ES2837155T3

ES2837155T3 - Uso de PD-1 y Tim-3 como medida de células CD8+ para predecir y tratar el carcinoma de células renales

Info

Publication number: ES2837155T3
Application number: ES17700023T
Authority: ES
Inventors: Eric Tartour; Charles Dariane; Clémence Granier; Alain Gey
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes
Priority date: 2016-01-04
Filing date: 2017-01-03
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2037-01-03
Also published as: WO2017118634A1; EP3400443B1; EP3400443A1; US20200264165A1

Abstract

Un método para predecir el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece carcinoma de células renales que comprende las etapas de: i) cuantificar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto, ii) comparar el porcentaje cuantificado en la etapa i) con su valor de referencia predeterminado correspondiente y iii) concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia corto cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es mayor que su valor de referencia predeterminado correspondiente o concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia largo cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es menor que su valor de referencia predeterminado correspondiente.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de PD-1 y Tim-3 como medida de células CD8+ para predecir y tratar el carcinoma de células renales

Campo:

La descripción se encuentra en el campo de la oncología. En particular, la descripción se refiere a métodos y composiciones farmacéuticas para predecir y tratar a un sujeto que padece carcinoma de células renales.

Antecedentes:

El cáncer es el resultado de modificaciones genéticas en células normales que desregulan el ciclo de crecimiento y división celular, supervivencia celular, metabolismo energético y migración celular, lo que hace que las células se vuelvan autónomas de las señales de control, se reproduzcan de forma incontrolable (Hanahan et al., 2011) y establezcan sucesos inflamatorios crónicos en el hospedante.

El microambiente de un tumor en desarrollo es un tejido complejo compuesto por células tumorales en proliferación, células estromales, células endoteliales linfáticas, vasos sanguíneos, fibroblastos, células inmunitarias infiltrantes (células mieloides y linfoides) y la matriz extracelular (ECM). Es un ambiente único que surge durante el tumor y está dominado por el tumor para proporcionar a las células tumorales nutrientes y oxígeno derivados de las redes de vascularización y factores de crecimiento producidos por las células inflamatorias y estromales para su crecimiento e invasión pero también promueve la infiltración de células inmunitarias. (Fridman et al., 2014).

El estroma tumoral resulta infiltrado con muchas otras células inmunitarias, incluyendo neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos/macrófagos, células dendríticas (DC), células citolíticas naturales (NK) y linfocitos. Entre estas, la célula más predominantes en el medio son los macrófagos asociados a tumores (TAM) y las poblaciones de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de células T CD3+ CD4+ y CD3+ CD8+ que presentan principalmente un fenotipo M2 y no Th1 respectivamente, cuando se establece la transición de una fase precancerosa a un tumor invasivo (Whiteside, 2008). En la mayoría de los casos se encuentran macrófagos, granulocitos y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) que infiltran o rodean los lechos tumorales tanto en el núcleo como en el frente invasivo del tumor (Bingle et al., 2002; Serafini et al., 2006). Las células NK se pueden encontrar en el estroma y el margen invasivo (Platonova et al., 2011), mientras que las DC inmaduras se encuentran en el núcleo del tumor o en el estroma (Gabrilovich et al., 1996). Los perfiles inmunológicos intratumorales se correlacionan con la supervivencia en pacientes afectados por ccRCC primario. Más particularmente, la infiltración de macrófagos M2 y Treg se correlaciona con una supervivencia reducida (Stefanie Regine Dannememann et al. 2013).

La distribución de TIL no es uniforme entre los tipos de tumores, pero se encuentran principalmente todos los subconjuntos de células T en el margen invasivo y en el núcleo del tumor. Las células B se encuentran principalmente en el margen invasivo del tumor, mientras que las células T, en especial las células T CD8+, se encuentran en el núcleo del tumor y el margen invasivo, donde tienen una mejor interacción con las células tumorales.

Las respuestas de las células T CD8+ son necesarias para el control de los tumores. Tras encontrarse con el antígeno a través de sus TCR, las células T CD8+ na'íve inician múltiples señales intracelulares que conducen a una respuesta celular. Esto incluye cambios en el fenotipo de la superficie celular, alta proliferación, adquisición de funciones efectoras (tales como secreción de citoquinas y citotoxicidad) y requisitos de supervivencia alterados para constituir la reserva de memoria.

Una vez que las células T CD8+ adquieren sus funciones efectoras, una variedad de moléculas efectoras producen y median la defensa contra las células cancerosas a través de la citolisis directa de las células diana (mediada por moléculas de perforina y granzima), señalización de Fas, secreción de citoquinas (TNF-a, IFN-y) y quimiocinas que atraen células inflamatorias (Harty et al., 2000; Wong y Pamer, 2003).

En tumores tales como el cáncer colorrectal, cáncer de pulmón y carcinoma de ovario, las altas densidades de células de memoria intratumorales (CD45RO+) y células T CD8+ se correlacionan con un pronóstico favorable.

El cáncer de riñón, también llamado "cáncer renal" o "carcinoma de células renales", se refiere al cáncer que ha surgido del riñón. El carcinoma de células renales (RCC), también conocido como cáncer de células renales o adenocarcinoma de células renales, es con mucho el tipo más común de cáncer de riñón y se origina en el revestimiento del túbulo contorneado proximal. Aproximadamente 9 de cada 10 cánceres de riñón son carcinomas de células renales. Más específicamente, el RCC abarca varios subtipos histológicos relativamente comunes: carcinoma de células renales de células claras, carcinoma papilar (cromófilo), cromófobo, de los conductos colectores y carcinoma medular. El carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) es el subtipo más común de RCC. La incidencia de ccRCC está aumentando y comprende 80% de la enfermedad localizada y más de 90% de la enfermedad metastásica.

La inmunoterapia es una nueva clase de tratamiento para el cáncer que trabaja para aprovechar las capacidades innatas del sistema inmunitario para combatir el cáncer. Debido a las propiedades únicas del sistema inmunitario, estas terapias pueden tener un mayor potencial que los enfoques de tratamiento actuales para combatir el cáncer de manera más poderosa, ofrecer protección a largo plazo contra la enfermedad, tener menos efectos secundarios y beneficiar a más pacientes con más tipos de cáncer. Existen diferentes estrategias de inmunoterapia para tratar el cáncer de riñón: 1) las citoquinas que se usan con mayor frecuencia para tratar el cáncer de riñón son la interleuquina-2 (IL-2) y el interferón-alfa. Ambas citoquinas pueden hacer que los cánceres de riñón se reduzcan en un pequeño porcentaje de pacientes. La administración de altas dosis de IL-2 parece ofrecer la mejor posibilidad de reducir el cáncer, pero esto puede causar efectos secundarios graves, por lo que, para empezar, no se usa en personas que tienen una mala salud en general. Se necesita un cuidado especial para reconocer y tratar estos efectos secundarios; 2) el tratamiento con interferón tiene efectos secundarios menos graves que la IL-2, pero no parece ser tan eficaz cuando se usa solo. Se usa con más frecuencia en combinación con el fármaco dirigido bevacizumab (Avastin); 3) una parte importante del sistema inmunitario es su capacidad para evitar que él mismo ataque las células normales del cuerpo. Para hacer esto, usan "puntos de control", que son moléculas en las células inmunitarias que deben activarse (o desactivarse) para iniciar una respuesta inmunitaria. Las células cancerosas a veces usan estos puntos de control para evitar ser atacadas por el sistema inmunológico. Pero los fármacos más nuevos que se dirigen a estos puntos de control son muy prometedores como tratamientos para el cáncer. Los fármacos que se dirigen a PD-1, una proteína en las células del sistema inmunitario llamadas células T de muerte celular programada 1, que normalmente ayuda a evitar que estas células ataquen a otras células del cuerpo. Al bloquear PD-1, el fármaco estimula la respuesta inmunitaria contra las células cancerosas. Sin embargo, en el cáncer RCC, el tratamiento basado en la inhibición de PD-1 produce sólo aproximadamente 30% de respuestas clínicas en pacientes con cáncer. S.F. Ngiow et al. 2015 han demostrado que las Treg intratumorales son en parte responsables del desarrollo de tumores resistentes a anti-PD1 y células T CD8+ PD1 hi. La coexpresión de distintos receptores inhibidores se ha asociado con un mayor agotamiento de las células T (Sakuishi et al. 2010, Jing et al. 2014 y Jiang et al. 2015). Un ensayo clínico reciente en fase III ha mostrado que los pacientes con carcinoma de células renales avanzado que habían recibido tratamiento antiangiogénico previo tenían una supervivencia más larga con el tratamiento de nivolumab que con el tratamiento de everolimus (Motzer et al 2015). En este ensayo, la expresión de PD-L1 no se correlacionó con la respuesta al tratamiento, por lo que es necesario identificar y validar otros biomarcadores de la respuesta al tratamiento.

Por lo tanto, es necesario encontrar una estrategia de tratamiento que permita tener pocos efectos secundarios y evite las recaídas.

Compendio:

La descripción se refiere a:

Un método para predecir el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece carcinoma de células renales que comprende las etapas de: i) cuantificar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto, ii) comparar el porcentaje cuantificado en la etapa i) con su valor de referencia predeterminado correspondiente y iii) concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia corto cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es mayor que su valor de referencia predeterminado correspondiente o concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia prolongado cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es menor que su valor de referencia predeterminado correspondiente.

El método de la descripción, en donde la cuantificación del porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se determina mediante inmunohistoquímica (IHC).

El método de la descripción, en donde la cuantificación del porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se determina mediante un microscopio automatizado.

Un método para determinar si un sujeto que padece un carcinoma de células renales logrará una respuesta con un inhibidor de puntos de control inmunitario que comprende las etapas de i) cuantificar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto tratado con un inhibidor de puntos de control inmunitario, ii) comparar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 cuantificadas en la etapa i) con sus valores de referencia predeterminados correspondientes y iii) concluir que el sujeto no responderá al tratamiento cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es mayor que su valor de referencia predeterminado correspondiente o concluir que el sujeto responderá al tratamiento cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es menor que su correspondiente valor de referencia predeterminado.

El método de la descripción, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo.

El método de la descripción, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal.

El método de la descripción, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-1.

El método de la descripción, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-L1.

El método de la descripción, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-L2.

El método de la descripción, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-Tim-3.

El método de la descripción, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es una molécula orgánica pequeña.

El método de la descripción, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un aptámero.

Descripción detallada:

Usando una nueva tecnología de formación de imágenes in situ de inmunofluorescencia múltiple espectral, los autores de la presente descripción mostraron que la importancia clínica de PD-1 en células T CD8+ difiere si se coexpresaba o no con Tim-3. De hecho, mostraron que los pacientes con carcinoma de células renales que coexpresaban PD-1 y Tim-3 tenían un fenotipo más agresivo definido por un grado de Fuhrman alto y un tumor de mayor tamaño y una puntuación de TNM y UISS avanzada.

