CN108069963B - 吡啶并嘧啶衍生物或其盐及其制法、药物组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及吡啶并嘧啶衍生物或其盐及其制法、药物组合物和用途，具体涉及一类新型TLR激动剂化合物以及该化合物的药学上可接受的盐或其组合物、也涉及上述物质的制备方法、以及在制备治疗传染病、呼吸系统疾病和免疫性疾病、病毒性疾病或肿瘤药物中的应用，具有很好的临床应用价值。

Description

吡啶并嘧啶衍生物或其盐及其制法、药物组合物和用途

技术领域

本发明涉及Toll样受体激动剂(Toll-like receptors，TLRs)技术领域，特别涉及用作TLR7和/或TLR8激动剂的吡啶并嘧啶衍生物或其盐及其制法、药物组合物和用于制备治疗传染性疾病、呼吸系统疾病、免疫相关疾病、病毒病或肿瘤药物中的应用。

背景技术

Toll样受体是进化中比较保守的一个受体家族，至少包括13个成员，在人中发现10种(TLR1-10)，TLRI、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10表达于细胞表面，快速识别细菌代谢的产物，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9表达在细胞内，主要是对病毒核酸的监测和识别，TLR3识别双链RNA，而TLR7和TLR8识别单链RNA，TLR9识别未甲基化的CG辅酶Ⅰ，调节细菌DNA和某些病毒的反应。

TLRs能特异识别病原相关分子模式(PAMP)，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要的作用，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。其中，TLR7在识别结合病毒的单链RNA或人工合成的小分子嘌呤类化合物后，会招募特异接头蛋白，激活一系列信号级联反应，启动高水平的系统性适应性免疫应答，杀伤感染病毒的细胞，从而彻底清除病毒。临床上己经开始利用TLR7激动剂治疗慢性病毒性感染疾病，如乙型肝炎、丙型肝炎等。此外，TLR7激动剂作为流感疫苗佐剂能诱导更加迅速有效的免疫保护。在抗肿瘤方面，TLR7激动剂不仅可以直接刺激pDC分泌IFN-α，还会增强pDC的共刺激和抗原递呈能力，激活的pDC促进CD4+T细胞的增殖，进一步激活CD8+T细胞，杀伤肿瘤细胞，故而TLR7激动剂作为免疫佐剂在机体识别和杀伤肿瘤过程中的作用也在逐渐得到重视。

发明内容

本发明提供了吡啶并嘧啶衍生物或其盐，其可用作TLRs受体激动剂，具有选择性好、活性高、安全性好的特点，同时提供了吡啶并嘧啶衍生物或其盐的制备方法及其药物组合物和用途。

本发明所提供的吡啶并嘧啶衍生物或其盐，其结构式如式(I)所示：

其中，

L表示连接基团，其为不存在或为C₁-C₆亚烷基或C₁-C₆亚烯基，其中所述基团均可任选地被C₁-C₄烷基取代；

R₁表示

或卤素，其中R₃选自H、卤素、氨基亚甲基、(取代氨基)亚甲基或其季铵盐、杂环取代的亚甲基、叠氮亚甲基、膦酸基亚甲基、膦酸二乙酯基亚甲基、甲氧基酰基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、CF₃-、-COOH、-COOCH₃、-CN、HO-CH₂；

取代氨基可为二甲基氨基、Leu-氨基、Leu Ala Ala Asn-氨基、(三氟甲基)亚甲基氨基、甲基氨基；

季铵盐为季铵盐酸盐；

R₂表示-YR₄，其中Y表示N、S、O，R₄表示C₁-C₄烷基，-YR₄中的Y和R₄还可以形成杂环，杂环可为吗啉或哌啶；

杂环选自

卤素为氟、氯。

所述L为C₁-C₆亚烷基，优选为-CH₂-。

所述R₁为

所述R₂为-NR₄。

一种吡啶并嘧啶衍生物或其盐的化合物选自：

所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、羧酸盐。

本发明另一方面提供了式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中

步骤包括：

(1)以3-氨基-6-溴吡啶-2-甲酸甲酯和氯甲脒盐酸盐为起始原料，加入二甲基砜，制得化合物1，反应式为：

(2)取化合物1溶于醋酐中，得化合物2，反应式为：

(3)室温下，取化合物2溶于二氧六环中，加入DMF，然后滴加草酰氯，得化合物3，反应式为：

(4)将步骤(3)所得化合物3直接溶于干燥的四氢呋喃中，加入含氮有机化合物或含硫有机化合物或含氧有机化合物R₄YH，然后加入N,N-二异丙基乙胺，得化合物4，反应式为：

(5)取化合物4溶于甲醇中，加入LiOH·H₂O，制得化合物5，反应式为：

(6)在氮气保护下，取化合物5溶于干燥的四氢呋喃中，依次加入取代苄溴、锌粉和Ni(PPh₃)₂Cl₂，制得化合物6，反应式为：

所述含氮有机化合物为烷基胺、哌啶、烷氧基胺、吗啉，优选正丁胺；含硫有机化合物为烷基硫醇，优选正丁硫醇；含氧有机化合物为烷基醇，优选正丁醇。

所述取代苄溴优选3-甲基苄溴。

本发明另一方面提供了药物组合物，包括：式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

所述药学上可接受的辅料包括但不限于增甜剂、稀释剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、崩解剂、助悬剂、等渗剂、溶剂。

本发明的药物组合物可制备成片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂。

给予本发明的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的途径包括但不限于口服、直肠、透粘膜、局部、经皮、吸入、胃肠外、舌下、阴道内、鼻内、肌内、皮下、静脉内给药。给药剂量为0.1-0.2mg/kg，优选0.1mg/kg，每天1次。

进一步，所述组合物中激动剂的浓度为0.1-0.2mg/kg，优选激动剂的浓度为0.1mg/kg。

所述组合物还含有至少一种其他治疗剂，所述治疗剂选自化疗剂、免疫治疗剂、抗血管生成剂、细胞因子、激素、多核苷酸、抗体、免疫学活性片段。

所述优选的，抗体包括但不限于：

MDX-010(新泽西州麦得莱克斯公司(Medarex)，其是人源化抗CTLA-4抗体；

SYNAGIS(马里兰州医学免疫公司(MedImmune))，其是人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体；HERCEPTIN(曲妥珠单抗)(加利福尼亚州基因泰克公司)，其是人源化抗HER2单克隆抗体；人源化抗CD18F(ab’)2(基因泰克公司(Genentech))；CDP860，其是人源化抗CD18F(ab’)2(英国塞尔泰克公司(Celltech，UK))；PRO542，其是与CD4融合的抗HIVgp120抗体(普罗杰尼克公司/健赞转基因公司(Progenics/GenzymeTransgenics))；Ostavir，其是人抗乙型肝炎病毒抗体(蛋白设计实验室/诺华公司(ProteinDesignLab/Novartis))；

PROTOVIRTM，其是人源化抗CMVIgG1抗体(蛋白设计实验室/诺华公司)；MAK-195(SEGARD)，其是鼠抗TNF-αF(ab’)2(科诺尔制药公司/巴斯夫公司(KnollPharma/BASF))；

IC14，其是抗CD14抗体(ICOS制药公司(ICOSPharm))；人源化抗VEGFIgG1抗体(基因泰克公司)；OVAREXTM，其是鼠抗CA125抗体(阿塔雷公司(Altarex))；PANOREXTM，其是鼠抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(葛兰素威康/山陶克(GlaxoWellcome/Centocor))；

BEC2，其是鼠抗独特型(GD3表位)IgG抗体(免疫克隆系统公司(ImCloneSystem))；

IMC-C225，其是嵌合抗EGFRIgG抗体(免疫克隆系统公司)；维他辛(VITAXIN)TM，其是人源化抗αVβ3整联蛋白抗体(应用分子进化/医学免疫公司(AppliedMolecularEvolution/MedImmune))；坎帕斯(Campath)1H/LDP-03，其是人源化抗CD52IgG1抗体(刘克赛特公司(Leukosite))；SmartM195，其是人源化抗CD33IgG抗体(蛋白设计实验室(ProteinDesignLab)/嘉娜宝公司(Kanebo))；RITUXANTM(利妥昔单抗TM)，其是嵌合抗CD20IgG1抗体(IDEC制药(IDECPharm)/基因泰克，罗氏/杰题克(Zettyaku))；

LYMPHOCIDETM，其是人源化抗CD22IgG抗体(免疫医学公司(Immunomedics))；

SmartID10，其是人源化抗HLA抗体(蛋白设计实验室)；ONCOLYMTM(Lym-1)，其是放射性标记的鼠抗HLADR抗体(特尼克隆公司(Techniclone))；ABX-IL8，其是人抗IL8抗体(安根尼克斯(Abgenix))；抗CD11a，是人源化IgG1抗体(基因泰克/索马公司(Xoma))；ICM3，是人源化抗ICAM3抗体(ICOS制药公司)；IDEC-114，是灵长类化抗CD80抗体(IDEC制药公司/三菱公司(Mitsubishi))；ZEVALINTM，它是放射性标记的鼠抗-CD20抗体(IDEC/先灵公司(ScheringAG))；IDEC-131，是人源化抗CD40L抗体(IDEC/卫材公司(Eisai))；

IDEC-151，是灵长类化抗CD4抗体(IDEC)；IDEC-152，是灵长类化抗-CD23抗体(IDEC/SKK公司(Seikagaku))；SMART抗-CD3，是人源化抗CD3IgG(蛋白设计实验室)；5G1.1，是人源化抗补体因子5(C5)抗体(亚力兄制药公司(AlexionPharm))；D2E7，是人源化抗TNF-α抗体(CAT/巴斯夫公司)；CDP870，是人源化抗TNF-αFab片段(塞尔泰克公司)；IDEC-151，是灵长类化抗CD4IgG1抗体(IDEC制药公司/史克必成公司(SmithKlineBeecham))；

MDX-CD4，是人抗CD4IgG抗体(麦得莱克斯公司(Medarex)/卫材公司/基麦公司(Genmab))；CDP571，是人源化抗TNF-αIgG4抗体(赛尔泰克公司)；LDP-02，是人源化抗α4β7抗体(刘克赛特公司/基因泰克公司)；OrthoCloneOKT4A，是人源化抗CD4IgG抗体(奥多生物技术公司(OrthoBiotech))；ANTOVATM，是人源化抗CD40LIgG抗体(拜耳基因公司(Biogen))；ANTEGRENTM，是人源化抗VLA-4IgG抗体(伊兰公司(Elan))；MDX-33，是人抗CD64(FcγR)抗体(麦得莱克斯公司/贝林公司(Centeon))；SCH55700，是人源化抗IL-5IgG4抗体(赛尔泰克公司/先灵公司)；SB-240563和SB-240683，分别是人源化抗IL-5和抗IL-4抗体(史克必成公司(SmithKlineBeecham))；rhuMab-E25，是人源化抗IgEIgG1抗体(基因泰克公司/诺华公司(Norvartis)/谭诺生物系统公司(TanoxBiosystems))；ABX-CBL，是鼠抗CD-147IgM抗体(安根尼克斯公司(Abgenix))；BTI-322，是大鼠抗CD2IgG抗体(医学免疫公司/生物移植公司(BioTransplant))；奥多克隆/OKT3(Orthoclone/OKT3)，是鼠抗CD3IgG2a抗体(奥多生物科技公司(orthoBiotech))；SIMULECTTM，是嵌合抗CD25IgG1抗体(诺华制药)；

