CN111164214A

CN111164214A - 用于改进动物饲料营养质量的酶共混物和方法

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Publication number: CN111164214A
Application number: CN201880058351.4A
Authority: CN
Inventors: J.弗里克曼; K.斯塔林斯; D.彼得森; M.B.佩德森; H.C.史密斯
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2020-05-15
Also published as: BR112020004476A2; EP3682014A1; CA3070730A1; WO2019055455A1; US20200263207A1

Abstract

本发明涉及一种用于改进作为发酵产物生产方法的副产物而生产的干酒糟(DGS)或含可溶物的干酒糟(DDGS)的营养质量的方法，用于生产发酵产物的方法，以及在这些方法中使用的酶共混物。

Description

用于改进动物饲料营养质量的酶共混物和方法

技术领域

发明背景

用于从含淀粉材料或含木素纤维素材料生产发酵产物如乙醇的方法在本领域中是熟知的。制备含淀粉材料如玉米用于此类发酵方法典型地从在干研磨或湿磨方法中研磨玉米开始。湿磨方法涉及将玉米分级为不同的组分，其中仅淀粉级分进入发酵方法。干研磨方法涉及将玉米粒研磨成粕，并将粕与水和酶混合。通常使用两种不同种类的干研磨方法。最常使用的方法常常被称作“常规方法”，包括研磨该含淀粉材料，然后在高温下典型地使用细菌α-淀粉酶使糊化的淀粉液化，随后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同时糖化和发酵(SSF)。另一种熟知的方法常常被称作“生淀粉水解”方法(RSH方法)，包括研磨含淀粉材料，然后在低于初始糊化温度下，典型地在酸性真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下，将颗粒淀粉同时糖化和发酵。

在用于从玉米生产乙醇的方法中，遵循SSF或RSH方法，例如通过从其他液体和/或固体分离所希望的发酵产物(例如乙醇)的蒸馏，从发酵醪(常常被称作“啤酒醪”)中回收液体发酵产物。剩余级分称为“全酒糟”。全酒糟典型地含有约10％至20％的固体。例如通过离心将全酒糟分离为固体级分和液体级分。分离的固体级分被称作“湿饼”(或“湿谷粒”)，而分离的液体级分被称作“酒糟水(thin stillage)”。湿饼和酒糟水分别含有约35％和7％固体。湿饼(具有任选的另外的脱水)被用作动物饲料中的组分，或被干燥以提供用作动物饲料的组分的“干酒糟”(DDG)。典型地蒸发酒糟水，以提供蒸发器冷凝物和浆料，或可替代地可以作为“逆流”被再循环至浆料槽。蒸发器冷凝物可以在排放前送往甲烷转化器，和/或可以作为“蒸煮水”被再循环到浆料槽。可以在干燥方法(可以依次包含一个或多个干燥器)之前或期间将浆料共混入DDG中或添加到湿饼中，以生产DDGS(含可溶物的干酒糟)。浆料典型地含有约25％至35％的固体。也可以从酒糟水和/或浆料中提取油，作为副产物用于生物柴油生产，作为饲料或食品添加剂或产物，或其他生物可再生产物。

含可溶物的酒糟(DGS)和含可溶物的干酒糟(DDGS)是谷粒制乙醇工业的副产品，其被用于动物饲料。DGS和DDGS富含纤维，因此单胃动物(例如像家禽和猪)的最高可行包合率低于反刍动物(如牛)的最高可行包合率。将糖基水解酶例如像内切木聚糖酶添加到饲料共混物中以增加富含纤维的饲料共混物的消化率。然而，存在一些与添加到饲料共混物中的酶的作用有关的挑战；例如，将酶均匀混合到饲料共混物中，在饲料造粒过程中酶蛋白的热稳定性，在通过低pH胃期间酶蛋白的稳定性，在一些动物物种的肠道中的相对较短的停留时间。

发明内容

本发明通过在发酵产物生产方法期间，例如在同时糖化和发酵(SSF)步骤期间，在上游添加木聚糖酶或包含木聚糖酶和/或纤维素分解组合物的酶共混物来克服上述挑战，其中连续地混合自由流动的浆料，温度是稳定的(例如，在30℃与35℃之间)，pH是稳定的(例如，在约pH4与pH5之间)，并且停留时间典型地在54至80小时的范围内。

本发明更特别地涉及在SSF方法期间添加木聚糖酶或含有木聚糖酶的酶共混物以生产对动物(例如，单胃动物)而言具有更高消化率的DDGS产物或DGS产物。不希望受到理论的束缚，认为当纤维(例如，玉米)被溶解时，降低了营养素(如蛋白质、油、和残留淀粉)的包封，从而使得这些营养素更容易获得，并且溶解的纤维可以被肠道微生物组发酵为可代谢产物(如脂肪酸)。此外，溶解的纤维有可能通过充当有益肠道菌群的底物而对肠道健康有积极作用。

本发明涵盖了在糖化、发酵、或同时糖化和发酵中单独使用木聚糖酶，以及使用在包含木聚糖酶和至少一种另外的酶(如纤维素分解组合物)的酶共混物中的木聚糖酶，以改进在常规和生淀粉水解(RSH)乙醇生产方法下游生产的DDGS的质量。在一方面，本发明涉及一种包含木聚糖酶的酶共混物。在一个实施例中，该酶共混物包含木聚糖酶和至少一种另外的酶。在一个实施例中，该酶共混物还包含纤维素分解组合物。在一个实施例中，该纤维素分解组合物存在于该共混物中，木聚糖酶和纤维素分解组合物的比率为约5:95至约95:5。在一个实施例中，该共混物中木聚糖酶和纤维素分解组合物的比率为约10:90。在一个实施例中，该共混物中木聚糖酶和纤维素分解组合物的比率为约20:80。在一个实施例中，该共混物中木聚糖酶和纤维素分解组合物的比率为约50:50。

在一个实施例中，该酶共混物包含至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的木聚糖酶。在一个实施例中，该酶共混物包含至少5％、至少10％的木聚糖酶，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％的纤维素分解组合物。

在一个实施例中，该木聚糖酶是GH30家族木聚糖酶。在一个实施例中，该木聚糖酶是GH30亚家族8木聚糖酶(“GH30_8木聚糖酶”)。在一个实施例中，该木聚糖酶是GH30_8木聚糖酶，其选自下组，该组由以下组成：(i)SEQ ID NO:1的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(ii)SEQ ID NO:2的枯草芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(iii)SEQ ID NO:3的枯草芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(iv)SEQ ID NO:4的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)木聚糖酶或其变体，该变体与该解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(v)SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(vi)SEQ IDNO:6的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)木聚糖酶或其变体，该变体与该地衣芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；和(vii)SEQ ID NO:2的饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)木聚糖酶或其变体，该变体与该饲料类芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、或至少三种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)β-葡糖苷酶；和(iii)内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉(Aspergillus fumigatus)纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌(Penicillium emersonii)GH61A多肽。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、或至少三种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iii)里氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ ID NO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；和/或(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ ID NO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；和任选地(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自选自由曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicilium)、篮状菌属(Talaromyces)、和木霉属(Trichoderma)组成的组的菌株，任选地其中：(i)该曲霉属菌株选自下组，该组由以下组成：黄曲霉(Aspergillus aurantiacus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)；(ii)该青霉属菌株选自下组，该组由以下组成：埃默森青霉菌和草酸青霉菌(Penicilium oxalicum)；(iii)该篮状菌属菌株选自下组，该组由以下组成：金黄篮状菌(Talaromyces aurantiacus)和埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)；并且(iv)该木霉属菌株是里氏木霉。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物。

在另一方面，本发明涉及一种生产发酵产物的方法，其包括以下步骤：(a)在低于初始糊化温度的温度下，用本发明的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、和木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物将含淀粉材料糖化；(b)使用发酵生物进行发酵；以及(c)任选地回收副产物。

在另一方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；(b)用本发明的葡糖淀粉酶和木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物将步骤(a)中获得的液化的材料糖化；(c)使用发酵生物进行发酵；以及(d)任选地回收副产物。

在一个实施例中，糖化和发酵同时进行。在一个实施例中，该含淀粉材料包含玉蜀黍、玉米、小麦、黑麦、大麦、黑小麦、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子。在一个实施例中，该发酵产物是醇，特别是乙醇。在一个实施例中，该发酵生物是酵母，特别是酵母菌属物种(Saccharomyces sp.)，更特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

在另一方面，本发明涉及一种用于改进作为发酵产物生产方法的副产物而生产的干酒糟(DGS)或含可溶物的干酒糟(DDGS)的营养质量的方法，该方法包括进行本发明的生产发酵产物的方法，以及回收该发酵产物以生产作为副产物的DGS或DDGS，其中生产的DGS或DDGS具有改进的营养质量。

在一方面，本发明涉及使用本文所述的方法生产的DGS或DDGS，其中与使用常规方法生产的DGS或DDGS的营养质量相比，该DGS/DDGS具有改进的营养质量。

在一个实施例中，与在本发明的生产发酵产物的方法的糖化步骤、发酵步骤、和/或同时糖化和发酵步骤期间不存在本发明的酶共混物时生产的DGS或DDGS的TME相比，该DGS或DDGS的真代谢能增加至少5％、至少10％、至少15％、或至少20％。

在一个实施例中，该动物是单胃动物。

在一个实施例中，与在本发明的方法的糖化步骤、发酵步骤、和/或同时糖化和发酵步骤期间不存在本发明的酶共混物时生产的DGS或DDGS相比，在干燥后生产的该DGS或DDGS没有变黑。

在另一方面，本发明涉及本发明的木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物用于改进作为发酵产物生产方法的副产物而生产的DGS或DDGS的营养质量的用途，优选地不导致DDG或DDGS变黑。

在另一方面，本发明涉及本发明的木聚糖酶或酶共混物用于溶解纤维(优选地用于溶解木糖和阿拉伯糖)的用途。

附图说明

图1显示了使用本发明的包含不同比例的木聚糖酶和纤维素分解组合物的酶共混物的阿拉伯糖溶解，并且特别地显示，与单独通过该纤维素分解组合物溶解阿拉伯糖相比，当该酶共混物中10％-100％的纤维素分解组合物被木聚糖酶替代时，阿拉伯糖的溶解显著增加。

图2显示了使用本发明的包含不同比例的木聚糖酶和纤维素分解组合物的若干种酶共混物的木糖溶解，并且特别地显示，与单独通过该纤维素分解组合物溶解阿拉伯糖相比，当该酶共混物中10％-100％的纤维素分解组合物被木聚糖酶替代时，阿拉伯糖的溶解显著增加。

图3显示了响应于增加剂量的若干种包含不同比率的木聚糖酶和纤维素分解组合物的酶共混物的阿拉伯糖溶解。

图4显示了响应于增加剂量的若干种包含不同比率的木聚糖酶和纤维素分解组合物的酶共混物的木糖溶解。

图5显示了在饲料试验中对根据本发明的用于改进DDGS的营养质量的方法生产的含可溶物的干酒糟(DDGS)的真代谢能(TME)值的积极作用。

图6显示了HPLC数据的结果，如增加的DP4+峰所证明的，该结果证明本发明的酶共混物增加了溶解的糖的量。

图7显示了HPLC数据的结果，如增加的DP3峰所证明的，该结果证明本发明的酶共混物增加了溶解的糖的量。

图8、图9和图10显示了在生淀粉水解(RSH)方法中使用本发明的酶共混物的IC数据的结果，证明糖(例如，阿拉伯糖(图8)、木糖(图9)和半乳糖(图10))与针对常规蒸煮方法相同的水平的溶解。

图11显示了LECO数据的结果，该结果证明将蛋白酶与本发明的酶共混物组合使用增加了蛋白质溶解。

图12、图13、和图14显示了与对照相比，测试的本发明的所有酶共混物导致显著更高水平的溶解的木糖(图12)、阿拉伯糖(图13)、和半乳糖(图14)。

图15显示了与对照相比，本发明的酶共混物产生更大量的乙醇，在不同酶共混物的情况下增加的乙醇量之间没有显著差异，除了与其他测试的酶共混物相比，一种酶共混物的大剂量给予产生的乙醇量显著更大外。

图16显示了与对照(E-Sep和Excel)相比，根据本发明的方法使用本发明的不同酶共混物生产的浆料样品的颜色的比较。按从左上到右下的顺序，显示的样品是Excel(#1)、E-Sep(#2)、GH30:VD 10:90(#3)、GH30:VD 20:80(#4)、GH30:VD 50:50(#5)和GH30:VD 200:800(#6)。

图17显示了与对照(Excel和E-Sep(分别为图16中的#1和#2))相比，根据本发明的方法使用不同剂量的本发明的酶共混物(图16的#5和#6)生产的DDGS样品。

图18显示了与对照(Excel和E-Sep(分别为图16和图17中的#1和#2))相比，根据本发明的方法使用不同剂量的本发明的酶共混物生产的DDGS样品的Hunter L颜色值。

图19显示了干燥后在图17中显示的每个样品中存在的干物质的百分比。

图20、图21、图22、图23、图24、图25、图26、图27、和图28是显示来自实例6中实验的HPLC结果的图，分别包括关于DP4+(图20)、DP3(图21)、DP2(图22)、葡萄糖(图23)、果糖(图24)、乳酸盐(图25)、甘油(图26)、乙酸盐(图27)、和乙醇(图28)的数据。

图29、图30、图31和图32是显示根据本发明使用各种酶共混物的情况下溶解的总糖和单体糖的图，包括例如阿拉伯糖(图29)、木糖(图30)、半乳糖(图31)、和葡萄糖(图32)。

图33、图34、图35、图36和图37是显示根据本发明的方法生产的DDGS的改进的营养质量/含量的图，包括淀粉(图33)、蛋白质(图34)、脂肪(图35)、纤维(酸性洗涤剂)(图36)、和纤维(中性洗涤剂)(图37)的DDGS含量。

序列表综述

SEQ ID NO:1是来自枯草芽孢杆菌的成熟GH30_8木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是来自枯草芽孢杆菌的成熟GH30木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是来自枯草芽孢杆菌的成熟GH30木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是来自解淀粉芽孢杆菌的成熟GH30木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是来自解淀粉芽孢杆菌HB-26的成熟GH30木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是来自地衣芽孢杆菌的成熟GH30木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是来自饲料类芽孢杆菌的成熟GH30木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8是来自烟曲霉的全长纤维二糖水解酶I的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是来自烟曲霉的全长纤维二糖水解酶II的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10是来自烟曲霉的全长β-葡糖苷酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11是来自埃默森青霉菌的全长GH61多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12是来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的全长α-淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是来自嗜热网团菌(Dictyogllomus thermophilum)的全长GH10木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14是来自嗜热网团菌的全长GH11木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15是来自丝衣霉状篮状菌(Rasamsonia byssochlamydoides)的全长GH10木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16是来自雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)的全长GH10木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17是来自烟曲霉的全长GH10木聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18是来自雷塞氏篮状菌的全长内切葡聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19是来自胶囊青霉(Penicillium capsulatum)的全长内切葡聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20是来自褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)的全长内切葡聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21是来自粪生粪壳菌(Sordaria fimicola)的全长GH45内切葡聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22是来自土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)的全长GH45内切葡聚糖酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23是来自草酸青霉(Penicillium oxalicum)的全长葡糖淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:24是来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的全长蛋白酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25是来自桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的全长蛋白酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:26是具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的具有以下取代G128D+D143N的微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)α-淀粉酶的氨基酸序列。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链和支链1,4-葡糖苷寡糖-和多糖的水解的一组酶。

动物：术语“动物”指除人以外的所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如以下动物，如绵羊、山羊、牛(例如，肉牛、奶牛和牛犊)、鹿、牦牛、骆驼、美洲驼和袋鼠。非反刍动物包括单胃动物，例如猪或生猪(包括但不限于小猪、成长猪和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡、蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、菖鲉(bocachico)、鲤科鱼、鲶鱼、卡叉马鱼(cachama)、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、瓜波特鱼(guapote)、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、珍珠斑点鱼(pearlspot)、佩杰瑞鱼(pejerrey)、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼和白鱼)；以及甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。

动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于或打算用于由动物摄入的任何化合物、制剂或混合物。单胃动物的动物饲料典型地包含浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(如在预混物中)，而反刍动物的动物饲料通常包含草料(包括粗粮和青贮)，并且还可包含浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(如在预混物中)。

β-葡糖苷酶:术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。

出于本发明的目的，根据Venturi等人,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties[来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：生产、纯化以及一些生物化学特性],J.Basic Microbiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％

20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。

体重增加：术语“体重增加”意指在给定时间段期间动物的活重的增加，例如从第1天到第21天的体重增加。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，之后呈现为成熟的剪接的mRNA。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function ofcellobiohydrolases[晶态纤维素降解：纤维二糖水解酶功能的新认识],Trends inBiotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？[里氏木霉纤维二糖水解酶：为什么对晶态纤维素如此有效？],Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会学报]26:173-178)。

根据Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；vanTilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；和Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]170:575-581所述的程序确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等人的方法可以用于确定纤维二糖水解酶活性。

纤维素分解酶、纤维素分解组合物、或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”、“纤维素分解组合物”、或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等人,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies[纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略],2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481中综述。通常使用不溶性底物，包括Whatman№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常见的总纤维素分解活性测定是将Whatman№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC))(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学(PureAppl.Chem.)59:257-68)确立的。

通过测量在以下条件下由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g预处理的玉米秸秆(“PCS”)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO₄，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过

HPX-87H柱(美国加州赫拉克勒斯伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.))进行糖分析。

编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人,2006,Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。出于本发明的目的，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定内切葡聚糖酶活性。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据亨利萨特(Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(Aclassification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；和亨利萨特B.和贝洛赫(Bairoch)A.，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。

饲料转化率：术语“饲料转化率”是指用来将动物的体重增加一个指定量的喂给动物的饲料量。改进的饲料转化率意指较低的饲料转化率。“较低的饲料转化率”或“改进的饲料转化率”意味着当饲料不包含所述饲料添加剂组合物时，与以将动物体重增加到相同量所需的饲料量相比，在饲料中使用饲料添加剂组合物导致需要将更少量的饲料喂给动物，以将动物的体重增加一个指定量。

饲料效率：术语“饲料效率”意指当动物在一段时间内被任意喂养或喂养指定量的食物时每单位饲料的增重的量。“增加的饲料效率”意味着根据本发明的饲料添加剂组合物在饲料中的使用导致与不用所存在的所述饲料添加剂组合物喂养的动物相比，每单位饲料摄入的增加的增重。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽主要部分的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有酶活性。在一个方面中，片段含有酶的成熟多肽的至少85％，例如至少90％或至少95％的氨基酸残基。

