脂质体和DNA形成非常稳定的复合物。SUV可用于核酸小片段。LUV通过本领域知道的许多方法制备。常用的方法包括Ca2+-EDTA螯合（Papahadjopoulos等人，Biochim.Biophys.Acta 394：483，1975；Wilson等人，Cell 17：77，1979）；醚注射（Deamer,D.和Bangham,A.，Biochim.Biophys.Acta 443：629，1976；Ostro等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.76：836，1977；Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  76：3348，1979）；洗涤剂透析（Enoch,H.和Strittmatter,P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：145，1979）；和反相蒸馏（REV）（Fraley等人，J.Biol.Chem.255：10431，1980；Szoka,F.和Papahadjopoulos,D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：145，1978；Schaefer-Ridder等人，Science 215：166，1982），将其引入本文作为参考。 
一般而言，DNA与脂质体的比例为约10:1至约1:10。优选的是，比例为约5:1至约1:5。更优选的是，比例为约3:1至约1:3。仍然更优选的是，比例为约1:1。 
美国专利号5,676,954（将其引入本文作为参考）报导了为小鼠注射与阳离子脂质体载体复合的遗传材料。美国专利号4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和国际公布号WO 94/9469（将其引入本文作为参考）提供了用于将DNA转染到细胞和哺乳动物中的阳离子脂质。美国专利号5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和国际公布号WO 94/9469提供了将DNA-阳离子脂质复合物投递至哺乳动物的方法。 
在某些实施方案中，离体或在体内用含有包含编码本发明清蛋白融合蛋白的序列的RNA的逆转录病毒颗粒改造细胞。可由其衍生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于莫罗尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒、和乳腺肿瘤病毒。 
使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产者细胞系。可转染的包装细胞的例子包括但不限于Miller，Human Gene Therapy 1：5-14，1990中描述的PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系，将其完整引入本文作为参考。可以通过本领域知道的任何方法用载体转导包装细胞。这样的方法包括但不限于电穿孔、利用脂质体、和CaPO4沉淀。在一个可选方案中，可将逆转录病毒质粒载体包裹在脂质体中，或者与脂质偶联，然后施用于宿主。 
生产者细胞系产生包含编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的感染性逆转录病毒载体颗粒。然后可以用这样的逆转录病毒载体颗粒在体外或在体内转导真核细胞。经过转导的真核细胞将表达本发明的融合蛋白。 
在某些其它实施方案中，离体或在体内用包含在腺病毒载体中的多核苷酸 改造细胞。可以这样操作腺病毒使之编码并表达本发明的融合蛋白，同时灭活其在正常溶胞性病毒生命周期中复制的能力。不需要将病毒DNA整合到宿主细胞染色体中就实现腺病毒表达，由此减轻了对插入诱变的担心。此外，腺病毒用作活体肠道疫苗已经多年，具有极好的安全特性（Schwartz等人，Am.Rev.Respir.Dis.109：233-238，1974）。最后，已经演示了腺病毒介导的基因转移的许多实例，包括将α-1-抗胰蛋白酶和CFTR转移至棉鼠的肺（Rosenfeld,M.A.等人，Science 252：431-434，1991；Rosenfeld等人，Cell 68：143-155，1992）。另外，试图将腺病毒确定为人癌症致病因子的广泛研究一律都是否定的（Green,M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：6606，1979）。 
可用于本发明的合适腺病毒载体描述于例如Kozarsky和Wilson，Curr.Opin.Genet.Devel.3：499-503，1993；Rosenfeld等人，Cell 68：143-155，1992；Engelhardt等人，Human Genet.Ther.4：759-769，1993；Yang等人，Nature Genet.7：362-369，1994；Wilson等人，Nature 365：691-692，1993；及美国专利号5,652,224，将其引入本文作为参考。例如，腺病毒载体Ad2是有用的，且可以在人293细胞中培养。这些细胞含有腺病毒的E1区，且组成性表达E1a和E1b，它们通过提供载体中删除的基因的产物而弥补缺陷型腺病毒。除Ad2以外，其它多种腺病毒（例如Ad3、Ad5和Ad7）也可用于本发明。 
优选的是，用于本发明的腺病毒是复制缺陷型的。复制缺陷型腺病毒需要辅助病毒和/或包装细胞系的帮助来形成感染性颗粒。如此得到的病毒能够感染细胞，并能够表达与启动子可操作连接的目的多核苷酸，但在大多数细胞中不能复制。复制缺陷型腺病毒可删除了一种或多种下列基因的整个或部分：E1a、E1b、E3、E4、E2a或L1至L5。 
在某些其它实施方案中，离体或在体内用腺伴随病毒（AAV）改造细胞。AAV是需要辅助病毒来产生感染性颗粒的天然存在缺陷型病毒（Muzyczka,N.，Curr.Topics in Microbiol.Immunol.158：97，1992）。它还是可将其DNA整合到非分裂细胞中的少数病毒之一。含有AAV的少至300个碱基对的载体就可包装和整合，但是供外源DNA的空间限制在约4.5kb。用于产生并使用这样的AAV的方法是本领域知道的。参见例如美国专利号5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,935、5,478,745和5,589,377。 
例如，用于本发明的合适AAV载体将包括DNA复制、壳体化、及宿主 细胞整合所必需的所有序列。使用标准克隆方法将多核苷酸构建体插入AAV载体，诸如在Sambrook等人，《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Press，1989中所找到的。然后使用任何标准技术，包括脂转染、电穿孔、磷酸钙沉淀等，将重组AAV载体转染到用辅助病毒感染的包装细胞系中。合适的辅助病毒包括腺病毒、细胞巨化病毒、牛痘病毒、或疱疹病毒。一旦包装细胞受到转染或感染，它们将产生包含多核苷酸构建体的感染性AAV病毒颗粒。然后用这些病毒颗粒离体或在体内转导真核细胞。经过转导的细胞将含有整合到其基因组中的多核苷酸构建体，且将表达本发明的融合蛋白。 
另一种基因治疗方法涉及通过同源重组使异源控制区和内源多核苷酸序列（例如编码本发明的多肽）可操作相连（参见例如1997年6月24日发表的美国专利号5,641,670；1996年9月26日出版的国际公开号WO 96/29411；1994年8月4日出版的国际公开号WO 94/12650；Koller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935，1989；及Zijlstra等人，Nature 342：435-438，1989，将其引入本文作为参考）。此方法涉及靶细胞中存在的但正常情况下不在细胞中表达或以低于期望水平表达的基因的激活。 
用本领域知道的标准技术制备多核苷酸构建体，它包含启动子且该启动子侧翼为靶向序列。本文描述了合适的启动子。靶向序列与内源序列充分互补以允许启动子-靶向序列与内源序列的同源重组。靶向序列将充分接近期望内源多核苷酸序列的5’端，使得启动子将通过同源重组与内源序列可操作连接。 
可以PCR扩增启动子和靶向序列。优选的是，扩增的启动子在5’和3’端含有截然不同的限制酶位点。优选的是，第一靶向序列的3’端含有与扩增启动子的5’端相同的限制酶位点，而第二靶向序列的5’端含有与扩增启动子的3’端相同的限制酶位点。消化扩增的启动子和靶向序列并连接到一起。 
将启动子-靶向序列构建体投递至细胞，或者作为裸露的多核苷酸，或者与上文更详细描述的促转染剂诸如脂质体、病毒序列、病毒颗粒、全病毒、脂转染、沉淀剂等联合。可通过任何方法投递P启动子-靶向序列，包括直接针注射、静脉内注射、局部施用、导管灌输、粒子加速器等。下文更详细的描述了这些方法。 
启动子-靶向序列构建体由细胞摄取。构建体与内源序列之间发生同源重组，使得内源序列置于启动子的控制之下。然后启动子驱动内源序列的表达。 
编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可含有促进蛋白质分泌的分泌信号序列。典型的，信号序列在待表达多核苷酸编码区中朝向或位于编码区的5’端。信号序列对于目的多核苷酸可以是同源的或异源的，且对于待转染细胞可以是同源的或异源的。另外，信号序列可以使用本领域知道的方法化学合成。 
可以使用任何模式来施用任何上述多核苷酸构建体，只要该模式导致一种或多种分子以足以提供治疗效果的数量表达。这包括直接针注射、系统注射、导管灌输、生物射弹注射、粒子加速器（即“基因枪”）、gelfoam海绵储库(depot)、其它商品化储库材料、渗透泵（例如Alza微型泵）、口服或栓剂固体（药片或药丸）药学制剂、及手术期间倾注或局部应用。例如，将裸露的磷酸钙沉淀质粒直接注射到大鼠肝和大鼠脾中或者将蛋白质包被的质粒直接注射到门静脉中导致外源基因在大鼠肝中的基因表达（Kaneda等人，Science 243：375，1989）。 
局部施用的一种优选方法是通过直接注射。优选的是，将与投递媒介复合的本发明清蛋白融合蛋白通过直接注射施用到动脉中或局部施用到动脉区域内。将组合物局部施用到动脉区域内指将组合物注射到动脉内几厘米优选几毫米。 
局部施用的另一种方法是将本发明的多核苷酸构建体置于手术伤口之中或周围。例如，可给患者施行手术，并可将多核苷酸构建体覆盖在伤口内的组织表面上，或者可将构建体注射到伤口内的组织区域中。 
可用于系统施用的治疗性组合物包括与本发明靶向投递媒介复合的本发明融合蛋白。适用于系统施用的投递媒介包括包含将媒介靶向特定部位的配体的脂质体。在具体的实施方案中，适用于系统施用的投递媒介包括包含将媒介靶向特定部位的本发明清蛋白融合蛋白的脂质体。 
系统施用的优选方法包括静脉内注射、气雾剂、口服和经皮（局部）投递。静脉内注射可用本领域的标准方法进行。气雾剂投递也可用本领域的标准方法进行（参见例如Stribling等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189：11277-11281，1992，将其引入本文作为参考）。口服投递可通过将本发明的多核苷酸构建体与能够抵挡动物肠道中消化酶的降解的载体复合来进行。这样的载体的例子包括塑料胶囊或药片，诸如本领域缩知道的。局部投递可通过将本发明的多核苷酸构建体与能够穿过皮肤的亲脂性药剂（例如DMSO） 混合来进行。 
决定物质投递的有效量可取决于多种因素，包括例如这些物质的化学结构和生物学活性、动物的年龄和体重、需要治疗的确切状况及其严重程度、及施药途径。治疗的频率取决于多种因素，诸如每次服药施用的多核苷酸构建物的数量、以及受试者的健康状况和病史。主治医师或兽医将决定确切的用量、服药次数、和服药时间。 
本发明的清蛋白融合蛋白可以施用于任何动物，优选哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人、犬、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马和猪，人是特别优选的。 
生物学活性
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于测试一种或多种生物学活性的测定法。如果清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸在特定测定法中显示出活性，那些与融合蛋白对应的治疗性蛋白质很可能涉及与该生物学活性有关的疾病。因此，所述融合蛋白可用于治疗相关疾病。 
在优选的实施方案中，本发明涵盖治疗表1“优选适应症Y”列中所列出的疾病或紊乱的方法，包括以有效治疗、预防或改善所述疾病或紊乱的数量对需要这种治疗、预防或改善的患者施用本发明的清蛋白融合蛋白，该清蛋白融合蛋白包含与表1“治疗性蛋白质X”列所公开的治疗性蛋白质（与表1“优选适应症Y”列所列出的疾病或紊乱位于同一行）对应的治疗性蛋白质部分。 
在另一个优选的实施方案中，本发明涵盖治疗表1“优选适应症Y”列对特定治疗性蛋白质所列出的疾病或紊乱的方法，包括以有效治疗、预防或改善所述疾病或紊乱的数量对需要这种治疗、预防或改善的患者施用本发明的清蛋白融合蛋白，该清蛋白融合蛋白包含与实施例中的适应症有关的治疗性蛋白质对应的治疗性蛋白质部分。 
本发明明确考虑了在由编码SEQ ID NO：Y的多核苷酸编码时由细胞所生成的清蛋白融合蛋白。在使用这些多核苷酸由细胞表达所编码蛋白质时，细胞的自然分泌和加工步骤生成了缺少表2第4和/或11列明确列出的信号序列的蛋白质。所列信号序列的具体氨基酸序列在说明书中有显示或是本领域众所周知的。如此，本发明最优选的实施方案包括由细胞生成的清蛋白融合蛋白（它缺少表2第4和/或11列所列出的前导序列）。最优选的还有包含SEQ ID NO：Y但不具有表2第4和/或11列所列出的前导序列的多肽。包 含这两个优选实施方案的组合物，包括药物组合物，也是优选的。明确考虑了使用这些清蛋白融合蛋白来治疗、预防或改善表1“优选适应症：Y”列为特定治疗性蛋白质所列出的疾病或紊乱。 
在优选的实施方案中，本发明的融合蛋白可用于诊断、预测、预防和/或治疗与内分泌系统（参见例如下文“内分泌紊乱”部分）、神经系统（参见例如下文“神经学紊乱”部分）、免疫系统（参见例如下文“免疫活性”部分）、呼吸系统（参见例如下文“呼吸紊乱”部分）、心血管系统（参见例如下文“心血管紊乱”部分）、生殖系统（参见例如下文“生殖系统紊乱”部分）、消化系统（参见例如下文“胃肠紊乱”部分）的疾病和紊乱有关的疾病和/或紊乱、与细胞增殖有关的疾病和/或紊乱（参见例如下文“过度增殖性紊乱”部分）、和/或与血液有关的疾病或紊乱（参见例如下文“血液相关紊乱”部分）。 
在某些实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白可用于诊断和/或预测与其中与本发明融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的基因进行表达的组织有关的疾病和/或紊乱。 
因此，本发明的融合蛋白和编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、检测和/或治疗与包括但不限于激素原激活、神经递质活性、细胞信号、细胞增殖、细胞分化、和细胞迁移的活性有关的疾病和/或紊乱。 
更普遍的，本发明的融合蛋白和编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗与下列系统有关的疾病和/或紊乱。 
免疫活性
本发明的清蛋白融合蛋白和编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通过例如激活或抑制免疫细胞的增殖、分化、或活动性（趋化性）来治疗、预防、诊断和/或预测免疫系统的疾病、紊乱和/或状况。免疫细胞在称为造血作用的过程中发育，从多能干细胞产生骨髓（血小板、红细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞）和淋巴（B和T淋巴细胞）细胞。这些免疫疾病、紊乱和/或状况的病因可能是遗传的、体细胞的（诸如癌症和一些自身免疫病）、获得性的（例如由化疗或毒素获得）、或传染的。另外，本发明的融合蛋白和编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作特定免疫系统疾病或紊乱的标志物或检测物。 
在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗免疫系统的疾病和紊乱和/或抑制或增强由与其中 本发明多肽进行表达的组织有关的细胞产生的免疫应答。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预测免疫缺陷，包括先天性的和获得性的两种免疫缺陷。其中免疫球蛋白水平B细胞功能和/或B细胞数目降低的B细胞免疫缺陷的例子包括：X-连锁的无丙种球蛋白血症（布鲁顿氏病）、X-连锁的婴儿无丙种球蛋白血症、X-连锁的高IgM免疫缺陷、非X-连锁的高IgM免疫缺陷、X-连锁的淋巴细胞增殖综合症（XLP）、无丙种球蛋白血症包括先天性和获得性无丙种球蛋白血症、成人期发作的无丙种球蛋白血症、迟发性无丙种球蛋白血症、异常丙种球蛋白血症、低丙种球蛋白血症、未定性的低丙种球蛋白血症、隐性无丙种球蛋白血症（瑞士型）、选择性IgM缺陷、选择性IgA缺陷、选择性IgG亚类缺陷、IgG亚类缺陷（具有或没有IgA缺陷）、Ig缺陷同时IgM增多、IgG和IgA缺陷同时IgM增多、抗体缺陷同时Ig正常或升高、Ig重链缺失、κ链缺陷、B细胞淋巴细胞增殖紊乱（BLPD）、常见变异型免疫缺陷（CVID）、常见变异型免疫缺陷（CVI）（获得性）、和婴幼儿短暂性低丙种球蛋白血症。 
在具体的实施方案中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防、诊断和/或预测共济失调-毛细管扩张或与共济失调-毛细管扩张有关的状况。 
其中T细胞和/或B细胞功能和/或数目降低的先天性免疫缺陷的例子包括但不限于：迪格奥尔格异常、严重联合免疫缺陷（SCID）（包括但不限于X-连锁的SCID、常染色体隐性SCID、腺苷脱氨酶缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）缺陷、II类MHC缺陷（裸淋巴细胞综合症）、维-奥二氏综合症、共济失调毛细管扩张）、胸腺发育不全、第三和第四咽囊综合症、22q11.2缺失、慢性粘膜皮肤假丝酵母病、天然杀伤细胞缺陷（NK）、特发性CD4+T-淋巴细胞减少、显性T细胞缺陷（未定性）的免疫缺陷、和未定性的细胞介导免疫性的免疫缺陷。 
在具体的实施方案中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防、诊断和/或预测迪格奥尔格异常或与迪格奥尔格异常有关的状况。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预测的其它免疫缺陷包括但不限于慢性肉芽肿病、切- 希二氏综合症、髓过氧化物酶缺陷、白细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、X-连锁的淋巴细胞增殖综合症（XLP）、白细胞粘附缺陷、补体成分缺陷（包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和/或C9缺陷）、网状细胞发育不全、胸腺淋巴发育不全-不发育、伴有胸腺瘤的免疫缺陷、严重先天性白细胞减少、伴有免疫缺陷的发育异常、新生儿嗜中性白细胞减少、四肢短小性侏儒症、及内兹罗夫综合症-合并Ig免疫缺陷。 
在一个优选的实施方案中，用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防、诊断和/或预测与上述免疫缺陷有关的免疫缺陷和/或状况。 
在一个优选的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作在免疫缺陷个体中增强免疫响应性的药剂。在具体的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作在B细胞和/或T细胞免疫缺陷个体中增强免疫响应性的药剂。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预测自身免疫性紊乱。许多自身免疫性紊乱都是由于免疫细胞错误的将自身识别为外来物质。这种错误识别引起导致宿主组织遭到破坏的免疫应答。因此，施用能够抑制免疫应答特别是T细胞的增殖、分化、或趋化性的本发明融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可能是预防自身免疫性紊乱的有效治疗方法。 
可以用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防、诊断和/或预测的自身免疫性疾病和紊乱包括但不限于下述的一种或多种：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、溶血性贫血、血小板减少、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性新生儿血小板减少、特发性血小板减少性紫癜、紫癜（例如亨-许二氏紫癜）、自身免疫性血细胞减少、古德帕斯丘氏综合症、寻常天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯氏病（甲状腺机能亢进）、和胰岛素抗性糖尿病。 
可能具有自身免疫因素的可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防和/或诊断的其它紊乱包括但不限于II型胶原诱导的关节炎、抗磷脂综合症、皮炎、变应性脑脊髓炎、心肌炎、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、神经炎、葡萄膜炎眼炎、多内分泌病、莱 特氏病、僵人综合症、自身免疫性肺部炎症、孤独症、格-巴二氏综合症、胰岛素依赖性糖尿病、和自身免疫性炎性眼病。 
可能具有自身免疫因素的可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预测的其它紊乱包括但不限于具有抗胶原抗体的硬皮症（通常特征为例如核仁和其它核抗体）、混合性结缔组织疾病（通常特征为例如针对可提取核抗原（例如核蛋白）的抗体）、多肌炎（通常特征为例如非组蛋白ANA）、恶性贫血（通常特征为例如抗壁细胞、微粒体和内在因子抗体）、特发性阿狄森氏病（通常特征为例如体液和细胞介导的肾上腺细胞毒性）、不育症（通常特征为例如抗精子抗体）、肾小球肾炎（通常特征为例如肾小球基底膜抗体或免疫复合物）、大泡性类天疱疮（通常特征为例如基底膜中的IgG和补体）、斯耶格伦氏综合症（通常特征为例如多组织抗体、和/或特异性非组蛋白ANA（SS-B））、糖尿病（通常特征为例如细胞介导的和体液胰岛细胞抗体）、和肾上腺素能药物抗性（包括伴随哮喘或囊性纤维化病的肾上腺素能药物抗性）（通常特征为例如β-肾上腺素能受体抗体）。 
可能具有自身免疫因素的可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断和/或预测的其它紊乱包括但不限于慢性活动性肝炎（通常特征为例如平滑肌抗体）、原发性胆囊硬化（通常特征为例如线粒体抗体）、其它内分泌腺衰竭（在一些病例中通常特征为例如特定组织抗体）、白癜风（通常特征为例如黑色素细胞抗体）、脉管炎（通常特征为例如管壁中的Ig和补体和/或低血清补体）、后MI（通常特征为例如心肌抗体）、心脏切开术综合症（通常特征为例如心肌抗体）、荨麻疹（通常特征为例如针对IgE的IgG和IgM抗体）、遗传过敏性皮炎（通常特征为例如针对IgE的IgG和IgM抗体）、哮喘（通常特征为例如针对IgE的IgG和IgM抗体）、和许多其它炎性、肉芽肿性、退化性和萎缩性紊乱。 
在一个优选的实施方案中，使用例如本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防、诊断和/或预测与上述疾病和紊乱有关的自身免疫性疾病和紊乱和/或状况。在一个具体的优选实施方案中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防和/诊断类风湿性关节炎。 
在另一个具体的优选实施方案中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发 明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防和/诊断系统性红斑狼疮。在另一个具体的优选实施方案中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防和/诊断特发性血小板减少性紫癜。 
在另一个具体的优选实施方案中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防和/诊断IgA肾病。 
在一个优选的实施方案中，使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防、诊断和/或预测与上述疾病和紊乱有关的自身免疫性疾病和紊乱和/或状况。 
在优选的实施方案中，将本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作免疫抑制剂。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、预测和/或诊断造血细胞的疾病、紊乱和/或状况。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在治疗或预防与某些（或许多）类型造血细胞减少有关的那些疾病、紊乱和/或状况，包括但不限于白细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血和血小板减少的努力中，增强造血细胞包括多能干细胞的分化和增殖。或者，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在治疗或预防与某些（或许多）类型造血细胞增多有关的那些疾病、紊乱和/或状况，包括但不限于组织细胞增多的努力中，增强造血细胞包括多能干细胞的分化和增殖。 
还可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗、预防、诊断和/或预测变态反应和状况，诸如哮喘（特别是变应性哮喘）或其它呼吸道问题。另外，这些分子可用于治疗、预防、预测和/或诊断过敏性、对抗原性分子的超敏性、或血型不相容。 
此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断和/或预测IgE介导的变态反应。这样的变态反应包括但不限于哮喘、鼻炎、和湿疹。在具体的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在体外或在体内调节IgE浓度。 
另外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗炎性状况。例如，由于本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可抑制涉及炎性应答的细胞的激 活、增殖和/或分化，因而这些分子可用于预防和/或治疗慢性和急性炎性状况。这些炎性状况包括但不限于例如与感染有关的炎症（例如感染性休克、败血症、或全身炎症反应综合症）、局部缺血-再灌注损伤、内毒素致死性、补体介导的超急性排斥、肾炎、细胞因子或趋化因子诱导的肺部损伤、炎性肠病、克罗恩氏病、细胞因子（例如TNF或IL-1）过度生成、呼吸紊乱（例如哮喘和变态反应）；胃肠紊乱（例如炎性肠病）；癌症（例如胃、卵巢、肺、膀胱、肝、和乳房）；CNS紊乱（例如多发性硬化症；缺血性脑损伤和/或中风、外伤性脑损伤、神经退行性疾病（例如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病）；AIDS相关痴呆；和朊病毒病）；心血管紊乱（例如动脉粥样硬化、心肌炎、心血管病、和心肺旁路并发症）；以及以炎症为特征的许多其它疾病、状况和紊乱（例如肝炎、类风湿性关节炎、痛风、外伤、胰腺炎、结节病、皮炎、肾缺血-再灌注损伤、格雷夫斯氏病、系统性红斑狼疮、糖尿病、和同种异体移植排斥）。 
因为炎症是基础防御机制，所以炎性紊乱事实上能够影响机体的任何组织。因此，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗组织特异性炎性紊乱，包括但不限于肾上腺炎、肺泡炎(alveolitis)、胆管胆囊炎、阑尾炎、龟头炎、睑炎、支气管炎、粘液囊炎、心脏炎、蜂窝织炎、宫颈炎、胆囊炎、声带炎、耳蜗炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、皮炎、憩室炎、脑炎、心内膜炎、食道炎、咽鼓管炎、纤维组织炎、毛囊炎、胃炎、胃肠炎、龈炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉炎、淋巴管炎、乳腺炎、中耳炎、脑膜炎、子宫炎、粘膜炎、心肌炎、肌炎、鼓膜炎、肾炎、神经炎、睾丸炎、骨软骨炎、耳炎、心包炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽炎、静脉炎、脊髓灰质炎、前列腺炎、牙髓炎、视网膜炎、鼻炎、输卵管炎、巩膜炎、巩膜脉络膜炎、阴囊炎、窦炎、脊椎炎、脂肪组织炎、口腔炎、关节膜炎、咽鼓管炎、腱炎、扁桃体炎、尿道炎、和阴道炎。 
在具体的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗器官移植排斥和移植物抗宿主病。器官排斥通过宿主免疫细胞经免疫反应破坏移植组织而发生。类似的，GVHD也涉及免疫反应，但在此情况下，外来的移植免疫细胞破坏宿主组织。抑制免疫反应，特别是T细胞的激活、增殖、分化或趋化性的本发明多肽、抗体或多核苷酸和/或其激动剂或拮抗剂可能是预防器官排斥或GVHD的有效治 疗方法。在具体的实施方案中，抑制免疫反应，特别是T细胞的激活、增殖、分化或趋化性的本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可能是预防试验性变应性和超急性异种移植物排斥的有效治疗方法。 
在其它实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗免疫复合物疾病，包括但不限于血清病、链球菌感染后肾小球肾炎、节结性多动脉炎、和免疫复合物诱导的脉管炎。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、检测和/或预防传染因子。例如，通过增强免疫反应，特别是增强B和/或T细胞的增殖、激活和/或分化，可以治疗、检测和/或预防传染病。免疫反应可通过增强现有的免疫反应或通过启动新的免疫反应而增强。或者，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可直接抑制传染因子（参考申请书中列出传染因子的部分等），而无需引发免疫反应。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为疫苗佐剂用于增强针对抗原的免疫响应性。在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为佐剂用于增强肿瘤特异性免疫反应。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为佐剂用于增强抗病毒免疫反应。可使用本发明的组合物作为佐剂而增强的抗病毒免疫反应包括本文描述的或本领域其它途径知道的病毒和病毒相关疾病或症状。在具体的实施方案中，本发明的组合物作为佐剂用于增强针对选自下组的病毒、疾病或症状的免疫反应：AIDS、脑膜炎、登革热、EBV、和肝炎（例如乙肝）。在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物作为佐剂用于增强针对选自下组的病毒、疾病或症状的免疫反应：HIV/AIDS、呼吸道合胞病毒、登革热病毒、轮状病毒、B型日本脑炎、A和B型流感、副流感、麻疹、细胞巨化病毒、狂犬病、胡宁病毒、基孔肯雅病、立夫特山谷热、单纯疱疹、和黄热病。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为佐剂用于增强抗细菌或抗真菌免疫反应。可用本发明的组合物作为佐剂而增强的抗细菌或抗真菌免疫反应包括本文描述的或本领域其它途径知道的细菌或真菌或细菌及真菌细菌或真菌相关疾 病或症状。在具体的实施方案中，本发明的组合物作为佐剂用于增强针对选自下组的细菌或真菌、疾病或症状的免疫反应：破伤风、白喉、肉毒中毒、和B型脑膜炎。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物作为佐剂用于增强针对选自下组的细菌或真菌、疾病或症状的免疫反应：霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）、副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi）、脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、B组链球菌、志贺氏菌（Shigella spp.）、产肠毒素的埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）、肠出血性大肠杆菌、和布氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为佐剂用于增强抗寄生虫免疫反应。可用本发明的组合物作为佐剂而增强的抗寄生虫免疫反应包括本文描述的或本领域其它途径知道的寄生虫和寄生虫相关疾病或症状。在具体的实施方案中，本发明的组合物作为佐剂用于增强针对寄生虫的免疫反应。在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物作为佐剂用于增强针对疟原虫（疟疾）或利什曼虫的免疫反应。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于治疗传染病，包括硅肺病、结节病、和特发性肺纤维化，例如通过阻止单核吞噬细胞的募集和激活。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明的清蛋白融合蛋白的多核苷酸作为抗原用于生成抗体，以抑制或增强针对本发明多肽的免疫介导反应。 
在一个实施方案中，将本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸施用于动物（例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪、鸡、骆驼、山羊、马、牛、绵羊、犬、猫、非人灵长类、和人，最优选人）以增强免疫系统产生更多数量的一种或多种抗体（例如IgG、IgA、IgM和IgE），诱导产生更高亲和力的抗体和免疫球蛋白类型转换（例如IgG、IgA、IgM和IgE），和/或增强免疫反应。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作针对病原体的B细胞响应性的刺激物。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作T细胞的激活物。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作在个体接受免疫抑制治疗前提升其免疫状况的药剂。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作诱导更高亲和力抗体的药剂。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作提高血清免疫球蛋白浓度的药剂。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作加快免疫受损个体恢复的药剂。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作增强老年群体和/或新生儿免疫反应的药剂。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作骨髓移植和/或其它移植（例如同种异体或异种器官移植）之前、期间、或之后的免疫系统增强剂。对于移植，本发明的组合物可以在移植之前、同时、和/或之后施用。在一个具体的实施方案中，本发明的组合物在移植后、T细胞群体开始恢复前施用。在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物首先在移植后T细胞群体开始恢复后，但在B细胞群体完全恢复前施用。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在具有获得性B细胞功能丧失的个体中用作增强免疫响应性的药剂。导致可通过施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸而改善或治疗的获得性B细胞功能丧失的状况包括但不限于HIV感染、AIDS、骨髓移植、和B细胞慢性淋巴细胞性白血病（CLL）。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在具有暂时性免疫缺陷的个体中用作增强免疫响应性的药剂。导致可通过施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸而改善或治疗的暂时性免疫缺陷的状况包括但不限于从病毒感染（例如流感）恢复、与营养不良有关的状况、从传染性单核细胞增 多恢复、与压力有关的状况、从麻疹恢复、从输血恢复、及从手术恢复。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作单核细胞、树突细胞、和/或B细胞抗原呈递的调节剂。在一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在体外或在体内增强抗原呈递或拮抗抗原呈递。另外，在相关实施方案中，此抗原呈递的增强或拮抗可用作抗肿瘤治疗或用于调节免疫系统。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作引导个体免疫系统向体液反应（即TH2）而非TH1细胞反应发展的药剂。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作诱导肿瘤增殖的手段，从而使之更易受抗赘生药的影响。例如，多发性骨髓瘤是缓慢分裂的疾病，因此事实上所有抗赘生治疗方案都难以控制。如果迫使这些细胞更快增殖，那么它们的易感谱很可能改变。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作诸如AIDS、慢性淋巴细胞紊乱和/或常见变异型免疫缺陷等病理中B细胞生成的刺激剂。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作手术、外伤或遗传缺陷后淋巴组织产生和/或再生的治疗方法。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于移植前骨髓样品的预处理。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作导致诸如SCID患者中所观察到的免疫无能/免疫缺陷的先天遗传性紊乱的基于基因的治疗方法。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作激活单核细胞/巨噬细胞抵御影响单核细胞的寄生虫病诸如利什曼原虫的手段。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作调节由本发明多肽引发的分泌性细胞因子的手段。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于本文描述的一种或多种应用，正如它们可用于兽用。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作阻断针对外来因子或自身的免疫反应不同方面的手段。可能希望阻断其中的免疫反应某些方面的疾病或状况的例子包括自身免疫性紊乱诸如狼疮、和关节炎、以及对皮肤变态反应的免疫响应性、炎症、肠病、损伤和与病原体有关的疾病/紊乱。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作阻止与自身免疫病诸如特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮和多发性硬化症有关的B细胞增殖和Ig分泌的治疗方法。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的多肽、抗体、多核苷酸和/或激动剂或拮抗剂用作内皮细胞中B和/或T细胞迁移的抑制剂。此活性破坏组织架构或同类反应，且可用于例如破坏免疫反应，和阻止败血症。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作诸如未定性单克隆丙种球蛋白病（MGUS）、瓦尔登斯特伦氏病、相关特发性单克隆丙种球蛋白病、和浆细胞瘤等疾病中明显的慢性高丙种球蛋白血症的治疗方法。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于例如在某些自身免疫性和慢性炎性和传染性疾病中抑制多肽趋化性和巨噬细胞及其前体、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B淋巴细胞和一些T细胞子集如活化的和CD8细胞毒性T细胞和天然杀伤细胞的激活。本文描述了自身免疫病的例子，包括多发性硬化症和胰岛素依赖性糖尿病。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可以通过例如阻止嗜曙红粒细胞的生成和迁移来治疗特发性高嗜曙红粒细胞综合症。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于增强或抑制补体介导的细胞溶解。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明 清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于增强或抑制抗体依赖性细胞毒性。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于治疗动脉粥样硬化，例如通过阻止动脉壁中的单核细胞渗透。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗成人呼吸窘迫综合症（ARDS）。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于刺激伤口和组织修复、刺激血管发生、和/或刺激血管或淋巴管疾病或紊乱的修复。此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于刺激粘膜表面的再生。 
在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于诊断、预测、治疗和/或预防特征为原发性或获得性免疫缺陷、血清免疫球蛋白生成不足、复发性感染、和/或免疫系统功能障碍的紊乱。另外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防关节、骨、皮肤、和/或腮腺的感染、血媒感染（例如败血症、脑膜炎、脓毒性关节炎、和/或骨髓炎）、自身免疫病（例如本文所公开的）、炎性紊乱、和恶性肿瘤、和/或与这些感染、疾病、紊乱和/或恶性肿瘤有关的任何疾病或紊乱或状况，包括但不限于CVID、其它原发性免疫缺陷、HIV病、CLL、复发性支气管炎、窦炎、中耳炎、结膜炎、肺炎、肝炎、脑膜炎、带状疱疹（例如严重带状疱疹）、和/或卡氏肺囊虫（Pneumocystis carnii）。可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸预防、诊断、预测和/或治疗的其它疾病和紊乱包括但不限于HIV感染、HTLV-BLV感染、淋巴细胞减少、吞噬细胞杀菌功能障碍性贫血、血小板减少、和血红蛋白尿。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗和/或诊断具有常见变异型免疫缺陷病（“CVID”；也称为“获得性无丙种球蛋白血症”和“获得性低丙种球蛋白血症”）或此疾病的亚类的个体。 
在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗癌症或赘生物，包括免疫细胞或免疫组织相关癌症或赘生物。可用本发明的融合蛋白和/或编 码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸预防、诊断或治疗的癌症或赘生物的例子包括但不限于急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞性贫血（ALL）、慢性淋巴细胞性白血病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、伯基特氏淋巴瘤、EBV转化的疾病、和/或本文其它地方标题为“过度增殖性紊乱”部分描述的疾病和紊乱。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作降低大型B细胞淋巴瘤细胞增殖的治疗方法。 
在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用作减少与慢性骨髓性白血病有关的B细胞和Ig的牵连的手段。 
在具体的实施方案中，本发明的组合物用作在B细胞免疫缺陷个体诸如例如接受了部分或全部脾切除的个体中增强免疫响应性的药剂。 
血液相关紊乱
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于调节止血（停止出血）或溶栓（凝块溶解）活性。例如，通过增强止血或溶栓活性，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防血液凝结疾病、紊乱和/或状况（例如纤维蛋白原缺乏血症、因子缺乏、血友病）、血小板疾病、紊乱和/或状况（例如血小板减少）、或源于外伤、手术或其它原因的损伤。或者，能够降低止血或溶栓活性的本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制或溶解凝块。这些分子可在心脏病发作（梗死）、中风、或结疤的治疗或预防中起重要作用。 
在具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、诊断、预测和/或治疗血栓形成、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血栓栓塞、肺部栓塞、动脉粥样硬化、心肌梗死、短暂性脑缺血发作、不稳定性心绞痛。在具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防隐静脉移植物闭塞(occulsion of saphenous grafts)、降低可能与血管成形术伴随的围手术期血栓形成风险、降低心房纤维颤动包括非风湿性心房纤维颤动患者的中风风险、降低与人工心脏瓣膜和/或二尖瓣疾病有关的栓塞风险。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的其它用途包括 但不限于预防身体外装置（例如血管内套管、血液透析患者中的血管通路分流装置、血液透析装置、和心肺旁路装置）中的阻塞。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、诊断、预测和/或治疗与其中本发明多肽进行表达的组织有关的血液和/或血液形成器官的疾病和紊乱。 
本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于调节造血活性（血细胞的形成）。例如，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加所有血细胞或血细胞子集诸如例如红细胞、淋巴细胞（B或T细胞）、骨髓细胞（例如嗜碱性细胞、嗜曙红细胞、嗜中性细胞、肥大细胞、巨噬细胞）和血小板的数量。增加血细胞或血细胞子集数量的能力可用于预防、检测、诊断和/或治疗下文描述的贫血和白细胞减少。或者，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于减少所有血细胞或血细胞子集诸如例如红细胞、淋巴细胞（B或T细胞）、骨髓细胞（例如嗜碱性细胞、嗜曙红细胞、嗜中性细胞、肥大细胞、巨噬细胞）和血小板的数量。降低血细胞或血细胞子集数量的能力可用于预防、检测、诊断和/或治疗白细胞增多诸如例如嗜曙红细胞增多。 
本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、治疗或诊断血液恶液质。 
贫血是红细胞数目或其中的血红蛋白（携带氧的蛋白质）数量低于正常水平的状况。贫血可能由过度出血、红细胞生成减少、或红细胞破坏（溶血）增加而引起。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/诊断贫血。可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防或诊断的贫血包括缺铁性贫血、低血色素性贫血、小红细胞性贫血、缺绿症(chlorosis)、遗传铁粒幼红细胞性贫血、特发性获得性铁粒幼细胞贫血、红细胞发育不全、巨红细胞性贫血（例如恶性贫血、（维生素B12缺乏）和叶酸缺乏性贫血）、再生障碍性贫血、溶血性贫血（例如自身免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、和阵发性夜间血红蛋白尿）。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断与下列疾病有关的贫血，所述疾病包括但不限于与系统性红斑狼疮、癌症、淋巴瘤、慢性肾病、和脾增大有关的贫血。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白 的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断由药物治疗引起的贫血，诸如与甲基多巴、氨苯砜、和/或磺胺药有关的贫血。此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断与异常红细胞架构有关的贫血，包括但不限于遗传性球形细胞增多、遗传性椭圆形红细胞增多、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、和镰状细胞贫血。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断血红蛋白异常（例如与镰状细胞贫血、血红蛋白C病、血红蛋白S-C病、和血红蛋白E病有关的）。此外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗珠蛋白生成障碍性贫血（地中海贫血），包括但不限于重型和轻型α-地中海贫血和β-地中海贫血。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗出血性紊乱，包括但不限于血小板减少（例如特发性血小板减少性紫癜、和血栓性血小板减少性紫瘢）、冯维勒布兰德氏病、遗传性血小板紊乱（例如储存池病，诸如切-希二氏综合症和赫-普二氏综合症、血栓烷A2功能障碍、血小板无力、和伯-苏二氏综合症）、溶血性尿毒症综合症、血友病诸如血友病A或因子VII缺乏以及基氏病（血友病B）或因子IX缺乏、遗传性出血性毛细管扩张、也称为朗-奥-韦三氏综合症、变应性紫癜（亨-许二氏紫癜）和散布性血管内凝结。 
可以使用本领域已知的任何凝血测试法来监测本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸对血液凝结时间的影响，包括但不限于全血部分促凝血酶原激酶时间（PTT）、活化部分促凝血酶原激酶时间（aPTT）、活化凝血时间（ACT）、复钙化活化凝血时间、或李-怀二氏凝血时间。 
几种疾病和多种药物能够引起血小板功能障碍。因此，在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗获得性血小板功能障碍，诸如伴随肾衰竭、白血病、多发性骨髓瘤、肝硬化、和系统性红斑狼疮的血小板功能障碍以及与药物治疗有关的血小板功能障碍，包括用高剂量的阿斯匹林、噻氯匹定、非固醇类抗炎药（用于关节炎、疼痛、和扭伤）、和青霉素进行的治疗。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白 融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗特征为白细胞数目增加或减少或与之有关的疾病和紊乱。当白细胞数目减少至低于正常水平时发生白细胞减少症。白细胞减少包括但不限于嗜中性白细胞减少和淋巴细胞减少。白细胞数目相对于正常水平的增加称为白细胞增多。机体在感染期间产生数目增多的白细胞。因此，白细胞增多可能仅仅是反映感染的正常生理学参数。或者，白细胞增多可能是损伤或其它疾病诸如癌症的指标。白细胞增多症包括但不限于嗜曙红细胞增多症和巨噬细胞积累。在具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗白细胞减少。在其它具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗白细胞增多。 
白细胞减少可以是所有类型白细胞的普遍减少，或者可以是特定类型白细胞的特异损耗。因此，在具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗称为嗜中性白细胞减少的嗜中性粒细胞数目减少。可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防和/或治疗的嗜中性白细胞减少包括但不限于婴幼儿遗传性粒细胞缺乏、家族性嗜中性白细胞减少、周期性嗜中性白细胞减少、源于饮食缺乏（例如维生素B12缺乏或叶酸缺乏）或与之有关的嗜中性白细胞减少、源于药物治疗（例如抗生素治疗方案，诸如青霉素治疗、磺胺药物治疗、抗凝血剂治疗、抗惊厥药物、抗甲状腺药物和癌症化疗）或与之有关的嗜中性白细胞减少、和源于嗜中性粒细胞破坏增加的嗜中性白细胞减少症，嗜中性粒细胞破坏增加可能与一些细菌或病毒感染、变应性紊乱、自身免疫病、脾肿大（例如费尔蒂综合症、疟疾和结节病）个体的状况、和一些药物治疗方案有关。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗淋巴细胞减少（B和/或T淋巴细胞数目减少），包括但不限于源于压力、药物治疗（例如皮质类固醇药物治疗、癌症化疗、和/或放疗）、AIDS感染和/或其它疾病诸如例如癌症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性感染、一些病毒感染和/或遗传性紊乱（例如迪格奥尔格综合症、威-奥二氏综合症、严重合并性免疫缺陷、共济失调毛细管扩张）的或与之有关的淋巴细胞减少。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗与巨噬细胞数目和/或巨噬细胞功能有关的疾病和紊乱，包括但不限于高歇氏病、尼-皮二氏病、莱-西二氏病、和汉-许-克三氏病。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗与嗜曙红粒细胞数目和/嗜曙红粒细胞功能有关的疾病和紊乱，包括但不限于特发性嗜曙红粒细胞增多综合症（idiopathic hypereosinophilic syndrome）、嗜曙红粒细胞-肌痛综合症、和汉-许-克三氏病。 
