CN102988336A - Tpck用于制备抗晶状体混浊产品的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及N-对甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮(TPCK)及其组合物用于治疗晶状体浑浊的新用途。TPCK在防治晶状体浑浊等方面的药效,主要是通过封闭晶体蛋白本身部分非必需的巯基、抑制蛋白之间通过形成二硫键而导致非特异性聚集、进而实现遏制大分子晶体蛋白形成之通路来发挥抗蛋白浑浊作用的,为白内障药物防治提供了一种新的药物来源和应用剂型,对其它年龄相关性眼部疾病的防治也有重要的参考价值。本发明安全价廉,疗效显著,性质稳定,适于医药、试剂等工业和行业的大规模生产和商业应用,易推广应用,具有良好应用前景,具有显著的社会效益、经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及医药、食品、饮料和试剂等技术领域,具体地说是涉及对蛋白质的巯基进行烷基化试剂的新用途,更具体地说是涉及N-对甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮(N-tosyl-L-phenylalanyl-chloromethyl ketone,简称:TPCK)的一种新用途,再具体地说是涉及TPCK能够用于制备抗晶状体浑浊产品的新用途。
背景技术
白内障的研究概况
1、概述
白内障是目前世界上影响人类健康的常见病,是严重影响人类健康的常见病、多发病,也是最常见的致盲原因之一,位列中国第一位致盲的疾病,其发病机制尚不十分清楚。
白内障临床研究表明,在各类白内障病例中,由老化所引起的老年性白内障占有绝大部分的比例。老年性白内障为双眼病,但两眼发病可有先后。根据白内障开始形成的部位,老年性白内障分为皮质性白内障(corticsal cataract)、核性白内障(nuclear cataract)和囊性白内障(subcapsular cataract),其中皮质性白内障是老年性白内障最常见的类型。
老年性白内障是老年人视力下降的主要原因,该病主要表现为在晶体老化过程中逐渐出现变性浑浊,又称变性白内障。在美国85岁以上的老年人中,患病率约占95%。
全世界特别是中国,面临人口快速增长的巨大压力及老龄化趋势加重的严峻局面,更加需要大力加强对白内障发病机理及影响因素的研究,以努力控制和减缓由此带来的白内障发病率上升的趋势。
2、白内障的形成原理及其病因学研究进展
白内障的发生与多种因素有关,是多种因素综合作用的结果。比如晶状体蛋白的基因突变、晶状体遭受氧化损伤、辐射损伤、老化变性、葡萄糖过度刺激、半乳糖等代谢障碍、脂质过氧化损伤等均可对晶状体的正常功能造成不同程度的损伤,结果导致晶状体发生混浊,影响晶状体对光的透射和折射,从而造成视物不清。
晶状体的功能是将光线聚焦到视网膜上产生视觉。晶状体的主要成分是水和蛋白质,晶状体干重的80%~90%是蛋白质,每种蛋白质的结构和它们彼此之间的相互作用是维持晶状体透明性的分子基础,所述的蛋白质包括α、β及γ三大族晶体蛋白。
晶状体的透明度是由恒定的水分含量、高浓度的蛋白质以及复杂的新陈代谢来保持的,即每种蛋白质的结构和它们彼此之间的相互作用是维持晶状体透明性的分子基础;也就是说,晶体蛋白的有序排列是维持晶状体空间结构的物质基础,即如果晶体蛋白组成发生改变,则会影 响、破坏此种正常结构。
缩略词表
英文缩写 | 英文全称 | 中文名称 |
HMW | High molecular weight | 高分子聚合状态 |
PTM | Post translational modification | 翻译后修饰 |
RSL | Reactive site loop | 环状结构区 |
Ts | Tosyl | 对甲苯磺酰基 |
DTT | Dithiothreitol | 二硫苏糖醇 |
TAB | Tert-butyl alcohol | 叔丁醇 |
Ts | Tosyl | 对甲基磺酰基 |
UPP | Ubiquitin-proteasome pathway | 泛素蛋白酶体途径 |
PTM | Post translational modification | 翻译后修饰 |
LEC | Lens epithelial cells | 晶状体上皮细胞 |
PBS | Phosphate-Bufer-Solution | 磷酸盐缓冲液 |
GO | Glucose oxidase | 葡萄糖氧化酶 |
OS | Oxidase Stress | 氧化应激 |
ROS | Reactive oxygen species | 活性氧 |
RNS | Reactive ntrogen species | 活性氮 |
G3PD | Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 |
NOS | Reactive Ntrogen Species | 活性氮自由基 |
TTase | Thioltransferase | 硫醇转移酶 |
Trx | Thioredoxin | 硫氧还蛋白 |
TR | Thioredoxin reductase | 硫氧还蛋白还原酶 |
Tr | Tris HCL-Bufer-Solution | Tris HCL缓冲液 |
GR | Glutathione reductase | 谷胱甘肽还原酶 |
Cys | Cysteine | 半胱氨酸 |
EB | Ethidium bromide | 溴化乙锭 |
CF | Cystic fibrosis | 囊性纤维化 |
TEMED | Tetramethylethylenediamine | N,N,N',N'-四甲基乙二胺 |
[0014]
DMSO | Dimethyl sulfoxide | 二甲基亚枫 |
CK-19 | Cytokeratin-19 | 细胞角蛋白19 |
dsRNA | Double-stranded RNA | 双链RNA |
siRNA | Small interfering RNA | 小干扰RNA |
NC | Negative control | 阴性对照 |
RT | Reverse transcription | 逆转录 |
FBS | Fetal bovine serum | 胎牛血清 |
FAM | Carboxyfluorescein | 羧基荧光素 |
Abs | Absorption wavelength | 吸收波长 |
Em | Emission wavelength | 发射波长 |
晶状体的透光性主要是取决于晶状体中水溶性蛋白组分的质和量,尤其是几种主要的结构蛋白如βB2(定义可参见文献:Aarts HJ,Lubsen NH,Schoenmakers JG..Crystallin gene expression during rat lens development.Eur J Biochem,1989,183(1):31-36)、γ5,6(γC,γD)、γ1,4、γ2,3和伴侣蛋白αA2及αB2。水溶性晶体蛋白的质和量的改变,直接影响晶体的透光性以及白内障的形成,以βB2为代表的高含量的晶体结构蛋白亦对晶状体的结构及其正常透光性起着举足轻重的作用。
α族晶体蛋白具有特殊的分子伴侣(Molecular Chaperone)作用,对于维持晶状体的正常结构起着关键作用;α族晶体蛋白的含量在老化过程中变化趋势,直接影响其分子伴侣活性的改变;随着老化进程,通常α族晶体蛋白分子伴侣作用减弱,而在白内障晶体中,则显现大量α族晶体蛋白转变为非水溶性的高分子量交联聚合物。
所谓分子伴侣,是指一类能够介导其它蛋白质的正确折叠和装配,以保护该蛋白质的活性,但它本身却不是有功能的最终装配产物的组成成分。但是,α族晶体蛋白是一种特殊的具有分子伴侣作用的蛋白,它不仅具有分子伴侣活性,而且也是晶体中最重要的结构蛋白之一。
晶体的透光性不仅需要足够量的水溶性成份来维持,而且还需要考虑晶状体的特殊代谢方式:晶体蛋白自生成之日起,不断被后生成的晶体蛋白向晶体的核心部挤压,并储存在不同的晶体结构层。因此,无论水溶性蛋白组分还是水不溶性组分,均无法代谢到体外。不过水溶性成份的积累有助于构建晶体从内到外层的正常结构;而水不溶性成份的渐次积累,则会逐渐增大晶体的光散射,不利于透光性,也就是说,它是老年性白内障形成的物质基础。
哺乳动物自出生后,由于晶体暴露在外,在晶状体发育成长过程中,晶体蛋白受机体自身自然老化及诸多外界因素的影响,易受体内外多种因素的影响而发生变异,会发生不同的修饰变性。晶体蛋白的质和量会发生改变,水溶性成份不断转变为水不溶性成分,影响其水溶性,进而影响晶状体的正常结构和透光性,最终导致老年性白内障的形成。也就是说,在人体衰老的过程中,一旦晶状体中的蛋白质结构受到破坏,则晶状体由清澈透明变为混浊不透明,进而 影响晶状体的正常结构及透光性,并逐步演变为老年性白内障。
综合文献相关晶体蛋白的结构特点,研究发现影响其蛋白结构的主要因素为翻译后修饰(posttranslational modification,简称:PTM),即许多晶体蛋白在翻译后可通过酶的催化或在酶控制下反应而发生的修饰,其主要包括糖基化、氧化、氨甲酰化、磷酸化、乙酰化、羟基化、脱酰胺、消旋和切除作用等。晶状体蛋白质周围存在许多活性分子,包括糖、来源于尿中的氰酸盐、糖皮质激素和具有活性的其他代谢产物等,这些均可在非酶环境下攻击蛋白质。
因此,维持晶状体的透光性,一方面,需保持晶状体中足够的水溶性蛋白的量,这主要取决于机体内部晶体蛋白的基因不遭受突变,能够实施正常表达即可,如需要某种晶体蛋白进行高表达或低表达,则可采用基因工程方法,激活或抑制相应的基因;另一方面,需要尽力遏制、减缓晶体蛋白由水溶性蛋白向水不溶性蛋白的转变。
3、白内障的治疗现状
白内障是世界性致盲性疾病。临床诊疗方面,目前对于白内障的唯一有效治疗手段是外科手术。尽管白内障手术已日臻完善,但不可避免的手术并发症和社会经济问题仍十分严重,如手术后数年内后发性白内障、继发性青光眼或角膜损伤等发生率较高,通常难以根除。
寻找有效的预防和药物治疗方法,早期控制白内障,仍然是该领域的研究热点。预防和药物治疗白内障主要有两种途径,即减少白内障发病的危险因素和应用抗白内障药物。
与白内障发病相关的主要危险因素有糖尿病、青光眼、近视、长期应用皮质类固醇、严重腹泻、紫外线辐射、大量饮酒和吸烟等。Taylor等总结为6个“D”,即阳光辐射、饮食、药物、糖尿病、脱水和原因不明。减少这些可能的危险因素是一种积极的预防手段。
在药物应用方面,现已研制出数十种药物用于临床,用于维持晶体的透光性延缓或治疗白内障。由于缺乏对于白内障生成机理的完善依据,研制并仍在使用的诸多药物,仍存在不少的缺陷,例如有效率较低、针对性差等。因此,虽然名目繁多的抗白内障药物在世界各国广泛应用,但是尚存在很多问题。白内障的药物治疗仍然面临着严峻的挑战:尽管有数十种抗白内障药物已被广泛临床使用,但证明其有效性的直接证据甚少。
由于白内障的发生是各种因素综合的结果,其发病原因还没有定论。当前,各科研组织多是针对某一发病因素,或是对抗发病过程中眼的某些生理生化变化进行抗白内障药物的研究开发。如今已经用于白内障治疗的药物主要有以下几类:
①醛糖还原酶抑制剂(简称:ARlS)是第一类被系统地研究并进行临床实验的抗白内障药物,使用该药物是基于1962年提出的渗透压学说和早期糖尿病性大鼠晶状体以及高糖孵育环境下,晶状体中大量的山梨醇沉积的证据。
代表药物有卡他林(Catalin)和法可立辛(Phacolysin),通过抑制晶状体中多元醇的积累,起到缓解糖性白内障的作用,同时二者与晶体蛋白的结合力都很强,可保护晶体蛋白不受因色氨酸代谢异常而产生的醌亚氨酸的损伤;但临床应用及实验室验证表明,ARIS治疗糖性白内障并非有效,而且ARIS的副作用严重,其药物机制“名不符实”。
②针对白内障发生的自由基氧化学说而开发的抗氧化药物抗氧化的药物品种很多,包括谷胱甘肽、牛磺酸、维生素E、维生素C、β胡萝卜素,以及带有还原性琉基的各类化合物等。
谷胱甘肽和药物前体:随着老化和白内障的形成,晶状体中谷胱甘肽的水平降低,故增加谷胱甘肽会有益于治疗白内障。谷胱甘肽是一种三肽(γ谷氨酰胺、半胱氨酸、氨基乙酸),它在晶状体中的水平将会被三肽自身、或者一种药物前体如酯、或者被氨基酸组分激活。谷胱甘肽可抑制糖基化。许多实验采用谷胱甘肽的酯和它的二肽前体,抑制各种实验性白内障的形成,但一般要比诱发白内障的因子同时或提前使用,可能的原因是简单地减少诱发因子的攻击或影响该因子的吸收。例如,谷胱甘肽单异丙基酯或提前一小时应用谷胱甘肽和γ谷氨酰胺半胱氨酸酯,可抑制Buthionine Sulphonimine诱导的白内障的发生;较亚硒酸钠提前30分钟应用谷胱甘肽和单异丙基酯,可减少硒性白内障的发生;在X射线辐射大鼠前注射半胱氨酸、硫脲、谷胱甘肽和半胱胺可减少辐射的副作用;X射线辐射大鼠一天后,谷胱甘肽单异丙基酯能保护X射线辐射诱导的白内障形成。
半胱氨酸是谷胱甘肽限制性底物,故使用半胱氨酸(或药物前体)可抑制白内障,如果能减少硫基或双硫基团,双硫化合物是较好的抗白内障药物。但目前临床试验甚少。
牛磺酸:牛磺酸可抑制半乳糖性白内障,阻止晶状体蛋白的糖基化和氧化。若饮食中增加牛磺酸替代品,可减少由于晶状体细胞的损害导致的γ晶体蛋白向玻璃体的渗漏,被认为是一种较好的抗氧化剂和抗白内障药物。
牛磺酸是一种磺基氨基酸,在人体中大量存在,其具有抗氧化作用,能保护细胞和组织免受氧化损伤。晶状体具有蓄积牛磺酸的能力,在晶状体中牛磺酸约占非蛋白质水解氨基酸的50%,是晶状体中重要的氨基酸。随着白内障病程的发展,晶状体中午磺酸的含量显著降低。世界各国的一些研究小组近年来进行了一系列系统研究,发现牛磺酸对亚硒酸钠性白内障的抑制作用与其抗氧化特性有关,而牛磺酸能够预防或延缓糖尿病性白内障的作用机制主要为:抗氧化作用;膜稳定作用;降血糖作用;渗透压调节作用。牛磺酸的抗氧化作用和渗透压调节作用对白内障的防治具有一定的可行性。
由美国国家眼科研究所资助的大规模年龄相关性眼病研究(简称:AREDS),对5000例进行为期5~10年的随访调查,目的是揭示大剂量抗氧化剂和锌添加剂的摄入对年龄相关性眼病包括白内障的防治作用。最近的报道对年龄55~80岁的3640例,长期服用维生素类药物的情况进行调查,平均随访6.3年,结果建议55岁以上有可疑年龄相关性黄斑变性,应服用抗氧化剂,如维生素C、维生素E、β胡萝卜素和锌,但大量摄入营养仅可提供很有限的抗白内障作用。
抗氧化剂越来越多的试验证实了,在白内障发生发展中,氧化损伤作用是各个层次上生理生化变化的枢纽,所以对各种抗氧化剂的研究成为抗白内障药物开发的焦点。日本学者研究了一系列还原性硫醇衍生物,发现它们可与游离基快速反应,阻断谷胱甘肽被氧化,恢复 晶状体的正常状态。其中,双硫伦(Disulfiram,简称:DSF)是这类药物中具有较高活性的一种前体药物,脂溶性的DSF透过角膜上皮后,可以转化为其单体二乙二硫氨甲酸(Diethyldithjocarbamateacid,简称:DDC)发挥抗白内障作用,对于急性硒性大鼠白内障模型具有明显的延缓白内障发生发展的作用,并能减轻氧化造成的损伤。
但是,单纯应用维生素类对于抗氧化剂的预防和治疗白内障的作用有限,临床资料缺乏可比性。
③针对因眼组织能量新陈代谢失调,特别是制造不足而导致的白内障而开发的能量补充剂,主要含有维生素B1、B2、B6、烟酰氨、腺嘌呤核苷、琥珀酸、遍多酸、维生素C、维生素E、ATP、儿茶酚、细胞色素C等成分。
④针对钙离子过多引起的白内障而应用于白内障治疗的Ca离子拮抗剂维拉帕米,能够阻断细胞钙离子的内流,降低白内障眼组织中的钙离子的浓度。
⑤针对Mallard反应为发病机理的药物,如布洛芬、DETAPAC等。
⑥中草药制剂,如八味地黄丸、珍珠明日液及雪叶莲挤压汁和美国金缕梅的浸出液等;
⑦氨基酸制剂Phakan,含有谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、肌醇、盐酸吡哆醛等。
⑧阿司匹林
阿司匹林是二十世纪最伟大的发明之一,作为治疗药物不断有新的用途出现。研究表明,阿斯匹林也具有抗白内障的作用。通过动物实验研究阿司匹林的作用机理,认为阿司匹林抗白内障机制有4种:(A)抑制非酶性蛋白质糖基化,即阿司匹林与晶体蛋白中赖氨酸残基结合,阻止葡萄糖与赖氨酸的非酶性糖基化反应,并可防止晶体蛋白聚合物形成;(B)抑制晶体蛋白的氨基甲酰化,阿司匹林的乙酰基与晶体蛋白的氨基酸基团结合,阻断了氨基酸残基甲酰化反应,使蛋白分子表面的正常电荷配布免遭破坏,从而维持了晶体蛋白的正常结构;(C)抑制脂质过氧化,阿司匹林的乙酰基可优先夺取晶体蛋白的活性氨基位点,避免了脂质过氧化给晶体带来的损害;(D)阿司匹林通过抑制膜上的环氧化酶使晶体细胞膜上的钙通道失活,从而防止晶体蛋白多肽链的聚合反应。
阿司匹林类药物廉价方便,副作用较少,有潜在的治疗老年性白内障的临床应用价值,但该药物适应症甚广,有部分病人对该药有依赖性,长期较大剂量的口服亦会有副作用,如临床个案发现,长期大剂量应用阿司匹林会导致胃出血。
⑨糖基化抑制剂
蛋白质糖基化学说-糖基化反应。此学说的核心是还原糖醛基与蛋白质中自由氨基(赖氨酸或精氨酸的。NH2或蛋白质分子的N端游离的-NH2)发生非酶性糖基化反应(Maillard反应),生成含Schiff氏碱基对的中间产物,在经过一系列缓慢的Amadori结构重排后,形成有酮胺结构特征的各种Amadori产物,再经脱水和分子重排后,最终形成有荧光和蛋白质交联特性的各种糖基化终产物(简称:AGE)。
糖基化抑制剂——氨基胍:氨基胍(aminoguanidine)是一种亲核肼的衍生物,70年代 认为可抑制糖基化末端产物的形成以及抑制二胺氧化酶、一氧化氮合成酶和过氧化氢酶活性。近年的研究表明,氨基胍、1,3—二氨基胍和甲基氨基胍可抑制醛糖还原酶。但在半乳糖性白内障模型中,这3种化合物并无醛糖还原酶抑制剂的作用。氨基胍是糖基化抑制剂,被用于糖尿病并发症的治疗,包括白内障,它能够与糖基化的化合物结合,在糖基化各个时期抑制早期和晚期糖基化产物。氨基胍可抑制轻度糖尿病性大鼠晶状体的混浊,可降低链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠主动脉、肾小球和肾小管血液中荧光值,减少尿中白蛋白的分泌,但不能降低肾皮质已升高的山梨醇水平。氨基胍的主要作用是抑制糖基化,而不是改变生物化学过程。氨基胍还可抑制钙依赖的Calpain(内肽酶)蛋白水解酶介导的晶状体蛋白质的水解,阻止遗传性Shumiya大鼠白内障。该药物已用于临床试验,其衍生物和清除糖基化交联因子正在研究中。
⑩Calpain抑制剂