葡糖淀粉酶(葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，EC 3.2.1.3)是催化末端(1→4)-连接的α-D-葡萄糖残基依次从链的非还原端水解并释放β-D-葡萄糖的一组酶。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解半纤维素材料的酶。参见例如，Shallom和Shoham,2003,Microbial hemicellulases[微生物半纤维素酶],Current Opinion In Microbiology[微生物学当前观点]6(3):219-228。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和线性多糖的异质群体，这些多糖经由氢与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合，从而将它们交联成稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以通过数字进行标记而被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的信息和更新的分类可在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中获得。在适当的温度下，例如，50℃、55℃、或60℃，可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chern.[纯粹与应用化学]59:1739-1752测量半纤维素分解酶活性。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全同一的任何亲本细胞子代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，基于预测SEQ ID NO:8的氨基酸1至26是信号肽的SignalP程序(Nielsen等人,1997,Protein Engineering[蛋白质工程]10:1-6)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸27至532。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:9的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸20至454。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:10的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:10的氨基酸20至863。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:11的氨基酸1至25是信号肽的SignalP程序，青霉属物种(Penicillium sp.)GH61多肽的成熟多肽是SEQ ID NO:11的氨基酸26至253。

在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞以不同的方式加工多肽，且因此表达多核苷酸的一种宿主细胞当与表达相同多核苷酸的另一种宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

营养素消化率：术语“营养素消化率”意指从胃肠道或胃肠道的指定区段(例如小肠)处消失的营养素的分数。营养素消化率可以测量为给予受试者的营养素与受试者粪便中所排出来的营养素之间的差值、或给予受试者的营养素与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养素之间的差值。

可以通过以下方式测量如本文所用的营养素消化率：在一段时间内营养素的摄入与通过排泄物的总收集获得的排泄的营养素之间的差值；或者使用惰性标记，该惰性标记不被动物吸收并且允许研究人员计算在整个胃肠道或胃肠道的区段中消失的营养素的量。这种惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为营养素在饲料中的百分比，或表示为可消化的营养素的质量单位/饲料中的营养素的质量单位。如本文所用的营养素消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

如本文所用的能量消化率意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)上的剩余消化物的总能量。

如本文所用的代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。能量消化率和代谢能可以测量为总能量的摄入与粪便中排泄的或胃肠道指定区段中存在的消化物中的总能量之间的差值，其使用与测量营养素消化率相同的方法，针对氮排泄进行适当校正以计算饲料的代谢能。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。

溶解的木聚糖百分比：术语“溶解的木聚糖百分比”意指在酶孵育之前存在于底物中的木糖的总量相比用酶孵育后在上清液中所测量的木糖的量。出于本发明的目的，溶解的木聚糖百分比可使用脱脂脱淀粉玉蜀黍(DFDSM)作为底物计算。DFDSM在实验部分中根据‘脱脂脱淀粉玉蜀黍(DFDSM)的制备’进行制备。可以如本文在“木糖溶解测定”中所描述的，使用20μg酶/g DFDSM的反应条件并在40℃，pH 5下孵育2.5小时来测定来自脱脂脱淀粉玉蜀黍(DFDSM)的溶解的木聚糖百分比。因此术语‘在20μg木聚糖酶变体/克脱脂脱淀粉玉蜀黍(DFDSM)的反应条件下并在40℃，pH 5下孵育2.5小时进行’被理解为如本文在‘木糖溶解测定’中的描述来计算溶解的木聚糖百分比。

在一个更详细的实施例中，在100mM乙酸钠，5mM CaCl₂，pH 5中制备2％(w/w)DFDSM悬浮液，并且允许在室温在温和搅拌下水合30min。水合后，将200μl底物悬浮液移液至96孔板中，并且将该悬浮液与20μl酶溶液混合以获得相对于底物的20PPM(20μg酶/g底物)的最终酶浓度。在平板培养箱中，在温和搅动(500RPM)下，将酶/底物混合物在40℃下于2.5h内静置用于水解。在酶水解后，将酶/底物板以3000RPM离心10min，并且将50μl上清液与100μl 1.6M HCl混合，并转移至300μl PCR管中，并在PCR仪中在90℃下静置酸水解持续40min。在酸水解后用125μl 1.4M NaOH中和样品，并且将这些样品加载到HPAE-PAD上用于单糖分析。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。出于本发明的目的，通过在以下条件下测量来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中的纤维素，其中总蛋白包括50％-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白和0.5％-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白，在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)以及pH(例如5.0或5.5)下，持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等总蛋白装载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)相比较。在一个方面中，将在2％-3％的总蛋白重量米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014，重组产生于米曲霉中)或2％-3％的总蛋白重量烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所描述中，重组产生于米曲霉中)的纤维素酶蛋白负载的存在下的

1.5L(诺维信公司，

丹麦)的混合物用作纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(例如，5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,同上)(例如，5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有酶或酶增强活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。

野生型木聚糖酶：术语“野生型”木聚糖酶意指由见于自然界中的一种天然存在的微生物(如细菌、酵母、或丝状真菌)表达的一种木聚糖酶。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切-1,4-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.136)，其催化一些葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4-β-D-木糖基键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃、在0.01％

X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-葡糖醛酸木聚糖作为底物来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-葡糖醛酸木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。

变体命名惯例

出于本发明的目的，使用SEQ ID NO:1来确定另一种木聚糖酶中相应的氨基酸残基。将另一种木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1进行比对，并基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular BiologyOpen Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(例如，5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于SEQ ID NO:1中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种木聚糖酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1794)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic Acids Research[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。

当其他酶与SEQ ID NO:1的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。

在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。

取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。

缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、^*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变.包括多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

发明说明

本发明涉及一种用于改进作为发酵产物生产方法的副产物而生产的干酒糟(DDG)或含可溶物的干酒糟(DDGS)的营养质量的方法，用于生产发酵产物的方法，以及在这些方法中使用的酶共混物。

DDGS典型地喂给牛，因为高纤维含量限制了单胃动物(例如，家禽和猪)的营养价值。因此，需要具体地改进DDGS对单胃动物的营养价值的解决方案。通过溶解部分纤维，可以增加对单胃动物而言的营养价值。一种溶解纤维的方案是将酶添加到该饲料共混物中，然而，较短的停留时间和不太理想的体内条件限制了添加到饲料中的酶的功效。

本文所述的工作证明，在发酵产物生产期间(例如，在同时糖化和发酵期间)在上游添加当前披露的木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物可显著增加纤维溶解程度。出乎意料地，作为附加的益处，当前披露的木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物显著增加了纤维溶解程度，在干燥方法期间不导致DDGS变黑。

I.酶共混物

本发明涵盖了在糖化、发酵、或同时糖化和发酵中单独使用木聚糖酶，以及使用在包含木聚糖酶和至少一种另外的酶(如纤维素分解组合物)的酶共混物中的木聚糖酶，以改进在常规和生淀粉水解(RSH)乙醇生产方法下游生产的DDGS的质量。在一方面，本发明涉及用于例如在发酵产物生产方法(例如，乙醇)的SSF步骤(或预糖化步骤)期间溶解纤维(例如，玉米纤维，例如，阿拉伯糖、木糖等)、优选地不导致作为发酵产物生产方法的副产物生产的DDG或DDGS变黑的木聚糖酶或包含木聚糖酶和/或纤维素分解组合物的酶共混物。当该纤维素分解组合物被包括在该共混物中时，木聚糖酶和纤维素分解组合物的比率可以被优化以增加任何特定底物(例如，玉米纤维)的纤维溶解并最小化或防止下游DDG或DDGS变黑。

在一方面，本发明涉及木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物。在一方面，本发明涉及木聚糖酶或包含木聚糖酶和纤维素分解组合物的酶共混物，其中在该共混物中木聚糖酶和纤维素分解组合物的比率为约5:95至约95:5。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为10:90。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为15:85。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为20:80。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为25:75。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为30:70。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为35:65。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为40:60。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为45:55。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为50:50。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为55:45。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为60:40。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为65:35。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为70:30。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为75:25。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为80:20。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为85:15。在一个实施例中，木聚糖酶与纤维素分解组合物的比率为90:10。

木聚糖酶

本发明涵盖了使用任何木聚糖酶，当其任选地与各种比率的纤维素分解组合物共混在一起时，能够在发酵产物生产方法(如尤其是乙醇)中溶解纤维(例如，阿拉伯糖、木糖等)，优选地在干燥后不导致该DDGS变黑。

在一个实施例中，该木聚糖酶来自分类目芽孢杆菌目(Bacillales)，或优选地分类科芽孢杆菌科(Bacillaceae)或类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)，或更优选地来自分类属芽孢杆菌属(Bacillus)或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，或甚至更优选地来自分类种枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或饲料类芽孢杆菌。在一个实施例中，该木聚糖酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、具有至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并获自或可获自分类目芽孢杆菌目，或优选地分类科芽孢杆菌科或类芽孢杆菌科，或更优选地来自分类属芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属，或甚至更优选地来自分类种枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或饲料类芽孢杆菌。在一个实施例中，该木聚糖酶是GH30亚家族8木聚糖酶(本文称作GH30_8木聚糖酶)。

该木聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，该多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，该木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一个实施例中，该木聚糖酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，是SEQ ID NO:1的片段，其中该片段具有木聚糖酶活性或包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列和多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-和/或C-末端延伸。

该木聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，该多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，该木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一个实施例中，该木聚糖酶包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成，是SEQ ID NO:2的片段，其中该片段具有木聚糖酶活性或包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列和多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-和/或C-末端延伸。

该木聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，该多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，该木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一个实施例中，该木聚糖酶包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成，是SEQ ID NO:3的片段，其中该片段具有木聚糖酶活性或包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列和多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-和/或C-末端延伸。

该木聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:4具有至少70％序列同一性，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，该多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，该木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:4相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一个实施例中，该木聚糖酶包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成，是SEQ ID NO:4的片段，其中该片段具有木聚糖酶活性或包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列和多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-和/或C-末端延伸。

该木聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:5具有至少70％序列同一性，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，该多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，该木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:5相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一个实施例中，该木聚糖酶包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成，是SEQ ID NO:5的片段，其中该片段具有木聚糖酶活性或包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列和多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-和/或C-末端延伸。

该木聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:6具有至少70％序列同一性，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，该多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，该木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:6相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一个实施例中，该木聚糖酶包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成，是SEQ ID NO:6的片段，其中该片段具有木聚糖酶活性或包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列和多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-和/或C-末端延伸。

该木聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:7具有至少70％序列同一性，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，该多肽具有木聚糖酶活性。在一方面，该木聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:7相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一个实施例中，该木聚糖酶包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成，是SEQ ID NO:7的片段，其中该片段具有木聚糖酶活性或包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-和/或C-末端延伸。

合适的木聚糖酶的其他实例是以下GENESEQP登录号：BCM03690、BBY25441、BBD43833、AZG87760、BBW75090、BCM03682、BBW96675、BCM03671、ADJ35022、BBW83525、BCM03685、BBW88031、BCM03707、AZH70238、AZG87766、BBX36748、BCM03686、AZQ23477、BCM03677、BCM03691、BCM03681、BCM03676、BCM03688、AZG68558、ADJ35028、BCM03687、BBG80964、AZX66647、AZH70244、BCM03689、AZM95903、BBW79314、BBX47049、BCM03683、BCM03679、BBW95840、BBX52401、BBW92246、BBX42063和AZG68552。

合适的木聚糖酶的其他实例是以下Uniprot登录号：A0A016QIT0、A0A024BEN2、A0A059N8P2、A0A060J1Q4、A0A060J3N3、A0A060MDP8、A0A063XEB2、A0A063Z3F5、A0A066ZQH2、A0A068QG80、A0A069DJA1、A0A074QA16、A0A076GH62、A0A076X095、A0A080UGI0、A0A081DRH7、A0A081L9P3、A0A085CCQ4、A0A086DRT4、A0A086SGC4、A0A086WWT9、A0A089J0T9、A0A089L7Q4、A0A089LS30、A0A089MA96、A0A089MMY5、A0A090ZY18、A0A093UG96、A0A097RET6、A0A097RT57、A0A0A0TJX0、A0A0A0TS05、A0A0A1STB1、A0A0A7GLZ8、A0A0A8C3V5、A0A0B0QGI0、A0A0B4S841、A0A0C2TMZ1、A0A0C5CYD2、A0A0D7XHL0、A0A0D7XPV8、A0A0D8JJW7、A0A0E1LNG3、A0A0E1P2T5、A0A0F5MCQ0、A0A0F5YUV2、A0A0G2M1V3、A0A0G2Z099、A0A0G3VDP8、A0A0H1RW51、A0A0H3DZC9、A0A0J1HNE5、A0A0J1I8S6、A0A0J5XBB3、A0A0J6E3H1、A0A0J6ENY2、A0A0J6MZ81、A0A0J6PTT5、A0A0K0HYL4、A0A0K6JZ62、A0A0K6L1E5、A0A0K6L5C0、A0A0K6LRC5、A0A0K6MBZ9、A0A0K9EI79、A0A0K9G2M8、A0A0L6C9N3、A0A0L7MT05、A0A0L7SGL4、A0A0M0HBT0、A0A0M2EI36、A0A0M2S6E2、A0A0M9X369、A0A0P0TKN9、A0A0P7GC51、A0A0Q3W7T1、A0A0Q4R8I7、A0A0Q7SDS0、A0A0R3K873、A0A0T6LD54、A0A0U3M226、A0A0U5Q000、A0A0V8QN06、A0A0V8QPQ0、A0A0V8RCK0、A0A0W1Q0Y8、A0A0W7XI48、A0A0W8K830、A0A0X1TCR2、A0A0X8C7K8、A0A0X8DHN5、A0A0X8KDH2、A0A101YC92、A0A101YL97、A0A117SZP6、A0A124JQM2、A0A125UIF6、A0A127DQZ4、A0A132BP80、A0A132TGU4、A0A132TSQ5、A0A136AEB9、A0A142F586、A0A150L2Y6、A0A160EHD0、A0A164XMN2、A0A172HNW1、A0A172XIR5、A0A199NI63、A0A199WHT5、A0A1A0CC44、A0A1A0G7Q3、A0A1A5VV23、A0A1A5YLD9、A0A1A7LKF3、A0A1B2AW76、A0A1C3SIT4、A0A1C4AHG6、A0A1D9PK78、A0A1E4Y0F1、A0A1G9MAD1、A0A1J0BBP6、A0A1J0C7I7、A0A1J5WRC5、A0A1J6F1D5、A0A1K1TBA7、A0A1L3PT45、A0A1L3QYI6、A0A1L3SH52、A0A1L4DM20、A0A1L5LNU4、A0A1L6CEM3、A0A1L6ZLN8、A0A1L6ZTD9、A0A1M7SMM4、A0A1N6S500、A0A1N7B930、A0A1N7E7E0、A0A1R1E8G3、A0A1R1ESJ7、A0A1R1FQ77、A0A1R1GBK8、A0A1R1GT02、A0A1R1HH77、A0A1S2F2R2、A0A1U3ULV5、A7Z5A1、A8FDV2、B3KF38、D1MEP8、D3EH02、D4FXC2、E0RDU2、E1ACF9、E1UV03、E3E322、E8VJ45、F4E4B0、F4EKU6、G0IKW9、G4EVQ6、G4HGL4、G4P7F1、G7W2J1、H0FNN1、H1ACZ7、H2AJ54、H3K352、H6CPJ0、H6WCZ0、H8XMR3、I4XB64、J0X3V6、J7JVZ4、K2HJT3、K2P3H7、L0BLZ3、L0CY72、L8AKB2、M1KJT1、M1U2J5、M1XAU4、M2U9N8、N0DFI8、Q45070、Q6YK37、Q70K02、R9TYN3、S6FS40、S6FXS9、U1T362、U1ZC44、U2TM90、U4PL99、U5X5B8、V5MRU9、V7Q6M1、V9REY3、W4AZH7、W4BXI4、W4C6X9、W4D801、W4DEL3、W8ILG7以及W9TFT6。

在一个实施例中，该木聚糖酶包含变体木聚糖酶，其具有在EP申请号17177304.7(其通过引用以其整体并入本文)中所述的一个或多个取代。

在一个实施例中，该木聚糖酶包含变体木聚糖酶，其具有在国际专利申请号PCT/EP2017/065336(其通过引用以其整体并入本文)中所述的一个或多个取代。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该木聚糖酶可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽还可包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。

该木聚糖酶可以获自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文中与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如具有木聚糖酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽。在一个实施例中，该多肽是来自芽孢杆菌纲(Bacilli)的细菌，如来自芽孢杆菌目，或优选地分类科芽孢杆菌科或类芽孢杆菌科，或更优选地来自分类属芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属，或甚至更优选地来自分类种枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或饲料类芽孢杆菌。

在一方面，该木聚糖酶是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)木聚糖酶。

在优选的方面，该木聚糖酶是枯草芽孢杆菌木聚糖酶，例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的木聚糖酶。

应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该木聚糖酶。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。

在一个实施例中，该木聚糖酶是芽孢杆菌属GH30_8木聚糖酶。在本发明的酶共混物和方法中使用的示例性GH30_8木聚糖酶包括来自拟杆菌属(Bacteroides)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、梭菌属、孢囊杆菌属(Cystobacter)、芽孢杆菌属、迪卡氏菌属(Dickeya)、丝状杆菌属(Fibrobacter)、土芽孢杆菌属、根结线虫属(Meloidogyne)、小单孢菌属(Micromonospora)、黏液杆菌属(Mucilaginibacter)、类芽孢杆菌属、沼杆菌属(Paludibacter)、穿孔线虫属(Radopholus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)、链霉菌属、疣孢菌属(Verrucosispora)、和黄单胞菌属(Xanthomonas)的分类属的那些。

在一个实施例中，该木聚糖酶是GH30_8木聚糖酶，其选自下组，该组由以下组成：(i)SEQ ID NO:1的枯草芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(ii)SEQ ID NO:2的枯草芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(iii)SEQ ID NO:3的枯草芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(iv)SEQ ID NO:4的解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(v)SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；