在又一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗白血病和淋巴瘤，包括但不限于急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病（ALL）、急性髓细胞样（髓细胞性、骨髓性、成髓细胞性、或骨髓单核细胞性）白血病、慢性淋巴细胞性白血病（例如B细胞白血病、T细胞白血病、塞扎里综合症、及毛细胞性白血病）、慢性髓细胞性（髓细胞样、骨髓性、或粒细胞性）白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、和蕈样肉芽肿。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防和/或治疗浆细胞的疾病和紊乱，包括但不限于浆细胞恶液质、单克隆丙种球蛋白病、未定性的单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、冷球蛋白血症、和雷诺氏现象。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防和/或诊断骨髓增殖性紊乱，包括但不限于真性红细胞增多、相对红细胞增多、继发性红细胞增多、骨髓纤维化、急性骨髓纤维化、原因不明的骨髓化生、血小板增多（包括原发性和继发性血小板增多）和慢性髓细胞性白血病。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于手术前的处理以增加血细胞生成。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作增强嗜中性粒细胞、嗜曙红粒细胞和巨噬细胞的迁移、吞噬作用、超氧化物生成、抗体依赖性细胞毒性的药剂。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作干细胞提取前增加循环中干细胞数目的药剂。在另一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作血小板提取前增加循环中干细胞数目的药剂。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作增加细胞因子生成的药剂。 
在其它实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防、诊断和/或治疗原发性造血紊乱。 
过度增殖性紊乱 
在某些实施方案中，本发明的融合蛋白和/或本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测过度增殖性紊乱，包括赘生物。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可通过直接或间接相互作用而抑制紊乱的扩散(proliferation)。或者，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可使能抑制过度增殖性紊乱的其它细胞增殖。 
例如，可通过提高免疫应答，特别是提高过度增殖性紊乱的抗原质量，或者通过使T细胞增殖、分化、或动员，来治疗过度增殖性紊乱。或是通过增强现有的免疫应答，或是通过发动新的免疫应答，可提高这种免疫应答。或者，降低免疫应答也可是治疗过度增殖性紊乱的方法，诸如化疗剂。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的过度增殖性紊乱的实例包括但不限于位于下列部位的赘生物：结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺（肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺）、眼、头和颈、神经（中枢和周围）、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸腔、和泌尿生殖道。 
类似的，其它过度增殖性紊乱也可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗或检测。这些过度增殖性紊乱的实例包括但不限于：急性儿童期成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、肾上腺皮质癌、成人（原发性）肝细胞癌、成人（原发性）肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓细胞样白血病、成人霍奇金氏病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、AIDS相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、 骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统（原发性）淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童期（原发性）肝细胞癌、儿童期（原发性）肝癌、儿童期急性成淋巴细胞性白血病、儿童期急性髓细胞样白血病、儿童期脑干神经胶质瘤、儿童期小脑星形细胞瘤、儿童期大脑星形细胞瘤、儿童期颅外生殖细胞瘤、儿童期霍奇金氏病、儿童期霍奇金氏淋巴瘤、儿童期下丘脑和视路神经胶质瘤、儿童期成淋巴细胞白血病、儿童期成神经管细胞瘤、儿童期非霍奇金氏淋巴瘤、儿童期松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童期原发性肝癌、儿童期横纹肌肉瘤、儿童期软组织肉瘤、儿童期视路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室鼓膜瘤、上皮癌、食管癌、尤文氏肉瘤及相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠瘤、生殖细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞性白血病、头和颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞性胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增殖性紊乱、巨球蛋白血症、女性乳癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐蔽性原发性鳞状细胞颈癌、转移性原发性鳞状细胞颈癌、转移性鳞状细胞颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、骨髓增生异常综合症、髓细胞性白血病、髓细胞样白血病、骨髓增殖性紊乱、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、妊娠期非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐蔽性原发性转移性鳞状细胞颈癌、口咽癌、骨-/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低级恶性潜在肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、紫癜、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞扎里综合症、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、过渡型肾盂和输尿管癌、滋养层瘤、输尿管和肾 盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、维尔姆斯氏肿瘤、以及位于上文所列器官系统中除赘生物之外的任何其它过度增殖性疾病。 
在另一个优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于诊断、预测、预防、和/或治疗恶化前状况，以及用于预防发展成赘生物或恶性状态，包括但不限于上文描述的那些紊乱。这些用途是已知或怀疑发生了前述向赘生物或癌的发展的状况所需要的(indicated)，特别是由非赘生性细胞生长构成的增生、化生，或最特别的是发育异常（关于这些异常生长状况的综述可参阅Robbins和Angell，1976，《Basic Pathology》，第2版，W.B.Saunders公司，Philadelphia，pp.68-79）。 
增生是受控细胞增殖的一种形式，牵涉组织或器官中细胞数目的增加，但结构或功能没有重大改变。可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防、和/或治疗的增生性紊乱包括但不限于血管滤泡纵隔淋巴结增生、伴有嗜曙红细胞增多的血管淋巴增生、非典型性黑素细胞增生、基底细胞增生、良性大淋巴结增生、牙骨质增生、先天性肾上腺增生、先天性皮脂腺增生、囊性增生、乳房的囊性增生、义齿性增生、导管增生、子宫内膜增生、纤维肌性增生、局灶性上皮增生、牙龈增生、炎性纤维增生、炎性乳头状增生、血管内乳头状内皮增生、前列腺的节结性增生、节结性再生性增生、假上皮瘤性增生、老年皮脂腺增生、和疣状增生。 
化生是受控细胞生长的一种形式，其中一类成熟的或完全分化的细胞替代另一类成熟的细胞。可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防、和/或治疗的化生性紊乱包括但不限于特发性髓样化生、顶泌化生、非典型性化生、自身实质化生(autoparenchymatous metaplasia)、结缔组织化生、上皮化生、肠化生、化生性贫血、化生性骨化、化生性息肉、髓样化生、原发性髓样化生、继发性髓样化生、鳞状细胞化生、羊膜的鳞状细胞化生、和有症状的髓样化生。 
发育异常常常是癌的预兆，且主要在上皮中发现；它是非赘生性细胞生长的大多数紊乱形式，牵涉细胞个体一致性和细胞构造取向的丧失。发育异常细胞常常具有异常大型的、浓重染色的核，且表现出复型现象。发育异常特征性的发生在存在慢性刺激(irritation)或炎症的情况中。可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防、和/或 治疗的发育异常性紊乱包括但不限于无汗性外胚层发育异常、anterofacial dysplasia、窒息性胸廓发育异常、心房手指发育异常、支气管肺发育异常、脑发育异常、宫颈发育异常、软骨外胚层发育异常、锁骨颅骨发育异常、先天性外胚层发育异常、颅骨干发育异常、颅腕跗发育异常、颅干骺端发育异常、牙本质发育异常、骨干发育异常、外胚层发育异常、牙釉质发育异常、脑性眼球发育异常、偏侧骨骺发育异常、多发性骨骺发育异常、点状骨骺发育异常、上皮发育异常、面指（趾）生殖器发育异常、颌（颚）的家族性纤维发育异常、家族性白色皱折发育异常、纤维肌性发育异常、骨的纤维发育异常、旺盛骨性发育异常、遗传性肾视网膜发育异常、有汗性外胚层发育异常、少汗性外胚层发育异常、淋巴细胞减少性胸腺发育异常、乳腺发育异常、下颌颜面发育异常、干骺端发育异常、蒙迪尼发育异常、单骨性纤维发育异常、粘膜上皮发育异常、多发性骨骺发育异常、眼耳椎骨发育异常、眼椎骨发育异常、牙源性发育异常、眼下颌支发育异常、尖周牙本质发育异常、多骨纤维发育异常、假性软骨形成脊柱骨骺发育异常(pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育异常、隔眼发育异常、脊柱骨骺发育异常、和脑室桡骨发育异常。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防、和/或治疗的其它赘生前紊乱包括但不限于良性异常增殖性紊乱（如良性肿瘤、纤维囊性状况、组织肥大、肠息肉、结肠息肉、和食道发育异常)、粘膜白斑病、角化病、博温氏病、农民皮肤、日光性唇炎、和日光性角化病。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断和/或预测与本发明多肽在其中表达的组织有关的紊乱。 
在另一个实施方案中，如本文所述与毒素或放射性同位素缀合的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗癌和赘生物，包括但不限于本文所描述的。在又一个优选的实施方案中，如本文所述与毒素或放射性同位素缀合的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗急性骨髓性白血病。 
另外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可影响凋亡，因此可用于治疗与细胞存活增强或凋亡抑制有关的许多疾病。例 如，可用本发明的多核苷酸、多肽、和/或激动剂或拮抗剂诊断、预测、预防、和/或治疗的与细胞存活增强或凋亡抑制有关的疾病包括癌（诸如滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、和激素依赖性肿瘤，包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、成神经胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳癌、前列腺癌、卡波西氏肉瘤、和卵巢癌）、自身免疫性紊乱（诸如多发性硬化症、斯耶格伦氏综合症、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球肾炎和类风湿性关节炎）和病毒感染（诸如疱疹病毒、痘病毒、和腺病毒）、炎症、移植物抗宿主病、急性移植排除、和慢性移植排斥。 
在优选的实施方案中，将本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于抑制癌的生长、发展、和/或转移，特别是上文所列举的。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防、和/或治疗的与细胞存活增强有关的其它疾病或状况包括但不限于恶性肿瘤和相关紊乱的发展和/或转移，诸如白血病（包括急性白血病（如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病（包括成髓细胞、前髓细胞（早幼粒细胞）、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病））和慢性白血病（如慢性髓细胞性（粒细胞性）白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多、淋巴瘤（如霍奇金氏病和非霍奇金氏病）、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、和成视网膜细胞瘤。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊 断、预测、预防、和/或治疗的与凋亡增强有关的疾病包括AIDS；神经变性紊乱（诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性和脑瘤或前述相关疾病）；自身免疫性紊乱（诸如多发性硬化症、斯耶格伦氏综合症、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球肾炎和类风湿性关节炎）；骨髓发育异常综合症（诸如再生障碍性贫血）、移植物抗宿主病、缺血性损伤（诸如由心肌梗死、中风、和再灌注损伤引起的）、肝损伤（如肝炎相关肝损伤、缺血性/再灌注损伤、胆汁淤积（胆管损伤）和肝癌）；毒素诱导的肝病（诸如由酒精引起的）、感染性休克、恶病体质和食欲缺乏。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、预测、预防、和/或治疗的过度增殖性疾病和/或紊乱包括但不限于位于下列部位的赘生物：肝、腹部、骨、乳房、消化系统、胰、腹膜、内分泌腺（肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺）、眼、头和颈、神经系统（中枢和周围）、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸腔、和泌尿生殖道。 
类似的，其它过度增殖性紊乱也可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来诊断、预测、预防、和/或治疗。这些过度增殖性紊乱的实例包括但不限于：高丙种球蛋白血症、淋巴增殖性紊乱、副蛋白血症、紫癜、结节病、塞扎里氏综合症、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、高歇氏病、组织细胞增多、以及位于上文所列器官系统中除赘生物之外的任何其它过度增殖性疾病。 
另一个优选的实施方案利用编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来抑制异常细胞分裂，它通过使用本发明的基因疗法和/或蛋白质融合物或其片段。 
由此，通过将编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸插入异常增殖的细胞，其中所述多核苷酸压制所述表达，本发明提供了用于治疗细胞增殖性紊乱的方法。 
本发明的另一个实施方案提供了用于在个体中治疗细胞增殖性紊乱的方法，包括对异常增殖的细胞施用一个或多个本发明的活性基因拷贝。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸是包含重组表达载体的DNA构建物，该重组表达载体有效表达编码所述多核苷酸的DNA序列。在本发明的另一个优选实施方案中，利用逆转录病毒或更优选的腺病毒载体将编码本发 明融合蛋白的DNA构建物插入待治疗的细胞（参阅G.J.Nabel等人，PNAS，1999，96：324-326，将其引入本文作为参考）。在一个最优选的实施方案中，病毒载体是缺陷型的，且不会转化非增殖细胞，只转化增殖细胞。此外，在一个优选的实施方案中，将本发明的多核苷酸或是单独或是联合或融合其它多核苷酸插入增殖细胞，然后可经由作用于所述多核苷酸上游的启动子以诱导所编码蛋白质产物表达的外部刺激（即磁性、特定小分子、化学制品、或药物施用等）进行调控。如此，可根据所述外部刺激明确调控本发明的有益治疗效果（即提高、降低、或抑制本发明的表达）。 
本发明的多核苷酸可用于压制致癌基因或抗原的表达。“压制致癌基因的表达”意指遏制基因转录、降解基因转录物（前信使RNA）、抑制剪接、破坏信使RNA、阻止蛋白质翻译后加工、破坏蛋白质、或抑制蛋白质正常功能。 
对于局部施用于异常增殖细胞，可通过本领域技术人员知道的任何方法来施用本发明的多核苷酸，包括但不限于细胞的转染、电穿孔、显微注射、或在诸如脂质体等媒介中、脂转染、或作为裸露的多核苷酸、或说明书全文描述的任何其它方法。可通过已知的基因投递系统来投递本发明的多核苷酸，诸如但不限于逆转录病毒（Gilboa,J.，Virology，44：845，1982；Hocke，Nature，320：275，1986；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：3014）、牛痘病毒系统（Chakrabarty等人，Mol.Cell Biol.，5：3403，1985）或本领域技术人员知道的其它高效DNA投递系统（Yates等人，Nature，313：812，1985）。这些参考文献只是例示性的，且引入本文作为参考。为了特异投递或转染异常增殖的细胞而避免不分裂的细胞，优选采用本领域技术人员知道的逆转录病毒或腺病毒（正如本领域和本文别处所描述的）投递系统。由于逆转录病毒DNA的整合需要宿主DNA复制，且逆转录病毒因缺乏其生活周期所需要的逆转录病毒基因而不能自我复制，因此为本发明的多核苷酸采用这种逆转录病毒投递系统将使所述基因和构建物靶向异常增殖的细胞，且避免不分裂的正常细胞。 
通过使用用于指导注射针恰好到达疾病部位的成像装置，可将本发明的多核苷酸直接投递至内脏、体腔等等中的细胞增殖性紊乱/疾病部位。本发明的多核苷酸还可在手术干预时施用至疾病部位。 
“细胞增殖性疾病”意指侵袭任何一种器官、腔、或身体部分或其任意 组合，特征为细胞、细胞群、或组织的单一或多重局部异常增殖（无论是良性的或是恶性的）的任何人或动物疾病或紊乱。 
可施用任何数量的本发明多核苷酸，只要它对所治疗细胞的增殖具有生物学抑制效果。此外，有可能将超过一种本发明多核苷酸同时施用至相同部位。“生物学抑制”意指部分的或完全的生长抑制，以及细胞增殖或生长速率的降低。生物学抑制剂量可通过评估本发明多核苷酸对组织培养中目标恶性或异常细胞生长、动物中肿瘤生长、和细胞培养的效果，或者本领域普通技术人员知道的任何其它方法来确定。 
此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制增殖细胞或组织的血管发生，或是单独作为蛋白质融合物，或是直接或间接联合其它多肽，正如本文别处所描述的。在一个最优选的实施方案中，所述抗血管发生效果可间接通过例如抑制造血的、肿瘤特异细胞诸如肿瘤相关巨噬细胞来实现（参阅Joseph,I.B.等人，J.Natl.Cancer Inst.，90(21)：1648-53，1998，将其引入本文作为参考）。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通过诱导凋亡来抑制增殖性细胞或组织。这些融合蛋白和/或多核苷酸可或直接或间接的作用于诱导增殖性细胞和组织的凋亡，例如在死亡域受体的激活在，诸如肿瘤坏死因子（TNF）受体-1、CD95（Fas/APO-1）、TNF受体相关凋亡介导的蛋白质（TRAMP）、及TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）受体-1和-2（参阅Schulze-Osthoff，K.等人，Eur.J.Biochem.，254(3)：439-59，1998，将其引入本文作为参考）。此外，在另一个优选的实施方案中，这些融合蛋白和/或多核苷酸可通过其它机制来诱导凋亡，诸如在激活凋亡的其它蛋白质的激活中，或者通过刺激这些蛋白质的表达，或是单独的或是联合小分子药物或佐剂，诸如apoptonin、半乳凝集素、硫氧还蛋白、抗炎蛋白（参阅例如Mutat.Res.，400(1-2)：447-55，1998；Med.Hypotheses，50(5)：423-33，1998；Chem.Biol.Interact.，4月24日，111-112：23-34，1998；J.Mol.Med.，76(6)：402-12，1998；Int.J.Tissue React.，20(1)：3-15，1998，将其都引入本文作为参考）。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制增殖性细胞或组织的转移。抑制可作为施用这些清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的直接结果而发生，或者间接的，诸如激活已知抑制转移的蛋 白质的表达，例如α4整联蛋白（参阅例如Curr.Top.Microbiol.Immunol.，231：125-41，1998，将其引入本文作为参考）。本发明的这种治疗效果可或单独或联合小分子药物或佐剂来实现。 
在另一个实施方案中，本发明提供了将含有本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的组合物投递至表达本发明清蛋白融合蛋白所结合的、其结合或缔合的多肽的靶细胞的方法。本发明的清蛋白融合蛋白可经由疏水性、亲水性、离子、和/或共价相互作用与异源多肽、异源核酸、毒素、或前体药物缔合。 
本发明的清蛋白融合蛋白可用于增强增殖细胞或组织的免疫原性和/或抗原性，或是直接的，诸如如果本发明的清蛋白融合蛋白的“种痘”引起针对增殖性抗原和免疫原时将发生的，或是间接的，诸如在激活已知增强针对所述抗原和免疫原的免疫应答的蛋白质（如趋化因子）的表达中。 
肾紊乱 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断、和/或预测肾系统的紊乱。可用本发明的组合物诊断、预测、预防、和/或治疗的肾紊乱包括但不限于肾衰竭、肾炎、肾的血管紊乱、代谢的和先天性肾紊乱、肾的泌尿紊乱、自身免疫性紊乱、硬化和坏死、电解质失衡、和肾癌。 
可用本发明的组合物诊断、预测、预防、和/或治疗的肾病包括但不限于急性肾衰竭、慢性肾衰竭、粥样栓塞性肾衰竭、晚期肾病、肾的炎性疾病（如急性肾小球肾炎、感染后肾小球肾炎、快速发展的肾小球肾炎、肾病综合症、膜性肾小球肾炎、家族性肾病综合症、I和II型膜增殖性肾小球肾炎、系膜增殖性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、急性肾小管间质性肾炎、慢性肾小管间质性肾炎、急性链球菌感染后肾小球肾炎（PSGN）、肾盂肾炎、狼疮性肾炎、慢性肾炎、间质性肾炎、和链球菌感染后肾小球肾炎）、肾的血管紊乱（如肾梗死、粥样栓塞性肾病、皮质坏死、恶性肾硬化、肾静脉血栓形成、肾低灌注、肾性视网膜病、肾缺血-再灌注、肾动脉栓塞、和肾动脉狭窄）、和由泌尿道疾病引起的肾紊乱（如肾盂肾炎、肾盂积水、尿石病（肾结石、肾石病）、反流性肾病、泌尿道感染、尿滞留、和急性或慢性单侧阻塞性尿路病）。 
另外，本发明的组合物可用于诊断、预测、预防、和/或治疗肾的代谢和先天性紊乱（如尿毒症、肾淀粉样变性、肾性骨营养不良、肾小管性酸中毒、 肾性糖尿、肾原性尿崩症、胱氨酸尿症、范康尼氏综合症、肾性纤维囊性骨质生成（肾性佝偻病）、哈特纳普氏病、巴特氏综合症、李德尔氏综合症、多囊性肾病、髓质囊性病、髓质海绵肾、阿尔波特氏综合症、指甲髌骨综合症、先天性肾病综合症、挤压综合症、马蹄肾、糖尿病性肾病、肾原性尿崩症、镇痛剂肾病、肾结石、和膜性肾病）、和肾的自身免疫性紊乱（如系统性红斑狼疮（SLE）、古德帕斯丘氏综合症、IgA肾病、和IgM系膜增殖性肾小球肾炎）。 
本发明的组合物可用于诊断、预测、预防、和/或治疗肾的硬化或坏死紊乱（如肾小球硬化症、糖尿病性肾病、局灶性节段性肾小球硬化症（FSGS）、坏死性肾小球肾炎、和肾乳头坏死）、肾癌（如肾瘤、肾上腺样瘤、肾母细胞瘤、肾细胞癌、移行细胞癌、肾腺癌、鳞状细胞癌、和维尔姆斯氏瘤）、和电解质失衡（如肾钙沉着症、脓尿、水肿、肾盂积水、蛋白尿症、低钠血症、高钠血症、低钾血症、高钾血症、低钙血症、高钙血症、低磷血症、和高磷血症）。 
本发明的组合物可使用本领域知道的任何方法来施用，包括但不限于投递部位的直接针注射、静脉内注射、局部施用、导管灌输、生物射弹喷射器、粒子加速器、明胶海绵贮存物、其它商品化贮存材料、渗透泵、口服或栓剂的固态药学制剂、手术过程中的倾倒或局部应用、气雾剂投递。这些方法是本领域所知道的。本发明的组合物可作为治疗剂的一部分来施用，下文有更为详细的描述。投递本发明多核苷酸的方法在本文中有更为详细的描述。 
心血管紊乱 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断、和/或预测心血管紊乱，包括但不限于周围动脉病，诸如肢体缺血。 
心血管紊乱包括但不限于心血管异常，诸如动脉-动脉瘘、动脉-静脉瘘、脑动脉畸形、先天性心脏缺损、肺动脉瓣闭锁、和弯刀综合症。先天性心脏缺陷包括但不限于主动脉狭窄、三房心、冠状血管异常、十字心、右位心、动脉导管未闭、埃布斯坦氏畸形、艾森曼格尔氏复合症、左心发育不全综合症、左位心、法洛氏四联症、主动脉肺动脉错位、右心室双出口、三尖瓣闭锁、永存动脉干、心间隔缺损诸如主动脉肺动脉间隔缺损、心内膜垫缺损、鲁腾巴赫综合症、法洛氏三联症、心室心间隔缺损。 
心血管紊乱还包括但不限于心脏病，诸如心律失常、类癌心脏病、高心排血量、低心排血量、心脏压塞、心内膜炎（包括细菌性的）、心动脉瘤、心脏停搏、充血性心力衰竭、充血性心肌病、阵发性呼吸困难、心源性水肿、心脏肥大、充血性心肌病、左心室肥大、右心室肥大、梗死后心脏破裂、室间隔破裂、心脏瓣膜疾病、心肌疾病、心肌缺血、心包积液、心包炎（包括缩窄性和结核性）、心包积气、心包切开术后综合症、肺原性心脏病、风湿性心脏病、心室机能障碍、充血、心血管妊娠并发症、弯刀综合症、心血管梅毒、和心血管结核病。 
心律失常包括但不限于窦性心律不齐、心房纤颤、心房扑动、心动过缓、期外收缩、亚当姆-斯托克司综合症、束支传导阻滞、窦房传导阻滞、长QT综合症、并行收缩、朗-甘-莱三氏综合症、马海姆型预激综合症、沃-帕-怀综合症、病窦综合症、心动过速、和心室纤颤。心动过速包括阵发性心动过速、室上性心动过速、加速性心室自主心律、房室结内折返性心动过速、异位性房性心动过速、异位性交接区性心动过速、窦房结内折返性心动过速、窦性心动过速、尖端扭转型室性心动过速、和室性心动过速。 
心脏瓣膜疾病包括但不限于主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、心杂音、主动脉瓣脱垂、二尖瓣脱垂、三尖瓣脱垂、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄、肺动脉瓣闭锁、肺动脉瓣闭锁不全、肺动脉瓣狭窄、三尖瓣闭锁、三尖瓣闭锁不全、和三尖瓣狭窄。 
心肌疾病包括但不限于酒精中毒性心肌病、充血性心肌病、肥厚型心肌病、主动脉瓣下狭窄、肺动脉瓣下狭窄、限制型心肌病、查格斯氏心肌病、心内膜弹力纤维增生症、心肌内膜纤维化、卡尔恩斯氏综合症、心肌再灌注损伤、和心肌炎。 
心肌缺血包括但不限于冠状动脉疾病，诸如心绞痛、冠状动脉瘤、冠状动脉硬化、冠状动脉血栓形成、冠状动脉痉挛、心肌梗死、和心肌顿抑。 
心血管疾病还包括血管疾病，诸如动脉瘤、血管发育不良、血管瘤、杆菌性血管瘤、希-林二氏病、克-特-韦三氏综合症、斯德奇-韦伯综合症、血管神经性水肿、主动脉疾病、高安氏动脉炎、主动脉炎、勒里施氏综合症、动脉闭塞性疾病、动脉炎、enarteritis、结节性多动脉炎、脑血管紊乱、糖尿病性血管病、糖尿病性视网膜病、栓塞、血栓形成、红斑性肢痛症、痔疮、肝静脉闭塞性疾病、高血压、低血压、局部缺血、周围血管疾病、静脉炎、 肺静脉闭塞性疾病、雷诺氏病、CREST综合症、视网膜静脉闭塞、弯刀综合症、上腔静脉综合症、毛细管扩张、共济失调性毛细管扩张、遗传性出血性毛细血管扩张症、精索静脉曲张、静脉曲张、静脉曲张性溃疡、血管炎、和静脉机能不全。 
动脉瘤包括但不限于分割性动脉瘤、假性动脉瘤、感染性动脉瘤、破裂性动脉瘤、主动脉瘤、脑动脉瘤、冠状动脉动脉瘤、心脏动脉瘤、和髂动脉瘤。 
动脉闭塞性疾病包括但不限于动脉硬化、间歇性跛行、颈动脉狭窄、纤维肌性发育异常、肠系膜血管闭塞、烟雾病、肾动脉闭塞、视网膜动脉闭塞、和血栓闭塞性血管炎。 
脑血管紊乱包括但不限于颈动脉疾病、大脑淀粉样血管病、脑动脉瘤、脑缺氧、脑动脉硬化、脑动静脉畸形、脑动脉疾病、脑栓塞和血栓形成、颈动脉血栓形成、静脉窦血栓形成、瓦伦伯格氏综合症、脑出血、硬脑膜外血肿、硬脑膜下血肿、蛛网膜下出血、脑梗死、脑缺血（包括暂时性）、锁骨下动脉盗血综合症、脑室周围白质软化、血管性头痛、丛集性头痛、偏头痛、和脊椎基底动脉机能不全。 
栓塞包括但不限于空气栓塞、羊水栓塞、胆固醇栓塞、蓝趾综合症、脂肪栓塞、肺栓塞、和血栓栓塞。血栓形成包括但不限于冠状动脉血栓形成、肝静脉血栓形成、视网膜静脉闭塞、颈动脉血栓形成、静脉窦血栓形成、瓦伦伯格氏综合症、和血栓性静脉炎。 
局部缺血性紊乱包括但不限于脑缺血、缺血性结肠炎、间隔综合症(compartment syndrome)、胫前肌综合症(anterior compartment syndrome)、心肌缺血、再灌注损伤、和四肢缺血(peripheral limb ischemia)。血管炎包括但不限于主动脉炎、动脉炎、贝切特氏综合症、丘-斯二氏综合症、粘膜皮肤淋巴结综合症、血栓闭塞性血管炎、超敏性血管炎、许兰-亨诺二氏紫癜、变应性皮肤血管炎、和瓦格纳氏肉芽肿。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可使用本领域知道的任何方法来施用，包括但不限于投递部位的直接针注射、静脉内注射、局部施用、导管灌输、生物射弹喷射器、粒子加速器、明胶海绵贮存物、其它商品化贮存材料、渗透泵、口服或栓剂的固态药学制剂、手术过程中的倾倒或局部应用、气雾剂投递。这些方法是本领域所知道的。投递多核苷酸的方法在本文中有更为详细的描述。 
呼吸紊乱 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断、和/或预测呼吸系统的疾病和/或紊乱。 
呼吸系统的疾病和紊乱包括但不限于鼻前庭炎、非变应性鼻炎（如急性鼻炎、慢性鼻炎、萎缩性鼻炎、血管运动性鼻炎）、鼻息肉和鼻窦炎、幼年型血管纤维瘤、鼻癌和幼年型乳头状瘤、声带息肉、小结（歌手小结）、接触性溃疡、声带麻痹、喉膨出、咽炎（如病毒性和细菌性）、扁桃体炎、扁桃体蜂窝织炎、咽旁脓肿、喉炎、喉膨出、和咽喉癌（如鼻咽癌、扁桃体癌、喉癌）、肺癌（如鳞状细胞癌、小细胞（燕麦形细胞）癌、大细胞癌、和腺癌）、变应性紊乱（嗜曙红细胞性肺炎、超敏性肺炎（如外源性变应性肺泡炎、变应性间质性肺炎、有机粉尘尘肺病、变应性支气管肺曲霉病、哮喘、瓦格纳氏肉芽肿（肉芽肿脉管炎）、古德帕斯丘氏综合症））、肺炎（如细菌性肺炎（如肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae（肺炎球菌肺炎）、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（葡萄球菌肺炎）、革兰氏阴性细菌性肺炎（由例如克雷伯氏菌属Klebsiella和假单胞菌属Pseudomonas引起）、肺炎枝原体Mycoplasma pneumoniae肺炎、流感嗜血菌Hemophilus influenzae肺炎、军团菌Legionella肺炎（军团病）、和鹦鹉热衣原体Chlamydia psittaci（鹦鹉热））、和病毒性肺炎（如流感、禽痘（水痘））。 
其它呼吸系统疾病和紊乱包括但不限于细支气管炎、脊髓灰质炎、哮吼、呼吸道合胞体病毒感染、腮腺炎、传染性红斑（第五病）、幼儿急疹、进行性风疹全脑炎、德国麻疹（风疹）、和亚急性硬化性全脑炎、真菌性肺炎（如组织胞浆菌病、球孢子菌病、芽生菌病、免疫系统受到严重遏制的人中的真菌感染（如由新型隐球酵母Cryyptococcus neoformans引起的隐球菌病；由曲霉属Aspergillus引起的曲霉病；由假丝酵母属Candida引起的假丝酵母病；和毛霉病））、卡氏肺囊虫Pneumocystis carinii（肺囊虫性肺炎）、非典型性肺炎（如枝原体属和衣原体属）、机会性感染肺炎、医院性肺炎、化学性肺炎、和吸入性肺炎、胸膜紊乱（如胸膜炎、胸腔积液、和气胸（如简单自发性气胸、复杂自发性气胸、张力性气胸））、阻塞性呼吸道疾病（如哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）、肺气肿、慢性或急性支气管炎）、职业性肺病（如硅沉着病、黑肺病（煤工肺尘埃沉着病）、石棉沉着病、铍中毒、职业性哮喘、棉屑沉着病、和良性肺尘埃沉着病）、浸润性肺病（如肺纤维化（如纤维化 肺泡炎、常见间质性肺炎）、特发性肺纤维化、脱屑性间质性肺炎、淋巴样间质性肺炎、组织细胞增多症X（如莱特勒-西韦病、汉-许-克病、嗜曙红细胞肉芽肿）、特发性肺含铁血黄素沉着症、结节病和肺泡蛋白沉着症）、急性呼吸窘迫综合症（也成为例如成人呼吸窘迫综合症）、水肿、肺栓塞、支气管炎（如病毒性、细菌性）、支气管扩张、肺不张、肺脓肿（由例如金黄色葡萄球菌或侵肺军团菌Legionella pneumophila引起）、和囊性纤维化。 
抗血管发生活性 
在血管发生的内源刺激物和抑制物之间的天然存在平衡中抑制的影响占优势。Rastinejad等人，Cell，56：345-355，1989。在正常生理学状况下发生新血管形成的罕见的情况中，诸如伤口愈合、器官再生、胚胎发育、和女性生殖过程，血管发生受到严格的调控且限定了空间和时间。在病理性血管发生的状况下，诸如表现出实体瘤生长，这些调控控制失败了。不受调控的血管发生成为病态并支持许多赘生和非赘生疾病的发展。许多严重的疾病受到异常新血管形成的支配，包括实体瘤生长和转移、关节炎、有些类型的眼科紊乱、和银屑病。参阅例如下列综述：Moses等人，Biotech.，9：630-634，1991；Folkman等人，N.Engl.J.Med.，333：1757-1763，1995；Auerbach等人，J.Microvasc.Res.，29：401-411，1985；Folkman，《Advances in Cancer Research》，Klein和Weinhouse编，Academic Press，New York，pp.175-203，1985；Patz，Am.J.Opthalmol.，94：715-743，1982；及Folkman等人，Science，221：719-725，1983。在许多病理性状况中，血管发生过程有助于疾病状态。例如，已经积累了大量的证据表明实体瘤的生长依赖于血管发生。Folkman和Klagsbrun，Science，235：442-447，1987。 
本发明提供了通过施用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸对与新血管形成有关的疾病或紊乱的治疗。可用本发明的多核苷酸和多肽或者激动剂或拮抗剂治疗的恶性和转移状况包括但不限于恶性肿瘤、实体瘤、及本文描述的和本领域其它途径知道的癌（关于这些紊乱的综述参阅Fishman等人，《Medicine》，第2版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，1985）。由此，本发明提供了治疗血管发生相关疾病和/或紊乱的方法，包括对有所需要的个体施用治疗有效量的本发明清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸。例如，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于多种其它方法，从而在治疗上 治疗癌或治疗。可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗的癌包括但不限于实体瘤，包括前列腺、肺、乳房、卵巢、胃、胰、喉、食道、睾丸、肝、腮腺、胆管、结肠、直肠、宫颈、子宫、子宫内膜、肾、膀胱、甲状腺癌；原发性肿瘤和转移；黑素瘤；成神经胶质细胞瘤；卡波西氏肉瘤；平滑肌肉瘤；非小细胞非癌；结肠直肠癌；高级恶性肿瘤；和血液传播肿瘤，诸如白血病。例如，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可局部投递以治疗癌，诸如皮肤癌、头和颈肿瘤、乳瘤、和卡波西氏肉瘤。 
在其它方面，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可通过例如膀胱内施用用于治疗浅表形式的膀胱癌。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可通过注射或导管直接投递到肿瘤内或肿瘤部位附近。当然，正如普通技术人员将领会的，适当的施用模式将根据待治疗的癌而变化。本文还讨论了其它投递模式。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗除癌以外的牵涉血管发生的其它紊乱。这些紊乱包括但不限于：良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、和脓性肉芽肿；动脉粥样硬化斑块；眼的血管发生性疾病，例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生、发红、成视网膜细胞瘤、眼的葡萄膜炎和翼状胬肉（异常血管生长）；类风湿性关节炎；银屑病；伤口愈合迟缓；子宫内膜异位；血管新生(vasculogenesis)；肉芽形成；肥厚性瘢痕（瘢痕疙瘩）；不连接骨折；硬皮病；沙眼；血管粘附；心肌血管发生；冠状动脉侧枝；脑侧枝；动静脉畸形；缺血性四肢血管发生(ischemic limb angiogenesis)；奥-韦二氏综合症；斑块新血管形成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤；纤维肌肉发育异常；伤口肉芽形成；克罗恩氏病；和动脉粥样硬化。 
例如，在本发明的一个方面，提供了用于治疗肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的方法，包括对肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步骤。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸直接注射到肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩中以预防这些损伤的发展。该疗法在已知导致肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩（如烧伤）发展的状况的 预防性治疗中特别有价值，且优选在增殖期有时间发展后（最初损伤后约14天）但在肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩发展前启动。如上所述，本发明还提供了用于治疗眼的新血管疾病的方法，包括例如角膜新血管形成、新生血管性青光眼、增殖性糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织增生、和黄斑变性。 
此外，可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗的与新血管形成有关的眼科紊乱包括但不限于：新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、成视网膜细胞瘤、晶状体后纤维组织增生、葡萄膜炎、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植新血管形成、以及与脉络膜或虹膜新血管形成有关的眼科炎性疾病、眼瘤、和疾病。参阅例如下列综述：Waltman等人，Am.J.Ophthal.，85：704-710，1978；及Gartner等人，Surv.Ophthal.，22：291-312，1978。 
由此，在本发明的一个方面，提供了用于治疗眼的新血管疾病的方法，诸如角膜新血管形成（包括角膜移植新血管形成），包括对患者对角膜施用治疗有效量的化合物（如本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸）的步骤，使得血管的形成受到抑制。简而言之，角膜是在正常情况下缺乏血管的组织。然而，在某些病理状况中，毛细管可由角膜和巩膜连接处的角膜周围血管丛延伸进入角膜。当角膜成为血管化后，它也就变得模糊，导致患者的视力下降。如果角膜变得完全不透明了，则可完全丧失视力。极其多种紊乱可导致角膜新血管形成，包括例如角膜感染（如沙眼、单纯疱疹性角膜炎、利什曼病、和盘尾丝虫病）、免疫学过程（如移植排斥和斯-约二氏综合症）、碱烧伤、创伤、炎症（任何原因）、中毒和营养缺乏状态、及作为佩戴隐形眼镜的并发症。 
在本发明特别优选的实施方案中，可在盐水中（联合常用于眼科制备物的任何防腐剂和抗微生物剂）制备用于局部施用，并以滴眼液的形式施用。溶液或悬浮液可以其纯的形式制备，并每天施用数次。或者，如上所述制备的抗血管发生组合物还可直接施用于角膜。在优选的实施方案中，抗血管发生组合物与结合角膜的粘膜粘合聚合物一起制备。在其它实施方案中，抗血管发生因子或抗血管发生组合物可用作常规类固醇疗法的辅助疗法。局部疗法还可在预防上用于已知具有诱导血管发生应答（诸如化学烧伤）的高概率的角膜损伤。在这些情况中，可立即开始治疗，有可能联合类固醇，以帮助预防后续并发症。 
在其它实施方案中，上文所述化合物可由眼科医师在显微镜指导下直接注射到角膜基质中。优选的注射部位可随个别损伤的形态学而变化，但是施用的目标将是将组合物置于血管结构的前沿（即散布于血管和正常角膜之间）。在大多数情况中，这将牵涉角膜和巩膜连接处周围的角膜注射以“保护”角膜免于推进的血管。该方法还可在角膜损伤后不仅使用，从而预防性的预防角膜新血管形成。在这种情况中，可将物质注射到角膜和巩膜连接处周围的角膜中，散布于角膜损伤及其不想要的潜在角膜和巩膜连接处血液供应之间。这种方法还可以类似方式用于预防移植角膜的毛细管入侵。在持续释放形式中，每年可能只需要2-3次注射。还可向注射液中添加类固醇以减少由注射本身引起的炎症。 
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗新生血管性青光眼的方法，包括对患者对眼施用治疗有效量的本发明清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步骤，使得血管的形成受到抑制。在一个实施方案中，化合物可局部施用至眼以治疗早期形式的新生血管性青光眼。在其它实施方案中，化合物可通过注射灌输到前房角区域中。在其它实施方案中，化合物还可置于任何部位，使得化合物连续释放到房水中。在本发明的另一个方面，提供了用于治疗增殖性糖尿病性视网膜病的方法，包括对患者对眼施用治疗有效量的本发明清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步骤，使得血管的形成受到抑制。 
在本发明特别优选的实施方案中，可通过注射到房水或玻璃体中以提高多核苷酸、多肽、拮抗剂、和/或激动剂在视网膜中的局部浓度来治疗增殖性糖尿病性视网膜病。优选的是，这种治疗应当在获得需要光凝固术的严重疾病前启动。 
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗晶状体后纤维组织增生的方法，包括对患者对眼施用治疗有效量的本发明清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的步骤，使得血管的形成受到抑制。化合物可通过玻璃体内注射和/或眼内植入局部施用。 
另外，可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗的紊乱包括但不限于血管瘤、关节炎、银屑病、血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑块、伤口愈合迟缓、肉芽形成、血友病性关节、肥厚性瘢痕、不连接骨折、奥-韦二氏综合症、脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼、和血管粘附。 
此外，可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断、和/或预测的紊乱和/或状态包括但不限于实体瘤、血液传播肿瘤诸如白血病、肿瘤转移、卡波西氏肉瘤、良性肿瘤例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、和脓性肉芽肿、类风湿性关节炎、银屑病、眼科血管发生疾病例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生、发红、成视网膜细胞瘤、和葡萄膜炎、伤口愈合迟缓、子宫内膜异位、血管新生、肉芽形成、肥厚性瘢痕（瘢痕疙瘩）、不连接骨折、硬皮病、沙眼、血管粘附、心肌血管发生、冠状动脉侧枝、脑侧枝、动静脉畸形、缺血性四肢血管发生、奥-韦二氏综合症、斑块新血管形成、毛细管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、纤维肌肉发育异常、伤口肉芽形成、克罗恩氏病、动脉粥样硬化、通过防止胚胎植入控制月经所需要的血管形成的避孕药、具有血管发生作为病理后果的疾病诸如猫抓病（Rochele minalia quintosa）、溃疡（幽门螺杆菌Helicobacter pylori）、巴尔通体病、和杆菌性血管瘤病。 
在节育方法的一个方面，在性交和受精发生之前或之后施用数量足以阻断胚胎植入的化合物，由此提供有效的节育方法，可能是“宿醉”方法。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于控制月经，或者在子宫内膜异位的治疗中或是作为腹腔灌洗液或是用于腹腔植入而施用。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可掺入外科缝合线以预防针脚肉芽肿。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于极其多种外科程序。例如，在本发明的一个方面，组合物（例如喷雾剂或薄膜的形式）可用于在切除肿瘤前对特定区域的涂抹或喷洒，从而将正常的周围组织与恶性组织分开，和/或预防疾病扩散至周围组织。在本发明的其它方面，组合物（例如喷雾剂的形式）可通过内窥镜检查程序投递，从而覆盖肿瘤或移植所需部位的血管发生。在本发明的另一些方面，经本发明抗血管发生组合物包被的外科网状织物可用于可利用外科网状织物的任何程序。例如，在本发明的一个实施方案中，装载了本发明抗血管发生组合物的外科网状织物可用于腹癌切除术过程（例如结肠切除术后），从而提供对结构的支持并释放一定量的抗血管发生因子。 
在本发明的其它方面，提供了用于治疗肿瘤切除部位的方法，包括在切除术后对肿瘤的切除边缘施用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸，使得癌的原地(local)复发和该部位新血管的形成受到抑制。在本发明的一个实施方案中，抗血管发生组合物直接施用至肿瘤切除部位（例如通过用抗血管发生化合物抹、刷、或其它方式覆盖肿瘤的切除边缘来应用)。或者，抗血管发生化合物可在施用前掺入已知的外科贴剂。在本发明特别优选的实施方案中，抗血管发生化合物在恶性肿瘤的肝切除术后和在神经外科手术后应用。 
在本发明的一个方面，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可施用于极其多种肿瘤的切除边缘，包括例如乳房、结肠、脑、和肝肿瘤。例如，在本发明的一个实施方案中，抗血管发生化合物可在切除术后施用于神经学肿瘤部位，使得该部位新血管的形成受到抑制。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可与其它抗血管发生因子一起施用。其它抗血管发生因子的代表性实例包括：抗侵入因子、视黄酸及其衍生物、紫杉醇（Paclitaxel）、苏拉明、金属蛋白酶-1的组织抑制物、金属蛋白酶-2的组织抑制物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、和各种形式的较轻“d组”过渡金属。 
较轻“d组”过渡金属包括例如钒、钼、钨、钛、铌、和钽核素。这些过渡金属核素可形成过渡金属复合物。上述过渡金属核素的合适复合物包括氧络过渡金属复合物。 
钒复合物的代表性实例包括氧络钒复合物，诸如钒酸盐和氧钒根复合物。合适的钒酸盐复合物包括偏钒酸盐和正钒酸盐复合物，诸如例如偏钒酸铵、偏钒酸钠、和正钒酸钠。合适的氧钒根复合物包括例如乙酰丙酮氧钒和硫酸氧钒包括硫酸氧钒水合物诸如一和三水合硫酸氧钒。 
钨和钼复合物的代表性实例也包括氧络复合物。合适的氧络钨复合物包括钨酸盐和氧化钨复合物。合适的钨酸盐复合物包括钨酸铵、钨酸钙、二水合钨酸钠、和钨酸。合适的氧化钨包括氧化钨(IV)和氧化钨(VI)。合适的氧络钼复合物包括钼酸盐、氧化钼、和氧钼根复合物。合适的钼酸盐复合物包括钼酸铵及其水合物、钼酸钠及其水合物、和钼酸钾及其水合物。合适的氧化钼包括氧化钼(IV)、氧化钼(VI)、和钼酸。合适的氧钼根复合物拷贝例如乙酰丙酮氧钼。其它合适的钨和钼复合物包括由例如甘油、酒石酸、和糖类 衍生的配位羟衍生物。 
极其多种其它抗血管发生因子也可用于本发明的内容。代表性的实例包括血小板因子4；硫酸鱼精蛋白；硫酸壳多糖衍生物（由雪花蟹壳制备）（Murata等人，Cancer Res.，51：22-26，1991）；硫酸多糖肽聚糖复合物（SP-PG）（该复合物的功能可通过类固醇的存在而增强，诸如雌激素和柠檬酸他莫昔芬）；十字孢碱；基质代谢的调控物，包括例如脯氨酸类似物、顺式羟基脯氨酸、d,L-3,4-脱氢脯氨酸、硫杂脯氨酸、α,α-二吡啶基氨基丙腈延胡索酸酯、4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-噁唑酮；氨甲喋呤；米托蒽醌；肝素；干扰素；2巨球蛋白-清蛋白；ChIMP-3（Pavloff等人，J.Bio.Chem.，267：17321-17326，1992）；抑糜酶素（Tomkinson等人，Biochem.J.，286：475-480，1992）；环糊精十四硫酸酯；Eponemycin；喜树碱；烟曲霉素（Ingber等人，Nature，348：555-557，1990）；硫代苹果酸钠金（“GST”；Matsubara和Ziff，J.Clin.Invest.，79：1440-1446，1987）；抗胶原酶血清；α2-抗纤溶酶（Holmes等人，J.Biol.Chem.，262(4)：1659-1664，1987）；必桑郡（National Cancer Institute）；氯苯扎利二钠（N-(2)-羧苯基-4-氯蒽茴酸(anthronilic acid)二钠或“CCA”；Takeuchi等人，Agents Actions，36：312-316，1992）；沙利度胺；抑制血管发生的类固醇；AGM-1470；羧基氨基咪唑；和金属蛋白酶抑制物，诸如BB94。 
细胞水平的疾病 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断、和/或预测的与细胞存活增强或凋亡抑制有关的疾病包括癌（诸如滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、和激素依赖性肿瘤，包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、成神经胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳癌、前列腺癌、卡波西氏肉瘤、和卵巢癌）；自身免疫性紊乱（诸如多发性硬化症、斯耶格伦氏综合症、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球肾炎和类风湿性关节炎）和病毒感染（诸如疱疹病毒、痘病毒、和腺病毒）、炎症、移植物抗宿主病、急性移植排除、和慢性移植排斥。 
在优选的实施方案中，将本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合 蛋白的多核苷酸用于抑制癌的生长、发展、和/或转移，特别是上文所列举的。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的与细胞存活增强有关的其它疾病或状况包括但不限于恶性肿瘤和相关紊乱的发展和/或转移，诸如白血病（包括急性白血病（如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病（包括成髓细胞、前髓细胞（早幼粒细胞）、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病））和慢性白血病（如慢性髓细胞性（粒细胞性）白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多、淋巴瘤（如霍奇金氏病和非霍奇金氏病）、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、和成视网膜细胞瘤。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、诊断、和/或预测的与凋亡增强有关的疾病包括但不限于AIDS；神经变性紊乱（诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性和脑瘤或前述相关疾病）；自身免疫性紊乱（诸如多发性硬化症、斯耶格伦氏综合症、桥本氏甲状腺炎、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球肾炎和类风湿性关节炎）；骨髓发育异常综合症（诸如再生障碍性贫血）、移植物抗宿主病、缺血性损伤（诸如由心肌梗死、中风、和再灌注损伤引起的）、肝损伤（如肝炎相关肝损伤、缺血性/再灌注损伤、胆汁淤积（胆管损伤）和肝癌）；毒素诱导的肝病（诸如由酒精引起的）、毒素诱导的肝病（诸如由酒精引起的）、感染性休克、恶病体质和食欲缺乏。 