Por consiguiente, la presente descripción se refiere a un método para predecir el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece carcinoma de células renales que comprende las etapas de: i) cuantificar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto, ii) comparar el porcentaje cuantificado en la etapa i) con sus valores de referencia predeterminados correspondientes y iii) concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia corto cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim -3 es mayor que su valor de referencia predeterminado correspondiente o concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia prolongado cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es menor que su valor de referencia predeterminado correspondiente.

Como se usa en la presente memoria, las expresiones "cáncer de riñón", "cáncer renal" o "carcinoma de células renales" se refieren al cáncer que se ha originado en el riñón. Las expresiones "cáncer de células renales" o "carcinoma de células renales" (RCC), como se usan en la presente memoria, se refieren al cáncer que se origina en el revestimiento del túbulo contorneado proximal. Más específicamente, el RCC abarca varios subtipos histológicos relativamente comunes: carcinoma de células renales de células claras, carcinoma papilar (cromófilo), cromófobo, del conducto colector y carcinoma medular. El carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) es el subtipo más común de RCC.

El método es particularmente adecuado para predecir la duración de la supervivencia global (SG), supervivencia sin progresión (SSP) y/o supervivencia sin enfermedad (SSE) del sujeto con cáncer. Los expertos en la técnica reconocerán que el tiempo de supervivencia SG en general se basa en y se expresa como el porcentaje de personas que sobreviven a un cierto tipo de cáncer durante una cantidad de tiempo específica. Las estadísticas de cáncer a menudo usan una tasa de supervivencia global a cinco años. En general, las tasas de SG no especifican si los sobrevivientes de cáncer todavía están recibiendo tratamiento a los cinco años o si ya no tienen cáncer (lograron la remisión). La SSE da información más específica y es el número de personas con un cáncer en particular que logran la remisión. Además, las tasas de supervivencia sin progresión (SSP) (el número de personas que todavía tienen cáncer, pero su enfermedad no progresa) incluyen personas que pueden haber tenido algún éxito con el tratamiento, pero el cáncer no ha desaparecido por completo. Como se usa en la presente memoria, la expresión "tiempo de supervivencia corto" indica que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia que será inferior a la mediana (o media) observada en la población general de sujetos que padecen dicho cáncer. Cuando el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia corto, significa que el sujeto tendrá un "mal pronóstico". A la inversa, la expresión "tiempo de supervivencia largo" indica que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia que será superior a la mediana (o media) observada en la población general de sujetos que padecen dicho cáncer. Cuando el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia largo, significa que el sujeto tendrá un "buen pronóstico".

Como se usa en la presente memoria, la expresión "muestra de tejido tumoral" tiene su significado general en la técnica y abarca trozos o cortes de tejido que se han retirado, incluyendo después de una resección quirúrgica del tumor. La muestra de tejido tumoral se puede someter a una variedad de técnicas de almacenamiento y preparación posteriores a la recogida bien conocidas (p. ej., fijación, almacenamiento, congelación, etc.) antes de determinar las densidades celulares. Típicamente, la muestra de tejido tumoral se fija en formalina y se embebe en un fijador rígido, tal como parafina (cera) o resina epoxídica, que se pone en un molde y más tarde se endurece para producir un bloque que se corta fácilmente. Después, se pueden preparar cortes finos de material usando un micrótomo, se ponen en un portaobjetos de vidrio y se someten, p. ej. a inmunohistoquímica (IHC) (usando un IHC automatizado tal como BenchMark® XT o Autostainer Dako, para obtener portaobjetos teñidos). La muestra de tejido tumoral se puede usar en micromatrices, denominadas micromatrices de tejido (TMA). La TMA consiste en bloques de parafina en los que se ensamblan hasta 1000 núcleos de tejido separados en forma de matriz para permitir el análisis histológico multiplexado. Esta tecnología permite la visualización rápida de dianas moleculares en muestras de tejido a la vez, ya sea a nivel de ADN, ARN o proteína. La tecnología de TMA se describe en los documentos WO2004000992, US8068988, Olli et al 2001 Human Molecular Genetics, Tzankov et al 2005, Elsevier; Kononen et al. 1198; Nature Medicine.

Como se usa en la presente memoria, "células T CD8+" tiene su significado general en la técnica y se refiere a un subconjunto de células T que expresan CD8 en su superficie. Están restringidas por MHC de clase I y funcionan como células T citotóxicas. Las "células T CD8+" también se denominan células T CD8, se denominan linfocitos T citotóxicos (CTL), células T citolíticas, linfocitos T citolíticos o células T citotóxicas. Los antígenos CD8 son miembros de la familia de supergenes de inmunoglobulinas y son elementos de reconocimiento asociativo de las interacciones restringidas en el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I. En el contexto de la descripción, las células T CD8+ se consideran TIL, para linfocitos infiltrantes de tumores. Este tipo de linfocitos están presentes en los tumores. Están implicados en la destrucción de células tumorales y, en la técnica, su presencia en tumores a menudo se asocia con mejores resultados clínicos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3" se refiere a células T CD 8+ que expresan en su superficie tanto PD-1 como Tim-3.

PD-1 se refiere a la proteína de muerte celular programada 1 y se expresa en células T, células B y macrófagos. Los ligandos para PD-1 son los miembros de la familia B7 PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (B7-DC). PD-L1 se refiere al ligando 1 de muerte programada que está presente en las células tumorales, en particular en células de cáncer de riñón.

Tim-3 es un miembro de la familia de dominio de inmunoglobulina de células T y de mucina (Tim), que abarca un grupo de proteínas transmembrana de tipo I expresadas por tipos de células tanto innatas como adaptativas dentro del sistema inmunitario. La familia de genes TIM consiste en ocho miembros (TIM-1 -8) situados en el cromosoma 11B1.1 en el ratón, y tres miembros (TIM-1, TIM-3 y TIM-4) situados en el cromosoma 5q33.2 en seres humanos. La unión de TIM-3 a un ligando de proteína (p. ej., galectina-9) puede inhibir la respuesta de Th1 a través del mecanismo de inducción de la apoptosis y, por lo tanto, conducir a una inducción de tolerancia periférica.

En particular, la cuantificación del porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se determina mediante inmunohistoquímica (IHC).

Por ejemplo, la cuantificación del porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se lleva a cabo poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con parejas de unión (p. ej., anticuerpos) específicos para los marcadores de superficie celular de dichas células. Típicamente, la cuantificación de la densidad de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se lleva a cabo poniendo en contacto la muestra de tejido tumoral con una pareja de unión (p. ej., anticuerpos) específica para CD8, PD-1 y Tim-3.

Típicamente, el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 consiste en el porcentaje de células específicas por el total de células T CD8+ (establecido en 100%). En particular, el número de estas células que se cuentan por unidad de superficie de muestra de tejido, p. ej., como el número de células que se cuentan por mm2 de superficie de muestra de tejido tumoral.

La inmunohistoquímica incluye típicamente las siguientes etapas i) fijar la muestra de tejido tumoral con formalina, ii) inclusión de dicha muestra de tejido tumoral en parafina, iii) cortar dicha muestra de tejido tumoral en secciones para la tinción, iv) incubar dichas secciones con la pareja de unión específica para el marcador, v) enjuagar dichas secciones, vi) incubar dicha sección con un anticuerpo secundario típicamente biotinilado y vii) revelar el complejo antígeno-anticuerpo típicamente con el complejo avidina-biotina-peroxidasa. Por consiguiente, la muestra de tejido tumoral se incuba en primer lugar con las parejas de unión, tales como el anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-Tim-3. Después del lavado, los anticuerpos marcados que se unen al marcador de interés se revelan por la técnica adecuada, dependiendo del tipo de marcador que lleva el anticuerpo marcado, p. ej. marcador radiactivo, fluorescente o enzimático. Se pueden realizar múltiples marcajes simultáneamente. Alternativamente, el método de la presente descripción puede usar un anticuerpo secundario acoplado a un sistema de amplificación (para intensificar la señal de tinción) y moléculas enzimáticas. Dichos anticuerpos secundarios acoplados están disponibles en el mercado, p. ej. de Dako, sistema EnVision. Se puede usar contratinción, p. ej. hematoxilina y eosina, DAPI, Hoechst. Se pueden llevar a cabo otros métodos de tinción usando cualquier método o sistema adecuado, como será evidente para un experto en la técnica, incluyendo sistemas automáticos, semiautomáticos o manuales. Por ejemplo, se pueden unir uno o más marcadores al anticuerpo, permitiendo así la detección de la proteína diana (es decir, el marcador). Los marcadores de ejemplo incluyen isótopos radiactivos, fluoróforos, ligandos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y combinaciones de los mismos. En particular En particular la descripción describe que el marcador es un punto cuántico. Los ejemplos no limitantes de marcadores que se pueden conjugar con ligandos de afinidad primarios y/o secundarios incluyen colorantes o metales fluorescentes (p. ej., fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, fluorescamina), colorantes cromóforos (p. ej., rodopsina), compuestos quimioluminiscentes (p. ej., luminal, imidazol) y proteínas bioluminiscentes (p. ej., luciferina, luciferasa), haptenos (p. ej., biotina). Se describe una variedad de otros agentes fluorescentes y cromóforos útiles en Stryer L (1968) Science 162: 526-533 y Brand L y Gohlke J R (1972) Annu. Rdo. Biochem. 41:843-868. Los ligandos de afinidad también se pueden marcar con enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-lactamasa), radioisótopos (p. ej., 3H, 14C, 32P, 35S o 125I) y partículas (p. ej., oro). Los diferentes tipos de marcadores se pueden conjugar con un ligando de afinidad usando diversos procedimientos químicos, p. ej. la reacción de amina o la reacción de tiol. Sin embargo, se pueden usar otros grupos reactivos distintos de aminas y tioles, p. ej. aldehídos, ácidos carboxílicos y glutamina. Se conocen en la técnica varios métodos de tinción enzimática para detectar una proteína de interés. Por ejemplo, las interacciones enzimáticas se pueden visualizar usando diferentes enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina o diferentes cromógenos tales como DAB, AEC o Fast Red. En otros ejemplos, el anticuerpo se puede conjugar con péptidos o proteínas que se pueden detectar mediante un anticuerpo o una pareja de unión marcada. En un ensayo de IHC indirecto, es necesario un anticuerpo secundario o segunda pareja de unión para detectar la unión de la primera pareja de unión, ya que no está marcada. Se obtienen imágenes de cada una de las muestras teñidas resultantes usando un sistema para visualizar la señal detectable y adquirir una imagen, tal como una imagen digital de la tinción. Los métodos para la adquisición de imágenes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una vez teñida la muestra, se puede usar cualquier dispositivo de formación de imágenes óptico o no ópti