硒性白内障是快速、有效和重复性良好的白内障模型,已广泛应用于白内障发病机制和评价抗白内障药物的研究。蛋白质水解酶诱导的晶体蛋白的切除作用,特别是钙依赖的Calpain蛋白水解酶LP82和M Calpain的激活,在该白内障发病中起重要作用。Calpain蛋白水解酶抑制剂E64可延迟大鼠硒性白内障的形成,但必须在亚硒酸钠应用前;E64在离体孵育晶状体中可抑制晶状体的混浊,其它还包括E64D和S JA6017等。但重要的问题是在白内障晶状体中尚未发现Calpain诱导的局部晶体蛋白的水解。钙依赖的Calpain蛋白水解酶在幼鼠晶状体中的含量远远超过了人的含量,所以它与人白内障的发病存在不同的机制。Calpain抑制剂主要是实验室研究结果,尚无临床资料。
糖基化抑制剂、谷胱甘肽和药物前体、相分离抑制剂和Calpain抑制剂等的研究虽有较大进展,但仍需要临床研究的进一步验证。此外,还有许多有希望成为抗白内障的药物正在开发和研制中。
4、白内障治疗药物研究的发展趋势
目前,手术是白内障的最直接、最有效的治疗方法。尽管白内障手术已较成熟,但不可避免的有相应的手术并发症,而且患者需要选择最佳的手术时期,过了最佳手术期便不会有太好的效果。因此,研究白内障的致病因素,发病机制,和有效的抗白内障药物极其重要。
一般认为,自由基损伤是引起各种致白内障因素作用的共同途径,晶状体上皮细胞过度凋亡及晶状体蛋白损伤也是白内障发生机制中的重要因素。随着对白内障发病机制的深入研究,越来越多的研究者认识到虽然不同的损伤因子导致白内障的途径和机制各不相同,但他们大多通过一个共同的最终产物——高分子量物质(High molecular weight,简称:HMW)而导致晶状体混浊。多年来人们对白内障的病因和发生机制进行了大量研究,针对不同的病因学说应用不同的药物治疗白内障,尽管目前在世界范围内有近40多种抗白内障的药物在临床上广泛应用,但其疗效不十分确切,手术治疗仍然是各种白内障的主要手段。因此研究新型抗白内障药物的疗效,探讨其干预的机制是白内障研究领域的重要内容。
白内障的发生是多因素共同作用而导致的综合结果,其病理变化是多水平多层次的。随着研究手段的不断提高,对白内障发病机理的研究也将日益深入,同时对治疗白内障药物的开发针对性也就越强。理想的白内障治疗药物应该能够恢复晶体的正常代谢和促进晶体混浊的吸收,但至今为止尚无一个药能够达到上述要求,尽管如此,任何有希望的抑制白内障发病的措施都显示出研究的价值,而世界医学的传统宝库还有待发明人去开发。
现临床上多种用于治疗白内障的药物,由于缺乏对于白内障生成机理的完善依据,使仍在广泛使用的诸多药物存在不少缺陷:有些效率较低、针对性差,有些还有较大的副作用。为此,亟待进一步探明白内障发病机理、找出影响晶体透光性的易感蛋白,作为治疗和预防白内障的有效靶点,设计有针对性的药物,以达延缓晶体老化和预防、治疗白内障的目的。
随着白内障发病机理的研究不断趋于完善,也一定会产生更多相关的应用思路和切实可行的方法服务于临床治疗,同时也为研究防治晶状体浑浊提供了一条新的策略。
因此,寻找新型、成分明确、疗效确切、不良反应小的抗晶状体浑浊产品仍然势在必行,特别是药物,意义重大,并具有显著的社会效益和经济效益。经文献检索等,迄今为止,尚未发现利用TPCK作为抗晶状体浑浊产品尤其是抗晶状体浑浊药物的报道。
发明内容
本发现所需要解决的技术问题是公开了一种对蛋白质的巯基进行烷基化试剂的新用途,即TPCK具有抗晶状体浑浊作用的新用途,能够用于制备抗晶状体浑浊产品,以克服现有技术存在的上述缺陷。
也就是说,本发明针对现有技术的不足,通过实验研究和理论探索,目的意在TPCK的用途,即提供含有上述药物或其组合物作为抗晶状体浑浊产品方面的应用。
本发明所述的抗晶状体浑浊产品是指医药、食品、饮料和试剂等技术领域中,一种直接或者间接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的产品;
优选直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的产品,所述的晶状体混浊疾病包括各类晶状体混浊疾病中的一种或多种。
所述的抗晶状体浑浊产品是包括药物、试剂等中的一种或多种,优选药物。
一、技术构思
自主开发研发创新药物是中国目前的一项紧迫任务,中国医药学具有悠久的历史,在预防和治疗疾病方面也积累了丰富的经验,寻找有效的活性成分或其组合物,发现新药物、已有药物的新组合或新用途等均是有效的快捷途径,特别是拓展现有化合物或已有药物的新用途更是高效、快捷、经济的手段,也是中国创新药物研制的优势之所在。
晶状体浑浊的防治是近年来的一个研究热点,然而有关白内障的病因学研究,尚远远滞后于临床需要。在白内障疾病的病因学研究方面,特别是以往在有关晶体蛋白受不同外界因素影响的研究方面,对晶体蛋白发生质和量的改变,大多不作细分,如宏观描述β晶体蛋白。但是, 发明人认为,晶体蛋白随老化进程,不同组分应该有不同的表达趋势、消长规律不一,不细分落实到具体蛋白,则难以定向研究各自晶体蛋白的特性。
晶状体的老化是一种不可避免的自然生理进程,即随着年龄的增长,晶状体逐渐老化。但是,发明人仍然可以通过探讨老年性白内障的形成机理,采用合理的控制方法或治疗手段,延缓晶状体的老化进程。但是,晶状体浑浊的机制复杂,是多种因素相互、共同作用的结果,而单一机制的研究往往不能达到满意的效果,因此多种机制的、多药物联合运用的综合性研究有待进一步开展。
氧化应激是由活性氧(简称:ROS)诱导的一种与老化密切相关的损伤类型,与老年性白内障的形成有关,被认为是白内障的始发因素。晶状体产生的主要活性氧分子包括超氧负离子、羟自由基和H2O2;内源性产生的活性氧的结构包括NADPH氧化酶,线粒体和过氧化物酶体,两种主要产生内源性活性氧的途径是紫外线和离子辐射。晶状体中通过这些途径产生的ROS分子可以经由抗氧化剂和氧化防御系统中和,因此晶状体中具备这两大修复系统来重塑损伤分子或者减轻损伤程度。硫醇转移酶(thioltransferase,简称:TTase)、硫氧还蛋白(thioredoxin,简称:Trx)和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,简称:TR)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,简称:GR)系统被认为是哺乳动物组织中强有力的蛋白修复系统。近年的研究显示TTase/GR和Trx/TR均存在于晶状体中,对保持晶状体的透明性有重要的作用。
近年来β晶体蛋白成为研究热点,发明人前期研究表明了它对维持晶状体的透明性和屈光度有一定的作用。晶体蛋白中均含有一定数量的半胱氨酸(Cys,αB除外),尤其是β、γ类含量较高,Cys含一游离的巯基(-SH),对于氧化极为敏感;巯基经氧化作用形成二硫键混合物,是晶体蛋白去折叠、聚集增强的主要动因。由此产生一对矛盾:氧化应激会使巯基氧化,而为了保持晶状体的透光性,晶体蛋白必须维持足够量的还原状态的巯基(-SH)。
晶体蛋白的翻译后修饰(简称:PTM)是白内障发病的主要诱因。晶状体是一种结构极为特殊的器官:透明、缺乏血供,晶体蛋白缺乏转化更新、形成后即伴随终生。使晶体蛋白遭受PTM的可能性远较其它类蛋白大。PTM对晶体蛋白的主要影响是:极易引发晶体蛋白去折叠、改变蛋白原有构象;二硫键形成、晶体蛋白之间非特异交联,蛋白水溶性下降;聚集增强形成高分子量物质(High molecular weight,简称:HMW),当HMW聚集达到1×107Da以上时,即可发生光散射,晶体失去透明性、发生白内障。
那么如何保持晶体蛋白中-SH未被氧化交联为二硫键,进而阻断后续蛋白分子交联、聚集、沉淀,对维持晶体透光性及防治老年性白内障起着关键的作用。
发明人前期的研究成果表明了二硫苏糖醇(dithiothreitol,简称:DTT,分子式为C4H10O2S2)具有良好的抗晶状体蛋白变性的作用,DTT是一类化学性质的还原剂,它可以解开蛋白质分子内部及蛋白质分子间的二硫键,作为巯基的保护剂,能够抑制晶状体蛋白的热变性及非特异性聚集沉淀。发明人前期研究显示出在用自行配制的DTT滴眼液第8天后 能使硒性白内障小鼠模型晶状体混浊的程度减轻。而且发明人研究也显示出DTT对紫外线性白内障大鼠模型具有良好的抑制作用。DTT不仅可以防止蛋白质分子间形成二硫键,并且可以和蛋白质竞争性结合-SH,因此在预防和治疗方面都发挥了一定的作用。
前期实验也初步验证了异丙醇对晶体蛋白巯基的烷基化作用,通过封闭部分巯基,抑制了二硫化合物的形成。能够对蛋白质的巯基进行烷基化的试剂有很多,发明人筛选出了
一些化合物,例如叔丁醇(Tert-butyl alcohol,简称:TAB)、N-对甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮(N-tosyl-L-phenylalanyl-chloromethyl ketone,中文名称:N-甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮、N-对-甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮、Na-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮或:L-1,4'-甲基磺酰基-2-苯基乙基氯甲基酮等,简称:TPCK)、甲苯磺胺氯甲基酮等等,其中叔丁醇对硒性白内障的治疗作用也得到了发明人初步的证实。
本发明研究已经证实TPCK能够抑制细胞的凋亡以及抗炎等作用对脑缺血有一定的治疗效果并初步应用于临床。对甲苯磺酰基(Tosyl,简称:Ts)是一个由对甲苯磺酸衍生出的取代基,它是一个亲电子基,常用作醇羟基的保护基;而甲基酮作为烷化剂可以封闭晶体蛋白暴露出的巯基,抑制蛋白之间的聚合,因此可以阻止和延缓晶状体的混浊程度。
基于前期实验结果,发明人首先将离体培养晶状体并模拟氧化应激的环境,加入TPCK干预后,观察TPCK对晶状体混浊程度的抑制作用,检测其中酶含量的变化,观察细胞凋亡的情况,研究TPCK抗氧化损伤的效果,研究其机制。
此外,泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,简称:UPP)是Hershko等发现的一个高效率蛋白质降解系统,目前世界各国对于UPP的研究主要集中在肿瘤的发病机制以及治疗学方面,是蛋白质的选择性降解中一项非常重要的机制;研究发现该通路介导的细胞蛋白降解是一个非常复杂而缜密的调控过程,是细胞调控的重要机制,通过降解细胞各通路的抑制因子和(或)激活因子发挥着上调或下调作用。最新有实验研究出晶状体上皮细胞中也含有UPP系统的所有组成部分,大约有40~50%受损的晶体蛋白可以通过UPP进行降解。UPP系统是晶状体中主要的蛋白质质量控制体系,它可以通过选择性地降解受损的晶状体蛋白,还能发挥有条件地降解与细胞内多种生物过程相关的调控蛋白的作用,参与晶状体的发育与分化。近年来,UPP作为细胞内蛋白质非溶解体性降解的主要途径已受到人们的日益重视,但UPP在白内障的研究目前仍处于起步阶段。
发明人研究UPP对晶状体上皮细胞内受损蛋白质水平的影响,探讨其是否能够清除受损变性的晶体蛋白。发明人通过原代培养的晶状体上皮细胞,对UPP活性和白内障形成及受损蛋白之间的关系进行评估,探讨抗白内障的作用机理。
发明人通过对晶体蛋白进行系统的抗浑浊实验,推断TPCK在防治晶状体浑浊等方面的药效,应主要是通过封闭晶体蛋白本身部分非必需的巯基、抑制蛋白之间通过形成二硫键而导致非特异性聚集、进而实现遏制大分子晶体蛋白形成之通路来发挥抗蛋白浑浊作用的,研究结果也证明和证实了TPCK具有显著的抗晶状体浑浊的药理作用。
总之,发明人的实验发现了此化合物具有良好的抗晶状体浑浊作用,为白内障药物防治的临床前期研究提供可靠的理论实验依据,而且这将对于其它年龄相关性眼部疾病的防治也有重要的参考价值。
根据此想法和思路,发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索,已成功得到预期的研究结果和应用产品。
二、确定TPCK能够用于制备抗晶状体浑浊产品的理论设想与研究基础
1、概述
晶状体具有独特的代谢方式,其中央无显著的蛋白质合成、氧浓度极低、长期遭受环境和眼内各种应激的刺激,给蛋白质翻译后修饰带来了机会,因此晶状体蛋白是研究人体老化极好的器官。白内障的形成是晶状体老化的最终结果。晶状体是富含蛋白质的组织,晶状体蛋白约占整个晶状体湿重的34%,透明性是由于这些蛋白质短程有序的排列方式,特别是α晶状体蛋白,随着年龄老化,或者是遭受氧化应激,晶体蛋白短程有序的排列方式,特别是α晶状体蛋白,随着年龄老化,或者是遭受氧化应激,晶状体蛋白的结构排列方式发生变化时,均可影响晶状体的正常功能。
晶状体蛋白的各种翻译后修饰(post translational modification,简称:PTM)包括βB1、βB2和βA3/βA1晶状体蛋白N端的切除,α晶状体蛋白部分磷酸化和C-末端降解;αA和γs晶状体蛋白的脱酰胺,αA晶状体蛋白内双硫键形成和γs晶状体蛋白巯基暴露等可导致不同程度的α晶状体蛋白分子伴侣活性的下降,β晶状体蛋白的溶解性降低。所以如何有效的修复或清除受损的晶状体蛋白质,防止其在晶状体内聚合沉淀,对维持晶状体的透明性及防治老年性白内障起着关键作用。
TPCK能够调节生物体内许多重要的生命过程,例如蛋白质的折叠、炎症反应、细胞基质重建以及肿瘤抑制等。它由240个氨基酸残基组成,在X光下的晶体结构为球状蛋白并含有9个α-螺旋和3个β-折叠。在其表面距离C末端约20个残基处具有一个环状结构区RSL(Reactive site loop),该结构是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的标志性结构,该结构区中存在能被靶酶的底物识别位点识别的酶切位点,包括临近N-末端的第一个氨基酸(P1),和临近C-末端与P1相邻的第一个氨基酸(P1′)。TPCK在反应构象改变过程中将失去约37%的结构特征,使其抵抗热变性及化学变性的能力大大提高。发明人前期的实验结果显示了二硫苏糖醇(dithiothreitol,简称:DTT)和叔丁醇(Tert-butyl alcohol,简称:TAB)以及异丙醇对晶状体混浊都有一定的抑制作用,TPCK化学结构中的对甲基磺酰基(Tosyl,简称:Ts)作为一个亲电子基团,可以保护醇羟基,间接发挥与DTT类似的作用;另外结构中的甲基酮作为烷化剂,和异丙醇一样封闭巯基,能够替代蛋白质暴露出的巯基,减少蛋白之间非特异性聚集变性的可能性,阻止蛋白高分子聚合物的形成,进而阻止其蛋白由水溶性变为水不溶性,具有良好的抑制晶状体蛋白中的含巯基蛋白的抗氧化作用。
本研究通过对TPCK和晶状体蛋白氧化损伤之间关系的研究,不但能够使发明人理解 TPCK的抗晶状体损伤混浊的作用,还将为白内障以及其他年龄相关性眼部疾病的防治提供新的思路。并且对进一步探索TPCK的抗晶状体氧化损伤的分子生物学机制提供实验依据。
综上所述,本发明从该靶蛋白的生物化学结构特征着手,着重研究了物理、化学等因素诱导晶体蛋白变性的机理;并据此研制抗靶蛋白变性的化合物,此化合物可作为能够保护晶体蛋白不受或少受促变异影响的外用药物;该化合物能够采用脂质体作为晶体角膜的导入体;并先期用于硒(亚硒酸钠Na2SeO3)诱导的SD大鼠白内障模型,模拟老年性白内障的病理变化,裂隙灯每日观察、记录晶体透光性改变进程,观察疗效;进而探讨临床应用的前景,期望该化合物能够对于延缓和治疗老年性白内障,尤其针对大部分初发期的老年性白内障治疗产生积极影响。
2、实验研究的基本情况
本发明基于对晶状体混浊发病机制的深入了解为起点,设计、筛选合适的抗晶状体混浊的新型药物,并验证其作用效果,进而探讨药物的作用机制。本发明的实验研究主要包括以下两部分内容:
(1)第一部分:TPCK对晶状体氧化应激下混浊程度和热稳定性的影响
本发明第一部分的研究内容在于开发临床现有的药物N-对甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮(简称:TPCK)的临床新用途。探讨TPCK在培养的大鼠离体晶状体中抵抗氧化应激的能力及对晶状体蛋白热稳定性的影响。
TPCK是已知的用于抗脑缺血继发性损伤的药物。巧妙利用该药的特殊结构特点,尝试一药多用,探讨该药物对于晶状体混浊的干预作用,该研究内容是发明人率先进行,世界各国均未见报道。
首先,发明人通过离体培养大鼠晶状体并模拟体内氧化应激损伤的环境,在不同时间点加入不同剂量的TPCK进行干预。
方法:取完整晶状体用H2O2诱导其氧化损伤,分别在不同的时间点观察完整晶状体在氧化损伤组和用TPCK干预组的混浊程度,检测不同组的晶状体蛋白的热稳定性的变化。
结果:未加入TPCK仅用H2O2诱导氧化损伤的晶体混浊程度高于TPCK用药组;晶状体蛋白吸光度值在用TPCK药物组低于氧化损伤组且上升速度缓慢。
结果观察到TPCK能够有效的延缓晶状体受到氧化损伤时的混浊发展程度,并且有助于提高晶状体蛋白的热稳定性。这是本发明的一个创新点,而且为白内障药物防治的临床转化,提供了新思路和实验依据。进一步的研究还证实,该药物发挥抗晶状体混浊是通过如下机制实现的:即TPCK通过释放活性甲苯磺酰基,作用于晶状体蛋白极易被氧化的氨基酸成分,尤其是半胱氨酸的巯基部位,形成巯基保护集团,从而阻止了巯基被自由基等氧化剂的氧化作用,因此有效阻止了晶状体蛋白因受氧化作用而形成二硫键、诱发蛋白变性,进一步影响到晶状体蛋白的正常生物学构型,使得晶状体透射光减弱、折射光增强,生物学作用表现为视物不清、最终产生白内障。
结论:TPCK能够在一定程度上减轻晶状体氧化应激状态下混浊程度的发生并稳定晶状体蛋白。
(2)第二部分:TPCK对晶状体氧化应激中抗氧化酶和凋亡的影响
第二部分研究发明人针对体内抗氧化酶系统进行。探讨H2O2诱导晶状体氧化损伤用TPCK干预后对抗氧化酶含量的影响及TPCK对细胞凋亡的作用。
既然第一部分研究表明,氧化对于晶状体的损伤至为严重,那么探讨体内有效的抗氧化作用对于晶状体的保护作用则至关重要。
为此,发明人检测了氧化应激损伤晶状体中的关键抗氧化酶TTase和Trx的变化。结果显示TTase和Trx活性的表达在晶状体氧化应激状态下升高,并且具有时效性,3小时内逐渐升高,随着损伤时间延长,6小时酶含量降低,以后慢慢衰竭;对比加入了TPCK组的晶状体,6小时TTase和Trx相比对照组降低但是高于氧化损伤组。同时对TPCK的抗凋亡作用进行研究,分别取晶状体上皮组织和晶状体上皮细胞进行TUNEL和流式凋亡检测,结果提示TPCK可以有效减少细胞的凋亡。本部分实验结果合理解释了晶状体在初始阶段有足够的氧化防御能力用以抵御过氧化氢(H2O2),并且足量TTase、Trx的存在减轻了晶状体蛋白和代谢相关酶中硫醇的异构,从而具有有效的抗氧化能力。但是,随着氧化应激时间的增加或程度加重,晶状体内在的TTase和Trx缺乏足够的量及活性不足以抵消氧化应激造成的危害,使晶状体正常功能受损。