伤口愈合和上皮细胞增殖 
依照本发明的又一个方面，提供了将本发明的融合蛋白和/或编码本发明 清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗目的的方法，例如出于伤口愈合的目的用于刺激上皮细胞增殖和基底角质形成细胞，及用于刺激毛囊生成和真皮伤口愈合。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在临床上用于刺激伤口愈合，包括外科伤口、切除术伤口、牵涉真皮和表皮损伤的深伤口、眼组织伤口、牙组织伤口、口腔伤口、糖尿病性溃疡、真皮溃疡、肘溃疡、动脉溃疡、静脉淤滞溃疡、由热暴露或化学药品引起的烧伤、以及其它异常伤口愈合状况，诸如尿毒症、营养不良、维生素缺乏、及与类固醇、放疗、和抗赘生药和抗代谢物的系统性治疗有关的并发症。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于促进真皮损失后的真皮重建。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于提高皮肤移植物对伤口面的粘附和用于刺激伤口面的表皮细胞再生。下面是可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸提高对伤口面的粘附的移植物类型：自体移植物(autograft)、人造皮肤、同种异体移植物(allograft)、自体真皮移植片、自体表皮移植片、无血管移植片、布-布二氏移植片、骨移植物、胚胎移植物、皮移植片(cutis graft)、延迟移植片、真皮移植片(dermic graft)、表皮移植片、筋膜移植片、全层皮移植片、异种移植物(heterologous graft)、异种移植物(xenograft)、同种异体移植物(homologous graft)、增生性移植物、角膜薄层移植片、网孔皮移植片、粘膜移植物、奥-提二氏移植物、网膜移植物、修补移植物、蒂状移植物、全层角膜移植片、分层皮移植片、厚分层皮移植片。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于提升皮肤强度和改善衰老皮肤的外观。 
我们认为本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还将在肝细胞增殖及肺、乳房、胰、胃、小肠、和大肠中的上皮细胞增殖中引起变化。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可促进上皮细胞增殖，诸如皮脂细胞(sebocyte)、毛囊、肝细胞、II型肺细胞、生成粘液素的杯形细胞、和皮肤、肺、肝、和胃肠道中含有的其它上皮细胞及其祖先。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可促进内皮细胞、角质形成细胞、和基底角质形成细胞的增殖。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸 还可用于降低由放疗、化疗、或病毒感染引起的内脏(gut)毒性副作用。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有对小肠粘膜的细胞保护效果。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可刺激由化疗和病毒感染引起的粘膜炎（口腔溃疡）的康复。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于完全和部分厚度皮肤缺损包括烧伤（即毛囊、汗腺、和皮脂腺的重驻）的完全再生、其它皮肤缺损诸如银屑病的治疗。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗大疱性表皮松解症，即表皮对下面真皮的粘附有缺陷，通过加速这些损伤的表皮细胞再生导致频繁的、开放的、且疼痛的水泡。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于治疗胃和十二指肠溃疡，并通过粘膜衬里的瘢痕形成及腺粘膜和十二指肠粘膜衬里的再生帮助更快愈合。炎性肠病，诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，指分别导致小肠或大肠粘膜表面破坏的疾病。由此，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于促进粘膜表面的新表面形成(resurfacing)以帮助更块愈合和预防炎性肠病的发展。用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸进行的治疗预计对整个胃肠道的粘液生成具有显著效果，且可用于保护肠粘膜免于所摄取有害物质或手术后的伤害。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗与表达不足有关的疾病。 
此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防和治疗各种病理状态对肺的损害。可刺激肺泡和支气管上皮增殖和分化并促进修复的本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于预防或治疗急性或慢性肺损伤。例如，导致肺泡渐进损失的肺气肿和引起支气管上皮和肺泡坏死的吸入性损伤（即由吸入烟和烧伤引起的）可使用本发明的多核苷酸或多肽、激动剂或拮抗剂有效治疗。同样，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于刺激II型肺细胞的增殖和分化，这有助于治疗或预防诸如透明膜病等疾病，诸如早产儿中的婴儿呼吸窘迫综合症和支气管肺发育异常。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可刺激肝细胞的增殖和分化，由此可用于减轻或治疗肝病和病理学，诸如由 肝硬化引起的爆发性肝衰竭、由病毒性肝炎和有毒物质（即醋氨酚、四氯化碳(carbon tetraholoride)和本领域已知的其它肝毒素）引起的肝损伤。 
另外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或预防糖尿病的发作。在最近诊断为I型和II型糖尿病、其中保留有些胰岛细胞功能的患者中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于维持胰岛功能，从而减轻、延迟、或预防疾病的永久表现。同样，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作胰岛细胞移植的辅助疗法以改进或促进胰岛细胞功能。 
神经活性和神经学疾病 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于脑和/或神经系统的疾病、紊乱、损伤、或损害的诊断和/或治疗。可用本发明的组合物（如本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸）治疗的神经系统紊乱包括但不限于神经系统损伤，以及导致轴突断开、神经元消减或变性、或脱髓鞘疾病或紊乱。可依照本发明的方法在患者（包括人和非人哺乳动物患者）中治疗的神经系统损伤包括但不限于下列中枢（包括脊髓、脑）或周围神经系统损伤：（1）缺血性损伤，其中部分神经系统缺氧导致神经元损伤或死亡，包括脑梗死或缺血或者脊髓梗死或缺血；（2）外伤性损伤，包括由物理伤害引起的或与手术有关的损伤，例如切断部分神经系统的损伤，或者压伤；（3）恶性损伤，其中部分神经系统遭到恶性组织的破坏或损伤，该恶性组织或是神经系统相关恶性肿瘤或是由非神经系统组织衍生的恶性肿瘤；（4）感染性损伤，其中部分神经系统因为感染而遭到破坏或损伤，例如通过沙眼或者与人免疫缺陷病毒、带状疱疹、或单纯疱疹病毒感染或与莱姆病、结核病、或梅毒有关；（5）变性损伤，其中部分神经系统因为变性过程而遭到破坏或损伤，包括但不限于与帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏舞蹈病、或肌萎缩侧索硬化（ALS）有关的变性；（6）与营养性疾病或紊乱有关的损伤，其中部分神经系统因新陈代谢的营养性疾病或紊乱而遭到破坏或损伤，包括但不限于维生素B12缺乏、叶酸缺乏、韦尼克病、烟酒性弱视、马-比二氏病（原发性胼胝体变性）、和酒精性小脑变性；（7）与系统性疾病有关的神经学损伤，包括但不限于糖尿病（糖尿病性神经病、贝耳氏面瘫）、系统性红斑狼疮、癌、或结节病；（8）由有毒物质引起的损伤，包括酒精、铅、或特定神经毒素；和（9）脱髓鞘损伤， 其中部分神经系统因脱髓鞘疾病而遭到破坏或损伤，包括但不限于多发性硬化症、人免疫缺陷病毒相关脊髓病、横贯性脊髓病或各种病因学、进行性多灶性白质脑病、和脑桥中央髓鞘溶解。 
在一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于保护神经细胞免于低氧的损害作用。在另一个优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于包含神经细胞免于脑缺氧的损害作用。根据这个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防与脑缺氧有关的神经细胞损伤。在这个实施方案的一个非排他性方面，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与脑缺血有关的神经细胞损伤。在这个实施方案的另一个非排他性方面，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与脑梗死有关的神经细胞损伤。 
在另一个优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与中风有关的神经细胞损伤。在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与中风有关的脑神经细胞损伤。 
在另一个优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与心脏病发作有关的神经细胞损伤。在一个具体的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗或预防与心脏病发作有关的脑神经细胞损伤。 
可用于治疗或预防神经系统紊乱的本发明组合物可通过测试在促进神经元存活或分化中的生物学活性来选择。例如，而非作为限制，引发任何下列效果的组合物可依照本发明使用：（1）在存在或缺乏缺氧或低氧条件中增加神经元在培养中的存活时间；（2）在培养中或在体内增加神经元的发芽；（3）在培养中或在体内增加神经元相关分子的生成，如就运动神经元而言是胆碱乙酰转移酶或乙酰胆碱酯酶；或（4）在体内减少神经元功能障碍。这些效果可通过本领域知道的任何方法来测量。在优选的非限制性实施方案中，增加神经元的存活可使用本文所列举的或本领域其它途径知道的方法来常规测量，诸如例如Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，973637-42，2000或Arakawa等人，J.Neurosci.，10：3507-15，1990；增加神经元的发芽可通 过本领域知道的方法来测量，诸如例如Pestronk等人，Exp.Neurol.，70：65-82，1980或Brown等人，Ann.Rev.Neurosci.，4：1742，1981中列举的方法；增加神经元相关分子的生成可使用本领域知道的且取决于待测量分子的技术通过生物测定法、酶促测定法、抗体结合、Northern印迹测定法等来测量；而运动神经元功能障碍可通过评估运动神经元紊乱的身体表现(physical manifestation)来测量，例如虚弱、运动神经元传导速度、或功能残疾。 
在具体的实施方案中，可依照本发明治疗的运动神经元紊乱包括但不限于诸如下列紊乱，梗死形成、感染、暴露于毒素、外伤、手术损伤、可影响运动神经元及神经系统其它成分的变性疾病或恶性肿瘤、以及选择性影响神经元的紊乱诸如肌萎缩侧索硬化，包括但不限于进行性脊髓性肌萎缩、进行性延髓性麻痹、原发性侧索硬化、婴儿型和幼年型肌萎缩、儿童期进行性延髓性麻痹（法奇奥-隆德二氏综合症）、脊髓灰质炎和脊髓灰质炎后综合症、和遗传性运动感觉神经病（夏科-马里-图思三氏病）。 
另外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在神经元存活、突触形成、传导、神经分化等中发挥作用。由此，本发明的组合物（包括本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸）可用于诊断和/或治疗或预防与这些作用有关的疾病或紊乱，包括但不限于学习和/或认知紊乱。本发明的组合物还可用于治疗或预防神经变性疾病状态和/或行为紊乱。这些神经变性疾病状态和/或行为紊乱包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、图雷特多综合症、精神分裂症、躁狂症、痴呆、偏执狂、强制性紊乱、惊恐性紊乱、学习无能、ALS、精神病、孤独症、和行为改变，包括进食、睡眠型式、平衡、和知觉紊乱。另外，本发明的组合物还可在与发育中胚胎有关的发育紊乱或性别连锁紊乱的治疗、预防、和/或检测中发挥作用。 
另外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于保护神经细胞免于与脑血管紊乱有关的疾病、损伤、紊乱、或损害，包括但不限于颈动脉疾病（如颈动脉血栓形成、颈动脉狭窄、或烟雾病）、脑淀粉样血管病、脑动脉瘤、脑缺氧、脑动脉硬化、脑动静脉畸形、脑动脉疾病、脑栓塞和血栓形成（如颈动脉血栓形成、静脉窦血栓形成、或瓦伦伯格氏综合症）、脑出血（如硬脑膜外或硬脑膜下血肿、或蛛网膜下出血）、脑梗死、脑缺血（如暂时性脑缺血、锁骨下动脉盗血综合症、或脊椎基底动脉机 能不全）、血管性痴呆（如多发性脑梗死性）、脑室周围白质软化、和血管性头痛（如丛集性头痛或偏头痛）。 
依照本发明的另一个方面，提供了出于治疗目的利用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的方法，例如用于刺激神经学细胞增殖和/或分化。因此，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗和/或检测神经疾病。此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作特定神经系统疾病或紊乱的标志物或检测物。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的神经紊乱的实例包括大脑疾病，诸如代谢性脑病，包括苯丙酮酸尿症诸如母体苯丙酮酸尿症、丙酮酸羧化酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症、韦尼克氏脑病、脑水肿、脑赘生物诸如小脑赘生物包括幕中赘生物、脑室赘生物诸如脉络丛赘生物、下丘脑赘生物、幕上赘生物、卡纳万病，小脑疾病，诸如小脑共济失调，包括脊髓小脑变性诸如共济失调性毛细管扩张、小脑协同失调、弗里德赖希氏共济失调、马-约二氏病、橄榄体脑桥小脑萎缩、小脑赘生物诸如幕中赘生物、弥漫性脑硬化诸如轴周脑炎、球样细胞脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、和亚急性硬化性全脑炎。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的其它神经疾病包括脑血管紊乱（诸如颈动脉疾病，包括颈动脉血栓形成、颈动脉狭窄、和烟雾病）、脑淀粉样血管病、脑动脉瘤、脑缺氧、脑动脉硬化、脑动静脉畸形、脑动脉疾病、脑栓塞和血栓形成诸如颈动脉血栓形成、静脉窦血栓形成、和瓦伦伯格氏综合症、脑出血诸如硬脑膜外血肿、硬脑膜下血肿、和蛛网膜下出血、脑梗死、脑缺血诸如暂时性脑缺血、锁骨下动脉盗血综合症、和脊椎基底动脉机能不全、血管性痴呆诸如多发性脑梗死性痴呆、脑室周围白质软化、血管性头痛诸如丛集性头痛和偏头痛。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的其它神经疾病包括痴呆诸如AIDS痴呆复合症、早老性痴呆诸如阿尔茨海默氏病和克-雅二氏综合症、老年痴呆诸如阿尔茨海默氏病和进行性核上性麻痹、血管性痴呆诸如多发性脑梗死性痴呆、脑炎包括轴周脑炎、病毒性脑炎诸如流行性脑炎、日本脑炎、圣路易脑炎、蜱传脑炎、和西尼罗河热、急性播散性脑脊髓炎、脑膜脑炎诸如葡萄膜脑膜脑炎综合症、脑炎后 帕金森病、和亚急性硬化性全脑炎、脑软化症诸如脑室周围白质软化、癫痫诸如全身型癫痫包括婴儿痉挛、失神性癫痫、肌阵挛型癫痫包括MERRF综合症、强直阵挛性癫痫、局限性癫痫诸如复杂的局限性癫痫、额叶性癫痫和颞叶性癫痫、外伤后癫痫、癫痫持续状态诸如持续性局限性癫痫、和哈-斯二氏综合症。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的其它神经疾病包括脑积水诸如丹迪-沃克综合征和正常压力脑积水、下丘脑疾病诸如下丘脑赘生物、脑型疟、发作性睡病包括猝倒症、延髓性脊髓灰质炎、假性脑瘤、瑞特氏综合症、雷耶氏综合症、脑丘疾病、脑弓形虫病、颅内结核球和泽韦格综合症、中枢神经系统感染诸如AIDS痴呆复合症、脑脓肿、硬脑膜下积脓、脑脊髓炎诸如马脑脊髓炎、委内瑞拉马脑脊髓炎、坏死性出血性脑脊髓炎、绵羊脱髓鞘性脑白质炎、和脑型疟。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的其它神经疾病包括脑膜炎诸如蛛网膜炎、无菌性脑膜炎诸如病毒性脑膜炎包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、细菌性脑膜炎包括嗜血杆菌脑膜炎、利斯特杆菌脑膜炎、脑膜炎球菌脑膜炎诸如沃-弗综合征、肺炎球菌脑膜炎和脑膜结核、真菌性脑膜炎诸如隐球菌脑膜炎、硬脑膜下积液、脑膜脑炎诸如葡萄膜脑膜脑炎综合症、脊髓炎诸如横贯性脊髓炎、神经梅毒诸如脊髓痨、脊髓灰质炎包括延髓性脊髓灰质炎和脊髓灰质炎后综合症、朊病毒病（诸如克-雅二氏综合症、牛海绵样脑病、格-斯二氏综合症、库鲁病、痒病）、和脑弓形虫病。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的其它神经疾病包括中枢神经系统赘生物，诸如脑赘生物，包括小脑赘生物诸如幕中赘生物、脑室赘生物诸如脉络丛赘生物、下丘脑赘生物和幕上赘生物、脑膜赘生物、脊髓赘生物包括硬脑膜外赘生物、脱髓鞘疾病诸如卡纳万病、弥漫性脑硬化包括肾上腺脑白质营养不良、轴周脑炎、球样细胞脑白质营养不良、弥漫性脑硬化诸如异染性脑白质营养不良、变应性脑脊髓炎、坏死性出血性脑脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、多发性硬化、脑桥中央髓鞘溶解、横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎、痒病、凹背、慢性疲劳综合症、绵羊脱髓鞘性脑白质炎、高压神经综合症、假性脑膜炎、脊髓病诸如先天性肌弛缓、肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩诸如韦德尼希-霍夫曼病、脊 髓受压、脊髓赘生物诸如硬脑膜外赘生物、脊髓空洞症、脊髓痨、僵体综合症、智力落后诸如天使综合症、猫叫综合症、德朗热氏综合症、唐氏综合症、神经节苷脂贮积病诸如神经节苷脂贮积病G(M1)、桑德霍夫病、泰-萨二氏病、哈特奈扑病、同型胱氨酸尿症、劳-穆-比三氏综合症、莱-尼二氏综合症、槭糖尿病、粘脂贮积病诸如岩藻糖苷贮积病、神经元蜡样脂褐质沉积症、眼脑肾综合症、苯丙酮酸尿症诸如母体苯丙酮酸尿症、普拉德-威利综合症、瑞特氏综合症、鲁宾斯坦-泰比综合征、结节性硬化症、WAGR综合症、神经系统异常诸如前脑无裂畸形、神经管缺陷诸如无脑畸形包括积水性无脑、阿-查二氏畸形、脑膨出、脑膜膨出、脊髓脊膜膨出、脊柱裂病诸如囊性脊柱裂和隐性脊柱裂。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的其它神经疾病包括遗传性运动和感觉神经病，包括夏科-马里二氏病、遗传性视神经萎缩、雷弗素姆氏病、遗传性痉挛性截瘫、韦德尼希-霍夫曼病、遗传性感觉和自主神经病诸如先天性无痛症和家族性自主神经异常、神经表现（诸如失认症，包括格斯特曼氏综合症、健忘症诸如逆行性遗忘、失用症、神经源性膀胱、猝倒症、社交紊乱诸如听觉紊乱包括耳聋、部分听力丧失、响度重振和耳鸣、语言紊乱诸如失语症包括失写症、命名不能症、布罗卡失语症和韦尼克失语症、诵读困难诸如后天性诵读困难、语言发展紊乱、语言紊乱诸如失语症包括命名不能症、布罗卡失语症和韦尼克失语症、构语紊乱、社交紊乱诸如语言紊乱包括构音困难、模仿言语、缄默症和口吃、发生紊乱诸如失声和声嘶、去大脑状态、谵妄、肌束震颤、幻觉、假性脑膜炎、运动障碍诸如天使综合症、共济失调、手足徐动症、舞蹈症、张力失常、运动减少、肌肉张力过低、肌阵挛、抽搐、斜颈和震颤、肌肉张力过高诸如肌肉僵化诸如僵体综合症、肌肉痉挛状态、麻痹诸如面瘫包括耳部带状疱疹、胃轻瘫、偏瘫、眼肌麻痹诸如复视、杜安氏综合症、霍纳氏综合症、慢性进行性外眼肌麻痹诸如基恩斯氏综合症、延髓性麻痹、热带痉挛性截瘫、截瘫诸如布朗-塞卡尔综合症、四肢瘫痪、呼吸麻痹和声带麻痹、轻瘫、幻肢、味觉紊乱诸如味觉缺失和味觉障碍、视觉紊乱诸如弱视、盲、色觉缺陷、复视、偏盲、盲点和低常视力、睡眠障碍诸如睡眠过度包括克莱恩-莱文综合症、失眠和梦游症、痉挛诸如牙关紧闭、无意识诸如昏迷、持续性植物状态和昏厥和眩晕、神经肌肉疾病诸如先天性肌弛缓、肌萎缩侧索硬 化、兰伯特-伊顿肌无力综合症、运动神经元疾病、肌萎缩诸如脊髓性肌萎缩、夏-马二氏病和韦德尼希-霍夫曼病、脊髓灰质炎后综合症、肌肉萎缩症、重症肌无力、萎缩性肌强直、先天性肌强直、线状体肌病、家族性周期性瘫痪、多发性（副）肌阵挛、热带痉挛性截瘫和僵体综合症、周围神经系统疾病诸如肢端痛、淀粉状蛋白神经病、自主神经系统疾病诸如艾迪氏综合症、巴-利二氏综合症、家族性性自主神经异常、霍纳氏综合症、反射交感性营养不良和夏伊-德雷格综合症、脑神经疾病诸如听神经疾病诸如听神经瘤包括神经纤维瘤病2、面神经疾病诸如面神经痛、梅尔克松-罗森塔尔综合症、动眼紊乱(ocular motility disorder)包括弱视、眼震、动眼神经麻痹、眼肌麻痹诸如杜安氏综合症、霍纳氏综合症、慢性进行性外眼肌麻痹包括基恩斯氏综合症、斜视诸如内斜视和外斜视、动眼神经麻痹、视神经疾病诸如视神经萎缩包括遗传性视神经萎缩、视盘玻璃疣、视神经眼诸如视神经脊髓炎、视盘水肿、三叉神经痛、声带麻痹、脱髓鞘疾病诸如视神经脊髓炎和凹背、和糖尿病性神经病诸如糖尿病足。 
可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的其它神经疾病包括神经压迫综合症诸如腕管综合症、跗管综合症、胸廓出口综合症诸如颈肋综合症、尺神经压迫综合症、神经痛诸如灼性神经痛、颈臂神经痛、面神经痛和三叉神经痛、神经炎诸如实验性变应性神经炎、视神经炎、多神经炎、多神经根神经病和神经根炎诸如多神经根炎、遗传性运动和感觉神经病诸如夏科-马里二氏病、遗传性视神经萎缩、雷弗素姆氏病、遗传性痉挛性截瘫和韦德尼希-霍夫曼病、遗传性感觉和自主神经病包括先天性无痛症和家族性自主神经异常、POEMS综合症、坐骨神经痛、味觉性出汗和手足搐搦。 
内分泌紊乱 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断、和/或预测与激素失衡有关的紊乱和/或疾病、和/或内分泌系统的紊乱或疾病。 
由内分泌系统的腺分泌的激素控制着身体生长、性功能、新陈代谢、和其它功能。紊乱可以两种方法进行分类：激素生成的扰动和应答激素的组织无能。这些激素失衡或内分泌系统疾病、紊乱或状况的病因可以是遗传的、肉体的（诸如癌和有些自身免疫病）、获得的（如通过化疗、损伤或毒素）、 或传染性的。此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作与内分泌系统和/或激素失衡有关的特定疾病或紊乱的标志物或检测物。 
内分泌系统和/或激素失衡紊乱和/或疾病涵盖子宫运动性的紊乱，包括但不限于：妊娠和分娩的并发症（如早产分娩、过期妊娠、自然流产、和分娩缓慢或停止）；及月经周期的紊乱和/或疾病（如痛经和子宫内膜异位症）。 
内分泌系统和/或激素失衡紊乱和/或疾病包括胰腺的紊乱和/或疾病，诸如例如糖尿病、尿崩症、先天性胰腺发育不全、嗜铬细胞瘤-胰岛细胞瘤综合症；肾上腺的紊乱和/或疾病，诸如例如艾迪生氏病、皮质类固醇缺乏症、男性化疾病、多毛症、库欣氏综合症、高醛甾酮症、嗜铬细胞瘤；垂体腺的紊乱和/或疾病，诸如例如垂体功能亢进、垂体功能减退、垂体性侏儒症、垂体腺瘤、全垂体功能减退、肢端肥大症、巨人症；甲状腺的紊乱和/或疾病，包括但不限于甲状腺机能亢进、甲状腺机能减退、普卢默氏病、格雷夫斯氏病（毒性弥漫性甲状腺肿）、毒性节结性甲状腺肿、甲状腺炎（桥本氏甲状腺炎、亚急性肉芽肿性甲状腺炎、和静息性淋巴细胞性甲状腺炎）、潘德雷德氏综合症、粘液水肿、克汀病、甲状腺毒症、甲状腺激素偶联缺陷、胸腺不发育、甲状腺的许特尔氏细胞瘤、甲状腺癌症、甲状腺癌、甲状腺髓样癌；甲状旁腺的紊乱和/或疾病，诸如例如甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退；下丘脑的紊乱和/或疾病。 
另外，内分泌系统和/或激素失衡紊乱和/或疾病还可包括睾丸或卵巢的紊乱和/或疾病，包括癌。睾丸或卵巢的其它紊乱和/或疾病还包括例如卵巢癌、多囊性卵巢综合症、克兰费尔特氏综合症、睾丸逸失综合症（双侧无睾症）、莱迪希氏细胞先天性缺失、隐睾症、努南氏综合症、强直性肌营养不良、睾丸的毛细血管瘤（良性）、睾丸的赘生物形成和新睾丸(neo-testis)。 
此外，内分泌系统和/或激素失衡紊乱和/或疾病还可包括紊乱和/或疾病诸如例如多腺缺陷综合症、嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤、多发性内分泌赘生物形成，及内分泌组织的紊乱和/或癌。 
在另一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、预测、预防、和/或治疗与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分所对应的治疗性蛋白质在其中表达的组织有关的内分泌疾病和/或紊乱。 
生殖系统紊乱 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于诊断、治疗、或预防生殖系统的疾病和/或紊乱。可用本发明的组合物治疗的生殖系统紊乱包括但不限于生殖系统损伤、感染、赘生性紊乱、先天性缺陷、和导致不育的疾病或紊乱、妊娠、分娩、或生产的并发症、和产后困难(postpartum difficulties)。 
生殖系统紊乱和/或疾病包括睾丸的疾病和/或紊乱，包括睾丸萎缩、睾丸女性化、隐睾症（单侧和双侧）、无睾症、异位睾丸、附睾炎和睾丸炎（通常由感染引起，诸如例如淋病、腮腺炎、结核病、和梅毒）、睾丸扭转、节结状输精管炎、生殖细胞肿瘤（如精原细胞瘤、胚性细胞癌、畸胎癌、绒膜癌、卵黄囊肿瘤、和畸胎瘤）、基质肿瘤（如莱迪希氏细胞肿瘤）、鞘膜积液、鞘膜积血、精索静脉曲张、精液囊肿、腹股沟疝、和精子生成紊乱（如不动纤毛综合症、无精症、弱精症、无精子症、精子减少症、和畸形精子症）。 
生殖系统紊乱还包括前列腺的紊乱，诸如急性非细菌性前列腺炎、慢性非细菌性前列腺炎、急性细菌性前列腺炎、慢性细菌性前列腺炎、前列腺张力失常、前列腺病、肉芽肿性前列腺炎、软化斑、良性前列腺肥大或再生、及前列腺赘生性紊乱，包括腺癌、移行细胞癌、导管癌、和鳞状细胞癌。 
另外，本发明的组合物可用于阴茎和尿道紊乱或疾病的诊断、治疗、和/或预防，包括炎性紊乱，诸如阴茎头包皮炎、闭塞性干燥性龟头炎、包茎、嵌顿包茎、梅毒、单纯疱疹病毒、淋病、非淋球菌性尿道炎、衣原体、枝原体、毛滴虫、HIV、AIDS、莱特尔氏综合症、尖锐湿疣、扁头湿疣、和珍珠样阴茎丘疹；尿道异常，诸如尿道下裂、尿道上裂、和包茎；恶化前损伤，包括凯拉增生性红斑、博温氏病、博温样丘疹病、布-勒二氏巨型湿疣、和疣状癌；阴茎癌，包括鳞状细胞癌、原位癌、疣状癌癌、和弥散性阴茎癌；尿道赘生性紊乱，包括阴茎尿道癌、尿道球膜癌(bulbomembranous urethral carcinoma)、和前列腺尿道癌；及勃起紊乱，诸如阴茎异常勃起、佩伦涅氏病、勃起功能障碍、和阳萎。 
此外，输精管的疾病和/或紊乱包括脉管炎和CBAVD（输精管先天性双侧缺如）；另外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于精囊疾病和/或紊乱的诊断、治疗、和/或预防，包括包囊虫病、先天性氯化物性腹泻、和多囊性肾病。 
男性生殖系统的其它紊乱和/或疾病包括例如克兰费尔特氏综合症、杨氏综合症、早泄、糖尿病、囊性纤维化、卡塔格纳氏综合症、高热、多发性硬化、和男子乳腺发育。 
另外，本发明的多核苷酸、融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于阴道和阴门疾病和/或紊乱的诊断、治疗、和/或预防，包括细菌性阴道病、假丝酵母阴道炎、单纯疱疹病毒、软下疳、腹股沟肉芽肿、性病淋巴肉芽肿、疥疮、人乳头瘤病毒、阴道外伤、阴门外伤、腺病、衣原体阴道炎、淋病、毛滴虫阴道炎、尖锐湿疣、梅毒、传染性软疣、萎缩性阴道炎、佩吉特氏病、硬化性苔藓、扁平苔藓、外阴痛、中毒性休克综合征、阴道痉挛、外阴阴道炎、外阴前庭炎、和赘生性紊乱，诸如鳞状细胞增生、透明细胞癌、基底细胞癌、黑素瘤、巴托林腺癌、和外阴上皮内赘生物形成。 
子宫的紊乱和/或疾病包括痛经、子宫后倾、子宫内膜异位、纤维瘤、腺肌病(adenomyosis)、无排卵性出血、闭经、库欣氏综合症、水泡状胎块（葡萄胎）、阿谢曼氏综合症、过早绝经、性早熟、子宫息肉、功能障碍性子宫出血（如由于异常激素信号）、和赘生性紊乱，诸如腺癌、平滑肌肉瘤、和肉瘤。另外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作先天性子宫异常的标志物或检测物，以及用于诊断、治疗、和/或预防，诸如双角子宫、有隔子宫、简单单角子宫、具有无腔原始角的单角子宫、具有无连通腔原始角的单角子宫、具有连通腔角的单角子宫、弓形子宫、双子宫、和T形子宫。 
卵巢的疾病和/或紊乱包括不排卵、多囊性卵巢综合症（斯坦-利文撒尔二氏综合症）、卵巢囊肿、卵巢机能减退、卵巢对促性腺激素不敏感、卵巢过度生成雄激素、右卵巢静脉综合症、闭经、hirutism、和卵巢癌（包括但不限于原发性和继发性癌性生长、塞尔托利-莱迪希二氏肿瘤、卵巢子宫内膜样癌、卵巢乳头状浆液性腺癌、卵巢粘液腺癌、和卵巢克鲁肯贝格瘤）。 
宫颈的疾病和/或紊乱包括宫颈炎、慢性宫颈炎、粘脓性宫颈炎、宫颈发育异常、宫颈息肉、纳博特氏囊肿、宫颈糜烂、宫颈机能不全、和宫颈赘生物（包括例如宫颈癌、鳞状化生、鳞状细胞癌、腺鳞状细胞赘生物形成、和柱状细胞赘生物形成）。 
另外，生殖系统的疾病和/或紊乱包括妊娠紊乱和/或疾病，包括流产和死产，诸如早期流产、晚期流产、自然流产、人工流产、治疗性流产、先兆 流产、稽留流产、不全流产、完全流产、习惯性流产、稽留流产、和流产感染；异位妊娠、贫血症、Rh不相容性、妊娠期间阴道出血、妊娠糖尿病、宫内生长迟缓、羊水过多、HELLP综合症、胎盘早期脱离、前置胎盘、剧吐、先兆子痫、子痫、妊娠疱疹、和妊娠荨麻疹。另外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于妊娠可并发疾病的诊断、治疗、和/或预防，包括心脏病、心力衰竭、风湿性心脏病、先天性心脏病、二尖瓣脱垂、高血压、贫血、肾病、传染性疾病（如风疹、细胞巨化病毒、弓形虫病、传染性肝炎、衣原体、HIV、AIDS、和生殖器疱疹）、糖尿病、格雷夫斯氏病、甲状腺炎、甲状腺机能减退、桥本氏甲状腺炎、慢性活动性肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、哮喘、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、阑尾炎、卵巢囊肿、胆囊紊乱、和肠梗阻。 
与分娩和生产有关的并发症包括羊膜早破、早产分娩、过期妊娠、过度成熟、分娩进展过于缓慢、胎儿窘迫（如异常心率（胎儿的或母亲的）、呼吸问题、和异常胎位）、肩难产、脱垂脐带、羊水栓塞、和异常子宫出血。 
另外，分娩后时期的疾病和/或紊乱包括子宫内膜炎、子宫肌炎、子宫旁（组织）炎、腹膜炎、骨盆血栓性静脉炎、肺栓塞、内毒素血症、肾盂肾炎、隐静脉血栓性静脉炎、乳腺炎、膀胱炎、产后出血、和倒置子宫。 
可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸诊断、治疗、和/或预防的女性生殖系统的其它紊乱和/或疾病包括例如特纳氏综合症、假两性畸形、经前综合症、盆腔炎疾病、盆腔充血（血管充血）、性感缺失、性快感缺失、性感不快、输卵管破裂、和经间痛。 
传染病 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测传染媒介。例如，可通过提高免疫应答，特别是提高B和/或T细胞的增殖和分化，来治疗传染病。或是通过增强现有的免疫应答，或是通过启动新的免疫应答，可提高免疫应答。或者，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可直接抑制传染媒介，无需引发免疫应答。 
病毒是可引起可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的疾病或症状的传染媒介的一种实例。病毒的 实例包括但不限于下列DNA和RNA病毒和病毒科：虫媒病毒(Arbovirus)、腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、动脉炎病毒科(Arterivirus)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、布尼病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、登革病毒、EBV、HIV、黄病毒科(Flaviviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)（肝炎病毒）、疱疹病毒科(Herpesviridae)（诸如细胞巨化病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒）、Mononegavirus（如副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒、杆状病毒科(Rhabdoviridae)）、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)（如流感病毒A、流感病毒B、和副流感病毒）、乳头瘤病毒、乳多空病毒科(Papovaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)（诸如天花或牛痘）、呼肠孤病毒科(Reoviridae)（如轮状病毒）、逆转录病毒科(Retroviridae)（HTLV-I、HTLV-II、慢病毒）、和披膜病毒科(Togaviridae)（如风疹病毒）。属于这些科的病毒可引起多种疾病或症状，包括但不限于：关节炎、细支气管炎、呼吸道合胞病毒、脑炎、眼部感染（如结膜炎、角膜炎）、慢性疲劳综合症、肝炎（甲型、乙型、丙型、戊型、慢性活动性、丁型）、日本B型脑炎、胡宁热、切昆贡亚热、裂谷热、黄热病、脑膜炎、机会性感染（如AIDS）、肺炎、伯基特氏淋巴瘤、禽痘、出血热、麻疹、腮腺炎、副流感、狂犬病、感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传播疾病、皮肤病（如卡波西氏、疣）、和病毒血症。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。在具体的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗：脑膜炎、登革热、EBV、和/或肝炎（如乙肝）。在另一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗对一种或多种其它商品化肝炎疫苗不响应的患者。在又一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗AIDS。 
类似的，可引起可用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗或检测的疾病或症状的细菌和真菌媒介包括但不限于下列革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、细菌科、和真菌：放线菌属(Actinomyces)（如诺卡氏菌属(Nocardia)）、不动杆菌属(Acinetobacter)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌科 (Bacillaceae)（如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)）、类杆菌属(Bacteroides)（如脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)）、芽生菌属(Blastomyces)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)（如布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)）、布鲁氏菌属(Brucella)、假丝酵母属(Candida)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)（如肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium diffcile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)）、球孢菌属(Coccidioides)、棒状杆菌属(Corynebacterium)（如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)）、隐球酵母属(Cryptococcus)、皮肤真菌病(Dermatocycoses)、大肠埃希氏杆菌(E.coli)（如产肠毒素的大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌）、肠杆菌属(Enterobacter)（如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)）、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)（克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)（如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)）、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)）、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、嗜血杆菌属(Haemophilus)（如B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)）、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)（如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)）、螺旋体属(Leptospira)、利斯特氏菌属(Listeria)（如单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)）、枝原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobacterium)（如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)）、弧菌属(Vibrio)（如霍乱壶菌(Vibrio cholerae)）、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)（如淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningilidis)）、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、变形菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)（如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、立克次氏体科(Rickettsiaceae)、螺旋体(Spirochetes)（如密螺旋体属(Treponema spp.)、钩端螺旋体属(Leptospira spp.)、疏螺旋体属(Borrelia spp.)）、志贺氏菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus)（如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)）、脑膜炎球菌(Meningiococcus)、肺炎球菌(Pneumococcus)和链球菌属(Streptococcus)（如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)及A、B、和C群链球菌）、和尿枝原体属(Ureaplasmas)。这些细菌、寄生虫、和真菌科可引起疾病或症状，包括但 不限于：抗生素抗性感染、菌血症、心内膜炎、败血症、眼部感染（如结膜炎）、葡萄膜炎、结核病、龈炎、细菌性腹泻、机会性感染（如AIDS相关感染）、甲沟炎、假体相关感染、龋、赖特尔氏病、呼吸道感染诸如百日咳或脓胸、脓毒症、莱姆病、猫抓病、痢疾、副伤寒、食物中毒、军团病、慢性和急性炎症、红斑、酵母感染、伤寒、肺炎、淋巴、脑膜炎（如A型和B型脑膜炎）、衣原体、梅毒、白喉、麻风、布氏菌病、消化性溃疡、炭疽、自然流产、出生缺陷、肺炎、肺部感染、耳部感染、耳聋、盲、嗜睡、不适、呕吐、慢性腹泻、克罗恩氏病、结肠炎、阴道炎、不育、盆腔炎疾病、假丝酵母病、副结核、结核病、狼疮、肉毒中毒、坏疽、破伤风、脓疱病、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤病（如蜂窝织炎、皮肤真菌病）、毒血症、尿道感染、伤口感染、医院感染。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。在具体的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗：破伤风、白喉、肉毒中毒、和/或B型脑膜炎。 
此外，引起可用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸治疗、预防、和/或诊断的疾病或症状的寄生虫媒介包括但不限于下列科或类：阿米巴虫（病）、巴倍斯虫（病）、球虫（病）、隐孢子虫（病）、双核阿米巴虫（病）、马等媾疫、外寄生虫（病）、贾第虫（病）、蠕虫（病）、利什曼虫（病）、裂体吸虫（血吸虫）病、泰勒尔梨浆虫（病）、弓形虫（病）、锥形虫（病）、和滴虫（病）和孢子虫（如间日疟原虫Plasmodium virax、恶性疟原虫Plasmodium falciparium、三日疟原虫Plasmodium malariae和卵形疟原虫Plasmodium ovale）。这些寄生虫可引起多种疾病或症状，包括但不限于：疥疮、恙螨病、眼部感染、肠病（如痢疾、贾第虫病）、肝病、肺病、机会性感染（如AIDS相关的）、疟疾、妊娠并发症、和弓形虫病。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、和/或诊断任何这些症状或疾病。在具体的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸用于治疗、预防、和/或诊断疟疾。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可这样施用，或是对患者施用有效量的本发明的清蛋白融合蛋白，或是由患者采集细胞，给细胞供应本发明的多核苷酸，并将经过改造的细胞返还患者 （离体疗法）。此外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可在疫苗中用作抗原，用于引发针对传染病的免疫应答。 
再生 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于细胞的分化、增殖、和吸引，导致组织再生（参阅Science，276：59-87，1997）。组织再生可用于修复、替换、或保换因先天性缺陷、外伤（伤口、烧伤、切口、或溃疡）、衰老、疾病（如骨质疏松、骨关节炎、牙周病、肝功能衰竭）、手术包括整容整形手术、纤维化、再灌注损伤、或系统性细胞因子损伤而受损的组织。 
可使用本发明再生的组织包括器官（如胰腺、肝、肠、肾、皮肤、内皮）、肌肉（平滑肌、骨骼肌、或心肌）、脉管系统（包括血管和淋巴管）、神经、造血、和骨骼（骨、软骨、腱、和韧带）组织。优选的是，增生的发生没有瘢痕或瘢痕减少。再生还可包括血管发生。 
此外，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可提高难以治愈的组织的再生。例如，提高腱/韧带再生将加快损伤后的恢复时间。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可在预防上用于避免损伤的努力。可治疗的具体疾病包括腱炎、腕管综合征、和其它腱或韧带缺损。不愈合伤口的组织再生的另一个实例包括压迫性溃疡、与血管机能不全有关的溃疡、手术和外伤伤口。 
类似的，神经和脑组织也可使用本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来再生，使神经细胞增殖和分化。可使用该方法治疗的疾病包括中枢和周围神经系统疾病、神经病、或机械性和外伤性紊乱（如脊髓紊乱、头部外伤、脑血管疾病、和中风）。具体而言，与周围神经损伤、周围神经病（如由化疗或其它医学疗法引起的）、局限性神经病、和中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨庭顿氏病、肌萎缩侧索硬化、和夏伊-德雷格综合症）有关的疾病都可使用本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸来治疗。 
胃肠紊乱 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治疗、预防、诊断、和/或预测胃肠紊乱，包括炎性疾病和/或状况、感染、癌（如肠赘生物（小肠类癌肿瘤、小肠非霍奇金氏淋巴瘤、小肠淋巴 瘤））、和溃疡，诸如消化性溃疡。 
胃肠紊乱包括吞咽困难、吞咽痛、食道炎症、消化性食道炎、胃反流、粘膜下纤维化和狭窄、马洛莱-韦斯损伤、平滑肌瘤、脂肪瘤、表皮癌、腺癌、胃滞留紊乱、胃肠炎、胃萎缩、胃癌、胃息肉、自身免疫性紊乱诸如恶性贫血、幽门狭窄、胃炎（细菌性、病毒性、嗜曙红细胞性、压力诱导的、慢性侵蚀性、萎缩性、浆细胞性、和梅尼特里埃氏）、和腹膜疾病（如乳糜性水腹(chyloperioneum)、腹腔积血、肠系膜囊肿、肠系膜淋巴结炎、肠系膜血管阻塞、脂膜炎、赘生物、腹膜炎、气腹、bubphrenic abscess）。 
胃肠紊乱还包括与小肠有关的紊乱，诸如吸收不良综合症、膨胀、肠易激综合征、糖不耐、乳糜泻、十二指肠溃疡、十二指肠炎、热带口炎性腹泻、惠普耳氏病、肠淋巴管扩张、克罗恩氏病、阑尾炎、回肠梗阻、麦克尔氏憩室、多发性憩室、小肠和大肠完全运行失效、淋巴瘤、和细菌和寄生虫疾病（诸如旅行者腹泻、伤寒和副伤寒、霍乱、蛔虫（似蚓蛔线虫Ascariasis lumbricoides）、钩虫（十二指肠钩口线虫Ancylostoma duodenale）、线虫（蠕形驻肠线虫Enterobius vermicularis）、绦虫（牛肉绦虫Taenia saginata、细粒棘球绦虫Echinococcus granulosus、裂头绦虫属Diphyllobothrium spp.、和猪肉绦虫T.solium）感染. 
肝的疾病和/或紊乱包括肝内胆汁淤积（阿拉吉尔氏综合症、胆汁性肝硬化）、脂肪肝（酒精性脂肪肝、莱耶氏综合症）、肝静脉血栓形成、肝豆状粒变性、肝大、肝肺综合症、肝肾综合症、门静脉高压（食道和胃血管曲张）、肝脓肿（阿米巴性肝脓肿）、肝硬化（酒精性、胆汁性、和实验性）、酒精性肝病（脂肪肝、肝炎、硬化）、寄生虫（肝包虫病、片形吸虫病、阿米巴性肝脓肿）、黄疸（溶血性、肝细胞性、和胆汁淤积性）、胆汁淤积、门静脉高压、肝扩大、腹水、肝炎（酒精性肝炎、动物肝炎、慢性肝炎（自身免疫、乙肝、丙肝、丁肝、药物诱导的）、中毒性肝炎、病毒性人肝炎（甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝）、威尔逊氏病、肉芽肿性肝炎、继发性胆汁性肝硬化、肝性脑病、门静脉高压、血管曲张、肝性脑病、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、肝细胞腺瘤、血管瘤、胆石、肝功能衰竭（肝性脑病、急性肝功能衰竭）、和肝赘生物（血管肌脂瘤、钙化性肝转移癌、囊性肝转移癌、上皮肿瘤、纤维板状肝癌、灶性节结性增生、肝腺癌、肝胆囊腺瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、肝细胞瘤、肝癌、肝血管内皮瘤、间叶性错构瘤、 肝的间叶细胞瘤、节结再生性增生、良性肝肿瘤（肝囊肿[简单囊肿、多囊性肝病、肝胆囊腺瘤、胆总管囊肿]、间叶细胞瘤[间叶性错构瘤、幼儿血管内皮瘤、血管瘤、紫癜样肝病、脂肪瘤、炎性假瘤、混杂型]、上皮瘤[胆管上皮（胆管错构瘤、胆管腺瘤）、肝细胞（腺瘤、灶性节结性增生、节结再生性增生）]、恶性肝肿瘤[肝细胞、肝母细胞瘤、肝细胞癌、胆管细胞、胆管癌、囊腺癌、血管肿瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管内皮瘤、其它肿瘤、胚性肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、癌肉瘤、畸胎瘤、类癌、鳞状细胞癌、原发性淋巴瘤]）、紫癜样肝病、红细胞生成性肝性卟啉症、肝性卟啉症（急性间歇性卟啉病、迟发性皮肤卟啉病）、泽韦格综合症）。 
胰腺的疾病和/或紊乱包括急性胰腺炎、慢性胰腺炎（急性坏死性胰腺炎、酒精性胰腺炎）、赘生物（胰腺的腺癌、囊腺癌、胰岛瘤、胃泌素瘤、和高血糖素瘤、囊性赘生物、胰岛细胞肿瘤、胰母细胞瘤）、和其它胰腺疾病（如囊性纤维化、囊肿（胰腺假囊肿、胰瘘、机能不全））。 
胆囊疾病包括胆石（胆石症和胆总管结石病）、胆囊切除术后综合症、胆囊憩室病、急性胆囊炎、慢性胆囊炎、胆管肿瘤、和粘液囊肿。 
大肠的疾病和/或紊乱包括抗生素抗性结肠炎、憩室炎、溃疡性结肠炎、获得性巨结肠、脓肿、真菌和细菌感染、肛门直肠紊乱（如肛裂、痔疮）、结肠疾病（结肠炎、结肠赘生物[结肠癌、腺瘤状结肠息肉（如绒毛状腺瘤）、结肠癌、结肠直肠癌]、结肠憩室炎、结肠憩室病、巨结肠[希尔施普龙病、中毒性巨结肠]；乙状结肠疾病[直肠结肠炎、乙状结肠赘生物]）、便秘、克罗恩氏病、腹泻（婴儿腹泻、痢疾）、十二指肠疾病（十二指肠赘生物、十二指肠梗阻、十二指肠溃疡、十二指肠炎）、小肠炎（小肠结肠炎）、FIN肠病、回肠疾病（回肠赘生物、回肠炎）、免疫增殖性小肠疾病、炎性肠病（溃疡性结肠炎、克罗恩氏病）、肠闭锁、寄生虫病（异尖线虫病、小袋纤毛虫病、酵母菌感染(blastocystis infection)、隐孢子虫病、双核阿米巴虫病、阿米巴痢疾、贾第虫病）、肠瘘（直肠瘘）、肠赘生物（盲肠赘生物、结肠赘生物、十二指肠赘生物、回肠赘生物、肠息肉、空肠赘生物直肠赘生物）、肠梗阻（输入袢综合症、十二指肠梗阻、粪便阻塞、假肠梗阻性直肠膨出）、消化性溃疡（十二指肠溃疡、消化性食道炎、出血、穿孔、胃溃疡、佐林格-埃利森综合征）、胃切除术后综合症（倾倒综合症）、胃病（如胃酸缺乏、十二指肠胃反流（胆汁反流）、胃窦血管扩张、胃瘘、胃出口梗阻、胃炎（萎缩 性或肥厚性）、胃轻瘫、胃扩张、胃憩室、胃赘生物（胃癌、胃息肉、胃腺癌、增生性胃息肉）、胃破裂、胃溃疡、胃扭转）、结核病、内脏下垂、呕吐（如呕血、妊娠剧吐、术后恶心和呕吐）、和出血性结肠炎。 
胃肠系统的其它疾病和/或紊乱包括胆管疾病，诸如腹裂、瘘（如胆瘘、食道瘘、胃瘘、肠瘘、胰瘘）、赘生物（如胆管赘生物、食道赘生物诸如食道腺癌、食道鳞状细胞癌、胃肠赘生物、胰赘生物诸如胰的腺癌、胰的粘蛋白囊性赘生物、胰囊性赘生物、胰母细胞瘤、和腹膜赘生物）、食道疾病（如大庖性疾病、假丝酵母病、糖原生成性棘皮症、溃疡、巴雷特食管血管曲张、闭锁、囊肿、憩室（如岑克尔氏憩室）、瘘（如气管食管瘘）、能动性紊乱（如CREST综合症、吞咽障碍、失弛缓症、痉挛、胃食管反流）、赘生物、穿孔（如布尔哈弗综合症、马洛莱-韦斯综合征）、狭窄、食道炎、膈疝（如食管裂孔疝）；胃肠疾病，诸如胃肠炎（如假霍乱、诺沃克病毒感染）、出血（如呕血、黑粪、消化性溃疡出血）、胃赘生物（胃癌、胃息肉、胃腺癌、胃癌））、疝（如先天性膈疝、股疝、腹股沟疝、闭孔疝、脐疝、腹疝）、和肠疾病（如盲肠疾病（阑尾炎、盲肠赘生物））。 
趋化性 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有趋化活性。趋化分子将细胞（如单核细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、肥大细胞、嗜曙红细胞、上皮细胞、和/或内皮细胞）吸引或动员至身体中特定部位，诸如发炎、感染、或过度增殖部位。然后动员的细胞可抗击和/或治疗特定创伤或异常。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可提高特定细胞的趋化活性。因而这些趋化分子可用于通过提高靶向身体中特定部位的细胞数目来治疗炎症、感染、过度增殖性紊乱、或任何免疫系统紊乱。例如，趋化分子可用于通过将免疫细胞吸引至受伤部位来治疗伤口或对组织的其它创始。本发明的趋化分子还可吸引成纤维细胞，它可用于治疗伤口。 
还设想了本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可抑制趋化活性。这些分子也可用于治疗紊乱。由此，本发明的融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作趋化性的抑制剂。 
结合活性 