tal como, por ejemplo, microscopios ópticos verticales o invertidos, microscopios confocales de barrido, cámaras, microscopios electrónicos de barrido o de efecto túnel, microscopios de sonda de barrido y detectores de imágenes por infrarrojos. En algunos ejemplos, la imagen se puede capturar de forma digital. Las imágenes obtenidas después se pueden usar para determinar cuantitativa o semicuantitativamente la cantidad de marcador en la muestra, o el número absoluto de células positivas para el marcador de interés, o la superficie de células positivas para el marcador de interés. Están disponibles en la técnica diversos sistemas de procesamiento, barrido y análisis de muestras automáticos adecuados para usar con IHC. Dichos sistemas pueden incluir tinción y barrido de microscopio automatizados, análisis de imágenes computarizado, comparación de secciones en serie (para controlar la variación en la orientación y el tamaño de una muestra), generación de informes digitales y archivo y seguimiento de muestras (tales como portaobjetos en los que se ponen las secciones de tejido). Están disponibles en el mercado sistemas de formación de imágenes celulares que combinan microscopios ópticos convencionales con sistemas de procesamiento de imágenes digitales para realizar análisis cuantitativos en células y tejidos, incluyendo muestras inmunoteñidas. Véase, p. ej., el sistema CAS-200 (Becton, Dickinson & Co.). En particular, la detección se puede hacer de forma manual o por técnicas de procesamiento de imágenes que implican procesadores y software informático. Usando dicho software, por ejemplo, las imágenes se pueden configurar, calibrar, normalizar y/o validar basándose en factores que incluyen, por ejemplo, la calidad de la tinción o la intensidad de la tinción, usando procedimientos conocidos por un experto en la técnica (véase, p. ej., publicación de patente de EE.UU. N° US20100136549). La imagen se puede analizarse cuantitativa o semicuantitativamente y puntuar en función de la intensidad de la tinción de la muestra. La histoquímica cuantitativa o semicuantitativa se refiere al método de barrido y puntuación de las muestras que se han sometido a histoquímica, para identificar y cuantificar la presencia del biomarcador especificado (es decir, el marcador). Los métodos cuantitativos o semicuantitativos pueden emplear software de imágenes para detectar densidades de tinción o cantidad de tinción o métodos de detección de tinciones por el ojo humano, donde un operador preparado clasifica los resultados numéricamente. Por ejemplo, las imágenes se pueden analizar cuantitativamente usando algoritmos de recuento de píxeles y un patrón de reconocimiento de tejidos (p. ej. Software Aperio Spectrum, plataforma de análisis cuantitativo automatizado (plataforma AQUA®) o T ribvn con el software Ilastic y Calopix) y otros métodos estándar que miden o cuantifican o semicuantifican el grado de tinción; véase, p. ej., la patente de EE.UU. N28.023.714; patente de EE.UU. N27.257.268; patente de EE.UU. N27.219.016; Patente de EE.UU. N27.646.905; publicación de patente de EE.UU. publicada N° US20100136549 y 20110111435; Camp et al. (2002) Nature Medicine, 8: 1323-1327; Bacus et al. (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19: 316-328). Se puede calcular y puntuar una relación de tinción positiva fuerte (tal como tinción marrón) a la suma del área teñida total. La cantidad del biomarcador detectado (es decir, el marcador) se cuantifica y se da como un porcentaje de píxeles positivos y/o una puntuación. Por ejemplo, la cantidad se puede cuantificar como un porcentaje de píxeles positivos. En algunos ejemplos, la cantidad se cuantifica como el porcentaje de área teñida, p. ej., el porcentaje de píxeles positivos. Por ejemplo, una muestra puede tener al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 0, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más píxeles positivos en comparación con el área de tinción total. Por ejemplo, la cantidad se puede cuantificar como un número absoluto de células positivas para el marcador de interés. En particular, se da una puntuación a la muestra que es una representación numérica de la intensidad o la cantidad de tinción histoquímica de la muestra, y representa la cantidad de biomarcador diana (p. ej., el marcador) presente en la muestra. Se puede dar a los valores de densidad óptica o de porcentaje de área una puntuación en una escala, por ejemplo, en una escala de números enteros. Por lo tanto, en particular, el método de la presente descripción comprende las etapas que consisten en i) proporcionar una o más cortes de sección de tejido inmunoteñidos obtenidas por un sistema de tinción de portaobjetos automatizado usando una pareja de unión capaz de interaccionar selectivamente con el marcador (p. ej., un anticuerpo como se ha descrito antes), ii) proceder a la digitalización de los portaobjetos de la etapa i) mediante captura de barrido de alta resolución, iii) detectar el corte de la sección de tejido en la imagen digital iv) proporcionando una cuadrícula de referencia de tamaño con unidades uniformemente distribuidas que tienen un misma superficie, estando adaptada dicha rejilla al tamaño de la sección de tejido que se va a analizar, y v) detectar, cuantificar y medir la intensidad o el número absoluto de células teñidas en cada unidad de modo que se evalúa el número o la densidad de células teñidas de cada unidad.

En particular, la cuantificación del porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se determina mediante un microscopio automatizado que permite medir las características morfométricas y de fluorescencia en los diferentes compartimentos celulares (membrana/citoplasma/núcleos) y cuantificar de forma valiosa el porcentaje de células de interés. Brevemente, la cuantificación del porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se lleva a cabo mediante las siguientes etapas: i) se proporcionan micromatrices de tejido (TMA) que contienen muestras de RCC, ii) las muestras de TMA se tiñen con anticuerpos anti-CD3, anti-CD8, anti-PD-1 y Tim-3, iii) las muestras se tiñen adicionalmente con un marcador de células epiteliales para ayudar a la segmentación automática del tumor y el estroma, iv) después se hace el barrido de los portaobjetos de TMA usando un sistema de formación de imágenes multiespectrales, v) las imágenes barridas se procesan usando un software de análisis de imágenes automático (p. ej. Perkin Elmer Technology) que permite la detección y segmentación de tejidos específicos a través de potentes algoritmos de reconocimiento de patrones, se entrena un algoritmo de aprendizaje automático de la máquina para segmentar el tumor del estroma e identificar las células marcadas; vi) se calcula el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 dentro de las áreas tumorales; vii) un patólogo califica el porcentaje de linfocitos; y vii) se compara la puntuación manual y automática con el tiempo de supervivencia del sujeto.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "el valor de referencia predeterminado" se refiere a un valor umbral o un valor de corte. Típicamente, un "valor umbral" o "valor de corte" se puede determinar de forma experimental, empírica o teórica. Un valor umbral también se puede seleccionar de manera arbitraria basándose en las condiciones experimentales y/o clínicas existentes, como reconocería un experto en la técnica. Por ejemplo, la medición retrospectiva de las densidades celulares en muestras históricas de sujetos adecuadamente depositadas en bancos se puede usar para establecer el valor de referencia predeterminado. El valor umbral se debe determinar con el fin de obtener la sensibilidad y especificidad óptimas de acuerdo con la función del ensayo y el equilibrio beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de falsos positivos y falsos negativos). Típicamente, la sensibilidad y la especificidad óptimas (y, por lo tanto, el valor umbral) se pueden determinar usando una curva característica operativa del receptor (ROC) basada en datos experimentales. Por ejemplo, después de cuantificar la densidad celular en un grupo de referencia, se puede usar análisis algorítmico para el tratamiento estadístico de las densidades medidas en las muestras a ensayar, y así obtener un estándar de clasificación que tenga significación para la clasificación de la muestra. El nombre completo de la curva ROC es curva característica del operador del receptor, que también se conoce como curva característica de operación del receptor. Se usa principalmente para pruebas de diagnóstico bioquímico clínico. La curva ROC es un indicador completo que refleja las variables continuas de tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) y tasa de falsos positivos (1-especificidad). Pone de manifiesto la relación entre sensibilidad y especificidad con el método de composición de imágenes. Se establece una serie de diferentes valores de corte (umbrales o valores críticos, valores límite entre los resultados normales y anormales de la prueba de diagnóstico) como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. Después la sensibilidad se usa como coordenada vertical y la especificidad se usa como coordenada horizontal para dibujar una curva. Cuanto mayor sea el área bajo la curva (AUC), mayor será la precisión del diagnóstico. En la curva ROC, el punto más cercano a la izquierda superior lejana del diagrama de coordenadas es un punto crítico que tiene valores tanto de alta sensibilidad como de alta especificidad. El valor del AUC de la curva ROC está entre 1,0 y 0,5. Cuando el AUC >0,5, el resultado del diagnóstico mejora cada vez más a medida que el AUC se acerca a 1. Cuando el AUC está entre 0,5 y 0,7, la precisión es baja. Cuando el AUC está entre 0,7 y 0,9, la precisión es moderada. Cuando el AUC es mayor que 0,9, la precisión es bastante alta. Este método algorítmico se realiza preferiblemente con un ordenador. Se puede usar software o sistemas existentes en la técnica para dibujar la curva ROC, tales como: software de estadística médica MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER POWER. SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Maryland, EE.UU.), etc.

En particular, el valor de referencia predeterminado se determina llevando a cabo un método que comprende las etapas de

a) proporcionar una colección de muestras de tejido tumoral de un sujeto que padece un RCC;

b) proporcionar, para cada muestra de tejido tumoral proporcionada en la etapa a), información relacionada con el resultado clínico real para el sujeto correspondiente (es decir, la duración de la supervivencia sin enfermedad (SSE) y/o la supervivencia global (SG));

c) proporcionar una serie de valores de cuantificación arbitrarios;

d) cuantificar el porcentaje de células T CD8+ para cada muestra de tejido tumoral contenida en la colección proporcionada en la etapa a);

e) clasificar dichas muestras de tejido tumoral en dos grupos para un valor de cuantificación arbitrario específico proporcionado en la etapa c), respectivamente: (i) un primer grupo que comprende muestras de tejido tumoral que presentan un valor de cuantificación para el nivel que es menor que dicho valor de cuantificación arbitrario contenido en dicha serie de valores de cuantificación; (ii) un segundo grupo que comprende muestras de tejido tumoral que presentan un valor de cuantificación para dicho nivel que es mayor que dicho valor de cuantificación arbitrario contenido en dicha serie de valores de cuantificación; de modo que se obtienen dos grupos de muestras de tejido tumoral para dicho valor de cuantificación específico, en donde las muestras de tejido tumoral de cada grupo se enumeran por separado;

f) calcular la significación estadística entre (i) el valor de cuantificación obtenido en la etapa e) y (ii) el resultado clínico real de los sujetos de los que derivan las muestras de tejido tumoral contenidas en el primer y segundo grupos definidos en la etapa f);

g) repetir las etapas f) y g) hasta que se ensaye cada valor de cuantificación arbitrario proporcionado en la etapa d);

h) establecer dicho valor de referencia predeterminado como de acuerdo con el valor de cuantificación arbitrario para el que se ha calculado en la etapa g la significación estadística más alta (valor P más significativo obtenido con una prueba log-rank, significación cuando P <0,05).