(vi)SEQ ID NO:6的地衣芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该地衣芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；和(vii)SEQ IDNO:2的饲料类芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该饲料类芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自梭菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，例如：(i)丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQID NO:1的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:1的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:36的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:36的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:37的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:37的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(ii)溶纸梭菌(Clostridium papyrosolvens)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:2的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:2的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:17的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:17的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(iii)热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:10的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:10的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(iv)糖全丁基丙酮梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:11的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:11的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:15的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:15的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或在US2016/040203中披露为SEQ IDNO:35的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:35的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或(v)梭菌属物种(Clostridiumsp.)DL-VIII木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:10的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:10的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自拟杆菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如克拉丽丝拟杆菌(Bacteroides clarus)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:29的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:29的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自纤维弧菌属(Cellvibrio)的菌株的GH30_8木聚糖酶，如日本纤维弧菌(Cellvibrio japonicas)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:9的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:9的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自孢囊杆菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如深褐孢囊杆菌(Cystobacter fuscus)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:7的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:7的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自芽孢杆菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，例如：(i)解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:25的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:25的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(ii)萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:20的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:20的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(iii)地衣芽孢杆菌木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:24的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:24的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(iv)短小芽孢杆菌木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:22的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:22的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:23的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:23的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(v)同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:21的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQID NO:21的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；(vi)枯草芽孢杆菌木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:5的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:5的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或(vii)厦门芽孢杆菌(Bacillus xiamenensis)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:19的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:19的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自迪卡氏菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如菊迪卡氏菌(Dickeya chrysanthemi)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:31的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:31的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自丝状杆菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQID NO:26的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:26的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自土芽孢杆菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如土芽孢杆菌属物种木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:16的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:16的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自根结线虫属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如南方根结线虫(Meloidogyne incognita)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:32的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:32的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自小单孢菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如(i)羽扇豆小单孢菌(Micromonospora lupini)菌株木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:18的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:18的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或(ii)小单孢菌属物种木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:28的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:28的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自黏液杆菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如梭状冻胶样杆菌(Mucilaginibacter paludis)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQID NO:4的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:4的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；或在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:30的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:30的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自类芽孢杆菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如类芽孢杆菌属物种木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:13的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:13的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自沼杆菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如产丙酸沼杆菌(Paludibacter propionicigenes)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQID NO:3的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:3的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自穿孔线虫属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如相似穿孔线虫(Radopholus similis)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:33的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:33的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自瘤胃球菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如瘤胃球菌属物种木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:12的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:12的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自沙雷氏菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如沙雷氏菌属物种E-15木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:6的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:6的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自链霉菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ IDNO:14的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:14的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自疣孢菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如玛丽疣孢菌(Verrucosispora marie)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:27的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:27的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶是来自黄单胞菌属的菌株的GH30_8木聚糖酶，如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)木聚糖酶，如在US2016/040203中披露为SEQ IDNO:8的一种或其变体，该变体与在US2016/040203中披露为SEQ ID NO:8的一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

在一个实施例中，该木聚糖酶不是GH10木聚糖酶。在一个实施例中，该木聚糖酶不是GH11木聚糖酶。

在一个实施例中，该木聚糖酶，例如GH30木聚糖酶，如尤其GH30_8木聚糖酶，例如SEQ NO:1-7的GH30_8木聚糖酶或其变体，以0.0001-1mg EP(酶蛋白)/g DS之间，例如0.0005-0.5mg EP/g DS，如0.001-0.1mg EP/g DS的浓度在预糖化、糖化、和/或同时糖化和发酵中给予。

纤维素分解组合物

本发明涵盖了使用任何纤维素分解组合物，当其与各种比率的木聚糖酶共混在一起时，能够在发酵产物生产方法(如尤其乙醇)中溶解纤维(例如，阿拉伯糖、木糖等)，在干燥后不导致该DDGS变黑。用于生产发酵产物的本发明的酶共混物或方法中使用的纤维素分解组合物可以源自任何微生物。如本文所用，“源自任何微生物”意指该纤维素分解组合物包含一种或多种在微生物中表达的酶。例如，源自里氏木霉的菌株的纤维素分解组合物意指该纤维素分解组合物包含一种或多种在里氏木霉中表达的酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自曲霉属的菌株，如黄曲霉、黑曲霉或米曲霉的菌株。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自青霉属的菌株，如埃默森青霉菌或草酸青霉菌的菌株。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自篮状菌属的菌株，如金黄篮状菌或埃默森篮状菌的菌株。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自里氏木霉的菌株。在一个优选的实施例中，该里氏木霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个优选的实施例中，该里氏木霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

在另一个优选的实施例中，该里氏木霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、或至少三种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)β-葡糖苷酶；和(iii)内切葡聚糖酶。在另一个优选的实施例中，该里氏木霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、或至少三种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iii)里氏木霉内切葡聚糖酶。

在又另一个优选的实施例中，该里氏木霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ ID NO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；以及(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该里氏木霉纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自黄曲霉的菌株。在一个优选的实施例中，该黄曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个优选的实施例中，该黄曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

在又另一个优选的实施例中，该黄曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ IDNO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；以及(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该黄曲霉纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自黑曲霉的菌株。在一个优选的实施例中，该黑曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个优选的实施例中，该黑曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

在又另一个优选的实施例中，该黑曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ IDNO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；以及(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该黑曲霉纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自米曲霉的菌株。在一个优选的实施例中，该米曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个优选的实施例中，该米曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

在又另一个优选的实施例中，该米曲霉纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ IDNO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；以及(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该米曲霉纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自埃默森青霉菌的菌株。在一个优选的实施例中，该埃默森青霉菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个优选的实施例中，该埃默森青霉菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

在又另一个优选的实施例中，该埃默森青霉菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ ID NO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；以及(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该埃默森青霉菌纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自草酸青霉菌的菌株。在一个优选的实施例中，该草酸青霉菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个优选的实施例中，该草酸青霉菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

在又另一个优选的实施例中，该草酸青霉菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ ID NO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；以及(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该草酸青霉菌纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自金黄篮状菌的菌株。在一个优选的实施例中，该金黄篮状菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个优选的实施例中，该金黄篮状菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

在又另一个优选的实施例中，该金黄篮状菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ ID NO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；以及(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该金黄篮状菌纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自埃默森篮状菌的菌株。在一个优选的实施例中，该埃默森篮状菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)纤维二糖水解酶I；(ii)纤维二糖水解酶II；(iii)β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一个优选的实施例中，该埃默森篮状菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

在又另一个优选的实施例中，该埃默森篮状菌纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ ID NO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；以及(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在一个实施例中，该埃默森篮状菌纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

该纤维素分解组合物还可包含多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含一种或多种如本文披露的配制剂，优选一种或多种选自以下列表的化合物，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土和纤维素。

在一个实施例中，将例如源自曲霉属、青霉属、篮状菌属、或木霉属的菌株的纤维素分解组合物，如里氏木霉纤维素分解组合物，以0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mgEP/g DS，优选0.001-1mg/g DS，更优选0.005-0.5mg EP/g DS，甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS的浓度在预糖化、糖化、和/或同时糖化和发酵中给予。

II.用于生产发酵产物的方法

本发明还涉及使用发酵生物从含淀粉材料生产发酵产物的方法，其中在发酵之前和/或期间添加木聚糖酶或包含木聚糖酶和任选地纤维素分解组合物(例如，源自里氏木霉)的酶共混物。本领域技术人员将理解，以上部分I中所述的或本文另外描述的任何木聚糖酶或酶共混物可用于本发明的方法(包括部分II的方法)中。

由含经未经糊化的淀粉的材料生产发酵产物的工艺

在一方面，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物而不使该含淀粉材料糊化(即，不蒸煮)的方法(常常被称作“生淀粉水解”方法)，其中添加当前披露的木聚糖酶或包含木聚糖酶和纤维素分解组合物(例如，源自里氏木霉)的酶共混物。可在不使包含含淀粉材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉的材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)，优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。

因此，在一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下，在本发明的木聚糖酶或酶共混物的存在下，使用产碳水化合物源的酶和发酵生物将含淀粉材料同时糖化和发酵。该方法中使用的示例性木聚糖酶和酶共混物描述于以上称为“酶共混物”的部分I中。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)在低于初始糊化温度的温度处使用产碳水化合物源的酶(例如葡糖淀粉酶)糖化含淀粉材料；以及

(ii)使用发酵生物进行发酵；

其中使用本发明的至少一种葡糖淀粉酶和至少一种木聚糖酶或酶共混物进行步骤(i)和/或(ii)。在一个实施例中，回收该方法的副产物。与通过类似的其中不存在木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物，或未将木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物添加到预糖化、糖化、发酵、或同时糖化和发酵中的方法生产的副产物相比，该副产物可以具有改进的营养质量。在一个实施例中，该副产物是DDG或DDGS。在一个实施例中，与通过类似的其中不存在木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物，或未将木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物添加到预糖化、糖化、发酵、或同时糖化和发酵中的方法生产的DDG或DDGS相比，该DDG或DDGS具有增加的TME，例如，对于单胃动物而言。

在一个实施例中，在糖化步骤(i)期间添加本发明的木聚糖酶或至少一种酶共混物。在一个实施例中，在发酵步骤(ii)期间添加本发明的木聚糖酶或至少一种酶共混物。

在一个实施例中，在步骤(i)中还添加α淀粉酶，特别是真菌阿尔法淀粉酶。可以同时进行步骤(i)和(ii)。在一个实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)期间添加本发明的木聚糖酶或至少一种酶共混物。在一个实施例中，该发酵生物是酵母，并在酵母繁殖期间添加木聚糖酶或至少一种酶共混物。

由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法

在一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；

(b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；以及

(c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将该糖发酵；其中在步骤(c)之前或期间添加本发明的木聚糖酶或至少一种酶共混物。在一个实施例中，回收该方法的副产物。与通过类似的其中不存在木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物，或未将木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物添加到预糖化、糖化、发酵、或同时糖化和发酵中的方法生产的副产物相比，该副产物可以具有改进的营养质量。在一个实施例中，该副产物是DDG或DDGS。在一个实施例中，与通过类似的其中不存在木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物，或未将木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物添加到预糖化、糖化、发酵、或同时糖化和发酵中的方法生产的DDG或DDGS相比，该DDG或DDGS具有增加的TME，例如，对于单胃动物而言。

将浆料加热至高于糊化温度并且可添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，该浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以进行喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。在一个实施例中，液化可作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6，特别是在pH 4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间，优选70℃-90℃之间，如优选80℃-85℃之间，并且添加α-淀粉酶变体，任选地连同蛋白酶、产碳水化合物源的酶(如葡糖淀粉酶)、磷脂酶、植酸酶、和/或普鲁兰酶，以开始液化(稀释)。通常在pH 4-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，完全糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在30℃到65℃之间的温度处，典型地约60℃处进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、特别是从40℃-70℃，典型地约60℃的温度处并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度处执行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。

含淀粉材料

可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉材料还可以是蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。在一个优选的实施例中，该含淀粉材料是玉米。在一个优选的实施例中，该含淀粉材料是小麦。

发酵产物

术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产物。发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选的实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。在一个实施例中，该发酵产物是乙醇。

发酵生物

术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，如酵母和丝状真菌。适合的发酵生物能够将可发酵糖(如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。

发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母菌(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；毕赤酵母属(Pichia)的菌株，特别是树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、假热带假丝酵母(Candida tropicalis)、或产朊假丝酵母(Candida utilis)。其他发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)的菌株，特别是异常汉逊酵母(Hansenula anomala)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的菌株，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的菌株，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

在一个实施例中，该发酵生物是C6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。

在一个实施例中，该发酵生物是C5糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。

发酵

基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵糖、一种或多种发酵生物和/或所希望的发酵产物确定发酵条件。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的发酵条件。发酵可以在常规使用的条件下进行。优选的发酵过程是厌氧过程。

例如，发酵可以在高达75℃，例如40℃-70℃之间，如50℃-60℃之间的温度处进行。然而，还已知的是细菌具有低至室温左右(20℃左右)的显著较低的最适温度。适合的发酵生物的实例可以发现于上面的“发酵生物”部分中。

对于使用酵母生产乙醇，发酵可以持续24至96小时，特别是持续35至60小时。在一个实施例中，在20℃至40℃，优选26℃至34℃之间，特别是32℃左右的温度处进行发酵。在一个实施例中，pH是从pH 3至6，优选pH 4至5左右。

发酵产物的回收

发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。典型地，获得具有高达例如约96vol.％的纯度的发酵产物，例如，乙醇。

因此，在一个实施例中，本发明的方法还包括蒸馏以获得发酵产物，例如，乙醇。该发酵和蒸馏可以同时和/或分别/顺序进行；任选地，随后是用于进一步精制该发酵产物的一个或多个方法步骤。

蒸馏方法完成后，剩余材料被视为全酒糟。如本文所用，术语“全酒糟”包括在发酵产物例如乙醇的回收之后在蒸馏方法结束时保留的材料。任选地可以通过本领域已知的任何方法回收该发酵产物。

将全酒糟分离(脱水)为酒糟水和湿饼

在一个实施例中，通过一种或多种将酒糟水与湿饼分离的方法，将该全酒糟分离或分配成固相和液相。将全酒糟分离为酒糟水和湿饼，以去除很大一部分的液体/水，可以使用任何适合的分离技术(包括离心、压榨和过滤)来实现。在一个优选实施例中，通过离心进行分离/脱水。在工业中，优选的离心机是沉降式离心机，优选高速沉降式离心机。适合的离心机的一个实例是来自阿法拉伐公司(Alfa Laval)的NX 400陡锥系列，它是高性能沉降器。在另一个优选实施例中，使用其他常规分离设备(如板/框压滤机、带压滤机、螺旋压榨机、重力浓缩机和脱水机)或类似设备来进行分离。

酒糟水的加工

酒糟水是用于全酒糟离心的上清液的术语。典型地，该酒糟水包含4％-6％的干固体(DS)(主要是蛋白质、可溶性纤维、细纤维、和细胞壁组分)，并且温度为约60℃-90℃。该酒糟水流可以通过蒸发进行冷凝，以提供两种工艺流，包括：(i)蒸发器冷凝流，其包含在蒸发期间从该酒糟水中去除的冷凝水，和(ii)浆料流，其包含更浓缩的非挥发性溶解的和未溶解的固体流，如由于去除了蒸发的水而从酒糟水中剩余下来的不可发酵糖和油。任选地，可从该酒糟水中去除油，或者可以作为蒸发方法的中间步骤去除油，该蒸发方法典型地使用一系列的若干个蒸发阶段进行。可以将浆料和/或脱油浆料与湿谷粒(来自全酒糟分离步骤)一起引入干燥器中，以提供被称作含可溶物的干酒糟的产物，其也可用作动物饲料。

在一个实施例中，将浆料和/或脱油浆料喷入一个或多个干燥器中，以将该浆料和/或脱油浆料与全酒糟合并，以生产含可溶物的干酒糟。

可以将5vol-％-90vol-％之间，如10％-80％之间，如15％-70％之间，如20％-60％之间的酒糟水(例如，任选地水解的)再循环(作为逆流)到步骤(a)。该再循环的酒糟水(即，逆流)可以占步骤(a)中形成的浆料的约1vol.-％-70vol.-％，优选15vol.-％-60vol.-％，尤其是从约30vol.-％至50vol.-％。

在一个实施例中，该方法还包括任选地在已经从该酒糟水流中提取油之后，将该酒糟水流的至少一部分再循环到该浆料中。

湿饼的干燥以及干酒糟和含可溶物的干酒糟的生产

在已经从酒糟水分离含约25wt-％-40wt-％、优选30wt-％-38wt-％干固体的湿饼后(例如，脱水)，可以在转鼓式干燥机、喷雾干燥机、环式干燥机、流化床干燥机等上将其干燥，以生产“干酒糟”(DDG)。DDG是用于动物(如家畜、家禽和鱼)的有价值饲料成分。优选以小于约10-12wt.-％湿度的含量提供DDG，以避免发霉和微生物分解并且增加保质期。另外，高含湿量还使得运输DDG更昂贵。优选在不变性湿饼中的蛋白质的条件下干燥湿饼。湿饼可以与分离自酒糟水的浆料共混，并且被干燥为含可溶物的干酒糟(DDGS)。可以通过部分干燥湿饼，任选地在干燥方法之前、期间或之后添加浆料来生产部分干燥的中间产物，如有时被称作经修饰的湿酒糟。III.用于改进DDG或DDGS的营养质量的方法

在另一方面，本发明涉及一种用于改进作为发酵产物生产方法的副产物而生产的干酒糟(DGS)或含可溶物的干酒糟(DDGS)的营养质量的方法。

在一个实施例中，用于改进作为发酵产物生产方法的副产物而生产的DGS或DDGS的营养质量的方法包括进行以上部分II(例如，包括液化步骤的RSH方法或常规蒸煮方法)或本文的实例中所述的用于生产发酵产物的方法，并回收该发酵产物以生产作为副产物的DGS或DDGS，其中生产的DGS或DDGS具有改进的营养质量。回收该发酵产物以生产作为副产物的DGS或DDGS的步骤可以包括上述回收一种或多种发酵产物的步骤中的任何一个或组合，例如通过蒸馏，以产生全酒糟，将全酒糟分离为湿饼和酒糟水，酒糟水的加工，湿饼的干燥和生产DDG或DDGS等。

如本文所用，“改进的营养质量”意指与发酵产物生产方法(例如，在部分II或本文实例中所阐述的RSH方法或包括液化步骤的常规蒸煮方法)(其中在预糖化、糖化、发酵、和/或同时糖化和发酵期间未添加当前披露的木聚糖酶或酶共混物)中生产的DDG或DDGS相比，DDG或DDGS的真代谢能(TME)增加至少5％。

在一个实施例中，与发酵产物生产方法(例如，在部分II或本文实例中所阐述的RSH方法或包括液化步骤的常规蒸煮方法)(其中在预糖化、糖化、发酵、和/或同时糖化和发酵期间未添加当前披露的木聚糖酶或酶共混物)中生产的DDG或DDGS相比，本发明的酶共混物和方法使该DDG或DDGS的TME增加至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、或至少30％。

在一个实施例中，本发明的木聚糖酶或酶共混物和方法改进了DDG或DDGS的营养质量，在干燥后不导致该DDG或DDGS变黑。本领域技术人员将理解，在发酵产物生产方法中(例如，在使用玉米醪底物生产乙醇的SSF期间)，在添加本发明的木聚糖酶或酶共混物之后，在干燥后该DDG或DDGS的变黑程度可容易地评估，例如，通过使用Hunter色标测量该DDG或DDGS颜色(参见本文实例)。

酶

下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的共混物或方法中。下文应在上文的“定义”部分中的酶披露的背景下加以阅读。

用于本发明的酶共混物或者工艺和方法中的纤维素分解组合物

本发明的用于生产发酵产物的方法中使用的纤维素分解组合物可以源自任何微生物。如本文所用，“源自任何微生物”意指该纤维素分解组合物包含一种或多种在微生物中表达的酶。例如，源自里氏木霉的菌株的纤维素分解组合物意指该纤维素分解组合物包含一种或多种在里氏木霉中表达的酶。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自里氏木霉的菌株。

该纤维素分解组合物可以包括以下多肽(包括酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI和CBHII、或其中两种、三种、或四种的混合物。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，其相对ED50负载值小于1.00，优选小于0.80，如优选小于0.60，如在0.1-0.9之间，如在0.2-0.8之间，如0.30-0.70。