本发明的清蛋白融合蛋白可用于筛选结合融合蛋白的治疗性蛋白质部分 的分子或融合蛋白的治疗性蛋白质部分结合的分子。融合蛋白与该分子的结合可刺激（激动剂）、提高、抑制（拮抗剂）、或降低融合蛋白或所结合分子的活性。这种分子的实例包括抗体、寡核苷酸、蛋白质（如受体）、或小分子。 
优选的是，该分子与本发明融合蛋白的治疗性蛋白质部分的天然配体密切相关，如配体的片段，或是天然底物、配体、结构或功能模拟物（参阅Coligan等人，Current Protocols in Immunology，1(2)：第5章，1991）。类似的，该分子可与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分结合的天然受体密切相关，或者至少是能由本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分结合的受体片段（如活性位点）。在任一种情况中，可使用已知技术理性设计该分子。 
优选的是，这些分子的筛选牵涉生成表达本发明清蛋白融合蛋白的适当细胞。优选的细胞包括来自哺乳动物、酵母、果蝇、或大肠杆菌的细胞。 
测定法可仅仅测试候选化合物与本发明清蛋白融合蛋白的结合，其中结合是通过标记物或在牵涉经标记竞争物的竞争的测定法中检测。此外，测定法可测试候选化合物通过与融合蛋白的结合而产生信号。 
或者，测定法可使用无细胞制备物、附着于固相支持物上的融合蛋白/分子、化学库、或天然产物混合物来进行。测定法还可仅仅包括下列步骤：将候选化合物与含清蛋白融合蛋白溶液混和；测量融合蛋白/分子活性或结合；并与标准品比较融合蛋白/分子活性或结合。 
优选的是，ELISA测定法可使用单克隆或多克隆抗体测量样品（如生物学样品）中的融合蛋白水平或活性。或是通过与清蛋白融合蛋白的直接或间接结合，或是通过与清蛋白融合蛋白竞争底物，抗体可测量融合蛋白水平或活性。 
另外，可通过本领域技术人员知道的许多方法来鉴定本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分结合的受体，例如配体淘选和FACS分选（Coligan等人，Current Protocols in Immun.，1(2)，第5章，1991）。例如，在融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应于FGF的情况中，可采用表达克隆，其中由响应清蛋白融合蛋白的细胞制备聚腺苷酸化RNA，例如已知含有FGF家族蛋白质的多种受体的NIH3T3细胞和SC-3细胞，并将由此RNA构建的cDNA文库分成几个集合并用于转染COS细胞或不响应清蛋白融合蛋白的其它细胞。将在载波片上培养的经转染细胞暴露于本发明的清蛋白融合蛋白，事先对它们进行标记。可通过多种方法来标记清蛋白融合蛋白，包括碘化或引入位点特异蛋白激酶的识别位点。 
固定和温育后，对载波片进行放射自显影分析。鉴定阳性集合，并使用反复分子集和再次筛选过程来制备子集和再次转染，最终产生编码假定受体的单一克隆。 
作为受体鉴定的替代方法，可将经标记清蛋白融合蛋白与表达本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的受体分子的细胞膜或提取制备物通过光亲和连接，连接的物质可通过PAGE分析解析并使X射线胶片曝光。可切下含融合蛋白受体的经标记复合物，解析成肽片段，并进行蛋白质微量测序。由微量测定得到的氨基酸序列将用于设计一组简并寡核苷酸探针，用于筛选cDNA文库以鉴定编码假定受体的基因。 
此外，可采用基因改组、基序改组、外显子改组、和/或密码子改组（统称为“DNA改组”）技术来调控融合蛋白和/或本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分或清蛋白成分的活性，由此高效生成本发明清蛋白融合蛋白的激动剂和拮抗剂。通常参阅美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458以及Patten,P.A.等人，Curr.Opinion Biotechnol.，8：724-33，1997；Harayama,S.，Trends Biotechnol.，16(2)：76-82，1998；Hansson,L.O.等人，J.Mol.Biol.，287：265-76，1999；及Lorenzo,M.M.和Blasco,R.，Biotechniques，24(2)：308-13，1998；将这些专利和出版物的每一篇引入本文作为参考。在一个实施方案中，可通过DNA改组来实现编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸及因而由其编码的清蛋白融合蛋白的改变。DNA改组牵涉通过同源或位点特异重组将两个或多个DNA区段组装成所需分子。在另一个实施方案中，可通过进行随机诱变来改变编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸及因而由其编码的清蛋白融合蛋白，而随机诱变可通过在重组前进行错误倾向PCR、随机核苷酸插入、或其它方法来实现。在另一个实施方案中，可将本发明清蛋白融合蛋白的一种或多种成分、基序、部件、部分、结构域、片段等与一种或多种异源分子的一种或多种成分、基序、部件、部分、结构域、片段等重组。在优选的实施方案中，异源分子是家族成员。在更为优选的实施方案中，异源分子是生长因子，诸如例如血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF-1）、转化生长因子（TGF）-α、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、TGF-β、骨形态发生蛋白（BMP）-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、激活蛋白A和B、decapentaplegic（dpp）、60A、OP-2、背蛋白、生长分化因子（GDF）、nodal、 MIS、抑制素-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5、和神经胶质细胞衍生神经营养因子（GDNF）。 
其它优选片段有本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分和/或清蛋白成分的生物学活性片段。生物学活性片段指展示的活性与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分和/或清蛋白成分的活性相似但不必相同的片段。片段的生物学活性可包括提高的想要的活性或降低的不想要的活性。 
另外，本发明提供了筛选化合物以鉴定调控本发明清蛋白融合蛋白作用的化合物的方法。这种测定法的实例包括将哺乳动物成纤维细胞、本发明的清蛋白融合蛋白、及待筛选的化合物和3[H]胸苷在成纤维细胞将正常增殖的细胞培养条件下混和。对照测定法可在缺乏待筛选化合物的条件下进行，并通过测定每种情况中的3[H]胸苷摄取与存在化合物时成纤维细胞增殖的数量进行比较以确定该化合物是否刺激增殖。成纤维细胞增殖的数量是通过液体闪烁层析测量的，它测量3[H]胸苷的掺入。激动剂和拮抗剂两种化合物都可通过这种程序来鉴定。 
在另一种方法中，将表达本发明融合蛋白的治疗性蛋白质成分的受体的哺乳动物细胞或膜制备物与经过标记的本发明融合蛋白在存在化合物的条件下一起温育。然后可测量化合物增强或阻断此相互作用的能力。或者，测量待筛选化合物与受体相互作用后的已知第二信使系统的应答，并测量化合物结合受体并引发第二信使应答的能力以确定该化合物是否是潜在的融合蛋白。这种第二信使系统包括但不限于cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道、或磷酸肌醇水解。 
所有这些上述测定法都可用作诊断或预测标志。通过活化或抑制融合蛋白/分子，使用这些测定法发现的分子可用于治疗疾病或在患者中产生特定结果（如血管生长）。此外，这些测定法能发现可抑制或增强合适操作的细胞或组织生成本发明清蛋白融合蛋白的试剂。 
因此，本发明包括鉴定结合本发明清蛋白融合蛋白的化合物的方法，包括下列步骤：（a）将候选结合化合物与本发明的清蛋白融合蛋白一起温育；并（b）测定是否发生了结合。此外，本发明包括鉴定激动剂/拮抗剂的方法，包括下列步骤：（a）将候选化合物与本发明的清蛋白融合蛋白一起温育，（b）测定生物学活性，并（c）测定融合蛋白的生物学活性是否发生了改变。 
靶向投递 
在另一个实施方案中，本发明提供了将组合物投递至表达本发明清蛋白融合蛋白一种成分的受体的靶细胞的方法。 
正如本文所讨论的，本发明的融合蛋白可经由疏水性、亲水性、离子、和/或共价相互作用与异源多肽、异源核酸、毒素、或前体药物缔合。在一个实施方案中，本发明提供了通过施用与异源多肽或核酸缔合的本发明融合蛋白（包括抗体）而将本发明的组合物特异投递至细胞的方法。在一个实施例中，本发明提供了用于将治疗性蛋白质投递到靶细胞中的方法。在另一个实施例中，本发明提供了用于将单链核酸（如反义或核酶）或双链核酸（如能整合到细胞基因组中或作为附加体复制且能够转录的DNA）投递到靶细胞中的方法。 
在另一个实施方案中，本发明提供了通过施用与毒素或胞毒剂缔合的本发明清蛋白融合蛋白（如本发明的多肽或本发明的抗体）来特异破坏细胞（如破坏肿瘤细胞）的方法。 
“毒素”意指结合并激活内源细胞毒性效应物系统的化合物、放射性同位素、全毒素、改良毒素、毒素的催化亚基、或通常在细胞中或在细胞表面上不存在的、在限定条件下引起细胞死亡的任何分子或酶。可依照本发明使用的毒素包括但不限于本领域已知的放射性同位素、诸如例如结合内在的或诱导的内源细胞毒性效应物系统的抗体（或其含补体固定部分）等化合物、胸苷激酶、内切核酸酶、RNA酶、α-毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、肥皂草毒蛋白、苦瓜毒蛋白、多花白树毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、α-帚曲霉素、和霍乱毒素。“细胞毒性前体药物”意指由通常在细胞中存在的酶转变成细胞毒性化合物的无毒化合物。可依照本发明的方法使用的细胞毒性前体药物包括但不限于苯甲酸芥子烷化剂的谷氨酰衍生物、鬼臼亚乙苷或丝裂霉素C的磷酸盐衍生物、阿糖胞甘、道诺红霉素、和阿霉素的苯氧基乙酰胺衍生物。 
药物筛选 
还设想了本发明的清蛋白融合蛋白或编码这些融合蛋白的多核苷酸用于筛选修饰(modify)本发明的清蛋白融合蛋白或与清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的蛋白质的活性的分子的用途。这种方法将包括使融合蛋白接触怀疑具有拮抗剂或激动剂活性的选定化合物，并测定融合蛋白在结合后的活性。 
通过在多种药物筛选技术中使用本发明的清蛋白融合蛋白或其结合片段，本发明特别可用于筛选治疗性化合物。在这种测试中所采用的清蛋白融合蛋白可以附着于固相支持物、表达于细胞表面、游离于溶液中、或定位于细胞内。一种药物筛选方法利用经表达清蛋白融合蛋白的重组核酸稳定转化的真核或原核宿主细胞。在竞争性结合测定法中针对这种经过转化的细胞或通过培养这种细胞得到的上清液对药物进行筛选。可测量例如所测试试剂与本发明清蛋白融合蛋白之间复合物的形成。 
由此，本发明提供了筛选药物或影响由本发明清蛋白融合蛋白介导的活性的任何其它试剂的方法。这些方法包括通过本领域众所周知的方法使该试剂接触本发明的清蛋白融合蛋白或其片段，并测定试剂与清蛋白融合蛋白或其片段之间复合物的存在。在这种竞争性结合测定法中，待筛选的试剂通常进行了标记。温育后，将游离试剂与以结合形式存在的试剂分开，而游离的或未络合的标记物的数量是特定试剂结合本发明清蛋白融合蛋白的能力的度量。 
另一种药物筛选技术提供了对本发明的清蛋白融合蛋白具有合适结合亲和力的化合物的高通量筛选，而且在1984年9月13日公布的欧洲专利申请84/03564中进行了极为详细的描述，将其引入本文作为参考。简而言之，在固相基底诸如塑料插脚或一些其它表面上合成大量的不同小肽测试化合物。使肽测试化合物与本发明的清蛋白融合蛋白进行反应，并进行清洗。然后通过本领域众所周知的方法来检测结合的肽。可将纯化的清蛋白融合蛋白直接包被在平板上以用于上述药物筛选技术。另外，非中和抗体可用于捕捉肽并将其固定在固相支持物上。 
本发明还设想了竞争性药物筛选测定法的用途，其中能够结合本发明清蛋白融合蛋白的中和抗体与测试化合物特异竞争与清蛋白融合蛋白或其片段的结合。如此，将抗体用于检测与本发明清蛋白融合蛋白共享一个或多个抗原性表位的任何肽的存在。 
结合肽和其它分子
本发明还涵盖用于鉴定结合本发明清蛋白融合蛋白的多肽和非多肽的筛选方法，以及由此鉴定得到的结合分子。这些结合分子可用作例如本发明清蛋白融合蛋白的激动剂和拮抗剂。这种激动剂和拮抗剂可依照本发明用于下文详细描述的治疗实施方案。 
该方法包括下列步骤：使本发明的清蛋白融合蛋白接触多种分子；并鉴 定结合清蛋白融合蛋白的分子。 
使本发明的清蛋白融合蛋白接触多种分子的步骤可以多种方式进行。例如，可设想将清蛋白融合蛋白固定在固相支持物上，并使多种分子的溶液接触固定化的多肽。这样一种流程将类似于亲和层析过程，其中亲和基质由固定化的本发明清蛋白融合蛋白构成。然后可通过亲和选择来纯化对清蛋白融合蛋白具有选择性亲和力的分子。固相支持物的本质、用于将清蛋白融合蛋白附着于固相支持物的过程、溶剂、以及亲和分离或选择的条件是极为方便的，且是本领域普通技术人员所熟知的。 
或者，还可将多种多肽分开成基本上分开的级分，给自包含个别多肽或其子集。例如，可通过凝胶电泳、柱层析、或本领域普通技术人员知道的用于将多肽分开的类似方法将多种多肽分开。还可以这样一种方式由经转化宿主细胞生成个别多肽，即表达在其外表面之上或周围（如重组噬菌体）。然后可用本发明的清蛋白融合蛋白“探查”个别分离物，任选在存在表达所需要的诱导物的条件下，以确定清蛋白融合蛋白与个别克隆之间是否存在任何选择性亲和相互作用。在使清蛋白融合蛋白接触包含个别多肽的每一级分前，首先可将多肽转移至固相支持物以提供额外便利。这种固相支持物可仅仅是一片滤膜，诸如由硝酸纤维素或尼龙制成的。如此，可由表达文库的经转化宿主细胞集合鉴定出阳性克隆，它包含编码对本发明的清蛋白融合蛋白具有选择性亲和力的多肽的DNA构建物。此外，可通过常规方法直接测定对本发明的清蛋白融合蛋白具有选择性亲和力的多肽的氨基酸序列，或者常常可更方便的测定编码多肽的DNA的编码序列。然后可由相应的DNA序列推导一级序列。如果要用多肽自身测定氨基酸序列，则可采用微量测序技术。测序技术可包括质谱法。 
在某些情况中，可能希望在试图测定或检测选择性亲和相互作用的存在之前由本发明清蛋白融合蛋白与多种多肽的混合物洗去任何未结合的多肽。在将本发明的清蛋白融合蛋白或多种多肽结合于固相支持物时，可能特别需要这种清洗步骤。 
依照该方法提供的多种分子可通过多样性文库的方式来提供，诸如可用于筛选特异结合本发明清蛋白融合蛋白的分子的随机或组合肽或非肽文库。本领域知道许多可用的文库，例如化学合成库、重组库（如噬菌体展示库）、和基于体外翻译的文库。Fodor等人，Science，251：767-773，1991；Houghten 等人，Nature，354：84-86，1991；Lam等人，Nature，354：82-84，1991；Medynski，Bio/Technology，12：709-710，1994；Gallop等人，J.Medicinal Chemistry，37(9)：1233-1251，1994；Ohlmeyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：10922-10926，1993；Erb等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：11422-11426，1994；Houghten等人，Biotechniques，13：412，1992；Jayawickreme等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：1614-1618，1994；Salmon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11708-11712，1993；PCT公布号WO 93/20242；及Brenner和Lemer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5381-5383，1992中描述了化学合成库的实例。 
Scott等人，Science，249：386-390，1990；Devlin等人，Science，249：404-406，1990；Christian等人，J.Mol.Biol.，227：711-718，1992；Lenstra，J.Immunol.Meth.，152：149-157，1992；Kay等人，Gene，128：59-65，1993；及PCT公布号WO 94/18318，1994年8月18日中描述了噬菌体展示库的实例。 
基于体外翻译的文库包括但不限于PCT公布号WO 91/05058，1991年4月18日；及Mattheakis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9022-9026，1994中所描述的。 
作为非肽文库的实例，苯并二氮杂草文库（参阅例如Bunin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：4708-4712，1994）可适应此用途。还可使用类肽文库（Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：9367-9371，1992）。Ostresh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：11138-11142，1994描述了可用文库的另一种实例，其中肽的酰胺官能度已经permethylated以产生化学转化的组合库。 
可用于本发明的非肽文库的种类极多。例如，Ecker和Crooke，Bio/Technology，13：351-360，1995在构成各种文库基础的化学种类中列出了苯并二氮杂草、乙内酰脲、哌嗪二酮、联苯、糖类似物、β-巯基酮、芳基乙酸、酰基哌啶、苯并吡喃、立方烷、黄嘌呤、胺化酰亚胺、和噁唑酮。 
非肽文库可粗略的分成两类：装饰单体和低聚物。装饰单体库采用相对简单的支架结构，在其上添加多种官能基。支架常常是具有已知有用药理学活性的分子。例如，支架可以是苯并二氮杂草结构。 
非肽低聚物文库利用大量的单体并将其组装到一起，根据单体的顺序产生新的形状。在已经采用的单体单位中有氨基甲酸酯、pyrrolinone、和吗啉 代。类肽，即其中侧链附着于α-氨基而非α-碳的肽样低聚物，构成了另一种形式的非肽低聚物文库的基础。最初的非肽低聚物文库利用单一类型的单体，因而含有重复的主链。最近的文库已经利用超过一种单体，使得文库的灵活性(flexibility)增加。 
筛选文库可通过普遍知道的多种方法来进行。参阅例如下列参考文献，它们公开了肽库的筛选：Parsley等人，Adv.Exp.Med.Biol.，251：215-218，1989；Scott等人，Science，249：386-390，1990；Fowlkes等人，BioTechniques，13：422-427，1992；Oldenburg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5393-5397，1992；Yu等人，Cell，76：933-945，1994；Staudt等人，Science，241：577-580，1988；Bock等人，Nature，355：564-566，1992；Tuerk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6988-6992，1992；Ellington等人，Nature，355：850-852，1992；美国专利号5,096,815、美国专利号5,223,409、和美国专利号5,198,346，都授予了Ladner等人；Rebar等人，Science，263：671-673，1993；及PCT公布号WO 94/18318。 
在一个具体实施方案中，为了鉴定结合本发明清蛋白融合蛋白的分子而进行的筛选可通过使文库成员接触固定在固相支持物上的本发明清蛋白融合蛋白并收获与清蛋白融合蛋白结合的那些文库成员来执行。例如Parmley等人，Gene，73：305-318，1988；Fowlkes等人，BioTechniques，13：422-427，1992；PCT公布号WO 94/18318；及其引用的参考文献中描述了称为“淘选”技术的这些筛选方法的实例 
在另一个实施方案中，用于在酵母中筛选相互作用蛋白质的双杂交系统（Fields等人，Nature，340：245-246，1989；Chien等人，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，88：9578-9582，1991）可用于鉴定特异结合本发明多肽的分子。 
当结合分子是多肽时，可由任何肽库方便的选择多肽，包括随机肽库、组合肽库、或偏爱肽库。术语“偏爱”在用于本文时指用于构建文库的方法在操作时对一项或多项参数施加了限制，而该参数决定了由此得到的分子（在这种情况中是肽）集合的多样性。 
由此，真正的随机肽库将产生这样的肽集合，即其中在肽的指定位置发现特定氨基酸的概率对于所有20种氨基酸是相同的。然而，通过指定例如每5个氨基酸出现一个赖氨酸或十肽库的位置4、8、和9固定为只包含精氨酸，可向文库中引入偏爱。显然，可设想许多类型的偏爱，而且本发明不限 于任何具体偏爱。此外，本发明设想了特定类型的肽库，诸如噬菌体展示肽库和采用包含λ噬菌体载体及DNA插入片段的DNA构建物的肽库。 
如上所述，在结合分子是多肽的情况中，多肽可具有约6个至少于约60个氨基酸残基，优选约6个至约10个氨基酸残基，且最优选约6个至约22个氨基酸。在另一个实施方案中，结合多肽具有15-100个氨基酸或20-50个氨基酸。 
选定的结合多肽可通过化学合成或重组表达来获得。 
其它活性
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在因多种疾病状况诸如血栓症、动脉硬化、和其它心血管状况引起的缺血组织中刺激新血管形成(re-vascularization)的治疗。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于刺激血管发生和肢体再生，正如上文所讨论的。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于治疗因伤害、烧伤、术后组织修复、和溃疡引起的创伤，因为它们促进不同起源的多种细胞的有丝分裂，诸如成纤维细胞和骨骼肌细胞，并由此促进受损或患病组织的修复或置换。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于刺激神经元生长，以及用于治疗和预防在某些神经元紊乱或神经变性状况中发生的神经元损伤，诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、和AIDS相关复合症。本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有刺激软骨细胞生长的能力，因此它们可用于增强骨和牙周再生，并在组织移植或骨移植中提供帮助。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于通过刺激角质形成细胞生长来预防因晒斑引起的皮肤衰老。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于预防掉毛(hair loss)。同样，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在联合其它细胞因子使用时可用于刺激造血细胞和骨髓细胞的生长和分化。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于在移植前维持器官或支持初生组织的细胞培养物。本发明的清蛋白 融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于在早期胚胎中诱导中胚层起源的组织进行分化。 
除上文讨论的造血谱系之外，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可提高或降低胚胎干细胞的分化或增殖。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于调控哺乳动物的特征，诸如身高、体重、毛色、眼睛颜色、皮肤、脂肪组织的比例、色素沉着、体型、和体形（如整容手术）。类似的，本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于调控哺乳动物的新陈代谢，影响分解代谢、合成代谢、能量的加工、利用和贮藏。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通过影响生物节律、心律、抑郁（包括抑郁症）、暴力倾向、疼痛耐受水平、生殖能力（优选通过激活素或抑制素样活性）、激素或内分泌水平、食欲、性欲、记忆力、压力、或其它认知质量来改变哺乳动物的精神状态或身体状态。 
本发明的清蛋白融合蛋白和/或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可作用食品添加剂或防腐剂，诸如用于提高或降低贮藏能力、脂肪含量、脂质、蛋白质、碳水化合物、微生物、矿物质、辐因子、或其它营养成分。 
上述应用可用于极其广泛的宿主。这些宿主包括但不限于人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、微型猪、鸡、山羊、牛、绵羊、犬、猫、非人灵长类、和人。在具体的实施方案中，宿主是小鼠、兔、山羊、豚鼠、鸡、大鼠、仓鼠、猪、绵羊、犬、或猫。在优选的实施方案中，宿主是哺乳动物。在最优选的实施方案中，宿主是人。 
在概括描述了本发明后，参考下面的实施例将更容易的理解本发明。这些实施例是作为例证提供的，而非意图作为限制。 
我们认为，在没有更多描述的条件下，凭借前述描述和下面的例示性实施例，本领域普通技术人员可生成和利用本发明中发现的改变，并实践所主张的方法。因此，下面的工作实施例具体指出了本发明的优选实施方案，而非解释为以任何方式限制公开书的其余部分。 
实施例
实施例1：pScNHSA和pScCHSA的产生 
载体pScNHSA（ATCC保藏号PTA-3279）和pScCHSA（ATCC保藏号PTA-3276）是pPPC0005（ATCC保藏号PTA-3278）的衍生物，并作为克隆载体用于插入编码治疗性蛋白质或其片段或变体的多核苷酸，与编码人血清清蛋白“HSA”的多核苷酸邻接且在同一翻译框中。pScCHSA可用于产生治疗性蛋白质-HSA融合物，而pScNHSA可用于产生HSA-治疗性蛋白质融合物。 
pScCHSA的产生：清蛋白部分位于治疗性部分C-末端的清蛋白融合物
通过改变pPPC0005中编码嵌合HSA信号肽的核酸序列以包括Xho I和Cla I限制性位点来制备便于将编码治疗性蛋白质的DNA克隆到编码成熟清蛋白蛋白质的DNA的N-末端的载体。 
第一步，通过用Xho I和Cla I消化pPPC0005除去pPPC0005固有的XhoI和Cla I位点（位于ADH1终止子序列的3’端），用T4DNA聚合酶补平粘端，并重新连接平端以产生pPPC0006。 
第二步，使用两轮PCR将Xho I和Cla I限制性位点加入pPPC006中编码HSA信号肽的核酸序列（HSA前导序列与来自交配因子α“MAF”的kex2位点的嵌合体）中。在第一轮PCR中，用SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示引物进行扩增。序列如SEQ ID NO：36所示的引物包含编码部分HSA信号肽序列、来自交配因子α前导序列的kex2位点和部分HSA成熟形式的氨基末端的核酸序列。序列中中引入了四个点突变，产生在嵌合信号肽和HSA成熟形式的连接处发现的Xho I和Cla I位点。这四个突变在如下所示序列中标有下划线。在pPPC0005中，这四个位置的核苷酸从5’到3’为T、G、T和G。 
5′-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGATTTGGG-3′（SEQ ID NO：36）和5′-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAATAAGC-3′（SEQ ID NO：37）。然后用上游侧翼引物，5′-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3′（SEQ ID NO：38）和下游侧翼引物5′-CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT-3′（SEQ ID NO：39）进行第二轮PCR。然后纯化如此产生的PCR产物，用Afl II和Xba I消化，并连接到pPPC0006的相同位点中以产生pScCHSA。如此产生的质粒具有引入到信号序列中的Xho I和Cla I位点。Xho I位点的存在在信号序列的末端中产 生了单个氨基酸改变即从LDKR到LEKR。在将具有5’Sal I位点（它与Xho I位点相容）和3’Cla I位点、包含编码清蛋白融合蛋白治疗性部分的多核苷酸的核酸序列连接到pScCHSA的Xho I和Cla I位点中后，D到E的改变将不会存在于最终的清蛋白融合蛋白表达质粒中。Sal I到Xho I的连接恢复了信号肽序列的原始氨基酸序列。编码清蛋白融合蛋白治疗性部分的DNA可插入到Kex2位点之后（Kex2在信号肽末端的二碱性氨基酸序列KR之后进行切割）和Cla I位点之前。 
pScNHSA的产生：清蛋白部分位于治疗性部分N-末端的清蛋白融合物
通过向pScCHSA中添加三个八碱基对限制性位点来制备便于将编码治疗性蛋白质部分的DNA克隆到编码成熟清蛋白蛋白质的DNA的C-末端的载体。将Asc I、Fse I和Pme I限制性位点添加到编码成熟HSA蛋白质的核酸序列末端的Bsu36 I和Hind III位点之间。这是通过使用含有下划线标示的Asc I、Fse I和Pme I限制性位点的两个互补合成引物（SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41）实现的。 
5′-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCTTAATTCT-3′（SEQ ID NO：40）和5′-AGAATTAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3′（SEQ ID NO：41）。将这些引物退火，用Bsu36I和Hind III消化，并连接到pScCHSA的相同位点中以产生pScNHSA。 
实施例2：用于酵母转化的一般构建物的产生 
载体pScNHSA和pScCHSA可作为克隆载体用于插入编码治疗性蛋白质或其片段或变体的多核苷酸，与编码成熟人血清清蛋白“HSA”的多核苷酸邻接。pScCHSA用于产生治疗性蛋白质-HSA融合物，而pScNHSA可以用于产生HSA-治疗性蛋白质融合物。 
包含HSA-治疗性蛋白质融合产物的清蛋白融合构建物的产生
编码治疗性蛋白质的DNA（如SEQ ID NO：X所示的或本领域已知的序列）可以使用便于产生融合构建物的引物（例如通过添加限制性位点、编码无缝融合物、编码接头序列等）进行PCR扩增。例如，本领域技术人员能够设计将编码HSA成熟形式的最后四个氨基酸（和含有Bsu36I位点）的多核苷酸到添加到编码治疗性蛋白质的DNA的5’端的5’引物；以及将终止 密码子和合适克隆位点添加到治疗性蛋白质编码序列的3’端的3’引物。例如，用于扩增编码治疗性蛋白质的DNA的正向引物可具有序列，5′-aagctGCCTTAGGCTTA(N)15-3’（SEQ ID NO：42），其中下划线序列是Bsu36I位点，大写的核苷酸编码成熟HSA蛋白质的最后四个氨基酸（ALGL），而(N)15与编码目的治疗性蛋白质的最先15个核苷酸相同。类似的，用于扩增编码治疗性蛋白质的DNA的反向引物可具有序列，5′-GCGCGC 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285802481
(N)15-3′（SEQ ID NO：43），其中斜体序列是Pme I位点，双下划线序列是Fse I位点，单下划线序列是Asc I位点，方框核苷酸是两个串联终止密码子的反向互补序列，而(N)15与编码目的治疗性蛋白质的最后15个核苷酸的反向互补序列相同。一旦扩增得到PCR产物，它可以用Bsu36I和（Asc I、Fse I或Pme I）之一进行切割，并连接到pScNHSA中。 
HSA嵌合前导序列中Xho I位点的存在在嵌合信号序列，即HSA-kex2信号序列的末端中产生了单个氨基酸改变，从LDKR（SEQ ID NO：44）到LEKR（SEQ ID NO：45）。 
包含基因-HSA融合产物的清蛋白融合构建物的产生
与上文所述方法类似，编码治疗性蛋白质的DNA可以使用下列引物进行PCR扩增：将含有SalI位点且编码HSA前导序列最后三个氨基酸DKR的多核苷酸添加到编码治疗性蛋白质的DNA的5′端的5′引物；和将含有ClaI位点、编码成熟HSA最初几个氨基酸的多核苷酸添加到编码治疗性蛋白质的DNA的3′端的3′引物。例如，用于扩增编码治疗性蛋白质的DNA的正向引物可具有序列，5′-aggagcgtcGACAAAAGA(N)15-3′（SEQ ID NO：46），其中下划线序列是Sal I位点，大写核苷酸编码HSA前导序列的最后三个氨基酸（DKR），而(N)15与编码目的治疗性蛋白质的最先15个核苷酸相同。类似的，用于扩增编码治疗性蛋白质的DNA的反向引物可具有序列，5′-CTTTAA 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285802482
(N)15-3′（SEQ ID NO：47），其中斜体序列是Cla I位点，下划线核苷酸是编码HSA成熟形式的最初9个氨基酸（DAHKSEVAH，SEQ ID NO：48）的DNA的反向互补序列，而(N)15与编码目的治疗性蛋白质的最后15个核苷酸的反向互补序列相同。一旦扩增得到PCR产物，它可以用Sal I和Cla I进行切割，并连接到经Xho I和Cla I消化的pScCHSA中。可能需要不同的信号或前导序列，例 如可通过本领域已知的标准方法将转化酶“INV”（Swiss-Prot Accession P00724）、交配因子α“MAF”（Genbank Accession AAA18405）、MPIF（Geneseq AAF82936）、纤蛋白B（Swiss-Prot Accession P23142）、簇蛋白（Swiss-Prot Accession P10909）、胰岛素样生长因子结合蛋白4（Swiss-Prot Accession P22692）和HSA前导序列的变换(permutation)亚克隆到合适载体中。 
适合在酿酒酵母中表达的清蛋白融合构建物的产生
从pScNHSA或pScCHSA产生含有编码N端或C端清蛋白融合蛋白的DNA的Not I片段，然后可克隆到具有LEU2选择标记的pSAC35的Not I位点中。接着将如此产生的载体用于酿酒酵母表达系统的转化。 
实施例3：酿酒酵母中的一般表达 
与酵母表达相容的表达载体可通过醋酸锂转化、电穿孔或本领域已知的和/或Sambrook、Fritsch和Maniatis，1989，《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》，第2版，卷1-3及Ausubel等人，2000，Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School，《Current Protocols in Molecular Biology》，卷1-4中描述的其它方法转化到酿酒酵母中。表达载体通过转化导入酿酒酵母菌株DXY1、D88或BXP10中，个别转化体可例如于30℃在10ml YEPD（1%w/v酵母提取物、2%w/v蛋白胨、2%w/v葡萄糖）中培养3天，并在培养60个小时后于稳定期收集细胞。通过将细胞以3000g离心10分钟来收集上清液。 
除LEU2选择标记以外，pSAC35（Sleep等人，1990，Biotechnology 8：42及参见图3）包含提供复制功能的整个酵母2μm质粒、PRB1启动子和ADH1终止信号。 
实施例4：酿酒酵母中由清蛋白融合物表达的清蛋白融合蛋白的一般纯化 
在优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白包含融合于治疗性蛋白质的成熟形式或其部分（例如表1中列出的治疗性蛋白质的成熟形式，或表2中以SEQ ID NO：Z显示的治疗性蛋白质的成熟形式）的N-或C-端的HSA的成熟形式。在本发明的一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白还包含在用于表达的宿主的分泌途径中指导初生融合多肽的信号序列。在优选的实施方案中，由信号序列编码的信号肽遭到切除，而成熟的清蛋白融合蛋白直 接分泌到培养基中。本发明的清蛋白融合蛋白优选包含异源信号序列（例如特定治疗性蛋白质的非天然信号序列），包括但不限于MAF、INV、Ig、纤蛋白B、簇蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白4、包括但不限于嵌合HSA/MAF前导序列的变体HSA前导序列、或本领域已知的其它异源信号序列。尤其优选表2中列出的那些信号序列和/或上文说明书“融合蛋白的表达”和/或“重组和合成生产清蛋白融合蛋白的其它方法”部分中列出的信号序列。在优选的实施方案中，本发明的融合蛋白还包含N端甲硫氨酸残基。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸，包括片段和/或变体。 
如上所述在酵母中表达的清蛋白融合蛋白能够如下在Dyax肽亲和柱上进行小规模纯化。来自表达清蛋白融合蛋白的酵母的上清液用3mM磷酸盐缓冲液pH 6.2、20mM NaCl和0.01%Tween 20渗率以减小体积和清除色素。然后使溶液通过0.22μm装置过滤。将滤出液加载到Dyax肽亲和柱上。用100mM Tris/HCl pH 8.2缓冲液对柱进行洗脱。收集含有蛋白质的峰级分，并在浓缩5倍后在SDS-PAGE上进行分析。 
对于大规模纯化，可以使用下述方法。将超过2升的上清液在20mM Tris/HCl pH8.0中渗率并浓缩至500ml。将浓缩的蛋白质溶液加载到经过预平衡的50ml DEAE-Sepharose Fast Flow柱上，洗柱，并用20mM Tris/HCl pH8.0中从0到0.4M NaCl的线性梯度NaCl洗脱蛋白质。合并含有蛋白质的级分，用0.5M磷酸钠（NaH2PO4）调至pH6.8。向蛋白质溶液中加入终浓度0.9M的(NH4)2SO4，并将整个溶液加载到经过预平衡的50ml Butyl650S柱上。用线性梯度的硫酸铵（0.9到0M的(NH4)2SO4）洗脱蛋白质。再次合并含有清蛋白融合物的级分，用10mM Na2HPO4/柠檬酸缓冲液pH5.75进行渗率，并加载到50ml经过预平衡的SP-Sepharose Fast Flow柱上。用0到0.5M的NaCl线性梯度洗脱蛋白质。合并含有目的蛋白质的级分，用Amicon浓缩器将缓冲液换成10mM Na2HPO4/柠檬酸pH6.25，电导率<2.5mS/cm。将此蛋白质溶液加载到15ml经过预平衡的Q-Sepharose高效柱上，洗柱，并用从0到0.15M NaCl的NaCl线性梯度洗脱蛋白质。然后可通过缓冲液转换将纯化的蛋白质配制成特定缓冲液组合物。 
实施例5：用于哺乳动物细胞转染的一般构建物的产生 
适合在哺乳动物细胞系中表达的清蛋白融合构建物的产生
可在用于哺乳动物细胞培养系统的表达载体中产生清蛋白融合构建物。可通过本领域已知的标准方法（例如PCR扩增、限制性消化和连接）将编码治疗性蛋白质的DNA克隆到哺乳动物表达载体中HSA的N端或C端。一旦构建了表达载体，可进行对哺乳动物表达系统的转染。合适的载体是本领域已知的，包括但不限于例如pC4载体和/或可从Lonza Biologics,Inc.（Portsmouth，NH）购得的载体。 
编码人血清清蛋白的DNA已经克隆到适于哺乳动物培养系统的pC4载体中，产生质粒pC4:HSA（ATCC保藏号PTA-3277）。此载体具有二氢叶酸还原酶，“DHFR”基因，容许在存在甲氨蝶呤时进行选择。 
pC4:HSA载体适于在CHO细胞中表达清蛋白融合蛋白。为了在其它哺乳动物细胞培养系统中进行表达，可能希望将包含编码清蛋白融合蛋白的DNA或由其组成的片段亚克隆到候选表达载体中。例如，可将包含编码成熟清蛋白融合蛋白的DNA或由其组成的片段亚克隆到另一种表达载体中，包括但不限于本文描述的任何哺乳动物表达载体。 
在优选的实施方案中，通过本领域已知的程序将编码清蛋白融合构建物的DNA亚克隆到由Lonza Biologics,Inc.（Portsmouth，NH）提供的载体中，用于NSO细胞中的表达。 
包含HSA-治疗性蛋白质融合产物的清蛋白融合构建物的产生
使用pC4:HSA（ATCC保藏号PTA-3277），可产生其中治疗性蛋白质部分位于成熟清蛋白序列C端的清蛋白融合构建物。例如，可将编码治疗性蛋白质或其片段或变体的DNA克隆到载体的Bsu 36I和Asc I限制性位点之间。在克隆到Bsu 36I和Asc I中时，可以采用为了克隆到酵母载体系统中而设计的相同引物（SEQ ID NO：42和43）（见实施例2）。 
包含基因-HSA融合产物的清蛋白融合构建物的产生
使用pC4:HSA（ATCC保藏号PTA-3277），可产生其中治疗性蛋白质部分克隆到成熟清蛋白序列N端的清蛋白融合构建物。例如，可将编码具有自己的信号序列的治疗性蛋白质的DNA克隆到pC4:HSA的Bam HI（或Hind III）和Cla I位点之间。在克隆到Bam HI或Hind III位点中时，优选在编码治疗性蛋白质的DNA的翻译起始密码子之前包含Kozak序列（CCGCCACCATG，SEQID NO：49）。如果治疗性蛋白质没有信号序列，那么可将编码该治疗性蛋白质的DNA克隆到pC4:HSA的Xho I和Cla I位 点之间。在使用Xho I位点时，可以使用下列5′（SEQ ID NO：50）和3′（SEQ ID NO：51）示例性PCR引物： 
5′-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)18-3′（SEQ ID NO：50） 
5′-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)18-3′（SEQ ID NO：51） 
在5′引物（SEQ ID NO：50）中，下划线序列是Xho I位点；且Xho I位点和Xho I位点后的DNA编码天然人血清清蛋白前导序列的最后七个氨基酸。在SEQ ID NO：50中，“(N)18”与编码目的治疗性蛋白质的最先18个核苷酸相同。在3′引物（SEQ ID NO：51）中，下划线序列是Cla I位点；且Cla I位点和其后的DNA是编码成熟HSA蛋白质（SEQ ID NO：1）最先10个氨基酸的DNA的反向互补序列。在SEQ ID NO：51中，“(N)18”是编码目的治疗性蛋白质的DNA的最后18个核苷酸的反向互补序列。使用这两个引物，可PCR扩增目的治疗性蛋白质，纯化PCR产物，用Xho I和Cla I限制酶消化它，并将它克隆到pC4:HSA载体的Xho I和Cla I位点中。 
如果需要候选前导序列，那么可通过本领域已知的标准方法将天然清蛋白前导序列替换成嵌合清蛋白前导序列，即HSA-kex2信号肽，或其它可选的前导序列。（例如，本领域技术人员能够常规PCR扩增替换用前导序列并将PCR产物亚克隆到清蛋白融合构建物中以代替清蛋白前导序列，同时保持读码框）。 
实施例6：哺乳动物细胞系中的一般表达 
可通过磷酸钙沉淀、脂转染胺试剂、电穿孔、或本领域已知的和/或Sambrook、Fritsch和Maniatis，1989，《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》，第2版及在Ausubel等人，2000，Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School，《Current Protocols in Molecular Biology》，卷1-4中描述的其它转染方法将在适于在哺乳动物细胞系中表达的表达载体中产生的清蛋白融合构建物转染到合适细胞系中。然后通过由表达载体中的选择标记决定的选择剂的存在来选择转染细胞。 
pC4表达载体（ATCC Accession No.209646）是质粒pSV2-DHFR（ATCC Accession No.37146）的衍生物。pC4含有劳氏肉瘤病毒的强启动子长末端重复序列“LTR”（Cullen等人，March 1985，Molecular and Cellular Biology， 438-447）和细胞巨化病毒“CMV”增强子的片段（Boshart等人，1985，Cell 41：521-530）。该载体还含有大鼠前胰岛素原基因的3’内含子、多聚腺苷酸化和终止信号，以及在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。将中国仓鼠卵巢“CHO”细胞或缺乏活性DHFR基因的其它细胞系用于转染。通过本领域已知的方法将pC4中的清蛋白融合构建物转染到CHO细胞中将容许在CHO细胞中表达清蛋白融合蛋白，随后切除前导序列，并分泌到上清液中。然后由上清液进一步纯化清蛋白融合蛋白。 
pEE12.1表达载体由Lonza Biologics,Inc.（Portsmouth，NH）提供，它是pEE6（Stephens和Cockett，1989，Nucl.Acids Res.17：7110）的衍生物。此载体包含人细胞巨化病毒主要即刻早期基因“hCMV-MIE”的启动子、增强子和完整的5’非翻译区（国际公开号WO89/01036），目的序列的上游区，以及谷氨酰胺合成酶基因（Murphy等人，1991，Biochem J.227：277-279；Bebbington等人，1992，Bio/Technology 10：169-175；美国专利US 5,122,464），其目的是在选择性的含硫代甲硫氨酸(methionine sulphoximine)的培养基中选择转染细胞。通过本领域已知的方法将在pEE12.1中产生的清蛋白融合构建物转染到NSO细胞（国际公开号WO86/05807）中容许在NSO细胞中表达清蛋白融合蛋白，随后切除前导序列，并分泌到上清液中。然后可使用本文描述的或本领域其它途径知道的技术由上清液进一步纯化清蛋白融合蛋白。 
清蛋白融合蛋白的表达可通过例如SDS-PAGE和Western印迹、反相HPLC分析、或本领域已知的其它方法进行分析。 
通过本领域已知的方法（例如脂转染胺试剂转染）产生并选择经清蛋白融合构建物转染的稳定CHO和NSO细胞系，例如用100nM甲氨蝶呤选择具有二氢叶酸还原酶“DHFR”基因作为选择标记的载体或者通过缺乏谷氨酰胺时的培养。表达水平可以通过例如免疫印迹来检验，首选以抗HSA血清作为一抗，或者次选以含有针对给定清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的抗体的血清作为一抗。 
以抗HSA血清为一抗，通过免疫印迹来检验表达水平。具体生产率通过ELISA来测定，其中捕获抗体可以是针对清蛋白融合物的治疗性蛋白质部分的单克隆抗体，而检测抗体可以是单克隆抗HSA生物素化抗体（或反之亦然），随后根据制造商的方案结合辣根过氧化物酶/链霉亲和素并进行分析。 
实施例7：清蛋白融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达 
可在哺乳动物细胞中表达本发明的清蛋白融合蛋白。典型的哺乳动物表达载体含有介导mRNA转录起始的启动子元件、蛋白质编码序列、和转录终止及转录物多聚腺苷酸化所需要的信号。其它元件包括增强子、Kozak序列和侧翼为RNA剪接供体和受体位点的间插序列。用来自SV40的早期和晚期启动子，来自逆转录病毒如RSV、HTLVI、HIVI的长末端重复序列（LTR），以及来自细胞巨化病毒（CMV）的早期启动子实现了高效转录。然而，也可以使用细胞元件（例如人肌动蛋白启动子）。 
适用于实行本发明的表达载体包括例如诸如下列载体，pSVL和pMSG（Pharmacia，Uppsala，Sweden）、pRSVcat（ATCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、pBC12MI（ATCC 67109）、pCMVSport 2.0和pCMVSport 3.0。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括但不限于人Hela、293、H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1、Cos 7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。 
或者，可以在含有整合到染色体中的编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸的稳定细胞系中表达清蛋白融合蛋白。与选择标记诸如DHFR、gpt、新霉素或潮霉素的共转染容许鉴定和分离转染细胞。 
还可以扩增编码融合蛋白的转染多核苷酸以表达大量的所编码融合蛋白。DHFR（二氢叶酸还原酶）标记可用于建立携带几百或甚至几千个拷贝的目的基因的细胞系（参见例如Alt等人，J.Biol.Chem.253：1357-1370，1978；Hamlin等人，Biochem.et Biophys.Acta 1097：107-143，1990；Page等人，Biotechnology 9：64-68，1991）。另一种有用的选择标记是酶谷氨酰胺合成酶（GS）（Murphy等人，Biochem J.227：277-279，1991；Bebbington等人，Bio/Technology 10：169-175，1992）。使用这些标记，在选择性培养基中培养哺乳动物细胞并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体中的扩增基因。中国仓鼠卵巢（CHO）和NSO细胞常用于蛋白质的生产。 
质粒pSV2-dhfr（ATCC Accession No.37146）的衍生物，表达载体pC4（ATCC Accession No.209646）和pC6（ATCC Accession No.209647）含有劳氏肉瘤病毒的强启动子（LTR）（Cullen等人，Molecular and Cellular Biology，438-447，March，1985）加上CMV增强子的片段（Boshart等人， Cell 41：521-530，1985）。多克隆位点，例如具有限制性酶切位点BamHI、XbaI和Asp718，便于目的基因的克隆。载体还含有大鼠前胰岛素原基因的3’内含子、多聚腺苷酸化和终止信号，以及在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。 
具体的说，例如用合适的限制酶消化质粒pC6，然后通过本领域已知程序使用小牛肠磷酸酶去磷酸化。然后从1%琼脂糖凝胶分离载体。 
使用本领域已知的技术产生编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸，并使用本领域已知的PCR技术扩增此多核苷酸。如果使用天然存在的信号序列来生产本发明的融合蛋白，那么载体不需要第二种信号肽。或者，如果不使用天然存在的信号序列，那么载体可进行修饰以包括异源信号序列（参见例如国际公开号WO96/34891）。 
使用商品化试剂盒（″Geneclean″，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）从1%琼脂糖凝胶分离编码本发明融合蛋白的扩增片段。然后用合适的限制酶消化该片段，并再次在1%琼脂糖凝胶上纯化。 
然后用相同的限制酶消化编码本发明清蛋白融合蛋白的扩增片段，并在1%琼脂糖凝胶上纯化。接着用T4DNA连接酶连接分离的片段和去磷酸化的载体。随后转化大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞，并通过例如限制酶分析来鉴定含有插入质粒pC6中的片段的细菌。 
将缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。使用脂转染试剂（Felgner等人，同上）将5μg表达质粒pC6或pC4与0.5μg质粒pSVneo共转染。质粒pSV2-neo含有显性选择标记，来自Tn5、编码赋予针对包括G418在内的一组抗生素的抗性的酶的neo基因。将细胞接种到补充1mg/mlG418的α-MEM中。两天后，将细胞用胰蛋白酶消化并接种到杂交瘤克隆平皿（Greiner，Germany）中补充10、25或50ng/ml氨甲喋呤加1mg/ml G418的α-MEM中。约10-14天后，将单个克隆用胰蛋白酶消化，然后接种到使用不同浓度甲氨蝶呤（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）的6孔皮氏培养皿或10ml烧瓶中。随后将在最高浓度甲氨蝶呤中生长的克隆转移到新的、含有甚至更高浓度甲氨蝶呤（1μM、2μM、5μM、10mM、20mM）的6孔平皿中。重复相同程序，直到获得在100-200μM浓度中生长的克隆。通过例如SDS-PAGE和Western印迹或通过反相HPLC分析对期望融合蛋白的表达进行分析。 
实施例8：哺乳动物细胞系中从清蛋白融合构建物表达的清蛋白融合蛋白的一般纯化 
在优选的实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白包含融合于治疗性蛋白质的成熟形式或其部分（例如表1中列出的治疗性蛋白质的成熟形式，或表2中以SEQ ID NO：Z显示的治疗性蛋白质的成熟形式）的N-端或C-端的HSA的成熟形式。在本发明的一个实施方案中，本发明的清蛋白融合蛋白还包含在用于表达的宿主的分泌途径中指导初生融合多肽的信号序列。在优选的实施方案中，由信号序列编码的信号肽遭到切除，而成熟的清蛋白融合蛋白直接分泌到培养基中。本发明的清蛋白融合蛋白优选包含异源信号序列（例如特定治疗性蛋白质的非天然信号序列），包括但不限于MAF、INV、Ig、纤蛋白B、簇蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白4、包括但不限于嵌合HSA/MAF前导序列的变体HSA前导序列、或本领域已知的其它异源信号序列。尤其优选表2中列出的那些信号序列和/或上文说明书“融合蛋白的表达”和/或“重组和合成生产清蛋白融合蛋白的其它方法”部分中列出的信号序列。在优选的实施方案中，本发明的融合蛋白还包含N端甲硫氨酸残基。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸，包括片段和/或变体。 
根据所使用的表达系统采用不同的方案由哺乳动物细胞系上清液纯化清蛋白融合蛋白。 
从CHO和293T细胞系纯化
由CHO细胞上清液或瞬时转染的293T细胞上清液纯化清蛋白融合蛋白可以包括首先使用磷酸钠缓冲液用阴离子HQ树脂进行捕获，并用磷酸盐梯度洗脱，随后在Blue Sepharose FF柱上进行亲和层析，使用盐梯度洗脱。Blue Sepharose FF除去主要的BSA/胎球蛋白污染物。采用磷酸盐梯度在Poros PI 50树脂上进行的进一步纯化可除去和降低内毒素污染物并浓缩清蛋白融合蛋白。 
从NSO细胞系纯化