方法:同第一部分采用晶状体离体培养的方法加入H2O2引起氧化损伤,另加入TPCK干预,对照组晶状体仅用TC-199培养剂。在不同时间点分别取晶状体测定TTase、Trx的变化并观察TUNEL凋亡的情况;另原代培养晶状体上皮细胞(Lens epithelial cells,LES),紫外线诱导凋亡后观察TPCK的影响。
结果:氧化应激后第3hr两组的TTase、Trx都有显著的提高,第6hr氧化损伤的晶状体中这两种酶的含量减少,TPCK组的TTase、Trx含量低于正常对照组但明显高于氧化损伤组,差别具有统计学意义;TUNEL凋亡提示,在培养3hr的晶状体上皮细胞中细胞凋亡在H2O2损伤组最多,TPCK组较少;细胞培养晶状体上皮细胞流式凋亡检测显示TPCK组细胞胞亡数少于氧化应激组。
此结果解释了实验之初3小时内晶状体在氧化应激条件下TTase和Trx的增加。但是延长氧化应激时间,晶状体自身不足以对抗持续的损伤,TTase和Trx的表达开始下降,这对应结果中6小时这两种酶的减少。但是此时间点TPCK组TTase和Trx的水平仍高于氧化损伤组,说明TPCK可以诱导这两个基因的表达从而在对抗氧化应激损伤中起到一定的作用。逐渐增加氧化应激的时间,晶状体已经出现不可逆性混浊,其自身或者另外加入药物干预也无法抵抗损伤的程度,这正好与实验结果12小时酶含量的大幅度衰竭吻合。而在凋亡检测中,组织和细胞的凋亡分析均可见TPCK能够减少细胞凋亡数量,表明晶状体混浊过程中细胞的凋亡也是一个诱发的因素,因此TPCK另外一种作用是通过减少细胞凋亡起到延缓晶状体混 浊的作用。
结论:TPCK可减少大鼠晶状体的氧化损伤时的程度。
三、TPCK的用途
1、概述
本发明研究涉及到的药物作用机制与封闭晶体蛋白部分巯基、抑制蛋白间非特异性聚集有关,并进行了进一步的动物实验研究与理论探索。
发明人经过研究的最新发现是:发明人以晶状体浑浊为研究重点,详细阐述了对蛋白质的巯基进行烷基化作用的积极作用。如采用TPCK干预晶状体,减缓晶状体因受氧化应激作用而浑浊,即明确了TPCK的抗氧化应激作用。
虽然还有很多问题有待解释和解决,但是发明人的实验为TPCK防治白内障的作用机制提供了实验依据,对下一步药物开发以及运用于临床前期的治疗方案提供了崭新思路。
也就是说,TPCK或其组合物能够用于制备抗晶状体浑浊产品,可用于所涉及晶状体浑浊的防护、治疗等应用,最优选的是抗晶状体浑浊药物。
经实验研究表明,TPCK体外能够显著延缓晶状体浑浊相关疾病的发展。已完成的急性毒性实验证明,小鼠腹腔注射给药对TPCK的最大耐受量超过1mg/kg,相当于临床推荐用药剂量的20倍以上,表明该有效部位安全可靠,解决了该类药物剂量使用禁忌上的问题。
综上所述,发明人对抗晶状体浑浊产品进行了理论探索,经过大量的实验研究包括长期的药理学试验,发现所述及的TPCK有显著的预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊的活性,为研制抗晶状体浑浊产品尤其是抗晶状体浑浊药物提供了新的来源,为进一步开发利用中国现有药物提供了科学依据。
因此,TPCK或其组合物尤其是药物组合物可用于制备抗晶状体浑浊产品,优选以本发明TPCK为原料制备而成的抗晶状体浑浊药物。
2、TPCK的使用方法与要求
本发明TPCK可以单独或进一步与其它活性组分联合使用,包括用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品,包括药物或试剂等,尤其是药物。
在具体使用方面,本发明所述的TPCK能够单独直接使用,还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能,包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解TPCK的副作用等,这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种;优选包括医药学上可接受的载体等中的一种或多种。
本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一 种或多种。在许多情况下,在该组合物中最好包括等渗剂,例如,糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质,例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种,它们增强了TPCK的有效期或效力。
从具体的分类上看,所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体,包括润滑剂,如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸镁等中的一种或多种;崩解剂,如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠或低取代羟丙纤维素等中的一种或多种;填充剂,如淀粉、糊精或乳糖等中的一种或多种;粘合剂,如预胶化淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素等中的一种或多种;渗透压调节剂,如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种;pH调节剂,如盐酸、氢氧化钠等酸或碱中的一种或多种;溶剂,如水、缓冲液、乙醇或丙二醇等中的一种或多种等;抗氧剂和络合剂,如亚硫酸钠、EDTA等中的一种或多种;表面活性剂,如季铵化合物、十六烷醇等;吸附载体,如高岭土或皂粘土等中的一种或多种;高分子骨架剂,如环糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一种或多种;稀释剂如淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖和大豆油等中的一种或多种;稳定剂如羧甲基纤维素钠或环糊精等中的一种或多种;防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或苯甲酸钠等中的一种或多种。另外,还可以在TPCK中加入其他辅助剂,如香味剂和/或甜味剂如蔗糖、果糖和天冬甜素等中的一种或多种。
例如,将TPCK溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如,蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如,植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中,即可制得注射制剂,其中溶剂中可含有增溶剂(例如,聚山梨酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚维酮、环糊精、泊洛沙姆、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如,氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下,如有必要,可加入添加剂,例如稳定剂(例如,人血清白蛋白等)、止痛剂(例如,盐酸普鲁卡因或利多卡因等中的一种或多种)等。
本发明所述及的TPCK还可以联合使用,特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物,包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种,优选人、小鼠、大鼠、猴、猪、兔或犬等中的一种或多种,进一步优选人、大鼠或猴等中的一种或多种。例如,可以将本发明TPCK加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常,该药用组合物包含本发明TPCK和药学上可接受的载体。
TPCK的组合物特别是药物组合物可以有各种形式,包括例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种;其中所说的药物组合物包括治疗有效量的TPCK为活性成分,以及一种或多种医药学上可接受的载体。
本发明所述的TPCK的组合物尤其是药物组合物能够可以采用本领域公知的常规生产方 法制成任何一种适合于实验、研究或临床上应用的剂型,包括固体制剂如胶囊、片剂、颗粒制剂等,液体制剂如口服液或者注射剂等。
例如使活性成分与一种或多种载体混合,然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种,采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗晶状体浑浊的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。
TPCK的组合物尤其是药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的TPCK与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言,通过将TPCK加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下,推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如,通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂,可以保持溶液的适当流动性。
该组合物中可包括延迟吸收的药剂,例如单硬脂酸盐或明胶,以达到注射组合物的延长吸收;可包括高分子聚合物载体,如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯,以达到口服组合物的延长释放。
用于患者时,本发明所述的TPCK剂量为0.005~0.05mg/kg·d,可以分一次或多次使用,该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。
本发明TPCK的组合物尤其是药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明TPCK。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。TPCK的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及TPCK在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指TPCK的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。
“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者,预防有效量通常小于治疗有效量。本发明TPCK的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是0.005~0.05mg/kg,更优选为0.01~0.02mg/kg。应注意,剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化,也就是说用于患者时,本发明所述的TPCK剂量或用量,通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。
另外,应理解,对于任何特定受治疗者,应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度,并且本文设定的剂量范围仅为例证性的,并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。
也就是说,需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等,变化本发明TPCK的每次和/或每日的剂量或用量。例如,经静脉给予哺乳动物,尤其是成年人(如体重60kg),所述TPCK的单剂量约为0.3~3mg,优选约0.5mg,优选每日给药1次。可以调整剂量单位, 以提拱最佳所需反应(例如,治疗或预防应答)。
例如,可以单次大剂量给药,可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式,指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位;每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物TPCK。本发明的剂量单位形式的规格,由以下确定并直接取决于以下(a)TPCK的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果,和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性TPCK的技术中的内在限制。
3、TPCK的药物剂型和给药途径
本发明所述的TPCK的组合物尤其是药物组合物制备的用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品,其中按照试剂技术领域的要求制备的产品能够用于诊断、检测、研究抗晶状体浑浊;按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗、诊断、预防或研究,既能够单独直接用于制备治疗、预防或研究的药物,也能够与许多化学物质进行混合或组合,直接或间接用于制备治疗、预防或研究的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。
在本发明中,所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等,均应根据实际情况和需要,采用试剂级或药用级的物料。
本发明所述的TPCK的组合物尤其是药物组合物,可以用本领域已知的各种方法给药,尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是喷雾剂或口服给药。但是,技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中,该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如控释制剂,包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外,还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物,例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,纽约,1978)。
本发明所述的TPCK的组合物尤其是药物组合物中,可以含有本领域公知的医药学上可接受的载体和其它任选成分。载体包括羧甲基淀粉、淀粉、纤维素、明胶、碳酸氢钠、丙二醇或吐温80等。任选成分例如是着色剂、甜味剂、抗氧剂等。
本发明所述的TPCK的组合物尤其是药物组合物,通常通过口服、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式,施用于需要这种治疗的患者。
本发明所述的TPCK的组合物尤其是药物组合物可以制成任何一种适合于临床上应用的剂型,包括固体制剂,如胶囊、片剂、颗粒制剂等,半固体制剂如软膏等,液体制剂如口服液、混悬剂、乳剂等,或者注射剂。采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注 射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗晶状体浑浊的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。
用于口服时,可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时,本发明TPCK可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。TPCK(和其它成分,如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药,可以将所述TPCK与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。
为了以非肠道给药之外给予本发明TPCK,可能需要用防止其失活的材料对TPCK包衣或与TPCK一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时,将本发明TPCK与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用,可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物,因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。
制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种,如糖浆、酊剂或酏剂等中的一种或多种;用于肠胃外给药时,可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。
以上药物或药物组合物能够使用各种途径,在所述的使用形式中,优选的形式是口服制剂(如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液或混悬液等中的一种或多种)、非肠道给予剂型(如注射剂、软膏或贴剂等中的一种或多种)等中的一种或多种,进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种,特别优选片剂或注射剂中的一种。
综上所述,本发明TPCK的组合物尤其是药物组合物可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品,优选药物和食品,进一步优选药物。
四、技术特长
本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊提供了一种新的药物来源和应用剂型,从而对现有的抗晶状体浑浊产品系统特别是药物进行了改进、改善和提高,从而拓展了现有药物的应用。
本发明安全有效,实用性较强,价廉,方便快捷,其制备工艺简便、容易操作,使用简便、疗效显著,可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究各类晶状体浑浊的治疗和预防。