该纤维素分解组合物可以包含一些半纤维素酶，例如像木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。该半纤维素酶可以来自生产纤维素分解组合物的生物或其他来源，例如，该半纤维素酶可以对生产纤维素分解组合物的生物例如像里氏木霉而言是外源的。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量小于10wt.％，如小于纤维素分解组合物的5wt.％。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶和CBH。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及CBHI。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶和CBHI。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI以及CBHII。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、CBHI、和CBHII。

该纤维素分解组合物还可以包含选自由以下组成的组的一种或多种酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。

在一个实施例中，该纤维素酶是选自由以下组成的组的一种或多种酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶I。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶II。

β-葡糖苷酶

在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种β-葡糖苷酶。在一个实施例中，该β-葡糖苷酶可以是源自曲霉属的菌株的一种，如源自米曲霉的，如在WO 2002/095014中披露的一种或在WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或源自烟曲霉的，如在WO 2005/047499或本文的SEQ ID NO:10中披露的一种或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，如在WO 2012/044915或共同未决的PCT申请PCT/US11/054185(或美国临时申请号61/388,997)中披露的一种，如具有以下取代的一种：F100D、S283G、N456E、F512Y。

在另一个实施例中，该β-葡糖苷酶源自青霉属的菌株，如披露于WO 2007/019442中的巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，β-葡糖苷酶是选自由以下组成的组的烟曲霉β-葡糖苷酶或其同系物：

(i)β-葡糖苷酶，其包含SEQ ID NO:10的成熟多肽；

(ii)β-葡糖苷酶，其包含与本文的SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；

(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；以及

(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。

在一个实施例中，β-葡糖苷酶是一个变体，该变体在对应于本文的SEQ ID NO:10的成熟多肽的位置100、283、456以及512的一个或多个(若干个)位置处包括取代，其中该变体具有β-葡糖苷酶活性。

在一个实施例中，该变体的亲本β-葡糖苷酶是(a)包含本文的SEQ ID NO:10的成熟多肽的多肽；(b)与本文的SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(c)多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在高或非常高严格条件下与以下杂交：(i)WO2013/148993中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)WO 2013/148993中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(d)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与WO 2013/148993中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％同一性；或(e)本文的SEQ ID NO:10的成熟多肽的片段，该片段具有β-葡糖苷酶活性。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％序列同一性。

在一个实施例中，该变体与本文的SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％序列同一性。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如烟曲霉β-葡糖苷酶(本文的SEQ ID NO:10)，其包括一个或多个选自由以下组成的组的取代：L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E、和F512Y；如其变体，具有以下取代：

-F100D+S283G+N456E+F512Y；

-L89M+G91L+I186V+I140V；

-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。

在一个实施例中，取代的数目在1与4之间，如1、2、3或4个取代。

在一个实施例中，变体在对应于位置100的位置处包括取代、在对应于位置283的位置处包括取代、在对应于位置456的位置处包括取代和/或在对应于位置512的位置处包括取代。

在一个优选的实施例中，该β-葡糖苷酶变体包括以下取代：本文的SEQ ID NO:10中的Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。

在一个优选的实施例中，该β-葡糖苷酶的相对ED50负载值小于1.00，优选小于0.80，如优选小于0.60，如在0.1-0.9之间，如在0.2-0.8之间，如0.30-0.70。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽

在一个实施例中，根据本发明所使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在一个实施方案中，所述酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)，如桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株的一种，如作为SEQ ID NO:2描述于WO 2005/074656中的一种；或源自梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的一种，如WO 2005/074647中作为SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8描述的一种；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的一种，如WO2010/138754中作为SEQ ID NO:2描述的多肽；或源自青霉属的菌株，如埃默森青霉菌的菌株的一种，如在WO 2011/041397中披露的或本文的SEQ ID NO:11的一种。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽或其同系物选自下组，该组由以下组成：

(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含本文的SEQ ID NO:11的成熟多肽；

(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含与本文的SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；

(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；以及

(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。

纤维二糖水解酶I

在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种CBHI(纤维二糖水解酶I)。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBHI)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如在WO 2011/057140中披露的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:8的Cel7A CBHI，或源自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同系物选自下组，该组由以下组成：

(i)包含本文的SEQ ID NO:8的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；

(ii)纤维二糖水解酶I，其包含与本文的SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；

(iii)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶I，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；以及

(iv)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶I，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。

纤维二糖水解酶II

在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种CBHII(纤维二糖水解酶II)。在一个实施例中，纤维二糖水解酶II(CBHII)是如源自以下项的纤维二糖水解酶II：曲霉属种的菌株(如烟曲霉的菌株)，如本文的SEQ ID NO:9中的纤维二糖水解酶II，或木霉属种的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳霉属种的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同系物选自下组，该组由以下组成：

(i)包括本文的SEQ ID NO:9的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；

(ii)纤维二糖水解酶II，其包含与本文的SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；

(iii)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶II，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；以及

(iv)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶II，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。

纤维素分解组合物

如以上提及的，该纤维素分解组合物可以包括多种不同的多肽(如酶)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括里氏木霉纤维素分解组合物，该组合物还包括具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，还包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，还包含在WO 2011/041397中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。

本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。

该酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，将液体酶组合物稳定化。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物(即，在步骤ii)的糖化和/或步骤iii)的发酵或SSF过程中)从0.0001-3mg EP/g DS、优选地0.0005-2mg EP/g DS、优选地0.001-1mg/gDS、更优选的从0.005-0.5mg EP/g DS、甚至更优选的0.01-0.1mg EP/g DS剂量添加。

液化过程中存在的和/或添加的α-淀粉酶

根据本发明，在液化中，α-淀粉酶任选地与半纤维素酶、内切葡聚糖酶、蛋白酶、产碳水化合物源的酶(如葡糖淀粉酶)、磷脂酶、植酸酶、和/或普鲁兰酶一起存在和/或添加。

在液化步骤i)过程中添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，如尤其是芽孢杆菌α-淀粉酶，如在液化过程中使用的温度是稳定的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。

细菌α-淀粉酶

术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在一个实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、芽孢杆菌属TS-23、或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可源自其他芽孢杆菌属物种。

细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:12的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、和WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、以及WO 2009/061380中披露为SEQ ID NO:1的芽胞杆菌属物种TS-23α-淀粉酶(所有序列都通过引用特此并入)。

在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶可为分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5以及WO 2009/061380中的SEQ ID NO:1所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。

在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ ID NO:12所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在C-末端截短的，所以它是约491个氨基酸长(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:12比较)，如从480至495个氨基酸长。

该芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、WO 02/10355以及WO 2009/061380(所有文件都通过引用特此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中披露(通过引用特此并入)并包括具有以下情况的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179、G180、I181和/或G182的任何一处的一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失–参见例如第20页，第1-10行(通过引用特此并入)，优选与WO 99/19467中披露的SEQID NO:3所阐述的或本文的SEQ ID NO:12的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:12的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌(BSG)α-淀粉酶，其与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3所阐述的或本文的SEQ IDNO:12的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比在对应于位置R179、G180、I181和G182具有一个或两个氨基酸缺失，优选地其对应于R179和G180具有双缺失，或优选地位置181和182的缺失(被表示为I181*+G182*)，并且任选地，还包含N193F取代(被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体或本文的SEQ ID NO:12中的S239的位置处具有取代。

在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q或A变体(使用本文的SEQ ID NO:12进行编号)。

在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，优选E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:12进行编号)。

其他涵盖的变体是WO 2009/061380中披露的芽孢杆菌属物种TS-23变体，尤其是WO 2009/061380的权利要求1中定义的变体(通过引用特此并入)。

细菌杂合α-淀粉酶

该细菌α-淀粉酶也可为杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，该杂合体具有下列取代中的一个或多个，尤其是全部：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。

在一个实施例中，该细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，其披露于Richardson等人,2002,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]277(29):.267501-26507，被称作BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQ IDNO:2所示的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。

热稳定的α-淀粉酶

根据本发明，任选地将α-淀粉酶与具有大于80℃的熔点(DSC)的半纤维素酶(优选是木聚糖酶)组合使用。任选地，可以包括具有大于70℃、如大于75℃、特别是大于80℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶。热稳定的α-淀粉酶(如细菌α-淀粉酶)优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌或芽孢杆菌属物种TS-23。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少10的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少15的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少20的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少25的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少30的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少40的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少50的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少60的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在10-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在15-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在20-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在25-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在30-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl₂下具有在40-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在50-70之间的T1/2(min)。在一个实施例中，该α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在60-70之间的T1/2(min)。

在一个实施例中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选地源自芽胞杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌，如在WO 99/19467中披露为SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:12，其中在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸缺失，特别是R179和G180缺失、或具有I181和G182缺失，具有如下突变列表中的突变。在优选的实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，任选地进一步包括选自以下列表的突变：

在一个实施例中，α-淀粉酶选自以下嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：

-I181*+G182*；

-I181*+G182*+N193F；

优选地

-I181*+G182*+E129V+K177L+R179E；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:12用于编号)。

在一个实施例中，细菌α-淀粉酶(如芽孢杆菌α-淀粉酶，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)与本文的SEQ ID NO:12的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。

在一个实施例中，细菌α-淀粉酶变体(如芽孢杆菌α-淀粉酶变体，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体)与本文的SEQ ID NO:12的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％同一性。

应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式自然地产生。特别地，截短是这样的，使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:12中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地是约491个氨基酸长，如从480至-495个氨基酸长。

在液化过程中存在的和/或添加的热稳定的半纤维素酶

根据本发明，具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)与α-淀粉酶(如细菌α-淀粉酶(以上描述的))组合存在于和/或被添加至液化步骤i)中。

半纤维素酶(优选地木聚糖酶)的热稳定性可以如“材料与方法”部分“通过差示扫描量热法测定T_d对内切葡聚糖酶和半纤维素酶的测定”中所述测定。

在一个实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10或GH11木聚糖酶具有大于82℃，如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如大于88℃、如大于90℃、如大于92℃、如大于94℃、如大于96℃、如大于98℃、如大于100℃、如在80℃和110℃之间、如在82℃和110℃之间、如在84℃和110℃之间的熔点(DSC)。

在一个优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:13的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自网团菌属的菌株、如嗜热网团菌的菌株。

在一个优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH11木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:14的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自网团菌属的菌株，如嗜热网团菌的菌株。

在一个优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:15的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自篮状菌属(Rasamsonia)的菌株，如丝衣霉状篮状菌的菌株。

在一个优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:16的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自篮状菌属的菌株、如雷塞氏篮状菌的菌株。

在一个优选的实施例中，半纤维素酶、特别是木聚糖酶、尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:17的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自曲霉属的菌株、如烟曲霉的菌株。

在液化过程中存在的和/或添加的热稳定的内切葡聚糖酶

根据本发明，在液化步骤i)中，具有大于70℃(如在70℃和95℃之间)的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶(“E”)可以与α-淀粉酶(如热稳定的细菌α-淀粉酶)和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)组合存在和/或添加。

内切葡聚糖酶的热稳定性可以如WO 2017/112540(其通过引用以其整体并入本文)的“材料与方法”部分中“通过差示扫描量热法测定T_d对内切葡聚糖酶和半纤维素酶的测定”标题下所述测定。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶具有大于72℃、如大于74℃、如大于76℃、如大于78℃、如大于80℃、如大于82℃、如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如在70℃和95℃之间、如在76℃和94℃之间、如在78℃和93℃之间、如在80℃和92℃之间、如在82℃和91℃之间、如在84℃和90℃之间的熔点(DSC)。

在一个优选的实施例中，在本发明的方法中使用的或包含在本发明的组合物中的内切葡聚糖酶是糖苷水解酶家族5内切葡聚糖酶或GH5内切葡聚糖酶(参见在“www.cazy.org”网站的CAZy数据库)。

在一个实施例中，GH5内切葡聚糖酶来自家族EG II，如本文的SEQ ID NO:18中显示的雷塞氏篮状菌内切葡聚糖酶；本文的SEQ ID NO:19中显示的胶囊青霉内切葡聚糖酶、以及本文的SEQ ID NO:20中显示的褐孢长毛盘菌内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶是家族GH45内切葡聚糖酶。在一个实施例中，GH45内切葡聚糖酶来自家族EG V，如本文的SEQ ID NO:21中显示的粪生粪壳菌或本文的SEQ IDNO:22中显示的土生梭孢壳酶内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:18的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。在一个实施例中，内切葡聚糖酶是源自篮状菌属(Talaromyces)的菌株，如雷塞氏篮状菌的菌株。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:19的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自青霉菌属的菌株，如胶囊青霉的菌株。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:20的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自长毛盘菌属的菌株，如褐孢长毛盘菌的菌株。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:21的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自粪壳菌属的菌株，如粪生粪壳菌的菌株。

在一个实施例中，切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:22的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自梭孢壳属的菌株、如土生梭孢壳酶的菌株。

在一个实施例中，在液化步骤i)中在从1-10,000μg EP(酶蛋白)/g DS)如10-1,000μg EP/g DS的剂量添加内切葡聚糖酶。

液化过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶

根据本发明，在液化中，任选的产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，优选是热稳定的葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)、以及任选的具有大于70℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶、以及任选的支链淀粉酶和/或任选的植酸酶一起存在和/或添加。

术语“产碳水化合物源的酶”包括产生可发酵糖的任何酶。产碳水化合物源的酶能够产生碳水化合物，该碳水化合物可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能量源，例如，当在用于生产发酵产物(如乙醇)的本发明的工艺中使用时。产生的碳水化合物可以直接或间接转化成希望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用碳水化合物源产生酶的混合物。具体实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。

在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是热稳定的。该产碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶一起或分开添加。

在一个具体并优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是热稳定的葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，如来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉菌的菌株，特别是在WO2011/127802(将其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的以及显示在本文的SEQ IDNO:23中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。

在一个实施例中，该热稳定的葡糖淀粉酶与WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:23中显示的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个实施例中，产碳水化合物源的酶，特别是热稳定的葡糖淀粉酶是本文的SEQID NO:23中显示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。

在一个优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是披露为WO 2011/127802中的SEQID NO:2以及显示在本文的SEQ ID NO:23中的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(称为“PE001”)(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列用于编号)。如WO 2013/036526(将其通过引用特此并入)中披露的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。

涵盖的草酸青霉葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(其通过引用特此并入)中。

在一个实施例中，这些变体具有对蛋白酶降解的降低的敏感度。

在一个实施例中，这些变体与亲本相比具有改进的热稳定性。

更具体地，在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:23进行编号)，并且还包括至少一种以下取代或取代的组合：

T65A；Q327F；E501V；Y504T；Y504*；T65A+Q327F；T65A+E501V；T65A+Y504T；T65A+Y504*；Q327F+E501V；Q327F+Y504T；Q327F+Y504*；E501V+Y504T；E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V；T65A+Q327F+Y504T；T65A+E501V+Y504T；Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+Y504*；T65A+E501V+Y504*；Q327F+E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504*；E501V+Y504T；T65A+K161S；T65A+Q405T；T65A+Q327W；T65A+Q327F；T65A+Q327Y；P11F+T65A+Q327F；

R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；P11F+T65A+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+S105P+Q327W；T65A+S105P+Q327F；T65A+Q327W+S364P；T65A+Q327F+S364P；T65A+S103N+Q327F；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；S255N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。

在一个优选的实施例中，草酸青霉葡糖淀粉酶变体具有使用本文的SEQ ID NO:23用于编号的K79V取代(PE001变体)，并且还包含以下突变之一：

P11F+T65A+Q327F；

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；

P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶变体，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶变体与本文的SEQID NO:23的成熟多肽具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％同一性。

产碳水化合物源的酶(特别是麦芽糖酶)能以从0.1-100微克EP/g DS、如0.5-50微克EP/g DS、如1-25微克EP/g DS、如2-12微克EP/g DS的量添加。

在液化过程中存在的和/或添加的支链淀粉酶

任选地，在液化步骤i)过程中，普鲁兰酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选木聚糖酶)一起存在和/或添加。如以上提及的，蛋白酶、产碳水化合物源的酶、优选地热稳定的葡糖淀粉酶也可以任选地在液化步骤i)过程中存在和/或添加。

支链淀粉酶可以在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化发酵过程中存在和/或添加。

普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰糖6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其特征在于它们在例如支链淀粉和普鲁兰糖中水解α-1,6-糖苷键的能力。

根据本发明涵盖的普鲁兰酶包括来自美国专利号4,560,651(其通过引用特此并入)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的普鲁兰酶、WO 01/151620(其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的普鲁兰酶、WO 01/151620(其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)、以及来自WO 01/151620(其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的普鲁兰酶以及还有描述于FEMS Mic.Let.[FEMS微生物学通讯](1994)115,97-106中的普鲁兰酶。

根据本发明涵盖的另外的支链淀粉酶包括来自沃斯氏热球菌、具体地来自WO 92/02614中披露的沃斯氏热球菌DSM No.3773的支链淀粉酶。

在一个实施例中，该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶包括如披露于WO 2011/087836中的(将其通过引用特此并入)中的X47结构域。更具体地该支链淀粉酶可以源自热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)和热水高温球菌(Thermococcus hydrothermalis)，如显示在WO 2011/087836中的在X47结构域之后的X4位点右侧截短的热水高温球菌支链淀粉酶。该支链淀粉酶还可以是嗜热高温球菌和热水高温球菌支链淀粉酶杂合体或具有截短位点X4的、披露于WO2011/087836(将其通过引用特此并入)中的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂合酶。

在另一个实施例中，该支链淀粉酶是包括披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的一种支链淀粉酶。

根据本发明，该支链淀粉酶能以有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于下文的“材料与方法”-部分中。

适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME 400L、PROMOZYME^TM D2(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦)、OPTIMAX L-300(杰能科公司，美国)、以及AMANO 8安能满公司，日本)。

液化过程中存在的和/或添加的植酸酶

任选地，在液化中，植酸酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)组合存在和/或添加。

根据本发明使用的植酸酶可以是能够从植酸(肌醇六磷酸盐)或其任何盐(植酸盐)中释放无机磷酸盐的任何酶。植酸酶可以根据其在初始水解步骤中的特异性进行分类，据此首先水解磷酸酯基团。本发明中使用的植酸酶可以具有任何特异性，例如是3-植酸酶(EC 3.1.3.8)、或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)或5-植酸酶(无EC号)。在一个实施例中，植酸酶具有大于50℃最适温度，如在从50℃至90℃的范围。

植酸酶可以源自植物或微生物，如细菌或真菌，例如酵母或丝状真菌。

植物植酸酶可以来自麦麸、玉蜀黍、大豆或百合花粉。适合的植物植酸酶描述在Thomlinson等人，Biochemistry[生物化学]，1(1962)，166-171；Barrientos等人,Plant.Physiol.[植物生理学],106(1994),1489-1495；WO 98/05785；WO 98/20139中。