由NSO细胞上清液纯化清蛋白融合蛋白可以包括Q-Sepharose阴离子交换层析，随后是分步洗脱的SP-sepharose纯化，然后是分步洗脱的Phenyl-650M纯化，和最后的渗率。 
然后可通过缓冲液转换配制纯化的蛋白质。 
实施例9：清蛋白融合蛋白的细菌表达 
使用与DNA序列的5’和3’末端对应的PCR寡核苷酸引物扩增包含细菌信号序列、编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸，以合成插入片段。为了将扩增产物克隆到表达载体中，用于扩增编码插入片段的多核苷酸的引物优选在引物的5’端含有限制性位点，诸如BamHI和XbaI。例如，BamHI和XbaI对应于细菌表达载体pQE-9（Qiagen,Inc.，Chatsworth，CA）上的限制酶位点。此质粒载体编码抗生素抗性（Ampr）、细菌复制起点（ori）、IPTG可调控启动子/操纵子（P/O）、核糖体结合位点（RBS）、六组氨酸标签（6-His）和限制酶克隆位点。 
用BamHI和XbaI消化pQE-9载体，并将扩增片段连接到pQE-9载体中，保持起始于细菌RBS的读码框。然后将连接混合液用于转化大肠杆菌菌株M15/rep4（Qiagen,Inc.），它含有多拷贝的质粒pREP4，后者表达lacI抑制子并赋予卡那霉素抗性（Kanr）。通过其在LB平皿上生长的能力来鉴定转化体，并选择氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并通过限制性分析确认。 
将含有期望构建物的克隆在补充Amp（100μg/ml）和Kan（25μg/ml）的LB培养基中以液体培养方式培养过夜（O/N）。将O/N培养物用于以1:100到1:250的比例接种大培养物。将细胞培养到光密度600（O.D.600）在0.4和0.6之间。随后加入IPTG（异丙基-B-D-硫代半乳糖苷）到1mM的终浓度。IPTG通过灭活lacI抑制子来诱导P/O的清除，导致基因表达升高。 
将细胞再培养3-4个小时。然后通过离心（6000Xg，20分钟）收集细胞。通过于4℃搅动3-4个小时将细胞沉淀物溶于离液剂6M胍-HCl或优选的8M尿素和浓度超过0.14M的2-巯基乙醇中（参见例如Burton等人，Eur.J.Biochem.179：379-387，1989）。通过离心除去细胞碎片，并将含有多肽的上清液加载到镍-次氮基三乙酸（“Ni-NTA”）亲和树脂柱（可从QIAGEN,Inc.获得，同上）上。具有6xHis标签的蛋白质以高亲和力结合Ni-NTA树脂，并能够在简单的一步程序中纯化（详情参见：The QIAexpressionist，1995，QIAGEN,Inc.，同上）。 
简要的说，将上清液加载到6M胍-HCl pH8中的柱上。柱首先用10倍体积的6M胍-HCl pH8清洗，然后用10倍体积的6M胍-HCl pH6清洗，最后用6M胍-HCl pH5洗脱多肽。 
随后通过将其对磷酸盐缓冲盐水（PBS）或50mM醋酸钠pH6缓冲液加200mM NaCl透析来使纯化的蛋白质复性。或者，可在固定在Ni-NTA柱上时使蛋白质成功的重折叠。例示性条件如下：复性使用500mM NaCl、20%甘油、20mM Tris/HCl pH7.4中的线性6M-1M尿素梯度，其中含有蛋白酶抑制物。复性应当进行1.5个小时或更长的时间。复性后，通过加入250mM咪唑来洗脱蛋白质。通过最后对PBS或50mM醋酸钠pH6缓冲液加200mMNaCl的透析步骤除去咪唑。将纯化的蛋白质贮存于4℃或冻存于-80℃。 
除上述表达载体外，本发明还包括称为pHE4a的表达载体（ATCCAccession Number 209645，于1998年2月25日保藏），它含有与编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可操作连接的噬菌体操纵基因和启动子元件，称为pHE4a（ATCC Accession Number 209645，于1998年2月25日保藏）。此载体含有：1）作为选择标记的新霉素磷酸转移酶基因，2）大肠杆菌复制起点，3）T5噬菌体启动子序列，4）两个lac操纵基因序列，5）Shine-Delgarno序列，和6）乳糖操纵子阻抑物基因（lacIq）。复制起点（oriC）衍生自pUC19（LTI，Gaithersburg，MD）。启动子和操纵子序列是人工合成的。 
可如下将DNA插入到pHE4a中，即用NdeI和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718限制性消化载体，将限制性酶切产物在凝胶上电泳，并分离较大片段（填充片段应当是约310个碱基对）。依照本文描述的或本领域其它途径知道的PCR方案使用具有NdeI（5′引物）和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718（3′引物）的限制性位点的PCR引物产生DNA插入物。将PCR插入物凝胶纯化，并用相容酶进行限制性消化。依照标准方案连接插入物和载体。 
可替换上述方案中的改造载体以在细菌系统中表达蛋白质。 
实施例10：从保藏的样品分离选定的cDNA克隆 
如表3所示，本发明的许多清蛋白融合构建物由ATCC保藏。清蛋白融合构建物可包含任意一种下列表达载体：酿酒酵母表达载体pSAC35、哺乳动物表达载体pC4、或哺乳动物表达载体pEE12.1。 
pSAC35（Sleep等人，1990，Biotechnology 8：42）、pC4（ATCC AccessionNo.209646；Cullen等人，Molecular and Cellular Biology，438-447，1985；Boshart等人，Cell 41：521-530，1985）和pEE12.1（Lonza Biologies,Inc.；Stephens和Cockett，Nucl.Acids Res.17：7110，1989；国际公开号 WO89/01036；Murphy等人，Biochem J.227：277-279，1991；Bebbington等人，Bio/Technology 10：169-175，1992；美国专利US 5,122,464；国际公开号WO86/05807）载体包含氨苄青霉素抗性基因以在细菌细胞中培养。可使用本领域描述的技术，诸如Hanahan，涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Broth琼脂平板上，并于37℃培养过夜，将这些载体和/或包含它们的清蛋白融合构建物转化到大肠杆菌菌株中，诸如Stratagene XL-1 Blue（Stratagene Cloning Systems,Inc.，11011 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA，92037)。 
表3中引用的ATCC保藏号所指定的样品中的保藏材料还可含有一种或多种额外的清蛋白融合构建物，每种编码不同的清蛋白融合蛋白。因此，共用同一个ATCC保藏号的保藏物含有至少一种表3相应行中确定的清蛋白融合构建物。 
有两种方法可用于从表3中为特定清蛋白融合构建物引用的质粒DNA的保藏样品分离该清蛋白融合构建物。 
方法1：筛选
首先，可直接分离清蛋白融合构建物，即使用本领域已知的方法使用与表1中个别构建物ID编号的SEQ ID NO：X对应的多核苷酸探针筛选保藏的质粒DNA样品。例如，可以使用Applied Biosystems DNA合成仪根据报道的序列合成具有30-40个核苷酸的特异多核苷酸。寡核苷酸可依照常规方法例如使用T4多核苷酸激酶用32P-γ-ATP进行标记并进行纯化（例如Maniatis等人，《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring，NY，1982）。使用本领域技术人员已知的技术，诸如由载体供应商或在上文引用的相关出版物或专利中提供的技术，将来自指定ATCC保藏物的清蛋白融合构建物转化到上文所述的合适宿主（诸如XL-1 Blue，Stratagene）中。将转化体以每个平皿约150个转化体（菌落）的密度涂布到1.5%琼脂平板（含有合适的选择剂，例如氨苄青霉素）上。依照细菌菌落筛选的常规方法（例如Sambrook等人，《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》，第2版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，pp 1.93-1.104）或本领域技术人员已知的其它技术使用尼龙膜筛选这些平板。 
方法2：PCR
或者，编码指定清蛋白融合蛋白的DNA可以从具有SEQ ID NO：X的 保藏的清蛋白融合构建物的样品中扩增，例如使用在保藏的清蛋白融合构建物的5′和3′与编码指定清蛋白融合蛋白的DNA发生杂交的17-20个核苷酸的两种引物。聚合酶链式反应在常规条件下进行，例如在含有0.5μg上述cDNA模板的25μl反应混合液中。方便的反应混合液是1.5-5mM MgCl2，0.01%(w/v)明胶，dATP、dCTP、dGTP、dTTP每种20μM，引物每种25pmol，及0.25个单位的Taq聚合酶。用Perkin-Elmer Cetus自动热循环仪进行35个PCR循环（94℃变性1分钟；55℃退火1分钟；72℃延长1分钟）。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，切下具有预期分子量的DNA条带并纯化。通过对DNA产物的亚克隆和测序证实该PCR产物是选定的序列。 
有几种方法可用于鉴定保藏克隆中可能不存在的基因的5′或3′非编码部分。这些方法包括但不限于滤膜探查(filter probing)、使用特异探针的克隆富集、以及与本领域已知的5′和3′“RACE”方案类似或等同的方案。例如，有一种与5′RACE类似的方法可用于产生期望全长转录物的缺失5’末端（Fromont-Racine等人，Nucleic Acids Res.21(7)：1683-1684，1993）。 
简要的说，将特定的RNA寡核苷酸连接到可能含有全长基因RNA转录物的RNA群体的5’末端。将含有对所连接RNA寡核苷酸特异的引物和对目的基因的已知序列特异的引物的引物组用于PCR扩增期望全长基因的5’部分。然后可对此扩增产物测序，并用于产生全长基因。 
此上述方法从预期来源分离的总RNA开始，但是也可使用polyA+RNA。如果需要，随后可以用磷酸酶处理RNA制备物以除去降解的或受损的RNA上的5’磷酸基团，它们可能会影响后面的RNA连接酶步骤。然后应当灭活磷酸酶，并用烟草酸性焦磷酸酶处理RNA以去除位于信使RNA 5’端的帽结构。此反应在切除帽的RNA的5’末端留下5’磷酸基团，它随后可使用T4RNA连接酶与RNA寡核苷酸连接。 
将此经修饰RNA制备物作为模板，使用基因特异的寡核苷酸合成第一条cDNA链。将第一条链合成反应作为模板，使用对所连接RNA寡核苷酸特异的引物和对目的基因的已知序列特异的引物PCR扩增期望的5’末端。然后对如此产生的产物测序和分析以证实该5’端序列属于预期基因。 
实施例11：多融合(Multifusion)融合物 
清蛋白融合蛋白（例如含有与清蛋白（或其片段或变体）融合的治疗性 蛋白质（或其片段或变体））可与其它蛋白质额外融合以产生“多融合蛋白”。这些多融合蛋白可用于广泛的应用。例如，本发明的清蛋白融合蛋白与His标签、HA标签、蛋白A、IgG结构域和麦芽糖结合蛋白的融合将有助于纯化（见例如EP A 394,827；Traunecker等人，Nature 331：84-86，1988）。与本发明多肽融合的核定位信号能够将蛋白质靶向特定亚细胞定位，而共价杂二聚体或同二聚体能够提高或降低清蛋白融合蛋白的活性。此外，附加蛋白质序列与本发明清蛋白融合蛋白的融合可进一步提高融合蛋白的溶解性和/或稳定性。上述融合蛋白可使用或常规修改本领域已知的技术和/或通过修改概述多肽与IgG分子融合的下列方案来生成。 
简要的说，可使用跨越下文所述序列5’和3’末端的引物PCR扩增人IgG分子的Fc部分。这些引物还应当具有便利的限制酶位点，以便于克隆到表达载体中，优选哺乳动物或酵母表达载体。 
例如，如果使用pC4（ATCC Accession No.209646），那么可将人Fc部分连接到BamHI克隆位点中。注意，应当破坏3’BamHI位点。接着，用BamHI再次限制性消化含有人Fc部分的载体，将线性化载体和编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸（使用本领域已知的技术产生和分离）连接到此BamHI位点中。注意，编码本发明融合蛋白的多核苷酸在没有终止密码子的情况下克隆，否则将不会产生含有Fc的融合蛋白。 
如果使用天然存在的信号序列来生产本发明的清蛋白融合蛋白，那么pC4不需要第二种信号肽。或者，如果不用天然存在的信号序列，那么载体可以进行修饰以包括异源信号序列（参见例如国际公开号WO 96/34891）。 
人IgG Fc区： 
GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT 
GCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCC 
CAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACAT 
GCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC 
TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG 
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG 
TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC 
TCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC 
AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG 
GGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG 
GCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC 
CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC 
TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG 
CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC 
CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGA 
CGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO:52) 
实施例12：由清蛋白融合蛋白生产抗体 
杂交瘤技术
与本发明的清蛋白融合蛋白和本发明清蛋白融合蛋白的部分（如融合蛋白的治疗性蛋白质部分或清蛋白部分）结合的抗体可以通过多种方法来制备（参见《Current Protocols》，第2章）。作为这些方法的一个实例，制备了本发明的清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分的制备物，并进行纯化以使其基本上不含天然污染物。然后将这样的制备物导入动物以产生具有更高特异性活性的多克隆抗血清。 
对本发明的清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分特异的单克隆抗体使用杂交瘤技术来制备（Kohler等人，Nature 256：495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammering等人，在《Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas》中，Elsevier，N.Y.，pp.563-681，1981）。通常，用本发明的清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分免疫动物（优选小鼠）。提取这些小鼠的脾细胞并与合适的骨髓瘤细胞系融合。可依照本发明采用任何合适的骨髓瘤细胞系；然而，优选使用可从ATCC获得的亲本骨髓瘤细胞系（SP20）。融合后，在HAT培养基中选择性维持如此产生的杂交瘤细胞，并随后通过Wands等人（Gastroenterology 80：225-232，1981）描述的有限稀释进行克隆。随后测定通过这种选择获得的杂交瘤细胞以鉴定分泌能够结合本发明的清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分的抗体的克隆。 
或者，可以使用抗独特型抗体以两步程序制备能够结合本发明的清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分的另外的抗体。这种方法利用抗体本身也是抗原，因此有可能获得与某种抗体结合的第二种抗体的事实。依照此方法，将蛋白质特异性抗体用于免疫动物，优选小鼠。然后将这种动物的脾细胞用于产生杂交瘤细胞，并筛选杂交瘤细胞以鉴定产生如下抗体的克隆，该抗体结合本发明的清蛋白融合蛋白（或本发明清蛋白融合蛋白的部分）特异性抗体的能力能够被本发明的融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分所阻断。这些抗体包含针对本发明融合蛋白（或本发明清蛋白融合蛋白的 部分）特异性抗体的抗独特型抗体，并用于免疫动物以诱导另外的本发明融合蛋白（或本发明清蛋白融合蛋白的部分）特异性抗体的形成。 
为了抗体在人体中的体内应用，将抗体“人源化”。可以使用由产生单克隆抗体的杂交瘤细胞衍生的基因构建物来生产这些抗体。用于生产嵌合和人源化抗体的方法是本领域已知的，并且在本文中有论述（回顾参见Morrison，Science 229：1202，1985；Oi等人，BioTechniques 4：214，1986；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Taniguchi等人，EP 171496；Morrison等人，EP 173494；Neuberger等人，WO 8601533；Robinson等人，国际公开号WO8702671；Boulianne等人，Nature 312：643，1984；Neuberger等人，Nature 314：268，1985）。 
从scFv库分离针对本发明的清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分的抗体片段。将从人PBL分离的天然存在V基因构建成含有针对本发明的清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分的反应性的抗体片段库，其中供体可以是曾经或未曾暴露于它（参见如美国专利5,885,793，将其完整引入本文作为参考）。 
库的回收(rescue)。如国际公开号WO 92/01047中所述，从人PBL的RNA构建scFv库。为了回收展示抗体片段的噬菌体，将大约109个含有噬菌粒的大肠杆菌用于接种50ml含有1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xTY（2xTY-AMP-GLU），并振荡培养至O.D.达到0.8。将5ml此培养物用于接种50ml 2xTY-AMP-GLU，加入2x108TU删除了基因3的辅助噬菌体（删除了基因3的M13，参见国际公开号WO 92/01047），将培养物在不振荡的条件下于37℃培养45分钟，然后于37℃振荡培养45分钟。将培养物以4000r.p.m.离心10分钟，将沉淀物重悬于2升含有100μgml氨苄青霉素和50μgml卡那霉素的2xTY中，并培养过夜。如国际公开号WO 92/01047中所述制备噬菌体。 
删除了基因3的M13如下制备：删除了基因3的M13辅助噬菌体不编码基因3蛋白质，因此展示抗体片段的噬菌体（噬菌粒）具有更高的与抗原结合的亲合力。传染性的删除了基因3的M13颗粒通过在含有pUC19衍生物的细胞中培养辅助噬菌体来制备，所述pUC19衍生物在噬菌体形态发生过程中提供野生型基因组3蛋白质。将培养物在不振荡的条件下于37℃温育1小时，然后再于37℃振荡培养1小时。将细胞离心沉淀（IEC-Centra 8,400r.p.m.10分钟），重悬于300ml含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉 素的2xTY培养基（2xTY-AMP-KAN），并于37℃振荡培养过夜。通过两次PEG沉淀（Sambrook等人，1990）从培养基中纯化和浓缩噬菌体颗粒，将其重悬于2ml PBS，并通过0.45μm的滤器（Minisart NML；Sartorius）以产生约1013转导单位/ml（氨苄青霉素抗性克隆）的终浓度。 
库的淘选。将Immunotubes（Nunc）在PBS中用4ml 100μg/ml或10μg/ml本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分包被过夜。将管用2%Marvel-PBS于37℃封闭2小时，然后用PBS洗3次。将约1013TU的噬菌体施加到管中，并于室温在翻转转盘(over and under turntable)上翻转温育30分钟，然后再静置1.5小时。将管用PBS、0.1%Tween-20洗10次并用PBS洗10次。为了洗脱噬菌体，加入1ml 100mM三乙胺，并在翻转转盘上旋转15分钟，其后立刻用0.5ml 1.0M Tris-HCl pH7.4中和溶液。然后，通过将洗脱的噬菌体与细菌于37℃温育30分钟，将噬菌体用于感染10ml对数中期(mid-log)的大肠杆菌TG1。然后将大肠杆菌涂布在含有1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE平板上。然后如上所述用删除了基因3的辅助噬菌体回收如此产生的细菌库以制备用于下一轮选择的噬菌体。然后将此过程重复总共4轮的亲和纯化，其中在第3轮和第4轮，洗管增加到用PBS、0.1%Tween-20洗20次并用PBS洗20次。 
结合者的鉴定。将第3轮和第4轮选择中洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌HB2151，并从单菌落生产可溶性scFv（Marks等人，1991）用于测定。采用用溶于50mM碳酸氢盐pH9.6的10pg/ml本发明的清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白的部分包被的微量滴定板实施ELISA。在ELISA呈阳性的克隆进而通过PCR指纹法（参见例如国际公开号WO 92/01047）和随后通过测序进行鉴定。这些ELISA阳性克隆还可通过本领域已知的技术，诸如例如表位作图、结合亲和力、受体信号转导、阻断或竞争性抑制抗体/抗原结合的能力、和竞争性对抗或拮抗活性进一步鉴定。 
实施例13：[3H]-2-脱氧葡萄糖摄取试验 
脂肪、骨骼肌和肝脏是胰岛素敏感组织。胰岛素可促进葡萄糖摄取/转运到这些组织中。在脂肪和骨骼肌的情况中，胰岛素启动最终导致葡萄糖转运蛋白4分子，GLUT4，从专门的胞内隔室转移到细胞表面的信号传导。一旦在细胞表面上，GLUT4容许葡萄糖的摄取/转运。 
[ 3 H]-2-脱氧葡萄糖的摄取
许多脂肪和肌肉相关细胞系可用于测试在缺乏或存在任何一种或多种为治疗糖尿病而列出的治疗性药物的组合时葡萄糖的摄取/转运活性。具体而言，3T3-L1鼠成纤维细胞和L6鼠骨骼肌细胞可分别分化成3T3-L1脂肪细胞和肌管以作为[3H]-2-脱氧葡萄糖摄取测定法的合适体外模型（Urso等人，J Biol Chem 274(43)：30864-73，1999；Wang等人，J Mol Endocrinol 19(3)：241-8，1997；Haspel等人，J Membr Biol 169(1)：45-53，1999；Tsakiridis等人，Endocrinology 136(10)：4315-22，1995）。简要的说，将2x105个细胞/100μl的脂肪细胞或已分化L6细胞转移到经50μg/ml多聚L-赖氨酸处理即包被的96孔组织培养皿即“TC”中的分化后培养基(post-differentiation medium)中的，并于37℃在5%CO2中培养过夜。细胞首先用无血清低葡萄糖DMEM培养基洗一次，然后用100μl/孔的相同培养基和用100μl/孔的缓冲液或任何一种或多种为治疗糖尿病而列出的治疗性药物的组合，例如本发明治疗剂（例如SEQ ID NO：Y公开的特定融合物及其片段和变体）的渐增浓度即1nM、10nM和100nM，于37℃在缺乏或存在1nM胰岛素时饥饿培养(starve)16小时。平皿用100μl/孔HEPES缓冲盐水洗三次。在存在10μM经标记[3H]-2-脱氧葡萄糖（Amersham，#TRK672）和10μM未标记2-脱氧葡萄糖（SIGMA，D-3179）时胰岛素于37℃在HEPES缓冲盐水中以1nM加入30分钟。作为对照，实行相同的条件，但是缺乏胰岛素。在不同孔中以100μl/孔加入终浓度10μM的松胞菌素(cytochalasin)B（SIGMA，C6762）以测量非特异摄取。细胞用HEPES缓冲盐水洗三次。经标记的即10μM[3H]-2-脱氧葡萄糖和未标记的即10μM 2-脱氧葡萄糖于室温加入10分钟。细胞用冷的磷酸盐缓冲盐水即“PBS”洗三次。通过加入150μl/孔0.2N NaOH以及随后于室温振荡保温20分钟来裂解细胞。然后将样品转移到加有5ml闪烁液的闪烁管中。将管在β-闪烁计数器中进行计数。重复条件中的摄取，区别在于缺乏或存在胰岛素，通过如下方程式测定：[(胰岛素的每分钟计数“cpm”-非特异cpm)/(无胰岛素的cpm-非特异性cpm)]。平均应答分别在脂肪细胞和肌管对照的约5倍和3倍的限制范围内。 
细胞的分化
在T-75cm2烧瓶中使细胞完全汇合。除去培养基，并用25ml分化前培养基(pre-differentiation medium)替换48小时。细胞于37℃在5%CO2、85% 湿度中进行培养。48小时后，除去分化前培养基，并用25ml分化培养基替换48小时。细胞再次于37℃在5%CO2、85%湿度中进行培养。48小时后，除去培养基，用30ml分化后培养基替换。分化后培养基保持14-20天，或者直到实现完全的分化。每2-3天更换培养基。人脂肪细胞可购自Zen-Bio,INC（#SA-1096）。 
实施例14：[3H]-胸苷掺入胰腺细胞系的体外测定法 
最近证明了GLP-1以时间和剂量依赖的方式诱导大鼠胰腺管上皮细胞系ARIP的分化，这与胰岛十二指肠同源框-1（IDX-1）和胰岛素mRNA水平的升高有关（Hui等人，2001，Diabetes 50(4)：785-96）。IDX-1继而提高GLP-1受体的mRNA水平。 
测试的细胞类型
RIN-M细胞：这些细胞可由美国典型组织培养物收藏中心（ATCC细胞系编号CRL-2057）获得。RIN-M细胞系衍生自放射诱导的可移植大鼠胰岛细胞瘤。该系是从肿瘤的裸鼠异种移植物建立的。该细胞产生并分泌胰岛多肽激素，并产生L-多巴脱羧酶（具有胺前体摄取和脱羧或APUD活性的细胞的标记）。 
ARLP细胞：这些是可由美国典型组织培养物收藏中心（ATCC细胞系编号CRL-1674）获得的上皮形态的胰腺外分泌细胞。也可参见参考文献：Jessop,N.W.和Hay,R.J.，“Characteristics of two rat pancreatic exocrine cell lines derived from transplantable tumors”，In Vitro 16：212，1980；Cockell,M.等人，“Identification of a cell-specific DNA-binding activity that interacts with a transcriptional activator of genes expressed in the acinar pancreas”，Mol.Cell.Biol.9：2464-2476，1989；Roux,E.等人，“The cell-specific transcription facotr PTF1 contains two different subunits that interact with the DNA”，Genes Dev.3：1613-1624，1989；及Hui,H.等人，“Glucagon-like peptide 1 induces differentiation of islet duodenal homcobox-1-positive pancreatic ductal cells into insulin-secreting cells”，Diabetes 50：785-796，2001。 
细胞的制备
RIN-M细胞系在含有10%胎牛血清（HyClone，#SH30088.03）的RPMI 1640培养基（HyClone，#SH300027.01）中培养，并每6-8天以1:3到1:6 的比例传代培养。每3-4天更换培养基。 
ARIP（ATCC#CRL-1674）细胞系在含有2mM L-谷氨酰胺并调至含有1.5g/L碳酸氢钠和10%胎牛血清的Ham氏F12K培养基（ATCC，#30-2004）中培养。ARIP细胞系以1:3到1:6的比例每星期传代培养两次。每3-4天更换培养基。 
测定方案
细胞以4000细胞/孔接种96孔平皿，并培养48-72小时至50%汇合。将细胞以100μl/孔转换成无血清培养基。培养48-72小时后，向孔中加入血清和/或本发明的治疗剂（如本发明的清蛋白融合蛋白及其片段和变体）。培养再持续36小时。[3H]-胸苷（5-20Ci/mmol）（Amersham Pharmacia，＃TRK120）稀释至1微居/5微升。培养36小时后，向每个孔中加入5微升，再培养24小时。通过用冷的磷酸盐缓冲盐水即“PBS”轻轻的洗细胞一次来终止反应。细胞随后用100微升10%冰冷的TCA于4℃固定15分钟。除去PBS，并加入200微升0.2N NaOH。平皿于室温振荡保温1小时。将溶液转移到闪烁管中，并加入5ml与水溶液相容的闪烁液，剧烈混匀。该管在β-闪烁计数器中进行计数。作为阴性对照，仅使用缓冲液。作为阳性对照，使用胎牛血清。 
实施例15：糖尿的测定 
糖尿（即尿中糖过量）能够容易的测定以提供糖尿病的疾病状态指数。与正常患者样品相比，患者样品中过量的尿是IDDM和NIDDM的症状。这种患有IDDM和NIDDM的患者的治疗效果表现为由此引起的尿中过量葡萄糖的量降低。在IDDM和NIDDM监测的优选实施方案中，使用本领域已知的技术对患者的尿样测定葡萄糖的存在。人的糖尿定义为尿葡萄糖浓度超过100mg/100ml。通过获得血样并测定血清葡萄糖，甚至可更加精确的测量显示糖尿的那些患者中过度的糖水平。 
实施例16：检测B细胞增殖和分化的刺激或抑制的测定法 
功能性体液免疫应答的产生需要B-谱系细胞与其微环境之间的可溶的和相关的信号。信号可传递导致B-谱系细胞继续其程序化发育的正刺激，或指示细胞停止当前发育途径的负刺激。至今，已经发现大量的刺激和抑制信号影响B细胞响应度，包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL10、IL-13、 IL-14和IL-15。有趣的是，这些信号本身是弱效应物，但是能够结合多种共刺激蛋白在B细胞群中诱导激活、增殖、分化、归巢、耐受和死亡。 
研究得最好的一类B-细胞共刺激蛋白是TNF超家族。在该家族中，已经发现CD40、CD27和CD30与它们相应的配体CD154、CD70和CD153一起调节多种免疫应答。可用于检测和/和观察这些B细胞群及其前体的增殖和分化的测定法是测定各种蛋白质对于这些B细胞群在增殖和分化方面可能具有的影响的有用工具。下面所列的是设计用于检测B细胞群及其前体的分化、增殖或抑制的两种测定法。 
体外测定法-可对本发明的清蛋白融合蛋白（包括含有治疗性蛋白质的片段或变体和/或清蛋白或清蛋白的片段或变体的融合蛋白）评估其在B细胞群及其前体中诱导激活、增殖、分化或抑制和/或死亡的能力。本发明清蛋白融合蛋白在从0.1到10000ng/ml的剂量范围上定性测量的对纯化的人扁桃体B细胞的活性是在标准B-淋巴细胞共刺激测定法中评估的，其中在存在福尔马林固定的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Cowan 1（SAC）或固定化抗人IgM抗体作为引发剂(priming agent)时培养纯化的扁桃体B细胞。根据含氚胸苷掺入的测量，二级信号诸如IL-2和IL-15与SAC和IgM交联协同作用，以引起B细胞增殖。新型协同剂可使用此测定法容易的鉴定。该测定法包括通过磁珠（MACS）耗尽CD3-阳性细胞来分离人扁桃体B细胞。根据CD45R（B220）的表达，评估得出如此产生的细胞群中超过95%是B细胞。 
将每个样品的多种稀释物置于96孔平皿的各个孔中，其中加入悬浮于培养基（RPMI 1640，含有10%FBS、5X10-5M 2ME、100U/ml青霉素、10μg/ml链霉素和10-5稀释度的SAC）的105个B细胞，总体积150μl。通过加入因子后72小时开始的3H-胸苷（6.7Ci/mM）的20小时脉冲（1uCi/孔）对增殖或抑制定量。正负对照分别是IL2和培养基。 
体内测定法-BALB/c小鼠每天注射(i.p.)两次单独的缓冲液、或2mg/Kg本发明的清蛋白融合蛋白（包括含有治疗性蛋白质的片段或变体和/或清蛋白或清蛋白的片段或变体的融合蛋白）。小鼠连续4天接受这种处理，这时处死小鼠，并收集各种组织和血清用于分析。来自正常脾和用本发明清蛋白融合蛋白处理的脾的H&E切片的比较确定了融合蛋白对脾细胞的活性的结果，诸如动脉周淋巴鞘的扩散和/或红髓区有核细胞结构的显著增加，这可指 示B细胞群的分化和增殖的激活。将使用B细胞标记即抗CD45R（B220）的免疫组织化学研究用于测定脾细胞的任何生理改变诸如脾组织破坏(disorganization)是否归因于渗入已建立T细胞区的宽松定义的B细胞区中的B细胞表现度(representation)增加。 
将来自用清蛋白融合蛋白处理的小鼠的脾的流式细胞计数分析用于指示清蛋白融合蛋白是否特异增加ThB+、CD45R（B220）双重(dull)B细胞的比例超过在对照小鼠中所观察到的。 
同样的，在体内增加成熟B细胞表现的预期结果是血清Ig滴度相应升高。因此，比较缓冲液和融合蛋白处理小鼠之间的血清IgM和IgA水平。 
实施例17：T细胞增殖测定法 
对PBMC进行CD-3诱导增殖测定法，并通过3H-胸苷的摄取进行测量。该测定法如下进行。96孔平皿用100μl/孔针对CD3的mAb（HIT3a，Pharmingen）或同种型匹配的对照mAb（B33.1）于4℃包被过夜（1μg/ml，溶于0.5M碳酸氢盐缓冲液pH9.5），然后用PBS洗三次。通过F/H梯度离心从人外周血分离PBMC，并加到mAb包被平皿的四孔（5x104/孔）中含有10%FCS和P/S且存在不同浓度的本发明清蛋白融合蛋白（包括含有治疗性蛋白质的片段或变体和/或清蛋白或清蛋白的片段或变体的融合蛋白）的RPMI中（总体积200μl）。以单独的相关蛋白质缓冲液和培养基作为对照。于37℃培养48小时后，平皿以1000rpm旋转2分钟，取出100μl上清液并保存于-20℃以测量IL-2（或其它细胞因子），如果观察到增殖效果的话。向孔中添加100μl含有0.5μCi 3H-胸苷的培养基，并于37℃培养18-24小时。收获孔，并以3H-胸苷掺入作为增殖的度量。以单独的抗CD3作为增殖的阳性对照。还使用IL-2（100U/ml）作为增强增殖的对照。使用不诱导T细胞增殖的对照抗体作为本发明融合蛋白效果的阴性对照。 
实施例18：本发明的融合蛋白对单核细胞和单核细胞衍生的人树突细胞的II类MHC、共刺激分子和粘附分子表达及细胞分化的影响 
树突细胞通过扩充在外周血中发现的增殖前体来产生：粘附性PBMC或淘析的单核细胞级分用GM-CSF（50ng/ml）和IL-4（20ng/ml）培养7-10天。这些树突细胞具有未成熟细胞的特征性表型（CD1、CD80、CD86、CD40 和II类MHC抗原的表达）。用激活因子诸如TNF-α进行的处理导致表面表型的迅速改变（I类和II类MHC、共刺激和粘附分子的表达增加，FCγRII下调，CD83上调）。这些改变与抗原呈递能力增加和树突细胞的功能成熟有关。 
表面抗原的FACS分析如下进行。细胞用递增浓度的本发明清蛋白融合蛋白或LPS（阳性对照）处理1-3天，用含有1%BSA和0.02mM叠氮钠的PBS清洗，然后与1:20稀释的合适FITC-或PE-标记单克隆抗体于4℃保温30分钟。再次清洗后，标记细胞在FACScan（Becton Dickinson）上通过流式细胞计量术进行分析。 
对细胞因子产生的影响。由树突细胞产生的细胞因子，特别是IL-12，在T细胞依赖性免疫应答的起始中是重要的。IL-12强烈影响Thl辅助T细胞免疫应答的发生，并诱导细胞毒性T和NK细胞功能。ELISA用于如下测量IL-12的释放。树突细胞（106/ml）用递增浓度的本发明清蛋白融合蛋白处理24小时。将LPS（100ng/ml）加入到细胞培养物中作为阳性对照。随后收集细胞培养物的上清液，并用商品化ELISA试剂盒（例如R&D Systems，Minneapolis，MN）分析IL-12含量。使用随试剂盒提供的标准方案。 
对II类MHC、共刺激分子和粘附分子表达的影响。可在单核细胞上鉴定细胞表面抗原的三个主要家族：粘附分子、参与抗原呈递的分子和Fc受体。II类MHC抗原和其它共刺激分子诸如B7和ICAM-1的表达的调控可导致单核细胞抗原呈递能力和诱导T细胞激活能力的改变。Fc受体的表达增加可能与改良的单核细胞细胞毒性活性、细胞因子释放和吞噬作用有关。 
使用FACS分析如下检验表面抗原。单核细胞用递增浓度的本发明清蛋白融合蛋白或LPS（阳性对照）处理1-5天，用含有1%BSA和0.02mM叠氮化钠的PBS清洗，然后与1:20稀释的合适FITC-或PE-标记单克隆抗体于4℃保温30分钟。再次清洗后，标记细胞在FACScan（Becton Dickinson）上通过流式细胞计量术进行分析。 
单核细胞激活和/或存活提高。针对激活（或灭活）单核细胞和/或提高单核细胞存活（或降低单核细胞存活）的分子的测定法是本领域已知的，并可常规用于测定本发明的分子是否具有单核细胞抑制物或激活物的功能。本发明的清蛋白融合蛋白可使用下述三种测定法进行筛选。对于这些测定法中的每一种，外周血单核细胞（PBMC）通过经过Histopaque梯度（Sigma） 的离心从单一供体袋装白细胞(leukopacks)（美国红十字会，Baltimore，MD）纯化。单核细胞通过逆流离心淘析从PBMC分离。 
单核细胞存活测定法。在缺乏血清或其它刺激的条件下培养时，人外周血单核细胞逐渐丧失活力。它们的死亡起因于内部调控的过程（凋亡）。向培养物中加入激活因子诸如TNF-α明显改善细胞存活并防止DNA断裂。使用碘化丙啶（PI）染色如下测量凋亡。将单核细胞在聚丙烯管中在无血清培养基中（阳性对照）在存在100ng/ml TNF-α的条件下（阴性对照）和在存在不同浓度的待测融合蛋白的条件下培养48小时。细胞以2x106/ml的浓度悬浮于含有终浓度为5μg/ml PI的PBS中，然后在FACScan分析前于室温保温5分钟。在此实验范例中，已经证明PI摄取与DNA断裂相关。 
对细胞因子释放的影响。单核细胞/巨噬细胞的一项重要功能是它们通过刺激后的细胞因子释放对免疫系统其它细胞群的调控活性。测量细胞因子释放的ELISA如下进行。人单核细胞以5x105细胞/ml的密度与递增浓度的本发明清蛋白融合蛋白以及在同样条件但缺少融合蛋白的情况下进行培养。对于IL-12的产生，细胞在存在融合蛋白的条件下用IFN（100U/ml）引发过夜。然后加入LPS（10ng/ml）。24小时后收集条件培养基，并保持冷冻直到使用。然后使用商品化ELISA试剂盒（例如R&D Systems，Minneapolis，MN）进行TNF-α、IL-10、MCP-1和IL-8的测量，并应用随试剂盒提供的标准方案。 
氧化猝发。将纯化的单核细胞以2-1x105细胞/孔置于96孔平皿中。在总体积0.2ml的培养基（RPMI 1640+10%FCS、谷氨酰胺和抗生素）中，向孔中加入递增浓度的本发明清蛋白融合蛋白。培养3天后，将平皿离心，从孔中除去培养基。向巨噬细胞单层加入每孔0.2ml酚红溶液（140mM NaCl、10mM磷酸钾缓冲液pH7.0、5.5mM右旋糖、0.56mM酚红和19U/ml HRPO），以及刺激物（200nM PMA）。将平皿于37℃保温2小时，通过向每个孔中加入20μl 1N NaOH终止反应。于610nm读取吸光度。为了计算由巨噬细胞产生的H2O2的量，对每个实验实行已知摩尔浓度的H2O2溶液的标准曲线。 
实施例19：本发明的清蛋白融合蛋白对血管内皮细胞生长的影响 
第一天，将人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）以2-5x104细胞/35mm平皿的密度接种含有4%胎牛血清（FBS）、16单位/ml肝素和50单位/ml内皮 细胞生长补充物（ECGS，Biotechnique,Inc.）的M199培养基中。第2天，将培养基换成含有10%FBS、8单位/ml肝素的M199。以不同浓度加入本发明的清蛋白融合蛋白和阳性对照，诸如VEGF和碱性FGF（bFGF）。第4天和第6天，更换培养基。第8天，用Coulter计数器测定细胞数目。 
HUVEC细胞数目增加表明融合蛋白可使血管内皮细胞增殖，而HUVEC细胞数目减少表明融合蛋白抑制血管内皮细胞。 
实施例20：大鼠角膜创伤愈合模型 
此动物模型显示了本发明清蛋白融合蛋白对新血管形成的影响。实验方案包括： 
制造1-1.5mm长的从角膜中央到基质层中的切口。 
在切口边缘下插入刮刀，面向眼的外角。 
制造袋（其底部距眼的边缘1-1.5mm）。 
在袋中放置含有50ng-5μg本发明清蛋白融合蛋白的颗粒。 
用本发明清蛋白融合蛋白进行的治疗也可以以20mg-500mg的剂量范围局部应用于角膜创伤（每天治疗，持续五天）。 
实施例21：糖尿病小鼠和糖皮质激素损害创伤愈合模型 
糖尿病db+/db+小鼠模型
为了证明本发明的清蛋白融合蛋白加速愈合过程，使用创伤愈合的遗传糖尿病小鼠模型。db+/db+小鼠中的全层皮肤创伤愈合模型是充分鉴定的、临床相关的、和可再生的损害创伤愈合模型。糖尿病创伤的愈合依赖于肉芽组织的形成和上皮再形成而不是收缩（Gartner,M.H.等人，J.Surg.Res.52：389，1992；Greenhalgh,D.G.等人，Am.J.Pathol.136：1235，1990）。 
糖尿病动物具有许多在II型糖尿病中观察到的特有特征。纯合（db+/db+）小鼠比它们的正常杂合（db+/+m）同胞仔肥胖。突变的糖尿病（db+/db+）小鼠在4号染色体上具有单个常染色体隐性突变（db+）（Coleman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：283-293，1982）。动物表现出多食、多饮和多尿。突变的糖尿病小鼠（db+/db+）具有升高的血糖、升高的或正常的胰岛素水平、和抑制的细胞介导免疫（Mandel等人，J.Immunol.120：1375，1978；Debray-Sachs,M.等人，Clin.Exp.Immunol.51(1)：1-7，1983；Leiter 等人，Am.J.of Pathol.114：46-55，1985）。已经在这些动物中描述了周围神经病、心肌并发症和微血管损伤，基膜肥厚和肾小球滤过异常（Norido,F.等人，Exp.Neurol.83(2)：221-232，1984；Robertson等人，Diabetes 29(1)：60-67，1980；Giacomelli等人，Lab Invest.40(4)：460-473，1979；Coleman,D.L.，Diabetes 31(Suppl)：1-6，1982）。这些纯合糖尿病小鼠形成与人类II型糖尿病类似的对胰岛素具有抗性的高血糖（Mandel等人，J.Immunol.120：1375-1377，1978）。 
在这些动物中观察到的特征表明此模型中的愈合可能与人类糖尿病中观察到的愈合相似（Greenhalgh等人，Am.J.of Pathol.136：1235-1246，1990）。 
此研究中使用了遗传糖尿病雌性C57BL/KsJ（db+/db+）小鼠和它们的无糖尿病（db+/+m）杂合同胞仔（Jackson Laboratories）。动物在其6周龄时购得，而在研究开始时是8周龄。动物单独饲养，并随意获得食物和水。所有操作都采用无菌技术进行。试验依照Human Genome Sciences,Inc.科研动物管理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）的规定和指导方针以及关于实验动物管理和使用的指导方针进行。 
创伤方案依照以前报道的方法进行（Tsuboi,R.和Rifkin,D.B.，J.Exp.Med.172：245-251，1990）。简要的说，在创伤当天，通过腹膜内注射溶于去离子水的阿佛丁（0.01mg/ml）、2,2,2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇麻醉动物。将动物的背部区域除毛，皮肤用70%乙醇溶液和碘酒清洗。手术区域在创伤前用无菌纱布弄干。随后用Keyes组织打孔器创造8mm的全层皮肤创伤。紧随创伤之后，轻轻拉伸附近皮肤以消除创伤扩张。创伤在实验期间保持开放。从创伤当天开始，连续5天实施局部处理。在处理前，伤口用无菌盐水和纱布轻轻清洁。 
肉眼检查创伤，并在手术当天和此后每隔两天于固定距离进行拍照。在第1-5天和第8天通过每天测量来测定伤口的闭合情况。使用标有刻度的Jameson测径器水平和垂直测量创伤。如果不再看到肉芽组织且创伤被连续的上皮所覆盖，则认为创伤愈合了。 
本发明的清蛋白融合蛋白采用范围不同剂量，从4mg到500mg每处创伤每天在载体中施用8天。载体对照组获得50ml载体溶液。 
动物在第8天通过腹膜内注射戊巴比妥钠（300mg/kg）安乐死。然后收集创伤和附近皮肤以用于组织学和免疫组织化学。组织样品置于组织盒中活 组织检查海绵之间10%中性缓冲福尔马林中以用于进一步加工。 
每组10只动物（5只糖尿病和5只无糖尿病对照）的三组评估：1)载体安慰剂对照，2)未处理组，和3)处理组。 
通过以水平和垂直轴测量区域并获得创伤的总平面面积来分析创伤闭合。随后通过确定最初创伤面积（第0天）和处理后的创伤面积（第8天）之间的差异评估收缩。第1天的创伤面积是64mm2，即皮肤打孔器的相应大小。使用如下公式进行计算： 
a.[第8天的开放面积]-[第1天的开放面积]/[第1天的开放面积] 
将样品在10%缓冲福尔马林中固定，并将石蜡包埋块垂直于创伤表面切片（5mm），切割采用Reichert-Jung切片机。对平分创伤的横截面进行常规苏木精-曙红（H&E）染色。使用创伤的组织学检查来评估修复皮肤的愈合过程和形态学外观是否因本发明清蛋白融合蛋白的处理而改变。此评估包括验证细胞聚集、炎性细胞、毛细管、成纤维细胞、上皮再形成和表皮成熟的存在（Greenhalgh,D.G.等人，Am.J.Pathol.136：1235，1990）。经校准的透镜测微计由不知情的观察者(blinded observer)使用。 
组织切片还用多克隆兔抗人角蛋白抗体进行免疫组织化学染色，其中使用ABC Elite检测系统。使用人皮肤作为阳性组织对照，而使用未免疫IgG作为阴性对照。通过使用经校准透镜测微计评估创伤上皮再形成的程度来测定角质形成细胞的生长。 
通过使用抗PCNA抗体（1:50）以及ABC Elite检测系统展示皮肤样品中的增殖细胞核抗原/细胞周期蛋白（PCNA）。使用人结肠癌作为阳性组织对照，而使用人脑组织被作为阴性对照。每个样品包括省略了一抗并以未免疫小鼠IgG替换的切片。这些切片的分级是基于增殖程度分为0-8的等级，反映轻微增殖的低端等级至反映强烈增殖的高端。 
使用非配对t检验分析实验数据。小于0.05的p值认为是显著的。 
类固醇损害大鼠模型
类固醇对创伤愈合的抑制已经在各种体外和体内系统中很好的证明（Wahl，“Glucocorticoids and Wound healing”，在《Anti-Inflammatory Steroid Action:Basic and Clinical Aspects》中，280-302，1989；Wahl等人，J.Immunol.115：476-481，1975；Werb等人，J.Exp.Med.147：1684-1694，1978）。糖皮质激素通过抑制血管发生、降低血管通透性（Ebert等人，An.Intern.Med. 37：701-705，1952）、成纤维细胞增殖、和胶原合成（Beck等人，Growth Factors 5：295-304，1991；Haynes等人，J.Clin.Invest.61：703-797，1978）以及产生循环单核细胞的瞬间减少（Haynes等人，J.Clin.Invest.61：703-797，1978；Wahl，“Glucocorticoids and wound healing”，在《Antiinflammatory Steroid Action:Basic and Clinical Aspects》中，Academic Press，New York，pp.280-302，1989）来延迟创伤愈合。在大鼠中系统施用类固醇损害创伤愈合是充分证明的现象（Beck等人，Growth Factors 5：295-304，1991；Haynes等人，J.Clin.Invest.61：703-797，1978；Wahl，“Glucocorticoids and wound healing”，在《Antiinflammatory Steroid Action:Basic and Clinical Aspects》中，Academic Press，New York，pp.280-302，1989；Pierce等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2229-2233，1989）。 
为了证明本发明的清蛋白融合蛋白能够加速愈合过程，评估了多次局部应用融合蛋白对大鼠中全层切除皮肤创伤的效果，其中愈合因系统施用甲基强的松龙而损害。 
此实施例使用体重200-300g的年轻成年雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Laboratories）。动物在8周龄时购得，在研究开始时为9周龄。大鼠的愈合应答因创伤时系统施用甲基强的松龙（17mg/kg/大鼠肌肉内）而受损。动物单独饲养，并随意获得食物和水。所有操作都采用无菌技术进行。此研究依照Human Genome Sciences,Inc.科研动物管理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）的规定和指导方针以及关于实验动物管理和使用的指导方针进行。 
遵循上文描述的创伤方案。在创伤当天，通过腹膜内注射可达眠（50mg/kg）和塞拉嗪（5mg/kg）麻醉动物。将动物的背部区域除毛，皮肤用70%乙醇溶液和碘溶液清洗。外科手术区域在创伤前用无菌纱布弄干。随后用Keyes组织打孔器创造8mm的全层皮肤创伤。创伤在实验期间保持开放。从创伤及随后施用甲基强的松龙当天开始，连续7天每天实施一次局部施用测试材料。在处理前，伤口用无菌盐水和纱布轻轻清洁。 
肉眼检查创伤，并在创伤当天和处理结束时于固定距离进行拍照。在第1-5天和第8天通过每天测量来测定伤口的闭合情况。使用标有刻度的Jameson测径器水平和垂直测量创伤。如果不再看到肉芽组织且创伤被连续的上皮所覆盖，则认为创伤愈合了。 
本发明的清蛋白融合蛋白采用范围不同剂量，从4mg到500mg每处创伤每天在载体中施用8天。载体对照组获得50ml载体溶液。 
动物在第8天通过腹膜内注射戊巴比妥钠（300mg/kg）安乐死。然后收集创伤和附近皮肤以用于组织学。组织样品置于组织盒中活组织检查海绵之间10%中性缓冲摩尔马来中以用于进一步加工。 
每组10只动物（5只糖尿病和5只无糖尿病对照）的三组评估：1)未处理组，2)载体安慰剂对照，3)处理组。 
通过以水平和垂直轴测量区域并获得创伤的总平面面积来分析创伤闭合。随后通过确定最初创伤面积（第0天）和处理后的创伤面积（第8天）之间的差异来评估闭合。第1天的创伤面积是64mm2，即皮肤打孔器的相应大小。使用如下公式进行计算： 
b.[第8天的开放面积]-[第1天的开放面积]/[第1天的开放面积] 
将样品在10%缓冲摩尔马来中固定，并将石蜡包埋块垂直于创伤表面切片（5mm），切割采用Olympus切片机。对平分创伤的横截面进行常规苏木精-曙红（H&E）染色。创伤的组织学检查能够评估修复皮肤的愈合过程和形态学外观是否因本发明清蛋白融合蛋白的处理而改善。经校准的透镜测微计由不知情的观察者使用以测定创伤裂口的距离。 
使用非配对t检验分析实验数据。小于0.05的p值认为是显著的。 
实施例22：淋巴水肿动物模型 
此实验方法的目的是创建合适和可靠的淋巴水肿模型以用于检验本发明清蛋白融合蛋白在大鼠后肢的淋巴循环系统的淋巴管发生和重建中的治疗效果。通过患病肢的肿胀体积、淋巴脉管系统数量的定量、总血浆蛋白和组织病理学来测量效果。急性淋巴水肿观察7-10天。可能更加重要的是，水肿的慢性过程跟踪长达3-4周。 
开始手术之前，采集血样用于蛋白质浓度分析。给体重约350g的雄性大鼠服用戊巴比妥。随后，右腿从膝盖到臀部除毛。除毛区域用浸在70%EtOH中的纱布擦洗。采集血样用于血清总蛋白质检验。在标记2个测量水平（后跟以上0.5cm，背爪的中部）之后，进行周长和体积测量，然后向脚爪中注射染料。右爪和左爪的背部皮内注射0.05ml 1%Evan氏蓝。然后在将染料注射到脚爪中后进行周长和体积测量。 
使用膝盖关节作为界标，沿圆周产生腿中部腹股沟切口，从而可定位股血管(femoral vessel)。使用镊子和止血钳解剖和分离皮瓣。定位股血管后，定位位于血管下面、沿一侧走向的淋巴管。然后将此区域的主要淋巴管电凝结(electrically coagulated)或缝合结扎(suture ligated)。 
使用显微镜将腿背部（邻近半肌腱和收肌）的肌肉直接切开。然后定位腿弯部的淋巴结。然后通过缝合结扎腿弯部淋巴结的2个邻侧和2个远侧淋巴管和远侧血液供应。然后通过切断结缔组织除去腿弯部淋巴结和任何附随的脂肪组织。 
注意控制由此操作引起的任何轻微出血。淋巴闭塞后，使用hquid皮肤（Vetbond）（AJ Buck）封闭皮瓣。将分开的皮肤边缘封闭到肌肉组织下，而在腿周围留下约0.5cm的裂口。在需要时，也可以通过缝合到肌肉下方来锚定皮肤。 
为了避免感染，动物用网单独饲养（无垫草）。正在复原的动物每天检查，通过最佳水肿峰，一般发生在第5-7天。随后观察到稳定水肿峰。为了评估淋巴水肿的强度，在手术前和7天的每天测量每个脚爪上2个指定位置的周长和体积。测定血浆蛋白质对淋巴水肿的影响，而且还调查了蛋白质分析是否是有效的检验范围(testing perimeter)。在2个位置评估对照和水肿肢体的重量。分析以盲目方式进行。 
周长测量：通过简单的气体麻醉以防止肢体活动，使用布卷尺测量肢体周长。由2个不同的人在踝骨和背爪处进行测量，并将这两个读数取平均值。从对照和水肿肢体获得读数。 
体积测量：在手术当天，动物用戊巴比妥麻醉，并在手术前进行检测。为每天测定体积，动物简单的用氟烷麻醉（快速制动和快速恢复），将两腿都除毛并用防水标记对腿进行同样标记。将腿首先浸入水中，然后浸入仪器中到每个标记的水平，随后通过Buxco水肿软件（Chen/Victor）测量。数据由一个人记录，而另一个人将肢体浸到标记区。 
血液-血浆蛋白质测量：在手术前采集血液、离心并分离血清，然后是结束时，用于比较总蛋白质和Ca2+。 
肢体重量比较：采集血液后，动物预备用于组织收集。用剪断机(quillitine)切除肢体，然后在结扎处切割实验和对照腿并称重。在胫-根关节脱离后进行第二次称重，并将足称重。 