Por ejemplo, se ha evaluado la densidad celular para 100 muestras de tejido tumoral de 100 sujetos. Las 100 muestras se clasifican según la densidad celular. La muestra 1 tiene la densidad más alta y la muestra 100 tiene la densidad más baja. Un primer agrupamiento proporciona dos subconjuntos: en un lado la muestra N° 1 y en el otro lado las otras 99 muestras. El siguiente agrupamiento proporciona por un lado las muestras 1 y 2 y por otro lado las 98 muestras restantes, etc., hasta el último agrupamiento: por un lado las muestras 1 a 99 y por el otro lado la muestra N° 100. De acuerdo con la información relacionada con el resultado clínico real para el sujeto de cáncer correspondiente, se preparan curvas de Kaplan-Meier para cada uno de los 99 grupos de dos subconjuntos. También para cada uno de los 99 grupos, se calculó el valor p entre ambos subconjuntos (prueba log-rank). Después, se selecciona el valor de referencia predeterminado de manera que la discriminación basada en el criterio del valor P mínimo sea la más fuerte. En otros términos, la densidad celular que corresponde al límite entre ambos subconjuntos para los que el valor P es mínimo se considera como el valor de referencia predeterminado. Debe indicarse que el valor de referencia predeterminado no es necesariamente el valor mediano de las densidades celulares. Así, en particular, el valor de referencia predeterminado permite la discriminación entre un pronóstico malo y uno bueno con respecto a la SSP y la SG de un sujeto. En la práctica, los valores de alta significación estadística (p. ej., valores P bajos) se obtienen generalmente para un intervalo de valores de cuantificación arbitrarios sucesivos, y no solo para un único valor de cuantificación arbitrario. Por lo tanto, en una realización alternativa de la descripción, en lugar de usar un valor de referencia predeterminado definido, se proporciona un intervalo de valores. Por lo tanto, se establece arbitrariamente un valor de significación estadística mínimo (umbral mínimo de significación, p. ej., valor P umbral máximo) y se retiene un intervalo de una pluralidad de valores de cuantificación arbitrarios para los que el valor de significación estadística calculado en la etapa g) es mayor (más significativo, p. ej. valor P más bajo), de modo que se proporciona un intervalo de valores de cuantificación. Este intervalo de valores de cuantificación incluye un valor de "corte" como se ha descrito antes. Por ejemplo, de acuerdo con esta realización específica de un valor de "corte", el resultado se puede determinar comparando la densidad celular con el intervalo de valores que se identifican. En particular, un valor de corte consiste, por lo tanto, en un intervalo de valores de cuantificación, p.ej. centrado en el valor de cuantificación para el que se encuentra el valor de significación estadística más alto (p. ej., generalmente el valor P mínimo que se encuentra).

En una realización adicional, la presente descripción se refiere a un método para determinar si un sujeto que sufre de carcinoma de células renales logrará una respuesta con un inhibidor de puntos de control inmunitario. En particular, la presente descripción se refiere a un método para determinar si un sujeto que padece un carcinoma de células renales logrará una respuesta con un inhibidor de puntos de control inmunitario, que comprende las etapas de i) cuantificar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto tratado con un inhibidor de puntos de control inmunitario, ii) comparar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 cuantificado en la etapa i) con sus valores de referencia predeterminados correspondientes y iii) concluir que el sujeto no responderá al tratamiento cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es mayor que su valor de referencia predeterminado correspondiente o concluir que el sujeto responderá al tratamiento cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es menor que su valor de referencia predeterminado correspondiente.

Como se usa en la presente memoria, el término "responde" se refiere a cuando el tiempo de supervivencia del sujeto aumenta con un tratamiento. En particular, en el contexto de la descripción, el término "responde" se refiere a la capacidad del sistema inmunitario para disminuir la masa tumoral, de modo que el sujeto presenta una mejora clínica en comparación con el sujeto que no recibe el tratamiento. Dicho sujeto se considera un "sujeto que responde" al tratamiento. La expresión "no responde" se refiere a un sujeto que no presenta ninguna mejora clínica al tratamiento con un tratamiento con inhibidor de puntos de control inmunitario. Este sujeto se considera un "sujeto que no responde" al tratamiento.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de puntos de control inmunitario" se refiere a moléculas que reducen, inhiben, interfieren o modulan total o parcialmente una o más proteínas de puntos de control inmunitario.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "proteína de puntos de control inmunitario" tiene su significado general en la técnica y se refiere a una molécula que es expresada por células T que aumenta una señal (moléculas de puntos de control estimuladoras) o disminuye una señal (moléculas de puntos de control inhibidoras). Se reconoce en la técnica que las moléculas de puntos de control inmunitario constituyen rutas de puntos de control inmunitario similares a las rutas dependientes de CTLA-4 y PD-1 (véase p. ej., Pardoll, 2012. Nature Rev Cáncer 12: 252-264; Mellman et al., 2011. Nature 480: 480-489). Los ejemplos de puntos de control estimuladores incluyen CD27 CD28 CD40, CD122, CD137, OX40, GITR e ICOS. Ejemplos de moléculas de puntos de control inhibidoras incluyen A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, CD277, IDO, KIR, PD-1, LAG-3, TIM-3 y VISTA. El receptor de adenosina A2A (A2AR) se considera un punto de control importante en la terapia del cáncer porque la adenosina en el microambiente inmunitario, que conduce a la activación del receptor A2a, es un bucle de retroalimentación inmunitaria negativa y el microambiente tumoral tiene concentraciones relativamente altas de adenosina. B7-H3, también llamado CD276, originalmente se entendió que era una molécula coestimuladora, pero ahora se considera co-inhibidora. B7-H4, también llamado VTCN1, es expresado por células tumorales y macrófagos asociados a tumores y tiene una función en el escape tumoral. El atenuador de linfocitos B y T (BTLA) y también llamado CD272, tiene HVEM (mediador de entrada del herpesvirus) como ligando. La expresión de superficie de BTLA es regulada por disminución gradualmente durante la diferenciación de células T CD8+ humanas del fenotipo de células na'íve a efectoras, sin embargo, las células T CD8+ humanas específicas de tumor expresan niveles altos de BTLA. CTLA-4, proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos y también llamada CD152. La expresión de CTLA-4 en células Treg sirve para controlar la proliferación de células T. IDO, indolamina 2,3-dioxigenasa, es una enzima catabólica del triptófano. Enzimas inmunoinhibidoras relacionadas. Otra molécula importante es la TDO, triptófano 2,3-dioxigenasa. Se sabe que IDO suprime las células T y NK, genera y activa Treg y células supresoras derivadas de mieloides y promueve la angiogénesis tumoral. KIR, receptor similar a la inmunoglobulina de células citolíticas, es un receptor de moléculas MHC de clase I en células citolíticas naturales. LAG3, gen 3 de activación de linfocitos, actúa para suprimir una respuesta inmunitaria mediante la acción de Tregs, así como efectos directos en células T CD8+. PD-1, receptor de muerte programada 1 (PD-1), tiene dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. Este punto de control es el objetivo del fármaco para el melanoma Keytruda de Merck & Co., que obtuvo la aprobación de la FDA en septiembre de 2014. Una ventaja de dirigirse a PD-1 es que puede restablecer la función inmunitaria en el microambiente del tumor. TIM-3, abreviatura de dominio de inmunoglobulina de células T y dominio de mucina 3, se expresa en células T CD4+ humanas activadas y regula las citoquinas Th1 y Th17. TIM-3 actúa como un regulador negativo de la función Th1/Tc1 al desencadenar la muerte celular tras la interacción con su ligando, galectina-9. VISTA, abreviatura de supresor de Ig de dominio V de la activación de células T, VISTA se expresa principalmente en células hematopoyéticas, por lo que la expresión constante de VISTA en leucocitos dentro de los tumores puede permitir que el bloqueo de VISTA sea eficaz en una amplia variedad de tumores sólidos.

Estas proteínas son responsables de las interacciones coestimuladoras o inhibidoras de las respuestas de las células T. Por tanto, las proteínas de puntos de control inmunitario regulan y mantienen la auto-tolerancia y la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas.

Las células tumorales a menudo aprovechan estos puntos de control para escapar a la detección por el sistema inmunitario. Por tanto, la inhibición de una proteína de punto de control en el sistema inmunitario puede mejorar la respuesta de células T antitumorales.

En particular, un inhibidor de puntos de control inmunitario se refiere a cualquier compuesto que inhiba la función de una proteína de punto de control inmunitario. La inhibición incluye reducción de la función y bloqueo completo.

En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario podría ser un anticuerpo, péptidos sintéticos o de secuencia natural, moléculas pequeñas o aptámeros que se unen a las proteínas de puntos de control inmunitario y sus ligandos.

En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo.

Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada. En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Hay dos tipos de cadenas ligeras, lambda (l) y kappa (k). Hay cinco clases principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados colectivamente CH). Las regiones variables de las cadenas tanto ligera (VL) como pesada (VH) determinan el reconocimiento de la unión y la especificidad del antígeno. Los dominios de la región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren importantes propiedades biológicas, tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria, unión del complemento y unión a receptores Fc (FcR). El término incluye fragmentos de anticuerpos que comprenden un dominio de unión al antígeno, tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único (DAB), dímero TandAb, Fv, scFv (Fv de cadena única), dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpos lineales, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, bicuerpos, tricuerpos (fusiones scFv-Fab, biespecíficos o triespecíficos, respectivamente); sc-diacuerpo; cuerpos kappa (lamda) (fusiones scFv-CL); BiTE (acoplador biespecífico de células T, tándems scFv-scFv para atraer células T); DVD-Ig (anticuerpo de dominio variable doble, formato biespecífico); SIP (inmunoproteína pequeña, una clase de minicuerpo); SMIP (dímero scFv-Fc "inmunofarmacéutico modular pequeño"; DART (diacuerpo de dc estabilizada de "redireccionamiento de afinidad doble"); miméticos de anticuerpos pequeños que comprenden una o más CDR y similares. Las técnicas para preparar y usar diversas construcciones y fragmentos basados en anticuerpos son bien conocidas en la técnica (véase Kabat et al., 1991, incorporado específicamente en la presente memoria por referencia). Los diacuerpos, en particular, se describen adicionalmente en los documentos EP 404.097 y WO 93/11161; mientras que los anticuerpos lineales se describen con adicionalmente en Zapata et al. (1995). Los anticuerpos se pueden fragmentar usando técnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab')2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante se puede tratar para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab'. La digestión con papaína puede conducir a la formación de fragmentos Fab. Los Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAb, TandAb, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos y otros fragmentos también se pueden sintetizar por técnicas recombinantes o se pueden sintetizar químicamente. Las técnicas para producir fragmentos de anticuerpos son bien conocidas y se describen en la técnica. Por ejemplo, cada uno de Beckman et al., 2006; Holliger y Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff y Heard, 2001; Reiter et al., 1996; y Young et al., 1995 describen y permiten además la producción de fragmentos de anticuerpos eficaces. En particular, el anticuerpo es un anticuerpo "quimérico" como se describe en la patente de EE.UU. N° 4.816.567. En particular, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, tal como se describe en las patentes de EE.UU. N° 6.982.321 y 7.087.409. En particular, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Un "anticuerpo humano" tal como se describe en los documentos US 6.075.181 y 6.150.584. En particular, el anticuerpo es un anticuerpo de dominio único tal como se describe en los documentos EP 0368684, WO 06/030220 y WO 06/003388.