本发明有针对性地研究晶状体浑浊,发现了一种新的抗晶状体浑浊产品,作出了意想不到的成绩;同时,本发明也有针对性地研究TPCK的活性,其药理作用较强,使用安全,最大限度地发挥了作用。本发明对TPCK拓展了新的医药用途,也为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊提供了一种新的药物来源。
TPCK用于治疗晶状体浑浊、特别是晶状体浑浊,可明显改善晶状体浑浊引起的细胞凋亡,治疗效果显著,且毒副作用小,克服了现有的常用药物造成的副作用。本发明拓展了现有的TPCK新的医药用途,也为防治晶状体浑浊提供了一种新的药物干预手段。
本发明TPCK药理作用较强,效果明显,其原料来源丰富、价廉,性质稳定,制备工艺简单,质量控制简便,更适于医药、试剂等工业和行业的大规模生产和商业应用;使用范围特别广,因此容易推广应用,能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。
总之,本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要,为研究开发新的抗晶状体浑浊产品提供了新的药物和制剂来源,对开发利用中国现有药物具有重要价值,是用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊等方面的安全原料,对改进和提高现有的医疗水平具有重要价值。
附图说明
图1:未加药组和加入TPCK药物的SD大鼠晶状体离体培养,均用H2O2诱导氧化损伤。同一时间未加药大鼠晶状体混浊程度高于TPCK组大鼠;
A、D分别为未加药和TPCK大鼠晶状体培养组0hr,B、C分别代表未加药组大鼠晶状体离体培养6、12hr,E、F分别代表TPCK组大鼠晶状体离体培养6、12hr;
图2:BCA标准曲线图;
图3:氧化应激和TPCK组大鼠晶体蛋白热变性;
图4:根据标准蛋白分子量Maker(如图4所示),切下所需分子量对应的凝胶块,置于转移缓冲液中;所需抗体分子量12kDa
图5:Trx在不同组不同时间点的PCR产物电泳图;
图6:TTase/TrxmRNA在大鼠离体培养晶状体氧化损伤后不同时间点变化趋势;
图7:TTase和Trx在不同组不同时间点的表达;
图8-1:正常晶状体上皮细胞TUNEL凋亡(×100);
图8-2:H2O2氧化损伤3hr后晶状体上皮细胞TUNEL凋亡(×100);
图9:原代培养的晶状体上皮细胞(×100);
图10:原代培养的晶状体上皮细胞(×100);
图11:Trizol一步抽提法的操作流程;
图12:RNA甲醛变性凝胶电泳法的操作流程;
图13:石蜡切片TUNEL法操作流程;
图14:流式细胞法检测操作流程。
具体实施方式
本发明研究了现有的晶状体浑浊技术,提供了一种新的抗晶状体浑浊产品的配方的新用途,便于医疗、试剂等行业的安全使用。
本发明最终需要制备成抗晶状体浑浊产品进行应用,下面将列举实施例进行进一步说明。如有问题,可以与发明人直接联系13386272938。上述提供的一些实验数据以及下列实施例中按前述发明内容给出几种配方及其使用方法及一些试验研究内容,但应该理解本发明并不仅限于此处所列出的研究内容,还应该理解此处所使用的术语仅用于描述特定的实施例,而并不是对本发明的限定。
下面以TPCK部分具体的实验研究内容为例,进一步阐述本发明TPCK的新用途。
(一)第一部分:TPCK对晶状体氧化应激混浊程度和热稳定性的影响
1、概述
白内障是我国的第一位致盲疾病,严重影响了我国人民的健康。白内障发生的关键因素是晶状体发生混浊,从而影响了光线经过屈光介质透射、汇聚到视网膜,最终造成视物不清晰。老年性白内障是年龄相关性的疾病,也是老年人视力下降及致盲的主要原因,究其原因就在于晶状体在老化过程中出现的变性混浊。随着我国人口的逐渐老龄化趋势,其患病人数还会继续增加。国外的研究资料表明(Bloemendal H,Jong W,Jaenicke R,Lubsen N H,Slingsby C,Tardieu A.Progress on the function and structure of serine protease inhibitor[J].Prog Biophys Mol Biol,2004,86:407-485.),75岁以上的人群中老年性白内障患病率高达88%。众所皆知氧化应激(oxidative stress)在老年性白内障的发病过程中发挥了重要作用,氧化应激与晶状体混浊以及晶状体蛋白遭受应激损伤的翻译后修饰(post translational modification,简称:PTM)密切相关(Quillen DA.Common causes of vision loss in elderly patients[J].Am Fam Physician,1999,60(1):99-108.和Sun W R,Zhang X H,Zhang S J,Zhou Z Y.Oxidative damage and enzyme histochemistry changes in senile cataract[J].US Chin J Ophthalmol,2000,1:1-3.)。人眼的晶状体是一个比较特殊的器官,它的赤道部的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,简称:LECs)不断分化形成新的晶状体纤维,并且逐步向晶状体的核区移动,在这一迁移过程中,纤维细胞的细胞核以及细胞器都不断地退化进而消失,仅仅残留下透明的细胞质,从而形成了几乎不存在蛋白质的更新的核性区域。随着时间的累积,晶状体组织的硬度明显的增加,有研究表明(Heys KR,Cram SL,Truscott RJ.Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age:the basis for presbyopia?[J].Mol Vis,2004,10:956-963.),人到中年大概有50%原本可溶性的蛋白质会变性成为不溶性蛋白,因此使得晶状体的硬度增加,透明性也明显降低。
随着人类年龄的增长,自然老化是一项不可避免的生理过程,人们无法完全地阻止老化进程对于晶状体正常功能的负面影响,但是发明人可以通过采取一些防护措施,延缓或者一定程度地抑制晶状体的老化。对于老年性白内障,如果能够尽早采用有助于预防晶状体混浊的外用药物,提早打下预防基础,努力维持晶状体的透明度,尽量减轻老年性白内障的发生程度,将对老年性白内障患者是一大福音。迄今为止白内障传统的治疗方法仍旧是通过外科手术摘除混浊的晶状体,虽然技术成熟依然有一定的创伤性;另外常规眼液白内停、卡林优(吡诺克辛钠滴眼液)等传统治疗白内障药物的临床应用效果也并不是十分明显。因此,探寻老年性白内障的发生机制,进一步为寻找新型的抗白内障药物成为发明人亟待关注的重点。
本部分研究的构思是期望通过采用TC-199培养液(成分与晶状体在体内中的离子成分、PH值等相近)离体培养大鼠晶状体的方法,外加入H2O2刺激造成氧化应激的模型,由此来模拟体内环境中晶状体随着年龄的增长不断遭受外界氧化损伤以及逐渐老化的条件,并同时通过药物TPCK进行干预性调节,从而对比观察干预后TPCK是否能对晶状体混浊程度具有一 定的延缓或者抑制的作用,并采用热诱导晶状体蛋白变性的方法检测分析不同处理组的晶状体蛋白受热后其稳定性的改变,以此初步明确TPCK对于晶状体在氧化应激状态下的保护作用。
2、材料与方法
(1)实验动物:大鼠
(2)主要仪器及耗材:显微手术器械、微镜、移液器、滤纸、相机、天平、离心机、水浴箱、超纯水装置、干燥箱、消毒箱、制冰机、旋涡混合器、冰箱、PH调节仪;
(3)主要试剂:培养液、GO、H2O2、TPCK、水合氯醛、蛋白浓度测定试剂盒;
(4)实验方法:
①晶状体离体培养
A、动物晶状体准备:取大鼠,采用水合氯醛腹腔麻醉后处死,酒精擦拭双眼睑周围,取出眼球,放入PBS中清洗血液,漂洗后置于超净台无菌条件下用显微剪刀在角巩膜缘偏后剪开,娩出晶状体。
B、方法:取出完整的晶状体放入PBS中,将周围残存的玻璃体小心剥离,再将漂洗过的晶状体在滤纸上吸干表面水分及多余杂质,之后将晶状体放入培养液中,浸泡后移入培养板,加入培养液,放入培养箱, 然后加入H2O2和GO;实验组再加入TPCK,对照组仅加培养液。
C、分组:H2O2氧化应激与另外加入TPCK治疗组分别为对照组和实验组。
②体外诱导晶状体蛋白热变性
A、测定前准备:取仅加入H2O2氧化应激的大鼠晶状体和加入TPCK治疗组晶状体,分别移入匀浆管中,加入蛋白裂解液,置于冰盒上使用匀浆器匀浆,离心,取上清液稀释后测定蛋白浓度,并将两组大鼠晶状体蛋白上清液调至同一浓度。
B、方法:将浓度水平一致的晶状体蛋白均浆液移入比色杯,水浴箱预热,样品首先测定起始吸光度值,双蒸水做参照,加热后,定时测定吸光度值,用双蒸水做参照。
(5)统计与分析
3、实验结果
(1)晶状体离体培养
晶状体在培养液中离体培养,观察到经H2O2诱导氧化损伤的晶状体及TPCK对照组晶状体均无明显改变;之后,随着时间的延长,H2O2诱导损伤组晶状体出现逐渐加重的混浊,从开始的前或后皮质混浊发展到全皮质甚至全晶状体混浊,同一时间里加入TPCK的大鼠晶状体混浊程度均低于于未加药组大鼠。
(2)体外诱导晶状体蛋白热变性
①BCA法测定蛋白浓度:根据蛋白标准品,测定吸光度,绘制标准曲线(注:公式中R2值越接近1越好)。
②热稳定性测定:H2O2诱导氧化损伤的晶状体混合蛋白的上清液混浊程度增加较快,抗氧化损伤能力下降;H2O2诱导氧化损伤的同时加入了TPCK的晶状体混合蛋白上清液经水浴后逐渐变混浊,程度缓慢加重。
4、讨论与结论
氧化应激和热诱导变性是白内障发病的诱发因素。氧化应激(Oxidation Stress,简称:OS)是美国RS.Sohal于1990年首次提出的一种病理生理性质的概念。氧化应激在各种类型的白内障的发病过程中都扮演着重要的角色。氧化应激的损伤可以使得晶状体中产生一些氧自由基(Reactive Oxygen Species,简称:ROS)、活性氮自由基(Reactive Ntrogen Species,简称:RNS),这些均能够损伤晶状体细胞中的蛋白质、脂质以及核酸,诱发晶状体混浊变性。当细胞处于较高的温度下,细胞膜就会产生一些单层膜状的结构,从而破坏了细胞膜整体性和通透性(Dowhan W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity:why are there so many lipids?[J].Annu Rev Biochem,1997,66:199-232.)。晶状体蛋白受热性质改变,形成不溶性蛋白,可以发生凝集沉淀反应,使得晶状体失去其透明性,混浊发生。Heys KR等(Zhen-Yu H,Rong Z,Pei-Hong S,Bo W,Cheng-Jian J.Progress on the function and structure of serine protease inhibitor[J].Genomics and Applied Biology,2011,30(45):1290-1298.)的研究表明,把完整的晶状体置于50℃温和的热应激下,用来模拟晶状体在人体35℃体温内环境中发生的年龄相关改变,该模型中晶状体内部也会出现细胞内可溶性晶状体蛋白含量的下降,蛋白高分子形式(High molecular weight,简称:HMW),HMW的形成并最终凝集沉淀以及晶状体的硬度增加等类似于年龄相关性的晶状体的改变。因此发明人通过氧化应激和热诱导变性的方法可以检测TPCK对于SD大鼠晶状体混浊程度的影响以及对蛋白稳定性的作用,从而得知TPCK对于晶状体遭受损伤时是否具有一定的保护作用。
根据第一部分发明人的实验结果提示了TPCK不仅有助于保护大鼠晶状体蛋白免于氧化应激状态下的混浊程度的进展,而且对晶状体蛋白受热变性具有一定的抵抗能力。在离体培养的晶状体收到外界H2O2的氧化应激的损伤时,TPCK表现出对晶状体遭受外界氧化损伤时混浊的保护效应,可以观察在前3个小时的大鼠晶状体离体培养中,H2O2氧化损伤组和TPCK干预组未见到明显的变化,之后连续的6个小时中,可以明显看到加入了TPCK干预组的晶状体较之H2O2氧化损伤组的混浊程度大大减轻。但是12个小时之后,晶状体开始出现核性的完全性混浊,即使TPCK也无法减缓或逆转混浊程度的发生。因此根据本实验的结果可以看出TPCK对于处于氧化应激状态下的晶状体是具有一定的防护作用的。
H2O2是氧化应激的一种方式,除了能够引起自由基的增多,蛋白质结构和空间构象的变化外,还能激活晶状体上皮细胞的氧化敏感性转录因子NF-КB,从而导致基因表达异常,最终导致白内障。这只是H2O2损伤的一个机制,TPCK是通过哪种机制来保护晶状体在氧 化应激下的损伤的,还需要发明人进一步的探讨。而对于在白内障发生过程中具有重要作用的晶状体蛋白来说,其热稳定性的提高也是延缓白内障发生的原因之一,在这部分实验中发明人可以看出,TPCK对于晶状体蛋白受到外来的氧化损伤时的蛋白稳定性具有一定的抵抗作用,较之未加入TPCK的大鼠晶状体,能够提高晶状体蛋白的稳定结构,提高抗损伤的能力。
众所周知,白内障形成时,晶状体核变为暗黄色乃至褐色,van Heyningen于1971年首次报道晶状体含有荧光色素物(葡萄糖方苷)(YAN Hong,HU I Yan-Nian.Ageing lens and development oftataract[J].Fourth Mil Med Univ,2005,26(2):97-100.)。晶状体纤维细胞中有从色氨酸氧化产物衍变来的犬尿氨酸(Kyn),其中主要包括3-羟基犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸葡萄糖方苷和4-(2-氨基-3-羟苯基)-4-氧丁酸O-L-D-葡萄糖方苷。晶状体中这些物质的氧化增加了晶状体蛋白的凝聚、色素沉着和非色氨酸荧光物质的增加,上述改变与晶状体混浊密切相关。犬尿氨酸可能与谷胱甘肽或亲核氨基酸(如半胱氨酸)形成3-羟基谷胱甘肽犬尿氨酸葡萄糖方苷加合物。Gamer等(Gamer B,Roberg K,Q ian M,et al.Distribution of ferritin and redox-actinve transition metals in normal and cataractous human lenses[J].Exp Eye Res,2000,71(6):599-604.)发现牛晶状体蛋白可被犬尿氨酸修饰产生有色(在365nm吸收)和荧光(激发380nm,发射450~490nm)的蛋白质加合物。这些加合物凝聚增加了光散射,降低了晶状体的透明性。氧化损伤引起自由基的升高不仅可以导致脂质过氧化而产生白内障,还可以提高晶状体中3-羟基犬尿氨酸的浓度。发明人前期实验对抗白内障药物卡优林的研究表明了它是通过这种代谢组氨酸、色氨酸等生色基团来发挥作用的。
如果阻止晶状体蛋白交联、聚集成高分子量物质,那么便可抑制受损蛋白之间的偶联沉淀和由此产生的晶状体混浊。因而发明人提出一种假设:使用烷基(甲基、乙基等)替代受损晶状体蛋白中暴露的-SH中的H达到封闭巯基的作用,就可以阻止晶状体蛋白聚集、抑制晶状体混浊。晶状体蛋白大多含有一定数量的巯基且在晶状体中浓度极高,可达晶体湿重的35%;晶体的核区蛋白含量更高达50%(Simpanya MF,Ansari RR,Suh KI.Aggregation of lens crystallins in an in vivo hyperbaric oxygen guinea pig model of nuclear cataract:Dynamic light-scattering and HPLC analysis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46(12):4641-4651.)。因此,晶体中含游离巯基的蛋白较多。通过控制烷基化试剂的浓度及活性、部分封闭巯基,使晶体蛋白不再发生或少发生二硫化物交联,应可阻止或降低蛋白聚集、保持晶体透光性。而发明人根据TPCK的化学结构和生物活性,推测它正是承担了这种烷基化作用。另外发明人有个大胆的猜测TPCK还可以通过以下途径发挥抗氧化损伤的作用:首先TPCK与晶状体中遭受氧化损伤时候起防护作用的蛋白酶结合后,将会裂解掉它的活性部位的一个环状结构,同时使其抵抗热变性及自身的化学性能大大提高(Heys KR,Friedrich MG,Truscott RJ.Presbypoia and heat:changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein,alpha-crystallin,in maintaining lens flexibility[J].Aging Cell,2007;6(6):807-815.)。这可能是TPCK以不断的牺牲自我的结构成分来保持晶状体的透光性。 另一方面,它结构中的甲基酮是有活性但是中性特性的烷基,可以取代晶状体蛋白暴露出的巯基起到封闭性作用,从而阻止蛋白巯基之间的相互结合,在蛋白的非特异性聚集方面可能起到一种主动作用。另外TPCK的化学结构中的对甲苯磺酰基可以保护醇类,发明人设想它可以间接通过保护醇类化合物来发挥抗氧化的作用。那么保护晶状体免于氧化应激的损伤是保持晶状体透光性的首要内容,发明人初步推测TPCK正是通过对晶状体蛋白非特异性聚集前的防御和结合后的解除作用保持了晶状体的透明性。