组织学制备物：解剖位于膝盖（腿弯部）区域后的横肌并排列在金属模具中，填满冰冻凝胶(freezeGel)，浸入冷的甲基丁烷，置于-80℃的带标记样品袋中直到切片。紧接切片，肌肉在荧光显微镜下观察淋巴。 
实施例23：本发明清蛋白融合蛋白对TNF α诱导的粘附分子表达的抑制 
淋巴细胞向炎症和血管发生区域的募集涉及淋巴细胞和血管内皮上的细胞表面粘附分子（CAM）之间的特异受体-配体相互作用。粘附过程在正常和病理条件中都遵循多步级联，它涉及内皮细胞（EC）上胞内粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、和内皮白细胞粘附分子-1（E-选择蛋白）的表达。这些分子和其它分子在血管内皮上的表达决定了白细胞可以在炎症反应期间粘附于局部血管系统并外渗到局部组织中的效率。细胞因子和生长因子的局部集中参与这些CAM的表达调控。 
肿瘤坏死因子α（TNF-a），一种有效的促炎细胞因子，是内皮细胞上所有三种CAM的刺激物，且可能涉及极其多种炎症反应，通常导致病理后果。 
可以检验本发明清蛋白融合蛋白介导对TNF-a诱导的CAM表达的抑制的潜力。采用以EC作为固相吸收剂的修正ELISA测定法来测量在用FGF蛋白质家族的一种成员共刺激后经TNF-a处理的EC上的CAM表达量。 
为了实施该实验，从合并的脐带收集物（cord harvests）获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养物，并在含5%CO2的37℃潮湿培养箱中保持在补充有10%FCS和1%青霉素/链霉素的生长培养基（EGM-2；Clonetics，San Diego，CA）中。将HUVEC以1x104细胞/孔的浓度接种到96孔平皿中，并于37℃温育18-24小时或直到汇合。随后将细胞单层用补充有100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI-1640的无血清溶液清洗3次，并用指定的细胞因子和/或生长因子于37℃处理24小时。培养后，对细胞评估CAM表达。 
将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在标准96孔平皿中培养至汇合。从细胞除去生长培养基，并用90μl 199培养基（10%FBS）替换。将用于测试的样品和阳性或阴性对照加到平皿中一式三份（10μl体积）。将平皿于37℃保温5小时（选择蛋白和整联蛋白表达）或24小时（仅整联蛋白表达）。将平皿抽吸以除去培养基，并向每个孔中加入100μl 0.1%低聚甲醛-PBS（含有Ca++和Mg++）。将平皿于4℃保持30分钟。 
随后从孔中除去固定液，将孔用PBS（+Ca、Mg）+0.5%BSA清洗1次，并排干。不让孔干燥。向测试和对照孔中加入10μl经过稀释的一抗。以10μg/ml的浓度（1∶10稀释的0.1mg/ml抗体储液）使用抗ICAM-1-生物素、抗VCAM-1-生物素和抗E-选择蛋白-生物素。将细胞在潮湿环境中于37℃保温30分钟。将孔用PBS（+Ca、Mg）+0.5%BSA清洗3次。 
然后向每个孔中加入20μl经过稀释的ExtrAvidin-碱性磷酸酶（1:5,000稀释），并于37℃保温30分钟。将孔用PBS（+Ca、Mg）+0.5%BSA清洗3次。将1片对硝基苯酚磷酸酯（p-Nitrophenol Phosphate，pNPP）溶于5ml甘氨酸缓冲液（pH 10.4）。向每个测试孔中加入100μl溶于甘氨酸缓冲液的pNPP底物。由ExtrAvidin-碱性磷酸酶溶于甘氨酸缓冲液的使用稀释液制备一式三份的标准孔：1:5,000（100）>10-0.5>10-1>10-1.5。每个稀释度取5μl加入到一式三份的孔中，如此得到的每个孔中的AP含量为5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng。然后必须向每个标准孔中加入100μl pNNP试剂。平皿必须于37℃保温4小时。向所有孔中加入50μl体积的3M NaOH。在读板仪上于405nm量化结果。对仅装有甘氨酸缓冲液的空白孔使用背景扣除选项。将模板设定为显示每个标准孔中AP-缀合物的浓度[5.50ng；1.74ng；0.55ng；0.18ng]。结果将显示为每个样品中结合的AP-缀合物的量。 
实施例24：GAS报道分子构建物的构建 
将涉及细胞分化和增殖的一种信号转导途径称为Jaks-STAT途径。Jaks-STAT途径中激活的蛋白质结合γ激活位点“GAS”元件或干扰素敏感应答元件（“ISRE”），它们位于许多基因的启动子中。蛋白质与这些元件的结合改变相关基因的表达。 
GAS和ISRE元件受到称为信号转导物和转录激活物或“STAT”的一类转录因子的识别。STAT家族有六个成员。Stat1和Stat3存在于许多细胞类型中，Stat2也一样（作为对IFN-α的应答是普遍的）。Stat4更加受限，而且在许多细胞类型中不存在，虽然它在I类T辅助细胞、用IL-12处理后的细胞中发现过。Stat5最初称为乳腺生长因子，但是已经发现它以更高浓度存在于其它细胞中，包括骨髓细胞。它能够在组织培养细胞中受到许多细胞因子的激活。 
STAT因称为Janus激酶（“Jaks”）家族的一组激酶的酪氨酸磷酸化受到 激活而从细胞质转移到核。Jaks代表了可溶性酪氨酸激酶的一个独特家族，包括Tyk2、Jak1、Jak2和Jak3。这些激酶展示显著的序列相似性，而且通常在静息细胞中无催化活性。 
Jaks受到下表所总结的多种受体的激活。（改编自Schidler和Darnell的综述，Ann.Rev.Biochem.64：621-51，1995）。能够激活Jaks的细胞因子受体家族分为两组：(a)1类包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-IS、Epo、PRL、GH、G-CSF、GM-CSF、LIF、CNTF、和血小板生成素的受体；和(b)2类包括IFN-a、IFN-g和IL-10。1类受体共有一个保守半胱氨酸基序（一组4个保守半胱氨酸和1个色氨酸）以及WSXWS基序（编码Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser（SEQ ID NO：53）的膜近中心区） 
因此，在配体与受体结合后，Jaks受到激活，它继而激活STAT，其随后转移并结合GAS元件。这整个过程包含在Jaks-STAT信号转导途径中。因此，由GAS或ISRE元件的结合所反映的Jaks-STAT途径的激活可用于指示涉及细胞增殖和分化的蛋白质。例如，已知生长因子和细胞因子激活Jaks-STAT途径（见下文表5）。因此，通过使用与受体分子连接的GAS元件，可以鉴定Jaks-STAT途径的激活因子。 
表5
Figure DEST_PATH_BDA00002106285802801
Figure DEST_PATH_BDA00002106285802811
为了构建含有启动子元件的合成GAS，它用于实施例27-29中描述的生物学测定法，采用基于PCR的策略来产生GAS-SV40启动子序列。5’引物含有GAS结合位点的4个串联拷贝，它是在IRF1启动子中发现的且先前证明在受到多种细胞因子的诱导后结合STAT（Rothman等人，Immunity 1：457-468，1994），虽然可以使用其它GAS或ISRE元件作为替代。5’引物还含有与SV40早期启动子序列互补的18bp序列，且侧翼为Xho I位点。5’引物的序列为： 
5′-GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG-3′（SEQ ID NO：54） 
下游引物与SV40启动子互补，且侧翼为Hind III位点：5′-GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC-3′（SEQ ID NO：55） 
使用从Clontech获得的B-gal：启动子质粒中存在的SV40启动子模板进行PCR扩增。将如此得到的PCR片段用Xho I/Hind III消化，并亚克隆到BLSK2-（Stratagene）中。用正向和反向引物进行的测序证实了插入物含有 如下序列： 
5’-CTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT-3′（SEQ ID NO：56） 
通过与SV40启动子连接的此GAS启动子元件，接着改造了GAS:SEAP2报道分子构建物。在这里，报道分子是分泌的碱性磷酸酶，或“SEAP”。然而，显然任何报道分子都可以在这个或任何其它实施例中替代SEAP。可用于替代SEAP的众所周知的报道分子包括氯霉素乙酰转移酶（CAT）、萤光素酶、碱性磷酸酶、B-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白（GFP）或可通过抗体检测的任何蛋白质。 
上述序列证实了合成GAS-SV40启动子元件使用HindIII和XhoI亚克隆到了从Clontech获得的pSEAP-启动子载体中，用扩增的GAS:SV40启动子元件有效替换SV40启动子，创建了GAS-SEAP载体。然而，此载体不含新霉素抗性基因，并因此不为哺乳动物表达系统所优选。 
因此，为了产生表达GAS-SEAP报道子的稳定哺乳动物细胞系，使用SalI和NotI将GAS-SEAP盒从GAS-SEAP载体中移出，并使用多克隆位点中的这些限制性位点插入含有新霉素抗性基因的主链载体，诸如pGFP-1（Clontech），创建了GAS-SEAP/Neo载体。一旦将此载体转化到哺乳动物细胞中，此载体就可以如实施例27-29所述用作GAS结合的报道分子。 
可以使用上文的描述并用不同启动子序列替换GAS来制备其它构建物。例如，实施例27-31中描述了含有EGR和NF-KB启动子序列的报道分子的构建。然而，可使用这些实施例中描述的方案替换许多其它启动子。例如，可以单独或联合（例如GAS/NF-KB/EGR、GAS/NF-KB、Il-2/NFAT或NF-KB/GAS）替换SRE、IL-2、NFAT或骨钙蛋白启动子。类似的，可使用其它细胞系来测试报道分子构建物活性，诸如HELA（上皮）、HUVEC（内皮）、Reh（B-细胞）、Saos-2（成骨细胞）、HUVAC（主动脉）或心肌细胞。 
实施例25：SEAP活性的测定法 
作为用于本文公开的实施例中描述的测定法的报道分子，根据下述一般程序用Tropix Phospho-light试剂盒（Cat.BP-400）测定SEAP活性。Tropix  Phospho-light试剂盒提供下面所用的稀释、测定和反应缓冲液。 
将分配器灌注2.5x稀释缓冲液，并将15μl 2.5x稀释缓冲液分配到装有35μl含本发明清蛋白融合蛋白溶液的Optiplate中。用塑料密封膜密封平皿，并于65℃保温30分钟。分开Optiplate以避免受热不均。 
使样品冷却至室温15分钟。排空分配器并灌注测定缓冲液。加入50μl测定缓冲液并于室温保温5分钟。排空分配器并灌注反应缓冲液（见下表）。加入50μl反应缓冲液并于室温保温20分钟。由于化学发光信号的强度依赖于时间，而且在发光计上读取5个平皿需要约10分钟，因此每次处理5个平皿，并在10分钟后开始第二组。 
在发光计中读取相对光单位。设定H12为空白，并打印结果。化学发光增强表明报道分子活性。 
表6
Figure DEST_PATH_BDA00002106285802831
实施例26：鉴定神经元活性的测定法 
在细胞进行分化和增殖时，一组基因通过许多不同的信号转导途径受到激活。这些基因之一，EGR1（早期生长反应基因1），在多种组织和细胞类型中在激活后诱受到导。EGR1的启动子负责这种诱导。使用与报道分子连接的EGR1启动子，可评估本发明融合蛋白激活细胞的能力。 
具体的说，使用如下方案在PC12细胞系中评估神经元活性。已知PC12细胞（大鼠嗜铬细胞瘤细胞）通过多种促细胞分裂剂诸如TPA（十四酰佛波醇醋酸酯）、NGF（神经生长因子）和EGF（表皮生长因子）的激活而增殖和/或分化。在此处理过程中EGR1基因表达受到激活。因此，通过用含有与SEAP报道基因连接的EGR启动子的构建物稳定转染PC12细胞，可评估本发明清蛋白融合蛋白对PC12细胞的激活。 
EGR/SEAP报道分子构建物可通过如下方案来装配。EGR-1启动子序列（-633至+1）（Sakamoto K等人，Oncogene 6：867-871，1991）可使用下列引物从人基因组DNA中PCR扩增： 
第一引物：5′-GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3′（SEQ ID NO：57） 
第二引物：5′-GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3′（SEQ ID NO：58） 
使用实施例24中产生的GAS:SEAP/Neo载体，然后可将EGR1扩增产物插入到此载体中。使用限制酶XhoI/HindIII将GAS:SEAP/Neo载体线性化，除去GAS/SV40填充物。用相同的酶将EGR1扩增产物限制性消化。连接载体和EGR1启动子。 
为了预备细胞培养用的96孔平皿，每个10cm平皿中加入2ml包被液（I类胶原（Upstate Biotech Inc.，产品目录编号08-115）在30%乙醇中1:30稀释（过滤灭菌））或96孔平皿每个孔50μl，并在空气中干燥2小时。 
将PC12细胞常规在经过预包被的10cm组织培养皿上在补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的含有10%马血清（JRH BIOSCIENCES，产品目录编号12449-78P）、5%加热灭活的胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（Bio Whittaker）中常规培养。每3到4天将其一分为四。通过刮取从平皿中取出细胞，并通过吸入和吹出超过15次进行重悬。 
使用本领域已知的技术将EGR/SEAP/Neo构建物转染到PC12中。通过在300μg/ml G418中培养细胞来获得EGR-SEAP/PC12稳定细胞。使用不含 G418的培养基进行常规培养，只是每1到2个月细胞应在300μg/ml G418中重新培养几代。 
为了测定神经元活性，对细胞长至大约70-80%汇合的10cm平皿进行筛选，即除去旧的培养基。用PBS（磷酸盐缓冲盐水）清洗细胞一次。然后将细胞在低血清培养基（含有1%马血清和0.5%FBS和抗生素的RPMI-1640）中饥饿培养过夜。 
第二天上午，除去培养基并用PBS清洗细胞。从平皿上刮下细胞，在2ml低血清培养基中充分悬浮细胞。对细胞计数，并加入更多低血清培养基，使最终的细胞密度达到5x105细胞/ml。 
向96孔平皿的每个孔中加入200μl细胞悬浮液（相当于1x105细胞/孔）。加入一系列不同浓度的本发明清蛋白融合蛋白，于37℃保温48到72小时。可使用已知通过EGR激活PC12细胞的生长因子作为阳性对照，诸如50ng/μl神经元生长因子（NGF）。在阳性对照孔中通常观察到超过50倍的SEAP诱导。SEAP测定法可使用本领域已知的和/或实施例25中描述的技术常规进行。 
实施例27：T细胞活性的测定法 
下面的方案用于通过鉴定因子并测定本发明的清蛋白融合蛋白是否增殖和/或分化T细胞来评估T细胞活性。使用实施例24中产生的GAS/SEAP/Neo构建物来评估T细胞活性。因此，增加SEAP活性的倍数指示激活Jaks-STAT信号转导途径的能力。此测定法中所使用的T细胞是Jurkat T-细胞（ATCC编号TIB-152），虽然也可以使用Molt-3细胞（ATCC编号CRL-1552）和Molt-4细胞（ATCC编号CRL-1582）。 
Jurkat T-细胞是成淋巴细胞CD4+Th1辅助细胞。为了产生稳定的细胞系，使用DMRIE-C（Life Technologies）（下文描述的转染方法）用GAS-SEAP/neo载体转染大约2百万Jurkat细胞。以每孔大约20,000细胞的密度接种转染细胞并选择对1mg/ml庆大霉素有抗性的转染子。扩增抗性菌落，然后测试它们对浓度增加的干扰素γ的反应。演示了一个选定克隆的剂量应答。 
具体而言，下面的方案将为75个含有200μl细胞的孔产生足够的细胞。因此，为了为多个96孔板产生足够的细胞，或者放大规模，或者多次实施。在含1%青霉素-链霉素的RPMI+10%血清中维持Jurkat细胞。在T25烧瓶 中混和2.5ml OPTI-MEM（Life Technologies）和10μg质粒DNA。加入含有50μl DMRIE-C的2.5ml OPTI-MEM，并于室温保温15-45分钟。 
在保温期间，对细胞浓度计数，旋转沉淀所需数目的细胞（107个细胞每次转染），并重悬于OPTI-MEM至终浓度107个细胞/ml。然后向T25烧瓶中加入1ml OPTI-MEM中的1x107个细胞，并于37℃保温6小时。保温后，加入10ml RPMI+15%血清。 
在RPMI+10%血清、1mg/ml庆大霉素和1%青霉素-链霉素中维持Jurkat:GAS-SEAP稳定报道系。用不同浓度的一种或多种本发明融合蛋白处理这些细胞。 
在用融合蛋白处理的当天，细胞应当清洗，并重悬于新鲜的RPMI+10%血清至每毫升500,000细胞的密度。所需细胞准确数目将取决于融合蛋白的数量和所筛选融合蛋白的不同浓度的数量。对于一个96孔板，需要大约1千万细胞（对于10个平皿，需要1亿细胞）。 
将含有经融合蛋白处理的Jurkat细胞的有孔器皿在培养箱中放置48小时（注意，这个时间在48-72小时之间可变化）。然后使用12道移液器将每个孔的35μl样品转移到不透明的96孔板中。（使用sellophene覆盖物）覆盖不透明的平板，并保存于-20℃直至根据实施例25进行SEAP测定法。将含有剩余经处理细胞的平板置于4℃，并在需要时用作在特定孔上重复测定的材料来源。 
可使用100U/ml干扰素γ作为阳性克隆，已知它激活Jurkat T细胞。在阳性对照孔中通常观察到超过30倍的诱导。 
上述方案可用于产生瞬时的和稳定的转染细胞，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。 
实施例28：T细胞活性的测定法 
NK-KB（核因子KB）是由多种因子，包括炎性细胞因子IL-1和TNF、CD30和CD40、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β通过暴露于LPS或凝血酶，以及通过某些病毒基因产物的表达而激活的一种转录因子。作为转录因子，NF-KB调控涉及免疫细胞活化、凋亡控制（NF-KB表现出保护细胞免于凋亡）、B和T-细胞发育、抗病毒和抗微生物反应以及多种应激反应的基因的表达。 
在未激发状态中，NF-KB与I-KB（抑制物KB）保留在细胞质中。然而，在刺激后，I-KB发生磷酸化和降解，导致NF-KB穿梭到细胞核中，从而激活靶基因的转录。由NF-KB激活的靶基因包括IL-2、IL-6、GM-CSF、ICAM-1和I类MHC。 
由于它的重要作用和应答多种刺激的能力，将利用NF-KB启动子元件的报道分子构建物用于筛选融合蛋白。NF-KB的激活物或抑制物在治疗、预防和/或诊断疾病中将是有用的。例如，NF-KB的抑制物可用于治疗那些涉及NF-KB的急性或慢性激活的疾病，诸如类风湿性关节炎。 
为了构建含有NF-KB启动子元件的载体，采用基于PCR的策略。上游引物含有NF-KB结合位点（GGGGACTTTCCC）（SEQ ID NO：59）的4个串联拷贝、与SV40早期启动子序列的5’端互补的18bp序列，且侧翼为XhoI位点： 
5′-GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG-3′（SEQ ID NO：60） 
下游序列与SV40启动子的3’端互补，且侧翼为HindIII位点：5′-GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC-3′（SEQ ID NO：55） 
使用从Clontech获得的pB-gal:启动子质粒中存在的SV40启动子模板进行PCR扩增。将如此得到的PCR片段用XhoI和HindIII消化，并亚克隆到BLSK2-（Stratagene）中。用T7和T3引物进行的测序证实了插入物含有如下序列： 
5’-CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT-3’（SEQ ID NO：61） 
接着，通过XhoI和HindIII用此NF-KB/SV40片段替换pSEAP2-启动子质粒（Clontech）中的存在的SV40最小启动子元件。然而，此载体不含新霉素抗性基因，因此不为哺乳动物表达系统所优选。 
为了产生稳定的哺乳动物细胞系，使用限制酶SalI和NotI将NF-KB/SV40/SEAP盒从上述NF-KB/SEAP载体中移出，并插入含有新霉素抗性的载体。具体而言，在用SalI和NotI将pGFP-1限制性消化后，将NF-KB/SV40/SEAP盒插入pGFP-1（Clontech），替换GFP基因。 
一旦创建NF-KB/SV40/SEAP/Neo载体，就根据实施例25中描述的方案创建并维持稳定的Jurkat T-细胞。类似的，实施例25还描述了使用这些稳定的Jurkat T-细胞来测定融合蛋白的方法。作为阳性对照，向孔H9、H10和H11中加入外源TNFα（0.1、1、10ng），其中通常观察到5-10倍的激活。 
实施例29：鉴定骨髓活性的测定法 
下面的方案用于通过测定融合蛋白是否增殖和/或分化骨髓细胞来评估本发明清蛋白融合蛋白的骨髓活性。使用实施例24中产生的GAS/SEAP/Neo构建物来评估骨髓细胞活性。如此，增加SEAP活性的倍数指示激活Jaks-STAT信号转导途径的能力。此测定法中使用的骨髓细胞是U937，一种前单核细胞细胞系，虽然也可以使用TF-1、HL60或KG1。 
为了用实施例24中产生的GAS/SEAP/Neo构建物瞬时转染U937细胞，使用DEAE-Dextran方法（Kharbanda等人，1994，Cell Growth & Differentiation 5：259-265）。首先，收集2x107个U937细胞并用PBS清洗。U937细胞通常在补充有100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的含有10%加热灭活的胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中培养。 
然后，将细胞悬浮于1ml含有0.5mg/ml DEAE-Dextran、8μg GAS-SEAP2质粒DNA、140mM NaCl、5mM KCl、375μM Na2HPO4.7H2O、1mM MgCl2和675μM CaCl2的20mM Tris-HCI(pH 7.4）缓冲液中。于37℃保温45分钟。用含有10%FBS的RPMI 1640培养基清洗细胞，然后重悬于10ml完全培养基，并于37℃保温36小时。 
通过在400μg/ml G418中培养细胞来获得GAS-SEAP/U937稳定细胞。使用不含G418的培养基进行常规培养，只是每1到2个月细胞应在400μg/ml G418中重新培养几代。 
为了测试这些细胞，收集1x108个细胞（这足够用于10个96孔板测定）并用PBS清洗。将细胞悬浮于200ml上文所述生长培养基，终密度为5x105细胞/ml。向96孔板的每个孔中加入200μl细胞（或1x105细胞/孔）。 
加入不同浓度的融合蛋白。于37℃保温48到72小时。可以使用100U/ml干扰素γ作为阳性对照，已知它激活U937细胞。在阳性对照孔中通常观察到超过30倍的诱导。根据本领域已知的方法和/或实施例25中描述的方案对上清液进行SEAP测定。 
实施例30：鉴定小分子浓度和膜通透性改变的测定法 
已知配体与受体的结合改变小分子，诸如钙、钾、钠和pH的胞内水平，并改变膜电位。这些改变可以在鉴定与特定细胞的受体结合的融合蛋白的测定法中进行测量。虽然下面的方案描述的是钙的测定法，但是此方案可以容易的修改以检测钾、钠、pH、膜电位或可由荧光探针检测的任何其它小分子的改变。 
下面的测定法使用荧光成像读板仪（“FLIPR”）来测量结合小分子的荧光分子（Molecular Probes）的改变。显然，可以使用检测小分子的任何荧光分子，替代本文使用的钙荧光分子，fluo-4（Molecular Probes,Inc.；产品目录编号F-14202）。 
对于粘附细胞，将细胞以10,000-20,000细胞/孔接种具有清澈底部的Co-star黑色96孔板。将平皿在CO2培养箱中保温20小时。将粘附细胞在Biotek洗涤器中用200μl HBSS（Hank氏平衡盐溶液）清洗两次，在最终的清洗后留下100μl缓冲液。 
在10%pluronic acid DMSO中制备1mg/ml fluo-4储液。为了使细胞负载fluo-4，向每个孔中加入50μl 12μg/ml fluo-4。将平皿在CO2培养箱中于37℃保温60分钟。将平皿在Biotek洗涤器中用HBSS清洗4次，并留下100μl缓冲液。 
对于非粘附细胞，将细胞从培养基中旋转沉淀。将细胞在50ml圆锥管中的HBSS中重悬至2-5x106个细胞/ml。向每毫升细胞悬浮液中加入4μl 1mg/ml fluo-4溶于10%pluronic acid DMSO的溶液。然后将管在37℃水浴中放置30-60分钟。细胞用HBSS清洗两次，重悬至1x106细胞/ml，并分配到微量培养板中，100μl/孔。将平皿以1000rpm离心5分钟。然后将平皿在Denley Cell Wash中用200μl清洗一次，随后通过吸取步骤达到100μl的终体积。 
对于基于非细胞的测定法，每个孔含有荧光分子，诸如fluo-4。向孔中加入本发明的融合蛋白，并检测荧光的改变。 
为了测量胞内钙的荧光，FLIPR设定如下参数：(1)系统增益300-800mW；(2)曝光时间0.4秒；(3)相机F/停止F/2；(4)激发488nm；(5)发射530nm；和(6)加样50μl。530nm的发射增加指示由本发明清蛋白融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白诱导的分子引起胞外信号事件，它导致胞内Ca++浓度增加。 
实施例31：鉴定酪氨酸激酶活性的测定法 
蛋白质酪氨酸激酶（PTK）代表一组多样的跨膜和细胞质激酶。在受体蛋白质酪氨酸激酶（RPTK）组中有多种促有丝分裂和代谢的生长因子的受体，包括PDGF、FGF、EGF、NGF、HGF和胰岛素受体亚家族。另外，存在RPTK大家族，其相应的配体是未知的。RPTK的配体主要包括分泌的小蛋白质，但也包括膜结合的和胞外的基质蛋白。 
配体对RPTK的激活牵涉配体介导的受体二聚化，导致受体亚基的转磷酸作用和胞质酪氨酸激酶的活化。胞质酪氨酸激酶包括与src家族的酪氨酸激酶（如src、yes、Ick、lyn、fyn）有关的受体和无受体连接的细胞溶质蛋白质酪氨酸激酶，诸如Jak家族，其成员介导由细胞因子受体超家族（如白介素、干扰素、GM-CSF和瘦蛋白）触发的信号转导。 
因为已知能够促进酪氨酸激酶活性的因子范围较广，所以对鉴定本发明的清蛋白融合蛋白或由本发明清蛋白融合蛋白诱导的分子是否能够激活酪氨酸激酶信号转导途径是感兴趣的。因此，下面的方案设计用于鉴定这种能够激活酪氨酸信号转导途径的分子。 
以每孔大约25,000个细胞的密度将靶细胞（如原代角质形成细胞）接种到购自Nalge Nunc（Naperville，IL）的96孔Loprodyne Silent Screen平皿中。平皿通过用100%乙醇漂洗两个30分钟进行灭菌，用水漂洗，并干燥过夜。一些平皿用100ml细胞培养级I类胶原（50mg/ml）、明胶（2%）或多聚赖氨酸（50mg/ml）（都可从Sigma Chemicals，St.Louis，MO购得）或10%Matrigel（购自Becton Dickinson，Bedford，MA），或牛血清包被2小时，用PBS漂洗，并保存于4℃。为了测定在这些平皿上生长的细胞，以5,000细胞/孔接种生长培养基上并在48小时后使用alamarBlue如制造商Alamar Biosciences,Inc.（Sacramento，CA）所述间接测定细胞的数量。使用Becton Dickinson（Bedford，MA）的Falcon平皿盖＃3071封盖Loprodyne Silent Screen平皿。Falcon Microtest III细胞培养平皿还可用于一些增殖实验。 
为了制备提取物，将A431细胞接种到Loprodyne平皿的尼龙膜上（20,000/200ml/孔），并在完全培养基中培养过夜。通过在无血清基础培养基中保温24小时使细胞静默（quiesce）。用EGF（60ng/ml）或不同浓度的本发明清蛋白融合蛋白处理5-20分钟后，除去培养基，并向每个孔中加入100ml提取缓冲液（20mM HEPES pH7.5、0.15M NaCl、1%Triton X-100、0.1%SDS、2mM Na3VO4、2mM Na4P2O7和从Boeheringer Mannheim（Indianapolis，IN） 获得的蛋白酶抑制物混合物（＃1836170）），并将平皿在旋转摇床上于4℃晃动5分钟。然后将平皿置于真空转移装置中，并使用室内真空器使提取物通过每个孔的0.45mm滤膜底过滤。提取物收集到真空装置底部的96孔捕获/测定平皿中并立即置于冰上。为了通过离心获得澄清的提取物，在洗涤剂溶解5分钟后，取出每个孔的内容物并于4℃以16,000xg离心15分钟。 
对经过过滤的提取物测试酪氨酸激酶活性的水平。虽然知道检测酪氨酸激酶活性的许多方法，本文只描述了其中一种方法。 
通常，本发明清蛋白融合蛋白的酪氨酸激酶活性是通过测定其磷酸化特定底物（生物素化的肽）上的酪氨酸残基的能力来评估的。可用于此目的的生物素化的肽包括PSK1（对应于细胞分裂激酶cdc2-p34的氨基酸6-20）和PSK2（对应于胃泌素的氨基酸1-17）。两种肽都是多种酪氨酸激酶的底物，且可从Boehringer Mannheim获得。 
通过按顺序添加下列组分建立酪氨酸激酶反应。首先，加入10μl 5μM生物素化的肽，然后是10μl ATP/Mg2+（5mM ATP/50mM MgCl2），然后是10μl 5x测定缓冲液（40mM咪唑氢氯化物pH7.3、40mM β-甘油磷酸、1mM EGTA、100mM MgCl2、5mM MnCl2、0.5mg/ml BSA），然后是5μl钒酸钠（1mM），然后是5μl水。轻轻混和各组分，并将反应混合物于30℃预保温2分钟。通过加入10μl对照酶或经过过滤的上清液而开始反应。 
随后加入10μl 120mm EDTA来终止酪氨酸激酶测定反应，并将反应置于冰上。 
通过将50μl反应混合物小样转移到微量滴定板（MTP）组件中并于37℃保温20分钟来测定酪氨酸激酶活性。这使得链霉亲和素包被的96孔平皿可与生物素化的肽相结合。用300μl/孔PBS清洗MTP组件4次。然后向每个孔中加入75μl与辣根过氧化物酶缀合的抗磷酸酪氨酸抗体（抗P-Tyr-POD，0.5u/ml），并于37℃保温1小时。如上所述洗孔。 
然后加入100μl过氧化物酶底物溶液（Boehringer Mannheim），并于室温保温至少5分钟（可长达30分钟）。使用ELISA读板仪测量样品在405nm处的吸光率。使用ELISA读板仪量化结合的过氧化物酶活性的水平，并反映酪氨酸激酶活性的水平。 
实施例32：鉴定磷酸化活性的测定法 
作为实施例31中描述的蛋白质酪氨酸激酶活性测定法的潜在选择和/或补充，还可使用检测主要胞内信号转导中间物的激活（磷酸化）的测定法。例如，如下所述，一种具体的测定法可检测Erk-1和Erk-2激酶的酪氨酸磷酸化。然而，其它分子，诸如Raf、JNK、p38MAP、Map激酶的激酶（MEK）、MEK激酶、Src、肌肉特异激酶（MuSK）、IRAK、Tec和Janus以及任何其它磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸或磷酸苏氨酸分子的磷酸化可通过用这些分子替换下述测定法中的Erk-1或Erk-2来检测。 
具体而言，通过将96孔ELISA平皿的孔用0.1ml蛋白G（1μg/ml）于室温（RT）包被2小时来制备测定平皿。然后经平皿用PBS漂洗，并用3%BSA/PBS于室温封闭1小时。然后将蛋白G平皿用针对Erk-1和Erk-2的2种商品化单克隆抗体（100ng/孔）处理（室温1小时）（Santa Cruz Biotechnology）。（为了检测其它分子，此步骤可以通过替换检测任意上述分子的单克隆抗体而容易的修改）用PBS漂洗3-5次后，将平皿保存于4℃直至使用。 
将A431细胞以20,000/孔接种96孔Loprodyne滤板，并在生长培养基中培养过夜。然后将细胞在基础培养基（DMEM）中饥饿培养48小时，然后用EGF（6ng/孔）或不同浓度的本发明融合蛋白处理5-20分钟。然后溶解细胞，并将提取物直接过滤到测定平皿中。 
与提取物一起于室温保温1小时后，将孔再次漂洗。作为阳性对照，使用MAP激酶的商品化制备物（10ng/孔）替换A431提取物。然后将平皿用特异识别Erk-l和Erk-2激酶的磷酸化表位的商品化多克隆（兔）抗体（1μg/ml）处理（室温1小时）。此抗体通过标准程序进行了生物素化。然后通过在Wallac DELFIA仪器（时间分辨荧光）中与铕-链霉亲合素和铕荧光增强试剂连续保温来测量结合的多克隆抗体。高于背景的荧光信号增加指示由本发明融合蛋白或本发明清蛋白融合蛋白诱导的分子产生的磷酸化。 
实施例33：磷酸化测定法 
为了测定本发明清蛋白融合蛋白的磷酸化活性，应用美国专利5,958,405中描述的磷酸化测定法（将其引入本文作为参考）。简要的说，可以通过用γ标记的32P-ATP磷酸化蛋白质底物并用γ放射性同位素计数器测定掺入的放射性来测量磷酸化活性。将本发明的融合蛋白与蛋白质底物、32P-ATP和激酶缓冲液一起保温。然后通过电泳将掺入底物的32P与游离的32P-ATP分开， 对掺入的32P计数并与阴性对照比较。高于阴性对照的放射性计数指示融合蛋白的磷酸化活性。 
实施例34：在存在肽配体时检测本发明清蛋白融合蛋白的磷酸化活性（活化作用） 
本领域已知的或本文描述的方法可用于测定本发明清蛋白融合蛋白的磷酸化活性。测定磷酸化活性的优选方法是使用US 5,817,471中描述的酪氨酸磷酸化测定法（引入本文作为参考）。 
实施例35：刺激骨髓CD34+细胞增殖的测定法 
此测定法是基于人CD34+在存在造血生长因子时增殖的能力，并评估本发明融合蛋白刺激CD34+细胞增殖的能力。 
先前已经证明大多数成熟的前体将仅应答单一信号。更多未成熟的前体需要至少两种信号以应答。因此，为了测试本发明融合蛋白对多种祖细胞的造血活性的影响，测定法在存在或不存在造血生长因子的条件下含有指定的本发明融合蛋白。将分离的细胞在存在干细胞因子（SCF）连同测试样品的条件下培养5天。SCF单独对骨髓（BM）细胞的增殖具有非常有限的效果，它在这种条件中仅作为“生存”因子。然而，在与对这些细胞显示刺激效果的任何因子（如IL-3）结合时，SCF将引起协同效应。因此，如果测试的融合蛋白对造血祖细胞中具有刺激效果，那么该活性可以容易的检测。由于正常BM细胞具有低水平的循环细胞(cycling cells)，因而有可能无法检测出指定融合蛋白的任何抑制效果。因此，对祖细胞的抑制效果的测定法优选在如下细胞中进行测试，该细胞首先用SCF+IL+3进行体外刺激，然后与要评估抑制该诱导增殖的化合物接触。 
简要的说，使用本领域已知的方法分离CD34+细胞。将细胞解冻并重悬于培养基（含1%L-谷氨酰胺的QBSF 60无血清培养基（500mI），Quality Biological,Inc.，Gaithersburg，MD，产品目录编号160-204-101）中。几次200xg的温和离心步骤后，使细胞休养1小时。将细胞数调至2.5x105细胞/ml。在此期间，向96孔平皿的外周孔中加入100μl无菌水。在此测定法中能够用本发明清蛋白融合蛋白测试的细胞因子有单独的50ng/ml rhSCF（R&DSystems，Minneapolis，MN，产品目录编号255-SC）及与rhSCF和30ng/ml  rhIL-3（R&D Systems，Minneapolis，MN，产品目录编号203-ML）联合。1小时后，将10μl准备好的细胞因子、不同浓度的本发明清蛋白融合蛋白、和20μl稀释细胞加入到已经存在于孔中的培养基中，使得最终的总体积为100μl。然后将平皿在37℃/5%CO2的培养箱中放置5天。 
测定法收获前18个小时，以10μl体积向每孔中加入0.5μCi/孔[3H]胸苷以测定增殖速率。试验通过使用Tomtec Harvester 96将细胞从每个96孔平皿收获到滤垫(filtermat)来终止。收获后，将滤垫干燥，整理并置于由一个OmniFilter平皿和一个OmniFilter盘组成的OmniFilter组件中。向每个孔中加入60μl Microscint，并用TopSeal-A强加密封膜密封平皿。在第一个平皿上粘贴一张条形码15贴纸以用于计数。然后将密封的平皿加载，通过Packard Top Count测定放射性水平，并收集打印的数据用于分析。放射性水平反映了细胞增殖的量。 
在本实施例中描述的研究测试指定融合蛋白促进骨髓CD34+细胞增殖的活性。本领域技术人员能够容易的修改示例的研究以测试本发明融合蛋白和多核苷酸（如基因治疗）及其激动物和拮抗物的活性。本发明清蛋白融合蛋白促进骨髓CD34+细胞增殖的能力指示清蛋白融合蛋白和/或与融合蛋白对应的多核苷酸对于诊断和治疗影响免疫系统和造血作用的疾病是有效的。代表性的用途描述于上文“免疫活性”和“传染病”部分，以及本文的其它地方。 
实施例36：胞外基质增强的细胞应答（EMECR）的测定法 
胞外基质增强的细胞应答（EMECR）的测定法的目的是评估本发明融合蛋白在胞外基质（ECM）诱导信号的背景下作用于造血干细胞的能力。 
细胞在从周围微环境中接收信号的背景下应答调控因子。例如，成纤维细胞及内皮和上皮干细胞在缺乏来自ECM的信号时无法复制。造血干细胞可以在骨髓中进行自我更新，但是在体外悬浮培养中无法进行。干细胞在体外进行自我更新的能力依赖于它们与基质细胞和ECM蛋白质纤连蛋白（fn）的相互作用。细胞与fn的粘附是由α5.β1和α4.β1整联蛋白受体介导的，它们由人和小鼠的造血干细胞表达。尚未鉴定出与ECM环境整合并负责刺激干细胞自我更新的因子。这些因子的发现在基因治疗和骨髓移植应用中将是极感兴趣的。 
简要的说，用fn片段以0.2μg/cm2的包被浓度包被聚苯乙烯未经组织培养处理的96孔平皿。在0.2ml无血清培养基中分发小鼠骨髓细胞（1,000细 胞/孔）。在存在IL-3（5ng/ml）+SCF（50ng/ml）的条件下培养的细胞将作为阳性对照，预计在此条件下干细胞很少自我更新但显著分化。在存在和不存在SCF（5.0ng/ml）的条件下用合适的阴性对照测试本发明的清蛋白融合蛋白，其中含有本发明清蛋白融合蛋白的施用组合物的体积占总测定体积的10%。然后通过在低氧环境（5%CO2、7%O2和88%N2）的组织培养培养箱中保温7天使分发的细胞生长。然后通过测量掺入细胞DNA的胸苷来测定孔中增殖细胞的数量。测定中阳性结果的证实需要细胞的表型鉴定，这可通过放大培养系统的规模和使用针对细胞表面抗原的合适抗体试剂和FACScan来进行。 
如果发现本发明的特定融合蛋白是造血祖细胞的刺激物，那么该融合蛋白以及与该融合蛋白对应的多核苷酸可能在例如影响免疫系统和造血作用的疾病的诊断和治疗中是有用的。代表性用途描述于上文“免疫活性”和“传染病”部分，以及本文的其它地方。融合蛋白可能在干细胞和各种血细胞谱系的定向祖细胞的扩增，以及各种细胞类型的分化和/或增殖中也是有用的。 
此外，本发明的清蛋白融合蛋白以及编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于抑制造血细胞的增殖和分化，并因此可用于在化疗期间保护骨髓干细胞免受化疗剂的作用。这种抗增殖效果可容许施用更高剂量的化疗剂，并因此进行更有效的化疗处理。 
此外，本发明的融合蛋白和编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸还可用于治疗和诊断造血相关紊乱，诸如贫血、全血细胞减少、白细胞减少、血小板减少或白血病，因为基质细胞在造血谱系细胞的产生中是重要的。用途包括骨髓细胞的离体培养、骨髓移植、骨髓重构、赘生物的放疗或化疗。 
实施例37：人真皮成纤维细胞和主动脉平滑肌细胞增殖 
将本发明的清蛋白融合蛋白加到正常人真皮成纤维细胞（NHDF）和人主动脉平滑肌细胞（AoSMC）的培养物中，每份样品进行两项共测定(co-assays)。第一项测定检查融合蛋白对正常人真皮成纤维细胞（NHDF）或主动脉平滑肌细胞（AoSMC）增殖的效果。成纤维细胞或平滑肌细胞的异常生长是几个病理过程的一部分，包括纤维化和再狭窄。第二项测定检查NHDF和SMC的IL6生成。IL6生成表明功能激活。激活细胞将增加多种细胞因子和其它因子的生成，可导致促炎或免疫调节后果。在有和没有共TNFa 刺激的条件下进行测定，以检查共刺激或抑制活性。 
简要的说，在第1天，96孔黑平皿设置为100μl培养基中的1000细胞/孔（NHDF）或2000细胞/孔（AoSMC）。NHDF培养基含有：Clonetics FB基础培养基、1mg/ml hFGF、5mg/ml胰岛素、50mg/ml庆大霉素、2%FBS，而AoSMC培养基含有Clonetics SM基础培养基、0.5gml hEGF、5mgml胰岛素、1μg/ml hFGF、50mg/ml庆大霉素、50μg/ml两性霉素B、5%FBS。于37℃保温至少4-5小时后，吸出培养基，替换为生长停滞培养基(Growth arrest media)。NHDF的生长停滞培养基含有成纤维细胞基础培养基、50mg/ml庆大霉素、2%FBS，而AoSMC的生长停滞培养基含有SM基础培养基、50mg/ml庆大霉素、50μg/ml两性霉素B、0.4%FBS。于37℃保温直至第2天。 
在第2天，设计本发明清蛋白融合蛋白的连续稀释物和模板，使得它们总是包括培养基对照和已知蛋白质对照。对于刺激和抑制两种实验，蛋白质都在生长停滞培养基中稀释。对于抑制实验，加入TNFa至终浓度2ng/ml（NHDF）或5ng/ml（AoSMC）的。加入1/3体积的含有对照或本发明清蛋白融合蛋白的培养基，并于37℃/5%CO2保温直至第5天。 
从每个孔转移60μl到另一个有标记的96孔平皿中，用平皿密封物封盖，并于4℃保存直到第6天（用于IL6 ELISA）。向细胞培养平皿中剩余的100μl，无菌加入相当于培养物体积10%（10μl）的Alamar Blue。将平皿放回培养箱3-4个小时。然后使用CytoFluor测量530nm处激发和590nm处发射的荧光。这产生了生长促进/抑制数据。 
在第5天，如下进行IL6 ELISA，用50-100μl/孔在PBS pH7.4中稀释的抗人IL6单克隆抗体包被96孔板，并于室温保温过夜。 
在第6天，向水槽中倒空平皿，并在纸巾上吸干。用4%BSA制备含有PBS的测定缓冲液。用200μl/孔PBS中的Pierce Super Block封闭缓冲液将平皿封闭1-2小时，然后用清洗缓冲液（PBS、0.05%Tween-20）清洗平皿。将平皿在纸巾上吸干。然后加入50μl/孔于0.5mg/ml稀释的抗人IL-6单克隆、生物素标记的抗体。将IL-6储液在培养基中稀释（30、10、3、1、0.3、0ng/ml）。向平皿的顶部行加入双份样品。封盖平皿，在摇床上于室温保温2小时。 
将平皿用清洗缓冲液清洗，并在纸巾上吸干。在测定缓冲液中1:1000稀释EU标记的链霉亲合素，并加入100μl/孔。封盖平皿并于室温保温1小时。将平皿再次用清洗缓冲液清洗，并在纸巾上吸干。 
加入100μl/孔的增强液。摇动5分钟。在Wallac DELFIA荧光计上对平皿读数。将每次测定中三份样品的读数制表并平均。 
此测定中的阳性结果说明AoSMC细胞增殖且清蛋白融合蛋白可能涉及真皮成纤维细胞增殖和/或平滑肌细胞增殖。阳性结果还暗示融合蛋白和编码清蛋白融合蛋白的多核苷酸的许多潜在用途。例如，炎症和免疫应答、伤口愈合和血管发生，正如本说明书全文所详述的。具体的说，融合蛋白可用于伤口愈合和皮肤再生，以及促进血管和淋巴管二者的脉管发生。脉管的生长可用于治疗例如心血管疾病。此外，在此测定法中显示拮抗活性的融合蛋白可能可通过作为抗血管剂（例如抗血管发成）有效的用于治疗涉及血管发生的疾病、紊乱和/或状况。这些疾病、紊乱和/或状况是本领域已知的和/或本文描述的，诸如例如恶性肿瘤、实体瘤、良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、和脓性肉芽肿；动脉粥样硬化斑块；眼的血管发生性疾病，例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生、发红、成视网膜细胞瘤、眼的葡萄膜炎和翼状胬肉（异常血管生长）；类风湿性关节炎；银屑病；伤口愈合迟缓；子宫内膜异位；血管新生(vasculogenesis)；肉芽形成；肥厚性瘢痕（瘢痕疙瘩）；不连接骨折；硬皮病；沙眼；血管粘附；心肌血管发生；冠状动脉侧枝；脑侧枝；动静脉畸形；缺血性四肢血管发生(ischemic limb angiogenesis)；奥-韦二氏综合症；斑块新血管形成；毛细管扩张；血友病性关节；血管纤维瘤；纤维肌肉发育异常；伤口肉芽形成；克罗恩氏病；和动脉粥样硬化。此外，在此测定法中作为拮抗物的清蛋白融合蛋白可用于治疗本领域已知的和/或本文描述的抗过度增殖性疾病和/或抗炎。 
实施例38：内皮细胞上的细胞粘附分子（CAM）表达 
淋巴细胞向炎症和血管发生区域的募集涉及淋巴细胞和血管内皮上的细胞表面粘附分子（CAM）之间的特异受体-配体相互作用。粘附过程在正常和病理条件中都遵循多步级联，它涉及内皮细胞（EC）上胞内粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、和内皮白细胞粘附分子-1（E-选择蛋白）的表达。这些分子和其它分子在血管内皮上的表达决定了白细胞可以在炎症反应期间粘附于局部血管系统并外渗到局部组织中的效率。细胞因子和生长因子的局部集中参与这些CAM的表达调控。 
简要的说，将内皮细胞（如人脐静脉内皮细胞（HUVEC））在标准96孔平皿中培养至汇合，从细胞除去生长培养基，并替换为100μl 199培养基（10%胎牛血清（FBS））。将测试样品（含有本发明的清蛋白融合蛋白）和阳性或阴性对照一式三份加到平皿中（10μl体积）。然后将平皿于37℃保温5小时（选择蛋白和整联蛋白表达）或24小时（仅整联蛋白表达）。将平皿抽吸以除去培养基，并向每个孔中加入100μl 0.1%低聚甲醛-PBS（具有Ca++和Mg++）。将平皿于4℃保持30分钟。从孔中除去固定液，将孔用PBS（+Ca、Mg）+0.5%BSA清洗1次并排干。向测试和对照孔中加入10μl经过稀释的一抗。抗ICAM-1-生物素、抗VCAM-1-生物素和抗E-选择蛋白-生物素以10μg/ml的浓度使用（0.1mg/ml抗体储液的1:10稀释液）。将细胞在潮湿环境中于37℃保温30分钟。将孔PBS（+Ca、Mg）+0.5%BSA清洗3次。向每个孔中加入20μl经过稀释的Extr亲合素-碱性磷酸酶（1:5,000稀释，在本文中称为使用稀释液），并于37℃保温30分钟。将孔用PBS（+Ca、Mg）+0.5%BSA清洗三次。每5ml甘氨酸缓冲液（pH10.4）中溶解1片对硝基苯酚磷酸酯pNPP。100μl氨基乙酸缓冲液中的pNPP底物将加入到每个检验孔。由Extr亲合素-碱性磷酸酶溶于甘氨酸缓冲液的使用稀释液制备一式三份的标准孔：1:5,000（100）>10-0.5>10-1>10-1.5。每个稀释度取5μl加入到一式三份的孔中，如此得到的每个孔中的AP含量为5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ng。然后向每个标准孔中加入100μl pNNP试剂。将平皿于37℃保温4小时。向所有孔中加入50μl体积的3M NaOH。在读板仪上于405nm对平皿读数，对仅装有甘氨酸缓冲液的空白孔使用背景扣除选项。此外，将模板设定为显示每个标准孔中AP-缀合物的浓度[5.50ng；1.74ng；0.55ng；0.18ng]。结果将显示为每个样品中结合的AP-缀合物的量。 
实施例39：Alamar Blue内皮细胞增殖测定法 
此测定法可用于定量测定由蛋白质介导的对bFGF诱导的牛淋巴内皮细胞（LEC）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）或人微血管子宫肌层细胞（UTMEC）增殖的抑制。此测定法掺入基于代谢活性检测的荧光生长指示剂。在添加10ng/ml bFGF作为内皮细胞刺激来源的EGM-2MV中预备标准Alamar Blue增殖测定。通过生长培养基和细胞浓度的微小改变，此测定法可将用于各种内皮细胞。将待测试蛋白质批次的稀释液适当稀释。使用不含bEGF的无血 清培养基作为无刺激对照，并包括制管张素或TSP-1作为已知的抑制对照。 
简要的说，将LEC、BAEC或UTMEC在生长培养基中以5000至2000细胞/孔的密度接种到96孔平皿中，并于37℃放置过夜。细胞保温过夜后，除去生长培养基，并替换为GIBCO EC-SFM。将细胞在一式三份孔中用本发明清蛋白融合蛋白或对照蛋白质样品的适当稀释液（在SFM中制备）进行处理，并添加bFGF至10ng/ml的浓度。一旦细胞用样品进行了处理，将平皿放回37℃培养箱中3天。3天后，向每个孔中加入10ml alamar blue储液（Biosource，产品目录编号DAL1100），并将平皿放回37℃培养箱中4个小时。然后使用CytoFluor荧光读数器在530nm激发和590nm发射对平皿读数。以相对荧光单位记录直接输出。 
Alamar blue是氧化-还原指示剂，荧光和颜色改变都反映由细胞生长导致的生长培养基的化学还原。当细胞在培养基中生长时，先天的代谢活性导致紧邻环境的化学还原。涉及生长的还原反应导致指示剂从氧化（无荧光的蓝色）形式变成还原（有荧光的红色）形式（即受到促进的增殖将产生更强的信号，而受到抑制的增殖将产生更弱的信号，总信号与细胞的总数以及它们的代谢活性成比例）。用单独的饥饿培养基观察活性的背景水平。将这与从阳性对照样品（生长培养基中的bFGF）和蛋白质稀释液中观察到的输出进行比较。 
实施例40：混合淋巴细胞反应的抑制的检测 
此测定法可用于检测和评估本发明融合蛋白对混合淋巴细胞反应（MLR）的抑制。MLR的抑制可能是由于对细胞增殖和活力的直接影响、相互作用细胞上共刺激分子的调节、淋巴细胞和附属细胞之间粘联的调节、佐细胞对细胞因子生成的调节。由于此测定法中所用的外周血单核级分包括T、B和自然杀伤淋巴细胞以及单核细胞和树突细胞，因而抑制MLR的清蛋白融合蛋白可针对多种细胞。 
将发现抑制MLR的本发明清蛋白融合蛋白可在与淋巴细胞和单核细胞激活或增殖有关的疾病中找到应用。这些包括但不限于诸如下列疾病，哮喘、关节炎、糖尿病、炎性皮肤状况、银屑病、湿疹、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、肾小球性肾炎、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、动脉硬化、硬化、移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病、肝炎、白血病和淋巴瘤。 
简要的说，使用淋巴细胞分离培养基（LSM
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，密度1.0770g/ml，Organon  Teknika Corporation，West Chester，PA）通过密度梯度离心纯化来自人供体的PBMC。将来自两个供体的PBMS在补充有10%FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640（Life Technologies，Grand Island，NY）中调至2x106细胞/ml。将来自第三供体的PBMC调至2x105细胞/ml。将50μl来自每个供体的PBMC加到96孔圆底微量滴定平皿的孔中。将融合蛋白测试材料的稀释液（50μl）一式三份加到微量滴定孔中。加入测试样品（目的蛋白质）至最终1:4稀释度；加入rhulL-2（R&D Systems，Minneapolis，MN，产品目录编号202-IL）至终浓度1μg/ml；加入抗CD4mAb（R&D Systems，克隆34930.11，产品目录编号MAB379）至终浓度10μg/ml。将细胞于37℃在5%CO2中培养7-8天，在培养的最后16个小时向孔中加入1μC[3H]胸苷。收集细胞，并用Packard TopCount测定胸苷掺入。数据表述为三份测定的平均值和标准偏差。 
在分开的实验中筛选目的融合蛋白的样本，并与抑制淋巴细胞增殖的阴性对照处理，抗CD4mAb以及增强淋巴细胞增殖的阳性对照处理，IL-2（重组材料或上清液）进行比较。 
实施例41：蛋白酶活性的测定法 
下面的测定法可用于评估本发明清蛋白融合蛋白的蛋白酶活性。 
明胶和酪蛋白酶谱法(zymography)本质上按照记载进行（Heusen等人，Anal.Biochem.102：196-202，1980；Wilson等人，Journal of Urology 149：653-658，1993）。将样品在含有1%明胶或酪蛋白的10%聚丙烯酰胺/0.1%SDS凝胶上进行电泳，在2.5%triton中于室温浸泡1小时，并在0.1M甘氨酸pH8.3中于37℃浸泡5-16小时。在酰胺黑中染色后，蛋白质水解区域显示为蓝黑背景中的清澈区。使用胰蛋白酶（Sigma T8642）作为阳性对照。 
还可以通过监测n-a-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）（Sigma B-4500）的切割来测定蛋白酶活性。在（25mM NaPO4、1mM EDTA和1mM BAEE），pH 7.5中设立反应。加入样品，并在Beckman DU-6分光光度计上以时间驱动模式监测260nm处吸光度的改变。使用胰蛋白酶作为阳性对照。 
通过测量280nm处的吸光度或使用Folin法的比色滴定，基于由酪蛋白或血红蛋白释放可溶肽的其它测定法如Bergmeyer等人，Methods of Enzymatic Analysis 5，1984）中所述进行。其它测定法牵涉显色底物的溶解（Ward，Applied Science 251-317，1983）。 
实施例42：鉴定丝氨酸蛋白酶底物特异性 
本领域已知的或本文描述的方法可用于测定具有丝氨酸蛋白酶活性的本发明清蛋白融合蛋白的底物特异性。测定底物特异性的优选方法是如GB 2324529（完整引入本文）中所述使用定位扫描合成组合库(positional scanning synthetic combinatorial libraries)。 
实施例43：配体结合测定法 
下面的测定法可用于评估本发明清蛋白融合蛋白的配体结合活性。 
配体结合测定法提供确认受体药理学的直接方法，并且适于高通量形式。将纯化的本发明清蛋白融合蛋白的配体放射性标记成高比活（50-2000Ci/mmol）以用于结合研究。随后确定放射性标记的过程没有消减配体对融合蛋白的活性。优化缓冲液、离子、pH和其它调节物诸如核苷酸的测定条件，从而对膜和全细胞多肽来源二者都建立可行的信噪比。对于这些测定法，特异的多肽结合定义为总的相关放射性减去存在过量未标记竞争性配体时测得的放射性。如果可能，使用超过一种竞争性配体来定义残余非特异性结合。 
实施例44：爪蟾卵母细胞中的功能测定法 
根据标准程序使用RNA聚合酶在体外合成编码本发明清蛋白融合蛋白的线性化质粒模板的加帽RNA转录物。将体外转录物以0.2mg/ml的终浓度悬浮于水中。从成年雌蟾蜍中取出卵巢叶，获得V阶段的去滤泡(defolliculated)卵母细胞，并使用显微注射装置以50nl推注(bolus)注射RNA转录物（10ng/卵母细胞）。使用两个电极电压钳来测量个别爪蟾卵母细胞应答融合蛋白和多肽激动剂暴露的电流。在无Ca2+Barth氏培养基中于室温进行记录。爪蟾系统可用于筛选已知配体和用于激活配体的组织/细胞提取物。 
实施例45：微生理功能测定测定法(Microphysiometric Assay) 