细菌植酸酶可以来自芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属、哈夫尼菌属、假单胞菌属、布丘氏菌属或埃希氏菌属，特别是枯草芽孢杆菌、布氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、蜂房哈夫尼菌、布伽瓦尼布丘氏菌(Buttiauxella gaviniae)、乡间布丘菌(Buttiauxellaagrestis)、诺亚克布丘氏菌(Buttiauxella noackies)和大肠杆菌。适合的细菌植酸酶描述在Paver和Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]151:1102-1108；Cosgrove,1970,Australian Journal of Biological Sciences[生物科学澳大利亚杂志]23:1207-1220；Greiner等人,Arch.Biochem.Biophys.[农业生物化学生物生理学],303,107-113,1993；WO 1997/33976；WO 1997/48812、WO 1998/06856、WO 1998/028408、WO2004/085638、WO 2006/037327、WO 2006/038062、WO 2006/063588、WO 2008/092901、WO2008/116878、和WO 2010/034835中。

酵母植酸酶可以源自酵母属或许旺酵母属，具体地物种酿酒酵母或许旺酵母。前面的酶已经描述为适合的酵母植酸酶描述于Nayini等人，1984，LebensmittelWissenschaft und Technologie[食品科学与技术]17:24-26；Wodzinski等人,Adv.Appl.Microbiol.[应用与环境微生物学],42,263-303；AU-A-24840/95；

来自丝状真菌的植酸酶可以源自子囊菌(Ascomycota、ascomycetes)真菌门或担子菌门，例如曲霉属、嗜热真菌属(也称为腐质霉属)、毁丝霉属、红曲霉属、青霉菌属、隔孢伏革属、田头菇属(Agrocybe)、桩菇属(Paxillus)或栓菌属(Trametes)，具体地物种土曲霉、黑曲霉、黑曲霉泡盛曲霉(Aspergillus niger var.awamori)、无花果曲霉、烟曲霉、米曲霉、疏绵状嗜热丝孢菌(也称为疏棉状腐质霉)、嗜热毁丝霉、隔孢伏革菌、平田头菇(Agrocybe pediades)、安卡红曲霉、卷边网褶菌(Paxillus involtus)或绒毛栓菌(Trametes pubescens)。适合的真菌植酸酶描述在Yamada等人,1986,Agric.Biol.Chem.[农业和生物化学]322:1275-1282；Piddington等人，1993，Gene[基因]133:55-62；EP 684,313；EP 0 420 358；EP 0 684 313；WO 1998/28408；WO 1998/28409；JP 7-67635；WO 1998/44125；WO 1997/38096；WO 1998/13480中。

在一个优选的实施例中，植酸酶源自布丘氏菌属，如布伽瓦尼布丘氏菌、乡间布丘菌、或诺亚克布丘氏菌(Buttiauxella noackies)，如在WO 2008/092901(通过引用特此并入)中分别披露为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的那些。

在一个优选的实施例中，植酸酶源自柠檬酸杆菌属，如布氏柠檬酸杆菌，如在WO2006/037328(通过引用特此并入)中披露的。

通过本领域已知的方法获得修饰的植酸酶或植酸酶变体，特别是通过以下中披露的方法：EP 897010；EP 897985；WO 99/49022；WO 99/48330、WO 2003/066847、WO 2007/112739、WO 2009/129489、和WO 2010/034835中。

含有产物的可商购的植酸酶包括BIO-FEED植酸酶^TM、植酸酶NOVO^TM CT或L(均来自诺维信公司(Novozymes))、LIQMAX(杜邦公司(DuPont))或RONOZYME^TM NP、

HiPhos、

P5000(CT)、NATUPHOS^TM NG 5000(来自DSM)。

糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶

根据本发明，在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加产碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶。

在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是一种真菌起源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌的菌株，

葡糖淀粉酶

根据本发明，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶可以源自任何适合的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组，该组由以下组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自丹麦诺维信公司，(Novozymes，Denmark))；WO 84/02921中披露的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或它们的变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人.(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人(1994),Biochem.J.301[生物化学杂志],275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,1996,Biochemistry[生物化学],35:8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,1997,Protein Engng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。

其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为罗尔伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii[来自罗尔伏革菌的粗淀粉降解葡萄糖淀粉酶的纯化及性质]”Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，踝节菌属葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森踝节菌(WO 99/28448)、雷塞氏篮状菌(美国专利号Re.32,153)、杜氏篮状菌(Talaromyces duponti)、以及嗜热踝节菌(美国专利号4,587,215)。在一个优选的实施例中，糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。

涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。

涵盖的真菌葡糖淀粉酶包括均在WO 2006/069289中披露的瓣环栓菌、纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)、和大白桩蘑(Leucopaxillus giganteus)；和WO2007/124285中披露的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。根据本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实例1的表1和4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用特此并入)。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别地如WO 2011/066576中所描述的密孔菌属的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)；或源自褐褶茵属的菌株，特别地如WO2011/068803中所描述的褐褶茵属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)或黑层孔属的菌株，特别地如WO 2012/064351中所披露的黑层孔属物种的菌株(SEQ ID NO:2)(所有参考文献通过引用特此并入)。还涵盖了以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶展现与上述葡糖淀粉酶的任一种的高同一性，即，与上述酶序列的成熟部分中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％的同一性。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS。

包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER、SAN^TMEXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TM FUEL、SPIRIZYME^TM B4U、SPIRIZYME^TM ULTRA、SPIRIZYME^TM EXCEL、SPIRIZYME^TM ACHIEVE、和AMG^TM E(来自诺维信公司(Novozymes A/S))；OPTIDEX^TM 300、GC480、GC417(来自杰能科国际(Genencor Int.))；AMIGASE^TM和AMIGASE^TMPLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990 ZR(来自美国丹尼斯克公司(Danisco US))。

产麦芽糖淀粉酶

在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶还可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖l,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而特此并入。在一个优选的实施例中，能以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加产麦芽糖淀粉酶。

液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶

在本发明的一个实施例中，在液化中，可以将任选的蛋白酶(如热稳定的蛋白酶)与α-淀粉酶(如热稳定的α-淀粉酶)、和具有大于80℃的熔点(DSC)的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)、以及任选地内切葡聚糖酶、产碳水化合物源的酶(特别是葡糖淀粉酶、任选地支链淀粉酶和/或任选地植酸酶)一起存在和/或添加。

蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。

在一个优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶。

为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。

可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。

蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。下文在WO 2017/112540(其通过引用并入本文的“材料和方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中优选的测定是所谓的“AZCL-酪蛋白测定”。

在一个实施例中，如通过在WO 2017/112540中“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定进行确定，热稳定蛋白酶具有JTP196变体(来自WO 2017/112540的实例2)或蛋白酶Pfu(本文的SEQ ID NO:24)的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。

对于在本发明的方法或组合物中使用的热稳定的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。

在一个优选的实施例中，该热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施例中，在本发明的方法或组合物中使用的热稳定的蛋白酶是真菌起源的，如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC3.4.24.39)的真菌金属蛋白酶。

在一个实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分的变体或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1以及本文的SEQID NO:25所示的成熟部分的变体，进一步具有选自以下列表的突变：

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L。

在一个优选的实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露为以下的成熟金属蛋白酶的变体：披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQID NO:1或本文的SEQ ID NO:25的成熟部分，该变体具有以下突变：

D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

在一个实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:25具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。

该热稳定性蛋白酶还可源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，该热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，如激烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。

在一个实施例中，该蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))的SEQ ID NO:1、和本文的SEQ ID NO:24所示的一种。

在一个实施例中，该热稳定性蛋白酶是披露在本文的SEQ ID NO:24或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:24具有至少80％同一性、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。激烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio，Japan)。

激烈火球菌蛋白酶是一种根据本发明的热稳定性蛋白酶。如WO 2017/112540的实例2中所述的进行测定，发现商业产品激烈火球菌蛋白酶(Pfu S)在pH 4.5具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性(参见实例5)。

在一个实施例中，热稳定的蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值，如实例2中所述的进行测定。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、如超过105％、如超过110％、如超过115％、如超过120％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，在20％与50％之间、如在20％与40％之间、如20％与30％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，在50％与115％之间、如在50％与70％之间、如在50％与60％之间、如在100％与120％之间、如在105％与115％之间的热稳定性。

在一个实施例中，如WO 2017/112540的实例2中所述的进行测定，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的、超过10％的热稳定性值。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的，超过10％，如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的，在10％与50％之间、如在10％与30％之间、如在10％与25％之间的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在80℃的残余活性；和/或

在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在84℃的残余活性。

“相对活性”以及“残余活性”的测定是如在WO 2017/112540的实例2中描述的进行的。

在一个实施例中，如使用WO 2017/112540的实例3中披露的Zein-BCA测定确定的，该蛋白酶在85℃可以具有高于90，如高于100的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有高于60％，如高于90％，如高于100％，如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有在60％-120％之间，如在70％-120％之间，如在80％-120％之间，如在90％-120％之间，如在100％-120％之间，如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。

在一个实施例中，如通过在WO 2017/112540的“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定进行确定，该热稳定蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的活性。

IV.本发明的另外方面

在本发明的另一方面，其涉及本发明的木聚糖酶(例如，GH30_8木聚糖酶)或酶共混物用于改进作为发酵产物生产方法的副产物而生产的干酒糟(DGS)或含可溶物的干酒糟(DDGS)的营养质量的用途，优选地不导致DDG或DDGS变黑。

本文部分I中披露的任何酶共混物都可以这种方式使用。在这方面的各种实施例中，可将另外的酶，如在“酶”部分下描述的酶或酶组合物，与本发明的酶共混物一起组合使用。

在一个实施例中，与在用于生产DDG或DDGS副产物的发酵产物生产方法的糖化、发酵、或同时糖化和发酵步骤期间不存在本发明的木聚糖酶或酶共混物时作为副产物生产的DDG或DDGS的TME相比，当给予至动物(例如，非反刍动物，例如，单胃动物，例如，家禽或猪等)时，该木聚糖酶或酶共混物通过使DDG或DDGS的TME增加至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、或至少20％来用于改进DGS或DDGS的营养质量。在一个实施例中，与在用于生产DDG或DDGS副产物的发酵产物生产方法的糖化、发酵、或同时糖化和发酵步骤期间不存在本发明的木聚糖酶或酶共混物时作为副产物生产的DDG或DDGS的TME相比，该木聚糖酶或酶共混物通过使动物(例如，非反刍动物，例如，单胃动物，例如，家禽或猪等)中DDG或DDGS的TME增加至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、或至少50％来用于改进DGS或DDGS的营养质量。

在本发明的仍另一方面，其涉及本发明的木聚糖酶或酶共混物用于增加在本发明的发酵产物生产方法期间发酵醪中存在的纤维的溶解的用途，优选地不导致该DDG或DDGS变黑。在一个实施例中，该木聚糖酶或酶共混物用于在从含淀粉材料生产醇(例如，乙醇)期间增加纤维溶解。在一个实施例中，该木聚糖酶或酶共混物用于在乙醇生产方法(如RSH方法或包括液化步骤的常规蒸煮)中增加玉米纤维的溶解。在一个实施例中，该酶共混物用于增加阿拉伯糖的溶解。在一个实施例中，该酶共混物用于增加木糖的溶解。

本文部分I中披露的任何木聚糖酶或酶共混物都可以这种方式使用。在这方面的各种实施例中，可将另外的酶，如在“酶”部分下描述的酶或酶组合物，与本发明的酶共混物一起组合使用。

在一个实施例中，与不接触本发明的木聚糖酶或酶共混物的纤维的溶解相比，该木聚糖酶或酶共混物用于将接触该酶共混物的纤维(例如，阿拉伯糖、木糖等)的溶解增加至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、或至少20％。在一个实施例中，与不接触该木聚糖酶或酶共混物的纤维相比，该木聚糖酶或酶共混物用于将接触该酶共混物的纤维(例如，阿拉伯糖、木糖等)的溶解增加至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、或至少50％。

在以下段落中进一步概述本发明：

1.一种生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在低于初始糊化温度的温度下，用α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、和木聚糖酶或包含该木聚糖酶的酶共混物将含淀粉材料糖化；

(b)使用发酵生物发酵以生产该发酵产物；以及

(c)任选地回收副产物。

2.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；

(b)用葡糖淀粉酶和木聚糖酶或包含该木聚糖酶的酶共混物将步骤(a)中获得的液化的材料糖化；

(c)使用发酵生物进行发酵；以及

(d)任选地回收副产物。

3.如段落1或2所述的方法，其中糖化和发酵同时进行。

4.如段落1至3中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料包含玉蜀黍、玉米、小麦、黑麦、大麦、黑小麦、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子。

5.如段落1至4中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，特别是乙醇。

6.如段落1至5中任一项所述的方法，其中该副产物是干酒糟(DDG)或含可溶物的干酒糟(DDGS)。

7.如段落1至6中任一项所述的方法，其中与作为用于生产发酵产物的其中不存在或未添加该木聚糖酶或包含该木聚糖酶的酶共混物的方法的副产物回收的DDG或DDGS相比，该DDG或DDGS具有改进的营养质量。

8.如段落7所述的方法，其中该DDG或DDGS具有增加的脂肪含量。

9.如段落1至8中任一项所述的方法，其中与在该方法的糖化步骤、发酵步骤、和/或同时糖化和发酵步骤期间不存在木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物时生产的DGS或DDGS的TME相比，该DGS或DDGS的真代谢能增加至少5％、至少10％、至少15％、或至少20％。

10.如段落9所述的方法，其中该TME是针对单胃动物。

11.如段落9或10所述的方法，其中与在如段落10至16中任一项所述的方法的糖化步骤、发酵步骤、和/或同时糖化和发酵步骤期间不存在如段落1至9中任一项所述的酶共混物时生产的DGS或DDGS相比，在干燥后生产的该DGS或DDGS没有变黑。

12.如段落1至11中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酵母，特别是酵母菌属物种，更特别是酿酒酵母。

13.如段落1至12中任一项所述的方法，其中该酶共混物还包含纤维素分解组合物。

14.如段落1至13中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物以约5:95至约95:5，如5:95、10:90、20:80、50:50、80:20、90:10、和95:5的木聚糖酶与纤维素分解组合物比率，存在于该共混物中。

15.如段落1至14中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶是GH30家族木聚糖酶。

16.如段落1至15中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶是GH30_8木聚糖酶。

17.如段落1至16中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶是GH30_8木聚糖酶，其选自下组，该组由以下组成：

(i)SEQ ID NO:1的枯草芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；

(ii)SEQ ID NO:2的枯草芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；

(iii)SEQ ID NO:3的枯草芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该枯草芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；

(iv)SEQ ID NO:4的解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；

(v)SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；

(vi)SEQ ID NO:6的地衣芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该地衣芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性；以及

(vii)SEQ ID NO:2的饲料类芽孢杆菌木聚糖酶或其变体，该变体与该饲料类芽孢杆菌木聚糖酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性。

18.如段落1至17中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：

(i)纤维二糖水解酶I；

(ii)纤维二糖水解酶II；

(iii)β-葡糖苷酶；以及

(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

19.如段落1至18中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；以及

(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽。

20.如段落1至19中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包含：

(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ ID NO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；

(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQ ID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；

(iii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸20至863的β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有至少一个选自由F100D、S283G、N456E、和F512Y组成的组的取代并与SEQ ID NO:10的氨基酸20至863具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；和/或

(iv)包含SEQ ID NO:11的氨基酸26至253的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽或其变体，该变体与SEQ ID NO:11的氨基酸26至253具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

21.如段落1至20中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

22.如段落1至21中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物源自选自由曲霉属、青霉属、篮状菌属、和木霉属组成的组的菌株，任选地其中：(i)该曲霉属菌株选自下组，该组由以下组成：黄曲霉、黑曲霉和米曲霉；(ii)该青霉属菌株选自下组，该组由以下组成：埃默森青霉菌和草酸青霉菌；(iii)该篮状菌属菌株选自下组，该组由以下组成：金黄篮状菌和埃默森篮状菌；并且(iv)该木霉属菌株是里氏木霉。

23.如段落1至13中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物。

24.如段落1至23中任一项所述的酶共混物用于改进作为如段落1至23中任一项所述的发酵产物生产方法的副产物而生产的DGS或DDGS的营养质量的用途，优选地不导致该DDG或DDGS变黑。

25.如段落1至23中任一项所述的酶共混物用于溶解纤维、优选地用于溶解木糖和阿拉伯糖的用途。

本文中所描述和要求保护的本发明并不局限于本文中所披露的具体实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等同的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。本文引用了各种参考文献，其披露内容通过引用以其整体并入本文。进一步通过以下实例来描述本发明，所述实例不应理解为限制本发明的范围。

材料与方法

α-淀粉酶369(AA369)：具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(本文的SEQ ID NO:12)被截短为491个氨基酸。

纤维素分解组合物A：源自里氏木霉的纤维素分解组合物，其包含：WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:6和本文的SEQ ID NO:8的烟曲霉Cel7A CBH1；WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:18和本文的SEQ ID NO:9的烟曲霉CBH II；披露于WO 2012/044915或共同未决的PCT申请PCT/US11/054185中的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:10)变体(F100D、S283G、N456E、F512Y)；以及源自埃默森青霉菌的菌株具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ IDNO:11)。

纤维素分解组合物B：源自里氏木霉的纤维素分解组合物，其包含：WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:6和本文的SEQ ID NO:8的烟曲霉Cel7A CBH1；以及披露于WO 2012/044915或共同未决的PCT申请PCT/US11/054185中的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:10)变体(F100D、S283G、N456E、F512Y)。

E-SEP：包含表达转基因GH10木聚糖酶和表达GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的里氏木霉纤维素菌株的共混物。

葡糖淀粉酶SA(GSA)：包括以下的共混物：在WO 99/28448中披露为SEQ ID NO:34的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、在WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及以本文的SEQ ID NO:26披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的具有以下取代G128D+D143N的微小根毛霉α-淀粉酶(AGU:AGU:FAU-F中活性比率为约20:5:1)。