LDP-01，是人源化抗β2-整联蛋白IgG抗体(刘克赛特公司)；抗LFA-1，是鼠抗CD18F(ab′)2(PM公司(Pasteur-Merieux)/免疫技术公司(Immunotech))；CAT-152，是人抗TGF-β2抗体(剑桥抗体技术公司(CambridgeAbTech))；CorsevinM，是嵌合抗因子VII抗体(山陶克公司)；MDX-1106，是PD-1抗体(百时美施贵宝公司(bristol-myerssquibb))；

MDX-1105，是PDL1抗体(罗氏公司(Roche))。

上述抗体优选为PD-1抗体、TIM-3抗体、PD-1抗体和TIM-3抗体。

所述治疗剂可为抗癌剂，所述抗癌剂包括但不限于：阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、六甲蜜胺、安波霉素、乙酸阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、安曲霉素、门冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、比折来新、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡普睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎胍宁、甲磺酸地扎胍宁、地吖醌、多西他赛、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氮尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、白介素II(包括重组白介素II或rIL2)、干扰素α2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂、盐酸伊立替康、乙酸兰瑞肽、来曲唑、乙酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美登素、盐酸氮芥、乙酸基孕甾酮、乙酸美仑孕酮、苯丙氨酸氮芥、美诺立尔、巯嘌呤、氨甲喋呤、氨甲喋呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托卡星、丝裂红素、米托洁林、丝裂马菌素、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、霉酚酸、诺考达唑、诺拉霉素、奥马铂、奥昔舒仑、紫杉醇、培门冬酶、培利霉素、奈莫司汀、硫酸培洛霉素、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟菲尔钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌罗霉素、盐酸嘌罗霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、磷乙酰天冬氨酸钠、司帕霉素、盐酸锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、链黑霉素、链佐星、磺氯苯脲、他利霉素、替可加兰钠、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酪、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、塞替派、噻唑呋林、替拉扎明、柠檬酸托瑞米芬、乙酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、葡糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、乌拉莫司汀、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂、净司他丁、盐酸佐柔比星。能使用的其他抗癌剂包括但不限于：5-乙炔基尿嘧啶、阿比特龙、阿柔比星、酰基富烯、腺环戊醇(adecypenol)、阿多来新、阿地白介素、ALL-TK拮抗剂、六甲蜜胺、氨莫司汀、2,4二氯苯氧乙酸(amidox)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、穿心莲内酯、血管新生抑制剂、拮抗剂D、拮抗剂G、安雷利克斯、抗-背侧化形成蛋白1、抗雄激素，前列腺癌、抗雌激素、抗瘤酮(antineoplaston)、反义寡核苷酸、甘氨酸阿非迪霉素、凋亡基因调节剂、凋亡调节剂、脱嘌呤核酸、ara-CDP-DL-PTBA、精氨酸脱氨酶、苯胺丫啶(asulacrine)、阿他美坦、阿莫司汀、阿西他汀(axinastatin)1、阿西他汀2、阿西他汀3、阿扎司琼、阿扎毒素、重氮酪氨酸、浆果赤霉素III衍生物、巴拉醇(balanol)、巴马司他、BCR/ABL拮抗剂、苯并二氢卟酚(benzochlorin)、苯甲酰星孢素、β内酰胺衍生物、β-阿里辛(β-alethine)、亚阿克拉霉素(betaclamycin)B、桦木酸、bFGF抑制剂、比卡鲁胺、比生群、双氮丙啶精胺、双奈法德、比特迪尼(bistratene)A、比折来新、贝伏特(breflate)、溴匹立明、布度钛、丁基硫堇亚胺、卡泊三醇、卡弗他丁(calphostin)C、喜树碱衍生物、金丝雀痘IL2、卡培他滨、羧酰胺-氨基-三唑、羧基酰胺三唑、CaRestM3、CARN700、软骨衍生的抑制剂、卡折来新、酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)、澳粟精胺、杀菌肽B、西曲瑞克、绿素类(chlorlns)、氯代喹喔啉磺酰胺、西卡前列素、顺-卟啉、克拉屈滨、恩氯米芬类似物、克霉唑、克利霉素(collismycin)A、克利霉素B、考布他汀A4、考布他汀类似物、克纳宁(conagenin)、科莱贝司丁(crambescidin)816、克立那托、自念珠藻环肽(cryptophycin)8、自念珠藻环肽A衍生物、库拉索(curacin)A、环戊蒽醌(cyclopentanthraquinone)、环铂(cycloplatam)、塞培霉素(cypemycin)、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、细胞裂解因子、磷酸己烷雌酚(cytostatin)、达昔单抗、地西他滨、脱氢代代宁B、地洛瑞林、地塞米松、右异环磷酰胺、右雷佐生、右维拉帕米、地吖醌、代代宁B、3,4-二羟基苯并氧肟酸(didox)、二乙基正精胺、二氢5-氮杂胞苷、二氢紫杉醇，9-、二氧霉素(dioxamycin)、二苯基螺莫斯汀、多西他赛、二十二烷醇、多拉司琼、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、屈大麻酚、多卡霉素SA、依布硒、依考莫司汀、依地福新、依决洛单抗、依氟鸟氨酸、榄香烯、乙嘧替氟、表柔比星、依立雄胺、雌莫司汀类似物、雌激素激动剂、雌激素拮抗剂、依他硝唑、磷酸依托泊甙、依西美坦、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、非格司亭、非那雄胺、夫拉平度(flavopiridol)、氟卓斯汀、夫卢丝龙(fluasterone)、氟达拉滨、盐酸氟代柔红霉素(fluorodaunorunicin)、福酚美克、福美坦、福司曲星、福莫司汀、德卟啉钆(gadoliniumtexaphyrin)、硝酸镓、加洛他滨、加尼瑞克、明胶酶抑制剂、吉西他滨、谷胱甘肽抑制剂、赫舒反(hepsulfam)、调蛋白、环己基双乙酰胺、金丝桃蒽酮、伊班膦酸、黄胆素、艾多昔芬、伊决孟酮、伊莫福新、伊洛马司他、咪唑并吖啶酮、咪喹莫特、免疫刺激肽、胰岛素样生长因子1受体抑制剂、干扰素激动剂、干扰素、白介素、碘苄胍、碘阿霉素、4-甘薯苦醇、伊罗普拉、伊索拉定、异本格唑(isobengazole)、异高软海绵素(isohomohalicondrin)B、伊他司琼、结丝立得(jasplakinolide)、卡哈拉得(kahalalide)F、片螺素(lamellarin)-N三乙酸、兰瑞肽、雷纳霉素(leinamycin)、来格司亭、硫酸蘑菇多糖、莱托斯汀(leptolstatin)、来曲唑、白血病抑制因子、白细胞α干扰素、亮丙瑞林+雌激素+孕酮、亮丙瑞林、左旋咪唑、利阿唑、直链多胺类似物、亲脂性二糖肽、亲脂性铂化合物、利索纳得(lissoclinamide)7、洛铂、胍乙基磷酸丝氨酸、洛美曲索、氯尼达明、洛索蒽醌、洛伐他汀、洛索立宾、勒托替康、德卟啉镥(lutetiumtexaphyrin)、莱索菲林(lysofylline)、细胞裂解肽、美坦新、慢诺他汀(mannostatin)A、马立马司他、马索罗酚、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)、基质溶解因子抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、美诺立尔、硫巴妥苯胺、美替瑞林、甲硫氨酸酶、甲氧氯普胺、MIF抑制剂、米非司酮、米替福新、米立司亭、错配的双链RNA、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素类似物、米托萘胺、迈托毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂草毒蛋白、米托蒽醌、莫法罗汀、莫拉司亭、单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素、单磷酰基脂质A+分支杆菌细胞壁骨架、莫哌达醇、多药耐药基因抑制剂、基于多肿瘤抑制物1的治疗、芥类抗癌剂、印度洋海绵(mycaperoxide)B、分枝杆菌细胞壁提取物、米亚普龙(myriaporone)、N-乙酰基地那林、N-取代的苯甲酰胺、那法瑞林、那瑞替喷(nagrestip)、纳洛酮+镇痛新、纳帕英(napavin)、萘萜二醇(naphterpin)、那托司亭、奈达铂、奈莫柔比星、奈立膦酸、中性内肽酶、尼鲁米特、尼萨霉素(nisamycin)、氮氧化物调节剂、硝基氧抗氧化剂、尼多林(nitrullyn)、O6-苄基鸟嘌呤、奥曲肽、奥可斯酮(okicenone)、寡核苷酸、奥那司酮、昂丹司琼、昂丹司琼、奥莱辛(oracin)、口服细胞因子诱导物、奥马铂、奥沙特隆、奥沙利铂、氧杂奥诺霉素(oxaunomycin)、紫杉醇、紫杉醇类似物、紫杉醇衍生物、帕劳胺(palauamine)、棕榈酰根霉素、帕米磷酸、人参炔三醇、帕诺米芬、副菌铁素(parabactin)、帕折普汀、培门冬酶、培得星、戊聚硫钠、喷司他丁、喷托唑(pentrozole)、全氟溴烷、培磷酰胺、紫苏子醇、苯那霉素(phenazinomycin)、乙酸苯酯(phenylacetate)、磷酸酶抑制剂、皮西巴尼(picibanil)、盐酸匹鲁卡品、吡柔比星、吡曲克辛、胎盘素(placetin)A、胎盘素B、纤溶酶原激活物抑制剂、铂络合物、铂化合物、铂-三胺络合物、卟菲尔钠、泊非霉素、氯泼尼松、丙基双吖啶酮、前列腺素J2、蛋白酶体抑制剂、基于蛋白A的免疫调节剂、蛋白激酶C抑制剂、蛋白激酶C抑制剂，微藻(microalgal)、蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂、嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、红紫素、吡唑啉吖啶、吡哆醛化的血红蛋白聚氧乙烯偶联物、raf拮抗剂、雷替曲塞、雷莫司琼、ras法尼基蛋白转移酶抑制剂、ras抑制剂、ras-GAP抑制剂、去甲基化的瑞替普汀、依替膦酸铼Re186、根霉素、核酶、RII维甲酰胺(retinamide)、罗谷亚胺、罗希吐碱(rohitukine)、罗莫肽、罗喹美克、卢比格酮(rubiginone)B1、卢伯西(ruboxyl)、沙芬戈、伞托平(saintopin)、SarCNU、萨可菲醇(sarcophytol)A、沙格司亭、Sdi1模拟物、司莫司汀、衰老衍生的抑制剂1、有义寡核苷酸、信号转导抑制剂、信号转导调节剂、单链抗原结合蛋白、西佐喃、索布佐生、硼卡钠、苯基乙酸钠、索尔醇(solverol)、生长调节素结合蛋白、索纳明、膦门冬酸、斯卡霉素(spicamycin)D、螺莫司汀、脾脏五肽(splenopentin)、海绵他汀(spongistatin)1、角鲨胺、干细胞抑制剂、干细胞分裂抑制剂、斯提酰胺(stipiamide)、基质分解素抑制剂、斯菲诺辛(sulfinosine)、强效血管活性肠肽拮抗剂、素拉迪塔(suradista)、苏拉明、苦马豆碱、合成粘多糖、他莫司汀、他莫昔芬甲碘化物、牛磺莫司汀、他扎罗汀、替可加兰钠、替加氟、碲吡喃洋(tellurapyrylium)、端粒酶抑制剂、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)、四佐胺(tetrazomine)、泰立拉汀(thaliblastine)、噻可拉林、血小板生成素、血小板生成素模拟物、胸腺法新、胸腺生成素受体激动剂、胸腺曲南、促甲状腺激素、本紫红素乙酯锡、替拉扎明、二氯环戊二烯钛、拓扑森汀(topsentin)、托瑞米芬、全能干细胞因子、翻译抑制剂、维甲酸、三乙酰基尿苷、曲西立滨、三甲曲沙、曲普瑞林、托烷司琼、妥罗雄脲、酪氨酸激酶抑制剂、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)、UBC抑制剂、乌苯美司、泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子、脲激酶受体拮抗剂、伐普肽、瓦立奥林(variolin)B、载体系统，红细胞基因治疗、维拉雷琐、藜芦明、瓦尔丁(verdins)、维替泊芬、长春瑞滨、威科萨汀(vinxaltine)、维他辛(Vitaxin)、伏氯唑、扎诺特隆、折尼铂、亚苄维C和净司他丁斯酯。