任何原因引起的晶状体遭受持续性氧化应激损伤,都会起动晶状体内的防御系统,这些防御系统的表达是受AP-1转录因子调控的(Meyer M,Schreck R,Baeuerle PA.H2O2 and antioxidants have opposite effects on activation of NR-kappa B and AP-1 in intact cells:AP-1 as secondary antioxidant responsive factor[J].EMBO,1993,12:2005-2015.和Sen CK,Packer L.Antioxidant and redox regulation of gene transcription[J].FASEB,1996,10:709-720.),包括谷胱甘肽还原酶(Pinkus R,Weiner LM,Daniel V. Role of oxidants and antioxidants in the induction of AP-1,NF-kappaB,and glutathione S-transferase gene expression[J].Biol Chem,1996,271:13422-13429.),谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase)(Grant CM,Collinson LP,Roe JH,Dawes IW.Yeast glutathione reductase is required for protection against oxidative stress and is a target gene for Yap-1 transcriptional regulation[J].Mol Microbiol,1996,21:171-179.),TTase,Trx(Kuge S,Jones N.YAP1 dependent activation of TRX2 is essential for the response of Saccharomyces cerevisiae to oxidative stress by hydroperoxides[J].EMBO,1994,13:655-664.)和TR(Morgan BA,Banks GR,Toone WM,Raitt D.Kuge S.Johnston LH.The Skn7 respnse regulator controls gene expression in the oxidative stress response of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae[J].EMBO,1997,16:1035-1044.)。Li,SpectorA(Li DW,Spector A.Hydrogen peroxide-induced expression of the proto-oncogenes,c-jun,c-fos and c-myc in rabbit lens epithelial cells[J].Mol Cell Biochem,1997,173:59-69.和Li WC,Wang GM,Wang RR,Spector A.The redox active components H2O2 and N-acetyl-L-cysteine regulate expression of c-jun and c-fos in lens system[J].Exp Eye Res,1994,59:179-190.)等证实了兔的晶状体上皮细胞H2O2介导的原癌基因c-Jun,c-fos和c-myc改变是由转录因子控制的。持续的氧化应激条件下,TTase表达和活性的增加对于保护晶状体细胞是必要的。抗氧化剂二硫酶可以修复氧化损伤中的关键酶和蛋白,比如ATP生成的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PD)、过氧化氢解毒酶和谷胱甘肽过氧化物酶(Xing K,Lou MF.The possible physiological function of thioltransferase in cells[J].FASEB,2003,17:2088-2090.)。另外,TTase活性增加可以增强抗坏血酸盐循环利用的能力以减少中毒的细胞中脱氢抗坏血酸的堆积(Fernando MR,Nanri H,Yoshitake S,Nagata-Kuno K,Minakami S.Thioredoxin regenerates proteins inactivated by oxidative stress in endothelial cells[J].Eur J Biochem,1992,209:917-922.)。激活的Trx和TR在氧化应激下可以帮助细胞修复氧化损伤,Trx从过氧化氢还原蛋白把电子传递给H2O2来破坏二硫键的结合,移除毒性的过氧化氢,从而再生氧化损伤的蛋白和酶(Yoshitake S,Nanri H, Yoshitake S,Fernando MR,Minakami S.Possible differences in the regenerative roles played by thioltransferase and thioredoxin for oxidatively damaged proteins[J].Biochem(Tokyo),1994,116:42-46.和Chae H,Robison K,Poole L,Church G,Storz G,Rhee S.Cloning and sequencing of thio-specific antioxidant from mammalian brain:alkyl hydroperoxide reductase and thiol-specific antioxidant define a large family of antioxidant enzymes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:7071-7072.)。
但是,在强氧化应激作用下,上述酶及蛋白功能同样受损,无法阻止随后的蛋白聚集。实验研究表明,单纯依靠晶状体维持体内自身的TTase、Trx浓度,仍难以有效抵抗晶体蛋白Cys-SH免受氧化(Ganea E,Harding JJ Glutathione-related enzymes and the eye[J].Curr Eye Res,2006,31(1):1-11.和Yogorova S,Yegorov O,Lou MF.Thioredoxin induced antioxidant gene expression in human lens[J].Exp Eye Res,2006,83(4):783-792.)。这一部分的实验发明人已经观察到TPCK能够防护离体培养的晶状体免于遭受氧化应激的损伤,减轻晶状体混浊程度,并一定程度上稳定晶状体蛋白受热变性。TPCK是否能够影响晶状体内的上述具有抗氧化作用的细胞溶质酶,通过自身以及TTase、Trx对晶状体蛋白二硫键的结合来维持晶状体的透明性呢?这是第二部分实验研究的出发点,另外针对TPCK已知的抗凋亡作用,第二部分同时检测TPCK在晶状体氧化应激损伤下对凋亡细胞的影响。
(二)第二部分:TPCK对晶状体抗氧化酶和凋亡情况的影响
1、概述
许多实验已经证明晶状体对氧化应激的反应发生于白内障晶状体混浊之前,氧化损伤是白内障形成的首发因素。氧化应激是由活性氧(reactive oxygen species,简称:ROS)诱导的。晶状体的酶类系统在正常的代谢过程中可以产生内源性的活性氧分子,或者是晶状体遭受外界环境的刺激后可以产生外源性的活性氧。晶状体中主要的活性氧分子包括超氧负离子,H2O2和羟自由基(Lou MF.Redox regulation in the lens[J].Prog Retin Eye Res,2003 22:657-682.),晶状体中可以产生活性氧的内源性系统包括NAPDH氧化酶、线粒体和过氧化物酶体。晶状体中两种主要产生外源性活性氧的途径是紫外线和离子辐射。晶状体中有抗氧化剂和氧化损伤防护体系来中和这两种途径产生的活性氧分子(Lou MF.Redox regulation in the lens[J].Prog Retin Eye Res,200322:657-682.和M.McNamara,R.C.Augusteyn.The effects of hydrogen peroxide on lens proteins:A possible model for nuclear cataract[J].Exp Eye Res,1984;38(1):45-56.)。虽然有这些强有力的抗氧化剂和活性氧中和酶系统,一些活性氧分子仍旧可以逃脱这些防御体系进而氧化损伤细胞中的蛋白质、脂质和DNA(Lou MF.Redox regulation in the lens[J].Prog Retin Eye Res,200322:657-682.和M.McNamara,R.C.Augusteyn.The effects of hydrogen peroxide on lens proteins:A possible model for nuclear cataract[J].Exp Eye Res,1984;38(1):45-56.和Lou MF.Thiol regulation in the lens[J].Ocul Pharmacol Ther,2000,16:137-148.)。因此晶状体中也具备一些可以修复损伤分子或者减轻损伤程度的蛋白酶类(Wagner BJ,Margolis JW,Garland D,Roseman JE.Bovine lens neutral proteinase preferentially hydrolyses oxidatively modified glutamine synthase[J].Exp Eye Res,1986,43:1141-1143.和Jahngen-Hodge J,Cry D,Laxman E,Taylor A.Ubiquitin and ubiquitin conjugates in human lens[J].Exp Eye Res,1992,55:897-902.)。硫醇转移酶(Thioltransferase,简称:TTase)、硫氧还蛋白(Thioredoxin,简称:Trx)、硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase,简称:TR)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,简称:GR)系统被认为是哺乳动物中这类具有强有力的蛋白修复能力的系统(Holmgren A.Thioredoxin and glutaredoxin systems[J].Biol Chem,1989,264:13963-13966.和Yoshitake S,Nanri H,Fernando MR,Minakami S.Possible differences in the regenerative roles played by thioltransferase and thioredoxin for oxidatively damaged proteins [J].Biochem(Tokyo),1994,116:42-46.和Fernando MR,Nanri H,Yoshitake S,Nagata-Kuno K,Minakami S.Thioredoxin regenerates proteins inactivated by oxidative stress in endothelial cells.[J].Eur J Biochem,1992,209:917-922.),近些年的研究证实了TTase/GR和Trx/TR存在于晶状体中,而且在维持晶状体处于还原状态,保持其透明性方面起到了至关重要的作用(Raghavachari N,Lou MF.Evidence for the presence of thioltransferferase in the lens[J].Exp Eye Res,1996,63:433-441.和Yoshitake S,Liu A,Lou MF.Human lens thioredoxin:molecular cloning and functional characterization[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44:3263-3271.)。
目前研究较多的是硫醇转移酶(简称:TTase)及硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶(简称:Trx/TR)等(Lou MF.Redox regulation in the lens[J].Prog Retin Eye Res,200322:657-682.和Yoshitake S,Liu A,Lou MF.Human lens thioredoxin:molecular cloning and functional characterization [J].Invest OphthalmolVis Sci,2003,44:3263-3271.和Holmgren A.Glutathione-dependent synthesis of deoxyribo nucleotides:characterization of the enzymatic mechanism of Escherichia coli glutaredoxin[J].Biol Chem,1979,254:3272-3278.)与GSH代谢及调节密切相关,众人悉知,GSH在晶状体中含量高(mmol水平)(Moon S,Rohan Fernando M,Lou MF.Induction of thioltransferase and thioredoxin/thioredoxin reductase systems in cultured porcine lenses under oxidative stress[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46:3783-3789.),有助于保护晶体蛋白中半胱氨酸Cys-SH处于还原状态,是晶状体中重要的抗氧化防御屏障(Yoshitake S,Liu A,Lou MF.Human lens thioredoxin:molecular cloning and functional characterization[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44:3263-3271.和Moon S,Rohan Fernando M,Lou MF.Induction of thioltransferase and thioredoxin/thioredoxin reductase systems in cultured porcine lenses under oxidative stress[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46:3783-3789.)。研究结果还表明,晶体中GSH浓度分布由晶体外层向核性区渐次下降,说明GSH抗氧化作用主要在晶体外层皮质区发挥作用。这些酶或蛋白质也具有抗氧化作用,在氧化应激作用下其酶活性或蛋白表达升高,促使蛋白二硫混合物的解离,有利于维持晶体透光性。但是随着年龄的增加这些酶含量逐渐减少,而且不能阻止后续的晶状体蛋白之间的二硫键聚集。
通过第一部分的实验,发明人已经观察到TPCK抗晶状体混浊的作用,基于它的化学结构,发明人推测其通过封闭部分巯基,既可以抑制大量二硫化物的形成;还可对已经形成的二 硫化物聚合体进行竞争结合,促使重新打开二硫键。那它面对TTase、Trx是否具有上调作用从而间接发挥作用呢?发明人通过检测氧化应激状态下干预了TPCK的晶状体中这两种酶的含量的改变来探索TPCK的作用,这是本部分要做的主要工作。
已经有研究证实了TPCK可以通过抗凋亡的作用对神经系统有明确的治疗效果(孙明,赵玉梅,徐超.N-甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮抗脑缺血作用[J].中风与神经疾病杂志,2002,2(19):70-72.);随着年龄的增加晶状体上皮细胞逐渐发生凋亡,细胞凋亡一定量即可诱发白内障的形成。白内障患者晶状体前囊上皮细胞的凋亡数量明显高于正常人(丁建光,李含玉,曾令柏,王家翠,杨策尧.晶状体上皮细胞凋亡与过氧化氢诱导白内障形成研究[J].中华实验眼科杂志,2001,3:202-204.)。那么本部分也将对TPCK的抗细胞凋亡作用进行检测,取晶状体上皮组织做TUNEL凋亡及对培养的晶状体上皮细胞进行流式凋亡检测,从而分析TPCK对于晶状体上皮细胞凋亡情况的影响。
2、材料与方法
(1)实验动物:大鼠
(2)主要仪器及耗材:手术器械、显微镜、移液器、滤纸、微波炉、天平、离心机、超纯水装置、PCR扩增仪、酶标仪、振荡器、水浴锅、摇床、电泳槽、电泳仪、成像仪、冰箱、流式细胞仪、巴氏吸管、培养瓶、超净台
(3)主要试剂:兔抗鼠TTase抗体、兔抗鼠Trx抗体、β-actin抗体、HRP Conjugated羊抗兔二抗、RNA提取试剂Trizol、各种DNA marker、6×DNA上样缓冲液、琼脂糖、PrimeScriptRT reagent Kit、SYBR-Green Master Mix、DAB显色试剂盒、多聚甲醛、TUNEL凋亡试剂盒、蛋白酶K、LEC原代细胞系、DMEM F12培养基、胎牛血清、胰酶
(4)实验方法
①晶状体离体培养和晶状体上皮细胞的培养
A、动物晶状体准备(同第一部分):取大鼠,采用水合氯醛麻醉后处死,酒精擦拭双眼睑周围,取出眼球,放入PBS中清洗血液,漂洗后置于超净台无菌条件下用显微剪刀在角巩膜缘偏后剪开,娩出晶状体。
B、晶状体离体培养方法:取出晶状体放入PBS中,将周围残存的玻璃体小心剥离,再将晶状体在滤纸上吸干水分及杂质,最后将晶状体置于培养液中,浸泡后移入培养板,加入培养液,放入培养箱,剔除培养后变混浊的晶状体,然后转移到新的培养板中,加入H2O2和GO,实验组再加入TPCK,对照组仅加培养液。
C、晶状体上皮细胞培养方法:取细胞,水浴箱中溶解,拿进超净台内将其中细胞液用吸管吸到离心管中,再加入培养液,离心,弃掉上清,加入培养液,混匀成单细胞悬液。将单细胞悬液加到已有培养液的培养瓶中,显微镜下观察细胞状态,将复苏好的细胞放入温箱中培养。观察细胞生长状态。细胞贴壁后继续培养,即可用于实验。
D、晶状体上皮细胞氧化应激损伤方法:
晶状体上皮细胞不用H2O2氧化应激损伤法,因为晶状体上皮细胞比较脆弱,H2O2氧化损伤可能造成不可逆性损伤,即使用药物干扰也无法逆转。所以发明人采用紫外线照射法造成氧化应激损伤。将培养的细胞在超净台内打开盖子,紫外线灯照射。
E、分组
H2O2氧化应激与另外加入TPCK治疗组分别为对照组和实验组,单纯培养离体晶状体未做任何处理的晶状体为空白组。免疫组织化学检测与TUNEL凋亡实验与上述相同。晶状体上皮细胞培养分为H2O2氧化应激和TPCK干预,分别为对照组和实验组。
②RT-PCR检测TTase和Trx的mRNA表达
A、晶状体总RNA提取
取离体培养的晶状体置于匀浆管中,每管加入匀浆器进行匀浆。
B、Trizol一步抽提法
C、核酸样品的鉴定
核酸样品的纯度测定用分光光度计测定。观测核酸样品在两个波长下的读数(简称:OD)值,根据比值来判断核酸样品的纯度。根据公式计算RNA样品的浓度(μg/μl):
RNA样品的浓度=OD 260×核酸稀释倍数×40/1000
RNA样品完整性的检测,采用凝胶电泳法。
D、引物设计
在互联网上利用Pubmed查找目的基因全长,设计并合成。设计结果用Blast进行对比,确保其特异性。总量2ODU260,采用PAGE方式纯化,有效去除了非全长片段,引物效率高。采用双蒸水复溶,然后上游引物与下游引物混合均匀,再加入DEPC水,存放。