En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar y aislar usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Las técnicas para la producción y aislamiento incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma de EBV. Típicamente, los anticuerpos se dirigen contra A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, CD277, IDO, KIR, PD-1, LAG-3, TIM-3 o VISTA. En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-1 tal como se describe en las publicaciones internacionales WO2011082400, WO2006121168, WO2015035606, WO2004056875, WO2010036959, WO2009114335, WO2010089411, WO2008156712, WO2011110621, WO2014055648 y WO2014194302. Ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 que se comercializan: Nivolumab (Opdivo®, BMS), Pembrolizumab (también llamado Lambrolizumab, KEYTRUDA® o MK-3475, MERCK). En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-L1 tal como se describe en las publicaciones internacionales WO2013079174, WO2010077634, WO2004004771, WO2014195852, WO2010036959, WO2011066389, WO2007005874, WO2015048520, US8617546 y WO2014055897. Ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 que están en ensayo clínico: Atezolizumab (MPDL3280A, Genentech/Roche), Durvalumab (AZD9291, AstraZeneca), Avelumab (también conocido como MSB0010718C, Merck) y BMS-936559 (BMS). En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-L2 tal como se describe en los documentos US7709214, US7432059 y US8552154. En el contexto de la descripción, el inhibidor de puntos de control inmunitario inhibe Tim-3 o su ligando.

En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-Tim-3 tal como se describe en las publicaciones internacionales WO03063792, WO2011155607, WO2015117002, WO2010117057 y WO2013006490.

En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario es una molécula orgánica pequeña.

La expresión "molécula orgánica pequeña" como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de un tamaño comparable a las moléculas orgánicas usadas generalmente en productos farmacéuticos. La expresión excluye macromoléculas biológicas (p. ej. proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Típicamente, las moléculas orgánicas pequeñas varían en tamaño hasta aproximadamente 5000 Da, más preferiblemente hasta 2000 Da y lo más preferiblemente hasta aproximadamente 1000 Da.

Típicamente, las moléculas orgánicas pequeñas interfieren con la ruta de transducción de A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, CD277, IDO, KIR, PD-1, LAG-3, TIM-3 o VISTA.

En particular, las moléculas orgánicas pequeñas interfieren con la ruta de transducción de PD-1 y Tim-3. Por ejemplo, pueden interferir con moléculas, receptores o enzimas implicados en la ruta de PD-1 y Tim-3.

En particular, las moléculas orgánicas pequeñas interfieren con el inhibidor de la indolamina-pirrol 2,3-dioxigenasa (IDO). IDO está implicada en el catabolismo del triptófano (Liu et al. 2010, Vacchelli et al. 2014, Zhai et al. 2015). En la publicación internacional WO 2014150677 se describen ejemplos de inhibidores de IDO. Ejemplos de inhibidores de IDO incluyen, sin limitación, 1 -metil-triptófano (IMT), p-(3-benzofuranil)-alanina, p-(3-benzo(b)tienil)-alanina), 6-nitro-triptófano, 6-fluoro-triptófano, 4-metil-triptófano, 5-metil-triptófano, 6-metil-triptófano, 5-metoxi-triptófano, 5-hidroxi-triptófano, indol-3-carbinol, 3,3'-diindolilmetano, galato de epigalocatequina, 1,3-diacetato de 5-Br-4-Clindoxilo, 9-vinilcarbazol, acemetacina, 5-bromo-triptófano, diacetato de 5-bromoindoxilo, ácido 3-amino-naftoico, pirrolidina ditiocarbamato, 4-fenilimidazol un derivado de brasinina, un derivado de tiohidantoína, un derivado de pcarbolina o un derivado de brasilexina. En particular, el inhibidor de IDO se selecciona de 1 -metil-triptófano, p-(3-benzofuranil)-alanina, 6-nitro-L-triptófano, ácido 3-amino-naftoico y p-[3-benzo(b)tienil]-alanina o un derivado o profármaco de los mismos.

En particular, el inhibidor de IDO es Epacadostat, (INCB24360, INCB024360) tiene la siguiente fórmula química en la técnica y se refiere a -N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N'-hidroxi-4-{[2-(sulfamoilamino)-etil]amino}-1,2,5-oxadiazol-3 carboximidamida:

En particular, el inhibidor es BGB324, también llamado R428, tal como se describe en la publicación internacional WO2009054864, se refiere a 1H-1,2,4-triazol-3,5-diamina, 1-(6,7-dihidro-5H-benzo[6,7]ciclohepta[1,2-c]piridazin-3-il)-N3-[(7S)-6,7,8,9-tetrahidro-7-(1 -pirrolidinil)-5H-benzociclohepten-2-ilo]- y tiene la siguiente fórmula en la técnica:

En particular, el inhibidor es CA-170 (o AUPM-170): un antagonista de puntos de control inmunitario de molécula pequeña oral dirigido al ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y al supresor de Ig de dominio V de la activación de células T (VISTA) (Liu et al 2015). Los datos preclínicos de CA-170 fueron presentados por el colaborador de Curis y Aurigene en noviembre en la Conferencia Internacional sobre Objetivos Moleculares y Terapéutica del Cáncer ACR-NCI-EORTC.

En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un aptámero.

Los aptámeros son una clase de moléculas que representan una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos u oligopéptidos con la capacidad de reconocer prácticamente cualquier clase de moléculas diana con alta afinidad y especificidad. Dichos ligandos se pueden aislar por la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias. La biblioteca de secuencias aleatorias se puede obtener por síntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligómero lineal, opcionalmente químicamente modificado, de una secuencia única.

Típicamente, los aptámeros se dirigen contra A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, CD277, IDO, KIR, PD-1, LAG-3, TIM-3 o VISTA.

En particular, los aptámeros son aptámeros de ADN como los descritos en Prodeus et al. 2015. Una desventaja importante de los aptámeros como entidades terapéuticas son sus perfiles farmacocinéticos malos, ya que estas cadenas cortas de ADN se eliminan rápidamente de la circulación debido a la filtración renal. Por tanto, los aptámeros de acuerdo con la descripción se conjugan con polímeros de alto peso molecular tales como polietilenglicol (PEG). En particular, el aptámero es un aptámero anti-PD-1. En particular, el aptámero anti-PD-1 es MP7 pegilado como se describe en Prodeus et al 2015.

Por lo tanto, al cuantificar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto que padece carcinoma de células renales, los médicos podrían determinar si el sujeto es elegible para un tratamiento con un inhibidor de puntos de control inmunitario, por lo tanto, puede adoptar el tratamiento a dicho sujeto.

Por tanto, la presente descripción se refiere también a un método para tratar el carcinoma de células renales en un sujeto identificado como un sujeto que no responde, con un inhibidor de puntos de control inmunitario, que comprende una etapa de administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación de inhibidores de puntos de control inmunitario.

En el contexto de la descripción, el término "tratamiento" o "tratar" como se usa en la presente memoria, se refiere tanto al tratamiento profiláctico o preventivo como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluyendo el tratamiento del sujeto en riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que ha contraído la enfermedad, así como el sujeto que está enfermo o se le ha diagnosticado que padece una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de la recaída clínica. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que tiene un trastorno médico o que finalmente puede adquirir el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. Por "régimen terapéutico" se entiende el patrón de tratamiento de una enfermedad, p. ej., el patrón de dosificación usado durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La frase "régimen de inducción" o "periodo de inducción" se refiere a un régimen terapéutico (o la parte de un régimen terapéutico) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un sujeto durante el periodo inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) un "régimen de carga", que puede incluir administrar una dosis mayor del fármaco que la que usaría un médico durante un régimen de mantenimiento, administrar un fármaco con más frecuencia de lo que administraría el fármaco un médico durante un régimen de mantenimiento, o ambos. La frase "régimen de mantenimiento" o "periodo de mantenimiento" se refiere a un régimen terapéutico (o la parte de un régimen terapéutico) que se usa para el mantenimiento de un sujeto durante el tratamiento de una enfermedad, p. ej., para mantener al sujeto en remisión durante periodos de tiempo prolongados (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear terapia continua (p. ej., administrando un fármaco a intervalos regulares, p. ej., semanales, mensuales, anuales, etc.) o terapia intermitente (p. ej., tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en la recaída o tratamiento tras lograr un criterio predeterminado particular [p. ej., dolor, manifestación de la enfermedad, etc.]).

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" pretende ser una cantidad mínima de agente activo que es necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" para un sujeto es una cantidad tal que induce, mejora o causa de otro modo una mejora en los síntomas patológicos, progresión de la enfermedad o condiciones fisiológicas asociadas o la resistencia a sucumbir a un trastorno.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "combinación de inhibidores de puntos de control inmunitarios" se refiere a dos inhibidores que inhiben dos puntos de control inmunitario diferentes de forma concomitante.

El inhibidor podría ser un anticuerpo, péptidos de secuencia sintética o natural, moléculas pequeñas y aptámeros que se unen a las proteínas de puntos de control inmunitario y sus ligandos.

En particular, un inhibidor de puntos de control inmunitario es un anti-PD-1 y el otro es un anti-Tim-3.

En particular, un inhibidor de puntos de control inmunitario es un anti-PD-L1 y el otro es un anti-Tim-3.

En particular, un inhibidor de puntos de control inmunitario es un anti-PD-L2 y el otro es un anti-Tim-3.

En particular, los inhibidores de puntos de control inmunitario son anticuerpos. Típicamente, los inhibidores de puntos de control inmunitario de PD-1, PDL-1, PD-L2 y Tim-3 son anticuerpos como se ha descrito antes.

En particular, los inhibidores de PD-1 y Tim-3 son anticuerpos biespecíficos contra Tim-3 y PD-1 como se describe en la publicación internacional WO2011159877.

Los inhibidores de puntos de control inmunitario como se han descrito antes, se pueden combinar con excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones farmacéuticas. "Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción perjudicial cuando se administran a un mamífero, en especial a un ser humano, según sea apropiado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo sólido, semisólido o líquido no tóxico.

Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, se pueden administrar en una forma de administración unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administración unitaria adecuadas comprenden formas de vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, formas de administración en aerosoles, implantes, subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal. Típicamente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede ser inyectada. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, en especial liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las soluciones que comprenden compuestos de la descripción como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua mezcladas de forma adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. El polipéptido (o el ácido nucleico que lo codifica) se puede formular en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede efectuar mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los polipéptidos activos en la cantidad requerida en el disolvente adecuado con varios de los otros ingredientes mencionados antes, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los mencionados antes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas antes, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero se debe hacer isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que se pueden usar a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis se podría disolver en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto. Se producirá necesariamente alguna variación en la dosis dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual.