一种提高机体正向免疫应答的方法，包括：向有需要的系统或个体给予治疗有效量的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、药物组合物，或上述药物组合物，或根据上述方法制备的化合物，从而调节TLR7和/或TLR8。

一种增强化疗效果的方法，包括向有需要的系统或个体给予治疗有效量的化疗药物，同时或随后给予治疗有效量的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、药物组合物，或上述的药物组合物，或根据上述方法制备的化合物。

一种提高免疫治疗的方法，包括：向有需要的系统或个体给予治疗有效量的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、药物组合物，或上述的药物组合物，或根据上述的方法制备的化合物，同时或随后将嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)输入系统或个体内。

本发明另一方面提供了一种治疗或预付哺乳动物疾病的方法，包括：向有需要的系统或个体给予治疗有效量的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、药物组合物。

本发明另一方面提供了治疗细胞增殖性病症的方法，包括：向有需要的系统或个体给予治疗有效量的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、药物组合物，其中细胞增殖性病症是淋巴瘤、骨肉瘤、黑素瘤，或乳腺、肾、前列腺、结肠直肠、甲状腺、卵巢、胰腺、神经元、肺、子宫或胃肠道的肿瘤。

本发明另一方面提供了式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐可用作TLRs受体激动剂，用于制备治疗与TLRs活性相关的疾病或病症药物中的应用。

优选的TLR为TLR7和/或TLR8。

式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐或药物组合物在制备药物制剂中的应用，所述药物制剂可以上调炎症和细胞因子介导的通路、T细胞激活、凋亡信号通路、B细胞激活通路等有利于肿瘤免疫治疗的基因数目。

进一步，药物制剂提高CD8+T细胞的数量。

进一步，药物制剂提高CD8+T细胞/Treg细胞的比值。

进一步，药物制剂通过提高PDL-1表达。

进一步，药物制剂提高白介素2的水平和/或提高干扰素γ的水平和/或降低白介素10水平。

式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐或药物组合物在制备下调Wnt信号通路制剂中的应用。优选的，下调β-catenin蛋白表达水平。

式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐或药物组合物制备影响巨噬细胞中各细胞因子分泌水平药物制剂中的应用，优选的，影响Il1b、Il6、Il12b、Tnf、Ifnb1、Cxcl1、Cxcl10和Il10等基因的mRNA水平的表达。

本发明另一方面提供了式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐或上述的药物组合物用于制备治疗传染性疾病、免疫性疾病、病毒病或肿瘤药物中的应用。

上述疾病优选哮喘、癌、HIV、HBV。

现有研究表明TLR与传染性疾病(Potent immune activation in chronichepatitis C patients upon administration of an oral inducer of endogenousinterferons that acts via Toll-like receptor.Antiviral Ther.,2012,17,4,P657-P667)、免疫性疾病(A new era of targeting the ancient gatekeepers of the immunesystem:toll-like agonists in the treatment of allergic rhinitis andasthma.Int.Arch.Allergy Immunol.,2014,164,1,P46-P63)、病毒病(.A nucleosideanalog,7-thia-8-oxoguanosine stimulates proliferation of thymocytes invitro.Immunol.Lett.,1999,69,3,P293-P300)、肿瘤(Vaccine adjuvant activity of3M-052:An imidazoquinoline designed for local activity without systemiccytokine induction.Vaccine,2011,29,33,P5434-P5442；Effective Innate andAdaptive Antimelanoma Immunity through Localized TLR7/8Activation，Immunol.,2014,193,9,P4722-P4731)密切相关，TLR7激动剂本发明提供的TLR7激动剂通过验证实验表明可用于治疗上述疾病。

上述免疫性疾病为自身免疫病，自身免疫病包括但不限于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病、斯耶格伦氏综合症、多肌炎、脉管炎、韦格纳肉芽肿、结节病、强直性脊柱炎、赖特综合征、牛皮癣性关节炎、贝赫切特综合征等。

上述病毒性疾病包括但不限于：埃博拉病毒病、炭疽菌病、尖锐湿疣、单纯疣、足底疣、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙型肝炎、丙型肝炎、登革热病毒、单纯疱疹病毒(例如HSV-I、HSV-II、CMV或VZV)、触染性软疣、牛痘、天花、慢病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、鼻病毒、肠病毒、腺病毒、流感、副流感、腮腺炎病毒、麻疹病毒、乳多泡病毒、黄病毒、逆转录病毒、沙粒病毒(例如LCM、胡宁病毒、马丘坡病毒、瓜纳瑞托病毒和拉沙热)和纤丝病毒(例如埃博拉病毒或马尔堡病毒)。

上述肿瘤包括但不限于：人肉瘤和癌，如纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，如急性淋巴细胞性白血病和急性成髓细胞性白血病(成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞和红细胞白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。

优选的，肿瘤为结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、脑膜瘤、肺癌、或胰腺癌。

现有研究表明TLR与肠癌(Toll-like receptor(TLR)7and TLR8expression onCD133+cells in colorectal cancer points to a specific role for inflammation-induced TLRs in tumourigenesis and tumour progression[J].European Journal ofCancer,2010,46(15):2849-2857)、膀胱癌(Intravesical Toll-like receptor 7agonistR-837:Optimization of its formulation in an orthotopic mouse model of bladdercancer[J].International journal of urology,2010,17(5):483-490)、黑色素瘤(Effective Innate and Adaptive Antimelanoma Immunity through Localized TLR7/8Activation.J.Immunol.,2014,193,9,P4722-P4731)、脑膜瘤(Vaccination forinvasive canine meningioma induces in situ production of antibodies capableof antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity[J].Cancer research,2013,73(10):2987-2997.)、肺癌(Toll-like receptor agonists in cancer therapy.Immunotherapy.2009November 1；1(6):949–964.)、或胰腺癌(Toll-like receptor 7regulatespancreatic carcinogenesis in mice and humans.J Clin Invest.2012；122:4118–4129.[PubMed:23023703])。

进一步，肿瘤药物延长肿瘤患者生存期。

式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐或药物组合物在制备预防肿瘤复发药物中的应用。药物组合物可引起持久的全身性免疫记忆从而预防复发。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)采用本发明式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐制得的药物组合物用于预防癌症的复发、抑制癌症的转移、抑制癌症或癌症转移的生长和/或扩散、延长预后时间。

(2)免疫系统针对癌细胞产生强大的肿瘤特异性免疫是免疫治疗的根本。Toll样受体(TLR)是免疫系统的基本组成成分。由于TLR激动剂强大的刺激先天免疫和适应性免疫的能力，作为单剂即可有效地消灭肿瘤。

(3)此外，和PD-1、Tim-3抗体联合能有效增强彼此抑瘤效果。联合用药组从全身的免疫状态上提高机体的免疫应答水平，促进免疫系统对肿瘤的杀伤。

相关定义：

“药学上可接受”指生物学或其它方面没有不良影响的材料，例如所述材料可以整合到给予患者的药物组合物中，而不引起任何不良的生物学作用或不与包含其的所述组合物中任何其它成分以有害方式发生相互作用。当术语“药学上可接受”用于指药物运载体或赋形剂时，其表示所述运载体或赋形剂符合毒理学和生产测试的所需标准或其包含于美国食品药品管理局制定的非活性成分指南。

本文所用的术语“组合”或“药物组合”是指通过混合或联合多于1种活性成分而得到并且包括活性成分的固定和不固定的组合的产品。

术语“TLR疾病”或“与TLR活性相关的疾病或病症”是指与toll样受体相关的任何疾病状态。

附图说明

图1是根据本发明的激动剂D018的EC50测定图。

图2是根据本发明的肿瘤体积的生长曲线图。

图3是根据本发明的第34天肿瘤各组小鼠肿瘤体积图。

图4是根据本发明的肿瘤组织内浸润性淋巴细胞检测图。

图5是根据本发明的各实验组CD 8+T淋巴细胞数量统计图。

图6是根据本发明的各实验组CD 8+T/Treg比值统计图。

图7是根据本发明的各实验组中PDL-1表达情况图。

图8是根据本发明的各实验组小鼠血清中细胞因子的分泌影响图。

图9是根据本发明的激动剂D018对巨噬细胞中细胞因子的分泌影响图。

图10是根据本发明的RT-PCR验证候选基因表达水平图。

图11是根据本发明的IHC检测CCl₄和β-catenin表达图。

图12是根据本发明的不同实验组肿瘤小鼠生存期统计图。

图13是根据本发明的联合用药对免疫记忆的影响图。

图14是根据本发明的激动剂D018与抗体PD-1和TIM3联用肿瘤体积的生长曲线图。

图15是本发明的激动剂D018抑瘤实验图。

图16是流式检测肿瘤浸润淋巴细胞的结果图。

图17是流式检测肿瘤浸润CD103+DC细胞结果图。

图18是流式检测Tcm细胞结果图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

制备实施例：

本发明采用的起始原料和试剂均来自市售，供应商包括但不限于：AldrichChemical Company、Lancaster Synthesis Ltd。其中，二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二氧六环均是购自于百灵威公司的超干溶剂，并储存于手套箱中，二氯甲烷和丙酮分别取自溶剂纯化系统，所有用于对水敏感的反应的玻璃仪器都先在100℃的烘箱中烘干。除特别注明外，未经进一步处理所用原料和试剂直接使用。

1H NMR和13C NMR图谱是使用Bruker DRX 400型核磁共振仪测定而得，化学位移用ppm表示。使用四甲基硅烷内标准(0.00ppm)，CDCl₃或者DMSO-d6作溶剂(或其他溶剂)。1HNMR的表示方法：s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝加宽的，dd＝双重峰的双重峰，dt＝三重峰的双重峰。若提供偶合常数时，其单位为Hz。质谱用Finnigan Advantage型质谱仪测定，离子化方式为ESI。化合物通过柱层析纯化(硅胶GF254:200-400目)。化合物纯度如无特别注明，使用HPLC测定，均指分离产率。

实施例1

化合物3的制备方法，步骤包括：

(1)于250mL密封管中加入3-氨基-6-溴嘧啶甲酸甲酯(6.2g，27mmol)，氯甲脒盐酸盐(3.4g，30mmol)和二甲基砜(50.8g，20mmol)，加热至140oC搅拌6小时后冷却至室温，往反应液中加入50mL水，超声30min后过滤，滤渣经水、丙酮洗涤，真空干燥得棕褐色固体1(yield＝65％)，反应式为：

(2)取化合物1溶于醋酐(25mL)中，加热至140℃回流8h后冷却至室温，减压浓缩得粗产物，经柱层析得白色固体2(化合物2)，反应式为：

(3)取化合物2(1193mg，5.0mmol)溶于25mL超干的二氧六环中，加入DMF(35mL)，反应液冰浴至0℃后缓慢滴加草酰氯(514ul，6.0mmol)，将反应液升温至室温搅拌2小时，减压浓缩得化合物3，反应式为：

实施例2

化合物N21的制备方法，步骤包括：

(1)将实施例1所得的化合物3直接溶于干燥的四氢呋喃(5mL)中，依次加入正丁胺(731uL，7.5mmol，1.5equiv.)和N,N-二异丙基乙胺(1.6mL，10.0mmol，2.0equiv)，反应液室温搅拌5小时后减压浓缩，柱层析纯化得化合物7，反应式为：