极其多种第二信使系统的激活导致少量酸从细胞中挤出。形成的酸主要是推动胞内信号过程所需的代谢活性增加的结果。细胞周围培养基中pH的改变是很小的，但是CYTOSENSOR微生理功能测定器（Molecular Devices  Ltd.，Menlo Park，Calif.）能检测到。CYTOSENSOR因此能够检测本发明清蛋白融合蛋白激活与能量利用胞内信号途径相关联的第二信使的能力。 
实施例46：提取物/细胞上清液筛选 
存在多种仍然还没有相关激活配体（激动剂）的哺乳动物受体。因而，这些受体的活性配体可能不包括在迄今鉴定的配体库中。因此，本发明的清蛋白融合蛋白还可针对组织提取物进行功能筛选（使用钙、cAMP、微生理功能测定器、卵母细胞电生理学等功能筛选）以鉴定本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分和/或清蛋白蛋白质部分的天然配体。产生阳性功能应答的提取物可以继续亚分级(subfractionate)直至分离和鉴定得到活性配体。 
实施例47：ATP结合试验 
下面的测定法可用于评估本发明融合蛋白的ATP结合活性。 
本发明清蛋白融合蛋白的ATP结合活性可使用美国专利5,858,719中描述的ATP结合测定法进行检测，将其完整引入本文作为参考。简要的说，在竞争性测定法中通过8-叠氮-ATP标记的光亲和力测量与本发明清蛋白融合蛋白结合的ATP。将含有1mg/ml ABC转运蛋白的反应混合液与不同浓度的ATP，或不能水解的ATP类似物腺嘌呤-5′-亚氨二磷酸一起于4℃保温10分钟。加入8-叠氮-ATP（Sigma Chem.Corp.，St.Louis，MO.）加8-叠氮-ATP（32P-ATP）（5mCi/μmol，ICN，Irvine，CA.）的混合物至100μM的终浓度，并将0.5ml小样置于冰上的瓷制点滴板的孔中。平皿用短波254nm UV灯在离平皿2.5cm的距离进行照射两个一分钟的时间间隔，其间有一个一分钟冷却间隔。加入终浓度2mM的二硫苏糖醇终止反应。将保温液进行SDS-PAGE电泳，干燥，并放射自显影。切下与本发明清蛋白融合蛋白对应的蛋白质条带，并测量放射性。随着ATP或腺嘌呤-5′-亚氨二磷酸渐增而降低的放射性提供了对融合蛋白的ATP亲和力的测量。 
实施例48：与本发明清蛋白融合蛋白相互作用的信号转导蛋白质的鉴定 
本发明的清蛋白融合蛋白可以作为研究工具，用于鉴定、表征和纯化信号转导途径蛋白质或受体蛋白质。简要的说，经过标记的本发明融合蛋白可作为试剂，用于纯化与其相互作用的分子。在亲和纯化的一个实施方案中， 将本发明的清蛋白融合蛋白与层析柱共价偶联。使源自假定靶细胞诸如癌组织的无细胞提取物流过柱子，而具有合适亲和力的分子与清蛋白融合蛋白结合。由柱子回收蛋白质复合物，解离，并对回收的分子进行N端蛋白质测序。此氨基酸序列随后用于鉴定捕获到的分子或设计用于从合适cDNA库中克隆相应基因的简并寡核苷酸探针。 
实施例49：IL-6生物测定法 
本领域知道多种用于测试本发明清蛋白融合蛋白的增殖效果的测定法。例如，这样一种测定法是Marz等所述的IL-6生物测定法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：3251-56，1998，将其引入本文作为参考）。于37℃保温68小时后，为了测量存活细胞的数量，加入四唑盐噻唑蓝（MTT）并于37℃再保温4小时。用SDS溶解B9细胞，并于570nm测量光密度。采用含有IL-6（阳性）和无细胞因子（阴性）的对照。（简要的说，将IL-6依赖性B9鼠细胞用无IL-6培养基清洗3次，并以每孔5,000细胞的浓度以50μl分配到平皿中，并加入50μl本发明的融合蛋白。）测试样品（含有本发明的清蛋白融合蛋白）中相对于阴性对照增强的增殖表明由融合蛋白介导的增殖效果。 
实施例50：鸡胚神经元存活的支持 
为了测试本发明的清蛋白融合蛋白是否支持交感神经元细胞的存活，可利用Senaldi等人的鸡胚神经元存活测定法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：11458-63，1998，将其引入本文作为参考）。简要的说，从鸡胚分离运动和交感神经元，分别重悬于L15培养基（含10%FCS、葡萄糖、亚硒酸钠、孕酮、伴清蛋白、腐胺和胰岛素；Life Technologies，Rockville，MD.）和Dulbecco氏改进的Eagles氏培养基（含10%FCS、葡萄糖、青霉素和25mM Hepes缓冲液(pH 7.2)；Life Technologies，Rockville，MD.），并在存在不同浓度的纯化的本发明融合蛋白时于37℃在5%CO2中保温，以及缺乏任何细胞因子的阴性对照。3天后，通过评估细胞形态学和使用Mosmann的比色测定法（Mosmann,T.，J.Immunol.Methods 65：55-63，1983）测定神经元存活。与缺乏细胞因子的对照相比增强的神经元细胞存活表明清蛋白融合蛋白增强神经元细胞存活的能力。 
实施例51：磷酸酶活性的测定法 
下面的测定法可用于评估本发明清蛋白融合蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（PTPase）活性。 
为了测定丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（PTPase）活性，可以利用本领域技术人员广泛知道的测定法。例如，本发明清蛋白融合蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（PSPase）活性可以使用New England Biolabs,Inc的PSPase测定试剂盒进行测量。在存在[32P]ATP时用cAMP依赖性蛋白激酶在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化髓磷脂碱性蛋白（MyBP），PSPase的底物。随后通过测量32P-标记MyBP释放的无机磷酸盐来测定蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性。 
实施例52：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶与其它蛋白质的相互作用 
具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的本发明融合蛋白（例如根据实施例51的测定）例如可作为研究工具，用于鉴定、表征和纯化其它相互作用的蛋白质或受体蛋白质，或其它信号转导途径蛋白质。简要的说，将经过标记的本发明融合蛋白可作为试剂，用于纯化与其相互作用的分子。在亲和纯化的一个实施方案中，将本发明的清蛋白融合蛋白与层析柱共价偶联。使来自推定靶细胞诸如神经或肝细胞的无细胞提取物流过柱子，而具有合适亲和力的分子与融合蛋白结合。从柱上回收融合蛋白-复合物，解离，并将回收的分子进行N端蛋白质测序。此氨基酸序列随后用于鉴定捕获到的分子或设计用于从合适cDNA库中克隆相应基因的简并寡核苷酸探针。 
实施例53：类肝素酶(heparanase)活性的测定法 
本领域知道可用于测定本发明清蛋白融合蛋白的类肝素酶活性的多种测定法。在一个实例中，本发明清蛋白融合蛋白的类肝素酶活性如Vlodavsky等人所述进行测定（Vlodavsky等人，Nat.Med.5：793-802，1999）。简要的说，将细胞溶解产物、条件培养基、完整细胞（每个35mm碟1x106细胞）、细胞培养上清液或纯化的融合蛋白于37℃pH 6.2-6.6与35S标记的ESC或源自峰I蛋白聚糖的可溶ECM一起保温18小时。将保温培养基离心，并在Sepharose CL-6B柱（0.9x 30cm）上通过凝胶过滤分析上清液。用PBS洗脱级分，并测量它们的放射性。硫酸类肝素侧链的降解片段在0.5<Kav<0.8（峰II）时从Sepharose 6B上洗脱。每个实验进行至少三次。如Vlodavsky 等人所述，与“峰II”对应的降解片段表明本发明清蛋白融合蛋白在切割硫酸类肝素中的活性。 
实施例54：生物分子的固定 
此实施例提供了用于在非宿主细胞脂双层构建物中稳定本发明清蛋白融合蛋白的方法（参见例如Bieri等人，Nature Biotech 17：1105-1108，1999，完整引入本文作为参考），它可适应上述各种功能测定法中本发明融合蛋白的研究。简要的说，将用于生物素化的碳水化合物特异性化学法用于将生物素标签限制于本发明的清蛋白融合蛋白，从而导致固定后统一的取向。将洗过的膜中50μM本发明清蛋白融合蛋白的溶液与20mM NaIO4和1.5mg/ml（4mM）BACH或2mg/ml（7.5mM）生物素-酰肼于室温保温1小时（反应体积，150μl）。然后将样品于4℃首先透析（Pierce Slidealizer Cassett，10kDa截留；Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）5小时，每个小时更换缓冲液，最后用500ml缓冲液R（0.15M NaCl、1mM MgCl2、10mM磷酸钠pH7）透析12小时。仅在加入比色杯前，将样品用缓冲液ROG50（补充有50mM辛基葡糖苷的缓冲液R）1:5稀释。 
实施例55：金属蛋白酶活性的测定法 
金属蛋白酶是肽水解酶，它利用金属离子诸如Zn2+作为催化机制。本发明清蛋白融合蛋白的金属蛋白酶活性可以根据本领域已知的方法来测定。提供了下面的示例性方法： 
α-2-巨球蛋白的蛋白水解
为了证实蛋白酶活性，将纯化的本发明融合蛋白与底物α-2-巨球蛋白（0.2单位/ml；Boehringer Mannheim，Germany）在1x测定缓冲液（50mM HEPES pH 7.5、0.2M NaCl、10mM CaCl2、25μM ZnCl2和0.05%Brij-35）中混合，并于37℃保温1-5天。使用胰蛋白酶作为阳性对照。阴性对照在测定缓冲液中仅含有α-2-巨球蛋白。收集样品，在含有5%2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸5分钟，然后加载到8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后，通过银染使蛋白质显影。通过与阴性对照相比更低分子量条带的出现证明了蛋白水解。 
金属蛋白酶的抑制物对2-巨球蛋白的蛋白水解的抑制
已知的金属蛋白酶抑制物（金属螯合剂（EDTA、EGTA和HgCl2）、肽金属蛋白酶抑制物（TIMP-1和TIMP-2）以及商品化小分子MMP抑制物）也可用于表征本发明清蛋白融合蛋白的蛋白水解活性。可以使用的三种合成MMP抑制物是：MMP抑制物I，[IC50=1.0μM对MMP-1和MMP-8；IC50=30μM对MMP-9；IC50=150μM对MMP-3]；MMP-3（溶基质蛋白酶-1）抑制物I，[IC50=5μM对MMP-3]，和MMP-3抑制物II，[Ki=130nM对MMP-3]；抑制物可从Calbiochem获得，产品目录编号分别是444250、444218和444225。简要的说，将不同浓度的小分子MMP抑制物与纯化的本发明融合蛋白（50μg/ml）在22.9μl 1x HEPES缓冲液（50mM HEPES pH 7.5、0.2M NaCl、10mM CaCl2、25μM ZnCl2和0.05%Brij-35）中混合，并于室温（24℃）保温2小时，然后加入7.1μl底物α-2-巨球蛋白（0.2单位/ml），并于37℃保温20小时。加入4x样品缓冲液来终止反应，并立刻煮沸5分钟。SDS-PAGE后，通过银染显现蛋白质条带。 
合成荧光肽底物切割测定法
具有已证实金属蛋白酶活性的本发明融合蛋白的底物特异性可以使用本领域已知的技术来测定，诸如使用合成荧光肽底物（购自BACHEM Bioscience Inc）。测试底物包括M-1985、M-2225、M-2105、M-2110和M-2255。前4种是MMP底物，最后一种是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）转化酶（TACE）的底物。这些底物优选在1:1的二甲基亚砜（DMSO）和水中制备。储液是50-500μM。使用配有恒温水浴的Perkin Elmer LS 50B发光分光计进行荧光测定。激发λ是328nm，发射λ是393nm。简要的说，如下进行测定，将176μl 1x HEPES缓冲液（0.2M NaCl、10mM CaCl2、0.05%Brij-35和50mM HEPES pH 7.5）和20μl底物溶液（50μM）于25℃保温15分钟，然后向测定比色杯中加入20μl纯化的本发明融合蛋白。底物的终浓度为1μM。对初始水解速率监测30分钟。 
实施例56：NOD小鼠中糖尿病的发生 
雌性NOD（无肥胖糖尿病）小鼠的特征是以与在人类中所发现的类似的病程显示IDDM，虽然疾病在雌性中比在雄性NOD小鼠更明显。在下文中，除非另有说明，术语“NOD小鼠”表示雌性NOD小鼠。NOD小鼠具有慢性自身免疫病引起的β细胞逐渐破坏。因此，NOD小鼠生命开始时具有正常血糖或正常的血糖水平。然而到约15-16周龄时，NOD小鼠开始变成 高血糖，这表明它们的大多数胰腺β细胞的破坏和相应的胰腺无能力产生足够的胰岛素。因此，疾病的起因和进展都与人IDDM患者类似。 
可以在雌性NOD/LtJ小鼠（可从The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Me.购得）中评估免疫方案功效的体内测定法。文献中报道80%的雌性小鼠在24周龄时形成糖尿病，胰岛炎的发作开始于6-8周龄之间。NOD小鼠是近交系，且高度响应多种免疫调控策略。成年NOD小鼠（6-8周龄）具有20-25g的平均重量。 
这些小鼠可以是未经处理的（对照），用本发明的治疗剂（如本发明的清蛋白融合蛋白及其片段和变体）单独或结合上文所述其它治疗性化合物处理的。这些不同疗法对糖尿病进展的效果可以如下测量： 
在14周龄时，可根据葡萄糖耐受确定雌性NOD小鼠的表型。葡萄糖耐受可以通过腹膜内葡萄糖耐受测试法（IPGTT）来测量。简要的说，在腹膜内注射葡萄糖（1g/kg体重）后的第0分钟和第60分钟从眶旁血管丛取血。正常耐受定义为第0分钟的血浆葡萄糖低于144mg%，或第60分钟低于160mg%。血糖水平是用Glucometer Elite装置测定的。 
基于此表型分析，可将动物分配到不同的试验组。具体的说，可以将具有升高的血糖水平的动物指定到葡萄糖耐受受损组。小鼠可以随意进食，并供应酸化水（pH2.3）。 
耐受和不耐受葡萄糖的小鼠可以进一步细分为对照组、本发明清蛋白融合蛋白组、和清蛋白融合蛋白/治疗性化合物组合组。对照组中的小鼠可每天接受载体的腹膜内注射，每周6次。清蛋白融合组中的小鼠可每天接受载体中的本发明治疗剂（如本发明的清蛋白融合蛋白及其片段和变体）的腹膜内注射，每周6次。清蛋白融合蛋白/治疗性化合物组合组中小鼠可如上所述接受清蛋白融合蛋白和治疗性化合物组合二者。 
NOD小鼠的尿糖水平可以用Labstix（Bayer Diagnostics，Hampshire，England）两周测定一次。体重和液体摄入也两周测定一次。在连续两次测定中出现糖尿之后确定糖尿病的发作。处理10周后，可以进行附加的IPGTT，并在第二天处死动物。 
经过10周疗程后，耐受和不耐受葡萄糖组中的对照动物分别以60%和86%的比例形成糖尿病（见美国专利号5,866,546，Gross等人）。因此，如果没有进行干预，即使在最初耐受葡萄糖的NOD小鼠中也出现高比例的糖尿病。 
可以通过测量治疗前后NOD小鼠中的血糖水平来证实结果。在描述的所有组中耐受和不耐受葡萄糖的两种小鼠的血糖水平都如上所述测量。 
在可选的实施方案中，本发明的治疗剂（例如作为SEQ ID NO：Y公开的特定融合蛋白及其片段和变体）可以使用光谱法分析来测量，并在注射前将适当数量的蛋白质重悬于每剂量50μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）。相隔一周的两次注射可皮下施用于每只小鼠的背部皮肤下。监测可以在免疫前两个分开的时期进行，且可以在治疗期间每周进行并在其后继续。可每周测试尿糖（Keto-Diastix.RTM.；Miles Inc.，Kankakee，Ill.），并可对糖尿小鼠检查血清葡萄糖（ExacTech.RTM.，MediSense,Inc.，Waltham，Mass.）。当禁食糖血症高于2.5g/L时诊断为糖尿病。 
实施例57：NOD小鼠的组织学检查 
NOD小鼠组织样品的组织学检查可以证明本发明组合物和/或本发明组合物与其它糖尿病治疗剂的组合增加胰腺中β细胞相对浓度的能力。实验方法如下： 
来自实施例56的小鼠可以在治疗阶段结束时处死，并从胰腺中取出组织样品。可将样品在溶于0.9%盐水的10%甲醛中固定，并包蜡。两组5个连续5μm切片可以以150μm的切割间隔切割以用于免疫标记。切片可以为胰岛素（豚鼠抗胰岛素抗血清1:1000稀释液，ICN Thames U.K.）和高血糖素（兔抗胰高血糖素抗血清1:2000稀释液）进行免疫标记，并用缀合了过氧化物酶的抗豚鼠（Dako，High Wycombe，U.K.）或缀合了过氧化物酶的抗兔血清（1:50稀释液，Dako）进行检测。 
本发明的组合物对于β细胞的可见质量(visible mass)可具有或不具有与其对耐受和不耐受葡萄糖的动物中糖尿病临床证明同样强的效果。 
实施例58：NIDDM的体内小鼠模型 
来自Jackson Laboratory（Bar Habor，ME）的雄性C57BL/6J小鼠可在3周龄时获得，并饲喂常规食物或富含脂肪（35.5%wt/wt；Bioserv.Frenchtown，NJ）或果糖（60%wt/wt；Harlan Teklad，Madison，Wl）的食物。常规食物由4.5%wt/wt脂肪、23%wt/wt蛋白质、31.9%wt/wt淀粉、3.7%wt/wt果糖和5.3%wt/wt纤维组成。高脂肪（猪油）食物由35.5%wt/wt脂肪、20%wt/wt蛋白质、 36.4%wt/wt淀粉、0.0%wt/wt果糖和0.1%wt/wt纤维组成。高果糖食物由5%wt/wt脂肪、20%wt/wt蛋白质、0.0%wt/wt淀粉、60%wt/wt果糖和9.4%wt/wt纤维组成。小鼠在22±3℃温度、50±20%湿度的12小时光照（上午6点到下午6点）/黑暗循环的控制室中饲养，每笼不超过5只（Luo等人，1998，Metabolism 47(6)：663-8，“Nongenetic mouse models of non-insulin-dependent diabetes mellitus”；Larsen等人，Diabetes 50(11)：2530-9，2001，“Systemic administration of the long-acting GLP-1 derivative NN2211 induces lasting and reversible weight loss in both normal and obese rats”）。给予相应的食物3周后，小鼠可腹膜内注射100mg/kg体重的链唑霉素，“STZ”（Sigma，St.Louis，MO）或载体（0.05mol/L柠檬酸pH4.5），并在接下来的4周保持同样的食物。在不禁食的条件下，通过剪去尾部末端在STZ后1、2和4周取血。将样品用于测量不禁食血浆的葡萄糖和胰岛素浓度。每周记录体重和食物摄取。 
为了直接测定高脂肪食物对胰岛素促进葡萄糖控制能力的影响，可在上文所述7周时期结束时对三组小鼠开始实验，即脂肪喂养小鼠、用载体注射的食物喂养小鼠、和用STZ注射的脂肪喂养小鼠。小鼠可在实验前禁食4小时。在第一组实验中，可通过吸入甲氧氟烷（Pitman-Moor，Mundelein，IL）麻醉小鼠。常规胰岛素（Sigma）可通过尾部静脉进行静脉内注射（[IV]0.1U/kg体重），并在注射后3、6、9、12和15分钟从不同尾部静脉取血。可对这些样品测定血浆葡萄糖浓度，并使用WinNonlin（Scientific Consulting，Apex，NC），一种药动学/药效学软件程序计算血浆中葡萄糖消失的半衰期（t1/2）。 
在第二组实验中，小鼠可通过腹膜内戊巴比妥钠（Sigma）麻醉。打开腹腔，暴露主要的腹部静脉，并插入24号IV导管（Johnson-Johnson Medical，Arlington，TX）。将导管固定在腹部静脉附近的肌肉组织上，在注射器连接的底部上切开，挂上预先注满的PE50塑料管，它继而连接装有灌注液的注射器。然后缝合腹腔。通过这种方法，将不存在血液从身体的较低部位回流的障碍。给小鼠以10μl/min灌注体积连续灌注葡萄糖（24.1mg/kg/min）和胰岛素（10mU/kg/min）。为了测量血浆葡萄糖和胰岛素浓度，可在灌注开始后90、105、120和135分钟采集眶后血液样品（每个70μl）。将这4个样品的平均值用于估算每个动物的稳定状态血浆葡萄糖（SSPG）和胰岛素（SSPI）浓度。 
最后，用于评估本申请的清蛋白融合蛋白，治疗性组合物，在单独施用或联合任何一种或多种为治疗糖尿病而列出的治疗性药物时降低血浆葡萄 糖能力的实验可在下列两组用STZ注射的“NIDDM”小鼠模型中进行：（1）脂肪喂养的C57BL/6J，和（2）果糖喂养的C57BL/6J。用于这些研究的小鼠的血浆葡萄糖浓度在255到555mg/dL的范围内。小鼠随机指定用载体、或是用本发明的清蛋白融合治疗剂单独或联合任何一种或多种为治疗糖尿病而列出的治疗性药物进行治疗。可施用总共三个剂量。可在首次服药之前和最后一次服药之后3小时采集尾部静脉血液样品用于测量血浆葡萄糖浓度。 
血浆葡萄糖浓度可使用来自Sigma的葡萄糖诊断试剂盒（Sigma No.315），一种酶比色测定法来测定。血浆胰岛素水平可使用来自Linco Research的小鼠胰岛素RIA试剂盒（＃RI-13K；St.Charles，MO）来测定。 
实施例59：确定涉及胰岛素作用的体外H4IIe-SEAP报道分子测定法 
各种H4IIe报道基因
H4IIe/rMEP-SEAP：分离自大鼠的苹果酸酶（rMEP）含有胰岛素途径中的PPAR-γ元件。将此报道分子构建物稳定转染到肝H4IIe细胞系中。 
H4IIe/SREBP-SEAP：固醇调控元件结合蛋白（SREBP-1c）是一种转录因子，它作用于多种胰岛素应答基因，例如脂肪酸合成酶（FAS）的启动子，并在成纤维细胞、脂细胞和肝细胞中调节脂肪酸代谢中关键基因的表达。SREBP-1c也称为脂肪细胞决定和分化因子1（ADD-1），认为是脂肪细胞中胰岛素影响基因表达的主要中介物。它的活性受到胰岛素、固醇和葡萄糖水平的调节。将此报道分子构建物稳定转染到肝H4IIe细胞系中。 
H4IIe/FAS-SEAP：脂肪酸合成酶报道分子构建物含有最小的SREBP响应性FAS启动子。将此报道分子构建物稳定转染到肝H4IIe细胞系中。 
H4IIe/PEPCK-SEAP：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）启动子是调节PECK活性的PEPCK基因转录的主要激素调控位点。PEPCK催化肝脏糖异生中的关键和限速步骤，因此必须小心控制从而将血糖水平维持在正常限度内。将此报道分子构建物稳定转染到肝H4IIe细胞系中。 
也可以将这些报道分子构建物稳定转染到3T3-L1成纤维细胞和L6成肌细胞中。然后如先前实施例13中所述使这些稳定细胞系分化成3T3-L1脂肪细胞和L6肌管。然后可以将分化的细胞系用于下文所述SEAP测定法。 
生长和测定培养基
生长培养基含有10%胎牛血清（FBS）、10%小牛血清、1%NEAA、 1x青霉素/链霉素、和0.75mg/ml G418（用于H4IIe/rFAS-SEAP和H4IIe/SREBP-SEAP）或0.50mg/ml G418（用于H4IIe/rMEP-SEAP）。对于H4IIe/PEPCK-SEAP，生长培养基由10%FBS、1%青霉素/链霉素、15mMHEPES缓冲盐水和0.50mg/ml G418组成。 
对于H4IIe/rFAS-SEAP、H4IIe/SREBP-SEAP、H4IIe/rMEP-SEAP报道基因，测定培养基由低葡萄糖DMEM培养基（Life Technologies）、1%NEAA、1x青霉素/链霉素组成。H4IIe/PEPCK-SEAP报道基因的测定法培养基由0.1%FBS、1%青霉素/链霉素、和15mM HEPES缓冲盐水组成。 
方法
将96孔平皿以75,000细胞/孔在100μl/孔生长培养基中接种，直到对数生长期的细胞变成贴壁的。通过将生长培养基替换为200μl/孔测定培养基，将细胞饥饿培养48小时。（对于H4IIe/PEPCK-SEAP细胞，以100μl/孔加入含有0.5μM地塞米松的测定培养基，并保温大约20小时）。随后将测定培养基替换为100μl/孔新鲜的测定培养基，并向孔中加入从表达本发明治疗剂（如本发明的清蛋白融合蛋白及其片段和变体）的转染细胞系获得的细胞上清液的50μl小样。使用来自空载体转染细胞系的上清液作为阴性对照。向孔中添加10nM和/或100nM胰岛素作为阳性对照。保温48小时后，收获条件培养基，并测量SEAP活性（Phospha-Light System protocol，Tropix ＃BP2500）。简要的说，将样品在稀释缓冲液中1:4稀释，并于65℃保温30分钟以灭活内源非胎盘形式的SEAP。将稀释样品的50μl小样与50μl SEAP测定缓冲液混合，后者含有对非胎盘SEAP同工酶有活性的抑制物混合物，并再保温5分钟。向混合液中加入在Emerald发光增强剂中1:20稀释的CSPD化学发光底物的50μl小样，并保温15-20分钟。将平皿在Dynex平皿光度计中进行读数。 
实施例60：转基因动物 
本发明的清蛋白融合蛋白也可在转基因动物中表达。任何物种的动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪、山羊、绵羊、牛和非人灵长类，如狒狒、猴子和猩猩都可用于产生转基因动物。在特定的实施方案中，使用本文所描述的或本领域其它途径知道的技术在人中表达本发明的融合蛋白，作为基因治疗方案的一部分。 
本领域已知的任何技术都可用于将编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸 导入动物以产生转基因动物的建立者系(founder lines)。这样的技术包括但不限于前核显微注射（Paterson等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.40：691-698，1994；Carver等人，Biotechnology(NY)11：1263-1270，1993；Wright等人，Biotechnology(NY)9：830-834，1991；及Hoppe等人，美国专利号4,873,191，1989）；逆转录病毒介导的基因转移至生殖系（Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-6152，1985）、胚泡或胚胎；胚胎干细胞中的基因靶向（Thompson等人，Cell 56：313-321，1989）；细胞或胚胎的电穿孔（Lo，1983，Mol.Cell.Biol.3：1803-1814，1983）；使用基因枪的本发明多核苷酸的导入（参见例如Ulmer等人，Science 259：1745，1993）；将核酸构建物导入胚胎多能干细胞并将干细胞转移回胚泡；及精子介导的基因转移（Lavitrano等人，Cell 57：717-723，1989）；等。这些技术的综述参见Gordon，“Transgenic Animals”，Intl.Rev.Cytol.115：171-229，1989），将其完整引入本文作为参考。 
可使用本领域已知的任何技术来产生含有编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的转基因克隆，例如将来自培养的胚胎、胎儿或诱导成静止的成体细胞的核核转移到去核的卵母细胞中（Campell等人，Nature 380：64-66，1996；Wilmut等人，Nature 385：810-813，1997）。 
本发明提供了在其所有细胞中携带编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸的转基因动物，以及在其一些但非所有细胞中携带这些核苷酸的动物，即嵌合动物或嵌合体。转基因可作为单一转基因或作为多拷贝例如多联体，如头对头串联或头对尾串联而整合。根据例如Lasko等人的教导，也可以将转基因选择性导入特定细胞类型并在其中激活（Lasko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236，1992）。这种细胞类型特异性激活所需的调控序列将取决于具体的目的细胞类型，而且对本领域技术人员是显而易见的。当期望编码本发明融合蛋白的多核苷酸整合到与本发明融合蛋白的治疗性蛋白质部分或清蛋白部分对应的内源基因的染色体位置时，基因打靶是优选的。简要的说，在使用这样的技术时，将含有一些与内源基因同源的核苷酸序列的载体设计用于通过与染色体序列的同源重组整合到内源基因的核苷酸序列中并破坏它的功能。根据例如Gu等人的教导，也可以将转基因选择性导入特定细胞类型，从而仅在该细胞类型中灭活内源基因（Gu等人，Science 265：103-106，1994）。这种细胞类型特异性灭活所需的调控序列将取决于具体的目的细胞类型，而且对本领域技术人员是显而易见的。 
一旦产生了转基因动物，可利用标准减少来测定重组基因的表达。通过Southern印迹分析或PCR技术分析动物组织来证实已经发生了编码本发明融合蛋白的多核苷酸的整合，由此完成初步筛选。还可使用下列技术来评估转基因动物的组织中编码本发明融合蛋白的多核苷酸的mRNA表达水平，包括但不限于从动物中获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析和逆转录PCR（rt-PCR）。表达融合蛋白的组织的样品还可以使用对融合蛋白特异的抗体进行免疫细胞化学或免疫组织化学评估。 
一旦产生了建立者动物，可以使它们交配、近交、远交或杂交以产生特殊动物的群体。这样的交配策略的例子包括但不限于：具有超过一个整合位点的建立者动物的远交，以建立隔离系(separate lines)；隔离系的近交，以产生由于每个转基因的附加表达的效果而以更高水平表达转基因的复合转基因动物；杂合转基因动物的杂交，以产生在指定整合位点纯合的动物，从而增加表达和消除通过DNA分析筛选动物的需要；隔离纯合系的杂交，以产生复合杂合或纯合系；及交配，以将转基因（即编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸）置于适于目的实验模型的独特背景。本发明的转基因动物的用途包括但不限于可用于在详细说明本发明融合蛋白和本发明融合蛋白的治疗性蛋白质和/或清蛋白组分的生物学功能、研究与异常表达有关的状况和/或疾病、以及筛选有效改善这些状况和/或紊乱的化合物的动物模型系统。 
实施例61：使用基因治疗的治疗方法-回体(ex vivo) 
基因治疗的一种方法将能够表达本发明清蛋白融合蛋白的成纤维细胞移植到患者身上。通常，通过皮肤活组织检查从受试者获得成纤维细胞。将如此获得的组织置于组织培养基中，并分为小块。将小块组织置于组织培养烧瓶的湿表面上，每个烧瓶中放置大约十块。将烧瓶上下颠倒，密闭，并于室温放置过夜。于室温放置24小时后，将烧瓶倒转，而组织块仍然固定在烧瓶底部，加入新鲜培养基（如含10%FBS、青霉素和链霉素的Ham氏F12培养基）。然后将烧瓶于37℃保温大约一周。 
此时，加入新鲜培养基，随后每几天进行更换。额外培养2周后，出现成纤维细胞单层。将细胞单层用胰蛋白酶消化，并放大规模至更大的烧瓶。 
将侧翼为Moloney鼠肉瘤病毒的长末端重复序列的pMV-7（Kirschmeier,P.T.等人，DNA 7：219-25，1988）用EcoRI和HindIII消化，然后用小牛肠磷酸酶 处理。将线性载体在琼脂糖凝胶上分级，并使用玻璃珠纯化。 
编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可使用本领域已知的技术产生，采用与其5’和3’端序列对应的PCR引物进行扩增，如果需要任选具有合适的限制性位点和起始/终止密码子。优选的是，5’引物含有EcoRI位点，而3’引物含有HindIII位点。将等量的Moloney鼠肉瘤病毒线性主链和扩增得到的EcoRI和HindIII片段在存在T4DNA连接酶时加到一起。在适于两种片段连接的条件下保持如此得到的混合物。然后将连接混合物用于转化细菌HB101，随后涂布在含有卡那霉素的琼脂上以证实载体中正确插入了目的基因。 
将双嗜性pA317或GP+aml2包装细胞在含10%小牛血清（CS）、青霉素和链霉素的Dulbecco氏改良的Eagles氏培养基（DMEM）中在组织培养中培养至汇合密度。然后向培养基中加入含有基因的MSV载体，用载体转导包装细胞。包装细胞现在产生含有基因的感染性病毒颗粒（包装细胞现在称为生产细胞）。 
向转导生产细胞中加入新鲜培养基，随后从汇合的生产细胞的10cm平皿收获培养基。使含有感染性病毒颗粒的用过的培养基通过微孔过滤器过滤以除去脱落的生产细胞，然后将此培养基用于感染成纤维细胞。从成纤维细胞的亚汇合平皿取出培养基，并更换成来自生产细胞的培养基。取出此培养基，并更换成新鲜培养基。如果病毒的滴度高，那么事实上所有成纤维细胞都将受到感染，而不需要进行选择。如果滴度很低，那么必须使用具有选择标记诸如neo或his的逆转录病毒载体。一旦有效感染了成纤维细胞，分析成纤维细胞以测定是否产生清蛋白融合蛋白。 
然后将经过改造的成纤维细胞单独或在cytodex 3微载体珠上生长至汇合后移植到宿主上。 
实施例62：使用基因治疗的治疗方法-体内 
本发明的另一个方面是使用体内基因疗法来治疗紊乱、疾病和状况。基因治疗方法涉及将编码本发明清蛋白融合蛋白的裸露核酸（DNA、RNA以及反义DNA或RNA）序列导入动物。编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可以与启动子或者由靶组织表达多肽所必需的任何其它基因元件可操作连接（即相连）。这样的基因治疗和投递技术及方法是本领域已知的，见例如WO 90/11092、WO 98/11779；美国申请号5693622、5705151、5580859；Tabata等人，Cardiovasc.Res.35(3)：470-479，1997；Chao等人，Pharmacol. Res.35(6)：517-522，1997；Wolff，Neuromuscul.Disord.7(5)：314-318，1997；Schwartz等人，Gene Ther.3(5)：405-411，1996；Tsurumi等人，Circulation 94(12)：3281-3290，1996（引入本文作为参考）。 
多核苷酸构建物可通过将可注射物质投递至动物细胞中的任何方法来投递，诸如注射至组织（心、肌肉、皮肤、肺、肝、肠等）胞间隙。多核苷酸构建物可以在制药学可接受液体或含水载体中投递。 
术语“裸露的”多核苷酸、DNA或RNA指序列游离于辅助、促进或加速进入细胞的任何投递载体，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂转染或沉淀试剂等。然而，编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸也可以在可通过本领域技术人员熟知的方法制备的脂质体制剂中投递（诸如Felgner P.L.等人，1995，Ann.NY Acad.Sci.772：126-139和Abdallah B.等人，1995，Biol.Cell 85(1)：1-7中所教导的）。 
用于基因治疗方法的多核苷酸载体构建物优选为既不会整合到宿主基因组中也不含允许复制的序列的构建物。可以使用本领域技术人员知道的任何强启动子来驱动DNA的表达。与其它基因治疗技术不同，将裸落的核酸序列导入靶细胞的一个主要优点是细胞中多核苷酸合成的短暂性质。研究表明可以将非复制DNA序列导入细胞，从而在可长达6个月的期间提供期望多肽的生成。 
可以将多核苷酸构建物投递至动物的组织胞间隙，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、软骨、胰、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺、和结缔组织。组织胞间隙包括细胞间液、器官组织的网状纤维间的粘多糖层、管壁或室壁中的弹性纤维、纤维组织的胶原纤维、或者纳入肌细胞的结缔组织或骨隙中的相同基质。由循环血浆和淋巴管道的淋巴液占据的空间也类似。由于下面讨论的原因优选投递至肌肉组织胞间隙。它们可以通过注射方便的投递至包含这些细胞的组织。它们优选投递至持久的、不分裂的已分化细胞并在其中表达，尽管投递和表达可以在未分化或者分化较不完全的细胞，诸如例如血液的干细胞或皮肤成纤维细胞中完成。在体内肌肉细胞在它们摄取和表达多核苷酸的能力方面特别胜任。 
对于裸露多核苷酸注射，DNA或RNA的有效剂量将在约0.05μg/kg体重至约50mg/kg体重的范围内。优选的是，剂量将是约0.005mg/kg至约20mg/kg且更优选约0.05mg/kg至约5mg/kg。当然，本领域普通技术人员将 领会，这个剂量将随着注射的组织部位而变化。核酸序列的适当且有效的剂量可由本领域普通技术人员容易的确定，而且可能取决于治疗的状况和施药途径。优选的施药途径是通过肠胃外注射途径至组织胞间隙中。然而，也可以使用其它肠胃外途径，诸如气雾剂吸入，特别适用于投递至肺或支气管组织、喉或鼻粘膜。此外，裸露多核苷酸构建物可在血管成形术过程中通过程序中使用的导管投递至动脉。 
体内肌肉注射多核苷酸的服药反应效果如下测定。依照常规重组DNA方法制备用于生成编码本发明多肽的mRNA的合适模板DNA。模板DNA，可能为环形的或线性的，或是作为裸露DNA使用或是与脂质体复合。随后给小鼠的四头肌注射不同量的模板DNA。 
五至六周龄的雌性和雄性Balb/C小鼠通过腹膜内注射0.3ml 2.5%阿佛丁来麻醉。在前大腿上做一1.5cm的切口，直接暴露四头肌。模板DNA在0.1ml载体中用1cc注射器通过27号针以一分钟注射，从肌肉末梢插入部位向膝盖约0.5cm并且约0.2cm深。为了将来的定位，在注射部位上缝合，并且皮肤用不锈钢夹闭合。 
在适当的保温时间（例如7天）后，通过切下整个四头肌来制备肌肉提取物。对个别四头肌的每五个15μm横向切片为蛋白质表达进行组织学染色。融合蛋白表达的时间过程可以相似形式完成，只是不同小鼠的四头肌在不同时间采集。注射后肌肉中DNA的持久性可由从注射小鼠和对照小鼠制备总细胞DNA和HIRT上清液的Southern印迹分析来测定。小鼠中上述实验的结果可用于外推合适的剂量以及在人和其它动物中使用裸露DNA的其它治疗参数。 
实施例63：本发明融合蛋白的生物学效果 
星形细胞和神经元测定法
可以对本发明的清蛋白融合蛋白测试在促进皮层神经元细胞的存活、神经突向外长出、或表型分化中的活性以及诱导胶质细胞原纤维酸性蛋白免疫阳性细胞，星形细胞增殖的能力。为生物测定法选择皮层细胞是基于皮层结构中FGF-1和FGF-2的普遍表达以及先前报道的因FGF-2处理引起的皮层神经元存活增强。例如，胸苷掺入测定法可用于阐明本发明清蛋白融合蛋白对这些细胞的活性。 
此外，先前描述FGF-2（基础FGF）在体外对皮层或海马神经元的生物 学效果的报道已经证实神经元存活和神经突向外长出二者的增加（Walicke等人，“Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extension”，Proc.Nntl.Acad.Sci.USA 83：3012-3016，1986，将测定法完整引入本文作为参考）。然而，来自对PC-12细胞所做实验的报告表明这两种应答不必是同义的，而是可能不仅取决于测试的是哪种FGF还取决于靶细胞上表达的是哪种受体。使用原代皮层神经元培养模本，本发明清蛋白融合蛋白诱导神经突向外长出的能力可与例如使用胸苷掺入测定法用FGF-2实现的应答进行比较。 
成纤维细胞和内皮细胞测定法
从Clonetics（San Diego，CA）获得人肺成纤维细胞，并在从Clonetics获得的生长培养基中维持。皮肤微血管内皮细胞从Cell Applications（San Diego，CA）获得。对于增殖测定法，可将人肺成纤维细胞和皮肤微血管内皮细胞在96孔平皿中在生长培养基中以5,000细胞/孔培养1天。然后将细胞在0.1%BSA基础培养基中保温1天。在用新鲜的0.1%BSA培养基更换培养基后，将细胞与本发明蛋白质的测试融合蛋白一起保温3天。向每个孔中加入Alamar Blue（Alamar Biosciences，Sacramento，CA）至终浓度10%。将细胞保温4个小时。通过CytoFluor荧光读数器中的读数测量细胞活力。对于PGE2测定法，将人肺成纤维细胞在96孔平皿中以5,000细胞/孔培养1天。在将培养基更换为0.1%BSA基础培养基后，将细胞与FGF-2或本发明的融合蛋白一起在含有或不含IL-lα的条件下保温24个小时。收集上清液并用EIA试剂盒（Cayman，Ann Arbor，MI）测定PGE2。对于IL-6测定法，将人肺成纤维细胞在96孔平皿中以5,000细胞/孔培养1天。在将培养基更换为0.1%BSA基础培养基后，将细胞与FGF-2或者在含有或不含本发明清蛋白融合蛋白和/或IL-lα的条件下保温24小时。收集上清液并用ELISA试剂盒（Endogen，Cambridge，MA）测定IL-6。 
在加入Alamar Blue以评估对成纤维细胞生长的效果之前，将人肺成纤维细胞与FGF-2或本发明的清蛋白融合蛋白一起在基础培养基中培养3天。FGF-2应当在10-2500ng/ml显示刺激效果，这可用于与本发明的融合蛋白比较刺激效果。 
基于[3H]胸苷掺入的细胞增殖
下面的[3H]胸苷掺入测定法可用于测量治疗性蛋白质，例如生长因子蛋 白对诸如成纤维细胞、上皮细胞或未成熟肌肉细胞等细胞的增殖效果。 
通过在不含血清的培养基中培养18小时，将亚汇合培养物阻滞在Gl阶段。然后加入治疗性蛋白质达24小时，并在最后的4小时用[3H]胸苷标记培养物，终浓度为0.33μM（25Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL）。掺入的[3H]胸苷用冰冷的10%三氯乙酸沉淀24小时。随后，将细胞连续用冰冷的10%三氯乙酸随后用冰冷的水漂洗。在0.5M NaOH中溶解后，合并溶解产物和PBS漂洗液（500ml），并测量放射性的数量。 
帕金森模型
帕金森病中的运动功能丧失要归咎于因黑质纹状体多巴胺能投射神经元退化引起的纹状体多巴胺缺乏。已经广泛鉴定的帕金森病动物模型牵涉系统施用l-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）。在CNS中，MPTP由星形细胞摄取，而由一元胺氧化酶B分解代谢为1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）并释放。随后，MPP+在多巴胺能神经元中通过多巴胺的高亲和力再摄取转运蛋白积极积累。然后MPP+在线粒体中通过电化学梯度集中并选择性抑制烟酰胺腺嘌呤二磷酸:泛醌氧化还原酶（复合物1），由此干扰电子转运并最终产生氧自由基。 
已经在组织培养范例中证实了FGF-2（基础FGF）具有针对黑质多巴胺能神经元的营养活性（Ferrari等人，Dev.Biol.1989）。近来，Unsicker博士的团队已经证实了以凝胶泡沫植入物在纹状体中施用FGF-2导致近乎完全保护黑质多巴胺能神经元免于与MPTP暴露有关的毒性（Otto和Unsicker，J.Neuroscience，1990）。 
根据FGF-2的数据，可以评估本发明的清蛋白融合蛋白以确定它是否具有与FGF-2在体外增强多巴胺能神经元存活中相似的作用，而且还可以在体内测试保护纹状体中的多巴胺能神经元免于与MPTP处理有关的损伤的作用。首先在体外在多巴胺能神经元细胞培养范例中检验本发明清蛋白融合蛋白的潜在作用。为了制备培养物，从妊娠14天Wistar大鼠胚胎解剖中脑底板。用胰蛋白酶解离组织，并以200,000细胞/cm2接种到polyorthinine-层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片上。在Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基和含有激素补充物（N1）的F12培养基中维持细胞。8天后在体外用低聚甲醛固定培养物，并为酪氨酸羟化酶(多巴胺能神经元的特殊标记）的免疫组织化学染色进行加工。从胚胎大鼠制备解离的细胞培养物。培养基每三天一换，并在那时加入因子。 
由于多巴胺能神经元是从妊娠14天的动物分离的，那时的发育时间已经过了多巴胺能前体细胞增殖的阶段，因此酪氨酸羟化酶免疫阳性神经元在数量上的增加将代表体外存活的多巴胺能神经元数量的增加。因此，如果本发明的治疗性蛋白质起到延长多巴胺能神经元存活的作用，那么表明该融合蛋白可能涉及帕金森病。 
实施例64：胰腺β-细胞移植联合治疗 
移植是自身免疫病的常见治疗形式，尤其是当靶自身组织已经严重受损时。例如，而非限于，胰腺移植和胰岛细胞移植是IDDM的常见治疗选择（见例如Stewart等人，Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 86(3)：984-988，2001；Brunicardi，Transplant.Proc.28：2138-40，1996；Kendall和Robertson，Diabetes Metab.22：157-163，1996；Hamano等人，Kobe J.Med.Sci.42：93-104，1996；Larsen和Stratta，Diabetes Metab.22：139-146，1996；及Kinkhabwala等人，Am.J.Surg.171：516-520，1996）。正如任何移植方法一样，自身免疫病患者的移植治疗包括将宿主排斥移植组织的风险降到最低的处理。然而，自身免疫病包括牵涉破坏最初自身组织的预先存在的宿主自身免疫应答将对移植组织产生相同损坏效果的附加的、独立的风险。因此，本发明涵盖在接受自身免疫病的移植治疗的个体中使用本发明的清蛋白融合蛋白联合免疫调节剂/免疫抑制剂来治疗自身免疫性胰腺疾病的方法和组合物。 
根据本发明，施用上文描述的基于清蛋白融合物的组合物和制剂来预防和治疗由宿主个体最初针对最初自身组织的自身免疫应答对移植器官、组织或细胞产生的损害。可以在移植前和移植后以每次相距一周的2至4个剂量进行施药。 
下面的免疫调节剂/免疫抑制剂，包括但不限于AI-401、CDP-571（抗TNF单克隆抗体）、CG-1088、Diamyd（糖尿病疫苗）、ICM3（抗ICAM-3单克隆抗体）、利诺胺（Roquinimex）、NBI-6024（改变的肽配体）、TM-27、VX-740（HMR-3480）、胱天蛋白酶8蛋白酶抑制剂、沙利度胺、hOKT3gammal（Ala-ala）（抗CD3单克隆抗体）、口服干扰素-α、口服乳酸杆菌以及LymphoStat-BTM，可以与本发明的清蛋白融合物治疗剂一起在胰岛细胞和胰腺移植中使用。 
实施例65：VH和VL结构域的鉴定和克隆 
从表达特定抗体的细胞系鉴定和克隆VH和VL结构域的一种方法是用 VH和VL特异引物对从抗体表达细胞系制备的cDNA进行PCR。简要的说，从细胞系分离RNA，并在设计用于扩增EBV细胞系表达的抗体VH和VL结构域的RT-PCR中用作模板。可以用TRlzol 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285803201
试剂（Life Technologies，Rockville.MD）溶解细胞，并用五分之一体积的氯仿抽提。加入氯仿后，使溶液于室温保温10分钟，并于4℃在台式离心机中在14,000rpm离心15分钟。收集上清液，并用等体积的异丙醇沉淀RNA。通过在台式离心机中于4℃以14,000rpm离心15分钟来沉降沉淀的RNA。离心后，丢弃上清液并用75%乙醇清洗。清洗后，将RNA再次于4℃以800rpm离心5分钟。丢弃上清液并使沉淀物空气干燥。将RNA溶于DEPC水中并加热至60℃达10分钟。可通过光密度测量法来测定RNA的数量。 
可以按照本领域众所周知的方法从1.5-2.5微克RNA用逆转录酶和随机六聚物引物合成cDNA。随后将cDNA作为PCR扩增VH和VL结构域的模板。用于扩增VH和VL基因的引物显示于表7。典型的是，PCR反应使用单一的5′引物和单一的3′引物。有时，当可获得的RNA模板的数量有限时，或者为了更高的效率，可以使用成组的5′和/或3′引物。例如，在单一PCR反应中有时使用所有五种VH-5′引物和所有JH3′引物。PCR反应在含有1XPCR缓冲液、2mM每种dNTP、0.7个单位的高保真Taq聚合酶、5′引物混合物、3′引物混合物和7.5微升cDNA的50微升体积中进行。VH和VL二者的5′和3′引物混合物可通过分别合并22pmole和28pmole的每种个别引物来制备。PCR条件为：96℃5分钟；随后25个循环的94℃1分钟、50℃1分钟、和72℃1分钟；随后一个延伸循环的72℃10分钟。反应完成后，将样品管贮存于4℃。 
表7：用于扩增VH和VL结构域的引物序列
Figure DEST_PATH_BDA00002106285803202
Figure DEST_PATH_BDA00002106285803211
然后将PCR样品在1.3%琼脂糖凝胶上电泳。可以从凝胶上切下预期大小的DNA条带（VH结构域是约506碱基对，而VL结构域是344碱基对），并用本领域众所周知的方法纯化。可以将纯化的PCR产物连接到PCR克隆载体中（来自Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA的TA载体）。可以在转染大肠杆菌和蓝/白颜色选择后分离个别克隆的PCR产物。然后可以将克隆的PCR产物用本领域普遍知道的方法测序。 
含有VH结构域和VL结构域的PCR条带还可用于创建全长Ig表达载体。可以将VH和VL结构域克隆到含有重链（例如人IgG1或人IgG4）或轻链（人κ或人λ）恒定区的核苷酸序列的载体中，使得在转染到适当的宿主细胞中后，可以从这些载体表达完整的重链或轻链分子。此外，当克隆的重链和轻链均在一个细胞系中表达时（从一种个或两种载体），它们可以装配成完整的功能性 抗体分子，分泌到细胞培养基中。用编码VH和VL抗体结构域的多核苷酸产生编码完整抗体分子的表达载体的方法是本领域众所周知的。 
实施例66：HA-细胞因子或HA-生长因子融合蛋白（诸如NGF、BDNFa、BDNFb和BDNFc）的制备 
目的细胞因子或生长因子诸如NGF的cDNA可以通过多种方法来分离，包括从cDNA库，通过RT-PCR和通过采用一系列交叠合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用标准方法。所有这些蛋白质的核苷酸序列是已知的且可获得的。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将NGF（或其它细胞因子）cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。然后可以从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见实施例1）。然后切下此表达盒并插入到适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。 
实施例67：HA-IFN融合蛋白（诸如IFNa）的制备 
目的干扰素诸如IFNa的cDNA可以通过多种方法来分离，包括但不限于从cDNA库，通过RT-PCR和通过采用一系列交叠合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用标准方法。干扰素诸如IFNa的核苷酸序列是已知的且是可获得的，例如在美国专利5,326,859和4,588,585、EP 32 134以及诸如GenBank等公共数据库中。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将IFNa（或其它干扰素）cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。然后可以从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见 实施例1）。然后切下此表达盒并插入到适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。 
从管中的最大蛋白质回收
本发明的清蛋白融合蛋白具有高度稳定性，即使在它们以低浓度包装时。此外，尽管蛋白质浓度低，仍然观察到好的融合蛋白回收率，即使在水溶液不含为了使与管壁的结合降至最低而加入的其它蛋白质时。将以管贮存的HA-IFN溶液的回收与储液进行比较。将6或30μg/ml HA-IFN溶液置于管中并贮存于4℃。48或72小时后，取出最初与10ng样品相当的体积并用IFN夹心ELISA测量。将估计值与高浓度储液进行比较。正如所证明的，这些管中的样品本质上没有损失，说明为了防止样品因管壁的损失而加入外源物质诸如清蛋白不是必需的。 
HA-α-IFN融合物的体内稳定性和生物利用度
为了测定HA-α-IFN融合分子的体内稳定性和生物利用度，对猴子施用纯化的融合分子（来自酵母）。由HA-α-IFN融合物配制的药物组合物可导致血清半衰期和生物利用度提高。因此，可以配制与天然α-干扰素分子相比含有较低剂量α-干扰素活性的药物组合物。 
含有HA-α-IFN融合物的药物组合物可用于在患有可通过施用α-IFN来调节的任何疾病或疾病状态的患者中治疗或预防疾病。这样的疾病包括但不限于毛细胞性白血病、卡波西氏肉瘤、生殖和肛门疣、慢性乙型肝炎、慢性非甲非乙型肝炎，特别是丙肝、丁肝、慢性髓细胞性白血病、肾细胞癌、膀胱癌、卵巢和宫颈癌、皮肤癌、复发性呼吸机乳头瘤病(recurrent respirator papillomatosis)、非霍奇金氏和皮肤T-细胞淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、AIDS、多发性硬化症、成胶质细胞瘤等（见Interferon Alpha，在《AHFS Drug Information》中，1997）。 
因此，本发明包括含有HA-α-IFN融合蛋白、多肽或肽且以正确剂量配制用于人类施用的药物组合物。本发明还包括治疗需要这种治疗的患者的方法，它包括施用含有至少一种HA-α-IFN融合蛋白、多肽或肽的药物组合物的至少一个步骤。 
双功能HA-α-IFN融合物
HA-α-IFN表达载体可以修饰成包含用于表达双功能HA-α-IFN融合蛋白的插入物。例如，可以在移除双重终止密码子或移动到编码序列下游后，将第二目的蛋白的cDNA以相同读码框插入“rHA-IFN”序列的下游。 
在双功能HA-α-IFN融合蛋白的一个版本中，可将针对B-淋巴细胞刺激 物蛋白质（GenBank编号4455139）或多肽的抗体或片段融合在融合分子的HA成分的一个末端。这种双功能蛋白质对调节由融合物的α-IFN成分产生的任何免疫应答是有用的。 
实施例68：HA-激素融合蛋白的制备 
目的激素的cDNA可以通过多种方法来分离，包括但不限于从cDNA库，通过RT-PCR和通过采用一系列交叠合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用标准方法。所有这些蛋白质的核苷酸序列是已知的且是可获得的，例如在诸如GenBank等公共数据库中。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将激素cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。然后可以从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见实施例1）。然后随后切下此表达盒并插入到适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。 
实施例69：HA-可溶性受体或HA-结合蛋白融合蛋白的制备 