E、逆转录-聚合酶链式反应(简称:RT-PCR)
F、聚合酶链式反应
在上简单PCR机之前,退火温度设置四个,进行简单PCR,以期摸索最佳退火温度。
G、琼脂糖凝胶电泳
制胶:在三角烧瓶中装入TAE电泳缓冲液,用dd H2O和琼脂糖粉。在微波炉中加热使琼脂糖溶解,使溶液冷却,加入EB,混合。在距离底板的位置上放置梳子,将温热琼脂糖溶液倒入胶模中,并检查梳子的齿下或齿间是否有气泡。在凝胶完全凝固后,移除梳子,将凝胶放入电泳槽中,加入电泳缓冲液。
电泳:取PCR产物与加样缓冲液混合后,用移液器将混合物加至样品槽中,其中第一泳道加入DNA ladder。调节通电电压,使DNA向阳极(红线)移动。电泳至溴酚蓝和二甲苯青FF在凝胶中迁移出适当的距离。切断电源,取出胶在紫外灯下观察结果并拍照。
结果判定:紫外光下呈现白色荧光,可见到条带的迁徙位置,凝胶图像照相确定TTase/Trx与内参β-actin的mRNA有表达后上RT-PCR仪器。
H、Real-time PCR
使用SYBR Green荧光染料嵌入法进行上述目的基因的Real time PCR扩增。
RT-PCR按照上述电泳的最佳温度条件:95℃,2min→(95℃,15s→62℃,30s→72℃,15s)循环40次→72℃,5s;同时以95℃,15s→62℃,30s→72℃,15s的条件监测扩增产物的链融解曲线,结果显示均成重叠单峰,确认引物的特异性较好。应用分析软件求出平均CT值,以目的和内参基因的mRNA相对表达量的比值进行定量分析。
③Western Blot检测TTase和Trx的表达
A、样品总蛋白的提取
取离体培养的晶状体置于匀浆管中,每管加入晶状体蛋白裂解液,样品用匀浆器进行匀浆,匀浆液静置,离心,取其上清转移到另一新的EP管中。
B、蛋白定量
采用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量检测蛋白含量:将试剂盒中配置好的蛋白标准品加到96孔板,加去离子双蒸水。依次加样品到96孔板中,最后每孔都加BCA工作液,放置。540nm波长处酶标仪测定OD值。根据标准品蛋白制作的标准曲线计算出样本蛋白浓度。每个样本加入蛋白上样缓冲液,置于EP管中,水浴,保存备用。
C、SDS-PAGE凝胶电泳
灌胶:迅速在间隙中灌注分离胶,留出浓缩胶空间,用移液器在分离胶溶液上覆盖一层异丙醇,将凝胶垂直放于室温。倾出覆盖层异丙醇,去离子水洗涤凝胶数次以取出未聚合的分离胶,用纸巾吸出残留液体。
加入浓缩胶,安装上样梳子。将凝胶垂直放于室温,移出梳子。用加样器按顺序加样,第一孔加入蛋白分子量标准。次序加样品标本,每样加蛋白加至底部,每加完一个应在槽缓冲液中洗涤加样器。正极接下槽,开始电泳。观察溴酚蓝达到分离胶底部,关闭电源。
转膜:转膜完成后将硝酸纤维素膜放入盛有脱脂奶粉溶液的平皿中,摇床内孵育,封闭非特异性抗原。将硝酸纤维膜放入长形玻璃容器中,加入抗体,摇床过夜。放入玻璃平皿中用TBST洗除过量的一抗。再将膜转入长形玻璃器皿中,加入羊抗兔二抗。室温摇床孵育。取出膜再用TBST洗膜。BCIP/NBT显色,并保存图像。实验重复时,条件完全一致。
根据标准蛋白分子量Maker,切下所需分子量对应的凝胶块,置于转移缓冲液中。切取硝酸纤维素膜和滤纸,大小与凝胶大小完全吻合。将硝酸纤维素膜浸泡于转移缓冲液中,并驱逐气泡。平放电极叠加滤纸,挤出气泡,将硝酸纤维素膜放在滤纸上,左下角剪开一角做标记,精确对齐。凝胶平放于膜上,再叠加滤纸,放上方电极。接通电源,电转移。
④TUNEL法检测晶状体上皮细胞的凋亡
A、组织标本的准备
取离体培养的大鼠晶状体,PBS漂洗,在滤纸上吸去水分,然后置于放有多聚甲醛中,过夜固定。
B、石蜡切片TUNEL法操作流程
⑤流式细胞法检测晶状体上皮细胞凋亡
将培养的晶状体上皮细胞转移到六孔板中,培养后分为两组,一组中加入TPCK,另一组不加,然后在紫外灯下照射,诱导凋亡。再培养,胰酶消化刺激后的细胞,收取细胞做流式。
⑥统计与分析
所有数据用均数±标准差 表示,应用统计软件进行t检验,p<0.01表示统计学差异非常显著,p<0.05表示统计学差异显著,p>0.05表示无统计学差异。
3、结果
(1)RT-PCR结果分析
PCR电泳结果显示各组晶状体Trx的条带亮度存在,且有明显变化。RT-PCR结果用Imageanalyst软件进行定量分析,正常对照组晶状体中Trx的mRNA有高表达;3hr H2O2氧化损伤的晶状体Trx的mRNA表达也较高,但是6hr H2O2氧化损伤的晶状体Trx的mRNA表达明显降低。未用药组仅H2O2氧化损伤组和TPCK组分别与空白对照组相比,TTase和Trx在用TPCK后各个时间点的表达均有统计学意义。
TTase和Trx的mRNA的相对表达量与对照组相比在3小时明显上调,6小时候表达量逐渐降低。
(2)Western-Blot结果分析
Western Blot印记杂交结果显示各组角膜β-actin条带亮度相似,而TTase和Trx的条带亮度有明显变化。处理3hr后TTase和Trx的蛋白表达水平都较之正常晶状体组有明显升高,TPCK用药组高于未用药组;6hr后开始减退,但是TPCK组仍高于未用药组但稍低于正常对照组。
(3)TUNEL凋亡结果分析
正常晶状体上皮细胞仅有微量的阳性着染。H2O2氧化损伤3hr,晶状体上皮细胞可见阳性表达,凋亡细胞着染棕褐色颗粒状,与氧化损伤组相比,TPCK处理组的凋亡细胞较少但仍有少许阳性着染。
(4)流式细胞凋亡结果分析
①晶状体上皮细胞培养结果
原代大鼠晶状体上皮细胞系复苏后,第三天的细胞形态,细胞几乎全部贴壁,无悬浮死细胞,细胞间无杂质,未见污染情况,晶状体上皮细胞呈现为梭状形态。在100倍数低倍镜下拍照。
②流式检测凋亡结果
细胞流式检测凋亡可见,紫外线照射后的晶状体上皮细胞凋亡细胞数占总细胞数的30.9%;而加入了TPCK干预的凋亡细胞数量仅占细胞总数的20.1%。
4、讨论与结论
TTase是11.8KD的热稳定蛋白,在原核和真核生物中存在(Holmgren A.Glutathione-dependent synthesis of deoxyribo nucleotides:characterization of the enzymatic mechanism of Escherichia coli glutaredoxin[J].Biol Chem,1979,254:3272-3278.)。它也是一种多功能的酶,在许多生化过程例如蛋白再生(Yoshitake S,Nanri H,Fernando MR,Minakami S.Possible differences in the regenerative roles played by thioltransferase and thioredoxin for oxidatively damaged proteins[J].Biochem(Tokyo),1994,116:42-46.),核糖核酸还原酶的还原(William CH,Arscott DL,Muller S.Thioredoxin reductase:two modes of catalysis have evovled [J].Eur J Biochem,2000,267:6110-6119.)和催化蛋白质巯基二硫化合物的聚合(Wang G-M,Raghavachari N,Lou MF.Relationship of protein-glutathione mixed disulfide and thioltransferase in H2O2-induced cataract in cultured pig lens[J].Exp Eye Res,1997,64:693-700.)以及恢复糖酵解和氧化防御关键酶的活性(Xing KY,Lou MF.Effect of H2O2 on human lens epithelial cells and the possible mechanism for oxidative damage repair by thioltransferase[J].Exp Eye Res,2002,74:113-122.)。近年,TTase还发现具有脱氢抗坏血酸还原酶活性(Wells WW,Wu D P,Yang YF,Rocque PA.Mammalian thioltransferase(glutaredoxin)and protein disulfide isomerase have dehydroascorbate reductase avtivity[J].Biol Chem,1990,265:15361-15364.和Fernando MR,Satake M,Monnier V,Lou MF.Thioltransferase mediated ascorbate recycling in human lens epithelial cells[J].Invset Ophthalmol Vis Sci,2004,45:230-237.)以及参与了信号转导机制的调控(Stark DW,Chock PB,Mieyal JJ.Glutathione-thiylradical scavenging and transferase properties of human glutaredoxin(thioltransferase):potential role in redox signal transduction[J].Bio Chem,2003,278:14607-14613.)。Trx是小的12KD的热稳定蛋白,在高等和低等生物中均存在,它的活性部位有两个高度保守的半胱氨酸残基,可以减少蛋白之间的二硫键(Holmgren A.Enzymatic reduction-oxidation of protein disulfides by thioredoxin[J].Methods Enzymol,1984,107:295-300.)。氧化的Trx通过TR和还原型NADH还原。TR是同源二聚体的含硒酶,可以催化Trx的依赖NADH还原系统,就像大多数其他的氧化细胞分子(Berken K,Gromer S,Schirmer RH,Muller S.Thioredoxin reductase as a pathophysiological factor and drug target[J].Eur J Biochem,2000,267:6118-6125.)。Trx/TR系统在大多数细胞内的氧化还原过程中起到了重要的作用,包括DNA合成、细胞增殖、生长和分化、蛋白的再生,以及可以抵御氧化应激和细胞凋亡的细胞毒素(Mustacichi D,Powis G.Thioredoxin reductase[J].Biochem,2000,346:1-8.和Berggren M,Gallegos A,Gasdaska JR,Gasdaska PY,Warneke J,Powis G.Thioredoxin and thioredoxin reductase gene expression in human tumors and cell lines,and the effects of serum stimulation and hypoxia[J].Anticancer Res,1996,16:3459-3466.)。
氧化的证据由于白内障晶状体中主要的抗氧化系统的活性降低,并发现白内障晶状体和房水中H2O2水平升高,Spector等(Spector A.Oxidative stressinduced cataract:Mechanism of action[J].FASEB,1995,9(12):1173-1179.)提出氧化损伤是白内障形成的启始因素。另外氧化应激可以诱导不同细胞中众多的蛋白和酶的表达。研究已经发现TTase的表达可在人类晶状 体上皮细胞遭受轻度的H2O2氧化损伤下增加两到三倍(Raghavachari N,Kryzan K,Xing K-Y,Lou MF.Regulation of thioltransferase expression in human lens epithelial cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2001,42:1002-1008.),这种上调是通过一系列的信号转导机制介导的(Kryzan K,Lou MF.Human thioltransferase(TTase)gene is controlled by AP-1 and mediated through redox signaling[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43:1876-1883.)。Trx也是通过相同的方式在氧化应激的刺激下引起人类晶状体上皮细胞中的表达上调的(Raghavachari N,Lou MF.Evidence for the presence ofthioltransferase in the lens[J].Exp Eye Res,1996,63:433-441.)。有研究显示Trx的表达在Emory小鼠的晶状体遭遇到光氧化时也发生一定的上调现象(Reddy PG,Bhuyan DK,Bhuyan KC.Lens-specific regulation of the thioredoxin-1 gene,but not thioredoxin-2 upon in vivo photochemical oxidative stress in the Emory mouse[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,265:345-349.)。Lou在2005年培养的猪晶状体中推测TTase和Trx的暂时上调现象在低浓度氧化应激(0.2Mm H2O2)发生在培养的6小时内,但是当氧化应激持续损伤条件下,TTase和Trx的防御体系崩溃,表达逐渐降低(Moon S,Rohan Fernando M,Lou MF.Induction of thioltransferase and thioredoxin/thioredoxin reductase systems in cultured porcine lenses under oxidative stress[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46:3783-3789.)。发明人本部分的实验结果提示,TTase和Trx的表达在H2O2氧化损伤3hr有一定的上调现象,6hr明显降低,这与之前的种种研究结果类似,只是在H2O2浓度以及TTase和Trx的表达增高的临界点有所出入,这与所用的实验动物以及实验条件不同有关。而且发明人的实验还设置了TPCK干预组,在6hr这两种酶含量降低的氧化应激组,TPCK干预组表现出TTase和Trx表达仍处于相对较高的水平,这可能提示TPCK对于TTase和Trx的表达具有一定的诱导效应,在晶状体遭受长期的氧化应激状况时,体内的TTase、Trx不足以清除蛋白的非特异性聚集,没有足够能力维持晶状体的透明性,而TPCK通过间接上调这两种酶的表达,同时自身对蛋白质二硫键的烷基化作用,可以减少受氧化损伤的晶状体蛋白二硫键之间的交联。
一定时间的氧化应激条件下,TTase和Trx的表达和活性增加对于保护细胞是必要的,它们通过修复氧化损伤中一些关键的酶类或者蛋白,譬如谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氢解毒酶(Xing K,Lou MF.The possible physiological function of thioltransferase in cells[J].FASEB,2003,17:2088-2090.)等;TTase还可以增强抗坏血酸盐循环利用的能力以减少中毒的细胞中脱氢抗坏血酸的堆积(Fernando MR,Nanri H,Yoshitake S,Nagata-Kuno K,Minakami S.Thioredoxin regenerates proteins inactivated by oxidative stress in endothelial cells[J].Eur J Biochem,1992,209:917-922.)。Trx能够从过氧化氢还原蛋白那里把电子传递给H2O2来破坏它与蛋白质二硫键的结合(Yoshitake S,Nanri H,Fernando MR,Minakami S.Possible differences in the regenerative roles played by thioltransferase and thioredoxin for oxidatively damaged proteins [J].Biochem(Tokyo),1994,116:42-46.),移除毒性的过氧化氢(Chae H,Robison K,Poole L,Church G,Storz G,Rhee S.Cloning and sequencing of thiol-specific antioxidant from mammalian brain:alkyl hydroperoxide reductase and thiol-specific antioxidant define a large family of antioxidant enzymes[J].Proc NatlAcad Sci USA,1994,91:7017-7021.),从而再生了氧化损伤的蛋白/酶类。发明人的实验结果也显示出在前3个小时内,这两种酶的活性明显提高。在氧化应激状态下用来保护细胞。但是在持续长时间的氧化应激损伤下,这些修复系统的酶类不能负荷如此持久强大的损害,导致本身活性的降低和含量的衰减(Moon S,Rohan Fernando M,Lou MF.Induction of thioltransferase and thioredoxin/thioredoxin reductase systems in cultured porcine lenses under oxidative stress[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46:3783-3789.)。这部分的实验中发明人也观察到了相同的现象,3个小时后的时间,TTase和Trx的含量逐渐降低,6个小时监测到显著的降低(和对照组相比差别有统计学差异),随后的时间内晶状体混浊逐步加深,发展为全白内障,核区已经混浊明显,混浊不可逆性,此时这些修复酶类也无法再行使职责发挥抗氧化的作用。本部分的实验结果与此吻合,也是第二部分实验的一个亮点,显示了TPCK的作用下,TTase、Trx这两种酶在晶状体遭受氧化应激时的时效性改变。