(2)取化合物7(882mg，3mmol)溶于甲醇(80mL)中，加入LiOH·H₂O(189mg，4.5mmol)后室温搅拌8小时，减压浓缩，柱层析得棕色固体8，反应式为：

(3)在氮气保护下，于25mL密封管中，取化合物8(125.9mg，0.5mmol)溶于5mL干燥四氢呋喃中，依次加入3-甲基苄溴(141mg，0.75mmol)，锌粉(98.1mg，1.5mmol)和Ni(PPh3)2Cl2(138.8mg，0.05mmol)，室温搅拌24小时，减压浓缩，硅胶柱层析得淡黄色粉末N21，反应式为：

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.57(d,J＝8.6Hz,1H),7.28(d,J＝8.8Hz,1H),7.19(t,J＝7.4Hz,1H),7.10(s,1H),7.04(m,3H),5.20(s,2H),4.14(s,2H),3.57(dd,J＝13.1,6.6Hz,2H),2.32(s,3H),1.70(dt,J＝14.6,7.2Hz,2H),1.46(dd,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.40(s),160.27(s),154.88(s),144.34(s),139.38(s),138.30(s),132.85(s),129.92(s),128.57(s),128.06(s),127.97(s),127.30(s),126.20(s),44.35(s),40.34(s),31.58(s),21.50(s),20.31(s),13.97(s).MScalculated for([M],C19H23N5)+:321.2,found:322.2。

实施例3

化合物N23和化合物N25的制备方法，步骤包括：

以将实施例2制得的化合物8为原料，在氮气保护下，于25mL密封管中，取化合物8(125.9mg，0.5mmol)溶于5mL干燥四氢呋喃中，依次加入2-甲氧基溴苄(150.8mg，0.75mmol)，锌粉(98.1mg，1.5mmol)和Ni(PPh3)2Cl2(138.8mg，0.05mmol)，室温搅拌24小时，减压浓缩，硅胶柱层析得淡黄色粉末N23，反应式为：

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(d,J＝8.6Hz,1H),7.29(d,J＝8.6Hz,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),7.13(m,2H),6.89(m,2H),5.32(s,2H),4.18(s,2H),3.80(s,3H),3.55(dd,J＝13.1,6.7Hz,2H),168(m,2H),1.44(dd,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.97(t,J＝7.3Hz,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ160.35(s),159.83(s),157.43(s),155.26(s),143.43(s),132.12(s),130.80(s),128.00(s),127.82(s),120.67(s),110.61(s),55.45(s),40.34(s),38.46(s),31.51(s),20.27(s),13.94(s).MS(EI)calculated for([M],C19H23N5O)+:337.2,found:338.2。

以将实施例2制得的化合物8为原料，在氮气保护下，于25mL密封管中，取化合物8(125.9mg，0.5mmol)溶于5mL干燥四氢呋喃中，依次加入4-甲氧基溴苄(150.8mg，0.75mmol)，锌粉(98.1mg，1.5mmol)和Ni(PPh3)2Cl2(138.8mg，0.05mmol)，室温搅拌24小时，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物N25，反应式为：

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.65(d,J＝8.5Hz,1H),7.25(d,J＝8.6Hz,2H),7.18(m,4H),5.89(s,2H),4.19(s,2H),3.57(d,J＝6.4Hz,2H),2.26(s,3H),1.69(m,2H),1.51–1.36(m,2H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.23(s),158.65(s),155.69(s),140.47(s),137.20(s),136.80(s),130.71(s),130.59(s),130.07(s),128.19(s),127.35(s),127.08(s),126.32(s),42.02(s),40.58(s),31.35(s),20.22(s),19.89(s),13.90(s).MS(EI)calculated for([M],C19H23N5O)+:337.2,found:338.2。

实施例4

化合物N26的制备方法，步骤包括：

以将实施例2制得的化合物8为原料，在氮气保护下，于25mL密封管中，取化合物8(125.9mg，0.5mmol)溶于5mL干燥四氢呋喃中，依次加入2–三氟甲基溴苄(0.75mmol)，锌粉(98.1mg，1.5mmol)和Ni(PPh3)2Cl2(138.8mg，0.05mmol)，室温搅拌24小时，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物N26，反应式为：

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(d,J＝7.6Hz,1H),7.62(d,J＝8.5Hz,1H),7.45(t,J＝7.4Hz,1H),7.34(t,J＝7.4Hz,1H),7.26(m,2H),7.09(s,1H),5.47(s,2H),4.38(s,2H),3.65–3.47(m,2H),1.66(dd,J＝14.3,7.1Hz,2H),1.43(dd,J＝14.8,7.4Hz,2H),1.03–0.88(m,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.27(s),159.84(s),153.83(s),143.17(s),137.63(s),132.26(s),132.04(s),131.87(s),128.89(q,J＝29.5Hz),128.03(s),127.90(s),126.74(s),126.14(q,J＝5.8Hz),124.60(q,J＝273.8Hz),40.35(d,J＝5.4Hz),31.39(s),20.20(s),13.89(s).MS(EI)calculated for([M],C19H20F3N5)+:375.2,found:376.2。

实施例5

化合物N32的制备方法，步骤包括：

以将实施例2制得的化合物8为原料，在氮气保护下，于25mL密封管中，取化合物8(125.9mg，0.5mmol)溶于5mL干燥四氢呋喃中，依次加入4–溴苄苯甲酸甲酯(0.75mmol)，锌粉(98.1mg，1.5mmol)和Ni(PPh3)2Cl2(138.8mg，0.05mmol)，室温搅拌24小时，减压浓缩，硅胶柱层析得得化合物N32，反应式为：

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99(d,J＝8.3Hz,2H),7.59(d,J＝8.6Hz,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,2H),7.28(d,J＝8.6Hz,1H),7.03(s,1H),5.01(s,1H),4.23(s,2H),3.91(s,3H),3.57(dd,J＝13.1,7.0Hz,2H),1.76–1.65(m,2H),1.46(dd,J＝15.0,7.4Hz,2H),1.00(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ167.05(s),160.53(s),160.36(s),153.53(s),144.95(s),144.86(s),133.36(s),129.98(s),129.20(s),128.53(s),128.36(s),127.82(s),52.14(s),44.30(s),40.32(s),31.57(s),20.30(s),13.95(s).MS(EI)calculated for([M],C20H23N5O2)+:365.2,found:366.2.MS(EI)calculated for([M],C20H23N5O2)+:365.2,found:366.2.

实施例6

化合物N33的制备方法，步骤包括：

以将实施例2制得的化合物8为原料，在氮气保护下，于25mL密封管中，取化合物8(125.9mg，0.5mmol)溶于5mL干燥四氢呋喃中，依次加入3–溴苄苯甲酸甲酯(0.75mmol)，锌粉(98.1mg，1.5mmol)和Ni(PPh3)2Cl2(138.8mg，0.05mmol)，室温搅拌24小时，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物N33，反应式为

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.96(s,1H),7.90(d,J＝7.6Hz,1H),7.56(d,J＝8.6Hz,1H),7.43(d,J＝7.6Hz,1H),7.36(t,J＝7.6Hz,1H),7.26((d,J＝8.6Hz,1H,7.02(s,1H),5.02(s,2H),4.21(s,2H),3.89(s,3H),3.55(dd,J＝13.3,6.8Hz,2H),1.73–1.57(m,2H),1.44(dd,J＝15.0,7.4Hz,2H),0.97(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.13(s),160.46(s),160.37(s),153.86(s),144.81(s),139.85(s),133.77(s),133.26(s),130.55(s),130.35(s),128.71(s),128.30(s),127.85(s),127.79(s),52.23(s),44.08(s),40.32(s),31.56(s),20.30(s),13.97(s).MS(EI)calculated for([M],C₂₀H₂₃N₅O₂)⁺:365.2,found:366.2.

实施例7

化合物N29的制备方法，步骤包括：

以将实施例2制得的化合物8为原料在氮气保护下，于25mL密封管中，取化合物8(125.9mg，0.5mmol)溶于5mL干燥四氢呋喃中，依次加入3–溴苄苯甲酸(0.75mmol)，锌粉(98.1mg，1.5mmol)和Ni(PPh3)2Cl2(138.8mg，0.05mmol)，室温搅拌24小时，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物N29，反应式为：

¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.97(s,1H),7.87(d,J＝7.7Hz,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,1H),7.64(d,J＝8.6Hz,1H),7.56(d,J＝7.5Hz,1H),7.40(t,J＝7.7Hz,1H),4.93(s,2H),4.31(s,2H),3.68(t,J＝7.2Hz,2H),1.71(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H),1.43(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ169.54(s),161.18(s),159.16(s),156.05(s),140.41(s),134.50(s),134.38(s),132.27(s),131.05(s),130.53(s),129.67(s),128.87(s),127.46(s),126.73(s),44.22(s),41.79(s),31.78(s),20.94(s),13.93(s).MS(EI)calculated for([M],C₁₉H₂₁N₅O₂)⁺:351.2,found:352.2。

实施例8

化合物N10的制备方法，步骤包括：

(1)取氢化锂铝(75.9mg，2.0mmol)置于细颈瓶中，在冰浴条件下加入干燥的四氢呋喃(2mL)，实施例7制得的化合物N29(182.7mg，0.5mmol)制备成四氢呋喃溶液，在冰浴条件下，缓慢滴加入氢化锂铝的四氢呋喃溶液中；反应结束后，加入76微升水，76微10％的氢氧化钠水溶液，3x76微升水淬灭反应，过滤，DCM洗涤滤渣，无水硫酸钠干燥，浓缩滤液的淡黄色固体9，反应式为：

(2)取化合物9溶于干燥DCM中，冰浴条件下滴加氯化亚砜(182uL，2.5mmol)，升温至室温搅拌60分钟，真空旋蒸的黄色油状物10，反应式为：

(3)化合物10溶于5mL干燥的四氢呋喃中，加入四氢吡咯(207uL，2.5mmol)和碳酸钾(207mg，1.5mmol)，反应液室温搅拌12小时后，浓缩，用DCM/H2O萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析得淡黄色固体化合物N10，反应式为：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝8.5Hz,1H),7.26(d,J＝8.0Hz,3H),7.19(d,J＝7.4Hz,2H),7.07(s,1H),5.09(s,2H),4.15(s,2H),3.56m,4H),2.49(s,4H),1.77(s,4H),1.73–1.59(m,3H),1.46(dd,J＝14.5,7.2Hz,2H),0.98(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.42(s),160.38(s),154.70(s),144.76(s),138.00(s),137.71(s),133.09(s),129.19(s),128.96(s),128.14(s),127.84(s),60.47(s),54.25(s),44.07(s),40.29(s),31.58(s),23.52(s),20.29(s),13.95(s).MS(EI)calculated for([M],C₂₃H₃₀N₆)⁺:390.3,found:391.3。

实施例9

化合物N01的制备方法，步骤包括：

以实施例8制得的化合物N10为原料，溶于5mL干燥的四氢呋喃中，加入二甲基胺盐酸盐(2.5mmol)和碳酸钾(207mg，1.5mmol)，反应液室温搅拌12小时后，浓缩，用DCM/H2O萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析得化合物N01，反应式为：