目的可溶性受体或结合蛋白的cDNA可以通过多种方法来分离，包括但不限于从cDNA库，通过RT-PCR和通过采用一系列交叠合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用标准方法。所有这些蛋白质的核苷酸序列是已知的且是可获得的，例如在GenBank中。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将受体cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。然后可以从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见实施例1）。然后切下此表达盒并插入适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。 
实施例70：HA-生长因子的制备 
目的生长因子的cDNA可以通过多种方法来分离，包括但不限于从cDNA库，通过RT-PCR和通过采用一系列交叠合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用标准方法（见GenBank编号NP_000609）。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将生长因子cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。然后从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见实施例1）。然后切下此表达盒并插入到适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。 
实施例71：HA-单链抗体融合蛋白的制备 
单链抗体通过几种方法制备，包括但不限于：从噬菌体库中选择，通过克隆抗体的cDNA并使用侧翼恒定区作为引物克隆可变区来克隆特定抗体的可变区，或者通过合成与任何特定抗体的可变区对应的寡核苷酸。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将细胞cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。 
在本发明的融合分子中，VH和VL可以通过下面的一种方法或其组合来连接：VH的C-末端和VL的N-末端之间的肽接头；VH和VL之间的Kex2p蛋白酶切割位点，使得二者可以在分泌后切开且随后自我缔合；以及胱氨酸残基，其位置使得VH和VL能够在它们之间形成二硫键以将它们连接在一起。可选选项是将VH置于HA或HA结构域片段的N-末端并将VL置于HA或HA结构域片段的C-末端。 
然后可以从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的 表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见实施例1）。然后切下此表达盒并插入到适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。用这种方式制备的抗体可以从培养基纯化，并用标准免疫化学方法测试其与抗原的结合。 
实施例72：HA-细胞粘附分子融合蛋白的制备 
目的细胞粘附分子的cDNA可以通过多种方法来分离，包括但不限于从cDNA库，通过RT-PCR和通过采用一系列交叠合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用标准方法。已知的细胞粘附分子的核苷酸序列是已知的且是可获得的，例如在GenBank中。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将细胞粘附分子cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。然后从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见实施例1）。然后切下此表达盒并插入到适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。 
实施例73：抑制因子和肽作为HA融合蛋白（诸如HA-抗病毒药、HA-抗生物质(antibiotic)、HA-酶抑制剂和HA-抗变应蛋白）的制备 
目的肽诸如抗生肽的cDNA可以通过多种方法来分离，包括但不限于从cDNA库，通过RT-PCR和通过采用一系列交叠合成寡核苷酸引物的PCR，所有均使用标准方法。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将肽cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。然后从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见实施例1）。然后切下此表达盒并插入到适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。 
实施例74：靶向HA融合蛋白的制备 
目的蛋白质的cDNA可以使用标准分子生物学方法从cDNA库中分离或者可以用几种交叠寡核苷酸合成制备。可以改造cDNA中的适当核苷酸以形成方便的限制性位点并容许将蛋白质cDNA附着于清蛋白cDNA。同样，可以将能够在细胞内引导蛋白质的靶向蛋白质或肽cDNA诸如单链抗体或肽，诸如核定位信号融合在清蛋白的另一端。将目的蛋白质和靶向肽克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，从而导致与清蛋白cDNA的融合。在这种方式中，清蛋白的N-和C-两个末端都融合有其它蛋白质。然后从pPPC0005中切出融合的cDNA并插入到诸如pSAC35等质粒中，从而可以在酵母中表达清蛋白融合蛋白。所有上述程序可以使用分子生物学的标准方法来执行。可以从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白，并使用适当的生化和生物学测试法测试其生物学活性和其靶向活性。 
实施例75：HA-酶融合物的制备 
目的酶的cDNA可以通过多种方法来分离，包括但不限于从cDNA库，通过RT-PCR和通过使用一系列交叠合成寡核苷酸引物的PCR，均使用标准方法。cDNA可以在5′和3′端修剪以产生限制性位点，使得可以使用寡核苷酸接头将cDNA克隆到含有HA的cDNA的载体中。这可以是在N或C-末端，使用或不用间隔物序列。将酶cDNA克隆到诸如pPPC0005（图2）、pScCHSA、pScNHSA或pC4:HSA等载体中，然后从其中切下完整表达盒并插入到质粒pSAC35中，从而可以在酵母菌中表达清蛋白融合蛋白。然后可以从培养基收集并纯化酵母分泌的清蛋白融合蛋白并测试其生物学活性。对于在哺乳动物细胞系中的表达，采用相似的程序，只是所用的表达盒采用哺乳动物启动子、前导序列和终止子（见实施例1）。然后切下此表达盒并插入到适于转染哺乳动物细胞系的质粒中。 
实施例76：构建物ID 2053，IFNb-HSA的产生 
构建物ID 2053，pEE12.1:IFNb.HSA在NSO表达载体pEE12.1中包含编码具有全长IFNb蛋白质的IFNb-清蛋白融合蛋白的DNA，其中包括与HSA成熟形式的氨基末端融合的天然IFNb前导序列。 
IFNb cDNA的克隆
使用下文所述引物IFNb-1和IFNb-2PCR扩增编码IFNb的多核苷酸，用Bam HI/Cla I切割，并连接到经Bam HI/Cla I切割的pC4:HSA中，产生构建物2011。将构建物ID#2011的Eco RI/Eco RI片段亚克隆到pEE12.1的Eco RI位点中，产生构建物ID#2053，它包含编码清蛋白融合蛋白的DNA，该融合蛋白含有前导序列和IFNb成熟形式，后面是成熟HSA蛋白质。 
合成适于PCR扩增编码全长IFNb的多核苷酸的两条寡核苷酸，IFNb-1和IFNb-2： 
IFNb-1：5′-GCGCGGATCCGAATT 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285803281
ACCAACAAGTGTCTCCTCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAGCTCTTTCCATGAGCTACAACTTGCTTGG-3’(SEQ ID NO:107) 
IFNb-2：5′-GCGCGCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCGTTTCGGAGGTAACCTGT-3′(SEQ ID NO:108) 
IFNb-1引物掺入了BamHI克隆位点（下划线显示）、Eco RI克隆位点、和Kozak序列（斜体显示），后面是编码全长形式IFNb的头27个氨基酸的80个核苷酸。在IFNb-2中，Cla I位点（下划线显示）及其后的DNA为编码成熟HSA蛋白质（SEQ ID NO：1）的头10个氨基酸的DNA的反向互补序列，而最后的18个核苷酸为编码IFNb的最后6个氨基酸残基的DNA的反向互补序列（见实施例2）。用这些引物产生PCR扩增物，纯化，用Bam HI和Cla I限制酶消化，并克隆到pC4:HSA载体的Bam HI和Cla I位点中。在确认序列后，将含有IFNb-清蛋白融合蛋白表达盒的Eco RI片段亚克隆到经Eco RI消化的pEE12.1中。 
此外，通过氨基酸测序对所表达清蛋白融合蛋白N-末端的分析可以证实预期IFNb序列的存在（见下文）。 
本发明的IFNb-清蛋白融合蛋白优选包含HSA的成熟形式即Asp-25至Leu-609，它融合在IFNb的成熟形式即Met-22至Asn-187的N-或C-末端。在本发明的一个实施方案中，本发明的IFNb-清蛋白融合蛋白还包含用于在用于表达的宿主的分泌途径中引导初生融合多肽的信号序列。在另一个优选的实施方案中，由信号序列编码的信号肽遭到切除，而成熟的IFNb-清蛋白融合蛋白直接分泌到培养基中。本发明的IFNb-清蛋白融合蛋白可包含异源信号序列，包括但不限于MAF、INV、Ig、纤蛋白B、簇蛋白、胰岛素样生 长因子结合蛋白4、HSA前导序列变体包括但不限于嵌合HSA/MAF前导序列、或本领域已知的其它异源信号序列。在一个优选的实施方案中，本发明的IFNb-清蛋白融合蛋白包含天然的IFNb。在另一个优选的实施方案中，本发明的IFNb-清蛋白融合蛋白还包含N-末端甲硫氨酸残基。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸，包括片段和/或变体。 
构建物ID 2053的表达和纯化
在鼠骨髓瘤NSO细胞系中的表达 
通过本领域已知的方法将构建物ID#2053，pEE12.1:IFNb-HSA电穿孔到NSO细胞中（见实施例6）。 
从NSO细胞上清液纯化 
从NSO细胞上清液纯化IFNb-HSA可包括在pH7.4用20mM Tris-HCl中0到1M的NaCl梯度进行的Q-Sepharose阴离子交换层析，随后是在pH6.5用5至40mM的柠檬酸钠梯度进行的Poros PI 50阴离子交换层析，并6DV渗滤至10mM柠檬酸盐pH6.5和140mM NaCl即最后的缓冲组合物中。N-末端测序应当得到序列MSYNLL，它是IFNb成熟形式的氨基末端。蛋白质具有约88.5kDa的分子量。 
对于更大规模的纯化，例如，可以将50升NSO细胞上清液浓缩至约8-10升。然后使浓缩样品流过pH7.5的Q-Sepharose阴离子交换柱（10x 19cm，1.5L），采用由50mM NaOAc pH6.0和150mM NaCl组成的分布洗脱。然后可以将洗脱的样品用0.75%Triton-X 100于室温灭活病毒60分钟。然后可以采用在pH 6.0使用50mM NaOAc和150mM NaCl的SDR-反相层析（10cm x10cm，0.8L），或者可以使样品流过pH4.8的SP-Sepharose柱，采用50mM NaOAc pH6.0和150mM NaCl的分布洗脱。随后通过DV 50过滤以除去任何病毒内容物。随后可以是pH6.0的Phenyl-650M层析（20cm x 12cm，3.8L），采用由350mM(NH4)2SO4和50mM NaOAc组成的或者由50mM NaOAc pH6.0组成的分布洗脱。6-8DV的渗滤可以将缓冲液更换成10mM Na2HPO4+58mM蔗糖+120mM NaCl pH7.2或10mM柠檬酸盐pH6.5和140mMNaCl或25mM Na2HPO4、100mM NaCl pH7.2的预期最终配制缓冲液。 
IFNb的活性可以用体外ISRE-SEAP测定法来测定
所有I型干扰素蛋白质通过公用受体复合物和类似的Jak/STAT信号路径来发信号，后者在通过干扰素序列应答元件“ISRE”激活干扰素“IFN”应 答基因中达到峰值。I型IFN活性的方便测定法是基于启动子-报道基因的测定系统，它含有与下游报道基因融合的多个拷贝ISRE元件。可产生稳定的HEK293细胞系，并含有对I型IFN极其敏感且在超过5个对数浓度上显示出线性的稳定整合拷贝的ISRE-SEAP报道基因。 
IFNb-HSA NSO稳定克隆的筛选方法 
如实施例6所述将构建物2053电穿孔到NSO细胞中。通过在ISRE-SEAP测定法中测试条件生长培养基对经构建物ID#2053转染的NSO细胞筛选活性。将ISRE-SEAP/293F报道细胞在处理前一天以3x104细胞/孔分配到经聚-D-赖氨酸包被的96孔平皿中。用各种稀释度（包括但不限于1:500和1:5000）的条件上清液或由构建物ID 2053编码的IFNb-清蛋白融合蛋白的纯化制备物或者作为对照的rhIFNb处理报道细胞。然后将报道细胞保温24小时，随后取出40μl，用于SEAP报道基因化学发光测定法（Roche产品目录编号1779842）。使用重组人干扰素β，“rhIFNb”（Biogen），作为阳性对照。 
结果 
NSO表达的IFNb-HSA的纯化制备物具有比EC50值为1.8×10-10g/ml（见实施例4）的rhIFNb（Biogen）更大的EC50值，为9.3×10-9g/ml。 
干扰素对OAS的体内诱导
方法 
OAS酶，2′-5′-寡腺苷酸合成酶在应答抗病毒感染中由干扰素在转录水平激活。干扰素构建物的效果可以通过从接受处理的猴子获得血样并对这些样品分析两种OAS mRNA，p41和p69的转录激活作用来测量。可从每组4只动物在每个动物的7个不同时间点，第0天、第1天、第2天、第4天、第8天、第10天、和第14天获得0.5ml体积的全血。不同的组可包括注射赋形剂对照、第一天静脉内和/或皮下注射30μg/kg和/或300μg/kg IFN-清蛋白融合蛋白、及第1、3和5天皮下注射40μg/kg干扰素α（Schering-Plough）作为阳性对照。p41和p69mRNA转录本的水平可使用对p41-OAS和p69-OAS特异的探针通过实时定量PCR（Taqman）来测定。OAS mRNA水平可相对于18S核糖体RNA内源对照进行定量。 
由构建物ID 2053编码的干扰素β-清蛋白融合物对OAS的体内诱导
方法 
由构建物2053编码的HSA-IFNb融合蛋白的活性可以通过体内OAS测 定法来测定，正如先前上文在副标题“干扰素对OAS的体内诱导”中所述。 
实施例77：IFNb-清蛋白融合蛋白的适应症 
IFNβ-清蛋白融合蛋白（包括但不限于由构建物2053编码的那些）可用于治疗、预防、改善和/或检测多发性硬化症。其它适应症包括但不限于病毒感染，包括严重急性呼吸道综合症（SARS）和其它冠状病毒感染；纤丝病毒，包括但不限于埃博拉病毒和马尔堡病毒；沙粒病毒，包括但不限于Pichende病毒、拉沙病毒、胡宁病毒、马丘坡病毒、瓜纳瑞托病毒；和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）；布尼亚病毒，包括但不限于庞塔托鲁病毒、克里米亚半岛-刚果出血热病毒、白蛉热病毒、立夫特山谷热病毒、拉克罗斯病毒、和汉坦病毒；黄病毒，包括但不限于黄热病、斑齐病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、蜱媒脑炎、鄂木斯克出血热、和科萨努尔森林病病毒；披膜病毒，包括但不限于委内瑞拉、东方、和西方马脑炎病毒、罗斯河病毒、和风疹病毒；正痘病毒，包括但不限于痘苗、牛痘、天花、和猴痘；疱疹病毒；流感A/B；呼吸道合胞病毒（RAV）；副流感；麻疹；鼻病毒；腺病毒；塞姆利基森林病毒；病毒性出血热；杆状病毒；副粘病毒，包括但不限于尼帕病毒和亨德拉病毒；及由美国疾病控制和预防中心确定为高度优先的疾病因子的其它病毒因子（即A、B、和C类因子；见例如Moran，Emerg.Med.Clin.North.Am.20(2)：311-30，2002及Darling等人，Emerg.Med.Clin.North Am.20(2)：273-309，2002）。 
实施例78：构建物ID 2249，IFNa2-HSA的产生 
构建物ID 2249，pSAC35:IFNa2.HSA在酿酒酵母表达载体pSAC35中包含编码IFNa2-清蛋白融合蛋白的DNA，该融合蛋白具有HSA嵌合前导序列，后面是IFNa2蛋白质的成熟形式即C1-E165，融合在HSA成熟形式的氨基末端。 
IFNa2 cDNA的克隆
使用下文所述引物IFNa2-1和IFNa2-2PCR扩增编码IFNa2的多核苷酸。用Sal I/Cla I切割PCR扩增物，并连接到经Xho I/Cla I切割的pScCHSA中。构建物ID＃2249编码清蛋白融合蛋白，它含有嵌合HSA前导序列、IFNa2的成熟形式，后面是成熟HSA蛋白质。 
合成适于PCR扩增编码IFNa2成熟形式的多核苷酸的两条寡核苷酸， IFNa2-1和IFNa2-2： 
IFNa2-1：5′-CGCGCGCGTCGACAAAAGATGTGATCTGCCTCAAACCCACA-3’(SEQ ID NO:109) 
IFNa2-2：5′-GCGCGCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCT-3′(SEQ ID NO:110) 
IFNa2-1引物掺入Sal I克隆位点（下划线显示）、编码嵌合HSA前导序列的最后三个氨基酸残基的核苷酸、及编码IFNa2成熟形式的头7个氨基酸残基的22个核苷酸（粗体显示）。在IFNa2-2中，Cla I位点（下划线显示）及其后的DNA为编码成熟HSA蛋白质的头10个氨基酸的DNA的反向互补序列，而最后的22个核苷酸（粗体显示）为编码IFNa2的最后7个氨基酸残基的DNA的反向互补序列（见实施例2）。用这些引物产生IFNa2-HSA的PCR扩增物，纯化，用Sal I和Cla I限制酶消化，并克隆到pScCHSA载体的Xho I和Cla I位点中。确认序列后，将编码此IFNa2-清蛋白融合蛋白的表达盒亚克隆到经Not I消化的pSAC35中。 
此外，通过氨基酸测序对所表达清蛋白融合蛋白N-末端的分析可以证实预期的IFNa2序列的存在（见下文）。 
通过本领域已知的方法构建了采用不同前导序列的其它IFNa2-清蛋白融合蛋白（见实施例2）。各种前导序列的例子包括但不限于转化酶“INV”（构建物2343和2410）和交配α因子“MAF”（构建物2366）。可以如先前所述（见实施例5）将这些IFNa2-清蛋白融合蛋白亚克隆到诸如pC4（构建物2382）和pEE12.1等哺乳动物表达载体中。还可以构建治疗性部分融合于HSA C-末端的IFNa2-清蛋白融合蛋白（构建物2381）。 
本发明的IFNa2-清蛋白融合蛋白优选包含HSA的成熟形式即Asp-25至Leu-609，它融合在IFNa2的成熟形式即Cys-1至Glu-165的N-或C-末端。在本发明的一个实施方案中，本发明的IFNa2-清蛋白融合蛋白还包含在用于表达的宿主的分泌途径中引导初始融合多肽的信号序列。在另一个优选的实施方案中，由信号序列编码的信号肽遭到切除，而成熟的IFNa2-清蛋白融合蛋白直接分泌到培养基中。本发明的IFNa2-清蛋白融合蛋白可包含异源信号序列，包括但不限于MAF、INV、Ig、纤蛋白B、簇蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白4、HSA前导序列变体包括但不限于嵌合HSA/MAF前导序列、或本领域已知的其它异源信号序列。在一个优选的实施方案中，本发明的IFNa2-清蛋白融合蛋白包含天然的IFNa2。在另一个优选的实施方案中，本 发明的IFNa2-清蛋白融合蛋白还包含N-末端甲硫氨酸残基。本发明还涵盖编码这些多肽的多核苷酸，包括片段和/或变体。 
构建物ID 2249的表达和纯化
在酿酒酵母中的表达 
通过本领域已知的方法将构建物2249转化到酿酒酵母菌株BXP10中（见实施例3）。可在生长72小时后收集稳定阶段的细胞。通过将细胞以3000g离心10分钟来收集上清液。使用抗HSA血清（Kent Laboratories）或者作为一抗通过免疫印迹检测来检验表达水平。可获得分子量大约88.5kDa的IFNa2-清蛋白融合蛋白。 
从酿酒酵母细胞上清液纯化 
含有在酿酒酵母细胞中由构建物ID＃2249表达的IFNa2-清蛋白融合蛋白的细胞上清液可使用Dyax肽亲和柱进行小规模（见实施例4），或者通过如下5步进行大规模纯化：渗滤、用DEAE-Sepharose Fast Flow柱进行的阴离子交换层析、用Butyl 650S柱进行的疏水相互作用层析（HIC）、用SP-Sepharose Fast Flow进行的阳离子交换层析或Blue-Sepharose层析、以及用Q-Sepharose高效柱进行的高效层析（见实施例4）。IFNa2-清蛋白融合蛋白可从DEAE-Sepharose Fast Flow柱上用100-250mM NaCl、从SP-Sepharose Fast Flow柱上用150-250mM NaCl、和在5-7.5mS/cm从Q-Sepharose高效柱上洗脱。N-末端序列应当得到与IFNa2成熟形式一致的序列CDLPQ（SEQ ID NO：98）。 
IFNa2的活性可以用体外ISRE-SEAP测定法来测定
方法 
可如先前实施例76所述对由构建物ID＃2249编码的IFNa2-清蛋白融合蛋白在ISRE-SEAP测定法中测试活性。简要的说，条件酵母上清液以1:1000的稀释度测试其在ISRE-SEAP/293F报道细胞系上指导ISRE信号转导的能力。将ISRE-SEAP/293F报道细胞在处理前一天以3x104细胞/孔分配到经聚-D-赖氨酸包被的96孔平皿中。然后将报道细胞保温18至24小时，随后取出40μl，用于SEAP报道基因化学发光测定法（Roche产品目录编号1779842）。使用重组人干扰素β，“rhIFNb”（Biogen），作为阳性。 
结果 
IFNa2-HSA的纯化制备物在ISRE-SEAP测定法中在浓度范围10-1至101ng/ml（见图5）或者10-10至10-8ng/ml（见图6）上展示相对线性的增加。 
由构建物ID 2249编码的干扰素α融合物对OAS的体内诱导
方法 
OAS酶，2′-5′-寡腺苷酸合成酶在应答抗病毒感染中由干扰素在转录水平激活。干扰素构建物的效果可以通过从接受处理的猴子获得血样并对这些样品分析两种OAS mRNA，p41和p69的转录激活作用来测量。从每组4只动物在每个动物的7个不同时间点，第0天、第1天、第2天、第4天、第8天、第10天、和第14天获得0.5ml体积的全血。不同的组包括赋形剂对照、第1天静脉内注射30μg/kg HSA-IFN、第1天皮下注射30μg/kg HSA-IFN、第1天皮下注射300μg/kg HSA-IFN、及第1、3和5天皮下注射40μg/kg干扰素α（Schering-Plough）作为阳性对照。p41和p69mRNA转录本的水平使用对p41-OAS和p69-OAS特异的探针通过实时定量PCR（Taqman）来测定。OAS mRNA水平相对于18S核糖体RNA内源对照进行定量。由构建物2249编码的清蛋白融合可进行类似的实验。 
结果 
在用HSA-干扰素处理的猴子中观察到p41和p69两种OAS的mRNA转录本水平的显著增加，与用IFNa处理的猴子形成对比（p41数据见图7）。作用持续近10天。 
实施例79：IFNa2-清蛋白融合蛋白的适应症 
IFNα-清蛋白融合蛋白（包括但不限于由构建物2249、2343、2410、2366、2382和2381编码的那些）可用于治疗、预防、改善和/或检测多发性硬化症。其它适应症包括但不限于病毒感染，包括严重急性呼吸道综合症（SARS）和其它冠状病毒感染；纤丝病毒(filovirus)，包括但不限于埃博拉病毒(Ebola virus)和马尔堡病毒(Marburg virus)；沙粒病毒(Arenavirus)，包括但不限于Pichende病毒、拉沙病毒(Lassa virus)、胡宁病毒(Junin virus)、马丘坡病毒(Machupo virus)、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)；和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）；布尼亚病毒(Bunyavirus)，包括但不限于庞塔托鲁病毒(Punta toro virus)、克里米亚半岛-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、白蛉热病毒(sandfly fever virus)、立夫特山谷热病毒(Rift Valley fever virus)、拉克罗斯病毒(La Crosse virus)、和汉坦病毒(hantavirus)；黄病毒(Flavivirus)，包括但不限于黄热病、斑齐病毒(Banzi virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、登革 热病毒、日本脑炎病毒、蜱媒脑炎、鄂木斯克出血热(Omsk Hemorrhagic fever)、和科萨努尔森林病病毒(Kyasanur Forest Disease virus)；披膜病毒(Togavirus)，包括但不限于委内瑞拉、东方、和西方马脑炎病毒、罗斯河病毒(Ross River virus)、和风疹病毒；正痘病毒，包括但不限于痘苗、牛痘、天花、和猴痘；疱疹病毒；流感A/B；呼吸道合胞病毒（RAV）；副流感；麻疹；鼻病毒；腺病毒；塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)；病毒性出血热；杆状病毒；副粘病毒，包括但不限于尼帕病毒(Nipah virus)和亨德拉病毒(Hendra virus)；及由美国疾病控制和预防中心确定为高度优先的疾病因子的其它病毒因子（即A、B、和C类因子；见例如Moran，Emerg.Med.Clin.North.A m.20(2)：311-30，2002及Darling等人，Emerg.Med.Clin.North Am.20(2)：273-309，2002）。 
优选的是，IFNa-清蛋白融合蛋白或IFN杂化物融合蛋白与CCR5拮抗剂联合施用，进而与利巴韦林(ribavirin)、IL-2、IL-12、喷他夫西(pentafuside)中的至少一种单独联合或联合抗HIV药物治疗，例如HAART，用于制备在未接受过治疗及接受过治疗的成人和小儿患者中治疗HIV-1感染、HCV、或HIV-1和HCV共感染的药物。 
实施例80：构建物＃3691，BNP-HSA的产生 
构建物ID＃3691，pC4:SPCON.BNP1-32/HSA在哺乳动物表达载体pC4中包含编码BNP-清蛋白融合蛋白的DNA，它具有共有前导序列，secrecon，后面是融合在HSA成熟形式氨基末端的经过加工的、有活性的BNP肽（氨基酸1-32）。 
用于构建物3691的BNP cDNA的克隆
使用下文所述引物BNP-1和BNP-2PCR扩增编码BNP的多核苷酸，用Bam HI/Cla I切割，并连接到经BamHI/Cla I切割的pC4:HSA中，产生构建物ID＃3691。构建物ID＃3691编码清蛋白融合蛋白，它含有共有前导序列（SEQ ID NO：111）和经过加工的活性形式的BNP，后面是成熟的HSA蛋白质（见表2中构建物3691的SEQ ID NO：321）。 
合成适于PCR扩增编码有活性的、经过加工形式的BNP的多核苷酸的两条核苷酸，BNP-1和BNP-2： 
BNP-1：5′-GAGCGCGGATCCAAGCTTCCGCCATC 
Figure DEST_PATH_BDA00002106285803351
Figure DEST_PATH_BDA00002106285803352
AGCCCCAAGCTGGTGCAAGG  -3′ 
(SEQIDNO:463) 
BNP-2：5′-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3′(SEQ ID NO:464) 
BNP-1掺入Bam HI克隆位点（下划线）、编码共有前导序列（SEQ ID NO：111）的多核苷酸（斜体）、和编码BNP的头7个氨基酸序列的多核苷酸（粗体）。在BNP-2中，下划线序列为Cla I位点，它后面的多核苷酸含有编码BNP的最后6个氨基酸（粗体）和成熟HSA蛋白质的头10个氨基酸的DNA的反向互补序列。使用这两种引物PCR扩增BNP蛋白质。必须根据经验为每对特异引物和模板确定退火和延伸温度和时间。 
纯化PCR产物（例如使用Wizard PCR Preps DNA纯化系统；Promega公司），然后用Bam HI和Cla I消化。在通过凝胶电泳进一步纯化BamHI-ClaI片段后，将产物克隆到经Bam HI/Cla I消化的pC4:HSA中，产生构建物ID#3691。验证表达构建物的序列。 
构建物ID 3691的表达和纯化
293F细胞中的表达 
通过本领域已知的方法将构建物ID#3691，pC4:SPCON.BNP1-32/HSA转染到293F细胞中（见实施例6）。 
从293F细胞上清液纯化 
转染后3天收集到2升上清液。重组蛋白用5ml Blue Sepharose CL-6B柱（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA）捕捉并用2M NaCl洗脱。将物质结合到HiPrep 16/10 Phenyl FF（high sub）柱上并用20mM MES pH6.7洗脱。通过羟磷灰石柱层析在pH6.8以磷酸钠缓冲液梯度（200ml中0-20mS/cm）进一步纯化BNP-HSA。通过HiPrep 26/10脱盐柱（Amersham Biosciences）将最终产物转换到PBS pH7.2中。 
BNP-HSA的活性可以用体外NPR-A/cGMP测定法来测定
利尿钠肽受体-A（NPR-A）是BNP的信号受体，因而负责BNP的大多数生物学作用。BNP的生物活性是由在激活后将GTP转变成cGMP的NPR-A鸟苷酸环化酶结构域介导的。BNP活性的方便测定法是测量稳定过表达NPR-A的293F细胞系的BNP刺激作用。可通过cGMP ELISA来测量暴露于BNP后细胞中的cGMP生成。 
NPR-A 293F稳定克隆的筛选方法 
将人NPR-A的开放读码框构建到pcDNA3.1表达载体（Invitrogen）中。 通过脂转染胺试剂(Lipofectamine)法用质粒DNA稳定转染293F细胞，并用0.8μg/ml G418选择。对293F/NPR-A稳定克隆筛选对重组BNP的最好响应。 
cGMP激活作用的测量 
BNP对cGMP的激活作用是在293F/NPR-A细胞中进行的，并使用CatchPoint cGMP荧光测定试剂盒（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）来测量。简要的说，将96孔平皿中以50,000细胞/孔培养的293F/NPR-A细胞用80μl预刺激缓冲液（含有10mM葡萄糖pH7.4、15nM碳酸氢钠、及0.75mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的Krebs-Ringe碳酸氢盐缓冲液）清洗。将40μl预刺激缓冲液中的BNP-HSA或重组BNP于37℃加入到细胞中达10分钟。将细胞用40μl溶解缓冲液摇晃溶解10分钟。按照制造商的指示测定溶菌产物中cGMP的数量。 
结果 
测定了BNP-HSA和重组BNP的剂量-应答关系（见图8）。构建物ID＃3691和重组BNP的最大活性是相似的（分别为1.63±0.016和1.80±0.016pm），EC50值分别为28.4±1.2和0.46±1.1nM。 
BNP-HSA在体内降低血压
方法 
BNP通过直接的血管舒张和通过抑制肾素/血管紧张素/内皮缩血管肽/醛固酮系统而降低血压。在购自Taconic（Germantown，NY，USA）的3月龄雄性自发性高血压大鼠中测试BNP-HSA降低动脉血压的能力。自发性高血压大鼠是遗传性高血压，高血压在3月龄后发作。将BNP-HSA或重组BNP在0.3cc PBS中重构给予每只大鼠。药物通过尾部静脉注射投递。使用XBP-1000系统（Kent Scientific，Torrington，CT，USA）通过套尾法记录心脏收缩和心脏舒张的血压。对于每个血压数据点，采集4-5个连续读数并取平均值。用1/3心脏收缩压+2/3心脏舒张压来计算平均动脉压（MAP）。对于剂量-应答测定，在以0.5、2、6和18nmol/kg的剂量施用pC4:SPCON.BNP1-32/HSA后20小时测量血压。 
结果 
自发性高血压大鼠的典型心脏收缩压在服药前是180-200mmHg。经尾部静脉注射投递的单一推注6nmol/kg BNP-HSA降低心脏收缩和心脏舒张两种血压，达到平均动脉压（MAP）降低超过30mmHg。降低的血压稳定并持 续1天，然后在几天内逐渐恢复到基线（见图9）。相反的，由于其瞬间清除，重组BNP的单一6nmol/kg推注仅产生约15mmHg的非常短暂的MAP降低。 
此外，在4只自发性高血压大鼠中测定了推注注射BNP-HSA后20个小时的剂量-应答。0.5nmol/kg BNP-HSA有平均7mmHg的MAP降低，而6nmol/kg BNP-HSA有平均30mmHg的MAP降低，18nmol/kg高剂量的BNP-HSA降低血压的幅度仅比6nmol/kg略多一点。 
BNP-HSA对血浆cGMP的体内诱导
方法 
BNP的细胞内cGMP活化作用导致其从细胞释放到循环中。血浆cGMP水平与BNP诱导的心血管和肾生理学有关。血浆cGMP已经用作体内BNP作用的生物标记。为了在体内测试BNP-HSA对血浆cGMP的诱导，对11-12周龄雄性C57/BL6小鼠经尾部静脉通过单一推注以6nmol/kg的剂量投递重组BNP或BNP-HSA。在重组BNP服药组的5、10、20、40和80分钟时间点和BNP-HSA组的额外640、1440、2880和5760分钟从尾血制备血浆。在零时间点收集用PBS处理的小鼠的血浆样品作为赋形剂对照。按照制造商的指示使用CatchPoint cGMP荧光测定试剂盒测定cGMP水平。 
结果 
在单一静脉内推注6nmol/kg重组BNP或BNP-HSA后，超过基线的峰值血浆cGMP水平分别增加了3.9倍或5.6倍（见图10）。此外，在用重组BNP处理后cGMP的单相指数式衰减半衰期(one-phase exponential decay half-life)为16分钟（10至42分钟，95%CI），而在施用BNP-HSA后cGMP的单相指数式衰减半衰期为1538分钟（1017至3153分钟，95%CI)。 
由构建物ID 3691编码的BNP-清蛋白融合物的体内药动学分析
方法 
11-12周龄雄性C57/BL6小鼠（从AceAnimals，Boyertown，PA，USA获得）在研究时间体重为25.1±0.12g。所有动物以10ml/g体重的体积服药。给预服药动物注射PBS。重组BNP腹膜内注射到尾部或者皮下注射到肩胛中间区域。 
对下面的组进行药动学分析： 
表8 
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从下腔静脉采集血样，置于经EDTA包被的微型容器中，并贮存在冰中。将样品在微量离心机中于室温以14,000rpm（16,000xg）离心10分钟。将血浆转移到簇管(cluster tube)中并贮存于-80℃。 
使用BNP EIA试剂盒（Phoenix Pharmaceutical，Belmont，CA，USA）测定血浆样品中的BNP-HSA浓度。在与测试样品相同的平皿上在相同的时间产生标准曲线。重组BNP的检测极限为0.11ng/ml。该测定法检测重组BNP且不与小鼠BNP交叉反应。 
通过非区室法（WinNonlin；4.1版；Pharsight Corp.，Mountain View，CA，USA）进行分析。分析中使用每个时间的平均血浆浓度。使用线性上升/对数下降梯形法来计算AUC0-t。用最后观察到的浓度除以终端消除速率常数来进行无穷大AUC0-∞的外推。将这些分析中的数据进行统一加权。 
结果 
在服药前样品中检测到的血浆中BNP-HSA平均基线浓度为大约0.081-0.095μg/ml。单一静脉内或皮下注射后，BNP-HSA有11.2（静脉内投递）或19.3小时（皮下投递）的终端消除半衰期(terminal elimination half-life)，而重组BNP在小鼠中的半衰期为3.1分钟。BNP-HSA的非区室分析(non compartmental analysis)揭示了BNP-HSA具有下列特征： 
表9 
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选择在静脉内曲线最终阶段的5个点和皮下曲线最终阶段的4个点用于最终半衰期的计算。如此得到的此最终阶段的AUC分别是静脉内和皮下曲线总AUC的约10%。与之相比，在选择最后3个点用于最终半衰期的计算时，分别仅有静脉内和皮下曲线总AUC的2%和4%。 
实施例81：构建物ID#3618，BNP(2X)-HSA的产生 
构建物ID#3618，pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA在哺乳动物表达载体pC4中包含编码BNP-清蛋白融合蛋白的DNA，它具有共有前导序列，secrecon，后面是融合在HSA成熟形式氨基末端的两个经过加工的、有活性的BNP肽（氨基酸1-32）。 
用于构建物3618的BNP cDNA的克隆
首先使用下文所述四种引物BNP-1、BNP-2、BNP-3和BNP-4从经过加工的活性形式BNP（氨基酸1-32）PCR扩增编码双重BNP模块的多核苷酸，以产生两个片段A和B。扩增后，将两个纯化片段（A和B）以等摩尔量混合，并作为PCR模板，用下文所述引物BNP-5和BNP-6扩增。然后用Bam HI和Cla I消化BNP(2x)插入物，并连接到经BamHI和ClaI预消化的pC4:HSA载体中，产生构建物ID＃3618。构建物ID＃3618编码清蛋白融合蛋白，它含有共有前导序列，secrecon，（SEQ ID NO：111），和经过加工的活性形式BNP的两个串联拷贝，后面是成熟HSA蛋白质（见表2中构建物3618的SEQ ID NO：483）。 
首先合成适于PCR扩增编码BNP蛋白质两个片段的多核苷酸的四条寡核苷酸： 
BNP-1 5′AGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCTGGGCTGCAAAGTGCTGAGGCGGCAT-3′(SEQ ID NO:486) 
BNP-2 5′-CCTTGCACCATCTTGGGGCTATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3′(SEQ ID NO:487) 
BNP-3 5′-GCAAAGTGCTGAGGCGGCATAGCCCCAAGATGGTGCA AGG-3′(SEQ ID NO:488) 
BNP-4 5′-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3′(SEQ ID NO:489) 
使用引物组BNP-I/BNP-2和BNP-3/BNP-4，PCR扩增两个BNP蛋白质片段（分别为A和B）。必须根据经验为每对特异引物和模板确定退火和延伸温度和时间。纯化片段A和B（例如使用Wizard PCR Preps DNA纯化系统；Promega Corp），以等摩尔量混合，并作为模板用于使用适于PCR扩增的另两条寡核苷酸BNP-5和BNP-6的PCR扩增： 
BNP-5 5′-GAGCGCGGATCCAAGCTTCCGCCATC 
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AGCCCCAAGCTGGTGCAAGG-3′(SEQ ID NO:463) 
BNP-6 5′-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3′(SEQ ID NO:464) 
BNP-5掺入Bam HI克隆位点（下划线）、编码共有前导序列（SEQ ID NO：111）的多核苷酸（斜体字）、和编码BNP的前7个氨基酸序列的多核苷酸（粗体）。在BNP-6中，下划线序列为Cla I位点，它后面的多核苷酸含有编码BNP的最后6个氨基酸（粗体）和成熟HSA蛋白质的头10个氨基酸的DNA的反向互补序列。使用这两种引物，PCR扩增共有前导序列和活性BNP肽的两个串联拷贝。必须根据经验为每对特异引物和模板确定退火和延伸温度和时间。 
纯化PCR产物（例如使用Wizard PCR Preps DNA纯化系统；Promega公司），然后用Bam HI和Cla I消化。在通过凝胶电泳进一步纯化BamHI-ClaI片段后，将产物克隆到经Bam HI/Cla I消化的pC4:HSA中，产生构建物ID #3618。验证表达构建物的序列。 
构建物ID 3618的表达和纯化
293F细胞中的表达 
通过本领域已知的方法将构建物ID #3618，pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA转染到293F细胞中（见实施例6）。 
从293F细胞上清液纯化 
如先前上文实施例80中在副标题“从203F细胞上清液纯化”下所述纯化由构建物ID#3618编码的pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA。 
BNP(2X)-HSA的活性可以用体外NPR-A/cGMP测定法来测定
由构建物ID#3618编码的BNP(2X)-HSA的活性可以如先前实施例80中在副标题“BNP-HSA的活性可以用体外NPR-A/cGMP测定法来测定”和“NPR-A  293F稳定克隆的筛选方法”下所述通过NPR-A/cGMP测定法在体外测定。 
结果 
测定了BNP(2X)-HSA和重组BNP的剂量-应答关系（见图8）。由构建物ID＃3618编码的BNP(2X)-HSA和重组BNP的最大活性是相似的（分别为1.68±0.021和1.80±0.016pm），EC50值分别为9.8±1.1和0.46±1.1nM。 
将本申请中引用的每篇文献（包括专利、专利申请、专利公布、杂志文章、摘要、实验指南、书籍、或其它公开）的全部公开以及可通过本申请中提到的GenBank、GeneSeq或CAS Registry特异标识符获得的信息完整引入本文作为参考。 
此外，将下述每项美国申请的说明书和序列表完整引入本文作为参考：2005年2月4日提交的美国申请号60/542,274；2004年3月5日提交的美国申请号60/549,901；2004年3月29日提交的美国申请号60/556,906；以及2004年12月17日提交的美国申请号60/636,603。 
关于保藏生物材料的说明 
A.下面的说明涉及说明书第44页表3提到的保藏生物材料。 
B.保藏物的鉴定
保藏单位名称：美国典型培养物保藏中心 
保藏单位地址：10801 University Boulevard 
              Manassas，Virginia 20110-2209 
              United States of America 
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加拿大：申请人要求，直至在申请基础上授予加拿大专利或申请被驳回，或者放弃且不再进行恢复，或者撤回，专利局长只能批准向局长指定的独立专家提供本申请中所提到的保藏生物学材料的样品，因此申请人必须在公布国际申请的技术准备完成之前以书面声明通知国际局。 
挪威：申请人在此要求，直至申请已经（通过挪威专利局）向公众公开，或者在没有公开的情况下已经最终由挪威专利局做出决定，样品应当只发放给本领域的专家。根据挪威专利法22和33(3)节，对此效力的要求应当在不迟于向公众公开之日由申请人向挪威专利局提出。如果申请人已经提出了此类要求，那么第三方提出的提供样品的任何要求应当指出将使用的专家。该专家可以是挪威专利局草 拟的公认专家表上的任何人或是个案中申请人批准的任何人。 
澳大利亚：申请人在此通知，微生物样品应当在授予专利之前、或者在终止、驳回或撤回申请之前只发放给作为与本发明无利害关系(interest)的熟练从业人员的人员（澳大利亚专利条例的条例3.25(3)）。 
芬兰：申请人在此要求，直至申请已经（通过国家专利和管理委员会）向公众公开，或者在没有向公众公开的情况下已经最终由国家专利和管理委员会做出决定，样品应当只发放给本领域的专家。 
英国：申请人要求，微生物的样品只能提供给专家。该申请必须由申请人在该申请作好国际公布的技术准备前提交给国际局才能生效。 
丹麦：申请人要求，直至该申请已经国际公开（由丹麦专利局），或已经由丹麦专利局在没有向公众公开的情况下作出最后决定，生物样品仅能发放给本领域的专家。依照丹麦专利法案第22和33(3)节，该要求在由申请人在不迟于向公众公开之日提交给丹麦专利局才能生效。如果申请人已经提交了这样的要求，那么任何第三方所提出的提供样品的要求都要满足专家使用的规定。所述专家可以是丹麦专利局所认可的专家名单中的任何专家，或者是申请人个案认可的任何人。 
瑞典：申请人要求，直至该申请已经国际公开（由瑞典专利局），或已经由瑞典专利局在没有向公众公开的情况下作出最后决定，生物样品仅能发放给本领域的专家。该要求必须在优先权之日起16个月届满前提交给国际局（优选以PCT申请人指南的第I卷附件Z中PCT/RO/134表的形式）才能生效。如果申请人已经提交了这样的要求，那么任何第三方所提出的要求提供样品的要求都要满足专家使用的规定。所述专家可以是丹麦专利局所认可的专家名单中的任何专家，或者是申请人个案认可的任何人。 
荷兰：申请人要求，直至荷兰专利授权之日或直至该申请被驳回或撤回或放弃之日，按照专利法31F(1)的规定，微生物仅可发放给专家。该要求必须由申请人在该申请按照荷兰专利法案的第22C节或第25节的规定向公众公开之日（两个日期无论那个在先）前提交给荷兰工业产权局才能生效。 
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Claims (29)

1.包含选自下组的成员的清蛋白融合蛋白：
(a)治疗性蛋白质：X和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的清蛋白；
(b)治疗性蛋白质：X和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性；
(c)治疗性蛋白质：X和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性，且其中所述清蛋白活性是与未融合状态的治疗性蛋白质：X的保存期相比延长治疗性蛋白质：X的保存期的能力；
(d)治疗性蛋白质：X和SEQ ID NO：1的氨基酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体具有清蛋白活性，且其中所述片段或变体包含SEQ IDNO：1的氨基酸1-387的氨基酸序列；
(e)治疗性蛋白质：X的片段或变体和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的清蛋白，其中所述片段或变体具有治疗性蛋白质：X的生物学活性；
(f)(a)-(e)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质：X或其片段或变体融合在清蛋白的N-末端，或清蛋白片段或变体的N-末端；
(g)(a)-(e)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质：X或其片段或变体融合在清蛋白的C-末端，或清蛋白片段或变体的C-末端；
(h)(a)-(e)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质：X或其片段或变体融合在清蛋白的N-末端和C-末端，或清蛋白片段或变体的N-末端和C-末端；
(i)(a)-(e)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，它包含第一治疗性蛋白质：X或其片段或变体和第二治疗性蛋白质：X或其片段或变体，其中所述第一治疗性蛋白质：X或其片段或变体不同于所述第二治疗性蛋白质：X或其片段或变体；
(j)(a)-(i)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质：X或其片段或变体通过接头与所述清蛋白或清蛋白片段或变体分开；和
(k)(a)-(j)的治疗性蛋白质：X或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体，其中所述清蛋白融合蛋白具有如下通式：R1-L-R2；R2-L-R1；或R1-L-R2-L-R1，且其中R1是治疗性蛋白质：X或其片段或变体，L是肽接头，而R2是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的清蛋白或清蛋白的片段或变体。
2.权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白的保存期或血浆稳定性大于未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性。
3.权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性。
4.权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性大于未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性。
5.包含插入到清蛋白或其片段或变体中的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的清蛋白融合蛋白，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段或变体。
6.包含插入到清蛋白或其片段或变体中的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的清蛋白融合蛋白，包含选自下组的一个或多个氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸54-61；
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸76-89；
(c)SEQ ID NO：1的氨基酸92-100；
(d)SEQ ID NO：1的氨基酸170-176；
(e)SEQ ID NO：1的氨基酸247-252；
(f)SEQ ID NO：1的氨基酸266-277；
(g)SEQ ID NO：1的氨基酸280-288；
(h)SEQ ID NO：1的氨基酸362-368；
(i)SEQ ID NO：1的氨基酸439-447；
(j)SEQ ID NO：1的氨基酸462-475；
(k)SEQ ID NO：1的氨基酸478-486；和
(l)SEQ ID NO：1的氨基酸560-566。
7.权利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比足以延长治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的部分清蛋白。
8.权利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比足以延长治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的部分清蛋白。
9.权利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性的部分清蛋白。
10.权利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体外生物学活性的部分清蛋白。
11.权利要求5的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性的部分清蛋白。
12.权利要求6的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白包含与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性相比足以延长与清蛋白融合的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的体内生物学活性的部分清蛋白。
13.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是非糖基化的。
14.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是在酵母中表达的。
15.权利要求14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化缺陷的。
16.权利要求14的清蛋白融合蛋白，其中所述酵母是糖基化和蛋白酶缺陷的。
17.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，它是由哺乳动物细胞表达的。
18.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白是由培养中的哺乳动物细胞表达的。
19.权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述清蛋白融合蛋白还包含分泌前导序列。
20.包含权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白和制药学可接受载体的组合物。
21.包含权利要求20的组合物的试剂盒。
22.治疗患者的疾病或紊乱的方法，包括施用权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述疾病或紊乱包含适应症：Y。
24.治疗患有受治疗性蛋白质：X或其片段或变体调节的疾病或紊乱的患者的方法，包括施用有效量的权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。
25.权利要求24的方法，其中所述疾病或紊乱是适应症：Y。
26.延长治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性的方法，包括将治疗性蛋白质：X或其片段或变体与清蛋白或其片段或变体融合的步骤，与未融合状态的治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性相比，所述清蛋白或其片段或变体足以延长治疗性蛋白质：X或其片段或变体的保存期或血浆稳定性。
27.核酸分子，包含编码权利要求1-12任一项的清蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。
28.包含权利要求27的核酸分子的载体。
29.包含权利要求28的核酸分子的宿主细胞。
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