La presente descripción se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente descripción.

Figuras:

Figura 1: Relaciones entre la coexpresión de PD-1 y Tim-3 en células T CD8+ y resultado clínico. A: Los pacientes con RCC se dividieron en dos grupos dependiendo de su porcentaje de coexpresión de PD-1 y Tim-3 en las células T CD8+ por encima o por debajo de la mediana (34,7). Se muestran curvas de Kaplan Meier para la supervivencia sin progresión para los dos grupos de pacientes. B: Se muestra la relación entre el porcentaje de coexpresión de PD-1 y Tim-3 en células T CD8+ seleccionado como una variable cuantitativa y la supervivencia a los 36 meses. La línea azul corresponde a esta relación, mientras que la línea roja representa los límites superior o inferior del IC al 95%. Los cuadrados azules en la parte superior indican que los pacientes correspondientes están vivos, mientras que los cuadrados azules en la parte inferior corresponden a la muerte del paciente.

Figura 2: La coexpresión de PD-1+Tim-3+ en células T CD8+ se correlaciona con niveles altos de PD-1. A: Intensidad media de fluorescencia (MFI) de PD-1 medida por citometría en células PD-1+Tim-3+ y PD-1+Tim-3- en la ventana de células T CD8+ para un paciente con RCC representativo. El mismo análisis se muestra para 16 pacientes seleccionados ya que coexpresan PD-1 y Tim-3 al menos en 10% de la población de células T CD8+ totales. B: Ejemplo de la intensidad de PD-1 detectada a niveles celulares por análisis de inmunofluorescencia in situ en células T CD8+ PD-1+Tim-3+ y PD-1+Tim-3neg (izquierda) y a niveles individuales después de integrar las diversas señales celulares en una sección de tejido. Análisis comparativo de la intensidad media de PD-1 medida por inmunofluorescencia in situ en los 2 subconjuntos de células T CD8+ (PD-1+ Tim-3- y PD-1+Tim-3+) en una serie de pacientes para quienes ambos secciones de tejidos y TIL estaban disponibles.

Figura 3: Análisis funcional de TIL dependiendo de su expresión de PD-1 sola o combinada con Tim-3. Las células recogidas después de separación fueron activadas o no por anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 horas y luego se midió IFN^ por Elisa en el líquido sobrenadante. * p <0,01

Figura 4: La coexpresión de PD-1 y Tim-3 en células T CD8+ se correlaciona con los parámetros clínicos de agresividad del RCC. El porcentaje de células T CD8+ PD-1+Tim-3+ seleccionado como una variable continua y medido por técnica de inmunofluorescencia in situ se representó frente a varios parámetros clínicos definidos como una variable binaria (TNM, grado de Fuhrman, puntuación UISS) o una variable continua (tamaño del tumor). TNM se dividió en dos grupos: enfermedad localizada (pT1 y pT2) y enfermedad avanzada (pT3, pT4, N+ o M+). El grado de Fuhrman se definió como bajo (grado I o II) y alto (grado III o IV) y la puntuación UISS en 3 clases (0,1,2).

Figura 5: Los pacientes que coexpresan PD-1 y Tim-3 en células T CD8+ presentaban con mayor frecuencia una histología de RCC de células claras. El porcentaje de PD-1+Tim-3- y PD-1+Tim-3+ en células T CD8+ seleccionado como una variable continua y medido por citometría se representaron gráficamente frente al grupo histológico de pacientes con RCC dividido en dos clases: histología de células claras o histología que no es de células claras (papilar, cormófobo, carcinoma medular, oncocitoma). Se muestra el análisis del diagrama de caja y bigotes.

Figura 6: La expresión de Tim-3 es menor en células T PD-1+CD8+ después del tratamiento con colagenasa A: El porcentaje de PD-1+Tim-3+/células T CD8+ se determinó por inmunofluorescencia in situ y citometría: en un serie de 10 pacientes con RCC para los que estaban disponibles tanto secciones congeladas como TIL recientes. B: MFI de Tim-3 en células T PD-1+ CD8+ medida por citometría para un paciente con RCC cuyos TIL se pretrataron con colagenasa o solución de recuperación celular. Datos integrados para 4 TIL derivados de pacientes con RCC. C: Se activaron cuatro PBMC con anti-CD3 y anti-CD28 durante 48 horas. Después, las PBMC se trataron o no con colagenasa o una solución de recuperación celular y se midió la MFI de Tim-3 en células T PD-1+CD8+ por citometría.

Ejemplo:

Introducción

La inmunoterapia basada en la inhibición de inhibidores de puntos de control (CTLA-4, PD-1) expresados en células T ha demostrado su eficacia clínica en varios ensayos clínicos de fase 3 en melanoma metastásico, carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) y carcinoma de células renales (RCC) (1). En general, este nuevo enfoque terapéutico conduce a aproximadamente 30% de respuestas clínicas en pacientes con cáncer (2). Parece que son necesarias células T CD8+ antitumorales preexistentes para el éxito del bloqueo de PD-1-PD-L1/2 en pacientes con cáncer (3). Varios argumentos sugieren que la coexpresión de receptores inhibidores (PD-1, CTLA-4, Tim-3, Lag3 ...) en las células T CD8+ puede representar una pista para explicar los mecanismos de resistencia al bloqueo de los inhibidores de puntos de control. De hecho, la coexpresión de distintos receptores inhibidores se asoció con un mayor agotamiento de las células T y resistencia a la capacidad de los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 para revitalizar estas células T disfuncionales tanto en infecciones como en cáncer (4-7).

Hasta ahora, la coexpresión de receptores inhibidores se ha realizado principalmente en células tumorales recientes por análisis citométrico multiparamétrico, lo que excluye la determinación de la importancia de pronóstico de este parámetro en una gran cohorte de pacientes o en estudios retrospectivos. Para superar este obstáculo, los autores de la invención han desarrollado un análisis de inmunofluorescencia in situ multiparamétrico con formación de imágenes multiespectrales. El uso de software para calcular el espectro puro de un fluoróforo a partir de señales de emisión mixtas combinado con el análisis de imágenes automatizado evita el riesgo habitual de superposición de señales de varios fluoróforos y la variación del recuento manual entre diferentes operadores. En seres humanos, el RCC representa un buen modelo para analizar la importancia clínica de esta coexpresión, ya que algunos estudios previos ya detectaron receptores inhibidores (PD-1, Lag3, PDL1, PD-L2) dotados de valor pronóstico malo en este cáncer (8, 9). Se centraron en la expresión de PD-1 y Tim-3 en las células T CD8+, ya que se ha mostrado que en la leucemia mielógena aguda murina, melanoma humano y NSCLC la coexpresión de PD-1 con Tim-3 se correlaciona con la disfunción de las células T (4, 10, 11). Como consecuencia de la inactivación del gen VHL en la mayoría de los RCC con histología de células claras, existe una sobreexpresión de VEGF que explica que el RCC es un cáncer muy vascular. Recientemente mostraron que el VEGF inducía la expresión de PD-1 y Tim-3 en células T CD8+ (12). Por último, la base de datos TCGA informaba de una alta expresión de Tim-3 en el carcinoma renal de células claras de riñón (13), pero puesto que Tim-3 también podría ser expresado por muchas células, incluyendo células tumorales, mieloides y endoteliales, solo el análisis de inmunofluorescencia in situ multiparamétrico permite definir su función e importancia clínica, cuando se expresan en células T CD8+. El objetivo de este estudio era evaluar la importancia biológica y el impacto clínico de la coexpresión de Tim-3 en células T PD-1+CD8+ intratumorales en pacientes con RCC.

Material y métodos

Cohortes de pacientes

En este estudio se incluyeron dos cohortes independientes de pacientes con RCC que se sometieron a nefrectomía en el departamento de Urología del Hospital Europeo Georges Pompidou. Una de ellas era una cohorte prospectiva de 42 pacientes incorporados entre febrero de 2012 y noviembre de 2015. En esta cohorte se incluyeron todos los tipos histológicos de cáncer, excepto las lesiones quísticas.

Se seleccionó retrospectivamente una segunda cohorte independiente de 87 pacientes que se sometieron a cirugía de un carcinoma renal entre abril de 1999 y junio de 2005 del biobanco del hospital Necker para el análisis in situ de inmunofluorescencia multiparamétrica. Estas muestras se congelaron directamente después de la nefrectomía y evaluación histológica y solo incluían carcinoma de células claras. Sólo se incluyeron pacientes no tratados que presentaban un carcinoma renal de células claras en las dos cohortes. Las características de los pacientes de las dos cohortes se dan en la Tabla S1 y S2. Esta investigación se llevó a cabo con un protocolo aprobado por el comité de ética local (CPP Ile de Francia n° 2012-05-04)

Inmunofenotipado por análisis de citometría

La tinción por inmunofluorescencia y el análisis de citometría de flujo de TIL se llevaron a cabo como se ha descrito previamente (14). Brevemente, después de la disociación de las biopsias por ADNasa I (30 UI/ml, Roche) y colagenasa D (1 mg/ml, Roche) durante 60 min, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable FVS 520 (eBioscience, París 75006, Francia), anti-CD3 marcado con BV510 (BD Biosciences, Pont de Claix 38801, Francia), anti-CD8 marcado con PE (BD Biosciences), anti-PD-1 marcado con BV421 (BD Biosciences) y anti-Tim-3 marcado con APC (Biolegend/Ozyme Saint Quentin Yvelines 78053 Francia). Para el análisis, las células se activaron en células T CD3+ positivas singletes viables. En cada experimento se incluyeron anticuerpos de control de isotipo. La descripción detallada de los anticuerpos usados para el análisis de citometría se describe en la tabla S3.

Tinción de inmunofluorescencia de TIL in situ

Las muestras de tejido obtenidas el día de la nefrectomía se congelaron y almacenaron a -802C. La calidad de la muestra se comprobó mediante una sección teñida con HyE. Las muestras congeladas se seccionaron de 4 a 6 |um con un criostato, se pusieron en portaobjetos, se secaron al aire y se fijaron durante 5 minutos con acetona al 100%. Antes de la incubación con anticuerpos, los portaobjetos se pretrataron con bloqueador de avidina/biotina (DAKO) durante 10 minutos y los receptores de Fc se bloquearon con suero de burro (DAKO) al 5% en TBS durante 30 minutos. La tinción para CD8, PD-1 y Tim3 se llevó a cabo usando anticuerpos primarios no marcados seguido de anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo. Los anticuerpos usados para las diversas tinciones de inmunofluorescencia se describen en la tabla S3. Se usaron anticuerpos de isotipo coincidente como controles negativos. En cada caso, se comprobó que los anticuerpos secundarios no reaccionaran de forma cruzada con anticuerpos primarios no relacionados usados en la combinación. Los núcleos se destacaron usando medio de montaje DAPI.