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.61(d,J＝8.6Hz,1H),7.30(d,J＝8.6Hz,1H),7.26(d,J＝8.5Hz,2H),7.20(d,J＝7.9Hz,2H),7.17(s,1H),5.31(s,2H),4.17(s,2H),3.57(q,J＝6.8Hz,2H),3.44(s,2H),2.26(s,6H),1.70(m,J＝7.4Hz,2H),1.47(m,J＝7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ160.37(s),159.71(s),155.22(s),143.13(s),138.29(s),136.62(s),132.24(s),129.61(s),129.11(s),128.17(s),127.86(s),63.97(s),45.27(s),44.08(s),40.46(s),31.53(s),20.31(s),13.96(s).MS(EI)calculated for([M],C₂₁H₂₈N₆)⁺:364.2,found:365.2。

实施例10

化合物N02的制备方法，步骤包括：

配置4M的盐酸二氧六环溶液1ml，加入实施例9制得的化合物N01(72.9mg，0.2mmol)，搅拌，析出白色固体，过滤，重结晶得白色晶体化合物N02，反应式为：

¹H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.56(d,J＝8.6Hz,1H),7.54–7.48(m,4H),7.45(d,J＝8.7Hz,1H),4.53(s,2H),4.27(s,2H),3.58(t,J＝7.2Hz,2H),3.11(s,9H),1.70(p,J＝7.4Hz,2H),1.47(dt,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ161.95(s),161.57(s),155.45(s),145.17(s),144.24(s),134.23(s),132.93(s),130.92(s),129.25(s),129.03(s),127.17(s),70.25(s),53.11(s),53.07(s),53.03(s),44.61(s),41.21(s),32.47(s),21.21(s),14.22(s).MS(EI)calculated for([M]⁺,C₂₂H₃₁N₆)⁺:379.3,found:379.3。

实施例11

化合物N12的制备方法，步骤包括：

在氮气保护下，取叠氮化钠(39.0mg，0.6mmol)溶于DMSO(1mL)，加入将实施例8制得的化合物10(177.9mg，0.5mmol)，反应液室温搅拌10小时，缓慢加入1mL水淬灭反应，待反应液冷却至室温，将反应液倒入1mL水中，乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得化合物N12，反应式为：

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.52(d,J＝8.6Hz,1H),7.21(d,J＝10.6Hz,5H),7.01(t,J＝5.7Hz,1H),5.00(s,2H),4.25(s,2H),4.12(s,2H),3.50(td,J＝7.2,5.8Hz,2H),1.70–1.59(m,2H),1.47–1.33(m,2H),0.93(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ160.36(s),160.26(s),154.37(s),144.41(s),139.68(s),133.66(s),133.02(s),129.62(s),128.61(s),128.16(s),127.93(s),54.63(s),44.03(s),40.36(s),31.56(s),20.31(s),13.98(s).MS(EI)calculated for([M]⁺,C₁₉H₂₂N₈)⁺:362.2,found:363.2。

实施例12

化合物N14的制备方法，步骤包括：

在手套箱中，取25ml烧瓶加入ZnI₂(191.5mg，0.6mmol)和HF(5mL)，得到白色液体，其中还有一些不溶的固体；向烧瓶中加入三乙基膦(129uL，0.75mmol)和实施例8化合物9(168.7mg，0.5mmol)；反应混合物加热回流16h后，冷却反应液至室温，真空中浓缩；所得残渣加入乙酸乙酯(2x50mL)和2NNaOH(2x10mL)洗过以后，合并有机相并用MgSO₄干燥，真空中蒸干溶剂，硅胶柱色谱纯化后得到淡黄色固体，即化合物N14，反应式为：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.57(d,J＝8.5Hz,1H),7.24(m,5H),7.09(s,1H),5.05(s,2H),4.15(s,2H),4.09–3.94(m,4H),3.57(dd,J＝13.0,6.5Hz,2H),1.79–1.60(m,2H),1.47(dd,J＝14.6,7.2Hz,2H),1.24(t,J＝7.0Hz,6H),1.00(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.27(s),160.14(s),154.56(s),144.33(s),138.02(s),138.00–137.96(m),132.86(s),130.00(s),129.94(s),129.21(s),129.18(s),128.01(s),127.79(s),62.06(d,J＝6.7Hz),43.90(s),40.24(s),34.03(s),32.66(s),31.47(s),20.19(s),16.38(s),16.32(s),13.85(s).MS(EI)calculated for([M],C₂₃H₃₂N₅O₃P)⁺:457.2,found:458.2。

实施例13

化合物N35的制备方法，步骤包括：

(1)在烘干的100ml圆底烧瓶中，将化合物3(128.5mg，0.5mmol)溶解到无水THF(5ml)中，再分别滴加2-甲氧基乙胺(130uL，1.5mmol)和DIEA(174uL，1.0mmol)到烧瓶中，搅拌5h，真空浓缩，粗产物经过硅胶柱色谱层析纯化得到化合物11，反应式：

(2)化合物11在甲醇(0.1M)中与LiOH·H₂O(31.5mg，0.75mmol)室温下搅拌8h，硅胶柱色谱层析纯化后得到化合物12，反应式为：

(3)取25ml封管，在手套箱中装入化合物12(76.1mg，0.3mmol)、溴甲苯(54uL，0.45mmol)、锌粉(58.9mg，0.9mmol)、Ni(PPh₃)2Cl₂(19.6mg，0.03mmol)和THF(3mL，0.1M)，无特别顺序要求；反应在室温下搅拌24h，硅胶柱色谱纯化得到产物浅黄色固体N35，反应式为：

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.60(d,J＝8.6Hz,1H),7.54(s,1H),7.34–7.26(m,3H),7.26–7.18(m,3H),5.68(s,2H),4.17(s,2H),3.78(dd,J＝10.5,5.2Hz,2H),3.64(t,J＝5.1Hz,2H),3.42(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.39(s),159.09(s),155.68(s),142.23(s),139.14(s),131.52(s),129.15(s),128.71(s),128.39(s),127.56(s),126.62(s),70.86(s),59.02(s),44.34(s),40.44(s).MS(EI)calculated for([M],C₁₇H₁₉N₅O)+:309.2,found:310.2。

实施例14

化合物N37的制备方法，步骤包括：

(1)在烘干的25ml圆底烧瓶中，将化合物3(128.5mg，0.5mmol)溶解到无水THF(5ml)中，再分别滴加哌啶(149uL，1.5mmol)和DIEA(174uL，1.0mmol)到烧瓶中，搅拌5h，真空浓缩；所得粗产物通过硅胶柱色谱层析纯化得到化合物13，反应式为：

(2)化合物13在甲醇(0.1M)中与LiOH.H2O(31.5mg，0.75mmol)室温下搅拌8h；硅胶柱色谱层析纯化后得到化合物14，反应式为：

(3)取25ml封管，在手套箱中装入化合物14(79.1mg，0.3mmol)、溴甲苯(54uL，0.45mmol)、锌粉(58.9mg，0.9mmol)、Ni(PPh₃)2Cl₂(19.6mg，0.03mmol)和THF(3mL，0.1M)，无特别顺序要求；反应在室温下搅拌24h，硅胶柱色谱纯化得到产物浅黄色固体N37，反应式为：

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.59(d,J＝8.6Hz,1H),7.33–7.17(m,6H),4.80(s,2H),4.21(s,4H),4.15(s,2H),1.69(dd,J＝6.3,3.1Hz,2H),1.64(d,J＝4.8Hz,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.27(s),159.49(s),153.14(s),148.01(s),139.76(s),133.73(s),130.59(s),129.37(s),128.59(s),126.80(s),126.37(s),49.01(s),44.68(s),26.49(s),25.09(s).MS(EI)calculated for([M],C₁₉H₂₁N₅)⁺:319.2,found:320.2.

实施例15

化合物N16的制备方法，步骤包括：

取25ml封管，在手套箱中装入化合物5(125.9mg，0.5mmol)、溴甲苯((89uL，0.75mmol)、锌粉(98.1mg，1.5mmol)、Ni(PPh₃)2Cl₂(32.7mg，0.05mmol)和THF(5mL，0.1M)，无特别顺序要求；反应在室温下搅拌24h，硅胶柱色谱纯化得到产物浅黄色固体，反应式为：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(d,J＝8.6Hz,1H),7.36–7.16(m,6H),7.06(s,1H),5.02(s,2H),4.17(s,2H),3.56(dd,J＝13.2,6.7Hz,2H),1.80–1.58(m,2H),1.46(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.45(s),160.42(s),154.63(s),144.82(s),139.53(s),133.19(s),129.18(s),128.68(s),128.21(s),127.89(s),126.54(s),44.41(s),40.32(s),31.60(s),20.31(s),13.98(s).MS(EI)calculatedfor([M],C₁₈H₂₁N₅)⁺:307.2,found:308.2。

实施例16

化合物N40的制备方法，步骤包括：取25ml封管，在手套箱中装入化合物5(125.9mg，0.5mmol)、(1-溴乙基)苯(102mg，0.75mmol)、锌粉(98.1mg，1.5mmol)、Ni(PPh₃)2Cl₂(32.7mg，0.05mmol)和THF(5mL，0.1M)，无特别顺序要求；反应在室温下搅拌24h，硅胶柱色谱纯化得到产物浅黄色固体N40，反应式为：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54(d,J＝8.6Hz,1H),7.28(dd,J＝17.3,8.1Hz,5H),7.20(t,J＝6.7Hz,1H),7.08(s,1H),5.01(s,2H),4.31(d,J＝7.1Hz,1H),3.57(dd,J＝13.2,6.9Hz,2H),1.79–1.61(m,5H),1.47(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.00(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.50(s),160.45(s),158.50(s),145.13(s),144.78(s),133.04(s),128.59(s),127.82(s),127.33(s),126.50(s),47.04(s),40.32(s),31.64(s),20.88(s),20.33(s),14.00(s).MS(EI)calculated for([M],C₁₉H₂₃N₅)⁺:321.2,found:322.2。

实施例17

化合物N42的制备方法，步骤包括：

(1)向化合物4(50mg，0.171mmol)的二氧六环(2.44ml)和水(0.86ml)的悬浊液中加入E-苯基乙烯基硼酸(27.8mg，0.188mmol，1.1eq)，Pd(PPh₃)₄(9.88mg，0.0086mmol，0.05equiv)和K₂CO₃(70.9mg，0.513mmol，3.0equiv)；反应混合物在氩气保护下120℃反应24h。反应混合物用EA稀释，再分别用水和饱和盐水洗并用Na₂SO₄干燥后，真空中浓缩有机相；浓缩后的残留物用4％methanol/DCM做流动相，色谱柱纯化得到化合物1550mg(92％)，反应式为：

(2)化合物15(45mg，0.14mmol)的乙醇(0.28ml)悬浊液中加入Pd/活性炭(4.2mg，5％)，将混合物在氢气中60℃中加热；过滤后蒸发浓缩得到淡黄色固体N42，反应式为：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(d,J＝8.5Hz,1H),7.31–7.22(m,3H),7.20(d,J＝6.7Hz,3H),7.05(s,1H),5.08(s,2H),3.56(dd,J＝13.3,6.9Hz,2H),3.23–2.99(m,4H),1.77–1.63(m,2H),1.46(dd,J＝15.0,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.37(s),160.17(s),144.33(s),141.61(s),132.61(s),128.56(s),128.47(s),128.19(s),127.87(s),126.08(s),40.35(s),39.53(s),35.76(s),31.62(s),20.33(s),13.99(s).MS(EI)calculated for([M],C₁₉H₂₃N₅)⁺:321.2,found:322.2。

实施例18

化合物S01的制备方法，步骤包括：

(1)在烘干的25ml圆底烧瓶中，将化合物3(128.5mg，0.5mmol)溶解到无水THF(5ml)中，再分别滴加正丁硫醇(161uL，1.5mmol)和DIEA(174uL，1.0mmol)到烧瓶中，搅拌5h，真空浓缩；所得粗产物通过硅胶柱色谱层析纯化得到化合物16，反应式为：