蛋白酶Pfu：源自激烈火球菌的蛋白酶，示于本文的SEQ ID NO:13中。

木聚糖酶：来自枯草芽孢杆菌的GH30_8木聚糖酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

酵母：ETHANOL RED^TM，商购自美国红星/乐斯福公司(Red Star/Lesaffre,USA)。

HPLC方案

下表1中的HPLC方案用于实例2、4、5和6中。

洗脱液梯度

下表2中的洗脱液梯度用于实例2、4、5和6中。

表2.洗脱液梯度

木糖溶解测定

通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAE-PAD)测量木聚糖酶变体对于脱脂脱淀粉玉蜀黍(DFDSM)的活性。在100mM乙酸钠，5mM CaCl₂，pH 5中制备2％(w/w)DFDSM悬浮液，并且允许在室温在温和搅拌下水合30分钟。水合后，将200μl底物悬浮液移液至96孔板中，并且将该悬浮液与20μl酶溶液混合以获得相对于底物的20PPM(20μg酶/g底物)的最终酶浓度。在平板培养箱(Biosan PST-100HL)中在温和搅动(500RPM)下，将酶/底物混合物在40℃下于2.5小时内水解。在酶水解后，将酶/底物板以3000RPM离心10分钟，并且将50μl上清液(水解物)与100μl 1.6M HCl混合，然后转移至300μl PCR管中，在PCR仪中在90℃下静置酸水解40分钟。酸水解的目的是将由木聚糖酶变体释放的可溶性多糖转化为单糖，该单糖可以使用HPAE-PAD定量。在酸水解后用125μl 1.4M NAOH中和样品，并将其固定在HPAE-PAD上用于单糖分析(木糖，阿拉伯糖和葡萄糖)(使用CarboPac PA1柱的DionexICS-3000)。使用单糖储备溶液制成合适的校准曲线，该单糖储备溶液经历与样品相同的酸水解程序。根据下式计算溶解的木糖百分比：

其中[木糖]表示通过HPAE-PAD测量的上清液中木糖的浓度；V表示样品的体积；MW，内部木糖在阿拉伯木聚糖中的分子量(132g/mol)；Xxyl，DFDSM中木糖的分数(0.102)以及Msub，样品中DFDSM的质量。

实例实例1

如材料与方法部分中所列，实例1证明了本发明的酶共混物的有效性，该酶共混物包含不同比率的木聚糖酶和纤维素分解组合物A。

每管添加大约5g玉米醪。该醪获自商业乙醇工厂，并已经用AA369和蛋白酶Pfu的共混物液化。随后给予悬浮的水合乙醇红酵母、GSA(0.6AGU/g干固体)和本发明的酶共混物或水。每种测试的酶共混物的总剂量为100μg/g干固体。

给予后，用具有小孔的塞子盖住管，用推针戳开并涡旋，之后放入32℃水浴中同时进行糖化和发酵(SSF)。在发酵期间，将管在早晨和下午涡旋。发酵三晚后，将管在3000RPM下离心5min，并将上清液通过0.45μm注射器式过滤器过滤。

在具有螺纹盖的微型离心管中进行酸水解。添加600μl样品和200μl 5N HCl，并将它们在95℃下放入加热块中保持40min。冷却后，将它们用200μl NaOH(50％w/w NaOH，4倍vol/vol稀释)中和。酸水解的目的是将寡糖水解为单糖，以通过随后的分析测定捕获所有溶解的糖。将水解后的样品在Hamilton上稀释100倍，之后在带有CarboPac PA1柱的DionexICS-3000 HPAEC-PAD系统上进行分析。使用来自SAS研究所的JMP软件包对数据进行分析。图1和图2分别显示了使用包含各种比例的木聚糖酶和纤维素分解组合物的本发明的酶共混物的情况下的阿拉伯糖和木糖溶解。图1和图2显示了与单独通过该纤维素分解组合物溶解阿拉伯糖和木糖相比，当该酶共混物中10％-100％的纤维素分解组合物被木聚糖酶替代时，阿拉伯糖和木糖的溶解显著增加。值得注意的是，在用不同的含有木聚糖酶的共混物获得的阿拉伯糖与木糖的溶解之间没有可检测的差异，表明本发明的酶共混物在共混物中存在的木聚糖酶与纤维素分解组合物的宽比率范围内有效地溶解了阿拉伯糖和木糖。

实例2

使用本发明的三种不同的酶共混物(例如，木聚糖酶和/或纤维素分解组合物A的共混物)获得剂量-响应曲线。数据表明，当将该纤维素分解组合物包括在该共混物中时，可以实现的阿拉伯糖和木糖的溶解程度更高，并且可以通过调节木聚糖酶:纤维素分解组合物比率来优化该共混物的性能。

通过“Glamdring”LEAP醪处理机器人每管给予约5g醪。将本发明稀释液的悬浮的水合酵母、GSA、和酶共混物给予到Biomek液体处理器上。SSF发酵在32℃下运行了三个晚上(64-72小时)。使用来自红色轨迹能源公司(Red Trail Energy，RTE)的醪。

给予后，用具有小孔的塞子盖住管，用推针戳开并涡旋，之后放入32℃水浴中。在发酵期间，将管在早晨和下午涡旋。发酵三晚后，将管在3000 RPM下离心5min，并将上清液通过0.2μm Spin-X过滤器过滤。

使用“材料和方法”部分中上表1的HPLC方案测量乙醇、糖、甘油、和酸。

在具有螺纹盖的微型离心管中进行酸水解。添加300μl样品和100μl 5N HCl，并将它们在95℃下放入加热块中保持40min。冷却后，将它们用100μl NaOH(50％w/w NaOH，4倍vol/vol稀释)中和。酸水解的目的是将寡糖水解为单糖，以通过随后的分析测定捕获所有溶解的糖。

在HPAEC-PAD之前，将水解和中和的样品在Hamilton上稀释100倍。使用具有CarboPac PA1柱的Dionex ICS-3000系统。应用“材料和方法”部分上表2中所示的洗脱液梯度。

柱温为30℃。样品体积5μl。PAD波形“Gold，Carbo，Quad”。

图3和图4分别显示了响应于增加剂量的本发明的酶共混物的阿拉伯糖和木糖溶解。阿拉伯糖和木糖溶解的图案相似。使用纯木聚糖酶(100％)，在10μg EP/g DS的剂量下获得最大溶解，其中曲线基本上变平。对于包含50％木聚糖酶和50％纤维素分解组合物的共混物，可以获得更高转化率，并在40μg总EP/g DS的剂量下基本上获得最大溶解。对于包含10％木聚糖酶和90％纤维素分解组合物的共混物，对于80μg总EP/G DS和以上的剂量，可能有甚至更高的最大溶解。该数据表明，单独的该木聚糖酶有效地溶解了阿拉伯糖和木糖，并且当包括纤维素分解组合物并调节该木聚糖酶:纤维素分解组合物比率时，可增强溶解。

实例3

该实例显示，在动物饲料试验中，通过添加本发明的包含20:80比率的木聚糖酶:纤维素分解组合物A的酶共混物生产的DDGS增加了真代谢能。

中试工厂生产的DDGS材料被用于动物饲料试验。饲料试验是在佐治亚大学对未切除盲肠的公鸡进行的48小时TME(真代谢能)试验。报道的结果是基于干固体的TMEn(氮校正)。纳入仅具有GSA的对照作为基线。对于本发明的酶共混物，每g干固体中添加100或1000μg酶蛋白。估算的TME增加为12％(“大剂量”为17％)。

五个中试工厂的发酵罐中分别填充有8kg的醪。该醪获自商业乙醇工厂，并使用AA369和蛋白酶Pfu的共混物和水加热器(hydro heater)液化。在转移到这些发酵罐中之前，将所有醪在50kg混合罐中充分混合，检查pH(5.07)，并添加50ppm尿素和3ppm青霉素。

如下制备DDGS饲料材料。将醪转移到放在秤上的塑料桶中，并从此处转移到这些发酵罐中。在添加酶和水合酵母之前，将温度稳定在32℃或更低。通过向夹套中添加蒸汽来进行加热，并且温度在稳定之前过冲至约42℃。SSF期间的温度必须通过来自搅拌器的摩擦热来维持，因为中试工厂中用于向夹套提供温水的热交换器已停用。因此，最初几天的温度一直较低(约24-28℃)，并且最后，搅拌器速度增加至600RPM以维持32℃。收获前，通过蒸汽注入将温度增加至95℃保持40min，并将通气设置为3L/min来蒸发掉乙醇。将搅拌设置为200RPM。然后，在清空发酵罐之前，使用水冷将温度降至50℃以下。将材料转移到9x13"不粘烤盘中，并在50℃下放入通风烤箱中。烤箱干燥后，将稍湿的材料在放入冷冻干燥机中之前在食品加工机中研磨，并在冷冻干燥后再次研磨。所有材料均在造粒楼(granulationbuilding)的8通样品分离器上分离。样品被运送到中西部(Midwest)进行近似分析。

取处理的平均值，估算下表3中的改进。这大幅度超过了设定的5％增加目标。在JMP统计软件中分析每干重的TMEn数据。由于制备的DDGS的批次间差异较大(相对于同一批次饲喂的八只个体禽之间的差异而言)，因此用五个DDGS批次作为解释变量拟合了单向方差分析模型；而不是处理类型下的嵌套批次(nesting batch)。

表3

表4

R平方	0.9327
		R平方修正	0.925
均方根误差	73.587
		响应的均值	3630.1
观察(或总权重)	40

表5-效应测试

来源	Nparm	DF	平方和	F比率	Prob>F
						批次	4	4	2626463.8	121.2568	<.0001*

表6-Tukey HSD多重比较检验

α＝0.050 Q＝2.87506

水平			最小二乘均数
				1000μg	A			3917
100μg 1	A		3830
				100μg 2		B		3686
对照1		C	3524
				对照2			D	3193

未连接相同字母的水平是显著不同的。

从上表6可以看出，对照#1与对照#2显著不同，并且100μg批次#1与100μg批次#2显著不同。因此，批次间差异非常大。

然而，尽管批次间差异较大，图5显示了酶处理对TME值有积极作用，因为批次的排序使得两个对照的TME最低，而1000μg“大剂量”的TME最高。

实例4

实例4证明，与先前使用来自常规蒸煮方法的醪上的酶共混物进行的测试相比，当添加到生淀粉SSF中时，本发明的包含50:50比率的木聚糖酶:纤维素分解组合物A的示例性酶共混物溶解了类似量的纤维。

材料

·细磨玉米粉(无IP)

·Lactrol储备液，1g/L

·尿素储备液，200g/L

·淀粉酶产品，BPX10.5c

·酵母膏

设备

·水分分析仪

·混合器/桨

·烧杯(用于混合玉米浆料)

·pH计

·移液管/吸头

·血清学移液管，100ml，具有切割吸头(cut tip)(用锯子将吸头切成小段，这样就可等分玉米浆料)

·125mL Wheaton瓶和钻有孔的盖

·加热的摇床

·水浴

·带挡板的烧瓶(250mL)

·HPLC小瓶/盖

·0.2u注射器式过滤器

·用于酶稀释的容量烧瓶(10mL)

程序

使用细磨粉和水，制备了指向34.5％干固体(DS)的浆料。使用水分方法仪，将玉米粉的干固体确定为84.54％。该玉米浆料补充有1000ppm尿素和3ppm Lactrol。用40％H2SO4将该浆料调节至pH 4.5，使其混合约一小时，然后再次调节至pH 4.5。

使用具有切割吸头的血清学移液管将约70g的玉米醪等分到预先称重的125mLWheaton瓶中。将这些瓶覆盖上钻有孔的盖。记录每个瓶的醪重量。将玉米浆料添加到带挡板的烧瓶中(约5g玉米浆料/处理)进行繁殖处理。根据处理所需的浆料体积选择繁殖烧瓶的尺寸，该烧瓶典型地是该浆料体积的5倍。该试验仅进行了一次繁殖。

酶剂量基于每个瓶中玉米浆料的重量。将水给予到每个发酵样品中，以使该体积校正使得实验中的所有瓶达到相同的总固体百分比，使得乙醇浓度在处理之间直接可比较。添加表7中的酶剂量。

表7

使用了MBLA855酵母膏(如WO2017/087330中所述)。在32℃下，在以150rpm振荡下运行繁殖6小时。该繁殖用于向发酵给予。将发酵醪如下给予，使繁殖占总发酵醪的5％。对于发酵，典型的90°F温度分期可见于表8。

表8

时间(小时)	温度(°F)	温度(℃)	时间与天
				0至16	90	32.2	星期一4-星期二8
16至24	88	31.1	星期二8-星期二4
				24至48	87	30.6	星期二4-星期三4
48至88	86	30	星期三4-星期五8

给予后，将发酵旋转并放入水浴中。浴中的水与瓶中的醪处于同一水平，以最小化蒸发。将所有瓶每天旋转两次；早上和晚上。

如下制备样品用于HPLC。将5ml样品转移到管中，并在3000g下离心10min，然后通过0.2μm注射器式过滤器过滤。将1ml样品转移到HPLC小瓶中并添加20μl的40％H₂SO₄。随后将这些小瓶涡旋。将样品储存在4℃。为了分析样品，使用“材料和方法”部分中上表1的HPLC方案。

该方法使用用于糊精(DP4+)、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油以及乙醇的校准标准品对分析物进行定量。使用4点校准(包括原点)。使用18分钟燃料方法。如下运行溶解测定。在具有螺纹盖的微型离心管中进行酸水解。添加180μl样品和60μl 5NHCl，并将它们在95℃下放入振荡加热块中保持40min。冷却后，将它们用60μl NaOH(50％w/w NaOH，4倍vol/vol稀释)中和。酸水解的目的是将寡糖水解为单糖，以通过随后的分析测定捕获所有溶解的糖。

在HPAEC-PAD之前，将样品在Hamilton上稀释100倍。使用具有CarboPac PA1柱的Dionex ICS-3000系统。

应用“材料和方法”部分上表2中所示的洗脱液梯度。

柱温为30℃。样品体积5μl。PAD波形“Gold，Carbo，Quad”。

结果

HPLC数据显示，如增加的DP4+(图6)和DP3峰(图7)所证明的，本发明的酶共混物增加了溶解的糖的量。

Ic数据显示糖(例如，阿拉伯糖(图8)、木糖(图9)和半乳糖(图10))与针对常规蒸煮方法相同的水平的溶解。

LECO数据显示，蛋白酶增加了蛋白质溶解(图11)。

实例5

对用AA369和蛋白酶Pfu的共混物液化的商业玉米醪进行SSF发酵。发酵后，模拟后端工艺，从酒糟中生产浆料和DDGS。乙醇红酵母和0.6AGU/g DS的GSA与表9所示的酶/共混物添加一起使用。

表9

与对照和E-SEP样品相比，使用本发明所有测试的酶共混物获得的溶解的木糖(图12)、阿拉伯糖(图13)和半乳糖(图14)的水平显著更高。然而，在包含不同木聚糖酶:纤维素分解组合物比率的共混物之间没有显著差异。甚至大剂量也没有在糖溶解中显著高于10％木聚糖酶。

E-SEP处理的样品产生最黑的DDGS。出乎意料地，在所有测试剂量(包括大剂量)下，本发明的酶共混物与对照相比未显示DDGS变黑。

图15证明，与对照相比，本发明的酶共混物生产更多量的乙醇，而在10％、20％或50％木聚糖酶:纤维素分解酶共混物之间没有显著差异。本发明的大剂量的1,000μg的酶共混物比所有其他处理具有显著更高的乙醇。

在将酒糟水蒸发成浆料后，在水分平衡(120℃)下测量每种处理的总固体。保存样品以比较浆料的颜色，作为最终DDGS颜色的指标。

以上所有浆料均为37％-39％DS左右。如所预期的，由于产生的单体糖，含有GH10木聚糖酶和GH-62阿拉伯呋喃糖苷酶的E-SEP处理是最黑的(图16)。出乎意料地，在本发明的三种酶共混物中未看出显著差异，并且它们在颜色上与Excel对照相似(图16)。该大剂量显现稍微增加了浆料颜色(图16)。

在浆料分析之后，将浆料和湿饼合并，并在冷藏温度下放置几天，以使水分均匀迁移。然后将每种处理在95℃下干燥约2小时，直到在该DDGS中实现90％-95％DS(图17)。在Hunter Lab颜色扫描仪上测量DDGS颜色。

如所预期的，E-SEP处理产生了较黑的DDGS。出人意料地，与Excel对照相比，本发明的酶共混物和本发明的大剂量的酶共混物未显示DDGS变黑，表明DDGS颜色变黑的问题得以解决(图18)。然而，如上可以看出，与其他处理相比，该E-SEP处理干燥了更多(约1％-2％)(图19)。

材料与方法

在这个实验中，液化物是从商业乙醇工厂接受的植物材料。使用AA369和蛋白酶Pfu在含有35.76％DS的玉米醪上获得液化物。

来自商业乙醇工厂的约5.5L醪(35％DS)用于这个实验。在添加34ppm尿素和3ppm青霉素之后，将约300g的醪等分到800mL发酵烧瓶(橙色螺纹盖)中，每个处理6个，重复3次(发酵中总共18个烧瓶)。

通过将100mL自来水加热至32℃，添加5.5g酵母，并在32℃下孵育30分钟来制备酵母。

根据上表9给予SSF酶。最后，将3mL酵母添加到每个烧瓶中，然后将所有烧瓶充分混合。将固体调节为指向34％DS，并将pH调节为5.0。

然后将烧瓶转移到空气摇床中，并在32℃下孵育66小时。

在88℃下，将先前已经液化和发酵的全酒糟(约15％DS)在旋转蒸发器中蒸馏30-40分钟，以去除乙醇和一些水。如以下所示，使用1或2L的圆底烧瓶附接全酒糟，并以85rpm的恒定旋转下降到水浴中。

使用刮铲将全酒糟(约18％-19％DS)穿过堆积在355μm筛上的879μm筛，产生酒糟水。收集重量以确定以湿饼(>355μm)或酒糟水(<355μm)结束的全酒糟百分比。这将是与客户的工厂工艺相关的重要信息。收集质量平衡数据以确定以湿饼(>355μm)或酒糟水(<355μm)结束的固体百分比。

然后将酒糟水加回到旋转蒸发器中，以生成每个处理约35％-40％DS的浆料。

66小时后收集样品以在HPLC上测试乙醇％。使用“材料和方法”部分中上表1中的HPLC方案测量乙醇产率％。

还测定了用于HPLC的样品中的溶解的糖；既有单体，又有以低聚物纳入的。这是通过将低聚物酸水解为单体，随后针对单体糖进行测定来完成的。

将600μl样品(过滤的上清液；在HPLC上运行的样品)和200μl 5N HCl添加到具有螺纹盖的微型离心管中。将这些涡旋，并在95℃下，在铝块加热器和摇床中孵育40min。在冰箱中冷却后，添加200μl NaOH(50％NaOH，以4倍v/v稀释)以中和样品，现在通过添加的HCl和NaOH将其稀释1.67倍v/v。将这些样品通过0.2μm Spin-X微型离心过滤器单元过滤，以去除任何沉淀物。随后将这些样品在Hamilton上稀释100倍(10μl样品加990μl水)。因此，最终样品稀释度为167倍。