以往许多研究显示凋亡机制有可能是一些白内障诸如辐射性白内障形成过程中共有的细胞学基础(Li WC,Kuazak JR,Dunn K.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for noncongenital cataract development in human and animals[J].Cell Biol,1995,130:169-181.)。凋亡最先发生于晶状体上皮细胞,使得晶状体上皮细胞从上皮层脱落,其密度减低,从而在维持晶状体内环境稳定的作用稍弱,还能使得晶状体蛋白的结构发生改变,蛋白之间的交联聚合增加从而导致光散射增强,晶状体透明度减低。而TPCK作为一种抗凋亡剂,已经证实能够干预许多病理生理过程,例如可以缩小短暂性局灶性脑缺血后的梗死体积,另有许多的研究发现TPCK通过阻断细胞内一些蛋白酶的活性,对多种细胞内凋亡因子发挥了一定的抑制作用。基于此本部分实验通过对离体培养的晶状体进行TUNEL凋亡检测来观察TPCK对于晶状体上皮细胞凋亡的影响,结果提示,在氧化应激条件下,TPCK能够一定程度的保护细胞免于遭受应激状况下的凋亡。在原代培养的晶状体上皮细胞的流式凋亡分析中也可看到相同的结果,对于最先遭受氧化应激损伤的晶状体上皮细胞,加入了TPCK干预的晶状体上皮细胞的凋亡数量明显少于氧化应激损伤组的数量。初步分析,TPCK可能抑制多种因素引起的不同细胞的凋亡,能够阻断晶状体上皮细胞在遭受氧化损伤时释放超氧阴离子和一些其它毒性细胞因子,正是这些超氧阴离子和毒性细胞因子造成了晶状体代谢的紊乱,例如使晶状体上皮细胞膜上的离子通道功能失调,细胞内外离子分布水平失衡,进而吸水膨胀引发了晶状体混浊的初步发生。
鉴于前两部分对TPCK对晶状体混浊的保护作用,强烈吸引发明人思考从巯基结合保护,而非被动维持还原性巯基入手,研究康晶状体蛋白聚集的新途径及作用机制。最近泛素蛋白酶体通路(简称:UPP)对于白内障形成的影响有了新的研究进展,UPP是比较经典的信号转导通路,以前较多的研究是集中在肿瘤发病机制和治疗方面,已经有研究将蛋白酶体抑制剂用于肿瘤并取得了一定的成效(Orlowski RZ,Dees EC.The role of the ubiquitination -proteasome pathway in breast cancer:applying drugs that affect the ubiquitin-proteasome pathway to the therapy ofbreast cancer[J].Breast Cancer Res,2003,5:5-7.)。最新关于白内障的研究表明 UPP能够通过快速降解受损的晶状体蛋白阻止了其在晶状体中的的聚集从而防止混浊的发生(Xinyu Zhang,Edward J.Dudek,Bingfen Liu,Linlin Ding,Alexandre F.Fernandes,Jack J.Liang,Josepb Horwitz,Allen Taylor,Fu Sbang.Degradation of C-terminal truncated αA-crystallins by the ubiquitin-proteasome pathway[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48:4200-4208.)。关于其对白内障具体的治疗成效世界各国尚未见相关的研究报道。结合最新的研究动态,发明人设想UPP这一经典的蛋白质质量控制机制行使了类似于DTT类化合物的作用,即能够解离已经形成的变性受损的二硫键,降低蛋白质的聚集程度。前期实验已经观察到DTT的干预效果远远超过同剂量GSH或其他临床常用滴眼液如卡林优,这提示了解离二硫键比被动维持还原型巯基更有效。
在白内障的发生过程中,蛋白质的聚集和沉淀是晶状体混浊的一个原因。在晶状体蛋白中,α晶状体蛋白和β晶状体蛋白都对蛋白裂解酶的降解敏感,α晶状体蛋白亲水的C端,β晶状体蛋白大部分的N端都可以被蛋白裂解酶降解,而这些亲水性末端对晶状体蛋白的水溶性起着重要的作用。γ晶状体蛋白相对比较稳定,最初它被认为是晶状体内的一种结构蛋白,比较不容易受到蛋白裂解酶的降解。三种晶状体蛋白中都含有一定数量的半胱氨酸(Cysteine,Cys),Cys中的游离巯基(-SH)极其容易遭受氧化损伤(Lou MF.Redox regulation in the lens [J].Progress in Retinal and Eye Research,2003,22(5):657-682.)进一步聚集形成二硫键,引起蛋白的变性沉淀,晶状体混浊的产生。英国牛津大学眼科的最新研究成果显示α晶体蛋白和含巯基的还原剂共同作用,可使人白内障晶状体中活性已丧失的酶“起死回生”(Schey KL,Little M,Fowler JG.Characterization of human lens major intrinsic protein structure[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41(1):175-183.)。α晶状体蛋白和硫甲丙脯酸使谷胱甘肽还原酶活性“回升”79%,α晶状体蛋白和二硫苏糖醇(DTT)能使巯醇转移酶活性增加200%。这进一步揭示了α晶体蛋白的分子伴侣活性在维持晶状体代谢中的重要性,分子伴侣可“解救”一类由于蛋白质错误折叠累积导致的构象性疾病,首次临床应用药物性伴侣治疗构象性疾病已取得可喜结果。α晶状体蛋白在透明性发面发挥着多功能的作用,α晶状体蛋白的特性以及蛋白质的低聚性是维持晶状体透明状态所需的。1992年Horwitz(Horwitz J.Alpha crystallin can function as a molecular chaperone[J].Natl Acad Sci,.1992,89:10449-10453.)提出α晶状体蛋白与年龄相关白内障的关系:α晶状体蛋白通过分子伴侣的作用纠正在老龄化拥挤的纤维细胞中的错误折叠或受损变性的蛋白,依次来抑制变性蛋白的聚集沉淀,维持晶状体的透明。鉴于此α晶状体蛋白的降解参与了晶状体混浊的发生,受到损伤而被蛋白酶类降解的α晶状体蛋白片段在晶状体内聚集沉淀,最终会导致晶状体不溶性蛋白增加,透光度减低,混浊逐渐产生。αA1-162晶状体蛋白是m-蛋白裂解酶的主要降解产物,而且研究显示出它在一般正常的晶状体中含量极少,在糖尿病白内障的晶状体中出现(Thampi P,Hassan A,Smith JB,Abraham EC.Enhanced c-terminal truncation of αA-and αB-crystallins in diabetic lenses[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43:3265-3237.),这也说明了它只有在遭受到氧化应激、离子辐射、 药物或者毒性刺激例如高糖状态的损伤时,才会出现并且容易聚集进而引起晶状体的混浊。
因此在研究抗晶状体蛋白聚集的新途径时发明人设想:晶状体蛋白的聚集与否主要取决于是否形成分子内或分子间的二硫化物交联,而保持游离-SH只是阻止上述交联的可能条件,而非必须条件。本部分的实验结果显示,在紫外线辐射的刺激下,晶状体上皮细胞中能够检测到αA1-162晶状体蛋白,这是晶状体上皮细胞中的αA晶状体蛋白在氧化应激的损伤下被蛋白酶裂解而产生的片段分子,这种片段由于暴露出本身结构中半胱氨酸的-SH,使得片段之间容易偶联聚合,蛋白变性聚集沉淀导致晶状体的混浊。已有研究表明在晶状体上皮细胞中应用UPP系统的化学性蛋白酶体抑制剂会使受损蛋白质的水平提高(Dudek EJ,Shang F,Valverde P,Liu Q,Hobbs M,Taylor A.Selectivity of the ubiquitin pathway for oxidatively modified proteins:relevance to protein precipitation diseases[J].Faseb J,2005,19:1707-1709.)。而在发明人设计了一种上调UPP活性的siRNA Ubc4(一种泛素聚合酶E2)并将其转染到晶状体上皮细胞后,增加了UPP的活性,结果显示可以清除受损而被蛋白酶裂解的小片段αA1-162晶状体,较之未转染的细胞其中的αA1-162晶状体蛋白的含量明显减少。Ubc4是一种UPP系统中的泛素聚合酶,由于它在晶状体细胞内的含量是有限的,发明人构建出以脂质体为载体的基因并通过RNA转移技术,在晶状体中过度表达这些限速成分,增加了UPP的蛋白质降解效率,使得晶状体蛋白的小分子降解片段即使得到清除,阻止这些受损晶状体蛋白之间二硫键的形成、非特异性交联、聚集增强形成高分子量物质(简称:HMW),保持晶状体的透明性。
前两部分实验中,发明人已经观察到TPCK能够一定程度的延缓晶状体在氧化应激损伤下混浊程度的发生,并能在氧化应激损伤条件下稳定晶状体蛋白。而且提高了晶状体上皮细胞中的关键抗氧化酶TTase和Trx的表达水平。
总之,通过整个的实验结果,发明人得知TPCK能够对晶状体中的蛋白质进行调控,在白内障的形成过程中发挥了一定的功能。白内障的发病机制极其复杂,是机体内外多重因素对晶状体综合作用而产生的结果,晶状体在整个的生命旅程中都处于动态的分化进程,其正常的分化状态是保持透明度的前提(Nakamura T,Pichel JG,Williams-Simons L.An apoptotic defect in lens differentiation caused by human p53 is rescued by a mutant allele[J].Pro Natl Acad Sci,1995,92(13):6142-6146.),分化失常则形成白内障。晶状体中含游离巯基的蛋白较多,如果通过控制烷基化试剂的浓度及活性、部分封闭巯基,使晶体蛋白不再发生或少发生二硫化物交联,应该可阻止或降低蛋白聚集、保持晶体透光性。根据上述假设,发明人设计将晶体蛋白的巯基进行烷基化。通过封闭部分巯基,既可以抑制大量二硫化物的形成;还可对已经形成的二硫化物聚合体进行竞争结合,促使重新打开二硫键。能够对蛋白质的巯基进行烷基化的试剂有很多,如碘乙酰胺、碘甲烷、2,4-二硝基氟苯、苯甲酰卤化物、氯甲基酮及其衍生物等。而TPCK中的甲基酮结构正是承担了这样的作用,发明人也检测到TPCK延缓晶体混浊的同时能够对GSH相关代谢调节酶或蛋白(TTase、Trx/TR等)的协同保护作用,能够在长期氧化应激的刺激下上调这两种酶的活性从而达到抗氧化的作用。
TPCK及其组合物的常用药物制剂的制备方法
本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法,以水作为溶媒,其步骤为:取TPCK,加入赋形剂,加水溶解,调节pH,加入活性炭,过滤除菌,灌装,半轧塞,冷冻干燥,压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷、白蛋白、pH调节剂等中的一种或几种。每瓶含TPCK0.1~4mg。
本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法,以水作为溶媒,其步骤为:取TPCK,加或不加赋形剂(赋形剂同上),加水溶解,加入活性炭,过滤除菌,喷雾干燥,无菌分装,压塞轧盖即可。每瓶含TPCK0.1~4mg。
本发明制备小针剂时,以注射用水作为溶媒配制即可,也可加适量辅料,辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、环糊精、抗氧剂、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。注射剂可以配制成溶液、微乳液、乳液、脂质体、微球、微囊或其它适合于高药物浓度的有序结构,其中可包括延迟吸收的药剂,例如单硬脂酸盐、明胶、乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等,以达到注射组合物的延长吸收。每支含TPCK0.1~4mg。
本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液,以注射用水作为溶媒,加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可,也可加适量辅料,辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、抗氧剂、环糊精、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。每瓶含TPCK0.1~4mg。
本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂,辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等,按常规技术制备。可包括高分子聚合物载体,如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯等,以达到口服组合物的延长释放。
在本发明中,以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明,并不是用来限制发明的范围。
下面通过实施例对本发明作详细描述。
以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均是来自上述的描述或符合上述的要求。
实施例1、TPCK对晶状体氧化应激混浊程度和热稳定性的影响
1、材料与方法
(1)实验动物
健康SD大鼠10只,雄性,6W龄,体重180g左右。由第二军医大学实验动物中心提供。清洁级并饲养于动物中心。
(2)主要仪器及耗材
(3)主要试剂
(4)主要试剂和溶液的配制
①TC-199培养液
取一袋TC-199(9.5g/袋),按照说明加入2.2gNaHCO3,加入双蒸水补至1L,调节PH值到5.5。于4℃存放。用前滤过除菌。
②0.25mM的TPCK溶液
TPCK分子式量为351.84。取一支100mg的TPCK粉末,溶于100ml的双蒸水中,再加入0.1ml的TWEEN80(作为一种增溶剂,可以促进溶解TPCK的作用),即为2.8mmol/L(1/351.84×1000=2.8mmol/L)的溶液。4℃存放。用前稀释10倍在超净台内滤过除菌后使用。
③葡萄糖氧化物(glucose oxidase,GO,0.025U/μl)
取GO(含10KU)加入1ml的dd H2O,配制成10U/μl。取出10μl加入90μl的双蒸水,此时浓度为1U/μl。用前稀释40倍,使其终浓度为0.025U/μl。-20℃保存。用前超净台内滤过除菌。加入GO为了维持稳定的H2O2的浓度。
④H2O2(0.24mM)
H2O2的密度是1.122g/ml,分子式量为34,(1.122×30%×100/34)/0.1=9.9mol/L,所以一般都认为大概是10mol/L。配制成0.24mM浓度,取1μl稀释40倍左右即0.24mM的H2O2,(1×10-3×10/0.24)=42ml。室温下存放。用前滤过除菌。
⑤10×磷酸盐缓冲液(Phosphate-Bufer-Solution,简称:PBS)
用800ml的双蒸水溶解,调节pH值至7.2~7.4,定容至1000ml,4℃保存,用前10倍稀释。
⑥晶状体蛋白裂解液
A液为0.2mol/L的Tris(MW 121.14)2.428g,加100ml双蒸水(ddH2O);B液为0.1mol/L的HCL(37%、1.19)0.84ml加100ml双蒸水(ddH2O)。然后将A液25ml与B液41.4ml均匀混合,调节酸碱度至PH为7.4,此溶液即晶状体蛋白裂解液。
(5)实验方法
①晶状体离体培养
A、动物晶状体准备
健康SD大鼠10只,雄性,6W龄,体重180g左右。采用10%水合氯醛(0.6~0.7/100g)腹腔麻醉后颈椎脱臼法处死,70%酒精擦拭双眼睑周围,取出眼球,放入PBS中清洗血液,漂洗两次后置于超净台无菌条件下用显微剪刀在角巩膜缘偏后约0.2mm处剪开,小心于裂口处向两边延伸,再用两把显微镊轻轻牵拉裂口两边小心娩出晶状体。
B、方法
取出完整的晶状体放入PBS中,将周围残存的玻璃体小心剥离,再将漂洗过的晶状体在滤纸上小心来回滚动几次吸干表面水分及黏连的多余杂质,之后将晶状体放入经过滤过除菌的TC-199培养液中,浸泡数秒后移入24孔培养板,加入600μl TC-199培养液,放入37℃、5%CO2培养箱2小时,然后加入0.04mM的H2O2和0.025U/μl的GO,使H2O2终浓度约为0.02mM,实验组再加入100μl的TPCK,对照组仅加培养液。
C、分组
H2O2氧化应激与另外加入TPCK治疗组分别为对照组和实验组,每组10只SD大鼠晶状体。
②体外诱导晶状体蛋白热变性
A、测定前准备
取仅加入H2O2氧化应激的SD大鼠晶状体和加入TPCK治疗组晶状体各2只,分别移入2ml匀浆管中,加入1.8ml蛋白裂解液,置于冰盒上使用电动匀浆器反复匀浆(注意每隔30s左右停止匀浆并于冰盒上静置30s后继续匀浆,间断匀浆),研磨均匀后,12,000rpm、4℃离 心20分钟,取上清液稀释后用BCA法、酶标仪540nm波长测定蛋白浓度,并将两组大鼠晶状体蛋白上清液调至同一浓度(7.5μg/μl)。
B、方法
将浓度水平一致的晶状体蛋白均浆液移入1cm光径比色杯,体积2ml;恒温水浴箱预热至50℃,样品首先于320nm波长处测定起始吸光度值,双蒸水做参照,加热后,每5分钟测定一次320nm波长处的吸光度值,用双蒸水做参照。
(6)统计与分析
所有数据用均数±标准差 表示,应用SPSS18.0医用统计软件进行t检验,p<0.01表示统计学差异非常显著,p<0.05表示统计学差异显著,p>0.05表示无统计学差异。
2、实验结果
(1)晶状体离体培养
晶状体在TC-199中离体培养的前三小时,观察到经H2O2诱导氧化损伤的晶状体及TPCK对照组晶状体均无明显改变;之后,随着时间的延长,H2O2诱导损伤组晶状体出现逐渐加重的混浊,从开始的前或后皮质混浊发展到全皮质甚至全晶状体混浊,同一时间里加入TPCK的大鼠晶状体混浊程度均低于于未加药组大鼠(图1)。
(2)体外诱导晶状体蛋白热变性
①BCA法测定蛋白浓度
根据7个蛋白标准品(浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μl),测定540nm处吸光度分别为0.096、0.138、0.163、0.251、0.302、0.377、0.500。绘制标准曲线,见图2(注:公式中R2值越接近1越好)。
②热稳定性测定