(2)化合物9在甲醇(0.1M)中与LiOH·H₂O(31.5mg，0.75mmol)室温下搅拌8h；硅胶柱色谱层析纯化后得到化合物17，反应式为：

(3)取25ml封管，在手套箱中装入化合物17(80.6mg，0.3mmol)，溴甲苯(54uL，0.45mmol)，锌粉(58.9mg，0.9mmol)，Ni(PPh3)2Cl2(19.6mg，0.03mmol)和THF(3mL，0.1M)，无特别顺序要求；反应在室温下搅拌24h，硅胶柱色谱纯化得到产物浅黄色固体，LOLXB059，反应式为：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.65(d,J＝8.7Hz,1H),7.44–7.16(m,6H),5.21(d,J＝11.9Hz,2H),4.27(s,2H),3.23(t,J＝7.3Hz,2H),1.77(dd,J＝14.8,7.5Hz,2H),1.54(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ175.42(s),158.60(s),157.10(s),144.23(s),139.11(s),135.10(s),133.92(s),129.38(s),128.90(s),128.78(s),126.67(s),44.79(s),30.99(s),28.89(s),22.34(s),13.86(s).MS(EI)calculated for([M],C₁₈H₂₀N₄S)⁺:324.2,found:325.2。

实施例19

化合物O01的制备方法，步骤包括：

(1)在烘干的100ml圆底烧瓶中，将化合物3(128.5mg，0.5mmol)溶解到无水正丁醇中，向烧瓶中缓慢地加入NaH(24.1mg，1.0mmol)；所得反应混合物搅拌5h后在真空中浓缩；粗产物经过硅胶柱色谱层析纯化得到化合物18，反应式为：

(2)化合物18在甲醇(0.1M)中与LiOH.H2O(31.5mg，0.75mmol)室温下搅拌8h；硅胶柱色谱层析纯化后得到化合物19，反应式为：

(3)取一25ml封管，在手套箱中装入化合物19(75.6mg，0.3mmol)、溴甲苯(54uL，0.45mmol)、锌粉(58.9mg，0.9mmol)、Ni(PPh₃)2Cl₂(19.6mg，0.03mmol)和THF(3mL，0.1M)，无特别顺序要求；反应在室温下搅拌24h，硅胶柱色谱纯化得到产物浅黄色固体O01，反应式为：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.65(d,J＝8.7Hz,1H),7.44–7.16(m,6H),5.21(d,J＝11.9Hz,2H),4.27(s,2H),3.23(t,J＝7.3Hz,2H),1.77(dd,J＝14.8,7.5Hz,2H),1.54(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ175.42(s),158.60(s),157.10(s),144.23(s),139.11(s),135.10(s),133.92(s),129.38(s),128.90(s),128.78(s),126.67(s),44.79(s),30.99(s),28.89(s),22.34(s),13.86(s).MS(EI)calculated for([M],C₁₈H₂₀N₄S)⁺:307.2,found:308.2。

实验实施例：

一、激动剂的EC50测定

试剂：HEK-Blue^TM hTLR7、HEK-Blue^TM hTLR8及对照HEK-Blue Null2-k细胞培养及检测所需试剂：DMEM(4.5g/l glucose)、牛血清FBS、链霉素(50μg/ml)、青霉素(50U/ml)Blasticidin(10mg/ml)、ZeocinTM(10mg/ml)、Normocin(50mg/ml)、HEK-BlueTMDetection。

基础培养基：DMEM+10％FBS+链霉素+青霉素+Normocin(100μg/ml)

细胞准备：将冻存的细胞迅速放入37℃水浴，不时摇动，在1分钟内使其完全融化；将细胞转移到15ml提前预热好的基础培养基中重悬；1000r/min，离心5min，弃去上层液；1ml基础培养基重悬，转入T25培养瓶，补充至5ml培养基，置于37℃培养箱培养；稳定传代两次后加入选择性抗生素筛选：HEK-Blue^TMhTLR7或HEK-Blue^TMhTLR8：100μg/ml Zeocin+Blasticidin(30μg/ml)、HEK-Blue Null2-k：100μg/ml Zeocin；一周换液2次；当细胞量达到70％-80％时，加PBS轻轻拍打使细胞脱落。

活性检测步骤：在96孔板中每孔加20μl样品(设置复孔)；加20μl阳性对照(如：INF-α，100ng/ml)；加20μl阴性对照(如：ddH2O)；用提前预热的5-10ml PBS(T75培养瓶)轻柔的冲洗细胞；加2-5ml PBS(T75培养瓶)于培养瓶中并放回培养箱温浴1-2min，轻轻拍打使细胞脱落；细胞计数，不可离心；HEK-Blue hTLR细胞量约为220000/ml，每孔180μl(约40000个细胞)，HEK-Blue Null2-k细胞量约为280000/ml，每孔180μl(约50000个细胞)；用HEK-Blue TM检测液重悬调整细胞数量，不可孵育时间太长，以免背景太深或出现假阳性；37℃培养箱培养6-16h，620-655nm检测SEAP读数。

实验结果：半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。实验结果显示：R848的半最大效应浓度为mTLR7(75nM)，hTLR(773nM)而本发明的TLR激动剂D018(化合物编号N01)：mTLR7(33nM)，hTLR(15nM)(见图1)，EC50很好的反应激动剂的药效，值越小说明药效越高。

二、小鼠肿瘤模型的建立及抑瘤实验

本实验中使用MC38肠癌细胞，MC38培养于含10％FBS的DMEM培养基中，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。常规传代用胰酶0.25％Trypsin-EDTA(GIBCO:25200-056)，消化1-3min。细胞传代比例为1：3，细胞密度低于80％传代。传代后细胞每周换液2-3次。在种瘤前3天细胞传代一次，并在注射前一天更换新的培养液。取存活率在80％的1×10⁶个MC38细胞注射于6-8周龄雌性C57BL/6小鼠右侧皮下。

实验分组：

小鼠肿瘤生长情况的观察

荷瘤后第13、16、18、23、27、30、33天开始利用游标卡尺，测小鼠肿瘤的最大径(a)及最小径(b)，利用公式V＝1/2ab²(a为长径，b为短径)计算各组肿瘤平均体积，绘制各组肿瘤组织生长曲线(具体见图2)；相比于第一组IgG Isotype对照组，其他组肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.0001)。荷瘤后第34天取出肿瘤组织进行观察，由图3可见，PD-1+D018组肿瘤大小远远小于其他组。以上数据综合表明激动剂D018和R848、PD-1抗体对肿瘤均有抑制作用，其中，激动剂D018对肿瘤的治疗效果要明显好于激动剂组R848和PD-1抗体组，尤其是，PD-1和D018联用后肿瘤体积一直维持在很低的水平，并且明显小于其他各组，显示PD-1+D018抑瘤效果最佳。其中αPD-1+D018 25μg组自给药处理开始瘤体积一直处于缓慢生长甚至是生长停滞状态，因此我们认为D018的抑瘤效果在10-25μg间存在明显的剂量依赖性。与R848给药组相比D018给药组具有更好的抑瘤效果和剂量依赖性，说明TLR7激动剂的药物疗效要明显好于商品化的R848。

三、肿瘤组织内浸润性淋巴细胞检测

肿瘤组织浸润性淋巴细胞由多种免疫细胞组成(CD4+T细胞，CD8+T细胞，NK细胞，NKT细胞等)，在肿瘤免疫中起着关键作用。为进一步明确激动剂D018发挥抗肿瘤免疫作用的机制，我们使用Miltenyi的小鼠肿瘤解离试剂盒与gentleMACS^TM Octo Dissociator仪器制备出小鼠肿瘤的单细胞悬液。对此单细胞悬液取出部分进行FITC-抗CD4抗体、标记PE-FOXP3抗体、标记percp-抗CD8抗体、标记APC-抗CD25抗体四色的流式染色，用流式细胞仪分析其中的肿瘤浸润淋巴细胞的成分，如：CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞。流式检测显示(具体见图4)。

CD8+T淋巴细胞又称为细胞毒T淋巴细胞(CTLs)是免疫应答的主要效应细胞，可被内源性抗原肽与MHCI类分子形成的复合物激活，特异性杀伤靶细胞并在抗病毒感染和抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。我们设定每个小鼠CD4+T细胞数10000为门，从而均一化各个样本，分析各组上样中CD8+T细胞的数量PD-1+D018(25μg)组和PD-1+R848(25μg)组肿瘤组织内CD8+T数量与其他组相比明显增多(图5)，同时这两组小鼠肿瘤生长速度也显著减缓。CD8+T细胞作为肿瘤免疫治疗中关键的效应细胞，其数量的多少直接决定着小鼠肿瘤免疫的强度和预后。由结果可知αPD-1和D018单独作用对CD8+T细胞的数量影响有限，而二者联合用药却可明显的改善这种状态，推测可能是TLR7的激动剂能够增强初始T细胞的数量，增强其接触小鼠肿瘤抗原的机会，但是由于某些原因这些T细胞迅速失活，而当我们给小鼠加入αPD-1后，其可明显延长效应T细胞的数量，因此二者联合用药后大大的改善了小鼠肿瘤的免疫微环境，增强了小鼠对肿瘤的免疫排斥。

PD-1+D018(25μg)组、PD-1+R848(10μg)组和PD-1+R848(25μg)组肿瘤组织内CD 8+T/Treg比值较高(图6)，同时这3组小鼠肿瘤生长速度也显著减缓。肿瘤的免疫微环境除了效应性的T细胞外，还有一些抑制性的调节T细胞比如说Treg细胞，目前的研究表明肿瘤的免疫微环境不能仅仅看效应T细胞的数量，还应该看微环境中效应T细胞与Treg细胞二者的比例，如比值增高意味着免疫微环境向着抑制肿瘤生长的方向发展，如比值降低则意味着微环境能够促进肿瘤的生长。为此我们比较了各组CD8+T细胞/Treg细胞的比值，由图可知αPD-1+D018 25μg组与IgG Isotype control组和αPD-1组相比其CD8+T细胞/Treg细胞的比值都有明显的提高，p值分别为p＝0.0007和p＝0.0008，说明联合用药组对肿瘤免疫微环境存在明显的正向调节促进小鼠对肿瘤的抑制。αPD-1+R848 25μg组与IgG Isotype control组相比其CD8+T细胞/Treg细胞的比值也有明显的提高，p值为p＝0.0172。而单独给药组αPD-1、R848 25μg和D018 25μg组与对照组相比未见明显的免疫环境改善。

四、细胞免疫荧光检测PDL-1的表达

将剥离出来的肿瘤组织用Miltenyi的小鼠肿瘤解离试剂盒与gentleMACS^TM OctoDissociator仪器制备成肿瘤的单细胞悬液后，对此单细胞悬液取出部分进行鼠的流式PD-L1抗体染色，染色半小时后洗两次处理的细胞，再用300ulPBS重悬过滤并上机检测。

PD-1一般表达在活化的T细胞上，并随T细胞的活化其表达量逐步升高。当活化的T细胞遇到其配体PD-L1则引起T细胞的失活，因此肿瘤组织中PDL-1的表达水平也影响着肿瘤免疫微环境中的效应T细胞数量与功能。为此我们检测了肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平(具体见图7)。由结果可知IgG Isotype control、αPD-1、D018 25μgαPD-1+D018 25μg，各组肿瘤细胞表面都有PD-L1的表达，且与IgG Isotype control相比αPD-1、D018 25μg、αPD-1+D018 25μg表达PD-L1的gate逐渐向右偏移，也就是说表达PD-L1细胞逐渐增多。与此同时我们分析了一下各组的mean值，由结果可知αPD-1+D018 25μg与其它组相比mean有明显的提高，mean值反应的是单个细胞上表达的量的多少，因此也就是说αPD-1+D018 25μg组的瘤细胞上表达PD-L1量是最高的其IgG Isotype control和αPD-1组相比p值分别为p＝0.0148和p＝0.0141。αPD-1+D018 25μg组的PD-L1表达明显提高与之前的结果并不矛盾，目前越来越多的研究表明PDL-1表达增高的患者其接受αPD-1治疗后有更好的临床治疗效果，可能与PD-L1的高表达后对αPD-1治疗更加敏感有关系。