通过HPAEC-PAD分析以上样品，以获得更详细的糖曲线。使用具有CarboPac PA1柱的Dionex ICS-3000系统。

应用“材料和方法”部分上表2中所示的洗脱液梯度。

柱温为30℃。样品体积5μl。PAD波形“Gold，Carbo，Quad”。

实例6

实例6证明了根据本发明使用包含木聚糖酶和纤维素分解组合物B的酶共混物生产的DDGS的改进的营养曲线。

在添加纤维素分解组合物B和木聚糖酶的组合的情况下两次运行四个IKA实验室反应器(LR-2.ST Allrounder)。测试了与应用有关的低木聚糖酶剂量。

每个块运行了四个IKA实验室反应器。每个反应器填充有2100g醪，每个反应器的估算产率为260g DDGS。该醪来自商业乙醇工厂，并用AA369和蛋白酶Pfu的共混物和水加热器液化。

将20kg醪添加到桶中，并设置蓝色IKA搅拌器以混合内容物。记录pH，并证实其高于4.5(无污染)。测量并记录干固体(数据未显示)。

根据下表10，根据醪添加尿素和青霉素。

表10

一次一个，将四个反应器放在秤上，并用罐(pitcher)转移2100g醪。

这些反应器设置为进行搅拌(50RPM)，并将水浴设置为32℃。平衡后验证反应器内部的温度。根据下表11和表12中所示的数据，为每个块给予酶稀释液和水合酵母。

表11-块1

表12-块2

SSF进行了三天。

从每个反应器中取出5g样品用于分析工作。然后，断开反应器上的水浴入口，并将水浴温度设定为95℃。当所有水浴温度均达到95℃时，重新连接入口，并将反应器加热一小时，以模拟工厂中的蒸馏和后端操作。之后，关闭水浴，并使反应器又搅拌一个小时。然后将反应器中的内容物倒入两个9x13"的烤盘/个反应器中，并使用橡胶刮板将反应器中的所有物质清理干净。将这些烤盘放入35℃的烤箱中过夜。然后，将这些样品充分混合，冷冻并冻干。记录材料的最终重量和干固体。

将上述抽取的5g样品在5300RPM下离心5min，并用0.2μm注射器式过滤器过滤上清液。将过滤后的上清液“按原样”提交给HPLC，并也用于酸水解，随后HPAEC-PAD(IC)，以将寡糖水解为单糖，以便定量所有溶解的糖。如下进行酸水解。将300μl样品和100μl 5N HCl添加到具有螺纹盖的微型离心管中。将管涡旋并在95℃下放入加热块保持40min。冷却后，将它们用125μl NaOH(50％w/w NaOH，5倍vol/vol稀释)中和。在HPAEC-PAD之前，将这些样品在Hamilton Microlab 600稀释器上稀释20倍(总稀释35倍)。也将未水解的样品稀释35倍并提交IC。使用具有CarboPac PA1柱的Dionex ICS-3000系统。应用上表2中所示的以下洗脱液梯度。

柱温为30℃。样品体积5μl。PAD波形“Gold，Carbo，Quad”。将每个反应器批次分给五只禽(各自5/32)。这应该给每只禽38.6g，剩下7/32或54.0g用于分析工作。这些样品如下表13中所示标记。

表13

将这些样品在双向分离器上分成八个级分，各自31±3g。这八个级分中的五个转移到自封袋中。然后，用刮铲将更多材料添加到袋中，每袋填充38.7g(占总重量的5/32)。剩下的材料全部用于分析样品。

结果

下表14中显示了记录的从反应器中倒出的内容物的重量。块1反应器1没有立即称重，并且一旦将热的内容物倒入烤盘中就大量蒸发。因此，第一反应器可能与其他反应器相似。

表14

HPLC结果示于下表15和图20-28中。

表15

HPLC结果非常一致。

对于IC，样品按“原样”运行以得到单体糖浓度，并在通常的HCl水解后获得总的溶解的糖的浓度，如下表16和图29-32所示。

表16

示于表16和图29-32的结果是一致的，并显示了当添加木聚糖酶时总溶解的阿拉伯糖和木糖增加。3μg木聚糖酶情况下的“升级”和30μg木聚糖酶情况下的“高”之间几乎没有差异。单体阿拉伯糖和木糖浓度非常低。对于半乳糖和葡萄糖，没有明确的趋势。因此，这些酶似乎不影响半乳糖和残留的葡萄糖浓度。

显示改进的DDGS营养质量和/或含量的结果示于图33-37中，并特别地显示出明确的趋势，显示该DDGS具有更高的测得脂肪。然而，ADF和NDF纤维的趋势不太明确，并显示出重复之间的差异。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 用于改进动物饲料营养质量的酶共混物和方法

<130> 14642-WO-PCT

<150> US 62/559,163

<151> 2017-09-15

<160> 26

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 390

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 1

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<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

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<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 3

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Ser Ile Leu Arg Ile His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr Lys

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<213> 解淀粉芽孢杆菌

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<210> 5

<211> 390

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌HB-26

<400> 5

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1 5 10 15

Gly Phe Gly Gly Met Asn His Pro Ala Trp Ile Gly Asp Leu Thr Ala

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<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 6

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<212> PRT

<213> 饲料类芽孢杆菌

<400> 7

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Gly Phe Gly Gly Ile Asn His Pro Asn Trp Ile Gly Asp Leu Thr Pro

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Ser Ile Leu Arg Ile Tyr Ile Asp Asp Asn Lys Asn Asn Trp Tyr Lys

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180 185 190

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195 200 205

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325 330 335

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<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 8

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100 105 110

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115 120 125

Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr Met Met Lys Asp Asp Ser Thr Tyr Glu

130 135 140

Met Phe Lys Leu Leu Asn Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser

145 150 155 160

Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp

165 170 175

Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr Pro Thr Asn Lys Ala Gly Ala Lys

180 185 190

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195 200 205

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Ala Asn Ala Gly Thr Gly Asn His Gly Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp

225 230 235 240

Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr Ala Phe Thr Pro His Pro Cys

245 250 255

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Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp

275 280 285

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325 330 335

Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Glu Ser Thr Trp Thr Gly

340 345 350

Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ser

355 360 365

Leu Phe Gln Asp Gln Asn Val Phe Glu Lys His Gly Gly Leu Glu Gly

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<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 9

Met Lys His Leu Ala Ser Ser Ile Ala Leu Thr Leu Leu Leu Pro Ala

1 5 10 15

Val Gln Ala Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp

20 25 30

Ser Gly Pro Thr Ser Cys Val Ala Gly Ala Ala Cys Ser Thr Leu Asn

35 40 45

Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Ala Thr Ser Thr Thr

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Pro Lys Ala Ser Ala Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Val Trp Leu Asp

130 135 140

Val Ala Ala Lys Val Pro Thr Met Gly Thr Tyr Leu Ala Asp Ile Gln

145 150 155 160

Ala Lys Asn Lys Ala Gly Ala Asn Pro Pro Ile Ala Gly Ile Phe Val

165 170 175

Val Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly

180 185 190

Glu Tyr Ser Ile Ala Asn Asn Gly Val Ala Asn Tyr Lys Ala Tyr Ile

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Leu Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Asn

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Val Ala Lys Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Val Asp

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Tyr Ala Leu Lys Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp

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435 440 445

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450

<210> 10

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<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 10

Met Arg Phe Gly Trp Leu Glu Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Ala Asn Ala Gln Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro

20 25 30

Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Asp Ala His Arg Arg Ala Val

35 40 45

Glu Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Gly Ile Arg Phe Ser Asp Leu Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Thr Asn

100 105 110

Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala

115 120 125

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130 135 140

Ala Ala Gly Pro Leu Gly Lys Tyr Pro Asp Gly Gly Arg Ile Trp Glu

145 150 155 160

Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala

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Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile

290 295 300

Ser Phe Asp Asp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Ala Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val

325 330 335

Arg Ile Met Thr Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Arg Ile

340 345 350

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355 360 365

Ser Ala Val Ser Glu Gly Ala Trp Thr Lys Val Asn Asp Phe Val Asn

370 375 380

Val Gln Arg Ser His Ser Gln Ile Ile Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser

385 390 395 400

Thr Val Leu Leu Lys Asn Thr Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu

405 410 415

Val Lys Val Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly

420 425 430

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435 440 445

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645 650 655

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675 680 685

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Asp Ser Ser Asp Asp Pro Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Glu Tyr Ile

725 730 735

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Gln Asp Trp Val Ile Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser

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Ser Ser Arg Lys Leu Pro Leu Arg Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr

850 855 860

<210> 11

<211> 253

<212> PRT

<213> 埃默森青霉菌

<400> 11

Met Leu Ser Ser Thr Thr Arg Thr Leu Ala Phe Thr Gly Leu Ala Gly

1 5 10 15

Leu Leu Ser Ala Pro Leu Val Lys Ala His Gly Phe Val Gln Gly Ile

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Val Ile Gly Asp Gln Phe Tyr Ser Gly Tyr Ile Val Asn Ser Phe Pro

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65 70 75 80

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115 120 125

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<210> 12

<211> 515

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌

<400> 12

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1 5 10 15

Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn

20 25 30

Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys

35 40 45

Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp

50 55 60

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met

85 90 95

Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly

100 105 110

Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln

115 120 125

Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe

130 135 140

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145 150 155 160

Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His

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Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val

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Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val

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515

<210> 13

<211> 356

<212> PRT

<213> 嗜热网团菌

<400> 13

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Lys Glu Glu Ala Lys

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Gly Met Glu Ile Pro Ser Leu Lys Glu Val Tyr Lys Asp Tyr Phe Thr

35 40 45

Ile Gly Ala Ala Val Ser His Leu Asn Ile Tyr His Tyr Glu Asn Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Val Ile His Pro Lys Pro Tyr Val Tyr Asp Phe Gly Pro Ala Asp

85 90 95

Glu Ile Val Asp Phe Ala Met Lys Asn Gly Met Lys Val Arg Gly His

100 105 110

Thr Leu Val Trp His Asn Gln Thr Pro Gly Trp Val Tyr Ala Gly Thr

115 120 125

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Gly His Tyr Lys Gly Lys Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala

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Leu Ser Asp Asn Pro Asn Glu Phe Leu Arg Arg Ala Pro Trp Tyr Asp

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Val Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Leu Glu Asp

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Pro Ile Lys Arg Glu Lys Ala Tyr Lys Leu Val Lys Lys Leu Lys Asp

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Lys Gly Val Pro Ile His Gly Ile Gly Ile Gln Gly His Trp Thr Leu

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Ala Trp Pro Thr Pro Lys Met Leu Glu Asp Ser Ile Lys Arg Phe Ala

245 250 255

Glu Leu Gly Val Glu Val Gln Val Thr Glu Phe Asp Ile Ser Ile Tyr

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275 280 285

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Pro Leu Leu Phe Asp Lys Asn His Asn Pro Lys Lys Ala Phe Trp Glu

340 345 350

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355

<210> 14

<211> 203

<212> PRT

<213> 嗜热网团菌

<400> 14

Gln Thr Ser Ile Thr Leu Thr Ser Asn Ala Ser Gly Thr Phe Asp Gly

1 5 10 15

Tyr Tyr Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Thr Gly Asn Thr Thr Met Thr Val

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115 120 125

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Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Thr

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Asp His Phe Arg Ala Trp Ala Asn Arg Gly Leu Asn Leu Gly Thr Ile

165 170 175

Asp Gln Ile Thr Leu Cys Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala

180 185 190

Asn Ile Thr Gln Asn Thr Phe Ser Gln Gly Ser

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<210> 15

<211> 383

<212> PRT

<213> 丝衣霉状篮状菌

<400> 15

Asp Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Phe Gly

1 5 10 15

Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Ser Asp Val Ala Tyr Glu Thr Gln

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Leu Asn Asn Thr Gln Asp Phe Gly Gln Ile Thr Pro Ala Asn Ser Met

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50 55 60

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65 70 75 80

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Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Arg Cys Tyr Ala Trp Asp Val

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145 150 155 160

Ala Ala Ala Asp Pro Asn Val Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile

165 170 175

Glu Tyr Ala Gly Val Lys Ala Thr Ala Ala Gln Asn Ile Val Lys Leu

180 185 190

Val Gln Ser Tyr Gly Ala Arg Ile Asp Gly Val Gly Leu Gln Ser His

195 200 205

Phe Ile Val Gly Glu Thr Pro Ser Thr Ser Thr Gln Ala Ser Asn Met

210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Asp Ala Cys Pro Trp Asp Asp Asn Tyr

290 295 300

Gln Lys Lys Pro Ala Tyr Tyr Gly Ile Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ser

305 310 315 320

Ala Ser Thr Thr Thr Val Gly Thr Gly Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ala

325 330 335

Thr Thr Ser Ser Thr Gly Ser Ser Gly Thr Gly Val Ala Gln His Trp

340 345 350

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355 360 365

Gly Tyr Thr Cys Thr Val Val Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

370 375 380

<210> 16

<211> 385

<212> PRT

<213> 雷塞氏篮状菌

<400> 16

Ala Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Phe Gly

1 5 10 15

Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Met Gln Glu

20 25 30

Thr Asp Asn Thr Asp Asp Phe Gly Gln Leu Thr Pro Ala Asn Ser Met

35 40 45

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Gly Asp Gln Ile Ala Asn Leu Ala Lys Ser Asn Gly Gln Met Leu Arg

65 70 75 80

Cys His Asn Leu Val Trp Tyr Asn Gln Leu Pro Ser Trp Val Thr Ser

85 90 95

Gly Ser Trp Thr Asn Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Lys Asn His Ile

100 105 110

Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Gln Cys Tyr Ala Trp Asp Val

115 120 125

Val Asn Glu Ala Leu Asn Asp Asp Gly Thr Tyr Arg Ser Asn Val Phe

130 135 140

Tyr Gln Tyr Ile Gly Glu Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Ala Thr Ala

145 150 155 160

Ala Ala Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile

165 170 175

Glu Tyr Pro Gly Ala Lys Ala Thr Ala Ala Gln Asn Ile Val Lys Met

180 185 190

Val Lys Ala Tyr Gly Ala Lys Ile Asp Gly Val Gly Leu Gln Ser His

195 200 205

Phe Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Gln Ser Ser Gln Gln Ser Asn Met

210 215 220

Ala Ala Phe Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp

225 230 235 240

Ile Arg Met Thr Leu Pro Ser Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gln Gln Ser

245 250 255

Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Val Ser Ala Cys Val Asn Thr Pro Lys Cys

260 265 270

Ile Gly Ile Thr Leu Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro

275 280 285

Asn Thr Phe Ser Gly Gln Gly Asp Ala Cys Pro Trp Asp Ser Asn Tyr

290 295 300

Gln Lys Lys Pro Ala Tyr Tyr Gly Ile Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ser

305 310 315 320

Ala Ser Thr Ser Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Thr Arg Thr Ser

325 330 335

Thr Thr Thr Ser Thr Ser Ala Thr Ser Thr Ser Thr Gly Val Ala Gln

340 345 350

His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys

355 360 365

Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Tyr Gln Cys

370 375 380

Leu

385

<210> 17

<211> 378

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 17

Ala Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Lys Gly Leu Lys Tyr Phe Gly

1 5 10 15

Ser Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Thr Asp Ser Ala Tyr Val Ala Gln

20 25 30

Leu Ser Asn Thr Asp Asp Phe Gly Gln Ile Thr Pro Gly Asn Ser Met

35 40 45

Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Asn Ser Phe Ser Phe Ala Asn

50 55 60

Gly Asp Ala Val Val Asn Leu Ala Asn Lys Asn Gly Gln Leu Met Arg

65 70 75 80

Cys His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Asn Trp Val Ser Ser

85 90 95

Gly Ser Trp Thr Asn Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Lys Asn His Ile

100 105 110

Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Lys Cys Tyr Ala Trp Asp Val

115 120 125

Val Asn Glu Ala Leu Asn Glu Asp Gly Thr Phe Arg Asn Ser Val Phe

130 135 140

Tyr Gln Ile Ile Gly Pro Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Ala Thr Ala

145 150 155 160

Ala Ala Ala Asp Pro Asp Val Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile

165 170 175

Glu Tyr Ser Gly Ala Lys Ala Thr Ala Ala Gln Asn Ile Val Lys Met

180 185 190

Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Lys Ile Asp Gly Val Gly Leu Gln Ala His

195 200 205

Phe Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Gln Ser Asp Leu Thr Thr Val Leu

210 215 220

Lys Gly Tyr Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Tyr Thr Glu Leu Asp

225 230 235 240

Ile Arg Met Gln Leu Pro Ser Thr Ala Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser

245 250 255

Thr Asp Phe Gln Gly Val Ala Ala Ala Cys Val Ser Thr Thr Gly Cys

260 265 270

Val Gly Val Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro

275 280 285

Ser Val Phe Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Leu Pro Trp Asp Glu Asn Tyr

290 295 300

Val Lys Lys Pro Ala Tyr Asp Gly Leu Met Ala Gly Leu Gly Ala Ser

305 310 315 320

Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Gly

325 330 335

Gly Thr Asp Pro Thr Gly Val Ala Gln Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly

340 345 350

Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln

355 360 365

Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu

370 375

<210> 18

<211> 409

<212> PRT

<213> 雷塞氏篮状菌

<400> 18

Met Lys Phe Ser Asn Val Ile Leu Ala Ala Ser Ala Ser Ser Leu Val

1 5 10 15

Leu Ala Ala Pro Lys Ser Lys Thr Lys Arg Thr Ser Ala Phe Gln Trp

20 25 30

Phe Gly Ala Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Asn Gln Asn Ile Pro

35 40 45

Gly Thr Leu Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Pro Asp Thr Ser Thr Ile Gln

50 55 60

Thr Leu Arg Asn Ala Gly Met Asn Ile Phe Arg Val Pro Phe Leu Met

65 70 75 80

Glu Arg Leu Val Pro Asn Gln Met Thr Gly Ser Pro Asp Pro Thr Tyr

85 90 95

Leu Ala Asp Leu Lys Ser Thr Val Asn Phe Ile Thr Gly Thr Gly Ala

100 105 110

Tyr Ala Val Val Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Asn Asn Ile

115 120 125

Ile Thr Ser Thr Ser Asp Phe Ala Ala Phe Trp Thr Thr Val Ala Ser

130 135 140

Gln Phe Ala Ser Asn Pro Arg Val Ile Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr

145 150 155 160

Asn Asn Met Asp Gln Thr Leu Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile

165 170 175

Asn Ala Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Ile Phe Ala Glu

180 185 190

Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Ser Val Asn Asp Asn

195 200 205

Met Lys Gln Leu Thr Asp Pro Ser Asn Lys Leu Val Tyr Glu Met His

210 215 220

Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Asp Gln Cys Val Asn

225 230 235 240

Ser Thr Ile Gly Tyr Asp Arg Ile Val Ser Ala Thr Gln Trp Leu Gln

245 250 255

Ala Asn Gly Lys Val Ala Phe Leu Gly Glu Phe Ala Gly Gly Ser Asn

260 265 270

Ser Val Cys Glu Ala Ala Val Thr Gly Met Leu Asp Tyr Met Glu Gln

275 280 285

Asn Ser Asp Val Trp Leu Gly Ala Glu Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp

290 295 300

Trp Gly Asn Tyr Ile Tyr Ser Met Glu Pro Pro Ser Gly Ile Ala Tyr

305 310 315 320

Gln Asn Tyr Leu Ser Ile Leu Glu Pro Tyr Phe Pro Gly Gly Ser Tyr

325 330 335

Ser Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Thr Thr Thr Ala Thr

340 345 350

Thr Thr Thr Thr Lys Val Pro Pro Thr Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ser

355 360 365

Ser Thr Gly Thr Gly Val Ala Gln His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln

370 375 380

Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Glu

385 390 395 400

Leu Asn Pro Tyr Tyr Tyr Gln Cys Leu

405

<210> 19

<211> 334

<212> PRT

<213> 胶囊青霉

<400> 19

Met Lys Phe Ser Asn Leu Val Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala

1 5 10 15

Met Ala Leu Pro Leu Thr Lys Lys His Ala Lys Arg Ala Ser Ser Phe

20 25 30

Glu Trp Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser Gly Asn

35 40 45

Ile Pro Gly Val Tyr Gly Thr Asp Tyr Ile Phe Pro Ser Thr Ser Ala

50 55 60

Ile Gln Thr Leu Ile Asn Asn Gly Met Asn Ile Phe Arg Val Thr Phe

65 70 75 80

Met Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Thr Met Thr Gly Ser Phe Asp Ala

85 90 95

Glu Tyr Leu Ser Asn Leu Thr Ser Val Val Asn Tyr Ile Thr Glu Ala

100 105 110

Gly Ala His Ala Val Ile Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly

115 120 125

Ser Ile Ile Ser Ser Thr Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Lys Asn Val

130 135 140

Ala Gly Gln Phe Lys Ser Asn Ser Leu Val Ile Phe Asp Thr Asn Asn

145 150 155 160

Glu Tyr His Asp Met Asp Gln Thr Leu Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala

165 170 175

Ala Ile Asn Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Ile Phe

180 185 190

Val Glu Gly Asn Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Ala Asp Val Asn

195 200 205

Asp Asn Leu Lys Asn Leu Thr Asp Pro Gln Asn Lys Ile Val Tyr Glu

210 215 220

Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Ala Thr Cys

225 230 235 240

Val Ser Thr Thr Ile Gly Lys Glu Arg Val Thr Ser Ala Thr Gln Trp

245 250 255

Leu Gln Lys Asn Gly Lys Val Gly Ile Leu Gly Glu Phe Ala Gly Gly

260 265 270

Val Asn Asp Gln Cys Lys Thr Ala Ile Thr Gly Met Leu Ser Tyr Leu

275 280 285

Glu Asp Asn Ser Asp Val Trp Arg Gly Ala Met Trp Trp Ala Ala Gly

290 295 300

Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe Ser Leu Glu Pro Pro Ser Gly Thr

305 310 315 320

Ala Tyr Thr Gly Met Trp Ser Thr Leu Lys Ser Tyr Leu Ala

325 330

<210> 20

<211> 394

<212> PRT

<213> 褐孢长毛盘菌

<400> 20

Met His Ser Phe Phe Ser Leu Ala Leu Ala Val Ala Gly Leu Pro Ala

1 5 10 15

Leu Ile Asn Ala Gln Gln Ser Ala Trp Gly Gln Cys Gly Gly Val Gly

20 25 30

Trp Thr Gly Ala Thr Thr Cys Val Ser Gly Tyr Tyr Cys Ser Lys Leu

35 40 45

Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Ile Pro Gly Thr Ala Ser Thr Thr Thr

50 55 60

Ser Ala Val Ser Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ser Pro Thr Gly Ser Val

65 70 75 80

Cys Ser Gly Asn Arg Thr Lys Phe Lys Tyr Phe Gly Val Asn Glu Ser

85 90 95

Gly Ala Glu Phe Gly Asn Asn Val Val Pro Gly Thr Leu Gly Lys Asp

100 105 110

Tyr Thr Trp Pro Thr Thr Asp Ser Val Asp Phe Phe Leu Gly Lys Gly

115 120 125

Met Asn Thr Phe Arg Ile Ala Phe Leu Met Glu Arg Leu Ser Pro Pro

130 135 140

Ala Gly Gly Leu Thr Gly Thr Phe Asp Pro Thr Tyr Leu Ala Ser Leu

145 150 155 160

Lys Asn Ile Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Lys Gly Gly Tyr Ala Ile Ile

165 170 175

Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Asn Gly Asn Ile Ile Thr Asp Tyr

180 185 190

Thr Ser Phe Gly Thr Trp Cys Lys Asn Leu Ala Ser Gln Phe Lys Ser

195 200 205

Asp Ser His Ile Ile Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp

210 215 220

Glu Thr Leu Val Phe Asn Leu Asn Gln Ala Cys Ile Asn Gly Ile Arg

225 230 235 240

Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Leu Ile Leu Ile Glu Gly Asn Ser Trp

245 250 255

Thr Gly Ala Trp Thr Trp Ile Ser Ser Gly Asn Ala Ala Ser Leu Ile

260 265 270

Asn Leu Thr Asp Pro Asn Asn Asn Ile Ala Tyr Glu Met His Gln Tyr

275 280 285

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Pro Thr Cys Val Ser Ser Thr

290 295 300

Ile Gly Ala Glu Arg Leu Ala Ala Ala Thr Ala Trp Leu Gln Ala Asn

305 310 315 320

Asn Lys Lys Gly Phe Leu Gly Glu Ile Gly Ala Gly Ser Asn Asp Asp

325 330 335

Cys Ile Ala Ala Val Lys Gly Ala Leu Cys Ser Met Gln Glu Ala Gly

340 345 350

Gly Val Trp Leu Gly Ala Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly

355 360 365

Asp Tyr Tyr Gln Ser Ile Glu Pro Pro Asp Gly Ala Ala Ile Ala Arg

370 375 380

Ile Leu Pro Glu Ala Leu Leu Pro Phe Leu

385 390

<210> 21

<211> 294

<212> PRT

<213> 粪生粪壳菌

<400> 21

Met Arg Ser Ser Thr Ile Leu Gln Thr Gly Leu Val Ala Val Leu Pro

1 5 10 15

Phe Ala Val Gln Ala Ala Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp

20 25 30

Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Ser Gly Lys Ala Ser Val Asn

35 40 45

Arg Pro Val Leu Ala Cys Asp Ala Asn Asn Asn Pro Leu Asn Asp Ala

50 55 60

Asn Val Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Cys Ala Asn

65 70 75 80

Asn Ser Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala

85 90 95

Thr Lys Leu Ser Gly Gly Thr Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr

100 105 110

Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Thr Leu Val Val

115 120 125

Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu

130 135 140

Asn Met Pro Gly Gly Gly Val Gly Leu Phe Asp Gly Cys Lys Arg Glu

145 150 155 160

Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser

165 170 175

Glu Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg

180 185 190

Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Glu Phe Thr Phe Lys Gln

195 200 205

Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn

210 215 220

Asp Asp Ser Gln Phe Pro Ala Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Asn Pro Ser Thr Pro Thr Thr Pro Pro Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Cys Ala Ala Ala Met Tyr Ala Gln Cys Gly Gly Ser Gly Phe Ser

260 265 270

Gly Cys Thr Asn Cys Pro Ser Gly Ser Thr Cys Lys Ala Ile Asn Asp

275 280 285

Tyr Tyr His Gln Cys Ala

290

<210> 22

<211> 278

<212> PRT

<213> 土生梭孢壳霉

<400> 22

Ala Ser Gly Ser Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro

1 5 10 15

Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro Val Tyr Ala

20 25 30

Cys Asp Ala Asn Phe Gln Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val Gln Ser Gly

35 40 45

Cys Asn Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala

50 55 60

Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly

65 70 75 80

Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr

85 90 95

Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr

100 105 110

Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro Gly Gly

115 120 125

Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ser Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro

130 135 140

Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asp Gln Cys Asp Ser Phe

145 150 155 160

Pro Ala Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln

165 170 175

Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Gln Val Gln Cys Pro Ala

180 185 190

Glu Ile Val Ala Arg Ser Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp Ser Ser Phe

195 200 205

Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Gly Thr Pro

210 215 220

Thr Ser Thr Ala Pro Gly Ser Gly Gln Thr Ser Pro Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Ser

245 250 255

Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Lys Leu Asn Asp

260 265 270

Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

275

<210> 23

<211> 595

<212> PRT

<213> 草酸青霉

<400> 23

Arg Pro Asp Pro Lys Gly Gly Asn Leu Thr Pro Phe Ile His Lys Glu

1 5 10 15

Gly Glu Arg Ser Leu Gln Gly Ile Leu Asp Asn Leu Gly Gly Arg Gly

20 25 30

Lys Lys Thr Pro Gly Thr Ala Ala Gly Leu Phe Ile Ala Ser Pro Asn

35 40 45

Thr Glu Asn Pro Asn Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu

50 55 60

Thr Ala Lys Cys Leu Ile Asp Leu Phe Glu Asp Ser Arg Ala Lys Phe

65 70 75 80

Pro Ile Asp Arg Lys Tyr Leu Glu Thr Gly Ile Arg Asp Tyr Lys Ser

85 90 95

Ser Gln Ala Ile Leu Gln Ser Val Ser Asn Pro Ser Gly Thr Leu Lys

100 105 110

Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Ile Asp Leu Asn Pro

115 120 125

Phe Ser Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg

130 135 140

Ala Thr Ala Met Ile Thr Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Ser His Gly Gln

145 150 155 160

Lys Ser Asp Val Ser Gln Val Met Trp Pro Ile Ile Ala Asn Asp Leu

165 170 175

Ala Tyr Val Gly Gln Tyr Trp Asn Asn Thr Gly Phe Asp Leu Trp Glu

180 185 190

Glu Val Asp Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala

195 200 205

Leu Val Glu Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys Leu Gly Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Ala Cys Asp Ser Gln Pro Pro Gln Ile Leu Cys Phe Leu Gln Ser Phe

225 230 235 240

Trp Asn Gly Lys Tyr Ile Thr Ser Asn Ile Asn Thr Gln Ala Ser Arg

245 250 255

Ser Gly Ile Asp Leu Asp Ser Val Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp

260 265 270

Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ala Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg

275 280 285

Ala Leu Ala Asn His Lys Val Tyr Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr

290 295 300

Lys Ile Asn Ala Gly Leu Ala Glu Gly Ser Ala Ala Asn Val Gly Arg

305 310 315 320

Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr

325 330 335

Leu Gly Ala Ser Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Arg

340 345 350

Leu Gly Lys Leu Glu Val Ser Glu Thr Ser Leu Ser Phe Phe Lys Asp

355 360 365

Phe Asp Ala Thr Val Lys Ile Gly Ser Tyr Ser Arg Asn Ser Lys Thr

370 375 380

Tyr Lys Lys Leu Thr Gln Ser Ile Lys Ser Tyr Ala Asp Gly Phe Ile

385 390 395 400

Gln Leu Val Gln Gln Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Ser Leu Ala Glu Gln

405 410 415

Tyr Asp Arg Asn Thr Ala Ala Pro Leu Ser Ala Asn Asp Leu Thr Trp

420 425 430

Ser Phe Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Gln Arg Arg Asp Ala Val Val

435 440 445

Pro Pro Ser Trp Gly Ala Lys Ser Ala Asn Lys Val Pro Thr Thr Cys

450 455 460

Ser Ala Ser Pro Val Val Gly Thr Tyr Lys Ala Pro Thr Ala Thr Phe

465 470 475 480

Ser Ser Lys Thr Lys Cys Val Pro Ala Lys Asp Ile Val Pro Ile Thr

485 490 495

Phe Tyr Leu Ile Glu Asn Thr Tyr Tyr Gly Glu Asn Val Phe Met Ser

500 505 510

Gly Asn Ile Thr Ala Leu Gly Asn Trp Asp Ala Lys Lys Gly Phe Pro

515 520 525

Leu Thr Ala Asn Leu Tyr Thr Gln Asp Gln Asn Leu Trp Phe Ala Ser

530 535 540

Val Glu Phe Ile Pro Ala Gly Thr Pro Phe Glu Tyr Lys Tyr Tyr Lys

545 550 555 560

Val Glu Pro Asn Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys Gly Pro Asn Arg Val

565 570 575

Phe Val Ala Pro Thr Gly Cys Pro Val Gln Pro His Ser Asn Asp Val

580 585 590

Trp Gln Phe

595

<210> 24

<211> 412

<212> PRT

<213> 激烈火球菌

<400> 24

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr

1 5 10 15

Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile

20 25 30

Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val

35 40 45

Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp

50 55 60

His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala

85 90 95

Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile

100 105 110

Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile

115 120 125

Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr

130 135 140

Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val

145 150 155 160

Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly

165 170 175

Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys

180 185 190

Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly

195 200 205

Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala

210 215 220

Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr

225 230 235 240

Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala

245 250 255

Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys

260 265 270

Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala

275 280 285

Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn

290 295 300

Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys

305 310 315 320

Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr

325 330 335

Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu

340 345 350

Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr

355 360 365

Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr

370 375 380

Ile Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val

385 390 395 400

Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser

405 410

<210> 25

<211> 177

<212> PRT

<213> 桔橙嗜热子囊菌

<400> 25

Thr Arg Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser Arg Gln Ser Ala Leu Thr Thr

1 5 10 15

Ala Leu Arg Asn Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala Ala Ala Asp Ala Ala

20 25 30

Gln Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser

35 40 45

Ser Ser Thr Arg Gln Thr Val Ala Ala Arg Leu Arg Ala Val Ala Arg

50 55 60

Glu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys Asp Asp

65 70 75 80

Pro Tyr Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Val Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ser

85 90 95

Tyr Asn Ile Ile Ala Asn Cys Asp Ile Phe Tyr Thr Tyr Leu Pro Ala

100 105 110

Leu Thr Ser Thr Cys His Ala Gln Asp Gln Ala Thr Thr Ala Leu His

115 120 125

Glu Phe Thr His Ala Pro Gly Val Tyr Ser Pro Gly Thr Asp Asp Leu

130 135 140

Ala Tyr Gly Tyr Gln Ala Ala Met Gly Leu Ser Ser Ser Gln Ala Val

145 150 155 160

Met Asn Ala Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr Ala Asn Ala Ile Tyr Leu Gly

165 170 175

Cys

<210> 26

<211> 583

<212> PRT

<213> 合成构建体

<400> 26

Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu

20 25 30

Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp

35 40 45

Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro

50 55 60

Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala

100 105 110

Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly

115 120 125

Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp Gln

130 135 140

Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp

145 150 155 160

Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly

165 170 175

Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys

180 185 190

His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val

195 200 205

Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro

210 215 220

Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala

225 230 235 240

Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser

245 250 255

Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu

260 265 270

Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln

275 280 285

Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly

290 295 300

Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly

305 310 315 320

Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp

325 330 335

Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg

340 345 350

Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn

355 360 365

Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr

370 375 380

Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe

385 390 395 400

Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr

405 410 415

Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro

420 425 430

Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro

435 440 445

Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala

450 455 460

Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr

465 470 475 480

Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu

485 490 495

Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr

500 505 510

Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro

515 520 525

Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr

530 535 540

Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp

545 550 555 560

Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala

565 570 575

Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg

580

Claims

1.一种生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(b)使用发酵生物发酵以生产该发酵产物；以及

(c)任选地回收副产物。

(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；

(c)使用发酵生物进行发酵；以及

(d)任选地回收副产物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中糖化和发酵同时进行。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料包含玉蜀黍、玉米、小麦、黑麦、大麦、黑小麦、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，特别是乙醇。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该副产物是干酒糟(DDG)或含可溶物的干酒糟(DDGS)。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中与作为用于生产发酵产物的其中不存在或未添加该木聚糖酶或包含该木聚糖酶的酶共混物的方法的副产物回收的DDG或DDGS相比，该DDG或DDGS具有改进的营养质量。

8.如权利要求7所述的方法，其中该DDG或DDGS具有增加的脂肪含量。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中与在该方法的糖化步骤、发酵步骤、和/或同时糖化和发酵步骤期间不存在木聚糖酶或包含木聚糖酶的酶共混物时生产的DGS或DDGS的TME相比，该DGS或DDGS的真代谢能增加至少5％、至少10％、至少15％、或至少20％。

10.如权利要求9所述的方法，其中该TME是针对单胃动物。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中与在如权利要求10至16中任一项所述的方法的糖化步骤、发酵步骤、和/或同时糖化和发酵步骤期间不存在如权利要求1至9中任一项所述的酶共混物时生产的DGS或DDGS相比，在干燥后生产的该DGS或DDGS没有变黑。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酵母，特别是酵母菌属物种，更特别是酿酒酵母。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该酶共混物还包含纤维素分解组合物。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物以约5:95至约95:5，如5:95、10:90、20:80、50:50、80:20、90:10、和95:5的木聚糖酶与纤维素分解组合物比率，存在于该共混物中。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶是GH30家族木聚糖酶。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶是GH30_8木聚糖酶。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该木聚糖酶是GH30_8木聚糖酶，其选自下组，该组由以下组成：

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：

(i)纤维二糖水解酶I；

(ii)纤维二糖水解酶II；

(iii)β-葡糖苷酶；以及

(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包含选自由以下组成的组的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种酶：

(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；以及

(iv)具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌(Penicillium emersonii)GH61A多肽。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包含：

(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸27至532的纤维二糖水解酶I或其变体，该变体与SEQ IDNO:8的氨基酸27至532具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；

(ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸20至454的纤维二糖水解酶II或其变体，该变体与SEQID NO:9的氨基酸20至454具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物还包含内切葡聚糖酶。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物源自选自由曲霉属、青霉属、篮状菌属、和木霉属组成的组的菌株，任选地其中：(i)该曲霉属菌株选自下组，该组由以下组成：黄曲霉、黑曲霉和米曲霉；(ii)该青霉属菌株选自下组，该组由以下组成：埃默森青霉菌和草酸青霉菌；(iii)该篮状菌属菌株选自下组，该组由以下组成：金黄篮状菌和埃默森篮状菌；并且(iv)该木霉属菌株是里氏木霉。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物。

24.如权利要求1至23中任一项所述的酶共混物用于改进作为如权利要求1至23中任一项所述的发酵产物生产方法的副产物而生产的DGS或DDGS的营养质量的用途，优选地该发酵产物生产方法不导致该DDG或DDGS变黑。

25.如权利要求1至23中任一项所述的酶共混物用于溶解纤维、优选地用于溶解木糖和阿拉伯糖的用途。