Análisis de fluorescencia y recuento celular automatizado

Los portaobjetos de secciones renales teñidas se leyeron con un microscopio automatizado VectraR. Esta tecnología de Perkin ElmerR permite medir las características morfométricas y de fluorescencia en los diferentes compartimentos celulares (membrana/citoplasma/núcleos). Junto con un software Inform, el sistema permite un protocolo de tinción multiplexado. Como se recomienda para el análisis multiplexado, se analizaron los portaobjetos con una tinción (Cianina 5 o Cianina 3 o Alexa Fluor 488) y no teñidos en Inform con el fin de integrar los espectros correspondientes en una biblioteca fluo.

Para cada portaobjetos (1 paciente), la adquisición de imágenes y el recuento posterior se hicieron en al menos 5 campos. Un patólogo examinó visualmente los portaobjetos teñidos antes del análisis. El análisis del marcaje por inmunofluorescencia de las células se realizó usando el software Inform. Brevemente, para el reconocimiento celular, se hizo una "segmentación celular" basándose en la tinción DAPI y el tamaño. Después, se examinó cuidadosamente una muestra de 1 (menos de 5) imagen por paciente para la etapa de fenotipado (véase la Figura 1). Las células monoteñidas para CD8 (punto azul) o co-teñidas para PD1 y CD8 (punto rojo) o PD-1, Tim-3 y CD8 (punto verde) se identificaron manualmente hasta que el reconocimiento automatizado por el software Inform era concordante con el recuento visual (error <5%). Cada imagen de fenotipado se comprobó después del análisis del software.

Separación de células y activación de células T

Los linfocitos infiltrantes de tumores recientes obtenidos después de la digestión con ADNasa/colagenasa se tiñeron con anti-CD3, anti-CD8, anti-PD-1 y anti-Tim-3 y se separaron en tres poblaciones PD-1+Tim-3+CD8+, PD-1+Tim-3-CD8+, PD1 -Tim-3-CD8+ usando un separador FACS-ARIA (BD Biosciences). Las células T recuperadas se incubaron durante 24 horas con medio o se estimularon con un kit de activación de células T anti-CD3-anti-CD28 (Miltenyi). El IFNn se midió por Elisa (Diaclone) en los líquidos sobrenadantes recogidos 24 horas después de la activación o no de las células T.

Tabla 1: Correlación entre la expresión de PD-1 sola o combinada con Tim-3 en células T CD8+ y parámetros de pronóstico clínico de pacientes con RCC. El porcentaje de PD-1+, PD-1+Tim-3+ o PD-1+Tim-3- en células T CD8+ seleccionado como una variable continua medida por técnica de inmunofluorescencia (IF) in situ o citometría (Citm) se correlacionó con varios parámetros clínicos definidos como una variable binaria (TNM, grado de Fuhrman, puntuación UISS) o una variable continua (tamaño del tumor). TNM se dividió en dos grupos: enfermedad localizada (pT1 y pT2) y enfermedad avanzada (pT3, pT4, N+ o M+). El grado de Fuhrman se definió como bajo (grado I o II) y alto (grado III o IV) y la puntuación UISS en 3 clases (0,1,2). Los valores de p para correlación significativa están en negrita.

Tabla S1: Características clínicas basales de paciente con RCC de células claras primario, seleccionado para análisis in situ de inmunofluorescencia multiparamétrico

Tabla S2: Características clínicas basales de paciente con RCC con análisis de TIL de tumor recientes. El grado de Fuhrman solo se podía evaluar para la histología de tipo células claras y papilar. Datos ausentes para 1 paciente para el grado Fuhrman y 3 para la puntuación UISS.

Tabla S3: Lista de anticuerpos usados para la tinción de inmunofluorescencia in situ y citometría

Tabla S4: Correlación entre el número total (Nb) de células T CD8+ y las que expresan Tim-3 y/o PD-1.

Resultados

1) Detección y caracterización de células T CD8+ que coexpresan o no PD-1 y Tim-3 por formación de imágenes espectrales de inmunofluorescencia in situ automatizadas.

Para caracterizar las células T CD8+ que infiltran el carcinoma de células renales y que expresan PD-1 y Tim-3, se estableció una técnica de multifluorescencia in situ con recuento automatizado. Primero se mostró que aproximadamente la mitad de las células T CD8+ expresan PD-1 (media 53,9%; EE: 30,49%). Esta población podría dividirse en dos grupos: i) uno que corresponde a doble positivo PD-1+Tim-3+ dentro de las células T CD8+ con un porcentaje medio de 38,16% (EE: 28,11%) i) una segunda población de células T CD8+ que expresan PD-1 sin Tim-3 (media: 15,77%; EE: 8,62%). Por tanto, dentro del microambiente tumoral, la mayoría de las células T CD8+PD-1 coexpresaban Tim-3, mientras que Tim-3 sin PD-1 se detectó en menos de 3% de las células T CD8+ (datos no mostrados). El número medio de células T CD8+ totales, células T CD8+PD-1+, células T CD8+ PD-1+Tim-3+ y PD-1+Tim-3 negativo era 116,5 (EE: 216), 89,32 (EE: 191,8), 66,9 (EE: 143), 22,38 (EE: 57,5) respectivamente. Como se esperaba, también se observó la expresión de Tim-3 en células no T CD8+.

2) Importancia clínica de la coexpresión de PD-1 y Tim-3 en células T CD8+ in situ.

Se han propuesto varios criterios (TNM, grado de Fuhrman, tamaño del tumor, puntuación UISS) para definir el valor pronóstico del RCC primario. El porcentaje o el número de células T CD8+ intratumorales que expresan PD-1 sin Tim-3 no se correlacionaba con ningún criterio de agresividad definido antes (Tabla 1 y Tabla S4). Por el contrario, se observó una relación positiva entre el porcentaje de células T CD8+ intratumorales que expresan PD-1 (es decir, Tim-3+ o Tim-3neg) o que coexpresan PD-1 y Tim-3 y el estadio TNM, el grado de Fuhrman y la puntuación UISS (Tabla 1). La coexpresión de PD-1 y Tim-3 también se asoció con un tamaño tumoral mayor. Además, el número de células T CD8+ que infiltran el tumor que expresan PD-1 o que coexpresan PD-1 y Tim-3 se correlacionaba con el grado de Fuhrman y la puntuación UISS (Tabla S4). En consonancia con este fenotipo más desfavorable, los pacientes con RCC cuyas células T CD8+ coexpresan PD-1 y Tim-3 por encima de la mediana (34,7) tienen más probabilidades de recaer (p = 0,046; HR 2,9; intervalo de confianza al 95% (IC): 1,02-8,21) (Fig. 1A). También se mostró una correlación entre el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 y la supervivencia global a 36 meses (Fig. 1B). Este mismo grupo de pacientes también tenía una tendencia hacia una supervivencia global peor cuando se seleccionaba la mediana como punto de corte (p = 0,079; HR 2,16; IC al 95%: 0,91-5,1). Cuando todos los demás subconjuntos de CD8 se establecieron como una variable continua o variable binaria definida por la mediana, no se encontró correlación estadística significativa con la supervivencia sin progresión (SSP) o la supervivencia global (SG). Solo el porcentaje de coexpresión de PD-1 y Tim-3 en las células T CD8+ tenía un impacto en el resultado clínico de los pacientes. En un modelo multivariable que incluye el porcentaje de las células T CD8+ doble positivas PD-1+Tim 3+, la clasificación de TNM y el tamaño del tumor, solo el tamaño del tumor permanece asociado significativamente con la SSP (p = 0,0099).

3) Evaluación de la coexpresión de PD-1 y Tim-3 en células T CD8+ por citometría y su importancia clínica.

Para validar estos resultados, se midió la expresión de PD-1 y Tim-3 en células T CD8+ por citometría en una serie de 42 tumores recientes derivados de pacientes con RCC. Como se observó previamente con la técnica de inmunofluorescencia multiparamétrica in situ, aproximadamente la mitad de las células T CD8+ expresan PD-1 (media 50,8+ 20,76) y ninguna célula T CD8+ expresa Tim-3 sin PD-1. En la población entera, 15% de las células T CD8+ coexpresan PD-1 y Tim-3 y este porcentaje aumenta a 17,42% en los pacientes con CRCC restringido. Aunque las dos series de pacientes eran independientes, sorprendió que el porcentaje de expresión de PD-1 en células T CD8+ se ajustara con las dos técnicas, pero no el de la de expresión de Tim-3. Primero se confirmó que esta diferencia no era secundaria a las series independientes de pacientes ensayados. De hecho, la figura 6A mostró que para el mismo grupo de 10 pacientes con RCC para los que estaban disponibles tanto los TIL como la sección congelada, el porcentaje de PD-1+Tim-3+ en las células T CD8+ era mayor cuando se detectaba por la técnica de inmunofluorescencia in situ que por citometría (p = 0,049). Esta discordancia se explicó más mostrando que los TIL tratados con colagenasa tienen una disminución en la expresión de Tim-3 en comparación con el uso del método mecánico de disociación (p = 0,028) (Fig. 6B). Desafortunadamente, este método mecánico tiene un rendimiento bajo de células recuperadas en comparación con el uso de colagenasa (datos no mostrados). La expresión de Tim-3 en PBMC activadas también disminuyó, cuando se trataron con colagenasa en comparación con la exposición a disociación mecánica o la ausencia de tratamiento (p = 0,029) (Fig. 6). Es interesante que la colagenasa no afectaba a la expresión de PD-1 de las células T CD8+, lo que explica la concordancia de este marcador entre estas dos técnicas. Estos resultados apoyan el valor clínico de la técnica multiparamétrica de inmunofluorescencia in situ para evitar este tipo de sesgo. En relación con la importancia clínica de los resultados obtenidos por citometría, se confirmó que el porcentaje de células T CD8+ que expresan PD-1 sin Tim-3 por análisis de citometría no se correlacionaba con ningún criterio de pronóstico (TNM, grado de Fuhrman, tamaño del tumor, puntuación UISS), mientras que los pacientes cuyas células T CD8+ coexpresan PD-1 y Tim-3 tenían un estadio de TNM más avanzado (p = 0,021), un tumor con un tamaño mayor (p = 0,021) y una puntuación UISS más alta (p = 0,049). Es interesante que la coexpresión de Tim-3 y PD-1 en células T CD8+ era mayor en el grupo de pacientes con una histología de CRCC que se considera un cáncer más agresivo que los subgrupos cromófobo o túbulo-papilar u oncocitoma (Fig. 5). Puesto que el estudio de citometría era un análisis prospectivo, el seguimiento no era lo suficientemente largo para evaluar la SSP y la SG de este grupo de pacientes. Así, excepto por el porcentaje absoluto de la coexpresión de PD-1 y Tim-3 en células T CD8+, los otros parámetros medidos y su importancia clínica eran muy similares entre las dos series.