五、荷瘤小鼠血清中细胞因子的检测

小鼠处死后，全血用1ml注射器21号针头于心脏穿刺收集血液，室温放置1小时使其凝结成块。3000转离心后收集血清。血清收获后储存冷冻(-80℃)。ELISA检测小鼠白细胞介素2(IL-2)，检测小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-6的指标，每个样三个副孔。实验前将所用试剂放置室温(18-25℃)复温；洗板：将包被好的酶标板置于洗板机上用洗液冲洗5次；接着在滤纸上轻叩，去除多余液体；加样：每孔加100ul细胞培养物上清样品，置于37℃孵箱，孵育1h；洗板：将酶标板置于洗板机上用洗液冲洗5次，接着在滤纸上轻叩，去除多余液体；加Detection Ab：每孔加入100ul(1:200)稀释的检测抗体；置于37℃孵箱，孵育1h；洗板：将酶标板置于洗板机上用洗液冲洗5次，接着在滤纸上轻叩，去除多余液体；加Aiding-HRP：加入100ul(1：1000)稀释Aiding-HRP；置于37℃孵箱，孵育30min；洗板：将酶标板置于洗板机上用洗液冲洗5次，接着在滤纸上轻叩，去除多余液体；底物显色：每孔加入100ul SubstrateSolution F(避光)，15min；终止：每孔加入100ul终止液终止反应；检测：酶标仪上450nm,30min内测定OD值，根据标准曲线所得的回归方程，计算得到样品中的细胞因子浓度。

我们检测了小鼠全身血液中的各种细胞因子(结果见图8)，发现联合用药组小鼠血清中白介素2的水平明显升高，白介素2作为刺激和维持T细胞的分化增殖的细胞因子其水平的明显升高对于肿瘤免疫微环境中的效应细胞发挥功能至关重要。联合用药组白介素6的水平较对照组有明显的提高，其能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。联合用药组干扰素γ的水平比较高，干扰素具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。联合用药组具有炎症与免疫抑制因子的负向免疫调节白介素10水平是各组中最低的。总结以上，联合用药组从全身的免疫状态来讲是趋向于提高机体的免疫应答水平，促进免疫系统对肿瘤的杀伤。

六、激动剂D018对巨噬细胞中细胞因子分泌水平的影响

巨噬细胞来源于野生型C57BL/6的骨髓细胞，取出后在含有M-CSF的条件培养基中培养5天后获得。在培养期结束后，收集贴壁细胞重新铺板进行细胞实验。实时定量PCR分析野生型C57BL/6骨髓衍生的巨噬细胞在不同时间和不同剂量的D018、R848和Poly(I:C)刺激下Il1b、Il6、Il12b、Tnf、Ifnb1、Cxcl1、Cxcl10和Il10等基因的mRNA水平，使用管家基因GAPDH对各个样本进行归一化。

由结果图9可知BMDMs在D018(0.023μg/ml)或R848(10μg/ml)时Il1b、Il6、Il12b三种细胞因子在刺激1h时候都有明显的提升，在6h时达到峰值。我们采用D018(0.023μg/ml)或R848(10μg/ml)或polyI:C(1μg/ml)，分别在检测了刺激BMDMs 0、1、3、6小时后tnf的水平，在刺激第1小时tnf就直接达到了最高点，从第3小时开始因子水平就开始下降，第6小时就已经降了很多。从结果中可以看到与另外两个刺激剂相比0.023μg/ml的D018刺激BMDMs产生tnf的水平是最高的，说明D018的剂量活性是最低的或者说活性是最高的。D018(0.023μg/ml)或R848(10μg/ml)在刺激BMDMs1小时后Ifnb1、Cxcl1、Cxcl10和Il10到了最高点，从第6小时开始因子水平开始回落。Ifnb1、Cxcl1、Cxcl10三细胞因子大体都是D018的活性要好于R848，而在刺激Il10时R848的活性更高一些。结果证实BMDMs在D018(0.023μg/ml)或R848(10μg/ml)刺激下Il1b、Il6、Il12b、Tnf、Ifnb1、Cxcl1、Cxcl10和Il10等基因的mRNA水平都有明显的提升，说明D018能在体内水平对小鼠全身免疫系统产生有益的影响。

七、高通量测序检测激动剂D018和PD-1抗体联用对肿瘤细胞基因表达的影响

收获各种不同细胞或组织，用PBS在1000rpm，5min的条件下离心洗3次。提取总RNA，总RNA浓度经NanoDrop(ND-lOOO)紫外分光光度仪测定，RNA浓度不低于40ng/m,纯度要求0D 260/280大于1.8。每个样品取5g，用Reverse transcriptTM kit(Invitrogen)逆转录合成单链cDNA文库。进行高通量测序。

为了进一步揭示联合用药的机制，发明对各组小鼠的肿瘤进行了RNA-seq，结果显示联合用药使得小鼠肿瘤的基因表达发生了一系列的变化，上调了炎症和细胞因子介导的通路、T细胞激活、凋亡信号通路、B细胞激活通路等有利于肿瘤免疫治疗的基因数目，另一方面其对Wnt信号通路的下调促进了免疫细胞向肿瘤组织的浸润。在此提示下我们使用荧光定量PCR法进行了验证。

有报道称β-catenin信号负向调控趋化因子Ccl4的表达，Ccl4能够介导DC细胞向肿瘤组织浸润。因此激活β-catenin会导致Ccl4表达的下调，从而抑制DC细胞向肿瘤组织浸润迁移影响DC细胞所介导的T细胞激活。目前从我们的结果可以看出与IgG Isotypecontrol相比，Ccl4基因表达在αPD-1组、D018 25μg和αPD-1+D018 25μg组都有所上调，但很明显的是联合用药αPD-1+D018 25μg组Ccl4基因表达的水平要明显高于其它组。因此我们进一步检测了各组中β-catenin的基因表达水平(见图10)，从结果可以看出，与对照组相比αPD-1、D018 25μg和αPD-1+D018 25μg组β-catenin的基因表达水平都发生了明显的下调，其中αPD-1和αPD-1+D018 25μg组下调的更加明显，αPD-1+D018 25μg组如此低水平的表达β-catenin与其CD8+T细胞等免疫效应细胞数量增多及瘤体积明显受到抑制的表型是完全一致的。

八、IHC检测D018和PD-1抗体联用对ccl4和β-catenin表达的影响

具体步骤如下：①脱蜡：组织芯片置于二甲苯中浸泡20分钟，换新鲜二甲苯重复一次；②再水化：将脱腊后的组织切片于100％乙醇中浸泡5分钟2次，95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、蒸馏水各浸泡5分钟×1次；③抗原修复：抗原修复液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将抗原修复液微波高温加热至沸腾，将切片放入，再用微波高火加热5分钟，补加蒸馏水恢复体积后再用微波高温加热5分钟，自然冷却至室温；④去除内源性过氧化物酶：新鲜配置3％H2O2，滴片，室温下避光孵育10分钟；⑤封闭：用正常羊血清工作液室温封闭20分钟；⑥一抗反应：用10μg/mL兔抗人PHF23一抗(以PBS稀释)滴片，37℃孵育1小时，对照组以PBS代替一抗；PBS洗5分钟×3次；⑦二抗反应：HRP-羊抗兔抗体1：200稀释(以PBS稀释)，室温反应30分钟；⑧PBS洗5分钟×3次；⑨二氨基联苯氨(DAB)显色，滴片，镜下观察反应结果；⑩苏木精复染细胞核，自来水蓝化；

乙醇上行脱水：50％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，100％乙醇5分钟×2次；中性树胶封片，于显微镜下观察并记录结果。

为了进一步证实联合用药的有效的机理，部分是通过降低β-catenin的蛋白表达从而降低其对Ccl4基因的抑制作用，使得更多的Ccl4发挥其促进DC细胞向瘤组织浸润及激活T细胞的作用，我们使用免疫组化的方法检测了IgG Isotype control、αPD-1、D018 25μg和αPD-1+D018 25μg各组的Ccl4与β-catenin的蛋白表达水平(见图11)，由结果可知与对照组相比Ccl4的蛋白表达水平在αPD-1、D018 25μg和αPD-1+D018 25μg组中依次上升，而β-catenin的蛋白表达水平在control、αPD-1、D018 25μg和αPD-1+D018 25μg各组中依次降低。结果如我们预期，说明了联合用药发挥的功能部分是通过此通路发挥作用的。Ccl4趋化性细胞因子受体促进DC及T细胞向肿瘤组织的浸润，使得DC细胞接触肿瘤的机会更多，更好的将肿瘤抗原提成给淋巴组织的T细胞，使得循环系统中肿瘤特异性淋巴细胞的数量增多，机体进入肿瘤特异性免疫的良性循环，加速机体对肿瘤组织的清除。

九、各实验组对肿瘤小鼠生存期影响

我们将对小鼠分为IgG Isotype control、αPD-1、R848 25μg、αPD-1+R84810μg、αPD-1+R848 25μg、D018 25μg、αPD-1+D018 10μg、αPD-1+D018 25μg8组，每组10只小鼠，在荷瘤小鼠的肿瘤长到100mm3后PD-1单抗每隔3天进行相应的药物治疗200μg/mouse，TLR7激动剂每隔7天一个免疫疗程,分为10μg与25μg两个剂量组。

根据各组小鼠肿瘤的生长曲线可知(见图12)，与IgG Isotype control相比其它给药组小鼠肿瘤都有不同程度的缩小，其中αPD-1+D018 25μg组自给药处理开始瘤体积一直处于缓慢生长甚至是生长停滞状态，其与对照组相比p值<0.001。无论是D018还是R848，单独给药组和联合治疗组都有明显的抑制肿瘤生长的作用，其中联合给药具有更明显的抑瘤作用，且其抑瘤效果在10-25μg间存在明显的剂量依赖性。与R848给药组相比D018给药组具有更好的抑瘤效果和剂量依赖性，可知MC38组中33天时IgG Isotype control的生存率为0、41天时αPD-1为40％、D018为90％、αPD-1+D018为100％。这说明本发明TLR7激动剂的药物疗效要明显好于商品化的R848。

十、联合用药对免疫记忆的影响

为了进一步确定针对肿瘤抗原的T细胞介导的记忆反应是否是用抗PD-1及D018联合治疗引发的免疫反应，我们选择了接受PD-1及D018联合治疗后拒绝MC38肿瘤的小鼠(无肿瘤＞30天)。用1×10⁶MC38细胞在初次接种的对侧接种。

结果可见(见图13)那些初次接种的小鼠肿瘤长的很快，而那些接受联合治疗后拒绝MC38肿瘤的小鼠则完全抵抗住了MC38细胞的压力。这些结果清楚地说明，PD-1及D018联合治疗可引起持久的全身性免疫记忆从而预防复发。