在一个小时的实验中,H2O2诱导氧化损伤的晶状体混合蛋白的上清液混浊程度增加较快,在320nm处的吸光度值上升较快,曲线陡峭,抗氧化损伤能力下降;H2O2诱导氧化损伤的同时加入了TPCK的晶状体混合蛋白上清液经水浴后逐渐变混浊,程度缓慢加重,在320nm处的吸光度值上升较慢,曲线斜率低(图3)。
3、结论
氧化应激和热诱导变性是白内障发病的诱发因素。
实施例2、TPCK对晶状体抗氧化酶和凋亡情况的影响
1、材料与方法
(1)实验动物
健康SD大鼠30只,雄性,6W龄,体重180g左右。由第二军医大学实验动物中心提供。清洁级,饲养于动物中心。
(2)主要仪器及耗材
健康SD大鼠30只,雄性,6W龄,体重180g左右。由第二军医大学实验动物中心提供。
清洁级,饲养于动物中心。
(3)主要试剂
β-actin、TTase、Trx引物均由上海英潍捷基(Invitrogen Trading Co.,Ltd)贸易有限公司合成。
(4)主要试剂和溶液的配制
①10×磷酸盐缓冲液(Phosphate-Bufer-Solution,简称:PBS)
同前。
②TBS-T缓冲液(Tris HCL-Buffer-Solution,简称:TBS)
NaCl 8g
KCL 2g
Tris 3g
用800ml的水双蒸水完全溶解,调节pH值至7.4,定容至1000ml,高压高温灭菌,此为TBS缓冲液,TBS-T是再加入1ml的TWEEN(TWEEN为一种非离子型去污剂,有复性抗原的作用,可提高特异性的识别能力)。室温下保存。
③10mg/ml溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)
100mg溴化乙锭完全溶解于10ml的双蒸水即得,于4℃避光保存。
④2×SDS凝胶加样缓冲液
先配成不含DTT的2×SDS加样缓冲液室温保存,临用前从1mol/L的DTT储存液(-20℃保存)现用现加于上述缓冲液中。
⑤晶状体蛋白裂解液
同第一部分。
⑥30%丙烯酞胺
称取丙烯酞胺29g,N,N’-亚甲双丙烯酸铵1g,加双蒸水60ml,加热至37℃溶解后加双蒸水定容至100ml,过滤除菌。置棕色瓶中4℃保存。
⑦10%十二烷基硫酸钠(简称:SDS)
称10g十二烷基硫酸钠加双蒸水90ml加热至68℃加浓盐酸调节PH至7.2后加双蒸水至1000ml。
⑧浓缩胶缓冲液(1mol/L Tris-HCL pH=6.8)
12.12g Tris溶解在80ml双蒸水中,用浓盐酸调节pH至6.8后加水至100ml,4℃保存。
⑨分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris-HCL pH=8.8)
18.16g Tris溶解在80ml双蒸水中,用浓盐酸调节pH至8.8后加水至100ml,4℃保存。
⑩10%过硫酸胺(简称:AP)
用双蒸水配成少量的10%储存液并4℃保存,由于过硫酸胺会缓慢分解,最好现用现配。
⑾封闭液
5%脱脂奶粉,溶于TBST中。
⑿5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Tris 125mmol/L 15.1g
甘氨酸 1.25mol/L 94g
SDS 10%50ml
加双蒸水至1000ml,使用时稀释5倍,pH=8.3。
⒀5×转移缓冲液
加双蒸水至1000ml,使用时稀释5倍。
⒁晶状体上皮细胞培养液
每50ml培养液中包含45ml的DMEM F12培养基中,5ml胎牛血清(Fetal bovine serum,简称:FBS),0.9ml的三抗(即10%FBS,1%三种抗菌素混合物)。
(5)实验方法
①晶状体离体培养和晶状体上皮细胞的培养
A、动物晶状体准备(同第一部分)
健康SD大鼠30只,雄性,6W龄,体重180g左右。采用10%水合氯醛(0.6~0.7/100g)腹腔麻醉后颈椎脱臼法处死,70%酒精擦拭双眼睑周围,取出眼球,放入PBS中清洗血液,漂洗两次后置于超净台无菌条件下用显微剪刀在角巩膜缘偏后约0.2mm处剪开,小心于裂口处向两边延伸,再用两把显微镊轻轻牵拉裂口两边小心娩出晶状体。
B、晶状体离体培养方法
取出完整的晶状体放入PBS中,将周围残存的玻璃体小心剥离,再将漂洗过的晶状体在滤纸上小心来回滚动几次吸干表面水分及黏连的多余杂质,最后将晶状体置于经过滤过除菌的TC-199培养液中,浸泡数秒后移入24孔培养板,加入600μl TC-199培养液,放入37℃、5%CO2培养箱2小时,剔除培养2小时后变混浊的晶状体(可能是由于操作损伤到晶状体囊膜),然后转移到新的24孔板中,加入0.24mM的H2O2和0.025U/μl的GO,使H2O2终浓度 大致为0.02mM,实验组再加入100μl的TPCK,对照组仅加培养液。
C、晶状体上皮细胞培养方法
从液氮中取出冻存细胞,于37℃水浴箱中不断摇晃直至溶解,把溶解的细胞液拿进超净台内将其中细胞液(1ml)用巴氏吸管小心吸到15ml离心管中,再加入4ml的培养液混匀,低速离心,1000rpm,5min。离心后弃掉上清,随即加入2ml培养液,巴氏吸管吹打混匀成单细胞悬液(尽量避免产生气泡)。事先准备好的培养瓶中加入3ml左右的培养液,将吹打好的单细胞悬液加到培养瓶中。显微镜下观察细胞状态,是否吹打均匀。将复苏好的细胞放入5%的CO2温箱中培养。隔日观察细胞生长状态。细胞贴壁后继续培养,2~3天更换一次细胞液,6~7天传代一次。传代到第三代细胞状态最好,即可用于实验。
D、晶状体上皮细胞氧化应激损伤方法
晶状体上皮细胞不用H2O2氧化应激损伤法,因为晶状体上皮细胞比较脆弱,H2O2氧化损伤可能造成不可逆性损伤,即使用药物干扰也无法逆转。所以发明人采用紫外线照射法造成氧化应激损伤。将培养的细胞在超净台内打开盖子,距离紫外线灯大约10cm的距离照射30min左右。
E、分组
H2O2氧化应激与另外加入TPCK治疗组分别为对照组和实验组,单纯培养离体晶状体未做任何处理的晶状体为空白组,每组10只SD大鼠晶状体。免疫组织化学检测与TUNEL凋亡实验与上述相同。晶状体上皮细胞培养分为H2O2氧化应激和TPCK干预,分别为对照组和实验组。
②RT-PCR检测TTase和Trx的mRNA表达
A、晶状体总RNA提取
取离体培养3hr、6hr、12hr的晶状体置于2ml的匀浆管中,每管加入1ml预冷的Trizol电动匀浆器进行匀浆。
B、Trizol一步抽提法
操作流程见图11。
C、核酸样品的鉴定
核酸样品的纯度测定
核酸样品的纯度用分光光度计测定。观测核酸样品在260nm和280nm两个波长下的读数(简称:OD)值,根据OD 260/OD 280的比值来判断核酸样品的纯度,理想比值为1.5~1.8,表明RNA溶液纯度高,含蛋白质、DNA杂质较少,适合RT-PCR实验。根据公式计算RNA样品的浓度(μg/μl):
RNA样品的浓度=OD 260×核酸稀释倍数×40/1000
RNA样品完整性的检测
采用RNA甲醛变性凝胶电泳法,操作流程见图12。
注意事项
全程佩戴一次性手套,避免RNA酶降解RNA并导致RNA的污染,使用灭菌的一次性塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪器导致RNA酶交叉污染。
D、引物设计
在互联网上利用Pubmed查找目的基因全长,由上海英潍捷基贸易有限公司设计并合成。设计结果用Blast进行对比,确保其特异性。总量2ODU260,采用PAGE方式纯化,有效去除了非全长片段,引物效率高。采用双蒸水复溶,然后上游引物10μl与下游引物10μl混合均匀,再加入30μl的DEPC水(此为PCR Primer Mix),–20℃存放。
β-actin检测引物:
上游引物5’-AGCCTTCCTTCTTGGGTA-3’
下游引物5’-TCAGTAACAGTAAGCCTA-3’,产物为338bp;
TTase检测引物:
上游引物5’-CAAATTTCCGGCAGTGTGTGTC-3’
下游引物5’-GAGCCATGCAATGGAGTCTGAGTA-3’,产物为87bp;
Trx检测引物:
上游引物5’-TACAACAGCTCACCGGAGCAAG-3’
下游引物5’-GGCCATTAGCATGGCTGGAC-3’,产物为194bp。
E、逆转录-聚合酶链式反应(简称:RT-PCR)
首先进行逆转录反应,根据样品个数准备逆转录反应管,先加入总体系20μl的下述试剂,逆转录反应条件为(37℃,15min×3,此为反转录反应;85℃,5sec,此为反转录酶的失活反应):
F、聚合酶链式反应
加入总体积30μl的下述反应试剂:
扩增条件如下:
在上简单PCR机之前退火温度设置62℃上下2℃范围左右内4个(即59℃、60℃、62℃、63℃四个退火温度),进行简单PCR,以期摸索最佳退火温度。
G、琼脂糖凝胶电泳
制胶:在三角烧瓶中装入50×TAE电泳缓冲液1ml,用dd H2O 49ml和0.5g琼脂糖粉。在微波炉中加热使琼脂糖溶解,使溶液冷却至60℃,加入EB至终浓度为0.5μg/μl,充分混合。在距离底板0.5~1.0mm的位置上放置梳子,将温热琼脂糖溶液倒入胶模中,凝胶厚度在3~5mm之间,并检查梳子的齿下或齿间是否有气泡。在凝胶完全凝固后(于室温放置30~45min),小心移除梳子,将凝胶放入电泳槽中,加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。
电泳:取10μl PCR产物与加样缓冲液混合后,用微量移液器慢慢将混合物加至样品槽中,其中第一泳道加入DNA ladder。将通电电压调至110mv,使DNA向阳极(红线)移动。电泳至溴酚蓝和二甲苯青FF在凝胶中迁移出适当的距离。切断电源,取出胶在紫外灯下观察结 果并拍照。
结果判定:紫外光下呈现白色荧光,可见到条带的迁徙位置,凝胶图像照相确定TTase/Trx与内参β-actin的mRNA有表达后上RT-PCR仪器。
H、Real-time PCR
使用SYBR Green荧光染料嵌入法进行上述目的基因的Real time PCR扩增。反应体系如下:
RT-PCR按照上述电泳的最佳温度条件:95℃,2min→(95℃,15s→62℃,30s→72℃,15s)循环40次→72℃,5s;同时以95℃,15s→62℃,30s→72℃,15s的条件监测扩增产物的链融解曲线,结果显示均成重叠单峰,确认引物的特异性较好。应用分析软件求出平均CT值,以目的和内参基因的mRNA相对表达量的比值进行定量分析。
③Western Blot检测TTase和Trx的表达
A、样品总蛋白的提取
取离体培养3hr、6hr、12hr的晶状体置于2ml的匀浆管中,每管加入900μl预冷的的晶状体蛋白裂解液,样品置于冰上用组织匀浆器进行匀浆。完全匀浆后匀浆液于冰上静置20min,后4℃,12000rpm,离心20min。取其上清转移到另一新的1.5ml EP管中。
B、蛋白定量
采用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量检测蛋白含量:将试剂盒中配置好的蛋白标准品按照0,1,2,4,8,12,16,18,20μl加到96孔板,加去离子双蒸水补足到20μl。依次加20μl样品到96孔板中,最后每孔都加BCA工作液200μl(A液:B液为50:1,混匀),37℃放置30min。540nm波长处酶标仪测定OD值。根据标准品蛋白制作的标准曲线计算出样本蛋白浓度。每个样本加入1/4体积的蛋白上样缓冲液(即样品:蛋白上样缓冲液=4:1),置于EP管中,沸水浴10min,使蛋白变性。-80℃保存备用。
C、SDS-PAGE凝胶电泳
按照下列配方配制12%的分离胶:
灌胶:迅速在间隙中灌注分离胶,留出浓缩胶空间(齿长再加1cm),用移液器小心的在分离胶溶液上覆盖一层异丙醇,将凝胶垂直放于室温,30min。倾出覆盖层异丙醇,去离子水洗涤凝胶数次以取出未聚合的分离胶,用纸巾吸出残留液体。
然后再按照下列配方配制5%的浓缩胶:
加入浓缩胶,安装上样梳子。将凝胶垂直放于室温,30min后小心移出梳子。用微量加样器按顺序加样,第一孔加入蛋白分子量标准(Maker)。次序加样品标本,每样加蛋白30μg加至底部,每加完一个应在槽缓冲液中洗涤加样器。正极接下槽,电压80V,开始电泳。约1hr后,观察溴酚蓝达到分离胶底部,关闭电源。
转膜:转膜完成后将硝酸纤维素膜放入盛有5%的脱脂奶粉溶液的平皿中,37℃摇床内孵育2hr,封闭非特异性抗原。将硝酸纤维膜放入长形玻璃容器中,加入1:1000的抗体(即2ml的脱脂奶粉加入2μl的一抗),4℃摇床过夜。放入玻璃平皿中用约200ml的TBST室温下洗20min×3次,去除过量的一抗。再将膜转入长形玻璃器皿中,加入1:2000的羊抗兔二抗。室温摇床孵育2hr。取出膜再用TBST洗膜3次。BCIP/NBT显色,并保存图像。实验重复时,条件完全一致。
根据标准蛋白分子量Maker(如图4所示),切下所需分子量对应的凝胶块,置于转移缓冲液中。切取硝酸纤维素膜和6张3mm滤纸,大小与凝胶大小完全吻合。将硝酸纤维素膜浸泡于转移缓冲液中5min,并驱逐气泡。平放电极(电极也置于转移缓冲液中)叠加3张滤纸,挤出气泡,将硝酸纤维素膜放在滤纸上,左下角剪开一角做标记,精确对齐。凝胶平放于膜上,再叠加3张滤纸,放上方电极。接通电源,200mA,电转移55min。
④TUNEL法检测晶状体上皮细胞的凋亡
A、组织标本的准备
取离体培养的大鼠晶状体,PBS漂洗两次,在滤纸上来回轻轻滚动吸去多余的水分,然后置于放有1ml的4%多聚甲醛中,过夜固定。
B、石蜡切片TUNEL法操作流程
见图13。
⑤流式细胞法检测晶状体上皮细胞凋亡
将培养的晶状体上皮细胞长至90%左右时转移到六孔板中,培养一天后分为两组,一组中加入TPCK,另一组不加,然后在紫外灯下照射30min,诱导凋亡。再培养一天,胰酶消化刺激后的细胞,收取细胞做流式,操作流程见图14。
⑥统计与分析
2、结果
(1)RT-PCR结果分析
PCR电泳结果显示各组晶状体Trx的条带亮度存在,且有明显变化(见图5)。RT-PCR结果用Image analyst软件进行定量分析,正常对照组晶状体中Trx的mRNA有高表达;3hr H2O2氧化损伤的晶状体Trx的mRNA表达也较高,但是6hr H2O2氧化损伤的晶状体Trx的mRNA表达明显降低。RT-PCR结果显示各个时间点TTase和Trx/β-actin的比值具体见表2-1,未用药组仅H2O2氧化损伤组和TPCK组分别与空白对照组相比,TTase和Trx在用TPCK后各个时间点的表达均有统计学意义(见图6)(P<0.05或P<0.01)。
第一泳道为DNA Maker,依次为对照组,3hr氧化损伤组,3hr加入TPCK组,6hr氧化损伤组,6hr加入TPCK组和12hr氧化损伤组,12hr加入TPCK组的Trx基因的表达。结果提示3hr表达量有所提高,6hr后逐渐下降,至12hr表达量很低。电泳结果也分析了最佳PCR条件如上3、(2)的扩增条件。
注:﹡与对照组相比(默认值为1),p<0.05;﹡﹡与对照组相比(默认值为1),p<0.01。
图中显示,TTase和Trx的mRNA的相对表达量与对照组相比在3小时明显上调,6小时候表达量逐渐降低。(前两个柱状图分别是TTase在3hr和6hr、Trx,黑色是H2O2组,蓝色是TPCK组,后两个是Trx)﹡p<0.05,﹡﹡p<0.01
(2)Western-Blot结果分析
Western Blot印记杂交结果显示各组角膜β-actin条带亮度相似,而TTase和Trx的条带亮度有明显变化(见图7)。图中可见处理3hr后TTase和Trx的蛋白表达水平都较之正常晶状体组有明显升高,TPCK用药组高于未用药组;6hr后开始减退,但是TPCK组仍高于未用药组但稍低于正常对照组。
(3)TUNEL凋亡结果分析
正常晶状体上皮细胞仅有微量的阳性着染。H2O2氧化损伤3hr,晶状体上皮细胞可见阳性表达,凋亡细胞着染棕褐色颗粒状,与氧化损伤组相比,TPCK处理组的凋亡细胞较少但仍有少许阳性着染(图8-1中白箭头所示)。图8-2为阴性对照。
(4)流式细胞凋亡结果分析
①晶状体上皮细胞培养结果
于武汉原生原代生物有限公司购买的原代大鼠晶状体上皮细胞系(RAT-CELL-0067)复苏后,第三天的细胞形态,细胞几乎全部贴壁,无悬浮死细胞,细胞间无杂质,未见污染情况,晶状体上皮细胞呈现为梭状形态。在100倍数低倍镜下拍照,如下图9所示:
②流式检测凋亡结果
细胞流式检测凋亡可见,紫外线照射30min后的晶状体上皮细胞凋亡细胞数占总细胞数的30.9%(图10中的C);而加入了TPCK干预的凋亡细胞数量仅占细胞总数的20.1%(图 10中的D)。图10中的A为未标记空白对照组,图10中的B为单标AV对照组。
3、结论
在TPCK的作用下,TTase、Trx这两种酶在晶状体遭受氧化应激时表现出时效性改变;TPCK能够一定程度的保护细胞免于遭受应激状况下的凋亡。
Claims (5)
1.TPCK在制备抗晶状体混浊产品中的用途。
2.TPCK的组合物在制备抗晶状体混浊产品中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的抗晶状体浑浊产品是指医药、食品、饮料和试剂技术领域中,一种直接或者间接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的产品。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述的抗晶状体浑浊产品是直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的药物。
5.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的晶状体混浊疾病包括各类晶状体混浊疾病中的一种或多种。
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WO2009044294A2 (en) * | 2007-06-15 | 2009-04-09 | Université De Geneve | Means and methods for the treatment of cataract and presbyopia |
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WO1994000095A2 (en) * | 1992-06-24 | 1994-01-06 | Cortex Pharmaceuticals, Inc. | Use of calpain inhibitors in the inhibition and treatment of medical conditions associated with increased calpain activity |
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