4) Caracterización fenotípica y funcional de la población de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3

Puesto que se ha mostrado que los niveles de PD-1 en células T se correlacionan con el agotamiento de células T definido por la expresión múltiple de receptores inhibidores (15), se cuantificó en una serie de 16 pacientes la expresión de PD-1 en células T CD8+ que coexpresan o no Tim-3 por citometría. Los pacientes se seleccionaron basándose en la coexpresión de PD-1 y Tim-3 de al menos 10% de la población total de células T CD8+. En el paciente que se muestra en la figura 2A, se observaba una mayor expresión de la intensidad media de fluorescencia (MFI) de PD-1, cuando coexpresaba Tim-3 (MFI: 10,4) en comparación con su expresión sola (5,88). Para la población entera, la MFI de PD-1 en las células T CD8+ que coexpresan Tim-3 (media 19,13 8,8) también era mayor que la MFI observada en células T CD8+ que no expresan Tim-3 (media 11,58 5,2) (p = 0,0063) (Fig. 2A). Este resultado se confirmó cuando se llevó a cabo el análisis de inmunofluorescencia in situ y se compararon los niveles de intensidad de PD-1, cuando se coexpresaba o no con Tim-3 en células T CD8+. De hecho, en ausencia de Tim-3, la media de la intensidad de fluorescencia de PD-1 se midió a 0,31 (+ 0,15) y aumentó a 0,489 (+ 0,19), cuando se coexpresaba con Tim-3 (Fig. 2B) (p = 0,0418). Por lo tanto, usando dos técnicas diferentes se demostró que la coexpresión de PD-1 y Tim-3 estaba asociada con niveles mayores de PD-1 en células T CD8+. Para determinar la supuesta diferencia en términos de funcionalidad entre las células T CD8+ PD-1+Tim-3+ y la población de células T CD8+ PD-1+Tim-3neg, se seleccionaron dos pacientes que coexpresan PD-1 y Tim-3 y se clasificaron las tres poblaciones siguientes: células T CD8+ PD-1negTim-3neg, células T c D8+ PD-1+Tim-3neg y células T CD8+ PD-1+Tim-3+ (Fig. 3). Después de una estimulación con mAb anti-CD3 y anti-CD28, se mostró que la población PD1-Tim3- y la población PD1+Tim3- secretan una gran cantidad de IFN en sus líquidos sobrenadantes sin diferencias significativas entre estas dos subpoblaciones. Por el contrario, la producción de IFN^ disminuyó significativamente en las células T CD8+ que coexpresan PD1 y Tim-3 en comparación con las otras dos poblaciones (Fig. 3).

Discusión

Usando una nueva tecnología espectral de obtención de imágenes de inmunofluorescencia múltiple in situ, se mostró que la importancia clínica de PD-1 en células T CD8+ difiere, si es coexpresado o no con Tim-3. De hecho, se mostró que los pacientes con cáncer de células renales infiltrados con células CD8 que coexpresaban PD-1 y Tim-3 tenían un fenotipo más agresivo definido por un grado de Fuhrman alto y un tumor de mayor tamaño y una puntuación avanzada de TNM y UISS. Además, este grupo de pacientes también presentaba una SSP más baja y una supervivencia global reducida a los 36 meses. Se confirmó este fenotipo agresivo por análisis de citometría, ya que los pacientes cuyas células T CD8+ coexpresaban PD-1 y Tim-3 tenían un estadio TNM y una puntuación UISS más avanzados y un tamaño tumoral mayor. Estos datos pueden explicar algunas controversias en la bibliografía sobre el valor pronóstico de PD-1 (8, 15-18) y destacan el papel crítico de la expresión combinada de receptores coinhibidores especialmente Tim-3 en la importancia clínica de PD-1. Esta compleja interpretación del valor clínico de PD-1 es paralela a su múltiple importancia biológica. De hecho, PD-1 es tanto un marcador de activación como una característica distintiva de las células T agotadas. Sin embargo, PD-1 también preserva las células T CD8+ de la sobreestimulación y el riesgo de acumulación de células T CD8+ agotadas diferenciadas terminalmente (19). Aunque Tim-3 también es inducido después de la activación (20), su coexpresión con PD-1 en el microambiente tumoral puede representar un cambio que conduce a la funcionalidad comprometida de las células T (4, 20, 21). Se mostró que la población de células T CD8+ que coexpresa PD-1 y Tim-3 presentaba todas las características de una población de células T agotada, ya que responden mal a la estimulación de células T. Además, los altos niveles de PD-1 expresados en su membrana se consideran una característica distintiva de una célula T particularmente disfuncional (11, 14). Es interesante que tanto in vitro como in vivo, el bloqueo del ligando Tim-3-Tim-3 en combinación con la inhibición de la ruta PD-1-PD-L1 actuaban en sinergia para restablecer la función de las células T, dando como resultado el control de la infección crónica y la inhibición del crecimiento tumoral (4, 5, 22, 23). Además de la activación, las citoquinas Th1 pueden favorecer esta coexpresión de PD-1 y Tim-3, ya que PD-1 e IL-12 regulados por IFN de tipo I y II mejoraban la expresión de Tim-3 (20, 24). Los macrófagos M2 asociados a tumores también regulaban la expresión de Tim-3 en células T derivadas de RCC (25). Recientemente se demostró que VEGF también mejoraba la expresión de PD-1 y Tim-3 después de activación (12). Tim-3 también podría ser expresado en células no T, tal como células mieloides confiriendo a estas células una inmunovigilancia deteriorada (26, 27). En el RCC, se ha mostrado que Tim-3 se expresa en macrófagos y en células tumorales (28). Tim-3 promovía la invasión de ccRCC y hacía a estas células más resistentes a moléculas antiangiogénicas (28). Las células T CD8+ Tim-3+ intratumorales se han correlacionado con el grado histológico y el estadio tumoral avanzado en el linfoma folicular y el NSCLC, respectivamente, pero sin datos sobre su influencia en el resultado clínico (11, 20). Además, una mayor expresión del gen de expresión de Tim-3 en el carcinoma de células renales de riñón era un marcador de una peor supervivencia a los 5 años (13). A diferencia del cáncer, en las lesiones preneoplásicas tales como la neoplasia vulvar intraepitelial de tipo habitual, la importancia de las células T Tim-3+CD8+ puede ser menos desfavorable, ya que se relacionaba con la ausencia de recurrencia. Sin embargo, el número de células T CD8+Tim-3+ aumentaba en el carcinoma vulvar en comparación con lesiones benignas (29). Todos estos datos convergen para el direccionamiento de Tim-3 en el cáncer solo o preferiblemente en combinación con anti-PD-1/PD-L1. Otros inhibidores de puntos de control tales como Lag-3 se podrían coexpresar con PD-1 en células T CD8+ como se muestra en RCC y otros tumores y se correlaciona normalmente con una función efectora deteriorada de estas células (9, 30). Es interesante que en el NSCLC las células T CD8+ que expresan Tim-3 son las que coexpresan el mayor número de otros receptores inhibidores en comparación con las células que expresan otros inhibidores de puntos de control que posiblemente hacen que Tim-3 sea un marcador sustituto de células T agotadas más avanzadas (11). Un límite de este estudio es que no se compartimentalizó la población de células T CD8+ en el núcleo del tumor o en el estroma debido a las dificultades para combinar un marcador de células tumorales homogéneo con el conjunto de anticuerpos de células T de los autores de la invención. Pero los carcinomas renales no son entidades histológicas con un margen invasivo bien definido como se observa en algunos otros tumores epiteliales (es decir, cáncer colorrectal). Puesto que se ha mostrado que el valor pronóstico de las subpoblaciones de células T depende de su ubicación en el nido del tumor o en la periferia, podría explicar algunas discrepancias menores entre los presentes resultados y la descripción en la bibliografía en relación con el valor pronóstico del número de células T CD8+ y células T PD-1+ (8, 9, 31). También podría explicar el impacto más significativo del porcentaje de expresión de los receptores inhibidores, PD-1 y Tim-3 frente al número de células que los expresan, ya que este porcentaje refleja un estado intrínseco del estado de agotamiento de las células T CD8+ intratumorales. La influencia del número de células T CD8+ PD-1+Tim 3+ puede depender más de su relación con el número de células tumorales. Además, en la mayoría de los informes de la bibliografía, se ha usado una técnica de inmunoquímica monoparamétrica para el análisis de la expresión de inhibidores de puntos de control que difiere del presente enfoque en la caracterización de inhibidores de puntos de control, específicamente en células T CD8+, considerados como uno de los principales efectores después de la inmunoterapia (3). También se seleccionaron las diversas variables como una variable continua o con un punto de corte de mediana, que difiere de los estudios previos que usaban el valor p óptimo (8, 9). La nueva tecnología multiparamétrica in situ establecida en este estudio y descrita recientemente por otros grupos (3, 32) permitirá una mejor caracterización de las células T CD8+ y otras células inmunitarias a niveles de células individuales en el microambiente tumoral para guiar mejor la elección de dianas inmunitarias para la inmunoterapia. Se mostró que para algunos parámetros tal como Tim-3, la colagenasa puede disminuir su expresión cuando se detectaba por citometría, lo que refuerza el valor de la presente técnica de inmunofluorescencia automatizada multiparamétrica in situ para evaluar directamente in vivo la expresión intratumoral del inhibidor de puntos de control en células intactas. Además, el hecho de que, a diferencia de la población de células T CD8+ PD-1+Tim-3neg, las células T CD8+ doble positivas PD-1+Tim-3+ no se podían activar in vitro con un estímulo fuerte sugiere que también podría resultar difícil revitalizarlas tras el bloqueo de PD-PDL-1 y, por tanto, constituye un biomarcador de resistencia a la inmunoterapia.

REFERENCIAS:

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece la presente descripción.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece carcinoma de células renales que comprende las etapas de: i) cuantificar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto, ii) comparar el porcentaje cuantificado en la etapa i) con su valor de referencia predeterminado correspondiente y iii) concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia corto cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es mayor que su valor de referencia predeterminado correspondiente o concluir que el sujeto tendrá un tiempo de supervivencia largo cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es menor que su valor de referencia predeterminado correspondiente.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la cuantificación del porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se determina por inmunohistoquímica (IHC).

3. El método de la reivindicación 1, en donde la cuantificación del porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 se determina mediante un microscopio automatizado.

4. Un método para determinar si un sujeto que padece un carcinoma de células renales logrará una respuesta con un inhibidor de puntos de control inmunitario que comprende las etapas de i) cuantificar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto tratado con un inhibidor de puntos de control inmunitario, ii) comparar el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 cuantificadas en la etapa i) con sus valores de referencia predeterminados correspondientes y iii) concluir que el sujeto no responderá al tratamiento cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es mayor que su valor de referencia predeterminado correspondiente o concluir que el sujeto responderá al tratamiento cuando el porcentaje de células T CD8+ que coexpresan PD-1 y Tim-3 es menor que su correspondiente valor de referencia predeterminado.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo.

6. El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal.

7. El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-1.

8. El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-L1.

9. El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-L2.

10. El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-Tim-3.

11. El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es una molécula orgánica pequeña.

12. El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un aptámero.