十一、激动剂D018、PD-1抗体和TIM-3抗体联用对小鼠肿瘤生长的影响

为了探究D018与其他免疫抗体联用的效果如何，我们选择6-8周龄雌性C57BL/6小鼠于右侧皮下分别注射MC38，构建荷瘤小鼠模型。随后将小鼠分为IgG Isotype control、αTim-3、D018、αPD-1+D018、αTim-3+D018、αPD-1+D018+αTim-3组，每组10只小鼠，在荷瘤小鼠的肿瘤长到100mm3后随机分选为以上6组。PD-1单抗每隔3天进行相应的药物治疗200μg/只，TLR7激动剂每隔7天一个免疫疗程，每3天用游标卡尺测量肿瘤大小一次。

根据各组小鼠肿瘤的生长曲线(图14)可知，与IgG Isotype control相比其它给药组小鼠肿瘤都有不同程度的缩小，其中αPD-1+D018、αPD-1+D018+αTim-3组自给药处理开始瘤体积一直处于缓慢生长甚至是生长停滞状态，其与对照组相比有显著差异。由图可知单纯的αTim-3给药未见有明显的治疗效果，但其与D018联合治疗后明显的提高了对瘤体积抑制的能力。因此，D018与αPD-1和αTim-3抗体的单独联合及三者联合治疗都有明显的抑制肿瘤生长的作用，其中联合两种免疫检测点给药具有最明显的抑瘤作用。

十二、Ag104Ld小鼠肿瘤模型的建立及抑瘤实验

本实验中使用Ag104Ld纤维细胞，培养于含10％FBS的DMEM培养基中，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。常规传代用胰酶0.25％Trypsin-EDTA(GIBCO:25200-056)，消化1-3min。传代后细胞每周换液2-3次。在种瘤前3天细胞传代一次，并在注射前一天更换新的培养液。取存活率在80％的1×10⁵个Ag104Ld细胞注射于6-8周龄雌性CH1小鼠右侧皮下。

实验分组：

小鼠肿瘤生长情况的观察(方法同内容二)。根据文献报道，Ag104Ld细胞的PD-L1表达与MC38相似，但其对PD-1抗体的应答比在MC38肿瘤模型中弱，因此IgG Isotypecontrol和PD-1组没有区别。在我们的实验中由图15可见，单独使用PD-1抗体与对照组确实无差别，而治疗组中单独使用D018就有很好的抑瘤效果，与PD-1+D018联用组无显著差异。这说明D018作为TLR7的激动剂，可以激活相应的通路产生一系列的炎症因子，使Ag104Ld肿瘤模型小鼠的肿瘤微环境的炎症水平改善，从而更利用调动免疫反应抑制肿瘤的生长。

十三、Ag104Ld肿瘤模型小鼠肿瘤组织内浸润性免疫细胞检测

为进一步明确激动剂D018及D018与PD-1抗体联用能否在其他肿瘤模型，如对PD-1抗体治疗应答弱的肿瘤类型，也可以发挥抗肿瘤的效果，我们分离得到Ag104Ld肿瘤模型小鼠肿瘤组织的单细胞悬液。对此单细胞悬液用标记APC cy7-抗CD45抗体，标记FITC-抗CD4抗体、标记PE-FOXP3抗体、标记percp-抗CD8抗体、标记APC-抗CD25抗体四色的流式染色，用流式细胞仪分析其中的肿瘤浸润淋巴细胞的成分，如：CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和Treg细胞，流式检测显示(具体见图16)。用CD45抗体、CD103抗体、CD11c抗体流式染色，分析其中CD103⁺的DC细胞，流式检测显示(具体见图17)。用CD45、CD4、CD8、CD44、CD62L抗体流式染色，分析其中记忆性T细胞，中心记忆型T细胞(Tcm)，效应记忆型T细胞(Tem)，流式检测显示(具体见图18)。

CD8⁺T细胞作为肿瘤免疫治疗中关键的效应细胞，其数量的多少直接决定着小鼠肿瘤免疫的强度和预后情况。分析Ag104Ld肿瘤模型小鼠各组肿瘤组织内浸润CD8⁺T细胞的数量发现，PD-1+D018组CD8⁺T数量与IgG Isotype control组和αPD-1组相比明显增多(图15)，p值分别为p＝0.0302和p＝0.013。其CD8⁺T细胞/Treg细胞的比值也有明显的提高，同时这两组小鼠肿瘤生长速度也显著减缓。

DC是抗原递呈能力很强的专职递呈细胞，能启动T淋巴细胞初次免疫应答反应。研究表明，DC表达多种表型分子，CD11c是其特异性标记物之一。CD103⁺DC是将抗原从肠黏膜固有层转运到派尔集合淋巴结和肠系膜淋巴结的主要调节性DC亚群，能刺激活化的T淋巴细胞表达归巢分子α4β7整合素，从而介导T淋巴细胞归巢到抗原入侵的部位。并且CD103⁺DC与CD8⁺T浸润到肿瘤微环境密切相关，因此我们检测了各组中CD103⁺DC的含量。由结果可知αPD-1+D018和D018单独作用组与对照组相比，均有显著的变化，p值分别为p＝0.0404和p＝0.0102。

T细胞被特异性的抗原物质激活后，进行增殖和分化，形成在功能上各异的两类细胞，即T免疫效应细胞和记忆T细胞。其中记忆T细胞则会在下一次抗原入侵时将记忆中的抵御机制调动出来，再次破坏靶细胞。记忆T细胞又包括中央记忆型T细胞(Tcm)和效应记忆型T细胞(Tem)。Tcm的生物标记为CD62L和CD44双阳性的细胞，这代表了Tcm能够通过淋巴屏蔽，回归淋巴结，同时处于被抗原激活的状态。Tcm细胞具有自我更新及复制能力，在体内存活时间长，可起到长期抗肿瘤作用。目前，Tcm细胞可被定量化的监测为临床规范化治疗提供参考指标。Tem是被激活的Tcm细胞，在抗原的再次刺激之下，可继续产生大量的携带同种抗原的克隆化的效应记忆型T细胞，Tem的生物标记为CD62L^-和CD44⁺的细胞。因此我们检测了肿瘤微环境中Tcm和Tem，根据结果(图18)可见，与对照组相比，Tcm在αPD-1+D018和D018单独作均有显著的变化，p值分别为p＝0.0454和p＝0.0359。这说明D018药物单独使用或联合应用免疫检查点阻断抗体，都可以使小鼠产生明显的Tcm，进行二次免疫防御。

上述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (28)

1.式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，

其中，

L表示连接基团，其为C₁-C₆亚烷基或C₁-C₆亚烯基，其中所述基团均可任选地被C₁-C₄烷基取代；

R₁表示

其中R₃选自H、卤素、氨基亚甲基、取代氨基亚甲基或其季铵盐、杂环取代的亚甲基、叠氮亚甲基、膦酸基亚甲基、膦酸二乙酯基亚甲基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、CF₃-、-COOH、-COOCH₃、-CN、HO-CH₂，所述杂环取代的亚甲基的杂环选自

卤素为氟、氯；

取代氨基可为二甲基氨基、Leu-氨基、Leu Ala Ala Asn-氨基、三氟甲基亚甲基氨基、甲基氨基；

季铵盐为季铵盐酸盐；

R₂表示-YR₄，其中Y表示N、S、O，R₄表示C₁-C₄烷基，-YR₄中的Y和R₄还可以形成杂环，杂环可为吗啉或哌啶。

2.根据权利要求1所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述L为C₁-C₆亚烷基。

3.根据权利要求1或2所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述L为-CH₂-。

4.根据权利要求1所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述R₁为

5.根据权利要求1所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述R₂为-NR₄。

6.一种吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自：

7.权利要求1所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中，式(I)中R₁表示

其步骤包括：

(1)以3-氨基-6-溴吡啶-2-甲酸甲酯和氯甲脒盐酸盐为起始原料，加入二甲基砜，制得化合物1，反应式为：

(2)取化合物1溶于醋酐中，得化合物2，反应式为：

(3)室温下，取化合物2溶于二氧六环中，加入DMF，然后滴加草酰氯，得化合物反应式为：

(4)将步骤(3)所得化合物3直接溶于干燥的四氢呋喃中，加入含氮有机化合物或含硫有机化合物或含氧有机化合物R₄YH，然后加入N,N-二异丙基乙胺，得化合物4，反应式为：

(5)取化合物4溶于甲醇中，加入LiOH·H₂O，制得化合物5，反应式为：

(6)在氮气保护下，取化合物5溶于干燥的四氢呋喃中，依次加入取代苄溴、锌粉和Ni(PPh₃)₂Cl₂，制得化合物6，反应式为：

8.根据权利要求7所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述含氮有机化合物为C_1-4烷基胺、哌啶、吗啉；含硫有机化合物为C_1-4烷基硫醇；含氧有机化合物为C_1-4烷基醇。

9.根据权利要求8所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述含氮有机化合物为正丁胺。

10.根据权利要求8所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述含硫有机化合物为正丁硫醇。

11.根据权利要求8所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述含氧有机化合物为正丁醇。

12.根据权利要求7所述的式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述取代苄溴为3-甲基苄溴。

13.一种药物组合物，包括：权利要求1所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，所述组合物还含有至少一种其他治疗剂，所述治疗剂选自化疗剂、免疫治疗剂、抗血管生成剂、细胞因子、激素、多核苷酸、抗体、免疫学活性片段。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体为PD-1和/或TIM-3抗体。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物为PD-1抗体和TIM-3抗体和式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐。

17.权利要求1-5任意一项所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求6所述吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求7所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法或权利要求13-16任意一项所述的药物组合物用于制备治疗呼吸系统疾病、免疫相关疾病、病毒性疾病或肿瘤药物中的应用。

18.权利要求1-5任意一项所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求6所述吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求7所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法或权利要求13-16任意一项所述的药物组合物用于制备治疗传染性疾病药物中的应用。

19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括但不限于：纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、结肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、乳头状癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、真性红细胞增多、淋巴瘤、多发性骨髓瘤；所述病毒性疾病及相关病毒包括但不限于：埃博拉病毒病、炭疽菌病、尖锐湿疣、单纯疣、足底疣、呼吸道合胞病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、登革热病毒、单纯疱疹病毒、触染性软疣、牛痘、天花、人免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、鼻病毒、肠病毒、腺病毒、流感、副流感、腮腺炎病毒、麻疹病毒、乳多泡病毒、黄病毒、沙粒病毒；自身免疫病包括但不限于：系统性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合症、韦格纳肉芽肿、结节病、赖特综合征、贝赫切特综合征；呼吸系统疾病包括但不限于：哮喘、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫综合征。

20.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括但不限于：平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头腺癌、囊腺癌、肝细胞瘤、小细胞肺癌；所述病毒性疾病及相关病毒包括但不限于：慢病毒、逆转录病毒。

21.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为冷肿瘤。

22.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、脑膜瘤、肺癌、肝癌或胰腺癌。

23.权利要求1-5任意一项式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求6所述吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求7所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法或权利要求13-16任意一项所述的药物组合物用于制备疫苗佐剂中的应用。

24.权利要求1-5任意一项式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求6所述吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求7所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法或权利要求13-16任意一项所述的药物组合物在制备药物制剂中的应用。

25.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述药物制剂上调炎症和细胞因子介导的通路、T细胞激活\凋亡信号通路、B细胞激活通路各通路中有利于免疫治疗的基因数目。

26.权利要求1-5任意一项式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求6所述吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求7所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法或权利要求13-16任意一项所述的药物组合物在制备影响巨噬细胞中各细胞因子分泌水平药物制剂中的应用。

27.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述药物制剂为影响Il1b、Il6、Il12b、Tnf、Ifnb1、Cxcl1、Cxcl10和Il10等基因的mRNA水平的表达的药物制剂。

28.权利要求1-5任意一项式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求6所述吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、权利要求7所述式(I)的吡啶并嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法或权利要求13-16任意一项所述的药物组合物在制备预防肿瘤复发药物中的应用。

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